ES2728436T3 - Método para la generación de TALE-nucleasas compactas y usos de la mismas - Google Patents

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Abstract

Un monómero de TALEN compacta que comprende: (i) Un armazón de TALE central que comprende regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) que tiene especificidad de unión a ADN en una secuencia diana de ADN bicatenario específica de interés; (ii) Al menos un dominio catalítico de I-TevI que puede escindir ADN adyacente a dicha secuencia diana de ADN bicatenario de interés cuando se fusiona al extremo C o N de dicho armazón de TALE central de (i); en el que dicho monómero de TALEN compacta se une a dicha secuencia de ADN diana y escinde ADN bicatenario.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la generación de TALE-nucleasas compactas y usos de la mismas
Campo de la invención
La presente invención describe un método para la generación de nucleasas de efector de tipo activador de transcripción (TALEN) compactas que pueden abordar y procesar de forma eficaz ADN bicatenario. Más específicamente, la presente invención describe un método para la creación de TALEN, que consiste en un único dominio de unión a ADN de TALE fusionado con al menos un dominio catalítico de modo que la entidad activa está compuesta de una única cadena polipeptídica para una vectorización simple y eficaz y no requiere dimerización para abordar una secuencia diana de A d N bicatenaria individual específica de interés y procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN. La presente invención también se refiere a TALEN compactas, vectores, composiciones y kits usados para implementar el método.
Antecedentes de la invención
Los genomas de mamífero sufren constantemente diversos tipos de daños, de los que las roturas bicatenarias (DSB) se consideran los más peligrosos (Haber 2000). La reparación de las DSB pueden producirse mediante diversos mecanismos que pueden depender del contexto celular. La reparación mediante recombinación homóloga (HR) puede restaurar la secuencia original en la rotura. A causa de su estricta dependencia en la homología de secuencia amplia, este mecanismo se sugiere como activo principalmente durante las fases S y G2 del ciclo celular, donde las cromátidas hermanas están en cercana proximidad (Sonoda, Hochegger et al. 2006). La hibridación monocatenaria (SSA) es otro proceso dependiente de homología que puede reparar las DSB entre repeticiones directas y promueve de este modo las eliminaciones (Paques y Haber 1999). Finalmente, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) del ADN es una ruta principal para la reparación de DSB que puede funcionar en todo el ciclo celular y no depende de la recombinación homóloga (Moore y Haber 1996; Haber 2008). La NHEJ parece comprender al menos dos componentes diferentes: (i) una ruta que consiste principalmente en la reunión directa de los extremos de DSB, y que depende de las proteínas XRCC4, Lig4 y Ku y; (ii) una ruta de NHEJ alternativa, que no depende de XRCC4, Lig4 y Ku, y es especialmente propensa a errores, provocando principalmente eliminaciones, produciéndose las uniones entre microhomologías Frank, Sekiguchi et al. 1998; Gao, Sun et al. 1998; Guirouilh-Barbat, Huck et al. 2004; Guirouilh-Barbat, Rass et al.
2007; Haber 2008; McVey y Lee 2008).
La dirección génica homóloga (HGT), descrita por primera vez hace más de 25 años (Hinnen, Hicks et al. 1978; Orr-Weaver, Szostak et al. 1981; Orr-Weaver, Szostak et al. 1983; Rothstein 1983), fue uno de los primeros métodos para la manipulación genómica racional y sigue siendo actualmente un criterio para la generación de células genomanipuladas o ratones knock-out (Capecchi 2001). No obstante, una eficacia inherentemente baja ha evitado que se use como protocolo rutinario en la mayoría de tipos celulares y organismos. Para abordar estas cuestiones, se ha propuesto una variedad amplia de estrategias racionales con la intención de conseguir más de un 1 % de modificaciones dirigidas. Muchos grupos se han centrado en potenciar la eficacia de HGT, habiendo llegado a ser evidentes dos disciplina principales: (i) los llamados métodos de "optimización de matriz", que consisten esencialmente en modificar la estructura del vector dirigido para conseguir una eficacia máxima y; (ii) métodos que implican efectores adicionales para estimular HR, en general endonucleasas específicas de secuencia. El campo de la optimización de matriz ha cubierto una amplia gama de técnicas, con grados variables de éxito (Russell e Hirata 1998; Inoue, Dong et al. 2001; Hirata, Chamberlain et al. 2002; Taubes 2002; Gruenert, Bruscia et al. 2003; Sangiuolo, Scaldaferri et al.
2008; Bedayat, Abdolmohamadi et al. 2010). La estimulación de HR mediante nucleasas, por otro lado, ha demostrado ser eficaz repetidamente (Paques y Duchateau 2007; Carroll 2008).
Para DSB inducidas por reactivos biológicos, por ejemplo, meganucleasas, ZFN y TALEN (véase a continuación), que escinden el ADN por hidrólisis de dos enlaces fosfodiéster, el ADN puede reunirse de una manera sin empalmes por religamiento simple de los extremos cohesivos. Como alternativa, pueden producirse inserciones o eliminaciones (indel) perjudiciales de diversos tamaños en las roturas, provocando finalmente una inactivación génica (Liang, Han et al. 1998; Lloyd, Plaisier et al. 2005; Doyon, McCammon et al. 2008; Perez, Wang et al. 2008; Santiago, Chan et al.
2008; Kim, Lee et al. 2009; Yang, Djukanovic et al. 2009). La naturaleza de este proceso, que no depende de recombinación específica de sitio u homóloga, da lugar a una tercera estrategia dirigida basada en mutagénesis inducida por endonucleasa. Esta estrategia, así como las aplicaciones relacionadas, puede ser más simple que las basadas en recombinación homóloga por que (a) no se necesita introducir una matriz de reparación y; (b) la eficacia será menos dependiente del tipo celular (en contraste con HR, NHEJ es probablemente activa en todo el ciclo celular (Delacote y Lopez 2008). La mutagénesis dirigida basada en NEHJ se ha usado para desencadenar la inactivación de genes individuales o incluso múltiples genes en líneas celulares inmortalizadas (Cost, Freyvert et al. 2010; Liu, Chan et al. 2010). Además, este método abre nuevas perspectivas para organismos en que los métodos de inactivación génica basada en HR clásicos han demostrado ser ineficaces, o al menos difíciles de establecer (Doyon, McCammon et al. 2008; Geurts, Cost et al. 2009; Shukla, Doyon et al. 2009; Yang, Djukanovic et al. 2009; Gao, Smith et al. 2010; Mashimo, Takizawa et al. 2010; Menoret, Iscache et al. 2010).
Durante los últimos 15 años, se ha documentado bien el uso de meganucleasas para inducir de forma satisfactoria la dirección génica, partiendo de experimentos directos que implican I-Scel de tipo silvestre para un trabajo más refinado que implica enzimas completamente rediseñadas (Stoddard, Scharenberg et al. 2007; Galetto, Duchateau et al. 2009; Marcaida, Munoz et al. 2010; Arnould, Delenda et al. 2011). Las meganucleasas, también llamadas endonucleasas de asentamiento (HE), pueden dividirse en cinco familiar basándose en la secuencia y los motivos estructurales: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, secuencia His-Cys y PD-(D/E)XK (Stoddard 2005; Zhao, Bonocora et al. 2007). Hay datos estructurales disponible para al menos un miembro de cada familia. La familia mejor estudiada es la de las proteínas LAGLIDADG, con un conjunto considerable de trabajo bioquímico, genético y estructural que ha establecido que estas endonucleasas podrían usarse como herramientas moleculares (Stoddard, Scharenberg et al. 2007; Arnould, Delenda et al. 2011). Las proteínas que son miembro están compuestas de dominios que adoptan un plegamiento appappa similar, comprendiendo el motivo LAGLIDADG la región terminal de la primera hélice y contribuyendo no solamente a un centro catalítico de dos partes, sino también formando la interacción de subunidad central/subunidad (Stoddard 2005). Dos de estos dominios a/p se ensamblan para formar la proteína funcional, creando las hebras p en cada uno una región de unión a ADN con forma de silla de montar. La sep aración espacial del centro catalítico con regiones que interactúan directamente con el ADN ha permitido un rediseño de la especificidad (Seligman, Chisholm et al. 2002; Sussman, Chadsey et al. 2004; Arnould, Chames et al. 2006; Doyon, Pattanayak et al. 2006; Rosen, Morrison et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006; Arnould, Perez et al. 2007). Además, mientras que todas las proteínas LAGLIDADG conocidas analizadas hasta la fecha actúan como "cleavasas" que cortan ambas hebras de ADN diana, se ha hecho progreso reciente en la generación de "meganickasas" que escinden únicamente una hebra (Niu, Tenney et al. 2008; McConnell Smith, Takeuchi et al. 2009). Dichas enzimas pueden proporcionar, en principio, niveles similares de HR inducida diana con una minimización en la frecuencia de NHEJ.
Aunque numerosos esfuerzos de diseño se han centrado en HE LAGLIDADG, los miembros de otras dos familias, GIY-YIG y HNH, son de particular interés. Los estudios bioquímicos estructurales han establecido que en ambas familias, las proteínas que son miembros pueden adoptar un plegamiento de dos partes con distintos dominios funcionales: (1) un dominio catalítico responsable principalmente de la escisión del ADN y; (2) un dominio de unión a ADN para proporcionar especificidad diana (Stoddard 2005; Marcaida, Munoz et al. 2010). Las HE GIY-YIG relacionadas I-Tevl e I-Bmol se han explotado para demostrar la capacidad de intercambio de la región de unión a ADN para estas enzimas (Liu, Derbyshire et al.2006). El análisis de la HE I-BasI reveló que aunque el dominio catalítico del extremo N pertenece a la familia HNH, la región de unión a ADN en el extremo C se parece al motivo de repetición de endonucleasa codificado en intrón (IENR1) encontrado en endonucleasas de la familia GIY-YIG (Landthaler y Shub 2003). La cabeza catalítica de I-BasI tiene similitud de secuencia con las de las HE HNH I-HmuI, I-HmuII e I-TwoI, todas las cuales funcionan como nickasas específicas de hebra (Landthaler, Begley et al. 2002; Landthaler y Shub 2003; Landthaler, Lau et al. 2004; Shen, Landthaler et al. 2004; Landthaler, Shen et al. 2006).
Aunque las familias anteriores de proteínas contienen nucleasas específicas de secuencia, el motivo HNH también se ha identificado en nucleasas no específicas tales como colicinas de E. coli (por ejemplo, ColE9 y ColE7), EndA de S. pneumoniae, NucA de Anabaena y CAD (Midon, Schafer et al. 2011). Además de tener el motivo HNH, varias de estas nucleasas contienen el motivo DRGH distintivo y comparten homología estructural con elementos centrales que forman el motivo de sitio activo de dedo ppa-Me. Los estudios mutacionales de los restos en los motivos HNH/DRGH han confirmado su función en la actividad de escisión de ácido nucleico (Ku, Liu et al. 2002; Doudeva, Huang et al. 2006; Eastberg, Eklund et al. 2007; Huang y Yuan 2007). Además, la afinidad de unión a ADN y la preferencia de secuencia para ColE7 podría alterarse de forma eficaz (Wang, Wright et al. 2009). Dichos estudios detallados ilustran el potencial en el rediseño de nucleasas no específicas con fines de dirección.
Las nucleasas de dedos de cinc (ZFN), generadas por fusión de los dominios de unión a ADN basados en dedos de cinc a un dominio catalítico independiente mediante un conector flexible (Kim, Cha et al. 1996; Smith, Berg et al. 1999; Smith, Bibikova et al. 2000), representa otro tipo de nucleasa genomanipulada habitualmente usada para estimular la dirección génica. Las ZFN arquetípicas se basan el dominio catalítico de la enzima de restricción de tipo IIS FokI y se han usado satisfactoriamente para inducir la corrección de genes, la inserción de genes y la eliminación de genes. Los dominios de unión a ADN basados en dedos de cinc están hechos de las cadenas de 3 o 4 dedos de cinc individuales, que reconoce en cada una un triplete de ADN (Pabo, Peisach et al. 2001). En teoría, una de las ventajas principales de las ZFN es que son fáciles de diseñar, usando ensamblaje combinatorio de dedos de cinc preexistentes con patrones de reconocimiento conocidos (Choo y Klug 1994; Choo y Klug 1994; Kim, Lee et al. 2009). Sin embargo, un examen cercano de estructuras de alta resolución muestra que hay realmente comunicaciones entre las unidades (Elrod-Erickson, Rould et al. 1996) y se han usado varios métodos para ensamblar proteínas ZF eligiendo dedos de cinc individuales de una manera dependiente del contexto (Greisman y Pabo 1997; Isalan y Choo 2001; Maeder, Thibodeau-Beganny et al. 2008; Ramirez, Foley et al.2008) para conseguir mejores tasas de éxito y reactivos de mejor calidad.
Recientemente, se ha descrito una nueva clase de nucleasa quimérica usando un dominio catalítico de FokI (Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). El dominio de unión a ADN de estas nucleasas se obtiene de efectores de tipo activador de transcripción (TALE), una familia de proteínas usada en el proceso de infección por patógenos vegetales del género Xanthomonas. En estos dominios de unión a ADN, la especificidad de secuencia está dirigida por una serie de repeticiones de 33-35 aminoácidos, que difieren esencialmente en dos posiciones (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009). Cada par de bases de la diana de ADN está en contacto con una única repetición, produciéndose la especificidad por los dos aminoácidos variantes de la repetición (el llamado dipéptido variable de repetición, RVD). La modularidad aparente de estos dominios de unión a ADN se ha confirmado a un cierto grado por ensamblaje modular de la proteína derivada de TALE diseñada con nuevas especificidades (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009). Sin embargo, aún no puede descartarse un determinado nivel de dependencia de los patrones de repetición individual/reconocimiento de bases, como se observó para las proteínas de dedos de cinc (véase anteriormente). Además, se ha demostrado que los efectores TAL naturales pueden dimerizarse (Gurlebeck, Szurek et al. 2005) y la manera en que esto afectaría a una nucleasa derivada de TALE "basada en dimerización" actualmente es desconocida.
La disposición funcional de un TALE-nucleasa (TALEN) basada en FokI es esencialmente el de una ZFN, estando remplazado el dominio de unión a ADN de dedos de cinc por el dominio deTALE (Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). Por tanto, la escisión de ADN por una TALEN requiere dos regiones de reconocimiento de ADN que flanquean una región central inespecífica. Esta región de ADN "espadadora" central es esencial para promover la catálisis por el dominio catalítico de FokI de dimerización, y se ha establecido un amplio esfuerzo en la optimización de la distancia entre los sitios de unión a ADN (Christian, Cermak et al. 2010; Miller, Tan et al. 2011). La longitud del espaciador se ha variado de 14 a 30 pares de bases, siendo la eficacia en la escisión del ADN interdependiente de la longitud del espaciador, así como la construcción del armazón de TALE (es decir, la naturaleza de la construcción de fusión usada). Aún se desconoce si diferencias en la región repetida (es decir, tipo de RVD y número usado) tiene un impacto sobre los requisitos del "espaciador' de ADN o sobre la eficacia de la escisión del ADN por TALEN. No obstante, las TALE-nucleasas han demostrado ser activas a diversos grados en ensayos basados en células en levaduras, células de mamífero y plantas (Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011).
Las arquitecturas de TALEN clásicas basadas en la fusión de un dominio de unión de TALE al dominio catalítico de FokI se han descrito por Miller et al. ("A TALE nuclease architecture for efficient genome editing"; nature biotechnology, volumen 29, n.° 2, páginas 143-148; 2011).
Las endonucleasas de asentamiento GIY-YIG tales como I-TevI se describen en Liu et al. ("Distance determination by GIY-YIG intron endonucleases: discrimination between repression and cleavage functions"; Nucleic Acids Research, volumen 34, n.° 6, páginas 1755-1764; 2006).
El uso de la propiedad modular de la endonucleasa Bmrl y la especificidad de unión a ADN de C.Bcll para generar una endonucleasa combinatoria se ha descrito en Siu-hong et al. ("Catalytic domain of restriction endonuclease Bmrl as a cleavage module for engineering endonucleases with novel substrate specificities"; Nucleic Acids Research, volumen 35, n.° 18, páginas 6238-6248; 2007).
Los autores de la invención han desarrollado un nuevo tipo de TALEN que puede genomanipularse para que reconozca y procese específicamente un ADN diana de forma eficaz. Estas "TALEN compactas" (cTALEN) novedosas no requieren dimerización para la actividad de procesamiento de ADN, aliviando de este modo la necesidad de sitios diana "dobles" con "espaciadores" de ADN intermedios. Además, la invención permite general varios tipos distintos de enzimas que pueden potenciar diferentes rutas de reparación de ADN (HR frente a NHEJ).
Breve sumario de la invención
La presente invención describe un método para generar nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALEN) compactas compuestas de una única cadena polipeptídica que no requieren dimerización para abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés. La presente invención también describe la creación de proteínas de fusión de un único polipéptido funcionales para la vectorización simple y eficaz. En otro aspecto, la presente invención describe TALEN compactas que comprenden al menos un dominio potenciador, en las que dicho dominio potenciador potencia la eficacia de procesamiento del ADN de dichas TALEN compactas cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés. La presente invención también se refiere a TALEN compactas, vectores, composiciones y kits usados para implementar el método. La presente invención también se refiere a métodos para el uso de dichas TALEN compactas de acuerdo con la invención para diversas aplicaciones que varían desde la escisión de ADN diana hasta la regulación génica diana. Los métodos de acuerdo con la presente invención pueden usarse en diversos campos que varían desde la creación de organismos transgénicos hasta el tratamiento de enfermedades genéticas.
Breve descripción de las figuras
Además de las características precedentes, la invención comprende además otras características que surgirán de la siguiente descripción, así como de los dibujos adjuntos. Una apreciación más completa de la invención y muchas de las ventajas consiguientes de la misma se obtendrá fácilmente según llegue a entenderse mejor la misma por referencia a las siguientes figuras junto con la descripción detallada a continuación.
Figura 1: Estrategias de dirección génica inducida por endonucleasa. Tras la escisión, los mecanismos de reparación del ADN pueden producir uno de varios resultados. (A) Cuando se aborda una rotura bicatenaria entre dos repeticiones directas, la HR puede producir la eliminación de una repetición junto con la secuencia intermedia. La inserción génica (B) o corrección (C) pueden conseguirse por la introducción de una matriz de reparación de ADN que contiene secuencias homólogas a la secuencia endógena que rodea la rotura del ADN. Pueden corregirse mutaciones en o distales a la rotura, disminuyendo la frecuencia de corrección según aumenta la distancia. (D) La reparación incorrecta de extremos de ADN por NHEJ propensa a errores puede provocar inserciones o eliminaciones de diversos tamaños, que dan lugar a inactivación génica.
Figura 2: Secuencias de ADN diana reconocidas por I-Crel e I-TevI. C1234 (SEQ ID NO: 3) representa la secuencia de ADN natural parcialmente simétrica reconocida y escindida por la meganucleasa I-CreI de tipo silvestre. C1221 (SEQ ID NO: 2) representa una secuencia de ADN palindrómica artificial, derivada de C1234 (SEQ ID NO: 3), también reconocida y escindida por I-CreI (SEQ ID NO: 1). Los nucleótidos están numerados hacia fuera (-/+) desde el centro de la diana. La escisión del ADN se produce en cualquier lado de la secuencia subrayada para generar extremos salientes 3' de 4 nucleótidos. Para meganucleasas basadas en I-Crel, la naturaleza de los nucleótidos en las posiciones -2 a 2 pueden interferir potencialmente con la actividad de escisión de la proteína. Tev (SEQ ID NO: 105) representa la secuencia de ADN asimétrica reconocida y escindida por la meganucleasa I-Tevl de tipo silvestre. La numeración de nucleótidos es relativa al sitio de inserción del intrón de la secuencia diana natural. La escisión por I-Tevl se produce en cualquier lado de la secuencia subrayada para generar extremos salientes 3' de 2 nucleótidos.
Figura 3: Secuencias de los ADN diana reconocidos por TALEN y construcciones de TALEN compactas. Los ADN diana para las TALEN compactas genomanipuladas cTN-Avr y cTN-Pth se basan en las secuencias asimétricas de origen natural AvrBs3 (19 pb) [en los armazones proteínicos basales bT 1 -Avr (SEQ ID NO: 136) y bT2-Avr (SEQ ID NO: 137)] y PthXo1 (25 pb) [en los armazones proteínicos basales bT1-Pth (SEQ ID NO: 138) y bT2-Pth (SEQ ID NO: 139)], respectivamente. Para cada secuencia, los nucleótidos están numerados hacia fuera (-/+) para la T de anclaje (posición -1). Las secuencias mostradas se ponen en contacto directo con la proteína para proporcionar especificidad diana. Los dipéptidos variables de repetición (RVD) de tipo silvestre corresponden a los dipéptidos encontrados en las repeticiones de las proteínas efectoras de origen natural dirigidas a cada secuencia. Los RVD cifrados se basan en el subconjunto de dipéptidos/pares de nucleótidos enumerados. Los RVD artificiales se obtienen por lectura directa de la secuencia de ADN subyacente usando el código RVD cifrado (SEQ ID NO: 245 a 249).
Figura 4: Esquema de configuraciones de fusión de meganucleasa. Las construcciones de fusión se optimizan para abordar o superar distintos problemas. (A) La adición de dos dominios catalíticos a una meganucleasa activa no solamente puede potenciar la actividad de escisión (por ejemplo, tres posibilidades de lograr la escisión de ADN por evento de unión), sino que también puede promover alteraciones de secuencia por NHEJ propensa a errores ya que se escinden pequeñas secciones de ADN por cada par de eventos de escisión. (B) Cuando el rediseño de especificidad imposibilita el mantenimiento de la actividad de escisión de la meganucleasa, los dominios catalíticos adheridos proporcionan la función de escisión de hebra necesaria. (C) y (D) representan los casos de (A) y (B), respectivamente, cuando únicamente un dominio catalítico se tolera por proteína de fusión (por ejemplo, como una fusión en el extremo N o C o en el contexto de una molécula monocatenaria). En todos los casos, el dominio catalítico ideado puede ser una cleavasa (capacidad de escindir ambas hebras del ADN) o una nickasa (escisión de únicamente una única hebra de ADN) dependiendo de la aplicación. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación. Los componentes de las proteínas de fusión se enumeran en la leyenda.
Figura 5: Esquema de configuraciones de cTALEN. Se diseñan TALEN compactas para aliviar la necesidad de múltiples restos proteínicos independientes cuando se aborda un evento de escisión de ADN. De forma importante, la región "espadadora" necesaria y los sitios diana dobles esenciales para la función de TALEN clásicas actuales son innecesarios. Además, como el dominio catalítico no requiere contactos de ADN específicos, no hay restricciones sobre las regiones que rodean el dominio de unión a ADN de TALE central. (A) Construcción de fusión del extremo N para promover HR mediante una ruta de reparación convencional (dominio cleavasa) o conservativa (dominio nickasa). (B) Construcción de fusión en el extremo C con propiedades como en (A). (C) La adhesión de dos dominios catalíticos a ambos extremos de la TALE permite la escisión doble con potenciación en NHEJ. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación. Los componentes de las proteínas de fusión se enumeran en la leyenda.
Figura 6: Esquema de configuraciones de cTALEN potenciadas. Las TALEN compactas pueden potenciarse mediante la adición de un dominio para promover actividades existentes o alternativas. Como cada extremo del dominio de unión a ADN de TALE es susceptible a fusión, el orden (en el extremo N frente al C) de adición de los dominios catalíticos y potenciadores puede variar con la aplicación. (A) Una cTALEN convencional con un dominio potenciador en el extremo C. (B) El dominio potenciador está fusionado a la cTALEN mediante el extremo N del dominio catalítico. Dicha configuración puede usarse para ayudar y/o anclar el dominio catalítico cerca del ADN para aumentar la actividad de escisión. (C) El dominio potenciador está emparedado entre el dominio catalítico y el dominio de unión a ADN de TALE. El dominio potenciador puede promover la comunicación entre los dominios flanqueantes (es decir, para ayudar en la catálisis y/o unión a ADN) o puede usarse para superar el nucleótido T necesario en la posición -1 de todas las dianas basadas en TALE. (D) El dominio potenciador se usa para remplazar funcionalmente la región del extremo N de la proteína TALE natural. (E) El dominio potenciador se usa para remplazar funcionalmente la región del extremo C de la proteína TALE natural. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación. Los componentes de las proteínas de fusión se enumeran en la leyenda.
Figura 7: Esquema de configuraciones de cTALEN en trans. Las TALEN compactas pueden combinarse con dominios potenciadores auxiliares para promover actividades alternativas. Los dominios auxiliares proporcionan una función adicional que no es esencial para la actividad de cTALEN. (A) Una cTALEN convencional con un dominio catalítico de nickasa en el extremo N se convierte en una "cleavasa" mediante la adición separada del dominio auxiliar. (B) En algunos casos, la necesidad de abordar la especificidad del dominio auxiliar es necesaria. Dicha configuración puede conseguirse mediante una fusión de TALE y puede usarse para ayudar y/o anclar el dominio auxiliar cerca del ADN para aumentar la actividad de la cTALEN. (C) El dominio auxiliar dirigido se proporciona antes o después de la cTALEN para realizar una tarea independiente. La comunicación entre las proteínas de fusión no es necesaria. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación. Los componentes de las proteínas de fusión se enumeran en la leyenda.
Figura 8: Esquema de escisión del ADN, religamiento in vivo y otras rutas de reparación. En células, la escisión por endonucleasas de corte infrecuente peptídico habitualmente produce una rotura bicatenaria del ADN (DSB) con extremos cohesivos. Por ejemplo, las meganucleasas de la familia LAGLIDADG, tales como I-Scel y I-Crel, producen DSB con salientes 3'. Estos extremos cohesivos pueden religarse in vivopor NHEJ, produciendo una reparación sin empalmes, y la restauración de la secuencia diana escindible, que a su vez puede procesarse de nuevo por la misma endonucleasa. Por tanto, puede tener lugar una serie de ciclos infructuosos de eventos de escisión y religamiento. La NHEJ imprecisa o recombinación homóloga puede alterar o eliminar el sitio de escisión, provocando la salida del ciclo; esto también puede aplicarse a las TALEN compactas y las TALEN compactas potenciadas (A). Otras dos vías también pueden detener el proceso: (i) Puede producirse pérdida del cromosoma como consecuencia del fracaso en la reparación de DSB; (ii) una pérdida de nucleasa (degradación, dilución, división celular, etc.). B-E: Consecuencias de escisión de enlaces fosfodiéster adicionales. La adición de una única actividad nickasa (B) o de dos actividades nickasa que afectan a la misma hebra (C) provocaría una interrupción monocatenaria, y suprimiría los extremos cohesivos, que a su vez podrían afectar el espectro de eventos. La adición de dos actividades nickasa que afectan a hebras opuestas (D) o de una nueva actividad cleavasa que genera una segunda DSB (E) provocaría una interrupción bicatenaria; como consecuencia, ya no es posible un religamiento perfecto, y podría estimularse uno o varios resultados de reparación alternativos. La figura actual no hace suposiciones respecto a las frecuencias relativas de estos resultados alternativos (NHEJ imprecisa, recombinación homóloga, otras, etc.). Los triángulos rellenos representan hidrólisis de enlaces fosfodiéster.
Figura 9: Actividad de TALE AvrBs3::TevI en levadura (37 °C). El control negativo consiste en una TALEN sin ningún RVD. n.d. indica actividad no detectable, indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura y ++ indica una actividad por encima de 0,7 en ensayo de levadura (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Figura 10: Actividad de TALE AvrBs3::TevI en células de mamífero. (Ensayo extracromosómico en CHO-K1). pCLS8993 (SEQ ID NO: 194) está representado por una barra negra y pCLS8994 (SEQ ID NO: 195) está representado por una barra gris oscura. Control negativo (vector vacío) por una barra blanca y control positivo (meganucleasa I-Scel) por una barra gris claro. Los datos están normalizados respecto al control positivo.
Figura 11: Actividad de TALE AvrBs3::NucA en levadura (37 °C). El control negativo es una diana que carece de un sitio de reconocimiento (ctrl. neg. : SEQ ID NO: 228). Compacta es una diana que tiene únicamente un sitio de reconocimiento (SEQ ID NO: 224). n.d. indica actividad no detectable, indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura a 37 °C; +, actividad por encima de 0,5 en ensayo de levadura a 37 °C y ++ actividad por encima de 0,7 en ensayo de levadura a 37 °C (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Figura 12: Actividad de TALE AvrBs3:: ColE7 en levadura (37 °C). El control negativo es una diana que carece de un sitio de reconocimiento (ctrl. neg. : SEQ ID NO: 228). Compacta es una diana que tiene únicamente un sitio de reconocimiento (SEQ ID NO: 224). n.d. indica actividad no detectable, indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura a 37 °C; +, actividad por encima de 0,5 en ensayo de levadura a 37 °C y ++ actividad por encima de 0,7 en ensayo de levadura a 37 °C (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Figura 13: Esquema y detalles de una TALEN compacta prototípica TALE::Crel. Esta clase de TALEN compacta está dirigida a una secuencia de reconocimiento de dos partes compuesta del sitio de unión a ADN de TALE proximal a un sitio diana de meganucleasa. El sitio de meganucleasa TCRB02-A genomanipulado se muestra junto con detalles del RVD y la secuencias de ADN reconocidas por el resto de TALE. Se presenta una región del gen del receptor B de célula de linfocitos T, que resalta la disposición endógena del sitio diana híbrido de TALEN compacta basado en TALE::Crel.
Figura 14: Actividad de construcciones basadas en TALE::scTB2aD01 en levadura (30 °C). Se muestran las disposiciones de las diversas dianas híbridas, empezando (5') con la región reconocida por el dominio de unión a ADN de TALE en mayúsculas, la región espadadora inespecífica en minúsculas y el sitio diana de meganucleasa en mayúscula subrayados. La actividad en levadura se ilustra para construcciones representativas selectivas. n.d. indica actividad no detectable, indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura a 30 °C; +, actividad por encima de 0,5 en ensayo de levadura a 30 °C y ++ actividad por encima de 0,7 en ensayo de levadura a 30 °C (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Figura 15: Transferencia de Western de construcciones basadas en TALE::scTB2aD01. Las construcciones se expresaron en células HEK293 y se prepararon extractos de proteínas totales 48 horas después de la transfección. La proteína se detectó usando un anticuerpo policlonal anti-I-Crel.
Figura 16: Toxicidad de construcciones basadas en TALE::scTB2aD01 en células CHOK1. La citotoxicidad se basa en niveles detectables de GFP expresada en células vivas, en el día 1 frente al día 6, respecto a un control convencional (transfección de plásmido vacío).
Figura 17: Actividad de NHEJ de construcciones basadas en TALE::scTB2aD01 en células HEK293. Se usa un análisis basado en PCR después de la transfección de ADN genómico para evaluar la actividad in vivo. La escisión de secuencias de ADN emparejadas incorrectamente por la endonucleasa de T7 es indicativa de eventos de NHEJ resultantes de la actividad de la cTALEN o meganucleasa en el locus diana.
Figura 18: Actividad de Tevl::TALE-AvrBs3 /- TALE-RagT2-R::TevI en levadura (37 °C). El control negativo es una diana que carece de un sitio de reconocimiento (ctrl. neg. : SEQ ID NO: 228). n.d. indica actividad no detectable, indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura a 37 °C; +, actividad por encima de 0,5 en ensayo de levadura a 37 °C y ++ actividad por encima de 0,7 en ensayo de levadura a 37 °C (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Figura 19: Actividad de TALE::SnaseSTAAU en levadura (37 °C). El control negativo es una diana que carece de un sitio de reconocimiento. Compacta es una diana que tiene únicamente un sitio de reconocimiento (SEQ ID NO: 224). n.d. indica actividad no detectable a 37 °C, /- indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura a 37 °C; indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura a 37 °C; + indica una actividad por encima de 0,5 en ensayo de levadura a 37 °C; ++ indica una actividad por encima de 0,75 en ensayo de levadura a 37 °C (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al.
2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Figura 20: Actividad de TALE::ColE7 con diversos conectores polipeptídicos en levadura (37 °C). Compacta es una diana que tiene únicamente un sitio de reconocimiento (SEQ iD NO: 224). n.d. indica actividad no detectable a 37 °C, indica una actividad por encima de 0,3 en ensayo de levadura a 37 °C; + indica una actividad por encima de 0,5 en ensayo de levadura a 37 °C; ++ indica una actividad por encima de 0,75 en ensayo de levadura a 37 °C (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al.
2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Tabla 6: Lista de dianas de AvrBs3 con diversas longitudes de espaciador (SEQ ID NO: 157 a 192).
Tabla 7: Lista de dianas AvrBs3 con diversas longitudes de espaciador (SEQ ID NO: 157 a 192) incluyendo una diana con únicamente un sitio de reconocimiento (compacta, SEQ ID NO: 224) y una diana de control negativo (ctrl. neg., SEQ ID NO: 228) que consiste en una diana sin ningún sitio de reconocimiento.
Tabla 13: Lista de dianas de RagT2-R/AvrBs3 híbridas con diversas longitudes de espaciador (SEQ ID NO: 315 a 350).
Descripción detallada de la invención
Salvo que se defina específicamente en este documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que el habitualmente comprendido por un experto en los campos de genoterapia, bioquímica, genética y biología molecular.
Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento pueden usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, describiéndose en este documento los métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes, salvo que se especifique de otro modo.
La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley y son Inc, Library of Congress, Estados Unidos); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente de Estados Unidos n.° 4683195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries y S. J. Higgins eds.
1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOg Y (J. Abelson y M. Simon, eds. principales, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, vol. 154 y 155 (Wu et al. eds.) y vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
En un primer aspecto, la presente invención describe un método para generar nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (cTALEN) compactas compuestas de una única cadena polipeptídica que no requieren dimerización para abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenaria única de interés.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención describe un método para generar nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (cTALEN) compactas, que comprende la etapas de:
(i) Genomanipular un armazón de TALE central (a) que comprende diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión al ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés, (b) en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN;
(ii) Determinar o genomanipular al menos un dominio catalítico en el que dicho dominio catalítico puede procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés cuando se fusiona a dicho armazón de TALE central genomanipulado de (i);
(iii) Opcionalmente determinar o genomanipular un conector peptídico para fusionar dicho dominio catalítico de (ii) a dicho armazón de TALE central genomanipulado de (i);
obteniendo de ese modo una entidad de TALEN compacta compuesta de una única cadena polipeptídica que no requiere dimerización para abordar una secuencia diana de ADN bicatenaria única específica de interés y procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés. En otras palabras, la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención es una unidad de entidad activa que puede abordar, por sí misma, únicamente una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés mediante un dominio de unión a ADN y de procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés.
En otra realización, es un método para abordar y procesar un ADN bicatenario, que comprende:
(a) Seleccionar una secuencia diana de ADN de interés en una hebra de un ADN bicatenario;
(b) proporcionar un monómero de TALEN compacta única, que comprende:
(i) Un armazón de TALE central que comprende regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) que tiene especificidad de unión a ADN en dicha secuencia diana de ADN de interés;
(ii) Al menos un dominio catalítico en el que dicho dominio catalítico puede procesar ADN a unas pocas pares de bases de dicha secuencia diana de a Dn de interés cuando se fusiona al extremo C y/o N de dicho armazón de TALE central de (i);
(iii) Opcionalmente un conector peptídico para fusionar dicho dominio catalítico de (ii) con dicho armazón de TALE central de (i) cuando se necesita;
en el que dicho monómero de TALEN compacta se ensambla para unir y procesar dicha ADN bicatenario sin requerir dimerización;
(c) Poner en contacto dicho ADN bicatenario con dicho monómero único de modo que la doble hebra se procese a una pocas pares de bases en la dirección 3' y/o 5' de dicha secuencia diana de una hebra.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado puede comprender un dominio del extremo N adicional que produce un armazón de TALE central genomanipulado que comprende secuencialmente un dominio del extremo N y diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión a ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés, en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado puede comprender un dominio del extremo C adicional que produce un armazón de TALE central genomanipulado que comprende secuencialmente diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión a ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y un dominio del extremo C, en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado puede comprender dominios en el extremo N y en el extremo C adicionales que producen un armazón de TALE central genomanipulado que comprende secuencialmente un dominio en el extremo N, diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión a ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y un dominio en el extremo C, en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN. Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado puede comprender las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en ST1 (SEQ ID NO: 134) y ST2 (SEQ ID NO: 135). Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE genomanipulado puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 134 y la SEQ ID NO: 135.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado puede comprender la secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en bT1-Avr (SEQ ID NO: 136), bT2-Avr (SEQ ID NO: 137), bT1-Pth (SEQ ID NO: 138) y bT2-Pth ( S e Q ID NO: 139). Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE genomanipulado puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 136 a la SEQ ID NO: 139.
Como también se divulga en este documento, dichos dominios en el extremo N y el extremo C adicionales del armazón de TALE central genomanipulado se obtienen preferiblemente de TALE natural. Como también se divulga en este documento, dichos dominios del extremo N y el extremo C adicionales del armazón de TALE central genomanipulado se obtienen más preferiblemente de TALE natural como AvrBs3, PthXol, AvrHahl, PthA, Tallc como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, dichos dominios en el extremo N y/o el extremo C adicionales pueden ser más preferiblemente formas truncadas de dominios en el extremo N y/o el extremo C respectivos de TALE natural como AvrBs3, PthXol, AvrHahl, PthA, Tallc como ejemplos no limitantes de los que se obtienen. Como también se divulga en este documento, dichas secuencias de los dominios en el extremo N y el extremo C adicionales del armazón de TALE central genomanipulado pueden seleccionarse más preferiblemente del grupo que consiste en ST1 SEQ ID NO: 134 y ST2 SEQ ID NO: 135 como se ejemplifica respectivamente en los armazones proteínicos basales bT 1 -Avr (SEQ ID NO: 136) o bT1-Pth (SEQ ID NO: 138) y bT2-Avr (SEQ ID NO: 137) o bT2-Pth (SEQ ID NO: 139).
Como también se divulga en este documento, cada RVD de dicho armazón central puede estar hecho de 30 a 42 aminoácidos, más preferiblemente 33 o 34, en el que dos aminoácidos críticos ubicados en las posiciones 12 y 13 median el reconocimiento de un nucleótido de dicha secuencia diana de ácido nucleico; dos aminoácidos críticos equivalentes pueden estar ubicados en las posiciones diferentes a 12 y 13 especialmente en RVD más grandes de 33 o 34 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, NK para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A e YG para reconocer T, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. Más preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimientos de los nucleótidos C, T, A, G/A y G respectivamente se seleccionan del grupo que consiste en NN o NK para reconocer G, HD para reconocer C, NG para reconocer T y NI para reconocer A, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. Como también se divulga en este documento, los RVD asociados con el reconocimiento del nucleótido C pueden seleccionarse del grupo que consiste en N* y los RVD asociados con el reconocimiento del nucleótido T pueden seleccionarse del grupo que consiste en N* y H*, donde * indica una interrupción en la secuencia de repetición que corresponde a una ausencia de resto de aminoácido en la segunda posición del RVD. Como también se divulga en este documento, los aminoácidos críticos 12 y 13 pueden mutarse en otros restos de aminoácido para modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G y, en particular, para potenciar su especificidad. Por otros restos de aminoácido se entiende cualquiera de los veinte restos de aminoácido naturales o derivados de aminoácidos no naturales.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón central de la presente invención puede comprender entre 8 y 30 RVD. Más preferiblemente, dicho armazón central de la presente invención puede comprender entre 8 y 20 RVD; de nuevo más preferiblemente 15 RVD.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón central puede comprender un único RVD truncado adicional hecho de 20 aminoácidos ubicado en el extremo C de dicho conjunto de RVD, es decir, un semi-RVD en el extremo C adicional. En este caso, dicho armazón central de la presente invención puede comprender entre 8,5 y 30,5 RVD, refiriéndose ",5" al semi-RVD mencionado previamente (o RVD terminal, o semirrepetición). Más preferiblemente, dicho armazón central de la presente invención puede comprender entre 8,5 y 20,5 RVD, de nuevo más preferiblemente, 15,5 RVD. Como también se divulga en este documento, dicho semi-RVD está preferiblemente en un contexto de armazón central que permite una ausencia de especificidad de dicho semi-RVD hacia los nucleótidos A, C, G, T. Como también se divulga en este documento, dicho semi-RVD más preferiblemente está ausente.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón central puede comprender RVD de diferentes orígenes. Como también se divulga en este documento, dicho armazón central puede comprender preferiblemente RVD originados de diferentes efectores TAL de origen natural. Como también se divulga en este documento, la estructura interna de algunos RVD del armazón central de la presente invención pueden estar constituidos preferiblemente por estructuras o secuencias originadas de diferentes efectores TAL de origen natural. Como también se divulga en este documento, Dicho armazón central de la presente invención puede comprender dominios de tipo RVD. Los dominios de tipo RVD tienen una secuencia diferente de los RVD de origen natural, pero tienen la misma función y/o estructura global dentro de dicho armazón central de la presente invención.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio en el extremo N adicional de dicho armazón de TALE central genomanipulado puede ser un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en la proteína de unión a ARN Puf o la superfamilia de anquirina, como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, dicha secuencia de dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en los dominios proteínicos de la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5, como ejemplos no limitantes enumerados en la tabla 1, un mutante funcional, una variante o un derivado de los mismos.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio en el extremo C adicional de dicho armazón de TALE central genomanipulado puede ser un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en hidrolasa/transferasa de la familia de Pseudomonas aeuriginosa, el dominio polimerasa de la familia de ligasa D de Mycobacterium tuberculosis, el factor de inicio elF2 de la familia de Pyrococcus, el factor de inicio de la traducción de la familia Aif2, como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, dicha secuencia de dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en los dominios proteínicos de la SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 9, como ejemplos no limitantes enumerados en la tabla 1, un mutante funcional, una variante o un derivado de los mismos.
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Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico que tiene capacidad de procesamiento de ADN cerca de la secuencia diana de ADN monocatenario única de interés, cuando se fusiona a dicha armazón de TALE central genomanipulado de acuerdo con el método de la presente invención, se fusiona preferiblemente en la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico se fusiona preferiblemente en la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. Como también se divulga en este documento, pueden fusionarse dos dominios catalíticos tanto a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central como a la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede tener más preferiblemente una actividad enzimática seleccionada del grupo que consiste en actividad nucleasa, actividad polimerasa, actividad cinasa, actividad fosfatasa, actividad metilasa, actividad topoisomerasa, actividad integrasa, actividad transposasa o actividad ligasa. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico fusionado al armazón de TALE central de la presente invención puede ser un activador o represor de la transcripción (es decir, un regulador de transcripción) o una proteína que interactúa con o modifica otras proteínas tales como histonas. Los ejemplos no limitantes de actividades de procesamiento del ADN de dicha TALEN compacta de la presente invención incluyen, por ejemplo, creación o modificación de elementos reguladores epigenéticos, generación de inserciones, eliminaciones o reparaciones específicas de sitio en el ADN, control de la expresión génica y modificación de la estructura de la cromatina.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico más preferiblemente tiene una actividad endonucleasa. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico más preferiblemente tiene actividad de escisión en dicho ADN bicatenario de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico más preferiblemente tiene una actividad nickasa sobre dicho ADN bicatenario de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico se selecciona más preferiblemente del grupo que consiste en las proteínas Mmel, Colicina-E7 (CEA7_ECOLX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP1I, I-BasI, I-Bmol, I-HmuI, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-Twol, R.Mspl, R.Mval, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_StAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.PleI, MlyI, AlwI, Mva1269I, BsrI, BsmI, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.BtsI, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu 10I subunidad alfa, Bpu10I subunidad beta, BmrI, Bfil, I-CreI, hExoI (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), ExoI de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y las SEQ ID NO: 1, 366 y 367), un mutante funcional, una variante o un derivado de los mismos. De acuerdo con el método de la presente invención, dicho dominio catalítico es I-Tevl (SEQ ID NO: 20). Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico I-Tevl (SEQ ID NO: 20), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 420-432. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico es preferiblemente ColE7 (SEQ ID NO: 11), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico ColE7 (SEQ ID NO: 11), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo se fusiona preferiblemente en el dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico ColE7 (SEQ ID NO: 11), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo se fusiona preferiblemente en el dominio del extremo C de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención preferiblemente comprende una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 435-438.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico es preferiblemente NucA (SEQ ID NO: 26), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico NucA (SEQ ID NO: 26), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo se fusiona preferiblemente en el dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico NucA (SEQ ID NO: 26), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo se fusiona preferiblemente en el dominio del extremo C de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención preferiblemente comprende una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 433-434.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede ser I-CreI (SEQ ID NO: 1), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico I­ CreI (SEQ ID NO: 1), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico I-CreI (SEQ ID NO: 1), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo C de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 439-441 y la SEQ ID NO: 444-446.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede ser una enzima de restricción tal como Mmel, R-HinPII, R.MspI, R.Mval, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I, ss.BspD6I, R.PleI, Mlyl y AlwI como ejemplos no limitantes enumerados en la tabla 2. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede tener una actividad exonucleasa.
Como también se divulga en este documento, cualquier combinación de dos dominios catalíticos seleccionados del grupo que consiste en la proteínas Mmel, Colicina-E7 (CEA7_ECOLX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP11, I-Basl, I-BmoI, I-HmuI, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-TwoI, R.Mspl, R.Mval, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_STAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.PleI, Mlyl, Alwl, Mva1269I, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.BtsI, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu 10I subunidad alfa, Bpu10I subunidad beta, Bmrl, BfiI, I­ CreI, hExol (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), Exol de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y las SEQ ID NO: 1, 366 y 367), un mutante funcional, una variante o un derivado de estos dominios proteínicos de los mismos, pueden fusionarse tanto a la parte del extremo N como la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central, respectivamente. Por ejemplo, el dominio catalítico I-Hmul puede fusionarse a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central y el dominio catalítico ColE7 puede fusionarse a la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. En otro ejemplo, el dominio catalítico I-Tevl puede fusionarse a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central y el dominio catalítico ColE7 puede fusionarse a la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. Como también se divulga en este documento, de acuerdo con el método de la presente invención, dicho monómero de TALEN compacta única puede comprender una combinación de dos dominios catalíticos, respectivamente fusionados a la parte del extremo C y a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central seleccionada del grupo que consiste en:
(i) un dominio Nuc A (SEQ ID NO: 26) en el extremo N y un domino Nuc A (SEQ ID NO: 26) en el extremo C; (ii) un dominio ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo N y un domino ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo C; (iii) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo C; (iv) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino NucA (SEQ ID NO: 26) en el extremo C; (v) un dominio ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo N y un dominio NucA (SEQ ID NO: 26) en el extremo C; (vi) un dominio NucA (SEQ ID NO: 26) en el extremo N y un dominio ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo C.
Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 448 y 450.
Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una combinación de dos dominios catalíticos, respectivamente fusionados a la parte del extremo C y a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central seleccionada del grupo que consiste en:
(i) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino Fokl (SEQ ID NO: 368) en el extremo C;
(ii) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo C;
(iii) un dominio scTrex2 (SEQ ID NO: 451) en el extremo N y un domino Fokl (SEQ ID NO: 368) en el extremo C.
Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 447-450 y la SEQ ID NO: 452.
Puede preverse la inserción de dicho dominio catalítico entre dos partes del armazón de TALE central genomanipulado, comprendiendo cada parte un conjunto de RVD. En este último caso, el número de RVD para cada parte del armazón de TALE central genomanipulado puede ser el mismo o no. En otras palabras, puede preverse dividir dicho armazón de TALE central para insertar un dominio catalítico entre las dos partes resultantes del armazón de TALE central genomanipulado. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 453-455.
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Como también se divulga en este documento, el conector peptídico que puede unir dicho dominio catalítico al armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1, NFS2, CFS1, RM2, BQY, QGPSG, LGPDGRKA, 1a8h_1, 1dnpA_1, 1d8cA_2, 1ckqA 3, 1sbp_1, 1ev7A_1, 1alo_3, 1amf_1, 1adjA_3, 1fcdC_1, 1al3_2, 1g3p_1, 1acc_3, 1ahjB_1, 1acc_1, 1af7_1, 1heiA_1, 1bia_2, 1igtB_1, 1nfkA_1, 1au7A_1, 1bpoB_1, 1b0pA_2, 1c05A_2, 1gcb_1, 1bt3A_1, 1b3oB_2, 16vpA_6, 1dhx_1, 1b8aA_1 y 1qu6A_1, como se enumera en la tabla 3 (de la SEQ ID NO: 67 a la SEQ ID NO: 104 y de la SEQ ID NO: 372 a la SEQ ID NO: 415). Como también se divulga en este documento, el conector peptídico que puede unir dicho dominio catalítico al armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1 (SEQ ID NO: 98), NFS2 (SEQ ID NO: 99) y CFS1 (SEQ ID NO: 100). También se describe el caso donde no se necesita un conector peptídico para fusionar un dominio catalítico al armazón de TALE para obtener una cTALEN.
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Dependiendo de su composición estructural [tipo de armazón de TALE central, tipo de domino o dominios catalíticos con actividades enzimáticas asociadas y finalmente tipo de conector o conectores], una TALEN compacta puede comprender diferentes niveles de actividades enzimáticas diferentes capaces de procesar ADN de forma diferente, produciendo una eficacia de procesamiento de ADN global para dicha TALEN compacta, teniendo cada una de dichas actividades enzimáticas diferentes su propia eficacia de procesamiento de ADN.
Como también se divulga en este documento, el método de acuerdo con la presente invención puede comprender además la etapas de:
(i) Genomanipulación de al menos un dominio potenciador;
(ii) Opcionalmente determinación o genomanipulación de un conector peptídico para fusionar dicho dominio potenciador a una parte dicha entidad de TALEN compacta;
obteniendo de ese modo una entidad de TALEN compacta con eficacia de procesamiento de ADN potenciada cerca de una secuencia diana de ADN bicatenario única de interés, es decir, una TALEN compacta potenciada.
En otras palabras, de acuerdo con el método de la presente invención, dicho monómero de TALEN compacta única comprende además:
(i) Al menos un dominio potenciador;
(ii) Opcionalmente un conector peptídico para fusionar dicho dominio potenciador con una parte de dicha entidad activa de monómero de TALEN compacta única.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse al extremo N de la parte de armazón de TALE central de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse al extremo C de la parte de armazón de TALE central de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse a la parte de dominio catalítico de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse entre el extremo N de la parte de armazón de TALE central y la parte catalítica de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse entre el extremo C de la parte de armazón de TALE central y la parte catalítica de dicha entidad de TALEN compacta. Puede preverse la inserción de dicho dominio catalítico y/o domino potenciador entre dos partes del armazón de TALE central genomanipulado, comprendiendo cada parte un conjunto de RVD. En este último caso, el número de RVD para cada armazón de TALE central genomanipulado puede ser el mismo o no. En otras palabras, puede preverse dividir dicho armazón de TALE central para insertar un dominio catalítico y/o un dominio potenciador entre las dos partes resultantes de dicho armazón de TALE central genomanipulado.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede ser catalíticamente activo o no, proporcionando soporte funcional y/o estructural a dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede consistir en un dominio proteínico seleccionado de grupo que consiste en Mmel, Colicina-E7 (CeA7_ECOlX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP11, I-BasI, I-Bmol, I-HmuI, I-TevI, I-TevII, I-Tevlll, I-Twol, R.Mspl, R.Mval, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_STAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.PleI, Mlyl, Alwl, Mva1269I, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.BtsI, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu 10I subunidad alfa, Bpu 10I subunidad beta, Bmrl, Bfil, I-CreI, hExol (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), Exol de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID No : 1, 366 y 367, un mutante funcional, una variante o un derivado de los mismos. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente activo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte funcional y/o estructural a dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente inactivo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte estructural a dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en I-Tevl (SEQ ID NO: 20), ColE7 (SEQ ID NO: 11) y NucA (SEQ ID NO: 26).
Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta potenciada de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender un segundo dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede tener las mismas característica que el primer dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede proporcionar soporte estructural a la entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede proporcionar soporte funcional a la entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede proporcionar soporte estructural y funcional a la entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender un dominio catalítico y un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender un dominio catalítico y dos dominios potenciadores. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender dos dominios catalíticos y un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender dos dominios catalíticos y dos dominios potenciadores. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede consistir en un dominio proteínico derivado de una proteína seleccionada del grupo que consiste en Mmel, Colicina-E7 (CEA7_ECOLX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP11, I-Basl, I-Bmol, I-Hmul, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-Twol, R.MspI, R.MvaI, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_STAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.PleI, Mlyl, Alwl, Mva1269I, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.BtsI, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu10I subunidad alfa, Bpu10I subunidad beta, Bmrl, Bfil, I-CreI, hExol (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), Exol de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 1,366 y 367, un mutante funcional, una variante o un derivado de los mismos. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente activo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte funcional y/o estructural a dicha entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente inactivo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte estructural a dicha entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, cualquier combinación de dominios catalíticos y/o potenciadores enumerados anteriormente, como ejemplos no limitantes, puede preverse para fusionarse a dicho armazón de TALE central proporcionando soporte estructural y/o funcional a dicha entidad de TALEN compacta. Más preferiblemente, pueden preverse combinaciones de dominios catalíticos seleccionados del grupo de Tevl (SEQ ID NO: 20), ColE7 (SEQ ID NO: 11) y NucA (SEQ ID NO: 26). Opcionalmente, Fokl (SEQ ID NO: 368) puede usarse en combinación con otro dominio catalítico de acuerdo con la lista de la tabla 2. Dichas combinaciones de dominios catalíticos y/o potenciadores puede preverse respecto a las aplicaciones prevista para usar el método de la presente invención.
Dependiendo de su composición estructural [tipo de armazón de TALE central, tipo de domino o dominios catalíticos con actividades enzimáticas asociadas, finalmente tipo de conector o conectores y tipo de dominio o dominios potenciadores], una TALEN compacta potenciada puede presentar diferentes niveles de actividades enzimáticas diferentes capaces de procesar ADN de forma diferente, produciendo una eficacia de procesamiento de ADN global para dicha TALEN compacta potenciada, teniendo cada una de dichas actividades enzimáticas diferentes su propia eficacia de procesamiento de ADN.
Como también se divulga en este documento, la eficacia de procesamiento de ADN de la entidad de TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede potenciarse genomanipulando al menos un dominio potenciador y un conector peptídico, obteniendo de ese modo una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada cerca de una secuencia diana de ADN bicatenario única de interés, es decir, una TALEN compacta potenciada.
Dependiendo de su composición estructural, la eficacia de procesamiento de ADN global que está potenciada en dicha TALEN compacta, potenciada, puede tener una actividad enzimática dominante seleccionada del grupo que cosiste en una actividad nucleasa, una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, la eficacia de procesamiento de ADN global que está potenciada en dicha TALEN compacta potenciada de acuerdo con la presente invención puede ser una combinación de diferentes actividades enzimáticas seleccionadas del grupo que consiste en una actividad nucleasa, una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, la eficacia de procesamiento de ADN global que está potenciada en dicha TALEN compacta potenciada puede ser una de sus diferentes actividades enzimáticas seleccionadas del grupo que consiste en una actividad nucleasa, una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. En este caso, la eficacia de procesamiento de ADN global es equivalente a una actividad de procesamiento de ADN entre las actividades enzimáticas mencionadas anteriormente. Como también se divulga en este documento, dicha actividad de procesamiento de ADN de la entidad de TALEN compacta que está potenciada por el potenciador puede ser una actividad cleavasa o una actividad nickasa o una combinación tanto de una actividad cleavasa como de una actividad nickasa.
La potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una entidad de TALEN compacta puede ser una consecuencia de un soporte estructural por al menos un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho soporte estructural puede potenciar la unión de una entidad de TALEN compacta por dicha secuencia diana de a Dn en comparación con la unión de dicha entidad de TALEN compacta de partida por la misma secuencia diana de ADN, ayudando indirectamente de este modo a que el dominio o los dominios catalíticos obtengan una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho soporte estructural puede potenciar la actividad catalítica existente de una entidad de TALEN compacta por una secuencia diana de ADN en comparación con la unión de una entidad de TALEN compacta de partida por la misma secuencia diana de ADN para obtener una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada.
Como también se divulga en este documento, dicho potenciador de acuerdo con el método de la presente invención puede potenciar tanto la unión de la entidad de TALEN compacta por dicha secuencia diana de ADN como la actividad catalítica del dominio o dominios catalíticos para obtener una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada. Todos estos ejemplos no limitantes dan lugar a una entidad de TALEN compacta con eficacia de procesamiento de ADN potenciada por una secuencia diana de ADN en un locus genómico de interés, es decir, una TALEN compacta potenciada.
La potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una entidad de TALEN compacta, en comparación con una entidad de TALEN compacta de partida, también puede ser una consecuencia de un soporte funcional por al menos un dominio potenciador. En una realización preferida, dicho soporte funcional puede ser la consecuencia de la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una nucleasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una endonucleasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una cleavasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una nickasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una exonucleasa.
En experimentos de manipulación de genoma, la eficacia de endonucleasa de corte infrecuente, por ejemplo, su capacidad de inducir un evento deseado (dirección a gen homólogo, mutagénesis dirigida, eliminación o escisión de secuencia) en un locus, depende de varios parámetros, incluyendo la actividad específica de la nucleasa, probablemente la accesibilidad de la diana y la eficacia y resultado de la ruta o rutas de reparación que provocan el evento deseado (reparación homóloga para dirección génica, rutas de NHEJ para mutagénesis dirigida).
La escisión por endonucleasas de corte infrecuente peptídico habitualmente genera extremos cohesivos, con salientes 3' para meganucleasas LAGLIDADG (Chevalier y Stoddard 2001) y salientes 5' para nucleasas de dedos de cinc (Smith, Bibikova et al. 2000). Estos extremos, que son el resultado de la hidrólisis de enlaces fosfodiéster, pueden volver a ligarse in vivo por NHEJ de una manera sin empalmes (es decir, un religamiento sin marcas). La restauración de una secuencia diana escindible permite un nuevo evento de escisión por la misma endonucleasa y, por tanto, puede tener lugar una serie de ciclos infructuosos de eventos de escisión y religamiento. Las evidencias indirectas han demostrado que incluso en la levadura Saccharomyces cerevisiae, dichos ciclos podrían tener lugar tras la escisión continua por la endonucleasa HO (Lee, Paques et al. 1999). En células de mamífero, varios experimentos han demostrado que un perfecto religamiento de extremos cohesivos compatibles resultantes de dos DSB inducidos por I-Scel independientes, pero cercanos es un proceso eficaz (Guirouilh-Barbat, Huck et al. 2004; Guirouilh-Barbat, Rass et al. 2007; Bennardo, Cheng et al. 2008; Bennardo, Gunn et al. 2009). La ausencia de la proteína de reparación de ADN Ku no afecta significativamente a la frecuencia global de eventos de NHEJ que vuelve a unir los extremos de las dos DSB; sin embargo, potencia muy fuertemente la contribución de NHEJ imprecisa al proceso de reparación en células inmortalizadas CDO y células ES de ratón (Guirouilh-Barbat, Huck et al. 2004; Guirouilh-Barbat, Rass et al.
2007; Bennardo, Cheng et al. 2008). Además, la ausencia de Ku estimula los eventos inducidos por I-Scel tales como NHEJ imprecisa (Bennardo, Cheng et al. 2008), hibridación monocatenaria (Bennardo, Cheng et al. 2008) y conversión génica (Pierce, Hu et al. 2001; Bennardo, Cheng et al. 2008) en células ES de ratón. Se han hecho observaciones similares con células deficientes para la proteína de reparación XRCC4 (Pierce, Hu et al. 2001; Guirouilh-Barbat, Rass et al. 2007; Bennardo, Gunn et al. 2009) (aunque la deficiencia de XRCC4 afecta al nivel global de NHEJ en células CHO (Guirouilh-Barbat, Rass et al. 2007)) o para DNA-PK (Pierce, Hu et al. 2001). Por el contrario, la atenuación de CtIP ha demostrado suprimir "alt-NHEJ" (una forma independiente de Ku y XRCC4 de NHEJ más propensa a producir NHEJ imprecisa), hibridación monocatenaria y conversión génica, mientras que no afecta al nivel global de reunión de dos extremos compatibles generados por I-Scel (Bennardo, Cheng et al. 2008). Por tanto, la competición entre las diferentes rutas de reparación DSB puede afectar al espectro o los eventos de reparación resultantes de una DSB inducida por nucleasa.
Además, la resección de DSB es importante para determinadas rutas de DSB. La resección de DSB extensiva, que produce la generación de regiones monocatenarias grandes (unos pocos cientos de nucleótidos al menos), se ha demostrado en levaduras que inicia la hibridación monocatenaria (Sugawara y Haber 1992) y la invasión de hebra, la etapa dependiente de ATP que inicia muchos eventos de recombinación homólogos de invasión de dúplex de ADN por una hebra homóloga a esa (White y Haber 1990; Sun, Treco et al. 1991) (para una revisión de los mecanismos, véase (Paques y Haber 1999)). En células eucariotas, la resección de DSB depende de varias proteínas incluyendo BLM/Sgs1 y DNA2, EXOI y el complejo MRN (Mre11, Rad50, Nbs1/Xrs2) y se cree que es el resultado de diferentes rutas. MRN está implicado en un proceso de resección a pequeña escala, mientras que dos rutas redundantes dependientes de BLM y DNA2 por un lado, y de EXOI por otro lado, estarían implicadas en la resección extensiva (Mimitou y Symington 2008; Nimonkar, Genschel et al. 2011). Además, el procesamiento de los extremos que implica un nucleótido dañado (resultante de la escisión química o de un aducto voluminoso), requiere la proteína CtIP/Sae2 junto con RMN (Sartori, Lukas et al. 2007; Buis, Wu et al. 2008; Hartsuiker, Mizuno et al. 2009). La sobreexpresión de la exonucleasa Trex2 demostró estimular fuertemente NHEJ imperfecta asociada con la pérdida de únicamente unas pocas pares de bases (Bennardo, Gunn et al. 2009), aunque inhibía diversos tipos de eventos de reparación de ADN entre secuencias distantes (tal como hibridación monocatenaria, NHEJ entre extremos de diferentes roturas o reparación por NHEJ de una DSB individual que implica microhomologías remotas). En el mismo estudio, se sugirió que Trex2 resecaba los salientes 3' dejados por I-Scel de una manera no procesiva. Por tanto, el tipo de ruta estimulada podría depender, a su vez, del tipo de resección (longitud de resección, monocatenario frente a bicatenario, resección de hebra 5' frente a hebra 3').
Por tanto, la eficacia de una TALEN compacta, por ejemplo, su capacidad de producir un evento deseado tal como mutagénesis dirigida o dirección a gen homólogo (véase la definición para la definición completa de "eficacia de TALEN compacta"), puede potenciarse mediante una potenciación o modificación de su eficacia de procesamiento de ADN global (véase la definición para la definición completa de "eficacia de procesamiento de ADN global"), por ejemplo, el resultante global o el resultado general de diferentes actividades enzimáticas separadas de dicha TALEN compacta.
Como también se divulga en este documento, la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN global de una entidad de TALEN compacta, en comparación con una entidad de TALEN compacta de partida, puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales en el sitio de escisión.
Dicha hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales en el sitio de escisión por dicho al menos un potenciador de acuerdo con la invención puede dar lugar a diferentes tipos de resección de DSB que afecta a dicho sitio de escisión de DSB, una única hebra de ADN o ambas hebra de ADN, que afecta a cualquier extremo saliente 5', cualquier extremo saliente 3' o ambos extremos y dependiendo de la longitud de dicha resección. Por tanto, añadir nuevas actividades nickasa o cleavasa a la actividad cleavasa existente de una entidad de TALEN compacta puede potenciar la eficacia de la TALEN compacta potenciada resultante, en un locus genómico de interés (figura 8B-8E). Como un ejemplo no limitante, la adición de dos actividades nickasa en hebras opuestas (figura 8D) o de una nueva actividad cleavasa que genera una segunda DSB (figura 8E) puede provocar una interrupción bicatenaria. Como consecuencia, el religamiento perfecto ya no es posible, y puede estimularse uno o varios resultados de reparación alternativos tales como NHEJ imprecisa, recombinación homóloga o SSA por ejemplo. Como otro ejemplo no limitante, la adición de una única actividad nickasa puede provocar una interrupción monocatenaria, y suprimir la cohesividad de los extremos, que también puede potenciar la eficacia de la TALEN compacta potenciada resultante en un locus genómico de interés, mediante estimulación de uno o varios resultados de reparación alternativos mencionados anteriormente.
En este aspecto descrito de la presente invención, la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una TALEN compacta se refiere al aumento en el nivel detectado de dicha eficacia de procesamiento de ADN, frente a una secuencia de ADN diana, o de TALEN compacta potenciada en comparación con la actividad de una primera TALEN compacta frente a la misma secuencia de ADN diana. Dicha primera TALEN compacta puede ser una TALEN compacta de partida o una TALEN compacta que ya se ha genomanipulado o una TALEN compacta potenciada. Puede preverse varias rondas de potenciación a partir de una TALEN compacta de partida o a partir de una TALEN compacta potenciada de partida.
En este aspecto descrito del método de la presente invención, la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de la entidad de TALEN compacta (o TALEN compacta potenciada) se refiere al aumento en el nivel detectado de dicha eficacia de procesamiento de ADN frente a una secuencia de ADN diana de interés o cerca de dicha secuencia de ADN de interés en comparación con la eficacia de una primera TALEN compacta o TALEN compacta de partida frente a o cerca de la misma secuencia de ADN diana. En este caso, la TALEN compacta de partida se toma como el armazón de referencia para medir la eficacia de procesamiento de ADN. Dicha TALEN compacta potenciada es una TALEN compacta genomanipulada que comprende un dominio potenciador de acuerdo con este aspecto descrito de la invención. Dicha TALEN compacta potenciada también puede tomarse como armazón de referencia para potenciación adicional de dicha eficacia de procesamiento de ADN. Como un ejemplo no limitante, dicha eficacia de procesamiento de ADN puede producirse a partir de una recombinación inducida por escisión generada por dicha TALEN compacta potenciada. En este caso, dicho nivel de recombinación inducida por escisión puede determinarse, por ejemplo, por un ensayo de recombinación basado en células como se describe en la solicitud PCT internacional WO 2004/067736. De forma importante, la potenciación de la eficacia en células (generación potenciada de mutagénesis dirigida o recombinación dirigida) puede estar asociada, aunque no necesariamente, con una potenciación de la actividad de escisión que podría detectarse en determinados ensayos in vitro. Por ejemplo, actividades fosfodiesterasa adicionales como se describe en la figura 8 podrían afectar escasamente al perfil de escisión, que se detecta por escisión in vitro y separación de los productos de escisión en un gel de electroforesis. Sin embargo, como se explica anteriormente, y en leyenda de la figura 8, los extremos de DSB generados de esta manera podrían ser más propensos para inducir reordenamientos genómicos detectables tales como mutagénesis dirigida (por NHEJ imprecisa) o recombinación homóloga. Dicha potenciación en la recombinación inducida por escisión de dicha TALEN compacta potenciada es una potenciación de al menos un 5 % en comparación con el armazón de partida o TALEN compacta de partida, más preferiblemente una potenciación de al menos un 10 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 15 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 20 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 25 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de un 50 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación mayor de un 50 %, que provoca una potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de dicha TALEN compacta potenciada de al menos un 5 % en comparación con el armazón de partida o TALEN compacta de partida, más preferiblemente una potenciación de al menos un 10 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 15 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 20 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 25 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de un 50 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación mayor de un 50 %.
Como también se divulga en este documento, el conector peptídico que puede unir dicho dominio potenciador a una parte de dicha entidad de TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1, NFS2, CFS1, RM2, BQY, QGPSG, LGPDGRKA, 1a8h_1, 1dnpA_1, 1d8cA_2, 1ckqA_3, 1sbp_1, 1ev7A_1, 1alo_3, 1amf_1, 1adjA_3, 1fcdC_1, 1al3_2, 1g3p_1, 1acc_3, 1ahjB_1, 1acc_1, 1af7_1, 1heiA_1, 1 bia_2, 1igtB_1, 1nfkA_1, 1au7A_1, 1bpoB_1, 1b0pA_2, 1c05A_2, 1gcb_1, 1bt3A_1, 1b3oB_2, 16vpA_6, 1dhx_1, 1b8aA_1 y 1qu6A_1 enumerados en la tabla 3 (de la SEQ ID NO: 67 a la SEQ ID NO: 104 y de la SEQ ID NO: 372 a la SEQ ID NO: 415). Como también se divulga en este documento, el conector peptídico que puede unir dicho dominio potenciador a una parte de dicha entidad de TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1(SEQ ID NO: 98), NFS2 (SEQ ID NO: 99) y CFS1 (SEQ ID NO: 100). También se describe el caso donde no se necesita un conector peptídico para fusionar un dominio potenciador a una parte de dicha entidad de TALEN compacta para obtener una TALEN compacta potenciada.
Dependiendo de su composición estructural [tipo de armazón de TALE central, tipo de domino o dominios catalíticos con actividades enzimáticas asociadas, tipo de potenciadores y finalmente tipo de conector o conectores], una TALEN compacta o una TALEN compacta potenciada puede comprender diferentes niveles de actividades enzimáticas diferentes que pueden procesar de forma diferente el ADN como se menciona anteriormente. Añadiendo nuevas actividades enzimáticas a dicha TALEN compacta o dicha TALEN compacta potenciada o potenciando la eficacia de procesamiento de ADN de una o varias de sus actividades enzimáticas constitutivas, se puede potenciar la eficacia de procesamiento de ADN global de una TALEN compacta o TALEN compacta potenciada en comparación con una TALEN compacta de partida o TALEN compacta potenciada.
Se diseñan TALEN compactas para aliviar la necesidad de múltiples restos proteínicos independientes cuando se aborda un evento de procesamiento de ADN. De forma importante, la región "espadadora" necesaria y los sitios diana dobles esenciales para la función de las TALEN actuales con innecesarios. Como cada extremo del armazón de TALE central es susceptible a fusión, el orden (en el extremo N frente al C) de adición de los dominios catalíticos y de potenciación puede variar con la aplicación. Además, como el dominio catalítico no requiere contactos de ADN específicos, no hay restricciones sobre las regiones que rodean el armazón de TALE central, como ejemplos no limitantes representados en la figura 5: (A) Construcción de fusión en el extremo N para promover la recombinación homóloga inducida por un dominio cleavasa o por un dominio nickasa. (B) Construcción de fusión en el extremo C con propiedades como en (A). (C) La adhesión de dos dominios catalíticos a ambos extremos del armazón de TALE central permite la escisión doble con potenciación en NHEJ. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación.
Las TALEN compactas pueden potenciarse mediante la adición de un dominio para promover actividades existentes o alternativas como ejemplos no limitantes representados en la figura 6: (A) Una TALEN compacta convencional con un dominio potenciador fusionado al extremo C de su parte de armazón de TALE central. (B) El dominio potenciador está fusionado a la TALEN compacta mediante el extremo N de su parte de dominio catalítico. Dicha configuración puede usarse para ayudar y/o anclar la parte de dominio catalítico cerca del ADN para aumentar la actividad de procesamiento de ADN. (C) El dominio potenciador se empareda entre la parte de dominio catalítico y la parte de armazón de TALE central. El dominio potenciador puede promover la comunicación entre los dominios flanqueantes (es decir, para ayudar en la catálisis y/o unión a ADN) o puede usarse para superar el nucleótido T necesario en la posición -1 de todas las dianas basadas en TALE. (D) El dominio potenciador se usa para remplazar funcionalmente la región del extremo N del armazón de TALE central genomanipulado. (E) El dominio potenciador se usa para remplazar funcionalmente la región del extremo C del armazón de TALE central genomanipulado. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación.
La naturaleza del dominio o dominios catalíticos comprendidos en la TALEN compacta y la TALEN compacta potenciada depende de la aplicación. Como un ejemplo no limitante, un dominio nickasa permitiría una relación de HR/NHEJ mayor que un dominio cleavasa, siendo de este modo más conveniente para aplicaciones terapéuticas (McConnell Smith, Takeuchi et al. 2009; Metzger, McConnell-Smith et al. 2011). Por ejemplo, el acoplamiento de un dominio cleavasa en un lado con un dominio nickasa en el otro podría provocar la escisión de una hebra simple de ADN que abarca la región de unión de una TALEN compacta. La generación dirigida de salientes monocatenarios prolongados podría aplicarse en aplicaciones que abordan mecanismos de reparación de ADN. Para inactivación génica dirigida, entonces se prefiere el uso de dos dominios cleavasa. Como también se divulga en este documento, puede favorecerse el uso de dos dominios nickasa. Además, se describe un método para generar varios tipos diferentes de TALEN compactas que pueden aplicarse a aplicaciones que varían desde escisión de ADN dirigida a regulación génica dirigida.
En otro aspecto, La presente invención describe una TALEN compacta, que comprende:
(i) Un armazón de TALE central que comprende diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión al ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés, en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN;
(ii) Al menos un dominio catalítico en el que dicho dominio catalítico puede procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés cuando se fusiona a dicho armazón de TALE central genomanipulado de (i);
(iii) Opcionalmente un conector peptídico para fusionar dicho dominio catalítico de (ii) a dicho armazón de TALE central genomanipulado de
(i) cuando se necesita;
de modo que dicha TALEN compacta no requiere dimerización para abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y procesar el a Dn cerca de dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés. En otras palabras, la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención es una unidad de entidad activa que puede abordar, por sí misma, únicamente una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés mediante un dominio de unión a ADN y de procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés.
La presente invención se refiere a un monómero de TALEN compacta, que comprende:
(i) Un armazón de TALE central que comprende regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) que tiene especificidad de unión a ADN en una secuencia diana de ADN bicatenario específica de interés;
(ii) Al menos un dominio catalítico en el que dicho dominio catalítico puede procesar ADN a unas pocas pares de bases de dicha secuencia diana de ADN bicatenario de interés cuando se fusiona al extremo C o N de dicho armazón de TALE central de (i);
(iii) Opcionalmente un conector peptídico para fusionar dicho dominio catalítico de (ii) con dicho armazón de TALE central genomanipulado de (i) cuando se necesita;
en el que dicho monómero de TALEN compacta se ensambla para unirse a dicha secuencia de ADN diana y procesar ADN bicatenario sin requerir dimerización.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado de TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender un dominio del extremo N adicional que produce un armazón de TALE central genomanipulado que comprende secuencialmente un dominio del extremo N y diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión a ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés, en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado de la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender un dominio del extremo C adicional que produce un armazón de TALE central genomanipulado que comprende secuencialmente diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión a ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y un dominio en el extremo C, en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado de la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender dominios en el extremo N y en el extremo C adicionales que producen un armazón de TALE central genomanipulado que comprende secuencialmente un dominio en el extremo N, diferentes conjuntos de regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) para cambiar la especificidad de unión a ADN y abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y un dominio en el extremo C, en que una selección de dominios catalíticos puede adherirse para lograr el procesamiento del ADN.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado de acuerdo con la presente invención puede comprender las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en ST1 (SEQ ID NO: 134) y ST2 (SEQ ID n O: 135). Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 134 y la SEQ ID NO: 135. Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE central genomanipulado de acuerdo con la presente invención puede comprender la secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en bT1-Avr (SEQ ID NO: 136), bT2-Avr (SEQ ID NO: 137), bT1 -Pth (SEQ ID NO: 138) y bT2-Pth (SEQ ID NO: 139). Como también se divulga en este documento, dicho armazón de TALE genomanipulado puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 136 a la SEQ ID NO: 139.
Como también se divulga en este documento, dichos dominios en el extremo N y el extremo C adicionales del armazón de TALE central genomanipulado pueden obtenerse preferiblemente de TALE natural. Como también se divulga en este documento, dichos dominios en el extremo N y el extremo C adicionales del armazón de TALE central genomanipulado pueden obtenerse más preferiblemente de TALE natural seleccionada del grupo que consiste en AvrBs3, PthXol, AvrHahl, PthA, Tallc como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, dichos dominios en el extremo N y/o dichos dominios en el extremo C pueden ser formas truncadas de dominios en el extremo N y/o el extremo C respectivos de TALE naturales como AvrBs3, PthXol, AvrHahl, PthA, Tallc como ejemplos no limitantes, de las que se obtienen. Como también se divulga en este documento, dichas secuencias de los dominios en el extremo N y el extremo C adicionales del armazón de TALE central genomanipulado pueden seleccionarse del grupo que consiste en ST1 SEQ ID NO: 134 y ST2 SEQ ID NO: 135 como se ejemplifica respectivamente en los armazones proteínicos basales bT1-Avr (SEQ ID NO: 136) o bT1-Pth (SEQ ID NO: 138) y bT2-Avr (SEQ ID NO: 137) o bT2-Pth (SEQ ID NO: 139).
Como también se divulga en este documento, cada RVD de dicho armazón central puede estar hecho de 30 a 42 aminoácidos, más preferiblemente 33 o 34, en el que dos aminoácidos críticos ubicados en las posiciones 12 y 13 median el reconocimiento de un nucleótido de dicha secuencia diana de ácido nucleico; dos aminoácidos críticos equivalentes pueden estar ubicados en las posiciones diferentes a 12 y 13 especialmente en RVD más grandes de 33 o 34 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, NK para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A e YG para reconocer T, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. Más preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimientos de los nucleótidos C, T, A, G/A y G respectivamente se seleccionan del grupo que consiste en NN o NK para reconocer G, HD para reconocer C, NG para reconocer T y NI para reconocer A, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. Como también se divulga en este documento, los RVD asociados con el reconocimiento del nucleótido C pueden seleccionarse del grupo que consiste en N* y los RVD asociados con el reconocimiento del nucleótido T se seleccionan del grupo que consiste en N* y H*, donde * indica una interrupción en la secuencia de repetición que corresponde a una ausencia de resto de aminoácido en la segunda posición del RVD. Como también se divulga en este documento, los aminoácidos críticos 12 y 13 pueden mutarse en otros restos de aminoácido para modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G y, en particular, para potenciar su especificidad. Por otros restos de aminoácido se entiende cualquiera de los veinte restos de aminoácido naturales o derivados de aminoácidos no naturales.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón central de la presente invención puede comprender entre 8 y 30 RVD. Más preferiblemente, dicho armazón central de la presente invención puede comprender entre 8 y 20 RVD; de nuevo más preferiblemente 15 RVD.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón central puede comprender un único RVD truncado adicional hecho de 20 aminoácidos ubicado en el extremo C de dicho conjunto de RVD, es decir, un semi-RVD en el extremo C adicional. En este caso, dicho armazón central comprende entre 8,5 y 30,5 RVD, refiriéndose ",5" al semi-RVD mencionado previamente (o RVD terminal, o semirrepetición). Más preferiblemente, dicho armazón central puede comprender entre 8,5 y 20,5 RVD, de nuevo más preferiblemente, 15,5 RVD. Como también se divulga en este documento, dicho semi-RVD puede estar en un contexto de armazón central que permite una ausencia de especificidad de dicho semi-RVD hacia los nucleótidos A, C, G, T. Como también se divulga en este documento, dicho semi-RVD puede estar ausente.
Como también se divulga en este documento, dicho armazón central puede comprender RVD de diferentes orígenes. Como también se divulga en este documento, dicho armazón central puede comprender RVD originados de diferentes efectores TAL de origen natural. Como también se divulga en este documento, la estructura interna de algunos RVD del armazón central puede estar constituida por estructuras o secuencias originadas de diferentes efectores TAL de origen natural. Como también se divulga en este documento, dicho armazón central puede comprender dominios de tipo RVD. Los dominios de tipo RVD tienen una secuencia diferente de los RVD de origen natural, pero tienen la misma función y/o estructura global dentro de dicho armazón central.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio en el extremo N adicional de dicho armazón de TALE central genomanipulado de dicha TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede ser un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en la proteína de unión a ARN Puf o la superfamilia de anquirina, como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, dicha secuencia de dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en dominios proteínicos de la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5 como ejemplos no limitantes enumerados en la tabla 1, un mutante funcional, una variante o un derivado de los mismos. Como también se divulga en este documento, dicho dominio en el extremo C adicional de dicho armazón de TALE central genomanipulado puede ser un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en hidrolasa/transferasa de la familia de Pseudomonas aeuriginosa, el dominio polimerasa de la familia de ligasa D de Mycobacterium tuberculosis, el factor de inicio elF2 de la familia de Pyrococcus, el factor de inicio de la traducción de la familia Aif2 como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, dicha secuencia de dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en dominios proteínicos de la SEQ ID NO: 6 la SEQ ID NO: 9 como ejemplos no limitantes enumerados en la tabla 1.
En otra realización preferida, el dominio catalítico que tiene capacidad de procesamiento de ADN cerca de la secuencia diana de ADN bicatenario única de interés, cuando se fusiona a dicha armazón de TALE central genomanipulado de acuerdo con la presente invención, se fusiona en la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central. En otra realización preferida, dicho dominio catalítico se fusiona en la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. Como también se divulga en este documento, pueden fusionarse dos dominios catalíticos tanto a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central como a la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede tener una actividad enzimática seleccionada del grupo que consiste en actividad nucleasa, actividad polimerasa, actividad cinasa, actividad fosfatasa, actividad metilasa, actividad topoisomerasa, actividad integrasa, actividad transposasa o actividad ligasa. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico fusionado al armazón de TALE central de la presente invención puede ser un activador o represor de la transcripción (es decir, un regulador de transcripción) o una proteína que interactúa con o modifica otras proteínas tales como histonas. Los ejemplos no limitantes de actividades de procesamiento del ADN de dicha TALEN compacta de la presente invención incluyen, por ejemplo, creación o modificación de elementos reguladores epigenéticos, generación de inserciones, eliminaciones o reparaciones específicas de sitio en el ADN, control de la expresión génica y modificación de la estructura de la cromatina.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede tener una actividad endonucleasa. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico de la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede tener actividad de escisión sobre dicho ADN bicatenario de acuerdo con método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede tener una actividad nickasa sobre dicho ADN bicatenario de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede seleccionarse del grupo que consiste en las proteínas Mmel, Colicina-E7 (CEA7_ECOLX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP11, I-BasI, I-BmoI, I-HmuI, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-TwoI, R.MspI, R.Mval, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_StAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.PleI, MlyI, AlwI, Mva1269I, BsrI, BsmI, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.BtsI, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu 10I subunidad alfa, Bpu10I subunidad beta, Bmrl, Bfil, I-CreI, hExoI (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), ExoI de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y las SEQ ID NO: 1, 366 y 367), un mutante funcional, una variante o un derivado de los mismos. El dominio catalítico de la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención es I-Tevl (SEQ ID NO: 20). En otra realización preferida, el dominio catalítico I-Tevl (SEQ ID NO: 20), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo se fusiona en el dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con la TALEN compacta de la presente invención. En otra realización preferida, dicha TALEN compacta de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 426-432.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico de la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede ser ColE7 (SEQ ID NO: 11), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico ColE7 (SEQ ID NO: 11), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico ColE7 (SEQ ID NO: 11), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo C de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 435-438.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico de la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede ser NucA (SEQ ID NO: 26), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico NucA (SEQ ID NO: 26), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico NucA (SEQ ID NO: 26), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo C de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 433-434.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede ser I-CreI (SEQ ID NO: 1), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico ICreí (SEQ ID NO: 1), un muíante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico I-Creí (SEQ ID NO: 1), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo puede fusionarse al dominio del extremo C de dicho armazón de TALE central de acuerdo con la presente invención. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 439-441 y la SEQ ID NO: 444-446.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede ser una enzima de restricción tal como Mmel, R-HinPII, R.MspI, R.MvaI, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I, ss.BspD6I, R.PleI, Mlyl y AlwI como ejemplos no limitantes enumerados en la tabla 2. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede tener una actividad exonucleasa. Como también se divulga en este documento, cualquier combinación de dos dominios catalíticos seleccionados del grupo que consiste en la proteínas Mmel, Colicina-E7 (CEA7_ECOLX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP1I, I-BasI, I-BmoI, I-HmuI, I-Tevl, I-TevII, I-TevIII, I-TwoI, R.MspI, R.MvaI, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_STAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.PleI, Mlyl, AlwI, Mva1269I, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.BtsI, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu10I subunidad alfa, Bpu10I subunidad beta, Bmrl, Bfil, I-CreI, hExol (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), Exol de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y las SEQ ID NO: 1, 366 y 367), un mutante funcional, una variante o un derivado de estos dominios proteínicos de los mismos, pueden fusionarse tanto a la parte del extremo N como la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central, respectivamente. Por ejemplo, el dominio catalítico I-Hmul puede fusionarse a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central y el dominio catalítico ColE7 puede fusionarse a la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. En otro ejemplo, el dominio catalítico I-Tevl puede fusionarse a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central y el dominio catalítico ColE7 puede fusionarse a la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central. La tabla 14 a continuación da ejemplos no limitantes de combinaciones de dominios catalíticos que pueden estar comprendidos en un monómero de TALEN compacto. Opcionalmente, Fokl (SEQ ID NO: 368) puede usarse en combinación con otro dominio catalítico de acuerdo con la lista de la tabla 2.
Tabla 14: Ejemplos de combinaciones de dominios catalíticos respectivamente fusionados a la parte de extremo N y rm z n nr l ^ TALEN m n l r TALEN i i n l .
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Como también se divulga en este documento, dicho monómero de TALEN compacta única puede comprender una combinación de dos dominios catalíticos, respectivamente fusionados a la parte del extremo N y a la parte del extremo C de dicho armazón de TALE central seleccionados del grupo que consiste en:
(i) un dominio Nuc A (SEQ ID NO: 26) en el extremo N y un domino Nuc A (SEQ ID NO: 26) en el extremo C; (ii) un dominio ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo N y un domino ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo C; (iii) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino ColE7 (Se Q ID NO: 11) en el extremo C; (iv) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino NucA (SEQ ID NO: 26) en el extremo C; (v) un dominio ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo N y un dominio NucA (SEQ ID NO: 26) en el extremo C; (vi) un dominio NucA (SEQ ID NO: 26) en el extremo N y un dominio ColE7 (SEQ ID NO: 11) en el extremo C.
Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 448 y 450.
Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender una combinación de dos dominios catalíticos, respectivamente fusionados a la parte del extremo C y a la parte del extremo N de dicho armazón de TALE central seleccionados del grupo que consiste en:
(i) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino Fokl (SEQ ID NO: 368) en el extremo C;
(ii) un dominio Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo N y un domino Tevl (SEQ ID NO: 20) en el extremo C;
(iii) un dominio scTrex2 (SEQ ID NO: 451) en el extremo N y un domino Fokl (SEQ ID NO: 368) en el extremo C. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 447-450 y la SEQ ID NO: 452.
Puede preverse la inserción de dicho dominio catalítico y/o dicho domino potenciador entre dos partes del armazón de TALE central genomanipulado, comprendiendo cada parte un conjunto de RVD. En este último caso, el número de RVD para cada parte del armazón de TALE central genomanipulado puede ser el mismo o no. En otras palabras, puede preverse dividir dicho armazón de TALE central para insertar un dominio catalítico y/o un dominio potenciador entre las dos partes resultantes de dicho armazón de TALE central genomanipulado. Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 453-455.
En otras palabras, se describe que el monómero de TALEN compacta comprende una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 420-450 y 452 -455.
En otra realización preferida de acuerdo con el método de la presente invención, el conector peptídico que puede unir dicho dominio catalítico al armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1, NFS2, CFS1, RM2, BQY, QGPSG, LGPDGRKA, 1a8h_1, 1dnpA_1, 1d8cA_2, 1ckqA_3, 1sbp_1, 1ev7A_1, 1alo_3, 1amf_1, 1adjA_3, 1fcdC_1, 1al3_2, 1g3p_1, 1acc_3, 1ahjB_1, 1acc_1, 1af7_1, 1heiA_1, 1bia_2, 1igtB_1, 1nfkA_1, 1au7A_1, 1bpoB_1, 1b0pA_2, 1c05A_2, 1gcb_1, 1bt3A_1, 1b3oB_2, 16vpA_6, 1dhx_1, 1b8aA_1 y 1qu6A_1, como se enumera en la tabla 3 (de la SEQ ID NO: 67 a la SEQ ID NO: 104 y de la SEQ ID NO: 372 a la SEQ ID NO: 415). Como también se divulga en este documento, el conector peptídico que puede unir dicho dominio catalítico al armazón de TALE central de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1 (SEQ ID NO: 98), NFS2 (SEQ ID NO: 99) y Cf S1 (SEQ ID NO: 100). También se describe el caso donde no se necesita un conector peptídico para fusionar un dominio catalítico al armazón de TALE para obtener una cTALEN.
Dependiendo de su composición estructural [tipo de armazón de TALE central, tipo de domino o dominios catalíticos con actividades enzimáticas asociadas y finalmente tipo de conector o conectores], una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender diferentes niveles de actividades enzimáticas diferentes que pueden procesar de forma diferente el ADN, produciendo una eficacia de procesamiento de ADN global para dicha TALEN compacta, teniendo cada una de dichas actividades enzimáticas diferentes su propia eficacia de procesamiento de ADN.
Como también se divulga en este documento, la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede comprender además:
(i) Al menos un dominio potenciador;
(ii) Opcionalmente un conector peptídico para fusionar dicho dominio potenciador con una parte de dicha entidad activa de TALEN compacta;
obteniendo de ese modo una entidad de TALEN compacta con eficacia de procesamiento de ADN potenciada cerca de una secuencia diana de ADN bicatenario única de interés, es decir, una TALEN compacta potenciada.
En otras palabras, dicho monómero de TALEN compacta única puede comprender además:
(i) Al menos un dominio potenciador;
(ii) Opcionalmente un conector peptídico para fusionar dicho dominio potenciador con una parte de dicha entidad activa de monómero de TALEN compacta única.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse al extremo N de la parte de armazón de TALE central de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse al extremo C de la parte de armazón de TALE central de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse a la parte de dominio catalítico de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse entre la parte de extremo N del armazón de TALE central y la parte catalítica de dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede fusionarse entre la parte de extremo C del armazón de TALE central y la parte catalítica de dicha entidad de TALEN compacta. Puede preverse la inserción de dicho dominio catalítico y/o domino potenciador entre dos partes del armazón de TALE central genomanipulado, comprendiendo cada parte un conjunto de RVD. En este último caso, el número de RVD para cada armazón de TALE central genomanipulado puede ser el mismo o no. En otras palabras, puede preverse dividir dicho armazón de TALE central para insertar un dominio catalítico y/o un dominio potenciador entre las dos partes resultantes de dicho armazón de TALE central genomanipulado.
Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede ser catalíticamente activo o no, proporcionando soporte funcional y/o estructural a dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede consistir en un dominio proteínico seleccionado de grupo que consiste en Mmel, Colicina-E7 (CeA7_ECOlX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP11, I-BasI, I-BmoI, I-HmuI, I-TevI, I-TevII, I-Tevlll, I-TwoI, R.MspI, R.MvaI, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_STAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.PleI, Mlyl, Alwl, Mva1269I, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.BtsI, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu 10I subunidad alfa, Bpu10I subunidad beta, Bmrl, Bfil, I-CreI, hExol (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), Exol de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y las SEQ ID NO: 1,366 y 367), un mutante funcional, una variante o un derivado de estos dominios proteínicos de los mismos. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente activo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte funcional y/o estructural a dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente inactivo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte estructural a dicha entidad de TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, dicho dominio potenciador puede seleccionarse del grupo que consiste en I-Tevl (SEQ ID NO: 20), ColE7 (SEQ ID NO: 11) y NucA (SEQ ID NO: 26).
Como también se divulga en este documento, dicha TALEN compacta puede comprender un segundo dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede tener las mismas característica que el primer dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede proporcionar soporte estructural a la entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede proporcionar soporte funcional a la entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede proporcionar soporte estructural y funcional a la entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender un dominio catalítico y un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender un dominio catalítico y dos dominios potenciadores. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender dos dominios catalíticos y un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicha entidad de TALEN compacta potenciada puede comprender dos dominios catalíticos y dos dominios potenciadores.
Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede consistir en un dominio proteínico derivado de una proteína seleccionada del grupo que consiste en Mmel, Colicina-E7 (CEA7_ECOLX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_ECOLI), Endo G humana (NUCG_HUMANA), Endo G bovina (NUCG_BOVINA), R.HinP1I, I-BasI, I-BmoI, I-HmuI, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-TwoI, R.MspI, R.Mval, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), nucleasa de estafilococos (NUC_STAHY), nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN_BPT7), metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I (R.BspD6I subunidad grande), ss.BspD6I (R.BspD6I subunidad pequeña), R.Plel, Mlyl, Alwl, Mva1269I, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1. Bts I, R2.BtsI, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, Bpu10I subunidad alfa, Bpu10I subunidad beta, Bmrl, Bfil, I-Crel, hExol (EXO1_HUMANA), Exol de levadura (EXO1_LEVADURA), Exol de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de ratón, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana, DNA2 de levadura (DNA2_LEVADURA) y VP16, como se enumera en la tabla 2 (de la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 66 y las SEQ ID NO: 1, 366 y 367), un mutante funcional, una variante o un derivado de estos dominios proteínicos de los mismos. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente activo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte funcional y/o estructural a dicha entidad de TALEN compacta potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho segundo dominio potenciador puede consistir en un derivado catalíticamente inactivo de los dominios proteínicos enumerados anteriormente y en la tabla 2, proporcionando soporte estructural a dicha entidad de TALEN compacta potenciada.
Como también se divulga en este documento, cualquier combinación de dominios catalíticos y/o potenciadores enumerados anteriormente, como ejemplos no limitantes, puede preverse para fusionarse a dicho armazón de TALE central proporcionando soporte estructural y/o funcional a dicha entidad de TALEN compacta. Más preferiblemente, combinaciones de dominios catalíticos enumeradas en la tabla 14. De nuevo más preferiblemente, pueden preverse combinaciones de dominios catalíticos seleccionados del grupo de Tevl (SEQ ID NO: 20), ColE7 (SEQ ID NO: 11) y NucA (SEQ ID NO: 26). Opcionalmente, Fokl (SEQ ID NO: 368) puede usarse en combinación con otro dominio catalítico de acuerdo con la lista de la tabla 2. Dichas combinaciones de dominios catalíticos y/o potenciadores puede preverse respecto a las aplicaciones prevista para usar el método de la presente invención. Dependiendo de su composición estructural [tipo de armazón de TALE central, tipo de domino o dominios catalíticos con actividades enzimáticas asociadas, tipo de conector o conectores y tipo de dominio o dominios potenciadores], una TALEN compacta potenciada puede presentar diferentes niveles de actividades enzimáticas diferentes capaces de procesar ADN de forma diferente, produciendo una eficacia de procesamiento de ADN global para dicha TALEN compacta potenciada, teniendo cada una de dichas actividades enzimáticas diferentes su propia eficacia de procesamiento de ADN.
Como también se divulga en este documento, la eficacia de procesamiento de ADN de la entidad de TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede potenciarse genomanipulando al menos un dominio potenciador y un conector peptídico, obteniendo de ese modo una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada cerca de una secuencia diana de ADN bicatenario única de interés, es decir, una TALEN compacta potenciada.
Dependiendo de su composición estructural, la eficacia de procesamiento de ADN global que está potenciada en dicha TALEN compacta, potenciada, puede tener una actividad enzimática dominante seleccionada del grupo que cosiste en una actividad nucleasa, una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, la eficacia de procesamiento de ADN global que está potenciada en dicha TALEN compacta potenciada puede ser una combinación de diferentes actividades enzimáticas seleccionadas del grupo que consiste en una actividad nucleasa, una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. Como también se divulga en este documento, la eficacia de procesamiento de ADN global que está potenciada en dicha TALEN compacta potenciada puede ser una de sus diferentes actividades enzimáticas seleccionadas del grupo que consiste en una actividad nucleasa, una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. En este caso, la eficacia de procesamiento de ADN global es equivalente a una actividad de procesamiento de ADN entre las actividades enzimáticas mencionadas anteriormente. Como también se divulga en este documento, dicha actividad de procesamiento de ADN de la entidad de TALEN compacta que está potenciada por el potenciador puede ser una actividad cleavasa o una actividad nickasa o una combinación tanto de una actividad cleavasa como de una actividad nickasa.
La potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una entidad de TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede ser una consecuencia de un soporte estructural por dicho al menos un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho soporte estructural puede potenciar la unión de una entidad de TALEN compacta de acuerdo con la invención por dicha secuencia diana de ADN en comparación con la unión de una entidad de TALEN compacta de partida por la misma secuencia diana de ADN, ayudando indirectamente de este modo a que el dominio o los dominios catalíticos obtengan una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada. Como también se divulga en este documento, dicho soporte estructural puede potenciar la actividad catalítica existente de una entidad de TALEN compacta por una secuencia diana de a Dn en comparación con la unión de una entidad de TALEN compacta de partida por la misma secuencia diana de ADN para obtener una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada.
Como también se divulga en este documento, dicho potenciador puede potenciar tanto la unión de la entidad de TALEN compacta por dicha secuencia diana de ADN como la actividad catalítica del dominio o dominios catalíticos para obtener una entidad de TALEN compacta con actividad de procesamiento de ADN potenciada. Todos estos ejemplos no limitantes dan lugar a una entidad de TALEN compacta con eficacia de procesamiento de ADN potenciada por una secuencia diana de ADN en un locus genómico de interés, es decir, una TALEN compacta potenciada.
La potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una entidad de TALEN compacta de acuerdo con la presente invención, en comparación con una entidad de TALEN compacta de partida, también puede ser una consecuencia de un soporte funcional por dicho al menos un dominio potenciador. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la consecuencia de la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una nucleasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una endonucleasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una cleavasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una nickasa. Como también se divulga en este documento, dicho soporte funcional puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales por un dominio proteínico derivado de una exonucleasa.
En experimentos de manipulación de genoma, la eficacia de endonucleasa de corte infrecuente, por ejemplo, su capacidad de inducir un evento deseado (dirección a gen homólogo, mutagénesis dirigida, eliminación o escisión de secuencia) en un locus, depende de varios parámetros, incluyendo la actividad específica de la nucleasa, probablemente la accesibilidad de la diana y la eficacia y resultado de la ruta o rutas de reparación que provocan el evento deseado (reparación homóloga para dirección génica, rutas de NHEJ para mutagénesis dirigida).
La escisión por endonucleasas de corte infrecuente peptídico habitualmente genera extremos cohesivos, con salientes 3' para meganucleasas LAGLIDADG (Chevalier y Stoddard 2001) y salientes 5' para nucleasas de dedos de cinc (Smith, Bibikova et al. 2000). Estos extremos, que son el resultado de la hidrólisis de enlaces fosfodiéster, pueden volver a ligarse in vivo por NHEJ de una manera sin empalmes (es decir, un religamiento sin marcas). La restauración de una secuencia diana escindible permite un nuevo evento de escisión por la misma endonucleasa y, por tanto, puede tener lugar una serie de ciclos infructuosos de eventos de escisión y religamiento. Las evidencias indirectas han demostrado que incluso en la levadura Saccharomyces cerevisiae, dichos ciclos podrían tener lugar tras la escisión continua por la endonucleasa HO (Lee, Paques et al. 1999). En células de mamífero, varios experimentos han demostrado que un perfecto religamiento de extremos cohesivos compatibles resultantes de dos DSB inducidos por I-Scel independientes, pero cercanos es un proceso eficaz (Guirouilh-Barbat, Huck et al. 2004; Guirouilh-Barbat, Rass et al. 2007; Bennardo, Cheng et al. 2008; Bennardo, Gunn et al. 2009). La ausencia de la proteína de reparación de ADN Ku no afecta significativamente a la frecuencia global de eventos de NHEJ que vuelve a unir los extremos de las dos DSB; sin embargo, potencia muy fuertemente la contribución de NHEJ imprecisa al proceso de reparación en células inmortalizadas CDO y células ES de ratón (Guirouilh-Barbat, Huck et al. 2004; Guirouilh-Barbat, Rass et al.
2007; Bennardo, Cheng et al. 2008). Además, la ausencia de Ku estimula los eventos inducidos por I-Scel tales como NHEJ imprecisa (Bennardo, Cheng et al. 2008), hibridación monocatenaria (Bennardo, Cheng et al. 2008) y conversión génica (Pierce, Hu et al. 2001; Bennardo, Cheng et al. 2008) en células ES de ratón. Se han hecho observaciones similares con células deficientes para la proteína de reparación XRCC4 (Pierce, Hu et al. 2001; Guirouilh-Barbat, Rass et al. 2007; Bennardo, Gunn et al. 2009) (aunque la deficiencia de XRCC4 afecta al nivel global de NHEJ en células CHO (Guirouilh-Barbat, Rass et al. 2007)) o para DNA-PK (Pierce, Hu et al. 2001). Por el contrario, la atenuación de CtIP ha demostrado suprimir "alt-NHEJ" (una forma independiente de Ku y XRCC4 de NHEJ más propensa a producir NHEJ imprecisa), hibridación monocatenaria y conversión génica, mientras que no afecta al nivel global de reunión de dos extremos compatibles generados por I-Scel (Bennardo, Cheng et al. 2008). Por tanto, la competición entre las diferentes rutas de reparación DSB puede afectar al espectro o los eventos de reparación resultantes de una DSB inducida por nucleasa.
Además, la resección de DSB es importante para determinadas rutas de DSB. La resección de DSB extensiva, que produce la generación de regiones monocatenarias grandes (unos pocos cientos de nucleótidos al menos), se ha demostrado en levaduras que inicia la hibridación monocatenaria (Sugawara y Haber 1992) y la invasión de hebra, la etapa dependiente de ATP que inicia muchos eventos de recombinación homólogos de invasión de dúplex de ADN por una hebra homóloga a esa (White y Haber 1990; Sun, Treco et al. 1991) (para una revisión de los mecanismos, véase (Paques y Haber 1999)). En células eucariotas, la resección de DSB depende de varias proteínas incluyendo BLM/Sgs1 y DNA2, EXOI y el complejo MRN (Mre11, Rad50, Nbs1/Xrs2) y se cree que es el resultado de diferentes rutas. MRN está implicado en un proceso de resección a pequeña escala, mientras que dos rutas redundantes dependientes de BLM y DNA2 por un lado, y de EXOI por otro lado, estarían implicadas en la resección extensiva (Mimitou y Symington 2008; Nimonkar, Genschel et al. 2011). Además, el procesamiento de los extremos que implica un nucleótido dañado (resultante de la escisión química o de un aducto voluminoso), requiere la proteína CtIP/Sae2 junto con RMN (Sartori, Lukas et al. 2007; Buis, Wu et al. 2008; Hartsuiker, Mizuno et al. 2009). La sobreexpresión de la exonucleasa Trex2 demostró estimular fuertemente NHEJ imperfecta asociada con la pérdida de únicamente unas pocas pares de bases (Bennardo, Gunn et al. 2009), aunque inhibía diversos tipos de eventos de reparación de ADN entre secuencias distantes (tal como hibridación monocatenaria, NHEJ entre extremos de diferentes roturas o reparación por NHEJ de una DSB individual que implica microhomologías remotas). En el mismo estudio, se sugirió que Trex2 resecaba los salientes 3' dejados por I-Scel de una manera no procesiva. Por tanto, el tipo de ruta estimulada podría depender, a su vez, del tipo de resección (longitud de resección, monocatenario frente a bicatenario, resección de hebra 5' frente a hebra 3').
Por tanto, la eficacia de una TALEN compacta, por ejemplo, su capacidad de producir un evento deseado tal como mutagénesis dirigida o dirección a gen homólogo (véase la definición para la definición completa de "eficacia de TALEN compacta"), puede potenciarse mediante una potenciación o modificación de su eficacia de procesamiento de ADN global (véase la definición para la definición completa de "eficacia de procesamiento de ADN global"), por ejemplo, el resultante global o el resultado general de diferentes actividades enzimáticas separadas de dicha TALEN compacta.
Como también se divulga en este documento, la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN global de una entidad de TALEN compacta de acuerdo con la presente invención, en comparación con una entidad de TALEN compacta de partida, puede ser la hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales en el sitio de escisión.
Dicha hidrólisis de enlaces fosfodiéster adicionales en el sitio de escisión por dicho al menos un potenciador de acuerdo con la invención puede dar lugar a diferentes tipos de resección de DSB que afecta a dicho sitio de escisión de DSB, una única hebra de ADN o ambas hebra de ADN, que afecta a cualquier extremo saliente 5', cualquier extremo saliente 3' o ambos extremos y dependiendo de la longitud de dicha resección. Por tanto, añadir nuevas actividades nickasa o cleavasa a la actividad cleavasa existente de una entidad de TALEN compacta puede potenciar la eficacia de la TALEN compacta potenciada resultante, en un locus genómico de interés (figura 8B-8E). Como un ejemplo no limitante, la adición de dos actividades nickasa en hebras opuestas (figura 8D) o de una nueva actividad cleavasa que genera una segunda DSB (figura 8E) puede provocar una interrupción bicatenaria. Como consecuencia, el religamiento perfecto ya no es posible, y puede estimularse uno o varios resultados de reparación alternativos tales como NHEJ imprecisa, recombinación homóloga o SSA por ejemplo. Como otro ejemplo no limitante, la adición de una única actividad nickasa puede provocar una interrupción monocatenaria, y suprimir la cohesividad de los extremos, que también puede potenciar la eficacia de la TALEN compacta potenciada resultante en un locus genómico de interés, mediante estimulación de uno o varios resultados de reparación alternativos mencionados anteriormente.
En este aspecto descrito de la presente invención, la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una TALEN compacta se refiere al aumento en el nivel detectado de dicha eficacia de procesamiento de ADN, frente a una secuencia de ADN diana, de una TALEN compacta en comparación con la actividad de una primera TALEN compacta frente a la misma secuencia de ADN diana. Dicha primera TALEN compacta puede ser una TALEN compacta de partida o una TALEN compacta que ya se ha genomanipulado o una TALEN compacta potenciada. Puede preverse varias rondas de potenciación a partir de una TALEN compacta de partida o a partir de una TALEN compacta potenciada de partida.
En este aspecto descrito de la presente invención, la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de la entidad de TALEN compacta (o TALEN compacta potenciada) se refiere al aumento en el nivel detectado de dicha eficacia de procesamiento de ADN frente a una secuencia de ADN diana de interés o cerca de dicha secuencia de ADN de interés en comparación con la eficacia de una primera TALEN compacta o TALEN compacta de partida frente a o cerca de la misma secuencia de ADN diana. En este caso, la TALEN compacta de partida se toma como el armazón de referencia para medir la eficacia de procesamiento de ADN. Dicha TALEN compacta potenciada es una TALEN compacta genomanipulada que comprende un dominio potenciador. Dicha TALEN compacta potenciada también puede tomarse como armazón de referencia para potenciación adicional en dicha eficacia de procesamiento de ADN. Como un ejemplo no limitante, dicha eficacia de procesamiento de ADN puede producirse a partir de una recombinación inducida por escisión generada por dicha TALEN compacta potenciada. En este caso, dicho nivel de recombinación inducida por escisión puede determinarse, por ejemplo, por un ensayo de recombinación basado en células como se describe en la solicitud PCT internacional WO 2004/067736. De forma importante, la potenciación de la eficacia en células (generación potenciada de mutagénesis dirigida o recombinación dirigida) puede estar asociada, aunque no necesariamente, con una potenciación de la actividad de escisión que podría detectarse en determinados ensayos in vitro. Por ejemplo, actividades fosfodiesterasa adicionales como se describe en la figura 8 podrían afectar escasamente al perfil de escisión, que se detecta por escisión in vitro y separación de los productos de escisión en un gel de electroforesis. Sin embargo, como se explica anteriormente, y en leyenda de la figura 8, los extremos de DSB generados de esta manera podrían ser más propensos para inducir reordenamientos genómicos detectables tales como mutagénesis dirigida (por NHEJ imprecisa) o recombinación homóloga. Dicha potenciación en la recombinación inducida por escisión de dicha TALEN compacta potenciada es una potenciación de al menos un 5 % en comparación con el armazón de partida o TALEN compacta de partida, más preferiblemente una potenciación de al menos un 10 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 15 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 20 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 25 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de un 50 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación mayor de un 50 %, que provoca una potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de dicha TALEN compacta potenciada de al menos un 5 % en comparación con el armazón de partida o TALEN compacta de partida, más preferiblemente una potenciación de al menos un 10 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 15 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 20 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de al menos un 25 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación de un 50 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación mayor de un 50 %.
En otra realización preferida de acuerdo con el método de la presente invención, el conector peptídico que puede unir dicho dominio potenciador a una parte de dicha entidad de TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1, NFS2, CFS1, RM2, BQY, QGPSG, LGPDGRKA, 1a8h_1, 1dnpA_1, 1d8cA_2, 1ckqA_3, 1sbp_1, 1ev7A_1, 1alo_3, 1amf_1, 1adjA_3, 1fcdC_1, 1al3_2, 1g3p_1, 1acc_3, lahjB_1, 1 acc_1, 1af7_1, 1heiA_1, 1bia_2, 1igtB_1, 1nfkA_1, 1au7A_1, 1bpoB_1, 1b0pA_2, 1c05A_2, 1gcb_1, 1bt3A_1, 1b3oB_2, 16vpA_6, 1dhx_1, 1b8aA_1 y 1qu6A_1 como se enumera en la tabla 3 (de la SEQ ID NO: 67 a la SEQ ID NO: 104 y de la SEQ ID NO: 372 a la Se Q ID NO: 415). Como también se divulga en este documento, el conector peptídico que puede unir dicho dominio potenciador a una parte de dicha entidad de TALEN compacta de acuerdo con el método de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en NFS1(SEQ ID NO: 98), NFS2 (SEQ ID NO: 99) y CFS1 (SEQ ID NO: 100). También se describe el caso donde no se necesita un conector peptídico para fusionar un dominio potenciador a una parte de dicha entidad de TALEN compacta para obtener una TALEN compacta potenciada.
Dependiendo de su composición estructural [tipo de armazón de TALE central, tipo de domino o dominios catalíticos con actividades enzimáticas asociadas, tipo de potenciadores y finalmente tipo de conector o conectores], una TALEN compacta o una TALEN compacta potenciada puede comprender diferentes niveles de actividades enzimáticas diferentes que pueden procesar de forma diferente el ADN como se menciona anteriormente. Añadiendo nuevas actividades enzimáticas a dicha TALEN compacta o TALEN compacta potenciada o potenciando la eficacia de procesamiento de ADN de una o varias de sus actividades enzimáticas constitutivas, se puede potenciar la eficacia de procesamiento de ADN global de una TALEN compacta o TALEN compacta potenciada en comparación con una TALEN compacta de partida o TALEN compacta potenciada.
De acuerdo con la presente invención, se diseñan TALEN compactas para aliviar la necesidad de múltiples restos proteínicos independientes cuando se aborda un evento de procesamiento de ADN. De forma importante, la región "espaciadora" necesaria y los sitios diana dobles esenciales para la función de las TALEN actuales con innecesarios, ya que las TALEN compactas de acuerdo con la invención comprenden un armazón de TALE central que contiene únicamente un dominio de unión a ADN para abordar una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés y procesar el ADN cerca de dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés. Como cada extremo del armazón de TALE central es susceptible a fusión, el orden (en el extremo N frente al C) de adición de los dominios catalíticos y de potenciación puede variar con la aplicación. Además, como el dominio catalítico no requiere contactos de ADN específicos, no hay restricciones sobre las regiones que rodean el armazón de TALE central, como ejemplos no limitantes representados en la figura 5: (A) Construcción de fusión en el extremo N para promover la recombinación homóloga inducida por un dominio cleavasa o por un dominio nickasa. (B) Construcción de fusión en el extremo C con propiedades como en (A). (C) La adhesión de dos dominios catalíticos a ambos extremos del armazón de TALE central permite la escisión doble con potenciación en NHEJ. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación.
Las TALEN compactas pueden potenciarse mediante la adición de un dominio para promover actividades existentes o alternativas como ejemplos no limitantes representados en la figura 6: (A) Una TALEN compacta convencional con un dominio potenciador fusionado al extremo C de su parte de armazón de TALE central. (B) El dominio potenciador está fusionado a la TALEN compacta mediante el extremo N de su parte de dominio catalítico. Dicha configuración puede usarse para ayudar y/o anclar la parte de dominio catalítico cerca del ADN para aumentar la actividad de procesamiento de ADN. (C) El dominio potenciador se empareda entre la parte de dominio catalítico y la parte de armazón de TALE central. El dominio potenciador puede promover la comunicación entre los dominios flanqueantes (es decir, para ayudar en la catálisis y/o unión a ADN) o puede usarse para superar el nucleótido T necesario en la posición -1 de todas las dianas basadas en TALE. (D) El dominio potenciador se usa para remplazar funcionalmente la región del extremo N del armazón de TALE central genomanipulado. (E) El dominio potenciador se usa para remplazar funcionalmente la región del extremo C del armazón de TALE central genomanipulado. Las uniones de fusión (en el extremo N frente al C) y los diseños de conector pueden variar con la aplicación.
La naturaleza del dominio o dominios catalíticos comprendidos en la TALEN compacta y la TALEN compacta potenciada depende de la aplicación. Como un ejemplo no limitante, un dominio nickasa permitiría una relación de HR/NHEJ mayor que un dominio cleavasa, siendo de este modo más conveniente para aplicaciones terapéuticas (McConnell Smith, Takeuchi et al. 2009; Metzger, McConnell-Smith et al. 2011). Por ejemplo, el acoplamiento de un dominio cleavasa en un lado con un dominio nickasa en el otro podría provocar la escisión de una hebra simple de ADN que abarca la región de unión de una TALEN compacta. La generación dirigida de salientes monocatenarios prolongados podría aplicarse en aplicaciones que abordan mecanismos de reparación de ADN. Para inactivación génica dirigida, entonces se prefiere el uso de dos dominios cleavasa. Como también se divulga en este documento, puede favorecerse el uso de dos dominios nickasa. Además, se describe un método para generar varios tipos diferentes de TALEN compactas que pueden aplicarse a aplicaciones que varían desde escisión de ADN dirigida a regulación génica dirigida.
La presente invención también describe métodos para el uso de dichas TALEN compactas de acuerdo con la invención para diversas aplicaciones que varían desde la escisión de ADN diana hasta la regulación génica diana. También se describe en este documento un método para aumentar HR dirigida (y NHEJ) cuando se promueve la actividad de rotura bicatenaria en una TALEN compacta dirigida a una secuencia diana de ADN de acuerdo con la invención. Como también se divulga en este documento, la adición de al menos dos dominios potenciadores cleavasa catalíticamente activos puede permitir el aumento de la mutagénesis inducida por rotura bicatenaria dando lugar a una pérdida de información genética y evitando cualquier religamiento sin marcas de locus genómico dirigida de interés por NHEJ. También se describe en este documento un método para aumentar HR dirigida con menos NHEJ (es decir, de un modo más conservativo) cuando se promueve actividad de rotura monocatenaria en una TALEN compacta dirigida a una secuencia diana de ADN de acuerdo con la invención.
También se describe en este documento un método para aumentar la escisión de una hebra individual de ADN que abarca la región de unión de una TALEN compacta cuando tanto un dominio potenciador cleavasa como un dominio potenciador nickasa, respectivamente, se fusionan tanto al extremo N como al extremo C de un armazón de TALE central.
También se describe en este documento un método para el tratamiento de una enfermedad genética causada por una mutación en una secuencia diana de ADN bicatenario única específica en un gen, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una variante de una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método para insertar un transgén en una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de un locus genómico de una célula, tejido o animal no humano, o una planta en la que al menos una TALEN compacta de la presente invención es transitoria o no se introduce en dicha célula, tejido, animal no humano o planta.
La presente invención también describe un método para modular la actividad de una TALEN compacta cuando se expresa en una célula, en el que dicho método comprende la etapa de introducir en dicha célula un dominio auxiliar que modula la actividad de dicha TALEN compacta. La presente invención también describe un método que permite tener un control temporal de la actividad de una TALEN compacta cuando se expresa en un célula introduciendo en dicha célula un dominio auxiliar que modula la actividad de dicha TALEN compacta una vez que dicha TALEN compacta ha conseguido su actividad (escisión de ADN, mellado de ADN u otras actividades de procesamiento de ADN). La presente invención también describe un método para inhibir la actividad de una TALEN compacta cuando se expresa en una célula, en el que dicho método comprende la etapa de introducir en dicha célula un dominio auxiliar que inhibe la actividad de dicha TALEN compacta. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico de la TALEN compacta puede ser NucA (SEQ ID NO: 26) y dicho dominio auxiliar es NuiA (SEQ ID NO: 229), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo. Como también se divulga en este documento, el dominio catalítico de dicha TALEN compacta es ColE7 (SEQ ID NO: 11) y dicho dominio auxiliar puede ser Im7 (SEQ ID NO: 230), un mutante funcional, una variante o un derivado del mismo.
También se abarca en el alcance de la presente invención un polinucleótido recombinante que codifica una TALEN compacta, de acuerdo con la presente invención. También se abarca en el alcance de la presente invención, un vector que comprende un polinucleótido recombinante que codifica una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención.
También se abarca en el alcance de la presente invención, un célula hospedadora que comprende un polinucleótido recombinante que codifica una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención.
También se abarca en el alcance de la presente invención, un animal transgénico no humano que comprende un polinucleótido recombinante que codifica una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención.
También se abarca en el alcance de la presente invención, una planta transgénica que comprende un polinucleótido recombinante que codifica una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención.
La presente invención también se refiere a kits usados para implementar el método de acuerdo con la presente invención. Más preferiblemente, se abarca en el alcance de la presente invención, un kit que comprende una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención e instrucciones para usar dicho kit en la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una secuencia diana de ADN bicatenario única de interés.
Para fines de tratamiento, las TALEN compactas de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que tal combinación se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia provoca un cambio detectable en la fisiología del destinatario. En el presente contexto, un agente es fisiológicamente significativo si su presencia provoca una disminución en la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad diana y una corrección del genoma de la lesión o anomalía. Los vectores que comprenden ADN y/o ácido nucleico de dirección que codifica una TALEN compacta pueden introducirse en una célula mediante una diversidad de métodos (por ejemplo, inyección, captación directa, bombardeo con proyectiles, liposomas, electroporación). Las TALEN compactas puede expresarse de forma estable o transitoria en células usando vectores de expresión. Las técnicas de expresión en células eucariotas son bien conocidas para los expertos en la técnica. (Véase Current Protocols in Human Genetics: Capítulo 12 "Vectors For Gene Therapy" y Capítulo 13 "Delivery Systems for Gene Therapy").
En un aspecto descrito adicional de la presente invención, la TALEN compacta de la presente invención es sustancialmente no inmunógena, es decir, genera poca o ninguna respuesta inmunológica adversa. Puede usarse una diversidad de métodos para mejorar o eliminar las reacciones inmunológicas perjudiciales de este tipo de acuerdo con la invención. Como también se divulga en este documento, la TALEN compacta puede estar sustancialmente libre de N-formilmetionina. Otra manera para evitar las reacciones inmunológicas indeseadas es conjugar la TALEN compacta con polietilenglicol ("PEG") o polipropilenglicol ("PPG") (preferiblemente de 500 a 20 000 Dalton de peso molecular promedio (PM). La conjugación con PEG o PPG, como se describe por Davis et al. (documento US 4179337) por ejemplo, puede proporcionar conjugados de TALEN compactas solubles en agua, fisiológicamente activos, no inmunógenos con actividad antivírica. Se describen métodos similares que también usan un copolímero de polietilenopolipropilenglicol en Saifer et al. (documento US 5006333).
En otro aspecto de la presente invención, es una composición que comprende una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención y un vehículo. Más preferiblemente, es una composición farmacéutica que comprende una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención y un vehículo farmacéuticamente activo conocido en el estado de la técnica.
En el alcance de la presente invención y para todas las aplicaciones mencionadas anteriormente, puede preverse el uso de más de una TALEN compacta (es decir, una entidad activa de TALEN compacta) (es decir, una entidad activa de TALEN compacta potenciada) para procesar ADN de acuerdo con la invención. Como también se divulga en este documento, pueden usarse dos TALEN compactas diferentes. Como también se divulga en este documento, como ejemplos no limitantes, dichas dos TALEN compactas diferentes pueden comprender el mismo armazón de TALE central o no; dichas dos TALEN compactas diferentes pueden comprender el mismo conjunto de dipéptidos variables de repetición o no; dichas dos TALEN compactas diferentes pueden comprender el mismo dominio catalítico o no. Cuando se usan dos entidades activas de TALEN compacta idénticas para el procesamiento de ADN de acuerdo con la invención, pueden considerarse un par homodimérico de entidades activas de TALEN compacta. Cuando se usan dos entidades activas de TALEN compacta no idénticas para el procesamiento de ADN de acuerdo con la invención, pueden considerarse un par heterodimérico de entidades activas de TALEN compacta. Como ejemplo no limitante, cuando se usan dos TALEN compactas de acuerdo la presente invención, una de las TALEN compactas pueden modular la actividad de la otra, dando lugar, por ejemplo, a un evento de procesamiento de ADN potenciado en comparación con el mismo evento de procesamiento de ADN conseguido por únicamente una TALEN compacta; en este ejemplo no limitante, una Trans-TALEN modula y potencia la actividad catalítica de una TALEN compacta inicial. Como también se divulga en este documento, pueden usarse tres TALEN compacta o tres TALEN compactas potenciadas. Como también se divulga en este documento, puede usarse más de tres TALEN compactas o tres TALEN compactas potenciadas para el procesamiento de ADN de acuerdo con la invención. Como también se divulga en este documento, puede usarse una combinación de TALEN compactas y TALEN compactas potenciadas para el procesamiento de ADN de acuerdo con la invención. Como un ejemplo no limitante, puede usarse una TALEN compacta y una TALEN compacta potenciada. Como otro ejemplo no limitante, puede usarse una TALEN compacta y una TALEN compacta de escisión doble. Como también se divulga en este documento, puede usarse una combinación de TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas y TALEN compactas de escisión doble, comprendiendo dichas TALEN compactas el mismo dominio catalítico o no, el mismo armazón de TALE central o no. Cuando tienen que usarse varias TALEN compactas, la secuencia diana de ADN para cada TALEN compacta de la combinación a usar puede estar ubicada en el mismo locus de ADN genómico endógeno de interés o no. Dichas secuencias diana de ADN puede estar ubicadas a una distancia aproximada de 1000 pares de bases (pb). Más preferiblemente, dichas secuencias diana de ADN pueden estar ubicadas a una distancia aproximada de 500 pb o 200 pb, o 100 pb o 50 pb o 20 pb, 19 pb, 18 pb, 17 pb, 16 pb, 15 pb, 14 pb, 13 pb, 12 pb, 11 pb, 10 pb, 9 pb, 8 pb, 7 pb, 6 pb, 5 pb, 4 pb, 3 pb, 2 pb, 1 pb. Dichas secuencias diana de ADN ubicadas a distancias mencionadas anteriormente son secuencias de a Dn "cercanas" en referencia a la secuencia de ADN diana para el procesamiento de ADN de acuerdo con la presente invención.
Como también se divulga en este documento, dos entidades activas de TALEN compacta pueden usarse como una manera de conseguir dos actividades de procesamiento de ADN diferentes cerca de una secuencia diana de ADN de acuerdo con la invención. Como un ejemplo no limitante, pueden usarse dos TALEN compactas dirigidas a dicha secuencia de ADN o secuencias de ADN cerca de dicha secuencia de ADN diana y que comprende cada una un dominio catalítico derivado de nickasa; en este caso, este uso de dos entidades activas de TALEN compacta puede representar una manera alternativa de conseguir una rotura bicatenaria cerca de dicha secuencia diana de a Dn , en comparación con el uso de una TALEN compacta dirigida a dicha secuencia de ADN que comprende un dominio catalítico derivado de cleavasa, o no. Como otro ejemplo no limitante, puede usarse una TALEN compacta que comprende un dominio derivado de cleavasa y una TALEN compacta que comprende un dominio derivado de exonucleasa para generar una rotura bicatenaria y crear una interrupción, respectivamente, para conseguir un evento de NHEJ impreciso en el locus genómico de interés que comprende dicha secuencia diana de ADN. En este caso, incluso si cada TALEN compacta que forma este par heterodimérico de TALEN compactas es activo por sí mismo, cada una de estas entidades activas depende de la otra para conseguir la actividad de procesamiento de ADN resultante deseada. De hecho, en este caso particular, la actividad resultante deseada es una interrupción creada por la actividad exonucleasa, siendo posible dicha actividad exonucleasa únicamente a partir de la rotura bicatenaria conseguida por el dominio cleavasa de las otra TALEN compactas. En el alcance de la presente invención, también se prevé el caso donde dos entidades activas de TALEN compacta idénticas (un par homodimérico de TALEN compactas) son dependientes entre sí para conseguir una actividad de procesamiento de ADN resultante deseada.
Definiciones
- Los restos de aminoácido en una secuencia polipeptídica se denominan en este documento de acuerdo con el código de una letra, en que, por ejemplo, Q significa Gln o resto de glutamina, R significa Arg o resto de arginina y D significa Asp o resto de ácido aspártico.
- Sustitución de aminoácido significa el remplazo de un resto de aminoácido con otro, por ejemplo, el remplazo de un resto de arginina con un resto de glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácido. - Actividad de procesamiento de ADN potenciada/aumentada/mejorada, se refiere a un aumento en el nivel detectado de una TALEN compacta o TALEN compacta potenciada dada asociada con actividad de procesamiento de ADN frente a una secuencia de ADN diana o secuencia diana de ADN por una segunda TALEN compacta o TALEN compacta potenciada en comparación con la actividad de una primera TALEN compacta o TALEN compacta potenciada frente a la secuencia de ADN diana. La segunda TALEN compacta o TALEN compacta potenciada puede ser una variante de la primera y puede comprender uno o más restos de aminoácidos sustituidos en comparación con la primera TALEN compacta o TALEN compacta potenciada. La segunda TALEN compacta o TALEN compacta potenciada puede ser una variante de la primera y puede comprender uno o más dominios catalíticos y/o potenciadores en comparación con dicha primera TALEN compacta o TALEN compacta potenciada. Esta definición se aplica más ampliamente para otras endonucleasas y endonucleasas de corte infrecuente. - Actividad de procesamiento de ADN se refiere a una actividad enzimática particular / dada de dicha TALEN compacta o TALEN compacta potenciada o más ampliamente para calificar la actividad enzimática de una endonucleasa de corte infrecuente. Dicha actividad de procesamiento de ADN puede referirse a una actividad de escisión, una actividad cleavasa, una actividad nickasa, más ampliamente una actividad nucleasa, pero también una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. En el alcance de esta definición, dicha actividad de procesamiento de ADN dada de una actividad enzimática particular también puede describir como eficacia de procesamiento de ADN de dicha actividad enzimática particular. Los métodos para potenciar la actividad de procesamiento de ADN de la TALEN compacta o TALEN compacta potenciada de acuerdo con esta definición son ilustrativos de la presente invención.
- La eficacia de procesamiento de ADN global describe, para una TALEN compacta o una TALEN compacta potenciada, el resultante global o el efecto general de diferentes actividades enzimáticas diferentes que puede comprender dicha TALEN compacta o TALEN compacta potenciada. De acuerdo con estas actividades enzimáticas separadas diferentes, una TALEN compacta o una TALEN compacta potenciada presenta una capacidad global de procesar ADN cerca de una secuencia diana en un locus genómico de interés, es decir, una eficacia de procesamiento de ADN global. Dicha eficacia de procesamiento de ADN global puede calificar o clasificar una segunda TALEN compacta o TALEN compacta potenciada dada en comparación con una primera TALEN compacta o TALEN compacta potenciada dada. Dependiendo de dicha composición de TALEN compactas o TALEN compactas potenciadas [tipo de armazón de TALE central, tipo de domino o dominios catalíticos con actividades enzimáticas asociadas, finalmente tipo de conector o conectores y tipo de dominio o dominios potenciadores], dicha eficacia de procesamiento de ADN global puede referirse a únicamente una actividad enzimática, dos actividades enzimáticas, tres actividades enzimáticas, cuatro actividades enzimáticas o más de cuatro actividades enzimáticas. Dicha eficacia de procesamiento de ADN global puede referirse a la suma de actividades enzimáticas individuales. Dicha eficacia de procesamiento de ADN global puede referirse a la sinergia o efecto combinado de diferentes actividades enzimáticas comprendidas en una TALEN compacta o TALEN compacta potenciada dada. Una potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una TALEN compacta de acuerdo con la presente invención puede reflejar una sinergia, un efecto combinado potenciado, que produce una TALEN compacta potenciada caracterizada por una eficacia de procesamiento de ADN global que es mayor que la suma de las eficacias de procesamiento de ADN respectivas de TALEN compactas de partica diferentes o que la suma de eficacias de procesamiento de ADN respectivas de actividades enzimáticas diferentes comprendidas en una misma TALEN compacta de partida.
- La eficacia de una endonucleasa de corte infrecuente de acuerdo con la presente invención es la propiedad de dicha endonucleasa de corte infrecuente de producir un evento deseado. Este evento deseado puede ser, por ejemplo, dirección génica homóloga, mutagénesis dirigida o eliminación o escisión de secuencias. La eficacia del evento deseado depende de varios parámetros, incluyendo la actividad específica de la nucleasa y la ruta o rutas de reparación que provocan el efecto deseado (eficacia de reparación homóloga para dirección génica, eficacia y resultado de rutas de NHEJ para mutagénesis dirigida. La eficacia de una endonucleasa de corte infrecuente para un locus pretende indicar su capacidad de producir un evento deseado en este locus. La eficacia de una endonucleasa de corte infrecuente para una diana pretende indicar su capacidad de producir un evento deseado como consecuencia de la escisión de esta diana.
- Los nucleótidos se denominan de la siguiente manera: se usa el código de una letra para denominar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.
- Por "meganucleasa", se pretende un subtipo de endonucleasa de corte infrecuente que tiene una secuencia diana de ADN bicatenario mayor de 12 pb. Dicha meganucleasa es una enzima dimérica, en la que cada dominio está en un monómero o una enzima monomérica que comprende los dos dominios en un único polipéptido.
- Por "dominio de meganucleasa" se pretende la región que interactúa con una mitad de la diana de ADN de una meganucleasa y puede asociarse con el otro dominio de la misma meganucleasa que interactúa con la otra mitad de la diana de ADn para formar una meganucleasa funcional que puede escindir dicha diana de ADN.
- Por "variante de endonucleasa", "variante de endonucleasa de corte infrecuente", "variante de endonucleasa de corte infrecuente quimérica" o "variante de meganucleasa" o "variante de TALEN compacta", o "variante de TALEN compacta potenciada" o "variante de TALEN compacta de escisión doble" o "variante" se pretende una endonucleasa, endonucleasa de corte infrecuente, endonucleasa de corte infrecuente quimérica, meganucleasa o TALEN compacta, TALEN compacta potenciada, TALEN compacta de escisión doble obtenida por remplazo de al menos un resto en la secuencia de aminoácidos de la endonucleasa precursora, endonucleasa de corte infrecuente, endonucleasa de corte infrecuente quimérica, meganucleasa o TALEN compacta, TALEN compacta potenciada, TALEN compacta de escisión doble con al menos un aminoácido diferente. La denominación "variante" también se aplica, por ejemplo, a una TALEN compacta potenciada que comprende al menos un dominio proteínico complementario (dominio catalítico o potenciador) en comparación con la entidad de TALEN compacta de partida. También se abarcan en el alcance de la presente definición, variantes y dominios proteínicos comprendidos en estas variantes que presentan una secuencia con un alto porcentaje de identidad o un alto porcentaje de homología con secuencias de TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas, TALEN compactas de escisión doble o dominios proteínicos y polipéptidos, a nivel nucleotídico o polipeptídico. Por alto porcentaje de identidad o alto porcentaje de homología se pretende un 60 %, más preferiblemente un 70 %, más preferiblemente un 75 %, más preferiblemente un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, más preferiblemente un 95, más preferiblemente un 97 %, más preferiblemente un 99 % o cualquier número entero comprendido entre un 60 % y un 99 %.
- Por "conector de péptido", "conector peptídico" o "espaciador peptídico" se pretende indicar una secuencia peptídica que permite la conexión de diferentes monómeros en una proteína de fusión y la adopción de la conformación correcta para la actividad de dicha proteína de fusión y que no altera la especificidad de ninguno de los monómeros por sus dianas. Los conectores peptídicos pueden ser de diversos tamaños, de 3 aminoácidos a 50 aminoácidos como intervalo indicativo no limitante. Los conectores peptídicos también pueden estar estructurados o no estructurados.
- Por "relacionado con", particularmente en la expresión "un tipo celular relacionado con el tipo celular u organismo elegido", se pretende un tipo celular o un organismo que comparte características con dicho tipo celular elegido o dicho organismo elegido; este tipo celular u organismo relacionado con el tipo celular u organismo elegido, puede obtenerse de dicho tipo celular u organismo elegido o no.
- Por "subdominio" se pretende la región de un dominio central de endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG que interactúa con una parte distinta de un semisitio diana de ADN de endonucleasa de asentamiento.
- Por "construcción de ADN de dirección/matriz de reparación mínima/matriz de reparación" se pretende indicar una construcción de ADN que comprende una primera y una segunda parte que son homólogas a las regiones 5' y 3' de la diana de ADN in situ. La construcción de ADN también comprende una tercera parte colocada entre la primera y la segunda parte que comprende algo de homología con la secuencia de ADN correspondiente in situ o como alternativa no comprende homología con la regiones 5' y 3' de la diana de ADN in situ. Después de la escisión de la diana de ADN, se estimula un evento de recombinación homóloga entre el genoma que contiene el gen diana comprendido en el locus de interés y la matriz de reparación, en la que la secuencia genómica que contiene la diana de ADN se remplaza por la tercera parte de la matriz de reparación y una parte variable de la primera y la segunda parte de la matriz de reparación.
- Por "variante funcional" se pretende una variante catalíticamente activa de una proteína, pudiendo tener dicha variante propiedad adicionales en comparación con su proteína precursora. Como un ejemplo no limitante, una variante funcional de una meganucleasa puede tener la capacidad de escindir una secuencia diana de ADN, siendo preferiblemente dicha diana una nueva diana que no se escinde por la meganucleasa precursora. Esta definición también se aplica a TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas, TALEN compactas de escisión doble o dominios proteínicos que constituyen dichas TALEN. También se abarcan en el alcance de la presente definición, variantes funcionales, polipéptidos y dominios proteínicos comprendidos en estas moléculas que presentan una secuencia con un alto porcentaje de identidad o un alto porcentaje de homología con secuencias de TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas, TALEN compactas de escisión doble o dominios proteínicos y polipéptidos, a nivel nucleotídico o polipeptídico. Por alto porcentaje de identidad o alto porcentaje de homología se pretende un 60 %, más preferiblemente un 70 %, más preferiblemente un 75 %, más preferiblemente un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, más preferiblemente un 95, más preferiblemente un 97 %, más preferiblemente un 99 % o cualquier número entero comprendido entre un 60 % y un 99 %.
- Por "derivado de" o "derivado o derivados" se pretende indicar, por ejemplo, una variante de meganucleasa que se crea a partir de una meganucleasa precursora y, por tanto, la secuencia peptídica de la variante meganucleasa está relaciona con (nivel de secuencia principal) pero deriva de (mutaciones) la secuencia peptídica de la meganucleasa precursora. En esta definición, las mutaciones abarcan eliminaciones o inserciones de varios restos de aminoácidos; como ejemplo no limitante, una variante truncada de una meganucleasa I-CreI se considera un armazón derivado de la meganucleasa I-CreI. Esta expresión también puede aplicarse a TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas, TALEN compactas de escisión doble o dominios proteínicos que constituyen dichas TALEN. También se abarcan en el alcance de la presente definición, derivados de TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas, TALEN compactas de escisión doble o dominios proteínicos y derivados de polipéptidos que presentan una secuencia con un alto porcentaje de identidad o un alto porcentaje de homología con secuencias de TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas, TALEN compactas de escisión doble o dominios proteínicos y polipéptidos, a nivel nucleotídico o polipeptídico. Por alto porcentaje de identidad o alto porcentaje de homología se pretende un 60 %, más preferiblemente un 70 %, más preferiblemente un 75 %, más preferiblemente un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, más preferiblemente un 95, más preferiblemente un 97 %, más preferiblemente un 99 % o cualquier número entero comprendido entre un 60 % y un 99 %.
- Por "I-CreI" se pretende la I-CreI de tipo silvestre que tiene la secuencia del código de acceso de pdb 1g9y, correspondiente a la secuencia SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias. En la presente solicitud de patente, las variantes de I-CreI descritas pueden comprender una alanina adicional después de la primera metionina de la secuencia de I-CreI de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1). Estas variantes también pueden comprender dos restos de alanina adicionales y un resto de ácido aspártico después de la prolina final de la secuencia de I-CreI de tipo silvestre como se muestra en la SEQ ID NO: 106. Estos restos adicionales no afectan a las propiedades de la enzima y para evitar confusiones, estos restos adicionales no afectan a la numeración de los restos en I-Crel o una variante menciona en la presente solicitud de patente, ya que estas referencias se refieren exclusivamente a restos de la enzima I-Crel de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) presente en la variante, de modo que, por ejemplo, el resto 2 de I-Crel es de hecho el resto 3 de una variante que comprende una alanina adicional después de la primera metionina.
- Por TALEN compacta, TALEN compacta potenciada, TALEN compacta de escisión doble con especificidad novedosa se pretende una variante de estas proteínas que tiene un patrón de dianas escindidas diferentes de las de sus TALEN compactas, TALEN compactas potenciadas, TALEN compactas de escisión doble precursoras respectivas. Las expresiones "especificidad novedosa", "especificidad modificada", "especificidad de escisión novedosa", "especificidad de sustrato novedosa" que son equivalentes y se usan indistintamente, se refieren a la especificidad de la variante hacia los nucleótidos de la secuencia diana de ADN.
- Por "sitio I-Crel" se pretende una secuencia de ADN bicatenario de 22 a 24 pb que se escinde porl-Crel. Los sitios I-CreI incluyen el sitio de asentamiento de I-Crel no palindrómico de tipo silvestre y las secuencias palindrómicas derivadas tales como la secuencia 5'- t-i2c- i ia-i0a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t- ia+ ic+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+ i0g+ i ia+i2 (SEQ ID NO: 2), también llamada C1221 o diana C1221.
- Por "dominio" o "dominio central" se pretende el "dominio central de endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG" que es el plegamiento appappa característico de las endonucleasas de asentamiento de la familia LAGLIDADG, correspondiente a una secuencia de aproximadamente cien restos de aminoácidos. Dicho dominio comprende cuatro hebras (pi p2p3p4) plegadas en una lámina beta antiparalela que interactúa con una mitad de la diana de ADN. Este dominio puede asociarse con otro dominio central de endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG que interactúa con la otra mitad de la diana de ADN para formar una endonucleasa funcional con capacidad de escindir dicha diana de ADN. Por ejemplo, en el caso de la endonucleasa de asentamiento dimérica I-CreI (i63 aminoácidos), el dominio central de endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG corresponde a los restos 6 a 94. - Por "horquilla beta" se pretende dos hebras beta consecutivas de la lámina beta antiparalela de un dominio central de endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG (p i p2 o p3p4) que están conectadas por un bucle o un giro. - Por "meganucleasa de una cadena", "meganucleasa quimérica de una cadena", "derivado de meganucleasa de una cadena", "derivado de meganucleasa quimérica de una cadena" o "derivado de una cadena" se pretende una meganucleasa que comprende dos dominios de endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG o dominios centrales ligados por un espaciador peptídico. La meganucleasa de una cadena puede escindir una secuencia diana de ADN quimérica que comprende una mitad diferente de cada secuencia diana de meganucleasa precursora.
- Por "diana de ADN", "secuencia diana de ADN", "secuencia de ADN diana", "secuencia diana", "sitio diana", "diana", "sitio", "sitio de interés", "sitio de reconocimiento", "sitio de reconocimiento polinucleotídico", "secuencia de reconocimiento", "sitio de reconocimiento de asentamiento", "sitio de asentamiento", "sitio de escisión" se pretende una secuencia polinucleotídica bicatenaria palindrómica, parcialmente palindrómica (seudopalindrómica) o no palindrómica que se reconoce y puede escindirse por una endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG tal como I-Crel, o una variante, o una meganucleasa quimérica de una cadena derivada de I-CreI. Dicha secuencia diana de ADN puede calificarse como "escindible" por una endonucleasa, endonucleasa de corte infrecuente, endonucleasa de corte infrecuente quimérica o meganucleasa cuando se reconoce dentro de una secuencia genómica y se sabe que corresponde a la secuencia diana de ADN de una endonucleasa, endonucleasa de corte infrecuente, endonucleasa de corte infrecuente quimérica o meganucleasa dada o una variante de dicha endonucleasa, endonucleasa de corte infrecuente, endonucleasa de corte infrecuente quimérica o meganucleasa. Estos términos se refieren a una ubicación de ADN específica, preferiblemente una ubicación genómica, pero también una parte de material genético que puede existir independientemente del cuerpo principal de material genético tal como plásmidos, episomas, virus, transposones o en orgánulos tales como mitocondrias o cloroplastos como ejemplos no limitantes, en que puede inducirse una rotura bicatenaria (escisión) por la endonucleasa, endonucleasa de corte infrecuente, endonucleasa de corte infrecuente quimérica o meganucleasa. Para la subfamilia de LAGLIDADG de endonucleasas de corte infrecuente, la diana de ADN se define por la secuencia 5' a 3' de una hebra del polinucleótido bicatenario, como se indica anteriormente para C i22 i (SEQ ID NO: 2). La escisión de la diana de ADN puede producirse en los nucleótidos en las posiciones 2 y -2, respectivamente para la hebra codificante y la no codificante. Salvo que se indique de otro modo, la posición en que puede producirse la escisión de la diana de ADN por una variante derivada de I-CreI, corresponde al sitio de escisión en la hebra codificante de la diana de ADN. En el caso particular de TALEN compactas, una subclase de endonucleasas de corte infrecuente quiméricas, las siguientes expresiones "diana de a Dn ", "secuencia diana de ADN", "secuencia de ADN diana", "secuencia diana", "sitio diana", "diana", "sitio", "sitio de interés", "sitio de reconocimiento", "sitio de reconocimiento polinucleotídico" y "secuencia de reconocimiento" pueden aplicarse para calificar su secuencia diana de ADN específica con la particularidad de que dicha secuencia diana de ADN específica reconocida por la TALEN compacta de acuerdo con la invención es la que se procesa y/o corta o no por la TALEN compacta. Una TALEN compacta, una TALEN compacta potenciada o una TALEN compacta de escisión doble puede procesar y/o cortar ADN dentro de dicha secuencia diana de ADN específica. Una TALEN compacta, una TALEN compacta potenciada o una TALEN compacta de escisión doble también puede procesar y/o cortar ADN fuera de dicha secuencia diana de ADN específica.
- Por "ADN cerca de dicha secuencia diana de ADN específica" o por "ADN cercano" se pretende la secuencia o secuencias de ADN ubicadas dentro o fuera de dicha secuencia diana de ADN específica. También se pretende una secuencia o secuencias de ADN unidas por una TALEN compacta o una TALEN compacta potenciada en dicha ubicación de secuencia diana de ADN específica o ADN ubicado a una distancia 5' o 3' de i - i 00 pares de bases (pb), i -50 pares de bases (pb) o i-25 pares de bases (pb) desde dicha secuencia diana de ADN específica.
Cuando tienen que usarse varias TALEN compactas en una aplicación de manipulación de genoma particular, la secuencia diana de ADN para cada TALEN compacta de la combinación a usar puede estar ubicada en el mismo locus de ADN genómico endógeno de interés o no. Dichas secuencias diana de ADN puede estar ubicadas a una distancia aproximada de 1-1000 pares de bases (pb), más preferiblemente de 1-500 pb, más preferiblemente de 1-100 pb, más preferiblemente de 1-100 pb, más preferiblemente de 1-50 pb, más preferiblemente de 1-25 pb, más preferiblemente de 1-10 pb. En otra realización, dicha secuencia diana de ADN para cada TALEN compacta de la combinación a usar puede estar ubicada en la misma hebra de ADN o no. Dichas secuencias diana de ADN ubicadas a distancias mencionadas anteriormente son secuencias de ADN "cercanas" en referencia a la secuencia de ADN diana para el procesamiento de ADN de acuerdo con la presente invención.
- Por "secuencia diana de ADN bicatenario única" se pretende un sitio de unión de TALEN compacta o TALEN compacta potenciada o TALEN compacta de escisión doble. El sitio de unión a ADN de reconocimiento de una TALEN compacta o TALEN compacta potenciada o TALEN compacta de escisión doble puede varias de 12 a 100 pares de bases (pb) de longitud, habitualmente de más de 12 pb de longitud.
- Por "semisitio diana de ADN", "semisitio de escisión o semisitio" se pretende la parte de la diana de ADN que se une por cada dominio central de endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG.
- El término "endonucleasa " se refiere a cualquier enzima de tipo silvestre o variante que puede catalizar la hidrólisis (escisión) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferiblemente una molécula de ADN. Las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte infrecuente que tienen típicamente un reconocimiento polinucleotídico de más de 12 pares de bases (pb) de longitud, más preferiblemente 14-45 pb. Las endonucleasas de corte infrecuente aumentan significativamente la HR induciendo roturas bicatenarias (DSB) de ADN en un locus definido (Rouet, Smih et al. 1994; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte infrecuente pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) quimérica resultante de la fusión de dominios de dedos de cinc genomanipulados con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como Fokl (Porteus y Carroll 2005) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006; Simon, Cannata et al. 2008). En endonucleasas químicas, se conjuga un agente de escisión químico o peptídico con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia diana específica, dirigiendo de ese modo la actividad de escisión a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abarcan nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula de escisión de ADN y oligonucleótidos que forman tripe hélice (TFO), que se sabe que unen secuencias de ADN específicas (Kalish y Glazer 2005). Dichas endonucleasas químicas están comprendidas en el término "endonucleasa" de acuerdo con la presente invención.
Las endonucleasas de corte infrecuente también pueden ser, por ejemplo, TALEN, una nueva clase de nucleasas quimérica que usan un dominio catalítico Fokl y un dominio de unión a ADN derivado del efector de tipo activador de transcripción (TALE), una familia de proteínas usadas en el proceso de infección por patógenos vegetales del género Xanthomonas genus (Boch, Scholze et al. 2009; Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2010; Li, Huang et al.
2011). La disposición funcional de un TALE-nucleasa (TALEN) basada en FokI es esencialmente la de una ZFN, con el dominio de unión a ADN de dedos de cinc que se remplaza por el dominio de TALE. Por tanto, la escisión de ADN por una TALEN requiere dos regiones de reconocimiento de ADN que flanquean una región central inespecífica. Las endonucleasas de corte infrecuente abarcadas en la presente invención también pueden obtenerse de TALEN. Los autores de la invención han desarrollado un nuevo tipo de TALEN que pueden genomanipularse para que reconozcan y procesen específicamente un ADN diana de forma eficaz. Estas "TALEN compactas" (cTALEN) novedosas no requieren dimerización para la actividad de procesamiento de ADN, aliviando de este modo la necesidad de sitios diana "dobles" con "espaciadores" de ADN intermedios; están TALEN compactas pueden verse como una subclase de endonucleasas de corte infrecuente o endonucleasas de corte infrecuente quiméricas de acuerdo con la presente invención.
La endonucleasa de corte infrecuente puede ser una endonucleasa de asentamiento, también conocida con el nombre de meganucleasa. Dichas endonucleasas de asentamiento son bien conocidas en la técnica (Stoddard 2005). Las endonucleasas de asentamiento reconocen una secuencia diana de ADN y generan una rotura monocatenaria o bicatenaria. Las endonucleasas de asentamiento son altamente específicas, reconociendo sitios diana de ADN que varían de 12 a 45 pares de bases (pb) de longitud, habitualmente que varían de 14 a 40 pb de longitud. La endonucleasa de asentamiento de acuerdo con la invención puede corresponder, por ejemplo, a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH o a una endonucleasa GIY-YIG.
En la naturaleza, las meganucleasas están representadas esencialmente por las endonucleasas de asentamiento. Las endonucleasas de asentamiento (HE) son una familia generalizada de meganucleasas naturales que incluye cientos de familias de proteínas (Chevalier y Stoddard 2001). Estas proteínas están codificadas por elementos genéticos móviles que se propagan por un proceso llamado "de asentamiento": la endonucleasa escinde un alelo afín del que hay un elemento móvil ausente, estimulando de ese modo un evento de recombinación homóloga que duplica el ADN móvil en el locus destinatario. Dadas sus propiedades de escisión excepcionales en términos de eficacia y especificidad, podrían representar armazones ideales para obtener endonucleasas novedosas altamente específicas.
Las HE pertenecen a cuatro familias principales. La familia LAGLIDADG, denominada después de un motivo peptídico conservado implicado en el centro catalítico, es el grupo más generalizado y mejor caracterizado. Ahora hay disponibles siete estructuras. Mientras que la mayoría proteínas de esta familia son monoméricas y presentan dos motivos LAGLIDADG, unas pocas tienen únicamente un motivo y, por tanto, dimerizan para escindir secuencias diana palindrómicas o seudopalindrómicas.
Aunque el péptido LAGLIDADG es la única región conservada entre los miembros de la familia, estas proteínas comparten una arquitectura muy similar. El centro catalítico está flanqueado por dos dominios de unión a ADN con una simetría doble perfecta para homodímeros tales como I-CreI (Chevalier, Monnat et al. 2001), I-MsoI (Chevalier, Turmel et al. 2003) y I-CeuI (Spiegel, Chevalier et al. 2006) y con una seudosimetría para monómeros tales como I-SceI (Moure, Gimble et al. 2003), I-DmoI (Silva, Dalgaard et al. 1999) o I-AniI (Bolduc, Spiegel et al. 2003). Ambos monómeros y ambos dominios (para proteínas monoméricas ) contribuyen al centro catalítico, organizado alrededor de cationes divalentes. Justo por encima del centro catalítico, los dos péptidos LAGLIDADG también desempañan una función esencial en la superficie de contacto de dimerización. La unión a ADN depende de dos pagamientos appappa con forma de silla de montar típicos, que se asientan en el surco mayor del ADN. Otros dominios pueden encontrarse, por ejemplo, en inteínas tales como PI-PfuI (Ichiyanagi, Ishino et al. 2000) y PI-SceI (Moure, Gimble et al. 2002), cuyo dominio de corte y empalme proteínico también está implicado en la unión a ADN.
La generación de meganucleasas quiméricas funcionales, por fusión del dominio I-DmoI en el extremo N con un monómero I-CreI (Chevalier, Kortemme et al. 2002; Epinat, Arnould et al. 2003); solicitud PCT internacional WO 03/078619 (Cellectis) y documento WO 2004/031346 (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Stoddard et al)) han demostrado la plasticidad de las proteínas LAGLIDADG.
Diferentes grupos también han usado una estrategia de semirrotación para alterar de forma local la especificidad de I-CreI (Seligman, Stephens et al. 1997; Sussman, Chadsey et al. 2004); Solicitudes PCT internacionales WO 2006/097784, WO 2006/097853, WO 2007/060495 y WO 2007/049156 (Cellectis); (Arnould, Chames et al. 2006; Rosen, Morrison et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006), I-SceI (Doyon, Pattanayak et al. 2006), PI-SceI (Gimble, Moure et al. 2003) y I-MsoI (Ashworth, Havranek et al. 2006).
Además, se genomanipularon cientos de derivados de I-CreI con especificidad localmente alterada combinando la estrategia de semirrotación y el cribado de alto rendimiento:
- Los restos Q44, R68 y R70 o Q44, R68, D75 y 177 de I-CreI se mutagenizaron y se identificó una colección de variantes con especificidad alterada en la posicione ±3 a 5 de la diana de ADN (diana de ADN 5NNN) por cribado (solicitudes PCT internacionales WO 2006/097784 y WO 2006/097853 (Cellectis); (Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
- Los restos K28, N30 y Q38 o N30, Y33 y Q38 o K28, Y33, Q38 y S40, de I-CreI se mutagenizaron y se identificó una colección de variantes con especificidad alterada en las posiciones ±8 a 10 de la diana de ADN (diana de ADN 10NNN) por cribado (Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006); solicitudes PCT internacionales WO 2007/060495 y WO 2007/049156 (Cellectis)).
Se combinaron dos variantes diferentes y se ensamblaron en una endonucleasa heterodimérica funcional que puede escindir una diana quimérica resultante de la fusión de dos mitades diferentes de cada secuencia diana de ADN variante ((Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006); solicitudes PCT internacionales WO 2006/097854 y WO 2007/034262).
Además, los restos 28 a 40 y 44 a 77 de I-CreI demostraron formar dos subdominios funcionales parcialmente separables, que pueden unirse a distintas partes del semisitio diana de endonucleasa de asentamiento Smith, Grizot et al. 2006); solicitudes PCT internacionales WO 2007/049095 y WO 2007/057781 (Cellectis)).
La combinación de mutaciones de los dos subdominios de I-CreI dentro del mismo monómero permitió el diseño de moléculas quiméricas novedosas (homodímeros) que pueden escindir una secuencia diana de ADN combinada palindrómica que comprende los nucleótidos en las posiciones ±3 a 5 y ±8 a 10 que se unen por cada subdominio ((Smith, Grizot et al. 2006); solicitudes PCT internacionales WO 2007/049095 y WO 2007/057781 (Cellectis)).
El método para producir variantes de meganucleasa y los ensayos basados en recombinación inducida por escisión en células de mamífero o levadura, que se usan para cribar variantes con especificidad alterada se describen en la solicitud PCT internacional WO 2004/067736; (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006). Estos ensayos producen un gen indicador LacZ funcional que puede controlarse por métodos convencionales.
La combinación de las dos etapas anteriores permite una estrategia combinatoria mayor, que implica cuatro subdominios diferentes. Los diferentes subdominios pueden modificare por separado y combinarse para obtener una variante de meganucleasa completamente rediseñada (molécula heterodimérica o monocatenaria) con especificidad elegida. En una primera etapa, se combinan pares de meganucleasas novedosas en nuevas moléculas("semimeganucleasas") que escinden dianas palindrómicas derivadas de la diana que se quiere escindir. Después, la combinación de dichas "semimeganucleasas" puede producir una especie heterodimérica que escinde la diana de interés. El ensamblaje de cuatro conjuntos de mutaciones en endonucleasas heterodiméricas que escinden una secuencia diana modelo o una secuencia de diferentes genes se ha descrito en las siguientes solicitudes de patente internacionales de Cellectis: gen XPC (documento WO2007/093918), gen RAG (documento WO2008/010093), gen HPRT (documento WO2008/059382), gen de beta 2 microglobulina (documento WO2008/102274), gen Rosa26 (documento WO2008/152523), gen de la hemoglobina beta humana (documento WO2009/13622) y gen de la cadena gamma del receptor de interleucina 2 humano (documento WO2009019614).
Estas variantes pueden usarse para escindir secuencias cromosómicas genuinas y han abierto camino para perspectivas novedosa en varios campos, incluyendo genoterapia.
Ejemplos de dicha endonucleasa incluyen /-Sce I, I-Chu I, I-Cre I, I-Csm I, Pl-Sce I, PI-Tli I, PI-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-Bsu I, PI-Dha I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-MfI I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I, PI-Tsp I, I-MsoI.
Una endonucleasa de asentamiento puede ser una endonucleasa LAGLIDADG tal como I-SceI, I-CreI, I-CeuI, I-MsoI, y I-DmoI.
Dicha endonucleasa LAGLIDADG puede ser I-Sce I, un miembro de la familia que contiene dos motivos LAGLIDADG y funciona como monómero, siendo su masa molecular aproximadamente dos veces la masa de otros miembros de la familia como I-CreI que contiene únicamente un motivo LAGLIDADG y funciona como homodímeros.
Las endonucleasa mencionadas en la presente solicitud, abarcan endonucleasas tanto de tipo silvestre (de origen natural) como variantes. Las endonucleasas de acuerdo con la invención pueden ser una endonucleasa "variante", es decir, una endonucleasa que no existe de forma natural en la naturaleza y que se obtiene por ingeniería genética o por mutagénesis aleatoria, es decir, una endonucleasa genomanipulada. Esta endonucleasa variante puede obtenerse, por ejemplo, por sustitución de al menos un resto en la secuencia de aminoácidos de una endonucleasa de origen natural de tipo silvestre con un aminoácido diferente. Dicha sustitución o sustituciones pueden introducirse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio y/o por mutagénesis aleatoria. En el marco de la presente invención, dichas endonucleasas variantes permanecen funcionales, es decir, retienen la capacidad de reconocer (función de unión) y opcionalmente escindir específicamente una secuencia diana para iniciar el proceso de dirección génica.
La endonucleasa variante de acuerdo con la invención escinde una secuencia diana que es diferente de la secuencia diana de la endonucleasa de tipo silvestre correspondiente. Los métodos para obtener dichas endonucleasas variantes con especificidades novedosas son bien conocidos en la técnica.
Las endonucleasas variantes pueden ser homodímeros (meganucleasa que comprende dos monómeros idénticos) o heterodímeros (meganucleasa que comprende dos monómeros no idénticos). Se entiende que el alcance de la presente invención también abarca endonucleasas variantes per se, incluyendo heterodímeros (documento WO2006097854), heterodímeros obligados (documento WO2008093249) y meganucleasas monocatenarias (documento WO03078619 y documento WO2009095793) como ejemplos no limitantes, que pueden escindir una diana de interés en una secuencia polinucleotídica o en un genoma. La invención también abarca una variante híbrida per se compuesta de dos monómeros de diferentes orígenes (documento WO03078619).
Las endonucleasas con especificidades novedosas pueden usarse en el método de acuerdo con la presente invención para dirección génica y de ese modo integrar un transgén de interés en un genoma en una ubicación predeterminada.
- Por "meganucleasa precursora" se pretende indicar una meganucleasa de tipo silvestre o una variante de dicha meganucleasa de tipo silvestre con propiedades idénticas o, como alternativa, una meganucleasa con algunas características alteradas en comparación con la versión de tipo silvestre de la misma meganucleasa. Esta expresión también puede trasladarse a una endonucleasa, una endonucleasa de corte infrecuente, una endonucleasa de corte infrecuente quimérica, una TALEN o una TALEN compacta y derivados.
- Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" se pretende cualquier vector de suministro que pueda usarse en la presente invención para poner en contacto celular (es decir, "contactar") o suministrar el interior de las células o compartimentos subcelulares agentes/productos químicos y moléculas (proteínas y ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, aunque sin limitación, vectores liposómicos de suministro, vectores víricos de suministro, vectores de suministro de fármacos, vehículos químicos, vehículos poliméricos, lipoplexos, poliplexos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonidos), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de suministro permiten el suministro de moléculas, agentes químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de suministro son vehículos moleculares. Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" también se pretenden métodos de suministro para realizar transfección.
- Los términos vector" o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un "vector" en la presente invención incluye, aunque sin limitación, un vector vírico, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en un ácido nucleico cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. Los vectores preferidos son aquellos con capacidad de replicación autónoma (vector episómico) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están ligados (vectores de expresión). Se conocen grande cantidad de vectores adecuados por los expertos en la materia y están disponibles en el mercado.
Los vectores víricos incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de hebra negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de hebra positiva tales como picornavirus y alfavirus y virus de ADN bicatenario incluyendo adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple de tipo 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C, de tipo B de mamífero, virus de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Tercera Edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).
- Por "vector lentivírico" se entiende vectores lentivíricos basados en VIH que son muy prometedores para suministro génico a causa de su capacidad de empaquetado relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad de transducir de forma estable con alta eficacia una gran gama de diferentes tipos celulares. Los vectores lentivíricos se generan habitualmente después de transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envuelta y transferencia) o más plásmidos en célula productoras. Como el VIH, los vectores lentivíricos entran en la célula diana a través de la interacción de glucoproteínas de la superficie vírica con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN vírico experimenta transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa vírica. El producto de transcripción inversa es un ADN vírico lineal bicatenario, que es el sustrato para el integración vírica del ADN de células infectadas.
- Por "vectores lentivíricos de integración (o LV)", se entiende dichos vectores, como ejemplo no limitante, que pueden integrarse en el genoma de una célula diana.
- En oposición a "vectores lentivíricos no integrantes (o NILV)" se entiende vectores de suministro génico eficaces que no se integran en el genoma de una célula diana mediante la acción de la integrasa vírica.
Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos de forma funcional se mencionan en este documento como "vectores de expresión". Un vector de acuerdo con la presente invención comprende, aunque sin limitación, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un BAC (artificial bacteriano), un vector baculovírico, un fago, un fagómido, un cósmido, un vector vírico, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en ADN cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de "plásmidos" que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenario circulares que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. Se conocen grandes cantidades de vectores adecuados por los expertos en la materia. Los vectores pueden comprender marcadores de selección, por ejemplo: neomicina fosfotransferasa, histidinol deshidrogenasa, dihidrofolato reductasa, higromicina fosfotransferasa, timidina cinasa del virus del herpes simple, adenosina desaminasa, glutamina sintetasa e hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa para cultivo de células eucariotas; TRP1 para S. cerevisiae; resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli. Preferiblemente dichos vectores son vectores de expresión, en los que una secuencia que codifica un polipéptido de interés se coloca bajo el control de elementos de control transcripcional y traduccional apropiados para permitir la producción o síntesis de dicho polipéptido. Por lo tanto, dicho polinucleótido está comprendido en un casete de expresión. Más particularmente, el vector comprende un origen de replicación, un promotor unido de forma funcional a dicho polinucleótido codificante, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de corte y empalme de ARN (cuando se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. También puede comprender elementos potenciadores o silenciadores. La selección del promotor dependerá de la célula en que se expresa el polipéptido. Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejido y/o inducibles. Los ejemplos de promotores inducibles son: promotor de la metalotioneína eucariota que se induce por niveles aumentados de metales pesados, promotor lacZ procariota que se induce en respuesta a isopropil-p-D-tiogalacto-piranósido (JPTG) y promotor de choque térmico eucariota que se induce por temperatura aumentada. Ejemplos de promotores específicos de tejido son genes de la creatina cinasa de músculo esquelético, antígeno específico de la próstata (PSA), a antitripsina proteasa, proteína A y B tensioactiva (SP) humana, p caseína y proteína de lactosuero ácida.
- Los promotores inducibles pueden inducirse por patógenos o sobrecarga, más preferiblemente por sobrecarga como frío, calor, luz UV o altas concentraciones iónicas (revisado en Potenza C et al. 2004, in vitro Cell Dev Biol 40:1-22). El promotor inducible puede inducirse por agentes químicos (revisado en Moore, Samalova et al. 2006); (Padidam 2003); (Wang, Zhou et al. 2003); (Zuo y Chua 2000).
Los vectores de suministro y vectores pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.
- Por célula o células se pretende cualquier célula viva procariota o eucariota, líneas celulares derivadas de estos organismos para cultivos in vitro, células primarias de origen animal o vegetal.
- Por "célula primaria" o "células primarias" se pretenden células recogidas directamente de tejido vivo (es decir material biopsia) y establecidas para cultivo in vitro, que han experimentado muy pocas duplicaciones de la población y, por lo tanto, son más representativas de los componentes funcionales principales y características de tejidos de los que se obtienen, en comparación con líneas celulares tumorigénicas o inmortalizadas de forma artificial continuas. Estas células, por tanto, representan un modelo más valioso para el estado in vivo al que se refieren.
- En el marco de la presente invención, "células eucariotas" se refieren a una célula fúngica, vegetal o animal o una línea celular derivada de los organismos enumerados a continuación y establecida para cultivo in vitro. Más preferiblemente, el hongo es del género Aspergillus, Penicillium, Acremonium, Trichoderma, Chrysoporium, Mortierella, Kluyveromyces o Pichia; más preferiblemente, el hongo es de la especie Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Mortierella alpine, Chrysosporium lucknowense, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris o Pichia ciferrii.
Más preferiblemente la planta es del género Arabidospis, Nicotiana, Solanum, Lactuca, Brassica, Oryza, Asparagus, Pisum, Medicago, Zea, Hordeum, Secale, Triticum, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Citrullis, Citrus, Sorghum; más preferiblemente, la planta es de la especie Arabidospis thaliana, Nicotiana tabaccum, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Solanum esculentum, Lactuca saliva, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Oryza glaberrima, Oryza sativa, Asparagus officinalis, Pisum sativum, Medicago sativa, Zea mays, Hordeum vulgare, Secale cereal, Triticum aestivum, Triticum durum, Capsicum sativus, Cucurbita pepo, Citrullus lanatus, Cucumis melo, Citrus aurantifolia, Citrus maxima, Citrus medica, Citrus reticulata.
Más preferiblemente la célula animal es del género Homo, Rattus, Mus, Sus, Bos, Danio, Canis, Felis, Equus, Salmo, Oncorhynchus, Gallus, Meleagris, Drosophila, Caenorhabditis; más preferiblemente, la célula animal es de la especie Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus, Sus scrofa, Bos taurus, Danio rerio, Canis lupus, Felis catus, Equus caballus, Salmo salar, Oncorhynchus mykiss, Gallus gallus, Meleagris gallopavo, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans.
En la presente invención, la célula puede ser una célula vegetal, una célula de mamífero, una célula de pez, una célula de insecto o líneas celulares derivadas de estos organismos para cultivos in vitro o células primarias recogidas directamente de tejido vivo y establecidas para cultivo in vitro. Como ejemplos no limitantes, la célula puede ser protoplastos obtenidos de organismos vegetales enumerados anteriormente. Como ejemplos no limitantes, pueden seleccionarse líneas celulares del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Huh7; células Huvec; células Molt 4.
Todas estas líneas celulares pueden modificarse por el método de la presente invención para proporcionar modelos de línea celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos métodos también pueden usarse para cribar moléculas biológicamente activas de interés en investigación y producción y diversos campos tales como de agentes químicos, biocombustibles, agentes terapéuticos y agronomía como ejemplos no limitantes. La inmunoterapia adoptiva usando linfocitos T manipulados genéticamente es una estrategia prometedora para el tratamiento de neoplasias y enfermedades infecciosas. Las estrategias más actuales dependen de la transferencia génica por integración aleatoria de un receptor de linfocitos T (TCR) apropiado o receptor de antígenos quimérico (CAR). La estrategia dirigida usando endonucleasa de corte infrecuente es un método alternativo eficaz y seguro para transferir genes a linfocitos T y generar linfocitos T manipulados genéticamente.
- Por "homóloga" se pretende una secuencia con suficiente identidad con otra para dar lugar a recombinación homóloga entre secuencias, más particularmente que tienen al menos un 95 % de identidad, preferiblemente un 97 % de identidad y más preferiblemente un 99 %.
- Identidad" se refiere a identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad puede determinarse comparando una composición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado se similitud o identidad entre secuencias de ácido nucleico o aminoácidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse con, por ejemplo, ajustes por defecto.
- Por "mutación" se pretende la sustitución, eliminación, inserción de uno o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. Dicha mutación puede afectar a la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o la estructura/estabilidad del ARNm codificado.
- En el marco de la presente invención, la expresión "mutagénesis inducida por rotura bicatenaria" (mutagénesis inducida por DSB) se refiere a un evento de mutagénesis consecutivo a un evento de NHEJ después de una DSB inducida por endonucleasa, que da lugar a inserción/eliminación en el sitio de escisión de una endonucleasa. - Por "gen" se entiende la unidad básica de herencia, que consiste en un segmento de ADN dispuesto de una manera lineal a lo largo de un cromosoma, que codifica una proteína específica o segmento de proteína. Un gen típicamente incluye un promotor, una región no traducida 5', una o más secuencias codificantes (exones), opcionalmente intrones, una región no traducida 3'. El gen puede comprender además un terminador, potenciadores y/o silenciadores.
- Como se usa en este documento, el término "transgén" se refiere a una secuencia que codifica un polipéptido.
Preferiblemente, el polipéptido codificado por el transgén no se expresa o se expresa, pero no es biológicamente activo, en la célula, tejido o individuo en que se inserta el transgén. Mucho más preferiblemente, el transgén codifica un polipéptido terapéutico útil para el tratamiento de un individuo.
- La expresión "gen de interés" o "GOI" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una producto génico conocido o putativo.
- Como se usa en este documento, el término "locus" es la ubicación física específica de una secuencia de ADN (por ejemplo, de un gen) en un cromosoma. El término "locus" habitualmente se refiere a la ubicación física específica de una secuencia diana de endonucleasa en un cromosoma. Dicho locus, que comprende una secuencia diana que se reconoce y escinde por una endonucleasa de acuerdo con la invención, se menciona como "locus de acuerdo con la invención". Además, la expresión "locus genómico de interés" se usa para calificar una secuencia de ácido nucleico en un genoma que puede ser una diana putativa para una rotura bicatenaria de acuerdo con la invención. Se entiende que el locus genómico considerado de interés de la presente invención no solamente puede calificar una secuencia de ácido nucleico que existe en el cuerpo principal de material genético (es decir, en un cromosoma) de una célula, sino también una parte de material genético que puede existir independientemente a dicho cuerpo principal de material genético tal como plásmidos, episomas, virus, transposones o en orgánulos tales como mitocondrias o cloroplastos como ejemplos no limitantes.
- Por la expresión "pérdida de información genética" se entiende la eliminación o adición de al menos un fragmento de ADN dado (al menos un nucleótido) o secuencia, que limita los sitios de reconocimiento de las endonucleasas, endonucleasas de corte infrecuente quiméricas, TALEN compactas o TALEN compactas potenciada de la presente invención o la secuencia intermedia entre al menos dos sitios de procesamiento de las endonucleasas, endonucleasas de corte infrecuente quiméricas, TALEN compacta o TALEN compacta potenciada y que da lugar a un cambio de la secuencia original alrededor de dichos sitios de corte por endonucleasa, sitios de corte por endonucleasa de corte infrecuente quimérica, sitio de unión a ADN de reconocimiento de TALEN compacta o TALEN compacta potenciada dentro del locus genómico de interés. Esta pérdida de información genética puede ser, como ejemplo no limitante, la eliminación de una secuencia intermedia entre dos sitios de corte por endonucleasa o entre dos sitios de procesamiento de una TALEN compacta o TALEN compacta potenciada. Como otro ejemplo no limitante, esta pérdida de información genética también puede ser una escisión de una única hebra de a Dn que abarca la región de unión de una TALEN compacta o una TALEN compacta potenciada.
- Por "religamiento sin marcas" se pretende el evento de religamiento perfecto, sin pérdida de información genética (sin eventos de inserción/eliminación) de los extremos rotos de ADN mediante un proceso de NHEJ después de la creación de un evento de rotura bicatenaria.
- Por "NHEJ imprecisa" se pretende el religamiento de extremos de ácidos nucleicos generados por una DSB, con inserciones o eliminaciones de nucleótidos. La NHEJ imprecisa es un resultado y no una ruta de reparación y puede estar producida por diferentes rutas de NHEJ (dependientes de Ku o independientes de Ku como ejemplos no limitantes).
- Por "proteína de fusión" se pretende el resultado de un proceso bien conocido en la técnica que consiste en la unión de dos o más genes que originalmente codifican proteínas separas o parte de las mismas, reduciendo la traducción de dicho "gen de fusión" un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales.
- Por "endonucleasa de corte infrecuente quimérica" se entiende cualquiera proteína de fusión que comprenda una endonucleasa de corte infrecuente. Dicha endonucleasa de corte infrecuente podría estar en la parte del extremo N de dicha endonucleasa de corte infrecuente quimérica; en oposición, dicha endonucleasa de corte infrecuente podría estar en la parte del extremo C de dicha endonucleasa de corte infrecuente quimérica. Una "endonucleasa de corte infrecuente quimérica" de acuerdo con la presente invención que comprende dos dominios catalíticos puede describirse como "bifuncional" o como "meganucleasa bifuncional". Una "endonucleasa de corte infrecuente quimérica" de acuerdo con la presente invención que comprende más de dos dominios catalíticos puede describirse como "multifuncional" o como "meganucleasa multifuncional". Como ejemplos no limitantes, las endonucleasas de corte infrecuente quiméricas de acuerdo con la presente invención pueden ser una proteína de fusión entre una endonucleasa de corte infrecuente y un dominio catalítico; las endonucleasas de corte infrecuente quiméricas de acuerdo con la presente invención también pueden ser una proteína de fusión entre una endonucleasa de corte infrecuente y dos dominios catalíticos. Como se menciona previamente, la parte de endonucleasa de corte infrecuente de endonucleasas de corte infrecuente quiméricas de acuerdo con la presente invención puede ser una meganucleasa que comprende dos monómeros idénticos, dos monómeros no idénticos o una meganucleasa de una cadena. La parte de endonucleasa de corte infrecuente de endonucleasas de corte infrecuente quiméricas de acuerdo con la presente invención también puede ser el dominio de unión a ADN de una endonucleasa de corte infrecuente inactiva. En otros ejemplos no limitantes, las endonucleasas de corte infrecuente quiméricas de acuerdo con la presente invención pueden derivar de una TALE nucleasa (TALEN), es decir, una fusión entre un dominio de unión a ADN derivado de un efector de tipo activador de transcripción (TALE) y uno o dos dominios catalíticos. En otros ejemplos no limitantes, una subclase de endonucleasas de corte infrecuente quiméricas de acuerdo con la presente invención puede ser una "TALE nucleasa compacta" (cTALEN), es decir, una fusión entre un armazón de TALE central genomanipulado que comprende al menos un dominio de regiones de dipéptido variable de repetición y al menos un dominio catalítico, constituyendo dicha proteína de fusión una entidad activada de TALEN compacta que no requiere dimerización para la actividad de procesamiento de ADN. Dicho dominio catalítico puede ser una endonucleasa enumerada en la tabla 2 como ejemplos no limitantes; dicho dominio catalítico puede ser una endonucleasa de corte frecuente tal como una enzima de restricción seleccionada del grupo que consiste en Mmel, R-HinPII, R.MspI, R.MvaI, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD6I, ss.BspD6I, R.PleI, MlyI y AlwI como ejemplos de enzimas de restricción no limitantes enumerados en la tabla 2.
- Por "dominio o dominios potenciadores" o "potenciador o potenciadores" se entiende dominios proteínicos que proporcionan soporte funcional y/o estructural a un armazón proteínico, una TALEN compacta como ejemplo no limitante, por lo tanto, que permite una potenciación en la eficacia de procesamiento de a Dn global de la proteína de fusión resultante, es decir, una TALEN compacta potenciada, respecto a la eficacia de procesamiento de ADN de la TALEN compacta de partida. Un dominio particular es un dominio potenciador cuando proporciona al menos un 5 % de potenciación en la eficacia del armazón de partida, más preferiblemente un 10 %, de nuevo más preferiblemente un 15 %, de nuevo más preferiblemente un 20 %, de nuevo más preferiblemente un 25 %, de nuevo más preferiblemente un 50 %, de nuevo más preferiblemente mayor de un 50 %. Ejemplos no limitantes de dichos dominios potenciadores se dan en las tablas 1 y 2. Por "dominios potenciadores auxiliares" o "potenciadores auxiliares" o "dominios auxiliares" se entienden dominios proteínicos que actúan en trans con una TALEN compacta o una TALEN compacta potenciada para proporcionar una función adicional que no es esencial para dicha actividad de TALEN compacta básica o dicha actividad de TALEN compacta potenciada. Cuando dichos potenciador auxiliares se usan, la TALEN compacta o TALEN compacta potenciada se convierte en "TALEN trans", respectivamente, TALEN compacta trans y TALEN compacta potenciada trans.
- Por "dominio catalítico" se pretende el dominio proteínico o módulo de una enzima que contiene el sitio activo de dicha enzima; por sitio activo se pretende la parte de dicha enzima en que se produce la catálisis del sustrato. Las enzimas, pero también sus dominios catalíticos, se clasifican y nombran de acuerdo con la reacción que catalizan. El número de la Comisión de Enzimas (número FC) es una esquema de clasificación numérica para las enzimas, basado en las reacciones químicas que catalizan (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Como se describe en la presente invención,, cualquier dominio catalítico puede fusionarse a un armazón de TALE central genomanipulado para generar una entidad activa de TALEN compacta con una eficacia de procesamiento de ADN proporcionada por al menos dicha actividad de dominio catalítico. Dicho dominio catalítico puede proporcionar una actividad nucleasa (actividades endonucleasa o exonucleasa, cleavasa o nickasa), una actividad polimerasa, una actividad cinasa, una actividad fosfatasa, una actividad metilasa, una actividad topoisomerasa, una actividad integrasa, una actividad transposasa o una actividad ligasa como ejemplos no limitantes. Ejemplos no limitantes de dichos dominios catalíticos se dan en las tablas 1 y 2. Como también se divulga en este documento, dicho dominio catalítico puede considerarse un dominio potenciador. Si es catalíticamente activo, dicho dominio potenciador puede proporcionar soporte funcional y/o estructural al armazón de TALEN compacta que da lugar a una TALEN compacta potenciada cuando se fusiona con la misma. Si es catalíticamente inactivo, dicho dominio potenciador proporciona soporte estructural al armazón de TALEN compacta que da lugar a una TALEN compacta potenciada cuando se fusiona con la misma. Se describe la fusión de dominios catalíticos de acuerdo con la presente invención a una parte de una TALEN clásica para dar a estas TALEN clásicas nuevas propiedades catalíticas proporcionadas por al menos dicha actividad de dominio catalítico o para mejorar su eficacia de procesamiento de ADN.
- Por "dominio catalítico nucleasa" se pretende el dominio proteínico que comprende el sitio activo de una enzima endonucleasa o exonucleasa. Dicho dominio catalítico nucleasa puede ser, por ejemplo, un "dominio cleavasa" o un "dominio nickasa". Por "dominio cleavasa" se pretende un dominio proteínico cuya actividad catalítica genera una rotura bicatenaria (DSB) en una diana de ADN. Por "dominio nickasa" se pretende un dominio proteínico cuya actividad catalítica genera una rotura monocatenaria en una secuencia diana de ADN. Ejemplos no limitantes de dichos dominios catalíticos se dan en las tablas 1 y 2 con un números de GenBank o NCBI o UniProtKB/Swiss-Prot como referencia.
- Por una "TALE nucleasa" (TALEN) o una "TALEN clásica" se pretende una proteína de fusión que consiste en una dominio de unión a ADN derivado de un efector de tipo activador de transcripción (TALE) y un dominio catalítico Fokl, que tienen que dimerizar para formar una entidad activa que pueda escindir una secuencia diana de ad.
- Por "TALE nucleasa compacta" (cTALEN) se pretende una denominación general de acuerdo con la presente invención para una proteína de fusión entre un armazón de TALE central genomanipulado que comprende al menos un dominio de dipéptido variable de repetición y al menos un dominio catalítico, constituyendo dicha proteína de fusión una entidad activa de TALEN compacta (o cTALEN) y que no requiere dimerización para la actividad de procesamiento de ADN. Se diseñan TALEN compactas para aliviar la necesidad de múltiples restos proteínicos independientes cuando se aborda un evento de escisión de ADN. De forma importante, la región "espadadora" necesaria y los sitios diana dobles esenciales para la función de las TALEN actuales con innecesarios. En otras palabras, la TALEN compacta de acuerdo con la presente invención es una unidad de entidad activa que puede abordar, por sí misma, únicamente una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de interés mediante un dominio de unión a ADN y de procesar el ADN cercano a dicha secuencia diana de ADN bicatenario única de interés. Además, como el dominio catalítico no requiere contacto de ADN específico, no hay restricciones sobre las regiones que rodean el dominio de unión a a Dn de TALE central. En el alcance de la presente invención, también puede preverse alguna preferencia de secuencia en el dominio catalítico. Cunado una cTALEN comprende únicamente un dominio catalítico, la cTALEN puede calificarse como "cTALEN básica" o "cTALEN". Cuando una cTALEN comprende además al menos un "dominio potenciador", la cTALEN puede calificarse como cTALEN potenciada o una "eTALEN". Una cTALEN o una eTALEN que comprende al menos un dominio catalítico cleavasa y un dominio catalítico nickasa o al menos dos dominios catalíticos cleavasa puede calificarse específicamente como cTALEN de escisión doble o "dcTALEN". Una cTALEN o una eTALEN que actúa con un dominio auxiliar en trans se califica como TALEN compacta trans o TALEN compacta potenciada trans, siendo ambas "TALEN trans".
La descripción escrita anteriormente de la invención proporciona una manera y proceso para generarla y usarla de modo que cualquier experto en la materia esté capacitado para generar y usar la misma, estando provista esta habilitación en particular para el objeto de las reivindicaciones adjuntas, que componen una parte de la descripción original.
Como se usa anteriormente, las expresiones "seleccionado del grupo que consiste en", "elegido de", y similares incluyen mezclas de los materiales especificados.
Cuando se indica en este documento un límite o intervalo numérico, los puntos finales están incluidos. Además, todos los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como escritos explícitamente.
Habiendo descrito en general esta invención, puede obtenerse una comprensión mayor por referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en este documento con fines de ilustración únicamente, y no pretenden ser limitantes salvo que se especifique de otro modo.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se eligió la meganucleasa I-CreI de tipo silvestre (SEQ ID NO: 106) como armazón precursor en el que fusionar el dominio catalítico de I-TevI (SEQ ID NO: 107). La I-TevI de tipo silvestre funciona como cleavasa monomérica de la familia GIY-YIG para generar una rotura bicatenaria escalonada en su ADN diana. Guiados por los datos bioquímicos y estructurales, se diseñaron construcciones de longitud variable de la región del extremo N de I-TevI que abarca el dominio catalítico completo y la región intolerante a eliminaciones de su conector (de la SEQ ID NO: 109 a la SEQ ID NO: 114). En todos salvo un caso, los fragmentos se fusionaron al extremo N de I-CreI con un conector polipeptídico de 5 restos intermedio (-QGPSG-; SEQ ID NO: 103). La construcción de fusión sin conector contenía restos (-LGPDGRKA-; SEQ ID NO: 104) similares a los del conector artificial. Como I-CreI es un homodímero, todas las construcciones de fusión contienen tres centros catalíticos (figura 4, donde "dominio catalítico" = cleavasa): el sitio activo de I-CreI natural en la superficie de contacto del dímero y un sitio activo I-TevI por monómero.
La actividad de cada meganucleasa "trifuncional" se evaluó usando nuestro ensayo de levaduras previamente descrito en las solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006). Todas las construcciones podían escindir el ADN diana C1221 con una actividad comparable a la de I-CreI de tipo silvestre (tabla 4).
Para validar la actividad del dominio catalítico I-TevI independiente del núcleo catalítico I-CreI, se hicieron mutaciones puntuales D20N para inactivar el armazón de I-CreI [SEQ ID NO: 108, de la SEQ ID NO: 115 a la SEQ ID NO: 120; Chevalier, Sussman et al. 2004)]. Las pruebas en nuestros ensayos de levadura no mostraron actividad visible a partir de la proteína mutante de I-CreI inactivada (D20N) en solitario (tabla 4). Sin embargo, pudo observase actividad de escisión para fusiones que tenían el dominio catalítico de I-TevI (tabla 4).
Tabla 4: Actividad en ensayo de levadura para fusiones de I-TevI/I-CreI. Se muestra la actividad relativa de las proteínas de tipo silvestre y de fusión en las dos dianas de proteína precursoras (C1221 para I-CreI y Tev para I-TevI). Se observa actividad máxima (++++) con cada proteína dada en su diana de ADN nativa. I-CreI N20 es una variante inactiva del armazón de I-CreI de tipo silvestre. En todos los otros casos, la actividad se detecta únicamente en la diana C1221 ya que el reconocimiento de ADN está dirigido por el armazón de I-CreI. Las variantes de fusión "N20" ilustran la actividad de escisión debida al dominio catalítico de I-TevI.
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Ejemplo 2
Se diseñaron armazones de fusión de proteína basándose en una forma truncada de I-CreI (SEQ ID NO: 106, I-CreI_X: SEQ ID NO: 121) y tres polipéptidos conectores diferentes (NFS1 = SEQ ID NO: 98; NFS2 = SEQ ID NO: 99; CFS1 = SEQ ID NO: 100) fusionados al extremo N o C de la proteína. Se generaron modelos estructurales en todos los casos, con el objetivo de diseñar un conector de fusión "basal" que atravesara la superficie de armazón precursor de I-CreI con poco o ningún efecto sobre su unión a ADN o actividades de escisión. Para los dos armazones de fusión en el extremo N, se usó el polipéptido que abarca los restos 2 a 153 de I-CreI, con una mutación K82A para permitir la colocación del conector. El armazón de fusión en el extremo C contiene los restos 2 a 155 de I-CreI de tipo silvestre. Para ambos tipos de armazón de fusión, el extremo "libre" del conector (es decir, en el que puede unirse un polipéptido) se diseña para que sea proximal al ADN, como se determina a partir de modelos construidos usando las estructuras de complejo de I-CreI/ADN como punto de partida (PDB id: 1g9z). Los dos armazones de fusión del extremo N de I­ CreI (I-CreI_NFS1 = SEQ ID NO: 122 y I-CreI_NFS2 = SEQ ID NO: 123) y el único armazón de fusión del extremo C (I-CreI_CFS1 = SEQ ID NO: 124) se ensayaron en nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1) y se descubrió que tenía actividad similar a la de I-CreI de tipo silvestre (tabla 5).
Tabla 5: Actividad en ensayo de levadura para fusiones de ColE7/I-CreI. Se muestra la actividad relativa de las proteínas de tipo silvestre de fusión sobre la diana C1221. I-Crel_X representa una versión truncada de I-CreI basada en la estructura cristalina y se usó como base para los armazones de fusión (I-CreI_NFS1, I-CreI_NFS2 y I-CreI_CFS1). Las construcciones "N20" son variantes inactivas de los armazones basados en I-CreI respectivos. La actividad se detecta en todos los casos en los que el armazón I-CreI es inactivo o cuando se proporciona la catálisis
ADN r l mini lE7.
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continuación
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La colicina E7 es una nucleasa no específica de la familia HNH que puede procesar ADN monocatenario y bicatenario (Hsia, Chak et al. 2004). Guiados por los datos bioquímicos y estructurales, se seleccionó la región de ColE7 que abarca el dominio catalítico completo SEQ ID NO: 140; (Hsia, Chak et al. 2004). Este dominio de ColE7 se fusionó al extremo N de I-CreI_NFS1 (SEQ ID NO: 122) o I-CreI_NFS2 (SEQ ID NO: 123) para crear hColE7Cre_D0101 (SEQ ID NO: 128) o hColE7Cre_D0102 (SEQ ID n O: 129), respectivamente. Además, se generó una construcción de fusión en el extremo C, hCreColE7_D0101 (SEQ ID NO: 130), usando I-CreI_CFS1 (SEQ ID NO: 124). Como I-CreI es un homodímero, todas las construcciones de fusión contienen tres centros catalíticos (figura 4, donde "dominio catalítico" = cleavasa): el sitio activo de I-CreI natural en la superficie de contacto del dímero y un sitio activo ColE7 por monómero.
La actividad de cada meganucleasa "trifuncional" se evaluó usando nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1). Todas las construcciones podían escindir el ADN diana C1221 con una actividad comparable a la de I-CreI de tipo silvestre (tabla 5). Para validar la actividad del dominio catalítico de ColE7 independiente del núcleo catalítico de I­ CreI, se hicieron mutaciones puntuales D20N para inactivar el armazón I-CreI (SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, la SEQ ID NO: 133; (Chevalier, Sussman et al. 2004)). Las pruebas en nuestros ensayos de levadura no mostraron actividad visible a partir de las proteínas mutantes I-CreI (D20N) inactivadas en solitario (tabla 5). Sin embargo, pudo observase actividad de escisión para fusiones que tenían el dominio catalítico de ColE7 (tabla 5).
Ejemplo 3
Se generan dos armazones de TALE central en que (a) podían insertarse diferentes conjuntos de dominios RVD para cambiar la especificidad de unión a ADN y; (b) pudo adherirse una selección de dominios catalíticos, en el extremo N o C, para lograr la escisión de ADN (o mellado). Los armazones centrales (sT1: SEQ ID NO: 134 y sT2: SEQ ID NO: 135) difieren en las regiones del extremo N y C, donde sT2 es una variante truncada que carece de 152 restos de aminoácido del extremo N (Szurek, Rossier et al. 2002) y los últimos 220 restos del extremo C en comparación con sT1. En sT1, la región del extremo C es un truncamiento con respecto a los dominios TALE de tipo silvestre, que finaliza en un sitio de restricción definido de forma fortuita (BamHI) en la secuencia codificante de ADN.
Usando los dos armazones centrales, se generan cuatro proteínas de unión a ADN de TALE "basales" ((bT1-Avr = SEQ ID NO: 136, bT2-Avr = SEQ ID NO: 137, bT1-Pth = SEQ ID NO 138 y bT2-Pth = SEQ ID NO 139) por inserción del conjunto correspondiente de dominios de repetición que reconocen las secuencias asimétricas de origen natural AvrBs3 (19 pb) y PthXo1 (25 pb) (figura 3). Se enumeran secuencias proteínicas ejemplares de los armazones basales en la SEQ ID n O: 136 a la SEQ ID NO: 139. Como tales, estos armazones pueden ensayarse in vitro para la capacidad de unión a ADN en dianas que tienen únicamente una sola secuencia de reconocimiento. Para la comparación con TALEN existentes, el dominio catalítico de la nucleasa FokI (SEQ ID NO: 368 y particularmente los restos P381 a F583 como ejemplo no limitante) puede fusionarse al extremo N o C de los armazones basales. La escisión eficaz usando estos controles requiere ADN de sitio diana que contengan dos secuencias de unión a TALE.
Además de verificar la actividad usando secuencias de origen natural, se generaron cinco construcciones de RVD artificiales que reconocen secuencias relevantes (figura 3): RagT2-R, NptIIT5-L, NptIIT5-R, NptIIT6-L, NptIIT6-R. Se enumeran secuencias proteínicas ejemplares de las RVD insertadas en la SEQ ID NO: 253 a la SEQ ID NO: 257. Se usan secuencias de RVD artificiales como se indica anteriormente dentro del armazón sT1 o sT2 para generar las TALEN compactas dirigidas deseadas.
Se generan TALEN compactas básicas (cTALEN) mediante fusión de dominios catalíticos al extremo N o C de los armazones basales (figura 5, A o B, respectivamente). Se presenta una lista no exhaustiva de dominios catalíticos susceptibles a fusión con dominios de unión a ADN de TALE en la tabla 2. Se presenta una lista no exhaustiva de conectores que pueden usarse en la tabla 3. Es apreciable que el diseño del conector puede depender de la naturaleza del dominio catalítico adherido y su aplicación dada. También puede preverse que pueden construirse conectores especialmente diseñados para controlar mejor o regular la actividad de alguno o ambos dominios. Los ejemplos 5, 6 y 7 a continuación analizan métodos adicionales y alternativos en que pueden definirse los conectores. Todos los diseños de cTALEN se evalúan usando nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1) y proporcionan actividad detectable comparable con las meganucleasas diseñadas existentes.
Ejemplo 3a: TALEN compacta TALE::TevI
El dominio catalítico de I-TevI (SEQ ID NO: 20), un miembro de la familia de endonucleasa GIY-YIG, se fusionó a un armazón derivado de TALE (compuesto de un dominio en el extremo N, un núcleo central compuesto de RVD y un dominio del extremo C) para crear una nueva clase de cTALEN (TALE::TevI). Para distinguir la orientación (extremo N frente a extremo C) de las fusiones del dominio catalítico (CD), los nombres de las construcciones se escriben como CD::TALE-RVD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo N al dominio de TALE) o TALE-RVD::CD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo C al domino de TALE), donde "-RVD" indica opcionalmente la secuencia reconocida por el dominio de TALE y "CD" es el tipo de dominio catalítico. En este documento, se describen construcciones TALE::TevI novedosas que abordan la secuencia AvrBs3, por ejemplo, llamada, por tanto, TALE-AvrBs3::TevI.
Actividad de TALE::TevI en levadura
Se seleccionó un armazón de TALE central, sT2 (SEQ ID NO: 135) en que (a) podían insertarse diferentes conjuntos de dominios de RVD para cambiar la especificidad de unión a ADN, y; (b) podía adherirse una selección de dominios catalíticos derivados de I-TevI, en el extremo N o C, para lograr la escisión de ADN (o mellado). El armazón truncado sT2 mencionado previamente se generó por PCR de un molde de armazón de TALEN central de longitud completa (pCLS7183, SEQ ID NO: 141) usando los cebadores CMP_G061 (SEQ ID NO: 142) y CMP_G065 (SEQ ID NO: 143) y se clonó en el vector pCLS7865 (SEQ ID NO: 144) para generar pCLS7865-cTAL11_CFS1 (pCLS9009, SEQ ID NO: 145) ,donde CFS1 indica la secuencia de aminoácidos -GSSG-(con sitios de restricción subyacentes BamHI y Kpn2I en el ADN codificante para facilitar la clonación). Se amplificaron tres variantes del dominio catalítico I-Tevl (SEQ ID NO: 20) por PCR en los moldes TevCreD01 [proteína de la SEQ ID NO: 109 en el plásmido pCLS6614 (SEQ ID NO: 146) ] usando el par de cebadores CMP_G069 (SEQ ID NO: 147) y CMP_G070 (SEQ ID NO: 148), TevCreD02 [proteína de la SEQ ID NO: 110 en el plásmido pCLS6615 (SEQ ID NO: 203)] usando el par de cebadores CMP_G069 (SEQ ID NO: 147) y CMP_G071 (SEQ ID NO: 149) o TevCreD05 [proteína de la SEQ ID NO: 113 en el plásmido pCLS6618 (SEQ ID NO: 258)] usando el par de cebadores CMP_G069 (SEQ ID NO: 147) y CMP_G115 (SEQ ID NO: 259) y se subclonó en la estructura pCLS9009 por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción BamHI y Eagl, produciendo pCLS7865-cT11_TevD01 (pCLS9010, SEQ ID NO: 150), pCLS7865-cT11_TevD02 (pCLS9011, SEQ ID NO: 151) y pCLS7865-cT11_TevD05 (pCLS15775, SEQ ID NO: 260), respectivamente. Todas las fusiones contienen el dipéptido -GS- que une el dominio de unión a ADN derivado de TALE y el domino catalítico derivado de I-TevI.
La secuencia de ADN que codifica los RVD para abordar el sitio AvrBs3 (SEQ ID NO: 152) se subclonó en ambos plásmidos pCLS9010 (SEQ ID NO: 150, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 420), pCLS9011 (SEQ ID NO: 151, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 421) y pCLS15775 (SEQ ID NO: 260, que codifica la proteína de SEQ ID NO: 422) usando enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y Bbvl y SfaNI para la secuencia de RVD insertada para crear las construcciones TALE-AvrBs3::TevI posteriores cT11Avr_TevD01 (pCLS9012, SEQ ID NO: 218, que codifica la pretina de la SEQ ID NO: 423), cT11Avr_TevD02 (pCLS9013, SEQ ID NO: 153, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 424) y cT11Avr_TevD05 (pCLS15776, SEQ iD NO: 261, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 425), respectivamente. Estas construcciones TALE-AvrBs3::TevI se secuenciaron y el inserto se transfirió a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
Los plásmidos de expresión de levadura de TALE-AvrBs3::Tevl finales, pCLS8523 (SEQ ID NO: 154), pCLS8524 (SEQ ID NO: 155) y pCLS12092 (SEQ ID NO: 262), se prepararon por clonación in vivo en levadura usando los plásmidos pCLS9012, pCLS9013 y pCLS15776, respectivamente. Para generar una secuencia codificante intacta por recombinación homóloga in vivo, se usaron aproximadamente 40 ng de cada plásmido linealizado por digestión con BssHIl y 1 ng del ADN del plásmido pCLS0542 (SEQ ID NO: 156) linealizado por digestión con Ncol y Eagl para transformar, respectivamente, la levadura S. cerevisiae cepa FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3A200) usando un protocolo de transformación con LiAc de alta eficacia (Arnould et al. 2007).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones TALE-AvrBs3::TevI se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 6). Los niveles de actividad de TALE-AvrBs3:en sus respectivas dianas en células de levadura se muestran en la figura 9. Los datos resumidos en la figura 9 muestran que TALE-AvrBs3::Tev es activa frente a varias dianas en levadura.
Actividad de TALE::TevI en células de mamífero
Se subclonó el ADN que codifica la construcción TALE-AvrBs3::TevI a partir de pCLS9012 (SEQ ID NO: 218) o pCLS9013 (SEQ ID n O: 153) en el plásmido de expresión de mamífero pCLS1853 (SEQ ID NO: 193) usando las enzimas de restricción AscI y Xhol para el plásmido receptor y las enzimas de restricción BssHII y Xhol para el inserto TALE-AvrBs3::TevI, que da lugar a los plásmidos de expresión de mamífero pCLS8993 y pCLS8994 (s Eq ID NO: 194 y 195), respectivamente.
Todos plásmidos indicadores diana de mamífero que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron usando el protocolo de Gateway convencional (INVITROGEN) en un vector indicador CHO (Arnould, Chames et al. 2006, Grizot, Epinat et al. 2010). Las construcciones TALE-AvrBs3::TevI se ensayaron en un ensayo extracromosómico en células de mamífero (CHO K1) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI, que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 6).
Para este ensayo, se transfectaron células CHO K1 en un formato de placa de 96 pocillos con 75 ng de vector diana y una cantidad creciente de cada ADN variante de 0,7 a 25 ng, en presencia de reactivo PolyFect (1 pl por pocilio). La cantidad total de ADN transfectado se completó a 125 ng (ADN diana, ADN variante, ADN transportador) usando un vector vacío. Setenta y dos horas después de la transfección, se retiró el medio de cultivo y se añadieron 150 pl de tampón de lisis/revelación para ensayo líquido de p-galactosidasa. Después de incubación a 37 °C, se midió la densidad óptica a 420 nm. El proceso completo se realiza en una plataforma automatizada Velocity11 BioCel (Grizot, Epinat et al. 2009).
Se muestran los niveles de actividad en células de mamífero para las construcciones TALE-AvrBs3::TevI (12,5 ng de ADN transfectado) en la diana Avr15 (SEQ ID NO: 167) en la figura 10. Parece que TALE-AvrBs3::TevI es eficaz para escindir la secuencia diana.
Actividad nickasa de TALE::TevI
Los resultados descritos en los ejemplos anteriores ilustran dos fusiones TALE::TevI, que contienen cada una un domino de unión a ADN basado en TALE y un dominio catalítico basado en I-TevI, que funcionan generando actividad detectable. Los ensayos usados miden la recombinación de repeticiones en tándem por hibridación monocatenaria, un proceso que se activa esencialmente por una DSB (Sugawara y Haber 1992; Paques y Duchateau 2007). Las fusiones TALE::TevI pueden tener una actividad nickasa insuficiente para activar en solitario una señal en el ensayo basado en células. Sin embargo, dos proteínas TALE::TevI que se unen a dos sitios cercanos a veces pueden generar dos mellas independientes, que cuando están proximales o en hebras de ADN diferentes pueden crear una DSB. En este caso, cada TALE::TevI es una cTALEN que puede generar una mella.
Se configuran diferentes experimentos para medir la actividad nickasa de TALE::TevI:
Ensayo de mellado y/o linealización de plásmido circular superenrollado
Las secuencias que codifican las construcciones de TALE-AvrBs3::Tevl cT11Avr_TevD01 y cT11Avr_TevD02 se clonan en un vector de expresión basado en T7 usando sitios de restricción de NcoI/EagI para producir los plásmidos pCLS9021 (SEQ ID NO: 201) y pCLS9022 (SEQ ID NO: 202), respectivamente. Esta etapa de clonación produce las proteínas TALE-AvrBs3::TevI que tienen una marca de hexa-His adicional para la purificación. Los plásmidos pCLS9021 y pCLS9022 entonces se usan para producir proteínas activas por uno de dos métodos:
1. Se usan plásmidos en un sistema de transcripción/traducción in vitro convencional; los lisados de la traducción se usan directamente sin purificación adicional.
2. Se usan plásmidos para transformar células de E. coli L21(DE3) para su expresión usando protocolos convencionales, concretamente: crecimiento hasta fase logarítmica, inducción con IPTG, recolección, lisis celular y purificación mediante métodos de afinidad para proteínas marcadas con His.
Las proteínas activas se ensayan frente a la dianas de ADN que tienen ninguna, una o dos secuencias de sitio de reconocimiento de AvrBs3. Cuando hay más de un sitio presente, se yuxtaponen secuencias de reconocimiento idénticas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb.
Se realiza un ensayo de mellado y/o linealización de plásmido circular superenrollado. Los plásmidos que albergan las dianas de ADN descritas anteriormente se preparan por métodos convencionales y se purifican en columna para producir plásmido superenrollado de >98 % de pureza. Se incuban cantidades crecientes de las proteínas t Al E-AvrBs3::TevI (preparadas como se describe anteriormente) con cada plásmido en condiciones para promover la escisión de ADN durante 1 h a 37 °C. Los productos de reacción se separan en geles de agarosa y se visualizan por tinción con EtBr.
Ensayo de mellado y/o escisión de ADN lineal
Se realiza un ensayo de mellado y/o escisión de ADN lineal. Se preparan productos de PCR que contienen las secuencias diana descritas anteriormente por métodos convencionales y se purifican en columna para producir el sustrato lineal de >98 % de pureza. Entonces se incuban cantidades crecientes de las proteínas TALE-AvrBs3::TevI (preparadas como se describe anteriormente) con cada sustrato de PCR en condiciones para promover la escisión del ADN durante 1 h a 37 °C. Los productos de reacción se separan en un gel de acrilamida desnaturalizante y se visualiza el ADN monocatenario.
Genomanipulación de la TALE::TevI
Se eligen variantes que difieren por truncamientos del dominio del extremo C de la TALEN derivado de AvrBs3 (SEQ ID NO: 196) como armazones de partida. Un subconjunto de estas variantes incluye el truncamiento después de las posiciones E886 (CO), P897 (C11), G914 (C28), L926 (C40), D950 (C64), R1000 (C115), D1059 (C172) (los dominios proteínicos de los dominios en el extremo C truncados C11 a C172 se dan respectivamente en la SEQ ID NO: 204 a 209) y P1117 [también mencionado como Cter wt o WT Cter (SEQ ID NO: 210) que carece del dominio de activación del domino del extremo C de AvrBs3 natural (SEQ ID NO: 220)]. Los plásmidos que codifican los armazones variantes que contienen el dominio del extremo N derivado de AvrBs3, el conjunto derivado de AvrBs3 de dominios de repetición y el dominio en el extremo C derivado de AvrBs3 truncado [pCLS7821, pCLS7803, pCLS7807, pCLS7809, pCLS7811, pCLS7813, pCLS7817 (SEQ ID NO: 211 a 217) que se basan en pCLS7184 (SEQ ID NO: 196)] permiten la clonación de cualquier dominio catalítico en fusión con el dominio del extremo C, usando los sitios de restricción BamHI y EagI.
Se diseñan variantes del dominio catalítico de I-TevI (SEQ ID NO: 20) a partir de la región del extremo N de I-TevI. Un subconjunto de estas variantes incluye truncamientos del dominio catalítico, como la región intolerante a eliminación de su conector, la región tolerante a eliminación de su conector y su dedo de cinc (SEQ ID NO: 197 a 200) nombrado en Liu et al., 2008 (Liu, Dansereau et al. 2008).
El ADN correspondiente a estas variantes de I-TevI se amplifica por PCR para introducir, a nivel de ADN, un sitio de restricción de BamHI (en el 5' de la hebra codificante) y uno Eagl (en el 3' de la hebra codificante) y, a nivel de proteína, un conector (por ejemplo tramo -SGGSGS-, SEQ ID NO: 219) entre el dominio del extremo C de TALE y la variante del dominio catalítico de I-TevI. Las construcciones TALE::TevI finales se generan por inserción de la variante de los dominios catalíticos de I-TevI en las variantes de armazón usando BamHI y EagI y procedimientos de biológica molecular convencionales.
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones TALE-AvrBs3::TevI se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 6).
Ejemplo 3b: TALEN compacta TevI::TALE
El armazón de TALE central sT2 (SEQ ID NO: 135) descrito en el ejemplo 3a se seleccionó para generar pCLS7865-cTAL11_NFS1 (pCLS9008, SEQ ID NO: 234), donde NFS1 denomina la secuencia de aminoácidos -GSSG- (con los sitios de restricción subyacentes BamHI y Kpn2I en el DNA codificante para facilitar la clonación). Se amplificaron cuatro variantes del dominio catalítico de I-Tevl (SEQ ID NO: 20) por PCR en los moldes TevCreD01 [proteína de la SEQ ID NO: 109 en el plásmido pCLS6614 (Se Q ID NO: 146)] usando los pares de cebadores CMP_G001 (SEQ ID NO: 239) y CMP_G067 (SEQ ID NO: 263) o CMP_G152 (SEQ ID NO: 264), TevCreD02 [proteína de la SEQ ID NO: 110 en el plásmido pCLS6615 (SEQ ID NO: 203)] usando el par de cebadores CMP_G001 (SEQ ID NO: 239) y CMP_G068 (SEQ ID NO: 240) o TevCreD05 [proteína de la SEQ ID NO: 113 en el plásmido pCLS6618 (SEQ ID NO: 258)] usando el par de cebadores CMP_G001 (SEQ ID NO: 239) y CMP_G114 (SEQ ID NO: 265) y se subclonó en la estructura pCLS9008 por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción Ncol y Kpn2I, produciendo pCLS7865TevW01_cT11 (pCLS15777, SEQ ID NO: 266, que codifica la pretina de la SEQ ID NO: 426), pCLS7865-TevD01_cT11 (pCLS15778, SEQ ID NO: 267, que codifica la pretina de la SEQ ID NO: 427), pCLS7865- TevD02_cT11 (pCLS12730, SEQ ID NO: 235, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 428) y pCLS7865- TevD05_cT11 (pCLS15779, SEQ ID NO: 268, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 429), respectivamente. Mientras que la fusión basada en TevW01_cT 11 contiene el dipéptido -SG- que une el dominio de unión a ADN derivado de TALE y el dominio catalítico derivado de I-TevI, todas las demás construcciones incorporan una pentapéptido más largo -QGPSG- para unir los dominios.
Actividad de Tevl::TALE en levadura
La secuencia de ADN que codifica las RVD para abordar el sitio AvrBs3 (SEQ ID NO: 152) se subclonó en los plásmidos pCLS15777 (SEQ ID NO: 266), pCLS15778 (SEQ ID NO: 267) y pCLS12730 (SEQ ID NO: 235) usando las enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y BbvI y SfaNI para la secuencia de RVD insertada para crear las construcciones TevI::TALE-AvrBs3 posteriores TevW01_cT11Avr (pCLS15780, SEQ ID NO: 269, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 430), TevD01_cT11Avr (pCLS15781, SEQ ID NO: 270, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 431) y TevD02_cT11Avr (pCLS12731, SEQ ID NO: 236, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 432), respectivamente. Se usó una técnica de clonación similar para introducir las RVD para abordar el sitio RagT2-R (SEQ ID NO: 271) en el plásmido pCLS15779 (SEQ ID NO: 268) para crear la construcción posterior TevD05_cT11RagT2-R (pCLS15782, SEQ ID NO: 272). Todas las construcciones TevI::TALE se secuenciaron y los insertos se transfirieron a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
Los plásmidos de expresión de levadura basados en TevI::TALE finales, pCLS11979 (SEQ ID NO: 273), pCLS8521 (SEQ ID NO: 274), pCLS8522 (SEQ ID NO: 237) y pCLS12100 (SEQ ID NO: 275), se prepararon por clonación in vivo en levadura usando el plásmido pCLS15780 (SEQ ID NO: 269), pCLS15781 (SEQ ID NO: 270), pCLS12731 (SEQ ID NO: 236) y pCLS15782 (SEQ ID NO: 272), respectivamente. Para generar una secuencia codificante intacta por recombinación homóloga in vivo, se usaron aproximadamente 40 ng de cada plásmido linealizado por digestión con BssHII y 1 ng del ADN del plásmido pCLS0542 (SEQ ID NO: 156) linealizado por digestión con Ncol y Eagl para transformar, respectivamente, la levadura S. cerevisiae cepa FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3A200) usando un protocolo de transformación con LiAc de alta eficacia (Arnould et al. 2007).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones TevI::TALE-AvrBs3 y TevI::TALE-RagT2-R se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al.2006; Smith, Grizot et al.2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 6). Además, las construcciones se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento de AvrBs3 o RagT2-R (SEQ ID NO: 238, tabla 8). El nivel de actividad de TevI::TALE-AvrBs3 fue comparable al de TALE-AvrBs3::TevI (pCLS8524, SEQ ID NO: 155) en dianas adecuadas. Se ilustra la actividad significativa en la tabla 8 para una diana de sitio único de muestra, de acuerdo con la cTALEN de la presente invención.
Tabla 8: Actividad de TevI::TALE-AvrBs3 y TevI::TALE-RagT2-R en dianas de ADN de sitio doble y único. La actividad relativa se clasifica como: n.d., sin actividad detectable; , <25 % de actividad; +, de 25 % a <50 % de actividad ++ de 50 % a <75 % de actividad +++ de 75 % a 100 % de actividad.
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Actividad de TevI::TALE en plantas
La secuencia de ADN que codifica las RVD para abordar los sitios NptI IT5-L y NptIIT6-L (de la SEQ ID NO: 276 a 279) se subclonaron en el plásmido pCLS12730 (SEQ ID NO: 235) usando las enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y BbvI y SfaNI para las secuencias de RVD insertadas para crear las construcciones TevI::TALE posteriores TevD02_cT 11 NptIIT5-L (pCLS15783, SEQ ID NO: 280) y TevD02_cT11NptIIT6-L (pCLS15784, SEQ ID NO: 281), respectivamente. Las construcciones se secuenciaron y los insertos de TevI::TALE se transfirieron por técnicas de clonación convencionales al plásmido pCLS14529 (SEQ ID NO: 282) para generar los plásmidos de expresión de TevI::TALE-NptIIT5-L y TevI::TALE-NptIIT6-L finales, pCLS14579 (SEQ ID NO: 283) y pCLS14581 (SEQ ID NO: 284), respectivamente. El plásmido pCLS14529 permite clonar secuencias del gen de interés después de un promotor que confiere altos niveles de expresión constitutiva en células vegetales.
Para ensayar la actividad en células vegetales, se empleó un ensayo de hibridación monocatenaria (SSA) basado en YFP. El gen indicador YFP tiene una corta duplicación de la secuencia codificante que está interrumpida por un sitio diana de TALEN NptIIT5 o NptI IT6. La escisión del sitio diana estimula la recombinación entre las repeticiones, provocando la reconstitución de un gen YFP funcional. Para cuantificar la escisión, el indicador se introduce junto con una construcción que codifica una TALEN o TALEN compacta basada en FokI en protoplastos de tabaco por transformación mediada por PEG (como se conoce u obtiene del estado de la técnica). Se obtuvieron eficacias de transformación uniformes usando la misma cantidad de plásmido en cada transformación, es decir, 15 pg de cada uno de los plásmidos que codifican YFP y la TALEN o cTALEN. Después de 24 horas, los protoplastos se sometieron a citometría de flujo para cuantificar el número de células positivas a YFP. Los niveles de actividad de TevI::TALE, usando las cTALEN de acuerdo con la presente invención, en plantas fueron comparables a los de las construcciones de control de TALEN basada en FokI en las dianas ensayadas (tabla 9).
Tabla 9: Actividad de TevI::TALE-NptIIT5-L y TevI::TALE-NptIIT6-L en dianas de ADN apropiadas. La actividad relativa se clasifica respecto a las construcciones de control como: n.a., no aplicable; , 100 % de actividad del nr l 2 l l iiv YFP
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Ejemplo 3c: TALEN compacta TALE::NucA
NucA (SEQ ID NO: 26), una endonucleasa no específica de Anabaena sp., se fusionó a un armazón derivado de TALE (compuesto de un dominio en el extremo N, un núcleo central compuesto de RVD y un dominio en el extremo C) para crear una nueva clase de cTALEN (TALE::NucA). Para distinguir la orientación (extremo N frente a extremo C) de las fusiones del dominio catalítico (CD), los nombres de las construcciones se escriben como CD::TALE-RVD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo N al dominio de TALE) o TALE-RVD::CD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo C al domino de TALE), donde "-RVD" indica opcionalmente la secuencia reconocida por el dominio de TALE y "CD" es el tipo de dominio catalítico. En este documento, se describen construcciones de TALE::NucA novedosas que abordan, por ejemplo, la secuencia AvrBs3 y, por tanto, se llaman TALE-AvrBs3::NucA. De forma notable, la endonucleasa NucA de tipo silvestre puede inhibirse mediante la formación de complejos con la proteína NuiA (SEQ ID NO: 229). En un contexto de TALEN compacta, la proteína NuiA puede funcionar como dominio auxiliar para modular la actividad nucleasa de las construcciones TALE::NucA.
Actividad de TALE::NucA en levadura
Se seleccionó un armazón de TALE central, sT2 (SEQ ID NO: 135) en que (a) podían insertarse diferentes conjuntos de dominios de RVD para cambiar la especificidad de unión a ADN, y; (b) podía adherirse una selección de dominios catalíticos derivados de NucA, en el extremo N o C, para lograr la escisión de ADN (o mellado). Como se menciona previamente, el armazón truncado sT2 se generó por PCR a partir de un molde de armazón de TALEN central de longitud completa (pCLS7183, SEQ ID NO: 141) usando los cebadores CMP_G061 (SEQ ID NO: 142) y CMP_G065 (SEQ ID NO: 143) y se clonó en el vector pCLS7865 (SEQ ID NO: 144) para generar pCLS7865-cTAL11_CFS1 (pCLS9009, SEQ ID NO: 145),donde CFS1 indica la secuencia de aminoácidos -GSSG- (con sitios de restricción subyacentes BamHI y Kpn2I en el ADN codificante para facilitar la clonación). El dominio catalítico NucA (SEQ ID NO: 26) correspondiente a los restos de aminoácido 25 a 274, se subclonó en la estructura pCLS9009 (SEQ ID NO: 145) por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción BamHI y Eagl, produciendo pCLS7865-cT11_NucA (pCLS9937, SEQ ID NO: 221, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 433). La fusión contiene el dipéptido -GS-que une el dominio de unión a ADN derivado de TALE y el domino catalítico derivado de NucA. La etapa de clonación también se produce a nivel de aminoácidos en una secuencia AAD en Cter del dominio catalítico NucA.
La secuencia de ADN que codifica las RVD para abordar el sitio AvrBs3 (SEQ ID NO: 152) se subclonó en el plásmido pCLS9937 (SEQ ID NO: 221) usando las enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y BbvI y SfaNI para la secuencia de RVD insertada para crear la construcción de TALE-AvrBs3::NucA posterior cT11Avr_NucA (pCLS9938, SEQ ID NO: 222, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 434). La construcción TALE-AvrBs3::NucA se secuenció y el inserto se transfirió a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
El plásmido de expresión de levadura de TALE-AvrBs3::NucA final, pCLS9924 (SEQ ID NO: 223), se preparó por clonación in vivo en levadura usando el plásmido pCLS9938 (SEQ ID NO: 222). Para generar una secuencia codificante intacta por recombinación homóloga in vivo, se usaron aproximadamente 40 ng de plásmido (pCLS9938) linealizado por digestión con BssHII y 1 ng del ADN plasmídico pCLS0542 (SEQ ID NO: 156) linealizado por digestión con NcoI y EagI para transformar la levadura S. cerevisiae cepa FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3A200) usando un protocolo de transformación con LiAc de alta eficacia (Arnould et al. 2007).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
La construcción de TALE-AvrBs3::NucA se ensayó en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 7). Además, las construcciones se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento AvrBs3 (SEQ ID NO: 224; tabla 7).
Genomanipulación de la TALE::NucA
Se eligen variantes que difieren por truncamientos del dominio del extremo C de la TALEN derivado de AvrBs3 (SEQ ID NO: 196) como armazones de partida. Un subconjunto de estas variantes incluye el truncamiento después de las posiciones E886 (CO), P897 (C11), G914 (C28), L926 (C40), D950 (C64), R1000 (C115), D1059 (C172) (los dominios proteínicos de los dominios en el extremo C truncados C11 a C172 se dan respectivamente en la SEQ ID NO: 204 a 209) y P1117 [también mencionado como Cter wt o WT Cter (SEQ ID NO: 210) que carece del dominio de activación del domino del extremo C de AvrBs3 natural (SEQ ID NO: 220)]. Los plásmidos que codifican los armazones variantes que contienen el dominio del extremo N derivado de AvrBs3, el conjunto derivado de AvrBs3 de dominios de repetición y el dominio en el extremo C derivado de AvrBs3 truncado [pCLS7821, pCLS7803, pCLS7807, pCLS7809, pCLS7811, pCLS7813, pCLS7817 (SEQ ID NO: 211 a 217) que se basan en pCLS7184 (SEQ ID NO: 196)] permiten la clonación de cualquier dominio catalítico en fusión con el dominio del extremo C, usando los sitios de restricción BamHI y EagI.
El ADN correspondiente a los restos de aminoácido 25 a 274 de NucA se amplifica por PCR para introducir, a nivel de ADN, un sitio de restricción de BamHI (en el 5' de la hebra codificante) y uno Eagl (en el 3' de la hebra codificante) y, a nivel de proteína, un conector (por ejemplo tramo -SGGSGS-, SEQ ID NO: 219) entre el dominio del extremo C del TALE y el dominio catalítico de NucA. Las construcción TALE::NucA finales se generan por inserción del dominio catalítico NucA en las variantes de armazón usando BamHI y EagI y procedimientos de biológica molecular convencionales. Por ejemplo, las variantes de armazón truncadas después de las posiciones P897 (C11), G914 (C28) y D950 (C64), respectivamente codificadas por pCLS7803, pCLS7807, pCLS7811, (SEQ ID NO: 212, 213 y 215), se fusionaron con el dominio catalítico NucA (SEQ ID NO: 26), dando lugar a pCLS9596, pCLS9597 y pCLS9599 (de la SEQ ID NO: 225 a 227). La etapa de clonación también se produce a nivel de aminoácidos en una secuencia AAD en Cter del dominio catalítico NucA.
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones TALE-AvrBs3::NucA se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 7). Además, las construcciones TALE-AvrBs3::NucA se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento AvrBs3 (SEQ ID NO: 224). Los datos resumidos en la figura 11 muestran que las construcciones TALE-AvrBs3::NucA son activas en todas las dianas que tienen al menos un sitio de reconocimiento AvrBs3, de acuerdo con la cTALEN de la presente invención.
Ejemplo 3d: TALEN compacta TALE::ColE7
El dominio catalítico de ColE7 (SEQ ID NO: 140), una endonucleasa no específica de E.coli, se fusionó a un armazón derivado de TALE (compuesto de un dominio en el extremo N, un núcleo central compuesto de RVD y un dominio en el extremo C) para crear una nueva clase de cTALEN (TALE::ColE7). Para distinguir la orientación (extremo N frente a extremo C) de las fusiones del dominio catalítico (CD), los nombres de las construcciones se escriben como CD::TALE-RVD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo N al dominio de TALE) o TALE-RVD::CD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo C al domino de TALE), donde "-RVD" indica opcionalmente la secuencia reconocida por el dominio de TALE y "CD" es el tipo de dominio catalítico. En este documento, se describen construcciones de TALE::ColE7 novedosas que abordan, por ejemplo, la secuencia AvrBs3 y, por tanto, se llaman TALE-AvrBs3::ColE7. De forma notable, la endonucleasa ColE7 de tipo silvestre puede inhibirse mediante la formación de complejos con la proteína de inmunidad Im7 (SEQ ID NO: 230). En un contexto de TALEN compacta, la proteína Im7 puede funcionar como dominio auxiliar para modular la actividad nucleasa de las construcciones TALE::ColE7.
Actividad de TALE::ColE7 en levadura
Se seleccionó un armazón de TALE central, sT2 (SEQ ID NO: 135) en que (a) podían insertarse diferentes conjuntos de dominios de RVD para cambiar la especificidad de unión a ADN, y; (b) podía adherirse una selección de dominios catalíticos derivados ColE7, en el extremo N o C, para lograr la escisión de ADN (o mellado). Como se menciona previamente, el armazón truncado sT2 se generó por PCR a partir de un molde de armazón de TALEN central de longitud completa (pCLS7183, SEQ ID NO: 141) usando los cebadores CMP_G061 (SEQ ID NO: 142) y CMP_G065 (SEQ ID NO: 143) y se clonó en el vector pCLS7865 (SEQ ID NO: 144) para generar pCLS7865-cTAL11_CFS1 (pCLS9009, SEQ ID NO: 145),donde CFS1 indica la secuencia de aminoácidos -GSSG- (con sitios de restricción subyacentes BamHI y Kpn2I en el ADN codificante para facilitar la clonación). El dominio catalítico ColE7 (SEQ ID NO: 140) se subclonó en la estructura pCLS9009 por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción Kpn2I y EagI, produciendo pCLS7865-cT11_ColE7 (pCLS9939, SEQ ID NO: 231, que codifica la proteína de la SEQ iD NO: 435). La fusión contiene el dipéptido -GSSG- que une el dominio de unión a ADN derivado de TALE y el domino catalítico derivado de ColE7.
La secuencia de ADN que codifica las RVD para abordar el sitio AvrBs3 (SEQ ID NO: 152) se subclonó en el plásmido pCLS9939 (SEQ ID NO: 231) usando las enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y Bbvl y SfaNI para la secuencia de RVD insertada para crear la construcción de TALE-AvrBs3::ColE7 posterior cT11Avr_ColE7 (pCLS9940, SEQ ID NO: 232, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 436). La construcción TALE-AvrBs3::ColE7 se secuenció y el inserto se transfirió a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
El plásmido de expresión de levadura de TALE-AvrBs3::ColE7 final, pCLS8589 (SEQ ID NO: 233), se preparó por clonación in vivo en levadura usando el plásmido pCLS9940 (SEQ ID NO: 232). Para generar una secuencia codificante intacta por recombinación homóloga in vivo, se usaron aproximadamente 40 ng de plásmido (pCLS9940) linealizado por digestión con BssHIl y 1 ng del ADN del plásmido pCLS0542 (SEQ ID NO: 156) linealizado por digestión con Ncol y EagI para transformar la levadura S. cerevisiae cepa FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3A200) usando un protocolo de transformación con LiAc de alta eficacia (Arnould et al. 2007).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
La construcción de TALE-AvrBs3::ColE7 se ensayó en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 7). Además, las construcciones se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento AvrBs3 (SEQ ID NO: 224, tabla 7). Los niveles de actividad de TALE-AvrBs3:ColE7 en las respectivas dianas en células de levadura se muestran en la figura 12.
Actividad de TALE::ColE7 en plantas
La secuencia de ADN que codifica las RVD para abordar los sitios Nptl IT5-L y NptIIT6-L (de la SEQ ID NO: 276 a 279) se subclonaron en el plásmido pCLS15785 (SEQ ID NO: 285, un mutante K497A de ColE7 modificado en el extremo N del plásmido pCLS9939, SEQ ID NO: 231) usando las enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y Bbvl y SfaNI para las secuencias RVD insertadas para crear las construcciones TALE::ColE7_A497 posteriores cT11NptIIT5-L_ColE7_A497 (pCLS15786, SEQ ID NO: 286) y cT11NptIIT6-L_ColE7_A497 (pCLS15787, SEQ ID NO: 287), respectivamente. Las construcciones se secuenciaron y los insertos de TALE::ColE7_A497 se transfirieron por técnicas de clonación convencionales al plásmido pCLS14529 (SEQ ID NO: 282) para generar los plásmidos de expresión de TALE-NptIIT5-L::ColE7_A497 y TALE-NptIIT6-L::ColE7_A497 finales, pCLS14584 (SEQ ID NO: 288, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 437) y pCLS14587 (SEQ ID NO: 289, que codifica la proteína de la SEQ iD NO: 438), respectivamente. El plásmido pCLS14529 permite clonar secuencias del gen de interés después de un promotor que confiere altos niveles de expresión constitutiva en células vegetales.
Para ensayar la actividad en células vegetales, se empleó un ensayo de hibridación monocatenaria (SSA) basado en YFP. El gen indicador YFP tiene una corta duplicación de la secuencia codificante que está interrumpida por un sitio diana de TALEN NptIIT5 o NptIIT6. La escisión del sitio diana estimula la recombinación entre las repeticiones, provocando la reconstitución de un gen YFP funcional. Para cuantificar la escisión, el indicador se introduce junto con una construcción que codifica una TALEN o TALEN compacta basada en Fokl en protoplastos de tabaco por transformación mediada por PEG. Se obtuvieron eficacias de transformación uniformes usando la misma cantidad de plásmido en cada transformación, es decir, 15 pg de cada uno de los plásmidos que codifican YFP y la TALEN o cTALEN. Después de 24 horas, los protoplastos se sometieron a citometría de flujo para cuantificar el número de células positivas a YFP. Los niveles de actividad de TALE::ColE7_A497, usando las cTALEN de acuerdo con la presente invención, en plantas fueron comparables a los de las construcciones de control de TALEN basada en FokI en las dianas ensayadas (tabla 10).
Tabla 10: Actividad de TALE-NptIIT5-L::ColE7_A497 y TALE-NptIIT6-L::ColE7_A497 en dianas de ADN apropiadas. La actividad relativa se clasifica respecto a las construcciones de control como: n.a., no aplicable; , 100 % de ivi l nr l l l iiv YFP .
Figure imgf000071_0001
Genomanipulación de la TALE::ColE7
Se eligen variantes que difieren por truncamientos del dominio del extremo C de la TALEN derivado de AvrBs3 (SEQ ID NO: 196) como armazones de partida. Un subconjunto de estas variantes incluye el truncamiento después de las posiciones E886 (CO), P897 (C11), G914 (C28), L926 (C40), D950 (C64), R1000 (C115), D1059 (C172) (los dominios proteínicos de los dominios en el extremo C truncados C11 a C172 se dan respectivamente en la SEQ ID NO: 204 a 209) y P1117 [también mencionado como Cter wt o WT Cter (SEQ ID NO: 210) que carece del dominio de activación del domino del extremo C de AvrBs3 natural (SEQ ID NO: 220)]. Los plásmidos que codifican los armazones variantes que contienen el dominio del extremo N derivado de AvrBs3, el conjunto derivado de AvrBs3 de dominios de repetición y el dominio en el extremo C derivado de AvrBs3 truncado [pCLS7821 pCLS7803 pCLS7807, pCLS7809, pCLS7811, pCLS7813, pCLS7817 (SEQ ID NO: 211 a 217) que se basan en pCLS7184 (SEQ ID NO: 196)] permiten la clonación de cualquier dominio catalítico en fusión con el dominio del extremo C, usando los sitios de restricción BamHI y EagI.
El ADN correspondiente al dominio catalítico de ColE7 se amplifica por PCR para introducir, a nivel de ADN, un sitio de restricción de BamHI (en el 5' de la hebra codificante) y uno Eagl (en el 3' de la hebra codificante) y, a nivel de proteína, un conector (por ejemplo tramo -SGGSGS-, SEQ ID NO: 219) entre el dominio del extremo C del TALE y el dominio catalítico ColE7. Adicionalmente, pueden generarse variantes del dominio de endonucleasa ColE7 que modula la actividad catalítica que tiene cambios (individualmente o combinados) en las siguientes posiciones: K446, R447, D493, R496, K497, H545, N560 y H573 [las posiciones se refieren a la secuencia de aminoácidos de la proteína ColE7 completa (SEQ ID NO: 11)]. Las construcción TALE::ColE7 finales se generan por inserción del dominio catalítico ColE7 en las variantes de armazón usando BamHI y EagI y procedimientos de biológica molecular convencionales.
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones de TALE-AvrBs3::ColE7 se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 7). Además, las construcciones se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento AvrBs3 (SEQ ID NO: 224, tabla 7).
Ejemplo 3e: TALEN compacta TALE::CreI
La meganucleasa I-CreI de tipo silvestre (SEQ ID NO: 106) se eligió como molde proteínico para derivar un dominio catalítico específico de secuencia que cuando se fusiona a un armazón derivado de TALE (compuesto de un dominio en el extremo N, un núcleo central compuesto de RVD y un dominio en el extremo C) generará una nueva clase de cTALEN (TALE::CreI). Para distinguir la orientación (extremo N frente a extremo C) de las fusiones del dominio catalítico (CD), los nombres de las construcciones se escriben como CD::TALE-RVD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo N al dominio de TALE) o TALE-RVD::CD (el dominio catalítico está fusionado en el extremo C al domino de TALE), donde "-RVD" indica opcionalmente la secuencia reconocida por el dominio de TALE y "CD" es el tipo de dominio catalítico. En este documento, se describen construcciones basadas en TALE::CreI novedosas que abordan, por ejemplo, la secuencia del gen del receptor B de linfocitos T (gen TCRB, SEQ ID NO: 290, figura 13), tanto mediante el dominio de unión a ADN de TALE como el dominio de I-CreI rediseñado. De forma notable, La especificidad de la TALEN compacta TALE::CreI está dirigida tanto por el dominio de unión a ADN de TALE, así como el dominio catalítico derivado de I-CreI. En un contexto de TALEN compacta, dichas proteínas pueden proporcionar, con una proteína monomérica de tamaño razonable, la alta especificidad necesaria demandada por las aplicaciones terapéuticas.
Actividad de TALE::CreI en levadura
Se seleccionó un armazón de TALE central, sT2 (SEQ ID NO: 135) en que (a) podían insertarse diferentes conjuntos de dominios de RVD para cambiar la especificidad de unión a ADN, y; (b) podía adherirse una selección de dominios catalíticos derivados de I-CreI, en el extremo N o C, para lograr la escisión de ADN (o mellado). Como se menciona previamente, el armazón truncado sT2 se generó por PCR a partir de un molde de armazón de TALEN central de longitud completa (pCLS7183, SEQ ID NO: 141) usando los cebadores CMP_G061 (SEQ ID NO: 142) y CMP_G065 (SEQ ID NO: 143) y se clonó en el vector pCLS7865 (SEQ ID NO: 144) para generar pCLS7865-cTAL11_CFS1 (pCLS9009, SEQ ID NO: 145),donde CFS1 indica la secuencia de aminoácidos -GSSG- (con sitios de restricción subyacentes BamHI y Kpn2I en el ADN codificante para facilitar la clonación). Un dominio catalítico I-CreI rediseñado, diseñado para abordar una secuencia en el gen del receptor B de linfocitos T (gen TCRB, SEQ ID NO: 290, figura 13) se subclonó en dos etapas. En primer lugar, el armazón I-CreI_NFS1 (SEQ ID NO: 122), donde NFS1 (SEQ ID NO: 98) comprende un conector de 20 aminoácidos -GSDITKSKISEKMKGQGPSG-(con sitios de restricción subyacentes BamHI y Kpn21 en el ADN codificante para facilitar la clonación), se fusionó al armazón pCLS7865-cTAL11_CFS1 (usando los sitios de restricción BamHI y EagI) para insertar en el mismo marco de la secuencia codificante el conector NFS1. La meganucleasa I-CreI se remplazó posteriormente por la construcción de meganucleasa TCRB02-A genomanipulada (pCLS6857, SEQ ID NO: 291) usando los sitios de restricción Kpn2I y XhoI, produciendo pCLS7865-cT11_scTB2aD01 (pCLS15788, SEQ ID NO: 292, que codifica la proteína de la Se Q ID NO: 439). También se subclonaron dos variantes de mutación puntual de la meganucleasa TCRB02-A, TCRB02-A_148C (pCLS12083, SEQ ID NO: 293, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 442) y TCRB02-A_333C (pCLS12195, SEQ ID NO: 294, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 443), como dominios catalíticos fusionados al núcleo de unión de TALE, produciendo las construcción pCLS7865-cT11_scTB2aD01_148C (pCLS15789, SEQ ID NO: 295, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 440) y pCLS7865- cT11_scTB2aD01_333C (pCLS15790, SEQ ID NO: 296, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 441).
Se diseñaron tres secuencias de ADN que codifican RVD que abordan el gen TCRB a diferentes distancias desde el sitio de meganucleasa, que dan lugar a las RVD TCRB02A1 (SEQ ID NO: 297), TCRB02A2 (SEQ ID NO: 298) y TCRB02A3 (SEQ ID NO: 299), que abordan secuencias ubicadas a 7 pb, 12 pb y 16 pb, respectivamente, delante del sitio TCRB de meganucleasa (figura 13). Las secuencias de ADN para cada RVD se subclonaron independientemente en el plásmido pCLS15788 (SEQ ID NO: 292) usando las enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y BbvI y SfaNI para la secuencia RVD insertada para crear las construcciones de TALE::scTB2aD01 posteriores cT 11 TB2A1_scTB2aD01 (pCLS15791, SEQ ID NO: 300), cT11TB2A2_scTB2aD01 (pCLS15792, SEQ ID NO: 301) y cT11TB2A3_scTB2aD01 (pCLS15793, SEQ ID NO: 302). Adicionalmente, las RVD TCRB02A2 (SEQ ID NO: 298) se clonaron de forma similar en pCLS15789 (SEQ ID NO: 295) para crear cT11TB2A2_scTB2aD01_148C (pCLS15794, SEQ ID NO: 303). Todas las construcciones se secuenciaron y los diversos insertos se transfirieron a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
Los plásmidos de expresión de levadura de TALE::scTB2aD01 finales, pCLS13449 (SEQ ID NO: 304, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 444), pCLS13450 (SEQ ID NO: 305, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 445), pCLS13451 (SEQ ID NO: 306, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 446) y pCLS15148 (SEQ ID NO: 307, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 455), se prepararon por clonación in vivo en levadura usando los plásmidos pCLS15791 (SEQ ID NO: 300), pCLS15792 (SEQ ID NO: 301), pCLS15793 (SEQ ID NO: 302) y pCLS15794 (SEQ ID NO: 303), respectivamente. Para generar una secuencia codificante intacta por recombinación homóloga in vivo, se usaron aproximadamente 40 ng de cada plásmido linealizado por digestión con BssHII y 1 ng del ADN del plásmido pCLS0542 (SEQ ID NO: 156) linealizado por digestión con Ncol y Eagl para transformar, respectivamente, la levadura S. cerevisiae cepa FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3A200) usando un protocolo de transformación con LiAc de alta eficacia (Arnould et al. 2007).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN o meganucleasa se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones basadas en TALE::scTB2aD01 se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas híbridas TCRB02Tsp7 (SEQ ID NO: AC4), TCRB02Tsp12 (SEQ ID NO: AC5) y TCRB02Tsp16 (SEQ ID NO: AC6), ilustradas en la figura 14. La diana únicamente TCRB02.1 se incluyó para comparar la actividad con la meganucleasa TCRB02-A genomanipulada (pCLS6857, SEQ ID NO: 291), que no requiere los sitios de unión a ADN de TALE para la actividad. Los niveles de actividad en las dianas respectivas en células de levadura para las construcciones basadas en TALE::scTB2aD01 indicadas se muestran en la figura 14. De forma notable, en las condiciones in vivo ensayadas, la construcción TALE-TB2A2::scTB2aD01_148C (pCLS15794, SEQ ID NO: 303) ya no escindía dianas que carecen de la secuencia de ADN reconocida por el resto de unión a ADN de TALE.
Actividad de TALE::CreI en células de mamífero
se subclonó el DNA que codifica las construcciones TALE-TB2A2::scTB2aD01 y TALE-TB2A3::scTB2aD01 a partir de pCLS15792 (SEQ ID NO: 301) y pCLS15793 (SEQ ID NO: 302) en el plásmido de expresión de mamífero pCLS1853 (SEQ ID NO: 193) usando las enzimas de restricción AscI y XhoI para el plásmido receptor y las enzimas de restricción BssHII y XhoI para los insertos basados en TALE::scTB2aD01, que da lugar a los plásmidos de expresión de mamífero que las TALEN compactas derivadas de TALE::CreI sean herramientas ideales para aplicaciones terapéuticas. Finalmente, debe apreciarse que el resto I-CreI podría en principio remplazarse con una gran cantidad de dominios catalíticos derivados de endonucleasa de asentamiento que exiten de forma natural existentes o rediseñados.
Ejemplo 3f: Actividad de TALE::SnaseSTAUU
Actividad de TALE::SnaseSTAUU en levadura
Se eligen variantes que difieren por truncamientos del dominio del extremo C de la TALEN derivado de AvrBs3 (SEQ ID NO: 196) como armazones de partida. Un subconjunto de estas variante incluye el truncamiento después de las posiciones G914 (C28) y L926 (C40) (los dominios proteínicos de los dominios del extremo C truncados C28 y C40 se dan respectivamente en la SEQ ID NO: 205 y 206). Los plásmidos que codifican los armazones variantes que contienen el dominio del extremo N derivado de AvrBs3, el conjunto derivado de AvrBs3 de dominios de repetición y el dominio en el extremo C derivado de AvrBs3 truncado [pCLS7807 y pCLS7809, (SEQ ID NO: 213 y 214) que se basan en pCLS7184 (SEQ ID NO: 196)] permite la clonación de cualquier domino catalítico en fusión con el dominio del extremo C, usando los sitios de restricción BamHI y EagI.
El ADN correspondiente a los restos de aminoácido 83 a 231 de SnaseSTAAU (SEQ ID NO: 30) se amplifica por PCR para introducir, a nivel de ADN, un sitio de restricción de BamHI (en el 5' de la hebra codificante) y uno Eagl (en el 3' de la hebra codificante) y, a nivel de proteína, un conector (por ejemplo tramo -SGGSGS-, SEQ ID NO: 219) entre el dominio del extremo C del TALE y el dominio catalítico SnaseSTAAU. Las construcción TALE::SnaseSTAAU finales se generan por inserción del dominio catalítico SnaseSTAAU en las variantes de armazón usando BamHI y EagI y procedimientos de biológica molecular convencionales. Las variantes de armazón truncadas después de las posiciones G914 (C28) y L926 (C40), respectivamente, codificadas por pCLS7807 y pCLS7809, (SEQ ID NO: 213 y 214), se fusionaron al dominio catalítico SnaseSTAAU (SEQ ID NO: 30), que da lugar a pCLS9082 y pCLS9081 (Se Q ID NO: 370 y 371). La etapa de clonación también se produce a nivel de aminoácidos en una secuencia AAD en Cter del dominio catalítico SnaseSTAAU.
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI, que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 7). Además, las construcciones TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento AvrBs3 (SEQ ID NO: 224). Los datos resumidos en la figura 19 muestran que las construcciones TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU son activas en dianas que tienen dos sitio de reconocimiento AvrBs3, de acuerdo con la proteína quimérica de la presente invención, pero también en dianas que contienen únicamente un sitio de reconocimiento AvrBs3.
Ejemplo 4
Las cTALEN básicas están compuestas de un único dominio de unión a ADN fusionado a un único dominio catalítico y se diseñan para estimular la HR mediante una escisión de ADN bicatenario única o evento de mellado monocatenario. Para determinadas aplicaciones (por ejemplo, inactivación génica), es favorable potenciar el nivel de NHEJ. Este ejemplo ilustra la creación de una cTALEN de escisión doble (dcTALEN) que puede lograr la escisión de ADN bicatenario en dos sitios distintos que flanquean el dominio de unión a ADN de TALE (figura 5C). Se espera que la escisión simultánea del ADN en los dos sitios elimine la secuencia intermedia y, por lo tanto, anule el religamiento "sin marcas" por NHEJ (figura 1).
Los armazones basales (de la SEQ ID NO: 136 a la SEQ ID NO: 139) descritos en el ejemplo 3 se usan como puntos de partida para los diseños de fusión. Se presenta una lista no exhaustiva de dominios catalíticos susceptibles a fusión con dominios de unión a ADN de TALE en la tabla 2. Se presenta una lista no exhaustiva de conectores que pueden usarse en la tabla 3. Véanse los ejemplos 3, 5, 6 y 7 para detalles adicionales respecto a la elección del conector o dominio de potenciación. Para los diseños de dcTALEN, se fusiona al menos un dominio cleavasa (en el extremo N o C) al dominio de unión a ADN de TALE. El dominio catalítico adicional puede ser un dominio nickasa o cleavasa (endonucleasa o exonucleasa) y depende de la naturaleza de la aplicación. Por ejemplo, el acoplamiento de un dominio cleavasa en un lado con un dominio nickasa en el otro podría provocar la escisión de una hebra simple de ADN que abarca la región de unión a ADN de TALE. La generación dirigida de salientes monocatenarios prolongados podría aplicarse en aplicaciones que abordan mecanismos de reparación de ADN. Para inactivación génica dirigida, se prefiere el uso de dos dominios cleavasa en la dcTALEN.
Todos los diseños de dcTALEN se evalúan usando nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1) y proporcionan actividad detectable comparable con las meganucleasas genomanipuladas existentes. Además, las posibles potenciaciones de NHEJ se controlan usando el ensayo basado en células de mamífero como se describe en el ejemplo 3.
Ejemplo 4a: Actividad de las TALEN de escisión doble TevI::TALE::FokI y TevI::TALE::TevI
Se generaron TALEN de escisión doble (CD::TALE::CD), que poseen un dominio catalítico derivado de I-TevI en el extremo N y un dominio catalítico en el extremo C derivado de FokI (SEQ ID NO: 368) o I-TevI (SEQ ID NO: 20) en el armazón bT2-Avr basal (SEQ ID NO: 137). El fragmento de dominio catalítico de I-TevI se escindió del plásmido pCLS12731 (SEQ ID NO: 236) y se subclonó en los vectores pCLS15795 (SEQ ID NO: 351) y pCLS9013 (SEQ ID NO: 153) por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción NcoI y NsiI, produciendo TevD02_cT11Avr_FokI-L (pCLS15796, SEQ ID NO: 352, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 447) y TevD02_cT11Avr_TevD02 (pCLS15797, SEQ ID NO: 353, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 448), respectivamente. Todas las construcciones se secuenciaron y el inserto se transfirió a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
Las plásmidos de expresión en levadura de TevI::TALE-AvrBs3::FokI y TevI::TALE-AvrBs3::TevI finales, pCLS13299 (Se Q ID NO: 354, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 449) y pCLS13301 (SEQ ID NO: 355, que codifica la pretina de la SEQ ID NO: 450), se prepararon por clonación in vivo en levadura usando los plásmidos CLS15796 (SEQ ID NO: 352) y pCLS15797 (SEQ ID NO: 353), respectivamente. Para generar una secuencia codificante intacta por recombinación homóloga in vivo, se usaron aproximadamente 40 ng de cada plásmido linealizado por digestión con BssHII y 1 ng del ADN del plásmido pCLS0542 (SEQ ID NO: 156) linealizado por digestión con Ncol y Eagl para transformar, respectivamente, la levadura S. cerevisiae cepa FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3ú200) usando un protocolo de transformación con LiAc de alta eficacia (Arnould et al. 2007).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones de TevI::TALE-AvrBs3::FokI y TevI::TALE-AvrBs3::TevI se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al.
2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 6). Además, las construcciones se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento de AvrBs3 o RagT2-R (SEQ ID NO: 238, tabla 11). En dinas adecuadas, los niveles de actividad de TevI::TALE-AvrBs3::FokI y TevI::TALE-AvrBs3::TevI en levadura eran comparables con los de sus moléculas precursoras que carecen del domino catalítico derivado de I-TevI en el extremo N. Se ilustra la actividad significativa en la tabla 11 para una diana de sitio único de muestra, de acuerdo con la dcTALEN de la presente invención.
Tabla 11: Actividad de diversas cTALEN y dcTALEN en dianas de ADN de sitio doble e individual. La actividad relativa se clasifica como: n.d., sin actividad detectable; , <25 % de actividad; +, de 25 % a <50 % de actividad;
++ de 50 % a <75 % de actividad +++ de 75 % a 100 % de actividad.
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Ejemplo 4b: TALEN de escisión doble scTrex2::TALE::FokI
Una TALEN de escisión doble (CD::TALE::CD), que posee un domino catalítico scTrex2 en el extremo N y un dominio catalítico en el extremo C derivado de FokI, se generó sobre el armazón bT2-Avr basal (SEQ ID NO: 137). El fragmento de dominio catalítico de scTrex2 se escindió del plásmido pCLS15798 (SEQ ID NO: 356, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 451) y se subclonó en el vector pCLS15795 (SEQ ID NO: 351) por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción NcoI y NsiI, produciendo scTrex2_cT11Avr_FokI- L (pCLS15799, SEQ ID NO: 357, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 452). La construcción se secuenció y el inserto se transfirió a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
El ADN que codifica las construcciones de TALE-AvrBs3::FokI o scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI a partir de pCLS15795 (SEQ ID NO: 351) o pCLS15799 (SEQ ID NO: 357), respectivamente, se subclonó en el plásmido de expresión de mamífero pCLS1853 (SEQ ID NO: 193) usando las enzimas de restricción AscI y XhoI para el plásmido receptor y las enzimas de restricción BssHII y XhoI para los insertos, que da lugar a los plásmidos de expresión de mamífero pCLS14972 y pCLS14971 (SEQ ID NO: 358 y 359), respectivamente.
Todos plásmidos indicadores diana de mamífero que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron usando el protocolo de Gateway convencional (INVITROGEN) en un vector indicador CHO (Arnould, Chames et al. 2006, Grizot, Epinat et al. 2010). Las construcciones de TALE-AvrBs3::FokI y scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI se ensayaron en un ensayo extracromosómico en células de mamífero (CHO K1) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI, que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador' que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 6).
Para este ensayo, se transfectaron células CHO K1 en un formato de placa de 96 pocillos con 75 ng de vector diana y una cantidad creciente de cada ADN variante de 0,7 a 25 ng, en presencia de reactivo PolyFect (1 pl por pocilio). La cantidad total de ADN transfectado se completó a 125 ng (ADN diana, ADN variante, ADN transportador) usando un vector vacío. Setenta y dos horas después de la transfección, se retiró el medio de cultivo y se añadieron 150 pl de tampón de lisis/revelación para ensayo líquido de p-galactosidasa. Después de incubación a 37 °C, se midió la densidad óptica a 420 nm. El proceso completo se realiza en una plataforma automatizada Velocity11 BioCel (Grizot, Epinat et al. 2009).
Los niveles de actividad en células de mamífero dianas adecuadas para la construcción scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI fueron comparable con los de la molécula TALE-AvrBs3::FokI precursora, que indica que el resto scTrex2 adicional no altera la función de escisión de ADN de TALEN. La evaluación de la función de scTrex2 se realiza en ensayos adecuados para la detección de eventos de NHEJ.
Ejemplo 5
Los diseños basales para los armazones de cTALEN se basan en los dominios de unión a ADN de TALE establecidos. Las TALEN compactas se diseñan para que sean lo más pequeñas y eficaces posibles. Para obtener este objetivo, por lo tanto, puede ser necesario recurrir a dominios "potenciadores" para unir el hueco funcional entre el dominio de unión a ADN de TALE compacta y los diversos dominios catalíticos. La figura 6 (A-E) ilustra diversas configuraciones no exhaustivas en las que pueden aplicarse dichos dominios potenciadores. Obsérvese que la figura es únicamente ilustrativa, y están implicadas variaciones del extremo N frente al C (es decir, la figura 6a también puede tener un dominio potenciador en el extremo N y un dominio catalítico en el extremo C). Las tablas 1 y 2 enumeran posibles dominios potenciadores que podrían ayudar en la unión al ADN (contactos específicos y no específicos).
Las TALEN potenciadas (eTALEN) se crean usando cTALEN funcionales del ejemplo 3. La adición del dominio potenciador se evalúa en nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1). Un dominio potenciador particular se considera útil si proporciona una potenciación mínima de un 5 % en la eficacia de la cTALEN de partida, más preferiblemente una potenciación mínima de un 10 %, más preferiblemente un 20 %, más preferiblemente un 30 %, más preferiblemente un 40 %, más preferiblemente un 50 %, de nuevo más preferiblemente una potenciación mayor de un 50 %.
Ejemplo 5a: TALEN potenciadas TALE::ColE7::TALE
Las TALEN potenciadas (TALE::CD::TALE), que poseen los dominio de unión a ADN de TALE en el extremo N y C limitando un dominio de escisión de ADN central, se generaron usando el armazón central sT2 (SEQ ID NO: 135). La disposición de esta clase de TALEN compacta se ilustra en la figura 6B, en la que el propio "dominio potenciador" en el extremo N es un dominio de unión a ADN de TALE. Un derivado de mutación puntual del dominio catalítico ColE7 (pCLS15785, SEQ ID NO: 285) se eligió para el núcleo catalítico de la eTALEN. Dos construcciones finales, TALE-AvrBs3::ColE7_A497::TALE-RagT2-R (pCLS15800, SEQ ID NO: 360, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 453) y TALE-RagT2-R::ColE7_A497::TALE-AvrBs3 (pCLS15801, SEQ ID NO: 361, que codifica la proteína de la SEQ ID NO: 454) se obtuvieron usando técnicas de clonación molecular convencionales con secuencias de ADN de sT2 (SEQ ID NO: 135), pCLS15785 (SEQ ID NO: 285), AvrBs3 (SEQ ID NO: 152) y RagT2-R (SEQ ID NO: 271) como moldes. Todas las construcciones TALE::CD::TALE se secuenciaron y los insertos se transfirieron a vectores adicionales según lo necesario (véase a continuación).
Los plásmidos de expresión de levadura basados en TALE::CD::TALE finales, pCLS12106 (SEQ ID NO: 362) y pCLS12110 (SEQ ID NO: 363), se prepararon por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción Ncol y Eagl para subclonar en el plásmido pCLS0542 (SEQ ID NO: 156). La levadura S. cerevisiae cepa FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3A200) se transformó usando un protocolo de transformación con LiAc de alta eficacia (Arnould et al. 2007).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones de TALE::CD::TALE se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas híbridas AvrBs3/RagT2-R asimétricas para comparar la actividad con una TALEN compacta precursora (por ejemplo, pCLS8589, SEQ ID NO: 233), que tiene actividad en dianas con un único sitio de unión. Además, las construcciones se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento de AvrBs3 o RagT2-R.
Ejemplo 6
Hasta la fecha, todos efectores TAL conocidos y derivados de los mismos parecen requerir una base T en las posiciones -1 (figura 3) en la secuencia de reconocimiento. Para superar esta limitación, se usa un dominio potenciador para remplazar la región del extremo N de la proteína TALE. El modelado de homología basado en secuencia y estructura de la región TALE del extremo N de derivados bT2 ha producido tres proteínas candidatas potenciales (tabla 1): (i) factor de unión a Fem-3, SEQ ID NO: 4,(FBF1, familia Puf de proteínas de unión a ARN) de C. elegans; (ii) proteínas de repetición alfa helicoides artificiales (aRep), SEQ ID NO: 5 y; (iii) proteínas de la superfamilia de anquirina. El contenido y disposición de los elementos estructurales secundarios permite usar estos modelos como puntos de partida para dominios potenciadores que remplazan la región del extremo N de la proteína TALE.
Las proteínas quiméricas se construyen usando las regiones análogas de uno de los 3 candidatos mencionados para remplazar la región de la proteína TALE del extremo N hasta el primer dominio de repetición canónica. La nueva superficie de contacto se rediseña in silico, usando los modelos de homología como guías. Esta estrategia puede usarse para determinar con precisión los determinantes de especificidad para la T necesaria en la posición -1 de la secuencia diana. El dominio potenciador de remplazo debe proporcionar como mínimo integridad estructural a la proteína cTALEN. Las construcciones se evalúan en nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1). Un dominio potenciador particular se considera útil si proporciona una retención mínima de un 5 % en la actividad de la cTALEN de partida en ausencia de una T en la posición diana -1, más preferiblemente una retención mínima de un 10 %, más preferiblemente un 20 %, más preferiblemente un 30 %, más preferiblemente un 40 %, más preferiblemente un 50 %, de nuevo más preferiblemente una retención en la actividad mayor de un 50 %.
Ejemplo 7
Para generar armazones más adecuados y compactos para cTALEN, se ha analizado la naturaleza de la región del extremo C (más allá del semidominio de repetición final) de la proteína TALE. El modelado de homología basado en secuencia y estructura de la región TALE del extremo C de derivados bT2 ha producido tres proteínas candidatas potenciales (tabla 1): (i) la hidrolasa/transferasa de Pseudomonas aeuriginosa, SEQ ID NO: 6; (ii) el dominio polimerasa de la ligasa D de Mycobacterium tuberculosis, la SEQ ID NO: 7; (iii) el factor de inicio elF2 de Pyrococcus, la SEQ ID NO: 8; (iv) factor de inicio de la traducción Aif2betagamma, la SEQ ID NO: 9. Como en el ejemplo 6, se usan modelos de homología para determinar con precisión regiones para generar posibles truncamientos en el extremo C; las posibles posiciones de truncamiento incluyen 28, 40, 64, 118, 136, 169, 190 restos que quedan más allá del último semidominio de repetición. Adicionalmente, pueden usarse regiones homólogas de las proteínas mencionadas anteriormente para remplazar el dominio del extremo C completamente. Pueden usarse programas de predicción de contacto para identificar, partiendo de la secuencia primaria de una proteína, los pares de restos que están probablemente proximales en el espacio 3D. Dichas proteínas quiméricas deben proporcionar armazones más estables en que construir las cTALEN.
Las construcciones se evalúan en nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1). Un dominio potenciador particular se considera útil si proporciona una retención mínima de un 5 % en la actividad de la cTALEN de partida, más preferiblemente una retención mínima de un 10 %, más preferiblemente un 20 %, más preferiblemente un 30 %, más preferiblemente un 40 %, más preferiblemente un 50 %, de nuevo más preferiblemente una retención en la actividad mayor de un 50 %.
Ejemplo 8
Para generar TALEN compactas con actividades alternativas, se generan cTALEN trans mediante (a) el uso de un dominio catalítico con actividades separables (figura 7A, B) o; (b) provisión de una actividad auxiliar como una fusión de TALE (figura 7C). Modelado basado en secuencia y estructura de la clase III (Chan, Stoddard et al. 2011). Se usaron endonucleasas de restricción de tipo IIS (REasas) para crear TALEN trans (véase la tabla 2 para una lista no exhaustiva). La TALEN trans inicial se genera mediante fusión de un dominio catalítico independientemente activo (por ejemplo, la nickasa Nt.BspD6I como se describe en los ejemplos 3 y 4. En principio, esta TALEN trans puede usarse dependiendo de la aplicación. Para convertir la cTALEN en una TALEN trans funcional, el dominio auxiliar (en este caso, ss.BspD6I) se proporciona en trans (figura 8A). Dichas proteínas opcionalmente en trans y/o heterodiméricas pueden permitir que los armazones de cTALEN con actividad puedan modularse para una aplicación dada.
Las construcciones se evalúan en nuestro ensayo de levadura (véase el ejemplo 1). Un dominio auxiliar particular se considera útil si proporciona una actividad alternativa a la de la cTALEN de partida.
Si el dominio auxiliar usado muestra actividad independiente de la cTALEN inicial (es decir, en un contexto de TALEN que no es trans), puede fusionarse también a un dominio TALE para dirección específica (figura 7B). Los dominios auxiliares también puede proporcionarse en trans como entidades dirigidas para proporcionar funciones no relaciones con la cTALEN (figura 7C).
Ejemplo 8a: Inhibición específica de actividad catalítica de TALEN
Como se menciona en los ejemplos 3c y 3d, tanto NucA (SEQ ID NO: 26) como ColE7 (SEQ ID NO: 140) pueden inhibirse por la formación de complejos con sus proteínas inhibidoras respectivas, NuiA (SEQ ID NO: 229) y Im7 (SEQ ID NO: 230). Colicina-E9 (SEQ ID NO: 366) es otro ejemplo no limitante de proteína que puede inhibirse por su inhibidor respectivo Im9 (SEQ ID NO: 369). Con las respecto a las TALEN derivadas de los dominios catalíticos NucA (TALE::NucA) o ColE7 (TALE::ColE7), los inhibidores sirven como dominios auxiliares (figura 7A) que modulan la actividad evitando la escisión de ADN.
Las proteínas inhibidoras Im7 (SEQ ID NO: 230) y NuiA (SEQ ID NO: 229) se subclonaron en la estructura pCLS7763 (SEQ ID NO: 241) por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción NcoI y EagI, produciendo pCLS9922 (SEQ ID NO: 242) y pCLS9923 (SEQ ID NO: 243), respectivamente. Estos plásmidos entonces se usaron en experimentos de cotransformación en el ensayo de SSA de levadura convencional como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Las construcciones TALE-AvrBs3::NucA (pCLS9924, SEQ ID NO: 223) y TALE-AvrBs3::ColE7 (pCLS8589, SEQ ID NO: 233) se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI (pCLS8590, SEQ ID NO: 244), que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBS3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (de la SEQ ID NO: 157 a 192, tabla 7). Además, las construcciones se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento AvrBs3 (SEQ ID NO: 224, tabla 7). La modulación de la actividad de las TALEN se evaluó en presencia o ausencia de proteína inhibidora específica o inespecífica, usando la TALEN TALE-AvrBs3::FokI como control.
Los datos resumidos en la tabla 12 indican que las construcciones de TALE-AvrBs3::NucA y TALE-AvrBs3::ColE7 se inactivan específicamente por la presencia de sus proteínas inhibidoras respectivas NuiA y Im7, de acuerdo con la presente invención.
Tabla 12: Actividad de construcciones de TALEN en presencia de proteína inhibidora. La actividad relativa se clasifica como: n.d., sin actividad detectable; , <25 % de actividad; +, de 25 % a <50 % de actividad; ++, de 50 % a <75 % de actividad +++ de 75 % a 100 % de actividad.
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Ejemplo 8b: Potenciación de la actividad catalítica de TALEN mediante una TALEN trans
El ejemplo 3b ilustra que la TevI::TALE funciona sin ayuda como una TALEN compacta (pCLS8522, SEQ ID NO: 237). Para potenciar adicionalmente la actividad, se diseñó una TALEN trans usando una construcción de TALE::TevI en una disposición representada en la figura 7C. La secuencia de ADN que codifica las RVD para abordar el sitio RagT2-R (SEQ ID NO: 271) se subclonó en el plásmido pCLS7865-cT11_TevD02 (pCLS9011, SEQ ID NO: 151) usando las enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y BbvI y SfaNI para la secuencia de RVD insertada para crear la construcción de TALE-RagT2-R::TevI posterior cT11RagT2- R_TevD02 (pCLS15802, SEQ ID NO: 364. La construcción se secuenció y el inserto se subclonó en la estructura pCLS7763 (SEQ ID NO: 241) por restricción y ligamiento usando los sitios de restricción NcoI y EagI, produciendo pCLS8990 (SEQ ID NO: 365). Los pares de plásmidos pCLS8522 (SEQ ID NO: 237) y pCLS7763 (SEQ ID NO: 241) o pCLS8522 (SEQ ID NO: 237) y pCLS8990 (SEQ ID NO: 365) entonces se usaron en experimentos de cotransformación en el ensayo de SSA de levadura convencional como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006).
Todos los plásmidos indicadores diana de levadura que contenían las secuencias diana de ADN de TALEN se construyeron como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006). Los pares de construcciones TALE-RagT2-R::TevI/TevI::TALE-AvrBs3 se ensayaron en un ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas híbridas RagT2-R/AvrBs3 asimétricas para comparar la actividad con una TALEN compacta precursora (por ejemplo, pCLS8522, SEQ ID NO: 237), que tiene actividad en dianas con un único sitio de unión. Las dianas híbridas RagT2-R/AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento diferentes yuxtapuestas con el extremo 3' del primero (RagT2-R) proximal al extremo 5' del segundo (AvrBs3) y separadas por Ad N "espaciador" que varía de 5 a 40 pb (SEQ ID NO: G064 a G099, tabla 13). La figura 18 ilustra la modulación en la actividad de TevI::TALE-AvrBs3 proporcionada por la construcción TALE-RagT2-R::TevI, de acuerdo con la cTALEN trans de la presente invención.
Ejemplo 9: Remplazo del dominio del extremo C por un conector polipeptídico, actividad con dominio catalítico ColE7.
Se generó una primera colección de 37 conectores diferentes. Muchos de ellos tienen una estructura común que comprende una región variable que codifica de 3 a 28 restos de aminoácido y flanqueada por las regiones que codifican el tramo SGGSGS (SEQ ID NO: 219) tanto en el extremo 5' como en el 3' (SEQ ID NO: 372 a 408). Estos conectores contienen sitios de restricción Xmal y BamHI en sus extremos 5' y 3', respectivamente. La colección de conectores entonces se subclona en pCLS7183 (SEQ ID NO: 141) mediante los sitios de restricción XmaI y BamHI para remplazar el dominio del extremo C de la TALEN derivada de AvrBs3 (pCLS7184, SEQ ID NO: 196). El conjunto derivado de AvrBs3 de dominios de repetición (RVD) o cualquier otra secuencia RVD que tenga o carezca del semi-RVD terminal se clona en esta colección de estructuras. El ADN de la colección se obtiene, después de raspado de las colonias de las placas de Petri, usando técnicas de minipreparación convencionales. La cabeza catalítica FokI se elimina usando las enzimas de restricción BamHI y EagI, purificándose la estructura restante usando técnicas de extracción de gel convencionales.
El ADN que codifica el dominio catalítico ColE7 (SEQ ID NO: 11) se amplificó por PCR para introducir, a nivel de ADN, un sitio de restricción de BamHI (en el 5' de la hebra codificante) y uno Eagl (en el 3' de la hebra codificante) y, a nivel de proteína, un conector (por ejemplo tramo -SGGSGS-, SEQ ID NO: 219) entre la colección de dominios de extremo C y la cabeza catalítica. Después de digestión con BamHI y EagI y la purificación, el ADN que codifica las diferentes cabezas catalíticas se subclonó individualmente en el armazón de la colección previamente preparado.
El ADN de la colección final se obtiene, después de raspado de las colonias de placas de Petri, usando técnicas de minipreparación convencionales y las colecciones resultantes se criban en nuestro ensayo de SSA de levadura como se describe previamente (solicitudes PCT internacionales WO 2004/067736 y en Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al.2006; Smith, Grizot et al.2006) en dianas seudopalindrómicas para comparar la actividad con una TALEN convencional TALE-AvrBs3::FokI, que requiere dos sitios de unión para la actividad. Las dianas AvrBs3 contienen dos secuencias de reconocimiento idénticas yuxtapuestas con los extremos 3' proximales y separadas por ADN "espaciador" que contiene 15, 18, 21 y 24 pb (SEQ ID NO: 167, 170, 173 y 176, tabla 7). Además, las construcciones (SEQ ID NO: 416-419) se ensayaron en una diana que tiene únicamente, un único sitio de reconocimiento AvrBs3 (SEQ ID NO: 224). Los datos resumidos en la figura 20 muestran secuencias del conector de una fracción de construcciones de ColE7 que son activas en dianas que tienen dos sitios de reconocimiento AvrBs3 o únicamente un sitio de reconocimiento AvrBs3.
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un monómero de TALEN compacta que comprende:
(i) Un armazón de TALE central que comprende regiones de dipéptido variable de repetición (RVD) que tiene especificidad de unión a ADN en una secuencia diana de ADN bicatenario específica de interés;
(ii) Al menos un dominio catalítico de I-TevI que puede escindir ADN adyacente a dicha secuencia diana de ADN bicatenario de interés cuando se fusiona al extremo C o N de dicho armazón de TALE central de (i);
en el que dicho monómero de TALEN compacta se une a dicha secuencia de ADN diana y escinde ADN bicatenario.
2. Una TALEN compacta de la reivindicación 1, en la que dicho monómero de TALEN compacta escinde ADN bicatenario a un distancia 5' o 3' de 1-25 pares de bases de la secuencia diana de ADN bicatenario específica de interés.
3. Un monómero de TALEN compacta de la reivindicación 1 o 2, que comprende además un conector peptídico para fusionar dicho dominio catalítico de (ii) con dicho armazón de TALE central de (i).
4. Un monómero de TALEN compacta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho dominio catalítico se fusiona al dominio del extremo C de dicho armazón de TALE central.
5. Un monómero de TALEN compacta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho dominio catalítico se fusiona al dominio del extremo N de dicho armazón de TALE central.
6. Un monómero de TALEN compacta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una secuencia proteínica que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 90 %, de nuevo más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias proteínicas seleccionadas del grupo de la SEQ ID NO: 426-432.
7. Un monómero de TALEN compacta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicha secuencia de conector peptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 67-104 y de la SEQ ID NO: 372 a la SEQ ID NO: 415.
8. Un polinucleótido recombinante que codifica una TALEN compacta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un vector que comprende un polinucleótido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende una TALEN compacta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicación 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente activo.
11. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido recombinante de la reivindicación 8.
12. Un animal transgénico no humano que comprende un polinucleótido recombinante de la reivindicación 8.
13. Una planta transgénica que comprende un polinucleótido recombinante de la reivindicación 8.
14. Un kit que comprende un monero de TALEN compacta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 e instrucciones para su uso en la potenciación de la eficacia de procesamiento de ADN de una secuencia diana de ADN bicatenario única de interés.
15. Un método para abordar y escindir un ADN bicatenario, que comprende:
(a) Seleccionar una secuencia diana de ADN de interés en una hebra de un ADN bicatenario;
(b) Proporcionar un monómero de TALEN compacta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; (c) Poner en contacto dicho ADN bicatenario con dicho monómero de modo que dicho monómero de TALEN compacta escinda dicho ADN bicatenario.
16. Un método para insertar in vitro o ex vivo un transgén en una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de un locus genómico de una célula o tejido, en el que se introduce al menos un monómero de TALEN compacta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en dicha célula o tejido, y en el que el método no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos.
17. Un método para insertar un transgén en una secuencia diana de ADN bicatenario única específica de un locus genómico de un animal no humano, en el que se introduce al menos un monómero de TALEN compacta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en dicho animal no humano, en el que el método no es un método de tratamiento del organismo animal.
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