KR102248157B1 - Ｃｄ19 특이적 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

Ｃｄ19 특이적 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. CAR은 선택된 타겟에 대한 면역 세포 특이성 및 반응성을 재유도하여 리간드-결합 도메인 성질을 이용할 수 있다. 특히, 본 발명은 세포외 리간드 결합이 CD19 모노클론 항체, 바람직하게 4G7로부터 유래된 scFV인 키메라 항원 수용체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 폴리누클레오티드, 상기 CAR을 엔코딩하는 벡터, 및 이의 표면에서 상기 CAR을 발현시키는 단리된 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 변환된 세포 상에서 지연된 "활성화된" 상태를 부여하는 이의 표면에서 4G7-CAR을 발현시키는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료를 위해 특히 유용하다.

Description

ＣＤ19 특이적 키메라 항원 수용체 및 이의 용도{CD19 SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND USES THEREOF}
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. CAR은 선택된 타겟에 대한 면역 세포 특이성 및 반응성을 재유도하여 리간드-결합 도메인 성질을 이용할 수 있다. 특히, 본 발명은 세포외 리간드 결합이 CD19 모노클론 항체, 바람직하게 4G7로부터 유래된 scFV인 키메라 항원 수용체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 폴리누클레오티드, 상기 CAR을 엔코딩하는 벡터, 및 상기 CAR을 표면에서 발현시키는 단리된 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 변환된 세포 상에서 지연된 "활성화된" 상태를 부여하는 표면에서 4G7-CAR을 발현시키는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료를 위해 특히 유용하다.
입양 면역치료(adoptive immunotherapy)는 생체 외에서 발생되는 자가 항원-특이적 T 세포의 전달을 수반하는 것으로서, 이는 바이러스 감염증 및 암을 치료하기 위한 유망한 전략이다. 입양 면역치료를 위해 사용되는 T 세포는 유전자 조작을 통한 항원-특이적 T 세포의 확대 또는 T 세포의 재유도 중 어느 하나에 의해 발생될 수 있다[Park, Rosenberg et al. 2011]. 바이러스 항원 특이적 T 세포의 전달은 이식 관련 바이러스 감염증 및 드믄 바이러스-관련 악성 종양(malignancy)의 치료를 위해 사용되는 널리-확립된 절차이다. 유사하게, 종양 특이적 T 세포의 단리 및 전달은 흑색종을 치료하는데 성공적인 것으로 나타났다.
T 세포에서의 신규한 특이성은 트랜스제닉(transgenic) T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전적 전달을 통해 성공적으로 발생되었다[Jena, Dotti et al. 2010]. CAR은 신호 융합 분자에서 하나 이상의 신호전달 도메인과 관련된 타겟화 모이어티로 이루어진 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결된 모노클론 항체의 경 및 가변성 분절을 포함하는, 단쇄 항체(scFv)의 항원-결합 도메인으로 이루어진다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기반으로 한 결합 모이어티는 또한 성공적으로 사용된다. 제1 세대 CAR을 위한 신호전달 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역으로부터 유래된다. 제1 세대 CAR은 T 세포 세포독성을 성공적으로 재유도하는 것으로 나타났지만, 이러한 것은 생체 내에서 지연된 확대 및 항-종양 활성을 제공하는데 실패하였다. CD28, OX-40 (CD134), 및 4-1BB (CD137)를 포함하는 동시-자극 분자로부터의 신호전달 도메인은 CAR 개질된 T 세포의 생존을 향상시키고 증식을 증가시키기 위해 단독으로(제2 세대) 또는 조합하여(제3 세대) 첨가된다. CAR은 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성 종양으로부터 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원에 대해 T 세포를 성공적으로 재유도하게 할 수 있다[Jena, Dotti et al. 2010].
CD19는, 대부분의 B-급성 림프구성 백혈병(B-ALL)이 CD19를 균일하게 발현시키기 때문에 면역치료를 위한 매력적인 타겟인 반면, 발현은 비-조혈 세포 뿐만 아니라, 골수성, 적혈구 및 T 세포, 및 골수 줄기 세포 상에 존재하지 않다. B-세포 악성 종양 상에 CD19를 타겟화하는 임상 시험은 항-종양 반응을 장려하면서 진행된다. 대부분의 주입 T 세포는 CD19-특이적 마우스 모노클론 항체 FMC63의 scFv 영역으로부터 유래된 특이성으로 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키기 위해 유전적으로 개질된다[Nicholson, Lenton et al. 1997; Cooper, Topp et al. 2003; Cooper, Jena et al. 2012][국제출원: WO2013/126712]. 그러나, 이러한 CAR을 발현시키는 세포를 유의미한 임상적 장점에 도달할 수 있게 하기 위해, T-세포 증식과 양호한 양립성을 나타내는 CAR의 구조를 개선시키는 것이 여전히 요구된다.
본 발명자들은 CD19 특이적 모노클론 항체, 4G7로부터 유래된 scFV를 포함하는 CD19 특이적 CAR (4G7-CAR)을 발생시켰고, 얻어진 4G7-CAR의 1차 T 세포로의 도입이 항원 결합에 독립적으로 변환된 세포 상에 지연된 "활성화된" 상태를 부여할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 시험관내 비-특이적 활성화 후(예를 들어, 항 CD3/CD28 코팅된 비드 및 재조합 IL2와 함께), 이러한 세포는 증가된 세포 크기(블라스트(blast) 형성) 뿐만 아니라 FMC63 scFV를 포함하는 유사한 CAR로 변환된 세포와 비교하여 연장된 시간에 걸쳐 활성화 마커(CD25)의 발현을 나타낸다. 이러한 장기간 활성화는 연장된 증식을 가능하게 하고, 시험관내 4G7-CAR 세포의 확대를 위한 항원-독립적 메카니즘을 제공한다.
이에 따라, 본 발명은 적어도 하나의 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인 및 적어도 하나의 신호 변환 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하며, 여기서, 상기 세포외 리간드 결합 도메인은 특이적 모노클론 항체, 4G7로부터 유래된 scFV를 포함한다. 특히, 본 발명의 CAR은 면역 세포로 변환된 직후에 세포의 항원 독립적 활성화 및 증식에 기여한다 본 발명은 또한, 핵산, CD19 특이적 모노클론 항체 4G7로부터 유래된 scFV를 포함하는 CAR을 엔코딩하는 벡터, 및 상기 세포에 4G7 CAR를 도입하는 것을 포함하는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 4G7, 특히 항원 메카니즘과 독립적으로 증식하는 면역 세포를 표면에서 발현시키는 유전적으로 개질된 면역 세포에 관한 것이다. 본 발명의 유전적으로 개질된 면역 세포는 B-세포 림프종 또는 백혈병 치료와 같은 치료 적용을 위해 특히 유용하다.
도 1: 비-변환된 KO T 세포(NTD)와 비교하여 4G7-CAR 렌티바이러스 벡터로 변환된 TCR 알파 비활성화된 T 세포(KO)의 증식. 증식은 가용성 항-CD28로의 재활성화 단계 (IL2+CD28) 후 또는 이러한 단계 없이(ILs) 이어졌다.
도 2: 4G7-CAR 발현 (CAR+, CAR-)을 기반으로 하여 게이팅되고 비-전기천공된 TCR 알파 포지티브(NEP) 또는 TCR 알파 파괴된 그러나 변환되지 않은(NTD) 세포에 대한 CD25 발현과 비교된, 4G7-CAR 렌티바이러스 벡터로 변환된 비활성화된 TCR 알파 T 세포의 표면에서의 CD25 활성화 마커 발현 분석. CD25 발현은 가용성 항-CD28로의 재활성화 단계 ((IL2+CD28) 후 또는 이러한 단계 없이(ILs) 분석되었다.
도 3: 4G7-CAR 또는 FMC63-CAR 중 어느 하나를 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환된 T 세포의 표면에서의 CAR 발현 분석. 분석은 유량세포분석법에 의해 변환후 3, 8 및 15일째에 수행되었다. NT는 변환되지 않은 T 세포를 지칭한다.
도 4: 4G7-CAR 또는 FMC63-CAR 중 어느 하나를 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환된 T 세포의 표면에서의 CD25 발현 분석. 분석은 유량세포분석법에 의해 변환후 3, 8 및 15일째에 수행되었다. NT는 변환되지 않은 T 세포를 지칭한다.
도 5: 4G7-CAR 또는 FMC63-CAR 중 어느 하나를 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환된 T 세포의 크기 분석. 분석은 유량세포분석법에 의해 변환후 3, 8 및 15일째에 수행되었다. NT는 변환되지 않은 T 세포를 지칭한다.
도 6: FMC63 렌티바이러스 벡터와 비교하여 4G7-CAR로 변환된 T 세포의 증식. 증식은 가용성 항-CD28로의 재활성화 단계 (CD28) 후 또는 이러한 단계 없이(-) 2일 동안 이어졌다. NTD는 변환되지 않은 T 세포를 지칭한다.
본원에서 상세하게 정의하지 않는 한, 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 유전자 치료법, 생화학, 유전학, 및 분자 생물학의 분야에서 숙련된 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 모든 방법 및 물질은 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있으며, 본원에는 적합한 방법 및 물질이 기술된다. 본원에 언급된 모든 공개문, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조 문헌은 이의 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우세할 것이다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것으로서, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실행은 달리 명시하지 않는 한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당해 분야의 기술 내에 속하는 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다[참조, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. 미국특허번호 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cell(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cell(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986].
CD19 특이적 키메라 항원 수용체
본 발명은 세포외 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 변환 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드를 결합시킬 수 있는 올리고- 또는 폴리펩티드로서 정의된다. 바람직하게, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 타겟 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인지하기 위해 선택될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결된 타겟 항원 특이적 모노클론 항체의 경(VL) 및 중(VH) 가변성 분절을 포함하는 단쇄 항체 분절(scFv)을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 scFV는 CD19 모노클론 항체 4G7로부터 유래되며(Peipp, Saul et al. 2004), 바람직하게, 본 발명의 상기 scFV는 바람직하게, 가요성 링커에 의해 함께 연결된, CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 감마 1 중쇄 (GenBank: CAD88275.1; SEQ ID NO: 1)의 일부 및 CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 카파 경쇄 (GenBank: CAD88204.1; SEQ ID NO: 2)의 일부를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 scFV는 가요성 링커에 의해 함께 연결된, CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 감마 1 중쇄 (SEQ ID NO: 3)의 가변성 분절 및 CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 카파 경쇄 (SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5)의 가변성 분절을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 가요성 링커는 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 6)을 갖는다.
다시 말해서, 상기 CAR은 CD19 특이적 모노클론 항체 4G7로부터 유래된 단쇄 FV 분절을 포함하는 세포외 리간드-결합 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 scFV는 SEQ ID NO: 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 일부를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 scFV는 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 포함한다.
본 발명에 따른 CAR의 신호 변환 도메인 또는 신호전달 도메인은 면역 세포 및 면역 반응의 활성화를 야기시키는 타겟에 세포외 리간드 결합 도메인을 결합시킨 후 세포내 신호전달의 원인이 된다. 다시 말해서, 신호 변환 도메인은 CAR을 발현시키는 면역 세포의 정상 이펙터(effector) 기능들 중 적어도 하나의 활성화의 원인이 된다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 시토카인의 분비를 포함하는 세포독성 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 이에 따라, 용어 "신호 변환 도메인"은 이펙터 신호 기능 신호를 변환시키고 특별한 기능을 수행하기 위해 세포를 유도하는 단백질의 일부를 지칭한다.
CAR에서 사용하기 위한 신호 변환 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 결합(engagement) 후 신호 변환을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체 및 공동-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이러한 서열의 임의 유도체 또는 변형체 및 임의 합성 서열일 수 있다. 신호 변환 도메인은 세포질 신호전달 서열의 두 개의 별도의 클래스, 즉 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것, 및 2차 또는 동시-자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 것을 포함한다. 1차 세포질 신호전달 서열은 ITAM의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프로서 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 클래스 티로신 키나아제에 대한 결합 사이트로서 제공하는 다양한 수용체의 세포질내 테일에서 발견된 널리 규정된 신호전달 모티프이다. 본 발명에서 사용되는 ITAM의 예는 비제한적인 예로서 TCR제타, FcR감마, FcR베타, FcR엡실론, CD3감마, CD3델타, CD3엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, CAR의 신호전달 변환 도메인은 (SEQ ID NO: 10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 CAR의 신호 변환 도메인은 동시-자극 신호 분자를 포함한다. 동시-자극 분자는 항원 수용체와는 다른 세포 표면 분자, 또는 효율적인 면역 반응을 위해 요구되는 이의 리간드이다. "동시-자극 리간드"는 T-세포 상에서 동족성 동시-자극 분자를 특이적으로 결합시켜, 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합물의 결합에 의해 제공된 1차 신호 이외에, 증식 활성화, 및 분화 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 표출 세포 상의 분자를 지칭한다. 동시-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유발성 동시-자극성 리간드 (ICOS-L), 세포간 접착 분자 (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨(Toll) 리간드 수용체를 결합시키는 효능제 또는 항체, 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 동시-자극 리간드는 또한, 특히, T 세포 상에 존재하는 동시-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, 비제한적으로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
"동시-자극 분자"는 동시-자극 리간드와 특이적으로 결합하여 비제한적으로 증식과 같은, 세포에 의해 동시-자극 반응을 매개하는 T-세포 상의 동족성 결합 파트너를 지칭한다. 동시-자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 동시-자극 분자의 예는 CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 등을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 CAR의 신호 변환 도메인은 4-1BB (GenBank: AAA53133.) 및 CD28 (NP_006130.1)의 분절으로 이루어진 군으로부터 선택된 동시-자극 신호 분자의 일부를 포함한다. 특히, 본 발명의 CAR의 신호 변환 도메인은 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 CAR은 세포의 표면 막 상에서 발현된다. 이에 따라, CAR은 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 적절한 막관통 도메인의 구별되는 특징은 세포, 바람직하게 본 발명에서 면역 세포, 특히 림프구 세포 또는 천연 킬러(NK) 세포의 표면에서 발현되고 사전규정된 타겟 세포에 대해 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 함께 상호작용하는 능력을 포함한다. 막관통 도메인은 천연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 임의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 막관통 폴리펩티드는 T 세포 수용체의 서브유닛, 예를 들어 α, β, γ, 또는 δ, CD3 복합물을 구성하는 폴리펩티드, IL2 수용체 p55 (α 사슬), p75 (β 사슬) 또는 γ 사슬, Fc 수용체의 서브유닛, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질일 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있고, 대개 소수성 잔부, 예를 들어 루신 및 발린을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 막관통 도메인은 인간 CD8 알파 사슬 (예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다. 막관통 도메인은 상기 세포외 리간드-결합 도메인과 상기 막관통 도메인 사이에 줄기 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "줄기 영역"은 일반적으로 세포외 리간드-결합 도메인에 막관통 도메인을 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 줄기 영역은 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 보다 큰 가요성 및 접근성을 제공하기 위해 사용된다. 줄기 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게 10 내지 100개의 아미노산 및 가장 바람직하게 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 줄기 영역은 천연 발생 분자 모두 또는 이의 일부, 예를 들어 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역 모두 또는 이의 일부, 또는 항체 불변 영역 모두 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 줄기 영역은 천연 발생 줄기 서열에 해당하는 합성 서열일 수 있거나, 전부 합성 줄기 서열일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 줄기 영역은 인간 CD8 알파 사슬 (예를 들어, NP_001139345.1)의 일부이다. 다른 특정 구체예에서, 상기 막관통 및 힌지 도메인은 인간 CD8 알파 사슬의 일부를 포함하는데, 이는 SEQ ID NO: 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 바람직하게 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 상기 키메라 항원 수용체는 CD19 모노클론 항체 4G7, CD8 알파 인간 힌지 및 막관통 도메인, CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB 신호전달 도메인으로부터 유래된 scFV를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 4G7 CAR은 SEQ ID NO: 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 포함한다.
타겟 항원의 하향조절 또는 돌연변이는 통상적으로 암 세포에서 관찰되는 것으로서, 항원-손실 이탈 변형체를 생성시킨다. 이에 따라, 종양 이탈(tumor escape)을 상쇄시키고 타겟에 대해 보다 특이적인 면역 세포를 제공하기 위하여, CD19 특이적 CAR은 타겟에서 상이한 구성요소를 동시에 결합시켜 면역 세포 활성화 및 기능을 증가시키도록 다른 세포외 리간드-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 세포외 리간드-결합 도메인은 동일한 막관통 폴리펩티드 상에 나란히 배치될 수 있거나, 링커에 의해 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 상이한 세포외 리간드-결합 도메인은 CAR을 구성하는 상이한 막관통 폴리펩티드 상에 배치될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 각 하나의 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역 세포를 제공하고 상기 세포의 표면에서 각 하나가 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 발현시키는 것을 포함하는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하고 상기 세포에, 각 하나가 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 구성하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 도입하는 것을 포함하는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. CAR의 집단은 각 하나가 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 CAR을 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 상이한 세포외 리간드 결합 도메인은 바람직하게 타겟에서 상이한 구성요소들을 동시에 결합시킬 수 있고, 이에 의해 면역 세포 활성화 및 기능을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 또한, 각 하나가 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 포함하는 단리된 면역 세포에 관한 것이다.
폴리누클레오티드 , 벡터:
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 상술된 CAR을 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 벡터에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 핵산 서열 SEQ ID NO: 17을 포함하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
폴리누클레오티드는 발현 카세트(expression cassette) 또는 발현 벡터로 구성될 수 있다(예를 들어, 박테리아 숙주 세포에 도입하기 위한 플라스미드, 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 곤충 숙주 세포의 트랜스펙션을 위한 바큘로바이러스 벡터, 또는 포유동물 숙주 세포의 트랜스펙션을 위한 렌티바이러스와 같은 플라스미드 또는 바이러스 벡터).
특정 구체예에서, 상이한 핵산 서열은 2A 펩티드를 엔코딩하는 서열과 같은 리보솜 스킵 서열(ribosomal skip sequence)을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나의 폴리누클레오티드 또는 벡터에 포함될 수 있다. 2A 펩티드는 피코르나바이러스의 아프토바이러스 서브그룹에서 확인되는 것으로서, 이는 코돈에 의해 엔코딩된 두 개의 아미노산들 사이에 펩티드 결합의 형성 없이 하나의 코돈에서 다음 코돈으로 리보솜 "스킵(skip)"을 야기시킨다[참조, (Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)]. "코돈(codon)"은 리보솜에 의해 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 mRNA (또는 DNA 분자의 전사 가닥) 상의 세 개의 누클레오티드를 의미한다. 이에 따라, 두 개의 폴리펩티드는 폴리펩티드가 프레임에 존재하는 2A 올리고펩티드 서열에 의해 분리될 때 mRNA 내에 단일의 인접한 개방 판독 프레임으로부터 합성될 수 있다. 이러한 리보솜 스킵 메카니즘은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 단일 메신저 RNA에 의해 엔코딩되는 여러 단백질의 발현을 위한 수 개의 벡터에 의해 사용되는 것으로 알려져 있다.
막관통 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위하여, 분비 신호 서열(또는 리더 서열, 프리프로(prepro) 서열) 또는 프리 서열로서 공지됨)은 폴리누클레오티드 서열 또는 벡터 서열에 제공된다. 분비 신호 서열은 막관통 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되며, 즉, 두 개의 서열은 정확한 판독 프레임에 연결되고, 새로이 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하도록 정위된다. 분비 신호 서열은 통상적으로 고려되는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 정위되며, 특정 분비 신호 서열은 고려되는 핵산 서열에서 다른 곳에 정위될 수 있다[참조, 예를 들어, Welch et al., 미국특허번호 5,037,743; Holland et al., 미국특허번호 5,143,830]. 바람직한 구체예에서, 신호 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18 및 19를 포함한다.
당업자는, 유전 코드의 퇴화의 측면에서, 상당한 서열 변화가 이러한 폴리누클레오티드 분자 중에서 가능한다는 것을 인식할 것이다. 바람직하게, 본 발명의 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해, 바람직하게 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는 제공된 종의 고도로 별현된 유전자에서 일반적으로 흔한 코돈에 의해 이러한 종의 고도로 발현된 유전자에서 일반적으로 드문 코돈의 고려되는 서열의 교환을 지칭하며, 이러한 코돈은 교환되는 코돈으로서 아미노산을 엔코딩한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다.
면역 세포를 조작하는 방법:
포함되는 특정 구체예에서, 본 발명은 면역 세포에 본 발명에 따른 CAR을 도입하고 상기 세포를 확대시키는 것을 포함하는 면역치료를 위한 면역 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 세포를 제공하고, 상기 세포의 표면에서 상술된 바와 같은 적어도 하나의 CAR을 발현시키는 것을 포함하는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 방법은 세포를 상술된 바와 같은 CAR을 엔코딩하는 적어도 하나의 폴리누클레오티드로 변형시키고, 상기 폴리누클레오티드를 상기 세포로 발현시키는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 폴리누클레오티드는 세포에서 안정적으로 발현되는 측면에서 렌티바이러스 벡터에 포함된다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 TCR의 하나의 구성요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자, 면역억제제용 타겟, HLA 유전자 및/또는 면역 체크포인트 유전자, 예를 들어 PDCD1 또는 CTLA-4를 비활성화시킴으로써 상기 세포를 유전적으로 개질시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 유전자는 TCR알파, TCR베타, CD52, GR, PD1 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 T 세포에 상기 유전자를 분할시키는 DNA에 의해 선택적으로 비활성화시킬 수 있는 희귀 절단 엔도누클레아제를 도입하는 것을 추가로 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 희귀 절단 엔도누클레아제는 TALE-누클레아제 또는 Cas9 엔도누클레아제이다.
전달 방법
상술된 상이한 방법은 세포에 CAR을 도입하는 것을 포함한다. 비제한적인 예로서, 상기 CAR은 하나의 플라스미드 벡터에 의해 엔코딩된 이식유전자로서 도입될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 또한, 상기 벡터를 수용한 세포의 동정 및/또는 선택을 위해 제공하는 선택 마커를 함유할 수 있다.
폴리펩티드는 세포에 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 도입의 결과로서 세포에서 인시튜로 합성될 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드는 세포 외측에서 형성되고 이후에 세포로 도입될 수 있다. 세포에 폴리누클레오티드 작제물을 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 비제한적인 예로서, 폴리누클레오티드 작제물을 세포의 게놈에 통합시키는 안정한 변형 방법, 폴리누클레오티드 작제물을 세포의 게놈에 통합시키지 않는 일시적 변형 방법, 및 바이러스 매개 방법을 포함한다. 상기 폴리누클레오티드는 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포솜, 등에 의해 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 일시적 변형 방법은 에를 들어, 마이크로주입, 전기천공 또는 입자 충격을 포함한다. 상기 폴리누클레오티드는 세포에서 발현되는 측면에서, 벡터, 더욱 구체적으로 플라스미드 또는 바이러스에 포함될 수 있다.
조작된 면역 세포
본 발명은 또한, 세포를 조작하기 위한 상기 방법에 의해 얻어질 수 있는 단리된 세포 또는 세포주에 관한 것이다. 특히, 상기 단리된 세포는 상술된 바와 같은 적어도 하나의 CAR을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 단리된 세포는 각 하나가 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 포함한다. 특히, 상기 단리된 세포는 CAR을 엔코딩하는 외인성 폴리누클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 유전적으로 개질된 면역 세포는 항원 결합 메카니즘과 독립적으로 활성화되고 증식한다.
본 발명이 범위에서, 또한, 단리된 면역 세포, 바람직하게 전술된 방법들 중 임의 하나에 따라 얻어진 T-세포가 포함된다. 상기 면역 세포는 선천성 및/또는 후천성 면역 반응의 개시 및/또는 실행에서 기능적으로 포함되는 조혈 기원의 세포를 지칭한다. 본 발명에 따른 상기 면역 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 성인 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 특히 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도다능성 줄기 세포, 전분화 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 예시적인 인간 세포는 CD34+ 세포이다. 상기 단리된 세포는 또한 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포의 확대 및 유전적 개질 이전에, 세포의 공급원은 다양한 비제한적인 방법을 통해 피검체로부터 얻어질 수 있다. 세포는 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 가슴샘 조직, 감염증 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 비-제한적인 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 당업자에게 이용 가능하고 알려진 임의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 건강한 기증자로부터, 암 진단 받은 환자로부터, 또는 감염증으로 진단 받은 환자로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 상이한 표현형 특징을 나타내는 세포의 혼합 집단의 일부이다. 본 발명의 범위에서, 또한 전술된 방법에 따른 변형된 T-세포로부터 얻어진 세포주가 포함된다. 면역억제 처리에 대해 내성이고 상기 방법에 의해 얻어질 수 있는 개질된 세포는 본 발명의 범위에 포함된다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 세포는 CAR을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확대
T 세포의 유전적 개질 이전 또는 후에든지, 본 발명의 유전적으로 개질된 면역 세포가 항원 결합 메카니즘과는 독립적으로 활성화되고 증식함에도 불구하고, 면역 세포, 특히 본 발명의 T-세포는 예를 들어 미국특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국특허출원공개번호 20060121005에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 추가로 활성화되고 일반적으로 확대될 수 있다. T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 확대될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 T-세포에 대한 활성화 신호를 생성시키기 위해 T 세포의 표면 상에서 CD3 TCR 복합물 및 동시-자극 분자를 자극시키는 제제와의 접촉에 의해 확대된다.
예를 들어, 화학물질, 예를 들어 칼슘 이오노포어 A23187, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA), 또는 미토겐 레시틴 유사 식물성응집소 (PHA)가 T-세포에 대한 활성화 신호를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
비제한적인 예로서, T 세포 집단은 표면 상에 고정된 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 분절, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴)과의 접촉에 의해 시험관 내에서 자극화될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 보조 분자의 동시-자극을 위하여, 보조 분자를 결합시키는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극시키기에 적합한 조건 하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양을 위해 적절한 조건은 혈청 (예를 들어, 우태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 증식 및 생존을 위해 필수적인 인자들을 함유할 수 있는 매질 (예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))을 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예를 들어 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 매질은 혈청-부재 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 규정된 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 발현을 위해 충분한 양의 시토카인(들)이 보충된 아미노산, 소듐 피루베이트, 및 비타민이 첨가된, RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함한다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 단지 실험 배양물에 포함되고, 피검체에 주입될 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 타겟 세포는 성장을 지지하는데 필šJ인 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다.
다른 특정 구체예에서, 상기 세포는 조직 또는 세포와 동시-배양함으로써 확대될 수 있다. 상기 세포는 또한 생체 내에서, 예를 들어, 상기 세포를 피검체에 투여한 후 피검체의 혈액에서 확대될 수 있다.
치료 적용
다른 구체예에서, 전술된 바와 같이 상이한 방법에 의해 얻어진 단리된 세포 또는 상기 단리된 세포로부터 유래된 세포주는 약제로서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 약제는 암을 치료하기 위해, 특히 이를 필요로 하는 환자에서 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료를 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 세포 도는 상기 단리된 세포로부터 유래된 세포주는 이를 필요로 하는 환자에서 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다:
(a) 전술된 방법들 중 임의 하나에 의해 얻어질 수 있는 면역-세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 환자에게 상기 변형된 면역 세포를 투여하는 단계.
일 구체예에서, 본 발명의 상기 T 세포는 왕성한 생체내 T 세포 확대를 일으킬 수 있고 연장된 시간 동안 지속할 수 있다.
상기 치료는 완화, 치료 또는 예방일 수 있다. 이는 자가 면역치료의 일부 또는 동종이계 면역치료 요법일 일부일 수 있다. 자가(autologous)는 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포, 세포주 또는 세포의 집단이 상기 환자로부터 또는 인간 백혈구 항원(HLA) 양립 가능한 기증자로부터 기원한 것을 의미한다. 동종이계(allogeneic)는 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포 또는 세포의 집단이 상기 활자로부터 기원하지 않고 기증자로부터 기원한 것을 의미한다.
기술된 방법과 함께 사용될 수 있는 세포는 이전 섹션에 기술된다. 상기 치료는 암 진단 받은 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암은 비고형 종양(예를 들어, 프리-B ALL(소아 징후)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 혈액 종양), 성인 ALL, 맨틀 세포 림프종, 확산 거대 B-세포 림프종, 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료될 암의 타입은 특정 백혈병 또는 림프 악성종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
이는 항체 요법, 화학요법, 시토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택된 암에 대한 하나 이상의 요법과 조합한 치료일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 치료는 면역억제 치료를 수행한 환자에 투여될 수 있다. 실제로, 본 발명은 바람직하게, 세포 또는 세포의 집단에 의존적인데, 이는 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 엔코딩하는 유전자의 비활성화로 인해 적어도 하나의 면역억제제에 대해 내성적이게 만들어졌다. 이러한 양태에서, 면역억제 치료는 환자 내에서 본 발명에 따른 T-세포의 선택 및 확대에 도움이 되어야 한다.
본 발명에 따른 세포 또는 세포의 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수액, 주입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 피하로, 피부내로, 종양내로, 절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내로 또는 림프구내 주입에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게 정맥내 주사에 의해 투여된다.
세포 또는 세포의 집단의 투여는 체중 1 kg 당 104 내지 109개의 세포, 바람직하게 체중 1 kg 당 105 내지 106개의 세포의 투여로 이루어질 수 있으며, 이는 이러한 범위 내의 모든 세포 수의 정수 수치를 포함한다. 세포 또는 세포의 집단은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 세포의 상기 유효량은 단일 용량으로 투여된다. 다른 구체예에서, 세포의 상기 유효량은 소정 시간에 걸쳐 1회 초과의 용량으로서 투여된다. 투여 간격은 관리 전문의의 판단에 따르고 환자의 임상적 상태에 따른다. 세포 또는 세포의 집단은 임의 공급원, 예를 들어 혈액 은행 또는 기증자로부터 얻어질 수 있다. 개개 요구가 달라지지만, 특정 질환 또는 증상에 대한 제공된 세포 타입의 유효량의 최적의 범위의 결정은 당해 분야의 기술에 속한다. 유효량은 치료학적 또는 예방학적 잇점을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투여량은 수용자의 연량, 건강 및 체중, 병용 치료의 종류, 임의의 경우, 치료 횟수 및 요망되는 효과의 특성에 따를 것이다.
다른 구체예에서, 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 조성물의 상기 유효량은 비경구적으로 투여된다. 상기 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내의 주입에 의해 직접적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 세포는 제제, 예를 들어 항바이러스 요법, 시도포비르 및 인터루틴-2, 시타라빈(또한, ARA-C로서 공지됨) 또는 MS 환자에 대한 나탈리지이마브 치료 또는 건선 환자에 대한 에팔리즈티마브 치료 또는 PML 환자에 대한 다른 치료와의 치료를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의 수의 관련 치료 양상과 함께(예를 들어, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여된다. 추가 구체예에서, 본 발명의 T 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들어 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예를 들어 CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다리빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코플리에놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 조사와 함께 사용될 수 있다. 이러한 약물은 칼슘 의존 포스파타제 칼시뉴린(시클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 성장 인자 유도 신호전달을 위해 중요한 p70S6 키나아제 (라파마이신)를 억제한다[Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993]. 추가 구체예에서, 본 발명의 세포 조성물은 환자에게 골수 이식, 화학요법 제제, 예를 들어 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 시클로포스파미드, 또는 항체, 예를 들어 OKT3 또는 CAMPATH을 이용한 T 세포 제거요법과 함께 (예를 들어, 전, 동시 또는 후에) 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 조성물은 하기 B-세포 제거 요법, 예를 들어 CD20과 반응하는 제제, 예를 들어 리툭산 이후에 투여된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 피검체는 말초혈 줄기 세포 이식 후 고용량의 화학요법으로의 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 구체예에서, 이식 후에, 피검체는 본 발명의 확대된 면역 세포의 주입을 수용한다. 추가 구체예에서, 확대된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
다른 정의
- 달리 특정하지 않는 한, 단수 명사, 및 "적어도 하나"는 교대로 사용되고 하나 또는 하나 초과를 의미한다. - 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기는 한-문자 코드에 따라 본원에서 명시되며, 여기서, 예를 들어 Q는 Gln 또는 글루타민 잔기를 의미하며, R은 Arg 또는 아르기닌 잔기를 의미하며, D는 Asp 또는 아스파르트산 잔기를 의미한다.
- 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미하며, 예를 들어, 펩티드 서열에서 아르기닌 잔기의 글루타민 잔기로의 대체는 아미노산 치환이다.
- 누클레오티드는 하기와 같이 명시된다: 한-문자 코드는 누클레오시드의 염기를 명시하기 위해 사용된다: a는 아데닌이며, t는 티민이며, c는시토신이며, g는 구아닌이다. 명시된 누클레오티드에 대하여, r은 g 또는 (푸린 누클리오티드)를 나타내며, k는 g 또는 t를 나타내며, s는 g 또는 c를 나타내며, w는 a 또는 t를 나타내며, m은 a 또는 c를 나타내며, y는 t 또는 c를 나타내며(피리미딘 누클레오티드), d는 g, a 또는 t를 나타내며, v는 g, a 또는 c를 나타내며, b는 g, t 또는 c를 나타내며, h는 a, t 또는 c를 나타내며, n은 g, a, t 또는 c를 나타낸다.
- 본원에서 사용되는 "핵산" 또는 "폴리누클레오티드"는 누클레오티드 및/또는 폴리누클레오티드, 예를 들어 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고누클레오티드, 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 생성된 분절, 및 결찰, 절단, 엔도누클레아제 작용 및 엑소누클레아지 작용 중 임의에 의해 생성된 분절을 지칭한다. 핵산 분자는 천연 발생 누클레오티드(예를 들어, DNA 및 RNA), 또는 천연 발생 누클레오티드의 유사체(예를 들어, 천연 발생 누클레오티드의 거울상이성질체 형태), 또는 둘 모두의 조합인 모노머로 이루어질 수 있다. 개질된 누클레오티드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 도는 푸린 염기 모이어티에서 변경을 가질 수 있다. 당 개질은 예를 들어, 하나 이상의 하이드록실 기를 할로겐, 알킬 기, 아민 및 아지도 기로 대체시키는 것을 포함하거나, 당이 에테르 또는 에스테르로서 작용화될 수 있다. 또한, 전체 당 모이어티는 입체적으로 그리고 전자적으로 유사한 구조, 예를 들어 아자-당 및 카보시클릭 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서 개질의 예는 알킬화된 푸린 및 피리미딘, 아실화된 푸린 또는 피리미딘, 또는 다른 널리 공지된 헤테로시클릭 치환체를 포함한다. 핵산 모노머는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
- 키메라 항원 수용체 (CAR)는 타겟 세포 상에 존재하는 성분, 예를 들어, 특이적 항-타겟 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성시키기 위해 타겟 세포 상에 존재하는 성분에 대한 결합 도메인, 에를 들어 요망되는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성에 대한 결합 도메인을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자를 의도한다. 일반적으로, CAR은 T 세포 항원 수용체 복합물 제타 사슬의 세포내 신호전달 도메인(scFvFc:ζ)에 융합된 세포외 단쇄 항체(scFvFc)로 이루어지고, T 세포에서 발현될 때, 모노클론 항체의 특이성을 기반으로 한 항원 인지를 다시 유도하는 능력을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 CAR의 일 예는 CD19 항원에 대해 유도하는 CAR이고, 비제한적인 예로서 아미노산 서열 : SEQ ID NO: 14를 포함할 수 있다.
- 용어 "엔도누클레아제"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게 DNA 분자 내에서 핵산 간의 결합의 가수분해(분열)를 촉매화할 수 있는 임의 야생형 또는 변형체 효소를 지칭한다. 엔도누클레아제는 이의 서열과는 무관하게 DNA 또는 RNA 분자를 분열시키지 않고, 특이적 폴리누클레오티드 서열에서 DNA 또는 RNA 분자를 인지하고 분열시키며, 이는 "타겟 서열" 또는 "타겟 부위"로서 추가로 지칭된다. 엔도누클레아제는 통상적으로 길이가 12개 초과의 염기 쌍(bp), 더욱 바람직하게 14 내지 55 bp의 폴루누클레오티드 인지 부위를 가질 때 희귀 절단 엔도누클레아제로서 분류될 수 있다. 희귀 절단 엔도누클레아제는 규정된 장소에서 DNA 이중 가닥 파괴(DSB)를 유도함으로써 HR을 크게 증가시킨다[Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007]. 희귀 절단 누클레아제는 예를 들어, 호밍(homing) 엔도누클레아제(Paques and Duchateau 2007), 조작된 아연-핑거 도메인과 FokI와 같은 제한 효소의 촉매 도메인과의 융합으로부터 야기되는 키메라 아연-핑거 누클레아제(ZFN)(Porteus and Carroll 2005), CRISPR 시스템으로부터의 Cas9 엔도누클레아제 (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) 또는 화학적 엔도누클레아제 (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006)일 수 있다. 화학적 누클레아제에서, 화학적 또는 펩티드 분열제는 핵산의 폴리머에 또는 특이적 타겟 서열을 인지하는 다른 DNA에 콘주게이션되고, 이에 의해 분열 활성을 특이적 서열에 타겟화한다. 화학적 엔도누클레아제는 또한, 오르쏘페난트롤린의 콘주게이트와 같은 합성 누클레아제, DNA 분열 분자, 및 특이적 DNA 서열을 결합시키는 것으로 알려진 삼중-형성 올리고누클레오티드(TFO)를 포함한다(Kalish and Glazer 2005). 이러한 화학적 엔도누클레아제는 본 발명에 따른 용어 "엔도누클레아제"에 포함된다.
- "TALE-누클레아제"(TALEN)는 통상적으로 핵산 타겟 서열을 분열시키기 위한 하나의 누클레아제 촉매 도메인 및 전사 활성제 유사 이펙터(TALE)로부터 유래된 핵산-결합 도메인으로 이루어진 융합 단백질로 의도된다. 촉매 도메인은 바람직하게 누클레아제 도메인, 및 더욱 바람직하게 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I와 같은, 엔도누클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 구체예에서, TALE 도메인은 예를 들어 I-CreI 및 I-OnuI 또는 이의 기능적 변형체와 같은 메가누클레아제에 융합될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 누클레아제는 모노머 TALE-누클레아제이다. 모노머 TALE-누클레아제는 WO2012138927에 기술된 I-TevI의 촉매 도메인과 조작된 TAL 반복체의 융합과 같은, 특이적 인지 및 분열을 위한 다이머화를 필요로 하지 않는 TALE-누클레아제이다. 전사 활성제 유사 이펙터(TALE)는 복수의 반복된 서열을 포함하는 박테리아 종 잔토모나스로부터의 단백질로서, 각 반복체는 핵산 타겟화된 서열의 각 누클레오티드 염기에 특이적인 12 및 13번 위치에서디-잔기를 포함한다(RVD). 유사한 모듈형 염기-당-염기 핵산 결합 성질(MBBBD)을 갖는 결합 도메인은 또한, 최근에 상이한 박테리아 종에서 본 출원인에 의해 발견된 신규한 모듈형 단백질로부터 유래될 수 있다. 신규한 모듈형 단백질은 TAL 반복물 보다 더욱 서열 가변성을 나타내는 장점을 갖는다. 바람직하게, 상이한 누클레오티드의 인지와 관련된 RVD는 C의 인지를 위한 HD, T의 인지를 위한 NH, A의 인지를 위한 NI, G의 인지를 위한 NN, 또는 A, C, G 또는 T의 인지를 위한 NS, T의 인지를 위한 HG, T의 인지를 위한 IG, G의 인지를 위한 NK, C의 인지를 위한 HA, C의 인지를 위한 ND, C의 인지를 위한 HI, G의 인지를 위한 HN, G의 인지를 위한 NA, G 똔는 A의 인지를 위한 SN, 및 T의 인지를 위한 YG, A의 인지를 위한 TL, A 또는 G의 인지를 위한 VT, 및 A의 인지를 위한 SW이다. 다른 구체예에서, 임계적 아미노산 12 및 13은 누클레오티드 A, T, C 및 G에 대한 이의 특이성을 조절하고 특히 이의 특이성을 향상시키기 위하여 다른 아미노산 잔기에 대해 돌연변이화될 수 있다. TALE-누클레아제는 이미 기술되어 있고, 유전자 타겟화 및 유전제 개질을 자극화하기 위해 사용된다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). 조작된 TAL-누클레아제는 상표명 TALENTM (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France)으로 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명에 따른 희귀 절단 엔도누클레아제는 또한, Cas9 엔도누클레아제일 수 있다. 최근에, 신규한 게놈 공학 툴은 타입 II 원핵 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats) 후천성 면역 시스템으로부터의 RNA-가이드 Cas9 누클레아제(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013)를 기반으로 하여 개발되었다[참조, review (Sorek, Lawrence et al. 2013)]. CRISPR 관련 (Cas) 시스템은 먼저 박테리아에서 발견되었고 바이러스 또는 플라스미드 중 어느 하나의 외래 DNA에 대한 방어로서 기능함을 발견하였다. CRISPR-매개 게놈 조작은 먼저 프로토-스페이서 인접 모티프(PAM)로서 지칭되는 짧은 서열 모티프에 의해 종종 측면에 있는 타겟 서열의 선택에 의해 진행한다. 타겟 서열 선택 이후에, 이러한 타겟 서열에 대해 상보적인 특이적 crRNA는 조작된다. 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)는 crRNA에 대해 쌍을 갖는 CRISPR 타입 II 시스템에서 요구되고, 제공된 Cas9 단백질에 결합된다. Cas9는 분자 고정체로서 작용하여 tracRNA와 cRNA의 염기 쌍형성을 촉진시킨다(Deltcheva, Chylinski et al. 2011). 이러한 삼원 복합물에서, 이중 tracrRNA:crRNA 구조는 동족 타겟 서열에 엔도누클레아제 Cas9를 유도하는 가이드 RNA로서 작용한다. Cas9-tracrRNA:crRNA 복합물에 의한 타겟 인지는 타겟 서열과 crRNA 간의 상동성에 대한 타겟 서열을 스캐닝함으로써 개시된다. 타겟 서열-crRNA 상보성 이외에, DNA 타겟화는 프로토스페이서에 인접한 짧은 모티프의 존재를 필요로 한다(프로토스페이서 인접 모티프 - PAM). 이중-RNA와 타겟 서열 간의 쌍형성 후에, Cas9는 이후에 PAM 모티프의 업스트림에 블런트 이중 가닥 브레이크 3 염기를 도입한다(Garneau, Dupuis et al. 2010).
희귀 절단 엔도누클레아제는 또한 메가누클레아제의 명칭으로 알려진, 호밍 엔도누클레아제일 수 있다. 이러한 호밍 엔도누클레아제는 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Stoddard 2005). 호밍 엔도누클레아제는 DNA 타겟 서열을 인지하고 단일- 또는 이중-가닥 파괴를 발생시킨다. 호밍 엔도누클레아제는 고도로 특이적이어서, 길이가 12 내지 45개 범위의 염기 쌍(bp), 대개 길이가 14 내지 40 범위의 bp의 DNA 타겟 부위를 인지한다. 본 발명에 따른 호밍 엔도누클레아제는 예를 들어, LAGLIDADG 엔도누클레아제, HNH 엔도누클레아제, 또는 GIY-YIG 엔도누클레아제에 해당할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 호밍 엔도누클레아제는 I-CreI 변형체일 수 있다.
- "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은 세포와 본 발명에서 요구되는 제제/화학물질 및 분자(단백질 또는 핵산)를 접촉하게 하고(즉, "접촉") 도는 세포 또는 준세포 구획 내측에 본 발명에서 요구되는 제제/화학물질 및 분자(단백질 또는 핵산)를 전달(즉, "도입")하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 임의 전달 벡터를 의미한다. 이는 리포솜 전달 벡터, 바이러스 전달 벡터, 약물 전달 벡터, 화학적 캐리어, 폴리머 캐리어, 리포플렉스, 폴리플렉스, 덴드리머, 마이크로버블(초음파 콘트라스트 제제), 나노입자, 에멀젼 또는 다른 적절한 전사 벡터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 전달 벡터는 디아토스(Diatos)에 의해 개발된 분자, 화학물질, 거대분자(유전자, 단백질), 또는 다른 벡터, 예를 들어 플라스미드, 펩티드를 전달할 수 있다. 이러한 경우에, 전달 벡터는 분자 캐리어이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은 또한, 트랜스펙션을 수행하기 위한 전달 방법을 의도한다.
- 용어 "벡터" 또는 "벡터들"은 연결된 다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에서 "벡터"는 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 또는 염색체, 비-염색체, 반-합성 또는 합성 핵산으로 이루어질 수 있는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직한 벡터는 연결되는 핵산의 자율 복제(에피솜 벡터) 및/또는 발현을 가능하게 하는 것이다(발현 벡터). 다수의 적합한 벡터는 당업자에게 알려져 있고, 상업적으로 입수 가능하다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 파르보바이러스(예를 들어, 아데노 관련 바이러스), 코로나바이러스, 네가티브 가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 오르소-믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스 (예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (예를 들어, 홍역 및 센다이), 포지티브 가닥 RNA 바이러스, 예를 들어 피노르나바이러스 및 알파바이러스, 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1 및 2, 엡스테인-바르 바이러스, 시토메갈로바이러스), 및 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아, 계두, 및 카나리아 두창)를 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스를 포함한다. 다른 바이러스는 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스, 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 새의 백혈증 육종(avian leukosis-sarcoma), 포유동물 C-타입, B-타입 바이러스 D 타입 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다(Coffin, J. M., Retroviridae: The Virus and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- "렌티바이러스 벡터"는 비교적 큰 패키징 용량, 감소된 면역원성 및 큰 범위의 상이한 세포 타입을 높은 효능으로 안정적으로 변화시키는 이의 능력으로 인해 유전자 전달에 대해 매우 유망한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 대개 세 가지(패키징, 엔벨로프 및 전사) 또는 그 초과의 플라스미드의 생산자 세포로의 일시적 트랜스펙션 후에 발생된다. HIV와 같이, 렌티바이러스 벡터는 세포 표면 상에 수용체와 바이러스 표면 글리코단백질의 상호작용을 통해 타겟 세포에 들어간다. 진입 시에, 바이러스 RNA는 역 전사되며, 이는 바이러스 역전사효소 복합물에 의해 매개된다. 역전사의 생성물은 이중가닥 선형 바이러스 DNA로서, 이는 감염된 세포의 DNA에서 바이러스 통합을 위한 기질이다. "통합 렌티바이러스 벡터 (또는 LV)"는 비제한적인 예로서 타겟 세포의 게놈을 통합할 수 있는 이러한 벡터를 의미한다. 상반되게, "비-통합 렌티바이러스 벡터 (또는 NILV)"는 바이러스 인테그라제의 작용을 통해 타겟 세포의 게놈을 통합하지 않는 효율적인 유전자 전달 벡터를 의미한다.
- 전달 벡터 및 벡터들은 초음파천공 또는 전기천공 도는 이러한 기술의 유도체와 같은 임의 세포 침투 기술과 관련되거나 이와 조합될 수 있다.
- 세포 또는 세포들은 임의 살아있는 진핵 세포, 1차 세포, 및 시험관내 배양을 위한 이러한 유기물로부터 유래된 세포주를 의도한다.
- "1차 세포" 또는 "1차 세포"는 살아있는 조직(즉, 생검 물질)로부터 직접적으로 얻어지고 시험관 내에서 성장시키기 위해 확립된 세포를 의미하는 것으로서, 이는 매우 적은 집단 이중화를 나타내고, 이에 따라 연속 종양원성 또는 인공적으로 무한증식 세포주와 비교하여 유래된 조직의 주요 기능성 성분 및 특징을 더욱 대표하는 것이다.
비-제한적인 예로서, 세포주는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; Jurkat 세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; Molt 4 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 이러한 세포주는 고려되는 유전자 또는 단백질을 형성시키고, 발현시키고, 정량화시키고, 검출하고, 연구하기 위해 세포주 모델을 제공하기 위한 본 발명의 방법에 의해 개질될 수 있다. 이러한 모델은 또한 연구 및 생산, 및 다양한 분야, 예를 들어 비제한적인 에로서 화학물질, 바이오연료, 치료제 및 농업 경영학에서 고려되는 생물학적 활성 분자를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
- "돌연변이"는 폴리누클레오티드(cDNA, 유전자) 또는 폴리펩티드 서열에서 최대 1, 2,, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 그 이상의 누클레오티드/아미노산의 치환, 제거, 삽입을 의미한다. 돌연변이는 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 이는 또한, 게놈 서열의 구조 또는 엔코딩된 mRNA의 구조/안정성에 영향을 미칠 수 있다.
- "변형체(들)"는 모 분자의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 잔기의 돌연변이 또는 대체에 의해 얻어진 반복 변형체, 변형체, DNA 결합 변형체, TALE-누클레아제 변형체, 폴리펩티드 변형체를 의미한다.
- "기능성 변형체"는 단백질 또는 단백질 도메인의 촉매적 활성 돌연변이체를 의미한다. 이러한 돌연변이체는 이의 모 단백질 또는 단백질 도메인 또는 추가 성질과 비교하여 동일한 활성, 또는 보다 높거나 보다 낮은 활성을 가질 수 있다.
- "동일성"은 두 개의 핵산 분자 또는 폴리펩티드 간의 서열 동일성을 지칭한다. 동일성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각 서열에서 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기에 의해 점유될 때, 분자는 그러한 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열 간의 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열에 의해 공유된 위치에서 동일하거나 매칭 누클레오티드의 수의 함수이다. 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램은 FASTA, 또는 GCG 서열 분석 패키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 일부로서 이용 가능한 BLAST를 포함하는, 두 개의 서열들 간에 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 디폴트 셋팅(default setting)로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 특이적 폴리펩티드에 대한 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지고 바람직하게 동일한 기능을 실질적으로 나타내는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 고려된다.
- "유사성"은 둘 이상의 폴리펩티드의 아미노산 서열들 간의 관계를 기술한다. BLASTP는 또한, BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80와 같은 유사성 매트릭스를 사용하여 기준 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 유사성 스코어는 BLOSUM62의 사용을 기반으로 할 것이다. BLASTP를 사용할 대, 유사성 백분율은 BLASTP 포지티브 스코어를 기반으로 하며, 서열 동일성 백분율은 BLASTP 동일성 스코어를 기반으로 한다. BLASTP "동일성"은 동일한 높은 스코어링 서열 쌍에서 전체 잔기의 수 및 분율을 나타내며, BLASTP "포지티브"는 정렬 스코어가 포지티브 수치를 가지고 서로 유사한 잔기의 수 및 분율을 나타낸다. 이러한 동일성 또는 유사성의 정도 및 본원에 기술된 아미노산 서열에 대한 동일성 또는 유사성의 임의 중간 정도를 갖는 아미노산 서열은 이러한 명세서에서 고려된 이에 의해 포함된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리누클레오티드 서열은 유전 코드를 사용하여 추정되고 통상적인 수단에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 기능적 변형체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 유전적 코드를 사용하여 이의 아미노산 서열을 역 번역함으로써 형성될 것이다.
- "신호-변환 도메인" 또는 "동시-자극 리간드"는 T-세포 상에 동족 동시-자극 분자를 특이적으로 결합시켜 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합물의 결합에 의해 제공된 1차 신호 이외에 증식 활성화, 분화 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 표출 세포 상의 분자를 지칭한다. 동시-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유발성 동시-자극성 리간드 (ICOS-L), 세포간 접착 분자 (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨 리간드 수용체를 결합시키는 효능제 또는 항체, 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 동시-자극 리간드는 또한, 특히, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83와 특이적으로 결합하는 리간드와 같은(이로 제한되지 않음), T 세포 상에 존재하는 동시-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
동시-자극 분자"는 동시-자극 리간드와 특이적으로 결합하여 증식과 같은 (그러나 이로 제한되지 않음) 세포에 의해 동시-자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족성 결합 파트너를 지칭한다. 동시-자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "동시-자극 신호"는 TCR/CD3 결찰과 같은 1차 신호와 조합하여 T 세포 증식 증식 및/또는 중요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 야기시키는 신호로 지칭된다.
- 본원에서 사용되는 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드를 결합시킬 수 있는 올리고- 또는 폴리펩티드로서 규정된다. 바람직하게, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 타겟 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인지하기 위해 선택될 수 있다. 이에 따라, 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염증, 자가면역 질환 및 암 세포와 관련된 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "피검체" 또는 "환자"는 비-인간 영장류 및 인간을 포함하는 동물계의 모든 일원을 포함한다.
본 발명의 상기 기술된 설명은 당업자가 동일하게 만들고 사용할 수 있도록 이를 만들고 사용하는 방식 및 공정을 제공하며, 이러한 실시가능성은 특히, 본래 설명의 일부를 구성하는, 첨부된 청구범위의 대상에 대해 제공된다.
수치 한계 또는 범위가 본원에 기술되는 경우에, 종결점이 포함된다. 또한, 수치 한계 또는 범위 내에서의 모든 수치 및 하위범위는 마치 명확하게 기술한 바와 같이 상세하게 포함된다.
상기 설명은 당업자가 본 발명을 제조하고 사용할 수 있을 정도로 제시되고, 특정 적용 및 이의 요건의 상황에서 제공된다. 바람직한 구체예에 대한 다양한 변형예는 당업자에게 용이하게 명백하게 될 것이며, 본원에서 규정된 일반적인 원리는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 구체예 및 적용에 적용될 수 있다. 이에 따라, 이러한 발명은 기술된 구체예로 한정되도록 의도되지 않고, 본원에 기술된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 범위에 부합될 것이다.
본 발명에서 일반적으로 기술되는 경우에, 추가 이해는 특정의 특별한 실시예를 참조로 하여 얻어질 수 있으며, 이는 본원에서 단지 예시를 목적으로 제공되고, 달리 명시하지 않는 한 제한적인 것으로서 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 4G7 -CAR를 발현시키는 TCR알파 비활성화된 세포의 증식
T-세포 수용체 알파 불변 사슬 영역(TRAC) 유전자 내에서 15-bp 스페이서에 의해 분리된 두 개의 17-bp 긴 서열을 타겟화하는 헤테로다이머 TALE-누클레아제(절반 타켓이라 불리워짐)를 디자인하고 형성시켰다. 각 절반 타겟을 표 1에 기술된 절반 TALE-누클레아제의 반복물에 의해 인지하였다.
Figure 112015121745673-pct00001
각 TALE-누클레아제 작제물을 T7 프로모터의 제어 하에서 포유동물 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 사용하여 서브클로닝하였다. TRAC 게놈 서열을 분열시키는 TALE-누클레아제를 엔코딩하는 mRNA를 T7 프로모터로부터 다운스트림의 코딩 서열을 운반하는 플라스미드로부터 합성하였다.
항CD3/CD28 코팅된 비드로 72시간 동안 전활성화된 정제된 절반 RAC_T01 TALE-누클레아제 둘 모두를 엔코딩하는 2 mRNA 각각으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션후 48시간 후에, T 세포를 4G7-CAR을 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터(SEQ ID NO: 14)로 변환시켰다. 변환후 2일 후에, CD3NEG 세포를 항-CD3 자성 비드를 사용하여 정제하고, 변환후 5일 후에, 세포를 가용성 항-CD28 (5 μg/ml)로 재활성화하였다.
세포 증식을 주당 세포를 2배로 카운팅하여 재활성화후 최대 30일 동안 이어졌다. 도 1은 두 명의 상이한 기증자에 대해 재활성화후 2일째에 나타난 세포의 양에 대한 세포 수의 배가 유도를 나타낸다. 특히, 항-CD28과 재활성화될 때, 4G7-CAR을 발현시키는 TCR 알파 비활성화된 세포의 증가된 증식은 비-변환된 세포와 비교하여 관찰되었다.
4G7-CAR을 발현시키는 인간 T 세포가 활성화된 상태를 나타내는 지의 여부를 좃하기 위하여, 활성화 마커 CD25의 발현을 변환후 7일 후에 FACS 7에 의해 분석하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 4G7-CAR을 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환된 정제된 세포는 비-변환된 세포 보다 이의 표면에서 상당히 더욱 CD25를 발현시켰다. 증가된 CD25 발현은 CD28 재활성화에서 도는 비-재활성화 조건 둘 모두에서 관찰되었다.
실시예 2: 4G7 -CAR 및 전통적인 FMC63 -CAR을 발현시키는 1차 인간 T 세포의 기저 활성화의 비교
4G7 scFV가 변환된 세포 상에서 지연된 "활성화된" 상태를 부여하는 지를 결정하기 위하여, 4G7 scFV (SEQ ID NO: 17 엔코딩된 SEQ ID NO: 15) 또는 전통적인 FMC63 scFV (SEQ ID NO: 16)를 번식시키는 CAR로 변환된 T 세포의 기저 활성화를 비교하였다.
정제된 인간 T 세포를 하기 프로토콜에 따라 변환시켰다: 간단하게, 1x106 CD3+ 세포를 3일 동안 항 CD3/CD28 코팅된 비드로 재활성화시켰으며, 재조합 IL2를 30μg/ml 레트로넥틴으로 코팅된 12-웰 비조직 배양 플레이트에서 5의 MOI에서 4G7-CAR (SEQ ID NO: 15) 및 FMC63-CAR (SEQ ID NO: 16)을 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환시켰다. 변환후 24시간 후에, 매질을 제거하고, 새로운 매질로 대체하였다. 이후에, 세포를 2 내지 3일 마다 세포 목록에 의해 배양 시간 전반에 걸쳐 1x106 세포/ml의 농도에서 유지시켰다.
4G7-CAR 또는 FMC63-CAR을 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환후 3, 8 및 15일 후에, CAR 발현 세포의 백분율을 유량세포분석법에 의해 평가하였다. 변환의 효능이 두 개의 렌티바이러스 벡터와 비교적 동일하다는 것으로 관찰되었다(도 3).
이후에, 4G7-CAR을 발현시키는 인간 T 세포가 FMC63-CAR를 발현시키는 인간 T 세포 보다 더욱 활성화된 상태를 나타내는 지의 여부를 조사하였다. 그러한 목적을 위하여, 활성화 마커 CD25의 발현을 상이한 시점에서 2 렌티바이러스 벡터로 변환된 T 세포의 표면에서 비교하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 변환 후 3 및 8일 후에, 4G7-CAR을 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환된 세포는 FMC63-CAR을 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환된 세포 보다 이의 표면에서 매우 더욱 큰 CD25를 발현시켰다.
4G7-CAR 또는 FMC63-CAR 변환된 세포의 크기는 또한, 상이한 시점에서 유량세포분석법에 의해 평가되었다. 4G7-CAR을 발현시키는 세포가 변환 후 3, 8 및 15일 후에 FMC63-CAR을 발현시키는 세포 보다 더욱 큰 것으로 관찰되었다(도 5).
시험관 내 비-특이적 활성화 후에, 4G7-CAR 변환된 세포는 연장된 시간에 걸쳐 증가된 세포 크기(블라스트 형성), 뿐만 아니라 활성화 마커(CD25)의 발현을 나타낸다. 이러한 장기 활성화는 FMC63 ScFv를 함유한 유사한 CAR로 변환된 세포와 비교하여 연장된 증식을 허용한다.
실시예 3: 4G7 -CAR 및 전통적인 FMC63 -CAR을 발현시키는 1차 인간 T 세포의 증식의 비교
4G7 scFV가 보다 높은 증식 활성을 부여하는 지의 여부를 결정하기 위하여, 4G7 scFV (SEQ ID NO: 17 엔코딩된 SEQ ID NO: 15) 또는 전통적인 FMC63 scFV (SEQ ID NO: 16)를 번식시키는 CAR로 변환된 T 세포의 증식은 주당 세포를 2배로 카운팅함으로써 최대 20일까지 이어졌다. 정제된 인간 T 세포를 하기 프로토콜에 따라 변환시켰다: 간단하게, 1x106 CD3+ 세포는 3일 동안 항 CD3/CD28 코팅된 비드로 전활성화되었으며, 재조합 IL2를 4G7-CAR (SEQ ID NO: 15) 및 FMC63-CAR (SEQ ID NO: 16)를 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터로 변환시켰다. 이후에, 세포를 전통적인 조건 하에서 유지시키고, 12일 째에 재활성화하였다. 세포를 동일한 밀도로 시딩하고, 20일 동안 주 당 두배로 카운팅하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 4G7-CAR을 발현시키는 T-세포의 증식 활성은 전통적인 FMC63-CAR을 발현시키는 세포의 증식 활성과 비교하여 2배 더 높았다.
참조문헌
Figure 112015121745673-pct00002
Figure 112015121745673-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Cellectis <120> CD19 SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND USES THEREOF <130> <150> PCT/US2013/040755 <151> 2013-05-13 <150> PCT/US2013/040766 <151> 2013-05-13 <150> US 13/892,805 <151> 2013-05-13 <150> USP 61/888,259 <151> 2013-10-08 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 464 <212> PRT <213> mus musculus <220> <223> anti-human CD19 monoclonal antibody 4G7 immunoglobulin gamma1 heavy chain <400> 1 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 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gtggtggaag 2580 gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640 aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700 tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760 gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814 <210> 24 <211> 2832 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60 gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120 cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180 ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240 ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300 gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360 acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420 attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480 acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 540 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720 gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140 agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200 caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260 caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320 ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440 atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500 ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560 ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740 gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1860 gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040 caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100 cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160 gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220 agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280 ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340 gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400 aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460 gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520 caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580 cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640 tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700 tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760 ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820 gccgactgat aa 2832

Claims (22)

  1. 하나 이상의 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인(transmembrane domain), 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CD19 특이적 키메라 항원 수용체로서, 상기 세포외 도메인이 CD19에 대해 특이적인 모노클론 항체 4G7로부터 유래된 단쇄 FV 분절을 포함하고, 상기 단쇄 FV 분절은 SEQ ID NO: 3의 CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 감마 1 중쇄의 가변성 분절 및 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 카파 경쇄의 가변성 분절을 포함하는, CD19 특이적 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단쇄 FV 분절이 SEQ ID NO: 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는, CD19 특이적 키메라 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, CD19 특이적 키메라 항원 수용체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB 도메인을 포함하는, CD 19 특이적 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서, 인간 CD8 알파 사슬 막관통 및 줄기 도메인(stalk domain)을 포함하는, CD19 특이적 키메라 항원 수용체.
  6. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 14 또는 15의 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CD19 특이적 키메라 항원 수용체.
  7. 제1항에 있어서, CD19에 대해 특이적이지 않은 다른 세포외 리간드 결합 도메인을 추가로 포함하는, CD19 특이적 키메라 항원 수용체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 상기 키메라 항원 수용체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 핵산 서열 SEQ ID NO: 17과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
  10. 제8항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  11. 하나 이상의 세포외 리간드 결합 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 세포 표면 막에서 발현하는 유전자 조작된 면역 세포로서, 상기 세포외 도메인이 CD19에 대해 특이적인 모노클론 항체 4G7로부터 유래된 단쇄 FV 분절을 포함하고, 상기 단쇄 FV 분절은 SEQ ID NO: 3의 CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 감마 1 중쇄의 가변성 분절 및 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 CD19 모노클론 항체 4G7 면역글로불린 카파 경쇄의 가변성 분절을 포함하는, 유전자 조작된 면역 세포.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 세포 표면 막에서 발현하는, 유전자 조작된 면역 세포.
  13. 제11항에 있어서, CD19에 대해 특이적이지 않은 다른 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 면역 세포.
  14. 제11항에 있어서, 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로부터 유래된, 유전자 조작된 면역 세포.
  15. 제13항에 있어서, 상기 세포는 건강한 기증자(donor)로부터 유래된, 유전자 조작된 면역 세포.
  16. 제13항에 있어서, 상기 세포는 암 진단 받은 환자로부터 유래된, 유전자 조작된 면역 세포.
  17. 치료법에서 사용하기 위한, 제13항에 따른 유전자 조작된 세포.
  18. B-세포 림프종 또는 백혈병 치료에서 사용하기 위한, 제13항에 따른 유전자 조작된 세포.
  19. (a) 면역 세포를 제공하고,
    (b) 상기 세포의 표면에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 발현시키는 것을 포함하는, 면역 세포를 조작하는 시험관내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    (a) 면역 세포를 제공하고,
    (b) 상기 세포에 상기 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드를 도입하고,
    (c) 상기 폴리누클레오티드를 상기 세포로 발현시키는 것을 포함하는, 면역 세포를 조작하는 시험관내 또는 생체 외 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    (a) 면역 세포를 제공하고,
    (b) 상기 세포에 상기 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드를 도입하고,
    (c) CD19에 대해 특이적이지 않은 하나 이상의 다른 키메라 항원 수용체를 도입하는 것을 포함하는, 면역 세포를 조작하는 시험관내 또는 생체 외 방법.
  22. 표면에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 발현시키는 면역 세포를 포함하는, B-세포 림프종 또는 백혈병을 치료하기 위한 약학적 조성물.
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