JP2023022005A - 操作された抗原受容体をコードする核酸分子及び阻害性核酸分子、並びにそれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】同種異系性の減少を示すが、in vivoでのNK細胞の死滅を回避する同種異系キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞のための核酸分子を提供する。【解決手段】(a)操作された抗原受容体(キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体等)をコードする核酸配列を含む第1の発現カセットと;(b)阻害性核酸分子をコードする核酸配列(ヒトベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子の構成要素、又はCD52に対して阻害性を示すもの)を含む第2の発現カセットと;(c)5’相同性アームと;(d)3’相同性アームと;を含み、前記5’相同性アーム及び前記3’相同性アームが、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列に隣接する染色体領域と相同性を有する、核酸分子を提供する。【選択図】なし
Description
本開示は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本開示は、キメラ抗
原受容体又は外因性T細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子、及び
RNA干渉分子等の阻害性核酸分子に関する。本開示はさらに、核酸、DNAコンストラ
クト、ウイルスベクター、医薬組成物、遺伝子改変細胞、及び本発明の核酸分子を利用す
る治療方法に関する。
原受容体又は外因性T細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子、及び
RNA干渉分子等の阻害性核酸分子に関する。本開示はさらに、核酸、DNAコンストラ
クト、ウイルスベクター、医薬組成物、遺伝子改変細胞、及び本発明の核酸分子を利用す
る治療方法に関する。
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、その全体が参照することで本明細書の一部をなす。2018年5月8日に作成された前
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T細胞養子免疫療法は、癌治療の有望なアプローチである。この戦略は、特定の腫瘍関
連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変された単離されたヒトT細胞を利用する
。遺伝子改変には、抗原特異性をT細胞にグラフトするためのキメラ抗原受容体(CAR
)又は外因性T細胞受容体の発現が含まれる場合がある。外因性T細胞受容体とは対照的
に、CARはモノクローナル抗体の可変ドメインから特異性を引き出す。したがって、C
ARを発現するT細胞は、主要組織適合性複合体(MHC)の非限定的な方法で腫瘍免疫
反応性を誘導する。今日まで、T細胞養子免疫療法は、B細胞悪性腫瘍(例、急性リンパ
芽球性白血病(ALL)、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)、及び慢性リンパ球性白
血病)、多発性骨髄腫、神経芽腫、膠芽腫、進行性神経膠腫、卵巣癌、中皮腫、黒色腫、
及び膵臓癌を含む多くの癌の臨床療法として利用されてきた。
連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変された単離されたヒトT細胞を利用する
。遺伝子改変には、抗原特異性をT細胞にグラフトするためのキメラ抗原受容体(CAR
)又は外因性T細胞受容体の発現が含まれる場合がある。外因性T細胞受容体とは対照的
に、CARはモノクローナル抗体の可変ドメインから特異性を引き出す。したがって、C
ARを発現するT細胞は、主要組織適合性複合体(MHC)の非限定的な方法で腫瘍免疫
反応性を誘導する。今日まで、T細胞養子免疫療法は、B細胞悪性腫瘍(例、急性リンパ
芽球性白血病(ALL)、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)、及び慢性リンパ球性白
血病)、多発性骨髄腫、神経芽腫、膠芽腫、進行性神経膠腫、卵巣癌、中皮腫、黒色腫、
及び膵臓癌を含む多くの癌の臨床療法として利用されてきた。
癌治療としての潜在的な有用性にもかかわらず、養子免疫療法は、部分的には、宿主組
織と同種異系CAR T細胞との間の同種反応性によって制限されてきた。同種反応性の
原因の1つは、CAR T細胞の細胞表面に非宿主MHCクラスI分子が存在することで
ある。MHCクラスI分子は、2つのポリペプチド鎖、α及びβで構成されている。ヒト
では、α鎖は3つのサブユニット、α1、α2、及びα3からなり、これらは第6染色体
上の多型ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子によってコードされている。HLA遺伝子座の
多様性、及びコードされたα鎖サブユニットは、外来MHCクラスI分子を保有している
ため、同種異系のCAR T細胞を宿主免疫系によって外来細胞として見る可能性がある
。その結果、患者に投与されたCAR T細胞は、宿主の細胞傷害性T細胞によって認識
され、殺傷される、宿主対移植片(HvG)拒絶を受ける可能性がある。
織と同種異系CAR T細胞との間の同種反応性によって制限されてきた。同種反応性の
原因の1つは、CAR T細胞の細胞表面に非宿主MHCクラスI分子が存在することで
ある。MHCクラスI分子は、2つのポリペプチド鎖、α及びβで構成されている。ヒト
では、α鎖は3つのサブユニット、α1、α2、及びα3からなり、これらは第6染色体
上の多型ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子によってコードされている。HLA遺伝子座の
多様性、及びコードされたα鎖サブユニットは、外来MHCクラスI分子を保有している
ため、同種異系のCAR T細胞を宿主免疫系によって外来細胞として見る可能性がある
。その結果、患者に投与されたCAR T細胞は、宿主の細胞傷害性T細胞によって認識
され、殺傷される、宿主対移植片(HvG)拒絶を受ける可能性がある。
MHCクラスI分子のβ鎖は、第15染色体上の非多型ベータ2ミクログロブリン(B
2M)遺伝子(配列番号1)によってコードされるベータ2ミクログロブリンからなる。
ベータ2ミクログロブリンは、α3サブユニットに非共有結合し、全てのMHCクラスI
分子に共通している。さらに、細胞表面でのMHCクラスI分子の発現には、ベータ2ミ
クログロブリンとの結合が必要である。このように、ベータ2ミクログロブリンは、CA
R T細胞でのMHCクラスI分子の発現を抑制するための論理的なターゲットを表し、
これにより、宿主の細胞傷害性T細胞に対して細胞が見えなくなり、同種反応性が低下す
る可能性がある。しかしながら、ベータ2ミクログロブリン発現の完全なノックアウトに
より、細胞表面MHCクラスI分子が不足するため、NK細胞がCAR T細胞を殺傷す
る可能性があり、これにより、NK細胞はそれらを非自己として認識し、細胞傷害性作用
を開始し得る。
2M)遺伝子(配列番号1)によってコードされるベータ2ミクログロブリンからなる。
ベータ2ミクログロブリンは、α3サブユニットに非共有結合し、全てのMHCクラスI
分子に共通している。さらに、細胞表面でのMHCクラスI分子の発現には、ベータ2ミ
クログロブリンとの結合が必要である。このように、ベータ2ミクログロブリンは、CA
R T細胞でのMHCクラスI分子の発現を抑制するための論理的なターゲットを表し、
これにより、宿主の細胞傷害性T細胞に対して細胞が見えなくなり、同種反応性が低下す
る可能性がある。しかしながら、ベータ2ミクログロブリン発現の完全なノックアウトに
より、細胞表面MHCクラスI分子が不足するため、NK細胞がCAR T細胞を殺傷す
る可能性があり、これにより、NK細胞はそれらを非自己として認識し、細胞傷害性作用
を開始し得る。
CAR T細胞に対する同種反応性の別の原因は、細胞表面での内因性T細胞受容体の
発現である。T細胞受容体は典型的には、可変α鎖及びβ鎖、又は少数ではあるが可変γ
鎖及びδ鎖からなる。T細胞受容体は、CD3を含むアクセサリタンパク質と複合体を形
成し、細胞表面共受容体(CD4やCD8等)と機能して、抗原提示細胞上のMHC分子
に結合した抗原を認識する。同種異系CAR T細胞の場合、内因性T細胞受容体の発現
は、患者への投与後に細胞に宿主MHC抗原を認識させ、移植片対宿主病(GVHD)の
発症につながる可能性がある。
発現である。T細胞受容体は典型的には、可変α鎖及びβ鎖、又は少数ではあるが可変γ
鎖及びδ鎖からなる。T細胞受容体は、CD3を含むアクセサリタンパク質と複合体を形
成し、細胞表面共受容体(CD4やCD8等)と機能して、抗原提示細胞上のMHC分子
に結合した抗原を認識する。同種異系CAR T細胞の場合、内因性T細胞受容体の発現
は、患者への投与後に細胞に宿主MHC抗原を認識させ、移植片対宿主病(GVHD)の
発症につながる可能性がある。
同種反応性を未然に防ぐため、臨床試験は主に自己CAR T細胞の使用に焦点を当て
、ドナーのT細胞を単離し、遺伝子改変してキメラ抗原受容体を組み込んでから同じ被験
体に再注入する。自己アプローチは、投与されたCAR T細胞に免疫寛容を提供するが
、このアプローチは、患者の癌が診断された後に患者特異的CAR T細胞を産生するの
に必要な時間と費用の両方によって制約される。
、ドナーのT細胞を単離し、遺伝子改変してキメラ抗原受容体を組み込んでから同じ被験
体に再注入する。自己アプローチは、投与されたCAR T細胞に免疫寛容を提供するが
、このアプローチは、患者の癌が診断された後に患者特異的CAR T細胞を産生するの
に必要な時間と費用の両方によって制約される。
したがって、同種異系性の減少を示すが、同時に、in vivoでのNK細胞の死滅
を回避する同種異系CAR T細胞の開発に対する必要性が当技術分野に存在する。
を回避する同種異系CAR T細胞の開発に対する必要性が当技術分野に存在する。
一態様では、本発明は、以下:(a)操作された抗原受容体をコードする核酸配列を含
む第1の発現カセットと;(b)阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第2の発現
カセットと;(c)5´相同性アームと;(d)3´相同性アームと、を含み;ここで、
5´相同性アーム及び3´相同性アームは、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列に隣接
する染色体領域に対して相同性を有する、核酸分子を提供する。
む第1の発現カセットと;(b)阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第2の発現
カセットと;(c)5´相同性アームと;(d)3´相同性アームと、を含み;ここで、
5´相同性アーム及び3´相同性アームは、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列に隣接
する染色体領域に対して相同性を有する、核酸分子を提供する。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子はRNA干渉分子である。特定の実施形態で
は、RNA干渉分子は、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(s
iRNA)、ヘアピンsiRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA、
又はmiRNA適合shRNAである。特定の実施形態では、RNA干渉分子はshRN
Aである。
は、RNA干渉分子は、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(s
iRNA)、ヘアピンsiRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA、
又はmiRNA適合shRNAである。特定の実施形態では、RNA干渉分子はshRN
Aである。
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体である。他の実施
形態では、操作された抗原受容体は外因性T細胞受容体である。
形態では、操作された抗原受容体は外因性T細胞受容体である。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識
配列、TALEN認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)認識配列、CRI
SPR/Cas認識配列、コンパクトTALEN認識配列、又はメガTAL認識配列であ
る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配
列である。
配列、TALEN認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)認識配列、CRI
SPR/Cas認識配列、コンパクトTALEN認識配列、又はメガTAL認識配列であ
る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配
列である。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は目的の任意の遺伝子である。特定の実施形態
では、目的の遺伝子は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である。特定の実施形
態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である。特定の
実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列は、ヒトT細胞受容体アルファ定常
領域遺伝子に配列番号1を含む。
では、目的の遺伝子は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である。特定の実施形
態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である。特定の
実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列は、ヒトT細胞受容体アルファ定常
領域遺伝子に配列番号1を含む。
いくつかの実施形態では、第1の発現カセットは、操作された抗原受容体の発現を駆動
するプロモータを更に含む。特定の実施形態では、プロモータはJeTプロモータである
。
するプロモータを更に含む。特定の実施形態では、プロモータはJeTプロモータである
。
いくつかの態様では、第2の発現カセットは、阻害性核酸分子の発現を駆動するプロモ
ータを更に含む。特定の実施形態では、プロモータはU6プロモータである。
ータを更に含む。特定の実施形態では、プロモータはU6プロモータである。
いくつかの実施形態では、第1の発現カセットは、操作された抗原受容体の翻訳を終結
させるためのポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、第2の発現カセ
ットは、阻害性核酸の翻訳を終結させるための中央ポリプリントラクト及び中央ターミネ
ータ配列(cPPT/CTS)の配列を含む。
させるためのポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、第2の発現カセ
ットは、阻害性核酸の翻訳を終結させるための中央ポリプリントラクト及び中央ターミネ
ータ配列(cPPT/CTS)の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、核酸分子内
で同じ向きにある。特定の実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは
、5´及び3´の相同性アームに対して5´から3´の向きにある。いくつかのかかる実
施形態では、第1の発現カセットは、第2の発現カセットの5´上流にある。他のかかる
実施形態では、第2の発現カセットは、第1の発現カセットの5´上流にある。
で同じ向きにある。特定の実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは
、5´及び3´の相同性アームに対して5´から3´の向きにある。いくつかのかかる実
施形態では、第1の発現カセットは、第2の発現カセットの5´上流にある。他のかかる
実施形態では、第2の発現カセットは、第1の発現カセットの5´上流にある。
いくつかの実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットが核酸分子内で
同じ向きにあり、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、5´及び3´の相同性
アームに対して3´から5´の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現
カセットは、第2の発現カセットの5´上流にある。他のかかる実施形態では、第2の発
現カセットは、第1の発現カセットの5´上流にある。
同じ向きにあり、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、5´及び3´の相同性
アームに対して3´から5´の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現
カセットは、第2の発現カセットの5´上流にある。他のかかる実施形態では、第2の発
現カセットは、第1の発現カセットの5´上流にある。
いくつかの実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、核酸分子内
で反対の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現カセットは、5´及び
3´の相同性アームに対して3´から5´の向きにあり、第2の発現カセットは5´から
3´の向きにある。特定の実施形態では、第1の発現カセットは、第2の発現カセットの
5´上流にある。他の実施形態では、第2の発現カセットは、第1の発現カセットの5´
上流にある。
で反対の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現カセットは、5´及び
3´の相同性アームに対して3´から5´の向きにあり、第2の発現カセットは5´から
3´の向きにある。特定の実施形態では、第1の発現カセットは、第2の発現カセットの
5´上流にある。他の実施形態では、第2の発現カセットは、第1の発現カセットの5´
上流にある。
特定の実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは核酸分子内で反対
の向きにあり、5´及び3´の相同性アームに対して第1の発現カセットは5´から3´
の向きにあり、第2の発現カセットは3´から5´の向きにある。いくつかのかかる実施
形態では、第1の発現カセットは、第2の発現カセットの5´上流にある。他のかかる実
施形態では、第2の発現カセットは、第1の発現カセットの5´上流にある。
の向きにあり、5´及び3´の相同性アームに対して第1の発現カセットは5´から3´
の向きにあり、第2の発現カセットは3´から5´の向きにある。いくつかのかかる実施
形態では、第1の発現カセットは、第2の発現カセットの5´上流にある。他のかかる実
施形態では、第2の発現カセットは、第1の発現カセットの5´上流にある。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、第2の発現カセットの複数のコピーを含む。い
くつかのかかる実施形態では、コピーは同一である。さらなる実施形態では、コピーは、
プロモータ、阻害性核酸分子のコード配列、及び阻害性核酸分子の翻訳を終結させるため
の(cPPT/CTS)配列等の配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、第2の発
現カセットのコピーは、核酸分子内でタンデムであり、同じ向き又は反対の向きであって
もよい。他のかかる実施形態では、コピーはタンデムでなくてもよく、同じ向き又は反対
の向きでもよい。
くつかのかかる実施形態では、コピーは同一である。さらなる実施形態では、コピーは、
プロモータ、阻害性核酸分子のコード配列、及び阻害性核酸分子の翻訳を終結させるため
の(cPPT/CTS)配列等の配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、第2の発
現カセットのコピーは、核酸分子内でタンデムであり、同じ向き又は反対の向きであって
もよい。他のかかる実施形態では、コピーはタンデムでなくてもよく、同じ向き又は反対
の向きでもよい。
いくつかの態様では、核酸分子は、第1の発現カセット及び第2の発現カセットに隣接
する5´逆方向末端反復及び3´逆方向末端反復を更に含む。
する5´逆方向末端反復及び3´逆方向末端反復を更に含む。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ2ミクログロブリンに対して
阻害性である。
阻害性である。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、MHCクラスI分子の構成要素に対して
阻害性である。特定の実施形態では、阻害分子は、MHCクラスIアルファ-1(α1)
ドメイン、アルファ-2(α2)ドメイン、アルファ-3(α3)ドメイン、又はベータ
2ミクログロブリンに対して阻害性である。
阻害性である。特定の実施形態では、阻害分子は、MHCクラスIアルファ-1(α1)
ドメイン、アルファ-2(α2)ドメイン、アルファ-3(α3)ドメイン、又はベータ
2ミクログロブリンに対して阻害性である。
いくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトCD52に対して阻害性である。
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ2ミクログロブリンに対して阻害性の
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、5´及び3´の相
同性アームに対して3´から5´向きにあり、第1の発現カセットは第2の発現カセット
の5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現カセットは:(i)キメ
ラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と;(ii)キメラ抗原受容
体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータと;(iii)ポリA配列
とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコードする核酸配列と;(v)
shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央ポリプリントラクト及び中
央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、5´及び3´の相
同性アームに対して3´から5´向きにあり、第1の発現カセットは第2の発現カセット
の5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現カセットは:(i)キメ
ラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と;(ii)キメラ抗原受容
体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータと;(iii)ポリA配列
とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコードする核酸配列と;(v)
shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央ポリプリントラクト及び中
央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ2ミクログロブリンに対して阻害性の
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、5´及び3´相同性アームに対して、第1の発現カセットは3´か
ら5´の向きにあり、第2の発現カセットは5´から3´の向きにあり、第1の発現カセ
ットは第2の発現カセットの5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発
現カセットは:(i)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と
;(ii)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータ
と;(iii)ポリA配列とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコー
ドする核酸配列と;(v)shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央
ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
いくつかのかかる実施形態では、核酸分子は、第2の発現カセットの第1のコピー及び第
2のコピーを含み、第1のコピー及び第2のコピーは同一であり、第1のコピー及び第2
のコピーはタンデムにあり、さらに第1のコピーと2番目のコピーは同じ向きにある。
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、5´及び3´相同性アームに対して、第1の発現カセットは3´か
ら5´の向きにあり、第2の発現カセットは5´から3´の向きにあり、第1の発現カセ
ットは第2の発現カセットの5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発
現カセットは:(i)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と
;(ii)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータ
と;(iii)ポリA配列とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコー
ドする核酸配列と;(v)shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央
ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
いくつかのかかる実施形態では、核酸分子は、第2の発現カセットの第1のコピー及び第
2のコピーを含み、第1のコピー及び第2のコピーは同一であり、第1のコピー及び第2
のコピーはタンデムにあり、さらに第1のコピーと2番目のコピーは同じ向きにある。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸分子を含む組換え
DNAコンストラクトを提供する。
DNAコンストラクトを提供する。
いくつかの態様では、組換えDNAコンストラクトはウイルスベクターをコードする。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベ
クター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAAVベクターである。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベ
クター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAAVベクターである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸分子を含むウイル
スベクターを提供する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベク
ター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス(A
AV)ベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAAVベクター
である。
スベクターを提供する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベク
ター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス(A
AV)ベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAAVベクター
である。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞を産生する方法を提供し、該方法は、本
明細書に記載される本発明の任意の核酸分子、及び(a)ヌクレアーゼ認識配列に対して
特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、該操作されたヌクレ
アーゼが細胞内で発現される、核酸又は(b)ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有
する操作されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入することを含み、ここで、該操作さ
れたヌクレアーゼは、細胞のゲノム中のヌクレアーゼ認識配列を認識して切断し、切断部
位を生成し、本発明の核酸分子は該切断部位で細胞のゲノムに挿入される。
明細書に記載される本発明の任意の核酸分子、及び(a)ヌクレアーゼ認識配列に対して
特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、該操作されたヌクレ
アーゼが細胞内で発現される、核酸又は(b)ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有
する操作されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入することを含み、ここで、該操作さ
れたヌクレアーゼは、細胞のゲノム中のヌクレアーゼ認識配列を認識して切断し、切断部
位を生成し、本発明の核酸分子は該切断部位で細胞のゲノムに挿入される。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞はヒトT細胞である。
この方法のいくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌク
レアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR/Ca
s、コンパクトTALEN、又はmegaTALである。上記方法の特定の実施形態では
、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼである。
レアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR/Ca
s、コンパクトTALEN、又はmegaTALである。上記方法の特定の実施形態では
、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼである。
上記方法のいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、ヒトT細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子内にある。
ファ定常領域遺伝子内にある。
上記方法の特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアー
ゼ認識配列である。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列がヒトT
細胞受容体アルファ定常領域内にあり、該ヌクレアーゼ認識配列は配列番号1を含む。
ゼ認識配列である。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列がヒトT
細胞受容体アルファ定常領域内にあり、該ヌクレアーゼ認識配列は配列番号1を含む。
上記方法のいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列がヒトT細胞受容体アルフ
ァ定常領域内にあり、内因性T細胞受容体の細胞表面発現は、対照細胞と比較して低下し
ている。
ァ定常領域内にあり、内因性T細胞受容体の細胞表面発現は、対照細胞と比較して低下し
ている。
この方法のいくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸はmR
NAである。特定の実施形態では、mRNAは、操作されたヌクレアーゼ及び少なくとも
1つの追加のポリペプチド又は核酸分子をコードするポリシストロニックmRNAである
。
NAである。特定の実施形態では、mRNAは、操作されたヌクレアーゼ及び少なくとも
1つの追加のポリペプチド又は核酸分子をコードするポリシストロニックmRNAである
。
この方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明の核酸分子は、ウイ
ルスベクターを使用して細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベ
クターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター
、又はAAVベクターである。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本
明細書で前述した組換えAAVベクター等の組換えAAVベクターである。
ルスベクターを使用して細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベ
クターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター
、又はAAVベクターである。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本
明細書で前述した組換えAAVベクター等の組換えAAVベクターである。
この方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明の核酸分子は、組換
えDNAコンストラクトを使用して細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、
組換えDNAコンストラクトは、本明細書で前述した組換えDNAコンストラクトである
。
えDNAコンストラクトを使用して細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、
組換えDNAコンストラクトは、本明細書で前述した組換えDNAコンストラクトである
。
上記方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明の核酸分子は、相同
組換えにより細胞のゲノムの切断部位に挿入される。
組換えにより細胞のゲノムの切断部位に挿入される。
この方法のいくつかの実施形態では、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体である
。上記方法の他の実施形態では、操作された抗原受容体は外因性T細胞受容体である。
。上記方法の他の実施形態では、操作された抗原受容体は外因性T細胞受容体である。
この方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ2ミクログロブリ
ンに対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの
細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~~約5
0%である。上記方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は
、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約25%である。上記
方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細
胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約10%である。上記方法の他の実施形
態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミ
クログロブリン発現の約1%~約5%である。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞
は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改変されていない
。
ンに対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの
細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~~約5
0%である。上記方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は
、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約25%である。上記
方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細
胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約10%である。上記方法の他の実施形
態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミ
クログロブリン発現の約1%~約5%である。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞
は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改変されていない
。
この方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ2ミクログロブリ
ンに対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの
細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%
~95%低下する。上記方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面
発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%
低下する。この方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、
対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して75%~95%低下する
。上記方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞
上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して90%~95%低下する。上記方
法の特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低下さ
せるように遺伝子改変されていない。
ンに対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの
細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%
~95%低下する。上記方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面
発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%
低下する。この方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、
対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して75%~95%低下する
。上記方法の他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞
上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して90%~95%低下する。上記方
法の特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低下さ
せるように遺伝子改変されていない。
上記方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、MHCクラスI分子の構成要
素に対して阻害性である。この方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表
面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約50%である。上記方法
の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラ
スI分子の発現の約1%~約25%である。上記方法の特定の実施形態では、MHCクラ
スI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約10%
である。この方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細
胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約5%である。上記方法の特定の実施形態で
は、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変され
ていない。
素に対して阻害性である。この方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表
面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約50%である。上記方法
の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラ
スI分子の発現の約1%~約25%である。上記方法の特定の実施形態では、MHCクラ
スI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約10%
である。この方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細
胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約5%である。上記方法の特定の実施形態で
は、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変され
ていない。
上記方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、MHCクラスI分子の構成要
素に対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表
面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較して10%~95%低下する。
上記方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のM
HCクラスI分子の発現と比較して50%~95%低下する。上記方法の特定の実施形態
では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と
比較して75%~95%低下する。上記方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子
の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較して90%~95%低
下する。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発
現を低下させるように遺伝子改変されていない。
素に対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表
面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較して10%~95%低下する。
上記方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のM
HCクラスI分子の発現と比較して50%~95%低下する。上記方法の特定の実施形態
では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と
比較して75%~95%低下する。上記方法の特定の実施形態では、MHCクラスI分子
の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較して90%~95%低
下する。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発
現を低下させるように遺伝子改変されていない。
上記方法のいくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトCD52に対して阻害性である
。上記方法の特定の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面C
D52発現の約1%~約50%である。上記方法の他の実施形態では、CD52の細胞表
面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約25%である。上記方法の他
の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1
%~約10%である。上記方法の他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細
胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約5%である。上記方法の特定の実施形態では、
対照細胞は、CD52の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
。上記方法の特定の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面C
D52発現の約1%~約50%である。上記方法の他の実施形態では、CD52の細胞表
面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約25%である。上記方法の他
の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1
%~約10%である。上記方法の他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細
胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約5%である。上記方法の特定の実施形態では、
対照細胞は、CD52の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
上記方法のいくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトCD52に対して阻害性である
。上記方法の特定の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面C
D52発現と比較して10%~95%低下する。上記方法の他の実施形態では、CD52
の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して50%~95%低下す
る。この方法の他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面C
D52発現と比較して75%~95%低下する。上記方法の他の実施形態では、CD52
の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して90%~95%低下す
る。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、CD52の細胞表面発現を低下させる
ように遺伝子改変されていない。
。上記方法の特定の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面C
D52発現と比較して10%~95%低下する。上記方法の他の実施形態では、CD52
の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して50%~95%低下す
る。この方法の他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面C
D52発現と比較して75%~95%低下する。上記方法の他の実施形態では、CD52
の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して90%~95%低下す
る。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、CD52の細胞表面発現を低下させる
ように遺伝子改変されていない。
別の態様では、本発明は、本明細書の上記の方法のいずれかによって作製された遺伝子
改変真核細胞を提供する。
改変真核細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸分子を含む遺伝子
改変真核細胞を提供し、ここで、操作された抗原受容体及び阻害核酸分子は遺伝子改変真
核細胞において発現される。
改変真核細胞を提供し、ここで、操作された抗原受容体及び阻害核酸分子は遺伝子改変真
核細胞において発現される。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変されたヒトT細胞である
。
。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ認識配列で遺伝子改変真
核細胞のゲノムに挿入される。
核細胞のゲノムに挿入される。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子
である。
である。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識
配列、TALEN認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)認識配列、CRI
SPR/Cas認識配列、コンパクトTALEN認識配列、又はメガTAL認識配列であ
る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配
列である。
配列、TALEN認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)認識配列、CRI
SPR/Cas認識配列、コンパクトTALEN認識配列、又はメガTAL認識配列であ
る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配
列である。
特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列がヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝
子内にあり、該ヌクレアーゼ認識配列は、配列番号1を含む操作されたメガヌクレアーゼ
認識配列である。
子内にあり、該ヌクレアーゼ認識配列は、配列番号1を含む操作されたメガヌクレアーゼ
認識配列である。
いくつかの実施形態では、内因性T細胞受容体の細胞表面発現は、対照細胞と比較して
低下している。
低下している。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ2ミクログロブリンに対して
阻害性である。特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照
細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約50%である。他の実施形
態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミ
クログロブリン発現の約1%~約25%である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロ
ブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%
~約10%である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対
照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約5%である。特定の実施
形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低減するように遺伝子
改変されていない。
阻害性である。特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照
細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約50%である。他の実施形
態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミ
クログロブリン発現の約1%~約25%である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロ
ブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%
~約10%である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対
照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約5%である。特定の実施
形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低減するように遺伝子
改変されていない。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ2ミクログロブリンに対して
阻害性である。特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照
細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%~95%低下する。他
の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベ
ータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%低下する。他の実施形態では、ベ
ータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン発現と比較して75%~95%低下する。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブ
リンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して
90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログ
ロブリン発現を低減するように遺伝子改変されていない。
阻害性である。特定の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照
細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%~95%低下する。他
の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベ
ータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%低下する。他の実施形態では、ベ
ータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン発現と比較して75%~95%低下する。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブ
リンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して
90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログ
ロブリン発現を低減するように遺伝子改変されていない。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、MHCクラスI分子の構成要素に対して
阻害性である。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上
のMHCクラスI分子の発現の約1%~約50%である。特定の実施形態では、MHCク
ラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約25
%である。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のM
HCクラスI分子の発現の約1%~約10%である。特定の実施形態では、MHCクラス
I分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約5%であ
る。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発現を低下させる
ように遺伝子改変されていない。
阻害性である。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上
のMHCクラスI分子の発現の約1%~約50%である。特定の実施形態では、MHCク
ラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約25
%である。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のM
HCクラスI分子の発現の約1%~約10%である。特定の実施形態では、MHCクラス
I分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現の約1%~約5%であ
る。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発現を低下させる
ように遺伝子改変されていない。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、MHCクラスI分子の構成要素に対して
阻害性である。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上
のMHCクラスI分子の発現と比較して10%~95%低下する。特定の実施形態では、
MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較し
て50%~95%低下する。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は
、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較して75%~95%低下する。特定の実
施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の
発現と比較して90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラ
スI分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
阻害性である。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上
のMHCクラスI分子の発現と比較して10%~95%低下する。特定の実施形態では、
MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較し
て50%~95%低下する。特定の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は
、対照細胞上のMHCクラスI分子の発現と比較して75%~95%低下する。特定の実
施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の
発現と比較して90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラ
スI分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
いくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトCD52に対して阻害性である。特定の実
施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~
約50%である。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面
CD52発現の約1%~約25%である。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は
、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約10%である。他の実施形態では、C
D52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約5%である。
特定の実施形態では、対照細胞は、CD52の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改
変されていない。
施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~
約50%である。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面
CD52発現の約1%~約25%である。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は
、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約10%である。他の実施形態では、C
D52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約5%である。
特定の実施形態では、対照細胞は、CD52の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改
変されていない。
いくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトCD52に対して阻害性である。特定の実
施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して
10%~95%低下する。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の
細胞表面CD52発現と比較して50%~95%低下する。他の実施形態では、CD52
の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して75%~95%低下す
る。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現
と比較して90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、CD52の細胞
表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して
10%~95%低下する。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の
細胞表面CD52発現と比較して50%~95%低下する。他の実施形態では、CD52
の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現と比較して75%~95%低下す
る。他の実施形態では、CD52の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現
と比較して90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、CD52の細胞
表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗原受容体
をコードする核酸配列をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞を提供し、ここで、遺伝
子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面
ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%~95%低下する。特定の実施形態では
、遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細
胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%低下する。特定の実施形
態では、遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞
上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して75%~95%低下する。特定の
実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対
照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して90%~95%低下する。
特定の実施形態では、対照細胞は、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現を低減する
ように遺伝子改変されていない。
をコードする核酸配列をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞を提供し、ここで、遺伝
子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面
ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%~95%低下する。特定の実施形態では
、遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細
胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%低下する。特定の実施形
態では、遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞
上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して75%~95%低下する。特定の
実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対
照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して90%~95%低下する。
特定の実施形態では、対照細胞は、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現を低減する
ように遺伝子改変されていない。
いくつか実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細
胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約50%である。他の実施形態では、ベ
ータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン発現の約1%~約25%である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細
胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約10%
である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の
細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約5%である。特定の実施形態では、
対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低減するように遺伝子改変されて
いない。
胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約50%である。他の実施形態では、ベ
ータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン発現の約1%~約25%である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細
胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約10%
である。他の実施形態では、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の
細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%~約5%である。特定の実施形態では、
対照細胞は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低減するように遺伝子改変されて
いない。
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、ベータ2ミクログロブ
リンに対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では
、阻害性核酸分子はRNA干渉分子である。いくつかの実施形態では、RNA干渉分子は
、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ヘアピン
siRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA、又はmiRNA適合s
hRNAである。特定の実施形態では、RNA干渉分子はshRNAである。特定の実施
形態では、shRNAは配列番号2~配列番号4のいずれか1つの配列を含む。特定の実
施形態では、shRNAは配列番号2の配列を含む。
リンに対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では
、阻害性核酸分子はRNA干渉分子である。いくつかの実施形態では、RNA干渉分子は
、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ヘアピン
siRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA、又はmiRNA適合s
hRNAである。特定の実施形態では、RNA干渉分子はshRNAである。特定の実施
形態では、shRNAは配列番号2~配列番号4のいずれか1つの配列を含む。特定の実
施形態では、shRNAは配列番号2の配列を含む。
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸
分子をコードする核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている。特定の実施形態では
、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、本発明の核酸分子を含む。
分子をコードする核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている。特定の実施形態では
、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、本発明の核酸分子を含む。
他の実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸分子を
コードする核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている。
コードする核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、対照細胞と比較した場合、内因性N
K細胞殺傷の影響を受けにくく、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長
されており、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び/又
は対照細胞と比較した場合、同種異系性の低下を示す。
K細胞殺傷の影響を受けにくく、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長
されており、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び/又
は対照細胞と比較した場合、同種異系性の低下を示す。
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体は、キメラ抗原受容体又は外因性T細
胞受容体である。
胞受容体である。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変されたヒトT細胞である
。
。
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変されたヒトT細胞であり、操作
された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である。
された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗原受容体
をコードする核酸配列をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞を提供し、ここで、遺伝
子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI
分子の細胞表面発現と比較して10%~95%低下する。特定の実施形態では、遺伝子改
変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子
の細胞表面発現と比較して50%~95%低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真
核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細
胞表面発現と比較して75%~95%低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細
胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表
面発現と比較して90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCク
ラスI分子の構成要素の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
をコードする核酸配列をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞を提供し、ここで、遺伝
子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI
分子の細胞表面発現と比較して10%~95%低下する。特定の実施形態では、遺伝子改
変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子
の細胞表面発現と比較して50%~95%低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真
核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細
胞表面発現と比較して75%~95%低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細
胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表
面発現と比較して90%~95%低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCク
ラスI分子の構成要素の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
いくつかの実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表
面MHCクラスI分子発現の約1%~約50%である。他の実施形態では、MHCクラス
I分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面MHCクラスI分子発現の約1%~約2
5%である。他の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細
胞表面MHCクラスI分子発現の約1%~約10%である。他の実施形態では、MHCク
ラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面MHCクラスI分子発現の約1%~
約5%である。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発現を
低下させるように遺伝子改変されていない。
面MHCクラスI分子発現の約1%~約50%である。他の実施形態では、MHCクラス
I分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面MHCクラスI分子発現の約1%~約2
5%である。他の実施形態では、MHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細
胞表面MHCクラスI分子発現の約1%~約10%である。他の実施形態では、MHCク
ラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面MHCクラスI分子発現の約1%~
約5%である。特定の実施形態では、対照細胞は、MHCクラスI分子の細胞表面発現を
低下させるように遺伝子改変されていない。
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、MHCクラスI分子の
構成要素に対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態
では、阻害分子は、MHCクラスIアルファ-1(α1)ドメイン、アルファ-2(α2
)ドメイン、アルファ-3(α3)ドメイン、又はベータ2ミクログロブリンに対して阻
害性である。特定の実施形態では、阻害分子はベータ2ミクログロブリンに対して阻害性
である。
構成要素に対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態
では、阻害分子は、MHCクラスIアルファ-1(α1)ドメイン、アルファ-2(α2
)ドメイン、アルファ-3(α3)ドメイン、又はベータ2ミクログロブリンに対して阻
害性である。特定の実施形態では、阻害分子はベータ2ミクログロブリンに対して阻害性
である。
特定の実施形態では、阻害性核酸分子はRNA干渉分子である。いくつかの実施形態で
は、RNA干渉分子は、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(s
iRNA)、ヘアピンsiRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA、
又はmiRNA適合shRNAである。特定の実施形態では、RNA干渉分子はshRN
Aである。
は、RNA干渉分子は、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(s
iRNA)、ヘアピンsiRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA、
又はmiRNA適合shRNAである。特定の実施形態では、RNA干渉分子はshRN
Aである。
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ2ミクログロブリンに対して阻害性の
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、5´及び3´の相
同性アームに対して3´から5´向きにあり、第1の発現カセットは第2の発現カセット
の5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現カセットは:(i)キメ
ラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と;(ii)キメラ抗原受容
体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータと;(iii)ポリA配列
とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコードする核酸配列と;(v)
shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央ポリプリントラクト及び中
央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、第1の発現カセット及び第2の発現カセットは、5´及び3´の相
同性アームに対して3´から5´向きにあり、第1の発現カセットは第2の発現カセット
の5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発現カセットは:(i)キメ
ラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と;(ii)キメラ抗原受容
体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータと;(iii)ポリA配列
とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコードする核酸配列と;(v)
shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央ポリプリントラクト及び中
央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ2ミクログロブリンに対して阻害性の
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、5´及び3´相同性アームに対して、第1の発現カセットは3´か
ら5´の向きにあり、第2の発現カセットは5´から3´の向きにあり、第1の発現カセ
ットは第2の発現カセットの5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発
現カセットは:(i)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と
;(ii)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータ
と;(iii)ポリA配列とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコー
ドする核酸配列と;(v)shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央
ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
いくつかのかかる実施形態では、核酸分子は、第2の発現カセットの第1のコピー及び第
2のコピーを含み、第1のコピー及び第2のコピーは同一であり、第1のコピー及び第2
のコピーはタンデムにあり、さらに第1のコピーと2番目のコピーは同じ向きにある。
shRNAであり、shRNAは、配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を
有する。特定の実施形態では、shRNAは配列番号2を含む配列を有する。いくつかの
かかる実施形態では、5´及び3´相同性アームに対して、第1の発現カセットは3´か
ら5´の向きにあり、第2の発現カセットは5´から3´の向きにあり、第1の発現カセ
ットは第2の発現カセットの5´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第1の発
現カセットは:(i)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と
;(ii)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプロモータ
と;(iii)ポリA配列とを含み;第2の発現カセットは、(iv)shRNAをコー
ドする核酸配列と;(v)shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;(vi)中央
ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列と、を含む。
いくつかのかかる実施形態では、核酸分子は、第2の発現カセットの第1のコピー及び第
2のコピーを含み、第1のコピー及び第2のコピーは同一であり、第1のコピー及び第2
のコピーはタンデムにあり、さらに第1のコピーと2番目のコピーは同じ向きにある。
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸
分子をコードする核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている。特定の実施形態では
、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、本発明の核酸分子を含む。
分子をコードする核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている。特定の実施形態では
、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、本発明の核酸分子を含む。
他の実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸分子を
コードする核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている。
コードする核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、対照細胞と比較した場合、内因性N
K細胞殺傷の影響を受けにくく、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長
されており、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び/又
は対照細胞と比較した場合、同種異系性の低下を示す。
K細胞殺傷の影響を受けにくく、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長
されており、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び/又
は対照細胞と比較した場合、同種異系性の低下を示す。
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体は、キメラ抗原受容体又は外因性T細
胞受容体である。
胞受容体である。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変されたヒトT細胞である
。
。
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変されたヒトT細胞であり、操作
された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である。
された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容可能な担体と、治療有効量の本明細書で上に記
載される遺伝子改変真核細胞とを含む、医薬組成物を提供する。
載される遺伝子改変真核細胞とを含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトT
細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、
ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン発現の約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5
%である。
細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、
ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン発現の約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5
%である。
他の特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトT細胞で
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、遺伝子
改変ヒトT細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上のベータ2
ミクログロブリンの細胞表面発現と比較して、10%~95%、50%~95%、75%
~95%、又は90%~95%低下する。
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、遺伝子
改変ヒトT細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上のベータ2
ミクログロブリンの細胞表面発現と比較して、10%~95%、50%~95%、75%
~95%、又は90%~95%低下する。
いくつかの特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトT
細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、
MHCクラスI分子の細胞表面発現は対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現の
約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5%である。
細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、
MHCクラスI分子の細胞表面発現は対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現の
約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5%である。
他の特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトT細胞で
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、遺伝子
改変ヒトT細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI
分子の細胞表面発現と比較して、10%~95%、50%~95%、75%~95%、又
は90%~95%低下する。
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、遺伝子
改変ヒトT細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI
分子の細胞表面発現と比較して、10%~95%、50%~95%、75%~95%、又
は90%~95%低下する。
他の特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトT細胞で
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体であり、CD52の細胞表面発現は対照
細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10
%、又は約1%~約5%である。
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体であり、CD52の細胞表面発現は対照
細胞上の細胞表面CD52発現の約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10
%、又は約1%~約5%である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトT細胞で
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、遺伝子
改変ヒトT細胞上のCD52の細胞表面発現は、対照細胞上のCD52の細胞表面発現と
比較して、10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~95%低下
する。
あり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、遺伝子
改変ヒトT細胞上のCD52の細胞表面発現は、対照細胞上のCD52の細胞表面発現と
比較して、10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~95%低下
する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、それを必要とする被験体の癌の治療にお
ける免疫療法用である。
ける免疫療法用である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の任意の遺伝子改変真核細胞を含
む遺伝子改変真核細胞の集団を提供する。
む遺伝子改変真核細胞の集団を提供する。
いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも10%、少なくとも15%、少な
くとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも4
0%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少
なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも
85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、
少なくとも98%、少なくとも99%、又は最大100%が、本明細書に記載される遺伝
子改変真核細胞である。
くとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも4
0%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少
なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも
85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、
少なくとも98%、少なくとも99%、又は最大100%が、本明細書に記載される遺伝
子改変真核細胞である。
特定の実施形態では、集団の遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変ヒトT細胞若しくはそ
れに由来する細胞、又は遺伝子改変NK細胞若しくはそれに由来する細胞である。
れに由来する細胞、又は遺伝子改変NK細胞若しくはそれに由来する細胞である。
特定の実施形態では、集団の遺伝子改変真核細胞は、細胞表面キメラ抗原受容体又は外
因性T細胞受容体を含む。これらの実施形態のいくつかでは、キメラ抗原受容体又は外因
性T細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメイン
を含む。
因性T細胞受容体を含む。これらの実施形態のいくつかでは、キメラ抗原受容体又は外因
性T細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメイン
を含む。
いくつかの実施形態では、集団の遺伝子改変真核細胞は、改変されていない対照細胞と
比較した場合、内因性T細胞受容体の細胞表面発現を有さない。いくつかの実施形態では
、集団の遺伝子改変真核細胞は、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又は
CD52の細胞表面発現が低下している。
比較した場合、内因性T細胞受容体の細胞表面発現を有さない。いくつかの実施形態では
、集団の遺伝子改変真核細胞は、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又は
CD52の細胞表面発現が低下している。
別の態様では、本発明は、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体の疾患を治療
する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与する
ことを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する遺伝子改変ヒトT細胞であり、遺伝子改変ヒトT細胞上のベータ2ミクログロ
ブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%
~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5%である。
する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与する
ことを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する遺伝子改変ヒトT細胞であり、遺伝子改変ヒトT細胞上のベータ2ミクログロ
ブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現の約1%
~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5%である。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトT細胞上のベータ2ミクログロブ
リンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して
10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~95%低下する。
リンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して
10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~95%低下する。
上記方法のいくつかの実施形態では、被験体おいて、細胞表面ベータ2ミクログロブリ
ン発現を有さない遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の内因性
NK細胞殺傷は低下する。
ン発現を有さない遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の内因性
NK細胞殺傷は低下する。
上記方法のいくつかの実施形態では、対照細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞
上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現が低下する、本明細書に記載される任意の医
薬組成物が被験体に投与される。
上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現が低下する、本明細書に記載される任意の医
薬組成物が被験体に投与される。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたヒトT細胞は被験体に対して同
種異系である。
種異系である。
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を有さな
い遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ2ミクログロブリン
の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の
持続性は被験体において延長されている。
い遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ2ミクログロブリン
の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の
持続性は被験体において延長されている。
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を有さな
い遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ2ミクログロブリン
の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の
拡大は被験体において増強されている。
い遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ2ミクログロブリン
の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の
拡大は被験体において増強されている。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトT細胞の同種異系性は、野生型レ
ベルのベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較し
た場合、低下している。
ベルのベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較し
た場合、低下している。
上記方法のいくつかの実施形態では、疾患は癌である。
上記方法のいくつかの実施形態では、癌は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白
血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、B細胞起源
の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、
卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方
法の特定の実施形態では、B細胞起源の癌は、B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞
慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、B細胞起源
の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、
卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方
法の特定の実施形態では、B細胞起源の癌は、B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞
慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体の疾患を治療
する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与する
ことを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する遺伝子改変ヒトT細胞であり、遺伝子改変ヒトT細胞上のMHCクラスI分子
の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現の約1%~約50%
、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5%である。
する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与する
ことを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する遺伝子改変ヒトT細胞であり、遺伝子改変ヒトT細胞上のMHCクラスI分子
の細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現の約1%~約50%
、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5%である。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトT細胞上のMHCクラスI分子の
細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現と比較して10%~9
5%、50%~95%、75%~95%、又は90%~95%低下する。
細胞表面発現は、対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現と比較して10%~9
5%、50%~95%、75%~95%、又は90%~95%低下する。
上記方法のいくつかの実施形態では、被験体おいて、MHCクラスI分子の細胞表面発
現を有さない遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の内因性NK
細胞殺傷は低下する。
現を有さない遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の内因性NK
細胞殺傷は低下する。
上記方法のいくつかの実施形態では、対照細胞と比較した場合に遺伝子改変ヒトT細胞
上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が低下する、本明細書に記載される任意の医薬組
成物が被験体に投与される。
上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が低下する、本明細書に記載される任意の医薬組
成物が被験体に投与される。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたヒトT細胞は被験体に対して同
種異系である。
種異系である。
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面MHCクラスI分子発現を有さない遺伝
子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのMHCクラスI分子の細胞表面発
現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の持続性は被験
体において延長されている。
子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのMHCクラスI分子の細胞表面発
現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の持続性は被験
体において延長されている。
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面MHCクラスI分子発現を有さない遺伝
子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのMHCクラスI分子の細胞表面発
現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の拡大は被験体
において増強されている。
子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのMHCクラスI分子の細胞表面発
現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトT細胞の拡大は被験体
において増強されている。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトT細胞の同種異系性は、野生型レ
ベルのMHCクラスI分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合
、低下している。
ベルのMHCクラスI分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合
、低下している。
上記方法のいくつかの実施形態では、疾患は癌である。
上記方法のいくつかの実施形態では、癌は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白
血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、B細胞起源
の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、
卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方
法の特定の実施形態では、B細胞起源の癌は、B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞
慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、B細胞起源
の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、
卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方
法の特定の実施形態では、B細胞起源の癌は、B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞
慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体の癌患を治療
する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与する
ことを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する遺伝子改変ヒトT細胞であり、遺伝子改変ヒトT細胞上のCD52の細胞表面
発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の1%~50%、1%~25%、1%~10
%、又は1%~5%である。
する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与する
ことを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する遺伝子改変ヒトT細胞であり、遺伝子改変ヒトT細胞上のCD52の細胞表面
発現は、対照細胞上の細胞表面CD52発現の1%~50%、1%~25%、1%~10
%、又は1%~5%である。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトT細胞上のCD52の細胞表面発
現は、対照細胞上のCD52の細胞表面発現と比較して10%~95%、50%~95%
、75%~95%、又は90%~95%低下する。
現は、対照細胞上のCD52の細胞表面発現と比較して10%~95%、50%~95%
、75%~95%、又は90%~95%低下する。
上記方法のいくつかの実施形態では、対照細胞と比較した場合に遺伝子改変ヒトT細胞
上のCD52の細胞表面発現が低下される、本明細書に記載される医薬組成物が被験体に
投与される。
上のCD52の細胞表面発現が低下される、本明細書に記載される医薬組成物が被験体に
投与される。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたヒトT細胞は被験体に対して同
種異系である。
種異系である。
上記方法のいくつかの実施形態では、癌は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白
血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、B細胞起源
の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、
卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方
法の特定の実施形態では、B細胞起源の癌は、B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞
慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、B細胞起源
の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、
卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方
法の特定の実施形態では、B細胞起源の癌は、B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞
慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
別の実施形態では、本発明は、操作された抗原受容体を含む遺伝子改変真核細胞の濃縮
された集団を調製する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される遺伝子改変真核細
胞、及び野生型レベルの細胞表面CD52を発現する細胞を含む細胞集団を調製すること
を含み、ここで、遺伝子改変真核細胞上のCD52の細胞表面発現が、対照細胞と比較し
た場合に、約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5
%であり、該方法が:(a)細胞集団を抗CD52結合分子に複合化したビーズと接触さ
せる工程であって、ここで、野生型レベルの細胞表面CD52を発現する細胞はビーズに
結合され、遺伝子改変真核細胞はビーズに結合していない工程、及び(b)細胞集団から
ビーズを除去して、細胞の濃縮集団を産生する工程であって、ここで、細胞の濃縮集団が
、遺伝子改変真核細胞について濃縮されている工程、を含む。
された集団を調製する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される遺伝子改変真核細
胞、及び野生型レベルの細胞表面CD52を発現する細胞を含む細胞集団を調製すること
を含み、ここで、遺伝子改変真核細胞上のCD52の細胞表面発現が、対照細胞と比較し
た場合に、約1%~約50%、約1%~約25%、約1%~約10%、又は約1%~約5
%であり、該方法が:(a)細胞集団を抗CD52結合分子に複合化したビーズと接触さ
せる工程であって、ここで、野生型レベルの細胞表面CD52を発現する細胞はビーズに
結合され、遺伝子改変真核細胞はビーズに結合していない工程、及び(b)細胞集団から
ビーズを除去して、細胞の濃縮集団を産生する工程であって、ここで、細胞の濃縮集団が
、遺伝子改変真核細胞について濃縮されている工程、を含む。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のCD52の細胞表面発現
は、対照細胞と比較した場合、10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は
90%~95%低下する。
は、対照細胞と比較した場合、10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は
90%~95%低下する。
この方法のいくつかの実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。上記方法の特定の実
施形態では、磁気ビーズは、磁気分離により細胞集団から除去される。
施形態では、磁気ビーズは、磁気分離により細胞集団から除去される。
上記方法のいくつかの実施形態では、濃縮された集団中の少なくとも約50%、少なく
とも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なく
とも約95%、又は最大100%の細胞が、遺伝子改変真核細胞である。
とも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なく
とも約95%、又は最大100%の細胞が、遺伝子改変真核細胞である。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞はキメラ抗原受容体を発現す
る。上記方法の他の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は外因性T細胞受容体を発現する
。
る。上記方法の他の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は外因性T細胞受容体を発現する
。
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、本明細書に記載される任
意の遺伝子改変T細胞等の遺伝子改変されたヒトT細胞である。
意の遺伝子改変T細胞等の遺伝子改変されたヒトT細胞である。
別の態様では、本開示は、医薬として使用するための本明細書に記載される遺伝子改変
真核細胞を提供する。本開示はさらに、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞を必要
とする被験体の疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される遺伝子
改変真核細胞の使用を提供する。かかる一実施形態では、医薬は癌の治療に有用である。
真核細胞を提供する。本開示はさらに、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞を必要
とする被験体の疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される遺伝子
改変真核細胞の使用を提供する。かかる一実施形態では、医薬は癌の治療に有用である。
本発明の前述及び他の態様並びに実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を
参照することにより、より完全に理解され得る。明確にするため、個別の実施形態に記載
される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよい。実施形
態の全て組み合わせは、本発明に特に包含され、あたかもそれぞれの全ての組み合わせが
個別かつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示されている。逆に、簡潔にする
ため、単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特徴は、個別に又は任意
の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態に挙げられる特徴の全てサ
ブコンビネーションもまた本発明に特に包含され、あたかもそれぞれの全てのかかるサブ
コンビネーションが本明細書において個々にかつ明示的に開示されているかのように本明
細書に開示される。本明細書に開示される本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加
えて、本発明の他の各態様に適用される。
参照することにより、より完全に理解され得る。明確にするため、個別の実施形態に記載
される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよい。実施形
態の全て組み合わせは、本発明に特に包含され、あたかもそれぞれの全ての組み合わせが
個別かつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示されている。逆に、簡潔にする
ため、単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特徴は、個別に又は任意
の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態に挙げられる特徴の全てサ
ブコンビネーションもまた本発明に特に包含され、あたかもそれぞれの全てのかかるサブ
コンビネーションが本明細書において個々にかつ明示的に開示されているかのように本明
細書に開示される。本明細書に開示される本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加
えて、本発明の他の各態様に適用される。
配列の簡単な説明
配列番号1は、TRC1-2認識配列の核酸配列を示す。
配列番号2は、抗ベータ2ミクログロブリンshRNA472の核酸配列を示す。
配列番号3は、抗ベータ2ミクログロブリンshRNA256の核酸配列を示す。
配列番号4は、抗ベータ2ミクログロブリンshRNA254の核酸配列を示す。
配列番号5は、抗CD52 shRNA572の核酸配列を示す。
配列番号6は、抗CD52 shRNA876の核酸配列を示す。
配列番号7は、抗CD52 shRNA568の核酸配列を示す。
配列番号8は、抗CD52 shRNA569の核酸配列を示す。
配列番号9は、抗CD52 shRNA571の核酸配列を示す。
配列番号10は、CAR7005コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号11は、CAR7002コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号12は、CAR7004コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号13は、CAR7204コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号14は、CAR7013コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号15は、CAR7213コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号16は、CAR7014コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号17は、CAR7214コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号18は、CAR7007コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号19は、CAR7217コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号20は、CAR7008コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号21は、CAR7218コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号22は、CAR7009コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号23は、CAR7219コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号24は、CAR7029コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号25は、CAR7056コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号26は、CAR7059コンストラクトの核酸配列を示す。
配列番号27は、CAR7060コンストラクトの核酸配列を示す。
1.1参照及び定義
(定義)
本明細書で参照される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。
本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及び
GenBankデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが具体的かつ個別に参照に
より組み込まれていることが示されているのと同程度に参照することで本明細書の一部を
なす。
(定義)
本明細書で参照される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。
本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及び
GenBankデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが具体的かつ個別に参照に
より組み込まれていることが示されているのと同程度に参照することで本明細書の一部を
なす。
本開示は、種々の形態で具体化され得て、本明細書に記載される実施形態に限定される
と解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が十分かつ完全であ
り、本開示の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されている。例えば、一実施形態に
関して例示される特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例
示される特徴をその実施形態から削除することができる。さらに、本開示に照らして、本
開示から逸脱しない本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形及び追加が当業者
には明らかであろう。
と解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が十分かつ完全であ
り、本開示の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されている。例えば、一実施形態に
関して例示される特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例
示される特徴をその実施形態から削除することができる。さらに、本開示に照らして、本
開示から逸脱しない本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形及び追加が当業者
には明らかであろう。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全て技術用語及び科学用語は、本開示が
属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の本開示
の説明で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本
開示を限定することを意図するものではない。
属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の本開示
の説明で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本
開示を限定することを意図するものではない。
本明細書で言及される全て出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照するこ
とでその全体が本明細書の一部をなす。
とでその全体が本明細書の一部をなす。
本明細書で使用される場合、「1つ(a)」、「1つ(an)」、又は「その(the
)」は、1つ以上を意味する場合がある。例えば、「1つの」細胞は、単一の細胞又は複
数の細胞を意味する。
)」は、1つ以上を意味する場合がある。例えば、「1つの」細胞は、単一の細胞又は複
数の細胞を意味する。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「又は」という言葉は、「いずれ
か/又は」の排他的な意味ではなく、「及び/又は」の包括的な意味で使用される。
か/又は」の排他的な意味ではなく、「及び/又は」の包括的な意味で使用される。
「発現カセット」、「組換えDNAコンストラクト」、「組換えコンストラクト」、「
発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、及び「組換え
DNA断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、核酸断片である。組換えコン
ストラクトは、自然界では一緒に見られない調節配列及びコード配列を含むがこれらに限
定されない核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えDNAコンストラクト
は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、自然に
見られるものとは異なる方法で配置された調節配列及びコード配列を含んでもよい。この
ようなコンストラクトを単独で使用してもよく、又はベクターと組み合わせて使用しても
よい。
発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、及び「組換え
DNA断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、核酸断片である。組換えコン
ストラクトは、自然界では一緒に見られない調節配列及びコード配列を含むがこれらに限
定されない核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えDNAコンストラクト
は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、自然に
見られるものとは異なる方法で配置された調節配列及びコード配列を含んでもよい。この
ようなコンストラクトを単独で使用してもよく、又はベクターと組み合わせて使用しても
よい。
本明細書で使用される「ベクター」又は「組換えDNAベクター」は、所与の宿主細胞
においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製システム及び配列を
含むコンストラクトであってもよい。ベクターが使用される場合であれば、ベクターの選
択は、当業者によく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法
に依存する。ベクターとしては、プラスミドベクター及び組換えレンチウイルス又は組換
えAAVベクター、又は本開示の共刺激ドメインをコードする遺伝子を標的細胞に送達す
るのに適した当技術分野で知られている任意の他のベクターが挙げられるが、これらに限
定されない。当業者は、本開示の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む
宿主細胞を成功裡に形質転換、選択及び増殖するためにベクター上に存在しなければなら
ない遺伝要素に精通している。
においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製システム及び配列を
含むコンストラクトであってもよい。ベクターが使用される場合であれば、ベクターの選
択は、当業者によく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法
に依存する。ベクターとしては、プラスミドベクター及び組換えレンチウイルス又は組換
えAAVベクター、又は本開示の共刺激ドメインをコードする遺伝子を標的細胞に送達す
るのに適した当技術分野で知られている任意の他のベクターが挙げられるが、これらに限
定されない。当業者は、本開示の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む
宿主細胞を成功裡に形質転換、選択及び増殖するためにベクター上に存在しなければなら
ない遺伝要素に精通している。
また、本明細書で使用される「ベクター」はウイルスベクターを指す場合もある。ウイ
ルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)が挙げられるが、これらに限
定されない。
ルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)が挙げられるが、これらに限
定されない。
本明細書で使用される「動作可能に連結された」という用語は、2つ以上の要素間の機
能的連結を意味することを意図している。例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼを
コードする核酸配列と調節配列(例えば、プロモータ)との間の動作可能な連結は、ヌク
レアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。動作可能に連結さ
れた要素は、連続してもよく、又は非連続であってもよい。2つのタンパク質コード領域
の連結を指すために使用される場合、動作可能に連結されることにより、コード領域が同
じリーディングフレームにあることが意図される。
能的連結を意味することを意図している。例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼを
コードする核酸配列と調節配列(例えば、プロモータ)との間の動作可能な連結は、ヌク
レアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。動作可能に連結さ
れた要素は、連続してもよく、又は非連続であってもよい。2つのタンパク質コード領域
の連結を指すために使用される場合、動作可能に連結されることにより、コード領域が同
じリーディングフレームにあることが意図される。
本明細書で使用する「RNA干渉」又は「RNAi」という用語は、二本鎖RNA(d
sRNA)を多様な範囲の生物及び細胞のタイプへの導入が相補的mRNAの分解を引き
起こす現象を指す。細胞では、長いdsRNAは、Dicerとして知られているリボヌ
クレアーゼによって、短い21個~25個のヌクレオチドの低分子干渉RNA、すなわち
siRNAに切断される。その後、siRNAはタンパク質成分とともにRNA誘導サイ
レンシング複合体(RISC)に集合し、その過程で一本鎖化される(unwindin
g)。活性化されたRISCは、siRNAアンチセンス鎖とmRNAとの間の塩基対相
互作用により、相補的な転写物に結合する。結合したmRNAは切断され、mRNAの配
列特異的分解は遺伝子サイレンシングをもたらす。例えば、米国特許第6,506,55
9号明細書を参照されたい。
sRNA)を多様な範囲の生物及び細胞のタイプへの導入が相補的mRNAの分解を引き
起こす現象を指す。細胞では、長いdsRNAは、Dicerとして知られているリボヌ
クレアーゼによって、短い21個~25個のヌクレオチドの低分子干渉RNA、すなわち
siRNAに切断される。その後、siRNAはタンパク質成分とともにRNA誘導サイ
レンシング複合体(RISC)に集合し、その過程で一本鎖化される(unwindin
g)。活性化されたRISCは、siRNAアンチセンス鎖とmRNAとの間の塩基対相
互作用により、相補的な転写物に結合する。結合したmRNAは切断され、mRNAの配
列特異的分解は遺伝子サイレンシングをもたらす。例えば、米国特許第6,506,55
9号明細書を参照されたい。
本明細書で使用される「siRNA」という用語は、低分子干渉RNA又はサイレンシ
ングRNAとしても知られる低分子干渉RNAを指す。siRNAは、例えば、18個~
30個、20個~25個、21個~23個、又は21個のヌクレオチド長の二本鎖RNA
分子であってもよい。本明細書で使用される「shRNA」は、ショートヘアピンRNA
であって、これはRNA干渉により遺伝子発現をサイレンシングするために使用すること
もできるタイトなヘアピンターンを作るRNAの配列である。shRNAは、U6プロモ
ータに動作可能に連結されることにより発現し得る。shRNAヘアピン構造は、細胞機
構によって切断されてsiRNAとなる。本明細書に開示されるshRNAは、標的タン
パク質のmRNAのヌクレオチドの少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレ
オチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌ
クレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも2
0ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、又は23
ヌクレオチドに相補的な配列を含み得る。
ングRNAとしても知られる低分子干渉RNAを指す。siRNAは、例えば、18個~
30個、20個~25個、21個~23個、又は21個のヌクレオチド長の二本鎖RNA
分子であってもよい。本明細書で使用される「shRNA」は、ショートヘアピンRNA
であって、これはRNA干渉により遺伝子発現をサイレンシングするために使用すること
もできるタイトなヘアピンターンを作るRNAの配列である。shRNAは、U6プロモ
ータに動作可能に連結されることにより発現し得る。shRNAヘアピン構造は、細胞機
構によって切断されてsiRNAとなる。本明細書に開示されるshRNAは、標的タン
パク質のmRNAのヌクレオチドの少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレ
オチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌ
クレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも2
0ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、又は23
ヌクレオチドに相補的な配列を含み得る。
本明細書で使用される「操作された抗原受容体」は、リガンド又は抗原(例えば、腫瘍
特異的抗原)への刺激/結合時に細胞内に活性化シグナルを誘導するキメラ抗原受容体又
は外因性T細胞受容体等、細胞に導入された外因性受容体を指す。
特異的抗原)への刺激/結合時に細胞内に活性化シグナルを誘導するキメラ抗原受容体又
は外因性T細胞受容体等、細胞に導入された外因性受容体を指す。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「CAR」は、抗原、又は他のリガン
ド若しくは分子に対する特異性を免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)
にグラフトする操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、少なくとも
細胞外リガンド結合ドメイン又は部分と、1つ以上のシグナル伝達ドメイン及び/又は共
刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
ド若しくは分子に対する特異性を免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)
にグラフトする操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、少なくとも
細胞外リガンド結合ドメイン又は部分と、1つ以上のシグナル伝達ドメイン及び/又は共
刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、モノクローナル抗
体に由来する単鎖可変断片(scFV)の形態であり、特定のエピトープ又は抗原に特異
性を提供する(例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子等の細胞の
表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原)。いくつかの実施形態では、scFvはリ
ンカー配列を介して付着している。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイ
ンは、目的の任意の抗原又はエピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、sc
Fvはヒト化されている。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメイン
は、Bリンパ球上の自己抗原特異的B細胞受容体によって認識される自己抗原を含み(P
ayneら(2016)Science,Vol.353(6295):179-184
参照)、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応性Bリンパ球を特異的に標的として殺傷するよ
うにT細胞に指示する。かかるCARは、キメラ自己抗体受容体(CAAR)と称される
ことがあり、本明細書に記載される1つ以上の共刺激ドメインのかかるCAARへの組み
込みが本開示に含まれる。
体に由来する単鎖可変断片(scFV)の形態であり、特定のエピトープ又は抗原に特異
性を提供する(例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子等の細胞の
表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原)。いくつかの実施形態では、scFvはリ
ンカー配列を介して付着している。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイ
ンは、目的の任意の抗原又はエピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、sc
Fvはヒト化されている。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメイン
は、Bリンパ球上の自己抗原特異的B細胞受容体によって認識される自己抗原を含み(P
ayneら(2016)Science,Vol.353(6295):179-184
参照)、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応性Bリンパ球を特異的に標的として殺傷するよ
うにT細胞に指示する。かかるCARは、キメラ自己抗体受容体(CAAR)と称される
ことがあり、本明細書に記載される1つ以上の共刺激ドメインのかかるCAARへの組み
込みが本開示に含まれる。
キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、目的の抗原に対する天然に存在するリガン
ド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含んでも
よい。
ド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含んでも
よい。
細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合後に活性化シグナルを細胞に伝
達する細胞質ドメインである。細胞内シグナル伝達ドメインは、当該分野で知られている
目的の任意の細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。かかる細胞質シグナル伝達ド
メインとしてはCD3ζが挙げられるが、これに限定されない。
達する細胞質ドメインである。細胞内シグナル伝達ドメインは、当該分野で知られている
目的の任意の細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。かかる細胞質シグナル伝達ド
メインとしてはCD3ζが挙げられるが、これに限定されない。
また、いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、細胞外ドメインの結合後、細胞増
殖、細胞生存、及び/又はサイトカイン分泌を促進する共刺激シグナルを伝達する、本明
細書に記載されるもの等の1つ以上の細胞内共刺激ドメインも含む。本明細書で使用され
る「共刺激ドメイン」は、活性化時に細胞内増殖及び/又は細胞生存シグナルを伝達する
ポリペプチドドメインを指す。共刺激ドメインの活性化は、2つの共刺激ドメインポリペ
プチドのホモ二量体化に続いて起こる場合がある。活性化は、例えば、共刺激ドメインを
含むコンストラクト(例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節コンストラクト)の活性
化後にも起こり得る。一般的には、共刺激ドメインは、膜貫通共刺激受容体、特に共刺激
受容体の細胞内部分に由来し得る。かかる細胞内共刺激ドメインは、当技術分野で知られ
ているもののいずれかであってもよく、限定されないが、CD27、CD28、CD8、
4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リン
パ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7
-H3、及びCD83、N1、N6と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組
み合わせを含み得る。
殖、細胞生存、及び/又はサイトカイン分泌を促進する共刺激シグナルを伝達する、本明
細書に記載されるもの等の1つ以上の細胞内共刺激ドメインも含む。本明細書で使用され
る「共刺激ドメイン」は、活性化時に細胞内増殖及び/又は細胞生存シグナルを伝達する
ポリペプチドドメインを指す。共刺激ドメインの活性化は、2つの共刺激ドメインポリペ
プチドのホモ二量体化に続いて起こる場合がある。活性化は、例えば、共刺激ドメインを
含むコンストラクト(例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節コンストラクト)の活性
化後にも起こり得る。一般的には、共刺激ドメインは、膜貫通共刺激受容体、特に共刺激
受容体の細胞内部分に由来し得る。かかる細胞内共刺激ドメインは、当技術分野で知られ
ているもののいずれかであってもよく、限定されないが、CD27、CD28、CD8、
4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リン
パ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7
-H3、及びCD83、N1、N6と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組
み合わせを含み得る。
本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、細胞増殖、in vitro及び/又は
in vivoでの細胞集団の拡大を促進し、細胞生存を促進し、サイトカインの分泌を
調節し(例えば、アップレギュレートし又はダウンレギュレートし)、及び/又は他の免
疫調節分子の産生及び/又は分泌を調節する、共刺激ドメインによって誘導される細胞内
シグナルを指す。いくつかの実施形態では、2つの共刺激ドメインポリペプチドのホモ二
量体化に続いて共刺激シグナルが誘導される。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル
は、共刺激ドメインを含むコンストラクト(例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節コ
ンストラクト)の活性化に続いて誘導される。
in vivoでの細胞集団の拡大を促進し、細胞生存を促進し、サイトカインの分泌を
調節し(例えば、アップレギュレートし又はダウンレギュレートし)、及び/又は他の免
疫調節分子の産生及び/又は分泌を調節する、共刺激ドメインによって誘導される細胞内
シグナルを指す。いくつかの実施形態では、2つの共刺激ドメインポリペプチドのホモ二
量体化に続いて共刺激シグナルが誘導される。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル
は、共刺激ドメインを含むコンストラクト(例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節コ
ンストラクト)の活性化に続いて誘導される。
キメラ抗原受容体は、ヒンジ又はスペーサー配列を介して細胞外リガンド結合ドメイン
に付着している膜貫通ドメインを含む、追加の構造要素を更に含んでもよい。膜貫通ドメ
インは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ポ
リペプチドは、T細胞受容体のサブユニット(すなわち、α、β、γ又はζ、CD3複合
体を構成するポリペプチド)、IL2受容体p55(鎖)、p75(β鎖)又はγ鎖、F
c受容体のサブユニット鎖(例えば、Fcγ受容体III)、又はCD8アルファ鎖等の
CDタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイ
シン及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。
に付着している膜貫通ドメインを含む、追加の構造要素を更に含んでもよい。膜貫通ドメ
インは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ポ
リペプチドは、T細胞受容体のサブユニット(すなわち、α、β、γ又はζ、CD3複合
体を構成するポリペプチド)、IL2受容体p55(鎖)、p75(β鎖)又はγ鎖、F
c受容体のサブユニット鎖(例えば、Fcγ受容体III)、又はCD8アルファ鎖等の
CDタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイ
シン及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。
ヒンジ領域とは、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能
するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大300個のアミノ酸、
好ましくは10個~100個のアミノ酸、最も好ましくは25個~50個のアミノ酸を含
み得る。ヒンジ領域は、CD8、CD4又はCD28の細胞外領域の全て若しくは一部、
又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよ
い。あるいは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又
は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒト
CD8アルファ鎖、FcyRllla受容体又はIgGlの一部を含む場合がある。
するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大300個のアミノ酸、
好ましくは10個~100個のアミノ酸、最も好ましくは25個~50個のアミノ酸を含
み得る。ヒンジ領域は、CD8、CD4又はCD28の細胞外領域の全て若しくは一部、
又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよ
い。あるいは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又
は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒト
CD8アルファ鎖、FcyRllla受容体又はIgGlの一部を含む場合がある。
本明細書で使用される「活性化」という用語は、検出可能なエフェクター機能を誘導す
るために十分に刺激された細胞(例えば、T細胞)の状態を指す。いくつかの実施形態で
は、活性化は、誘導されたサイトカイン産生及び/又は誘導された細胞増殖及び拡大に関
連している。
るために十分に刺激された細胞(例えば、T細胞)の状態を指す。いくつかの実施形態で
は、活性化は、誘導されたサイトカイン産生及び/又は誘導された細胞増殖及び拡大に関
連している。
本明細書で使用される「外因性T細胞受容体」又は「外因性TCR」は、その配列がT
CRを内因的に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトT細胞)
のゲノムに導入されるTCRを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性TCRの発現は、
特定のエピトープ又は抗原(例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒
子の表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原)に対する特異性を付与することができ
る。かかる外因性T細胞受容体は、アルファ鎖及びベータ鎖を含んでもよく、あるいは、
ガンマ鎖及びデルタ鎖を含んでもよい。本発明において有用な外因性TCRは、目的の任
意の抗原又はエピトープに対して特異性を有してもよい。
CRを内因的に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトT細胞)
のゲノムに導入されるTCRを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性TCRの発現は、
特定のエピトープ又は抗原(例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒
子の表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原)に対する特異性を付与することができ
る。かかる外因性T細胞受容体は、アルファ鎖及びベータ鎖を含んでもよく、あるいは、
ガンマ鎖及びデルタ鎖を含んでもよい。本発明において有用な外因性TCRは、目的の任
意の抗原又はエピトープに対して特異性を有してもよい。
本明細書で使用される場合、タンパク質に関して、「操作された」又は「組換え」とい
う用語は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物に対す
る遺伝子工学技術の適用の結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味する。
核酸に関して、「組換え」という用語は、遺伝子工学技術の適用の結果として変更された
核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては、PCR及びDNAクローニ
ング技術、トランスフェクション、形質転換、その他の遺伝子導入技術、相同組換え、部
位特異的突然変異誘発、及び遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定
義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主での
クローニング及び発現により産生されるタンパク質は、組換え体とは見なされない。
う用語は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物に対す
る遺伝子工学技術の適用の結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味する。
核酸に関して、「組換え」という用語は、遺伝子工学技術の適用の結果として変更された
核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては、PCR及びDNAクローニ
ング技術、トランスフェクション、形質転換、その他の遺伝子導入技術、相同組換え、部
位特異的突然変異誘発、及び遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定
義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主での
クローニング及び発現により産生されるタンパク質は、組換え体とは見なされない。
本明細書で使用される「野生型」という用語は、所与の表現型の原因となる最も一般的
な天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を指す。野生型の対立遺伝子
又はポリペプチドが生物に正常な表現型を付与できるのに対し、突然変異体又は変異体の
対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、表現型の変化を付与することができる
。
な天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を指す。野生型の対立遺伝子
又はポリペプチドが生物に正常な表現型を付与できるのに対し、突然変異体又は変異体の
対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、表現型の変化を付与することができる
。
組換えタンパク質に関して本明細書で使用される「修飾」という用語は、参照配列(例
えば、野生型配列又は天然配列)に対する組換え配列内のアミノ酸残基の挿入、欠失、又
は置換を意味する。
えば、野生型配列又は天然配列)に対する組換え配列内のアミノ酸残基の挿入、欠失、又
は置換を意味する。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、12塩基対を超える
認識配列で二本鎖DNAに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では
、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は22塩基対である。メガヌクレアーゼは、I-
CreIに由来するエンドヌクレアーゼであってもよく、例えばDNA結合特異性、DN
A切断活性、DNA結合親和性、又は二量化特性に関して天然のI-CreIと比較して
改変されたI-CreIの操作された変異体を指す場合がある。I-CreIのかかる改
変された変異体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている(例えば、国際公開第
2007/047859号明細書)。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ
二量体として二本鎖DNAに結合する。メガヌクレアーゼは、ペプチドリンカーを使用し
てDNA結合ドメインのペアが単一のポリペプチドにつながっている「単鎖メガヌクレア
ーゼ」であってもよい。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレ
アーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、細胞、特にヒトT細胞
で発現される場合、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合細胞生存率への有害な
影響又はメガヌクレアーゼ切断活性の著しい低下を観察することなく、細胞をトランスフ
ェクトして37℃で維持できるように実質的に非毒性である。
認識配列で二本鎖DNAに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では
、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は22塩基対である。メガヌクレアーゼは、I-
CreIに由来するエンドヌクレアーゼであってもよく、例えばDNA結合特異性、DN
A切断活性、DNA結合親和性、又は二量化特性に関して天然のI-CreIと比較して
改変されたI-CreIの操作された変異体を指す場合がある。I-CreIのかかる改
変された変異体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている(例えば、国際公開第
2007/047859号明細書)。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ
二量体として二本鎖DNAに結合する。メガヌクレアーゼは、ペプチドリンカーを使用し
てDNA結合ドメインのペアが単一のポリペプチドにつながっている「単鎖メガヌクレア
ーゼ」であってもよい。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレ
アーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、細胞、特にヒトT細胞
で発現される場合、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合細胞生存率への有害な
影響又はメガヌクレアーゼ切断活性の著しい低下を観察することなく、細胞をトランスフ
ェクトして37℃で維持できるように実質的に非毒性である。
本明細書で使用される場合、「単鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによっ
てつなげられたヌクレアーゼサブユニットのペアを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌ
クレアーゼは:N末端サブユニット・リンカー・C末端サブユニットの構成を有する。2
つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般的にアミノ酸配列が同一ではなく、非同一のD
NA配列を認識する。したがって、単鎖メガヌクレアーゼは通常、偽パリンドローム又は
非パリンドロームの認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体では
ないが、「単鎖ヘテロ二量体」又は「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と称される場
合がある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は
、二量体又は単鎖メガヌクレアーゼを指す場合がある。
てつなげられたヌクレアーゼサブユニットのペアを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌ
クレアーゼは:N末端サブユニット・リンカー・C末端サブユニットの構成を有する。2
つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般的にアミノ酸配列が同一ではなく、非同一のD
NA配列を認識する。したがって、単鎖メガヌクレアーゼは通常、偽パリンドローム又は
非パリンドロームの認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体では
ないが、「単鎖ヘテロ二量体」又は「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と称される場
合がある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は
、二量体又は単鎖メガヌクレアーゼを指す場合がある。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、2つのメガヌクレアーゼサブユニッ
トを単一のポリペプチドにつなげるために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカ
ーは、天然タンパク質に見られる配列を有してもよく、又は天然タンパク質には見られな
い人工配列であってもよい。リンカーは柔軟性であって二次構造が欠けていてもよく、又
は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有してもよい。リンカーとしては
、米国特許第8,445,251号明細書及び同第9,434,931号明細書に含まれ
るリンカーのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
トを単一のポリペプチドにつなげるために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカ
ーは、天然タンパク質に見られる配列を有してもよく、又は天然タンパク質には見られな
い人工配列であってもよい。リンカーは柔軟性であって二次構造が欠けていてもよく、又
は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有してもよい。リンカーとしては
、米国特許第8,445,251号明細書及び同第9,434,931号明細書に含まれ
るリンカーのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ZFN」という用語は
、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、マング
ビーンヌクレアーゼ(mung bean nuclease)、膵臓DNAse I、
ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母HOエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定さ
れないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに融
合したジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィ
ンガーヌクレアーゼの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、FokI、FoM、
及びStsIの制限酵素を含むが、これらに限定されない、II型制限エンドヌクレアー
ゼに由来するものが挙げられる。追加のII型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第2
007/014275号明細書に記載されており、その全体が参照することで本明細書の
一部をなす。ジンクフィンガードメインの構造は、亜鉛イオンの配位により安定化される
。1つ以上のジンクフィンガードメインを含むDNA結合タンパク質は、配列特異的にD
NAに結合する。ジンクフィンガードメインは、天然の配列であってもよく、又は合理的
又は実験的な手段で再設計して、2塩基対~10塩基対離れた9塩基対のハーフサイト(
half-site)のペアを有する、長さが約18塩基対の所定のDNA配列に結合す
るタンパク質を産生することもできる。例えば、各々がその全体を参照することで本明細
書の一部をなす、米国特許第5,789,538号、同第5,925,523号、同第6
,007,988号、同第6,013,453号、同第6,200,759号の明細書、
並びに国際公開第95/19431号、同第96/06166号、同第98/53057
号、同第98/54311号、同第00/27878号、同第01/60970号、同第
01/88197号、及び同第02/099084号の明細書を参照されたい。この操作
されたタンパク質ドメインをFokIヌクレアーゼ等のヌクレアーゼドメインに融合する
ことにより、ゲノムレベルの特異性でDNA切断を標的にすることが可能である。標的部
位、ジンクフィンガータンパク質、並びにジンクフィンガーヌクレアーゼの設計及び構築
のための方法の選択は、当業者に知られており、米国特許出願公開第200302324
10号、同第20050208489号、同第2005064474号、同第20050
026157号、同第20060188987号及び国際公開第07/014275号の
明細書に詳細に記載され、各々がそれらの全体が参照することで本明細書の一部をなす。
ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断により、平滑末端又は可変長の5´オーバーハ
ンド(overhand)(多くの場合、4塩基対)が生じる可能性がある。
、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、マング
ビーンヌクレアーゼ(mung bean nuclease)、膵臓DNAse I、
ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母HOエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定さ
れないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに融
合したジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィ
ンガーヌクレアーゼの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、FokI、FoM、
及びStsIの制限酵素を含むが、これらに限定されない、II型制限エンドヌクレアー
ゼに由来するものが挙げられる。追加のII型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第2
007/014275号明細書に記載されており、その全体が参照することで本明細書の
一部をなす。ジンクフィンガードメインの構造は、亜鉛イオンの配位により安定化される
。1つ以上のジンクフィンガードメインを含むDNA結合タンパク質は、配列特異的にD
NAに結合する。ジンクフィンガードメインは、天然の配列であってもよく、又は合理的
又は実験的な手段で再設計して、2塩基対~10塩基対離れた9塩基対のハーフサイト(
half-site)のペアを有する、長さが約18塩基対の所定のDNA配列に結合す
るタンパク質を産生することもできる。例えば、各々がその全体を参照することで本明細
書の一部をなす、米国特許第5,789,538号、同第5,925,523号、同第6
,007,988号、同第6,013,453号、同第6,200,759号の明細書、
並びに国際公開第95/19431号、同第96/06166号、同第98/53057
号、同第98/54311号、同第00/27878号、同第01/60970号、同第
01/88197号、及び同第02/099084号の明細書を参照されたい。この操作
されたタンパク質ドメインをFokIヌクレアーゼ等のヌクレアーゼドメインに融合する
ことにより、ゲノムレベルの特異性でDNA切断を標的にすることが可能である。標的部
位、ジンクフィンガータンパク質、並びにジンクフィンガーヌクレアーゼの設計及び構築
のための方法の選択は、当業者に知られており、米国特許出願公開第200302324
10号、同第20050208489号、同第2005064474号、同第20050
026157号、同第20060188987号及び国際公開第07/014275号の
明細書に詳細に記載され、各々がそれらの全体が参照することで本明細書の一部をなす。
ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断により、平滑末端又は可変長の5´オーバーハ
ンド(overhand)(多くの場合、4塩基対)が生じる可能性がある。
本明細書で使用される「TALEN」という用語は、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミ
ングエンドヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓DNAs
e I、ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母HOエンドヌクレアーゼを含むがこれら
に限定されないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメイン
又はその活性部分に融合した複数のTALドメインリピートを含むDNA結合ドメインを
含むエンドヌクレアーゼを指す。例えば、参照することでその全体が本明細書の一部をな
す、Christianら(2010)Genetics186:757-761を参照
されたい。TALENの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、FokI、FoM
、StsI、HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI、
及びAlwIを含むがこれらに限定されないII型制限エンドヌクレアーゼに由来するも
のが挙げられる。追加のII型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第2007/014
275号明細書に記載されている。いくつかの態様では、TALENのヌクレアーゼドメ
インはFokIヌクレアーゼドメイン又はその活性部分である。TALドメインリピート
は、キサントモナス(Xanthomonas)属の植物病原体による感染プロセスで使
用されるTALE(転写活性化因子様エフェクター)ファミリーのタンパク質に由来し得
る。TALドメインリピートは、多様な12番目と13番目のアミノ酸を持つ33個~3
4個のアミノ酸配列である。反復可変ジペプチド(RVD:repeat variab
le dipeptide)と称されるこれらの2つの位置は非常に可変的であり、特定
のヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。DNA標的配列の各塩基対は、単一のTAL
リピートによって、RVDに起因する特異性と接触する。いくつかの実施形態では、TA
LENは16個~22個のTALドメインリピートを含む。TALENによるDNA切断
には、非特異的な中央領域(すなわち、「スペーサー」)に隣接する2つのDNA認識領
域が必要である。TALENに関する「スペーサー」という用語は、TALENを構成す
る各モノマーによって認識及び結合される2つの核酸配列を分離する核酸配列を指す。T
ALドメインリピートは、天然に存在するTALEタンパク質の天然配列であってもよく
、又は合理的若しくは実験的手段で再設計して、所定のDNA配列に結合するタンパク質
を産生することもできる(例えば、各々がその全体を参照することで本明細書の一部をな
す、Bochら(2009)Science 326(5959):1509-1512
、及びMoscou and Bogdanove(2009)Science 326
(5959):1501を参照されたい)。特定の配列及びRVDの例、並びに対応する
標的ヌクレオチドを認識するためにTALENを操作する方法については、米国特許出願
公開第20110145940号及び国際公開第2010/079430号の明細書も参
照されたい。いくつかの実施形態では、各ヌクレアーゼ(例えば、FokI)モノマーは
、異なるDNA配列を認識するTALエフェクター配列に融合されてもよく、2つの認識
部位が近接している場合にのみ、不活性モノマーが一緒になって機能性酵素を作り出す。
ングエンドヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓DNAs
e I、ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母HOエンドヌクレアーゼを含むがこれら
に限定されないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメイン
又はその活性部分に融合した複数のTALドメインリピートを含むDNA結合ドメインを
含むエンドヌクレアーゼを指す。例えば、参照することでその全体が本明細書の一部をな
す、Christianら(2010)Genetics186:757-761を参照
されたい。TALENの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、FokI、FoM
、StsI、HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI、
及びAlwIを含むがこれらに限定されないII型制限エンドヌクレアーゼに由来するも
のが挙げられる。追加のII型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第2007/014
275号明細書に記載されている。いくつかの態様では、TALENのヌクレアーゼドメ
インはFokIヌクレアーゼドメイン又はその活性部分である。TALドメインリピート
は、キサントモナス(Xanthomonas)属の植物病原体による感染プロセスで使
用されるTALE(転写活性化因子様エフェクター)ファミリーのタンパク質に由来し得
る。TALドメインリピートは、多様な12番目と13番目のアミノ酸を持つ33個~3
4個のアミノ酸配列である。反復可変ジペプチド(RVD:repeat variab
le dipeptide)と称されるこれらの2つの位置は非常に可変的であり、特定
のヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。DNA標的配列の各塩基対は、単一のTAL
リピートによって、RVDに起因する特異性と接触する。いくつかの実施形態では、TA
LENは16個~22個のTALドメインリピートを含む。TALENによるDNA切断
には、非特異的な中央領域(すなわち、「スペーサー」)に隣接する2つのDNA認識領
域が必要である。TALENに関する「スペーサー」という用語は、TALENを構成す
る各モノマーによって認識及び結合される2つの核酸配列を分離する核酸配列を指す。T
ALドメインリピートは、天然に存在するTALEタンパク質の天然配列であってもよく
、又は合理的若しくは実験的手段で再設計して、所定のDNA配列に結合するタンパク質
を産生することもできる(例えば、各々がその全体を参照することで本明細書の一部をな
す、Bochら(2009)Science 326(5959):1509-1512
、及びMoscou and Bogdanove(2009)Science 326
(5959):1501を参照されたい)。特定の配列及びRVDの例、並びに対応する
標的ヌクレオチドを認識するためにTALENを操作する方法については、米国特許出願
公開第20110145940号及び国際公開第2010/079430号の明細書も参
照されたい。いくつかの実施形態では、各ヌクレアーゼ(例えば、FokI)モノマーは
、異なるDNA配列を認識するTALエフェクター配列に融合されてもよく、2つの認識
部位が近接している場合にのみ、不活性モノマーが一緒になって機能性酵素を作り出す。
本明細書で使用される「コンパクトTALEN」という用語は、I-TevIホーミン
グエンドヌクレアーゼ、又はMmeI、EndA、End1、I-BasI、I-Tev
II、I-TevIII、I-TwoI、MspI、MvaI、NucA、NucM等が
含まれるが、これらに限定されない米国特許出願第20130117869号の表2に収
載されているエンドヌクレアーゼのいずれか(その全体が参照することで本明細書の一部
をなす)の任意の部分に任意の方向で融合した1つ以上のTALドメインリピートを有す
る、DNA結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。コンパクトTALENはDN
Aプロセッシング活性に二量体化を必要とせず、介在するDNAスペーサーを持つ二重標
的部位の必要性を軽減する。いくつかの実施形態では、コンパクトTALENは16個~
22個のTALドメインリピートを含む。
グエンドヌクレアーゼ、又はMmeI、EndA、End1、I-BasI、I-Tev
II、I-TevIII、I-TwoI、MspI、MvaI、NucA、NucM等が
含まれるが、これらに限定されない米国特許出願第20130117869号の表2に収
載されているエンドヌクレアーゼのいずれか(その全体が参照することで本明細書の一部
をなす)の任意の部分に任意の方向で融合した1つ以上のTALドメインリピートを有す
る、DNA結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。コンパクトTALENはDN
Aプロセッシング活性に二量体化を必要とせず、介在するDNAスペーサーを持つ二重標
的部位の必要性を軽減する。いくつかの実施形態では、コンパクトTALENは16個~
22個のTALドメインリピートを含む。
本明細書で使用する「CRISPR」という用語は、Cas9等のカスパーゼと、ゲノ
ムDNAの認識部位にハイブリダイズすることによりカスパーゼのDNA切断を指示する
ガイドRNAとを含むカスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。CRISPRのカ
スパーゼ構成要素は、RNA誘導DNAエンドヌクレアーゼである。特定の実施形態では
、カスパーゼはクラスII Cas酵素である。これらの実施形態のいくつかでは、カス
パーゼは、Cas9等のクラスII、II型酵素である。他の実施形態では、カスパーゼ
は、Cpf1等のクラスII、V型酵素である。ガイドRNAは、定方向反復(dire
ct repeat)と、標的認識部位に相補的なガイド配列(内因性CRISPR系に
関してスペーサーと称されることが多い)とを含む。特定の実施形態では、CRISPR
は、ガイドRNA上に存在する定方向反復塩基配列(direct repeat se
quence)(時にtracrメイト配列と称される)に(完全又は部分的に)相補的
であるtracrRNA(トランス活性化CRISPR RNA)を更に含む。特定の実
施形態では、カスパーゼは、該酵素が標的ポリヌクレオチドの一本鎖を切断し、ニッカー
ゼとして機能し、標的DNAの一本鎖のみを切断する能力を欠くように、対応する野生型
酵素に関して変異させることができる。ニッカーゼとして機能するカスパーゼ酵素の非限
定的な例としては、RuvC I触媒ドメイン内のD10A変異、又はH840A、N8
54A、若しくはN863Aの変異を有するCas9酵素が挙げられる。
ムDNAの認識部位にハイブリダイズすることによりカスパーゼのDNA切断を指示する
ガイドRNAとを含むカスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。CRISPRのカ
スパーゼ構成要素は、RNA誘導DNAエンドヌクレアーゼである。特定の実施形態では
、カスパーゼはクラスII Cas酵素である。これらの実施形態のいくつかでは、カス
パーゼは、Cas9等のクラスII、II型酵素である。他の実施形態では、カスパーゼ
は、Cpf1等のクラスII、V型酵素である。ガイドRNAは、定方向反復(dire
ct repeat)と、標的認識部位に相補的なガイド配列(内因性CRISPR系に
関してスペーサーと称されることが多い)とを含む。特定の実施形態では、CRISPR
は、ガイドRNA上に存在する定方向反復塩基配列(direct repeat se
quence)(時にtracrメイト配列と称される)に(完全又は部分的に)相補的
であるtracrRNA(トランス活性化CRISPR RNA)を更に含む。特定の実
施形態では、カスパーゼは、該酵素が標的ポリヌクレオチドの一本鎖を切断し、ニッカー
ゼとして機能し、標的DNAの一本鎖のみを切断する能力を欠くように、対応する野生型
酵素に関して変異させることができる。ニッカーゼとして機能するカスパーゼ酵素の非限
定的な例としては、RuvC I触媒ドメイン内のD10A変異、又はH840A、N8
54A、若しくはN863Aの変異を有するCas9酵素が挙げられる。
本明細書で使用される「メガTAL」という用語は、操作された配列特異的ホーミング
エンドヌクレアーゼを有する転写活性化因子様エフェクター(TALE)DNA結合ドメ
インを含む単鎖ヌクレアーゼを指す。
エンドヌクレアーゼを有する転写活性化因子様エフェクター(TALE)DNA結合ドメ
インを含む単鎖ヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「認識配列」という用語は、エンドヌクレアーゼによって
結合及び切断されるDNA配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、4塩基対
で隔てられた逆向きの9塩基対の「ハーフサイト」のペアを含む。単鎖メガヌクレアーゼ
の場合、タンパク質のN末端ドメインは第1のハーフサイトに接触し、タンパク質のC末
端ドメインは第2のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切断により、4塩
基対の3´「オーバーハング」がもたらされる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は
、二本鎖DNA配列のエンドヌクレアーゼ切断によってもたらすことができる短い一本鎖
DNAセグメントである。I-CreIに由来するメガヌクレアーゼ及び単鎖メガヌクレ
アーゼの場合、オーバーハングは22塩基対認識配列の10塩基~13塩基を含む。コン
パクトTALENの場合、認識配列は、I-TevIドメインによって認識される第1の
CNNNGN配列と、それに続く長さ4塩基対~16塩基対の非特異的スペーサー、続い
てTALエフェクタードメインによって認識される長さ16bp~22bpの第2の配列
を含む(この配列は典型的には5´T塩基を有する)。コンパクトTALENによる切断
は2塩基対3´オーバーハングをもたらす。CRISPRの場合、認識配列は、ガイドR
NAが結合して直接切断するための配列であり、典型的には16塩基対~24塩基対であ
る。ガイド配列と認識配列との間の完全な相補性は、切断を行うために必ずしも必要では
ない。CRISPRによる切断は、カスパーゼに応じて、平滑末端(クラスII、II型
カスパーゼ等)又はオーバーハング末端(クラスII、V型カスパーゼ等)をもたらすこ
とができる。CpfIカスパーゼが利用されるそれらの実施形態では、これを含むCRI
SPR複合体による切断は5´オーバーハングを生じ、特定の実施形態では、5ヌクレオ
チドの5´オーバーハングを生じる。各カスパーゼ酵素はまた、ガイドRNAに相補的な
認識配列の近くにPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列の認識も必要とする。正
確な配列、PAMに対する長さの要件、及び標的配列からの距離は、カスパーゼ酵素によ
って異なるが、PAMは通常、標的/認識配列に近接する2塩基対~5塩基対の配列であ
る。特定のカスパーゼ酵素のPAM配列は当技術分野で知られており(例えば、各々が全
体を参照することで本明細書の一部をなす、米国特許第8,697,359号及び米国特
許出願公開第20160208243号の明細書を参照されたい)、新規又は操作された
カスパーゼ酵素のPAM配列は、PAM枯渇アッセイ(例えば、その全体が本明細書の一
部をなす、Karvelisら(2017)Methods121-122:3-8を参
照されたい)等、当技術分野で知られている方法を使用して識別され得る。ジンクフィン
ガーの場合、DNA結合ドメインは典型的には、2塩基対~10塩基対離れた9塩基対の
「ハーフサイト」のペアを含む18bp認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は可
変長(多くの場合、4塩基対)の平滑末端又は5´オーバーハングを作る。
結合及び切断されるDNA配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、4塩基対
で隔てられた逆向きの9塩基対の「ハーフサイト」のペアを含む。単鎖メガヌクレアーゼ
の場合、タンパク質のN末端ドメインは第1のハーフサイトに接触し、タンパク質のC末
端ドメインは第2のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切断により、4塩
基対の3´「オーバーハング」がもたらされる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は
、二本鎖DNA配列のエンドヌクレアーゼ切断によってもたらすことができる短い一本鎖
DNAセグメントである。I-CreIに由来するメガヌクレアーゼ及び単鎖メガヌクレ
アーゼの場合、オーバーハングは22塩基対認識配列の10塩基~13塩基を含む。コン
パクトTALENの場合、認識配列は、I-TevIドメインによって認識される第1の
CNNNGN配列と、それに続く長さ4塩基対~16塩基対の非特異的スペーサー、続い
てTALエフェクタードメインによって認識される長さ16bp~22bpの第2の配列
を含む(この配列は典型的には5´T塩基を有する)。コンパクトTALENによる切断
は2塩基対3´オーバーハングをもたらす。CRISPRの場合、認識配列は、ガイドR
NAが結合して直接切断するための配列であり、典型的には16塩基対~24塩基対であ
る。ガイド配列と認識配列との間の完全な相補性は、切断を行うために必ずしも必要では
ない。CRISPRによる切断は、カスパーゼに応じて、平滑末端(クラスII、II型
カスパーゼ等)又はオーバーハング末端(クラスII、V型カスパーゼ等)をもたらすこ
とができる。CpfIカスパーゼが利用されるそれらの実施形態では、これを含むCRI
SPR複合体による切断は5´オーバーハングを生じ、特定の実施形態では、5ヌクレオ
チドの5´オーバーハングを生じる。各カスパーゼ酵素はまた、ガイドRNAに相補的な
認識配列の近くにPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列の認識も必要とする。正
確な配列、PAMに対する長さの要件、及び標的配列からの距離は、カスパーゼ酵素によ
って異なるが、PAMは通常、標的/認識配列に近接する2塩基対~5塩基対の配列であ
る。特定のカスパーゼ酵素のPAM配列は当技術分野で知られており(例えば、各々が全
体を参照することで本明細書の一部をなす、米国特許第8,697,359号及び米国特
許出願公開第20160208243号の明細書を参照されたい)、新規又は操作された
カスパーゼ酵素のPAM配列は、PAM枯渇アッセイ(例えば、その全体が本明細書の一
部をなす、Karvelisら(2017)Methods121-122:3-8を参
照されたい)等、当技術分野で知られている方法を使用して識別され得る。ジンクフィン
ガーの場合、DNA結合ドメインは典型的には、2塩基対~10塩基対離れた9塩基対の
「ハーフサイト」のペアを含む18bp認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は可
変長(多くの場合、4塩基対)の平滑末端又は5´オーバーハングを作る。
本明細書で使用される「標的部位」又は「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認
識配列を含む細胞の染色体DNAの領域を指す。
識配列を含む細胞の染色体DNAの領域を指す。
本明細書で使用される「相同組換え」又は「HR」という用語は、修復テンプレートと
して相同DNA配列を使用して二本鎖DNA切断が修復される天然の細胞プロセスを指す
(例えば、Cahillら(2006),Front.Biosci.11:1958-
1976を参照されたい)。相同DNA配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は
外因性核酸であってもよい。
して相同DNA配列を使用して二本鎖DNA切断が修復される天然の細胞プロセスを指す
(例えば、Cahillら(2006),Front.Biosci.11:1958-
1976を参照されたい)。相同DNA配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は
外因性核酸であってもよい。
本明細書で使用される「非相同末端結合」又は「NHEJ」という用語は、2本の非相
同DNAセグメントを直接つなぐことによって二本鎖DNA切断が修復される天然の細胞
プロセスを指す(例えば、Cahillら(2006),Front.Biosci.1
1:1958-1976を参照されたい)。
同DNAセグメントを直接つなぐことによって二本鎖DNA切断が修復される天然の細胞
プロセスを指す(例えば、Cahillら(2006),Front.Biosci.1
1:1958-1976を参照されたい)。
本明細書で使用される「低下した、減少した、軽減された」という用語は、疾患の症状
若しくは重症度の任意の低下、又は癌細胞の増殖若しくは数の任意の減少を指す。いずれ
の場合も、かかる低下、減少、軽減は最大5%、10%、20%、30%、40%、50
%、60%、70%、80%、90%、95%、又は最大100%であり得る。したがっ
て、「低下した、減少した、軽減された」という用語は、病状の部分的な軽減と完全な低
下、減少、軽減の両方を包含する。
若しくは重症度の任意の低下、又は癌細胞の増殖若しくは数の任意の減少を指す。いずれ
の場合も、かかる低下、減少、軽減は最大5%、10%、20%、30%、40%、50
%、60%、70%、80%、90%、95%、又は最大100%であり得る。したがっ
て、「低下した、減少した、軽減された」という用語は、病状の部分的な軽減と完全な低
下、減少、軽減の両方を包含する。
本明細書で使用される「低下した」という用語はまた、適切な対照細胞と比較した場合
のポリペプチドの細胞表面発現の低下を指す場合もある。本文脈において、低下は、発現
が100%低下されるポリペプチド発現のノックアウトとは異なる。むしろ、本発明では
、低下とは、発現が減少するが完全には排除されていないことを示す。低下等は、例えば
、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又はCD52を低下させるように遺
伝子改変されていない対照細胞とそれぞれ比較した場合の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン、MHCクラスI分子、又はCD52発現の低下であってもよい。発現の低下は、約
10%~約99%又はその中の任意の数又は範囲であってもよい。例えば、対照細胞と比
較した場合、低下は約10%~95%、約50%~約95%、約75%~約95%、又は
約90%~約95%であってもよい。低下は、対照細胞と比較した場合、約10%、20
%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85
%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、又は99%であってもよい。
のポリペプチドの細胞表面発現の低下を指す場合もある。本文脈において、低下は、発現
が100%低下されるポリペプチド発現のノックアウトとは異なる。むしろ、本発明では
、低下とは、発現が減少するが完全には排除されていないことを示す。低下等は、例えば
、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又はCD52を低下させるように遺
伝子改変されていない対照細胞とそれぞれ比較した場合の細胞表面ベータ2ミクログロブ
リン、MHCクラスI分子、又はCD52発現の低下であってもよい。発現の低下は、約
10%~約99%又はその中の任意の数又は範囲であってもよい。例えば、対照細胞と比
較した場合、低下は約10%~95%、約50%~約95%、約75%~約95%、又は
約90%~約95%であってもよい。低下は、対照細胞と比較した場合、約10%、20
%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85
%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、又は99%であってもよい。
本明細書で使用される「MHCクラスI分子」という用語は、非自己タンパク質のペプ
チド断片を提示する細胞表面に見られる主要組織適合性複合体(MHC)を指す。MHC
クラスI分子は2つのポリペプチド鎖からなる。アルファ鎖は、アルファ-1(α1)ド
メイン、アルファ-2(α2)ドメイン、及びアルファ-3(α3)ドメインと称される
3つのポリペプチドからなる。α鎖は、α3ドメインを介して、ベータ2ミクログロブリ
ン(B2M)からなるβ鎖に非共有結合される。アルファ鎖は多型であり、HLA遺伝子
(すなわち、HLA-A、HLA-B、及びHLA-C)によってコードされているが、
ベータ2ミクログロブリンは多型ではなく、B2M遺伝子によってコードされている。
チド断片を提示する細胞表面に見られる主要組織適合性複合体(MHC)を指す。MHC
クラスI分子は2つのポリペプチド鎖からなる。アルファ鎖は、アルファ-1(α1)ド
メイン、アルファ-2(α2)ドメイン、及びアルファ-3(α3)ドメインと称される
3つのポリペプチドからなる。α鎖は、α3ドメインを介して、ベータ2ミクログロブリ
ン(B2M)からなるβ鎖に非共有結合される。アルファ鎖は多型であり、HLA遺伝子
(すなわち、HLA-A、HLA-B、及びHLA-C)によってコードされているが、
ベータ2ミクログロブリンは多型ではなく、B2M遺伝子によってコードされている。
本明細書で使用される「ベータ2ミクログロブリン」という用語は、MHCクラスI分
子のベータ鎖構成要素を指す。ヒトベータ2ミクログロブリンは、B2M遺伝子(例:N
CBI Gene ID 567)によってコードされる。ベータ2ミクログロブリンの
発現は、細胞表面上のMHCクラスI分子の集合と機能に必要である。
子のベータ鎖構成要素を指す。ヒトベータ2ミクログロブリンは、B2M遺伝子(例:N
CBI Gene ID 567)によってコードされる。ベータ2ミクログロブリンの
発現は、細胞表面上のMHCクラスI分子の集合と機能に必要である。
本明細書で使用される「CD52」という用語は、分化抗原群52とも称されるヒトC
D52遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID1043)によってコードされるポリペプチ
ドを指す。
D52遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID1043)によってコードされるポリペプチ
ドを指す。
本明細書で使用される「抗腫瘍活性」又は「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減
少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の延長、又は癌性状態に関連する様
々な生理学的症状の改善によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、
第1に腫瘍の発生の予防における本開示の遺伝子改変細胞の能力によって現れ得る。
少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の延長、又は癌性状態に関連する様
々な生理学的症状の改善によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、
第1に腫瘍の発生の予防における本開示の遺伝子改変細胞の能力によって現れ得る。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益又は望ましい生物学的及び/又は臨
床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、治療用(例えば、遺伝子改変細
胞、CAR T細胞等)の製剤又は組成物、疾患及びその重症度、並びに治療される被験
体の年齢、体重、身体状態及び反応性に応じて変化する。特定の実施形態では、有効量の
本明細書に開示される共刺激ドメインを含む細胞又は本明細書に開示される医薬組成物は
、少なくとも1つの症状又は疾患の進行を軽減する。
床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、治療用(例えば、遺伝子改変細
胞、CAR T細胞等)の製剤又は組成物、疾患及びその重症度、並びに治療される被験
体の年齢、体重、身体状態及び反応性に応じて変化する。特定の実施形態では、有効量の
本明細書に開示される共刺激ドメインを含む細胞又は本明細書に開示される医薬組成物は
、少なくとも1つの症状又は疾患の進行を軽減する。
本明細書で使用する「治療する」又は「治療」という用語は、被験体が経験する疾患又
は障害の少なくとも1つの兆候又は症状の頻度又は重症度を低下させることを意味する。
は障害の少なくとも1つの兆候又は症状の頻度又は重症度を低下させることを意味する。
本明細書で使用される「癌」という用語は、悪性の増殖又は腫瘍を引き起こす異常で制
御されない細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患(浸潤性にしろ転移性にしろ)を包含
すると理解されるべきである。
御されない細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患(浸潤性にしろ転移性にしろ)を包含
すると理解されるべきである。
本明細書で使用される「癌腫」という用語は、上皮細胞で構成される悪性の増殖を指す
。
。
本明細書で使用される「白血病」という用語は、造血器官/系の悪性腫瘍を指し、一般
的には、血液及び骨髄における白血球及びそれらの前駆体の異常な増殖及び発達を特徴と
する。
的には、血液及び骨髄における白血球及びそれらの前駆体の異常な増殖及び発達を特徴と
する。
本明細書で使用される「肉腫」という用語は、胚性結合組織のような物質で構成され、
一般に線維性、不均一又は均一な物質に埋め込まれた密に詰まった細胞で構成される腫瘍
を指す。
一般に線維性、不均一又は均一な物質に埋め込まれた密に詰まった細胞で構成される腫瘍
を指す。
本明細書で使用される「黒色腫」という用語は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系か
ら生じる腫瘍を指す。
ら生じる腫瘍を指す。
本明細書で使用される「リンパ腫」という用語は、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍
のグループを指す。
のグループを指す。
本明細書で使用される「芽細胞腫」という用語は、前駆細胞又は芽細胞(未成熟又は胚
組織)の悪性腫瘍によって引き起こされる癌のタイプを指す。
組織)の悪性腫瘍によって引き起こされる癌のタイプを指す。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質
導入された」又は「ヌクレオフェクトされた」とは、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導
入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形
質導入された」細胞は、外因性核酸で形質移入、形質転換又は形質導入された細胞である
。細胞には、初代被験体細胞とその子孫が含まれる。
導入された」又は「ヌクレオフェクトされた」とは、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導
入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形
質導入された」細胞は、外因性核酸で形質移入、形質転換又は形質導入された細胞である
。細胞には、初代被験体細胞とその子孫が含まれる。
本明細書で使用する「ヒトT細胞」又は「T細胞」は、ヒトドナーから単離されたT細
胞を指す。ヒトT細胞及びそれに由来する細胞としては、培養で継代されていない単離T
細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代及び維持されたT細胞、並びに不死化されて無
期限に細胞培養条件下で維持され得るT細胞が挙げられる。
胞を指す。ヒトT細胞及びそれに由来する細胞としては、培養で継代されていない単離T
細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代及び維持されたT細胞、並びに不死化されて無
期限に細胞培養条件下で維持され得るT細胞が挙げられる。
本明細書で使用される「ヒトナチュラルキラー細胞」又は「ヒトNK細胞」又は「ナチ
ュラルキラー細胞」又は「NK細胞」とは、自然免疫系にとって重要な細胞傷害性リンパ
球のタイプを指す。NK細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害
性T細胞の役割に類似している。NK細胞は、ウイルスに感染した細胞に迅速に反応し、
腫瘍形成に反応し、感染後約3日で作用する。
ュラルキラー細胞」又は「NK細胞」とは、自然免疫系にとって重要な細胞傷害性リンパ
球のタイプを指す。NK細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害
性T細胞の役割に類似している。NK細胞は、ウイルスに感染した細胞に迅速に反応し、
腫瘍形成に反応し、感染後約3日で作用する。
本明細書で使用される「対照」又は「対照細胞」とは、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は
表現型の変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、以下
:(a)野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝的変化の出発物質と同
じ遺伝子型の細胞;(b)遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌルコンスト
ラクトで形質転換されている細胞(すなわち、目的の特性に影響を与えないコンストラク
トを有する);又は、(c)遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変更された遺伝子
型又は表現型の発現を誘発する条件、刺激、又は更なる遺伝子改変に曝露されていない細
胞、を含んでもよい。特定の実施形態では、対照細胞は、遺伝子改変細胞とその他の点で
は同一であるが、特定のポリペプチド(例えば、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラ
スI分子、CD52)の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
表現型の変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、以下
:(a)野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝的変化の出発物質と同
じ遺伝子型の細胞;(b)遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌルコンスト
ラクトで形質転換されている細胞(すなわち、目的の特性に影響を与えないコンストラク
トを有する);又は、(c)遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変更された遺伝子
型又は表現型の発現を誘発する条件、刺激、又は更なる遺伝子改変に曝露されていない細
胞、を含んでもよい。特定の実施形態では、対照細胞は、遺伝子改変細胞とその他の点で
は同一であるが、特定のポリペプチド(例えば、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラ
スI分子、CD52)の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、用語「パーセン
ト同一性」、「配列同一性」、「パーセンテージ類似性」、「配列類似性」等は、整列し
たアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大化し、同一又は類似の残基又はヌクレ
オチドの数、残基又はヌクレオチドの総数、並びに配列アラインメントのギャップの存在
及び長さの関数である、配列のアラインメントに基づく2つの配列の類似度の尺度を指す
。標準パラメーターを使用して配列類似性を決定するため、様々なアルゴリズム及びコン
ピュータープログラムを使用することができる。本明細書で使用される場合、配列類似性
は、アミノ酸配列用のBLASTpプログラム及び核酸配列用のBLASTnプログラム
を使用して測定され、いずれもNational Center for Biotec
hnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov
)を通じて入手可能であって、例えば、Altschulら(1990),J.Mol.
Biol.215:403-410;Gish and States(1993),N
ature Genet.3:266-272;Maddenら(1996),Meth
.Enzymol.266:131-141;Altschulら(1997),Nuc
leic Acids Res.25:33 89-3402);Zhangら(200
0),J.Comput.Biol.7(1-2):203-14に記載されている。本
明細書で使用される場合、2つのアミノ酸配列のパーセント類似性は、BLASTpアル
ゴリズムの以下のパラメーター:ワードサイズ=3;ギャップオープニングペナルティ=
-11;ギャップ拡張ペナルティ=-1;及びスコアリングマトリクス=BLOSUM6
2に基づくスコアである。本明細書で使用される場合、2つの核酸配列のパーセント類似
性は、BLASTnアルゴリズムの以下のパラメーター:ワードサイズ=11;ギャップ
オープニングペナルティ=-5;ギャップ拡張ペナルティ=-2;マッチリワード=1;
ミスマッチペナルティ=-3に基づくスコアである。
ト同一性」、「配列同一性」、「パーセンテージ類似性」、「配列類似性」等は、整列し
たアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大化し、同一又は類似の残基又はヌクレ
オチドの数、残基又はヌクレオチドの総数、並びに配列アラインメントのギャップの存在
及び長さの関数である、配列のアラインメントに基づく2つの配列の類似度の尺度を指す
。標準パラメーターを使用して配列類似性を決定するため、様々なアルゴリズム及びコン
ピュータープログラムを使用することができる。本明細書で使用される場合、配列類似性
は、アミノ酸配列用のBLASTpプログラム及び核酸配列用のBLASTnプログラム
を使用して測定され、いずれもNational Center for Biotec
hnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov
)を通じて入手可能であって、例えば、Altschulら(1990),J.Mol.
Biol.215:403-410;Gish and States(1993),N
ature Genet.3:266-272;Maddenら(1996),Meth
.Enzymol.266:131-141;Altschulら(1997),Nuc
leic Acids Res.25:33 89-3402);Zhangら(200
0),J.Comput.Biol.7(1-2):203-14に記載されている。本
明細書で使用される場合、2つのアミノ酸配列のパーセント類似性は、BLASTpアル
ゴリズムの以下のパラメーター:ワードサイズ=3;ギャップオープニングペナルティ=
-11;ギャップ拡張ペナルティ=-1;及びスコアリングマトリクス=BLOSUM6
2に基づくスコアである。本明細書で使用される場合、2つの核酸配列のパーセント類似
性は、BLASTnアルゴリズムの以下のパラメーター:ワードサイズ=11;ギャップ
オープニングペナルティ=-5;ギャップ拡張ペナルティ=-2;マッチリワード=1;
ミスマッチペナルティ=-3に基づくスコアである。
2つのタンパク質又はアミノ酸配列の修飾に関して本明細書で使用される場合、「に対
応する」という用語は、第1のタンパク質の特定の修飾が第2のタンパク質の修飾と同じ
アミノ酸残基の置換であることを示すために使用され、2つのタンパク質が標準的な配列
アラインメントに供される場合(例えば、BLASTpプログラムを使用する場合)、第
1のタンパク質の修飾のアミノ酸位置は、第2のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応
する又はそれと整列する。したがって、第1のタンパク質の残基「X」のアミノ酸「A」
への修飾は、配列アラインメントにおいて残基Xと残基Yが互いに一致する場合、XとY
が異なる数である可能性があるという事実にもかかわらず、第2のタンパク質の残基「Y
」のアミノ酸「A」への修飾に対応する。
応する」という用語は、第1のタンパク質の特定の修飾が第2のタンパク質の修飾と同じ
アミノ酸残基の置換であることを示すために使用され、2つのタンパク質が標準的な配列
アラインメントに供される場合(例えば、BLASTpプログラムを使用する場合)、第
1のタンパク質の修飾のアミノ酸位置は、第2のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応
する又はそれと整列する。したがって、第1のタンパク質の残基「X」のアミノ酸「A」
への修飾は、配列アラインメントにおいて残基Xと残基Yが互いに一致する場合、XとY
が異なる数である可能性があるという事実にもかかわらず、第2のタンパク質の残基「Y
」のアミノ酸「A」への修飾に対応する。
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等
しい変数で本開示が実施され得ると伝えることを意図している。したがって、本質的に不
連続な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しい場
合がある。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範
囲内の任意の実数値に等しい場合がある。例として、制限されずに、0~2の間の値を持
つと記載される変数は、該変数が本質的に不連続である場合、値0、1、又は2を取るこ
とができ、該変数が本質的に連続している場合、値0.0、0.1、0.01、0.00
1、又は0以上2以下の任意の他の実数値を取ることができる。
しい変数で本開示が実施され得ると伝えることを意図している。したがって、本質的に不
連続な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しい場
合がある。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範
囲内の任意の実数値に等しい場合がある。例として、制限されずに、0~2の間の値を持
つと記載される変数は、該変数が本質的に不連続である場合、値0、1、又は2を取るこ
とができ、該変数が本質的に連続している場合、値0.0、0.1、0.01、0.00
1、又は0以上2以下の任意の他の実数値を取ることができる。
2.1 発明の原理
本開示は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン、その結果MHCクラスI分子のノック
ダウンがCAR T細胞等の遺伝子改変細胞の同種異系性を低下し得るという観察に一部
基づいている。重要なことに、本発明者らは、ベータ2ミクログロブリン及びMHCクラ
スI分子の不完全なノックダウン(すなわち、完全なノックアウトではなく、野生型発現
の割合が低い)が、遺伝子改変細胞の同種異系性を低下させるだけでなく、B2M陰性の
細胞を非自己として認識し、細胞傷害作用を誘導し得るNK細胞による殺傷を劇的に低下
するのに役立つことを発見した。
本開示は、細胞表面ベータ2ミクログロブリン、その結果MHCクラスI分子のノック
ダウンがCAR T細胞等の遺伝子改変細胞の同種異系性を低下し得るという観察に一部
基づいている。重要なことに、本発明者らは、ベータ2ミクログロブリン及びMHCクラ
スI分子の不完全なノックダウン(すなわち、完全なノックアウトではなく、野生型発現
の割合が低い)が、遺伝子改変細胞の同種異系性を低下させるだけでなく、B2M陰性の
細胞を非自己として認識し、細胞傷害作用を誘導し得るNK細胞による殺傷を劇的に低下
するのに役立つことを発見した。
本発明はまた、CARをコードするコンストラクトがCD52に対するRNA干渉分子
のコード配列を含む場合、CAR陽性T細胞の集団が有利な陰性選択法により濃縮され得
るという本発明者らの発見に一部基づいている。このようにして、CD52陽性細胞を捕
捉するため、CAR T細胞の集団を抗CD52抗体に複合化したビーズと接触させるこ
とができる。ビーズ、したがってCD52陽性細胞の分離により、CD52の細胞表面発
現が低下したCAR陽性細胞の集団が濃縮される。
のコード配列を含む場合、CAR陽性T細胞の集団が有利な陰性選択法により濃縮され得
るという本発明者らの発見に一部基づいている。このようにして、CD52陽性細胞を捕
捉するため、CAR T細胞の集団を抗CD52抗体に複合化したビーズと接触させるこ
とができる。ビーズ、したがってCD52陽性細胞の分離により、CD52の細胞表面発
現が低下したCAR陽性細胞の集団が濃縮される。
したがって、キメラ抗原受容体等の操作された抗原受容体をコードする第1の発現カセ
ットと、RNA干渉分子等の阻害性核酸分子をコードする第2の発現カセットとを含む核
酸分子が提供される。さらに、核酸分子には5´及び3´の相同性アームが隣接しており
、操作されたヌクレアーゼによって産生される切断部位等の二本鎖切断での細胞のゲノム
への核酸の標的挿入が促進される。本発明の特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、M
HCクラスI分子の構成要素であるヒトベータ2ミクログロブリン、又はCD52に対す
るものであってもよい。
ットと、RNA干渉分子等の阻害性核酸分子をコードする第2の発現カセットとを含む核
酸分子が提供される。さらに、核酸分子には5´及び3´の相同性アームが隣接しており
、操作されたヌクレアーゼによって産生される切断部位等の二本鎖切断での細胞のゲノム
への核酸の標的挿入が促進される。本発明の特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、M
HCクラスI分子の構成要素であるヒトベータ2ミクログロブリン、又はCD52に対す
るものであってもよい。
さらに本明細書では、組換えDNAコンストラクト及び核酸分子を含むウイルスベクタ
ー、核酸分子を含む遺伝子改変細胞、及びかかる細胞を含む医薬組成物が開示される。ま
た、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又はCD52の細胞表面発現が低
下し、本発明の特定の核酸分子を発現する場合又は発現しない場合もある、操作された抗
原受容体(例えば、CAR又は外因性TCR)を発現する遺伝子改変細胞も開示される。
ー、核酸分子を含む遺伝子改変細胞、及びかかる細胞を含む医薬組成物が開示される。ま
た、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又はCD52の細胞表面発現が低
下し、本発明の特定の核酸分子を発現する場合又は発現しない場合もある、操作された抗
原受容体(例えば、CAR又は外因性TCR)を発現する遺伝子改変細胞も開示される。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞の投与は、本開示の遺伝子改変細胞
によって標的とされ得る癌等の疾患の症状又は重症度を軽減する。
によって標的とされ得る癌等の疾患の症状又は重症度を軽減する。
また、本明細書に開示される遺伝子改変細胞及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組
成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を治療する免疫
療法の方法も本明細書に開示される。かかる方法では、CARが発現され、細胞表面ベー
タ2ミクログロブリン及び/又はMHCクラスI分子が減少し、不完全なノックアウトが
、細胞の同種異系性及びNK細胞による細胞の死滅の両方の低下に結び付く。
成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を治療する免疫
療法の方法も本明細書に開示される。かかる方法では、CARが発現され、細胞表面ベー
タ2ミクログロブリン及び/又はMHCクラスI分子が減少し、不完全なノックアウトが
、細胞の同種異系性及びNK細胞による細胞の死滅の両方の低下に結び付く。
さらに、遺伝子改変細胞の濃縮集団を生産する方法が開示され、該方法では、RNA干
渉によりCARが発現され、細胞表面CD52が減少し、CD52発現が減少したCAR
陽性細胞の陰性選択が可能になる。
渉によりCARが発現され、細胞表面CD52が減少し、CD52発現が減少したCAR
陽性細胞の陰性選択が可能になる。
2.2 核酸分子
特定の実施形態では、本発明は、以下:(a)操作された抗原受容体をコードする核酸
配列を含む第1の発現カセットと;(b)阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第
2の発現カセットと;(c)5´相同性アームと;(d)3´相同性アームとを含む核酸
分子を提供する。5´相同性アーム及び3´相同性アームは、適切な認識配列が存在する
標的細胞内の任意の所望の遺伝子であってもよい、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列
に隣接する染色体領域と相同性を有するように、任意の適切な長さで操作することができ
る。
特定の実施形態では、本発明は、以下:(a)操作された抗原受容体をコードする核酸
配列を含む第1の発現カセットと;(b)阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第
2の発現カセットと;(c)5´相同性アームと;(d)3´相同性アームとを含む核酸
分子を提供する。5´相同性アーム及び3´相同性アームは、適切な認識配列が存在する
標的細胞内の任意の所望の遺伝子であってもよい、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列
に隣接する染色体領域と相同性を有するように、任意の適切な長さで操作することができ
る。
本発明の核酸分子は、任意の数の配向を有することができる。図1に示すいくつかの非
限定的な例。特定の実施形態では、第1及び第2の発現カセットは同じ向きであってもよ
い。この方向は、相同性アームに対して5´から3´、又は3´から5´のいずれかであ
る。いずれの場合でも、第1の発現カセットは第2のカセットの5´にあってもよく、又
は第2のカセットは第1のカセットの5´にあってもよい。他の実施形態では、第1及び
第2の発現カセットは、核酸分子内で異なる向きにあってもよい。例えば、第1の発現カ
セットは5´から3´に向けられてもよく、一方、第2の発現カセットは3´から5´に
向けられてもよい。あるいは、第1の発現カセットは3´から5´に向けられてもよく、
第2の発現カセットは5´から3´に向けられてもよい。
限定的な例。特定の実施形態では、第1及び第2の発現カセットは同じ向きであってもよ
い。この方向は、相同性アームに対して5´から3´、又は3´から5´のいずれかであ
る。いずれの場合でも、第1の発現カセットは第2のカセットの5´にあってもよく、又
は第2のカセットは第1のカセットの5´にあってもよい。他の実施形態では、第1及び
第2の発現カセットは、核酸分子内で異なる向きにあってもよい。例えば、第1の発現カ
セットは5´から3´に向けられてもよく、一方、第2の発現カセットは3´から5´に
向けられてもよい。あるいは、第1の発現カセットは3´から5´に向けられてもよく、
第2の発現カセットは5´から3´に向けられてもよい。
発現カセットが反対の向きにある実施形態では、第1の発現カセットは3´から5´に
向けられ、5´から3´に向けられる第2の発現カセットに対して5´に配置されるよう
に、それらの発現カセットは「tail-to-tail」構成で方向付けられる。同様
のtail-to-tailの実施形態では、第2の発現カセットは3´から5´に向け
られ、5´から3´に向けられる第1の発現カセットに対して5´に配置される。
向けられ、5´から3´に向けられる第2の発現カセットに対して5´に配置されるよう
に、それらの発現カセットは「tail-to-tail」構成で方向付けられる。同様
のtail-to-tailの実施形態では、第2の発現カセットは3´から5´に向け
られ、5´から3´に向けられる第1の発現カセットに対して5´に配置される。
発現カセットが反対の向きにある他の実施形態では、それらの発現カセットは「hea
d-to-head」構成で方向付けられる。第1の発現カセットは5´から3´に向け
られ、3´から5´に向けられる第2の発現カセットに対して5´に配置される。同様の
head-to-headの実施形態では、第2の発現カセットは5´から3´に向けら
れ、3´から5´に向けられる第1の発現カセットに対して5´に配置される。
d-to-head」構成で方向付けられる。第1の発現カセットは5´から3´に向け
られ、3´から5´に向けられる第2の発現カセットに対して5´に配置される。同様の
head-to-headの実施形態では、第2の発現カセットは5´から3´に向けら
れ、3´から5´に向けられる第1の発現カセットに対して5´に配置される。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、第2の発現カセットの複数のコピーを含んでも
よい。第2の発現カセットのコピーは同一であってもよく、又は互いに異なってもよい。
いくつかの場合には、コピーは、プロモータ、阻害性核酸分子のコード配列、及び阻害性
核酸分子の翻訳を終結させるための(cPPT/CTS)配列等の配列を含んでもよい。
第2の発現カセットのコピーは、核酸分子内で互いにタンデムであってもよく、同じ向き
又は反対の向きであってもよい。あるいは、コピーはタンデムでなくてもよく、同じ向き
又は反対の向きでもよい。
よい。第2の発現カセットのコピーは同一であってもよく、又は互いに異なってもよい。
いくつかの場合には、コピーは、プロモータ、阻害性核酸分子のコード配列、及び阻害性
核酸分子の翻訳を終結させるための(cPPT/CTS)配列等の配列を含んでもよい。
第2の発現カセットのコピーは、核酸分子内で互いにタンデムであってもよく、同じ向き
又は反対の向きであってもよい。あるいは、コピーはタンデムでなくてもよく、同じ向き
又は反対の向きでもよい。
核酸分子の発現カセットは、操作された抗原受容体及び/又は阻害性核酸分子の発現を
駆動する様々なプロモータを含んでもよい。適切なプロモータの一例は、前初期サイトメ
ガロウイルス(CMV)プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに制御可能
に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動可能な強力な構成的プ
ロモータ配列である。適切なプロモータの別の例は、伸長増殖因子-1α(EF-1α:
Elongation Growth Factor-1α)である。しかしながら、シ
ミアンウイルス40(SV40)初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)
、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ロングターミナルリピート(LTR)プロモータ、M
oMuLVプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタインバーウイルス前初
期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ等を含むが、これらに限定されない他の構
成的プロモータ配列、同様にアクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプ
ロモータ、クレアチンキナーゼプロモータ等を含むが、これらに限定されないヒト遺伝子
プロモータも使用され得る。さらに、本開示は、構成的プロモータの使用に限定されるべ
きではない。誘導性プロモータも本開示の一部として企図される。誘導性プロモータの使
用は、かかる発現が望まれる場合に制御可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現を
オンにする、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを
提供する。誘導性プロモータの例としては、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコ
イドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが挙げら
れるが、これらに限定されない。
駆動する様々なプロモータを含んでもよい。適切なプロモータの一例は、前初期サイトメ
ガロウイルス(CMV)プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに制御可能
に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動可能な強力な構成的プ
ロモータ配列である。適切なプロモータの別の例は、伸長増殖因子-1α(EF-1α:
Elongation Growth Factor-1α)である。しかしながら、シ
ミアンウイルス40(SV40)初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)
、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ロングターミナルリピート(LTR)プロモータ、M
oMuLVプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタインバーウイルス前初
期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ等を含むが、これらに限定されない他の構
成的プロモータ配列、同様にアクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプ
ロモータ、クレアチンキナーゼプロモータ等を含むが、これらに限定されないヒト遺伝子
プロモータも使用され得る。さらに、本開示は、構成的プロモータの使用に限定されるべ
きではない。誘導性プロモータも本開示の一部として企図される。誘導性プロモータの使
用は、かかる発現が望まれる場合に制御可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現を
オンにする、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを
提供する。誘導性プロモータの例としては、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコ
イドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが挙げら
れるが、これらに限定されない。
合成プロモータも本開示の一部として企図される。例えば、特定の実施形態では、操作
された抗原受容体の発現を駆動するプロモータはJeTプロモータである(国際公開第2
002/012514号明細書を参照されたい)。
された抗原受容体の発現を駆動するプロモータはJeTプロモータである(国際公開第2
002/012514号明細書を参照されたい)。
いくつかの実施形態では、プロモータは、所望の結果に基づいて選択される。本明細書
に開示されるポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置及び/又はレベルを調節するた
めに発現カセットに異なるプロモータを使用することにより、種々の用途を強化すること
ができると認識されている。かかる発現コンストラクトは、必要に応じて、プロモータ調
節領域(例えば、誘導性、構成的、環境的若しくは発生的に調節される、又は細胞若しく
は組織特異的/選択的発現を付与するもの)、転写開始開始部位、リボソーム結合部位、
RNAプロセシングシグナル、転写終結部位、及び/又はポリアデニル化シグナルを含ん
でもよい。
に開示されるポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置及び/又はレベルを調節するた
めに発現カセットに異なるプロモータを使用することにより、種々の用途を強化すること
ができると認識されている。かかる発現コンストラクトは、必要に応じて、プロモータ調
節領域(例えば、誘導性、構成的、環境的若しくは発生的に調節される、又は細胞若しく
は組織特異的/選択的発現を付与するもの)、転写開始開始部位、リボソーム結合部位、
RNAプロセシングシグナル、転写終結部位、及び/又はポリアデニル化シグナルを含ん
でもよい。
RNA干渉分子の発現を駆動するのに特に有用なプロモータは、当技術分野でよく知ら
れており、U6又はH1等のpol IIIプロモータを含むが、これらに限定されない
。
れており、U6又はH1等のpol IIIプロモータを含むが、これらに限定されない
。
核酸分子の5´及び3´の相同性アームは、ゲノム中のヌクレアーゼ認識配列の5´上
流及び3´下流の対応する配列と配列相同性を有する。相同性アームは、ヌクレアーゼに
よって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する。一般に、相同性アームは、少
なくとも50塩基対、好ましくは少なくとも100塩基対、及び最大2000塩基対以上
の長さを持つことができ、ゲノム中のそれらの対応する配列に対して、少なくとも90%
、好ましくは少なくとも95%、又はそれ以上の配列相同性を持つことができる。
流及び3´下流の対応する配列と配列相同性を有する。相同性アームは、ヌクレアーゼに
よって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する。一般に、相同性アームは、少
なくとも50塩基対、好ましくは少なくとも100塩基対、及び最大2000塩基対以上
の長さを持つことができ、ゲノム中のそれらの対応する配列に対して、少なくとも90%
、好ましくは少なくとも95%、又はそれ以上の配列相同性を持つことができる。
遺伝子改変細胞における操作された抗原受容体(例えば、CAR又は外因性T細胞受容
体)の発現を評価するために、本発明の核酸分子は、任意に、コード化された細胞表面タ
ンパク質の存在の検出に使用され得るエピトープを含んでもよい。本明細書に記載される
いくつかの例では、CARコード配列は、抗CD34抗体を使用する検出を可能にするQ
Bend10エピトープを含んでもよい(国際公開第2013/153391号明細書を
参照されたい)。
体)の発現を評価するために、本発明の核酸分子は、任意に、コード化された細胞表面タ
ンパク質の存在の検出に使用され得るエピトープを含んでもよい。本明細書に記載される
いくつかの例では、CARコード配列は、抗CD34抗体を使用する検出を可能にするQ
Bend10エピトープを含んでもよい(国際公開第2013/153391号明細書を
参照されたい)。
他の例では、発現カセットは選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のい
ずれか、又はそれらの両方を含むことができ、ウイルスベクターによりトランスフェクト
又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする。他の態様
では、選択可能なマーカーは、DNAの別々の断片上で保持され、同時トランスフェクシ
ョン手順で使用され得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞で
の発現を可能にする適切な調節配列が隣接してもよい。有用な選択可能なマーカーとして
は、例えば、抗生物質耐性遺伝子及び蛍光マーカー遺伝子が挙げられる。
ずれか、又はそれらの両方を含むことができ、ウイルスベクターによりトランスフェクト
又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする。他の態様
では、選択可能なマーカーは、DNAの別々の断片上で保持され、同時トランスフェクシ
ョン手順で使用され得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞で
の発現を可能にする適切な調節配列が隣接してもよい。有用な選択可能なマーカーとして
は、例えば、抗生物質耐性遺伝子及び蛍光マーカー遺伝子が挙げられる。
発現はまた、阻害性核酸配列により標的化されたポリペプチドのタンパク質発現を判断
することにより評価され得る。例えば、ベータ2ミクログロブリン及びCD52の発現は
、当技術分野で知られている多くの技術により細胞表面上で検出され得る。発現はまた、
細胞表面ポリペプチドを発現する、又はその発現を欠く細胞の特定の集団を精製する陽性
又は陰性の選択手順によって判断することもできる。
することにより評価され得る。例えば、ベータ2ミクログロブリン及びCD52の発現は
、当技術分野で知られている多くの技術により細胞表面上で検出され得る。発現はまた、
細胞表面ポリペプチドを発現する、又はその発現を欠く細胞の特定の集団を精製する陽性
又は陰性の選択手順によって判断することもできる。
本開示の核酸分子を含むベクターも本明細書で提供される。いくつかの態様では、核酸
分子は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、又はコスミドを含
むがこれらに限定されないベクターにクローニングされる。特に目的のベクターとしては
、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げら
れる。
分子は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、又はコスミドを含
むがこれらに限定されないベクターにクローニングされる。特に目的のベクターとしては
、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げら
れる。
他の実施形態では、本発明の核酸分子は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター等のウイ
ルスベクター上で提供される。ウイルスベクター技術は、当技術分野でよく知られており
、例えば、Sambrookら(2001, Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La
boratory,New York)、及び他のウイルス学及び分子生物学のマニュア
ルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスが挙げられるが、こ
れらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物で機能する複製
起点、プロモータ配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択マーカ
ーを含む(例えば、国際公開第01/96584号;同第01/29058号;及び米国
特許第6,326,193号の明細書)。本発明の核酸が、ゲノムへのランダムな統合を
促進し、相同組換えのために5´及び3´の相同アームの存在を必要としないウイルスベ
クターで提供される場合、本発明の核酸は、5´及び3´の相同性アームを伴わずに提供
され得る。
クター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター等のウイ
ルスベクター上で提供される。ウイルスベクター技術は、当技術分野でよく知られており
、例えば、Sambrookら(2001, Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La
boratory,New York)、及び他のウイルス学及び分子生物学のマニュア
ルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスが挙げられるが、こ
れらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物で機能する複製
起点、プロモータ配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択マーカ
ーを含む(例えば、国際公開第01/96584号;同第01/29058号;及び米国
特許第6,326,193号の明細書)。本発明の核酸が、ゲノムへのランダムな統合を
促進し、相同組換えのために5´及び3´の相同アームの存在を必要としないウイルスベ
クターで提供される場合、本発明の核酸は、5´及び3´の相同性アームを伴わずに提供
され得る。
2.3 キメラ抗原受容体(CAR)
本明細書では、操作された抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞が提供される。いくつ
かの実施形態では、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体(CAR)である。一般に
、本開示のCARは、少なくとも細胞外ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの
実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン又はリガンド結合部分とも称さ
れる標的特異的結合要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメイン又は細胞質ド
メインは、少なくとも1つの共刺激ドメインと、1つ以上のシグナル伝達ドメインとを含
む。他の実施形態では、CARはCD3ζ等のシグナル伝達ドメインのみを含んでもよく
、細胞は、細胞内で発現される別のコンストラクト上に1つ以上の共刺激ドメインを含ん
でもよい。
本明細書では、操作された抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞が提供される。いくつ
かの実施形態では、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体(CAR)である。一般に
、本開示のCARは、少なくとも細胞外ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの
実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン又はリガンド結合部分とも称さ
れる標的特異的結合要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメイン又は細胞質ド
メインは、少なくとも1つの共刺激ドメインと、1つ以上のシグナル伝達ドメインとを含
む。他の実施形態では、CARはCD3ζ等のシグナル伝達ドメインのみを含んでもよく
、細胞は、細胞内で発現される別のコンストラクト上に1つ以上の共刺激ドメインを含ん
でもよい。
いくつかの実施形態では、CARは、リガンド結合ドメイン又はリガンド結合部分とも
称される細胞外の標的特異的結合要素を含む。リガンド結合ドメインの選択は、標的細胞
の表面を定義するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、リガンド結合ドメインは、
特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識
するように選択されてもよい。したがって、本開示のCARにおけるリガンド結合ドメイ
ンのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌及び寄生
虫の感染症、自己免疫疾患、及び癌細胞に関連するものを挙げることができる。いくつか
の実施形態では、本開示のCARは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガン
ド結合部分を操作することにより、目的の腫瘍抗原を標的とするように操作される。本開
示の文脈において、「腫瘍抗原」とは、癌等の特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指
す。
称される細胞外の標的特異的結合要素を含む。リガンド結合ドメインの選択は、標的細胞
の表面を定義するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、リガンド結合ドメインは、
特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識
するように選択されてもよい。したがって、本開示のCARにおけるリガンド結合ドメイ
ンのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌及び寄生
虫の感染症、自己免疫疾患、及び癌細胞に関連するものを挙げることができる。いくつか
の実施形態では、本開示のCARは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガン
ド結合部分を操作することにより、目的の腫瘍抗原を標的とするように操作される。本開
示の文脈において、「腫瘍抗原」とは、癌等の特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指
す。
いくつかの態様では、CARの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原又は
エピトープ、特に目的の任意の腫瘍抗原又はエピトープに特異的である。非限定的な例と
して、いくつかの実施形態では、標的の抗原は、ErbB2(HER2/neu)、癌胎
児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、上皮成長因子受容体(EGFR
)、EGFRバリアントIII(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD22、
CD30、CD40、CLL-1、ジシアロガングリオシドGD2、管上皮ムチン、gp
36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、B-ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン、アルファフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン
、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(A
S)、腸内カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスタ
ーゼ、プロスターゼ特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-la
、p53、プロスタイン、PSMA、サバイビング(surviving)及びテロメラ
ーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスタ
ーゼ、エフリンB2、インスリン成長因子(IGFl)-1、IGF-II、IGFI受
容体、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体(MH
C)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチ
ンの追加ドメインA(EDA)及び追加ドメインB(EDB)並びにテネイシンCのAl
ドメイン(TnC Al)、並びに維芽細胞関連タンパク質(fap)等の腫瘍関連表面
抗原;CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD38、
CD123、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2
(CD86)等の系統特異的又は組織特異的抗原、エンドグリン、主要組織適合複合体(
MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF 17)、CS1、又はHIV特異
抗原(HIV gpl20等)等のウイルス特異表面抗原;EBV特異抗原、CMV特異
抗原、E6又はE7腫瘍性タンパク質等のHPV特異抗原、ラッセウイルス特異抗原、イ
ンフルエンザウイルス特異抗原、同様にこれらの表面マーカーの任意の誘導体又はバリア
ントである。本開示の特定の実施形態では、リガンド結合ドメインはCD19に特異的で
ある。
エピトープ、特に目的の任意の腫瘍抗原又はエピトープに特異的である。非限定的な例と
して、いくつかの実施形態では、標的の抗原は、ErbB2(HER2/neu)、癌胎
児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、上皮成長因子受容体(EGFR
)、EGFRバリアントIII(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD22、
CD30、CD40、CLL-1、ジシアロガングリオシドGD2、管上皮ムチン、gp
36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、B-ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン、アルファフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン
、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(A
S)、腸内カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスタ
ーゼ、プロスターゼ特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-la
、p53、プロスタイン、PSMA、サバイビング(surviving)及びテロメラ
ーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスタ
ーゼ、エフリンB2、インスリン成長因子(IGFl)-1、IGF-II、IGFI受
容体、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体(MH
C)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチ
ンの追加ドメインA(EDA)及び追加ドメインB(EDB)並びにテネイシンCのAl
ドメイン(TnC Al)、並びに維芽細胞関連タンパク質(fap)等の腫瘍関連表面
抗原;CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD38、
CD123、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2
(CD86)等の系統特異的又は組織特異的抗原、エンドグリン、主要組織適合複合体(
MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF 17)、CS1、又はHIV特異
抗原(HIV gpl20等)等のウイルス特異表面抗原;EBV特異抗原、CMV特異
抗原、E6又はE7腫瘍性タンパク質等のHPV特異抗原、ラッセウイルス特異抗原、イ
ンフルエンザウイルス特異抗原、同様にこれらの表面マーカーの任意の誘導体又はバリア
ントである。本開示の特定の実施形態では、リガンド結合ドメインはCD19に特異的で
ある。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、Bリンパ球上の自己
抗原特異的B細胞受容体によって認識され得る自己抗原を更に含み(Payneら(20
16)Science、Vol.353(6295):179-184を参照されたい)
、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応性Bリンパ球を特異的に標的として殺傷するようにT
細胞に指示する。かかるCARは、キメラ自己抗体受容体(CAAR)と称されることが
あり、本明細書に記載される1つ以上の共刺激ドメインのかかるCAARへの組み込みが
本開示に含まれる。
抗原特異的B細胞受容体によって認識され得る自己抗原を更に含み(Payneら(20
16)Science、Vol.353(6295):179-184を参照されたい)
、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応性Bリンパ球を特異的に標的として殺傷するようにT
細胞に指示する。かかるCARは、キメラ自己抗体受容体(CAAR)と称されることが
あり、本明細書に記載される1つ以上の共刺激ドメインのかかるCAARへの組み込みが
本開示に含まれる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、目的の抗原に対する
天然に存在するリガンド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガ
ンドの断片を含んでもよい。
天然に存在するリガンド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガ
ンドの断片を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、CARは、ヒンジ又はスペーサー配列を介して細胞外リガン
ド結合ドメイン又は自己抗原を細胞内シグナル伝達及び共刺激ドメインと連結する膜貫通
ドメインを含む。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由
来し得る。例えば、膜貫通ポリペプチドは、T細胞受容体のサブユニット(すなわち、α
、β、γ又はζ、CD3複合体を構成するポリペプチド)、IL2受容体p55(鎖)、
p75(β鎖)又はγ鎖、Fc受容体のサブユニット鎖(例えば、Fcγ受容体III)
、又はCD8アルファ鎖等のCDタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメイン
は合成であってもよく、ロイシン及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。特定の
例では、膜貫通ドメインはCD8α膜貫通ポリペプチドである。
ド結合ドメイン又は自己抗原を細胞内シグナル伝達及び共刺激ドメインと連結する膜貫通
ドメインを含む。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由
来し得る。例えば、膜貫通ポリペプチドは、T細胞受容体のサブユニット(すなわち、α
、β、γ又はζ、CD3複合体を構成するポリペプチド)、IL2受容体p55(鎖)、
p75(β鎖)又はγ鎖、Fc受容体のサブユニット鎖(例えば、Fcγ受容体III)
、又はCD8アルファ鎖等のCDタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメイン
は合成であってもよく、ロイシン及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。特定の
例では、膜貫通ドメインはCD8α膜貫通ポリペプチドである。
ヒンジ領域とは、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能
するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大300個のアミノ酸、
好ましくは10個~100個のアミノ酸、最も好ましくは25個~50個のアミノ酸を含
み得る。ヒンジ領域は、CD8、CD4又はCD28の細胞外領域の全て若しくは一部、
又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよ
い。あるいは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又
は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒト
CD8アルファ鎖、FcyRllla受容体又はIgGlの一部を含む場合がある。
するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大300個のアミノ酸、
好ましくは10個~100個のアミノ酸、最も好ましくは25個~50個のアミノ酸を含
み得る。ヒンジ領域は、CD8、CD4又はCD28の細胞外領域の全て若しくは一部、
又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよ
い。あるいは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又
は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒト
CD8アルファ鎖、FcyRllla受容体又はIgGlの一部を含む場合がある。
本開示のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが置かれた細胞の正常なエフ
ェクター機能の少なくとも1つの活性化及び/又は増殖及び細胞生存の経路の活性化を担
う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクタ
ー機能は、例えば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であって
もよい。CD3ζ等の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合に応答して
細胞に活性化シグナルを提供することができる。検討されるように、活性化シグナルは、
例えば細胞溶解活性又はサイトカイン分泌等の細胞のエフェクター機能を誘導することが
できる。
ェクター機能の少なくとも1つの活性化及び/又は増殖及び細胞生存の経路の活性化を担
う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクタ
ー機能は、例えば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であって
もよい。CD3ζ等の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合に応答して
細胞に活性化シグナルを提供することができる。検討されるように、活性化シグナルは、
例えば細胞溶解活性又はサイトカイン分泌等の細胞のエフェクター機能を誘導することが
できる。
CARの細胞内ドメインには、細胞外ドメインの結合後に、細胞増殖、細胞生存、及び
/又はサイトカイン分泌を促進するために共刺激シグナルを伝達する1つ以上の細胞内共
刺激ドメインを含めることができる。かかる細胞内共刺激ドメインとしては、限定されな
いが、CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、
CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、C
D7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83、N1、又はN6と特異的に
結合するリガンド等の当技術分野で知られているもののいずれかが挙げられる。
/又はサイトカイン分泌を促進するために共刺激シグナルを伝達する1つ以上の細胞内共
刺激ドメインを含めることができる。かかる細胞内共刺激ドメインとしては、限定されな
いが、CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、
CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、C
D7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83、N1、又はN6と特異的に
結合するリガンド等の当技術分野で知られているもののいずれかが挙げられる。
CARは、任意の種類の癌細胞に特異的である。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、
肉腫、芽細胞腫、白血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色
腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が
挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、
B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞非ホジキンリン
パ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
肉腫、芽細胞腫、白血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色
腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が
挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、
B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞非ホジキンリン
パ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
2.4 組換えウイルスベクターを生産する方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の方法で使用するための組換えAAVベク
ターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK-293等の哺乳動物細
胞株で産生される。ウイルスのcap遺伝子及びrep遺伝子はベクターから除去されて
、自己複製を防ぎ、治療遺伝子(複数の場合もある)(例:エンドヌクレアーゼ遺伝子)
を送達する余地を作ることから、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供する必
要がある。さらに、複製を支持するために必要な「ヘルパー」(例えば、アデノウイルス
)構成要素を提供する必要がある(Cots D,Bosch A,Chillon M
(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370-81)。多くの場合
、組換えAAVベクターは、細胞株に「ヘルパー」構成要素をコードする第1のプラスミ
ド、cap遺伝子及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケー
ジングされるための介在DNA配列を含むウイルスITRを含む第3のプラスミドを用い
てトランスフェクションするトリプルトランスフェクションを使用して産生される。次い
で、カプシドに包まれたゲノム(目的のITR及び介在遺伝子(複数の場合もある)を含
むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で知ら
れている他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子は塩化セシウム密度勾配遠心
分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、その後、細胞、組織、又
はヒト患者等の生物に目的の遺伝子(複数の場合もある)を送達する。したがって、本明
細書に記載される本発明の核酸分子を含む組換えAAVベクターを産生する方法が本明細
書に提供される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の方法で使用するための組換えAAVベク
ターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK-293等の哺乳動物細
胞株で産生される。ウイルスのcap遺伝子及びrep遺伝子はベクターから除去されて
、自己複製を防ぎ、治療遺伝子(複数の場合もある)(例:エンドヌクレアーゼ遺伝子)
を送達する余地を作ることから、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供する必
要がある。さらに、複製を支持するために必要な「ヘルパー」(例えば、アデノウイルス
)構成要素を提供する必要がある(Cots D,Bosch A,Chillon M
(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370-81)。多くの場合
、組換えAAVベクターは、細胞株に「ヘルパー」構成要素をコードする第1のプラスミ
ド、cap遺伝子及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケー
ジングされるための介在DNA配列を含むウイルスITRを含む第3のプラスミドを用い
てトランスフェクションするトリプルトランスフェクションを使用して産生される。次い
で、カプシドに包まれたゲノム(目的のITR及び介在遺伝子(複数の場合もある)を含
むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で知ら
れている他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子は塩化セシウム密度勾配遠心
分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、その後、細胞、組織、又
はヒト患者等の生物に目的の遺伝子(複数の場合もある)を送達する。したがって、本明
細書に記載される本発明の核酸分子を含む組換えAAVベクターを産生する方法が本明細
書に提供される。
いくつかの実施形態では、遺伝子導入は、レンチウイルスベクターを介して達成される
。他のレトロウイルスとは対照的に、レンチウイルスは、場合によっては、特定の非分裂
細胞の形質導入に使用され得る。レンチウイルスベクターの非限定的な例としては、ヒト
免疫不全ウイルス1(HIV-1)、HIV-2、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒ
トTリンパ球好性ウイルス1(HTLV-1)、HTLV-2、又はウマ感染性貧血ウイ
ルス(E1AV)等のレンチウイルスに由来するものが挙げられる。例えば、例えば、遺
伝子env、vif、vpr、vpu、及びnefを削除し、HIV病原性遺伝子を多重
に減衰させることでレンチウイルスベクターを生成し、治療目的に対してベクターをより
安全なものとした。レンチウイルスベクターは、当技術分野で知られており、Naldi
niら(1996 and 1998);Zuffereyら(1997);Dullら
1998、米国特許第6,013,516号;及び同第5,994,136号の明細書)
を参照されたい。いくつかの実施形態では、これらのウイルスベクターはプラスミド系又
はウイルス系であり、外来核酸を統合するため、選択のため、及び宿主細胞への核酸の移
入のための必須配列を保持するように構成される。既知のレンチウイルスは、Ameri
can Type Culture Collection(“ATCC”;10801
University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209)
等の寄託機関又はコレクションから容易に入手できるか、又は一般的に利用可能な技術を
使用して既知の供給源から単離され得る。
。他のレトロウイルスとは対照的に、レンチウイルスは、場合によっては、特定の非分裂
細胞の形質導入に使用され得る。レンチウイルスベクターの非限定的な例としては、ヒト
免疫不全ウイルス1(HIV-1)、HIV-2、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒ
トTリンパ球好性ウイルス1(HTLV-1)、HTLV-2、又はウマ感染性貧血ウイ
ルス(E1AV)等のレンチウイルスに由来するものが挙げられる。例えば、例えば、遺
伝子env、vif、vpr、vpu、及びnefを削除し、HIV病原性遺伝子を多重
に減衰させることでレンチウイルスベクターを生成し、治療目的に対してベクターをより
安全なものとした。レンチウイルスベクターは、当技術分野で知られており、Naldi
niら(1996 and 1998);Zuffereyら(1997);Dullら
1998、米国特許第6,013,516号;及び同第5,994,136号の明細書)
を参照されたい。いくつかの実施形態では、これらのウイルスベクターはプラスミド系又
はウイルス系であり、外来核酸を統合するため、選択のため、及び宿主細胞への核酸の移
入のための必須配列を保持するように構成される。既知のレンチウイルスは、Ameri
can Type Culture Collection(“ATCC”;10801
University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209)
等の寄託機関又はコレクションから容易に入手できるか、又は一般的に利用可能な技術を
使用して既知の供給源から単離され得る。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)か
らクローニングされたgag、pol、tat、及びrevの遺伝子をコードする第1の
プラスミドと、偽型ウイルス粒子に対して使用される水疱性口内炎ウイルス(VSV-G
)に由来するエンベロープタンパク質をコードする第2のプラスミドを使用して調製され
る。pCDH-EF1-MCSベクター等のトランスファーベクターは、適切なプロモー
タと共に使用され得る。次いで、3つのプラスミド全てをレンチウイルス細胞(Lent
i-X-293T細胞等)にトランスフェクトし、次いで、適切なインキュベーション時
間後にレンチウイルスを収集、濃縮、スクリーニングすることができる。したがって、本
明細書に記載される本発明の核酸分子を含む組換えレンチウイルスベクターを産生するた
めの方法が本明細書において記載される。
らクローニングされたgag、pol、tat、及びrevの遺伝子をコードする第1の
プラスミドと、偽型ウイルス粒子に対して使用される水疱性口内炎ウイルス(VSV-G
)に由来するエンベロープタンパク質をコードする第2のプラスミドを使用して調製され
る。pCDH-EF1-MCSベクター等のトランスファーベクターは、適切なプロモー
タと共に使用され得る。次いで、3つのプラスミド全てをレンチウイルス細胞(Lent
i-X-293T細胞等)にトランスフェクトし、次いで、適切なインキュベーション時
間後にレンチウイルスを収集、濃縮、スクリーニングすることができる。したがって、本
明細書に記載される本発明の核酸分子を含む組換えレンチウイルスベクターを産生するた
めの方法が本明細書において記載される。
2.5 遺伝子改変細胞
本明細書において、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含むように遺伝子改変さ
れた細胞が提供される。さらに、本発明の特定の核酸分子を必ずしも含まないベータ2ミ
クログロブリン、MHCクラスI分子、及び/又はCD52の細胞表面発現が低下した遺
伝子改変細胞(例えば、CAR又は外因性TCRを発現するヒトT細胞)が提供される。
本明細書において、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含むように遺伝子改変さ
れた細胞が提供される。さらに、本発明の特定の核酸分子を必ずしも含まないベータ2ミ
クログロブリン、MHCクラスI分子、及び/又はCD52の細胞表面発現が低下した遺
伝子改変細胞(例えば、CAR又は外因性TCRを発現するヒトT細胞)が提供される。
本開示の異なるバリエーションにおいて、本発明の核酸分子は、遺遺伝子改変細胞のゲ
ノム内に存在する、又は該細胞のゲノムに統合されない。特定の実施形態では、本発明の
核酸分子は、操作されたヌクレアーゼによってもたらされる等の二本鎖切断によってもた
らされる切断部位での標的挿入により細胞のゲノムに挿入される。核酸分子の第1及び第
2の発現カセットに隣接する5´及び3´の相同性アームの存在は、核酸分子の切断部位
への相同組換えを促進し、標的挿入をもたらす。
ノム内に存在する、又は該細胞のゲノムに統合されない。特定の実施形態では、本発明の
核酸分子は、操作されたヌクレアーゼによってもたらされる等の二本鎖切断によってもた
らされる切断部位での標的挿入により細胞のゲノムに挿入される。核酸分子の第1及び第
2の発現カセットに隣接する5´及び3´の相同性アームの存在は、核酸分子の切断部位
への相同組換えを促進し、標的挿入をもたらす。
核酸分子がゲノムに統合されていないいくつかの実施形態では、核酸分子は、遺伝子改
変細胞、組換えDNAコンストラクト、mRNA、ウイルスゲノム、又は細胞のゲノムに
統合されていない他の核酸に存在し得る。
変細胞、組換えDNAコンストラクト、mRNA、ウイルスゲノム、又は細胞のゲノムに
統合されていない他の核酸に存在し得る。
特定の実施形態では、本発明の核酸分子を含む細胞、及び本発明の他の遺伝子改変細胞
は、真核細胞である。特定の実施形態では、かかる細胞はT細胞又はNK細胞、特にヒト
のT細胞又はNK細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は初代T細胞又は初代NK
細胞である。
は、真核細胞である。特定の実施形態では、かかる細胞はT細胞又はNK細胞、特にヒト
のT細胞又はNK細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は初代T細胞又は初代NK
細胞である。
T細胞及びNK細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感
染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍を含む多くの供給源から取得され得る。本開
示の特定の実施形態では、当技術分野で利用可能な任意の数のT細胞及びNK細胞株を使
用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、T細胞及びNK細胞は、当業者
に知られている任意の数の技術を使用して、被験体から収集された血液単位から得られる
。一実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得られる。
染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍を含む多くの供給源から取得され得る。本開
示の特定の実施形態では、当技術分野で利用可能な任意の数のT細胞及びNK細胞株を使
用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、T細胞及びNK細胞は、当業者
に知られている任意の数の技術を使用して、被験体から収集された血液単位から得られる
。一実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得られる。
本明細書に開示される核酸分子を含む遺伝子改変細胞、及び本発明の他の遺伝子改変細
胞は、細胞内でどのポリペプチドが減少するか、及び/又は阻害性核酸分子により標的化
されるかによって多くの機能的特性を示すことができる。例えば、本発明のいくつかの遺
伝子改変細胞では、ベータ2ミクログロブリンが減少する、又は阻害性核酸分子がヒトベ
ータ2ミクログロブリンに対するものであり、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現が
野生型発現のわずかな割合まで低下する。かかる遺伝子改変細胞は、内因性NK細胞殺傷
の影響を受けにくく、被験体における持続時間を延長し、被験体において増強された拡大
を示し、及び/又はB2Mの野生型レベルを有する細胞又は完全にB2M陰性の細胞より
も同種異系性が低下している。その結果、ベータ2ミクログロブリンが減少すると、ベー
タ2ミクログロブリンはそれらの集合及び機能に必要であるため、MHCクラスI分子の
細胞表面発現が低下する。したがって、同じ特性は、MHCクラスI分子の細胞表面発現
が低下した本発明の遺伝子改変細胞にも適用可能である。
胞は、細胞内でどのポリペプチドが減少するか、及び/又は阻害性核酸分子により標的化
されるかによって多くの機能的特性を示すことができる。例えば、本発明のいくつかの遺
伝子改変細胞では、ベータ2ミクログロブリンが減少する、又は阻害性核酸分子がヒトベ
ータ2ミクログロブリンに対するものであり、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現が
野生型発現のわずかな割合まで低下する。かかる遺伝子改変細胞は、内因性NK細胞殺傷
の影響を受けにくく、被験体における持続時間を延長し、被験体において増強された拡大
を示し、及び/又はB2Mの野生型レベルを有する細胞又は完全にB2M陰性の細胞より
も同種異系性が低下している。その結果、ベータ2ミクログロブリンが減少すると、ベー
タ2ミクログロブリンはそれらの集合及び機能に必要であるため、MHCクラスI分子の
細胞表面発現が低下する。したがって、同じ特性は、MHCクラスI分子の細胞表面発現
が低下した本発明の遺伝子改変細胞にも適用可能である。
NK細胞殺傷に対する感受性は、本明細書で更に記載されているもの等、当技術分野で
知られている方法によって決定され得る。NK細胞殺傷における低下は、対照細胞と比較
した場合、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%
、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96、97%、98%、99%、又は最大100%
であってもよい。
知られている方法によって決定され得る。NK細胞殺傷における低下は、対照細胞と比較
した場合、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%
、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96、97%、98%、99%、又は最大100%
であってもよい。
本発明の遺伝子改変細胞は、投与後に被験体内で拡大可能である。ここでは、拡大は、
in vivoでの増殖及び分裂に起因する細胞数の増加と見なされる。拡大の程度は、
部分的には、細胞に対する被験体の反応に依存し、例えば、細胞が同種異系及び/又は非
自己と識別される場合、被験体の免疫系は細胞の拡大能を低下させ、投与後の細胞の持続
性を更に低下させ得る。したがって、いくつかの例では、本発明の遺伝子改変細胞は、対
照細胞と比較した場合、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、7
0%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、200%、350%
、400%、450%、500%、最大1000%、又はそれ以上の被験体における拡大
の増加を示し得る。in vivoでの拡大は、当該分野で知られている任意の方法によ
り投与後に判断され得る。被験体における遺伝子改変細胞の持続時間は、例えば、当技術
分野で知られている任意の方法によって被験体において検出され得る細胞の投与後時間の
量と見なすことができる。いくつかの例では、本発明の遺伝子改変細胞は、対照細胞より
も、最大約1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、2ヶ月、3ヶ月
、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、1年、又はそれ以上長い持続時間の増加を有するであろう。
in vivoでの増殖及び分裂に起因する細胞数の増加と見なされる。拡大の程度は、
部分的には、細胞に対する被験体の反応に依存し、例えば、細胞が同種異系及び/又は非
自己と識別される場合、被験体の免疫系は細胞の拡大能を低下させ、投与後の細胞の持続
性を更に低下させ得る。したがって、いくつかの例では、本発明の遺伝子改変細胞は、対
照細胞と比較した場合、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、7
0%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、200%、350%
、400%、450%、500%、最大1000%、又はそれ以上の被験体における拡大
の増加を示し得る。in vivoでの拡大は、当該分野で知られている任意の方法によ
り投与後に判断され得る。被験体における遺伝子改変細胞の持続時間は、例えば、当技術
分野で知られている任意の方法によって被験体において検出され得る細胞の投与後時間の
量と見なすことができる。いくつかの例では、本発明の遺伝子改変細胞は、対照細胞より
も、最大約1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、2ヶ月、3ヶ月
、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、1年、又はそれ以上長い持続時間の増加を有するであろう。
同種異系性は、本明細書で更に説明される方法等、当技術分野で知られている任意の方
法によって判断され得る。本発明の遺伝子改変細胞は、対照細胞と比較した場合に約5%
、10%、20%、30%、40%、50%55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%9
4%、95%、96、97%、98%、99%、又は最大100%の同種異系性の低下を
示し得る。
法によって判断され得る。本発明の遺伝子改変細胞は、対照細胞と比較した場合に約5%
、10%、20%、30%、40%、50%55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%9
4%、95%、96、97%、98%、99%、又は最大100%の同種異系性の低下を
示し得る。
2.6 遺伝子改変細胞を生産する方法
本開示は、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含む遺伝子改変細胞を産生する方
法を提供する。特定の実施形態では、核酸分子を含むように細胞を改変する方法が提供さ
れる。本開示の異なる態様では、核酸分子は細胞のゲノムに統合される、又は細胞のゲノ
ムに統合されない。
本開示は、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含む遺伝子改変細胞を産生する方
法を提供する。特定の実施形態では、核酸分子を含むように細胞を改変する方法が提供さ
れる。本開示の異なる態様では、核酸分子は細胞のゲノムに統合される、又は細胞のゲノ
ムに統合されない。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、当該分野で知られている任意の技術を使用して
細胞に導入される。特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を含むベクター
又は発現カセットは、ウイルスベクターを使用して細胞に導入される。かかるベクターは
当技術分野で知られており、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びア
デノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが含まれる(Vannucci,ら(2013 N
ew Microbiol.36:1-22)で概説される)。本開示において有用な組
換えAAVベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及び細胞へのヌクレアーゼ遺伝子の
挿入、並びに特定の実施形態では細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有し得
る。特定の実施形態では、組換えAAVベクターは、AAV2、AAV6、又はAAV8
の血清型を有する。組換えAAVベクターはまた、宿主細胞において二本鎖DNA合成を
必要としないように自己相補的であってもよい(McCartyら(2001)Gene
Ther.8:1248-54)。
細胞に導入される。特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を含むベクター
又は発現カセットは、ウイルスベクターを使用して細胞に導入される。かかるベクターは
当技術分野で知られており、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びア
デノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが含まれる(Vannucci,ら(2013 N
ew Microbiol.36:1-22)で概説される)。本開示において有用な組
換えAAVベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及び細胞へのヌクレアーゼ遺伝子の
挿入、並びに特定の実施形態では細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有し得
る。特定の実施形態では、組換えAAVベクターは、AAV2、AAV6、又はAAV8
の血清型を有する。組換えAAVベクターはまた、宿主細胞において二本鎖DNA合成を
必要としないように自己相補的であってもよい(McCartyら(2001)Gene
Ther.8:1248-54)。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、DNAの形態(例えば、
環状又は直線化プラスミドDNA又はPCR産物)で、及び/又はウイルスベクターを介
して細胞に送達される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、当
技術分野で知られている方法を使用して、ナノ粒子に共有結合若しくは非共有結合される
か、又はかかるナノ粒子内にカプセル化される(Sharmaら(2014)Biome
d Res Int.2014)。ナノ粒子は、その長さの尺度が1μm未満、好ましく
は100nm未満のナノスケール送達システムである。かかるナノ粒子は、金属、脂質、
ポリマー、又は生体高分子で構成されるコアを使用して設計され得て、核酸分子の複数の
コピーをナノ粒子コアに付着又はカプセル化することができる。これにより、各細胞に送
達されるDNAのコピー数が増加するため、細胞内発現が増加し、コードされた生成物が
発現される可能性が最大になる。かかるナノ粒子の表面は、コアシェルナノ粒子を形成す
るため、ポリマー又は脂質(例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂
質)で更に修飾されてもよく、その表面がペイロードの細胞送達及び取り込みを強化する
追加機能を付与する(Jianら(2012)Biomaterials.33(30)
:7621-30)。ナノ粒子はさらに、ナノ粒子を適切な細胞型に誘導し、及び/又は
細胞取り込みの可能性を高めるために、標的分子に有利に結合され得る。かかる標的分子
の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体の天然リガンド(又は
天然リガンドの一部)が挙げられる。
環状又は直線化プラスミドDNA又はPCR産物)で、及び/又はウイルスベクターを介
して細胞に送達される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、当
技術分野で知られている方法を使用して、ナノ粒子に共有結合若しくは非共有結合される
か、又はかかるナノ粒子内にカプセル化される(Sharmaら(2014)Biome
d Res Int.2014)。ナノ粒子は、その長さの尺度が1μm未満、好ましく
は100nm未満のナノスケール送達システムである。かかるナノ粒子は、金属、脂質、
ポリマー、又は生体高分子で構成されるコアを使用して設計され得て、核酸分子の複数の
コピーをナノ粒子コアに付着又はカプセル化することができる。これにより、各細胞に送
達されるDNAのコピー数が増加するため、細胞内発現が増加し、コードされた生成物が
発現される可能性が最大になる。かかるナノ粒子の表面は、コアシェルナノ粒子を形成す
るため、ポリマー又は脂質(例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂
質)で更に修飾されてもよく、その表面がペイロードの細胞送達及び取り込みを強化する
追加機能を付与する(Jianら(2012)Biomaterials.33(30)
:7621-30)。ナノ粒子はさらに、ナノ粒子を適切な細胞型に誘導し、及び/又は
細胞取り込みの可能性を高めるために、標的分子に有利に結合され得る。かかる標的分子
の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体の天然リガンド(又は
天然リガンドの一部)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、リポソーム内にカプセル
化され得るか、又はカチオン性脂質を使用して複合体化され得る(例えば、LIPOFE
CTAMINE,Life Technologies Corp.,Carlsbad
,CA;Zurisら(2015) Nat Biotechnol.33:73-80
;Mishraら(2011)J Drug Deliv.2011:863734を参
照されたい)。リポソーム及びリポプレックスの製剤は、ペイロードを分解から保護し、
細胞の細胞膜との融合及び/又は細胞膜の破壊により細胞の取り込み及び送達効率を促進
することができる。
化され得るか、又はカチオン性脂質を使用して複合体化され得る(例えば、LIPOFE
CTAMINE,Life Technologies Corp.,Carlsbad
,CA;Zurisら(2015) Nat Biotechnol.33:73-80
;Mishraら(2011)J Drug Deliv.2011:863734を参
照されたい)。リポソーム及びリポプレックスの製剤は、ペイロードを分解から保護し、
細胞の細胞膜との融合及び/又は細胞膜の破壊により細胞の取り込み及び送達効率を促進
することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、ポリマー足場(例えば、
PLGA)内にカプセル化され得るか、又はカチオン性ポリマー(例えば、PEI、PL
L)を使用して複合化され得る(Tamboliら(2011)Ther Deliv.
2(4):523-536)。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子
を、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わせることができる(Tongら(20
07)J Gene Med.9(11):956-66)。高分子ミセルは、凝集を防
止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的相互作用を低減し得る親水性ポリマー
(例えば、ポリエチレングリコール)で形成されたミセルシェルを含む場合がある。
PLGA)内にカプセル化され得るか、又はカチオン性ポリマー(例えば、PEI、PL
L)を使用して複合化され得る(Tamboliら(2011)Ther Deliv.
2(4):523-536)。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子
を、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わせることができる(Tongら(20
07)J Gene Med.9(11):956-66)。高分子ミセルは、凝集を防
止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的相互作用を低減し得る親水性ポリマー
(例えば、ポリエチレングリコール)で形成されたミセルシェルを含む場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、細胞への送達用のエマル
ジョンとして製剤化され得る。「エマルジョン」という用語は、水に混和しない相が水相
と混合される際に、非極性残基(例えば、長い炭化水素鎖)を水から遠ざけ、極性頭部基
を水に向ける疎水性力の結果として形成することができる脂質構造を含む、水中油型、油
中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴のいずれかを指すが、これら
に限定されない。これらの他の脂質構造としては、単層、少層(paucilamell
ar)、及び多層の脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が挙げられるが、これらに限定され
ない。エマルジョンは、水相及び親油性相(典型的には、油及び有機溶媒を含む)で構成
されている。エマルジョンには、1つ以上の界面活性剤も含まれることが頻繁にある。例
えば、各々がその全体を参照することで本明細書の一部をなす、米国特許出願番号第20
02/0045667号及び同第2004/0043041号の明細書、並びに米国特許
第6,015,832号、同第6,506,803号、同第6,635,676号、及び
同第6,559,189号の明細書に記載されるように、ナノエマルジョン製剤がよく知
られている。
ジョンとして製剤化され得る。「エマルジョン」という用語は、水に混和しない相が水相
と混合される際に、非極性残基(例えば、長い炭化水素鎖)を水から遠ざけ、極性頭部基
を水に向ける疎水性力の結果として形成することができる脂質構造を含む、水中油型、油
中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴のいずれかを指すが、これら
に限定されない。これらの他の脂質構造としては、単層、少層(paucilamell
ar)、及び多層の脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が挙げられるが、これらに限定され
ない。エマルジョンは、水相及び親油性相(典型的には、油及び有機溶媒を含む)で構成
されている。エマルジョンには、1つ以上の界面活性剤も含まれることが頻繁にある。例
えば、各々がその全体を参照することで本明細書の一部をなす、米国特許出願番号第20
02/0045667号及び同第2004/0043041号の明細書、並びに米国特許
第6,015,832号、同第6,506,803号、同第6,635,676号、及び
同第6,559,189号の明細書に記載されるように、ナノエマルジョン製剤がよく知
られている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、多機能ポリマーコンジュ
ゲート、DNAデンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合により又は非共有結
合的に付着され得る(Mastorakosら(2015)Nanoscale.7(9
):3845-56;Chengら(2008)J Pharm Sci.97(1):
123-43)。デンドリマーの生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、高い
ペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の提示を活用して、安定
性を改善し、非特異的な相互作用を減らすことができる。
ゲート、DNAデンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合により又は非共有結
合的に付着され得る(Mastorakosら(2015)Nanoscale.7(9
):3845-56;Chengら(2008)J Pharm Sci.97(1):
123-43)。デンドリマーの生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、高い
ペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の提示を活用して、安定
性を改善し、非特異的な相互作用を減らすことができる。
遺伝子を細胞に導入及び発現させる方法は、当技術分野で知られている。発現ベクター
の文脈において、ベクターは、当該分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動
物、細菌、酵母、又は昆虫の細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理
的、化学的、又は生物学的な手段によって宿主細胞に移入され得る。ポリヌクレオチドを
宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微
粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が挙げられる。ベクター
及び/又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。例
えば、Sambrookら(2001,Molecular Cloning:A La
boratory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory,New York)を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入す
るための好ましい方法は、リン酸カルシウムのトランスフェクションである。目的のポリ
ヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、DNA及びRNAベク
ターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、ヒト細胞
等の哺乳動物に遺伝子を挿入するため最も広く使用されている方法となった。他のウイル
スベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウ
イルス、及びアデノ随伴ウイルス等に由来してもよい。例えば、米国特許第5,350,
674号及び同第5,585,362号の明細書を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿
主細胞に導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフ
ェア、ビーズ等のコロイド分散系、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及
びリポソームを含む脂質ベース系が挙げられる。in vitro及びin vivoで
送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜
小胞)である。
の文脈において、ベクターは、当該分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動
物、細菌、酵母、又は昆虫の細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理
的、化学的、又は生物学的な手段によって宿主細胞に移入され得る。ポリヌクレオチドを
宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微
粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が挙げられる。ベクター
及び/又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。例
えば、Sambrookら(2001,Molecular Cloning:A La
boratory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory,New York)を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入す
るための好ましい方法は、リン酸カルシウムのトランスフェクションである。目的のポリ
ヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、DNA及びRNAベク
ターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、ヒト細胞
等の哺乳動物に遺伝子を挿入するため最も広く使用されている方法となった。他のウイル
スベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウ
イルス、及びアデノ随伴ウイルス等に由来してもよい。例えば、米国特許第5,350,
674号及び同第5,585,362号の明細書を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿
主細胞に導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフ
ェア、ビーズ等のコロイド分散系、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及
びリポソームを含む脂質ベース系が挙げられる。in vitro及びin vivoで
送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜
小胞)である。
2.7 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の遺伝子改変細胞、又は遺伝子改変細胞の
集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、
既知の技術に従って調製され得る。例えば、Remington,The Scienc
e And Practice of Pharmacy(21sted.2005)を
参照されたい。本開示による医薬製剤の製造において、細胞は典型的には薬学的に許容可
能な担体と混合され、得られた組成物は被験体に投与される。担体は、もちろん、製剤中
の他の成分と適合性があるという意味で許容可能でなければならず、被験体に有害であっ
てはならない。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、被験体の疾患の治療に
有用な1つ以上の追加の薬剤を更に含む。追加の実施形態では、遺伝子改変細胞が遺伝子
改変ヒトT細胞又はNK細胞(又はそれに由来する細胞)である場合、本開示の医薬組成
物は、in vivoでの細胞増殖及び生着を促進するサイトカイン(例えばIL-2、
IL-7、IL-15、及び/又はIL-21)等の生体分子を更に含む。本開示の遺伝
子改変細胞を含む医薬組成物を、追加の薬剤又は生体分子と同じ組成物で投与してもよく
、又は代替的に別の組成物で同時投与してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の遺伝子改変細胞、又は遺伝子改変細胞の
集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、
既知の技術に従って調製され得る。例えば、Remington,The Scienc
e And Practice of Pharmacy(21sted.2005)を
参照されたい。本開示による医薬製剤の製造において、細胞は典型的には薬学的に許容可
能な担体と混合され、得られた組成物は被験体に投与される。担体は、もちろん、製剤中
の他の成分と適合性があるという意味で許容可能でなければならず、被験体に有害であっ
てはならない。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、被験体の疾患の治療に
有用な1つ以上の追加の薬剤を更に含む。追加の実施形態では、遺伝子改変細胞が遺伝子
改変ヒトT細胞又はNK細胞(又はそれに由来する細胞)である場合、本開示の医薬組成
物は、in vivoでの細胞増殖及び生着を促進するサイトカイン(例えばIL-2、
IL-7、IL-15、及び/又はIL-21)等の生体分子を更に含む。本開示の遺伝
子改変細胞を含む医薬組成物を、追加の薬剤又は生体分子と同じ組成物で投与してもよく
、又は代替的に別の組成物で同時投与してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、T細胞養子免疫療法により標的化さ
れ得る任意の疾患状態の治療に有用である。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は
、癌の治療における免疫療法として有用である。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉
腫、芽細胞腫、白血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫
、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙
げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、B
系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリ
ンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物及び医薬で治療され
得る癌の非限定的な例は、B細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、
横紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌(gastric cancer)、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、
頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌
、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胃癌(stomach cancer)、精巣癌、子宮癌、
卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌
、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌
、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系
(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍(spinal
axis tumor)、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上
皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリ
ンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白
血病、免疫芽球性大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞
リンパ腫、T細胞リンパ腫、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定
されない、癌腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍である。
特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、B細胞系の急性リンパ芽球性白血病、B
細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、前駆B
ALL(小児適応症)、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バ
ーキットリンパ腫、及びB細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されな
い。
れ得る任意の疾患状態の治療に有用である。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は
、癌の治療における免疫療法として有用である。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉
腫、芽細胞腫、白血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫
、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙
げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、B
系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリ
ンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物及び医薬で治療され
得る癌の非限定的な例は、B細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、
横紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌(gastric cancer)、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、
頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌
、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胃癌(stomach cancer)、精巣癌、子宮癌、
卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌
、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌
、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系
(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍(spinal
axis tumor)、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上
皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリ
ンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白
血病、免疫芽球性大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞
リンパ腫、T細胞リンパ腫、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定
されない、癌腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍である。
特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、B細胞系の急性リンパ芽球性白血病、B
細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、前駆B
ALL(小児適応症)、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バ
ーキットリンパ腫、及びB細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されな
い。
本開示の遺伝子改変細胞で癌を治療するこれらの実施形態のいくつかでは、遺伝子改変
細胞が投与された被験体に、放射線、手術、又は化学療法剤等の追加の治療を更に適用す
る。
細胞が投与された被験体に、放射線、手術、又は化学療法剤等の追加の治療を更に適用す
る。
本発明はさらに、本明細書に記載される複数の遺伝子改変細胞を含む遺伝子改変細胞の
集団を提供する。かかる遺伝子改変細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体等
の操作された抗原受容体をコードする核酸分子、及びRNA干渉分子等の阻害性核酸分子
をそれらのゲノム中に含み得る。また、かかる遺伝子改変細胞は、キメラ抗原受容体又は
外因性T細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子をそれらのゲノム中
に含むことができ、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又はCD52の細
胞表面発現が低下しており、必ずしも発明の特定の核酸分子を含まない。したがって、本
発明の様々な実施形態では、遺伝子改変細胞の集団が提供され、該集団中の細胞の少なく
とも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30
%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少な
くとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも7
5%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は最大1
00%が、本明細書に記載される遺伝子改変細胞である。
集団を提供する。かかる遺伝子改変細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体等
の操作された抗原受容体をコードする核酸分子、及びRNA干渉分子等の阻害性核酸分子
をそれらのゲノム中に含み得る。また、かかる遺伝子改変細胞は、キメラ抗原受容体又は
外因性T細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子をそれらのゲノム中
に含むことができ、ベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子、又はCD52の細
胞表面発現が低下しており、必ずしも発明の特定の核酸分子を含まない。したがって、本
発明の様々な実施形態では、遺伝子改変細胞の集団が提供され、該集団中の細胞の少なく
とも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30
%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少な
くとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも7
5%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は最大1
00%が、本明細書に記載される遺伝子改変細胞である。
2.8 遺伝子改変細胞の投与方法
本明細書に開示される別の態様は、それを必要とする被験体への本開示の遺伝子改変細
胞の投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、それを必要
とする被験体に投与される。例えば、細胞表面キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する、有効量の本発明の遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集団を、疾患を有す
る被験体に投与することができる。特定の実施形態では、疾患は、B細胞起源の癌等の癌
であってもよい。したがって、本開示はまた、哺乳動物にCAR T細胞を投与する工程
を含む、哺乳動物の標的細胞集団又は組織にT細胞媒介性免疫応答を提供する方法も提供
し、ここで、CARは、腫瘍抗原等の所定の標的と特異的に相互作用する細胞外リガンド
結合ドメインと、CD3ζ等の少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメ
インと、任意に、1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。投与されたCAR
T細胞は、レシピエントにおいて増殖を抑え、数を減らし、標的細胞を殺傷することがで
きる。抗体療法とは異なり、本開示の遺伝子改変細胞は、in vivoで複製及び拡大
することができ、その結果、疾患の持続的制御につながる可能性のある長期持続性がもた
らされる。
本明細書に開示される別の態様は、それを必要とする被験体への本開示の遺伝子改変細
胞の投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、それを必要
とする被験体に投与される。例えば、細胞表面キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体
を発現する、有効量の本発明の遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集団を、疾患を有す
る被験体に投与することができる。特定の実施形態では、疾患は、B細胞起源の癌等の癌
であってもよい。したがって、本開示はまた、哺乳動物にCAR T細胞を投与する工程
を含む、哺乳動物の標的細胞集団又は組織にT細胞媒介性免疫応答を提供する方法も提供
し、ここで、CARは、腫瘍抗原等の所定の標的と特異的に相互作用する細胞外リガンド
結合ドメインと、CD3ζ等の少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメ
インと、任意に、1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。投与されたCAR
T細胞は、レシピエントにおいて増殖を抑え、数を減らし、標的細胞を殺傷することがで
きる。抗体療法とは異なり、本開示の遺伝子改変細胞は、in vivoで複製及び拡大
することができ、その結果、疾患の持続的制御につながる可能性のある長期持続性がもた
らされる。
阻害性核酸分子がヒトベータ2ミクログロブリン又はMHCクラスI分子の構成要素に
対するものである例、又はベータ2ミクログロブリン若しくはMHCクラスI分子が他の
方法で低下している例では、かかるCAR T細胞の拡大及び/又は持続性は、野生型レ
ベルのベータ2ミクログロブリン若しくはMHCクラスI分子を有するCAR T細胞、
又は細胞表面のベータ2ミクログロブリン若しくはMHCクラスIの発現を有さないCA
R T細胞と比較した場合、被験体において増強され得る。さらに、野生型レベルのベー
タ2ミクログロブリン及びMHCクラスI分子の細胞表面発現を有するCAR T細胞と
比較した場合、CAR T細胞の同種異系性を低下させることができる。これらの有利な
特徴は、細胞表面のベータ2ミクログロブリン(及びその結果としてMHCクラスI分子
)が野生型発現のわずかな割合まで不完全に低下されることに起因し、これは、NK細胞
の回避ではなく同種異系性の減少を可能とし、そうでない場合にはベータ2ミクログロブ
リン陰性細胞を標的とする。
対するものである例、又はベータ2ミクログロブリン若しくはMHCクラスI分子が他の
方法で低下している例では、かかるCAR T細胞の拡大及び/又は持続性は、野生型レ
ベルのベータ2ミクログロブリン若しくはMHCクラスI分子を有するCAR T細胞、
又は細胞表面のベータ2ミクログロブリン若しくはMHCクラスIの発現を有さないCA
R T細胞と比較した場合、被験体において増強され得る。さらに、野生型レベルのベー
タ2ミクログロブリン及びMHCクラスI分子の細胞表面発現を有するCAR T細胞と
比較した場合、CAR T細胞の同種異系性を低下させることができる。これらの有利な
特徴は、細胞表面のベータ2ミクログロブリン(及びその結果としてMHCクラスI分子
)が野生型発現のわずかな割合まで不完全に低下されることに起因し、これは、NK細胞
の回避ではなく同種異系性の減少を可能とし、そうでない場合にはベータ2ミクログロブ
リン陰性細胞を標的とする。
可能な投与経路の例としては、非経口(例えば、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮
内、皮下(SC)、又は注入)投与が挙げられる。さらに、投与は、持続注入、又は単回
若しくは複数回のボーラス投与によるものであってもよい。特定の実施形態では、薬剤の
一方又は両方が、約12時間、6時間、4時間、3時間、2時間、又は1時間未満の期間
に亘って注入される。さらに他の実施形態では、注入は最初はゆっくり起こり、その後、
経時的に増加する。
内、皮下(SC)、又は注入)投与が挙げられる。さらに、投与は、持続注入、又は単回
若しくは複数回のボーラス投与によるものであってもよい。特定の実施形態では、薬剤の
一方又は両方が、約12時間、6時間、4時間、3時間、2時間、又は1時間未満の期間
に亘って注入される。さらに他の実施形態では、注入は最初はゆっくり起こり、その後、
経時的に増加する。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変真核細胞又はその集団は、癌を治療する
目的で腫瘍抗原を標的とする。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白
血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸
癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これ
らに限定されない。特定の実施形態では、癌及び障害としては、pre-B ALL(小
児適応症)、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、同
種骨髄移植後のサルベージ等が含挙げられるが、これらに限定されない。これらのがんは
、例えば、CD19、CD20、CD22、及び/又はROR1を標的とするCARの組
み合わせを使用して治療され得る。いくつかの非限定的な例では、本開示の遺伝子改変真
核細胞又はその集団は、B細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、横
紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌(gastric cancer)、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭
頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、
結腸癌、直腸癌、肛門癌、胃癌(stomach cancer)、精巣癌、子宮癌、卵
管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小
腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小
児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系(C
NS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍(spinal a
xis tumor)、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌
、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ
腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病
、免疫芽球性大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リン
パ腫、T細胞リンパ腫、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定され
ない、癌腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍を標的とする
。特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、B細胞系の急性リンパ芽球性白血病、
B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、前駆
B ALL(小児適応症)、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、
バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、及びB細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
目的で腫瘍抗原を標的とする。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白
血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸
癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これ
らに限定されない。特定の実施形態では、癌及び障害としては、pre-B ALL(小
児適応症)、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、同
種骨髄移植後のサルベージ等が含挙げられるが、これらに限定されない。これらのがんは
、例えば、CD19、CD20、CD22、及び/又はROR1を標的とするCARの組
み合わせを使用して治療され得る。いくつかの非限定的な例では、本開示の遺伝子改変真
核細胞又はその集団は、B細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、横
紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌(gastric cancer)、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭
頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、
結腸癌、直腸癌、肛門癌、胃癌(stomach cancer)、精巣癌、子宮癌、卵
管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小
腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小
児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系(C
NS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍(spinal a
xis tumor)、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌
、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ
腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病
、免疫芽球性大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リン
パ腫、T細胞リンパ腫、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定され
ない、癌腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍を標的とする
。特定の実施形態では、B細胞起源の癌としては、B細胞系の急性リンパ芽球性白血病、
B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、前駆
B ALL(小児適応症)、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、
バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、及びB細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
「有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、
年齢、体重、腫瘍サイズ(存在する場合)、感染又は転移の程度、及び患者(被験体)の
状態の個人差を考慮して医師が決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細
書に記載される遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、それらの範囲内の全ての整数値を含
む104細胞/kg体重~109細胞/kg体重の投薬量で投与される。さらなる実施形
態では、投与量は、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、105細胞/kg体重~1
06細胞/kg体重である。いくつかの実施形態では、細胞組成物はこれらの投与量で複
数回投与される。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用することによ
り投与され得る(例えば、RosenbergらNew Eng.J.of Med.3
19:1676,1988を参照されたい)。特定の患者に対する最適な投薬量及び治療
計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することにより
、医学の当業者によって容易に決定され得る。
年齢、体重、腫瘍サイズ(存在する場合)、感染又は転移の程度、及び患者(被験体)の
状態の個人差を考慮して医師が決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細
書に記載される遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、それらの範囲内の全ての整数値を含
む104細胞/kg体重~109細胞/kg体重の投薬量で投与される。さらなる実施形
態では、投与量は、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、105細胞/kg体重~1
06細胞/kg体重である。いくつかの実施形態では、細胞組成物はこれらの投与量で複
数回投与される。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用することによ
り投与され得る(例えば、RosenbergらNew Eng.J.of Med.3
19:1676,1988を参照されたい)。特定の患者に対する最適な投薬量及び治療
計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することにより
、医学の当業者によって容易に決定され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞の投与は、標的の疾患又は状態の少
なくとも1つの症状を軽減する。例えば、本開示の遺伝子改変細胞の投与は、B細胞起源
の癌等の癌の少なくとも1つの症状を軽減することができる。B細胞起源の癌等の癌の症
状は、当技術分野でよく知られており、既知の技術によって決定され得る。
なくとも1つの症状を軽減する。例えば、本開示の遺伝子改変細胞の投与は、B細胞起源
の癌等の癌の少なくとも1つの症状を軽減することができる。B細胞起源の癌等の癌の症
状は、当技術分野でよく知られており、既知の技術によって決定され得る。
実験
この開示は、以下の実施例により更に説明されるが、これらの実施例は限定と解釈され
るべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の
物質及び手順に対する多数の同等物を認識又は確認することができる。かかる同等物は、
以下の実施例に続く特許請求の範囲に含まれることが意図される。
この開示は、以下の実施例により更に説明されるが、これらの実施例は限定と解釈され
るべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の
物質及び手順に対する多数の同等物を認識又は確認することができる。かかる同等物は、
以下の実施例に続く特許請求の範囲に含まれることが意図される。
実施例1 B2Mノックアウト初代ヒトT細胞のNK細胞殺傷
1.方法及び材料
5%ウシ胎仔血清を添加したXVIVO-15培地(Lonza)において、IL-2
(Gibco)の存在下で、ImmunoCult抗CD2/CD3/CD28(Ste
mCell Technologies)を使用して、初代ヒトT細胞を3日間刺激した
。4D Nucleofector(Lonza)を使用して、B2M13-14x47
9ヌクレアーゼをコードするRNAをT細胞に導入した。ビオチン化抗ヒトB2M(Bi
oLegend)及びBiotin Selection Kit(StemCell
Technologies)を使用して、残存するB2M+細胞を磁気的に枯渇させる前
に、細胞をIL-2の存在下で6日間培養した。NK細胞を、CD56陽性選択キット(
StemCell Technologies)を使用して、同じドナーのPBMCサン
プルから単離した。ダウディ細胞をATCCから購入した。ダウディ細胞は本来B2M-
であり、NK細胞溶解に非常に感受性であると報告されている。全ての標的細胞を1uM
CellTrace Violet(LifeTechnologies)で標識し、
混合培養においてエフェクターと区別した。単離されたNK細胞を、エフェクター:標的
比2:1、1:1、0.5:1及び0:1で、自己B2M+T細胞標的(NK細胞溶解に
対する陰性対照)ダウディ標的(NK細胞溶解に対して陽性対照)、又は自己B2M K
O T細胞標的(実験サンプル)のいずれかと混合した。共培養の2時間後に殺傷を評価
した。NK細胞による殺傷を、CaspACE-VAD-FMK(Promega)で染
色することにより測定した。
1.方法及び材料
5%ウシ胎仔血清を添加したXVIVO-15培地(Lonza)において、IL-2
(Gibco)の存在下で、ImmunoCult抗CD2/CD3/CD28(Ste
mCell Technologies)を使用して、初代ヒトT細胞を3日間刺激した
。4D Nucleofector(Lonza)を使用して、B2M13-14x47
9ヌクレアーゼをコードするRNAをT細胞に導入した。ビオチン化抗ヒトB2M(Bi
oLegend)及びBiotin Selection Kit(StemCell
Technologies)を使用して、残存するB2M+細胞を磁気的に枯渇させる前
に、細胞をIL-2の存在下で6日間培養した。NK細胞を、CD56陽性選択キット(
StemCell Technologies)を使用して、同じドナーのPBMCサン
プルから単離した。ダウディ細胞をATCCから購入した。ダウディ細胞は本来B2M-
であり、NK細胞溶解に非常に感受性であると報告されている。全ての標的細胞を1uM
CellTrace Violet(LifeTechnologies)で標識し、
混合培養においてエフェクターと区別した。単離されたNK細胞を、エフェクター:標的
比2:1、1:1、0.5:1及び0:1で、自己B2M+T細胞標的(NK細胞溶解に
対する陰性対照)ダウディ標的(NK細胞溶解に対して陽性対照)、又は自己B2M K
O T細胞標的(実験サンプル)のいずれかと混合した。共培養の2時間後に殺傷を評価
した。NK細胞による殺傷を、CaspACE-VAD-FMK(Promega)で染
色することにより測定した。
2.結果
NK細胞は、自己B2M+標的において薄暗いVAD-FMKシグナルのみを誘発し、
活性カスパーゼによる低レベルのアポトーシス誘導を示す(図2A~図2D)。それに比
べて、高いVAD-FMKシグナルがクラスI-ダウディ細胞の大部分で誘導され(71
%~83%、図2I~図2L)、広範なカスパーゼカスケード活性化を示す。同様に、B
2M-自己T細胞は、NKの遭遇に応答して高いVAD-FMKシグナルを回復し(19
%~47%、図2E~図2H)、これは、カスパーゼを介したアポトーシス誘導の指標で
ある。これらの結果のグラフによる要約を図3に示す。
NK細胞は、自己B2M+標的において薄暗いVAD-FMKシグナルのみを誘発し、
活性カスパーゼによる低レベルのアポトーシス誘導を示す(図2A~図2D)。それに比
べて、高いVAD-FMKシグナルがクラスI-ダウディ細胞の大部分で誘導され(71
%~83%、図2I~図2L)、広範なカスパーゼカスケード活性化を示す。同様に、B
2M-自己T細胞は、NKの遭遇に応答して高いVAD-FMKシグナルを回復し(19
%~47%、図2E~図2H)、これは、カスパーゼを介したアポトーシス誘導の指標で
ある。これらの結果のグラフによる要約を図3に示す。
3.結論
操作されたメガヌクレアーゼを使用した細胞表面B2Mの完全なノックアウトは、初代
ヒトT細胞をNK細胞の攻撃と殺傷に対して感作する。
操作されたメガヌクレアーゼを使用した細胞表面B2Mの完全なノックアウトは、初代
ヒトT細胞をNK細胞の攻撃と殺傷に対して感作する。
実施例2 B2Mに対する候補shRNAの特性評価及び初代ヒトT細胞のNK細胞殺傷
に対するB2Mノックダウンの効果
1.材料及び方法
異なるB2Mターゲティング配列をコードする5つのMission-shRNAレン
チウイルストランスファープラスミドを、Sigma-Aldrichから購入した。第
2世代のレンチウイルスベクターを、Lenti-X 293T細胞(ClonTech
)とトリプルトランスフェクション法(Lipofectamine2000-Ther
mo-Fisher)を使用して社内で作製した。T細胞を、実施例1のようにImmu
noCult抗CD2/CD3/CD28で3日間刺激することにより、レンチウイルス
形質導入用に調製した。形質導入を5μMポリブレン(Sigma-Aldritch)
の存在下で行って、形質導入後48時間で開始し、薬物添加後72時間で終了して、ピュ
ーロマイシン(InVivoGen)で形質導入細胞を選択した。ノックダウンの程度を
決定するため、B2M表面発現のフローサイトメトリー分析の前に、選択された細胞をI
L-2添加培地で5日間拡大させた。B2M shRNAを受け取った培養物は、NK及
びCTLの殺傷アッセイの標的として使用した。NK殺傷アッセイを、実施例1に記載さ
れるように実施したが、K562細胞株をNK細胞溶解の陽性対照として使用した。CT
L殺傷アッセイでは、標的細胞のドナーとは無関係のドナーからのCD8+T細胞を単離
し、エフェクターとして使用した。NK殺傷アッセイを2時間実行し、CTLアッセイを
6時間実行した。両方のアッセイについて、標的細胞を1uM CellTrace V
iolet(Life Technologies)で標識し、CaspACE-VAD
-FMK(Promega)を使用して死滅を測定した。
に対するB2Mノックダウンの効果
1.材料及び方法
異なるB2Mターゲティング配列をコードする5つのMission-shRNAレン
チウイルストランスファープラスミドを、Sigma-Aldrichから購入した。第
2世代のレンチウイルスベクターを、Lenti-X 293T細胞(ClonTech
)とトリプルトランスフェクション法(Lipofectamine2000-Ther
mo-Fisher)を使用して社内で作製した。T細胞を、実施例1のようにImmu
noCult抗CD2/CD3/CD28で3日間刺激することにより、レンチウイルス
形質導入用に調製した。形質導入を5μMポリブレン(Sigma-Aldritch)
の存在下で行って、形質導入後48時間で開始し、薬物添加後72時間で終了して、ピュ
ーロマイシン(InVivoGen)で形質導入細胞を選択した。ノックダウンの程度を
決定するため、B2M表面発現のフローサイトメトリー分析の前に、選択された細胞をI
L-2添加培地で5日間拡大させた。B2M shRNAを受け取った培養物は、NK及
びCTLの殺傷アッセイの標的として使用した。NK殺傷アッセイを、実施例1に記載さ
れるように実施したが、K562細胞株をNK細胞溶解の陽性対照として使用した。CT
L殺傷アッセイでは、標的細胞のドナーとは無関係のドナーからのCD8+T細胞を単離
し、エフェクターとして使用した。NK殺傷アッセイを2時間実行し、CTLアッセイを
6時間実行した。両方のアッセイについて、標的細胞を1uM CellTrace V
iolet(Life Technologies)で標識し、CaspACE-VAD
-FMK(Promega)を使用して死滅を測定した。
2.結果
B2M発現の干渉についてヒトT細胞で5つのshRNAをスクリーニングした。2つ
の配列は、サイトメトリー分析でB2Mの平均蛍光強度を低下しなかった(表示していな
い)。3つのshRNA配列はB2M発現のMFIを減少させ、配列254及び配列25
5はMFIをおよそ50%減少させ、配列472はMFIをおよそ95%減少させた(図
4)。
B2M発現の干渉についてヒトT細胞で5つのshRNAをスクリーニングした。2つ
の配列は、サイトメトリー分析でB2Mの平均蛍光強度を低下しなかった(表示していな
い)。3つのshRNA配列はB2M発現のMFIを減少させ、配列254及び配列25
5はMFIをおよそ50%減少させ、配列472はMFIをおよそ95%減少させた(図
4)。
次に、変化したB2M発現を示す、CTL及びNKの殺傷の標的を測定した。CTLで
はなく、NK細胞がクラスI欠損K562細胞でカスパーゼ活性化(VAD-FMKシグ
ナルで測定)を誘導した(46%vs.5%-図5A及び図5B)。逆に、CTLはミス
マッチB2M+T細胞においてカスパーゼ活性化を誘導し(32%)、NK細胞はミスマ
ッチT細胞のより頻度が低いシグナルを誘導した(14%)(図5C及び図5D)。B2
M抗原密度の50%減少を示すT細胞標的では、NK細胞は標的の17%でカスパーゼ活
性を誘導したが、ミスマッチCTLは標的の36%で誘導した(図6A及び図6B)。B
2Mレベルの95%ノックダウンを示すT細胞標的では、NK細胞は標的の16%でカス
パーゼ活性化を誘導したが、ミスマッチCTLは標的の20.8%で誘導した(図5C及
び図5D)。
はなく、NK細胞がクラスI欠損K562細胞でカスパーゼ活性化(VAD-FMKシグ
ナルで測定)を誘導した(46%vs.5%-図5A及び図5B)。逆に、CTLはミス
マッチB2M+T細胞においてカスパーゼ活性化を誘導し(32%)、NK細胞はミスマ
ッチT細胞のより頻度が低いシグナルを誘導した(14%)(図5C及び図5D)。B2
M抗原密度の50%減少を示すT細胞標的では、NK細胞は標的の17%でカスパーゼ活
性を誘導したが、ミスマッチCTLは標的の36%で誘導した(図6A及び図6B)。B
2Mレベルの95%ノックダウンを示すT細胞標的では、NK細胞は標的の16%でカス
パーゼ活性化を誘導したが、ミスマッチCTLは標的の20.8%で誘導した(図5C及
び図5D)。
3.結論
B2M発現は、ウイルスベクターによって送達されるshRNAを使用して効果的にノ
ックダウンされ得る。カスパーゼ(VAD-FMK)活性を使用してNK細胞又はCTL
による標的細胞のアポトーシス誘導を測定すると、両方のB2Mノックダウンの標的が操
作されていない標的と同じVAD-FMK頻度を示し、K562標的よりも少ないVAD
-FMKシグナルを示したことから、B2MノックダウンはNK細胞溶解に対する標的の
感受性を変化させないことが特定された。さらに、shRNA 472群のVAD-FM
K+標的の頻度が陽性対照で観察された頻度のおよそ半分であったことから、B2Mノッ
クダウンはCTL細胞溶解に対していくらかの保護を与える。実際、ノックダウンの程度
とNK細胞からのCTL活性に対する保護の程度との間には直接的な関係があった。
B2M発現は、ウイルスベクターによって送達されるshRNAを使用して効果的にノ
ックダウンされ得る。カスパーゼ(VAD-FMK)活性を使用してNK細胞又はCTL
による標的細胞のアポトーシス誘導を測定すると、両方のB2Mノックダウンの標的が操
作されていない標的と同じVAD-FMK頻度を示し、K562標的よりも少ないVAD
-FMKシグナルを示したことから、B2MノックダウンはNK細胞溶解に対する標的の
感受性を変化させないことが特定された。さらに、shRNA 472群のVAD-FM
K+標的の頻度が陽性対照で観察された頻度のおよそ半分であったことから、B2Mノッ
クダウンはCTL細胞溶解に対していくらかの保護を与える。実際、ノックダウンの程度
とNK細胞からのCTL活性に対する保護の程度との間には直接的な関係があった。
実施例3 B2Mの細胞表面発現を減少させるためのshRNAを利用したCAR T細
胞の生産及び特性評価
1.材料及び方法
抗CD19 CARコード配列と、B2Mに対するshRNAとを含む多くのコンスト
ラクトを調製した。これらは図7A~図7Fに示されており、配列番号18~配列番号2
3で提供される。CARコンストラクトの7007及び7217(配列番号18及び配列
番号19)は、同じ5´から3´方向のCARコード配列及びshRNA472配列を含
む。CARコンストラクトの7008及び7218(配列番号20及び配列番号21)は
、3´から5´方向のCARコード配列、及び5´から3´方向(すなわち、tail-
to-tail)のshRNA472配列を含む。CARコンストラクトの7009及び
7219(配列番号22及び配列番号23)は、CARコード配列と3´から5´方向の
shRNA472配列の両方を含む。CARコード配列及びshRNA472配列に隣接
する5´及び3´の相同性アームは、TRAC遺伝子座のTRC1-2認識配列の上流及
び下流の領域と相同性がある。
胞の生産及び特性評価
1.材料及び方法
抗CD19 CARコード配列と、B2Mに対するshRNAとを含む多くのコンスト
ラクトを調製した。これらは図7A~図7Fに示されており、配列番号18~配列番号2
3で提供される。CARコンストラクトの7007及び7217(配列番号18及び配列
番号19)は、同じ5´から3´方向のCARコード配列及びshRNA472配列を含
む。CARコンストラクトの7008及び7218(配列番号20及び配列番号21)は
、3´から5´方向のCARコード配列、及び5´から3´方向(すなわち、tail-
to-tail)のshRNA472配列を含む。CARコンストラクトの7009及び
7219(配列番号22及び配列番号23)は、CARコード配列と3´から5´方向の
shRNA472配列の両方を含む。CARコード配列及びshRNA472配列に隣接
する5´及び3´の相同性アームは、TRAC遺伝子座のTRC1-2認識配列の上流及
び下流の領域と相同性がある。
CAR T細胞は、TRC1-2認識配列で二本鎖切断を誘導し、T細胞のゲノムへの
コンストラクトの標的挿入を促進するためのTRC1-2x87EEをコードするmRN
Aの同時ヌクレオフェクションにより、上記のCAR/shRNAコンストラクトの1つ
を含む組換えAAVベクターで形質導入された初代ドナーヒトT細胞を使用して調製され
る。第1及び第2の発現カセットのどの方向が、細胞表面で最も一貫したレベルのB2M
ノックダウンと共に、最も高い及び/又は最も一貫したCAR発現をもたらすかを判断す
るため、上記のようにベータ2ミクログロブリン発現を判定する。
コンストラクトの標的挿入を促進するためのTRC1-2x87EEをコードするmRN
Aの同時ヌクレオフェクションにより、上記のCAR/shRNAコンストラクトの1つ
を含む組換えAAVベクターで形質導入された初代ドナーヒトT細胞を使用して調製され
る。第1及び第2の発現カセットのどの方向が、細胞表面で最も一貫したレベルのB2M
ノックダウンと共に、最も高い及び/又は最も一貫したCAR発現をもたらすかを判断す
るため、上記のようにベータ2ミクログロブリン発現を判定する。
特定のコンストラクトで産生されたCAR T細胞は、前述の同種異系性とNK細胞殺
傷の両方のアッセイで評価する。さらに、細胞の増殖/拡大及び細胞毒性の可能性の変化
を判断するため、開示されるコンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞を、C
AR T細胞が抗原に繰り返し曝露される、様々なストレス試験で評価する。開示される
コンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞はまた、動物において腫瘍細胞を排
除する能力を判断し、in vivoで持続するそれらの能力を評価するため、in v
ivo腫瘍モデルで利用される。本明細書に記載される実施例に基づいて、細胞表面ベー
タ2ミクログロブリンのノックダウンが減少しているが不完全であるCAR T細胞は、
完全にB2M陰性であるCAR T細胞と比較した場合、in vivoでより大きな持
続性及び/又は増強された拡大を有し、NK細胞殺傷の影響を受けやすい可能性があると
予想される。
傷の両方のアッセイで評価する。さらに、細胞の増殖/拡大及び細胞毒性の可能性の変化
を判断するため、開示されるコンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞を、C
AR T細胞が抗原に繰り返し曝露される、様々なストレス試験で評価する。開示される
コンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞はまた、動物において腫瘍細胞を排
除する能力を判断し、in vivoで持続するそれらの能力を評価するため、in v
ivo腫瘍モデルで利用される。本明細書に記載される実施例に基づいて、細胞表面ベー
タ2ミクログロブリンのノックダウンが減少しているが不完全であるCAR T細胞は、
完全にB2M陰性であるCAR T細胞と比較した場合、in vivoでより大きな持
続性及び/又は増強された拡大を有し、NK細胞殺傷の影響を受けやすい可能性があると
予想される。
特定の研究では、TCR陰性、CAR陽性であり、B2Mの細胞表面発現が低下したC
AR T細胞が調製された。CAR T細胞は、プロモータ駆動CARコード配列と、T
2Aエレメントと、1つ以上のプロモータ駆動B2M shRNAカセットとを含むドナ
ーテンプレートを使用して調製された。この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康
で、情報が知らされ、補償されているドナーから採取し、製造業者の指示(Stem C
ell Technologies)に従ってCD3陽性選択キットIIを使用してT細
胞を濃縮した。T細胞を、5%ウシ胎仔血清及び10ng/ml IL-2(Gibco
)を添加したX-VIVO 15培地(Lonza)でImmunoCult T細胞刺
激装置(抗CD2/CD3/CD28-Stem Cell Technologies
)を使用して活性化した。3日間の刺激の後、細胞を収集し、Lonza4D Nucl
eoFectorを使用して、以下の核酸種の混合物を用いて1e6細胞のサンプルをエ
レクトロポレーションした。
・T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン1に二本鎖切断を生じるTRC1-
2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA1μg
・TMEM173(STING)に特異的な100mM siRNA1.5μl
・ドナーテンプレートを含む直線化プラスミドDNA 1μg
この実験では、B2M表面発現をノックダウンする能力について3つの異なるCARコ
ンストラクトを分析した。3つのコンストラクトはいずれも、TRC1-2x.87EE
結合部位(TRC1-2認識部位と称される)に隣接するゲノム領域との相同性を使用し
て、T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入を指示し、いずれのコンストラ
クトもCD34エピトープタグ(検出用)を含むCARを発現する。コンストラクト70
02(配列番号11)はshRNA遺伝子をコードしない。コンストラクト7008(配
列番号20)は、shRNA472の1つのコピーをコードする。コンストラクト702
9(配列番号24)は、このshRNAカセットの2つのコピーをコードする。各shR
NAカセットからの発現は、U6プロモータによって駆動される。
AR T細胞が調製された。CAR T細胞は、プロモータ駆動CARコード配列と、T
2Aエレメントと、1つ以上のプロモータ駆動B2M shRNAカセットとを含むドナ
ーテンプレートを使用して調製された。この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康
で、情報が知らされ、補償されているドナーから採取し、製造業者の指示(Stem C
ell Technologies)に従ってCD3陽性選択キットIIを使用してT細
胞を濃縮した。T細胞を、5%ウシ胎仔血清及び10ng/ml IL-2(Gibco
)を添加したX-VIVO 15培地(Lonza)でImmunoCult T細胞刺
激装置(抗CD2/CD3/CD28-Stem Cell Technologies
)を使用して活性化した。3日間の刺激の後、細胞を収集し、Lonza4D Nucl
eoFectorを使用して、以下の核酸種の混合物を用いて1e6細胞のサンプルをエ
レクトロポレーションした。
・T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン1に二本鎖切断を生じるTRC1-
2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA1μg
・TMEM173(STING)に特異的な100mM siRNA1.5μl
・ドナーテンプレートを含む直線化プラスミドDNA 1μg
この実験では、B2M表面発現をノックダウンする能力について3つの異なるCARコ
ンストラクトを分析した。3つのコンストラクトはいずれも、TRC1-2x.87EE
結合部位(TRC1-2認識部位と称される)に隣接するゲノム領域との相同性を使用し
て、T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入を指示し、いずれのコンストラ
クトもCD34エピトープタグ(検出用)を含むCARを発現する。コンストラクト70
02(配列番号11)はshRNA遺伝子をコードしない。コンストラクト7008(配
列番号20)は、shRNA472の1つのコピーをコードする。コンストラクト702
9(配列番号24)は、このshRNAカセットの2つのコピーをコードする。各shR
NAカセットからの発現は、U6プロモータによって駆動される。
5%FBS及び30ng/mlのIL-2を添加したX-VIVO15培地で更に10
日間細胞培養を維持した。ヌクレオフェクション後4日、7日、10日に培養物を採取し
、CD3(抗CD3-BV711、BioLegend)、CD34(抗CD34-PE
、LifeTechnologies)、及びB2M(抗B2M-APC、BioLeg
end)の表面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータを、Beckma
n-Coulter CytoFLEX-LXで取得した。
日間細胞培養を維持した。ヌクレオフェクション後4日、7日、10日に培養物を採取し
、CD3(抗CD3-BV711、BioLegend)、CD34(抗CD34-PE
、LifeTechnologies)、及びB2M(抗B2M-APC、BioLeg
end)の表面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータを、Beckma
n-Coulter CytoFLEX-LXで取得した。
2.結果
B2M表面レベルを、対照CARコンストラクト(7002)、又はB2M特異的sh
RNAのコピーを1つ(7008)若しくは2つ(7029)発現するCARコンストラ
クトでヌクレオフェクトしたサンプルで測定した(図12)。7002(対照)及び70
08(単一shRNA)を発現する細胞のCD3-/CD34+集団を比較すると、70
08発現細胞はわずかに低いレベルの表面B2Mを示すことが観察された(図12A)。
特に、コンストラクト7029(2つのshRNAコピー)でヌクレオフェクトした細胞
は、対照細胞(7002)の表面に提示されるB2Mの量のおよそ半分を示した(図12
B)。この観察は、CD3-/CD34+集団に特異的であったが、CD3-/CD34
-集団では観察されなかった(図12C)。
B2M表面レベルを、対照CARコンストラクト(7002)、又はB2M特異的sh
RNAのコピーを1つ(7008)若しくは2つ(7029)発現するCARコンストラ
クトでヌクレオフェクトしたサンプルで測定した(図12)。7002(対照)及び70
08(単一shRNA)を発現する細胞のCD3-/CD34+集団を比較すると、70
08発現細胞はわずかに低いレベルの表面B2Mを示すことが観察された(図12A)。
特に、コンストラクト7029(2つのshRNAコピー)でヌクレオフェクトした細胞
は、対照細胞(7002)の表面に提示されるB2Mの量のおよそ半分を示した(図12
B)。この観察は、CD3-/CD34+集団に特異的であったが、CD3-/CD34
-集団では観察されなかった(図12C)。
3.結論
事前にスクリーニングされたB2MターゲティングshRNAは、(T細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子座への標的挿入により)コンストラクトが送達された細胞の表面でB
2M発現レベルをノックダウンすることができる。B2M転写産物が豊富にあるため、こ
れらのデータは、単一のshRNAコピーが低レベルのB2Mノックダウンに十分である
可能性があることを示唆するが、より顕著なノックダウンを達成するにはshRNAカセ
ットの複数のコピーが必要となる可能性がある。
事前にスクリーニングされたB2MターゲティングshRNAは、(T細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子座への標的挿入により)コンストラクトが送達された細胞の表面でB
2M発現レベルをノックダウンすることができる。B2M転写産物が豊富にあるため、こ
れらのデータは、単一のshRNAコピーが低レベルのB2Mノックダウンに十分である
可能性があることを示唆するが、より顕著なノックダウンを達成するにはshRNAカセ
ットの複数のコピーが必要となる可能性がある。
実施例4 B2Mの細胞表面発現を減少させるためのshRNAを利用したCAR T細
胞の生産及び特性評価
1.材料及び方法
抗CD19 CARコード配列と、B2Mに対するshRNAとを含む多くのコンスト
ラクトを調製した。これらは図7A~図7Fに示されており、配列番号18~配列番号2
3で提供される。CARコンストラクトの7007及び7217(配列番号18及び配列
番号19)は、同じ5´から3´方向のCARコード配列及びshRNA472配列を含
む。CARコンストラクトの7008及び7218(配列番号20及び配列番号21)は
、3´から5´方向のCARコード配列、及び5´から3´方向(すなわち、tail-
to-tail)のshRNA472配列を含む。CARコンストラクトの7009及び
7219(配列番号22及び配列番号23)は、CARコード配列と3´から5´方向の
shRNA472配列の両方を含む。CARコンストラクトの7056、7059、及び
7060には、U6-shRNA遺伝子カセットの改変バージョンが含まれている。コン
ストラクトの7007~7009及び7217~7219のU6プロモータとヘアピン配
列との間に位置していたクローニング部位を除去した。コンストラクト7056は、CA
Rコード配列及び3´から5´方向のshRNA472配列を含む。コンストラクト70
56は、3´から5´方向のCARコード配列、及び5´から3´方向(tail-to
-tail)のshRNA472配列を含む。コンストラクト7060は、3´から5´
方向のCARコード配列、及び5´から3´方向のU6-shRNA472配列の2つの
コピーを含む。CARコード配列及びshRNA472配列に隣接する5´及び3´の相
同性アームは、T細胞受容体アルファ定常遺伝子座のTRC1-2認識配列の上流及び下
流の領域と相同性がある。
胞の生産及び特性評価
1.材料及び方法
抗CD19 CARコード配列と、B2Mに対するshRNAとを含む多くのコンスト
ラクトを調製した。これらは図7A~図7Fに示されており、配列番号18~配列番号2
3で提供される。CARコンストラクトの7007及び7217(配列番号18及び配列
番号19)は、同じ5´から3´方向のCARコード配列及びshRNA472配列を含
む。CARコンストラクトの7008及び7218(配列番号20及び配列番号21)は
、3´から5´方向のCARコード配列、及び5´から3´方向(すなわち、tail-
to-tail)のshRNA472配列を含む。CARコンストラクトの7009及び
7219(配列番号22及び配列番号23)は、CARコード配列と3´から5´方向の
shRNA472配列の両方を含む。CARコンストラクトの7056、7059、及び
7060には、U6-shRNA遺伝子カセットの改変バージョンが含まれている。コン
ストラクトの7007~7009及び7217~7219のU6プロモータとヘアピン配
列との間に位置していたクローニング部位を除去した。コンストラクト7056は、CA
Rコード配列及び3´から5´方向のshRNA472配列を含む。コンストラクト70
56は、3´から5´方向のCARコード配列、及び5´から3´方向(tail-to
-tail)のshRNA472配列を含む。コンストラクト7060は、3´から5´
方向のCARコード配列、及び5´から3´方向のU6-shRNA472配列の2つの
コピーを含む。CARコード配列及びshRNA472配列に隣接する5´及び3´の相
同性アームは、T細胞受容体アルファ定常遺伝子座のTRC1-2認識配列の上流及び下
流の領域と相同性がある。
特定の研究では、TCR陰性、CAR陽性であり、B2Mの細胞表面発現が低下したC
AR T細胞が調製された。CAR T細胞は、プロモータ駆動CARコード配列、及び
1つ以上のプロモータ駆動B2M shRNAカセットを含むドナーテンプレートを使用
して調製された。この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康で、情報が知らされ、
補償されているドナーから採取し、製造業者の指示(Stem Cell Techno
logies)に従ってCD3陽性選択キットIIを使用してT細胞を濃縮した。T細胞
を、5%ウシ胎仔血清及び10ng/ml IL-2(Gibco)を添加したX-VI
VO 15培地(Lonza)でImmunoCult T細胞刺激装置(抗CD2/C
D3/CD28-Stem Cell Technologies)を使用して活性化し
た。3日間の刺激の後、細胞を収集し、Lonza 4D NucleoFectorを
使用して、以下の核酸種の混合物を用いて1e6細胞のサンプルをエレクトロポレーショ
ンした。
・T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン1に二本鎖切断を生じるTRC1-
2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA1μg
・TMEM173(STING)に特異的な100mM siRNA1.5μl
・ドナーテンプレートを含む直線化プラスミドDNA 1μg
この実験では、B2M表面発現をノックダウンする能力について、4つの異なるCAR
コンストラクトを分析した。4つのコンストラクトはいずれも、TRC1-2x.87E
E認識部位に隣接するゲノム領域との相同性を使用して、T細胞受容体アルファ定常領域
遺伝子座への標的挿入を指示し、いずれのコンストラクトもCD34エピトープタグ(検
出用)を含むCARを発現する。コンストラクト7002(配列番号11)はshRNA
遺伝子をコードしない。コンストラクト7056(配列番号25)はshRNA472の
1つのコピーをコードし、いずれのカセットも3´から5´方向(head-to-ta
il)にある。コンストラクト7059(配列番号26)は、3´から5´方向のCAR
発現カセット、及び5´から3´方向shRNA472カセット(tail-to-ta
il)と共にこのshRNAカセットの1つのコピーをコードする。コンストラクト70
60(配列番号27)はコンストラクト7059と同じ向きであるが、shRNA472
カセットの2つのコピーをコードする(tail-to-tail)。各shRNAカセ
ットからの発現は、U6プロモータによって駆動される。細胞培養を、5%FBS及び3
0ng/mlのIL-2を添加したX-VIVO15培地で更に最大10日間維持した。
ヌクレオフェクション後4日、7日、及び/又は10日に培養物を採取し、CD3(抗C
D3-BV711、BioLegend)、CD34(抗CD34-PE、又はAPC、
LifeTechnologies)、B2M(抗B2M-APC、又はPE、BioL
egend)、及び/又はHLA-A、B、C(クローンW6/32、BV605)の表
面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータを、Beckman-Coul
ter CytoFLEX-LXで取得した。
AR T細胞が調製された。CAR T細胞は、プロモータ駆動CARコード配列、及び
1つ以上のプロモータ駆動B2M shRNAカセットを含むドナーテンプレートを使用
して調製された。この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康で、情報が知らされ、
補償されているドナーから採取し、製造業者の指示(Stem Cell Techno
logies)に従ってCD3陽性選択キットIIを使用してT細胞を濃縮した。T細胞
を、5%ウシ胎仔血清及び10ng/ml IL-2(Gibco)を添加したX-VI
VO 15培地(Lonza)でImmunoCult T細胞刺激装置(抗CD2/C
D3/CD28-Stem Cell Technologies)を使用して活性化し
た。3日間の刺激の後、細胞を収集し、Lonza 4D NucleoFectorを
使用して、以下の核酸種の混合物を用いて1e6細胞のサンプルをエレクトロポレーショ
ンした。
・T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン1に二本鎖切断を生じるTRC1-
2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA1μg
・TMEM173(STING)に特異的な100mM siRNA1.5μl
・ドナーテンプレートを含む直線化プラスミドDNA 1μg
この実験では、B2M表面発現をノックダウンする能力について、4つの異なるCAR
コンストラクトを分析した。4つのコンストラクトはいずれも、TRC1-2x.87E
E認識部位に隣接するゲノム領域との相同性を使用して、T細胞受容体アルファ定常領域
遺伝子座への標的挿入を指示し、いずれのコンストラクトもCD34エピトープタグ(検
出用)を含むCARを発現する。コンストラクト7002(配列番号11)はshRNA
遺伝子をコードしない。コンストラクト7056(配列番号25)はshRNA472の
1つのコピーをコードし、いずれのカセットも3´から5´方向(head-to-ta
il)にある。コンストラクト7059(配列番号26)は、3´から5´方向のCAR
発現カセット、及び5´から3´方向shRNA472カセット(tail-to-ta
il)と共にこのshRNAカセットの1つのコピーをコードする。コンストラクト70
60(配列番号27)はコンストラクト7059と同じ向きであるが、shRNA472
カセットの2つのコピーをコードする(tail-to-tail)。各shRNAカセ
ットからの発現は、U6プロモータによって駆動される。細胞培養を、5%FBS及び3
0ng/mlのIL-2を添加したX-VIVO15培地で更に最大10日間維持した。
ヌクレオフェクション後4日、7日、及び/又は10日に培養物を採取し、CD3(抗C
D3-BV711、BioLegend)、CD34(抗CD34-PE、又はAPC、
LifeTechnologies)、B2M(抗B2M-APC、又はPE、BioL
egend)、及び/又はHLA-A、B、C(クローンW6/32、BV605)の表
面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータを、Beckman-Coul
ter CytoFLEX-LXで取得した。
2.結果
B2M表面レベルを、対照CARコンストラクト(7002)、又はhead-to-
tail(7056)若しくはtail-to-tail(7059、7060)の構成
のいずれかでB2M特異的shRNAのコピーを1つ(7056又は7059)若しくは
2つ(7060)発現するCARコンストラクトでヌクレオフェクトしたサンプルで測定
した。U6プロモータとshRNA配列との間の以前のコンストラクトに存在していた制
限消化部位を、これらのshRNA472ベクターから除去した。パリンドローム制限消
化部位は、コンストラクトの有効性及びshRNAがB2Mをノックダウンする能力を妨
害すると仮定された。
B2M表面レベルを、対照CARコンストラクト(7002)、又はhead-to-
tail(7056)若しくはtail-to-tail(7059、7060)の構成
のいずれかでB2M特異的shRNAのコピーを1つ(7056又は7059)若しくは
2つ(7060)発現するCARコンストラクトでヌクレオフェクトしたサンプルで測定
した。U6プロモータとshRNA配列との間の以前のコンストラクトに存在していた制
限消化部位を、これらのshRNA472ベクターから除去した。パリンドローム制限消
化部位は、コンストラクトの有効性及びshRNAがB2Mをノックダウンする能力を妨
害すると仮定された。
7002(対照)及び7056(単一shRNA)を発現する細胞のCD3-/CD3
4+集団を比較すると、7056発現細胞はより低いレベルの表面B2Mを示すことが観
察された(77%ノックダウン)(図13A)。7059(単一コピー、tail-to
-tail)でヌクレオフェクトされた細胞は、7002対照細胞(図13B)と比較し
てB2Mの90.1%ノックダウンを示し、一方7060ヌクレオフェクション(2コピ
ー、tail-to-tail)は、7002対照と比較して92%ノックダウンをもた
らした(図13C)。
4+集団を比較すると、7056発現細胞はより低いレベルの表面B2Mを示すことが観
察された(77%ノックダウン)(図13A)。7059(単一コピー、tail-to
-tail)でヌクレオフェクトされた細胞は、7002対照細胞(図13B)と比較し
てB2Mの90.1%ノックダウンを示し、一方7060ヌクレオフェクション(2コピ
ー、tail-to-tail)は、7002対照と比較して92%ノックダウンをもた
らした(図13C)。
3.結論
事前にスクリーニングされたB2MターゲティングshRNAは、(T細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子座への標的挿入により)コンストラクトが送達された細胞の表面でB
2M発現レベルをノックダウンすることができる。U6プロモータとヘアピン配列との間
のクローニング部位を削除すると、B2Mのノックダウン効率が改善する。7008(t
ail-to-tail、1つのshRNA472カセット-図12A)は最小限のB2
Mノックダウンを支持し、7059(1つのカセット、tail-to-tail-図1
3B)は90%超のノックダウンを支持する。CD52特異的shRNAを使用して観察
されたように、CARプロモータ及びshRNAプロモータが異なる方向に向けられてい
る場合(tail-to-tail構成)、優れたノックダウンが観察された。第2のs
hRNA配列を追加しても、顕著な利点は得られなかった(92%対90.1%ノックダ
ウン)。
事前にスクリーニングされたB2MターゲティングshRNAは、(T細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子座への標的挿入により)コンストラクトが送達された細胞の表面でB
2M発現レベルをノックダウンすることができる。U6プロモータとヘアピン配列との間
のクローニング部位を削除すると、B2Mのノックダウン効率が改善する。7008(t
ail-to-tail、1つのshRNA472カセット-図12A)は最小限のB2
Mノックダウンを支持し、7059(1つのカセット、tail-to-tail-図1
3B)は90%超のノックダウンを支持する。CD52特異的shRNAを使用して観察
されたように、CARプロモータ及びshRNAプロモータが異なる方向に向けられてい
る場合(tail-to-tail構成)、優れたノックダウンが観察された。第2のs
hRNA配列を追加しても、顕著な利点は得られなかった(92%対90.1%ノックダ
ウン)。
実施例5 B2Mの細胞表面発現を減少させるためのshRNAを利用したCAR T細
胞の生産及び特性評価
1.材料及び方法
この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康で、情報が知らされ、補償されている
ドナーから採取し、製造業者の指示(Stem Cell Technologies)
に従ってCD3陽性選択キットIIを使用してT細胞を濃縮した。T細胞を、5%ウシ胎
仔血清及び10ng/ml IL-2(Gibco)を添加したX-VIVO15培地(
Lonza)でImmunoCult T細胞刺激装置(抗CD2/CD3/CD28-
Stem Cell Technologies)を使用して活性化した。3日間の刺激
の後、細胞を収集し、1e6細胞のサンプルをT細胞受容体α定常遺伝子座のTRC1-
2認識配列を認識して切断するTRC1-2L.1592メガヌクレアーゼをコードする
1ugのRNAでエレクトロポレーションし、25000ウイルスゲノム/細胞のMOI
でコンストラクト7056と共にパッケージされたAAVで形質導入した。
胞の生産及び特性評価
1.材料及び方法
この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康で、情報が知らされ、補償されている
ドナーから採取し、製造業者の指示(Stem Cell Technologies)
に従ってCD3陽性選択キットIIを使用してT細胞を濃縮した。T細胞を、5%ウシ胎
仔血清及び10ng/ml IL-2(Gibco)を添加したX-VIVO15培地(
Lonza)でImmunoCult T細胞刺激装置(抗CD2/CD3/CD28-
Stem Cell Technologies)を使用して活性化した。3日間の刺激
の後、細胞を収集し、1e6細胞のサンプルをT細胞受容体α定常遺伝子座のTRC1-
2認識配列を認識して切断するTRC1-2L.1592メガヌクレアーゼをコードする
1ugのRNAでエレクトロポレーションし、25000ウイルスゲノム/細胞のMOI
でコンストラクト7056と共にパッケージされたAAVで形質導入した。
細胞培養を、5%FBS及び30ng/mlのIL-2を添加したX-VIVO15培
地で更に最大10日間維持した。ヌクレオフェクション後4日、7日、及び/又は10日
に培養物を採取し、CD3(抗CD3-PE、BioLegend)、(AlexaFl
uor488に複合化された抗FMC63抗CARクローンVM16)、B2M(抗B2
M-APC、又はPE、BioLegend)、並びにHLA-A、B及びC(クローン
W6/32、BV605)の表面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータ
を、Beckman-Coulter CytoFLEX-LXで取得した。
地で更に最大10日間維持した。ヌクレオフェクション後4日、7日、及び/又は10日
に培養物を採取し、CD3(抗CD3-PE、BioLegend)、(AlexaFl
uor488に複合化された抗FMC63抗CARクローンVM16)、B2M(抗B2
M-APC、又はPE、BioLegend)、並びにHLA-A、B及びC(クローン
W6/32、BV605)の表面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータ
を、Beckman-Coulter CytoFLEX-LXで取得した。
2.結果
B2M及びHLA-ABCのレベルを、コンストラクト7056を発現するサンプル及
び対照集団で測定した。図14Aは、対照培養物に由来するshRNAを発現していない
TRAC編集細胞と比較したCD3-/CAR+細胞のB2M表面レベルを示す。図14
Bは、同じ培養物におけるCD3-/CAR+対CD3+/C
AR-集団のB2Mレベルを示す。図14C及び図14Dは、HLA-ABC表面レベル
の表示でそれぞれ同じ比較を行う。AAV-7056で形質導入された細胞のCD3-/
CAR+画分は、対照集団と比較して90%超減少したB2M及びHLA-ABCのレベ
ルを示した。
B2M及びHLA-ABCのレベルを、コンストラクト7056を発現するサンプル及
び対照集団で測定した。図14Aは、対照培養物に由来するshRNAを発現していない
TRAC編集細胞と比較したCD3-/CAR+細胞のB2M表面レベルを示す。図14
Bは、同じ培養物におけるCD3-/CAR+対CD3+/C
AR-集団のB2Mレベルを示す。図14C及び図14Dは、HLA-ABC表面レベル
の表示でそれぞれ同じ比較を行う。AAV-7056で形質導入された細胞のCD3-/
CAR+画分は、対照集団と比較して90%超減少したB2M及びHLA-ABCのレベ
ルを示した。
3.結論
事前にスクリーニングされたB2MターゲティングshRNAは、(T細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子座への標的挿入により)コンストラクトが送達された細胞の表面でB
2M発現レベルをノックダウンすることができる。この効果は、CAR+集団(すなわち
、TRAC遺伝子座への標的化された統合が起こった細胞)に特有である。この実験は、
同じAAVテンプレート上のCAR遺伝子とTRAC遺伝子座に同時送達されたshRN
A472の単一コピーを使用して、B2Mを効率的にノックダウンできることを実証する
。
事前にスクリーニングされたB2MターゲティングshRNAは、(T細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子座への標的挿入により)コンストラクトが送達された細胞の表面でB
2M発現レベルをノックダウンすることができる。この効果は、CAR+集団(すなわち
、TRAC遺伝子座への標的化された統合が起こった細胞)に特有である。この実験は、
同じAAVテンプレート上のCAR遺伝子とTRAC遺伝子座に同時送達されたshRN
A472の単一コピーを使用して、B2Mを効率的にノックダウンできることを実証する
。
実施例6 初代ヒトT細胞におけるCD52に対する候補shRNAの特性評価
1.材料及び方法
異なるCD52ターゲティング配列をコードする5つのMission-shRNAレ
ンチウイルストランスファープラスミドを、Sigma-Aldrichから購入した。
第2世代のレンチウイルスベクターを、Lenti-X 293T細胞(ClonTec
h)とトリプルトランスフェクション法(Lipofectamine 2000-Th
ermo-Fisher)を使用して社内で作製した。T細胞を、実施例1のようにIm
munoCult抗CD2/CD3/CD28で3日間刺激することにより、レンチウイ
ルス形質導入用に調製した。形質導入を5μMポリブレン(Sigma-Aldritc
h)の存在下で行って、CD52表面レベルのフローサイトメトリー分析の前にIL-2
補足培地で形質導入細胞を5日間拡大させた。CD52Hi細胞の磁気枯渇において、下
流の試みには不均一な集団が望ましいため、ピューロマイシンで細胞を選択しなかった。
shRNA 568をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞をビオチン化抗C
D52(Miltenyi Biotec)で標識し、Biotin Positive
Selection Kit(StemCell Technologies)を使用
して磁気分離を行った。表面CD52の分離後分析を実施した。
1.材料及び方法
異なるCD52ターゲティング配列をコードする5つのMission-shRNAレ
ンチウイルストランスファープラスミドを、Sigma-Aldrichから購入した。
第2世代のレンチウイルスベクターを、Lenti-X 293T細胞(ClonTec
h)とトリプルトランスフェクション法(Lipofectamine 2000-Th
ermo-Fisher)を使用して社内で作製した。T細胞を、実施例1のようにIm
munoCult抗CD2/CD3/CD28で3日間刺激することにより、レンチウイ
ルス形質導入用に調製した。形質導入を5μMポリブレン(Sigma-Aldritc
h)の存在下で行って、CD52表面レベルのフローサイトメトリー分析の前にIL-2
補足培地で形質導入細胞を5日間拡大させた。CD52Hi細胞の磁気枯渇において、下
流の試みには不均一な集団が望ましいため、ピューロマイシンで細胞を選択しなかった。
shRNA 568をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞をビオチン化抗C
D52(Miltenyi Biotec)で標識し、Biotin Positive
Selection Kit(StemCell Technologies)を使用
して磁気分離を行った。表面CD52の分離後分析を実施した。
2.結果
スクリーニングされた5つのshRNA配列のうち、3つ(shRNA568、shR
NA572、及びshRNA876)がCD52の発現を干渉した。CD52表面発現プ
ロファイルを図8に示す。模擬形質導入T細胞(9A)、shRNA-568レンチウイ
ルスで形質導入されたT細胞(9B)、及びCD52磁気枯渇を受けたLV-shRNA
568形質導入細胞(9C)について、T細胞の表面に提示されるCD52のレベルを図
9に示す。
スクリーニングされた5つのshRNA配列のうち、3つ(shRNA568、shR
NA572、及びshRNA876)がCD52の発現を干渉した。CD52表面発現プ
ロファイルを図8に示す。模擬形質導入T細胞(9A)、shRNA-568レンチウイ
ルスで形質導入されたT細胞(9B)、及びCD52磁気枯渇を受けたLV-shRNA
568形質導入細胞(9C)について、T細胞の表面に提示されるCD52のレベルを図
9に示す。
3.結論
細胞表面のCD52抗原密度は、ウイルスベクターにより送達されるshRNAを使用
して減少させることができる。配列568は、最高度のCD52ノックダウンを示した。
このshRNA配列を使用するCD52のノックダウンは、非形質導入CD52 Hi細
胞の磁気的枯渇を可能にするのに十分であった。
細胞表面のCD52抗原密度は、ウイルスベクターにより送達されるshRNAを使用
して減少させることができる。配列568は、最高度のCD52ノックダウンを示した。
このshRNA配列を使用するCD52のノックダウンは、非形質導入CD52 Hi細
胞の磁気的枯渇を可能にするのに十分であった。
実施例7 異なる向きのCAR/CD52コンストラクトを使用したCD52ノックダウ
ンプロファイル
1.材料及び方法
実施例1に記載されるように、ImmunoCult抗CD2/CD3/CD28を使
用してT細胞を3日間刺激した。3日後、TRC1-2x.87EE mRNA、STI
NG siRNA、及び異なるCARコンストラクトをコードする直線化AAVトランス
ファーベクター(図10)を4-D Nucleofector(Lonza)を使用し
てT細胞に送達した。CD3、CAR(CD34エピトープタグ付き)、及びCD52の
フローサイトメトリー分析の前に、IL-2を添加した培地でヌクレオフェクションした
T細胞の培養を10日間行った。
ンプロファイル
1.材料及び方法
実施例1に記載されるように、ImmunoCult抗CD2/CD3/CD28を使
用してT細胞を3日間刺激した。3日後、TRC1-2x.87EE mRNA、STI
NG siRNA、及び異なるCARコンストラクトをコードする直線化AAVトランス
ファーベクター(図10)を4-D Nucleofector(Lonza)を使用し
てT細胞に送達した。CD3、CAR(CD34エピトープタグ付き)、及びCD52の
フローサイトメトリー分析の前に、IL-2を添加した培地でヌクレオフェクションした
T細胞の培養を10日間行った。
2.結果
TRAC編集CAR T細胞での操作されていないレベルのCD52表面提示を実証す
るため、TRC1-2x.87EEヌクレアーゼ及びshRNA配列をコードしないCD
34タグ付きCARコンストラクトを送達した。TCR KO細胞、TCR KO CA
R+細胞、及び編集されていない細胞のCD52レベルを、図11Aのヒストグラムに重
ねて表示する。U6プロモータ制御CD52 shRNAをコードする3つのCARコン
ストラクトを、TRAC遺伝子座に統合された場合のCD52をノックダウンする能力に
ついて評価した。CAR遺伝子とshRNAカセットの両方が順方向の場合、CD52抗
原密度はおよそ50%減少する(図11C;コンストラクト7004)。CAR遺伝子の
みの転写方向を逆にすると(すなわち、tail-to-tail構成)、表面に提示さ
れるCD52の量がおよそ95%減少し(図11B;コンストラクト7013)するのに
対し、CAR遺伝子とU6-shRNAエレメントの両方の方向を逆にすると、CD52
シグナルがおよそ90%減少する(図11D;コンストラクト7014)。
TRAC編集CAR T細胞での操作されていないレベルのCD52表面提示を実証す
るため、TRC1-2x.87EEヌクレアーゼ及びshRNA配列をコードしないCD
34タグ付きCARコンストラクトを送達した。TCR KO細胞、TCR KO CA
R+細胞、及び編集されていない細胞のCD52レベルを、図11Aのヒストグラムに重
ねて表示する。U6プロモータ制御CD52 shRNAをコードする3つのCARコン
ストラクトを、TRAC遺伝子座に統合された場合のCD52をノックダウンする能力に
ついて評価した。CAR遺伝子とshRNAカセットの両方が順方向の場合、CD52抗
原密度はおよそ50%減少する(図11C;コンストラクト7004)。CAR遺伝子の
みの転写方向を逆にすると(すなわち、tail-to-tail構成)、表面に提示さ
れるCD52の量がおよそ95%減少し(図11B;コンストラクト7013)するのに
対し、CAR遺伝子とU6-shRNAエレメントの両方の方向を逆にすると、CD52
シグナルがおよそ90%減少する(図11D;コンストラクト7014)。
3.結論
CD52特異的shRNA配列568は、TRAC遺伝子座への標的挿入により1コピ
ーのみが送達される場合、CD52発現を干渉する可能性がある。CAR遺伝子のみ(す
なわち、tail-to-tail構成)、又はCARとshRNA遺伝子の両方の転写
方向を変更すると、ターゲット遺伝子のノックダウンの効率に影響を与える可能性がある
。CAR遺伝子の向きのみを逆にすると、最も効率的なノックダウンをもたらした。
CD52特異的shRNA配列568は、TRAC遺伝子座への標的挿入により1コピ
ーのみが送達される場合、CD52発現を干渉する可能性がある。CAR遺伝子のみ(す
なわち、tail-to-tail構成)、又はCARとshRNA遺伝子の両方の転写
方向を変更すると、ターゲット遺伝子のノックダウンの効率に影響を与える可能性がある
。CAR遺伝子の向きのみを逆にすると、最も効率的なノックダウンをもたらした。
4.更なる研究
抗CD19 CARコード配列及びCD52に対するshRNAを含む多くのコンスト
ラクトを調製した。これらは図10A~図10Hに示されており、配列番号10~配列番
号17で提供される。上記のように、CARコンストラクトの7004(配列番号12)
、7013(配列番号14)、及び7014(配列番号16)を、CARを発現しながら
CD52発現を低下させる能力について以前に評価した。CARコード配列及びshRN
A配列に隣接する5´及び3´の相同性アームは、TRAC遺伝子座のTRC1-2認識
配列の上流及び下流の領域と相同性がある。
抗CD19 CARコード配列及びCD52に対するshRNAを含む多くのコンスト
ラクトを調製した。これらは図10A~図10Hに示されており、配列番号10~配列番
号17で提供される。上記のように、CARコンストラクトの7004(配列番号12)
、7013(配列番号14)、及び7014(配列番号16)を、CARを発現しながら
CD52発現を低下させる能力について以前に評価した。CARコード配列及びshRN
A配列に隣接する5´及び3´の相同性アームは、TRAC遺伝子座のTRC1-2認識
配列の上流及び下流の領域と相同性がある。
追加の研究では、CAR T細胞は、TRC1-2認識配列で二本鎖切断を誘導し、T
細胞のゲノムへのコンストラクトの標的挿入を促進するためのTRC1-2x.87EE
をコードするmRNAの同時ヌクレオフェクションにより、上記のCAR/shRNAコ
ンストラクトの1つを含む組換えAAVベクターで形質導入された一次ドナーヒトT細胞
を使用して調製される。第1及び第2の発現カセットのどの方向が、細胞表面で最も一貫
したレベルのCD52ノックダウンと共に、最も高い及び/又は最も一貫したCAR発現
をもたらすかを判断するため、上記のようにCD52発現を判定する。
細胞のゲノムへのコンストラクトの標的挿入を促進するためのTRC1-2x.87EE
をコードするmRNAの同時ヌクレオフェクションにより、上記のCAR/shRNAコ
ンストラクトの1つを含む組換えAAVベクターで形質導入された一次ドナーヒトT細胞
を使用して調製される。第1及び第2の発現カセットのどの方向が、細胞表面で最も一貫
したレベルのCD52ノックダウンと共に、最も高い及び/又は最も一貫したCAR発現
をもたらすかを判断するため、上記のようにCD52発現を判定する。
特定のコンストラクトで産生されたCAR T細胞は、前述の同種異系性とNK細胞殺
傷の両方のアッセイで評価する。さらに、細胞の増殖/拡大及び細胞毒性の可能性の変化
を判断するため、開示されるコンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞を、C
AR T細胞が抗原に繰り返し曝露される、様々なストレス試験で評価する。開示される
コンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞はまた、動物において腫瘍細胞を排
除する能力を判断し、in vivoで持続するそれらの能力を評価するため、in v
ivo腫瘍モデルで利用される。本明細書に記載される実施例に基づいて、CD52の細
胞表面発現が低下したCAR T細胞の有利な陰性選択により、CAR T細胞の濃縮集
団をin vivoで使用するために産生することができると予想される。
傷の両方のアッセイで評価する。さらに、細胞の増殖/拡大及び細胞毒性の可能性の変化
を判断するため、開示されるコンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞を、C
AR T細胞が抗原に繰り返し曝露される、様々なストレス試験で評価する。開示される
コンストラクトを使用して産生されたCAR T細胞はまた、動物において腫瘍細胞を排
除する能力を判断し、in vivoで持続するそれらの能力を評価するため、in v
ivo腫瘍モデルで利用される。本明細書に記載される実施例に基づいて、CD52の細
胞表面発現が低下したCAR T細胞の有利な陰性選択により、CAR T細胞の濃縮集
団をin vivoで使用するために産生することができると予想される。
Claims (153)
- (a)操作された抗原受容体をコードする核酸配列を含む第1の発現カセットと;
(b)阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第2の発現カセットと;
(c)5’相同性アームと;
(d)3’相同性アームと;を含み、
前記5’相同性アーム及び前記3’相同性アームが、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識
配列に隣接する染色体領域と相同性を有する、核酸分子。 - 前記阻害性核酸分子がRNA干渉分子である、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記RNA干渉分子が、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(
siRNA)、ヘアピンsiRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA
、又はmiRNA適合shRNAである、請求項2に記載の核酸分子。 - 前記RNA干渉分子がshRNAである、請求項2又は3に記載の核酸分子。
- 前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である、請求項
1~4のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列、TALEN認識
配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)認識配列、CRISPR/Cas認識配
列、コンパクトTALEN認識配列、又はメガTAL認識配列である、請求項1~5のい
ずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列が操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である、請求項1~
6のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記目的の遺伝子がヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である、請求項1~7の
いずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列が配列番号1を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の
核酸分子。 - 前記第1の発現カセットが、前記操作された抗原受容体の発現を駆動するプロモータを
更に含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の核酸分子。 - プロモータがJeTプロモータである、請求項10に記載の核酸分子。
- 前記第2の発現カセットが、前記阻害性核酸分子の発現を駆動するプロモータをさらに
含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記プロモータがU6プロモータである、請求項12に記載の核酸分子。
- 前記第1の発現カセットが、前記操作された抗原受容体の翻訳を終結させるためのポリ
アデニル化シグナルを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記第2の発現カセットが、前記阻害核酸の翻訳を終結させるための中央ポリプリント
ラクト及び中央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配列を含む、請求項1~14の
いずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記第1の発現カセット及び前記第2の発現カセットが、前記核酸分子において同じ向
きにある、請求項1~15のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記第1の発現カセット及び前記第2の発現カセットが、前記5’及び3’の相同性ア
ームに対して5’から3’の向きにある、請求項16に記載の核酸分子。 - 前記第1の発現カセットが、前記第2の発現カセットの5’上流にある、請求項17に
記載の核酸分子。 - 前記第2の発現カセットが、前記第1の発現カセットの5’上流にある、請求項17に
記載の核酸分子。 - 前記第1の発現カセット及び前記第2の発現カセットが、前記5’及び3’の相同性ア
ームに対して3’から5’の向きにある、請求項16に記載の核酸分子。 - 前記第1の発現カセットが、前記第2の発現カセットの5’上流にある、請求項20記
載の核酸分子。 - 前記第2の発現カセットが、前記第1の発現カセットの5’上流にある、請求項20記
載の核酸分子。 - 前記第1の発現カセット及び前記第2の発現カセットが、前記核酸分子において反対の
向きにある、請求項1~15のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記5’及び3’の相同性アームに対して、前記第1の発現カセットが3’から5’の
向きであり、前記第2の発現カセットが5’から3’の向きである、請求項23に記載の
核酸分子。 - 前記第1の発現カセットが、前記第2の発現カセットの5’上流にある、請求項24に
記載の核酸分子。 - 前記第2の発現カセットが、前記第1の発現カセットの5’上流にある、請求項24に
記載の核酸分子。 - 前記5’及び3’の相同性アームに対して、前記第1の発現カセットが5’から3’の
向きにあり、前記第2の発現カセットが3’から5’の向きにある、請求項23に記載の
核酸分子。 - 前記第1の発現カセットが、前記第2の発現カセットの5’上流にある、請求項27に
記載の核酸分子。 - 前記第2の発現カセットが、前記第1の発現カセットの5’上流にある、請求項27に
記載の核酸分子。 - 前記核酸分子が、前記第1の発現カセット及び前記第2の発現カセットに隣接する5’
逆方向末端反復及び3’逆方向末端反復を更に含む、請求項1~29のいずれか一項に記
載の核酸分子。 - 前記阻害性核酸分子が、ヒトベータ2ミクログロブリン、MHCクラスI分子の構成要
素、又はCD52に対して阻害性である、請求項1~30のいずれか一項に記載の核酸分
子。 - 前記阻害性核酸分子がベータ2ミクログロブリンに対する阻害性shRNAであり、前
記shRNAが配列番号2~配列番号4のいずれか1つを含む配列を有する、請求項1~
31のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記shRNAが配列番号2を含む配列を有する、請求項32に記載の核酸分子。
- 前記第1の発現カセット及び前記第2の発現カセットが、前記5’及び3’の相同性ア
ームに対して3’から5’の向きにあり、前記第1の発現カセットが前記第2の発現カセ
ットの5’上流にある、請求項32又は請求項33に記載の核酸分子。 - 前記第1の発現カセットが:
(i)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と;
(ii)前記キメラ抗原受容体又は前記外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプ
ロモータと;
(iii)ポリA配列と;を含み、
前記第2の発現カセットが:
(iv)前記shRNAをコードする核酸配列と;
(v)前記shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;
(vi)中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列(cPPT/CTS)の配
列と、を含む、請求項34に記載の核酸分子。 - 前記5’及び3’相同性アームに対して、前記第1の発現カセットが3’から5’の向
きにあり、前記第2の発現カセットが5’から3’の向きにあり、前記第1の発現カセッ
トが前記第2の発現カセットの5’上流にある、請求項32又は請求項33に記載の核酸
分子。 - 前記第1の発現カセットが:
(i)キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする核酸配列と;
(ii)前記キメラ抗原受容体又は前記外因性T細胞受容体の発現を駆動するJeTプ
ロモータと;
(iii)ポリA配列と;を含み、
前記第2の発現カセットが:
(iv)前記shRNAをコードする核酸配列と;
(v)shRNAの発現を駆動するU6プロモータと;
(vi)前記中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列(cPPT/CTS)
の配列と、を含む、請求項36に記載の核酸分子。 - 前記核酸分子が、前記第2の発現カセットの第1のコピー及び第2のコピーを含み、前
記第1のコピー及び前記第2のコピーが同一であり、前記第1コピー及び前記第2コピー
がタンデムであり、前記第1のコピーと前記第2のコピーが同じ向きである、請求項37
に記載の核酸分子。 - 請求項1~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含む組換えDNAコンストラク
ト。 - 前記組換えDNAコンストラクトがウイルスベクターをコードする、請求項39に記載
の組換えDNAコンストラクト。 - 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
ウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項40に記
載の組換えDNAコンストラクト。 - 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項41に記載の組換えDN
Aコンストラクト。 - 請求項1~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含むウイルスベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
ウイルスベクター、又はAAVベクターである、請求項43に記載のウイルスベクター。 - 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項44に記載のウイルスベ
クター。 - 請求項1~31のいずれか一項に記載の核酸分子を含む遺伝子改変真核細胞であって、
前記操作された抗原受容体及び前記阻害核酸分子が前記遺伝子改変真核細胞で発現される
、遺伝子改変真核細胞。 - 前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である、請求項
46に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記核酸分子が、前記ヌクレアーゼ認識配列において前記遺伝子改変真核細胞のゲノム
に挿入される、請求項46又は請求項47に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列、TALEN認識
配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)認識配列、CRISPR/Cas認識配
列、コンパクトTALEN認識配列、又はメガTAL認識配列である、請求項46~48
のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である、請求項4
9に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記目的の遺伝子がヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である、請求項46~5
0のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列が配列番号1を含む、請求項46~51のいずれか一項に記
載の遺伝子改変真核細胞。 - 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が対照細胞と比較して低下している、請求項51又
は請求項52に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記阻害性核酸分子がヒトベータ2ミクログロブリンに対して阻害性である、請求項4
6~53のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が請求項32~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含
む、請求項54に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%~95%低下している、請求
項54又は請求項55に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%低下している、請求
項54~56のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して75%~95%低下している、請求
項54~57のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して90%~95%低下している、請求
項54~58のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記対照細胞が、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改
変されていない、請求項56~59のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記阻害性核酸分子が、MHCクラスI分子の構成要素に対して阻害性である、請求項
46~53のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して10%~95%低下している、請求項61に記
載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して50%~95%低下している、請求項62又は
請求項63に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して75%~95%低下している、請求項61~6
3のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して90%~95%低下している、請求項61~6
4のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記対照細胞が、MHCクラスI分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変さ
れていない、請求項62~65のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、内因性NK細胞殺傷の影響を受
けにくく、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性
が延長されており、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体におい
て増強された拡大を示し、及び/又は前記遺伝子改変真核細胞の同種異系性が、対照細胞
と比較した場合、低下されている、請求項54~66のいずれか一項に記載の遺伝子改変
真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトT細胞である、請求項46~67のいずれか
一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトT細胞であり、前記操作された抗原受容体が
キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である、請求項54~67のいずれか一項に記
載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記阻害性核酸分子がヒトCD52に対して阻害性である、請求項46~53のいずれ
か一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗原受容体をコードする核酸配列
をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞であって、ここで、前記遺伝子改変真核細胞上
のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログ
ロブリン発現と比較して10%~95%低下している、遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%低下している、請求
項71に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して75%~95%低下している、請求
項71又は請求項72に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して90%~95%低下している、請求
項71~73のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記対照細胞が、ベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現を低下させるように遺伝子
改変されていない、請求項71~74のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が、そのゲノム中に、ベータ2ミクログロブリンに対して阻害
性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む、請求項71~75のいずれか一項に記
載の遺伝子改変真核細胞。 - 遺伝子改変真核細胞であって、前記遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗
原受容体をコードする核酸配列をそのゲノム中に含み、ここで、前記遺伝子改変真核細胞
上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面
発現と比較して10%~95%低下している、遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して50%~95%低下している、請求項77に記
載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して75%~95%低下している、請求項77又は
請求項78に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して90%~95%低下している、請求項77~7
9のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記対照細胞が、MHCクラスI分子の構成要素の細胞表面発現を低下させるように遺
伝子改変されていない、請求項77~80のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が、そのゲノム中に、MHCクラスI分子の構成要素に対して
阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む、請求項77~81に記載の遺伝子
改変真核細胞。 - 前記MHCクラスI分子の構成要素がベータ2ミクログロブリンである、請求項82に
記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記阻害性核酸分子がRNA干渉分子である、請求項76、82、又は83のいずれか
一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記RNA干渉分子が、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(
siRNA)、ヘアピンsiRNA、マイクロRNA(miRNA)、前駆体miRNA
、又はmiRNA適合shRNAである、請求項84に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記RNA干渉分子がshRNAである、請求項84又は請求項85に記載の遺伝子改
変真核細胞。 - 前記操作された抗原受容体をコードする核酸配列が、前記阻害性核酸分子をコードする
前記核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている、請求項76、又は82~86のい
ずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が、そのゲノム中に請求項1~31のいずれか一項に記載の前
記核酸分子を含む、請求項87に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が請求項32~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含
む、請求項87に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記操作された抗原受容体をコードする核酸配列が、前記阻害性核酸分子をコードする
前記核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている、請求項76又は82~86の
いずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、内因性NK細胞殺傷の影響を受
けにくく、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性
が延長されており、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体におい
て増強された拡大を示し、及び/又は前記遺伝子改変真核細胞の同種異系性が、対照細胞
と比較した場合、低下されている、請求項71~90のいずれか一項に記載の遺伝子改変
真核細胞。 - 前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体(CAR)又は外因性T細胞受容体(T
CR)である、請求項71~91のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変されたヒトT細胞である、請求項71~92のい
ずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞がキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体を発現する、請
求項93に記載の遺伝子改変真核細胞。 - 遺伝子改変真核細胞を産生する方法であって、請求項1~38のいずれか一項に記載の
前記核酸分子;及び
(a)前記ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコ
ードする核酸であって、前記操作されたヌクレアーゼが前記細胞内で発現される、核酸;
又は
(b)前記ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有する操作されたヌクレアーゼタン
パク質、
を前記細胞に導入することを含み、
ここで、前記操作されたヌクレアーゼが、前記細胞のゲノム中の前記ヌクレアーゼ認識
配列を認識して切断し、切断部位を生成し、
請求項1~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子が前記切断部位で前記細胞のゲノ
ムに挿入される、遺伝子改変真核細胞を産生する方法。 - 前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、TALEN、ジンクフ
ィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR/Cas、コンパクトTALEN、又は
メガTALである、請求項95記載の方法。 - 前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼである、請求項96に記
載の方法。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列がヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子内にある、請求
項95~97のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ヌクレアーゼ認識配列が配列番号1を含む、請求項95~98のいずれか一項に記
載の方法。 - 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が対照細胞と比較して低下している、請求項98又
は請求項99のいずれか一項に記載の方法。 - 前記操作されたヌクレアーゼをコードする前記核酸がmRNAである、請求項95~1
00のいずれか一項に記載の方法。 - 前記mRNAが、前記操作されたヌクレアーゼと、少なくとも1つの追加のポリペプチ
ド又は核酸分子とをコードするポリシストロニックmRNAである、請求項101に記載
の方法。 - 請求項1~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子が、ウイルスベクターを使用して
前記細胞に導入される、請求項95~102のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
ウイルスベクター、又はAAVベクターである、請求項103に記載の方法。 - 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項104に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが請求項43~45のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクタ
ーである、請求項104に記載の方法。 - 請求項1~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子が、組換えDNAコンストラクト
を使用して前記細胞に導入される、請求項95~102のいずれか一項に記載の方法。 - 前記組換えDNAコンストラクトが請求項39~42のいずれか一項に記載の前記組換
えDNAコンストラクトである、請求項107に記載の方法。 - 請求項1~38のいずれか一項に記載の前記核酸分子が、相同組換えにより前記切断部
位で前記細胞のゲノムに挿入される、請求項95~108のいずれか一項に記載の方法。 - 前記阻害性核酸分子がヒトベータ2ミクログロブリンに対して阻害性である、請求項9
5~109のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%~95%低下している、請求
項110に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して50%~95%低下している、請求
項110又は請求項111に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞でのベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して75%から95%低下している、請
求項110~112のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞でのベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上
の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して90%から95%低下している、請
求項110~113のいずれか一項に記載の方法。 - 前記対照細胞が、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改
変されていない、請求項111~114のいずれか一項に記載の方法。 - 前記阻害性核酸分子がMHCクラスI分子の構成要素に対して阻害性である、請求項9
5~109のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して10%~95%低下している、請求項116に
記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して50%~95%低下している、請求項116又
は請求項117に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して75%~95%低下している、請求項116~
118のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のMH
CクラスI分子の細胞表面発現と比較して90%~95%低下する、請求項116~11
9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記対照細胞が、MHCクラスI分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変さ
れていない、請求項117~120のいずれか一項に記載の方法。 - 前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である、請求項
95~121のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞がヒトT細胞である、請求項95~122のいずれか一項に記
載の方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトT細胞であり、前記操作された抗原受容体が
キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体である、請求項110~123のいずれか一項
に記載の方法。 - 前記阻害性核酸分子がヒトCD52に対して阻害性である、請求項95~109のいず
れか一項に記載の方法。 - 請求項95~125のいずれか一項に記載の方法により作製された、遺伝子改変真核細
胞。 - 請求項124に記載の方法によって作製された遺伝子改変真核細胞。
- 薬学的に許容可能な担体と、治療的有効量の請求項46~94、126、又は127の
いずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物。 - 薬学的に許容可能な担体と、治療的に有効な量の請求項69、94、又は127のいず
れか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物であって、ここで、前記遺
伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトT細胞であり、前記操作された抗原受容体がキメラ抗
原受容体又は外因性T細胞受容体であり、前記遺伝子改変ヒトT細胞上のベータ2ミクロ
グロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比
較して10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~95%低下する
、医薬組成物。 - 薬学的に許容可能な担体と、治療的有効量の請求項69、94、又は127のいずれか
一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物であって、
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトT細胞であり、前記操作された抗原
受容体がキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体であり、
前記遺伝子改変ヒトT細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細胞上のM
HCクラスI分子の細胞表面発現と比較して10%~95%、50%~95%、75%~
95%、又は90%~95%低下する、医薬組成物。 - 薬学的に許容可能な担体と、治療的有効量の請求項70又は請求項126のいずれか一
項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物であって、
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトT細胞であり、前記操作された抗原
受容体がキメラ抗原受容体であり、
前記遺伝子改変ヒトT細胞上のCD52の細胞表面発現が、対照細胞上のCD52の細
胞表面発現と比較して10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~
95%低下する、医薬組成物。 - 前記医薬組成物が、それを必要とする被験体の癌の治療における免疫療法用である、請
求項128~131のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法であって、
前記方法が、治療的有効量の請求項69、94、又は127のいずれか一項に記載の前
記遺伝子改変真核細胞を前記被験体に投与することを含み;
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体を発現
する遺伝子改変ヒトT細胞であり;
前記遺伝子改変ヒトT細胞上のベータ2ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞
上の細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現と比較して10%~95%、50%~95%
、75%~95%、又は90%~95%低下する、免疫療法を使用して、それを必要とす
る被験体において疾患を治療する方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の内因性NK細胞殺傷が、細胞表面ベータ2ミクログロブリ
ン発現を有さない遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、前記被験体において低下してい
る、請求項133に記載の方法。 - 前記被験体に請求項129に記載の前記医薬組成物が投与される、請求項133又は請
求項134に記載の方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞が前記被験体に対して同種異系である、請求項133~13
5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の持続性が、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を有さ
ない遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ2ミクログロブリ
ンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、前記被験体において延
長されている、請求項133~136のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の拡大が、細胞表面ベータ2ミクログロブリン発現を有さな
い遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ2ミクログロブリン
の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、前記被験体において増強
されている、請求項133~137のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の同種異系性が、野生型レベルのベータ2ミクログロブリン
の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、低下している、請求項1
33~138のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法であって、
前記方法が、治療的有効量の請求項69、94、又は127のいずれか一項に記載の前記
遺伝子改変真核細胞を前記被験体に投与することを含み;
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体を発現
する遺伝子改変ヒトT細胞であり;
ここで、前記遺伝子改変ヒトT細胞上のMHCクラスI分子の細胞表面発現が、対照細
胞上のMHCクラスI分子の発現と比較して10%~95%、50%~95%、75%~
95%、又は90%~95%低下する、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体に
おいて疾患を治療する方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の内因性NK細胞殺傷が、細胞表面MHCクラスI分子発現
を有さない遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、前記被験体において低下している、請
求項140に記載の方法。 - 前記被験体に請求項130の前記医薬組成物が投与される、請求項140又は請求項1
41に記載の方法。 - 前記遺伝子改変されたヒトT細胞が前記被験体に対して同種異系である、請求項140
~142のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の持続性が、細胞表面MHCクラスI分子発現を有さない遺
伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのMHCクラスI分子の細胞表面
発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、前記被験体において延長されている
、請求項140~143のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の拡大が、細胞表面MHCクラスI分子発現を有さない遺伝
子改変ヒトT細胞と比較した場合、又は野生型レベルのMHCクラスI分子の細胞表面発
現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、前記被験体において増強されている、
請求項140~144のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変ヒトT細胞の同種異系性が、野生型レベルのMHCクラスI分子の細胞
表面発現を有する遺伝子改変ヒトT細胞と比較した場合、低下している、請求項140~
145のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法であって、
前記方法が、治療的有効量の請求項70又は請求項126のいずれか一項に記載の前記
遺伝子改変真核細胞を前記被験体に投与することを含み;
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が、キメラ抗原受容体及びCD52に対する阻害性核
酸を発現する遺伝子改変ヒトT細胞であり;
前記遺伝子改変ヒトT細胞上のCD52の細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面CD
52発現と比較して10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~9
5%低下する、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方
法。 - 前記被験体に請求項131の前記医薬組成物が投与される、請求項147に記載の方法
。 - 前記疾患が癌である、請求項133~148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病の癌からなる群から選択され
る、請求項149に記載の方法。 - 前記癌が、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌
、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群
から選択される、請求項149又は請求項150に記載の方法。 - 前記B細胞起源の癌が、B系統の急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ性白血病
、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項151に記載の方法
。 - 操作された抗原受容体を含む遺伝子改変真核細胞の濃縮された集団を調製する方法であ
って、前記方法が、請求項70又は請求項126に記載の前記遺伝子改変真核細胞、及び
野生型レベルの細胞表面CD52を発現する細胞を含む細胞集団を調製することを含み、
ここで、前記遺伝子改変細胞上のCD52の細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面CD
52発現と比較して、10%~95%、50%~95%、75%~95%、又は90%~
95%低下し、前記方法が以下:
(a)前記細胞集団を抗CD52結合分子に複合化したビーズと接触させる工程であっ
て、ここで、野生型レベルの細胞表面CD52を発現する細胞は前記ビーズに結合され、
前記遺伝子改変真核細胞は前記ビーズに結合していない工程、
(b)前記細胞集団から前記ビーズを除去して、前記細胞の濃縮集団を産生する工程で
あって、ここで、前記細胞の濃縮集団が、前記遺伝子改変真核細胞について濃縮されてい
る工程、
を含む、操作された抗原受容体を含む遺伝子改変真核細胞の濃縮された集団を調製する
方法。
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