JP6608807B2 - Ｒｎａガイドｃａｓヌクレアーゼ系を用いることによって免疫療法のためにｔ細胞を操作するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、免疫療法のために、遺伝子操作された、好ましくは非アロ反応性のT細胞を開発する方法に関する。本方法は、T細胞にある、いろいろな重要遺伝子座を特異的に標的とするために、RNAガイドエンドヌクレアーゼ、特にCas9/クリスパー系を使用することを伴う。操作されたT細胞はまた、その免疫活性を悪性細胞または感染細胞に再誘導するためにキメラ抗原受容体（CAR）を発現することも意図される。本発明は、癌、ウイルス感染症、および自己免疫疾患を処置するための、T細胞を用いた標準的で手頃な価格の養子免疫療法戦略への道を開く。

発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫治療は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫治療のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子改変を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park,Rosenberg et al.2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。

T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena,Dotti et al.2010）。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティングモエティからなる合成受容体である。概してCARの結合モエティは、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合モエティも、成功裡に使用されている。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裡に向け直すことが示されたが、より長期間の増大および抗腫瘍活性をインビボで提供することはできなかった。CARによって改変されたT細胞の生存を増強し、増殖を増加させるため、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）付加された。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対して、T細胞が向け直されることを、成功裡に可能にしている（Jena,Dotti et al.2010）。

養子免疫療法を用いて患者を処置する現行のプロトコールは自己細胞移入に基づいている。このアプローチでは、Tリンパ球が患者から回収され、遺伝子組換えされるか、エクスビボで選択され、必要に応じて細胞数を増幅するためにインビトロで培養され、最後に、患者に注入される。リンパ球注入に加えて、宿主は、T細胞の生着または免疫応答へのT細胞の関与を支援する他のやり方、例えば、（放射線または化学療法を用いた）プレコンディショニング（preconditioning）およびリンパ球増殖因子（例えば、IL-2）の投与で操作されてもよい。各患者には、患者自身のリンパ球（すなわち、自家療法）を用いて、個々に作られた処置が与えられる。自家療法は、実際の適用に対して大きな技術的な障害および物流上の障害に直面している。作製するには、高価な専用施設および専門家が必要であり、患者を診断した後、短時間で作製しなければならない。多くの場合、患者の前処置によって免疫機能が低下し、患者のリンパ球は十分に機能せず、非常に少数で存在する可能性がある。これらの障害のために、各患者の自己細胞調製物は事実上新たな製品であり、その結果、効力および安全性の大幅なばらつきが生じる。

理想的には、同種異系治療用細胞を予め製造し、詳細に特徴付け、患者に即時に投与することができる標準化された療法を使用したい。同種異系とは、細胞が、同じ種に属する個体から得られているが、遺伝的に似ていないことを意味する。しかしながら、現在、同種異系細胞の使用には多くの欠点がある。免疫能力のある宿主では、同種異系細胞は素早く拒絶される。これは、宿主対移植片拒絶反応（HvG）と呼ばれるプロセスである。このため、導入された細胞の効力は大きく制限される。免疫能力のない宿主では、同種異系細胞は生着することができるが、その内因性T細胞受容体（TCR）特異性は宿主組織を異物として認識し、その結果、移植片対宿主病（GvHD）が起こる。移植片対宿主病（GvHD）は重大な組織損傷および死亡につながる場合がある。

同種異系細胞を効果的に入手するために、本発明者らは、T細胞を遺伝子操作する方法を以前に開示し、この方法では、登録商標TALEN（商標）（Cellectis, 8, rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS）の方がよく知られている特異的TAL-ヌクレアーゼを用いることによって、様々なエフェクター遺伝子、特にT細胞受容体をコードする遺伝子が不活性化される。この方法は、プラットフォームの一部としてRNAトランスフェクションを使用し、初代細胞において高効率であることが分かっており、そのため同種異系T細胞を大量生産することができる（WO2013/176915）。

最近、細菌S.ピオゲネス（S.pyogenes）のII型原核生物クリスパー（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeat）適応免疫系の成分に基づいて新たなゲノム操作ツールが開発された。この多成分系はRNAガイドCasヌクレアーゼ系（Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012）またはもっと簡単にクリスパーと呼ばれ、Casエンドヌクレアーゼと、このヌクレアーゼをいくつかの特定のゲノム配列に動かす能力をもつガイドRNA分子が関与する。RNAガイドがゲノム配列にハイブリダイズすると、エンドヌクレアーゼはDNAを切断することができる。クリスパー/クリスパー関連（Cas）系は、（1）「スペーサー」と呼ばれる外来遺伝物質が宿主ゲノム内のクラスター化アレイに保持されていること、（2）スペーサーから短いガイドRNA（crRNA）が発現されること、（3）crRNAが、プロトスペーサーと呼ばれる外来DNAの特定の部分に結合すること、および（4）クリスパー関連ヌクレアーゼ（Cas）がプロトスペーサーを分解することが必要である。外来DNAへの結合の特異性は、プレcrRNAの中にある非反復スペーサーエレメントによって制御される。プレcrRNAはtracrRNAと共に転写されると、Cas9ヌクレアーゼをプロトスペーサー:crRNAヘテロ二重鎖に向け、二本鎖破壊（DSB）形成を誘導する。さらに、Cas9ヌクレアーゼは、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）として知られる特定の配列がプロトスペーサー配列のすぐ下流に存在する場合にのみDNAを切断する。S.ピオゲネスにおける古典的なPAM配列は5'-NGG-3'であり、Nは任意のヌクレオチドを指す。後になって、Cas9ヌクレアーゼが標的DNA配列を配列特異的に切断するには、1種類のキメラcrRNA:tracrRNA転写物の発現だけで十分であることが証明された。このキメラcrRNA:tracrRNA転写物は、通常、天然II型クリスパー系では2つの異なるRNAとして発現される。哺乳動物細胞において使用するためにS.ピオゲネス由来内因性II型クリスパー/Cas系を適合させることによって、いくつかのグループは、独立して、RNAガイドCas9が、高い効率および最小限のオフターゲット効果で哺乳動物細胞の内因性ゲノム遺伝子座に正確な二本鎖切断を効率的に導入できることを示した（Cong et al. 2013, Mali et al. 2013, Cho et al. 2013）。さらに、ゲノム操作および転写調節におけるさらなる用途のために、Cas9ヌクレアーゼの特徴を利用するために、いくつかのCas9ヌクレアーゼ変異型が開発されている。例えば、Cas9ヌクレアーゼ変異型の1つはニッカーゼとして機能し（Jinek et al. 2012）、野生型Cas9のように両鎖ではなくDNAの相補鎖を切断する。これにより、NHEJではなく高忠実度の経路を用いてDNAテンプレートを修復することが可能になり、それによって、標的となる遺伝子座での、およびおそらくゲノム内の他の場所でのインデル形成が妨げられて、起こり得るオフターゲット/毒性作用が低減すると同時に、相同組換えを受ける能力が維持される（Cong et al., 2013）。つい最近、対となるニッキングが細胞株におけるオフターゲット活性を1/1,500〜1/50にし、オンターゲット切断効率を失うことなくマウス接合子における遺伝子ノックアウトを容易にすることが示された（Ran et al., 2013）。

Cas9/クリスパー系などのRNAガイドエンドヌクレアーゼは、哺乳動物細胞を遺伝子操作するための魅力的なアプローチのように思われるが、初代細胞、特にT細胞におけるRNAガイドエンドヌクレアーゼの使用は、以下の事実:
-T細胞細胞質へのDNAの導入によりT細胞が悪影響を受けること、すなわち、細胞がDNAベクターで形質転換されたときに高いアポトーシス率が観察されること、
-クリスパー系には細胞内でCas9が安定発現されることが必要であるが、生細胞内でCas9が長期間発現されると染色体欠陥が生じる可能性があること、
-現行のRNAガイドエンドヌクレアーゼの特異性は、11ヌクレオチド（N12-20NGG、式中、NGGはPAMを表す）を含む配列だけで決まるため、ゲノムに固有にある、望ましい遺伝子座の標的配列を特定することが非常に難しいこと
が大きな障害となっている。

本願は、RNAガイドエンドヌクレアーゼをT細胞に効率的に実装するために、これらの制約に対する解決策を提供することを目的とする。

本発明は、Cas9/クリスパーなどのRNAガイドエンドヌクレアーゼを用いることによって、T細胞、特にドナーから入手可能な同種異系T細胞を、免疫療法目的に適するように、操作する方法を開示する。

本発明の方法は、さらに詳細には、MHC認識および/または免疫チェックポイントタンパク質に関与する遺伝子を不活性化または交換することによって、免疫療法に関係のあるT細胞のゲノムを正確に改変することを可能にする。特に、本発明の方法は、ガイドRNAが細胞死を誘発することなくTCR成分を不活性化するために、ゲノム内にある特定の関係のある標的配列を提供する。

いくつかの好ましい態様によれば、免疫療法に関係のある改変された細胞は、特異的な細胞認識のために、単鎖およびマルチサブユニットのキメラ抗原受容体（CAR）をコードする外因性組換えポリヌクレオチドをさらに含む。さらに詳細には、CD19抗原に対して向けられたCARを有する、リンパ腫を処置するための改変されたT細胞が入手可能になる。

本発明は、詳細な説明、実施例、および図面に示した遺伝子組換えを含む、単離された細胞または細胞株、ならびにT細胞においてRNAガイドエンドヌクレアーゼを実装するのに有用なタンパク質、ポリペプチド、またはベクターの全てを包含する。

本発明の結果として、改変されたT細胞は、癌、感染症、または自己免疫疾患を処置または予防するための方法において、治療製品として、理想的には、「既製の（off the shelf）」製品として使用することができる。
[本発明1001]
（a）少なくとも、
-RNAガイドエンドヌクレアーゼ、および
-該エンドヌクレアーゼを、T細胞ゲノム内にある少なくとも1種の標的となる遺伝子座に向ける、特異的ガイドRNA
の細胞への導入および/または発現によってT細胞を遺伝子組換えする工程、
（b）結果として生じた細胞を増殖させる工程
を含む、免疫療法のためにT細胞を調製する方法。
[本発明1002]
RNAガイドエンドヌクレアーゼが、S.ピオゲネス（S.Pyogenes）のCas9に由来するRuvCドメインまたはHNHドメイン（SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2）と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
RNAガイドエンドヌクレアーゼがCas9である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
RNAガイドエンドヌクレアーゼが少なくとも2つのポリペプチドに分割され、一つのポリペプチドがRuvCを含み、別のポリペプチドがHNHを含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
RNAガイドエンドヌクレアーゼが安定化型または不活性型で発現され、
T細胞が産生する酵素によって活性化されるか、またはT細胞内でそのポリペプチド構造が不安定化されると、該エンドヌクレアーゼが活性となる、本発明1004の方法。
[本発明1006]
ガイドRNAがペプチド核酸（PNA）またはロックド核酸（LNA）によって生じる、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
トランスフェクトされたmRNAからRNAガイドエンドヌクレアーゼが発現される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
トランスフェクトされたmRNAからRNAガイドエンドヌクレアーゼが発現され、プラスミドDNAからガイドRNAが発現される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
トランスフェクトされたmRNAが、修飾核酸塩基またはポリアデニル化配列を含めることによって安定化される、本発明1007または1008の方法。
[本発明1010]
トランスフェクトされたmRNAがARCA（アンチリバースCap類似体）の付加によって安定化される、本発明1007の方法。
[本発明1011]
トランスフェクトされたmRNAが5'UTRまたは3'UTRの付加によって安定化される、本発明1007の方法。
[本発明1012]
トランスフェクトされたmRNAが少なくとも1種の細胞透過性ペプチドと結合される、本発明1007の方法。
[本発明1013]
細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン、TAT、ポリアルギニンペプチド、pVEC、MPG、トランスポータン、グアニジウムリッチ分子輸送体より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
透過性ペプチドが、RQIRIWFQNRRMRWRR、RQIRIWFQNRRMRWRRC、および/またはRQIKIWFQNRRMKWKKCより選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
ガイドRNAおよび/またはmRNAがエレクトロポレーションによって細胞に導入される、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
エンドヌクレアーゼがDNAベクターから発現される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1017]
ガイドRNAが細胞内で産生された時点で、エンドヌクレアーゼの発現が誘導される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
DNAベクターがゲノムに組み込まれない、本発明1016の方法。
[本発明1019]
DNAベクターがエピソームベクターである、本発明1016の方法。
[本発明1020]
DNAベクターがトランスポゾンである、本発明1016の方法。
[本発明1021]
ガイドRNAがDNAベクターからの転写物である、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
DNAベクターが、T細胞においてガイドRNAをより効率的に転写させるためにU6プロモーターを含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
エンドヌクレアーゼが非組み込みウイルスベクターから発現される、本発明1001の方法。
[本発明1024]
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが染色体に組み込まれると、エンドヌクレアーゼが発現される、本発明1001の方法。
[本発明1025]
偽形質導入によりウイルスキャプシドが形成されると、前記ヌクレアーゼおよび/またはガイドRNAがT細胞に導入される、本発明1001の方法。
[本発明1026]
エンドヌクレアーゼおよび/またはガイドRNAがリポソームベクターを用いてトランスフェクトされる、本発明1001の方法。
[本発明1027]
少なくとも1種の標的となる遺伝子座がT細胞受容体（TCR）の成分をコードする、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
T細胞受容体の成分がTCRαである、本発明1027の方法。
[本発明1029]
ガイドRNAが、表2に列挙したSEQ ID NO：6〜SEQ ID NO：52より選択されるTCRαの標的配列に特異的にハイブリダイズする、本発明1028の方法。
[本発明1030]
少なくとも1種の標的となる遺伝子座がHLA遺伝子をコードする、本発明1001〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
少なくとも1種の標的となる遺伝子座がT細胞受容体（TCR）の成分の発現の調節に関与する、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1032]
少なくとも1種の標的となる遺伝子座が、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、およびGUCY1B3より選択される免疫チェックポイントタンパク質の発現に関与する、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記遺伝子座がPD1遺伝子またはCTLA-4遺伝子の発現に関与する、本発明1032の方法。
[本発明1034]
少なくとも2種の不活性化される遺伝子が、PD1およびTCRα、PD1およびTCRβ、CTLA-4およびTCRα、CTLA-4およびTCRβ、LAG3およびTCRα、LAG3およびTCRβ、Tim3およびTCRα、Tim3およびTCRβ、BTLAおよびTCRα、BTLAおよびTCRβ、BY55およびTCRα、BY55およびTCRβ、TIGITおよびTCRα、TIGITおよびTCRβ、B7H5およびTCRα、B7H5およびTCRβ、LAIR1およびTCRα、LAIR1およびTCRβ、SIGLEC10およびTCRα、SIGLEC10およびTCRβ、2B4およびTCRα、2B4およびTCRβからなる群より選択される、本発明1032の方法。
[本発明1035]
少なくとも1種の標的となる遺伝子座が、化学療法または免疫抑制薬物に対するT細胞の感受性を付与する、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1036]
標的となる遺伝子座がCD52である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
標的となる遺伝子座がヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）である、本発明1035の方法。
[本発明1038]
標的となる遺伝子座がグルココルチコイド受容体（GR）をコードする、本発明1035の方法。
[本発明1039]
外因性DNAまたは変異をT細胞ゲノムに導入するように、標的となる遺伝子座において相同組換えが誘導される、本発明1001〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
キメラ抗原受容体（CAR）をT細胞に導入する工程をさらに含む、本発明1001〜1038のいずれかの方法。
[本発明1041]
工程（a）のT細胞が、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、本発明1001〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
工程（a）のT細胞がCD4+Tリンパ球および/またはCD8+Tリンパ球に由来する、本発明1041の方法。
[本発明1043]
形質転換されたT細胞がインビトロで増殖する、本発明1001〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
形質転換されたT細胞がインビボで増殖する、本発明1001〜1042のいずれかの方法。
[本発明1045]
医薬として用いられるT細胞を調製するための、本発明1001〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
必要とする患者における癌またはウイルス感染症を処置するためのT細胞を調製するための、本発明1014の方法。
[本発明1047]
リンパ腫を処置するための、本発明1046の方法。
[本発明1048]
本発明1001〜1047のいずれかの方法によって入手可能な、操作されたT細胞。
[本発明1049]
（a）本発明1001〜1047のいずれかの方法に従って、改変されたT細胞の集団を調製する工程、および
（b）該形質転換されたT細胞を患者に投与する工程
を含む、患者を処置するための方法。
[本発明1050]
患者が、癌、ウイルス感染症、自己免疫障害、または移植片対宿主病（GvHD）と診断されている、本発明1049の方法。
[本発明1051]
T細胞が、処置しようとする患者に由来する、本発明1050の方法。
[本発明1052]
T細胞がドナーに由来する、本発明1051の方法。

T細胞と抗原提示細胞との正常な関係の模式図。 患者の腫瘍細胞に対する、本発明による遺伝子組換え治療用T細胞の模式図。 本発明によるRNAガイドエンドヌクレアーゼ操作T細胞に導入することができるマルチサブユニットCARの模式図。 免疫療法のためにヒト同種異系細胞を操作する方法の一例の模式図。 T細胞における、TCR遺伝子に対するクリスパー系活性のフローサイトメトリー分析（実施例2からの実験結果）。5x10⁶個のT細胞を、Cas9 mRNA 10μg+カスパーゼ阻害剤の存在下で、U6プロモーターの制御下でTRAC遺伝子特異的sgRNAを発現するプラスミドDNA 10μgでトランスフェクトした。読み取り：トランスフェクション3日後の、TCRαβ抗体を用いたフローサイトメトリー分析。対照：非トランスフェクト細胞。 T細胞における、CD52遺伝子に対するクリスパー系活性のフローサイトメトリー分析（実施例2からの実験結果）。5x10⁶個のT細胞を、Cas9 mRNA 10μg+カスパーゼ阻害剤の存在下で、U6プロモーターの制御下でCD52遺伝子特異的sgRNAを発現するプラスミドDNA 10μgでトランスフェクトした。読み取り：トランスフェクション3日後の、CD52抗体を用いたフローサイトメトリー分析。対照：非トランスフェクト細胞。

表1：PBMC由来T細胞におけるエレクトロポレーションに必要な最低電圧を求めるために使用した様々なcytopulseプログラム
表2：PBMC由来T細胞におけるエレクトロポレーションに必要な最低電圧を求めるために使用した様々なcytopulseプログラム
表3：TCRαの非遺伝毒性Cas9/クリスパー破壊のための標的配列

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

適当な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は全て、特に、参照が引用されている隣接する文章、段落、またはセクションにおける主題に関する各参照によって開示される主題について、参照によってその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA）；Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Third Edition,（Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait ed.,1984）；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984）；Transcription And Translation（B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984）；Culture Of Animal Cells（R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press,1986）；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）;the series,Methods In ENZYMOLOGY（J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York）、特に、第154巻および第155巻（Wu et al.eds.）および第185巻、"Gene Expression Technology"（D.Goeddel,ed.）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory）；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（Mayer and Walker, eds., Academic Press,London,1987）；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D. M. Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986）；ならびにManipulating the Mouse Embryo,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.,1986）を参照されたい。

概略的な局面において、本発明は、癌および感染症の処置における新たな養子免疫療法戦略のための方法に関する。

本発明の主な目的は、細胞療法において適切な細胞を作製するために、Cas9などのRNAガイドエンドヌクレアーゼを用いてT細胞を遺伝子組換えすることである。第1の態様において、本発明の方法は、
（a）少なくとも、
-RNAガイドエンドヌクレアーゼ、および
-前記エンドヌクレアーゼを、T細胞ゲノム内にある少なくとも1種の標的となる遺伝子座に向ける、特異的ガイドRNA
の細胞への導入および/または発現によって、T細胞を遺伝子組換えする工程、
（b）結果として生じた細胞を増殖させる工程
を含む、免疫療法のためにT細胞を調製する方法に関する。

「RNAガイドエンドヌクレアーゼ」とは、エンドヌクレアーゼの活性および特異性がエンドヌクレアーゼとRNA分子が結合することに依存するポリペプチドを意味する。このRNA分子の全配列、またはより一般的にはこのRNA分子の断片は、ゲノム内の標的配列を特定することができる。このRNA分子の断片は、好ましくは8核酸塩基より長い配列であり、より好ましくは10核酸塩基より長い配列であり、さらにより好ましくは12核酸塩基より長い配列である。このRNA分子は概して、前記標的配列にハイブリダイズし、前記エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性を媒介することができる。RNAガイドエンドヌクレアーゼの一例は、Cas9/クリスパー系の一部であるcas9である。

Cas9
Cas9はCsn1（COG3513）とも呼ばれ、crRNAの生合成および侵入DNAの破壊の両方に関与する大きなタンパク質である。Cas9は、S.サーモフィラス（S.thermophilus）（Sapranauskas, Gasiunas et al. 2011）、リステリア・イノクア（listeria innocua）（Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012）、およびS.ピヨゲネス（S. Pyogenes）（Deltcheva, Chylinski et al. 2011）などの様々な細菌種において述べられている。この大きなCas9タンパク質（>1200アミノ酸）は、タンパク質の中央にある2つの推定ヌクレアーゼドメイン、すなわち、HNH（McrA様）ヌクレアーゼドメインと、分割されたRuvC様ヌクレアーゼドメイン（RNアーゼHフォールド（RNase H fold））（Haft, Selengut et al. 2005; Makarova, Grishin et al. 2006）を含有する。

「Cas9」とは、標的核酸配列を処理することができる、操作されたエンドヌクレアーゼまたはCas9ホモログも意味する。特定の態様において、Cas9は、二本鎖切断または一本鎖切断のいずれかに対応し得る核酸標的配列の切断を誘導することができる。Cas9変種は、天然で自然界に存在しないCas9エンドヌクレアーゼ、およびタンパク質工学またはランダム変異誘発によって得られるCas9エンドヌクレアーゼでもよい。本発明によるCas9変種は、例えば変異、すなわちS.ピオゲネスCas9エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（COG3513-SEQ ID NO：3）内にある、少なくとも1つの残基からの欠失または少なくとも1つの残基の挿入もしくは置換によって得ることができる。本発明のフレーム（frame）局面において、このようなCas9変種は機能的なままである、すなわち標的核酸配列を処理する能力を保持している。Cas9変種はまた、S.ピオゲネスCas9のアミノ酸配列内にある、少なくとも1つの残基からの欠失または少なくとも1つの残基の挿入もしくは置換を含んでもよい、S.ピオゲネスCas9ホモログでもよい。最終構築物が望ましい活性、特にガイドRNAまたは核酸標的配列に結合する能力をもつのであれば、最終構築物に到達するために、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが作られてもよい。

RuvC/RNアーゼHモチーフは、RNAおよびDNAに両方に働く幅広い核酸分解機能を示すタンパク質（RNアーゼH、RuvC、DNAトランスポザーゼ、およびレトロウイルスインテグラーゼ、およびアルゴノートタンパク質のPIWIドメイン）を含む。本発明では、Cas9（SEQ ID NO：4）タンパク質のRuvC触媒ドメインは、配列モチーフ:D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aによって特徴付けることができ、式中、Xは20種類の天然アミノ酸のいずれか1つであり、[I/L]はイソロイシンまたはロイシンである（SEQ ID NO:1）。他の点で、本発明は、少なくともD-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A配列を含み、式中、Xが20種類の天然アミノ酸のいずれか1つであり、[I/L]がイソロイシンまたはロイシンであるCas9変種に関する（SEQ ID NO:1）。

HNHモチーフは、コリシン、制限酵素、およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む二本鎖DNAに働く多くのヌクレアーゼに特有のものである。ドメインHNH（SMART ID: SM00507、SCOP名：HNHファミリー）は、広範囲のDNA結合タンパク質と結合し、様々な結合および切断機能を行う（Gorbalenya 1994; Shub, Goodrich-Blair et al. 1994）。これらのタンパク質のいくつかは、機能が詳細に明らかにされていない仮説上のタンパク質または推定のタンパク質である。機能が分かっているタンパク質は、細菌毒性、グループIおよびグループIIイントロンならびにインテインにおけるホーミング機能、組換え、発生により制御されるDNA再編成、ファージパッケージング、ならびに制限エンドヌクレアーゼ活性を含む広範囲の細胞プロセスに関与する（Dalgaard, Klar et al. 1997）。これらのタンパク質は、ウイルス、古細菌、真正細菌、および真核生物において発見された。興味深いことに、LAGLI-DADGおよびGIY-YIGモチーフと同様に、HNHモチーフは、インテイン、グループIおよびグループIIイントロンのような自己増殖性エレメントのエンドヌクレアーゼドメインと結合していることが多い（Gorbalenya 1994; Dalgaard, Klar et al. 1997）。HNHドメインは、保存されたHis（アミノ末端）およびHis/Asp/Glu（カルボキシ末端）残基がある程度の距離をとって隣接する保存されたAsp/His残基の存在によって特徴付けることができる。これらのタンパク質のかなりの数が中央Asp/His残基の両側にCX2Cモチーフも有する場合がある。構造上、HNHモチーフは、ねじれたβ鎖からなる中央ヘアピンとして現れ、その両側にαヘリックスが隣接する（Kleanthous, Kuhlmann et al. 1999）。Cas9の大きなHNHドメインはSEQ ID NO：5によって示される。本発明では、HNHモチーフは、配列モチーフ: Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sによって特徴付けることができ、式中、Xは20種類の天然アミノ酸のいずれか1つを表す（SEQ ID NO:2）。本発明は、少なくともY-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S配列を含むCas9変種に関し、式中、Xは20種類の天然アミノ酸のいずれか1つを表す（SEQ ID NO:2）。

標的とする多重遺伝子組換えを容易に行うために、およびガイドRNAをCas9細胞に導入することによって誘導性ヌクレアーゼ系を作り出すために、本発明は特に関心が高い可能性がある。本発明の目的のために、本発明者らは、ガイドRNAと一緒に、または別々に標的核酸配列を処理することができる2つの別個のスプリット（split）Cas9 RuvCドメインとHNHドメインに、Cas9タンパク質を分けることができると証明した。

ヌクレアーゼ効率または特異性を改善するために、異なるRNAガイドエンドヌクレアーゼまたはCasホモログに由来するRuvCドメインおよびHNHドメインも集められ得る。異なる種に由来するドメインは2つのタンパク質に分割されてもよく、互いに融合して変種Casタンパク質を形成してもよい。Cas9スプリット系は、誘導性のゲノム標的化方法に特に適しており、細胞内でのCas9過剰発現の潜在的な毒性作用を回避すると考えられる。実際に、第1のスプリットCas9ドメインを細胞に導入してもよく、好ましくは、前記スプリットドメインをコードするトランスジーンで前記細胞を安定に形質転換することによって導入してもよい。次いで、2つのスプリット部分が望ましい時間で細胞内に再び集まって、機能的Cas9タンパク質を再構成するように、Cas9の相補スプリット部分を細胞に導入してもよい。

野生型Cas9と比較してスプリットCas9のサイズを小さくすると、例えば、細胞透過性ペプチドを用いることによって、細胞に向けること（vectorization）および送達することが容易になる。異なるCasタンパク質に由来する再編成ドメイン（re-arranging domain）を用いると、例えば、S.ピオゲネスCas9とわずかに異なるPAMモチーフを標的とすることによって、特異性およびヌクレアーゼ活性を調節することが可能になる。

スプリットCas9系
RuvCドメインおよびHNHドメインの以前の特徴付けに促されて、本発明者らはスプリットCas9タンパク質を作り出すようにCas9タンパク質を操作した。驚いたことに、本発明者らは、これらの2つのスプリットCas9が一緒になって、または別々に、核酸標的を処理できることを示した。この観察から、スプリットCas9タンパク質を用いて新たなCas9系を開発することが可能になる。それぞれのスプリットCas9ドメインは別々に調製および使用することができる。従って、このスプリット系は、さらに短い、および/または不活性のタンパク質の送達を可能にする、RNAガイドエンドヌクレアーゼをT細胞に向けかつ送達するための、いくつかの利点を示し、かつ望ましい時間でT細胞においてゲノム操作を誘導するのに特に適しており、従って、組み込まれたCas9ヌクレアーゼの潜在的な毒性を制限する。

「スプリットCas9」とは、ここでは、RuvCドメインまたはHNHドメインのいずれかを含むCas9タンパク質またはCas9変種の短縮型または切断型を意味し、これらの両ドメインを含むCas9タンパク質またはCas9変種の短縮型または切断型を意味しない。このような「スプリットCas9」は独立してガイドRNAと共に用いられてもよく、例えば、1つのスプリットCas9がRuvCドメインを提供し、別のスプリットCas9がHNHドメインを提供するように補完的に用いられてもよい。RuvCドメインおよび/またはNHNドメインのいずれかを有する異なるスプリットRNAガイドエンドヌクレアーゼが一緒に用いられてもよい。

それぞれのCas9スプリットドメインは同じCas9ホモログに由来してもよく、異なるCas9ホモログに由来してもよい。多くのCas9ホモログがゲノムデータベースにおいて特定されている。

ゲノム操作方法として、本発明は、
（a）任意で細胞内にPAMモチーフを含む、標的核酸配列を選択する工程;
（b）標的核酸配列に相補的な配列を含むガイドRNAを準備する工程;
（c）少なくとも1つのスプリットCas9ドメインを準備する工程;
（d）スプリットCas9ドメインが細胞内の標的核酸配列を処理するように、ガイドRNAおよび前記スプリットCas9ドメインを細胞に導入する工程
を提供する。

前記Cas9スプリットドメイン（RuvCドメインおよびHNHドメイン）は細胞内の標的核酸配列を処理するように細胞に同時に導入されてもよく、連続して導入されてもよい。前記Cas9スプリットドメインおよびガイドRNAは、下記のように細胞透過性ペプチドまたは他のトランスフェクション方法を用いることによって細胞に導入されてもよい。

本発明の別の局面において、コンパクト（compact）Cas9と呼ばれる、たった1つのスプリットCas9ドメインが前記細胞に導入される。実際に、驚いたことに、本発明者らは、前記のRuvCモチーフを含むスプリットCas9ドメインが、HNHモチーフを含むスプリットドメインとは独立して標的核酸配列を切断できることを示した。従って、本発明者らは、ガイドRNAが標的核酸配列に結合するのにHNHドメインの存在を必要とせず、RuvCスプリットドメインが結合するのに十分に安定していると証明することができた。好ましい態様において、前記スプリットCas9ドメインは単独で前記標的核酸配列をニッキングすることができる。

それぞれのスプリットドメインは、N末端および/またはC末端において少なくとも1つの活性ドメインと融合されてもよい。前記活性ドメインは、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、転写活性化因子（例えば、VP64、VP16）、転写阻害剤（例えば、KRAB）、DNA末端処理酵素（例えば、Trex2、Tdt）、レポーター分子（例えば、蛍光タンパク質、lacZ、ルシフェラーゼ）からなる群より選択されてもよい。

HNHドメインは標的二本鎖DNAの一方の鎖のニッキングを担い、RuvC様RNアーゼHフォールドドメインは二本鎖核酸標的の（PAMモチーフを含む）他方の鎖のニッキングに関与する（Jinek, Chylinski et al. 2012）。しかしながら、野生型Cas9では、これらの2つのドメインは、PAMのすぐ近くにある、侵入DNAの同じ標的配列（プロトスペーサー）内に平滑末端切断をもたらす（Jinek, Chylinski et al. 2012）。Cas9はニッカーゼでもよく、様々な標的配列内においてニック事象を誘導する。

非限定的な例として、様々な標的配列内でニック事象を誘導するために、Cas9またはスプリットCas9はHNHドメインまたはRuvC様ドメインのいずれかの触媒残基に変異を含んでもよい。非限定的な例として、Cas9タンパク質の触媒残基は、アミノ酸D10、D31、H840、H868、N882、およびN891、またはCasファミリーメンバーのホモログにあるCLUSTALW法を用いてアラインメントされた位置に対応する触媒残基である。これらの残基は全て、他の任意のアミノ酸、好ましくはアラニン残基と交換することができる。触媒残基の変異とは、cas9の触媒ドメインの少なくとも1つの不活性化を誘導する、別のアミノ酸による置換またはアミノ酸の欠失もしくは付加を意味する。（参照）。特定の態様において、Cas9またはスプリットCas9は前記変異の1つまたはいくつかを含んでもよい。別の特定の態様において、スプリットCas9は2つのRuvC触媒ドメインおよびHNH触媒ドメインのうち1つしか含まない。本発明では、異なる種に由来するCas9、Cas9ホモログ、操作されたCas9、およびその機能的変種を使用することができる。本発明は、関心対象の遺伝子配列における核酸切断を行うために、任意のRNAガイドエンドヌクレアーゼまたはスプリットRNAガイドエンドヌクレアーゼ変種の使用を考える。

好ましくは、前記Cas9変種は、S.ピオゲネスのCas9と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列（COG3513-SEQ ID NO：3）を有する。

本発明の別の局面において、Cas9またはスプリットCas9にはヌクレオチド鎖切断活性がない。結果として生じるCas9またはスプリットCas9は標的核酸配列の相補配列を含むように設計されたガイドRNAと共発現される。ヌクレオチド鎖切断活性がないCas9が発現すると、関心対象の遺伝子が特異的にサイレンシングする。この系はクリスパー干渉（CRISPR interference）（CRISPRi）（Qi, Larson et al. 2013）と呼ばれる。サイレンシングとは、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形で発現されないことを意味する。サイレンシングは転写段階で起こってもよく、翻訳段階で起こってもよい。本発明によれば、サイレンシングは、転写を直接ブロックすることによって、さらに詳細には、転写伸長をブロックすることによって起こってもよく、任意のプロモーター内にある重要なシス作用モチーフを標的として、シス作用モチーフとコグネイトトランス作用転写因子との結合を立体的にブロックすることによって起こってもよい。ヌクレオチド鎖切断活性がないCas9は非機能的なHNHドメインおよびRuvCドメインを両方とも含む。特に、Cas9またはスプリットCas9ポリペプチドは、RuvC様ドメインおよびHNHドメインの触媒残基の不活性化変異を含む。例えば、切断Cas9活性に必要な触媒残基は、S.ピオゲネスのCas9（COG3513-SEQ ID NO：3）のD10、D31、H840、H865、H868、N882、およびN891でもよく、CasファミリーメンバーのホモログにあるCLUSTALW法を用いてアラインメントされた位置でもよい。HNHモチーフまたはRuvCモチーフに含まれる残基は、前段落に記載の残基でもよい。これらの残基は全て、他のアミノ酸のいずれか1つ、好ましくはアラニン残基と交換することができる。触媒残基の変異とは、cas9の触媒ドメインの少なくとも1つの不活性化を誘導する、別のアミノ酸による置換またはアミノ酸の欠失もしくは付加を意味する。

別の特定の態様において、Cas9またはそれぞれのスプリットドメインは、N末端および/またはC末端において少なくとも1つの活性ドメインと融合されてもよい。前記活性ドメインは、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、転写活性化因子（例えば、VP64、VP16）、転写阻害剤（例えば、KRAB）、DNA末端処理酵素（例えば、Trex2、Tdt）、レポーター分子（例えば、蛍光タンパク質、lacZ、ルシフェラーゼ）からなる群より選択されてもよい。

RNAガイドエンドヌクレアーゼ/ガイドRNA系の誘導性ヌクレアーゼ活性
T細胞における様々なRNAとの可能性のある非特異的相互作用および予想可能なオフサイト標的化によるT細胞内でのRNAガイドエンドヌクレアーゼの潜在的な毒性を考えて、本発明者らは、細胞内でRNAガイドエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を一過的に、理想的にはガイドRNAの寿命の間に誘導する解決策を探し求めた。

第一の解決策として、RNAガイドエンドヌクレアーゼを安定化型または不活性型で発現することができる。T細胞が産生する酵素によって活性化されると、またはT細胞内でそのポリペプチド構造が不安定化されると、この安定化型または不活性型が活性化型になる。条件付きのタンパク質安定性は、例えばエンドヌクレアーゼを、非限定的な例として、タンパク質コンホメーション変化が低分子によって誘導されるFKBP/ラパマイシン系に基づく安定化/不安定化タンパク質と融合することによって得ることができる。

エンドヌクレアーゼをロックまたはアンロックするために、エンドヌクレアーゼタンパク質と融合したタンパク質パートナーの化学的二量体化または光誘導性二量体化も使用することができる。

前で示唆したようにRNAガイドエンドヌクレアーゼが2つのポリペプチドに分割された場合、それぞれのスプリットはパートナータンパク質と融合されてもよい。両パートナータンパク質は低分子が添加されると二量体化し、生細胞内で活性エンドヌクレアーゼを再構成する。このような系は、非限定的な例として、二量体化パートナーとしてFKBB/FRBおよび低分子としてラパマイシンの使用に基づいてもよい。別の例として、エンドヌクレアーゼタンパク質に挿入された低分子または代謝産物に結合すると、大きなコンホメーション変化を受けることができるタンパク質（1本のポリペプチド鎖は2つの「スプリット」からなる）。低分子が結合（または非結合）すると、Cas9の活性コンホメーションと不活性コンホメーションが切り替わる。このような系は、非限定的な例として、カルモジュリンおよびCa2+の使用に基づいてもよい。

スプリットエンドヌクレアーゼの各半分はまた、感光性のパートナータンパク質とも融合されてよい。このような系は、非限定的な例として、クリプトクローム2（CRY2）および融合パートナーとしてCIB1を用いて青色光に頼ってもよく、紫外線-B光受容体UVR8およびCOP1融合パートナーを用いて紫外線に頼ってもよい。例えば、フィトクロームBおよびPIF6パートナー（赤色光で結合、遠赤色光で解離）および外因性PCB発色団を用いることで、光と化学物質の両方が組み合わされてもよい。

ガイドRNA
本発明の方法は、操作されたガイドRNAを準備する工程を含む。ガイドRNAは、相補配列を含む核酸配列に対応する。好ましくは、前記ガイドRNAは、別々に使用されてもよく、一緒に融合されてもよいcrRNAおよびtracrRNAに対応する。

天然のII型クリスパー系では、クリスパー標的化RNA（crRNA）標的化配列は、プロトスペーサーとして知られるDNA配列から転写される。プロトスペーサーは、細菌ゲノム内でクリスパーアレイと呼ばれるグループになってクラスター化している。プロトスペーサーは、短い回文反復によって分けられ、将来の遭遇に備えて記録のように保たれた、既知の外来DNAからなる短い配列（約20bp）である。crRNAを作り出すために、クリスパーアレイは転写され、反復間の個々の認識配列を分離するようにRNAはプロセシングされる。スペーサーを含有するクリスパー遺伝子座は長いプレcrRNAに転写される。クリスパーアレイ転写物（プレcrRNA）から個々のcrRNAへのプロセシングは、回文反復に相補的な配列を有するトランス活性化crRNA（tracrRNA）の存在に依存する。tracrRNAは、プレcrRNAのスペーサーを分けている反復領域にハイブリダイズして、内因性RNアーゼIIIによるdsRNA切断を開始し、その後に、Cas9によって各スペーサー内に別の切断事象が起こり、それによって、tracrRNAとCas9が結合したままの成熟crRNAが生じ、Cas9-tracrRNA：crRNA複合体が形成される。操作されたcrRNAとtracrRNAは、選択された核酸配列を標的とすることができ、それによって、RNアーゼIIIとcrRNAプロセシング全体が不要になる（Jinek, Chylinski et al. 2012）。

本発明では、crRNAは、標的核酸配列を標的とすることができるように、好ましくは標的核酸配列を切断できるように、標的核酸の一部に相補的な配列を含むように操作される。特定の態様において、crRNAは、標的核酸配列に相補的な5〜50ヌクレオチド、好ましくは12ヌクレオチドの配列を含む。さらに詳細な態様において、crRNAは、標的核酸配列に相補的な少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは12ヌクレオチドを含む少なくとも30ヌクレオチドの配列である。

別の局面において、crRNAは、標的核酸に相補的な、さらに長い配列を含むように操作されてもよい。実際に、本発明者らは、ガイドRNAだけを用いて、RuvCスプリットCas9ドメインが標的核酸配列を切断できることを示した。従って、ガイドRNAは、HNHスプリットCas9ドメインの非存在下で標的核酸配列に結合することができる。crRNAは、HNHスプリットドメイン結合の安定効果を生じる必要がなく、DNA-RNA二重鎖間のアニーリングを高めるために、さらに長い相補配列、好ましくは20bp超を含むように設計されてもよい。従って、crRNAは、20bp超の、標的核酸配列に対する相補配列を含んでもよい。このようなcrRNAはCas9活性の特異性を高めることを可能にする。

標的化高率を改善するために、crRNAはまた、5'末端に、後ろに4〜10ヌクレオチドが続く相補配列を含んでもよい（Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）。好ましい態様では、crRNAの相補配列の後ろには、3'末端に、反復配列または3'延長配列と呼ばれる核酸配列が続く。

2つの異なる遺伝子に対する別々の相補領域をもち、両遺伝子を標的とした、いくつかのcrRNAの共発現を同時に使用することができる。従って、特定の態様では、crRNAは、異なる標的核酸配列を同時に認識するように操作されてもよい。この場合、同じcrRNAが、異なる標的核酸配列の一部に相補的な少なくとも2つの別々の配列を含む。好ましい態様において、前記相補配列の間隔は反復配列によってあけられる。

本発明のさらなる態様として、特に、T細胞内での前記ガイドRNAの安定性を改善するために、前記ガイドRNAはペプチド核酸（PNA）またはロックド核酸（LNA）によって生じる。

PAMモチーフ
本発明における潜在的な選択された標的核酸配列は全て、3'末端に、プロトスペーサー隣接モチーフまたはプロトスペーサー関連モチーフ（PAM）と呼ばれる特定の配列を有する場合がある。PAMは標的となる核酸配列に存在するが、これを標的とするように作製されたcrRNAには存在しない。好ましくは、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）は、リーダー遠位末端においてプロトスペーサーにすぐ接して始まるかまたはプロトスペーサーの近くにある2〜5個のヌクレオチドに対応する場合がある。PAMの配列および場所は様々な系によって異なる。PAMモチーフは、例えば、非限定的な例として、NNAGAA、NAG、NGG、NGGNG、AWG、CC、CC、CCN、TCN、TTCでもよい（Shah SA, RNA biology 2013）。異なるII型系が異なるPAM要件を有する。例えば、S.ピオゲネス系はNGG配列を必要とし、式中、Nは任意のヌクレオチドでよい。S.サーモフィラスII型系はNGGNG（Horvath and Barrangou 2010）およびNNAGAAW（Deveau, Barrangou et al. 2008）を必要とするのに対して、異なるS.変異体系はNGGまたはNAAR（Van der Ploeg 2009）を許容する。PAMは、プロトスペーサーに隣接する領域に限定されず、プロトスペーサーの一部でもよい（Mojica, Diez-Villasenor et al. 2009）。特定の態様において、Cas9タンパク質はPAMモチーフを全く認識しないように操作されてもよく、非天然PAMモチーフを認識するように操作されてもよい。この場合、選択された標的配列は、アミノ酸の任意の組み合わせを持つさらに小さなPAMモチーフまたはさらに大きなPAMモチーフを含んでもよい。好ましい態様において、選択された標的配列は、本発明によるCas9変種が認識する少なくとも3個、好ましくは、4個、より好ましくは5個のヌクレオチドを含むPAMモチーフを含む。

2つの異なる遺伝子に対する別々の相補領域をもち、両遺伝子を標的とした、いくつかのcrRNAの共発現を、同時に使用することができる。従って、特定の態様では、crRNAは異なる標的核酸配列を同時に認識するように操作されてもよい。この場合、同じcrRNAが、異なる標的核酸配列の一部に相補的な少なくとも2つの別々の配列を含む。好ましい態様において、前記相補配列の間隔は反復配列によってあけられる。

本発明によるcrRNAはまた、二次構造の安定性および/またはCas9に対するcrRNAの結合親和性を高めるように改変されてもよい。特定の態様において、crRNAは2',3'-環式リン酸を含んでもよい。2',3'-環式リン酸末端は、多くの細胞プロセス、すなわち、tRNAスプライシング、いくつかのリボヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖切断、RNAリボザイムによる自己切断、ならびに小胞体内での折り畳まれていないタンパク質の蓄積および酸化ストレスを含む様々な細胞ストレスに対する応答に関与するように見える（Schutz, Hesselberth et al. 2010）。本発明者らは、2',3'-環式リン酸がcrRNAの安定性またはCas9に対するcrRNAの親和性/特異性を高めていると推測した。従って、本発明は、2',3'-環式リン酸を含む改変されたcrRNA、および改変されたcrRNAを用いた、クリスパー/cas系（Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）に基づくゲノム操作のための方法に関する。

ガイドRNAはまたトランス活性化クリスパーRNA（TracrRNA）も含んでよい。本発明によるトランス活性化クリスパーRNAは、crRNAの3'延長配列の少なくとも一部と塩基対合して、ガイドRNA（gRNA）とも呼ばれるtracrRNA:crRNAを形成することができるアンチリピート配列を特徴とする。tracrRNAは、crRNAのある領域に相補的な配列を含む。crRNAおよびtracrRNAの融合を含み、tracrRNA-crRNA複合体を模倣するヘアピンを形成するガイドRNA（Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）を用いて、Cas9 エンドヌクレアーゼを介した標的核酸切断を誘導することができる。ガイドRNAは、2つの標的核酸配列の一部に相補的であり、好ましくは反復配列によって間隔があけられた2つの別々の配列を含んでもよい。

相同組換え
ヌクレオチド鎖切断は相同組換えの割合を刺激することが知られている。従って、別の好ましい態様において、本発明は、RNAガイドエンドヌクレアーゼを用いることによって核酸標的配列内の相同遺伝子標的化を誘導するための方法に関する。この方法は、相同組換えが標的核酸配列と外因性核酸との間で発生するように、少なくとも標的核酸配列の一部に相同な配列を含む外因性核酸を細胞（例えば、ドナーDNA）に供給する工程をさらに含んでもよい。

特定の態様において、前記外因性核酸は、標的核酸配列の5'側の領域と相同な第1の部分および3'側の領域と相同な第2の部分を含む。これらの態様における前記外因性核酸はまた、標的核酸配列の5'側および3'側の領域と相同でない、第1の部分と第2の部分との間に配置される第3の部分も含む。標的核酸配列が切断された後に、標的核酸配列と外因性核酸との間で相同組換え事象が刺激される。好ましくは、少なくとも50bp、好ましくは100bp超、より好ましくは200bp超の相同配列が前記ドナーマトリックス内で用いられる。従って相同配列は、好ましくは200bp〜6000bp、より好ましくは1000bp〜2000bpである。実際には、共有される核酸相同性は切断部位の上流および下流に隣接する領域に配置され、導入しようとする核酸配列は、これらの2つのアーム（arm）の間に配置しなければならない。

切断事象が起こった標的核酸配列の場所に応じて、このような外因性核酸は、例えば、外因性核酸が前記遺伝子のオープンリーディングフレーム内部に配置された場合、遺伝子をノックアウトするのに用いられてもよく、関心対象の新たな配列もしくは遺伝子を導入するのに用いられてもよい。このような外因性核酸の使用による配列挿入は、前記遺伝子の訂正または交換（非限定的な例として対立遺伝子の入れ替え）によって、既存の標的とする遺伝子を改変するのに用いられてもよく、前記標的とする遺伝子の訂正または交換（非限定的な例としてプロモーターの入れ替え）によって、標的とする遺伝子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするのに用いられてもよい。

送達方法
本発明の方法は、関心対象の分子、例えば、ガイドRNA（crRNA、tracrRNa、または融合ガイドRNA）、スプリットCas9、Cas9、外因性核酸、DNA末端処理酵素を細胞に導入することを伴う。RNAをコードするベクター内に含まれるポリヌクレオチド、好ましくはトランスジーン、またはポリペプチドを細胞に導入した結果として、ガイドRNA、スプリットCas9、Cas9、外因性核酸、DNA末端処理酵素、または関心対象の他の分子はインサイチューで細胞内で合成されてもよい。または、関心対象の分子は細胞外で産生され、次いで、細胞に導入される場合がある。

本発明者らは、薬剤/化学物質および分子（タンパク質および核酸）を細胞内に、または細胞下区画に送達するために、非限定的な例として、リポソーム送達手段、ポリマー担体、化学的担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、エマルジョン、天然のエンドサイトーシス、または食作用経路、ならびにエレクトロポレーションなどの物理的方法を含む当技術分野において公知の任意の手段を使用できると考えた。

本発明の好ましい態様として、本発明のRNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、エレクトロポレーションによって、細胞に直接導入されるmRNAの形式でトランスフェクトされる。本発明者らは、表1に示すT細胞におけるmRNAエレクトロポレーションに最適な様々な条件を確かめた。本発明者は、パルス電場を用いることで、材料を細胞に送達するために生細胞を一過的に透過処理するのを可能にするcytoPulse技術を使用した。この技術は、PulseAgile（Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA）エレクトロポレーション波形の使用に基づいており、パルス持続時間、強度、ならびにパルス間の間隔の正確な制御を与える（米国特許第6,010,613号およびWO2004083379）。高いトランスフェクション効率と最低限の死のための最高条件に達するために、これらのパラメータは全て変更することができる。基本的には、最初の高電場パルスによって孔が形成するのに対して、その後の低電場パルスによってポリヌクレオチドは細胞内に移動する。本発明の一局面において、本発明者は、T細胞におけるmRNAの>95％トランスフェクション効率の達成につながった工程、およびT細胞において様々な種類のタンパク質を一過的に発現させるためのエレクトロポレーションプロトコールの使用について説明する。特に、本発明は、T細胞を形質転換する方法に関し、本方法は、前記T細胞をRNAと接触させる工程と、
（a）電圧範囲が2250〜3000V/センチメートルであり、パルス幅が0.1msであり、工程（a）の電気パルスと（b）の電気パルスとの間のパルス間隔が0.2〜10msである、1回の電気パルス、
（b）電圧範囲が2250〜3000Vであり、パルス幅が100msであり、工程（b）の電気パルスと工程（c）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス、;および
（c）電圧が325Vであり、パルス幅が0.2msであり、4回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをT細胞に適用する工程を含む。

特定の態様において、T細胞を形質転換する方法は、前記T細胞をRNAと接触させる工程と、
（a）電圧が2250V、2300V、2350V、2400V、2450V、2500V、2550V、2400V、2450V、2500V、2600V、2700V、2800V、2900V、または3000V/センチメートルであり、パルス幅が0.1msであり、工程（a）の電気パルスと（b）の電気パルスとの間のパルス間隔が0.2ms、0.5ms、1ms、2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms、8ms、9ms、または10msである、1回の電気パルス、
（b）電圧範囲が2250V、2250V、2300V、2350V、2400V、2450V、2500V、2550V、2400V、2450V、2500V、2600V、2700V、2800V、2900V、または3000Vであり、パルス幅が100msであり、工程（b）の電気パルスと工程（c）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス、および
（c）電圧が325Vであり、パルス幅が0.2msであり、4回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをT細胞に適用する工程とを含む。

前記の値の範囲に含まれる任意の値が本願において開示される。エレクトロポレーション培地は当技術分野において公知の任意の適切な培地でよい。好ましくは、エレクトロポレーション培地の伝導率は0.01〜1.0ミリシーメンスの範囲である。

（表１）PBMC由来T細胞におけるエレクトロポレーションに必要な最低電圧を求めるために使用した様々なcytopulseプログラム

ウイルス形質導入
本発明よれば、RNAガイドエンドヌクレアーゼをコードする核酸および/またはガイドRNAとして用いられる転写物の形質導入のために以下で定義されるウイルスベクターを使用することは、前のトランスフェクション手段の考えられる代案であると見出された。ウイルス形質導入のための方法は当技術分野において周知である。しかしながら、このような方法は、T細胞ゲノムにレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが安定に組み込まれることと、その結果としてエンドヌクレアーゼが長期間にわたって発現されることにより、現状では、いくつかの制約に遭遇する可能性がある。このことは、RNAガイドによって付与される特異性レベルに応じてT細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。

RNAガイドエンドヌクレアーゼのウイルスキャプシド形成を用いた偽形質導入
RNAガイドエンドヌクレアーゼをT細胞内の作用部位に送達する既存の手段および材料の短所のいくつかを考えて、本発明者らは、代替の送達方法、特に、前記ポリペプチドウイルス成分と融合することによってRNAガイドエンドヌクレアーゼがポリペプチドの形で導入される送達方法を探し求めてきた。一例として、RNAガイドエンドヌクレアーゼはVprまたはVpxなどのHIVプレインテグレーション複合体タンパク質と融合されてもよい。従って、ポリペプチドの形をとったRNAガイドエンドヌクレアーゼは、ウイルス侵入およびカプセル除去（decapsulation）後に細胞内に放出されたらすぐに宿主細胞ゲノム内の特定の標的に働くことができる。

治療用途の場合、前述のレトロウイルス成分が日和見性ウイルス感染症の「ヘルパータンパク質」であるので、その使用が問題を提起することがある。本発明者らは代案を予期せず発見することができた。本発明者らは、ビリオン集合中にRNAガイドエンドヌクレアーゼ、特にCas9をレンチウイルスベクター粒子に組み込むことができ、このようなウイルスベクターによる標的細胞の感染後に標的ゲノムを改変するように働くには、このような「自己」組み込みエンドヌクレアーゼで十分であることを観察した。

本発明のこの局面によれば、以下の工程:
（a）エンドヌクレアーゼの存在下で少なくとも1つのウイルスベクターを組み立てる工程であって、前記エンドヌクレアーゼが、好ましくは、どんなレンチウイルス成分とも融合されない工程、
（b）少なくとも1つの標的細胞を前記ウイルスベクターと接触させる工程、
（c）前記標的細胞による前記ウイルスベクターの内部移行後に、前記ヌクレアーゼが、前記少なくとも1つの標的細胞のゲノム内にある少なくとも1種類の特定の標的を認識および切断する工程
の1つまたはいくつかを伴うゲノム操作方法が提供される。

本発明によれば、ウイルスベクターには、ウイルス、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス）ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスに由来するウイルスベクターが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルス（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）が含まれる。「ウイルスベクター」または「ベクター」という用語は、核酸分子および/もしくはペプチドまたは他の分子を標的細胞に導入するのに使用することができる改変されたウイルス粒子を指す。

本発明者らは、RNAガイドエンドヌクレアーゼが細胞質に導入された後に、その活性を保持し、容易にガイドRNAと結合できることを示した。前記ガイドRNAもビリオン集合中にキャプシド形成され、それによって、T細胞の細胞質内に同時に放出されてもよい。

本発明のさらなる局面によれば、ウイルスベクターは、レンチウイルスまたはレトロウイルスをベースとするベクター（LV）、好ましくは、非組み込み型ウイルスベクターである。LVは、ウイルス遺伝物質を取り囲む、一般にヌクレオキャプシドコアと呼ばれる内側タンパク質コアと外側脂質膜を含む複製欠損ウイルス粒子である。これらの複製欠損ウイルス粒子は、パッケージング細胞内でレンチウイルスのgag遺伝子およびpol遺伝子によってコードされるタンパク質を発現することによって組み立てられる。gag遺伝子およびpol遺伝子は、ポリタンパク質、およびこれらのポリタンパク質を処理してウイルス粒子の個々の成分にするプロテアーゼをコードする。

NLSは、タンパク質を核膜孔複合体を通って細胞核に移動するように働くアミノ酸配列であり、RNAガイドエンドヌクレアーゼの送達効率を改善するためにRNAガイドエンドヌクレアーゼと融合されてもよい。典型的に、NLSは、リジンまたはアルギニンなどの正荷電アミノ酸からなる1つまたは複数の短い配列、例えば、公知のタンパク質SV40ラージT抗原に由来する短い配列-PKKKRKV-、ヌクレオプラスミンに由来する短い配列-KR[PAATKKAGQA]KKKK-、p54に由来する短い配列-RIRKKLR-、SOX9に由来する短い配列-PRRRK-、NS5Aに由来する短い配列-PPRKKRTVV-からなる。

本発明によるRNAガイドエンドヌクレアーゼのこの使用とは独立して、前記のウイルスキャプシド形成方法を、ウイルスベクターが感染することができるあらゆるタイプの細胞について、TAL-ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼなどの他のタイプのレアカッティングエンドヌクレアーゼに広げることができる。

細胞透過性ペプチド送達方法
本発明の一部として、本発明者らは、さらなる送達方法、特にRNAガイドおよび/またはRNAガイドエンドヌクレアーゼをT細胞に導入するための細胞透過性ペプチド（CPP）の使用を調べた。

従って、本発明の方法は、RNAガイドおよび/またはRNAガイドエンドヌクレアーゼと連結した細胞透過性ペプチドを含む組成物を調製する工程を含んでもよい。これらの分子と、前記CPP、好ましくはCPPのN末端またはC末端も、結合することができる。この結合は共有結合でもよく非共有結合でもよい。CPPは、2つの主要なクラスにさらに分けることができる。第1のクラスは分子と化学的連結を必要とし、第2のクラスは安定な非共有結合複合体の形成を伴う。共有結合したCPPは、化学的な架橋結合（例えば、ジスルフィド結合）によって、またはクローニング後にCPP-RNAガイドエンドヌクレアーゼ融合タンパク質を発現させることによって、共有結合結合体を形成する。好ましい態様において、前記CPPは、チオール修飾分子がCPPとジスルフィド結合を形成するようにピリジルジスルフィド機能を有する。前記ジスルフィド結合は、特に、細胞質などの還元環境において切断することができる。非共有結合CPPは優先的に両親媒性ペプチドである。

CPPの定義は常に発展しているが、概してタンパク質またはキメラ配列に由来し、受容体非依存的に細胞膜を通過して極性親水性生体分子を輸送することができる35アミノ酸未満の短いペプチドだと述べられている。CPPは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチかつ抗菌性の配列を有するペプチド、およびキメラペプチドまたは二分ペプチド（bipartite peptide）（Pooga and Langel 2005）でもよい。特定の態様において、カチオン性CPPは複数の塩基性またはカチオン性のCPP（例えば、アルギニンおよび/またはリジン）を含んでもよい。好ましくは、CCPは両親媒性であり、正味の正電荷を有する。CPPは生体膜を透過し、様々な生体分子が細胞膜を通過して細胞質内に移動するのを誘発し、様々な生体分子の細胞内輸送を改善し、それによって、標的との相互作用を容易にすることができる。CPPの例には、ヒト免疫不全症ウイルス1型（HIV-1）によるウイルス複製に必要な101アミノ酸タンパク質である核転写活性化因子タンパク質であるTat、ドロソフィリア（Drosophilia）のホメオタンパク質アンテナペディア（Antennapedia）の3番目のヘリックスに対応するペネトラチン、カポジ線維芽細胞増殖因子（FGF）シグナルペプチド配列、インテグリンβ3シグナルペプチド配列、グアニンリッチ分子輸送体、MPG、pep-1、スィートアロー（sweet arrow）ペプチド、ダーマセプチン、トランスポータン、pVEC、ヒトカルシトニン、マウスプリオンタンパク質（mPrPr）、ポリアルギニンペプチドArgs配列、単純ヘルペスウイルスに由来するVP22タンパク質、抗菌ペプチドブフォリン（Buforin）I、およびSynB（US2013/0065314）が含まれ得る。新たなCPP変種が様々な伝達ドメインに結合することができる。

非アロ反応性T細胞
T細胞受容体（TCR）は、抗原提示に応答したT細胞活性化に関与する細胞表面受容体である。TCRは概して、集合してヘテロ二量体を形成する2本のα鎖およびβ鎖から作られ、CD3伝達サブユニットと結合して、細胞表面に存在するT細胞受容体複合体を形成する。TCRのα鎖およびβ鎖はそれぞれ、免疫グロブリンに似たN末端可変（V）領域および定常（C）領域、疎水性膜貫通ドメイン、ならびに短い細胞質領域からなる。免疫グロブリン分子と同様に、α鎖およびβ鎖の可変領域は、T細胞集団内に抗原特異性の大きな多様性を生み出すV（D）J組換えによって生じる。しかしながら、インタクトな抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、T細胞は、MHC分子と結合した処理ペプチド断片によって活性化される。これによって、MHC拘束として知られる、T細胞による抗原認識にさらなる要素を導入される。T細胞受容体を介してドナーとレシピエントとのMHC不一致が認識されると、T細胞が増殖し、場合によってはGVHDが発症する。正常なTCR表面発現は、複合体の7つ全ての成分の協調した合成および集合に依存することが示されている（Ashwell and Klusnor 1990）。TCRαまたはTCRβを不活性化すると、T細胞表面からTCRが無くなり、それによって、アロ抗原の認識を阻止し、従って、GVHDを阻止することができる。しかしながら、TCRが破壊されると概してCD3シグナル伝達成分が無くなり、さらなるT細胞増殖の手段が変化する。

本発明の主な目的の1つは、免疫療法において使用するために非アロ反応性T細胞を操作するための方法において前記のRNAガイドエンドヌクレアーゼを使用することである。

この方法は、さらに詳細には、特異的ガイドRNAと結合したRNAガイドエンドヌクレアーゼを用いることでT細胞受容体（TCR）の少なくとも1つの成分を不活性化することによって、前記のT細胞を改変する工程を含む。

同種異系T細胞の生着は、TCR成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化することによって可能になる。TCRα遺伝子および/またはTCRβ遺伝子を不活性化することによって、TCRは細胞内で機能しなくなる。同種異系T細胞におけるTCR不活性化はGvHDを阻止または軽減することを目的とする。

遺伝子を不活性化するとは、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形で発現されないことが意図される。特定の態様において、前記方法の遺伝子組換えは、標的とするある遺伝子の切断を触媒し、それによって、この標的とする遺伝子を不活性化するような、操作しようとする準備された細胞におけるRNAガイドエンドヌクレアーゼの発現に頼る。該エンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖切断は、概して、相同組換え末端結合または非相同末端結合（NHEJ）の別々の機構によって修復される。しかしながら、NHEJは、切断部位のDNA配列を変えることが多い不完全な修復プロセスである。機構は、直接的な再連結（Critchlow and Jackson 1998）によって、または、いわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003）を介して2つのDNA末端の残存物を再結合することを伴う。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は小さな挿入または欠失をもたらすことが多く、特異的遺伝子ノックアウトを作り出すことに使用することができる。前記組換えは少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加でもよい。切断によって誘導される変異誘発事象、すなわち、NHEJ事象に続く変異誘発事象が起こった細胞は、当技術分野において周知の方法によって特定および/または選択することができる。

本発明者らは、TCRをコードする3つのエキソンの中に適切な標的配列を決定した。これにより、切断効率を保持しながら毒性を大幅に低減することが可能になった。好ましい標的配列を表2に示した（TCR陰性細胞の割合が低い場合+、割合が中程度の場合++、割合が高い場合+++）。

（表２）T細胞においてCas9を用いるガイドRNAの適切な標的配列

薬物耐性T細胞を操作するための方法
癌療法および同種異系T細胞の選択的生着を改善するために、操作されたT細胞に薬物耐性を付与して、操作されたT細胞を化学療法または免疫抑制剤の毒性副作用から保護することができる。実際に、本発明者らは、ほとんどの患者が、T細胞免疫療法を伴う試験の前に治療の標準として化学療法および免疫枯渇剤（immune depleting agent）による処置を受けたことを観察した。本発明者らは、処置前に細胞をエクスビボで増殖させるために培養培地中に化学療法薬物を添加すること、または化学療法もしくは免疫抑制処置を受けている患者においてインビボで操作されたT細胞の選択的増殖物を得ることのいずれかによって、これらの処理を利用して操作されたT細胞の選択を助けることができることも発見した。

薬物感受性細胞と比べて、薬物耐性遺伝子を発現するT細胞が生き残り、増殖するので、T細胞の薬物耐性はインビボまたはエクスビボでT細胞の濃縮も可能にする。特に、本発明は、
（a）T細胞を準備する工程、
（b）少なくとも1種類の薬物を選択する行程、
（c）薬物耐性を前記T細胞に付与するようにT細胞を改変する工程、
（d）前記操作されたT細胞を前記薬物の存在下で増殖させる工程
を含む、免疫療法のために同種異系かつ薬物耐性のT細胞を操作する方法に関する。任意で、前の工程は、以前に述べられた、
（e）T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化することによって前記T細胞を改変する工程、
（f）細胞表面にTCRを発現しない、形質転換されたT細胞を分別する工程
と組み合わされてもよい。

従って、本発明の一局面によれば、前記方法は、T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化する工程と、薬物、さらに詳細には化学療法薬剤に対する耐性を付与するように前記T細胞をさらに改変する工程を含む。薬物耐性は、薬物耐性遺伝子を発現させることによってT細胞に付与することができる。薬物耐性を細胞に付与する、いくつかの遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ2（IMPDH2）、カルシニューリン、またはメチルグアニントランスフェラーゼ（MGMT）の変種対立遺伝子が同定されている。前記薬物耐性遺伝子は、前記遺伝子をコードするトランスジーンを細胞に導入することによって細胞内で発現されてもよく、相同組換えによって前記薬物耐性遺伝子を細胞ゲノムに組み込むことによって細胞内で発現されてもよい。

薬物耐性は、薬物に対する細胞の感受性を担う1種または複数種の遺伝子（薬物感受性遺伝子）、例えばヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子（GenBank: M26434.1）を不活性化することによって、T細胞に付与することができる。特に、細胞分裂停止性の代謝産物である6-チオグアニン（6TG）に対する耐性を付与するために、操作されたT細胞においてHPRTを不活性化することができる。6-チオグアニン（6TG）は、HPRTによって、現在、癌患者、特に白血病患者を処置するのに用いられている細胞傷害性チオグアニンヌクレオチドに変換される（Hacke, Treger et al. 2013）。別の例では、通常、T細胞表面に発現しているCD3を不活性化すると、テプリズマブなどの抗CD3抗体に対する耐性を付与することができる。

その他の場合では、前記薬物耐性は、少なくとも1種類の薬物耐性遺伝子を発現させることによってT細胞に付与することができる。前記薬物耐性遺伝子とは、化学療法剤（例えば、メトトレキセート）などの薬剤に対する「耐性」をコードする核酸配列を指す。言い換えると、細胞内で薬物耐性遺伝子を発現させると、薬物耐性遺伝子のない対応する細胞を増殖させるより多量に、薬剤の存在下で細胞を増殖させることが可能になる。本発明の薬物耐性遺伝子は、代謝拮抗物質、メトトレキセート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、その類似体または誘導体などに対する耐性をコードしてもよい。

標的とする細胞に薬物耐性を付与するのに潜在的に使用することができる、いくつかの薬物耐性遺伝子が同定されている（Takebe, Zhao et al. 2001 ; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007）。

薬物耐性遺伝子の一例はまたジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の変異型または改変型でもよい。DHFRは、細胞内のテトラヒドロ葉酸量の調節に関与し、DNA合成に必須の酵素である。メトトレキセート（MTX）などの葉酸類似体は、DHFRを阻害し、従ってクリニックにおいて抗悪性腫瘍剤として用いられる。療法において用いられる葉酸代謝拮抗剤による阻害に対する耐性を高めた様々なDHFR変異型が述べられている。特定の態様において、本発明による薬物耐性遺伝子は、葉酸代謝拮抗剤処置、例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与する少なくとも1つの変異を含む、ヒト野生型DHFRの変異型をコードする核酸配列（GenBank: AAH71996.1）でもよい。特定の態様において、DHFR変異型は、位置G15、L22、F31、またはF34、好ましくは、位置L22またはF31に少なくとも1つの変異アミノ酸を含む（（Schweitzer, Dicker et al. 1990）; 国際出願 W094/24277; 米国特許第6,642,043号）。

本明細書で使用する「葉酸代謝拮抗剤」または「葉酸類似体」は、ある程度のレベルで葉酸代謝経路を妨害するように向けられた分子を指す。葉酸代謝拮抗剤の例には、例えば、メトトレキセート（MTX）; アミノプテリン; トリメトレキセート（Neutrexin（登録商標））; エダトレキサート; N10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸（CB3717）; ZD1694（Tumodex）、5,8-ジデアザイソ葉酸（IAHQ）; 5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸（DDATHF）; 5-デアザ葉酸; PT523（Nα-（4-アミノ-4-デオキシプテロイル）-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン）; 10-エチル-10-デアザアミノプテリン（DDATHF、ロマトレキソール（lomatrexol））; ピリトレキシム; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; ペメトレキサート（Pemetrexate）およびPDX（10-プロパルギル-10-デアザアミノプテリン）が含まれる。

薬物耐性遺伝子の別の例はまた、グアノシンヌクレオチド新規合成における律速酵素であるイオニシン（ionisine）-5'-一リン酸デヒドロゲナーゼII（IMPDH2）の変異型または改変型でもよい。IMPDH2の変異型または改変型はIMPDH阻害剤耐性遺伝子である。IMPDH阻害剤はミコフェノール酸（MPA）またはそのプロドラッグであるミコフェノール酸モフェチル（MMF）でもよい。変異IMPDH2は、野生型ヒトIMPDH2（NP_000875.2）のMAP結合部位に、IMPDH阻害剤耐性を大幅に高める少なくとも1つの変異、好ましくは2つの変異を含んでもよい。変異は、好ましくは、位置T333および/またはS351（Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013）にある。特定の態様において、位置333のスレオニン残基はイソロイシン残基と交換され、位置351のセリン残基はチロシン残基と交換される。

別の薬物耐性遺伝子は変異型カルシニューリンである。カルシニューリン（PP2B）は、多くの生物学的プロセスに関与し、T細胞活性化の中心をなす広範に発現しているセリン/スレオニンプロテインホスファターゼである。カルシニューリンは、触媒サブユニット（CnA;3種類のアイソフォーム）および調節サブユニット（CnB;2種類のアイソフォーム）からなるヘテロ二量体である。T細胞受容体が結合した後に、カルシニューリンは転写因子NFATを脱リン酸化し、転写因子NFATは核およびIL2などの活発な重要標的遺伝子に移動できるようになる。FKBP12と複合体化したFK506、またはCyPAと複合体化したシクロスポリンA（CsA）は、カルシニューリン活性部位にNFATが接近するのをブロックし、NFATの脱リン酸を阻止し、それによってT細胞活性化を阻害する（Brewin, Mancao et al. 2009）。本発明の薬物耐性遺伝子は、FK506および/またはCsAなどのカルシニューリン阻害剤に対して耐性のカルシニューリン変異型をコードする核酸配列でもよい。特定の態様において、前記変異型は、野生型カルシニューリンヘテロ二量体aの位置:V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360に少なくとも1つの変異アミノ酸、好ましくは、位置T351およびL354またはV314およびY341に二重変異を含んでもよい。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は、野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体のアミノ酸の位置で表されることが多い（GenBank: ACX34092.1）。

別の特定の態様において、前記変異型は、野生型カルシニューリンヘテロ二量体bの位置:V120、N123、L124、またはK125に少なくとも1つの変異アミノ酸、好ましくは、位置L124およびK125に二重変異を含んでもよい。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は、野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体bポリペプチドのアミノ酸の位置で表されることが多い（GenBank: ACX34095.1）。

別の薬物耐性遺伝子は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ（hAGT）をコードするO（6）-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（MGMT）である。AGTは、アルキル化剤、例えば、ニトロソ尿素およびテモゾロミド（TMZ）の細胞傷害作用に対する耐性を付与するDNA修復タンパク質である。6-ベンジルグアニン（6-BG）は、ニトロソ尿素の毒性を増強し、この薬剤の細胞傷害作用を増強するためにTMZと同時投与されるAGT阻害剤である。AGT変種をコードするいくつかのMGMT変異型は、6-BGによる不活性化に対して高度に耐性があるが、DNA損傷を修復する能力を保持している（Maze, Kurpad et al. 1999）。特定の態様において、AGT変異型は野生型AGT位置P140の変異アミノ酸を含んでもよい（UniProtKB: P16455）。

別の薬物耐性遺伝子は多剤耐性タンパク質1（MDR1）遺伝子でもよい。この遺伝子は、細胞膜を通過する代謝副産物の輸送に関与するP-糖タンパク質（P-GP）として知られる膜糖タンパク質をコードする。P-Gpタンパク質は、構造が関係しない数種類の化学療法剤に対して広い特異性を示す。従って、MDR-1（NP_000918）をコードする核酸配列を発現させることによって薬物耐性を細胞に付与することができる。

薬物耐性遺伝子はまた、ble遺伝子またはmcrA遺伝子などの細胞傷害性抗生物質でもよい。免疫細胞におけるble遺伝子またはmcrAの異所的発現は、それぞれ、化学療法剤であるブレオマイシンまたはマイトマイシンCに曝露されたときに選択上の利点をもたらす。

免疫抑制剤に関して、本発明は、可能性のある任意の工程:
（a）好ましくは細胞培養物または血液試料から、T細胞を準備する工程、
（b）前記T細胞の中にある、免疫抑制剤の標的を発現する遺伝子を選択する工程、
（c）前記免疫抑制剤の標的をコードする前記遺伝子を、DNA切断、好ましくは二本鎖切断によって、選択的に不活性化することができるRNAガイドエンドヌクレアーゼを前記T細胞に導入する工程、
（d）任意で前記免疫抑制剤の存在下で、前記細胞を増殖させる工程
を提供する。

さらに好ましい態様では、前記方法は、T細胞受容体（TCR）の成分を不活性化する工程を含む。

免疫抑制剤は、いくつかの作用機序の1つによって免疫機能を抑制する薬剤である。言い換えると、免疫抑制剤は、免疫応答の程度および/または貪食を減らす能力によって示される化合物が果たす役割である。非限定的な例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシン標的、インターロイキン-2α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド、または免疫抑制性代謝拮抗物質でもよい。古典的な細胞傷害性免疫抑制剤はDNA合成を阻害することによって作用する。その他の免疫抑制剤はT細胞を活性化することによって作用してもよく、ヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用してもよい。本発明による方法を用いると、T細胞内にある免疫抑制剤の標的を不活性化することによって、免疫療法のためにT細胞に免疫抑制耐性を付与することが可能になる。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、免疫抑制剤の受容体、例えば、CD52、グルココルチコイド受容体（GR）、FKBPファミリー遺伝子メンバー、およびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーでもよい。

免疫能力のある宿主では、同種異系細胞は通常、宿主免疫系によって素早く拒絶される。放射線照射されていない血液製剤に存在する同種異系白血球はわずか5〜6日間しか残らないことが証明されている（Boni, Muranski et al. 2008）。従って、同種異系細胞の拒絶反応を阻止するためには、宿主免疫系を効果的に抑制しなければならない。免疫抑制のためにグルココルチコイドステロイドが治療に広く用いられる（Coutinho and Chapman 2011）。このクラスのステロイドホルモンは、T細胞サイトゾルに存在するグルココルチコイド受容体（GR）に結合し、その結果、核に移行し、免疫プロセスに関与する多数の遺伝子の発現を調節する特定のDNAモチーフに結合する。T細胞をグルココルチコイドステロイドで処理するとサイトカイン産生レベルが低下し、それによって、T細胞アネルギーが発生し、T細胞活性化が妨害される。アレムツズマブはCAMPATH1-Hとしても知られ、12アミノ酸のグリコシルホスファチジル-イノシトール-（GPI）結合糖タンパク質であるCD52を標的とするヒト化モノクローナル抗体である（Waldmann and Hale 2005）。CD52はTリンパ球およびBリンパ球において高レベルで発現し、単球では低レベルで発現しているのに対して、顆粒球および骨髄前駆体には存在しない。CD52に対して向けられたヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブによる処置は循環リンパ球および単球の急速な枯渇を誘導することが示されている。アレムツズマブは、T細胞リンパ腫の処置において、ある特定の場合では移植のための移植前処置の一環として頻繁に用いられる。しかしながら、養子免疫療法の場合、免疫抑制薬物の使用は、導入された治療用T細胞に悪影響も及ぼすことがある。従って、これらの条件で養子免疫療法アプローチを効果的に使用するには、導入された細胞は免疫抑制処置に対して耐性になる必要があるだろう。

上記工程の好ましい態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はCD52であり、工程（d）の免疫抑制処置は、CD52抗原を標的とするヒト化抗体を含む。別の態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はグルココルチコイド受容体（GR）であり、工程（d）の免疫抑制処置は、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾンを含む。別の態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はFKBPファミリー遺伝子メンバーまたはその変種であり、工程（d）の免疫抑制処置は、タクロリムスまたはフジマイシン（fujimycin）としても知られるFK506を含む。別の態様として、前記FKBPファミリー遺伝子メンバーはFKBP12またはその変種である。別の態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーまたはその変種であり、工程（d）の免疫抑制処置はシクロスポリンを含む。

本発明の特定の態様において、前記方法の遺伝子組換え工程は、CD52およびGR、CD52およびTCRα、CDR52およびTCRβ、GRおよびTCRα、GRおよびTCRβ、TCRαおよびTCRβからなる群より選択される2種類の遺伝子の不活性化に依拠する。別の態様において、前記方法の遺伝子組換え工程は2種類を超える遺伝子の不活性化に依拠する。遺伝子組換えは、好ましくは異なる遺伝子を標的とする少なくとも2種類のRNAガイドを用いてエクスビボで行われる。

遺伝子を不活性化することによって、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現されないことが意図される。

免疫療法のために高活性T細胞を操作する
本発明の範囲には、以前に述べられた方法のいずれか一つに従って得られた単離されたT細胞も包含される。本発明による前記T細胞は幹細胞に由来してもよい。幹細胞は、成人幹細胞、胚性幹細胞、さらに詳細には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞でもよい。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。本発明のT細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択され得る。別の態様において、前記細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来してもよい。本発明の細胞の増殖および遺伝子組換えの前に、様々な非限定的な方法によって対象から細胞供給源を得ることができる。T細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多数の非限定的な供給源から得ることができる。本発明のある特定の態様では、入手可能でありかつ当業者に公知の任意の数のT細胞株を使用することができる。別の態様において、前記細胞は健常ドナーから得てもよく、癌と診断された患者または感染症と診断された患者から得てもよい。別の態様において、前記細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部でもよい。本発明の範囲には、以前に述べた方法による形質転換T細胞から得た細胞株も包含される。免疫抑制処置に対して耐性があり、かつ前記の方法によって入手することができる改変された細胞が、本発明の範囲に包含される。

免疫チェックポイント
「免疫チェックポイント」という用語は、T細胞が発現する分子の一群を意味することが当業者により理解される。これらの分子は、免疫応答を下方制御または阻害するための「ブレーキ」として効果的に働く。免疫チェックポイント分子には、免疫細胞を直接阻害する、Programmed Death1（PD-1。PDCD1またはCD279としても知られる。アクセッション番号:NM_005018）、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4。CD152としても知られる。GenBankアクセッション番号AF414120.1）、LAG3（CD223としても知られる。アクセッション番号:NM_002286.5）、Tim3（HAVCR2としても知られる。GenBankアクセッション番号:JX049979.1）、BTLA（CD272としても知られる。アクセッション番号:NM_181780.3）、BY55（CD160としても知られる。GenBankアクセッション番号:CR541888.1）、TIGIT（IVSTM3としても知られる。アクセッション番号:NM_173799）、LAIR1（CD305としても知られる。GenBankアクセッション番号:CR542051.1）、SIGLEC10（GeneBankアクセッション番号:AY358337.1）、2B4（CD244としても知られる。アクセッション番号:NM_001166664.1）、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3が含まれるが、これに限定されない。例えば、CTLA-4は、ある特定のCD4 T細胞上およびCD8 T細胞上で発現する細胞表面タンパク質であり、抗原提示細胞上に、そのリガンド（B7-1およびB7-2）が結合すると、T細胞活性化およびエフェクター機能が阻害される。従って、本発明は、特に免疫療法のために、T細胞を操作する方法でに関し、本方法は、免疫チェックポイントに関与する少なくとも1種類のタンパク質、特にPD1および/もしくはCTLA-4、または表3において言及した任意の免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することによってT細胞を遺伝子組換えする工程を含む。

好ましい態様において、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3からなる群より選択される免疫チェックポイントタンパク質をコードする少なくとも2種類の遺伝子が不活性化される。

さらに好ましい態様において、上記の免疫チェックポイントタンパク質の不活性化は、特にTCR成分の、以前に提案された不活性化と組み合わせられる。

別の好ましい態様において、本発明による操作されたT細胞は、CD52およびGR、CD52およびTCRα、CDR52およびTCRβ、GRおよびTCRα、GRおよびTCRβ、TCRαおよびTCRβ、PD1およびTCRα、PD1およびTCRβ、CTLA-4およびTCRα、CTLA-4およびTCRβ、LAG3およびTCRα、LAG3およびTCRβ、Tim3およびTCRα、Tim3およびTCRβ、BTLAおよびTCRα、BTLAおよびTCRβ、BY55およびTCRα、BY55およびTCRβ、TIGITおよびTCRα、TIGITおよびTCRβ、B7H5およびTCRα、B7H5およびTCRβ、LAIR1およびTCRα、LAIR1およびTCRβ、SIGLEC10およびTCRα、SIGLEC10およびTCRβ、2B4およびTCRα、2B4およびTCRβからなる群より選択される2種類の不活性化された遺伝子を含む、ならびに/またはCARもしくは多鎖CARを発現する。

悪性細胞に対するキメラ抗原受容体を発現する操作されたT細胞
単鎖CAR
養子免疫療法は、エクスビボで作製された抗原特異的自己T細胞の導入を伴い、ウイルス感染症および癌を処置するのに有望な戦略である。養子免疫療法に用いられるT細胞は抗原特異的T細胞の増殖によって作製されてもよく、遺伝子工学によるT細胞の再誘導によって作製されてもよい（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の導入は、移植に関連するウイルス感染症および稀なウイルス関連悪性疾患の処置に用いられる十分に確立した手順である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および導入は黒色腫の処置においてうまくいくことが示されている。

（表３）免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子のリスト

T細胞における新たな特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）を遺伝子導入することによって首尾良く作製されている（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、1つの融合分子の形をとる、1つまたは複数のシグナル伝達ドメインに結合した標的となる部分からなる合成受容体である。概してCARの結合部分は、可動性リンカーによってつながっているモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む単鎖抗体（scFv）抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインをベースとする結合部分も首尾良く用いられている。第1世代CAR用のシグナル伝達ドメインはCD3ζまたはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第1世代CARはT細胞の細胞傷害性を首尾良く再誘導することが示されているが、インビボで長期増殖および抗腫瘍活性をもたらさなかった。CAR改変T細胞の生存率を向上させ、増殖を増やすために、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む補助刺激分子に由来するシグナル伝達ドメインが単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）加えられている。CARを用いると、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現している抗原にT細胞を首尾良く再誘導することができた（Jena, Dotti et al. 2010）。

本発明は、本明細書に記載の操作されたT細胞において、文献に記載のキメラ抗原受容体を発現させる可能性をさらに含む。

B急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）の圧倒的多数がCD19を一様に発現するので、CD19は免疫療法のための魅力的な標的であるが、非造血細胞、ならびに骨髄系細胞、赤血球系細胞、およびT細胞、ならびに骨髄幹細胞では発現はない。B細胞悪性疾患上にあるCD19を標的とする臨床試験が進められており、期待が持てる抗腫瘍応答が認められた。ほとんどが、CD19特異的マウスモノクローナル抗体FMC63のscFv領域に由来する特異性をもつキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞を注入する（Nicholson, Lenton et al. 1997; Cooper, Topp et al. 2003; Cooper, Jena et al. 2012）（国際出願: WO2013/126712）。

本発明による遺伝子操作されたT細胞において発現される単鎖キメラ抗原受容体の一例は、少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む1本のポリペプチドであり、前記細胞外リガンド結合ドメインは、特異的抗CD19モノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含む。例えば、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入を用いることによってT細胞に形質導入されると、このCARは、リンパ腫または白血病に関与する悪性B細胞の表面に存在するCD19抗原の認識に寄与する。

多発性骨髄腫またはリンパ芽球性白血病抗原マーカー、例えば、TNFRSF17（UNIPROT Q02223）、SLAMF7（UNIPROT Q9NQ25）、GPRC5D（UNIPROT Q9NZD1）、FKBP11（UNIPROT Q9NYL4）、KAMP3、ITGA8（UNIPROT P53708）、およびFCRL5（UNIPROT Q68SN8）に対して向けられた抗原受容体を有するCARなどのキメラ抗原受容体の他の例も、本発明によるT細胞に導入することができる。

さらなる例として、標的の抗原は、分化分子（例えば、CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、およびCD138）、腫瘍関連表面抗原、例えば、ErbB2（HER2/neu）、癌胎児抗原（CEA）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、EGFR変種III（EGFRvIII）、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシドGD2、管上皮ムチン（mucine）、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ（prostase）、プロスターゼ特異的抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン（prostein）、PSMA、生存（surviving）およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インシュリン増殖因子（IGF1）-I、IGF-II、IGFI受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメイン（extra domain）A（EDA）およびエクストラドメインB（EDB）、ならびにテネイシン-CのA1ドメイン（TnC A1）および線維芽細胞関連タンパク質（fap）、細胞系列特異的抗原または組織特異的抗原、例えば、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、GM-CSF、サイトカイン受容体、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、BCMA（CD269、TNFRSF17）、またはウイルス特異的表面抗原、例えば、HIV特異的抗原（例えば、HIV gp120）、EBV特異的抗原、CMV特異的抗原、HPV特異的抗原、ラッセ（Lasse）ウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、ならびにこれらの表面マーカーの任意の誘導体または変種の任意のクラスターに由来してもよい。抗原は必ずしも表面マーカー抗原とは限らず、細胞表面においてHLAクラスIが提示する内因性の小さな抗原でもよい。

マルチサブユニットCAR
T細胞に導入される先行技術のキメラ抗原受容体は、シグナル伝達ドメインの連続付加を必要とする単鎖ポリペプチドから形成された。しかしながら、シグナル伝達ドメインがその自然の膜近傍位置から動くと、その機能が妨げられる可能性がある。この欠点を克服するために、出願人は、最近、全ての関係するシグナル伝達ドメインの正常な膜近傍位置を可能にするために、FcεRIに由来する多鎖CARを設計した。この新たな構造では、FcεRIα鎖の高親和性IgE結合ドメインは、T細胞特異性を細胞標的に再誘導するためにscFvなどの細胞外リガンド結合ドメインと交換され、補助刺激シグナルを正常な膜近傍位置に配置するためにFcεRIβ鎖のN末端テールおよび/またはC末端テールが用いられる。

従って、本発明による操作されたT細胞が発現するCARは、特に、本発明の操作されたT細胞の作製および増殖に合わせられた多鎖キメラ抗原受容体（CAR）でもよい。このような多鎖CARは、以下の成分:
（a）FcεRIα鎖の膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインを含む1つのポリペプチド、
（b）FcεRIβ鎖のN末端細胞質テールおよびC末端細胞質テールの一部ならびに膜貫通ドメインを含む1つのポリペプチド、ならびに/または
（c）それぞれが、FcεRIγ鎖の細胞質内テールの一部および膜貫通ドメイン含み、異なるポリペプチドが自発的に一緒になって多量体化して二量体CAR、三量体CAR、または四量体CARを形成する、少なくとも2つのポリペプチド
の少なくとも2つを含む。

このような構造によれば、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインは、別個のポリペプチドに載って運ばれる。異なるポリペプチドは近接して膜内に固定されるので、互いに相互作用することが可能になる。このような構造では、シグナル伝達ドメインおよび補助刺激ドメインは、膜近傍位置にあってもよい（すなわち、細胞膜に隣接し、細胞膜の内側にあってもよい）。これは、補助刺激ドメインの機能の改善を可能にすると考えられる。このマルチサブユニット構造はまた、さらに大きな融通性と、T細胞活性化をさらに厳密に制御するCARを設計する可能性ももたらす。例えば、多重特異性CAR構造を得るために、異なる特異性を有するいくつかの細胞外抗原認識ドメインを含めることも可能である。多鎖CARの中に入る異なるサブユニット間の相対比を制御することも可能である。このタイプの構造は、最近、本出願人によってPCT/US2013/058005で説明された。

1つの多鎖CARの一部として異なる鎖を集合することは、例えば、シグナル伝達ドメインおよび補助刺激ドメインと融合した、IgEの高親和性受容体（FcεRI）（Metzger, Alcaraz et al. 1986）の異なるα鎖、β鎖、およびγ鎖を用いることによって可能になる。γ鎖は、膜貫通領域と、1個の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ITAM）（Cambier 1995）を含有する細胞質テールを含む。

標的の中にある異なるエレメントに同時結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を増強するために、多鎖CARは数種類の細胞外リガンド結合ドメインを含んでもよい。一態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上で縦列に配置されてもよく、任意でリンカーによって分けられてもよい。別の態様において、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多鎖CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチドに配置されてもよい。別の態様において、本発明は、それぞれが1つの異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARからなる集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法に関し、本方法は、免疫細胞を準備する工程、および前記細胞の表面に、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARからなる集団を発現させる工程を含む。別の特定の態様において、本発明は、免疫細胞を操作する方法に関し、本方法は、、免疫細胞を準備する工程、およびそれぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARからなる集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む。特定の態様において、前記免疫細胞を操作する方法は、前記細胞の表面に、少なくとも、シグナル伝達ドメインと融合したFcεRIβ鎖および/またはγ鎖の一部、ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインと融合したFcεRIα鎖のいくつかの部分を発現させる工程を含む。さらに詳細な態様において、前記方法は、シグナル伝達ドメインと融合したFcεRIβ鎖および/またはγ鎖の一部、ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインと融合したいくつかのFcεRIα鎖をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む。多鎖CARからなる集団とは、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個の、またはそれより多い多鎖CARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なるエレメントに同時結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を増強してもよい。

本発明はまた、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CAR集団を含む、単離された免疫細胞に関する。

本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後に、免疫細胞および免疫応答の活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を担う。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、多鎖CARが発現している免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカイン分泌を含むヘルパー活性でもよい。

本願において、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を誘導するタンパク質部分を指す。

単鎖CARまたは多鎖CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して働く、Fc受容体またはT細胞受容体および補助受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変種、および同じ機能をもつ任意の合成配列でもよい。シグナル伝達ドメインは、抗原依存的一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列、および二次シグナルまたは補助刺激シグナルを供給するように抗原非依存的に働く細胞質シグナル伝達配列である2つの別々のクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ITAMの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として役立つ、様々な受容体の細胞質内テールにおいて発見された、詳細に明らかにされているシグナル伝達モチーフである。本発明において用いられるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するITAMが含まれ得る。好ましい態様において、多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含んでもよく、FcεRIβ鎖またはγ鎖の細胞質内ドメインを含んでもよい。

特定の態様において、本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、補助刺激シグナル分子を含む。補助刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。

リガンド結合ドメインは、文献において言及された単鎖CARに関して、以前に使用および言及された任意の抗原受容体、特に、モノクローナル抗体に由来するscFvであってもよい。

WO2014/4011988に記載の二重特異性CARまたは多重特異性CARも本発明の範囲に入る。

T細胞の活性化および増殖
T細胞を遺伝子組換えする前でも遺伝子組換えした後でも、T細胞は概して、例えば、米国特許第6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;および米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて活性化および増殖させることができる。T細胞はインビトロで増殖させてもよく、インビボで増殖させてもよい。

概して、本発明のT細胞は、CD3 TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、T細胞表面にある共刺激分子を刺激するリガンドが取り付けられている表面と接触させることによって増殖する。

特に、T細胞集団は、インビトロでは、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体との接触によって刺激されてもよく、プロテインキナーゼCアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）とカルシウムイオノフォアとの接触によって刺激されてもよい。T細胞表面にあるアクセサリー分子を同時刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞増殖を刺激するのに適した条件下で、T細胞集団を抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+T細胞の増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、それぞれのシグナルを供給する薬剤が、溶解状態にあってもよく、表面に結合されてもよい。当業者が容易に理解することができるように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒径によって決まる場合がある。本発明のさらなる態様において、T細胞などの細胞は、薬剤コーティングビーズと組み合わされ、ビーズおよび細胞は後で分離され、次いで、細胞は培養される。別の態様では、培養前に薬剤コーティングビーズおよび細胞は分離されず、一緒に培養される。抗CD3および抗CD28が取り付けられている常磁性ビーズ（3x28ビーズ）がT細胞と接触するのを可能にすることで、細胞表面タンパク質が連結される場合がある。一態様では、細胞（例えば、4〜10個のT細胞）およびビーズ（例えば、1:1比のDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ）が、緩衝液中、好ましくは、PBS（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）の中で組み合わされる。これもまた、任意の細胞濃度を使用できることを当業者は容易に理解することができる。混合物は、数時間（約3時間）〜約14日間、培養されてもよく、その間の任意の整数値の時間にわたって培養されてもよい。別の態様では、混合物は21日間、培養されてもよい。T細胞培養に適した条件には、血清（例えば、胎仔ウシ血清ウシまたは胎児ヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インシュリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞増殖のための他の任意の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、および還元剤、例えば、N-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールが含まれるが、これに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清の、あるいは適量の血清（もしくは血漿）、または規定された一組のホルモン、ならびに/またはT細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインが加えられた、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にだけ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気+5％CO2）の下で維持される。異なる刺激時間に曝露されたT細胞は異なる特徴を示す場合がある。

別の特定の態様において、前記細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖させることもできる。前記細胞はまたインビボで増殖されてもよく、例えば、前記細胞を対象に投与した後に対象の血液中で増殖させることもできる。

治療用途
上記の様々な方法によって得られたT細胞は、中でも癌、感染症、または免疫疾患を、必要とする患者において処置するための医薬として使用することが意図される。

前記処置は、寛解させる処置でもよく、根治的処置でもよく、予防的処置でもよい。前記処置は自己由来免疫療法の一環でもよく、同種異系免疫療法処置の一環でもよい。自己由来とは、患者の処置に用いられる細胞、細胞株、または細胞集団が前記患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系とは、患者の処置に用いられる細胞または細胞集団が前記患者に由来しないが、ドナーに由来することを意味する。

本発明は、T細胞、典型的にはドナーから得られたT細胞を形質転換して非アロ反応性細胞にすることができる限り、同種異系免疫療法に特に適している。これは標準的なプロトコール下で行われ、必要に応じて何回でも再現される場合がある。結果として得られた改変されたT細胞はプールされ、1人または数人の患者に投与される場合があり、それによって「既製の」治療製品として利用可能になる。開示された方法と共に使用することができる細胞は前の項において説明されている。

前記処置は主として、癌、ウイルス感染症、自己免疫障害、または移植片対宿主病（GvHD）と診断された患者を処置するためのものである。癌は好ましくは、液性腫瘍を有する白血病およびリンパ腫であるが、懸案の固形腫瘍であってもよい。本発明のCARを用いて処置される癌のタイプには、癌腫、芽腫、および肉腫、ならびにある特定の白血病またはリンパ系腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これに限定されない。成人腫瘍/癌および小児科腫瘍/癌も含まれる。

本発明のT細胞は、患者自身の免疫細胞に対して向けられた特異的CARを搭載しているときには、リウマチ性多発関節炎（rheumatoid polyarthritis）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、硬皮症、線維筋痛症、筋炎、強直性脊椎炎、インシュリン依存性I型糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、クローン病、セリアック病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および多発性硬化症（MS）などの自己免疫疾患を処置するための重要な段階である前記細胞の阻害または調節を可能にする。

処置は、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される1種以上の治療との組み合わせで行われ得る。

本発明の好ましい態様によると、処置は、免疫抑制処置または化学療法処置を受けている患者に対して特に適している。実際、本発明は、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して抵抗性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を支援するべきである。

一態様によれば、本発明の前記T細胞は患者に投与されると活発にインビボでT細胞増殖することができ、長期間にわたって、好ましくは1週間、より好ましくは2週間、さらにより好ましくは少なくとも1ヶ月間、体液中で持続することができる。本発明によるT細胞はこれらの期間にわたって持続すると予想されるが、患者の体内での寿命は、1年を超えない、好ましくは6ヶ月、より好ましくは2ヶ月、さらにより好ましくは1ヶ月を超えないことが意図される。

本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり10⁴〜10⁹個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり10⁵〜10⁶個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。

本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。本明細書に記載の方法のいずれか1つによって得られた前記改変された細胞は、宿主対移植片（HvG）拒絶反応および移植片対宿主病（GvHD）に対する処置を必要とする患者を処置するために本発明の特定の局面において使用することができる。従って、宿主対移植片（HvG）拒絶反応および移植片対宿主病（GvHD）に対する処置を必要とする患者を処置する方法であって、不活性化されたTCRα遺伝子および/またはTCRβ遺伝子を含む有効量の改変された細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置する工程を含む方法が本発明の範囲にある。

他の定義
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードによって本明細書において表記され、例えば、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。

アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。

ヌクレオチドは以下のように表記される：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。

本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のようなヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖モエティおよび／またはピリミジン塩基モエティもしくはプリン塩基モエティに変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖モエティ全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似した構造に交換されてもよい。塩基モエティの修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

「前記二本鎖切断の上流側にある配列と相同な第1の領域、前記細胞のゲノムに挿入しようとする配列、および前記二本鎖切断の下流側にある配列と相同な第2の領域を連続的に含むポリヌクレオチド」とは、インサイチューでDNA標的の5'側および3'側の領域と相同な第1の部分および第2の部分を含むDNA構築物またはマトリックスを意味することが意図される。DNA構築物はまた、インサイチューで対応するDNA配列といくらかの相同性を含むか、またはインサイチューでDNA標的の5'側および3'側の領域と相同性を含まない、第1の部分と第2の部分との間に配置される第3の部分も含む。DNA標的が切断された後に、関心対象の遺伝子座に含まれる標的となる遺伝子を含有するゲノムと、このマトリックスとの間で相同組換え事象が刺激され、DNA標的を含有するゲノム配列は、マトリックスの第3の部分ならびに前記マトリックスの第1の部分および第2の部分の可変部と交換される。

「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「核酸標的配列」、「標的配列」、または「プロセシング部位」とは、本発明によるレアカッティングエンドヌクレアーゼによって標的とされかつ処理することができるポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、細胞内にある特定のDNAの位置、好ましくは、ゲノムの位置だけでなく、遺伝物質の本体とは独立して存在することができる遺伝物質部分、例えば、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはミトコンドリアなどの細胞小器官の中にある遺伝物質部分も指す。RNAガイド標的配列の非限定的な例として、RNAガイドエンドヌクレアーゼを所望の遺伝子座に向けるガイドRNAにハイブリダイズすることができるゲノム配列がある。

「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミドのようなその他のベクター、または透過性ペプチドの送達を可能にする。これら後者のケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。

「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。

ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。

「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、概して、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスDNAである。「組み込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組み込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。

送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。

細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。

「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。

非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS 細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択される。

これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。

「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチドの配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を与える場合もある。

「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列における少なくとも1個の残基の変異または交換によって入手されたリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALEヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを表す。

「機能的バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を表し；そのような変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。

「遺伝子」とは、特定のタンパク質またはタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って直線的に並べられたDNAセグメントからなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、典型的に、プロモーター、5'非翻訳領域、1つまたは複数のコード配列（エキソン）、任意で、イントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー、および/またはサイレンサーをさらに含んでもよい。

本明細書で使用する「遺伝子座」という用語は、染色体上にあるDNA配列（例えば、遺伝子）の特定の物理的な場所である。「遺伝子座」という用語は、染色体上にあるレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的配列の特定の物理的な場所を指すことがある。このような遺伝子座は、本発明によるレアカッティングエンドヌクレアーゼによって認識および/または切断される標的配列を含んでもよい。本発明の関心対象の遺伝子座は、細胞の遺伝物質の本体（すなわち、染色体）に存在する核酸配列だけでなく、遺伝物質の前記本体とは独立して存在することができる遺伝物質部分、例えば、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはミトコンドリアなどの細胞小器官の中にある遺伝物質部分も当てはまることが理解される。

「切断」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合バックボーンの破壊を指す。ホスホジエステル結合の酵素的加水分解または化学的加水分解を含むが、これに限定されない様々な方法によって切断を開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断がいずれも可能であり、二本鎖切断は2つの別個の一本鎖切断事象の結果として発生してもよい。二本鎖DNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッド切断によって平滑末端または付着末端のいずれかが生じる可能性がある。

「融合タンパク質」とは、元々は別々のタンパク質またはその一部をコードする2種類以上の遺伝子を結合することにある当技術分野において周知のプロセスの結果を意図する。前記「融合遺伝子」が翻訳されると、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する1本のポリペプチドが生じる。

「同一性」とは、2種の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有している位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、2種の配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。

「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。

「共刺激シグナル」とは、本明細書において使用されるように、TCR/CD3ライゲーションのような一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルをさす。

「二重特異性抗体」とは、1つの抗体分子の中に、2つの異なる抗原に対する結合部位をもつ抗体を指す。標準的な抗体構造に加えて、2つの結合特異性をもつ他の分子が構築され得ることが当業者によって理解されるだろう。二重特異性抗体による抗原結合は同時に起こってもよく、連続して起こってもよいことがさらに理解されるだろう。二重特異性抗体は化学的技法によって作製されてもよく（例えば、Kranz et al. （1981） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,5807を参照されたい）、「ポリドーマ（polydoma）」法（米国特許第4,474,893号を参照されたい）によって作製されてもよく、組換えDNA法によって作製されてもよい。これらの技法は全てそれ自体が公知である。非限定的な例として、それぞれの結合ドメインは、抗体重鎖に由来する少なくとも1つの可変領域（「VH領域またはH領域」）を含み、第1の結合ドメインのVH領域はCD3などのリンパ球マーカーに特異的に結合し、第2の結合ドメインのVH領域は腫瘍抗原に特異的に結合する。

「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。

「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。

上記の本発明の説明は、当業者が本発明を作成し使用することが可能になるよう、本発明を作成し使用する様式および過程を提供するものであり、この可能性は、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。

本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に記載されたかのごとく、具体的に含まれる。

本発明を全般的に説明したが、ある種の具体例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。それらの具体例は、例示目的のために本明細書に提供されるに過ぎず、他に特記されない限り、限定するためのものではない。

実施例1:免疫療法のためにヒト同種異系細胞を操作する概略的方法
本発明をさらに深く理解するために、免疫療法のためにヒト同種異系細胞を操作する方法を、図4に図示した。この方法は、以下の工程の1つまたはいくつかからなる組み合わせを含む。
1．患者一人一人または血液バンクから入手した細胞培養物または血液試料からT細胞を準備する工程、および抗CD3/C28アクチベータービーズを用いて前記T細胞を活性化する工程。このビーズは、T細胞の活性化および増殖に必要な一次シグナルおよび補助刺激シグナルを両方とも供給する。
2．前記細胞に多鎖CARを形質導入する工程であって、これが、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する標的細胞の表面に発現している抗原、特に抗原CD19に対してT細胞を再誘導することを可能にする、工程。補助刺激ドメインの機能を改善するために、本発明者らは、以前に述べたようにFcεRIに由来する多鎖CARを設計した。形質導入は、RNAガイドエンドヌクレアーゼを用いた遺伝子不活性化の前または後に成し遂げられ得る。
3．非アロ反応性の、任意で耐性のT細胞を操作する工程：
（a）細胞表面からTCRを無くし、同種異系TCRが宿主組織を異物として認識するのを阻止し、従って、GvHDを回避するために、前記細胞においてTCRαを不活性化することが可能である。
（b）移植されたT細胞に影響を及ぼすことなく移植片拒絶反応を阻止するために、前記細胞が免疫抑制処置または化学療法処置に対して耐性になるように、免疫抑制剤または化学療法薬物の標的をコードする1種類の遺伝子を不活性化することも可能である。この例では、免疫抑制剤の標的はCD52であり、免疫抑制剤はヒト化モノクローナル抗CD52抗体である。
本発明者らが以下に示したように、単に、それぞれが1種類の遺伝子、例えば、TCRα遺伝子およびCD52遺伝子を標的とする2つの別々のガイドRNA（gRNA）を導入することによってT細胞において二重遺伝子不活性化を成し遂げるためには、RNAガイドエンドヌクレアーゼを使用することが特に有利である。これは、Cas9をコードするmRNAでT細胞をエレクトロポレーション処理し、同時に、特異的gRNAをコードするDNAプラスミドを転写させることによって行うことができる。代替として、gRNAは、レトロウイルスベクターを用いてゲノムに安定に組み込まれたDNA配列から転写されてもよい。mRNAからCas9の一過的発現は、高い形質転換率をもたらし、T細胞に有害でないことが本発明者らによって見出されている。次いで、磁気ビーズを用いて不活性化T細胞を分別する。例えば、標的とする遺伝子（例えば、CD52）を依然として発現するT細胞は、固体表面に固定化されることで除去することができ、不活性化細胞は、カラムを通るストレスに曝露されない。この穏やかな方法によって、正しく操作されたT細胞の濃度が上昇する。
4.操作されたT細胞を、CD3複合体刺激を介して、患者に投与する前にインビトロで増殖させるか、または患者に投与した後にインビボで増殖させる工程。投与工程の前に、患者は、ヒト化モノクローナル抗体抗CD52であるCAMPATH1-Hなどの免疫抑制処置に供されてもよい。
5.任意で、操作された細胞を標的抗原に近接させるために、前記細胞を患者に投与する前にエクスビボで二重特異性抗体に曝露するか、または前記細胞を患者に投与した後にインビボで二重特異性抗体に曝露する工程。

実施例2:T細胞におけるTCR遺伝子およびCD52遺伝子の特異的不活性化
1- CAS9およびgRNAプラスミド構築
S.ピオゲネスに由来するCas9をコードする配列を新規合成し（GeneCust）、C末端で3xNLSおよびHAタグに隣接させた（pCLS22972（SEQ ID NO：53））。TCRa遺伝子（SEQ ID NO：54）およびCD52遺伝子（SEQ ID NO：55）の中にある、それぞれの20bp配列（5'→3'）を標的とするgRNAをコードする配列をpUC57由来プラスミドのU6プロモーター下流にクローニングして、それぞれ、pCLS24029（SEQ ID NO：56）およびpCLS24027（SEQ ID NO：57）プラスミドベクターを得た。

2- CAS9 mRNA合成
CAS9をコードするmRNAを作製し、mMessage mMachine T7 Ultraキット（Life technologies）を用いて製造業者の説明書に従ってポリアデニル化した。その後、RNAをRNeasyカラム（Qiagen）で精製し、エレクトロポレーション緩衝液に溶出し、260nmでの吸光度を測定することによって定量した（Nanodrop ND-1000分光光度計）。RNAの品質を変性ホルムアルデヒド/MOPSアガロースゲル上で検証した。

3- トランスフェクション
活性化（Dynabeads（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28, Life technologies）して4日後に、AgilePulse MAXシステム（Harvard Apparatus）を用いた、CAS9をコードするmRNAおよびgRNAをコードするプラスミドの電気泳動転写によってTリンパ球細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、抗CD3/CD28コーティングビーズおよびIL2を用いたプレトランスフェクションによって、T細胞を数日間（3〜5日間）予め活性化した。エレクトロポレーションの1日前に培養培地を交換し、細胞を10⁶細胞/mlで播種した。24時間後に、T細胞をcytoporation medium T（Harvard Apparatus）で洗浄し、EasySepマグネット（StemCell technologies）に差し込んだチューブからT細胞懸濁液をデカントすることによって活性化ビーズを除去した。次いで、T細胞をペレット化し、cytoporation medium Tに25x10⁶細胞/mlで再懸濁した。5x10⁶個の細胞を、10μgのCAS9をコードするmRNAおよびTCRaを標的とするgRNAをコードするプラスミドと混合して0.4cmキュベットに入れた。エレクトロポレーションは、2回の1200Vで0.1msのパルスに続いて4回の130Vで0.2msのパルスからなった。エレクトロポレーション後に、T細胞を培養培地で希釈し、37℃/5％CO₂で24時間インキュベートした後に、もう1回、培地を交換した。エレクトロポレーションの3日後に、T細胞を固定可能な生死判別色素（viability dye）eFluor-780、およびTCRaの細胞表面発現を評価するために特異的なPE結合ヤギ抗マウスIgG F（ab'）2断片、CD52の細胞表面発現を評価するために特異的なAPC結合ヤギ抗マウスIgG F（ab'）2断片で染色した。TCRα遺伝子またはCD52遺伝子のノックアウトをフローサイトメトリーによって分析した（MACSQuant）。結果を図5および図6に示した。図5および図6から、かなりの割合の分析細胞においてTCR遺伝子およびCD52遺伝子がそれぞれ不活性化されたことが分かる。

実施例3:抗CD19単鎖キメラ抗原受容体（CAR）をコードするモノシストロニックmRNAを用いてエレクトロポレーション処理した操作されたT細胞の機能分析
キメラ抗原受容体（CAR CD19）が提供されたときに、操作されたT細胞の抗腫瘍活性を示す能力がゲノム操作によって影響を受けなかったことを検証するために、Cas9と、TCRαを標的とする特異的ガイドRNAを用いて前もって標的としたT細胞を、抗CD19 CARをコードするRNA 10μgでさらにトランスフェクトした。24時間後に、T細胞をCD19発現ダウジ細胞と4時間インキュベートした。Tリンパ球による細胞傷害性顆粒放出（脱顆粒と呼ぶ）のマーカーであるCD107aの細胞表面アップレギュレーションをフローサイトメトリー分析によって測定した（Betts, Brenchley et al. 2003）。

抗CD3/CD28コーティングビーズおよびIL2によって数日間（3〜5日間）予め活性化した5X10⁶個のT細胞をcytoporation buffer Tに再懸濁し、0.4cmキュベットに入れて、mRNA無しで、または単鎖CARをコードするmRNA 10μgを用いてエレクトロポレーション処理した。

エレクトロポレーションの24時間後に、細胞を、固定可能な生死判別色素eFluor-780、および生細胞上のCARの細胞表面発現を評価するために特異的なPE結合ヤギ抗マウスIgG F（ab'）2断片で染色した。データを図20に示した。Aは、前記のモノシストロニックmRNAを用いてエレクトロポレーション処理した生T細胞の圧倒的多数が表面にCARを発現することを示している。エレクトロポレーションの24時間後に、T細胞をダウジ（CD19⁺）細胞と6時間、共培養し、表面における脱顆粒マーカーCD107aの発現を検出するためにフローサイトメトリーによって分析した（Betts, Brenchley et al. 2003）。

これらの結果から、TCRα陰性細胞およびTCRα陽性T細胞は、PMA/イオノマイシン（正の対照）またはCD19+ダウジ細胞に応答して脱顆粒する能力が同じであることが分かる。CD107アップレギュレーションはCD19+の存在に依存する。これらのデータから、T細胞の、制御された抗腫瘍応答を開始する能力はCas9を用いたゲノム操作によって悪影響を受けなかったことが示唆される。

説明において引用された参考文献のリスト

Claims (25)

1. （a）少なくとも、
   -Cas9 RNAガイドエンドヌクレアーゼ、および
   -該エンドヌクレアーゼを、T細胞ゲノム内にある少なくとも1種の標的となる遺伝子座に向ける、特異的ガイドRNA
   のエクスビボでの細胞への導入および/または細胞における発現によってT細胞を遺伝子組換えする工程であって、トランスフェクトされたmRNAから該RNAガイドエンドヌクレアーゼが発現され、かつ該ガイドRNAがDNAベクターからの転写物として細胞において発現される、工程、
   （b）結果として生じた細胞をインビトロで増殖させる工程
   を含む、免疫療法のためにT細胞を調製する方法。
2. Cas9 RNAガイドエンドヌクレアーゼが、S.ピオゲネス（S.Pyogenes）のCas9に由来するRuvCドメインまたはHNHドメイン（SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2）と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
3. プラスミドDNAからガイドRNAが発現される、請求項1または2記載の方法。
4. トランスフェクトされたmRNAが、修飾核酸塩基またはポリアデニル化配列を含めることによって安定化される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
5. トランスフェクトされたmRNAがARCA（アンチリバースCap類似体）の付加によって安定化される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
6. トランスフェクトされたmRNAが5'UTRまたは3'UTRの付加によって安定化される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
7. トランスフェクトされたmRNAが少なくとも1種の細胞透過性ペプチドと結合される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
8. 細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン、TAT、ポリアルギニンペプチド、pVEC、MPG、トランスポータン、グアニジウムリッチ分子輸送体より選択される、請求項7記載の方法。
9. 透過性ペプチドが、RQIRIWFQNRRMRWRR、RQIRIWFQNRRMRWRRC、および/またはRQIKIWFQNRRMKWKKCより選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8記載の方法。
10. mRNAがエレクトロポレーションによって細胞に導入される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
11. DNAベクターがエピソームベクターである、請求項1記載の方法。
12. DNAベクターが、T細胞においてガイドRNAをより効率的に転写させるためにU6プロモーターを含む、請求項1記載の方法。
13. エンドヌクレアーゼRNAがリポソームベクターを用いてトランスフェクトされる、請求項1記載の方法。
14. 少なくとも1種の標的となる遺伝子座がT細胞受容体（TCR）の成分をコードする、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. その細胞表面にTCRを発現しない形質転換されたT細胞を分別する工程をさらに含む、請求項14記載の方法。
16. T細胞受容体の成分がTCRαである、請求項14記載の方法。
17. ガイドRNAが、表2に列挙したSEQ ID NO：6〜SEQ ID NO：52より選択されるTCRαの標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項16記載の方法。
18. RNAガイドエンドヌクレアーゼおよびガイドRNAによって標的となる少なくとも1種の遺伝子座が、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2およびGUCY1B3から選択される免疫チェックポイントタンパク質をコードする、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
19. RNAガイドエンドヌクレアーゼおよびガイドRNAによって標的となる遺伝子座がPD1または CTLA-4をコードする、請求項17記載の方法。
20. RNAガイドエンドヌクレアーゼおよびガイドRNAによって標的となる少なくとも1種の遺伝子座が薬物感受性遺伝子または免疫抑制剤の標的を発現する遺伝子である、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
21. 標的となる遺伝子座がCD52、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）、またはグルココルチコイド受容体（GR）である、請求項20記載の方法。
22. 外因性DNAまたは変異をT細胞ゲノムに導入するように、標的となる遺伝子座において相同組換えが誘導される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
23. キメラ抗原受容体（CAR）をT細胞に導入する工程をさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
24. 工程（a）のT細胞が、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
25. 工程（a）のT細胞がCD4+Tリンパ球および/またはCD8+Tリンパ球に由来する、請求項24記載の方法。

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