JP2016520074A - Ｃｄ１９特異的キメラ抗原受容体およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）に関する。CARは、リガンド結合ドメイン特性を活用して、免疫細胞の特異性および反応性を選択された標的へ向け直すことができる。具体的には、本発明は、細胞外リガンド結合が、CD19モノクローナル抗体、好ましくは4G7に由来するscFVであるキメラ抗原受容体に関する。本発明は、CARをコードするポリヌクレオチド、ベクター、およびCARを表面に発現する単離された細胞にも関する。本発明は、形質導入された細胞により長期間の「活性化」状態を付与する4G7-CARを表面に発現するように免疫細胞を操作する方法にも関する。本発明は、B細胞リンパ腫およびB細胞白血病の処置のために特に有用である。

Description

発明の分野
本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）に関する。CARは、リガンド結合ドメイン特性を活用して、免疫細胞の特異性および反応性を選択された標的へ向け直すことができる。具体的には、本発明は、細胞外リガンド結合が、CD19モノクローナル抗体、好ましくは、4G7に由来するscFVであるキメラ抗原受容体に関する。本発明は、CARをコードするポリヌクレオチド、ベクター、およびCARを表面に発現する単離された細胞にも関する。本発明は、形質導入された細胞により長期間の「活性化」状態を付与する4G7-CARを表面に発現するように免疫細胞を操作する方法にも関する。本発明は、B細胞リンパ腫およびB細胞白血病の処置のために特に有用である。

発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫治療は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫治療のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park,Rosenberg et al.2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。

T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena,Dotti et al.2010）。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティングモエティからなる合成受容体である。一般に、CARの結合モエティは、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合モエティも、成功裡に使用されている。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裡に向け直すことが示されたが、より長期間の増大および抗腫瘍活性をインビボで提供することはできなかった。CARによって改変されたT細胞の生存を増強し、増殖を増加させるため、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）付加された。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対して、T細胞が向け直されることを、成功裡に可能にしている（Jena,Dotti et al.2010）。

大部分のB急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）が一様にCD19を発現しており、非造血細胞、ならびに骨髄系細胞、赤血球、およびT細胞、および骨髄幹細胞には発現が存在しないため、CD19は、免疫治療の魅力的な標的である。見込みのある抗腫瘍応答を有する、B細胞悪性疾患におけるCD19を標的とする臨床試験が、進行中である。大部分が、CD19特異的マウスモノクローナル抗体FMC63のscFv領域に由来する特異性を有するキメラ抗原受容体（CAR）を発現するよう遺伝子改変されたT細胞を注入している（Nicholson,Lenton et al.1997；Cooper,Topp et al.2003；Cooper,Jena et al.2012）（国際出願：WO2013/126712）。しかしながら、そのようなCARを発現する細胞が、有意な臨床的利点に達することを可能にするためには、T細胞増殖とのよりよい適合性を示すCARの構築を改善することが、依然として必要とされている。

本発明者らは、CD19特異的モノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含むCD19特異的CAR（4G7-CAR）を生成し、得られた4G7-CARの初代T細胞への導入が、抗原結合と無関係に、形質導入された細胞により長期間の「活性化」状態を付与し得ることを、驚くべきことに見出した。（例えば、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよび組換えIL2による）インビトロの非特異的な活性化の後、これらの細胞は、FMC63 scFVを含む類似したCARによって形質導入された細胞と比較して、より長期間にわたり、増加した細胞サイズ（芽細胞形成）および活性化マーカー（CD25）の発現を示した。この長期活性化は、より長期間の増殖を可能にし、インビトロでの4G7-CAR細胞の増大のための抗原非依存性の機序を提供する。従って、本発明は、特異的なモノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含む少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。具体的には、本発明のCARは、免疫細胞へ形質導入された後、抗原非依存性の細胞の活性化および増殖に寄与する。本発明は、CD19特異的モノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含むCARをコードする核酸、ベクター、および4G7 CARを細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法にも関する。本発明は、表面に4G7を発現している遺伝子改変免疫細胞、特に、抗原機序と無関係に増殖する免疫細胞にも関する。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、B細胞リンパ腫またはB細胞白血病の処置のような治療的適用のために特に有用である。

非形質導入KO T細胞（NTD）と比較した、4G7-CARレンチウイルスベクターによって形質導入されたTCRα不活性化T細胞（KO）の増殖。可溶性抗CD28による再活性化の工程の後（IL2＋CD28）またはその工程なしに（IL2）、30日間、増殖を追跡した。 4G7-CAR発現（CAR+、CAR-）に基づきゲーティングされ、TCRα陽性非電気穿孔（NEP）細胞またはTCRα破壊非形質導入（NTD）細胞におけるCD25発現と比較した、4G7-CARレンチウイルスベクターによって形質導入されたTCRα不活性化T細胞の表面におけるCD25活性化マーカー発現分析。可溶性抗CD28による再活性化の工程の後（IL2＋CD28）またはその工程なしに（IL2）、CD25発現を分析した。 4G7-CARまたはFMC63-CARのいずれかをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入されたT細胞の表面におけるCAR発現分析。フローサイトメトリーによって、形質導入の3日後、8日後、および15日後に分析を行った。NTとは、非形質導入T細胞をさす。 4G7-CARまたはFMC63-CARのいずれかをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入されたT細胞の表面におけるCD25発現分析。フローサイトメトリーによって、形質導入の3日後、8日後、および15日後に分析を行った。NTとは、非形質導入T細胞をさす。 4G7-CARまたはFMC63-CARのいずれかをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入されたT細胞のサイズ分析。フローサイトメトリーによって、形質導入の3日後、8日後、および15日後に分析を行った。NTとは、非形質導入T細胞をさす。 FMC63レンチウイルスベクターと比較した4G7-CARによって形質導入されたT細胞の増殖。可溶性抗CD28による再活性化の工程の後（CD28）またはその工程なしに（-）、20日間、増殖を追跡した。NTDとは、非形質導入T細胞をさす。

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

適当な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によってその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)、特に、第154巻および第155巻(Wu et al.eds.)および第185巻、"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；ならびにManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照されたい。

CD19特異的キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナリング伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）に関する。

「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。

好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって結合された標的抗原特異的なモノクローナル抗体の軽鎖（V_L）および重鎖（V_H）の可変断片を含む単鎖抗体断片（scFv）を含む。好ましい態様において、scFVは、CD19モノクローナル抗体4G7（Peipp,Saul et al.2004）に由来し、好ましくは、本発明のscFVは、好ましくは、フレキシブルリンカーによって共に連結された、CD19モノクローナル抗体4G7免疫グロブリンγ1重鎖の一部（GenBank:CAD88275.1；SEO ID NO:1）とCD19モノクローナル抗体4G7免疫グロブリンκ軽鎖の一部（GenBank：CAD88204.1；SEO ID NO:2）とを含む。好ましい態様において、本発明のscFVは、フレキシブルリンカーによって共に連結された、CD19モノクローナル抗体4G7免疫グロブリンγ1重鎖の可変断片（SEQ ID NO:3）とCD19モノクローナル抗体4G7免疫グロブリンκ軽鎖の可変断片（SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:5）とを含む。具体的な態様において、フレキシブルリンカーはアミノ酸配列（SEQ ID NO:6）を有する。

換言すると、CARは、CD19特異的モノクローナル抗体4G7に由来する単鎖FV断片を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。具体的な態様において、scFVは、SEQ ID NO:1〜5からなる群より選択されるアミノ酸配列の一部を含む。好ましい態様において、scFVは、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を含む。

本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1種の活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。

CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインには、細胞質シグナリング配列の2種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、ITAMの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、CARのシグナリング伝達ドメインには、（SEQ ID NO:10）からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインが含まれ得る。

具体的な態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド等が含まれる。

好ましい態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank：AAA53133）およびCD28（NP_006130.1）の断片からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。具体的には、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。

本発明によるCARは、細胞の表面膜上に発現される。従って、CARは、膜貫通ドメインを含み得る。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色は、細胞、本発明において好ましくは免疫細胞、具体的にはリンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指図するために共に相互作用する能力を含む。膜貫通ドメインは、天然起源に由来してもよいし、または合成起源に由来してもよい。膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくはδのようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体のp55（α鎖）、p75（β鎖）、もしくはγ鎖、Fc受容体、具体的には、Fcγ受容体IIIのサブユニット鎖、またはCDタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような疎水性残基を主に含み得る。好ましい態様において、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）に由来する。膜貫通ドメインは、さらに、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にストーク領域を含んでいてもよい。本明細書において使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するよう機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインのために、より高い柔軟性および接近可能性を提供するために使用される。ストーク領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、CD8、CD4、またはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部のような、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全に合成のストーク配列であってもよい。好ましい態様において、ストーク領域は、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）の一部である。別の具体的な態様において、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインは、SEQ ID NO:13からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を含むヒトCD8α鎖の一部を含む。

具体的な態様において、本発明のキメラ抗原受容体は、CD19モノクローナル抗体4G7に由来するscFV、CD8αヒトヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、CD3ζシグナリングドメイン、ならびに4-1BBシグナリングドメインを含む。好ましくは、本発明の4G7 CARは、SEQ ID NO:14および15からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を含む。

標的抗原のダウンレギュレーションまたは変異は、癌細胞において一般的に観察され、抗原損失エスケープバリアントを作出する。従って、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするため、CD19特異的CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化するための、他の細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてもよい。一つの態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれてもよく、任意で、リンカーによって隔てられていてもよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれてもよい。別の態様において、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団に関する。具体的には、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を該細胞の表面に発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。別の具体的な態様において、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。CARの集団とは、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上のCARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む単離された免疫細胞にも関する。

ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明は、上記の本発明によるCARをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。好ましい態様において、本発明は、核酸配列SEQ ID NO:17を含むポリヌクレオチドに関する。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17からなる群より選択される核酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有する。

ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）の中に存在し得る。

具体的な態様において、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳されるmRNA（またはDNA分子のセンス鎖）上の3ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。

膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、2種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は、一般的には、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。好ましい態様において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列SEQ ID NO:18および19を含む。

当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。

好ましい態様において、本発明によるポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17からなる群より選択される核酸配列を含む。本発明は、SEQ ID NO:17からなる群より選択される核酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

免疫細胞を操作する方法：
包含される具体的な態様において、本発明は、本発明によるCARを免疫細胞へ導入する工程、および該細胞を増大させる工程を含む、免疫治療のための免疫細胞を調製する方法に関する。具体的な態様において、本発明は、細胞を準備する工程、および該細胞の表面に少なくとも1種の上記のCARを発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。具体的な態様において、方法は、上記のCARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドによって細胞を形質転換する工程、およびポリヌクレオチドを細胞において発現させる工程を含む。

好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、細胞における安定的な発現を考慮して、レンチウイルスベクターに含まれる。

別の態様において、方法は、TCRの1種の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子、免疫抑制剤の標的、HLA遺伝子、および／またはPDCD1もしくはCTLA-4のような免疫チェックポイント遺伝子を不活性化することによって、細胞を遺伝子改変する工程をさらに含む。好ましい態様において、遺伝子は、TCRα、TCRβ、CD52、GR、PD1、およびCTLA-4からなる群より選択される。好ましい態様において、方法は、DNA切断によって遺伝子を選択的に不活性化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをT細胞へ導入する工程をさらに含む。より好ましい態様において、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼまたはCas9エンドヌクレアーゼである。

送達方法
上記の異なる方法は、CARを細胞へ導入する工程を含む。非限定的な例として、CARは、1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとして導入され得る。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含有し得る。

ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞外で作製され、次いで、細胞へ導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれ得る。

操作した免疫細胞
本発明は、細胞を操作する方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。具体的には、単離された細胞は、少なくとも1種の上記のCARを含む。別の態様において、単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む。具体的には、単離された細胞は、CARをコードする外因性のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖する。

既に記載された方法のいずれか一つによって入手された単離された免疫細胞、好ましくは、T細胞も、本発明の範囲に包含される。免疫細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の態様において、細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。既に記載された方法によって形質転換されたT細胞から入手された細胞株も、本発明の範囲に包含される。免疫抑制処置に対して抵抗性であり、以前の方法によって入手可能である改変された細胞は、本発明の範囲に包含される。

別の態様において、本発明による単離された細胞は、CARをコードするポリヌクレオチドを含む。

T細胞の活性化および増大
本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖するが、本発明の免疫細胞、具体的には、T細胞は、T細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載されるような方法を一般に使用して、さらに活性化させ増大させることができる。T細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。

一般に、本発明のT細胞は、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。

例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂促進性レクチンのような化学物質が、T細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。

非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養のために適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞の増殖のためのその他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のためのその他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはT細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補足されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、対象へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％C02）で維持される。様々な刺激時間に曝されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。

別の具体的な態様において、細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させることができる。細胞は、細胞を対象へ投与した後、インビボで、例えば、対象の血液中で増大させてもよい。

治療的適用
別の態様において、既に記載されたような異なる方法によって入手された単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。別の態様において、医薬は、その必要のある患者において、癌を処置するため、具体的には、B細胞リンパ腫およびB細胞白血病の処置のため、使用され得る。別の態様において、本発明による単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、その必要のある患者における癌の処置のための医薬の製造において使用され得る。

別の局面において、本発明は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む、その必要のある患者を処置する方法に依拠する：
（a）既に記載された方法のいずれかによって入手可能な免疫細胞を準備する工程；
（b）形質転換された免疫細胞を患者へ投与する工程。

一つの態様において、本発明のT細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。

処置は、寛解的、治癒的、または予防的であり得る。それは、自己免疫治療の一部または同種異系免疫治療処置の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者を処置するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合性ドナーに起因することを意味する。同種異系とは、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。

開示された方法によって使用され得る細胞は、以前のセクションに記載されている。処置は、癌を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得る癌には、プレB ALL（小児科徴候）、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫等を含むが、これらに限定されない、血液腫瘍のような非固形腫瘍が含まれ得る。本発明のCARによって処置される癌の型には、ある種の白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／癌および小児科の腫瘍／癌も含まれる。

それは、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、癌に対する1種以上の治療との組み合わせ処置であり得る。

本発明の好ましい態様によると、処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して抵抗性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を支援するべきである。

本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり10⁴〜10⁹個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり10⁵〜10⁶個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。

本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。

他の定義
他に特記されない限り、「a」、「an」、「the」、および「少なくとも1」は、交換可能に使用され、1または複数を意味する。ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードによって本明細書において表記され、例えば、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。

アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。

ヌクレオチドは以下のように表記される：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。

本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のようなヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖モエティおよび／またはピリミジン塩基モエティもしくはプリン塩基モエティに変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖モエティ全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似した構造に交換されてもよい。塩基モエティの修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

キメラ抗原受容体（CAR）とは、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。一般に、CARは、細胞外単鎖抗体（scFvFc）がT細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したもの（scFvFc:ζ）からなり、T細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。本発明において使用されるCARの一例は、CD19抗原に対するCARであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：SEQ ID NO:14を含み得る。

「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型酵素またはバリアント酵素をさす。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断するのではなく、「標的配列」または「標的部位」とさらに呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列においてDNA分子またはRNA分子を認識し切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、12塩基対（bp）より長い、より好ましくは、14〜55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する時、低頻度切断エンドヌクレアーゼとして分類され得る。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、定義された場所においてDNA二本鎖切断（DSB）を誘導することによって、HRを有意に増加させる（Perrin,Buckle et al.1993；Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin et al.1995；Pingoud and Silva 2007）。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Paques and Duchateau 2007）、操作したジンクフィンガードメインとFoklのような制限酵素の触媒ドメインとの融合に起因するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Porteus and Carroll 2005）、 CRISPR系に由来するCas9エンドヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）、または化学的エンドヌクレアーゼ（Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas et al.2006）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいては、化学的なまたはペプチド性の切断剤が、核酸のポリマーまたは特定の標的配列を認識する他のDNAのいずれかにコンジュゲートされ、それによって、切断活性を特定の配列へターゲティングする。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のDNA配列に結合することが公知の、オルトフェナントロリン、DNA切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される（Kalish and Glazer 2005）。そのような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。

「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）とは、典型的には、転写活性化因子様（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断する1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を表す。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えば、I-Tevl、ColE7、NucA、Fok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。具体的な態様において、TALEドメインは、例えば、I-CrelおよびI-Onulまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい態様において、ヌクレアーゼは単量体TALEヌクレアーゼである。単量体TALEヌクレアーゼとは、WO2012138927に記載された、操作されたTALリピートとI-Tevlの触媒ドメインとの融合のような、特異的な認識および切断のために二量化を必要としないTALEヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、複数の反復配列を含む、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）由来のタンパク質であり、各リピートは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に対して特異的な2残基（RVD）を12位および13位に含む。類似したモジュラー1塩基対1塩基核酸結合（modular base-per-base nucleic acid binding）特性を有する結合ドメイン（MBBBD）も、異なる細菌種において出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TALリピートより多くの配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連したRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、Tを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。別の態様において、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性をモジュレートするため、具体的には、この特異性を増強するため、他のアミノ酸残基に変異させてもよい。TALEヌクレアーゼは、既に記載され、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を刺激するために使用されている（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang et al.2011）。操作されたTALヌクレアーゼは、商標TALEN（商標）の下で市販されている（Cellectis,8 rue de la Croix Jarry,75013 Paris,France）。

本発明による低頻度切断エンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼでもあり得る。最近、II型原核生物CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）適応免疫系（概説については（Sorek,Lawrence et al.2013）を参照されたい）から、RNAガイド（RNA-guided）Cas9ヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）に基づき、新しいゲノム操作ツールが開発された。CRISPR関連（Cas）系は、細菌において最初に発見され、外来DNA、ウイルスまたはプラスミドに対する防御として機能する。CRISPRによって媒介されるゲノム操作は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフがしばしば隣接している標的配列の選択によって進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特異的なcrRNAが操作される。CRISPR II型系において必要とされるトランス活性化crRNA（tracrRNA）は、crRNAと対合し、供給されたCas9タンパク質へ結合する。Cas9は、tracRNAのcRNAとの塩基対合を容易にする分子アンカーとして作用する（Deltcheva,Chylinski et al.2011）。この三元複合体において、二重tracrRNA:crRNA構造は、同族標的配列にエンドヌクレアーゼCas9を差し向けるガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性について標的配列を走査することによって開始される。標的配列-crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングは、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ−PAM）の存在を必要とする。その後、二重RNAと標的配列との間の対合に続き、Cas9が、PAMモチーフの3塩基上流に平滑末端二本鎖切断を導入する（Garneau,Dupuis et al.2010）。

低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも公知のホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野において周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖の切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、12〜45塩基対（bp）長、一般的には、14〜40bp長の範囲のDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-Crelバリアントであり得る。

「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Diatosによって開発されたペプチドのようなその他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」とは、トランスフェクションを実施するための送達方法も表す。

「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。

ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。

「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、一般的には、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。

送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。

細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。

「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。

非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS 細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択される。

これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。

「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチドの配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を与える場合もある。

「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列における少なくとも1個の残基の変異または交換によって入手されたリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALEヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを表す。

「機能的バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を表し；そのような変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。

「同一性」とは、2種の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有している位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、2種の配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。

「類似性」とは、2種以上のポリペプチドのアミノ酸配列の間の関係を記載する。BLASTPも、BLOSUM45、BLOSUM62、またはBLOSUM80のような類似性マトリックスを使用して、参照アミノ酸配列との少なくとも70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。他に示されない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPが使用される時、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示し；BLASTP「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されたアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似したポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって入手され得る。そのような機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって作製されるであろう。

「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。

「共刺激シグナル」とは、本明細書において使用されるように、TCR/CD3ライゲーションのような一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルをさす。

「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。

「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。

上記の本発明の説明は、当業者が本発明を作成し使用することが可能になるよう、本発明を作成し使用する様式および過程を提供するものであり、この可能性は、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。

本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に記載されたかのごとく、具体的に含まれる。

上記の説明は、当業者が本発明を作成し使用することを可能にするために提示され、特定の適用およびその必要条件に関して提供される。好ましい態様に対する様々な改変は、当業者に容易に明白になり、本明細書において定義された一般原理は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の態様および適用に適用され得る。従って、本発明は、示された態様に限定されず、本明細書に開示された原理および特色と一致する最も広い範囲を与えられるものとする。

本発明を全般的に説明したが、ある種の具体例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。それらの具体例は、例示目的のために本明細書に提供されるに過ぎず、他に特記されない限り、限定するためのものではない。

実施例1：4G7-CARを発現するTCRα不活性化細胞の増殖
T細胞受容体α定常鎖領域（TRAC）遺伝子内の15bpスペーサーによって隔てられた2個の17bp長配列（半標的と呼ぶ）を標的とする異種二量体TALEヌクレアーゼを設計し作製した。半標的は、各々、表1にリストされた半TALEヌクレアーゼのリピートによって認識される。

(表１)

各TALEヌクレアーゼ構築物を、制限酵素消化を使用して、T7プロモーターの調節下で哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。TRACゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAを、T7プロモーターから下流にコード配列を保持しているプラスミドから合成した。抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズによって72時間予備活性化された精製T細胞に、両方の半TRAC_T01 TALEヌクレアーゼをコードする2種のmRNAの各々をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、T細胞を、4G7-CAR（SEQ ID NO:14）をコードするレンチウイルスベクターによって形質導入した。形質導入の2日後、CD3_NEG細胞を抗CD3磁気ビーズを使用して精製し、形質導入の5日後、細胞を可溶性抗CD28（5μg/ml）によって再活性化した。

1週間に2回、細胞を計数することによって、再活性化後、30日間、細胞増殖を追跡した。図1は、2人の異なるドナーについての再活性化後2日目に存在する細胞の量に対する細胞数の誘導倍率を示す。特に、抗CD28によって再活性化された場合、4G7-CARを発現するTCRα不活性化細胞において、非形質導入細胞と比較して増加した増殖が観察された。

4G7-CARを発現するヒトT細胞が活性化状態を示すか否かを調査するため、活性化マーカーCD25の発現を、形質導入の7日後に、FACSによって分析した。図2に示すように、4G7-CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入されている精製された細胞は、非形質導入細胞より相当多いCD25を表面に発現した。CD28再活性化条件または非再活性化条件の両方で、増加したCD25発現が観察される。

実施例2：4G7-CARおよび古典的なFMC63-CARを発現する初代ヒトT細胞の基底活性化の比較
4G7 scFVが、形質導入された細胞により長期間の「活性化」状態を付与するか否かを決定するため、4G7 scFV（SEQ ID NO:17によってコードされたSEQ ID NO:15）または古典的なFMC63 scFV（SEQ ID NO:16）を保有するCARによって形質導入されたT細胞の基底活性化を比較した。精製されたヒトT細胞を、以下のプロトコルに従って形質導入した：簡単に説明すると、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよび組換えIL2によって3日間予備活性化された1×10⁶個のCD3+細胞を、30μg/mlレトロネクチン（retronectin）によってコーティングされた12穴非組織培養プレートにおいて、5のMOIで4G7-CAR（SEQ ID NO:15）およびFMC63-CAR（SEQ ID NO:16）をコードするレンチウイルスベクターによって形質導入した。形質導入の24時間後、培地を除去し、新鮮な培地に交換した。次いで、2〜3日毎に細胞数を測定することによって、培養期間を通じて、1×10⁶細胞/mlの濃度に細胞を維持した。4G7-CARまたはFMC63-CARのいずれかをコードするレンチウイルスベクターによる形質導入の3日後、8日後、および15日後に、CAR発現細胞の百分率をフローサイトメトリーによって査定した。2種のレンチウイルスベクターで、形質導入の効率が比較的等しいことが観察された（図3）。

次いで、4G7-CARを発現するヒトT細胞がFMC63-CARを発現するヒトT細胞より高度の活性化状態を示すか否かを調査した。その目的のため、2種のレンチウイルスベクターによって形質導入されたT細胞の表面における活性化マーカーCD25の発現を、異なる時点で比較した。図4に示すように、形質導入の3日後および8日後に、4G7-CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入された細胞は、FMC63-CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入された細胞より相当多くのCD25を表面に発現した。

4G7-CARまたはFMC63-CARによって形質導入された細胞のサイズも、異なる時点で、フローサイトメトリーによって査定した。形質導入の3日後、8日後、および15日後に、4G7-CARを発現する細胞は、FMC63-CARを発現する細胞より大きいことが観察された（図5）。

インビトロでの非特異的な活性化の後、4G7-CARによって形質導入された細胞は、より長期間にわたり、増加した細胞サイズ（芽細胞形成）および活性化マーカー（CD25）の発現を示す。この長期活性化は、FMC63 ScFvを含有している類似したCARによって形質導入された細胞と比較して、より長期間の増殖を可能にする。

実施例3：4G7-CARおよび古典的なFMC63-CARを発現する初代ヒトT細胞の増殖の比較
4G7 scFVがより高い増殖活性を付与するか否かを決定するため、4G7 scFV（SEO ID NO:17によってコードされたSEO ID NO:15）または古典的なFMC63 scFV（SEO ID NO:16）を保有するCARによって形質導入されたT細胞の増殖を、1週間に2回、細胞を計数することによって20日まで追跡した。精製されたヒトT細胞を、以下のプロトコルによって形質導入した：簡単に説明すると、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよび組換えIL2によって3日間予備活性化された1×10⁶個のCD3+細胞を、4G7-CAR（SEO ID NO:15）およびFMC63-CAR（SEO ID NO:16）をコードするレンチウイルスベクターによって形質導入した。次いで、細胞を古典的な条件の下で維持し、12日目に再活性化した。細胞を同一の密度で播種し、20日間、1週間に2回、計数した。図6に表されるように、4G7-CARを発現するT細胞の増殖活性は、古典的なFMC63-CARを発現する細胞のものと比較して2倍高い。

参照

Claims (22)

1. 少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナリングドメインを含むCD19特異的キメラ抗原受容体であって、該細胞外ドメインが、CD19に特異的なモノクローナル抗体4G7のγ重鎖（SEQ ID NO:1）およびκ軽鎖（SEQ ID NO:2）に由来する単鎖FV断片を含む、CD19特異的キメラ抗原受容体。
2. モノクローナル抗体4G7に由来する単鎖FV断片が、SEQ ID NO:3〜5およびSEQ ID NO:7〜8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
3. 細胞内シグナリングドメインがCD3ζシグナリングドメインを含む、請求項1または2記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
4. 細胞内シグナリングドメインが4-1BBドメインを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
5. ヒトCD8α鎖の膜貫通ドメインおよびストークドメインを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
6. アミノ酸配列SEQ ID NO:14および15と少なくとも75％、好ましくは80％、85％、90％、95％を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
7. CD19に特異的ではない他の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
8. 請求項1〜7のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
9. アミノ酸配列SEQ ID NO:17と少なくとも75％、好ましくは80％、85％、90％、95％を有する核酸配列を含む、請求項8記載のポリヌクレオチド。
10. 請求項8または9記載の核酸を含む発現ベクター。
11. 少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインおよび少なくとも1つの細胞内シグナリングドメインを含むCD19特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する遺伝子操作免疫細胞であって、細胞外ドメインが、CD19に特異的なモノクローナル抗体4G7に由来する単鎖FV断片を含む、遺伝子操作免疫細胞。
12. 請求項1〜7のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する遺伝子操作免疫細胞。
13. CD19に特異的ではない他のキメラ抗原受容体をさらに含む、請求項11または12記載の遺伝子操作免疫細胞。
14. 炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項11〜13のいずれか一項記載の遺伝子操作免疫細胞。
15. ドナーから回収された遺伝子操作免疫細胞。
16. 患者から回収された遺伝子操作免疫細胞。
17. 治療において使用するための遺伝子操作細胞。
18. B細胞リンパ腫およびB細胞白血病において使用するための遺伝子操作細胞。
19. （a）免疫細胞を準備する工程、
    （b）請求項1〜7のいずれか一項記載の少なくとも1種のCD19特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
    を含む、免疫細胞を操作する方法。
20. （a）免疫細胞を準備する工程、
    （b）CD19特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
    （c）該ポリヌクレオチドを該細胞において発現させる工程
    を含む、請求項19記載の免疫細胞を操作する方法。
21. （a）免疫細胞を準備する工程、
    （b）CD19特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
    （c）CD19に特異的ではない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
    を含む、請求項19記載の免疫細胞を操作する方法。
22. （a）請求項1〜7のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を準備する工程、
    （b）該免疫細胞を患者へ投与する工程
    を含む、その必要のある対象を処置する方法。

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