JP7286796B2

JP7286796B2 - マイクロｒｎａ適合ｓｈｒｎａ（ｓｈｒｎａｍｉｒ）を含む遺伝子改変免疫細胞

Info

Publication number: JP7286796B2
Application number: JP2021559084A
Authority: JP
Inventors: マーティン，アーロン; イー．チャタートン，ジョン; ブレンダピレス，ミシェル
Original assignee: プレシジョンバイオサイエンシズ，インク．
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2023-06-05
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: US20220041987A1; MX2021012110A; CN113993999B; IL299249B2; JP7516617B2; EP4332115A3; WO2020206248A1; KR20240122580A; CN113993999A; US11851680B2; US11186822B2; AU2020253538A1; IL304624A; IL299249A; US20210254002A1; EP3947682B1; JP2022526590A; US20230279349A1; IL286896A; US20240084252A1

Description

本発明は、腫瘍学、がん免疫療法、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、特定の標的遺伝子の安定なノックダウンを可能にするマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）分子を含む遺伝子改変免疫細胞に関する。本発明はさらに、対象における内因性タンパク質の発現を低下させ、がんを含む疾患を治療するための、このような遺伝子改変免疫細胞の使用に関する。

ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年４月３日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＰＢＩＯ－０３７ＷＯ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿４－２０と名付けられ、サイズが５８，９１１バイトである。

Ｔ細胞養子免疫療法は、がん治療のための有望なアプローチである。本明細書に開示される免疫療法治療方法は、特定の腫瘍関連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変された単離ヒトＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、抗原特異性をＴ細胞に移植するためのキメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体の発現を含み得る。外因性Ｔ細胞受容体とは対照的に、キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体の可変ドメインからそれらの特異性を得る。したがって、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲＴ細胞）は、主要組織適合遺伝子複合体非拘束性様式で腫瘍免疫反応性を誘導する。Ｔ細胞養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、進行性神経膠腫、卵巣がん、中皮腫、黒色腫、前立腺がん、膵臓がんなどを含む多くのがんの臨床療法として利用されている。

がん治療としての潜在的有用性にもかかわらず、ＣＡＲＴ細胞による養子免疫療法は、部分的には、細胞表面上の内因性Ｔ細胞受容体の発現によって制限されてきた。内因性Ｔ細胞受容体を発現するＣＡＲＴ細胞は、同種異系患者への投与後に主要組織適合抗原および副組織適合抗原を認識し得、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症をもたらし得る。結果として、臨床試験は、患者のＴ細胞を単離し、キメラ抗原受容体を組み込むように遺伝子改変し、次いで同じ患者に再注入する自己ＣＡＲＴ細胞の使用に主に焦点を当ててきた。自己アプローチは、投与されたＣＡＲＴ細胞に免疫寛容を提供するが、このアプローチは、患者のがんが診断された後に患者特異的ＣＡＲＴ細胞を作製するのに必要な時間および費用の両方によって制約される。

したがって、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の発現が低下しているか、または検出可能な細胞表面発現を有さず、投与時にＧＶＨＤを発症しない、第三者健常ドナー由来のＴ細胞を使用して調製された「既製の」ＣＡＲＴ細胞を開発することが有利であると思われる。このような製品は、診断の前に作製および検証することができ、必要に応じてすぐに患者に利用可能にすることができる。したがって、ＧＶＨＤの発生を防止するために、内因性Ｔ細胞受容体を欠く同種異系ＣＡＲＴ細胞の開発が必要とされている。

この目的のために、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質発現の発現を完全にノックアウトするために、ベータ－２ミクログロブリン遺伝子に特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼが生成されている（例えば、特許文献１を参照されたい）。Ｂ２Ｍは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の成分であり、Ｂ２Ｍが存在しなければこの分子は細胞表面に構築されない。したがって、Ｂ２Ｍのノックアウトは、ＣＡＲＴ細胞を同種異系患者に投与した場合にＧＶＨＤを軽減するはずの、ＭＨＣクラスＩ分子を排除するための手段である。

しかしながら、ＣＡＲＴ細胞の細胞表面上のＢ２ＭおよびＭＨＣクラスＩ分子発現を完全に排除した結果により、ＣＡＲＴ細胞は、それらを非自己と見なすナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による標的化をより受けやすくなる。この現象を考慮して、Ｂ２Ｍの不完全なノックダウンを生じるための、ＣＡＲＴ細胞に対するノックダウンアプローチが開発された（例えば、特許文献２を参照されたい）。本質的に、Ｂ２Ｍ標的ｓｈＲＮＡコード配列を含むカセットが、ヌクレアーゼ媒介標的挿入によってＴ細胞のＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に導入された。ｓｈＲＮＡコード配列は、ＣＡＲコード配列も含むカセットに含まれ、ＴＣＲ陰性、ＣＡＲ陽性であり、細胞表面Ｂ２Ｍの部分的ノックダウンを有するＣＡＲＴ細胞の生成を可能にした。このプロジェクトのデータは、これらのＣＡＲＴ細胞が実際に、Ｂ２Ｍの完全なノックアウトを示したＣＡＲＴ細胞よりもＮＫ細胞による殺滅を受けにくいことを実証した。

国際公開第２０１７／１１２８５９号パンフレット国際公開第２０１８／２０８８３７号パンフレット

しかしながら、本明細書に記載されるように、さらなる実験は、ｓｈＲＮＡコード配列を含むカセットが安定ではなく、Ｂ２Ｍノックダウンが一過性であることを示した。最終的に、細胞はゲノムからｓｈＲＮＡコード配列を除去し、Ｂ２Ｍ発現の回復を引き起こした。したがって、Ｂ２Ｍなどの内因性タンパク質の安定なノックダウンを維持することができるＣＡＲＴ細胞の作製が依然として必要とされている。当技術分野におけるこの問題に対する答えの探求に際して、免疫細胞において目的のタンパク質のさまざまな程度の遺伝子ノックダウンを生じさせるために使用できる技術が本明細書において発見された。

本発明は、標的タンパク質の発現を低下させるマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）を発現する遺伝子改変免疫細胞（およびその集団）を提供する。標的タンパク質の発現をノックダウンするためのｓｈＲＮＡｍｉＲの使用は、タンパク質発現の安定なノックダウンを可能にし、これは、ノックアウトではなくノックダウンが好ましい標的タンパク質に理想的である。例えば、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）標的ｓｈＲＮＡｍｉＲの発現を介して、Ｂ２Ｍの発現レベルが低下した免疫細胞は、Ｂ２Ｍ発現が遺伝子不活性化によってノックアウトされた細胞よりもナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞溶解に対する感度が低い。したがって、細胞のゲノムに挿入され、内因性タンパク質の発現を低下させるために発現されるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を導入することによって、免疫細胞における内因性タンパク質の発現を低下させる方法がさらに提供される。

したがって、一態様では、本発明は、そのゲノム中にマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）をコードする核酸配列を含む遺伝子改変免疫細胞を提供する。ｓｈＲＮＡｍｉＲは、遺伝子改変免疫細胞中で発現され、遺伝子改変免疫細胞における標的タンパク質の発現を低下させる。標的タンパク質発現の低下は、ｓｈＲＮＡｍｉＲガイド配列が標的タンパク質をコードするｍＲＮＡへ結合することによって媒介される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞、またはそれに由来する細胞である。ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれに由来する細胞である。他の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変Ｂ細胞、またはそれに由来する細胞である。さまざまな実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変された単球もしくはマクロファージ、またはそれに由来する細胞である。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、５’から３’に：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステム（ｂａｓａｌｓｔｅｍ）ドメイン；（ｃ）パッセンジャー鎖；（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムドメイン；および（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ｍｉＲループドメインは、ｍｉＲ－３０ａループドメイン、ｍｉＲ－１５ループドメイン、ｍｉＲ－１６ループドメイン、ｍｉＲ－１５５ループドメイン、ｍｉＲ－２２ループドメイン、ｍｉＲ－１０３ループドメインまたはｍｉＲ－１０７ループドメインである。特定の実施形態では、ｍｉＲループドメインはｍｉＲ－３０ａループドメインである。

ある実施形態では、ｍｉＲ－３０ａループドメインが、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－３０ａループドメインは、配列番号３の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、マイクロＲＮＡ－Ｅ（ｍｉＲ－Ｅ）足場、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）足場、ｍｉＲ－１５足場、ｍｉＲ－１６足場、ｍｉＲ－１５５足場、ｍｉＲ－２２足場、ｍｉＲ－１０３足場、またはｍｉＲ－１０７足場を含む。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲはｍｉＲ－Ｅ足場を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；および／または（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。

ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号１の核酸配列を含み；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号２の核酸配列を含み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号４の核酸配列を含み；および（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号５の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲは遺伝子改変免疫細胞によって発現される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列とは異なる遺伝子内に位置する。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、またはＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内に位置する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、またはＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、配列番号５８を含む配列内のＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ遺伝子内に位置する。ある実施形態では、遺伝子は、ＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、配列番号５８を含む配列内のＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内に位置する。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸は、遺伝子中のカセット内にある。いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、同じプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｂ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。他のこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；および（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ向きである。他のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と逆向きである。いくつかのこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。いくつかのこのような実施形態では、カセットは、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかのこのような実施形態では、カセットは終結シグナルを含む。

ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列と同じ遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、遺伝子はＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子中のカセット内にある。いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、同じプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｂ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；および（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列と、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。特定のこのような実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。いくつかのこのような実施形態では、カセットはプロモータを含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列はプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、カセットは終結シグナルを含む。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、同じ遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、遺伝子はＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子中のカセット内にある。いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、同じプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｄ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。他のこのような実施形態では、イントロン配列は、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、イントロン配列内に配置される。いくつかのこのような実施形態では、カセットは、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかのこのような実施形態では、カセットは終結シグナルを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

上記のいくつかの実施形態では、イントロン配列は合成イントロン配列である。ある実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９の核酸配列を含む。

上記のいくつかの実施形態では、終結シグナルはポリＡ配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終結シグナルである。ある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８の核酸配列を含む。ある実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは配列番号７１の核酸配列を含む。

上記のいくつかの実施形態では、プロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、プロモータは、配列番号６７の核酸配列を含む。

上記のいくつかの実施形態では、２Ａ配列は、配列番号７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。特定の実施形態では、２Ａ配列は、配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。

上記のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）配列番号７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）配列番号６７の核酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、配列番号６８の核酸配列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、配列番号７４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置されているカセットを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、配列番号７４の核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置されているカセットを含む。

上記のいくつかの実施形態では、カセットは、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上の核酸を含む。ある実施形態では、２つ以上の核酸は同じｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の核酸は、同じ標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。他の実施形態では、２つ以上の核酸は、異なる標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする。ある実施形態では、カセットは、本明細書に記載の異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上の核酸を含むことができる。特定の実施形態では、カセットは、Ｂ２Ｍの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、およびＣＤ５２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、同じ遺伝子に位置し、異なるプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結された、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。他のこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ向きである。他のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と逆向きである。あるこのような実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。他の実施形態では、第１のプロモータと第２のプロモータとは異なる。いくつかのこのような実施形態では、カセットは１つまたは複数の終結シグナルを含む。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、異なるプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。他のこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むカセットを含む。あるこのような実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。他のこのような実施形態では、第１のプロモータと第２のプロモータとは異なる。いくつかのこのような実施形態では、カセットは１つまたは複数の終結シグナルを含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。いくつかのこのような実施形態では、カセットは、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲの転写を終結させることができる第１の終結シグナル、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることができる第２の終結シグナルを含む。他のこのような実施形態では、カセットは、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることができる第１の終結シグナル、およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲの転写を終結させることができる第２の終結シグナルを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

上記のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の終結シグナルは、ポリＡ配列またはＢＧＨ終結シグナルである。

上記のいくつかの実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルと同一である。いくつかのこのような実施形態では、第１の終結シグナルおよび第２の終結シグナルは、ポリＡ配列またはＢＧＨ終結シグナルである。

上記のいくつかの実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルとは異なる。いくつかの実施形態では、第１の終結シグナルはポリＡ配列であり、第２の終結シグナルはＢＧＨ終結シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の終結シグナルはＢＧＨ終結シグナルであり、第２の終結シグナルはポリＡ配列である。

上記のいくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。ある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。ある実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルが配列番号７１の核酸配列を含む。

上記のいくつかの実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。いくつかのこのような実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは、ＪｅＴプロモータまたはＥＦ１アルファコアプロモータである。

上記のいくつかの実施形態では、第１のプロモータは第２のプロモータとは異なる。ある実施形態では、第１のプロモータはＪｅＴプロモータであり、第２のプロモータはＥＦ１アルファコアプロモータである。ある実施形態では、第１のプロモータはＥＦ１アルファコアプロモータであり、第２のプロモータはＪｅＴプロモータである。

上記のある実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列番号６７の核酸配列を含む。ある実施形態では、ＥＦ１アルファコアプロモータは、配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＦ１アルファコアプロモータは、配列番号７２の核酸配列を含む。

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）任意選択的に、配列番号７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が、配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）配列番号６７の核酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）任意選択的に、配列番号７０の核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）配列番号７２の核酸配列を含む第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番号７１の核酸配列を含む第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、配列番号７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置されているカセットを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、配列番号７５の核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置されているカセットを含む。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＳ１、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＤ５２、ＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子、ＣＤ７、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、核内受容体サブファミリー２グループＦメンバー６（ＮＲ２Ｆ６）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、またはＣ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）である。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はベータ－２ミクログロブリンである。いくつかのこのような実施形態では、ベータ－２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の発現は、対照細胞と比較して、細胞表面上で少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞と比較して同種異系性が低下している。

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１８の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号１１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１２の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号１３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１４の核酸配列を含む；または（ｆ）パッセンジャー鎖が配列番号１５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１６の核酸配列を含む。あるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号１７の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号１８の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号４６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号４６の配列を含む。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＳ１である。いくつかのこのような実施形態では、ＣＳ１の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する。さらなるこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞と比較して、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞によるフラトリサイドを受けにくい。

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号２１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２２の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２４の核酸配列を含む；または（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２６の核酸配列を含む。あるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号２５の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号２６の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは配列番号５０の配列を含む。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかのこのような実施形態では、ＴＧＦＢＲ２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなる実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞と比較して、トランスフォーミング増殖因子Ｂ１（ＴＧＦＢ１）による免疫抑制を受けにくい。

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号２７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２８の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３０の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３２の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号３３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３４の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号３５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３６の核酸配列を含む。あるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号３１の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号３２の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５３の配列を含む。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＢＬ－Ｂである。いくつかのこのような実施形態では、ＣＢＬ－Ｂの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比較して、下流シグナル伝達タンパク質の分解によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の抑制を受けにくい。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＤ５２である。いくつかのこのような実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなる実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ５２抗体誘導細胞死を受けにくい。

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３８の核酸配列を含む；または（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号３９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号４０の核酸配列を含む。あるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号３８の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５６の配列を含む。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＤＣＫである。いくつかのこのような実施形態では、ＤＣＫの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなるこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、細胞増殖に対するプリンヌクレオシド類似体（例えば、フルダラビン）の影響を受けにくい。

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号７７の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７８の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号７９の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号８０の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８１の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号８２の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８３の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号８４の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８５の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号７６の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号７７の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号８６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号８６の配列を含む。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＧＲである。いくつかのこのような実施形態では、ＧＲの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなるこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、増殖の低下などのグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）の影響を受けにくい。

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号９１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９２の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号９３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９４の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９６の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号９７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９８の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号９９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１００の核酸配列を含む；（ｆ）パッセンジャー鎖が配列番号１０１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０２の核酸配列を含む；（ｇ）パッセンジャー鎖が配列番号１０３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０４の核酸配列を含む；（ｈ）パッセンジャー鎖が配列番号１０５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０６の核酸配列を含む；または（ｉ）パッセンジャー鎖が配列番号１０７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０８の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号９５の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号９６の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号１１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号１１１の配列を含む。

別の態様では、本発明は、免疫細胞における内因性タンパク質の発現を低下させる方法であって、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を免疫細胞に導入して、鋳型核酸が免疫細胞のゲノムに挿入されることを含む、方法を提供する。ｓｈＲＮＡｍｉＲは、免疫細胞中で発現され、免疫細胞における内因性標的タンパク質の発現を低下させる。標的タンパク質発現の低下は、ｓｈＲＮＡｍｉＲガイド配列が標的タンパク質をコードするｍＲＮＡへ結合することによって媒介される。

本方法のいくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞またはそれに由来する細胞である。ある実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはそれに由来する細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞またはそれに由来する細胞である。さまざまな実施形態では、免疫細胞は、単球もしくはマクロファージ、またはそれに由来する細胞である。

上記方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ランダムな組み込みによって免疫細胞のゲノム内に挿入される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）、例えばレンチウイルスベクター（すなわち、組換えレンチウイルス）を使用して免疫細胞に導入される。

本方法のいくつかの実施形態では、免疫細胞はＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する。

いくつかの実施形態では、本方法は、免疫細胞のゲノム中の認識配列に特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。操作されたヌクレアーゼは、免疫細胞において発現され、認識配列に切断部位を生成する。ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸は、切断部位において免疫細胞のゲノム内に挿入される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、認識配列に隣接する配列と相同性を有する相同アームに隣接し、鋳型核酸は、相同組換えによって切断部位に挿入される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を使用して免疫細胞に導入される。いくつかのこのような実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクター（すなわち、組換えＡＡＶ）である。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６の血清型を有する。本方法のいくつかのこのような実施形態では、認識配列は標的遺伝子内にある。本方法のいくつかのこのような実施形態では、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現は、免疫細胞において破壊される。本方法のあるこのような実施形態では、標的遺伝子がＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子であり、免疫細胞が内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の検出可能な細胞表面発現を有さない。本方法のいくつかのこのような実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬである。本方法の特定のこのような実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼである。本方法のあるこのような実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸は、ｍＲＮＡを使用して導入される。

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸が導入される免疫細胞は、そのゲノム中に、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列をさらに含む。本方法のある実施形態では、鋳型核酸が導入される免疫細胞は、そのゲノム中に、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸が、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列をさらに含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲが免疫細胞によって発現される。いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、免疫細胞中で同じプロモータに作動可能に連結される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｂ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法の他のこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列および；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ向きである。本方法の他のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と逆向きである。本方法のいくつかのこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。本方法のあるこのような実施形態では、鋳型核酸はプロモータを含み、プロモータがＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列に作動可能に連結される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は終結シグナルを含む。

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は免疫細胞によって発現される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、免疫細胞中で同じプロモータに作動可能に連結される。本方法のあるこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｂ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法の他のこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；および（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列と、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列とは、２Ａ配列またはＩＲＥＳ配列によって分離される。本方法のあるこのような実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸はプロモータを含み、プロモータがＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列に作動可能に連結される。本方法のあるこのような実施形態では、鋳型核酸は終結シグナルを含む。

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲおよびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は免疫細胞によって発現される。本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、同じプロモータに作動可能に連結される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｄ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。本方法の他のこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。本方法のあるこのような実施形態では、鋳型核酸は終結シグナルを含む。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列、および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている。

本法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている。

上記方法のいくつかの実施形態では、イントロン配列は合成イントロン配列である。本方法のある実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９の核酸配列を含む。

上記方法のいくつかの実施形態では、終結シグナルはポリＡ配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終結シグナルである。本方法のある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８の核酸配列を含む。本方法のある実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは配列番号７１の核酸配列を含む。

上記方法のある実施形態では、プロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、プロモータは配列番号６７の核酸配列を含む。

上記方法のある実施形態では、２Ａ配列は、配列番号７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。本方法の特定の実施形態では、２Ａ配列は、配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。

上記方法のある実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

上記方法のある実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。本方法の特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）配列番号７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている。

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７の核酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；ならびに（ｅ）任意選択的に、配列番号６８の核酸配列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている。

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号７４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に挿入される。本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号７４の核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に挿入される。

上記方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上の核酸を含む。本方法のある実施形態では、２つ以上の核酸は同じｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。本方法のいくつかの実施形態では、２つ以上の核酸は、同じ標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。本方法の他の実施形態では、２つ以上の核酸は、異なる標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする。本方法のある実施形態では、鋳型核酸は、本明細書に記載の異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上の核酸を含むことができる。本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、Ｂ２Ｍの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、およびＣＤ５２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含むことができる。

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、免疫細胞中で異なるプロモータに作動可能に連結される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結されたＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結されたｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法の他のこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結されたｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結されたＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ向きである。本方法の他のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と逆向きである。本方法の特定のこのような実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。本方法の他のこのような実施形態では、第１のプロモータと第２のプロモータとは異なる。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、１つまたは複数の終結シグナルを含む。

上記方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、免疫細胞中で異なるプロモータに作動可能に連結される。本方法の特定のこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。本方法の他のこのような実施形態では、第１のプロモータと第２のプロモータとは異なる。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、１つまたは複数の終結シグナルを含む。

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。本方法のいくつかの実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。本方法のいくつかの実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲの転写を終結させることができる第１の終結シグナル、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることができる第２の終結シグナルを含む。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることができる第１の終結シグナル、およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲの転写を終結させることができる第２の終結シグナルを含む。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

上記の方法のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の終結シグナルは、ポリＡ配列またはＢＧＨ終結シグナルである。

上記方法のいくつかの実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルと同一である。本方法の他の実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルとは異なる。本方法のある実施形態では、第１の終結シグナルはポリＡ配列であり、第２の終結シグナルはＢＧＨ終結シグナルである。本方法のある実施形態では、第１の終結シグナルはＢＧＨ終結シグナルであり、第２の終結シグナルはｐｏｌｙＡ配列である。

上記方法のある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８の核酸配列を含む。本方法のある実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは配列番号７１の核酸配列を含む。

上記方法のいくつかの実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。本方法の他の実施形態では、第１のプロモータは第２のプロモータとは異なる。本方法のある実施形態では、第１のプロモータはＪｅＴプロモータであり、第２のプロモータはＥＦ１アルファコアプロモータである。本方法のある実施形態では、第１のプロモータはＥＦ１アルファコアプロモータであり、第２のプロモータはＪｅＴプロモータである。

上記方法のある実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列番号６７の核酸配列を含む。本方法のある実施形態では、ＥＦ１アルファコアプロモータは、配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＥＦ１アルファコアプロモータは、配列番号７２の核酸配列を含む。

上記方法のいくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

上記方法のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。本方法の特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。

本方法の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）任意選択的に、配列番号７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７の核酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）任意選択的に、配列番号７０の核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）配列番号７２の核酸配列を含む第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番号７１の核酸配列を含む第２の終結シグナル；を含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に挿入される。本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸が配列番号７５の核酸配列を含み、カセットがＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノムに挿入される。

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、５’から３’に：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン；（ｃ）パッセンジャー鎖；（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムドメイン；および（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメインを含む。

本方法のいくつかの実施形態では、ｍｉＲループドメインは、ｍｉＲ－３０ａループドメイン、ｍｉＲ－１５ループドメイン、ｍｉＲ－１６ループドメイン、ｍｉＲ－１５５ループドメイン、ｍｉＲ－２２ループドメイン、ｍｉＲ－１０３ループドメインまたはｍｉＲ－１０７ループドメインである。本方法の特定の実施形態では、ｍｉＲループドメインはｍｉＲ－３０ａループドメインである。

本方法のある実施形態では、ｍｉＲ－３０ａループドメインが、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ｍｉＲ－３０ａループドメインは、配列番号３の核酸配列を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、マイクロＲＮＡ－Ｅ（ｍｉＲ－Ｅ）足場、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）足場、ｍｉＲ－１５足場、ｍｉＲ－１６足場、ｍｉＲ－１５５足場、ｍｉＲ－２２足場、ｍｉＲ－１０３足場、またはｍｉＲ－１０７足場を含む。本方法のある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲはｍｉＲ－Ｅ足場を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；および／または（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。

本方法のある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号１の核酸配列を含み；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号２の核酸配列を含み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号４の核酸配列を含み；および（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号５の核酸配列を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＳ１、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＤ５２、ＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子、ＣＤ７、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、核内受容体サブファミリー２グループＦメンバー６（ＮＲ２Ｆ６）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、またはＣ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）である。

上記方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はベータ－２ミクログロブリンである。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ベータ－２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の発現は細胞表面において、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のいくつかのこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比較して同種異系性が低下している。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１８の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号１１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１２の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号１３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１４の核酸配列を含む；または（ｆ）パッセンジャー鎖が配列番号１５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１６の核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号１７の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号１８の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号４６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号４６の配列を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＳ１である。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ＣＳ１の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のいくつかのこのような実施形態では、免疫細胞は、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比較して、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する免疫細胞によるフラトリサイドを受けにくい。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号２１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２２の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２４の核酸配列を含む；または（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２６の核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号２５の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号２６の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは配列番号５０の配列を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＴＧＦＢＲ２である。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ＴＧＦＢＲ２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比較して、トランスフォーミング増殖因子Ｂ１（ＴＧＦＢ１）による免疫抑制を受けにくい。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号２７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２８の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３０の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３２の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号３３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３４の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号３５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３６の核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号３１の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号３２の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５３の配列を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＢＬ－Ｂである。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ＣＢＬ－Ｂの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比較して、下流シグナル伝達タンパク質の分解によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の抑制を受けにくい。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＤ５２である。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ５２抗体誘導細胞死を受けにくい。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３８の核酸配列を含む；または（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号３９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号４０の核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号３８の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５６の配列を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＤＣＫである。いくつかのこのような実施形態では、ＤＣＫの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、細胞増殖に対するプリンヌクレオシド類似体（例えば、フルダラビン）の影響を受けにくい。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号７７の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７８の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号７９の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号８０の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８１の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号８２の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８３の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号８４の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８５の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号７６の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号７７の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号８６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号８６の配列を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＧＲである。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ＧＲの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、増殖の低下などのグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）の影響を受けにくい。

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号９１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９２の核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号９３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９４の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９６の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号９７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９８の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号９９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１００の核酸配列を含む；（ｆ）パッセンジャー鎖が配列番号１０１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０２の核酸配列を含む；（ｇ）パッセンジャー鎖が配列番号１０３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０４の核酸配列を含む；（ｈ）パッセンジャー鎖が配列番号１０５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０６の核酸配列を含む；または（ｉ）パッセンジャー鎖が配列番号１０７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０８の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号９５の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号９６の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号１１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号１１１の配列を含む。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はベータ－２ミクログロブリンであり、本方法によって作製された免疫細胞は、ベータ－２ミクログロブリンおよび／またはＭＨＣクラスＩタンパク質の細胞表面発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＳ１であり、本方法によって作製された免疫細胞はＣＳ１の細胞表面発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＴＧＦＲＢ２であり、本方法によって作製された免疫細胞は、ＴＧＦＢＲ２の発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＢＬ－Ｂであり、本方法によって作製された免疫細胞はＣＢＬ－Ｂの発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＤ５２であり、本方法によって作製された免疫細胞は、ＣＤ５２の細胞表面発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＤＣＫであり、本方法によって作製された免疫細胞は、ＤＣＫの発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＧＲであり、本方法によって作製された免疫細胞はＧＲの発現が低下している。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の複数の遺伝子改変免疫細胞、または複数の免疫細胞を含む細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大１００％が、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞、または本明細書に記載の免疫細胞である。

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載の複数の遺伝子改変免疫細胞、または本明細書に記載の複数の免疫細胞とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の細胞の集団を含む。

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象において疾患を治療するための免疫療法の方法であって、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、それを必要とする対象においてがんを治療するための免疫療法であって、遺伝子改変免疫細胞または免疫細胞が、遺伝子改変ヒトＴ細胞もしくはそれに由来する細胞、または遺伝子改変ＮＫ細胞もしくはそれに由来する細胞であり、遺伝子改変免疫細胞または免疫細胞が、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲが、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む免疫療法である。本方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞または免疫細胞は、不活性化ＴＣＲアルファ遺伝子または不活性化ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子を含む。本方法のさらなる実施形態では、遺伝子改変免疫細胞または免疫細胞は、内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の検出可能な細胞表面発現を有さない。本方法のいくつかの実施形態では、がんは、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫および白血病のがんからなる群から選択される。本方法のある実施形態では、がんは、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒色腫、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫からなる群から選択される。本方法の特定の実施形態では、Ｂ細胞起源のがんは、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される。

本方法の特定の実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてがんなどの疾患を治療する方法であって、内因性デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列をそのゲノム中に含む本明細書に記載の任意の遺伝子改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞またはＮＫ細胞）の集団の治療有効量を、プリンヌクレオシドの投与前、投与中、または投与後に対象に投与することを含む方法を提供する。ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＤＣＫ発現の低下は、遺伝子改変免疫細胞の増殖またはインビボ持続性に対するプリンヌクレオシドの効果を低下させる。

本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞の集団およびプリンヌクレオシドは、プリンヌクレオシドが投与されるとき、またはプリンヌクレオシドが有効レベルで対象中に存在する間に、遺伝子改変免疫細胞が対象中に存在する（すなわち、宿主によって除去されていない）ように投与される。上記方法のいくつかの実施形態では、プリンヌクレオシドはフルダラビンである。本方法のいくつかのこのような実施形態では、フルダラビンは、免疫療法のためのリンパ球枯渇レジメンの一部として、単独で、または別の化学療法化合物と組み合わせて投与される。

本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、標的がん細胞上の抗原に対して特異性を有するＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する、遺伝子改変ヒトＴ細胞または遺伝子改変ＮＫ細胞である。

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてがんなどの疾患を治療する方法であって、内因性グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列をゲノムに含む本明細書に記載の任意の遺伝子改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞またはＮＫ細胞）の集団の治療有効量を、コルチコステロイドの投与前、投与中、または投与後に対象に投与することを含む方法を提供する。ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＧＲ発現の低下は、遺伝子改変免疫細胞の増殖またはインビボ持続性に対するコルチコステロイドの効果を低下させる。

本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞の集団およびコルチコステロイドは、コルチコステロイドが投与されるとき、またはコルチコステロイドが有効レベルで対象中に存在する間に、遺伝子改変免疫細胞が対象中に存在する（すなわち、宿主によって除去されていない）ように投与される。本方法のいくつかの実施形態では、コルチコステロイドはデキサメタゾンまたはメチルプレドニゾロンである。本方法のいくつかのこのような実施形態では、コルチコステロイドは、免疫療法中のサイトカイン放出症候群を低下させるための治療の一部として、単独で、または別の化合物と組み合わせて投与される。

別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞もしくはその集団、または本明細書に記載の免疫細胞もしくはその集団を提供する。本発明はさらに、それを必要とする対象において疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞もしくはその集団、または本明細書に記載の免疫細胞もしくはその集団の使用を提供する。このような一態様では、医薬はがんの治療に有用である。

別の態様では、本発明は、疾患の治療、好ましくはがんの治療に使用するための、本明細書に記載の遺伝子改変細胞もしくはその集団、または本明細書に記載の免疫細胞もしくはその集団を提供する。

ｓｈＲＮＡ４７２の単一コピーをＣＡＲと３’から５’への頭－尾（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）配置で発現する構築物７０５６を含むＡＡＶにより形質導入されたＴ細胞上のベータ－２ミクログロブリンの発現またはＨＬＡ－Ａ、Ｂ、およびＣの発現（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子発現）を示す。対照培養物由来のｓｈＲＮＡを発現しないメガヌクレアーゼ編集細胞と比較した、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞におけるＢ２Ｍの表面レベルを示す。同じ培養物中のＣＤ３－／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団のＢ２Ｍレベルを示す。対照培養物由来のｓｈＲＮＡを発現しないメガヌクレアーゼ編集細胞と比較した、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞におけるＨＬＡ－ＡＢＣ（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子）の表面レベルを示す。同じ培養物中のＣＤ３＋／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団のＨＬＡ－ＡＢＣレベルを示す。ＡＡＶ７０５６を用いて産生された培養物におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。４日目のＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。４日目のＢ２Ｍのノックダウンを示す。７日目のＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７日目のＢ２Ｍのノックダウンを示す。１０日目のＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。１０日目のＢ２Ｍのノックダウンを示す。ＡＡＶ７２０６、ＡＡＶ７０５６またはＡＡＶ７２８２による形質導入の３日後に産生された培養物における、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。７２０６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７２０６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。７２８２－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７２８２－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。７０５６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７０５６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。ＡＡＶ７２０６、ＡＡＶ７０５６またはＡＡＶ７２８２を用いた形質導入の７日後に産生された培養物における、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。７２０６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７２０６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。７２８２－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７２８２－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。７０５６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７０５６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。ＡＡＶ７２０６、ＡＡＶ７０５６またはＡＡＶ７２８２による形質導入の１１日後に産生された培養物における、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。７２０６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７２０６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。７２８２－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７２８２－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。７０５６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。７０５６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。同種抗原特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）またはＮＫ細胞による細胞溶解に対するＣＡＲＴ細胞の感受性についての、Ｂ２Ｍのノックアウトまたはノックダウン効果を示す。Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２ＭノックダウンＣＡＲＴ細胞集団に対する、プライムされた同種抗原特異的ＣＴＬの細胞溶解活性を示す。Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２ＭノックダウンＣＡＲＴ細胞集団に対するＮＫ細胞の細胞溶解活性を示す。操作されたメガヌクレアーゼおよびＨＬＡ－Ｅポリペプチドのコード配列を含むドナー鋳型の標的挿入を用いた、Ｂ２Ｍのノックアウトを示す図である。標的挿入なしのＢ２Ｍノックアウトを示す。ＡＡＶ７３４６を使用したＢ２Ｍノックアウトおよびドナー鋳型の標的挿入を示す。Ｂ２Ｍノックアウトおよび挿入されたドナー鋳型によってコードされるＨＬＡ－Ｅの細胞表面発現によるＴ細胞集団の精製を示す。Ｂ２Ｍ陰性の細胞集団を示す。精製されたＢ２Ｍ陰性集団を示す。ＨＬＡ－Ｅ陽性である細胞集団を示す。精製されたＨＬＡ－Ｅ陽性細胞集団を示す。同種抗原プライムＣＴＬによるＣＡＲＴ細胞殺滅およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞殺滅を示す。エフェクター：標的比の漸増時の、同種抗原プライムＣＴＬによるＢ２Ｍ陽性、Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２Ｍノックアウト／ＨＬＡ－Ｅノックイン、ＣＡＲＴ細胞の殺滅を示す。エフェクター：標的比の漸増時の、Ｂ２Ｍ陽性、Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２Ｍノックアウト／ＨＬＡ－Ｅノックイン、ＣＡＲＴ細胞のＮＫ細胞殺滅を示す。ＣＡＲＴ細胞におけるＢ２ＭのｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導ノックダウンのインビボ有効性および安定性を示す。ＮＡＬＭ－６細胞を移植し、ビヒクルで処置したマウス（黒色の線で三角形を付して示す）、ＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞で処置したマウス（濃い灰色の線で丸を付して示す）、または統合されたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含むＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞で処置したマウス（薄い灰色の線で三角形を付して示す）における経時的な総フラックスの生物発光イメージングを示す。統合されたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含むＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞（薄い灰色のヒストグラムとして示される）または対照ＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞（濃い灰色のヒストグラムとして示される）のいずれかを投与した１４日後のヒトＣＤ４５＋細胞におけるＢ２Ｍ発現についてのフローサイトメトリ染色を示す。ＣＡＲＴ細胞におけるＣＳ１のｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導安定的ノックダウンを示す。ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７ｓｈＲＮＡｍｉＲの３つの候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。構築物をＡＡＶ７２１０１～７２１０３と命名し、ドナーＴ細胞の形質導入に使用した。ＢＣＭＡＣＡＲをコードするがｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物をコードしないＡＡＶによる形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。ＡＡＶ７２１０１による形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。ＡＡＶ７２１０２による形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。ＡＡＶ７２１０３による形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。ＣＡＲＴ細胞におけるＴＧＦＲＢ２のｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導安定的ノックダウンを示す。ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲの複数の候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。構築物をＡＡＶ７２１１０～７２１１４と命名し、ドナーＴ細胞の形質導入に使用した。モック形質導入後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。ＡＡＶ７２１１０による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。ＡＡＶ７２１１１による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。ＡＡＶ７２１１２による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。ＡＡＶ７２１１３による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。ＡＡＶ７２１１４による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。２つの操作されたメガヌクレアーゼを使用したＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックアウトを検出するフローサイトメトリを示す。陰性染色対照を示す。モックトランスフェクトＴ細胞を示す。ＴＧＦ１－２ｘ．５メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞を示す。ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞を示す。ＴＧＦＢ１で処理したＴＧＦＢＲ２陽性Ｔ細胞および陰性Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＭＡＤ２／３のフローサイトメトリ染色を示す。ＴＧＦＢＲ２陽性ＣＡＲＴ細胞、タンパク質発現をノックダウンするために抗ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲＴ細胞、およびＴＧＦＢＲ２発現をノックアウトするために操作されたメガヌクレアーゼで処理されたＴ細胞におけるリン酸化ＳＭＡＤ２／３のフローサイトメトリを示す。未処理対照ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞（Ａ）、ＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞（Ｂ）、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２がノックアウトされた、ＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞（Ｃ）、または７２１１２ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＴＧＦＢＲ２がノックダウンされた、ＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞（Ｄ）、におけるリン酸化ＳＭＡＤ２／３のフローサイトメトリを示す。正常なＫ５６２細胞、ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ）、またはＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ－ＴＧＦ）と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞数を示す。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦＢＲＫＤ）するか、またはｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（ＣｔｒｌＫＤ）した。ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ）、またはＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ－ＴＧＦ）と共培養した後の、経時的な標的細胞数を示す。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦＢＲＫＤ）するか、またはｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（ＣｔｒｌＫＤ）した。正常なＫ５６２細胞、ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞、およびＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞数を示す。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞、およびＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞のＣＤ４：ＣＤ８比を示す。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。正常なＵ２６６細胞、または活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＵ２６６細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞数を示す。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。Ｕ２６６細胞、または活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＵ２６６細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞数を示す。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。Ｕ２６６細胞と共培養した異なる時点での、ＣＤ４＋ＣＡＲＴ細胞の数のフローサイトメトリプロットを示す。７２１５４構築物を組み込んだＣＡＲＴ細胞を示す。７２１５５構築物を組み込んだＣＡＲＴ細胞を示す。ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質がＢ２Ｍ遺伝子にノックインされたＣＡＲＴ細胞を示す。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞変異体と１６日間共培養した後の、Ｕ２６６細胞の生細胞対死細胞のフローサイトメトリプロットを示す。Ｕ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦｂＲＫＤ）されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞との共培養を示す。Ｕ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＢ２Ｍをノックダウンするように改変（ＣｔｒｌＫＤ）されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞との共培養を示す。Ｕ２６６細胞と、操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ＴＧＦｂＲＫＯ）されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞との共培養を示す。活性ＴＧＦβ１を分泌するＵ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦｂＲＫＤ）されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞との共培養を示す。活性ＴＧＦβ１を分泌するＵ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＢ２Ｍをノックダウンするように改変（ＣｔｒｌＫＤ）されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞との共培養を示す。活性ＴＧＦβ１を分泌するＵ２６６細胞と、操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ＴＧＦｂＲＫＯ）されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞との共培養を示す。ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ５２のｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導安定的ノックダウンを示す。ＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲの複数の候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。構築物をＡＡＶ７２１２３およびＡＡＶ７２１２４と命名し、ドナーＴ細胞の形質導入に使用した。ＡＡＶ形質導入後のＣＤ３－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の染色を示す。ＡＡＶ７２１２３による形質導入の１０日後のＣＤ３－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ５２のノックダウンを示す。ＡＡＶ７２１２４による形質導入の１０日後のＣＤ３－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ５２のノックダウンを示す。Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＴ細胞におけるＢ２ＭおよびＣＤ５２についてのフローサイトメトリ染色を示す。Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲＴ集団のＣＤ５２枯渇後に回収されたＣＡＲ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。構築物７３１６１、７３１６２、７３１６３、および７３１６４の図を示す。ＪｅＴプロモータ、ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子、Ｐ２Ａ／フューリン部位、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＳＶ４０双方向性ポリＡ配列を含む構築物７３１６１を示す。ＪｅＴプロモータ、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子、ＳＶ４０双方向性ポリＡ配列、第２のＪｅＴプロモータ、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終結シグナルを含む構築物７３１６２を示す。ＪｅＴプロモータ、ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子、ＳＶ４０双方向ポリＡ配列、ＥＦ１アルファコアプロモータ、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＢＧＨ終結シグナルを含む構築物７３１６３を示す。ＪｅＴプロモータ、ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子、ＳＶ４０双方向ポリＡ配列、第２のＪｅＴプロモータ、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＢＧＨ終結シグナルを含む７３１６４構築物を示す。同定された構築物がＡＡＶによって導入され、ＴＲＡＣ遺伝子座のみに挿入されたＴ細胞（７２０６および７３１６１～７３１６４）、またはＣＡＲ遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入された細胞（ｄＫＯｄＫＩ）のＣＡＲ表現型を要約する表を示す。この表は、７２０６構築物を使用して導入されたＣＡＲと比較した場合の、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋であった細胞のパーセンテージ、ＣＡＲノックインを有したＣＤ３ノックアウト細胞のパーセンテージ、発現したＣＡＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、および各ＣＡＲのＭＦＩの比較を提供する。同定された構築物がＡＡＶによって導入され、ＴＲＡＣ遺伝子座のみに挿入されたＴ細胞（７２０６および７３１６１～７３１６４）、またはＣＡＲ遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入された細胞（ｄＫＯｄＫＩ）のＨＬＡ－ＡＢＣおよびＨＬＡ－Ｅ表現型を要約する表を示す。この表は、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団における野生型と比較したＨＬＡ－ＡＢＣ発現のパーセンテージ、野生型ゲーティングアウトによるＨＬＡ－ＡＢＣノックダウンのパーセンテージ、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団におけるＨＬＡ－Ｅを発現する細胞のパーセンテージ、このような細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現のＭＦＩ、およびＣＡＲ－集団におけるＨＬＡ－Ｅ＋であった細胞のパーセンテージを提供する。同定された構築物がＡＡＶによって導入され、ＴＲＡＣ遺伝子座のみに挿入されたＣＡＲＴ細胞（７２０６および７３１６１～７３１６４）、またはＣＡＲ遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入された細胞（ｄＫＯｄＫＩ）の特徴を要約する表を示す。２種の異なるドナー（Ｋ３２１２またはＫ２９１６）由来の同種抗原プライムＣＴＬと共培養した場合の、第１のドナー（ＨＣ６３６６）由来のＴ細胞を用いて調製したＣＤ１９ＣＡＲＴ変異体の細胞溶解を示す。Ｋ３２１２同種抗原プライムＣＴＬによるＣＡＲＴ細胞の殺滅を示す。Ｋ２９１６同種抗原プライムＣＴＬによるＣＡＲＴ細胞の殺滅を示す。１：１の比で共培養したＣＤ１９ＣＡＲＴ変異体のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞溶解を複数の時点において示す。２４時間での細胞溶解を示す。４８時間での細胞溶解を示す。１２０時間での細胞溶解を示す。ＮＡＬＭ／６白血病細胞を移植した免疫不全マウスにおけるＣＤ１９ＣＡＲＴ変異体のインビボ有効性を実証する発光測定を示す。ＣＤ１９ＣＡＲＴ変異体で処置した、ＮＡＬＭ／６白血病細胞を移植した免疫不全マウスの生存を示す。異なる濃度のフルダラビンとインキュベーションした後のＣＤ３ノックアウトＴ細胞における、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ＣＡＲ配列のノックインパーセントの変化を示す。ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞変異体と共にインキュベートしたフルダラビンの濃度に対するＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の事象／ｕＬを示す。ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まない異なるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞変異体を異なる濃度のフルダラビンで処理した後４日目の生細胞数／ｍＬを示す。ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まない異なるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞変異体を異なる濃度のフルダラビンで処理した後８日目の生細胞数／ｍＬを示す。異なる濃度のフルダラビンの存在下で、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを欠くＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（エフェクター）と共培養されたＣＤ１９発現ＨＥＫ２９３細胞（標的）の細胞溶解パーセントを示す。細胞を２：１、１：２、および１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。異なる濃度のフルダラビンの存在下で、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲ（７２１３８）を含むＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（エフェクター）と共培養されたＣＤ１９発現ＨＥＫ２９３細胞（標的）の細胞溶解パーセントを示す。細胞を２：１、１：２、および１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。異なる濃度のフルダラビンの存在下で、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲ（７２１３６）を含むＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（エフェクター）と共培養されたＣＤ１９発現ＨＥＫ２９３細胞（標的）の細胞溶解パーセントを示す。細胞を２：１、１：２、および１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。異なる濃度のデキサメタゾンとのインキュベーション後のＣＤ３ノックアウトＴ細胞における、ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ＣＡＲ配列のノックインパーセントの変化を示す。ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞変異体と共にインキュベートしたデキサメタゾンの濃度に対するＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の事象／ｕＬを示す図である。

配列の簡単な説明

配列番号１は、５’ｍｉＲ－Ｅ足場ドメインコード配列の核酸配列を示す。

配列番号２は、５’ｍｉｒ－Ｅ基底ステムドメインコード配列の核酸配列を示す。

配列番号３は、ｍｉＲ－３０ａループドメインコード配列の核酸配列を示す。

配列番号４は、３’ｍｉＲ－Ｅ基底ステムドメインコード配列の核酸配列を示す。

配列番号５は、３’ｍｉＲ－Ｅ足場ドメインコード配列の核酸配列を示す。

配列番号６は、ｓｈＲＮＡ４７２をコードする核酸配列を示す。

配列番号７は、７２８２ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８は、７２８２Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９は、７２８５Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０は、７２８５Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１１は、７２８６Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１２は、７２８６Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１３は、７２８７Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１４は、７２８７Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１５は、７２８８Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１６は、７２８８Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１７は、７２８９Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１８は、７２８９Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１９は、７２９０Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号２０は、７２９０Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号２１は、７２１０１ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号２２は、７２１０１ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号２３は、７２１０２ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を設定する。

配列番号２４は、７２１０２ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を設定する。

配列番号２５は、７２１０３ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を設定する。

配列番号２６は、７２１０３ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号２７は、７２１１０トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号２８は、７２１１０ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号２９は、７２１１１ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３０は、７２１１１ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３１は、７２１１２ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３２は、７２１１２ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３３は、７２１１３ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３４は、７２１１３ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３５は、７２１１４ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３６は、７２１１４ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３７は、７２１２３ＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３８は、７２１２３ＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号３９は、７２１２４ＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号４０は、７２１２４ＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号４１は、７２８２Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４２は、７２８５Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４３は、７２８６Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４４は、７２８７Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４５は、７２８８Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４６は、７２８９Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４７は、７２９０Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４８は、７２１０１ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号４９は、７２１０２ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５０は、７２１０３ＣＳ１ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５１は、７２１１０ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５２は、７２１１１ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５３は、７２１１２ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５４は、７２１１３ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５５は、７２１１４ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５６は、７２１２３ＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５７は、７２１２４ＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号５８は、ＴＲＣ１－２認識配列（センス）の核酸配列を示す。

配列番号５９は、ＴＲＣ１－２認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。

配列番号６０は、Ｂ２Ｍ１３－１４認識配列（センス）の核酸配列を示す。

配列番号６１は、Ｂ２Ｍ１３－１４認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。

配列番号６２は、ＴＧＦ１－２認識配列（センス）の核酸配列を示す。

配列番号６３は、ＴＧＦ１－２認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。

配列番号６４は、ＴＧＦ１－２ｘ．５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６５は、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６６は、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号６７は、ＪｅＴプロモータの核酸配列を示す。

配列番号６８は、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナルの核酸配列を示す。

配列番号６９は、合成イントロンの核酸配列を示す。

配列番号７０は、Ｐ２Ａ／フューリン部位の核酸配列を示す。

配列番号７１は、ウシ成長ホルモン終結シグナルの核酸配列を示す。

配列番号７２は、ＥＦ１アルファコアプロモータの核酸配列を示す。

配列番号７３は、シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号７４は、構築物７３１６１に含まれるカセットの核酸配列を示す。

配列番号７５は、構築物７３１６３に含まれるカセットの核酸配列を示す。

配列番号７６は、７２１３６ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号７７は、７２１３６ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号７８は、７２１３７ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号７９は、７２１３７ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８０は、７２１３８ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８１は、７２１３８ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８２は、７２１３９ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８３は、７２１３９ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８４は、７２１４０ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８５は、７２１４０ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号８６は、７２１３６ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号８７は、７２１３７ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号８８は、７２１３８ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号８９は、７２１３９ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号９０は、７２１４０ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号９１は、７２１４２ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９２は、７２１４２ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９３は、７２１４３ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９４は、７２１４３ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９５は、７２１４５ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９６は、７２１４５ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９７は、７２１４６ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９８は、７２１４６ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号９９は、７２１４８ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１００は、７２１４８ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０１は、７２１４９ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０２は、７２１４９ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０３は、７２１５０ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０４は、７２１５０ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０５は、７２１５１ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０６は、７２１５１ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０７は、７２１５２ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０８は、７２１５２ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列を示す。

配列番号１０９は、７２１４２ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１０は、７２１４３ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１１は、７２１４５ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１２は、７２１４６ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１３は、７２１４８ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１４は、７２１４９ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１５は、７２１５０ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１６は、７２１５１ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１７は、７２１５２ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

配列番号１１８は、ＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質のアミノ酸配列を示す。

配列番号１１９は、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸配列を示す。

配列番号１２０は、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２１は、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２２は、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２３は、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来の野生型Ｉ－ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

発明の詳細な説明
１．１参照および定義
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して例示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかであると思われ、本発明から逸脱するものではない。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」は、１つまたは複数を意味することができる。例えば、「ａ」細胞は、単一の細胞または多数の細胞を意味し得る。

本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「または」という単語は、「および／または」の包括的な意味で使用され、「いずれか／または」の排他的な意味では使用されない。

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して「外因性」または「異種」という用語は、純粋に合成されている、外来種に由来する、または同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成および／またはゲノム遺伝子座においてその天然の形態から実質的に改変されている配列を意味することを意図している。

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはタンパク質に関して「内因性」という用語は、細胞内に天然に含まれるかまたは細胞によって発現される配列またはタンパク質を意味することを意図している。

本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」という用語は互換的に使用され、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する、天然に存在する酵素または操作された酵素を指す。

本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用可能なヘアピンを含む人工ＲＮＡ分子を指す。

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲ」という用語は、標的遺伝子の発現を転写後に低下させる約２２ｎｔ長の内因的にコードされる成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を指す。ｍｉＲＮＡは、植物、動物、および一部のウイルスに見られ、一般に、高度に組織特異的または発達段階特異的な様式で発現される。

「ステムループ構造」は、主に一本鎖ヌクレオチドの領域（ループ部分）によって片側に連結された二本鎖（ステム部分）を形成することが知られている、または予測されるヌクレオチド領域を含む二次構造を有する核酸を指す。いくつかの場合、ループは非常に短く、それによってＤｉｃｅｒによって認識されず、Ｄｉｃｅｒ非依存性ｓｈＲＮＡ（内因性ｍｉＲ０４３１に匹敵する）をもたらし得る。用語「ヘアピン」はまた、ステムループ構造を指すために本明細書で使用される。ステムループ構造内のヌクレオチドの実際の一次配列は、二次構造が存在する限り、説明の実施にとって重要ではない。当技術分野で公知のように、二次構造は、正確な塩基対形成を必要としない。したがって、ステムは、１つまたは複数の塩基ミスマッチを含んでもよい。あるいは、塩基対形成は正確であり得る（すなわち、いかなるミスマッチも含まない）。

本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡｍｉＲ」および「マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ」という用語は、マイクロＲＮＡ足場にはめ込まれたｓｈＲＮＡ配列を指す。ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、それらが効率的なプロセシングに必要な配列に隣接するヘアピンを含むという点で、天然に存在するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ分子を模倣し、Ｄｒｏｓｈａ酵素によってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒによって切断され、その後、成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣに入ることができる。マイクロＲＮＡ足場は、天然に存在するマイクロＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、もしくはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはその変異体に由来し得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲが基づくｓｈＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ（２２ヌクレオチド長である）とは異なる長さであり、したがって、ｍｉＲＮＡ足場は、より長いまたはより短いｓｈＲＮＡ配列長に適応するために改変されなければならない。

本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ隣接配列」という用語は、マイクロＲＮＡプロセシングエレメントを含むヌクレオチド配列を指す。マイクロＲＮＡプロセシングエレメントは、一次マイクロＲＮＡまたは前駆体マイクロＲＮＡからの成熟マイクロＲＮＡの生成に寄与する最小核酸配列である。多くの場合、これらのエレメントは、マイクロＲＮＡステム－ループ構造に隣接する４０ヌクレオチド配列内に位置する。いくつかの例では、マイクロＲＮＡプロセシングエレメントは、マイクロＲＮＡステム－ループ構造に隣接する５～４，０００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列のストレッチ内に見出される。ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子に使用されるマイクロＲＮＡ隣接配列は、天然に存在するマイクロＲＮＡに隣接する天然に存在する配列であり得るか、またはその変異体であり得る。マイクロＲＮＡ隣接配列には、ｍｉＲ足場ドメインおよびｍｉＲ基底ステムドメインが含まれる。

ここに開示される組成物および方法において使用されるｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、５’から３’方向に：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン；（ｃ）パッセンジャー鎖；（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムドメイン；（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメインを含む。

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ｍｉＲ足場ドメイン」という用語は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子中のマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの５’または３’末端のいずれかに隣接することができ、天然に存在するマイクロＲＮＡ隣接配列またはその変異体に由来し得るヌクレオチド配列を指す。一般に、ｍｉＲ基底ステムドメイン配列は、ｓｈＲＮＡ配列（パッセンジャー鎖およびガイド鎖、ならびにｍｉＲループドメイン）と足場ドメインとを分離する。５’ｍｉＲ足場ドメインは、その３’末端またはその近くに制限酵素（例えば、ＩＩＳ型制限酵素）認識配列を含むことができ、３’ｍｉＲ足場ドメインは、その５’末端またはその近くに制限酵素認識配列を含むことができ、したがって、ｓｈＲＮＡ配列の挿入が容易になる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ足場ドメインの二次構造は、その実際の配列よりも重要である。

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ｍｉＲ基底ステムドメイン」という用語は、パッセンジャー：ガイド二重鎖の下のヘアピンステムの塩基を含む、パッセンジャー鎖配列およびガイド鎖配列に直接隣接する配列を指す。したがって、５’および３’ｍｉＲ基底ステムドメインは、配列が互いに（完全にまたは部分的に）相補的である。いくつかの実施形態では、５’および３’ｍｉＲ基底ステムドメインは、互いにハイブリダイズした場合に、それぞれが１つまたは２つのミスマッチ塩基対を含む２つのミスマッチバブルを形成する配列を含む。

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「パッセンジャー鎖」という用語は、ガイド配列に（完全にまたは部分的に）相補的であるｓｈＲＮＡｍｉＲの配列を指す。

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ガイド鎖」という用語は、発現の低下が望まれる標的ｍＲＮＡ配列と（完全または部分的）相補性を有するｓｈＲＮＡｍｉＲの配列を指す。

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ｍｉＲループドメイン」は、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー：ガイド二重鎖の一端における一本鎖ループ配列を指す。ｍｉＲループドメインは、天然に存在するｐｒｅ－マイクロＲＮＡループ配列またはその変異体に由来し得る。

本明細書で使用される場合、「切断する」または「切断」という用語は、標的配列内の二本鎖切断をもたらす、本明細書で「切断部位」と呼ばれる標的配列内の認識配列骨格内のホスホジエステル結合の加水分解を指す。

本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列において二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１２３）に由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して天然のＩ－ＣｒｅＩと比較して改変された、Ｉ－ＣｒｅＩの操作された変異体を指し得る。Ｉ－ＣｒｅＩのこのような改変された変異体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２００７／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに連結されている「単鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、細胞、特にヒト免疫細胞で発現された場合実質的に非毒性であり、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合、細胞生存率への有害な影響またはメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低下を観察することなく、細胞をトランスフェクトし、３７℃で維持することができる。

本明細書で使用される場合、「単鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによって連結された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、同一ではないＤＮＡ配列に結合する。したがって、単鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリンドロームまたは非パリンドローム認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「単鎖ヘテロ二量体」または「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体または単鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに連結するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有していてもよく、またはいずれの天然タンパク質にも見られない人工配列であってもよい。リンカーは、可動性であり、二次構造を欠いていてもよく、または生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい。リンカーは、限定するものではないが、米国特許第８，４４５，２５１号、同第９，３４０，７７７号、同第９，４３４，９３１号および同第１０，０４１，０５３号明細書に包含されるものを含むことができ、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６５の残基１５４～１９５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６５の残基１５４～１９５を含むアミノ酸配列を有し得る。

本明細書で使用される場合、「ＴＡＬＥＮ」という用語は、限定するものではないが、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、および酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインまたはその活性部分に融合された複数のＴＡＬドメインリピートを含むＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｔａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１８６：７５７－７６１を参照されたい（当該文献は参照によりその全体が組み込まれる）。ＴＡＬＥＮの設計に有用なヌクレアーゼドメインには、限定するものではないが、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、ＳｔｓＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、およびＡｌｗＩを含むＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに由来するものが含まれる。さらなるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレットに記載されており、当該文献は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその活性部分である。ＴＡＬドメインリピートは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体による感染過程で使用されるタンパク質のＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）ファミリーに由来し得る。ＴＡＬドメインリピートは、１２番目および１３番目に多様なアミノ酸を有する３３～３４個のアミノ酸配列である。リピート可変ジペプチド（ＲＶＤ）と呼ばれるこれらの２つの位置は非常に可変的であり、特異的ヌクレオチド認識と強い相関を示す。ＤＮＡ標的配列中の各塩基対は、ＲＶＤから生じる特異性を有する単一のＴＡＬリピートに接触される。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、１６～２２個のＴＡＬドメインリピートを含む。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断は、非特異的中央領域（すなわち、「スペーサ」）に隣接する２つのＤＮＡ認識領域（すなわち、「ハーフサイト」）を必要とする。ＴＡＬＥＮに関して「スペーサ」という用語は、ＴＡＬＥＮを構成する各モノマーによって認識および結合される２つの核酸配列を分離する核酸配列を指す。ＴＡＬドメインリピートは、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質由来の天然配列であり得るか、または所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を生成するために合理的または実験的手段によって再設計することができる（例えば、Ｂｏｃｈｅｔａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０９－１５１２およびＭｏｓｃｏｕａｎｄＢｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０１、これらはそれぞれその全体が参照により組み込まれる）。特定の配列を認識して結合するようにＴＡＬＥＮを操作する方法、ならびにＲＶＤおよびそれらの対応する標的ヌクレオチドの例については、米国特許出願公開第２０１１０１４５９４０号および国際公開第２０１０／０７９４３０号パンフレットも参照されたい。いくつかの実施形態では、各ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）モノマーは、異なるＤＮＡ配列を認識して結合するＴＡＬエフェクター配列に融合することができ、２つの認識部位が近接している場合にのみ、不活性モノマーが一緒になって機能性酵素を生成する。用語「ＴＡＬＥＮ」は、ＴＡＬＥＮスペーサ配列に隣接する上流および下流のハーフサイトに結合し、スペーサ配列内に切断部位を生成するために協調して働く、単一のＴＡＬＥＮタンパク質、あるいは、一対のＴＡＬＥＮタンパク質（すなわち、左ＴＡＬＥＮタンパク質および右ＴＡＬＥＮタンパク質）を指し得ることが理解されよう。所定のＤＮＡ遺伝子座またはスペーサ配列が与えられると、上流および下流のハーフサイトは、当技術分野で公知のいくつかのプログラム（ＫｏｒｎｅｌＬａｂｕｎ；ＴｅｓｓａＧ．Ｍｏｎｔａｇｕｅ；ＪａｍｅｓＡ．Ｇａｇｎｏｎ；ＳｕｍｍｅｒＢ．Ｔｈｙｍｅ；ＥｉｖｉｎｄＶａｌｅｎ．（２０１６）．ＣＨＯＰＣＨＯＰｖ２：ａｗｅｂｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ３９８；ＴｅｓｓａＧ．Ｍｏｎｔａｇｕｅ；ＪｏｓｅＭ．Ｃｒｕｚ；ＪａｍｅｓＡ．Ｇａｇｎｏｎ；ＧｅｏｒｇｅＭ．Ｃｈｕｒｃｈ；ＥｉｖｉｎｄＶａｌｅｎ．（２０１４）．ＣＨＯＰＣＨＯＰ：ａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ａｎｄＴＡＬＥＮｗｅｂｔｏｏｌｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４２．Ｗ４０１－Ｗ４０７）を使用して同定することができる。ＴＡＬＥＮ認識配列は、単一のＴＡＬＥＮタンパク質のＤＮＡ結合配列（すなわち、ハーフサイト）として、または代替的に、上流ハーフサイト、スペーサ配列、および下流ハーフサイトを含むＤＮＡ配列として定義され得ることも理解されよう。

本明細書で使用される場合、「コンパクトＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ－ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼの任意の部分、または米国特許出願公開第２０１３０１１７８６９号明細書（その全体が参照により組み込まれる）の表２に列挙されているエンドヌクレアーゼのいずれかに任意の方向で融合した１つまたは複数のＴＡＬドメインリピートを有するＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指し、ＭｍｅＩ、ＥｎｄＡ、Ｅｎｄ１、Ｉ－ＢａｓＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＴｗｏＩ、ＭｓｐＩ、ＭｖａＩ、ＮｕｃＡ、およびＮｕｃＭを含むがこれらに限定されない。コンパクトＴＡＬＥＮは、ＤＮＡプロセシング活性のために二量体化を必要とせず、介在するＤＮＡスペーサを有する二重標的部位の必要性を軽減する。いくつかの実施形態では、コンパクトＴＡＬＥＮは、１６～２２個のＴＡＬドメインリピートを含む。

本明細書で使用される場合、「ｍｅｇａＴＡＬ」という用語は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインおよび操作された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼを含む単鎖エンドヌクレアーゼを指す。

本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」という用語は、限定するものではないが、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、および酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィンガーヌクレアーゼの設計に有用なヌクレアーゼドメインには、限定するものではないが、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、およびＳｔｓＩ制限酵素を含むＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに由来するものが含まれる。さらなるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレットに記載されており、当該文献は参照によりその全体が組み込まれる。ジンクフィンガードメインの構造は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。１つまたは複数のジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的にＤＮＡに結合する。ジンクフィンガードメインは、天然配列であり得るか、２～１０塩基対で分離された一対の９塩基対ハーフサイトを含む長さが約１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生するように、合理的または実験的手段によって再設計されてもよい。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号明細書、および国際公開第９５／１９４３１号、同第９６／０６１６６号、同第９８／５３０５７号、同第９８／５４３１１号、同第００／２７８７８号、同第０１／６０９７０号、同第０１／８８１９７号、同第０２／０９９０８４号パンフレットを参照されたく、これらの各々はその全体が参照により組込まれる。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼなどのヌクレアーゼドメインに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断を標的化することが可能である。標的部位、ジンクフィンガータンパク質の選択、ならびにジンクフィンガーヌクレアーゼの設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５０６４４７４号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６０１８８９８７号明細書および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットに詳細に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。ジンクフィンガーの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、２～１０塩基対の「スペーサ配列」によって分離された一対の９塩基対「ハーフサイト」を含む１８ｂｐ認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は、平滑末端または可変長の５’オーバーハング（多くの場合、４塩基対）を作り出す。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼスペーサ配列に隣接する上流および下流のハーフサイトに結合し、スペーサ配列内に切断部位を生成するために協調して働く、単一のジンクフィンガータンパク質、あるいは、一対のジンクフィンガータンパク質（すなわち、左ＺＦＮタンパク質および右ＺＦＮタンパク質）を指し得ることが理解されよう。所定のＤＮＡ遺伝子座またはスペーサ配列が与えられると、上流および下流のハーフサイトは、当技術分野で公知の多くのプログラム（ＭａｎｄｅｌｌＪＧ，ＢａｒｂａｓＣＦ３ｒｄ．ＺｉｎｃＦｉｎｇｅｒＴｏｏｌｓ：ｃｕｓｔｏｍＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓｆｏｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓａｎｄｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００６Ｊｕｌ１；３４（ＷｅｂＳｅｒｖｅｒｉｓｓｕｅ）：Ｗ５１６－２３）を使用して同定することができる。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識配列は、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質のＤＮＡ結合配列（すなわち、ハーフサイト）、または代替的に、上流ハーフサイト、スペーサ配列、および下流ハーフサイトを含むＤＮＡ配列として定義され得ることも理解されよう。

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」または「ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド中の認識部位にハイブリダイズすることによって関連エンドヌクレアーゼによる核酸切断を指示する、ガイドＲＮＡと会合するＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短いパリンドロームリピート）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼまたはその変異体を指す。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはクラス２ＣＲＩＳＰＲ酵素である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはクラス２のＩＩ型酵素、例えばＣａｓ９である。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２のＶ型酵素、例えばＣｐｆ１である。ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートと、標的認識部位に相補的なガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではしばしばスペーサと呼ばれる）とを含む。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイドＲＮＡ上に存在するダイレクトリピート（ｔｒａｃｒ－メイト配列と呼ばれることもある）に（完全にまたは部分的に）相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）をさらに含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、酵素が、標的ポリヌクレオチドの一本の鎖を切断する能力を欠き、ニッカーゼとして機能して、標的ＤＮＡの単一の鎖のみを切断するように、対応する野生型酵素に対して変異させることができる。ニッカーゼとして機能するＣＲＩＳＰＲ酵素の非限定的な例としては、ＲｕｖＣＩ触媒ドメイン内にＤ１０Ａ変異を有するか、またはＨ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡもしくはＮ８６３Ａ変異を有するＣａｓ９酵素が挙げられる。所定のＤＮＡ遺伝子座が与えられると、認識配列は、当技術分野で公知のいくつかのプログラム（ＫｏｒｎｅｌＬａｂｕｎ；ＴｅｓｓａＧ．Ｍｏｎｔａｇｕｅ；ＪａｍｅｓＡ．Ｇａｇｎｏｎ；ＳｕｍｍｅｒＢ．Ｔｈｙｍｅ；ＥｉｖｉｎｄＶａｌｅｎ．（２０１６）．ＣＨＯＰＣＨＯＰｖ２：ａｗｅｂｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ３９８；ＴｅｓｓａＧ．Ｍｏｎｔａｇｕｅ；ＪｏｓｅＭ．Ｃｒｕｚ；ＪａｍｅｓＡ．Ｇａｇｎｏｎ；ＧｅｏｒｇｅＭ．Ｃｈｕｒｃｈ；ＥｉｖｉｎｄＶａｌｅｎ．（２０１４）．ＣＨＯＰＣＨＯＰ：ａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ａｎｄＴＡＬＥＮｗｅｂｔｏｏｌｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４２．Ｗ４０１－Ｗ４０７）を使用して同定することができる。

本明細書で使用される場合、「鋳型核酸」は、細胞のゲノム内の切断部位に挿入されることが望ましい核酸（すなわち、ポリヌクレオチド）を指す。

本明細書で使用される場合、タンパク質に関して「組換え」または「操作された」という用語は、タンパク質をコードする核酸およびタンパク質を発現する細胞または生物への遺伝子操作技術の適用の結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」または「操作された」という用語は、遺伝子操作技術の適用の結果として変更された核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作技術には、限定するものではないが、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術；トランスフェクション、形質転換および他の遺伝子移入技術；相同組換え；部位特異的突然変異誘発；および遺伝子融合が挙げられる。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニングおよび発現によって産生されるタンパク質は、組換えまたは操作されていると見なされない。

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する、同じタイプの遺伝子の対立遺伝子集団における最も一般的な天然対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を指す。「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野生型対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）およびポリペプチドは、野生型配列と比較して１つまたは複数の突然変異および／または置換を含む突然変異体または変異体の対立遺伝子およびポリペプチドとは区別可能である。野生型対立遺伝子またはポリペプチドは生物において正常な表現型を付与することができるが、突然変異体または変異体の対立遺伝子またはポリペプチドは、場合によっては、変更された表現型を付与し得る。野生型ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼまたは天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」という用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、および／または対象、または比較目的で使用される細胞、生物、および／または対象を指すことができる。

本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている、またはその先祖においてゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている細胞または生物を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、「遺伝子導入」という用語を包含する。

組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、参照配列（例えば、野生型配列または天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、または置換を意味する。

本明細書で使用される場合、「認識配列」または「認識部位」という用語は、ヌクレアーゼによって結合および切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離された一対の逆位９塩基対「ハーフサイト」を含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトと接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２のハーフサイトと接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’オーバーハングを生じる。「オーバーハング」または「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって生成することができる短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼおよび単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０～１３を含む。コンパクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ－ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮＮＮＧＮ配列、それに続く長さ４～１６塩基対の非特異的スペーサ、それに続くＴＡＬ－エフェクタードメインによって認識される長さ１６～２２ｂｐの第２の配列（この配列は典型的には５’Ｔ塩基を有する）を含む。コンパクトＴＡＬＥＮによる切断は、２塩基対の３’オーバーハングを生じる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの場合、認識配列は、ガイドＲＮＡが結合して切断を指示する、典型的には１６～２４塩基対の配列である。ガイド配列と認識配列との間の完全な相補性は、切断をもたらすために必ずしも必要ではない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じて、平滑末端（例えばクラス２、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる）またはオーバーハング末端（例えばクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる）を生じ得る。ＣｐｆＩＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが利用される実施形態では、ＣｐｆＩＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体による切断は、５’オーバーハングをもたらし、ある実施形態では、５ヌクレオチドの５’オーバーハングをもたらす。各ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ酵素はまた、ガイドＲＮＡに相補的な認識配列の近くにあるＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列の認識も必要とする。ＰＡＭの正確な配列、長さ要件、および標的配列からの距離は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、標的／認識配列に隣接する２～５塩基対の配列である。特定のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ酵素に対するＰＡＭ配列は当技術分野で公知であり（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号明細書を参照されたい、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる）、新規または操作されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ酵素に対するＰＡＭ配列は、ＰＡＭ枯渇アッセイなどの当技術分野で公知の方法を使用して同定することができる（例えば、Ｋａｒｖｅｌｉｓｅｔａｌ．（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ１２１－１２２：３－８を参照されたい、当該文献はその全体が本明細書に組み込まれる）。ジンクフィンガーの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、２～１０塩基対によって分離された一対の９塩基対「ハーフサイト」を含む１８ｂｐの認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は、平滑末端または可変長の５’オーバーハング（多くの場合、４塩基対）を作り出す。

本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」または「結合親和性」という用語は、ヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列または任意の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計的に有意なパーセント変化で増加または減少する場合、ヌクレアーゼは「変更された」結合親和性を有する。

本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、認識配列と呼ばれる塩基対の特定の配列においてのみ、または認識配列の特定のセットにおいてのみ、ヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ分子に結合して切断する能力を意味する。認識配列のセットは、特定の保存された位置または配列モチーフを共有するが、１つまたは複数の位置で縮重し得る。高度に特異的なヌクレアーゼは、１つのみまたはごく少数の認識配列を切断することができる。特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。

本明細書で使用される場合、「相同組換え」または「ＨＲ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ切断が、修復鋳型として相同ＤＮＡ配列を使用して修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌｅｔａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体配列または外因性核酸であり得る。

本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、２本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌｅｔａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復はエラーを起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の鋳型なしの付加または欠失を頻繁にもたらす。いくつかの例では、標的認識配列での切断が、標的認識部位においてＮＨＥＪをもたらす。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断とそれに続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を破壊する突然変異、例えばフレームシフト突然変異をコード配列に導入し得る。したがって、操作されたヌクレアーゼを使用して、細胞集団中の遺伝子を効果的にノックアウトすることができる。

本明細書で使用される場合、「破壊された」または「破壊する」または「発現を破壊する」または「標的配列を破壊すること」という用語は、遺伝子機能に干渉し、ポリペプチド／それによってコードされる発現産物の発現および／または機能を妨げる突然変異（例えばフレームシフト突然変異）の導入を指す。例えば、遺伝子のヌクレアーゼ媒介破壊は、切断型タンパク質の発現および／または野生型機能を保持しないタンパク質の発現をもたらし得る。さらに、遺伝子への鋳型核酸の導入は、コードされたタンパク質の非発現、切断型タンパク質の発現、および／または野生型機能を保持していないタンパク質の発現をもたらし得る。

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）上に抗原に対する特異性を付与または移植する操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインまたは部分、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数のシグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、抗体または抗体断片である。これに関連して、「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと、（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一部を指すことができる。抗体断片の例には、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、抗体断片から形成された多重特異性抗体、例えばヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が含まれる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒａｎｄＨｕｄｓｏｎ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：１１２６－１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合断片はまた、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場に移植することもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、特定のエピトープまたは抗原（例えば、がん細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしくは粒子などの、細胞表面に優先的に存在するエピトープまたは抗原）に対する特異性を提供する、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して結合している。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ネズミ、ヒト化、または完全ヒトである。

キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原を含むことができ（Ｐａｙｎｅｅｔａｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい）、したがって抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的化して殺滅するようにＴ細胞に指示する。このようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ぶことができ、それらの使用は本発明に包含される。キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインはまた、目的の抗原に対する天然に存在するリガンド、または目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含むことができる。

細胞内刺激ドメインは、抗原結合後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する１つまたは複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。このような細胞質シグナル伝達ドメインとしては、限定するものではないが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを挙げることができる。

細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖および／または細胞生存シグナルを伝達する１つまたは複数の細胞内共刺激ドメインを含み得る。このような細胞内共刺激ドメインは、当技術分野で公知のもののいずれかであり得、限定するものではないが、例えば、Ｎｏｖｅｌ６などの国際公開第２０１８／０６７６９７号パンフレットに開示されている共刺激ドメインを挙げることができる。共刺激ドメインのさらなる例としては、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。

キメラ抗原受容体は、ヒンジまたはスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに結合している膜貫通ドメインを含む、さらなる構造エレメントをさらに含む。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３複合体を構成するα、β、γまたはζポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃｙ受容体ＩＩＩ）のサブユニット鎖、またはＣＤ８アルファ鎖などのＣＤタンパク質のサブユニットであり得る。ある例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファドメインである。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。

ヒンジ領域は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えばＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体またはＩｇＧ１の一部を含み得る。ある例では、ヒンジ領域はＣＤ８アルファドメインであり得る。

本明細書で使用される場合、「外因性Ｔ細胞受容体」または「外因性ＴＣＲ」という用語は、その配列が免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞）のゲノムに導入されるＴＣＲを指し、ＴＣＲは内因的に発現されてもされなくてもよい。免疫細胞上の外因性ＴＣＲの発現は、特定のエピトープまたは抗原（例えば、がん細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしくは粒子の表面に優先的に存在するエピトープまたは抗原）に対する特異性を付与することができる。このような外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖を含むことができ、あるいはガンマ鎖およびデルタ鎖を含むことができる。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、目的の任意の抗原またはエピトープに対する特異性を有し得る。

本明細書で使用される場合、「ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ融合タンパク質」または「ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質」という用語は、細胞表面上でのＨＬＡ－Ｅタンパク質の発現を可能にする少なくとも１つのさらなるタンパク質に融合したＨＬＡ－Ｅタンパク質を含むタンパク質を指す。ＨＬＡ－Ｅタンパク質としては、例えば、ＨＬＡ－Ｅ－０１：０１またはＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質（例えば、配列番号１１８）を挙げることができる。ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、例えば、細胞表面上でのＨＬＡ－Ｅタンパク質の発現を可能にするベータ－２ミクログロブリンタンパク質（例えば、配列番号１１９）に融合したＨＬＡ－Ｅタンパク質を含み得る。さらなる例では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質と、例えば、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチド（例えば、配列番号１２０）および当技術分野で公知の他のものなどの提示のためにＨＬＡ－Ｅタンパク質にロードされるさらなるタンパク質との両方に融合したＨＬＡ－Ｅタンパク質を含み得る。ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質のタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば、配列番号１２１（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー）または配列番号１２２（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー）などを含むリンカーによって融合され得る。

本明細書で使用される場合、標的タンパク質（すなわち、内因的に発現されるタンパク質）に関して「発現低下」という用語は、対照細胞と比較した場合の、遺伝子改変細胞による内因性タンパク質の発現の任意の低下を指す。低下したという用語はまた、対照細胞集団と比較した場合の、本開示のｓｈＲＮＡｍｉＲによって標的化される内因性タンパク質を野生型レベルで発現する細胞の、細胞集団中のパーセンテージの低下を指すことができる。標的内因性タンパク質を完全に発現する細胞の、集団中のパーセンテージのこのような低下は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％であり得る。本開示の文脈において、「低下した」という用語は、標的または内因性タンパク質の部分的または不完全なノックダウンを包含し、ヌクレアーゼによる遺伝子不活性化によって達成されるものなどの完全なノックダウンとは区別されることが理解されよう。

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列および核酸配列の両方に関して、「同一性パーセント」、「配列同一性」、「類似性パーセンテージ」、「配列類似性」などの用語は、アライメントしたアミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大にし、同一または類似の残基またはヌクレオチドの数、残基またはヌクレオチドの総数、ならびに配列アラインメントにおけるギャップの存在および長さの関数である、配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するために、さまざまなアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴｐプログラムおよび核酸配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方とも国立生物工学情報センターを介し利用可能であり（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；ＧｉｓｈａｎｄＳｔａｔｅｓ（１９９３），ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎｅｔａｌ．（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９７），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２）；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３；ギャップオープニングペナルティ＝－１１；ギャップ拡張ペナルティ＝－１；およびスコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャップオープニングペナルティ＝５；ギャップ拡張ペナルティ＝２；マッチリワード＝１；およびミスマッチペナルティ＝－３。

本明細書で使用される場合、２つのタンパク質またはアミノ酸配列の改変に関する「に対応する」という用語は、第１のタンパク質の指定の改変が第２のタンパク質の改変と同じアミノ酸残基の置換であること、および２つのタンパク質が標準的な配列アラインメントに（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）供される場合、第１のタンパク質の改変のアミノ酸位置が第２のタンパク質の改変のアミノ酸位置に対応するか整列することを示すために使用される。したがって、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、残基ＸおよびＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、ＸおよびＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応する。

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子」または「ＴＣＲアルファ遺伝子」という用語は、Ｔ細胞受容体アルファサブユニットをコードするＴ細胞内の遺伝子座を指す。Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、再編成の前後に、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号６９５５を指し得る。再編成に続いて、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、内因性プロモータ、再編成されたＶセグメントおよびＪセグメント、内因性スプライスドナー部位、イントロン、内因性スプライスアクセプター部位、ならびにサブユニットコードエクソンを含むＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座を含む。

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体アルファ定常領域」または「ＴＣＲアルファ定常領域」という用語は、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子のコード配列を指す。ＴＣＲアルファ定常領域は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号２８７５５によって同定される野生型配列およびその機能的変異体を含む。

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子」または「ＴＣＲベータ遺伝子」という用語は、Ｔ細胞受容体ベータサブユニットをコードするＴ細胞内の遺伝子座を指す。Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号６９５７を指し得る。

本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「カセット」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである。組換え構築物は、限定するものではないが、天然には一緒に見られない調節配列およびコード配列を含む核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来し、天然に見られるものとは異なる様式で編成された調節配列およびコード配列を含み得る。このような構築物は、単独で使用されてもよく、またはベクターと併せて使用されてもよい。

本明細書で使用される場合、「ベクター」または「組換えＤＮＡベクター」という用語は、所与の宿主細胞においてポリペプチドコード配列の転写および翻訳が可能な複製システムおよび配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、限定するものではないが、プラスミドベクターおよび組換えＡＡＶベクター、または遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベクターを挙げることができる。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチドまたは核酸配列のいずれかを含む、宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントを十分に認識している。

本明細書で使用される場合、「ベクター」はウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を指すこともできる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、レトロウイルスベクター（すなわち、組換えレトロウイルス）、レンチウイルスベクター（すなわち、組換えレンチウイルス）、アデノウイルスベクター（すなわち、組換えアデノウイルス）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）（すなわち、組換えＡＡＶ）を挙げることができる。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫系（自然および／または適応）の一部であり、造血起源の任意の細胞を指す。免疫細胞の非限定的な例としては、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、巨核球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、骨髄系由来サプレッサー細胞、自然リンパ球系細胞、血小板、赤血球、胸腺細胞、白血球、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球および顆粒球が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ヒトＴ細胞」または「Ｔ細胞」または「単離ヒトＴ細胞」は、ドナー、特にヒトドナーから単離されたＴ細胞を指す。Ｔ細胞およびそれに由来する細胞には、培養で継代されていない単離Ｔ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代および維持されたＴ細胞、ならびに不死化され、細胞培養条件下で無期限に維持され得るＴ細胞が含まれる。

本明細書で使用される場合、「ヒトＮＫ細胞」または「ＮＫ細胞」は、ドナー、特にヒトドナーから単離されたＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞およびそれに由来する細胞には、培養で継代されていない単離ＮＫ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代および維持されたＮＫ細胞、ならびに不死化され、細胞培養条件下で無期限に維持され得るＮＫ細胞が含まれる。

本明細書で使用される場合、「ヒトＢ細胞」または「Ｂ細胞」は、ドナー、特にヒトドナーから単離されたＢ細胞を指す。Ｂ細胞およびそれに由来する細胞には、培養で継代されていない単離Ｔ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代および維持されたＢ細胞、ならびに不死化され、細胞培養条件下で無期限に維持され得るＢ細胞が含まれる。

本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」という用語は、遺伝子改変細胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝子変更のための出発物質と同じ遺伝子型の野生型細胞；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物を用いて（すなわち、目的の形質に公知の影響を及ぼさない構築物を用いて）形質転換された細胞；または（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変更された遺伝子型または表現型の発現を誘導する条件もしくは刺激またはさらなる遺伝子改変に曝露されていない細胞を含み得る。

本明細書で使用される場合、「治療」または「対象を治療する」という用語は、疾患を有する対象への本発明の遺伝子改変免疫細胞または遺伝子改変免疫細胞の集団の投与を指す。例えば、対象はがんなどの疾患を有することができ、治療は疾患を治療するための免疫療法を表し得る。治療の望ましい効果としては、限定するものではないが、疾患の発症または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。いくつかの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞または遺伝子改変免疫細胞の集団は、治療中に本発明の医薬組成物の形態で投与される。

「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益または望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤または組成物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重、体調および応答性に応じて変化する。特定の実施形態では、有効量の本発明の遺伝子改変免疫細胞もしくは遺伝子改変免疫細胞の集団、または本明細書に開示の医薬組成物は、対象における疾患の少なくとも１つの症状を軽減する。疾患ががんである実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の有効量は、がんの増殖もしくは転移のレベルを低下させ、がんの部分的もしくは完全な応答もしくは寛解を引き起こし、または対象におけるがんの少なくとも１つの症状を軽減する。

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、悪性の増殖または腫瘍を引き起こす異常で制御されない細胞分裂を特徴とする任意の新生物性疾患（浸潤性または転移性にかかわらず）を包含すると理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「癌腫」という用語は、上皮細胞で構成される悪性増殖を指す。

本明細書で使用される場合、「白血病」という用語は、造血器官／造血系の悪性腫瘍を指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびその前駆体の異常な増殖および発達を特徴とする。

本明細書で使用される場合、「肉腫」という用語は、胚性結合組織のような物質で構成され、一般に線維性、不均一または均一な物質に埋め込まれた密集した細胞で構成される腫瘍を指す。

本明細書で使用される場合、「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を指す。

本明細書で使用される場合、「リンパ腫」という用語は、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍の群を指す。

本明細書で使用される場合、「芽細胞腫」という用語は、前駆細胞または芽球（未成熟または胚性組織）の悪性腫瘍によって引き起こされるがんのタイプを指す。

本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等しい変数で本発明が実施され得ることを伝えることを意図している。したがって、本質的に離散的な変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しくなり得る。例として、限定するものではないが、０と２との間の値を有すると記載されている変数は、その変数が本質的に離散的である場合、０、１または２の値をとることができ、その変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、または０以上２以下の任意の他の実数値をとることができる。

２．１発明の原理
本発明は、一部には、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）分子が、内因性タンパク質の発現の安定した低下を有する遺伝子改変免疫細胞を作製するために使用することができるという発見に基づく。本明細書では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列をＴ細胞のゲノムに挿入することにより、例えば、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＣＳ１、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、グルココルチコイド（ＧＲ）、および分化抗原群５２（ＣＤ５２）の安定かつ効果的なノックダウンを含む、一連の内因性タンパク質の安定なノックダウンが提供されることが実証される。内因性タンパク質のノックダウンは、いくつかの例では、遺伝子不活性化によるノックアウトと比較して有利であり得る特性を付与し得る。例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＢ２Ｍノックダウンは、Ｂ２Ｍの完全なノックアウトを示すＣＡＲＴ細胞よりも同種異系でなく、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による殺滅を受けにくいＣＡＲＴ細胞を産生する。さらに、免疫細胞のゲノムへのｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の組み込みは、ｓｈＲＮＡ分子をコードするカセットの挿入により観察される安定性および毒性の問題を解決することが実証されている。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子が複数の内因性タンパク質の発現を低下させるために使用され得るという実証を考慮すると、本開示の組成物および方法は、免疫細胞内のＢ２Ｍタンパク質だけでなく任意の目的の内因性タンパク質の発現をさまざまな程度で安定にノックダウンするために使用することができる。

２．２マイクロＲＮＡ適応ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングは、遺伝子発現がマイクロＲＮＡなどの非コードＲＮＡによって負に調節されるプロセスを指す。負の調節は、以下の３つの可能な機序のうちの１つまたは複数により生じ得る：（１）標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制することによる、（２）転写産物の脱アデニル化および不安定化による、および（３）ｍＲＮＡの切断および分解による。ＲＮＡｉは、通常、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または内因性マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）によって誘発される。

内因性マイクロＲＮＡ分子の生成は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモータからの一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍＲＮＡ）の転写から始まる。各ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、１～６個のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含有し得る。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、約７０ヌクレオチドで構成されるヘアピンループ構造であり、各ヘアピンは、効率的なプロセシングに必要な配列に隣接している。酵素Ｄｒｏｓｈａは、ヘアピン塩基から約１１ヌクレオチドのＲＮＡを切断することによって、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡからヘアピンを遊離させる。Ｄｒｏｓｈａ切断によって生成されるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。この２ヌクレオチドのオーバーハングは、核から細胞質へのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの搬出を媒介するＥｘｐｏｒｔｉｎ－５タンパク質によって結合される。細胞質において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンは、ヘアピンの５’末端および３’末端との相互作用を介してＤｉｃｅｒによって切断される。Ｄｉｃｅｒは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンをループ領域において切断して、約２２ヌクレオチド長である不完全なｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ二重鎖を生成する。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ二重鎖（成熟ｍｉＲＮＡ）の単一の鎖は、ｍｉＲＮＡおよびそのｍＲＮＡ標的が相互作用するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。

その発見以来、ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞における遺伝子発現を抑制するための強力な遺伝子ツールとして浮上した。遺伝子ノックダウンは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを模倣し、Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされ、ＲＩＳＣに供給される合成短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現によって達成され得る。しかしながら、本明細書に記載のように、ｓｈＲＮＡは、免疫細胞におけるタンパク質発現を長期低下させることができない。対照的に、本発明のマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）分子の発現は、タンパク質発現の持続的な低下および毒性効果の低下をもたらす。ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、それらが効率的なプロセシングに必要な配列に隣接するヘアピンを含むという点でｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ分子を模倣し、Ｄｒｏｓｈａ酵素によってｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒによって切断され、その後、成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣに入ることができる。

本発明は、内因性タンパク質の存在量を減少させる、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子を発現する遺伝子改変免疫細胞を提供する。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の構造が天然に存在するマイクロＲＮＡ（またはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡもしくはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）またはその変異体の構造を模倣することができるという点で、マイクロＲＮＡ足場を含むことができる。マイクロＲＮＡ（ならびにｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）の配列は、当技術分野で公知である。本開示のｓｈＲＮＡｍｉＲのための好適なｍｉＲ足場の非限定的な例としては、ｍｉＲ－Ｅ、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）、ｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－１０３およびｍｉＲ－１０７が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の組成物および方法で使用されるｓｈＲＮＡｍｉＲは、ｍｉｒ－Ｅ足場を含む。ｍｉｒ－Ｅ足場は、ｍｉＲ－３０ａの合成由来変異体であり、その起源は国際公開第２０１４／１１７０５０号パンフレットに記載されており、当該文献は参照によりその全体が組み込まれる。

本開示のｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、５’から３’方向に以下のドメインを含み得る：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン；（ｃ）パッセンジャー鎖；（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムドメイン；および（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメイン。ｍｉＲ足場ドメインおよび基底ステムドメインは、ｍｉＲＮＡステム－ループに隣接し、本明細書では、マイクロＲＮＡプロセシングエレメント（一次マイクロＲＮＡまたは前駆体マイクロＲＮＡからの成熟マイクロＲＮＡの生成に寄与する最小核酸配列）を含むマイクロＲＮＡ隣接配列と称される。多くの場合、これらのエレメントは、マイクロＲＮＡステム－ループ構造に隣接する４０ヌクレオチド配列内に位置する。いくつかの例では、マイクロＲＮＡプロセシングエレメントは、マイクロＲＮＡステム－ループ構造に隣接する５～４，０００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列のストレッチ内に見出される。

いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ隣接配列は、約３～約４，０００ｎｔ長であり、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の５’末端および３’末端のいずれか、または両方に存在し得る。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子のマイクロＲＮＡ隣接配列の最小長は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１５０、約２００、およびその間の任意の整数である。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子のマイクロＲＮＡ隣接配列の最大長は、約２，０００、約２，１００、約２，２００、約２，３００、約２，４００、約２，５００、約２，６００、約２，７００、約２，８００、約２，９００、約３，０００、約３，１００、約３，２００、約３，３００、約３，４００、約３，５００、約３，６００、約３，７００、約３，８００、約３，９００、約４，０００、およびそれらの間の任意の整数である。

マイクロＲＮＡ隣接配列は、天然マイクロＲＮＡ隣接配列または人工マイクロＲＮＡ隣接配列であり得る。天然マイクロＲＮＡ隣接配列は、マイクロＲＮＡ配列と共に天然に存在する系内に通常含まれるヌクレオチド配列である（すなわち、これらの配列は、インビボで最小マイクロＲＮＡヘアピンを取り囲むゲノム配列内に見出される）。人工マイクロＲＮＡ隣接配列は、天然に存在する系においてマイクロＲＮＡ配列に隣接していることが見出されないヌクレオチド配列である。人工マイクロＲＮＡ隣接配列は、他のマイクロＲＮＡ配列との関連において天然に見出される隣接配列であり得る。あるいは、それらは、天然に存在する隣接配列内に見出され、天然には隣接配列として存在しないか、または天然の隣接配列として部分的にのみ存在する他のランダム核酸配列に挿入される最小のマイクロＲＮＡプロセシングエレメントから構成され得る。

いくつかの実施形態では、５’ｍｉＲ足場ドメインは、約１０～約１５０ヌクレオチド長であり、限定するものではないが、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０および約１５０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、５’ｍｉＲ足場ドメインは約１１１ヌクレオチド長である。５’ｍｉＲ足場ドメインは、ＩＩＳ型制限酵素に対する認識配列である３’配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、５’ｍｉＲ足場ドメインは、その３’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む。特定の実施形態では、５’ｍｉＲ足場ドメインは、配列番号１として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、５’ｍｉＲ足場ドメインは、配列番号１として示される配列を有する。

ｓｈＲＮＡｍｉＲの５’ｍｉＲ基底ステムドメインは約５～約３０ヌクレオチド長であり得、いくつかの実施形態では、限定するものではないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９および約３０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、５’ｍｉＲ基底ステムドメインは約２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、５’ｍｉＲ基底ステムドメインは、配列番号２として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、５’ｍｉＲ基底ステムドメインは、配列番号２として示される配列を有する。

本開示の組成物および方法のｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ステム－ループ構造を含み、ステムはハイブリダイズしたパッセンジャー鎖およびガイド鎖から構成され、ループは一本鎖である。ｍｉＲループドメインは、天然に存在するｐｒｅ－マイクロＲＮＡまたはｐｒｉ－マイクロＲＮＡループ配列またはその変異体に由来し得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲループドメインは、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）、ｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－１０３およびｍｉＲ－１０７のいずれか１つに由来するループドメインの配列を有する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲはｍｉＲ－３０ａループドメインを含み、その配列は配列番号３として示される。

ある実施形態では、ｍｉＲループドメインは約５～約３０ヌクレオチド長であり得、限定するものではないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９および約３０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ｍｉＲループドメインは約１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｍｉＲループドメインは、配列番号３として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、ｍｉＲループドメインは、配列番号３として示される配列を有する。

ｓｈＲＮＡｍｉＲの３’ｍｉＲ基底ステムドメインは約５～約３０ヌクレオチド長であり得、いくつかの実施形態では、限定するものではないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９および約３０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、３’ｍｉＲ基底ステムドメインは約１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、３’ｍｉＲ基底ステムドメインは、配列番号４として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、３’ｍｉＲ基底ステムドメインは、配列番号４として示される配列を有する。

いくつかの実施形態では、３’ｍｉＲ足場ドメインは、約５０～約１５０ヌクレオチド長であり、限定するものではないが、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０または約１５０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、３’ｍｉＲ足場ドメインは約１１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、３’ｍｉＲ足場ドメインは、配列番号５として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、３’ｍｉＲ足場ドメインは、配列番号５として示される配列を有する。

ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖は、ｍＲＮＡを標的とする配列であり、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の存在量の減少をもたらす。ガイド鎖がその標的ｍＲＮＡに結合した後、ＲＩＳＣは、標的転写物を分解するか、および／または標的転写物が翻訳のためにリボソームに取り込まれるのを防ぐ。ガイド鎖は、標的ｍＲＮＡの発現の低下をもたらすために、標的ｍＲＮＡと十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、標的ｍＲＮＡ配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％相補的である。ある実施形態では、ガイド鎖は、コード配列内の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする。ガイド鎖は、標的ｍＲＮＡ配列と１、２、３、４、５またはそれを超えるミスマッチヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、ガイド鎖は、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などの非コード領域において標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、約１５～約２５ヌクレオチド長であり、限定するものではないが、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４および約２５ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ガイド鎖は約２２ヌクレオチド長である。ｓｈＲＮＡｍｉＲが由来するｓｈＲＮＡ配列が、ほとんどの天然に存在するマイクロＲＮＡの長さである２２ヌクレオチド長未満である特定の実施形態では、追加のヌクレオチドがｓｈＲＮＡ配列に付加され、ある実施形態では、この追加のヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ内の対応する位置と相補的なものである。

ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖は、ガイド鎖配列と完全または部分的に相補的な配列である。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、約１５～約２５ヌクレオチド長であり、限定するものではないが、約１５～約２５ヌクレオチド長を含み、限定するものではないが、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４および約２５ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、パッセンジャー鎖は約２２ヌクレオチド長である。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％相補的であり得る。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と１、２、３、４、５またはそれを超えるミスマッチヌクレオチドを含み得る。しかしながら、ある実施形態では、ガイド：パッセンジャー鎖二重鎖は、いかなるミスマッチヌクレオチドも含まない。一般に、ガイド／パッセンジャー鎖配列は、それ自体の中にいかなる二次構造も形成しないように選択されるべきである。さらに、一塩基多型を含むｍＲＮＡ内の部位を標的とするガイド／パッセンジャー鎖配列の使用は避けるべきである。標的ｍＲＮＡに特異的なガイド／パッセンジャー鎖配列は、オフターゲット効果（すなわち、非標的ｍＲＮＡの発現の低下）を回避するために好ましい。

適切なｓｈＲＮＡｍｉＲガイド／パッセンジャー鎖、または他のｓｈＲＮＡｍｉＲドメインの配列の選択を助けるために、ＲＮＡ分子の予測二次構造をモデル化する当技術分野で公知の任意のプログラム、限定するものではないが、Ｍｆｏｌｄ、ＲＮＡｆｏｌｄ、およびＵＮＡＦｏｌｄなどを使用することができる。特定のｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡガイド／パッセンジャー配列の効率を予測することができる当技術分野で公知の任意のプログラム、限定するものではないが、例えば、以下に開示されているものを使用して適切なガイド／パッセンジャー鎖配列を選択することができる：Ａｇａｒｗａｌｅｔａｌ．（２０１５）ｅＬｉｆｅ４：ｅ０５００５；およびＫｎｏｔｔｅｔａｌ．（２０１４）ＭｏｌＣｅｌｌ５６（６）：７９６－８０７、これらの各文献はその全体が本明細書に組み込まれる。

２．３遺伝子改変免疫細胞
本発明は、遺伝子改変免疫細胞およびその集団、ならびにそれらを作製するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法の遺伝子改変免疫細胞はヒト免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞、またはそれに由来する細胞である。他の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはそれに由来する細胞である。さらに他の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞、またはそれに由来する細胞である。さらに他の実施形態では、免疫細胞は、単球もしくはマクロファージ細胞、またはそれに由来する細胞である。

免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。本開示のある実施形態では、当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株、ＮＫ細胞株、Ｂ細胞株、単球細胞株またはマクロファージ細胞株を使用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液単位から得られる。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞はアフェレーシスによって得られる。本発明の免疫細胞はまた、機能的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）に分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞であり得る。

本開示の組成物および方法の遺伝子改変免疫細胞は、細胞のゲノム中にｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、標的タンパク質の発現の低下をもたらす。

内因性タンパク質の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかにおいて、内因性タンパク質の発現は、対照細胞（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。当技術分野で公知の任意の方法、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット、免疫細胞化学および免疫沈降などを使用して、ｓｈＲＮＡｍｉＲによって標的化される内因性タンパク質の発現レベルを決定することができる。

集団内の細胞によってｓｈＲＮＡｍｉＲを発現させると、対照細胞の集団と比較した場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲが標的とする内因性タンパク質を完全に発現する細胞の、集団中の細胞のパーセンテージの低下をもたらし得る。このような低下は、集団中の細胞の最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％であり得る。

ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、遺伝子改変免疫細胞のゲノム、例えばカセットに存在し得る。このようなカセットは、例えば、ランダムな組み込み（例えば、レンチウイルス形質導入）、または選択された部位への標的挿入（例えば、ヌクレアーゼ媒介標的挿入によって）のいずれかによって本発明の鋳型核酸を導入することによって、ゲノムに内に挿入することができる。ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列を含むカセットは、例えば、本明細書に記載されるもの（例えば、ＣＡＲ、外因性ＴＣＲ、融合タンパク質）などの追加のタンパク質をコードする核酸配列を含むことができ、プロモータおよび終結配列などの制御配列も含み得る。ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲの発現を可能にするカセットまたは鋳型核酸内の任意の数の位置に配置することができる。いくつかの例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、別の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ、外因性ＴＣＲまたは融合タンパク質をコードする核酸配列）の終止コドンと終結シグナルとの間に配置される。他の例では、カセットまたは鋳型核酸中に存在する別の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ、外因性ＴＣＲまたは融合タンパク質をコードする核酸配列）は、導入遺伝子配列内に配置されるイントロンを含む。ここで、「配置される」とは、得られた配列が導入遺伝子の５’部分、イントロン配列および導入遺伝子の３’部分を含むように、イントロン配列が導入遺伝子配列に挿入されることを意味することを意図している。いくつかのこのような例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、このようなイントロン内に配置することができる。ここで、「配置される」とは、得られた配列がイントロン配列の５’部分、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列、およびイントロン配列の３’部分を含むように、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列がイントロン配列に挿入されることを意味することを意図している。このような場合、導入遺伝子が発現されると、ｓｈＲＮＡｍｉＲが発現され、イントロン配列が細胞によってスプライシングで切り出される。この様式で含めることができるイントロンは、天然に存在するイントロンまたは代替的に合成イントロンであり得る。本発明に有用な合成イントロンの特定の例は、配列番号６９によってコードされる。

ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中にＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、免疫細胞表面上に発現され得るＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列をさらに含むことができる。

ＣＡＲ／ＴＣＲコード核酸配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列と同じ遺伝子内に位置し得る。あるいは、ＣＡＲ／ＴＣＲコード核酸配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列とは異なる遺伝子内に位置し得る。

各コード配列は、異なるプロモータに作動可能に連結され得る。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列は、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列と同じプロモータに作動可能に連結されている。いくつかの具体例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列がすべて同じ遺伝子内に位置する場合、核酸配列の２つは第１のプロモータに作動可能に連結されており、第３の核酸配列は第２のプロモータに作動可能に連結されている。他の具体例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列がすべて同じ遺伝子内に位置する場合、核酸配列の３つすべてが同じプロモータに作動可能に連結されている。さまざまな実施形態では、核酸配列は、ゲノム内への挿入後に内因性プロモータに作動可能に連結され得る。いくつかのこのような場合、本発明のカセットまたは鋳型核酸は、コードされた配列を発現させるために外因性プロモータを必要としない場合がある。さらに、このような場合、カセットまたは鋳型核酸は、核酸が内因性プロモータに作動可能に連結されるのに必要なエレメント（例えば、スプライスアクセプター配列、２ＡまたはＩＲＥＳ配列など）を含み得る。他の実施形態では、本発明のカセットまたは鋳型核酸は、核酸配列に作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲ、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲ、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の発現を駆動する１つまたは複数の外因性プロモータを含む。

コード配列の各々は、ゲノム中に同じ向きで、または互いに異なる向きで存在し得る。例えば、１つのコード配列は二本鎖ＤＮＡのプラス鎖上にあり得、別のコード配列はマイナス鎖上にあり得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード核酸配列は、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列の３’下流にある。代替的な実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列は、ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列の５’上流にある。

ある実施形態では、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲ、ｓｈＲＮＡｍｉＲ、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列などの核酸配列は、同じプロモータに作動可能に連結され、同じ核酸分子からの２つ以上の遺伝子（すなわち、シストロン）の翻訳を可能にするために当技術分野で公知の任意のエレメントによって分離される。このような要素としては、限定するものではないが、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメント（例えば、Ｐ２Ａ／フューリン）、Ｅ２Ａエレメント、およびＦ２Ａエレメントを挙げることができる。

ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、免疫細胞をＮＫ細胞殺滅から保護する細胞表面タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの例では、核酸配列は、非古典的ＭＨＣＩタンパク質をコードする。非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質としては、限定するものではないが、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－ＧおよびＨＬＡ－Ｈを挙げることができる。特定の例では、核酸配列はＨＬＡ－Ｅタンパク質をコードする。ＨＬＡ－Ｅタンパク質の例としては、限定するものではないが、ＨＬＡ－Ｅ－０１：０１タンパク質またはＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質（例えば、配列番号１１８）が挙げられる。本発明の特定の例では、核酸配列は、非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ）と、免疫細胞の細胞表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を可能にする少なくとも１つの追加のタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする。融合タンパク質は、例えば、細胞表面上でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を可能にするベータ－２ミクログロブリンタンパク質（例えば、配列番号１１９）に融合したＭＨＣクラスＩタンパク質（ＨＬＡ－Ｅ）を含み得る。内因性ベータ－２ミクログロブリンの発現を阻害し、ベータ２ミクログロブリンを含む融合タンパク質の発現を阻害しないために、融合タンパク質中のベータ－２ミクログロブリンコード配列を、変更された配列に対してｓｈＲＮＡｍｉＲが特異性を有さないように変更することができる（例えば、コドン最適化）。さらなる例では、融合タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質と非古典的ＭＨＣによって細胞外に提示される追加のタンパク質との両方に融合した非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ）を含み得る。このような追加のタンパク質としては、例えば、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチド（例えば、配列番号１２０）を挙げることができる。融合タンパク質の個々のタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば、配列番号１２１（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー）または配列番号１２２（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー）などを含むリンカーによって融合され得る。

特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質、およびＨＬＡ－Ｇリーダーペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質である。いくつかのこのような実施形態では、ＨＬＡ－Ｅタンパク質はＨＬＡ－Ｅ－０１：０１タンパク質またはＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質であり、特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅタンパク質は配列番号１１８のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質である。いくつかのこのような実施形態では、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質は、配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチドは、配列番号１２０のアミノ酸配列を有する。さらなるこのような実施形態では、ＨＬＡ－Ｅタンパク質、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質、およびＨＬＡ－Ｇリーダータンパク質は、配列番号１２１（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー）または配列番号１２２（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー）を含むポリペプチドリンカーによって融合される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または最大少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む。一般に、本開示のＣＡＲは、少なくとも細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分とも称される標的特異的結合エレメントを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインおよび１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、本発明において有用なＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインを含む。リガンド結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数に依存する。例えば、リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲにおいてリガンド結合ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーのいくつかの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患、ならびにがん細胞に関連するものが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、がん（すなわち、腫瘍）細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガンド結合部分を操作することによって、目的のがん特異的抗原を標的とするように操作される。本開示の文脈において、「がん抗原」、「腫瘍抗原」、「がん特異的抗原」または「腫瘍特異的抗原」は、がんなどの特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原またはエピトープ、特に目的の任意の腫瘍抗原またはエピトープに特異的である。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、標的の抗原は、主要関連表面抗原、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ｂ、ＩＬ１ＲＡＰ、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＣＬＬ－１、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴ脂質、神経膠腫関連抗原、Ｂ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－ｌａ、ｐ５３、プロスタイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）－１、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）とエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシンＣのＡｌドメイン（ＴｎＣＡｌ）、および線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）；系列特異的または組織特異的抗原、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＳ１；またはウイルス特異的表面抗原、例えば、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶｇｐｌ２０など）、ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、Ｅ６もしくはＥ７腫瘍性タンパク質などのＨＰＶ特異的抗原、ラッセウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、ならびにこれらの表面マーカーの誘導体または変異体である。

いくつかの例において、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、抗体または抗体断片である。抗体断片は、例えば、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一部であり得る。抗体断片の例には、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、抗体断片から形成された多重特異性抗体、例えばヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が含まれる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒａｎｄＨｕｄｓｏｎ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：１１２６－１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合断片はまた、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場に移植することもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、特定のエピトープまたは抗原（例えば、がん細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしくは粒子などの、細胞表面に優先的に存在するエピトープまたは抗原）に対する特異性を提供する、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態である。いくつかのこのような実施形態では、ｓｃＦｖは、抗原に対する特異性を有するモノクローナル抗体由来の重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して結合している。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ネズミ、ヒト化、または完全ヒトである。

キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原を含むことができ（Ｐａｙｎｅｅｔａｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい）、したがって抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的化して殺滅するようにＴ細胞に指示する。このようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ぶことができ、それらの使用は本発明に包含される。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、目的の抗原に対する天然に存在するリガンド、または目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含むことができる。

ＣＡＲは、ヒンジ領域またはスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインと連結する膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３複合体を構成するα、β、γまたはζポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃｙ受容体ＩＩＩ）のサブユニット鎖、またはＣＤ８アルファ鎖などのＣＤタンパク質のサブユニットであり得る。ある例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファドメインである。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置された細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化ならびに／または増殖および細胞生存経路の活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。細胞内刺激ドメインは、抗原結合後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する１つまたは複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。このような細胞質シグナル伝達ドメインとしては、限定するものではないが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを挙げることができる。

細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖および／または細胞生存シグナルを伝達する１つまたは複数の細胞内共刺激ドメインを含み得る。場合によっては、共刺激ドメインは、１つまたは複数のＴＲＡＦ結合ドメインを含み得る。このような細胞内共刺激ドメインは、当技術分野で公知のもののいずれかであり得、限定するものではないが、例えば、Ｎｏｖｅｌ６（「Ｎ６」）などの国際公開第２０１８／０６７６９７号パンフレットに開示されている共刺激ドメインを挙げることができる。共刺激ドメインのさらなる例としては、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態では、共刺激ドメインはＮ６ドメインである。別の特定の実施形態では、共刺激ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインである。

他の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含む。このような外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖を含むことができ、あるいはガンマ鎖およびデルタ鎖を含むことができる。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、限定するものではないが、本明細書に開示の任意の抗原またはエピトープなどの目的の任意の抗原またはエピトープに対する特異性を有し得る。

特定の実施形態では、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲは、任意のタイプのがん細胞に特異的であり得る。このようながんとしては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒色腫、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病およびホジキンリンパ腫を挙げることができる。特定の実施形態では、がんおよび障害としては、限定するものではないが、プレＢＡＬＬ（小児適応症）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種骨髄移植後のサルベージなどが挙げられる。これらのがんは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２および／またはＲＯＲ１を標的とするＣＡＲの組み合わせを使用して治療することができる。いくつかの非限定的な例では、本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団は、癌種、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、および胚細胞腫瘍を標的とし、限定するものではないが、Ｂ細胞起源のがん、神経芽細胞腫、骨肉腫、前立腺がん、腎細胞癌腫、肝がん、胃がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、腎がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、アスベストによって誘発されるがんを含む環境誘発がん、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、真菌症、未分化大細胞リンパ腫、およびＴ細胞リンパ腫、ならびに前記がんの任意の組み合わせなどを標的とする。ある実施形態では、Ｂ細胞起源のがんには、限定するものではないが、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、プレＢＡＬＬ（小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫が含まれる。いくつかの例では、がんには、限定するものではないが、Ｂ細胞起源のがんまたは多発性骨髄腫が含まれ得る。いくつかの例では、Ｂ細胞起源のがんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。いくつかの例では、Ｂ細胞起源のがんは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、不活性化ＴＣＲアルファ遺伝子および／または不活性化ＴＣＲベータ遺伝子を含む。本発明の遺伝子改変細胞を作製するためのＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子の不活性化は、ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子が発現されている少なくとも一方または両方の対立遺伝子において起こる。したがって、一方または両方の遺伝子の不活性化は、内因性ＴＣＲアルファ鎖または内因性ＴＣＲベータ鎖タンパク質の発現を妨げる。これらのタンパク質の発現は、細胞表面上の内因性アルファ／ベータＴＣＲの構築に必要である。したがって、ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子の不活性化は、内因性アルファ／ベータＴＣＲの検出可能な細胞表面発現を有さない遺伝子改変免疫をもたらす。内因性アルファ／ベータＴＣＲはＣＤ３を組み込んでいる。したがって、不活性化ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ鎖を有する細胞は、ＣＤ３の検出可能な細胞表面発現を有し得ない。特定の実施形態では、不活性化遺伝子は、ＴＣＲアルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子である。

いくつかの例では、ＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、またはＴＣＲベータ遺伝子は、遺伝子の切断部位への鋳型核酸の挿入によって不活性化される。鋳型核酸の挿入は、内因性ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖の発現を破壊し、したがってＴ細胞表面上の内因性アルファ／ベータＴＣＲの構築を妨げる。いくつかの例において、鋳型核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子内に挿入される。特定の例では、鋳型核酸は、配列番号５８（すなわち、ＴＲＣ１－２認識配列）を含む操作されたメガヌクレアーゼ認識配列においてＴＲＡＣ遺伝子内に挿入される。特定の例では、ＣＡＲ導入遺伝子は、配列番号５８内のヌクレオチド位置１３と１４との間に挿入される。

遺伝子改変免疫細胞がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する実施形態のいくつかでは、このような細胞は内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の検出可能な細胞表面発現を有さない。したがって、本発明はさらに、ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現し、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の検出可能な細胞表面発現を有さず、いくつかの実施形態ではさらにＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する遺伝子改変免疫細胞の集団を提供する。例えば、この集団は、ＣＡＲを発現し（すなわち、ＣＡＲ＋である）、または外因性Ｔ細胞受容体を発現し（すなわち、ｅｘｏＴＣＲ＋）、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を有さない（すなわち、ＴＣＲ－である）、本発明の複数の遺伝子改変免疫細胞を含み得る。

本明細書で使用される場合、「内因性ＴＣＲの検出可能な細胞表面発現」とは、標準的な実験方法を使用して免疫細胞の細胞表面上のＴＣＲ複合体（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ複合体）の１つまたは複数の成分を検出する能力を指す。このような方法としては、例えば、ＴＣＲアルファ鎖もしくはＴＣＲベータ鎖などのＴＣＲ自体の成分、またはＣＤ３などの構築された細胞表面ＴＣＲ複合体の成分に特異的な免疫染色および／またはフローサイトメトリを挙げることができる。免疫細胞上の内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の細胞表面発現を検出する方法としては、本明細書の実施例に記載の方法、および例えば、ＭａｃＬｅｏｄｅｔａｌ．（２０１７）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２５（４）：９４９－９６１に記載されている方法が挙げられる。

２．４ｓｈＲＮＡｍｉＲ標的タンパク質
本開示の組成物および方法の遺伝子改変免疫細胞は、任意の内因性タンパク質の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを含み、発現することができる。ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いて発現を低下させることができる内因性タンパク質の非限定的な例には、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＳ１、ＣＤ５２、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子、およびＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子が含まれる。

Ａ．ベータ－２ミクログロブリン
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下する内因性タンパク質は、Ｂ２Ｍである。Ｂ２Ｍは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の成分であり、Ｂ２Ｍが存在しなければこの分子は細胞表面に構築されない。ＭＨＣクラスＩ分子は、Ｂ２Ｍに加えて、α１、α２、およびα３タンパク質から構成される。ＭＨＣクラスＩ分子内で、Ｂ２Ｍタンパク質は、α３タンパク質の横に位置し、細胞表面のα１タンパク質の下に位置する。Ｂ２Ｍは膜貫通領域を欠き、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝の安定性に必要である。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、Ｂ２ＭｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＢ２ＭｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。Ｂ２ＭｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４０４８．３であり、Ｂ２Ｍタンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４０３９．１である。

Ｂ２Ｍの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下するそれらの実施形態のいくつかでは、Ｂ２Ｍの細胞表面発現は、対照細胞（例えば、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

Ｂ２Ｍが細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子の構築に必要であることを考えると、Ｂ２Ｍの発現が低下した細胞はまた、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子の減少を示す。これらの実施形態のいくつかでは、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子の発現は、対照細胞（例えば、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

Ｂ２Ｍを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、Ｂ２Ｍ遺伝子内の配列に（完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１７および１８として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ７２８９ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号７および８として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ７２８２ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９および１０として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ７２８５ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１１および１２として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ７２８６ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１３および１４として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ７２８７ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１５および１６として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ７２８８ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１９および２０として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ７２９０ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４１～４７のいずれか１つに示される核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４１～４７のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４１に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４２に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４３に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４４に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４５に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４７に示される配列を含む。

Ｂ２ＭおよびＭＨＣクラスＩ分子のレベルが低下した細胞は、対照細胞（例えば、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、同種異系性の低下を示し得る。本明細書で使用される場合、「同種異系性」という用語は、細胞が「他の」または自己ではないものとして免疫系によって認識され作用される能力を指す。同種異系性は、プライミングされた同種異系抗原特異的ＣＴＬまたはＮＫ細胞とのインキュベーション後に生細胞のパーセンテージを定量した本明細書の他の箇所に記載される方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。

Ｂ．ＣＳ１
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下する内因性タンパク質は、ＣＳ１（ＣＣＮＤ３サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＣＤ３１９、およびＳＬＡＭＦ７としても知られている）である。ＣＳ１は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）関連受容体ファミリーのメンバーであり、正常なＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、および単球の表面上に発現される。ＣＳ１は、多発性骨髄腫細胞によって過剰発現され、多発性骨髄腫の免疫療法標的として機能する。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＳ１ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＣＳ１ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＣＳ１ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１１８１であり、ＣＳ１タンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６７００４．３である。

ＣＳ１の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＣＳ１の細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＣＳ１標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

ＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＳ１遺伝子内の配列に（完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２１および２２として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２３および２４として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２５および２６として示される配列を含む。

ＣＳ１標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４８～５０のいずれか１つに示される核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４８～５０のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４８に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４９に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５０に示される配列を含む。

遺伝子改変細胞がＣＳ１の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞はＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを含む。ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲの非限定的な例としては、限定するものではないが、国際公開第２０１４／１７９７５９号パンフレット、国際公開第２０１５１２１４５４号パンフレットおよび国際公開第２０１６／０９０３６９号パンフレットに記載のものが挙げられる。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ発現を介してＣＳ１の発現がノックダウンされた細胞は、対照細胞（例えば、ＣＳ１標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞によるフラトリサイドを受けにくい可能性がある。これは、多発性骨髄腫などの疾患の治療のためにＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲ発現細胞を使用する場合に有用であり、この場合、ＣＡＲ発現細胞の長期存在、したがって、疾患細胞（例えば、多発性骨髄腫細胞）の殺滅が望まれる。本明細書で使用される場合、「フラトリサイド」という用語は、同様の遺伝子型および／または表現型の細胞による細胞の殺滅を指す。ＣＳ１特異的ＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞によるフラトリサイドは、限定するものではないが、ＣＳ１特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する免疫細胞とＣＳ１特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞とのインキュベーション、および生存ｓｈＲＮＡｍｉＲ発現細胞の数の定量を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。

Ｃ．ＴＧＦＢＲ２
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下する内因性タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）である。ＴＧＦＢＲ２は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦＢ）に結合する膜貫通受容体である。ＴＧＦＢＲ２は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼドメインを含み、他のＴＧＦＢ受容体とヘテロ二量体化する。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＴＧＦＢＲ２ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＢ２ＭｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＴＧＦＢＲ２ｍＲＮＡ配列の非限定的な例はＮＭ＿００１０２４８４７．２であり、ＴＧＦＢＲ２タンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０２００１８．１である。

ＴＧＦＢＲ２の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＴＧＦＢＲ２の細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＴＧＦＢＲ２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

ＴＧＦＢＲ２を標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子内の配列に（完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２７および２８として示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２７２１１１０ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２９および３０として示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２７２１１１１ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号３１および３２として示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２７２１１１２ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号３３および３４として示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２７２１１１３ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号３５および３６として示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２７２１１１４ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

ＴＧＦＢＲ２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５１～５５のいずれか１つに示される核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５１～５５のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５１に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５２に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５３に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５４に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５５に示される配列を含む。

遺伝子改変免疫細胞がＴＧＦＢＲ２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞（例えば、ＴＧＦＢＲ２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない免疫細胞）と比較して、トランスフォーミング増殖因子Ｂ１（ＴＧＦＢ１）による免疫抑制を受けにくい。本明細書で使用される場合、「免疫抑制」という用語は、免疫系の活性化または有効性の低下を指す。ＴＧＦＢ１による免疫抑制は、限定するものではないが、Ｔ細胞の分化および／またはサイトカイン産生に対するＴＧＦＢ１の効果の測定を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。

Ｄ．ＣＢＬ－Ｂ
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下する内因性タンパク質は、Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）である。ＣＢＬ－Ｂは、ユビキチンのタンパク質への結合を触媒し、したがって分解のためにタンパク質を標的化するＥ３ユビキチンリガーゼである。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＢＬ－ＢｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＣＢＬ－ＢｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＣＢＬ－ＢｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７０６６２．５であり、ＣＢＬ－Ｂタンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿７３３７６２．２である。

ＣＢＬ－Ｂの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＣＢＬ－Ｂの細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＣＢＬ－Ｂ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

ＣＢＬ－Ｂを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子内の配列に（完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。

遺伝子改変免疫細胞がＣＢＬ－Ｂの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞（例えば、ＣＢＬ－Ｂ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない免疫細胞）と比較して、下流シグナル伝達タンパク質の分解によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の抑制を受けにくい。ＣＢＬタンパク質は、ｐ８５（ＰＩ３Ｋの調節サブユニット）、ホスホリパーゼＣ－ｇ、ならびにＬｃｋ、ＦｙｎおよびＺＡＰ７０などのチロシンキナーゼのターンオーバーを調節し、これらはすべてＴＣＲシグナル伝達に関与する（Ｌｅｅｅｔａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０２：１２１８－１２２２）。下流シグナル伝達タンパク質の分解によるＴＣＲシグナル伝達の抑制に対する感受性は、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット、免疫細胞化学、および免疫沈降を含む当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。

Ｅ．ＣＤ５２
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下する内因性タンパク質は、ＣＡｍＰＡＴＨ－１抗原としても知られているＣＤ５２（分化抗原群５２）である。ＣＤ５２は、成熟リンパ球の表面ならびに単球および樹状細胞上に存在する糖タンパク質である。可溶性ＣＤ５２分子は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン１０（Ｓｉｇｌｅｃ１０）と相互作用して、Ｔ細胞の増殖および活性化を阻害する（Ｚｈａｏｅｔａｌ．（２０１７）ＩｎｆｌａｍｍＲｅｓ６６（７）：５７１－５７８）。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＤ５２ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＣＤ５２ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＣＤ５２ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１８０３．３であり、ＣＤ５２タンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１７９４．２である。

ＣＤ５２の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

ＣＤ５２を標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＤ５２遺伝子内の配列に（完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号３７および３８として示される配列を含む（例えば、ＣＤ５２７２１２３ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号３９および４０として示される配列を含む（例えば、ＣＤ５２７２１２４ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

ＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５６または５７として示される核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５６または５７として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５６に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５７に示される配列を含む。

遺伝子改変免疫細胞がＣＤ５２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞はＣＤ５２抗体誘導細胞死を受けにくい。

Ｆ．デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下する内因性タンパク質は、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）である。ＤＣＫは、主にデオキシシチジンをリン酸化し、デオキシシチジン一リン酸に変換する。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＤＣＫｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＤＣＫｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＤＣＫｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００７８８．３であり、ＤＣＫタンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００７７９．１である。

ＤＣＫの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＤＣＫの細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＤＣＫ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

ＤＣＫを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＤＣＫ遺伝子内の配列に（完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号７６および７７として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ７２１３６ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号７８および７９として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ７２１３７ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号８０および８１として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ７２１３８ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号８２および８３として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ７２１３９ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号８４および８５として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ７２１４０ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

ＤＣＫ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８６～９０のいずれか１つに示される核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８６～９０のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８６に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８７に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８８に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８９に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号９０に示される配列を含む。

遺伝子改変免疫細胞がＤＣＫの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、細胞増殖に対するプリンヌクレオシド類似体（例えば、フルダラビン）の影響を受けにくい。実際、ＤＣＫの発現が低下した遺伝子改変免疫細胞は、細胞集団と、フルダラビンなどのプリンヌクレオシド類似体とのインキュベーションによって濃縮することができる。さらに、ＤＣＫの発現が低下した遺伝子改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、治療の経過中にフルダラビンなどのプリンヌクレオシド類似体を投与した場合、免疫療法中にインビボでより高い持続性を有し得る。

Ｇ．グルココルチコイド受容体（ＧＲ）
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下する内因性タンパク質は、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）である。コルチゾールまたはデキサメタゾンなどのグルココルチコイドの結合は、細胞におけるトランス活性化またはトランス抑制につながり得る、ヒートショックタンパク質などのタンパク質の放出を誘導する可能性がある。

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＧＲｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＧＲｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＧＲｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＭ１８３２６２．１である。

ＧＲの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＧＲの発現は、対照細胞（例えば、ＧＲ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

ＧＲを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＧＲ遺伝子内の配列に（完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９１および９２として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１４２ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９３および９４として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１４３ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９５および９６として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１４５ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９７および９８として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１４６ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９９および１００として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１４８ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１０１および１０２として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１４９ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１０３および１０４として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１５０ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１０５および１０６として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１５１ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１０７および１０８として示される配列を含む（例えば、ＧＲ７２１５２ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

ＧＲ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１０９～１１７のいずれか１つに示される核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１０９～１１７のいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１０９に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１０に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１１に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１２に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１３に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１４に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１６に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１７に示される配列を含む。

遺伝子改変免疫細胞がＧＲの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、コルチゾールまたはデキサメタゾンなどのグルココルチコイドの影響、例えば増殖の低下を受けにくい。実際、ＧＲの発現が低下した遺伝子改変免疫細胞は、細胞集団とグルココルチコイドとのインキュベーションによって濃縮することができる。さらに、ＧＲの発現が低下した遺伝子改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、治療の経過中にグルココルチコイド（例えば、ステロイド）を投与した場合、免疫療法中にインビボでより高い持続性を有し得る。

２．５内因性タンパク質の発現を低下させる方法
本発明は、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を細胞に導入し、それによって鋳型核酸がゲノムに挿入され、発現されることによって、免疫細胞において内因性タンパク質の発現を低下させる方法を提供する。

鋳型核酸は、ランダムな組み込みによって免疫細胞のゲノム内に挿入することができる。あるいは、鋳型核酸は、ヌクレアーゼ媒介標的挿入によって標的遺伝子内に挿入することができ、操作されたヌクレアーゼは、免疫細胞のゲノム内の認識配列に対して特異性を有し、認識配列に切断部位を生成し、免疫細胞のゲノム内への鋳型核酸の挿入を切断部位において可能にする。

操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬを含む任意の操作されたヌクレアーゼを、鋳型核酸の標的挿入に使用することができる。

例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノム中の所定の部位を認識および切断するように操作することができる。ＺＦＮは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ制限酵素などのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）由来のヌクレアーゼドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。ジンクフィンガードメインは、天然配列であり得るか、長さが約１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生するように、合理的または実験的手段によって再設計されてもよい。この操作されたタンパク質ドメインをヌクレアーゼドメインに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断を標的化することが可能である。ＺＦＮは、広範囲の真核生物における遺伝子の付加、除去および置換を標的とするために広く使用されている（Ｓ．Ｄｕｒａｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３３，５９７８（２００５）に概説されている）。

同様に、ＴＡＬ－エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を作製して、ゲノムＤＮＡの特定の部位を切断することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ制限酵素などのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）に融合された操作された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｍａｋ，ｅｔａｌ．（２０１３）ＣｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ．２３：９３－９に概説されている）。しかしながら、この場合、ＤＮＡ結合ドメインは、それぞれが単一のＤＮＡ塩基対を特異的に認識するＴＡＬ－エフェクタードメインのタンデムアレイを含む。

コンパクトＴＡＬＥＮは、二量体化の必要性を回避する代替的なエンドヌクレアーゼアーキテクチャである（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，ｅｔａｌ．（２０１３）ＮａｔＣｏｍｍｕｎ．４：１７６２）。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｉ－ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼまたは米国特許出願公開第２０１３０１１７８６９号明細書の表２に列挙されているエンドヌクレアーゼのいずれかに由来するヌクレアーゼドメインに融合された、操作された部位特異的ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。コンパクトＴＡＬＥＮは、ＤＮＡプロセシング活性のために二量体化を必要としないので、コンパクトＴＡＬＥＮは単量体として機能的である。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づく操作されたエンドヌクレアーゼも当技術分野で公知である（Ｒａｎ，ｅｔａｌ．（２０１３）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ．８：２２８１－２３０８；Ｍａｌｉｅｔａｌ．（２０１３）ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．１０：９５７－６３）。ＣＲＩＳＰＲシステムは、２つの構成要素：（１）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ；（２）ヌクレアーゼをゲノム中の目的の位置に指向させる約２０ヌクレオチドの標的化配列を含む短鎖「ガイドＲＮＡ」、を含む。ＣＲＩＳＰＲシステムはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。各々が異なる標的化配列を有する複数のガイドＲＮＡを同じ細胞内で発現させることにより、ＤＮＡ切断をゲノム内の複数の部位に同時に標的化することが可能である。

１２塩基対を超える認識配列において二本鎖ＤＮＡに結合する操作されたメガヌクレアーゼを、本開示の方法に使用することができる。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩに由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して天然のＩ－ＣｒｅＩと比較して改変された、Ｉ－ＣｒｅＩの操作された変異体を指し得る。Ｉ－ＣｒｅＩのこのような改変された変異体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット、当該文献は参照によりその全体が組み込まれる）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに連結されている「単鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。

ｍｅｇａＴＡＬと呼ばれるヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインおよび操作された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼを含む単鎖エンドヌクレアーゼである。

特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼの認識配列は標的遺伝子内にある。標的遺伝子は、配列が変更されること（例えば、ヌクレオチドの付加もしくは削除、ヌクレオチドの置換、または異種もしくは外因性配列の挿入）が望ましい任意の遺伝子であり得る。例えば、遺伝子不活性化による標的遺伝子のノックアウトが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲベータ遺伝子である。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＴＣＲアルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子であり得る。いくつかの具体的な実施形態では、標的遺伝子はＴＲＡＣ遺伝子であり、認識配列は配列番号５８に示されるＴＲＣ１－２認識配列である。

これらの実施形態のいくつかでは、鋳型核酸の標的遺伝子への挿入は、標的遺伝子によってコードされる完全長内因性タンパク質の発現の破壊をもたらす。したがって、標的遺伝子がＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、またはＴＣＲベータ遺伝子である実施形態のいくつかでは、内因性ＴＣＲが、これらの遺伝子によってコードされる内因性タンパク質の非存在下で細胞表面に適切に構築されないので、遺伝子改変免疫細胞は、アルファ／ベータＴＣＲなどの内因性ＴＣＲの検出可能な細胞表面発現を有さない。

遺伝子改変免疫細胞が、アルファ／ベータＴＣＲの成分をコードする遺伝子の不活性化に起因して、内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の検出可能な細胞表面発現を有さない特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をさらに発現する。ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、鋳型核酸内に含まれる配列によってコードされ得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列とは異なるプロモータに作動可能に連結されている。代替的な実施形態では、ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列と同じプロモータまたは異なるプロモータに作動可能に連結されている。ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列の５’または３’であり得、コード配列は、同じ向きまたは異なる向き、例えば５’から３’または３’から５’であり得る。さらに、コード配列は、同じ核酸分子からの２つ以上の遺伝子（すなわち、シストロン）の翻訳を可能にするために、当技術分野で公知のエレメント、限定するものではないが、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメント（例えば、Ｐ２Ａ／フューリン）、Ｅ２Ａエレメント、およびＦ２Ａエレメントなどによって分離され得る。

内因性ＴＣＲの発現を破壊するためのヌクレアーゼの使用、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガＴＡＬ、およびＣＲＩＳＰＲシステムの使用が開示されている（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅｔａｌ．（２０１６），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２４（３）：５７０－５８１；Ｅｙｑｕｅｍｅｔａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ５４３：１１３－１１７；米国特許第８，９５６，８２８号明細書；米国特許出願公開第２０１４／０３０１９９０号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号明細書）。ヒトＴＲＡＣ遺伝子のＤＮＡ標的を切断するための操作されたメガヌクレアーゼの具体的な使用も以前に開示されている。例えば、国際公開第２０１４／１９１５２７号パンフレットがあり、これはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のエクソン１内の認識配列を標的とするように操作されたＩ－ＯｎｕＩメガヌクレアーゼの変異体を開示した。

さらに、国際公開第２０１７／０６２４３９号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０６２４５１号パンフレットにおいて、出願人らは、ＴＣＲアルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子のエクソン１中の認識配列に対して特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼを開示した。これらには、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中のＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５８）に特異性を有する「ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼ」が含まれた。公報’４３９および’４５１はまた、ＣＡＲコード配列または外因性ＴＣＲコード配列をＴＣＲ１－２メガヌクレアーゼ切断部位へ標的挿入するための方法を開示した。

特定の実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって連結されたＮ末端サブユニットおよびＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインの各々は、認識配列の半分（すなわち、認識ハーフサイト）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が一対の４塩基対の３’一本鎖オーバーハングを生成するように、４塩基対によってオフセットされる。

操作されたヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または好ましくは操作されたヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。このような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状または線状化プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。操作されたヌクレアーゼコード配列がＤＮＡ形態で送達される実施形態の場合、それは、ヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結されなければならない。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎｅｔａｌ．（１９８４），ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．８１（３）：６５９－６３）またはＳＶ４０初期プロモータ（ＢｅｎｏｉｓｔａｎｄＣｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４－１０）などの構成的プロモータ、ならびにテトラサイクリン誘導性プロモータなどの誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．（１９９２），ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４５）が含まれる。操作されたヌクレアーゼをコードする核酸はまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータとしては、限定するものではないが、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号パンフレット）を挙げることができる。

ある実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列は、組換えＤＮＡ構築物または発現カセット上に送達される。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータと本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含む発現カセット（すなわち、「カセット」）を含むことができる。

いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、これが、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに統合される可能性を低減するので、細胞に送達される。

操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、インビトロ転写などの当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、改変された５’キャップを含む。このような改変５’キャップは当技術分野で公知であり、限定するものではないが、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）（米国特許第７０７４５９６号）、７－メチル－グアノシン、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）類似体、例えばＣａｐ１類似体（Ｔｒｉｌｉｎｋ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を挙げることができ、または例えばワクシニアキャップ酵素などを使用して酵素的にキャップされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡは、コードされた操作されたヌクレアーゼの発現および／またはｍＲＮＡ自体の安定性を増強するために、さまざまな５’および３’非翻訳配列エレメントを含有し得る。このようなエレメントには、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメントなどの翻訳後調節エレメントが含まれ得る。

ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルウリジンまたは２－チオウリジンなどのヌクレオシド類似体または天然に存在するヌクレオシドを含有し得る。さらなるヌクレオシド類似体としては、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号明細書に記載のものが挙げられる。

別の特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、操作されたヌクレアーゼをコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含むことができる。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、操作されたヌクレアーゼをコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３’相同アームをさらに含むことができる。

別の特定の実施形態では、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状化ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入することができる。いくつかの例では、ヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるように、１つまたは複数の制限酵素によって消化され得る。

精製されたヌクレアーゼタンパク質を細胞内に送達してゲノムＤＮＡを切断することができ、これにより、本明細書で以下にさらに詳述するものを含む、当技術分野で公知のさまざまな異なる機序によって、切断部位における目的の配列との相同組換えまたは非相同末端結合が可能になる。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞取り込みを促進するために細胞透過性ペプチドまたは標的化リガンドに結合される。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔａｌ．（２００８）ＭｏｌＴｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚｅｔａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔａｌ．（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓｅｔａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：７６９８－７７０６）、およびＨＳＶ－１ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓｅｔａｌ．（２００５）ＣｅｌｌＭｏｌＬｉｆｅＳｃｉ．６２：１８３９－４９）が挙げられる。代替的な実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞上に発現される特異的細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合または非共有結合して、ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細胞によって内在化されるようにする。あるいは、ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、このような細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）に共有結合または非共有結合することができる。（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔａｌ．（２０１４）ＴｉｓｓｕｅＢａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ，ｅｔａｌ．（２０１３）ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ，ｅｔａｌ．（２０１４）ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；Ｑｉａｎｅｔａｌ．（２０１４）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＤｒｕｇＭｅｔａｂＴｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法（Ｓｈａｒｍａ，ｅｔａｌ．（２０１４）ＢｉｏｍｅｄＲｅｓＩｎｔ．２０１４）を使用して、ナノ粒子に共有結合もしくは好ましくは非共有結合されるか、またはこのようなナノ粒子内に封入される。ナノ粒子は、長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満であるナノスケール送達システムである。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、または生物学的高分子で構成されたコアを使用して設計することができ、複数コピーのヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡをナノ粒子コアに付着させる、または封入することができる。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させ、したがって、各ヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性を最大にする。このようなナノ粒子の表面は、ポリマーまたは脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質）でさらに改変されて、コア－シェルナノ粒子を形成することができ、その表面に細胞送達およびペイロードの取り込みを増強するための追加の機能性が付与される（Ｊｉａｎｅｔａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１－３０）。ナノ粒子は、ナノ粒子を適切な細胞型に指向させるため、および／または細胞取り込みの可能性を高めるために、標的化分子にさらに有利に結合され得る。このような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体および細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、またはカチオン性脂質を使用して複合体化される（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓｅｔａｌ．（２０１５）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．（２０１１）ＪＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照されたい）。リポソームおよびリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的細胞の細胞膜との融合および／または細胞膜の破壊を通じて細胞取り込みおよび送達効率を促進することができる。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内に封入されるか、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉｅｔａｌ．（２０１１）ＴｈｅｒＤｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）。ポリマー担体は、ポリマー侵食および薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度を提供するように設計することができ、高い薬物封入効率は、所望の標的細胞集団への細胞内送達まで治療用ペイロードの保護を提供することができる。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、または組換えヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセル内に自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔｏｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＪＧｅｎｅＭｅｄ．９（１１）：９５６－６６）。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、非特異的相互作用を低減することができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与および／または送達のためにエマルジョンまたはナノエマルジョン（すなわち、１ｎｍ未満の平均粒径を有する）に製剤化される。「エマルジョン」という用語は、限定するものではないが、水不混和性相が水相と混合された場合に、無極性残基（例えば、長鎖炭化水素）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成することができる脂質構造を含む、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、または油中水中油型の分散液または液滴を指す。これらの他の脂質構造としては、限定するものではないが、単層、少層、および多層の脂質小胞、ミセル、およびラメラ相が挙げられる。エマルジョンは、水相および親油性相（典型的には油および有機溶媒を含有する）から構成される。エマルジョンはまた、１つまたは複数の界面活性剤を含むことが多い。ナノエマルジョン製剤は周知であり、例えば、米国特許出願公開第２００２／００４５６６７号および同第２００４／００４３０４１号明細書、ならびに米国特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同第６，６３５，６７６号および同第６，５５９，１８９号明細書に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、およびポリマーデンドリマーに共有結合または非共有結合する（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓｅｔａｌ．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇｅｔａｌ．（２００８）ＪＰｈａｒｍＳｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デンドリマー生成は、ペイロードの容量およびサイズを制御することができ、高い薬物ペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の表示を利用して、安定性を改善し、非特異的相互作用を低減させ、細胞特異的標的化および薬物放出を増強することができる。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を使用して送達される。このようなベクターは当技術分野で公知であり、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔａｌ．（２０１３）ＮｅｗＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２）。本発明で有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞へのウイルスの形質導入および細胞ゲノムへのヌクレアーゼ遺伝子の挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６の血清型を有する。ＡＡＶベクターはまた、自己相補的であり得、したがって、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としない（ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔａｌ．（２００１）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．８：１２４８－５４）。本明細書に開示の鋳型核酸を送達するものを含む組換えＡＡＶベクターによって送達されるポリヌクレオチドは、左（５’）および右（３’）逆位末端反復配列を含み得る。

ヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態（例えば、プラスミド）で、および／またはウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能に連結されなければならない。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクターのＬＴＲ）由来の内因性プロモータ、または周知のサイトメガロウイルスプロモータもしくはＳＶ４０ウイルス初期プロモータなどのウイルスプロモータであり得る。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに作動可能に連結される。

ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、さらなる制御配列をさらに含むことができる。例えば、配列は、相同組換えエンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。操作されたヌクレアーゼをコードする配列はまた、少なくとも１つの核局在化シグナルを含み得る。核局在化シグナルの例は、当技術分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１－５１０５を参照されたい）。

本発明はさらに、標的遺伝子への鋳型核酸の導入を提供する。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、インサートの要素に隣接する５’相同アームおよび３’相同アームを含む。このような相同アームは、切断部位が生成されるヌクレアーゼ認識配列の５’上流および３’下流の対応する配列と配列相同性を有する。一般に、相同アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、最大２０００塩基対以上の長さを有することができ、ゲノム中のそれらの対応する配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、またはそれを超える配列相同性を有することができる。

本明細書に開示の鋳型核酸（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードするもの、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸）は、前述の手段のいずれかによって細胞に導入することができる。特定の実施形態では、鋳型核酸は、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）、例えば組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、または好ましくは組換えＡＡＶベクター（すなわち、組換えＡＡＶ）によって導入される。外因性核酸（例えば、鋳型核酸）を導入するのに有用な組換えＡＡＶベクターは、ウイルスの細胞への形質導入および外因性核酸配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、自己相補的であり得、したがって、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としない。

別の特定の実施形態では、本明細書に開示の鋳型核酸（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードするもの、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸）は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、目的の外因性配列を含むことができ、好ましい実施形態では、相同組換えによってメガヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するために５’および３’相同アームを含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、５’相同アームの５’上流に５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、および３’相同アームの３’下流に３’ＡＡＶＩＴＲ配列をさらに含むことができる。

別の特定の実施形態では、本明細書に開示の鋳型核酸（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードするもの、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸）は、線状化ＤＮＡ鋳型を用いて細胞に導入することができる。いくつかの例では、プラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞にトランスフェクトされる前に線状化されるように、１つまたは複数の制限酵素によって消化され得る。

本発明によって改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、目的のヌクレアーゼおよび／または外因性配列の導入前に活性化を必要とし得る。例えば、Ｔ細胞は、可溶性であるか、または支持体（すなわち、ビーズ）にコンジュゲートされている抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体と、細胞を活性化するのに十分な期間接触させることができる。

本発明の遺伝子改変免疫細胞は、１つまたは複数の誘導性自殺遺伝子を発現するようにさらに改変することができ、その誘導は細胞死を引き起こし、インビトロまたはインビボでの細胞の選択的破壊を可能にする。いくつかの例では、自殺遺伝子は、細胞傷害性ポリペプチド、非毒性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する能力を有するポリペプチド、および／または細胞内の細胞傷害性遺伝子経路を活性化するポリペプチドをコードすることができる。すなわち、自殺遺伝子は、単独で、または他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす産物をコードする核酸である。このような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子および５－フルオロシトシンを高毒性化合物５－フルオロウラシルに変換することができる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼである。自殺遺伝子には、非限定的な例として、カスパーゼ－９、カスパーゼ－８またはシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子も含まれる。いくつかの例では、カスパーゼ－９は、特定の二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。自殺遺伝子はまた、治療用および／または細胞傷害性モノクローナル抗体に対して細胞を敏感にする、細胞の表面で発現されるポリペプチドをコードし得る。さらなる例では、自殺遺伝子は、抗ＣＤ２０ｍＡｂのリツキシマブによって認識される抗原モチーフおよび自殺遺伝子を発現する細胞の選択を可能にするエピトープを含む組換え抗原性ポリペプチドをコードすることができる。例えば、２つのリツキシマブ結合エピトープおよびＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含む、国際公開第２０１３１５３３９１号パンフレットに記載のＲＱＲ８ポリペプチドを参照されたい。このような遺伝子の場合、リツキシマブを対象に投与して、必要に応じて細胞枯渇を誘導することができる。さらなる例では、自殺遺伝子は、切断型ＥＧＦＲポリペプチドと組み合わせて発現されるＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含み得る。

天然に存在するヌクレアーゼおよびマイクロＲＮＡ配列（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよびｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列を含む）の変異体を、本開示の組成物および方法に使用することができる。本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味することを意図している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１つまたは複数の内部部位での１つまたは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、および／または天然ポリペプチドの１つまたは複数の部位での１つまたは複数のアミノ酸の置換による、「天然」ポリペプチドに由来するポリペプチドを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態に包含される変異体ポリペプチドは、生物学的に活性である。すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性を保持し続ける。このような変異体は、例えば、ヒトの操作により生じ得る。天然ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される場合、天然ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有すると思われる。ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチドまたはサブユニットと、わずか約１～４０個のアミノ酸残基、わずか約１～２０個、わずか約１～１０個、わずか約５個、わずか４個、３個、２個、またはさらには１個のアミノ酸残基だけ異なり得る。

ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含むさまざまな方法で変更され得る。このような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびポリヌクレオチド変更のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８－４９２；Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；ＷａｌｋｅｒａｎｄＧａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆｅｔａｌ．（１９７８）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が最適であり得る。

ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然ポリヌクレオチド内の１つまたは複数の部位における１つまたは複数のヌクレオチドの欠失および／または付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識されよう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体は、遺伝暗号の縮重のために、実施形態のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。変異体ポリヌクレオチドには、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるが、依然としてポリペプチドまたはＲＮＡをコードするものなどの合成由来ポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される場合、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有すると思われる。特定のポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）の変異体は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同一性パーセントの比較によって評価することもできる。

本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、ポリペプチドの特徴に根本的な変化をもたらすことは予期されない。しかしながら、置換、欠失または挿入の正確な効果を事前に予測することが困難である場合、当業者は、ポリペプチドをその生物学的活性についてスクリーニングすることによって、その効果が評価されることを理解されよう。

２．６医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の遺伝子改変免疫細胞、または本発明の遺伝子改変免疫細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造では、細胞を典型的には薬学的に許容される担体と混合し、得られた組成物を対象に投与する。担体は、当然のことながら、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象の疾患の治療に有用な１つまたは複数の追加の薬剤をさらに含むことができる。さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、遺伝子改変Ｔ細胞のインビボ細胞増殖および生着を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１）などの生物学的分子をさらに含むことができる。本発明の遺伝子改変免疫細胞を含む医薬組成物は、追加の薬剤または生物学的分子と同じ組成物中で投与することができ、あるいは別個の組成物で同時投与することができる。

本開示はまた、医薬として使用するための、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞またはその集団を提供する。本開示はさらに、それを必要とする対象において疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞またはその集団の使用を提供する。このような一態様では、医薬は、それを必要とする対象におけるがん免疫療法に有用である。

本発明の医薬組成物は、養子免疫療法、特にＴ細胞養子免疫療法によって標的化され得る任意の疾患状態を治療するのに有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物および医薬は、がんの治療に有用である。本開示の医薬組成物および医薬で治療することができるがんの非限定的な例には、限定するものではないが、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲによって標的とされ得る本明細書に記載のさまざまな種類のがんが含まれる。

がんが本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団で治療される実施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞またはその集団を投与された対象に、放射線、外科手術、または化学療法剤などの追加の治療法をさらに投与する。

本発明はさらに、そのゲノム中にｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む本明細書に記載の複数の遺伝子改変免疫細胞を含む遺伝子改変免疫細胞の集団であって、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする外因性核酸分子をＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子に挿入し、したがって細胞が内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の検出可能な細胞表面発現を有さないようにすることができる遺伝子改変免疫細胞の集団を提供する。したがって、本発明のさまざまな実施形態では、免疫細胞の集団であって、集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％が、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免疫細胞の集団が提供される。本発明のいくつかの実施形態では、免疫細胞の集団であって、集団中の細胞の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または最大１００％が、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免疫細胞の集団が提供される。本発明のさらなる実施形態では、免疫細胞の集団であって、集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％が、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをさらに発現し、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をさらに発現する本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免疫細胞の集団が提供される。本発明のある実施形態では、免疫細胞の集団であって、集団中の細胞の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または最大１００％が、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲ、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をさらに発現する本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免疫細胞の集団が提供される。

２．７遺伝子改変免疫細胞の投与方法
本明細書に開示の別の態様は、有効量の本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団の、それを必要とする対象への投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、それを必要とする対象に投与される。例えば、有効量の細胞集団を、疾患を有する対象に投与することができる。特定の実施形態では、疾患はがんであり得、本発明の遺伝子改変免疫細胞の投与は免疫療法を表す。投与された細胞は、レシピエントにおける標的細胞の増殖を低下させ、数を減少させ、または殺滅することができる。抗体療法とは異なり、本開示の遺伝子改変免疫細胞は、インビボで複製および増殖することができ、疾患の持続的制御につながり得る長期持続性をもたらす。

可能な投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、または注入）投与が挙げられる。さらに、投与は、連続注入によって、または単回もしくは複数回のボーラス投与によるものであり得る。特定の実施形態では、薬剤は、約１２時間未満、６時間、４時間、３時間、２時間、または１時間の期間にわたって注入される。さらに他の実施形態では、注入は最初はゆっくり行われ、次いで経時的に増加される。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団は、がんを治療する目的で腫瘍抗原を標的とする。このようながんとしては、限定するものではないが、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲによって標的とされ得る本明細書に記載のさまざまな種類のがんを挙げることができる。

「有効量」または「治療量」が示される場合、投与される正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ（存在する場合）、感染または転移の程度、および状態の個人差を考慮して医師が決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞またはその集団を含む医薬組成物は、それらの範囲内のすべての整数値を含めて、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重の投与量で投与される。さらなる実施形態では、投与量は、それらの範囲内のすべての整数値を含めて、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与される。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．ｏｆＭｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量および治療計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することによって、医学の当業者が容易に決定することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団の投与は、標的疾患または状態の少なくとも１つの症状を軽減する。例えば、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞またはその集団の投与は、がんの少なくとも１つの症状を軽減することができる。がんの症状は当技術分野で周知であり、公知の技術によって決定することができる。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定として解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の物質および手順に対する多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることが意図される。

実施例１
ｓｈＲＮＡカセットを抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞のゲノムに挿入した場合の、ベータ－２ミクログロブリンの一過性ノックダウン

これらの実験では、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座にＣＡＲ遺伝子と同時送達されるｓｈＲＮＡの単一コピーを使用して、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を効率的にノックダウンできるかどうかを評価した。アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５８）を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションし、構築物７０５６をパッケージングしたＡＡＶを２５，０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩで用いて形質導入した。ＡＡＶ７０５６は、ＴＲＡＣオープンリーディングフレームと反対向きのＣＡＲ（抗ＣＤ１９ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、Ｎｏｖｅｌ６（Ｎ６）共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインから構成される）をコードする。転写はＪｅＴプロモータによって開始され、双方向ポリＡ配列によって終結される。ＣＡＲ発現を制御するＪｅＴプロモータの上流には、やはりＴＲＡＣＯＲＦに対して反対の転写配向でｓｈＲＮＡ発現カセットが位置している。ｓｈＲＮＡの転写は、Ｕ６プロモータによって開始され、中央ポリピリミジントラクトによって終結される。いくつかのｓｈＲＮＡ配列を、Ｂ２Ｍ発現のノックダウン効力について評価した。ＡＡＶ７０５６は、ｓｈＲＮＡ４７２と略されるｓｈＲＮＡ配列ＴＲＣＮ００００３８１４７２を含み、その配列は配列番号６として示される。

細胞培養物を、５％ＦＢＳおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中でさらに最大ｘ日間維持した。ヌクレオフェクション後４、７および／または１０日目に、培養物をサンプリングし、ＣＤ３（抗ＣＤ３－ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＡＲ（抗ＦＭＣ６３抗ＣＡＲ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされたクローンＶＭ１６）、Ｂ２Ｍ（抗Ｂ２Ｍ－ＡＰＣまたはＰＥ、クローンＴＵ－９９ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ならびにＨＬＡ－Ａ、ＢおよびＣ（クローンＷ６／３２、ＢＶ６０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の表面発現について分析した。フローサイトメトリデータを、Ｂｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＬＸで取得した。細胞表面ＣＤ３の検出は、細胞表面上の内因性Ｔ細胞受容体の指標である。したがって、ＣＤ３＋またはＣＤ３－である遺伝子改変細胞は、それぞれＴＣＲ＋およびＴＣＲ－であることが理解されよう。

Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－ＡＢＣレベルを、構築物７０５６を発現するサンプルおよび対照集団において測定した。図１Ａは、対照培養物由来のｓｈＲＮＡを発現しないＴＲＡＣ編集細胞と比較した、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞におけるＢ２Ｍの表面レベルを示す。図１Ｂは、同じ培養物中のＣＤ３－／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団のＢ２Ｍレベルを示す。図１Ｃおよび１Ｄは、ＨＬＡ－ＡＢＣ表面レベルの表示において同じそれぞれの比較を行う。ＡＡＶ－７０５６により形質導入された細胞のＣＤ３－／ＣＡＲ＋画分は、対照集団と比較して９０％超低下したＢ２ＭおよびＨＬＡ－ＡＢＣのレベルを示した。

導入遺伝子送達後の最も早い時点で、ＣＡＲ＋細胞は、マーカーおよび比較によって、ＨＬＡ－ＡＢＣおよびＢ２Ｍの表面レベルの９０～９５％の低下を示す。培養をより長期間行うと、ＣＡＲ＋事象の頻度が低下し、Ｂ２Ｍ表面発現がほぼ正常レベルまで回復する（図２Ａ～２Ｆ）。

このノックダウン効力の喪失の根本原因を明らかにするために、生存ＣＡＲ＋細胞のゲノム中の遺伝子導入インサートを形質導入の１０日後（ｄ１０）に配列決定した。７０５６配列のＴＲＡＣ相同アームにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して、配列決定反応をプライミングした。Ｂ２Ｍ転写産物を標的とすることを意図した自己相補的ヘアピン構造の配列は、ｄ１０ゲノムでは回収されなかった。しかし、この配列は、ＡＡＶ調製物またはパッケージングプラスミドを鋳型として使用した反応から回収した。Ｕ６プロモータおよびｃＰＰＴを含む隣接配列が乱されなかったので、配列喪失はヘアピン配列に限定されるように見えた。

これらの研究は、事前スクリーニングされたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡが、（Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入を介して）構築物が送達された細胞の表面上のＢ２Ｍ発現レベルをノックダウンできることを示している。この効果はＣＡＲ＋集団（すなわち、ＴＲＡＣ遺伝子座への標的化された組み込みが起こった細胞）に特異的である。この実験は、ＴＲＡＣ遺伝子座および同じＡＡＶ鋳型上のＣＡＲ遺伝子に同時送達されたｓｈＲＮＡ４７２の単一コピーを使用して、Ｂ２Ｍを効率的にノックダウンできることを実証する。結果は初期の時点で有望であるように見えたが、ノックダウン効果は一過性であり、ＣＡＲ＋集団における毒性または成長停止に関連すると判定された。ノックダウン効果が弱まるにつれて、生存Ｔ細胞のゲノムからのｓｈＲＮＡ配列の喪失が観察された。これは、ｓｈＲＮＡ４７２がゲノムから切除され、統合された単一コピーにより媒介されるＢ２Ｍまたは潜在的に他の内因性タンパク質のノックダウンには適していないことを示唆した。

実施例２
ベータ－２ミクログロブリンｓｈＲＮＡｍｉＲの設計、構築および特性評価

ｓｈＲＮＡを使用したＢ２Ｍ発現の標的化は、おそらくゲノムからのヘアピン配列の喪失のために、ＣＡＲＴ産物における一過性ノックダウン効果および毒性によって妨げられた。短鎖ヘアピンを含むガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列を、より大きく、より高度に構造化されたマイクロＲＮＡ足場（ｍｉＲ）に適合させた。ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの技術のこの組み合わせは、本明細書ではマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉＲと呼ばれる。

ｓｈＲＮＡｍｉＲを作製するために選択されるｍｉＲ足場はｍｉＲ－Ｅと呼ばれ、ｍｉＲ－３０と呼ばれるヒトゲノム中の天然に存在するｍｉＲの操作された誘導体である（国際公開第２０１４／１１７０５０号パンフレットを参照されたく、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。マイクロＲＮＡは核内の細胞のＲＮＡｉ経路に入り、そこでＤｒｏｓｈａによってプロセシングされ、エキスポーチン複合体によってサイトゾルに輸送され、その後ＤｉｃｅｒおよびＡｒｇｏｎａｕｔと相互作用して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる。

この研究において使用されるｍｉＲ－Ｅ足場の配列は、配列番号１（５’ｍｉＲ－Ｅ足場ドメイン）、配列番号２（５’ｍｉＲ－Ｅ基底ステムドメイン）、配列番号３（ｍｉｒ－３０ａループドメイン）、配列番号４（３’ｍｉＲ－Ｅ基底ステムドメイン）および配列番号５（３’ｍｉＲ－Ｅ足場ドメイン）として示される。それぞれ配列番号７および８として示されるＢ２Ｍ標的化パッセンジャー鎖配列およびガイド鎖配列を、終止コドンの下流であるがポリＡ転写ターミネータの上流である抗ＣＤ１９ＣＡＲ（実施例１に記載されるものと同じ）ベクター内にクローニングした。このベクター（７２８２）をＡＡＶ６キャプシドにパッケージングし、Ｂ２Ｍノックダウンの規模および持続期間を決定するための研究に使用した。

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションし、構築物７２８２をパッケージングしたＡＡＶを２５，０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩで用いて形質導入した。ＲＮＡｉの特徴を有さないＣＡＲＴ細胞（７２０６）またはｓｈＲＮＡ－４７２を有するＣＡＲＴ細胞（７０５６）を対照として含めた。

編集およびＡＡＶ形質導入の３、７、および１１日後に、これらの培養物由来の細胞を、ＴＣＲノックアウト（抗ＣＤ３－ＢＢ５１５クローンＳＫ７、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを使用）について、ＣＡＲ導入遺伝子ノックイン（抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、クローンＶＭ１６、自社生産を使用）について、および抗Ｂ２Ｍ－ＰＥ（クローンＴＵ－９９、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢ２Ｍノックダウンについて分析した。Ｂ２Ｍレベル（ＰＥチャネル中の平均蛍光強度によって測定）を、同じ培養物由来の細胞のＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団とＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団との間で比較した。

編集／形質導入の３日後、ＡＡＶ７２８２を使用して産生されたＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＲ＋の頻度に関してＡＡＶ７２０６に比肩したが、ＡＡＶ７０５６を使用して産生された培養物は、ＣＡＲ＋細胞の頻度がより低かった。ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度は、ＡＡＶ７２０６またはＡＡＶ７２８２を用いて産生された培養物では増加または同じままであったが、ＡＡＶ７０５６により形質導入された培養物では全細胞の５％未満に減少した。

ｓｈＲＮＡ（ＡＡＶ７０５６）を発現するＣＡＲＴ細胞は、３日目にＢ２Ｍの表面レベルを急速に９１．９％下方制御した。Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲは、この時点でＢ２Ｍ表面レベルを７７．４％下方制御した（図３）。培養物をさらに数日間保持すると、ｓｈＲＮＡによって媒介されるノックダウンの規模は、７および１１日目にそれぞれ８４．３％および６５．１％に低下した（図４および５）。さらに、これらの時点で、正常レベルまたはほぼ正常レベルのＢ２Ｍを再発現し始めたＣＡＲ＋事象がＡＡＶ７０５６形質導入培養物に存在した。比較すると、ｓｈＲＮＡｍｉＲによって媒介されるノックダウンの大きさは、驚くべきことに、７日目および１１日目に、両方の時点で約８５％に増加し、Ｂ２Ｍ発現の上方制御は観察されなかった。

したがって、Ｂ２Ｍ発現に干渉するためのｓｈＲＮＡｍｉＲの使用は、実施例１に記載の以前に評価されたｓｈＲＮＡと比較した場合、より遅いノックダウン速度論およびわずかに低いノックダウン規模を有利にもたらしたが、より安定な表現型および毒性の大幅な低下をもたらした。この研究で観察された優れた結果は、ＣＡＲＴ細胞における内因性タンパク質発現を下方制御するためのｓｈＲＮＡｍｉＲの使用のための初期概念実証を提供し、これは特定の状況における遺伝子ノックアウトよりも有利であり得る。

実施例３
さらなるＢ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の設計および特性評価

６つのさらなるＢ２Ｍガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列を同定し、ｍｉＲ－Ｅ骨格にクローニングし、実施例２に記載の抗ＣＤ１９ＣＡＲ構築物のＣＡＲの終止コドンとポリＡ転写ターミネータとの間に挿入した。Ｂ２Ｍ７２８５ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号９および１０として示される。Ｂ２Ｍ７２８６ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１１および１２として示される。Ｂ２Ｍ７２８７ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１３および１４として示される。Ｂ２Ｍ７２８８ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１５および１６として示される。Ｂ２Ｍ７２８９ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１７および１８として示される。Ｂ２Ｍ７２９０ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１９および２０として示される。これらのさらなるＢ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を、Ｂ２Ｍ発現をノックダウンする能力について試験した。

この研究では、アフェレーシスサンプルをドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、Ｔ細胞受容体アルファ定常遺伝子座のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションした。６つのＣＡＲ－ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物（構築物７２８５～７２９０）を、ヌクレオフェクション中にＴＲＣ１－２ＲＮＡと同時に線状化ＤＮＡ（２μｇ／サンプル）としてＴ細胞に送達した。あるいは、Ｔ細胞に、ヒトＢ２Ｍ遺伝子中のＢ２Ｍ１３－１４認識配列（配列番号６０）を認識して切断するＢ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９ヌクレアーゼをヌクレオフェクトした（国際公開第２０１７１１２８５９号パンフレットを参照されたい）。これは、Ｂ２Ｍノックアウト細胞上に存在するバックグラウンドシグナルを定義することによって、ｓｈＲＮＡｍｉＲノックダウンに存在するＢ２Ｍ表面シグナルの量の状況を説明するために含めた。

ヌクレオフェクション後４および１１日目に、培養物のサンプルを抗ＣＤ３－ＢＢ５１５（クローンＳＫ７、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）、抗Ｂ２Ｍ－ＰＥ（クローンＴＵ－９９、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを使用）で染色した。Ｂ２Ｍレベル（ＰＥチャネル中の平均蛍光強度によって測定）を、同じ培養物由来の細胞のＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団とＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団との間で比較した。

ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団およびＣＤ３＋ＣＡＲ－集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、下記の表１において対応するｓｈＲＮＡｍｉＲの横に列挙する。ノックダウンのパーセントを、（ｓｈＲＮＡｍｉＲ＋集団のＭＦＩ／参照集団のＭＦＩ）×１００として定義する。表にしたデータは、ヌクレオフェクション後１１日目に取得した。構築物７２８９および７２９０は、試験した７つの構築物の中で最大のＢ２Ｍ干渉を示した。Ｂ２Ｍノックアウト細胞上に存在するバックグラウンドシグナルは、参照集団の２％未満である（列挙せず）。

この研究で試験した７つの構築物はすべて、ある程度の安定したＢ２ＭノックダウンおよびＣＡＲ発現を示した。興味深いことに、この研究は、内因性タンパク質ノックダウンの程度が、異なるガイド鎖およびパッセンジャー鎖の選択によって調節され得ることを実証した。ｓｈＲＮＡｍｉＲアプローチによって提供されるこの柔軟性は、さまざまな程度の内因性タンパク質ノックダウンがほぼ完全なノックアウトよりも好ましい場合に有利であり得る。７２８２、７２８８、７２８９、および７２９０でコードされた候補配列をさらなる実験で調査した。

実施例４
ｓｈＲＮＡｍｉＲＢ２ＭＣＡＲＴ細胞の同種異系性およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞殺滅に対する感受性

これらの研究では、同種抗原特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）またはＮＫ細胞による細胞溶解に対する細胞の感受性についての、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用した不完全であるが安定したノックダウンと比較して、遺伝子アブレーションによるＢ２Ｍのノックアウトの効果を評価した。非血縁健常ドナー由来の単球由来樹状細胞を使用してＣＴＬをプライミングして、同種抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を活性化および増殖させた。

アフェレーシスサンプルを２人の非血縁健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。樹状細胞を調製するために、アフェレーシスサンプルからの未分画単核細胞をポリスチレン細胞培養フラスコにプレーティングし、１～２時間接着させた。非接着細胞を捨て、接着細胞を、単球を樹状細胞様細胞に分化させるサイトカイン混合物（８００Ｕ／ｍｌＧＭ－ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌＩＬ－４、いずれもＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製）中で６日間培養した。樹状細胞（ＤＣ）を収集し、非血縁ドナー由来のＴ細胞と共にさまざまな比率でプレーティングした。最初の２４時間の共培養は、外因性サイトカインの非存在下で行った。その後、ＩＬ－２を１０ｎｇ／ｍｌで培養物に添加した。

共培養を５日間行い、ＭｉｌｔｅｎｙｉＣｌｉｎｉＭＡＣＳＣＤ４マイクロビーズおよびＬＳカラムを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させることによってＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した。ＣＤ３－ＰＥ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ８－ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して純度を評価した。次いで、プライミングされたＣＴＬを、ＤＣを生成したのと同じドナー由来の標的Ｔ細胞と共培養した。標的Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、標的Ｔ細胞を、メガヌクレアーゼＢ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９を使用してＢ２Ｍ遺伝子座で編集（Ｂ２ＭＫＯ）するか、またはＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２を使用してＴＲＡＣ遺伝子座で編集した。ＴＲＡＣ編集標的Ｔ細胞に、ＡＡＶ７２０６（対照ＣＡＲＴ）またはＡＡＶ７２８９（Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲ）のいずれかを２５，０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩで形質導入した。

ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗Ｂ２Ｍ－ＰＥ（クローンＴＵ－９９、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３－ＰＥ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ＦＭＣ６３－ＢＶ４２１（自社生産のクローンＶＭ１６）を使用して、Ｂ２Ｍ－画分またはＣＡＲ＋画分を９９％超の純度にＦＡＣＳ選別した。選別した標的細胞を１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、１：５～５：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で同種抗原感作ＣＴＬと共に培養物中に入れた。培養セットアップの１８時間後、サンプルを色素陽性生標的細胞について分析し、生存標的細胞の数を「エフェクターなし」対照と比較することによって殺滅パーセントを計算した。

ナチュラルキラー（ＮＫ）応答も測定した。ＮＫ細胞を、ＣＤ５６陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣサンプルから磁気的に濃縮した。濃縮されたＮＫ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ標識ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＡＡＶ６－７２０６で作製）、Ｂ２ＭノックダウンＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲを含有するＡＡＶ６－７２８９で作製）、またはＢ２ＭノックアウトＴ細胞と１８時間共培養した。１８時間の共培養後、色素陽性生存標的細胞を計数し、殺滅パーセントを計算した。

正常レベルのＢ２Ｍ表面発現を有するＣＡＲＴ細胞を、プライミングされた同種抗原特異的ＣＴＬによって殺滅させた（図６Ａ）。Ｅ：Ｔ比が上昇するにつれて、それに応じて殺滅パーセントが増加し、２：１のＥ：Ｔ比で最大７４％の殺滅があった。Ｂ２Ｍ遺伝子座で遺伝子編集され、Ｂ２Ｍタンパク質の表面発現を完全に欠いているＴ細胞は、各Ｅ：Ｔ比でＢ２Ｍ＋対照ほど効率的に殺滅されなかった。Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲをコードし、正常なＢ２Ｍ表面レベルの５～１０％を発現するＣＡＲＴ細胞で観察された殺滅レベルは、同様に、プライミングされたＣＴＬによって、Ｂ２ＭＫＯによって観察されたものよりも低いパーセンテージで非効率的に殺滅された。

Ｂ２Ｍノックアウト細胞は、Ｅ：Ｔ比と相関してＮＫ細胞によって殺滅され、５：１のＥ：Ｔ比で最大５０％の殺滅に達したことがさらに観察された（図６Ｂ）。操作されていないレベルのＢ２Ｍ発現を有するＣＡＲＴ細胞は、ＮＫ細胞によって効率的に殺滅されなかったが、いくらかのバックグラウンド殺滅が最も高いＥ：Ｔ比で観察された。注目すべきことに、Ｂ２Ｍノックダウン細胞は、ＮＫ細胞によって非効率的に殺滅されたが、最も高いＥ：Ｔ比でいくらかの殺滅（２８％）が観察された。

メガヌクレアーゼによるＢ２Ｍ発現の遺伝子アブレーションは、プライミングされた同種抗原特異的ＣＴＬによる殺滅に対して高度に耐性の細胞をもたらしたが、それらはＮＫ細胞によって容易に殺滅された。ｓｈＲＮＡｍｉＲアプローチを使用して内因性Ｂ２Ｍを正常レベルの５～１０％に安定にノックダウンすると、ＣＴＬに対して同様に耐性であるが、ＮＫ細胞溶解に対して実質的に感度が低い細胞が得られた。これは、これらの細胞が、Ｂ２Ｍの完全なノックアウトを有する同種異系ＣＡＲＴ細胞よりもインビボでＮＫ細胞殺滅を回避する可能性が高いことを示唆している。

Ｂ２ＭのｓｈＲＮＡｍｉＲ媒介ノックダウンに加えて、第２の遺伝子編集アプローチをＮＫ細胞回避について評価した。第２のアプローチは、Ｂ２Ｍ遺伝子に切断部位を生成するように操作されたメガヌクレアーゼの使用、および切断部位へのドナー鋳型の導入を含んだ。このドナー鋳型は、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチド（配列番号６６）をコードした。細胞表面に発現された場合、ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害受容体に結合することが知られており、ＮＫ細胞媒介溶解からＨＬＡ－Ｅ＋細胞を保護することが示されている。ここでは、ＨＬＡ－Ｅコード配列のＢ２Ｍ遺伝子への標的挿入がＢ２Ｍ発現を同時にノックアウトし、したがってＣＡＲＴ細胞の同種異系性を低下させ、ＮＫ細胞殺滅を阻害するためにＨＬＡ－Ｅを発現することができるかどうかを調べた。

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常で、情報を知らされ、補償されたドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８－ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１ｅ６細胞のサンプルに、Ｂ２Ｍ遺伝子座中のＢ２Ｍ１３－１４認識配列（配列番号６０）を認識して切断するＢ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１ｕｇをエレクトロポレーションした。

エレクトロポレーションの直後に、グリシン－セリンリンカーによって連結された３つのポリペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質（配列番号６６）をコードするＡＡＶ７３４６を用いて細胞に形質導入した。第１のポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチド（配列番号１２０）とそれに続く（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号１２１）とを含む九量体である。第２のポリペプチドは、完全長コドン最適化ヒトＢ２Ｍ遺伝子（配列番号１１９をコードする）とそれに続く（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号１２２）である。第３のポリペプチドは、ヒトＨＬＡ－Ｅ－０１：０３配列（配列番号１１８）である。導入遺伝子はＪｅＴプロモータの制御下にあり、双方向ポリＡ配列によって終結する。導入遺伝子は、導入遺伝子をＢ２Ｍ１３－１４切断部位に挿入するように指向させる相同アームに隣接している。

３０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２を含有する完全Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地で少なくとも６日間培養した後、細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＷ６／３２－Ｂ２Ｍ編集細胞を検出するため）および抗ＨＬＡ－Ｅ－ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローン３Ｄ１２）で染色した。Ｂｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＳまたはＬＸを使用して、細胞をノックアウト／ノックイン頻度について分析した。ＨＬＡ－ＡＢＣ^－ＨＬＡＥ^＋細胞を、Ｂｅｃｋｔｏｎ－ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙを使用してＦＡＣＳによって精製した。形質導入されていないＨＬＡ－ＡＢＣ－（Ｂ２Ｍ編集され、ＡＡＶなし）を対照として選別した。この実施例において以前に記載されたように、ＣＴＬおよびＮＫ細胞による殺滅に対する感受性について、選別された細胞を測定した。

Ｂ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９ＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞は、標準的なＭＨＣＩタンパク質ＨＬＡ－Ａ、ＢおよびＣならびにＨＬＡ－Ｅの表示を欠く集団を発達させた（図７Ａ）。Ｂ２Ｍ編集細胞にＡＡＶ７３４６を用いて形質導入すると、高レベルのＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子を発現するＨＬＡ－ＡＢＣ－細胞の集団が現れる（図７Ｂ）。これらの集団を９９％超の純度に選別した（図８）。

図９Ａに示されるように、Ｂ２Ｍ編集されていないＣＡＲＴ細胞は、同種抗原プライムＣＴＬによって殺滅され、Ｅ：Ｔ比の上昇につれて、ＣＡＲＴ殺滅の増加が観察された（最大で約７５％に達した）。対照的に、Ｂ２Ｍノックアウト細胞およびＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子を発現するＢ２Ｍノックアウト細胞は両方とも効率的に殺滅されず（１０％以下）、Ｅ：Ｔ比の上昇による殺滅の増加は観察されなかった。

図９Ｂに示すように、ＮＫ細胞による殺滅を測定した場合、Ｂ２Ｍが十分なＣＡＲＴ細胞はＮＫ細胞によって効率的に標的化されなかったが、Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞は効率的に殺滅された（最大約５０％）。ＨＬＡ－ＡＢＣ発現を欠くにもかかわらず、ＨＬＡ－Ｅ^＋細胞は、Ｂ２Ｍが十分な細胞で観察される程度に匹敵する程度までＮＫ細胞溶解から保護された。これらのデータは、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子破壊が、同種抗原プライムＣＴＬによる細胞溶解からＴ細胞を保護し、ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子が、ＮＫ細胞溶解の自己機序の喪失を防止することを示している。

実施例５
ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＢ２Ｍのノックダウンを有するＣＡＲＴ細胞のインビボ有効性およびＢ２Ｍノックダウンの安定性

これらの研究は、対照ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を標的細胞に曝露し、インビボで活性化した後の細胞と比較した、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＢ２Ｍのノックダウンを有するＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の有効性を評価するため、およびインビボでのＢ２Ｍノックダウンの安定性を決定するために行った。

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を、前述のように解凍し、静置し、活性化した。活性化後３日目に、細胞に、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼ（ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、直ちに、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ配列を担持する７２０６ＡＡＶベクター、またはＣＡＲの終止コドンとポリアデニル化配列との間にコードされるＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを有するＣＤ１９ＣＡＲを担持する７２８９ＡＡＶベクターを用いて形質導入した。両群由来の残存ＣＤ３＋（未編集）ＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ３磁気濃縮キットを使用して枯渇させ、処分し、両群由来の細胞を、前述のように枯渇後の増殖後に凍結保存した。

雌ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するＮＡＬＭ－６ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株を接種し、１週間後、ビヒクルコントロール、ＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞、またはＣＤ１９ＣＡＲ－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲ細胞のいずれかを５ｅ６ＣＡＲＴ細胞／マウスの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（ｎ＝動物５匹／群）。

ルシフェラーゼ活性を、遮光性のサンプル室に取り付けられたＣＣＤカメラを備えたＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＭＡ）イメージングシステムを使用して、生きた動物において測定した。

イメージングの当日に、動物にルシフェリン基質を注射し、麻酔誘導室に入れた。鎮静の後、ルシフェリン基質後に一定の間隔で画像を取得するために、生理学的温度に加熱したステージを備えたイメージングチャンバー内に動物を背臥位で置いた。取得時間は、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアによって自動的に決定された。目的の領域を各マウスの周りに引き、フラックスを定量化し、光子／秒（ｐ／ｓ）として報告した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア４．５．２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＭＡ）を使用してデータを分析し、エクスポートした。

マウス血液中に存在するヒトＴ細胞上のＢ２Ｍ発現の分析のために、ＣＡＲＴ細胞の投与後１４日目に個々のマウスから血液サンプルを採取した。赤血球を溶解し、次いでサンプルを洗浄し、ヒトＣＤ４５およびＢ２Ｍの存在について染色し、前述のようにフローサイトメトリによって分析した。

図１０Ａに示すように、ＮＡＬＭ－６細胞を移植し、ビヒクル（三角形の黒い線）で処置したマウスは、生物発光イメージングによって測定されるように、研究の経過にわたって腫瘍成長の増加を示し、経時的に総フラックスが着実に増加した。対照的に、ビヒクル処置動物と比較して総フラックスの減少によって観察されるように、ＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞（丸のついた濃い灰色の線）または統合されたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲ（三角形のついた薄い灰色の線）を含むＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞のいずれかで処置したマウスは、研究の経過にわたって迅速かつ持続可能な抗腫瘍活性を媒介した。

ＣＡＲＴ投与の１４日後に、血液サンプルを採取して、ヒトＣＤ４５＋細胞上のＢ２Ｍの発現を評価した。図１０Ｂに示すように、Ｂ２Ｍ発現のＭＦＩは、統合されたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを有するＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞では、対照ＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞と比較して９０％を超えて減少しており、活性化され、標的細胞のクリアランスを媒介しているＢ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲ保有細胞が、ゲノムに統合されたＢ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲを有さない対照細胞と比較してＢ２Ｍ発現レベルが依然として低下していることを示した。

ＣＡＲを発現する細胞におけるＢ２Ｍ発現の標的ノックダウンを可能にする構築物の一方にｓｈＲＮＡｍｉＲベクターが含まれることのみが異なる、ＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞の２つの群を作製した。両方の群のＣＡＲＴ細胞は、白血病の異種移植モデルにおいて腫瘍負荷を軽減することができた。マウスから採取した血液サンプルにより、Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲを有するヒトＴ細胞が、対照ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞群のマウスの血液中のＴ細胞よりも細胞表面上のＢ２Ｍ発現レベルが低いことが確認され、Ｂ２Ｍのノックダウンが、ヒト白血病の関連するマウスモデルにおいて活性化され、標的細胞の殺滅を媒介している細胞においてさえ安定であることを示している。

実施例６
ＣＡＲＴ細胞におけるＣＳ１の安定なノックダウン

これらの研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を使用してＣＳ１を安定にノックダウンすることができるかどうかを決定するために開始した。ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７ｓｈＲＮＡｍｉＲの３つの候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ（ＢＣＭＡ特異的ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、Ｎ６共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む）の終止コドンの後に配置した。これらを構築物７２１０１、７２１０２、および７２１０３と命名した。

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常で、情報を知らされ、補償されたドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８－ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１ｅ６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１ｕｇをエレクトロポレーションした。ヌクレオフェクションを、ＣＡＲをコードする線状化ＤＮＡの２ｕｇ／１ｅ６細胞および候補ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７ｓｈＲＮＡｍｉＲのうちの１つの存在下で行った。この実験では、個々のサンプルに、上記のようなＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、およびＲＮＡｉの特徴をコードしないＢＣＭＡＣＡＲ構築物をヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションの７日後、培養物を抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＳ１（クローン１６２．１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびビオチン化ＢＣＭＡ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で染色して、ＣＡＲ（ストレプトアビジン－ＡＰＣまたはＢＶ４２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄを用いて対比染色）を検出した。

ＣＡＲ＋細胞上のＣＳ１表面発現レベルを、同じ培養物中のＣＡＲ－細胞上に表示されるレベルと比較することによって、相対的なノックダウンの大きさを測定することができた。構築物７２１０１および７２１０２は、ＣＳ１発現を目に見えるように変化させなかったが、平均蛍光強度は、それぞれ２６％および３０％のノックダウンを示唆した。７２１０３を使用して産生されたＣＡＲＴ細胞は、目に見えるほど低いレベルのＣＳ－１を示し、高発現細胞はほとんどなく、３６％のノックダウンと計算された（図１１）。

これらの実験は、内因性ＣＳ１の発現がＣＡＲＴ細胞において安定に低下され得ることを実証した。産生中のフラトリサイド活性を防止するために、ＣＳ１特異的ＣＡＲＴ細胞上のＣＳ１をノックダウンするという目的で、候補７２１０３をさらに調べることになる。

実施例７
ＣＡＲＴ細胞におけるトランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）の安定なノックダウン

これらの研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を使用してさらなる内因性遺伝子のＴＧＦＢＲ２を安定にノックダウンすることができるかどうかを決定するために開始した。ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのための候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列を同定し、ｍｉＲ－Ｅ足場に組み込み、（実施例１に記載されるように）ＦＭＣ６３に基づく抗ＣＤ１９ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。ＴＧＦＢＲ２７２１１０ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号２７および２８として示される。ＴＧＦＢＲ２７２１１１ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号２９および３０として示される。ＴＧＦＢＲ２７２１１２ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３１および３２として示される。ＴＧＦＢＲ２７２１１３ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３３および３４として示される。ＴＧＦＢＲ２７２１１４ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３５および３６として示される。

アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。

刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションした。ヌクレオフェクションを、ＣＡＲをコードする線状化ＤＮＡの２μｇ／１×１０^６細胞および候補ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲのうちの１つの存在下で行った。この実験では、個々のサンプルに上記のＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２をヌクレオフェクションし、ＦＭＣ６３抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードするがＲＮＡｉの特徴を含まないＡＡＶ７２０６を用いて形質導入した。

細胞を、抗ＴＧＦＢＲ２抗体ＭＭ００５６－４Ｆ１４（Ａｂｃａｍ）およびＰＥにコンジュゲートされた抗マウスκ軽鎖二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、ヌクレオフェクション後７、１０および１４日目にＴＧＦＢＲ２発現について分析した。ＣＡＲ＋細胞を、自社で作製した抗ＦＭＣ６３－Ａｌｘ６４７を使用して同定した。ＣＡＲ＋上のＴＧＦＢＲ２シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＣＡＲ－細胞上のものと比較し、ノックダウンパーセントを計算した。ＣＡＲ＋事象の頻度は、異なる構築物にわたって一貫しており、４．９％～６．７％の範囲であった（図１２）。

ＴＧＦＢＲ２表面レベルは、ＣＡＲ＋集団ではサンプルごとに変動したが、ＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれたＣＡＲ－ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物を有さないＣＡＲ－集団では比較的一貫していた。配列７２１１１、７２１１２および７２１１３は、実験全体を通して最も堅固なノックダウンを支援するように思われた（ＴＧＦＢＲ２ＭＦＩによる測定、以下の表２に要約する）。これらの３つの配列をさらなる研究のために選択した。

ＴＧＦＢＲ２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列のこのスクリーニングにより、さまざまなレベルのＴＧＦＢＲ２の安定なノックダウンを有するＣＡＲＴ細胞を調製可能であることが実証された。特に、構築物７２１１１、７２１１２および７２１１３は、ＣＡＲ－ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列が首尾よく組み込まれた細胞における表面ＴＧＦＢＲ２の堅固な減少を支援した。

本明細書に記載のｓｈＲＮＡｍｉｒ媒介ノックダウンアプローチを、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のヌクレアーゼ媒介ノックアウトと比較するために、さらなる研究を行った。

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常で、情報を知らされ、補償されたドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８－ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１ｅ６細胞のサンプルに、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２をコードするＲＮＡ１ｕｇ、またはＴＧＦＢＲ２遺伝子を標的とする２つのヌクレアーゼ候補：ＴＧＦ１－２ｘ．５（配列番号６４）またはＴＧＦ１－２Ｌ．２９６（配列番号６５）のうちの１つをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２を補充した完全Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地中で６日間培養し、その後編集効率を分析した。これは、細胞を抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体（ＡｂｃａｍクローンＭＭ００５６－４Ｆ１４）で染色し、続いてＰＥにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧκ軽鎖（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローンＲＭＫ４５）で染色することによって達成した。データを、Ｂｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＳまたはＬＸで取得した。

ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２をエレクトロポレーションしたＴ細胞に、ＡＡＶ７２１１２（実施例１に記載の抗ＣＤ１９ＦＭＣ６３ＣＡＲをコードし、ＣＡＲ終止コドンの後およびＴＧＦＢＲ２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲがポリＡ配列の前に挿入されている）またはＡＡＶ７２０６（ＲＮＡｉを含まない対照ＦＭＣ６３ＣＡＲをコードする）を用いて直ちに形質導入した。培養の６日間後、ＣＤ３－ＣＡＲ＋細胞を、上記の方法を使用してＦＡＣＳによって精製した。さらに、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６編集培養物由来のＴＧＦβＲＩＩ－細胞をこの様式で選別した。選別した細胞を無血清培地中で一晩静置した後、５００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦβ１（ＴＧＦＢＲ２のリガンド）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で刺激した。ＴＧＦβ１添加の３０分後、細胞を回収し、Ｐｈｏｓ－Ｆｌｏｗｌｙｓｅ－ｆｉｘ緩衝液およびＰｈｏｓ－ＦｌｏｗＦｉｘ－Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して、染色のために直ちに調製した。固定された細胞を抗ｐＳＭＡＤ２／３－ＰＥ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、データをＢｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＬＸで取得した。

モックヌクレオフェクトＴ細胞を抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体および二次抗体で、または二次抗体単独で染色して、それぞれ、ＴＧＦβＲＩＩの表面検出の陽性対照および陰性対照として役立てた。

モックヌクレオフェクト細胞と比較して、ＴＧＦ１－２ｘ．５の導入は培養物中の細胞の３８．６％においてＴＧＦＢＲ２ノックアウトをもたらしたが、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６の導入は６９％のより高いノックアウト頻度をもたらした（図１３）。

ＴＧＦβＲＩＩ発現が破壊されたＴ細胞（メガヌクレアーゼ対ＲＮＡｉ）を選別し、ＴＧＦβ１で刺激して、ＴＧＦβＲの下流シグナル伝達物質であるＳＭＡＤ２／３のリン酸化を評価した。ＴＧＦβ１の非存在下で低いｐＳＭＡＤ２／３シグナルおよびＴＧＦβ１曝露後により高いｐＳＭＡＤシグナルを示すＴＲＡＣ編集Ｔ細胞と比較して、ＴＧＦＢＲ２ＫＯ細胞はリガンド曝露にほとんど応答しない（図１４）。ＴＧＦＢＲ２編集サンプルにおいて事象のある小さな集団が、サイトカイン曝露後にＳＭＡＤ２／３リン酸化を示すが、これはおそらく選別不純物を表す。ＴＧＦβ１に応答してＳＭＡＤ２／３をリン酸化する選別されたＴＧＦβＲＩＩ十分Ｔ細胞（７２０６ＣＡＲＴ）、およびＴＧＦβ１に応答してＳＭＡＤ２／３をリン酸化しない選別されたＴＧＦＢＲ２ＫＯ細胞と比較して、ＴＧＦＢＲ２指向性ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲＴ細胞は、ＳＭＡＤ２／３を陽性対照および陰性対照によって線引きされる範囲にわたるレベルにリン酸化する（図１５）。

ＴＧＦＢＲ２のメガヌクレアーゼ媒介ノックアウトおよびｓｈＲＮＡｍｉＲ媒介ノックダウンが、（実施例６に記載されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する）ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲＴ細胞におけるｐＳＭＡＤ２／３シグナル伝達を低下させることができるかどうかを決定するために、さらなる実験を行った。ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞の４つの実験群を調製し、ｐＳＭＡＤ２／３レベルについて試験した。第１および第２の群には、それぞれ未処理対照およびＴＧＦβ１処理ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞が含まれた。第３および第４の群には、それぞれ、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼでノックアウトされたＴＧＦＢＲ２、または７２１１２ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲでノックダウンされたＴＧＦＢＲ２のいずれかを有するＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞が含まれた。

ＣＡＲＴ細胞の各群を、ＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼを使用して調製し、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物を上記のようにこの認識配列内に挿入した。ＴＧＦＢＲ２のノックアウトを有するＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼを用いて調製し、ＴＧＦＢＲ２のノックダウンを有する細胞を、上記のように７２１１２ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いて調製した。それぞれのＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞群をＴＧＦβ１（５００ｎｇ／ｍｌ）で処理し、すべての細胞群を回収し、上記のように分析した。ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞については、ＴＧＦＢＲ２陰性細胞集団についてフローサイトメトリをゲーティングした。

図１６に示されるように、未処理ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞は低レベルのｐＳＭＡＤ２／３を有し、これに対して、ＴＧＦβ１による処理はこれらのレベルを増大させた。ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼによるＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックアウトは、ｐＳＭＡＤ２／３を未処理ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞対照と同等またはそれより低いレベルまで低下させた。７２１１２ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックアウトはまた、ｐＳＭＡＤ２／３を未処理ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞対照と同等のレベルまで低下させた。

したがって、これらの研究は、遺伝子編集またはｓｈＲＮＡｍｉＲのいずれかによるＴＧＦＢＲ２破壊が、ＣＡＲＴ細胞のＳＭＡＤ２／３をリン酸化する能力の低下をもたらすことを実証した。ＳＭＡＤリン酸化は、障害されたＴＧＦＢＲ２遺伝子を有するＣＡＲＴ細胞では検出されなかったが、ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する細胞は不均一であり、細胞はさまざまな程度でＳＭＡＤ２／３をリン酸化する。

実施例８
ＣＡＲＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックダウン対ノックアウトの比較

ＴＧＦβ経路に対するさまざまな変更の後でＣＡＲＴ細胞の活性を評価するさらなる研究を行った。ＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ１－２部位に挿入されたＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ（実施例６に記載）を使用して、ＣＡＲＴ細胞を、健常な補償されたドナーのＴ細胞から生成した（他の箇所に記載）。いくつかの変異体では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする配列も、ＣＡＲと同じカセット中のＴＲＣ１－２部位（ＣＡＲ終止コドンとポリＡ配列との間に配置される）に導入された。一変異体では、ｓｈＲＮＡｍｉＲはＴＧＦＢＲ２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲ（構築物７２１５４）であったが、別の変異体では、ＴＧＦβ機能に関連しないｓｈＲＮＡｍｉＲ（Ｂ２Ｍを標的とする－構築物７２１５５）を導入した。ＣＡＲＴ細胞の第３の変異体を、構築物７２１５５を使用して作製したが、ＴＧＦＢＲ２遺伝子をノックアウトするために、それらを、上記のＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアーゼを使用してＴＧＦＢＲ２遺伝子座において編集した。ＴＧＦＢＲ２ＫＯ群のＣＡＲＴ細胞は６０％のＫＯを含んでいた。

ＣＡＲＴ細胞の各群に、さまざまな腫瘍標的：Ｋ５６２陰性対照細胞、ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトしたＫ５６２細胞、およびＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞（Ｃ２２３ＳＣ２２５Ｓ点変異）を負荷した。１つの実験では、ＣＡＲＴ細胞および標的を１：１の比でプレーティングした。図１７に示す時点において、Ｔ細胞および任意の生存標的を計数し、各時点で１：１の比が再確立されるように新鮮な標的を培養物に添加した。時間に対する培養中のＴ細胞の数を図１７に示す。陰性対照Ｋ５６２細胞に応答して増殖するＣＡＲＴ細胞は観察されなかった。

正常レベルのＴＧＦＢＲ２発現を有するＣＡＲＴ細胞は、ＢＣＭＡ＋標的を負荷した場合、共培養の６日目までに１５倍超増殖したが、ＴＧＦＢ分泌標的細胞の存在下では５倍しか増殖しなかった。比較すると、ＴＧＦＢＲ２ノックダウン細胞は、ＢＣＭＡ＋標的に応答して同様に増殖するが、ＴＧＦＢ分泌標的による阻害は少ない（１５倍対１０倍）。別の実験では、ＣＡＲＴ細胞を１：９のＥ：Ｔ比で標的と共にプレーティングし、生存標的細胞を５日目および７日目に計数した。７日目までに、ＴＧＦＢＲ２ノックダウン細胞は、それらのＴＧＦｂ分泌能にかかわらず、ＢＣＭＡ＋標的細胞を実質的に根絶した。対照ＣＡＲＴ細胞は、対照ＢＣＭＡ＋標的を根絶しただけであり、ＴＧＦｂ分泌ＢＣＭＡ＋標的を排除しなかった（図１８）。

ＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアーゼで編集してＴＧＦＢＲ２をノックアウトしたＣＡＲＴ細胞は、対照、または標的細胞によるＴＧＦｂ分泌に関連しなかったＴＧＢＦＲＩＩノックダウンＣＡＲＴ細胞を上回る機能的利点を示した。図１９に示されるように、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＣＡＲＴ細胞を含有する培養物は、実験の１７日間にわたって連続的な増殖を示した。これは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＣＡＲＴ細胞を含有する培養物における、ＣＤ４：ＣＤ８比の持続的な上昇に関連していた（図２０）。

まとめると、これらのデータは、ＴＧＦ１－２Ｌ２９６による編集、またはＴＧＦＢＲ２－特異的（ｓｅｐｃｉｆｉｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲの包含が、ＣＡＲＴ細胞が抑制量のＴＧＦｂ１の存在下でエフェクター機能を維持および実行可能にすることを示している。

実施例９
ＣＡＲＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックダウン対ノックアウトの比較

実施例８に記載のＣＡＲＴ変異体に多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６、または活性ＴＧＦｂ１を分泌するように操作されたＵ２６６細胞をさらに繰り返し（上記のように）負荷した。Ｋ５６２実験からの知見と一致して、対照ＣＡＲＴ細胞の増殖ピークは、対照Ｕ２６６標的と比較して、ＴＧＦｂ分泌Ｕ２６６標的に応答して約５０％低下した（図２１）。ＴＧＦＢＲ２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲＴ細胞は、ＴＧＦｂ１分泌Ｕ２６６標的によって阻害されなかった。ＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアーゼで編集してＴＧＦＢＲ２をノックアウトしたＣＡＲＴ細胞は、他のＣＡＲＴ変異体よりも多数に増殖し、この実験の１９日間、多数を維持した（図２２）。これに伴い、ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度も上昇した（図２３）。図２３のヒストグラムは共培養の１６日目に得られ、対照ＣＡＲＴ培養物（７２１５４、ＣＤ４＋約１６％）と比較して、ＴＧＦＢＲ２ノックダウンＣＡＲＴ培養物はわずかにＣＤ４頻度（２３％）が上昇したが、培養された二重編集ＣＡＲＴは６３％のＣＤ４＋細胞を含んでいたことを示している。

増殖のピーク後の、培養物中の標的細胞を根絶するＣＡＲＴ細胞の能力に関してさらなる観察を行った。１６日目の時点の、ＢＣＭＡ（ｙ軸）またはＴＧＦｂ－ＧＦＰ導入遺伝子（ｘ軸）を発現する生存標的細胞を示すドットプロットを図２４に示す。１３日目の再チャレンジ後の１６日目にＴ細胞数の減少が観察されたにもかかわらず、対照およびＴＧＦＢＲ２ノックダウンＣＡＲＴ細胞の両方がＵ２６６標的を根絶することができた。Ｔ細胞数の減少を示さなかった二重編集ＣＡＲＴ細胞もまた、１３日目と１６日目との間にＵ２６６標的を根絶した。重要なことに、ＴＧＦｂ耐性を有する（ＴＧＦＢＲ２ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するか、またはＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアーゼで編集された）ＣＡＲＴ細胞のみが、ＴＧＦｂ分泌Ｕ２６６標的を排除することができた。対照ＣＡＲＴ細胞は、ＴＧＦｂ分泌Ｕ２６６標的を殺滅させることができなくなり、１３日目から１６日目までに共培養物の９０％超を占めるように増殖した。

これらのデータは、ｓｈＲＮＡｍｉＲノックダウンまたは遺伝子ノックアウトのいずれかによって、ＴＧＦＢＲ２の発現が乱されたＣＡＲＴ細胞が、抑制レベルのＴＧＦｂサイトカインの存在下で増殖し、標的細胞を排除することができるという実施例８における結論を裏付けている。

実施例１０
ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ５２の安定なノックダウン

これらの研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を使用してさらなる内因性遺伝子のＣＤ５２を安定にノックダウンすることができるかどうかを決定するために開始した。ＣＤ５２７２１２３ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３７および３８として示される。ＣＤ５２７２１２４ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３９および４０として示される。

アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションした。線状化ＤＮＡのサンプルも、ヌクレオフェクション時に最終濃度２μｇ／１×１０^６細胞まで細胞に添加した。この実験では、それぞれが７２０６の変異体であり、それぞれがＦＭＣ６３ＣＡＲ遺伝子の終止コドンの下流であるがポリＡ転写ターミネータの上流に異なるＣＤ５２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする、２つの異なる線状化構築物を使用した。

ヌクレオフェクション後１０日目に、細胞の培養物を抗ＣＤ３－ＢＶ７１１（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＦＭＣ６３－Ａｌｘ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）および抗ＣＤ５２－ＰＥクローン４Ｃ８ＢＤＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＣＤ５２の強度を、ＣＤ３－ＣＡＲ＋細胞と未編集のＣＤ３＋／ＣＡＲ－細胞との間で比較した。

ヌクレオフェクション後１０日目に、ＴＲＡＣ編集ＣＡＲ＋細胞上のＣＤ５２強度を、同じ培養物中の未編集（ＣＤ３＋ＣＡＲ－）細胞上のＣＤ５２強度に対してプロットした。構築物７２１２３および７２１２４をヌクレオフェクトされた培養物からのＣＡＲ＋集団（影のないヒストグラム）は、対応する参照集団（影のあるヒストグラム）よりも約１ｌｏｇ低いＣＤ５２シグナルを発現し、ＣＡＲ＋集団で約９０％の安定した低下を表した（図２５）。

この研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲアプローチが、ＣＡＲＴ細胞集団における内因性ＣＤ５２タンパク質を効率的かつ安定に約９０％ノックダウンするために活用できることを実証する。

実施例１１
ＣＡＲＴ細胞におけるｓｈＲＮＡｍｉＲによるタンパク質の多重ノックダウン

さらなる研究を、多重アプローチにおいてＣＡＲＴ細胞でのｓｈＲＮＡｍｉＲ媒介ノックダウンを使用することの実現可能性を決定するために行った。これらの研究では、Ｂ２ＭおよびＣＤ５２の両方を、ゲノムから安定に発現された異なるｓｈＲＮＡｍｉＲによる、同じＴ細胞中でのノックダウンのために標的化した。

これらの実験のために、アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションした。

線状化ＤＮＡのサンプルも、ヌクレオフェクション時に最終濃度１μｇ／１×１０^６細胞まで細胞に添加した。この実験では、３つの異なる線状化構築物を使用し、それぞれがＪｅＴ駆動抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現する７２０６の変異体であった。クローン７２９０と呼ばれる１つの配列は、ＣＡＲの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む。７２１２４と呼ばれる第２の構築物は、同じ位置にＣＤ５２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲを含有し、７２１５６と呼ばれる第３の構築物は、ＣＡＲの３’ＵＴＲにＣＤ５２ｓｈＲＮＡｍｉＲ、そのすぐ後にＢ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲを含有する。

エレクトロポレーション後、細胞を、３０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２を補充した完全Ｘ－ＶＩＶＯ１５中で７日間インキュベートした。この時点で、Ｔ細胞を、上に詳述したように、ＴＲＡＣ編集およびＣＡＲ挿入、ならびにＣＤ５２およびＢ２Ｍ発現について分析した。

ＣＡＲ^＋ＣＤ３^－細胞の集団を、ＣＤ５２およびＢ２Ｍ発現について各サンプル中の未編集ＣＤ３^＋ＣＡＲ^－細胞と比較した。７２９０ＤＮＡを投与したサンプルでは、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３＋ＣＡＲ－細胞と比較して、Ｂ２Ｍの表面レベル（平均蛍光強度によって測定）の９１％の低下を示した。両集団は、同等レベルの表面ＣＤ５２を示した。７２１２４ＤＮＡを投与したサンプルでは、ＣＡＲ＋集団は未編集集団と比較してＣＤ５２レベルの９０％の低下を示したが、Ｂ２Ｍレベルの低下は示さなかった。７２１５６ＤＮＡを含有するＣＡＲ^＋細胞は、参照集団と比較して、両方のレベル低下、ＣＤ５２（８９％）およびＢ２Ｍ（８８％）を示した（図２６）。さらに、ビオチン化抗ＣＤ５２試薬を、依然として高レベルのＣＤ５２を発現するＣＡＲ－細胞を枯渇させるための陰性選択アプローチに使用して、ＣＤ５２発現が低下したＣＡＲ＋細胞の集団を濃縮できることが実証された（図２７）。

これらの知見は、２つの異なる転写物に対して指向する２つの操作されたｓｈＲＮＡｍｉＲが、単一コピー標的挿入を介してＴ細胞に送達可能なこと、および両方のｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子が、一方のｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子のみを発現する対照と比較して、性能にほとんどまたは全く差がなく同時に機能し得ることを示す。

実施例１２
ＣＡＲ、ＨＬＡ－ＥおよびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする構築物の単一ゲノム遺伝子座への標的挿入

同種異系ＣＡＲＴ細胞持続性を改善し、潜在的なＮＫ細胞殺滅に対するそれらの感受性を低下させるためのアプローチにおける、ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の使用をさらに評価する研究を行った。これらの研究では、前述のＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼを使用して、４つの候補構築物をＴＲＣ１－２認識部位においてＴ細胞に挿入した。各構築物は、腫瘍抗原標的化のためのＣＤ１９特異的ＣＡＲ遺伝子（実施例１に記載されているが、配列番号７３のシグナルペプチドを含むように改変されている）、ＭＨＣＩ発現を低下させ、アロ反応性Ｔ細胞を回避するように最適化されたＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲ（前述の７２８９構築物で使用されるものと同じもの）、およびＮＫ細胞溶解を阻害するためのＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質遺伝子を含んでいた。図２８に示す構築物７３１６１～７３１６４は、プロモータ使用および転写終結の点で違いのある異なる構成でこれらの３つのエレメントを組み込んでいる。

構築物７３１６１（図２８Ａ）は、ＪｅＴプロモータ（配列番号６７）を使用して、ＣＡＲ、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質（配列番号６６）、およびｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子の発現を、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナル（標識ＢｉｐＡ；配列番号６８）で終結する単一転写物として駆動する。ｓｈＲＮＡｍｉＲは、ＨＬＡ－Ｅ０３－０１対立遺伝子のエクソン接合部に挿入された合成イントロン（配列番号６９）にコードされている。イントロンはスプライシングで切り出され、核マイクロＲＮＡ生合成機序によってプロセシングされるが、ＣＡＲ－ＨＬＡ－Ｅ転写物の残りはサイトゾルに輸送され、タンパク質に翻訳される。Ｐ２Ａ／フューリン部位（配列番号７０）は、ＣＡＲおよびＨＬＡ－Ｅ融合ポリペプチドの分離を可能にする。

構築物７３１６２～１６４（図２８Ｂ～図２８Ｄ）は、Ｐ２Ａ／フューリン切断部位を使用しないが、ＣＡＲおよびＨＬＡ－Ｅの発現を駆動するために別々のプロモータに依存する。７３１６２では、ｓｈＲＮＡｍｉＲイントロンはＣＡＲ遺伝子に移動し、その両方がＪｅＴプロモータによって制御され、ＢｉｐＡによって終結し、ＨＬＡ－Ｅは別個のＪｅＴプロモータによって制御され、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルによって終結する（配列番号７１）。７３１６３および７３１６４の構築物では、ｓｈＲＮＡｍｉＲイントロンはこの場合もまたＨＬＡ－Ｅにコードされ、ＣＡＲおよびＨＬＡ－Ｅの発現は別々のプロモータおよびターミネータによって制御される。７３１６３では、ＣＡＲ遺伝子はＪｅＴプロモータによって制御され、ＢｉｐＡによって終結し、ＨＬＡ－Ｅ発現はＥＦ１αコアプロモータ（配列番号７２）およびＢＧＨターミネータによって制御される。７３１６４では、両方の遺伝子は、別個のＪｅＴプロモータ、およびＢｉｐＡ（ＣＡＲ）またはＢＧＨ（ＨＬＡ－Ｅ）ターミネータのいずれかによって制御される。４つすべての構築物において、ＣＡＲ遺伝子は、編集されたＴ細胞の表面上のＣＡＲ密度を増加させるように最適化されたシグナルペプチド（配列番号７３）を含む。

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を、前述のように解凍し、静置し、活性化した。活性化後３日目に、細胞に、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼ（ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、直後に２５０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩでＡＡＶベクターを用いて形質導入した。細胞に、ＡＡＶ７２０６または７３１６１～７３１６４のうちの１つを投与した。さらに、刺激されたＴ細胞の他のサンプルに、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、および内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするヌクレアーゼＢ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９の両方をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。これらの細胞に、ＪｅＴ駆動ＨＬＡ－Ｅ遺伝子をコードし、Ｂ２Ｍ１３－１４部位に隣接する領域に相同な挿入を指向させるＡＡＶ７２０６およびＡＡＶ７３４６（前述）を用いて形質導入した。これらの細胞は、ダブルノックアウト、ダブルノックイン（ｄＫＯｄＫＩ）と呼ばれる。

編集およびＡＡＶ形質導入の６日後、細胞を、先に記載された試薬、ハードウェア、ソフトウェアおよび手順を使用して、ＣＡＲ、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＥおよびＣＤ３の表面発現についてフローサイトメトリによって分析した。

ＴＲＡＣ編集ＣＡＲＴ細胞の頻度、ならびにＣＡＲ染色の強度を評価し、図２９の表にまとめた。ＣＤ１９特異的ＣＡＲのみを発現する７２０６対照と比較して、構築物７３１６１および７３１６３は遜色がなかったが、構築物７３１６２および７３１６４はＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団を産生したが、効率的ではなかった。すべての実験構築物は、７２０６よりも高いＣＡＲ表面発現レベルが確認された（任意の蛍光単位で列挙したＭＦＩならびに７２０６シグナルのパーセンテージ）。これは、リーダーペプチド配列に対して行われた改善に起因する可能性がある。

すべての実験構築物は、Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲの発現および可変レベルのＨＬＡ－Ｅ発現から生じる、ＨＬＡ－ＡＢＣの等しく効率的なノックダウン（８９～９０％、図３０）が確認された。注目すべきことに、７３１６２および７３１６４の構築物は、ＨＬＡ－Ｅを発現するＣＤ３－／ＣＡＲ－集団の集団を生じさせた。この観察結果は、これらのサンプルにおけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞のより低い相対頻度と相まって、ベクターの左半分（ＣＡＲをコードする）または右半分（ＨＬＡ－Ｅ）のいずれかを欠く不完全なインサートが産生され、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされたことを示す。配列分析（図示せず）により、組換え事象が、ベクター中に存在し得る同一の配列によって駆動されたことが確認される。断片化は、２つのＪｅＴプロモータを含むベクター７３１６２および７３１６４で観察されたが、同様のサイズのベクター、例えば反復同一配列を含まない７３１６３からはインタクトなインサートのみが検出される。ＨＬＡ－ＡＢＣの効率的なノックダウンはまた、ｓｈＲＮＡｍｉＲをイントロンに配置することが許容され、ＲＮＡｉ機能を損なわないことを示唆する。

要約すると、これらの研究は、ＣＡＲＴ細胞において３つの異なる機能を支援するいくつかの構築物の有効性を実証している（すなわち、ＣＡＲの高発現、ＨＬＡ－Ｅの高発現、およびＨＬＡ－ＡＢＣの効率的なノックダウン）。ＨＬＡ－Ｅの発現およびＢ２Ｍ（したがって、ＨＬＡ－ＡＢＣ）のノックダウンの両方が、ＣＡＲＴ細胞をＮＫ細胞殺滅から保護するように潜在的に作用し得る。重要なことに、これらの多成分構築物のそれぞれは、単一のヌクレアーゼを使用してゲノム内の単一の遺伝子座に挿入することができ、第１のヌクレアーゼを使用してＣＡＲ遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子座に挿入し、第２のヌクレアーゼを使用してＨＬＡ－Ｅ遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子座に別々に挿入するための多重遺伝子編集の必要性を回避する。さらに、ＨＬＡ－Ｅ染色のシグナル強度は、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がＢ２Ｍ１３－１４部位に挿入されている本発明者らの以前に記載されたｄＫＯｄＫＩ細胞よりも多遺伝子実験サンプル（構築物７３１６１～７３１６４）において大きいことが分かった（図３０の表の第５列に報告されているＭＦＩを参照されたい）。本発明者らは、ｄＫＯ／ｄＫＩ細胞で観察されるＨＬＡ－Ｅ発現レベルによりＮＫ細胞溶解からの保護を達成できることを知っているので、本発明者らは、構築物７３１６１および７３１６３によって支持されるＨＬＡ－Ｅ発現レベルが保護も付与すると予想する。

最後に、これらの実験は、均質なベクター、ＡＡＶ調製、および細胞表現型を達成するために、導入遺伝子における同一の反復配列の使用を回避することによって、部分的なベクター喪失をもたらす分子内相同性によって駆動される組換え事象を最小化しなければならないことをさらに示す。

実施例１３
ＣＡＲ／ＨＬＡ－Ｅ／Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の評価

この研究では、ＣＡＲＴ細胞を調製し、実施例１２に記載されるようにＣＡＲ、ＨＬＡ－ＡＢＣおよびＨＬＡ－Ｅの表面発現について評価した。ここで、構築物７２０６、７３１６１、または７３１６３をＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ１－２部位に挿入した。ＨＬＡ－ＡＢＣおよびＨＬＡ－Ｅの発現レベルの比較として、さらなる対照細胞（ｄＫＯ／ｄＫＩ）を含めた。これらの対照ｄＫＯ／ｄＫＩ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ１－２部位に挿入されたＣＤ１９－ＣＡＲ７２０６構築物と、Ｂ２Ｍ遺伝子のＢ２Ｍ１３－１４部位に挿入されたＨＬＡ－Ｅ構築物とを有していた。

表にしたフローサイトメトリデータを図３１に示す。７３１６１および７３１６３で調製した培養物中のＣＤ３－ＣＡＲ＋細胞の頻度は、導入遺伝子を発現するＴＲＡＣ編集細胞（ＫＯ中のＫＩ）の頻度と同様に、対照（７２０６）に比肩した。ＣＡＲシグナルのＭＦＩは、７３１６１および７３１６３で生成されたサンプルでは、７２０６またはｄＫＯ／ｄＫＩサンプルよりも約２．５倍高く現れた。７３１６１および７３１６３で生成されたＣＡＲ＋細胞は、ＨＬＡ－ＡＢＣＭＦＩの９０％超の減少を示し、それらの大部分はＨＬＡ－Ｅも発現する。ＨＬＡ－Ｅ＋ＣＡＲＴ細胞の頻度およびＭＦＩの両方が、７３１６１の調製物でより高かった。まとめると、これらの結果は、ベクター７３１６１および７３１６３が、７２０６よりも高いＣＡＲ発現、高度のＨＬＡ－ＡＢＣノックダウン、およびｄＫＯ／ｄＫＩアプローチよりも高いＨＬＡ－Ｅレベルを支援することを示し、これはインビボでのＮＫ細胞殺滅からのより大きな回避をもたらし得る。

実施例１４
セクション３．２の実験－アロ反応性Ｔ細胞に対する保護のインビトロ評価

この研究では、Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子を備えている場合、ＣＡＲＴ細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）および細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）殺滅から逃れる能力を評価した。最初に、ＣＡＲＴ細胞を、他の箇所に記載のベクター７２０６、７２８９、７３１６１または７３１６３を使用して作製した。Ｂ２ＭＫＯＴ細胞およびＢ２ＭＫＯ／ＨＬＡ－ＥＫＩ細胞は、Ｂ２Ｍ特異的メガヌクレアーゼと、ＪｅＴプロモータによって駆動されるＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードするＢ２Ｍ特異的修復ベクターとを使用して作製した。すべてのＣＡＲＴ変異体を、同じドナーから収集された細胞（ＨＣ６３６６）から作製した。

次に、２人の非血縁ドナー由来のナイーブＴ細胞（Ｋ２９１６およびＫ３２１２）をＨ６３６６アロ抗原に対して感作した。簡潔には、ＨＣ６３６６由来の単球を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ－ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびＩＬ－４（４００Ｕ／ｍｌ－ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下で６日間培養して、樹状細胞様ＡＰＣに分化させた。ＡＰＣを収集し、Ｋ３２１２およびＫ２９１６由来のナイーブＴ細胞と５：１のＴ：ＡＰＣ比で共培養した。ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を２４時間後に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで培養物に添加した。プレーティングの１週間後、同種抗原感作Ｔ細胞を収集し、ＣＤ４枯渇によってＣＴＬを濃縮した（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＣＤ４マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）。ＣＡＲＴ変異体を１ｕＭＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、次いで、図３２に示す比で各ドナー由来の同種抗原プライムＣＴＬと共にプレーティングした。この共培養を２０～２４時間行い、その時点でサンプルを１ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）で標識し、Ｂｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓを用いて各サンプル中の色素陽性生細胞の数を計数した。ゼロエフェクター対照を使用して殺滅パーセントを決定した。

図３２では、Ｋ３２１２（パネルＡ）またはＫ２９１６（パネルＢ）のＣＴＬによるＣＡＲＴ細胞の殺滅が示されている。広範な殺滅が、対照（７２０６）ＣＡＲＴ細胞に対して観察された。低いＥ：Ｔ比（１：１未満）は２５～５０％の殺滅をもたらしたが、１を超えるＥ：Ｔはこのアッセイでの最大殺滅：５０～６０％を支援した。Ｂ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲＴ細胞はＣＴＬ殺滅を受けにくく、７３１６３ＣＡＲＴ細胞において最大２０％、７３１６１ＣＡＲＴ細胞において最大１０％であった。

ＣＡＲＴ変異体に対するＮＫ活性を評価するために、ＣＤ５６陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、同じドナー（ＨＣ６３６６）および非血縁ドナー（Ｋ７９９）由来のＰＢＭＣからＮＫ細胞を磁気的に濃縮し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－１５（Ｇｉｂｃｏ）中で４８時間培養した。ＣＡＲＴ標的細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（上記）で標識し、図３３に指定された比でＮＫ細胞と一緒にプレーティングした。共培養を、ＸＶＩＶＯ１５＋５％ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２中で４～５日間行った。プレーティングの４～５日後、培養物を１ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで標識し、生存ＣＡＲＴ標的を上記のように計数した。Ｂ２ＭＫＯ細胞および７２８９ＣＡＲＴ細胞（ｓｈＲＮＡｍｉＲ単独）は、ドナー一致ＮＫ細胞および不一致ＮＫ細胞の両方によってほぼ根絶され（９０％超の殺滅）、殺滅を、正常なＨＬＡ－ＡＢＣレベルまたはＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子のいずれかの欠如に関連づけられる。正常なＨＬＡ－ＡＢＣ発現を有するＣＡＲＴ細胞（７２０６）のＮＫ殺滅は非常に低かった（１０％未満）か、または検出されなかった。ＨＬＡ－ＡＢＣを欠くが、ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子を発現するＣＡＲＴ変異体は、ＮＫ細胞溶解に対する感受性が変化した。自己ＮＫ細胞と共に培養した場合、７３１６３ＣＡＲＴ細胞およびＢ２ＭＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ＋細胞は中程度に保護され（３０～４０％の殺滅）、７３１６１ＣＡＲＴ細胞は堅固に保護された（１０％未満の殺滅）。同種異系ＮＫ細胞を用いて行った実験では、Ｂ２ＭＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ＋細胞および７３１６１細胞の殺滅は検出されなかった。

これらの観察は、構築物７３１６１および７３１６３が、細胞をＮＫ殺滅に対して感作することなく、同種抗原特異的ＣＴＬに対する保護を付与することを示している。さらに、この保護は、単一の遺伝子編集を使用してＴＲＡＣ遺伝子座に挿入される単一の組換えＡＡＶベクターによって提供され得る。

実施例１５
Ｂ２ＭｓｈＲＮＡｍｉＲ／ＨＬＡ－ＥＣＡＲＴ細胞のインビボ活性

ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子の包含がＣＡＲＴ細胞の殺腫瘍活性を損なわないことを実証するために、本発明者らは、ＮＡＬＭ／６白血病細胞を移植した免疫不全マウスにおいて腫瘍殺滅を経時的にモニターするインビボ実験を行った。ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス（ＮＯＤ．ｓｃｉｄ．γ鎖ＫＯまたはＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ホタルルシフェラーゼを発現する５×１０^５個のＮＡＬＭ／６細胞（Ｉｍａｎｉｓ）を尾静脈を介して注射した。腫瘍移植の６日後、動物にｄ－ルシフェリンを注射し、ＩＶＩＳｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光を測定した。腫瘍生着を確認した後、マウスを、７２０６対照導入遺伝子（ＣＤ１９ＣＡＲのみ）、７２８９導入遺伝子、７３１６１導入遺伝子または７３１６３導入遺伝子のいずれかを担持する１×１０^６個または５×１０^６個のＣＡＲＴ細胞（他の箇所に記載されるように作製される）で処置した。動物の１つの群にビヒクル対照（２％ヒト血清アルブミンを補充した生理食塩水）を投与した。マウスを、発光については縦方向で、および体重についてモニターした。ＩＡＣＵＣ承認のヒューマンエンドポイントを使用して生存期間を決定した。発光測定値を図３４に示し、生存率を図３５にプロットする。

ビヒクル対照を投与された動物は、ＮＡＬＭ／６の生着後およそ２７日目にエンドポイントに達するまで、処置後に発光の増加を示した。ＣＡＲＴ介入を施されたマウスは、ＣＡＲＴ用量に比例する持続時間および大きさで、一時的に発光の低下を示した。これは延命効果を伴い、１×１０^６個のＣＡＲＴ細胞を投与されたマウスは３５～４２日生存し、５×１０^６個の細胞を投与されたマウスは５２日から６０日を超えて生存する。用量サイズ以外に、処置群間の発光または生存に対する有意な寄与は観察されなかった。この研究は、構築物７３１６１および７３１６３を使用して作製されたＣＡＲＴ細胞が、７２０６ＣＡＲＴ細胞と同等の有効性を有することを示す。

実施例１６
ＣＡＲ／ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の非ウイルスＤＮＡトランスフェクションによるＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲのスクリーニング

これらの研究は、ＤＣＫを安定にノックダウンするためのｓｈＲＮＡｍｉＲとしての異なるガイド配列およびパッセンジャー配列を評価するために開始した。この目的は、ＣＡＲＴ細胞におけるＤＣＫのノックダウンが、ＣＡＲＴリンパ球枯渇レジメンにおいて一般的に使用されるフルダラビンなどのプリンヌクレオシド類似体の存在下でのＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の濃縮を可能にするかどうかを決定することであった。

この研究で利用された導入遺伝子は、ＣＤ１９ＣＡＲの発現を駆動するＪｅＴプロモータ（実施例１で前述）と、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナルで終結する単一転写物としてのｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子とを含んでいた。導入遺伝子は、導入遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ１－２切断部位に挿入するように指向させる相同アームによって両側で挟まれていた。ｓｈＲＮＡｍｉＲについては、５つのＤＣＫガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列を同定し、ｍｉＲ－Ｅ骨格にクローニングし、ＣＡＲの終止コドンと双方向ＳＶ４０ポリＡ転写ターミネータとの間でＣＤ１９－ＣＡＲ構築物に挿入した。別個の実験では、この研究で評価されたＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲは、ＤＣＫ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含まないＣＤ１９ＣＡＲ発現対照細胞の内因性ＤＣＫレベルと比較した場合、７０％（７２１３６）、４０％（７２１３７）、３５％（７２１３８）、６０％（７２１４０）の低下を示した（７２０６）。これらのＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を、フルダラビンで処理した場合のＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団を濃縮する能力について試験した。

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、静置した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションした。５つのＣＡＲ－ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物（構築物７２１３６～７２１４０）を、ヌクレオフェクション中にＴＲＣ１－２ヌクレアーゼＲＮＡと同時に線状化ＤＮＡ（１μｇ／１×１０^６細胞）としてＴ細胞に送達した。エレクトロポレーションした細胞を、５％ウシ胎児血清および３０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２を添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養した。

ヌクレオフェクション後４日目に、２．５ｅ５の生存細胞を、９６丸底プレート中で広範囲の用量のフルダラビンで処理した；１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地中５０ｕＭ、５ｕＭ、０．５ｕＭ、０．０５ｕＭ、０．００５ｕＭ、および未処理対照。未処理対照には、最高用量のフルダラビンに等しい体積のＤＭＳＯを投与した。処理の２日後、９６ウェルプレートを遠心沈殿させ、薬物を含有する培地を捨て、細胞を９６ウェルプレートから４８ウェルプレートに移し、新鮮な完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地、サイトカインおよびフルダラビン（いかなる薬物も与えなかった未処理対照は除いて）で処理した。フルダラビンによる処理後６日目に、２００ｕＬのサンプルを染色のために各ウェルから取り出し、残りの細胞を遠心沈殿させ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）およびフルダラビン（いかなる薬物も与えなかった未処理対照は除いて）を補充した新鮮な完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地で処理した。フルダラビンによる処理後６日目および１０日目に、２００ｕＬの培養物のサンプルを抗ＣＤ３－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＣｌｏｎｅＵＣＨＴ１）、抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）で染色した。

図３６は、フローサイトメトリによって試験した異なる用量のフルダラビンでプロットしたＫＯ中のＫＩ％を示し、表３の対応するｓｈＲＮＡｍｉＲの下にも列挙する。ＫＯ中のＫＩパーセントは、（ＣＤ３－／ＣＡＲ＋％）／（総ＣＤ３－％）×１００として定義される。表にしたデータは、フルダラビンによる処理後１０日目に取得した。ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲでは、漸増用量のフルダラビンによる処理は、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の濃縮をもたらし、ＫＯ中のＫＩパーセントの増加によって表３で観察することができる。７２１３９を除いて、すべてのＤＣＫノックダウン構築物は、５ｕＭのフルダラビン用量で７０％を超えるＫＯ中のＫＩを示した。用量５０ｕＭのフルダラビンは、細胞に対して毒性が高すぎた。図３７は、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の事象／ｕＬ対フルダラビンの濃度（ｕＭ）を示し、ＫＯ中のＫＩ％と相関する。最も高いＫＯ中のＫＩパーセントおよび事象／ｕＬは、フルダラビン用量５ｕＭにおいて見られた。

７２１３６、７２１３８にコードされた候補配列を、ＡＡＶを使用してさらなる実験で調査した。

この実験は、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＤＣＫをノックダウンすることにより、フルダラビンの存在下でＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の濃縮が可能になることを実証した。この非ウイルスアプローチによって試験された５つのＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物のうち４つは、用量５ｕＭのフルダラビンによる１０日間の処理が７０％を超えるＫＯ中のＫＩをもたらしたことを示した。フルダラビンは、ＣＡＲＴの投与前に患者をリンパ球枯渇させるためにシクロホスファミドと共に一般的に使用される。この研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲでＤＣＫをノックダウンすることにより、ＣＡＲＴ細胞がフルダラビンに対して耐性になり、それらの濃縮が可能になるという概念実証を提供する。臨床的には、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲの包含は、同種異系フルダラビン耐性ＣＡＲＴの投与後の患者へのフルダラビンの継続的投与を可能にし、したがって宿主免疫応答を抑制し、これらの薬物耐性ＣＡＲＴ細胞がインビボでより大きな増殖および持続性を有することを可能にし得る。したがって、ＤＣＫをノックダウンする潜在的な臨床的利点は、同種異系薬物耐性ＣＡＲＴ細胞の活性の治療域の拡大を可能にし得るが、同時に、フルダラビンとＣＡＲＴ療法との相乗的抗腫瘍活性も可能にし得る。

実施例１７
ＣＡＲＴ細胞の表現型および抗腫瘍活性に対する、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＤＣＫノックダウンの効果

これらの研究は、ＡＡＶ形質導入後にＤＣＫを安定にノックダウンするためのｓｈＲＮＡｍｉＲ（構築物７２１３６および７２１３８）としての異なるガイド配列およびパッセンジャー配列を評価するために開始した。この目的は、ＣＡＲＴ細胞の表現型および抗腫瘍活性に対するＤＣＫノックダウンの効果を決定することであった。

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を、前述のように解凍し、静置し、活性化した。活性化後３日目に、細胞に、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼであるＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、直後に２００００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩでＡＡＶベクターを用いて形質導入した。細胞に、ＡＡＶ７２０６、または７２１３６もしくは７２１３８を投与したか、またはＡＡＶを与えなかった（ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２のみを投与した）。形質導入の３日後、ＣＡＲＴ表現型を、抗ＣＤ３－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１）、抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）、抗ＣＤ４－ＢＶ７１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＯＫＴ４）、抗ＣＤ８ａ－ＢＶ７８５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＳＫ１）、抗ＣＤ６２Ｌ－ＢＳ５１５（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＤＲＥＧ－５６）、抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ／シアニン７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＬ１）、抗ＣＤ２７－ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＯ３２３）で染色することによって研究した。サンプルをフローサイトメトリによって試験し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓでデータを取得した。

２．５ｅ５の生存細胞を４８ウェルプレートにおいて以下の用量のフルダラビンで処理した：１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全Ｘｕｒｉ培地中、１２ｕＭ、６ｕＭ、３ｕＭおよび未処理対照。注：未処理対照には、最高用量のフルダラビンに等しい体積のＤＭＳＯを投与した。処理後４日目に、細胞数を得て（図３８に示す）、１ｅ６生存細胞を遠心沈殿させ、上清を捨て（６ｕＭおよび１２ｕＭのフルダラビンで処理したサンプルＴＲＣおよび７２０６を除く）、細胞を新しい４８ウェルプレートに移し、新鮮な完全Ｘｕｒｉ培地、サイトカイン、＋／－フルダラビンで処理した。フルダラビンによる処理後８日目に、上記のようにＣＡＲＴ表現型染色のためにサンプルを採取した。残りの細胞は、ＥａｓｙＳｅｐＨｕｍａｎＲｅｌｅａｓｅＣＤ３陽性選択キットを使用してＣＤ３を枯渇させた。ＣＤ３－画分を保持し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全Ｘｕｒｉ培地で培養し、フルダラビンによるさらなる処理を行わなかった。形質導入後１４日目、ＣＡＲＴ表現型染色のためにサンプルを採取し、その後ＡＣＥＡアッセイをセットアップした（上記のパネル参照）。これは、ＣＤ３－ＣＡＲ＋の％が、エフェクターとして加えるべきＣＡＲＴの正確な数を決定するために必要とされるからである。形質導入後１５日目に、エフェクター細胞として３または６ｕＭのフルダラビンで未処理の、または処理した７２１３６または７２１３８（ＤＣＫノックダウンＣＤ１９－ＣＡＲＴ）または７２０６（ＣＤ１９ＣＡＲＴ）、および標的細胞としてＣＤ１９を発現するＨＥＫ２９３使用して、ＡＣＥＡ殺滅アッセイを設定した。細胞溶解の陽性対照としてＴｒｉｔｏｎＸ－１００を使用し、陰性対照としてＴＲＣを使用した。実験を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比２：１、１：２および１：４で設定した。

形質導入（フルダラビンによる前処理）後３日目のＣＡＲＴ表現型をフローサイトメトリによって試験し、以下の表４に要約する。ＫＯ中のＫＩパーセントは、（ＣＤ３－／ＣＡＲ＋％）／（総ＣＤ３－％）×１００として定義される。Ｔナイーブ（Ｔｎ）、Ｔセントラルメモリー（Ｔｃｍ）／Ｔトランジションメモリー（Ｔｔｍ）、Ｔエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）についてのＣＤ４：ＣＤ８比および頻度を表４に報告する。ＴｎはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ－（低）であり、一方、ＴｃｍはＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋（中）であり、ＴｔｍはＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋（高）であり、ＴｅｍはＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＯ＋である。フルダラビンによる処理前のＣＡＲＴ表現型は、以下に示すように、７２０６（ＣＤ１９－ＣＡＲ）と７２１３６、７２１３８（ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ）との間で変化しないままである。

図３８は、フルダラビンによる処理後４日目に得た生細胞数／ｍＬを示す。ＴＲＣのみ（ＡＡＶなし）または７２０６（ＣＤ１９－ＣＡＲＡＡＶ）では、７２１３６および７２１３８（ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲＡＡＶ）と比較して、漸増用量のフルダラビンによる処理後に細胞数の５０％以上の減少が見られた。

フルダラビンによる処理後８日目のＣＡＲＴ表現型をフローサイトメトリによって試験し、下記の表５に報告する。図３９は、フルダラビンによる処理後８日目に得た生細胞数／ｍＬを示す。ＤＣＫノックダウンにより、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲＴ細胞は、ＴＲＣヌクレアーゼのみ（ＡＡＶなし）および７２０６（ＣＤ１９－ＣＡＲＡＡＶ）と比較して、フルダラビンの存在下でより生存可能であった。ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲＴでは、漸増用量のフルダラビンによる処理はＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の濃縮をもたらし、ＫＯ中のＫＩパーセントの増加によって表５において観察することができる。Ｔナイーブ（Ｔｎ）、Ｔセントラルメモリー（Ｔｃｍ）／Ｔトランジションメモリー（Ｔｔｍ）、Ｔエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）についてのＣＤ４：ＣＤ８比および頻度もまた報告する。未処理またはフルダラビンで処理したサンプルの間で、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲのＣＡＲＴ表現型に有意差は観察されなかった。しかしながら、ＣＤ１９ＣＡＲ（７２０６）では、フルダラビンによる処理時のＣＤ４およびＣＤ８表現型は、セントラルメモリーからトランジションメモリーへ移行し、およびエフェクターメモリー表現型に移行する。これは、ＤＣＫノックダウンおよびフルダラビンによる処理がＣＡＲＴ細胞表現型に対して有意な効果を全く有さなかったことを示す。

図４０は、ＡＣＥＡアッセイにおけるエフェクター細胞として、未処理または３および６ｕＭのフルダラビンで処理した７２０６（ＣＤ１９－ＣＡＲ）を使用した（ＴＲＣに対して正規化した）細胞溶解％を示す。ＣＤ１９を発現するＨＥＫ２９３を標的細胞とした。実験を、Ｅ：Ｔ比２：１、１：２および１：４で設定した。細胞溶解の陽性対照としてＴｒｉｔｏｎを使用し、陰性対照としてＴＲＣを使用した。フルダラビンによる処理の＋／－にかかわらず、最も効率的な殺滅は、Ｅ：Ｔ比２：１で見られた。Ｅ：Ｔ比１：２、１：４では、未処理と比較して、漸増用量のフルダラビンの存在下では効率の悪い殺滅が見られた。

図４１は、ＡＣＥＡアッセイにおけるエフェクター細胞として、未処理、または３ｕＭもしくは６ｕＭのフルダラビンで処理した７２１３８（ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ）を使用した（ＴＲＣに対して正規化した）細胞溶解％を示す。ＣＤ１９を発現するＨＥＫ２９３を標的細胞とした。実験を、Ｅ：Ｔ比２：１、１：２および１：４で設定した。細胞溶解の陽性対照としてＴｒｉｔｏｎを使用し、陰性対照としてＴＲＣを使用した。フルダラビン処理の有無にかかわらず、Ｅ：Ｔ比２：１、次いで１：２、次いで１：４で最も効率的な殺滅が見られたことが観察された。図４２は、ＡＣＥＡアッセイにおけるエフェクター細胞として、未処理、または３ｕＭもしくは６ｕＭのフルダラビンで処理した７２１３６（ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ）を使用した（ＴＲＣに対して正規化した）細胞溶解％を示す。ＣＤ１９を発現するＨＥＫ２９３を標的細胞とした。実験を、Ｅ：Ｔ比２：１、１：２および１：４で設定した。細胞溶解の陽性対照としてＴｒｉｔｏｎを使用し、陰性対照としてＴＲＣを使用した。フルダラビン処理の有無にかかわらず、Ｅ：Ｔ比２：１、次いで１：２、次いで１：４で最も効率的な殺滅が見られたことが観察された。

最後に、ＤＣＫｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ（７２１３６、７２１３８）は、フルダラビンで処理した場合、Ｅ：Ｔ比１：２でＣＤ１９ＣＡＲよりもより効率的な殺滅を示した。これは、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用するＤＣＫノックダウンおよびフルダラビンによる処理が、ＣＤ１９－ＣＡＲの抗腫瘍活性に対して相乗効果を有することを実証した。

実施例１８
ＣＡＲ／ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の非ウイルスＤＮＡトランスフェクションによるグルココルチコイド受容体ｓｈＲＮＡｍｉＲのスクリーニング

これらの研究は、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）を安定にノックダウンするためのｓｈＲＮＡｍｉＲとしての異なるガイド配列およびパッセンジャー配列を評価するために開始した。目的は、ＣＡＲＴ細胞におけるＧＲのノックダウンが、ＣＡＲＴ細胞療法に関連し得るサイトカイン放出症候群の治療において一般に使用されるデキサメタゾンなどのコルチコステロイドの存在下でのＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の濃縮を可能にするかどうかを決定することであった。

この研究で利用された導入遺伝子は、ＣＤ１９－ＣＡＲの発現を駆動するＪｅＴプロモータと、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナルで終結する単一転写物としてのｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子とを含んでいた。導入遺伝子は、導入遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ１－２切断部位に挿入するように指向させる相同アームによって両側で挟まれていた。ｓｈＲＮＡｍｉＲについては、９つのＧＲガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列を同定し、ｍｉＲ－Ｅ骨格にクローニングし、ＣＡＲの終止コドンと双方向ＳＶ４０ポリＡ転写ターミネータとの間でＣＤ１９－ＣＡＲ構築物に挿入した。別個の実験では、この研究で評価されたＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲは、ＣＤ１９ＣＡＲを発現したがＧＲ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含まない対照細胞（７２０６）の内因性ＧＲレベルと比較した場合、３７％（７２１４２）、４５％（７２１４３）、５０％（７２１４５）および５６％（７２１４９）の低下を示した。これらのＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を、デキサメタゾンで処理した場合のＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団を濃縮する能力について試験した。

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、静置した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、Ｔ細胞受容体アルファ定常遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ１μｇをエレクトロポレーションした。９つのＣＡＲ－ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物（構築物７２１４２、７２１４３、７２１４５、７２１４６、７２１４８～７２１５２）を、ヌクレオフェクション中にＴＲＣ１－２ヌクレアーゼＲＮＡと同時に、線状化ＤＮＡ（１μｇ／１×１０^６細胞）としてＴ細胞に送達した。エレクトロポレーションした細胞を、５％ウシ胎児血清および３０ｎｇ／ｍｌＩＬ－２を添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養した。

ヌクレオフェクション後８日目に、２．５ｅ５の生存細胞を、９６丸底プレート中で広範囲の用量のデキサメタゾンで処理した；１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地中１００ｕＭ、１０ｕＭ、１ｕＭ、０．１ｕＭ、０．０１ｕＭ、および未処理対照。注：未処理対照には、最高用量のデキサメタゾンに等しい体積の９５％エタノールを投与した。処理の３日後、９６ウェルプレートを遠心沈殿させ、薬物を含有する培地を捨て、細胞を９６ウェルプレートから４８ウェルプレートに移し、新鮮な完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地、サイトカインおよびデキサメタゾン（いかなる薬物も与えなかった未処理対照は除いて）で処理した。デキサメタゾンによる処理後７日目に、染色のために各ウェルから２００ｕＬのサンプルを取り出した。サンプルを、抗ＣＤ３－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１）、抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）で染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＬＸでフローサイトメトリによって試験した。

図４３は、フローサイトメトリによって試験した異なる用量のデキサメタゾンでのＫＯ中のＫＩパーセントを示し、表６の対応するｓｈＲＮＡｍｉＲの下に列挙する。ＫＯ中のＫＩパーセントは、（ＣＤ３－／ＣＡＲ＋％）／（総ＣＤ３－％）×１００として定義される。表にしたデータは、デキサメタゾンによる処理後７日目に取得した。ＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲでは、漸増用量のデキサメタゾンによる処理はＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の濃縮をもたらし、ＫＯ中のＫＩパーセントの増加によって表６において観察することができる。７２１４８を除いて、すべてのＧＲノックダウン構築物は、用量１、１０ｕＭのデキサメタゾンで３５～５０％のＫＯ中のＫＩを示した。図４４は、デキサメタゾンの濃度（ｕＭ）に対してプロットされたＣＤ３－／ＣＡＲ＋の事象／ｕＬを示す。ＫＯ中のＫＩパーセントは、事象／ｕＬと相関する。

この実験は、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＧＲをノックダウンすることにより、コルチコステロイド様デキサメタゾンの存在下でＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の濃縮が可能になることを実証した。非ウイルスアプローチによって試験した９つのＧＲｓｈＲＮＡｍｉＲのうち８つは、用量１ｕＭまたは１０ｕＭのデキサメタゾンによる７日間の処理が３５～５０％のＫＯ中のＫＩをもたらしたことを示した。

したがって、これらの実験により、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＧＲのノックダウンがＣＡＲＴ細胞をデキサメタゾンに対して耐性にし、それらの濃縮を可能にすることが確認された。臨床的には、コルチコステロイドは、がんのための養子Ｔ細胞療法の投与後に時折見られる、潜在的に生命を脅かす毒性であるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の治療においてトシリズマブと併せて一般に使用される。サイトカイン放出症候群は、いくつかのサイトカインの循環レベルの上昇に関連する。しかしながら、高用量のコルチコステロイドの投与は、ＣＡＲＴ療法の臨床的有効性を低下させ得る。ＣＡＲＴ細胞をコルチコステロイドに対して耐性にすることによって、ＣＡＲＴ細胞に対するＨｖＧ応答を、ＣＡＲＴ機能に影響を及ぼすことなく抑制することができ、それによって、活性に対する可能性の枠を増大させ、安全性を改善する。

Claims

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列；
（ｃ）２Ａ配列；
（ｄ）ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、およびイントロン配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記イントロン配列が配列番号６９の核酸配列を含み、およびマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）をコードする核酸配列が前記イントロン配列内に配置され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号４６の配列を含み；並びに
（ｅ）終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記プロモータに作動可能に連結されているカセットを含み、且つ、
前記カセットが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子内に配置される、遺伝子改変ヒトＴ細胞。
前記カセットが、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内の配列番号５８からなる配列内に配置される、請求項１に記載の遺伝子改変ヒトＴ細胞。
前記カセットが、配列番号５８内のヌクレオチド位置１３と１４との間に配置される、請求項２に記載の遺伝子改変ヒトＴ細胞。