JP2023175699A - Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の改変されたイントロンを含む遺伝子改変ｔ細胞 - Google Patents

Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の改変されたイントロンを含む遺伝子改変ｔ細胞 Download PDF

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Abstract

【課題】ゲノム中に改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子を含む遺伝子改変Ｔ細胞を作製するための操作されたメガヌクレアーゼを提供する。【解決手段】ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置するヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロン内の認識配列を認識して切断する操作されたメガヌクレアーゼであって、該操作されたメガヌクレアーゼが第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、該第１のサブユニットが前記認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットが前記認識配列の第２の認識ハーフサイトに結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、操作されたメガヌクレアーゼを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、腫瘍学、癌免疫療法、分子生物学、及び組換え核酸技術の分野に関する。特
に、本発明は、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流にあるＴ細胞受容体アルファ遺伝子に改変
イントロンを含む遺伝子改変Ｔ細胞と並んで、それを作製するための組成物及び方法に関
する。本発明は更に、被験体において癌を含む疾患を治療するためかかる細胞を使用する
方法に関する。
ＥＦＳ－ＷＥＢによるテキストファイルで提出された配列表に対する参照
本出願には、ＥＦＳ－ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表が含まれており
、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。２０１７年１０月３１日に作成され
たＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１０９０７００２４ＵＳ０１－ＳＥＱ－ＨＪＤという名前であ
り、サイズは１２４，０３５バイトである。
Ｔ細胞養子免疫療法は、癌治療の有望なアプローチである。この戦略は、特定の腫瘍関
連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変された単離されたヒトＴ細胞を利用する
。遺伝子改変には、抗原特異性をＴ細胞にグラフトするためのキメラ抗原受容体又は外因
性Ｔ細胞受容体の発現が含まれる場合がある。外因性Ｔ細胞受容体とは対照的に、キメラ
抗原受容体はモノクローナル抗体の可変ドメインから特異性を導き出す。従って、キメラ
抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、非制限的な様式で主要組織適合性複
合体において腫瘍免疫反応性を誘導する。Ｔ細胞養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例、
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び慢性リ
ンパ球性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽腫、膠芽腫、進行性神経膠腫、卵巣癌、中皮腫
、黒色腫、及び膵臓癌を含む多くの癌の臨床療法として利用されてきた。
癌治療としての潜在的な有用性にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞を用いる養子免疫療法
は、細胞表面での内因性Ｔ細胞受容体の発現により部分的に制限されている。内因性Ｔ細
胞受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、同種異系患者への投与後、主要及び副組織適合性
抗原を認識し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症につながる可能性がある。その結果、
臨床試験は主に自己ＣＡＲ Ｔ細胞の使用に焦点を当て、患者のＴ細胞を単離し、遺伝子
改変してキメラ抗原受容体を組み込んだ後、同じ患者に再注入する。自己アプローチは、
投与されたＣＡＲ Ｔ細胞に免疫寛容を提供するが、このアプローチは、患者の癌が診断
された後に患者特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を産生するのに必要な時間と費用の両方によって制
約をうける。
従って、内因性Ｔ細胞受容体の発現が低下し、投与時にＧＶＨＤを開始しない、第三者
の健康なドナーからのＴ細胞を使用して調製した「既製の」ＣＡＲ Ｔ細胞を開発するこ
とが有利であろう。かかる製品を、診断の前に生成及び検証し、必要に応じて患者がすぐ
に利用できるようにすることができる。従って、ＧＶＨＤの発生を防ぐため、内因性Ｔ細
胞受容体を欠く同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の開発が必要とされている。
ゲノムＤＮＡの遺伝子改変は、目的の遺伝子座のＤＮＡ配列を認識するように操作され
た、部位特異的で切断頻度の少ないエンドヌクレアーゼを使用して実行され得る。操作さ
れた部位特異的エンドヌクレアーゼを生成する方法は、当該技術分野で知られている。例
えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を、ゲノム内の所定の部位を認識して切
断するように操作することができる。ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限酵素のヌクレアーゼドメイ
ンに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。ジン
クフィンガードメインを合理的又は実験的手段により再設計して、長さが約１８塩基対の
所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を生成することができる。この操作されたタンパ
ク質ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤ
ＮＡ切断を標的にすることが可能である。ＺＦＮは、広範囲の真核生物における遺伝子の
付加、除去、及び置換を標的とするために広く使用されている（非特許文献１で概説され
る）。同様に、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：ＴＡＬ－ｅｆｆｅｃｔｏ
ｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を生成して、ゲノムＤＮＡの特定の部位を切断することができる
。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合した操作された
部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む（非特許文献２で概説される）。しかしながら、こ
の場合、ＤＮＡ結合ドメインは、それぞれが単一のＤＮＡ塩基対を特異的に認識するＴＡ
Ｌエフェクタードメインのタンデムアレイを含む。本発明の実施に関してＺＦＮ及びＴＡ
ＬＥＮが有する制限は、それらがヘテロ二量体であることであり、そのため、細胞内での
単一機能性ヌクレアーゼの産生には、２つのタンパク質モノマーの共発現が必要である。
コンパクトＴＡＬＥＮは、二量体化の必要性を回避する代替エンドヌクレアーゼ構造を
有する（非特許文献３）。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｉ－ＴｅｖＩホーミングエンドヌク
レアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに融合した、操作された部位特異的ＴＡＬエフ
ェクターＤＮＡ結合ドメインで構成されている。ＦｏｋＩとは異なり、Ｉ－ＴｅｖＩは２
本鎖ＤＮＡ切断を生成するのに二量体化する必要がないため、コンパクトＴＡＬＥＮはモ
ノマーとして機能する。
ＣＲＩＳＰＲシステムに基づいて操作されたエンドヌクレアーゼも当該技術分野で知ら
れている（非特許文献４；非特許文献５）。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、２つの
コンポーネント：（１）カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ、典型的には微生物のＣａ
ｓ９、Ｃｐｆ１、又は別の適切なヌクレアーゼ；並びに（２）ヌクレアーゼをゲノム内の
目的の位置に誘導する約２０ヌクレオチドのターゲティング配列を含む、短い「ガイドＲ
ＮＡ」を含む。それぞれが異なるターゲティング配列を持つ複数のガイドＲＮＡを同じ細
胞内で発現させることにより、ＤＮＡ切断をゲノムの複数の部位において同時にターゲテ
ィングすることができる。従って、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは本発明に適している。Ｃ
ＲＩＳＰＲシステムの主な欠点は、報告された高頻度の標的外ＤＮＡ切断であり、ヒト患
者の治療に対するシステムの有用性を制限する可能性がある（非特許文献６）。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物や菌類のゲノムに共通して見られる１５塩基対
～４０塩基対の切断部位を認識する天然起源のヌクレアーゼのグループである。ホーミン
グエンドヌクレアーゼは、グループ１の自己スプライシングイントロン及びインテイン等
の寄生ＤＮＡ要素と頻繁に関連付けられている。ホーミングエンドヌクレアーゼは染色体
の２本鎖切断を生成することにより、宿主ゲノムの特定の場所で相同組換え又は遺伝子挿
入を自然に促進し、細胞ＤＮＡ修復機構を動員する（非特許文献７）。ホーミングエンド
ヌクレアーゼは、一般に４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリ
ー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリ
ーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造モチ
ーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーは
、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフの１つ又は２つのいずれかのコ
ピーを持つことを特徴とする（非特許文献８を参照されたい）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配
列番号２）モチーフの単一コピーを持つＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエ
ンドヌクレアーゼはホモダイマーを形成するが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチ
ーフの２つのコピーを持つメンバーはモノマーとして見つかる。
Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）は、藻類のクラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍ
ｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体染色体の２２塩基対認識配列を認
識して切断するホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファ
ミリーのメンバーである。遺伝子選択技術を使用して、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ切断部位の選
択傾向を変更した（非特許文献９～１２）。最近では、Ｉ－ＣｒｅＩ及び他のホーミング
エンドヌクレアーゼを、哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスゲノムの部位を含む
、広く多様なＤＮＡ部位を標的とするため、包括的に再設計することができる、モノＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が
記載された（特許文献１）。
特許文献２に最初に記載されているように、Ｉ－ＣｒｅＩ及びその操作された誘導体は
通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に結合
する短いペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに融合され得る（非特許文献１
３及び１４）。従って、機能性の「１本鎖」メガヌクレアーゼを、単一の転写物から発現
させることができる。
ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子のＤＮＡ標的を切断するための操作されたメガヌクレ
アーゼの使用は以前に開示されている。例えば、特許文献３及び４では、出願人は、Ｔ細
胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）遺伝子エクソン１の認識配列に特異性を有する操作さ
れたメガヌクレアーゼを開示した。特許文献３及び４は、メガヌクレアーゼ切断部位への
ＣＡＲコード配列の標的化された挿入のための方法も開示した。更に、特許文献５は、Ｔ
ＲＡＣエクソン１内の認識配列（特許文献５刊行物の配列番号３）を標的とするように操
作されたＩ－ＯｎｕＩメガヌクレアーゼの変異体を開示した。特許文献５は、キメラ抗原
受容体がＴＣＲノックアウト細胞で発現できることを検討しているが、著者らはＣＡＲコ
ード配列をメガヌクレアーゼ切断部位に挿入することを開示しなかった。
スモールヘアピンＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子
様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ、及びＣＲＩＳＰＲシステ
ム（例えば、非特許文献１５；特許文献６～８）を含む、他のヌクレアーゼの使用及び内
因性ＴＣＲの発現を妨害するメカニズムも開示されている。
更に、非特許文献１６は、ＴＲＡＣエクソン１の５’末端とＴＲＡＣエクソン１のすぐ
５’上流に位置する内因性スプライスアクセプター部位の両方にまたがる部位へのＣＡＲ
コード配列の挿入を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を開示した。著者
らは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの予想される２本鎖切断部位がスプライスアクセプター部位
内にあることを記載している（Ｅｙｑｕｅｍ、補足図１Ａを参照されたい）。このスプラ
イスアクセプター部位は、Ｃａｓ９による部位の妨害がドナーテンプレートの非存在下で
Ｔ細胞の７０％においてＴＣＲノックアウトを引き起こすという事実により証明される通
り、ＴＣＲ発現に必要である（Ｅｙｑｕｅｍ、補足図１Ｃの２つ目のパネルを参照された
い）。
特に、先行技術に開示されているヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲシステムはそれぞれ、
遺伝子の発現及び機能性Ｔ細胞受容体；例えば、ＴＲＡＣエクソン、又は内因性スプライ
スアクセプター部位の形成に重要な部位若しくは遺伝子座においてＴ細胞受容体遺伝子の
認識配列を標的とする。これらの切断部位にＣＡＲコード配列を挿入すると、ＣＡＲ陽性
（ＣＡＲ＋）であるＴ細胞受容体陰性（ＴＣＲ－）細胞が生じる可能性があるが、このア
プローチの重大な欠点は、ドナーテンプレートが挿入されていない場合、ＴＣＲ発現が切
断部位でエラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕ
ｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ）によってノックアウトされ得ることである。
その結果、ＣＡＲ Ｔ細胞を産生する以前の方法は、前臨床及び臨床使用のため更なる
濃縮を必要とするＴＣＲ－／ＣＡＲ＋細胞及びＴＣＲ－／ＣＡＲ－細胞の混合集団をもた
らす。例えば、前述のように、Ｅｙｑｕｅｍの補足図１Ｃは、ドナーテンプレートが存在
しない場合にＣａｓ９がＴＲＡＣエクソン１の５’上流のスプライスアクセプター部位を
破壊すると、細胞の約７０％がＴＣＲ－／ＣＡＲ－であったことを示している。しかしな
がら、ＣＡＲドナーテンプレート（１ｅ６ ＡＡＶ６）の存在下でも、ＴＣＲ－／ＣＡＲ
－細胞及びＴＣＲ－／ＣＡＲ＋細胞の混合集団が産生された。具体的には、テンプレート
ＤＮＡが１ｅ６のＡＡＶ６ ＭＯＩによって提供された場合、Ｔ細胞の４５．６％はＴＣ
Ｒ－／ＣＡＲ＋であったが、Ｃａｓ９及びその後のＮＨＥＪによるエラーを起こしやすい
修復によるスプライスアクセプター部位内の切断のため、かなりの割合の細胞（３０．７
％）がＴＣＲ－／ＣＡＲ－であった。
国際公開第２００７／０４７８５９号公報 国際公開第２００９／０５９１９５号公報 国際公開第２０１７／０６２４３９号公報 国際公開第２０１７／０６２４５１号公報 国際公開第２０１４／１９１５２７号公報 米国特許第８，９５６，８２８号公報 米国特許出願公開第２０１４／０３０１９９０号公報 米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号公報
Ｄｕｒａｉら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，５９７８ Ｍａｋら（２０１３），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２３：９３－９ Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１３），Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２） Ｒａｎら（２０１３），Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１－２３０８ Ｍａｌｉら（２０１３），Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９５７－６３ Ｆｕら（２０１３），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８２２－６ Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５ Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７－３７７４ Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１ Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８ Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９ Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８ Ｌｉら（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２ Ｇｒｉｚｏｔら（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９ Ｏｓｂｏｒｎら（２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（３）：５７０－５８１ Ｅｙｑｕｅｍら（（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７
これに反して、本発明は、Ｔ遺伝子を改変し、ＣＡＲコード配列等の目的の配列を挿入
するための直感に反するアプローチをとる。ＴＣＲ発現に必須のＴＣＲ遺伝子の要素を標
的にするのではなく、本発明は、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流にあるＴＣＲアルファ遺
伝子のイントロンを標的とする。イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び
内因性スプライスアクセプター部位が改変されない限り、この非コードイントロン内のヌ
クレアーゼによる２本鎖切断は、ＮＨＥＪが切断部位でインデルを産生したとしても、Ｔ
ＣＲ発現に実質的な影響を及ぼさない。
慣例に反して、イントロンの認識配列を標的とすることによって、少なくとも外因性ス
プライスアクセプター部位及び／又はポリＡシグナルを含む目的の配列が、例えば相同組
換えによって、切断部位に挿入される場合にのみＴＣＲ発現が妨害される。その結果、本
発明に従って産生されたＴＣＲ細胞は、イントロン切断部位に挿入された目的の配列を含
む。拡大すると、挿入された目的の配列にＣＡＲコード配列が更に含まれる場合、得られ
る細胞集団のＴＣＲ－細胞の殆ど又は全てがＴＣＲ－／ＣＡＲ＋となり、これは以前の方
法とは全く対照的であって、得られる集団には、かなりの割合のＴＲＣ－／ＣＡＲ－であ
る細胞も含まれ得る。従って、本発明は、ＴＲＣ－細胞の混合集団からＣＡＲ＋細胞を濃
縮するための面倒な必要性を排除することにより、この分野を著しく前進させる。
更に、本発明の幾つかの実施形態では、イントロンに挿入される目的の配列は、コード
配列（例えば、ＣＡＲコード配列）の５’上流の２Ａ要素を含む（図１を参照されたい）
。この２Ａ要素を含めることにより、外因性プロモータではなく、内因性Ｔ細胞受容体ア
ルファ遺伝子プロモータによって駆動されるコード配列の発現が可能になる。このように
して、ＣＡＲ等のポリペプチドの発現は、ＴＣＲ発現に通常関連するＴ細胞フィードバッ
ク機構によって制御される。
本発明は、そのゲノム中に改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子を含む、遺伝子改変ヒ
トＴ細胞又はそれに由来する細胞を提供する。改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子は、
ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置するＴ細胞受容体アルファ遺伝子内のイントロンに
挿入された目的の外因性配列を含み得る。イントロンに挿入される目的の外因性配列は、
外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリＡシグナルを含むことができ、Ｔ細胞
受容体アルファサブユニットの発現を妨害する。幾つかの実施形態では、目的の配列は、
ポリペプチドのコード配列（例えば、ＣＡＲコード配列）も含むことができる。さらに、
イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセプター部
位は、改変されておらず、及び／又は細胞内で機能性のままである。更に、内因性Ｔ細胞
受容体の細胞表面発現は、非改変対照細胞と比較した場合に低下している。
本発明はまた、遺伝子改変Ｔ細胞と並んで、Ｔ細胞の集団を産生するための組成物及び
方法を提供する。本発明はさらに、遺伝子改変Ｔ細胞を投与することにより癌を治療する
ための免疫療法の方法を提供し、ここで、Ｔ細胞は腫瘍特異的抗原（例えばＣＡＲ）に対
する受容体を発現する。
従って、本発明の一態様では、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置するヒトＴ細胞受
容体アルファ遺伝子のイントロン内の認識配列を認識して切断する操作されたメガヌクレ
アーゼであって、該操作されたメガヌクレアーゼが第１のサブユニット及び第２のサブユ
ニットを含み、該第１のサブユニットが上記認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し
、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、上記第２のサブユニットが上記認識配列の第２
の認識ハーフサイトに結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、操作されたメガヌ
クレアーゼを提供する。幾つかの実施形態では、イントロンは配列番号３を含み、操作さ
れたメガヌクレアーゼは、イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位又は内因性
スプライスアクセプター部位内に認識配列を持たない。
ある特定の実施形態では、認識配列は配列番号４（即ち、ＴＲＣ１１－１２認識配列）
を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２～１５のいずれか１つの
残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２～１５のいずれか１つの
残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３
５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２～１５のいずれか１つの
残基２１５～２７０を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２～１５のいずれか１つの
残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２～１５のいずれか１つの
残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０
、７５、及び７７に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２～１５のいずれか１つの
残基２４～７９を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２～１５のいずれか
１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２
のサブユニットは、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８
０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２～１５のいずれか
１つの残基１９８～３４４を含む。幾つかのかかる実施形態では、第２のサブユニットは
、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基７～１５３を含む。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含み、該リン
カーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２～１５の
いずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、認識配列は、配列番号６（即ち、ＴＲＣ１５－１６認識配列
）を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１６～１９のいずれか１つの
残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１６～１９のいずれか１つの
残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０
、７５、及び７７に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１６～１９のいずれか１つの
残基６４に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１６～１９のいずれか１つの
残基２４～７９を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１６～１９のいずれか１つの
残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１６～１９のいずれか１つの
残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３
５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１６～１９のいずれか１つの
残基２１５～２７０を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１６～１９のいずれか
１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％
、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサ
ブユニットは、配列番号１６～１９いずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０
％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含む。
幾つかのかかる実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１６～１９のいず
れか１つの残基７～１５３を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１６～１９のいずれか
１つの残基１９８～３４４を含む。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含み、該リン
カーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１６～１９の
いずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、認識配列は、配列番号８（即ち、ＴＲＣ１７－１８認識配列
）を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２０～２３のいずれか１つの
残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２０～２３のいずれか１つの
残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０
、７５、及び７７に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２０～２３のいずれか１つの
残基６６に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２０～２３のいずれか１つの
残基２４～７９を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２０～２３のいずれか１つの
残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２０～２３のいずれか１つの
残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３
５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２０～２３のいずれか１つの
残基２１５～２７０を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２０～２３のいずれか
１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％
、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサ
ブユニットは、配列番号２０～２３いずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０
％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかのかかる実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号２０～２３のいず
れか１つの残基７～１５３を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号２０～２３のいずれか
１つの残基１９８～３４４を含む。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含み、該リン
カーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２０～２３の
いずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、認識配列は、配列番号１０（即ち、ＴＲＣ１９－２０認識配
列）を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２４～２７のいずれか１つの
残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２４～２７のいずれか１つの
残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０
、７５、及び７７に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２４～２７のいずれか１つの
残基２４～７９を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２４～２７のいずれか１つの
残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２４～２７のいずれか１つの
残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３
５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。
幾つかのかかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２４～２７のいずれか１つの
残基２１５～２７０を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２４～２７のいずれか
１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％
、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサ
ブユニットは、配列番号２４～２７いずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０
％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかのかかる実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号２４～２７のいず
れか１つの残基７～１５３を含む。
幾つかのかかる実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号２４～２７のいずれか
１つの残基１９８～３４４を含む。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含み、該リン
カーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。
幾つかのかかる実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２４～２７の
いずれか１つのアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される操作されたメガヌクレアーゼをコード
する核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
更なる態様では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載される操作されたメガヌクレアーゼ及び
少なくとも１つの追加のポリペプチド又は核酸をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡで
ある。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ
コンストラクトを提供する。
或る特定の実施形態では、組換えＤＮＡコンストラクトはウイルスベクターをコードす
る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイル
スベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであ
る。具体的な実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むウイルスベク
ターを提供する。
或る特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイ
ルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。特定の実施形態で
は、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子
改変Ｔ細胞を産生する方法を提供する。該方法は、Ｔ細胞に対して、（ａ）本明細書に記
載される操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列であって、該操作され
たメガヌクレアーゼがＴ細胞において発現される第１の核酸配列；及び（ｂ）目的の配列
を含む第２の核酸配列；の１又は複数を導入することを含み、該操作されたメガヌクレア
ーゼが、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置する上記ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子
のイントロン内の認識配列に染色体の切断部位を生成し；上記目的の配列が、上記切断部
位で染色体に挿入され；上記目的の配列が、外因性スプライスアクセプター部位及び／又
はポリＡシグナルを含み；上記イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内
因性スプライスアクセプター部位が、改変されていない及び／又は機能性のままである。
上記方法の幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｖセグメント及びＪセグメントの再編成
が起こっていない前駆Ｔ細胞である。
上記方法の或る特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、非改変対
照細胞と比較した場合に低下している。
この方法の幾つかの実施形態では、イントロンは配列番号３を含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、認識配列は配列番号４を含み、操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号４を認識して切断する本明細書に記載される操作されたメガヌクレ
アーゼである。上記方法の幾つかの実施形態では、認識配列は配列番号６を含み、操作さ
れたメガヌクレアーゼは、配列番号６を認識して切断する本明細書に記載される操作され
たメガヌクレアーゼである。上記方法の幾つかの実施形態では、認識配列は配列番号８を
含み、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８を認識して切断する本明細書に記載さ
れる操作されたメガヌクレアーゼである。上記方法の幾つかの実施形態において、認識配
列は配列番号１０を含み、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１０を認識して切断
する本明細書に記載される操作されたメガヌクレアーゼである。
上記方法の或る特定の実施形態では、第２の核酸配列は、切断部位に隣接する配列に相
同な配列を更に含み、目的の配列は相同組換えにより切断部位に挿入される。
上記方法の幾つかの実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞、又はそれに由来する細胞であ
る。
上記方法の様々な実施形態において、目的の配列は、５’から３’に、外因性スプライ
スアクセプター部位、２Ａ要素又はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及び
ポリＡシグナルを含む。上記方法の或る特定の実施形態では、２Ａ要素はＴ２Ａ要素、Ｐ
２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、又はＦ２Ａ要素である。上記方法の特定の実施形態では、２Ａ要
素はＴ２Ａ要素である。
上記方法の幾つかの実施形態では、目的の配列は、外因性スプライスアクセプター部位
の５’上流に位置する外因性分岐部位を更に含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、目的の配列は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞
受容体のコード配列を含む。上記方法の特定の実施形態では、キメラ抗原受容体又は外因
性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメイン
を含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、少なくとも第１の核酸配列がｍＲＮＡによってＴ細
胞に導入される。
上記方法の或る特定の実施形態では、少なくとも第２の核酸配列は、ウイルスベクター
によってＴ細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ア
デノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶ
ベクターである。上記方法の具体的な実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベ
クターである。
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子
改変Ｔ細胞を産生する方法を提供する。上記方法は、（ａ）Ｔ細胞に対して本明細書に記
載される操作されたメガヌクレアーゼを導入すること；及び（ｂ）目的の配列を含む核酸
で該Ｔ細胞を形質移入すること、を含み、ここで、上記操作されたメガヌクレアーゼは、
ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置する上記ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイント
ロン内の認識配列に染色体の切断部位を生成し；上記目的の配列は、上記切断部位で染色
体に挿入され；上記目的の配列は、外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリＡ
シグナルを含み；上記イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内因性スプ
ライスアクセプター部位は改変されていない及び／又は機能性のままである。
上記方法の幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｖセグメント及びＪセグメントの再編成
が起こっていない前駆Ｔ細胞である。
上記方法の幾つかの実施形態では、非改変対照細胞と比較した場合、内因性Ｔ細胞受容
体の細胞表面発現が低下している。
上記方法の或る特定の実施形態では、イントロンは配列番号３を含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、認識配列は配列番号４を含み、操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号４を認識して切断する本明細書に記載される操作されたメガヌクレ
アーゼである。上記方法の幾つかの実施形態では、認識配列は配列番号６を含み、操作さ
れたメガヌクレアーゼは、配列番号６を認識して切断する本明細書に記載される操作され
たメガヌクレアーゼである。上記方法の幾つかの実施形態では、認識配列は配列番号８を
含み、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８を認識して切断する本明細書に記載さ
れる操作されたメガヌクレアーゼである。上記方法の幾つかの実施形態において、認識配
列は配列番号１０を含み、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１０を認識して切断
する本明細書に記載される操作されたメガヌクレアーゼである。
上記方法の或る特定の実施形態では、核酸は、切断部位に隣接する配列と相同の配列を
更に含み、目的の配列は相同組換えにより切断部位に挿入される。
上記方法の幾つかの実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞、又はそれに由来する細胞であ
る。
上記方法の或る特定の実施形態では、目的の配列は、５’から３’に、外因性スプライ
スアクセプター部位、２Ａ要素又はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及び
ポリＡシグナルを含む。上記方法の特定の実施形態では、２Ａ要素はＴ２Ａ要素、Ｐ２Ａ
要素、Ｅ２Ａ要素、又はＦ２Ａ要素である。上記方法の具体的な実施形態では、２Ａ要素
はＴ２Ａ要素である。
上記方法の幾つかの実施形態では、目的の配列は、外因性スプライスアクセプター部位
の５’上流に位置する外因性分岐部位を更に含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、目的の配列は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞
受容体のコード配列を含む。上記方法の特定の実施形態では、キメラ抗原受容体又は外因
性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメイン
を含む。
上記方法の或る特定の実施形態では、核酸はウイルスベクターによってＴ細胞に導入さ
れる。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。上記方
法の具体的な実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。
別の態様では、本発明は、改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子を含む遺伝子改変Ｔ細
胞を産生する方法を提供する。該方法は、（ａ）Ｔ細胞に対して：（ｉ）操作されたヌク
レアーゼをコードする第１の核酸配列であって、該操作されたヌクレアーゼはＴ細胞にお
いて発現される第１の核酸配列；又は（ｉｉ）操作されたヌクレアーゼタンパク質、を導
入すること；及び（ｂ）目的の外因性配列を含む第２の核酸配列を上記細胞に導入するこ
と；を含み、ここで、上記操作されたヌクレアーゼは、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に
位置する上記ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロン内の認識配列に切断部位を生
成し；上記目的の配列は、上記切断部位でヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子に挿入され；
上記目的の配列は、外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリＡシグナルを含み
；上記イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセプ
ター部位は、改変されていない及び／又は機能性のままである。
上記方法の幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｖセグメント及びＪセグメントの再編成
が起こっていない前駆Ｔ細胞である。
上記方法の幾つかの実施形態では、非改変対照細胞と比較した場合、内因性Ｔ細胞受容
体の細胞表面発現が低下している。
上記方法の或る特定の実施形態では、イントロンは配列番号３を含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、第２の核酸配列は、５’から３’に：（ａ）切断部
位に隣接する５’上流配列に相同な５’相同性アーム；（ｂ）目的の外因性配列；（ｃ）
切断部位に隣接する３’下流配列に相同な３’相同性アームを含み、ここで、目的の外因
性配列は、相同組換えにより切断部位でヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子に挿入される。
上記方法の幾つかの実施形態では、目的の配列は、外因性スプライスアクセプター部位
の５’上流に位置する外因性分岐部位を更に含む。
上記方法の或る特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞、又
はそれに由来する細胞である。
上記方法の幾つかの実施形態では、目的外因性配列は、５’から３’に、外因性スプラ
イスアクセプター部位、２Ａ要素又はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及
びポリＡシグナルを含む。上記方法の或る特定の実施形態では、２Ａ要素はＴ２Ａ要素、
Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、又はＦ２Ａ要素である。上記方法の特定の実施形態では、２Ａ
要素はＴ２Ａ要素である。
上記方法の幾つかの実施形態では、目的の配列は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞
受容体のコード配列を含む。上記方法の或る特定の実施形態では、キメラ抗原受容体又は
外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメ
インを含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、少なくとも第１の核酸配列がｍＲＮＡによってＴ細
胞に導入される。
上記方法のある特定の実施形態では、少なくとも第２の核酸配列は、ウイルスベクター
によってＴ細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ア
デノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。上記方法の具体的な実施形態では、ウイルスベ
クターは組換えＡＡＶベクターである。
上記方法の幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレ
アーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌク
レアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はｍｅ
ｇａＴＡＬである。上記方法の特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作さ
れたメガヌクレアーゼである。
上記方法の幾つかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４を含む
認識配列に対して特異性を有する。上記方法の幾つかのかかる実施形態では、操作された
メガヌクレアーゼは、配列番号４を認識して切断する本明細書に記載される操作されたメ
ガヌクレアーゼである。
上記方法の幾つかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６を含む
認識配列に対して特異性を有する。上記方法の幾つかのかかる実施形態では、操作された
メガヌクレアーゼは、配列番号６を認識して切断する本明細書に記載される操作されたメ
ガヌクレアーゼである。
上記方法の幾つかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８を含む
認識配列に対して特異性を有する。上記方法の幾つかのかかる実施形態において、操作さ
れたメガヌクレアーゼは、配列番号８を認識して切断する本明細書に記載される操作され
たメガヌクレアーゼである。
上記方法の幾つかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１０を含
む認識配列に対して特異性を有する。上記方法の幾つかのかかる実施形態では、操作され
たメガヌクレアーゼは、配列番号１０を認識して切断する本明細書に記載される操作され
たメガヌクレアーゼである。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変Ｔ細胞を産生するための本明細書に記載される方
法のいずれかによって調製された遺伝子改変Ｔ細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、そのゲノム中に改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子を含む
遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、ここで、改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子は、ＴＲＡＣ
エクソン１の５’上流に位置するＴ細胞受容体アルファ遺伝子内のイントロンに挿入され
た目的の外因性配列を含み、目的の外因性配列は外因性スプライスアクセプター部位及び
／又はポリＡシグナルを含み、イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内
因性スプライスアクセプター部位は、改変されておらず、及び／又は機能性のままであり
、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現は、非改変対照細胞と比較した場合に低下している
。
幾つかの実施形態では、イントロンは配列番号３を含む。
或る特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞、又はそれに由
来する細胞である。
幾つかの実施形態では、目的の外因性配列は、５’から３’に、外因性スプライスアク
セプター部位、２Ａ要素又はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及びポリＡ
シグナルを含む。特定の実施形態では、２Ａ要素はＴ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素
、又はＦ２Ａ要素である。具体的な実施形態では、２Ａ要素はＴ２Ａ要素である。
幾つかの実施形態では、目的の外因性配列は、外因性スプライスアクセプター部位の５
’上流に位置する外因性分岐部位を更に含む。
或る特定の実施形態では、目的の配列は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体の
コード配列を含む。特定の実施形態では、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体は、
腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、目的の外因性配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識部位、
ＴＡＬＥＮ認識部位、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識部位、ＣＲＩＳＰＲ認識部位、
又はｍｅｇａＴＡＬ認識部位でイントロンに挿入される。特定の実施形態では、目的の外
因性配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識部位でイントロンに挿入される。具体的な
実施形態では、目的の外因性配列は、配列番号４内のイントロンに挿入される。他の実施
形態では、目的の外因性配列は、配列番号６内のイントロンに挿入される。更なる実施形
態では、目的の外因性配列は、配列番号８内のイントロンに挿入される。他の実施形態で
は、目的の外因性配列は、配列番号１０内のイントロンに挿入される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の遺伝子改変Ｔ細胞を含む遺伝子
改変Ｔ細胞の集団を提供する。
幾つかの実施形態では、上記集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少
なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも
４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、
少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％
、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％が、本明細書に記載される遺
伝子改変Ｔ細胞である。
特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞、又はそれに由来す
る細胞である。
幾つかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞に存在する目的の外因性配列は、キメラ抗原
受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む。特定の実施形態では、キメラ抗原受
容体又は外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド
結合ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現は、非改変対照細胞と比較
した場合に、遺伝子改変Ｔ細胞上で低下している。
別の態様では、本発明は、疾患の治療に有用な医薬組成物を必要とする被験体における
疾患の治療に有用な医薬組成物を提供し、該医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体及び
治療有効量の本明細書に記載される遺伝子改変Ｔ細胞を含む。
ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞、又はそれに由
来する細胞である。
幾つかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞に存在する目的の外因性配列は、キメラ抗原
受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む。特定の実施形態では、キメラ抗原受
容体又は外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド
結合ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現は、非改変対照細胞と比較
した場合に、遺伝子改変Ｔ細胞上で低下している。
別の態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする被験体において疾患を治療する方法
を提供し、該方法は、本明細書に記載される遺伝子改変Ｔ細胞を被験体に投与することを
含む。
幾つかの実施形態では、上記方法は、本明細書に記載される医薬組成物を被験体に投与
することを含む。
ある特定の実施形態では、上記方法は、癌の治療を必要とする被験体における癌の治療
のための免疫療法である。幾つかのかかる実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は遺伝子改変
ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞であり、遺伝子改変Ｔ細胞に存在する上記目的の外因
性配列は、キメラ抗原受容体又は腫瘍特異的抗原に特異性を有する細胞外リガンド結合ド
メインを含む外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含み、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発
現は、非改変対照細胞と比較した場合に、遺伝子改変Ｔ細胞上で低下している。
上記方法の幾つかの実施形態では、癌は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血
病の癌からなる群から選択される。
上記方法の或る特定の実施形態では、癌は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、
骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、
及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
上記方法の特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病
、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる
群から選択される。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための本明細書に記載される遺伝子改
変細胞を提供する。本開示は更に、本明細書に記載される遺伝子改変細胞の使用を必要と
する被験体において疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される遺
伝子改変細胞の使用を提供する。かかる一態様では、上記医薬は癌の治療に有用である。
別の態様では、本発明は、疾患の治療、好ましくは癌の治療に使用するための、本明細
書に記載される遺伝子改変細胞を提供する。
目的の外因性配列をＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロンに挿入し、発現させるためのサンプル戦略の図であり、機能性Ｔ細胞受容体アルファサブユニットをコードするように再編成されている。示されるように、目的の外因性配列は、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流にあるＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロンに挿入される。標的５’イントロンに隣接する内因性スプライスアクセプター部位及び内因性スプライスアクセプター部位は無傷のままである。ヌクレアーゼによる切断に続いて、本明細書に記載される目的の外因性配列がイントロンに挿入される。示されるように、目的の配列は、少なくとも外因性スプライスアクセプター部位及び／又はイントロンに挿入された場合に、Ｔ細胞受容体アルファサブユニットの発現を妨害するポリＡシグナルを含む。挿入された目的の配列は、任意にＴ２Ａ要素で表される、２Ａ要素を含めることができる。挿入された目的の配列は、キメラ抗原受容体コード配列で表される、目的のポリペプチドのコード配列も任意に含むことができる。必要に応じて、目的の配列は、外因性スプライスアクセプター部位の５’上流に位置する外因性分岐部位を更に含むことができる。 ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンのＴＲＣ認識配列を示す。本発明の操作されたメガヌクレアーゼによって標的とされる各認識配列は、２つの認識ハーフサイトを含む。各認識ハーフサイトは、４塩基対の中心配列によって隔てられた９塩基対で構成されている。ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）は、ＴＲＣ１１及びＴＲＣ１２と称される２つの認識ハーフサイトを含む。ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）は、ＴＲＣ１５及びＴＲＣ１６と称される２つの認識ハーフサイトを含む。ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）は、ＴＲＣ１７及びＴＲＣ１８と称される２つの認識ハーフサイトを含む。ＴＲＣ１９－２０認識配列（配列番号１０）は、ＴＲＣ１９及びＴＲＣ２０と称される２つの認識ハーフサイトを含む。 本発明の操作されたメガヌクレアーゼは２つのサブユニットを含み、第１のサブユニットは、第１の認識ハーフサイト（例えば、ＴＲＣ１１、ＴＲＣ１５、ＴＲＣ１７又はＴＲＣ１９）に結合するＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットは、第２の認識ハーフサイト（例えば、ＴＲＣ１２、ＴＲＣ１６、ＴＲＣ１８、又はＴＲＣ２０）に結合するＨＶＲ２領域を含む。操作されたメガヌクレアーゼが１本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかのサブユニットとして配置され得る。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかのサブユニットとして配置され得る。 Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンに見られる認識配列を標的とする操作されたメガヌクレアーゼを評価するＣＨＯ細胞のレポーターアッセイの概略を示す。本明細書に記載される操作されたメガヌクレアーゼについて、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定して組み込まれたＣＨＯ細胞株を作製した。レポーターカセットは、５’から３’の順に：ＳＶ４０初期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５’２／３；本発明の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＴＲＣ１１－１２認識配列）；ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号）；及びＧＦＰ遺伝子の３’２／３で構成される。このカセットで安定的に形質移入された細胞は、ＤＮＡ切断誘導物質の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドのＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかでＤＮＡ切断が誘導された場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域が相互に組換えられ、機能性ＧＦＰ遺伝子をもたらした。ＧＦＰを発現する細胞の割合は、操作されたメガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的な尺度として、フローサイトメトリーによって決定され得る。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンに見られる認識配列を認識して切断する、操作されたメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号１２～１５に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）を標的とするように操作した。配列番号１６～１９に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）を標的とするように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。配列番号２０～２３に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）を標的とするように操作した。配列番号２４～２７に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１９－２０認識配列（配列番号１０）を標的とするように操作した。示される結果は、各アッセイで観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を示し、これは、標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断する各メガヌクレアーゼの有効性を示す。さらに、陰性対照（ｂｓ）を各アッセイに含めた。図５Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｂは、ＴＲＣ１５－１６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｃは、ＴＲＣ１７－１８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｄは、ＴＲＣ１９－２０認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイでＴＲＡＣエクソン１の５’上流にあるヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロンの認識配列を認識して切断する、操作されたメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号１２～１５に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）を標的とするように操作した。配列番号１６～１９に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）を標的とするように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。配列番号２０～２３に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）を標的とするように操作した。配列番号２４～２７に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１９～２０認識配列（配列番号１０）を標的とするように操作した。ヌクレオフェクション後７日間の複数の時点で、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性について、操作されたメガヌクレアーゼをスクリーニングした。示される結果は、分析の７日間に亘って各アッセイで観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を示し、これは、時間の関数として、標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列の切断に対する各メガヌクレアーゼの有効性を示す。図６Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図６Ｂは、ＴＲＣ１５－１６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図６Ｃは、ＴＲＣ１７－１８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図６Ｄは、ＴＲＣ１９－２０認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。 Ｔ細胞溶解物のＴ７Ｅアッセイを示す。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気分離によりＰＢＭＣから単離し、７２時間活性化した。活性化ヒトＴ細胞にＴＲＣ１１－１２又はＴＲＣ１５－１６メガヌクレアーゼｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションを行い、形質移入後７２時間に細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を採取した。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイを実行し、内因性ＴＲＣ１１－１２又はＴＲＣ１５－１６認識配列での遺伝子改変を推定した。 標的５’イントロンの認識配列での切断は、Ｔ細胞受容体の発現に影響しない。ヒトＴ細胞をヒトドナーから得られたアフェレーシスサンプルから濃縮し、ＩＬ－２の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して３日間刺激した。３日後、Ｔ細胞を採取し、ビーズを取り除き、１μｇの指定のメガヌクレアーゼＲＮＡをＴ細胞サンプルに導入した。ヌクレオフェクションした細胞は、フローサイトメトリー分析の前に６日間培養した。内因性Ｔ細胞受容体の発現を表すＣＤ３表面提示を、抗ＣＤ３－ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７１１及びＧｈｏｓｔＤｙｅ－５１０でＴ細胞サンプルを標識することにより測定した。Ｔ細胞は、ＴＲＣ１～２ｘ．８７ＥＥ（ＴＲＡＣエクソン１を標的とする操作されたヌクレアーゼ）又はＲＮＡなし（モック）のいずれかでヌクレオフェクションされ、それぞれＴＲＡＣ遺伝子座編集の陽性対照及び陰性対照としての役割を果たし、図８Ａ及び図８Ｂに示される。４つの追加サンプルも、ＴＲＣ１５－１６ファミリーからの１つの異なるヌクレアーゼ変異体をコードするＲＮＡでヌクレオフェクションし、その全てのメンバーが５’イントロンのＴＲＣ１５－１６認識配列を標的とする。ＴＲＡＣ遺伝子座の編集により遺伝子破壊が起こると、ＴＣＲα鎖は合成されず、編集された細胞の表面にＴＣＲ複合体（ＣＤ３を含む）は提示されない。ＴＲＣ ｌ－２ｘ．８７ＥＥで編集されたＴ細胞の半分超が、エクソン１の切断及びＮＨＥＪによる切断部位のエラーを起こしやすい修復のためにＴＲＣ陰性であることが示された（図８Ｂ）。比較すると、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３ｌ、ＴＲＣ１５－１６ｘ．６３、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８７、及びＴＲＣ１５－１６ｘ．８９による編集後のＴＣＲ陰性細胞の頻度はわずか４％～８％であった（それぞれ図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、及び図８Ｆ）。 目的の外因性配列のドナーテンプレートを示す。相同性アーム、外因性スプライスアクセプター部位、ＣＡＲコード配列、及びポリＡシグナルを含むドナーテンプレートを提供する。図９Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列への挿入に適した例示的なドナーテンプレート（配列番号６０）を提供する。図９Ｂは、ＴＲＣ１５－１６認識配列への挿入に適した例示的なドナーテンプレート（配列番号６１）を提供する。図９Ｃは、ＴＲＣ１７－１８認識配列への挿入に適した例示的なドナーテンプレート（配列番号６２）を提供する。 ＧＦＰコード配列の標的５’イントロンへの挿入を示す。Ｔ細胞をＴＲＣ１１－１２ｘ．８２ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのないＧＦＰコード配列をコードする７２２７コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。追加のＴ細胞をＴＲＣ１５－１６．ｘ３１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのないＧＦＰコード配列をコードする７２２８コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。ＴＣＲノックアウト及びＧＦＰ発現を、形質移入／形質導入の５日後にフローサイトメトリーで測定した。図１０Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３（ｘ軸）及びＧＦＰ（ｙ軸）の発現を示す。図１０Ｂは、ＴＲＣ１１－１２認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＧＦＰ発現（ｘ軸）及び細胞数（ｙ軸）を示す。図１０Ｃは、ＴＲＣ１５－１６認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３（ｘ軸）及びＧＦＰ（ｙ軸）発現を示す。図１０Ｄは、ＴＲＣ１５－１６認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＧＦＰ発現（ｘ軸）及び細胞数（ｙ軸）を示す。 標的５’イントロンへの抗ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列の挿入。Ｔ細胞をＴＲＣ１１－１２ｘ．８２ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのない抗ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列をコードする７２２５コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。追加のＴ細胞をＴＲＣ１５－１６．ｘ３１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのない抗ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列をコードする７２２６コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。ＴＣＲノックアウト及びＣＡＲの発現を、形質移入／形質導入の５日後にフローサイトメトリーで測定した。図１１Ａは、陰性対照群（ＴＲＣ酵素のみ）のＣＤ３細胞でのＣＡＲ発現を示す。図１１Ｂは、ＴＲＣ１１－１２認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３細胞でのＣＡＲ発現を示す。図１１Ｃは、ＴＲＣ１５－１６認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３細胞でのＣＡＲ発現を示す。
配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子イントロンの核酸配列を示す。
配列番号４は、ＴＲＣ１１－１２（センス）の核酸配列を示す。
配列番号５は、ＴＲＣ１１－１２（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号６は、ＴＲＣ１５－１６（センス）の核酸配列を示す。
配列番号７は、ＴＲＣ１５－１６（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号８は、ＴＲＣ１７－１８（センス）の核酸配列を示す。
配列番号９は、ＴＲＣ１７－１８（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１０は、ＴＲＣ１９－２０（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１１は、ＴＲＣ１９－２０（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１２は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．８２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．６３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．１５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．８２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列示す。
配列番号２２は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．１８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．７１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．７４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．７１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．８７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．４メガヌクレアーゼＴＲＣ１１結合サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．８２メガヌクレアーゼＴＲＣ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６０メガヌクレアーゼＴＲＣ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６３メガヌクレアーゼＴＲＣ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．４メガヌクレアーゼＴＲＣ１２結合サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．８２メガヌクレアーゼＴＲＣ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６０メガヌクレアーゼＴＲＣ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６３メガヌクレアーゼＴＲＣ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１メガヌクレアーゼＴＲＣ１５結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８７メガヌクレアーゼＴＲＣ１５結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．６３メガヌクレアーゼＴＲＣ１５結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８９メガヌクレアーゼＴＲＣ１５結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１メガヌクレアーゼＴＲＣ１６結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８７メガヌクレアーゼＴＲＣ１６結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．６３メガヌクレアーゼＴＲＣ１６結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８９メガヌクレアーゼＴＲＣ１６結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．１５メガヌクレアーゼＴＲＣ１７結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．８２メガヌクレアーゼＴＲＣ１７結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．１８メガヌクレアーゼＴＲＣ１７結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４７は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．７１メガヌクレアーゼＴＲＣ１７結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４８は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．１５メガヌクレアーゼＴＲＣ１８結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号４９は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．８２メガヌクレアーゼＴＲＣ１８結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．１８メガヌクレアーゼＴＲＣ１８結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、ＴＲＣ１７－１８ｘ．７１メガヌクレアーゼＴＲＣ１８結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．８５メガヌクレアーゼＴＲＣ１９結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．７４メガヌクレアーゼＴＲＣ１９結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．７１メガヌクレアーゼＴＲＣ１９結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．８７メガヌクレアーゼＴＲＣ１９結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．８５メガヌクレアーゼＴＲＣ２０結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．７４メガヌクレアーゼＴＲＣ２０結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．７１メガヌクレアーゼＴＲＣ２０結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、ＴＲＣ１９－２０ｘ．８７メガヌクレアーゼＴＲＣ２０結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、ＴＲＣ１１－１２認識配列に挿入できる抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むド
ナーテンプレートの核酸配列を示す。
配列番号６１は、ＴＲＣ１５－１６認識配列に挿入できる抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むド
ナーテンプレートの核酸配列を示す。
配列番号６２は、ＴＲＣ１７－１８認識配列に挿入できる抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むド
ナーテンプレートの核酸配列を示す。
配列番号６３は、ＴＲＣ１１－１２認識配列に挿入できるＧＦＰタンパク質をコードす
る７２２７ドナーテンプレートの核酸配列を示す。
配列番号６４は、ＴＲＣ１１－１２認識配列に挿入できる抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコード
する７２２５ドナーテンプレートの核酸配列を示す。
配列番号６５は、ＴＲＣ１５－１６認識配列に挿入できるＧＦＰタンパク質をコードす
る７２２８ドナーテンプレートの核酸配列を示す。
配列番号６６は、ＴＲＣ１５－１６認識配列に挿入できる抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコード
する７２２６ドナーテンプレートの核酸配列を示す。
発明の詳細な説明
（定義）
１．１参照及び定義
本明細書で参照される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明
細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及びＧｅ
ｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが具体的かつ個別に参照により
組み込まれていることが示されているのと同程度に引用することで本明細書の一部をなす
。
本発明は、種々の形態で具体化され得て、本明細書に記載される実施形態に限定される
と解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が十分かつ完全であ
り、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されている。例えば、一実施形態に
関して例示される特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例
示される特徴をその実施形態から削除することができる。さらに、本開示に照らして、本
発明から逸脱しない本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形及び追加が当業者
には明らかであろう。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明
が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で本発
明の説明に使用される用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、
本発明を限定することを意図するものではない。
本明細書で言及される全て出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、引用するこ
とでその全体が本明細書の一部をなす。
本明細書で使用される場合、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、又は「その（ｔｈｅ
）」は、１つ又は１つ以上を意味する場合がある。例えば、「１つの」細胞は、単一の細
胞又は複数の細胞を意味し得る。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「又は」という言葉は、「いずれ
か／又は」の排他的な意味ではなく、「及び／又は」の包括的な意味で使用される。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える
認識配列で２本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本発明のメ
ガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩに由
来するエンドヌクレアーゼであってもよく、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、
ＤＮＡ結合親和性、又は二量化特性に関して天然のＩ－ＣｒｅＩと比較して改変された、
Ｉ－ＣｒｅＩの操作された変異体を指す場合がある。Ｉ－ＣｒｅＩのかかる改変された変
異体を産生する方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００７
／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として、
又はペプチドリンカーを使用してＤＮＡ結合ドメインのペアが単一のポリペプチドに結合
される「１本鎖メガヌクレアーゼ」として２本鎖ＤＮＡに結合する。「ホーミングエンド
ヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本発明の
メガヌクレアーゼは、細胞、特にヒトＴ細胞で発現される場合、本明細書に記載される方
法を使用して測定した場合に細胞生存率への有害な影響又はメガヌクレアーゼ切断活性の
著しい低下を観察することなく、細胞を形質移入して３７℃で維持できるように実質的に
非毒性である。
本明細書で使用される場合、「１本鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによ
ってつなげられたヌクレアーゼサブユニットのペアを含むポリペプチドを指す。１本鎖メ
ガヌクレアーゼは：Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットの構成を有する
。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般的にアミノ酸配列が同一ではなく、非同一
のＤＮＡ配列を認識する。従って、１本鎖メガヌクレアーゼは通常、偽パリンドローム又
は非パリンドロームの認識配列を切断する。１本鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体
ではないが、「１本鎖ヘテロ二量体」又は「１本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と称
される場合がある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」とい
う用語は、二量体又は１本鎖メガヌクレアーゼを指す場合がある。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、２つのメガヌクレアーゼサブユニッ
トを単一のポリペプチドにつなげるために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカ
ーは、天然タンパク質に見られる配列を有してもよく、又は任意の天然タンパク質には見
られない人工配列であってもよい。リンカーは柔軟性であって二次構造が欠けていてもよ
く、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有してもよい。リンカーと
しては、米国特許第８，４４５，２５１号及び米国特許第９，４３４，９３１号に含まれ
るリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、リンカーは
、配列番号１２～２７のいずれか１つの残基１５４～１９５を含むアミノ酸配列を有して
もよい。
本明細書で使用される「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」という用語は
、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マング
ビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、膵臓ＤＮＡｓｅ Ｉ、
ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定さ
れないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに融
合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィ
ンガーヌクレアーゼの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、
ＳｔｓＩの制限酵素を含むが、これらに限定されない、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに
由来するものが挙げられる。追加のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００
７／０１４２７５号に記載されており、その全体が引用することで本明細書の一部をなす
。ジンクフィンガードメインの構造は、亜鉛イオンの配位により安定化される。１つ以上
のジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的にＤＮＡに結合
する。ジンクフィンガードメインは、天然配列であってもよく、合理的又は実験的手段に
より再設計して、長さが約１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生す
ることもできる。例えば、各々がその全体を引用することで本明細書の一部をなす、米国
特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、
同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、並びに国際公開第９５／１９４
３１号、同第９６／０６１６６号、同第９８／５３０５７号、同第９８／５４３１１号、
同第００／２７８７８号、同第０１／６０９７０号、同第０１／８８１９７号、及び同第
０２／０９９０８４号を参照されたい。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋＩヌ
クレアーゼ等のヌクレアーゼドメインに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤ
ＮＡ切断を標的にすることが可能である。標的部位、ジンクフィンガータンパク質、並び
にジンクフィンガーヌクレアーゼの設計及び構築のための方法の選択は、当業者に知られ
ており、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号
、同第２００５０６４４７４号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６０１８８
９８７号及び国際公開第０７／０１４２７５号に詳細に記載され、各々がそれらの全体が
引用することで本明細書の一部をなす。
本明細書で使用される「ＴＡＬＥＮ」という用語は、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミ
ングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓ
ｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むがこれら
に限定されないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメイン
又はその活性部分に融合した複数のＴＡＬドメインリピートを含むＤＮＡ結合ドメインを
含むエンドヌクレアーゼを指す。例えば、引用することでその全体が本明細書の一部をな
す、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：７５７－７６１を参
照されたい。ＴＡＬＥＮの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、ＦｏｋＩ、Ｆｏ
Ｍ、ＳｔｓＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ
、及びＡｌｗＩを含むがこれらに限定されないＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに由来する
ものが挙げられる。追加のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０１
４２７５号に記載されている。幾つかの態様では、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン又はその活性部分である。ＴＡＬドメインリピートは、キ
サントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体による感染プロセスで使用され
るＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）ファミリーのタンパク質に由来し得る。Ｔ
ＡＬドメインリピートは、多様な１２番目と１３番目のアミノ酸を持つ３３個～３４個の
アミノ酸配列である。反復可変ジペプチド（ＲＶＤ：ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ
ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）と称されるこれらの２つの位置は非常に可変的であり、特定のヌク
レオチド認識と強い相関関係を示す。ＤＮＡ標的配列の各塩基対は、ＲＶＤに起因する特
異性で単一のＴＡＬリピートに接触する。幾つかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは１６個～
２２個のＴＡＬドメインリピートを含む。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断には、非特異的な
中央領域（即ち、「スペーサ」）に隣接する２つのＤＮＡ認識領域が必要である。ＴＡＬ
ＥＮに関する「スペーサ」という用語は、ＴＡＬＥＮを構成する各モノマーによって認識
及び結合される２つの核酸配列を分離する核酸配列を指す。ＴＡＬドメインリピートは、
天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の天然配列であってもよく、又は合理的若しくは実験
的手段で再設計して、所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生することもできる（
例えば、各々がその全体を引用することで本明細書の一部をなす、Ｂｏｃｈら（２００９
）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０９－１５１２ａｎｄ Ｍｏｓｃｏｕ ａｎ
ｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０１を参
照されたい）。特定の配列及びＲＶＤの例、並びに対応する標的ヌクレオチドを認識する
ためにＴＡＬＥＮを操作する方法については、米国特許出願公開第２０１１０１４５９４
０号及び国際公開第２０１０／０７９４３０号も参照されたい。幾つかの実施形態では、
各ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）モノマーは、異なるＤＮＡ配列を認識するＴＡＬエ
フェクター配列に融合されてもよく、２つの認識部位が近接している場合にのみ、不活性
モノマーが一緒になって機能性酵素を作り出す。
本明細書で使用される「コンパクトＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ－ＴｅｖＩホーミン
グエンドヌクレアーゼ、又はＭｍｅＩ、ＥｎｄＡ、Ｅｎｄ１、Ｉ－ＢａｓＩ、Ｉ－Ｔｅｖ
ＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＴｗｏＩ、ＭｓｐＩ、ＭｖａＩ、ＮｕｃＡ、ＮｕｃＭ等が
含まれるが、これらに限定されない米国特許出願第２０１３０１１７８６９号の表２に収
載されているエンドヌクレアーゼのいずれか（その全体が引用することで本明細書の一部
をなす）の任意の部分に任意の方向で融合した１６－２２ＴＡＬドメインリピートを有す
る、ＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。コンパクトＴＡＬＥＮはＤＮ
Ａプロセッシング活性に二量体化を必要とせず、介在するＤＮＡスペーサを持つ二重標的
部位の必要性を軽減する。幾つかの実施形態では、コンパクトＴＡＬＥＮは１６個～２２
個のＴＡＬドメインリピートを含む。
本明細書で使用する「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１又は他の好適
なヌクレアーゼ等のカスパーゼと、ゲノムＤＮＡの認識部位にハイブリダイズすることに
よりカスパーゼのＤＮＡ切断を指示するガイドＲＮＡとを含むカスパーゼに基づくエンド
ヌクレアーゼを指す。ＣＲＩＳＰＲのカスパーゼ構成要素は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌ
クレアーゼである。或る特定の実施形態では、カスパーゼはクラスＩＩ Ｃａｓ酵素であ
る。これらの実施形態の幾つかでは、カスパーゼは、Ｃａｓ９等のクラスＩＩ、ＩＩ型酵
素である。他の実施形態では、カスパーゼは、Ｃｐｆ１等のクラスＩＩ、Ｖ型酵素である
。ガイドＲＮＡは、定方向反復（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）と、標的認識部位に相補
的なガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してスペーサと称されることが多い）とを含
む。或る特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、ガイドＲＮＡ上に存在する定方向反復塩
基配列（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（時にｔｒａｃｒメイト配列
と称される）に（完全又は部分的に）相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化Ｃ
ＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を更に含む。特定の実施形態では、カスパーゼは、該酵素が標的ポ
リヌクレオチドの１本鎖を切断し、ニッカーゼとして機能し、標的ＤＮＡの１本鎖のみを
切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異させることができる。ニッ
カーゼとして機能するカスパーゼ酵素の非限定的な例としては、ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイ
ン内のＤ１０Ａ変異、又はＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、若しくはＮ８６３Ａの変異を有する
Ｃａｓ９酵素が挙げられる。
本明細書で使用される「ｍｅｇａＴＡＬ」という用語は、操作された配列特異的ホーミ
ングエンドヌクレアーゼを有する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合
ドメインを含む１本鎖ヌクレアーゼを指す。
タンパク質に関して、本明細書で使用される「組換え」又は「操作された」という用語
は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物に対する遺伝
子工学技術の適用の結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に
関して、「組換え」又は「操作された」という用語は、遺伝子工学技術の適用の結果とし
て変更された核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては、ＰＣＲ及びＤ
ＮＡクローニング技術；形質移入、形質転換、その他の遺伝子導入技術；相同組換え；部
位特異的突然変異誘発；及び遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定
義によれば、天然起源のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクロ
ーニング及び発現により産生されるタンパク質は、組換え体又は操作されたものとは見な
されない。
本明細書で使用される「野生型」という用語は、同じタイプの遺伝子の対立遺伝子集団
における最も一般的な天然起源の対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）を指し、野
生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドはその元の機能を有する。「野生型」
という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドも指す。野生型対立
遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列（複数の場合も
ある）と比較して１又は複数の突然変異及び／又は置換を含む突然変異体又は変異体の対
立遺伝子及びポリペプチドと区別可能である。野生型の対立遺伝子又はポリペプチドが生
物に正常な表現型を付与できるのに対し、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペ
プチドは、場合によっては、表現型の変化を付与することができる。野生型ヌクレアーゼ
は、組換え、操作された、又は天然に存在しないヌクレアーゼと区別され得る。
組換え又は操作されたタンパク質に関して本明細書で使用される「改変」という用語は
、参照配列（例えば、野生型配列又は天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の
挿入、欠失、又は置換を意味する。
本明細書で使用される場合、「認識配列」という用語は、エンドヌクレアーゼによって
結合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対
で隔てられた逆向きの９塩基対の「ハーフサイト」のペアを含む。１本鎖メガヌクレアー
ゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトに接触し、タンパク質のＣ
末端ドメインは第２のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切断により、４
塩基対の３’「オーバーハング」がもたらされる。「オーバーハング」又は「粘着末端」
は、２本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によってもたらすことができる短い１本
鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩに由来するメガヌクレアーゼ及び１本鎖メガヌ
クレアーゼの場合、オーバーハングは２２塩基対認識配列の１０塩基～１３塩基を含む。
コンパクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ－ＴｅｖＩドメインによって認識される第
１のＣＮＮＮＧＮ配列と、それに続く長さ４塩基対～１６塩基対の非特異的スペーサ、続
いてＴＡＬエフェクタードメインによって認識される長さ１６ｂｐ～２２ｂｐの第２の配
列を含む可能性がある（この配列は典型的には５’Ｔ塩基を有する）。コンパクトＴＡＬ
ＥＮによる切断は２塩基対３’オーバーハングをもたらす。ＣＲＩＳＰＲの場合、認識配
列は、ガイドＲＮＡが結合してＣａｓ９切断を指示するための配列であり、典型的には１
６塩基対～２４塩基対である。ガイド配列と認識配列との間の完全な相補性は、切断を行
うために必ずしも必要ではない。ＣＲＩＳＰＲによる切断は、カスパーゼに応じて、平滑
末端（クラスＩＩ、ＩＩ型カスパーゼ等）又はオーバーハング末端（クラスＩＩ、Ｖ型カ
スパーゼ等）をもたらすことができる。ＣｐｆＩカスパーゼが利用されるそれらの実施形
態では、これを含むＣＲＩＳＰＲ複合体による切断は５’オーバーハングを生じ、或る特
定の実施形態では、５ヌクレオチドの５’オーバーハングを生じる。各カスパーゼ酵素は
また、ガイドＲＮＡに相補的な認識配列の近くにＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）
配列の認識も必要とする。正確な配列、ＰＡＭに対する長さの要件、及び標的配列からの
距離は、カスパーゼ酵素によって異なるが、ＰＡＭは通常、標的／認識配列に近接する２
塩基対～５塩基対の配列である。特定のカスパーゼ酵素のＰＡＭ配列は当該技術分野で知
られており（例えば、各々が全体を引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第８
，６９７，３５９号及び米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号を参照されたい）
、新規又は操作されたカスパーゼ酵素のＰＡＭ配列は、ＰＡＭ枯渇アッセイ（例えば、そ
の全体が本明細書の一部をなす、Ｋａｒｖｅｌｉｓら（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ １２
１－１２２：３－８を参照されたい）等、当該技術分野で知られている方法を使用して識
別され得る。ジンクフィンガーの場合、ＤＮＡ結合ドメインは典型的には、２塩基対～１
０塩基対離れた９塩基対の「ハーフサイト」のペアを含む１８ｂｐ認識配列を認識し、ヌ
クレアーゼによる切断は可変長（多くの場合、４塩基対）の平滑末端又は５’オーバーハ
ングを作る。
本明細書で使用される「標的部位」又は「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認
識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
本明細書で使用される「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」という用語は、メガヌ
クレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）と非共有結合する傾向
を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用されるよ
うに、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが参照ヌクレアーゼと比較して統計学的
に有意なパーセント変化によって増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変更された」
結合親和性を有する。
本明細書で使用される「相同組換え」又は「ＨＲ」という用語は、修復テンプレートと
して相同ＤＮＡ配列を使用して２本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す
（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－
１９７６を参照されたい）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は
外因性核酸であってもよい。
本明細書で使用される「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」という用語は、２本の非相
同ＤＮＡセグメントを直接つなぐことによって２本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞
プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１
１：１９５８－１９７６を参照されたい）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復はエラーを
起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列のテンプレート化されていない付加又は欠失が頻
繁に生じる。場合によっては、標的認識配列での切断により、標的認識部位でＮＨＥＪが
生じる。遺伝子のコード配列の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断後のＮＨＥＪによるＤＮ
Ａ修復は、遺伝子機能を妨げるフレームシフト変異等の変異をコード配列に導入する可能
性がある。従って、操作されたヌクレアーゼを使用して、細胞集団の遺伝子を効果的にノ
ックアウトすることができる。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、抗原に対する特異性を
免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に付与する又はグラフトする操作された受
容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、少なくとも細胞外リガンド結合ドメイン
又は部分と、１つ以上のシグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含む細胞内ド
メインとを含む。
幾つかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、モノクローナル抗体
に由来する１本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）の形態であり、特定のエピトープ又は抗原に特異
性を提供する（例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子等の細胞の
表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原）。幾つかの実施形態では、ｓｃＦｖはリン
カー配列を介して付着している。様々な実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン
は、目的の任意の抗原又はエピトープに特異的である。幾つかの実施形態では、ｓｃＦｖ
はマウス、ヒト化、又は完全にヒトのものである。
キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体に
よって認識され得る自己抗原を含み得（Ｐａｙｎｅら（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３
５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい）、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応
性Ｂリンパ球を特異的に標的として殺傷するようにＴ細胞に指示する。かかるＣＡＲを、
キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と称する場合があり、それらの使用は本発明に含まれ
る。
キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、目的の抗原に対する天然に存在するリガン
ド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含んでも
よい。
細胞内刺激ドメインは、抗原結合後に免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを伝達す
る１又は複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含んでもよい。かかる細胞質シグナル伝達
ドメインとしてはＣＤ３ζが挙げられるが、これに限定されない。
細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖及び／又は細胞生存シグナルを伝達
する１又は複数の細胞内共刺激ドメインを含んでもよい。本明細書で使用される「共刺激
ドメイン」は、活性化時に細胞内増殖及び／又は細胞生存シグナルを伝達するポリペプチ
ドドメインを指す。共刺激ドメインの活性化は、２つの共刺激ドメインポリペプチドのホ
モ二量体化に続いて起こる場合がある。活性化は、例えば、共刺激ドメインを含むコンス
トラクト（例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節コンストラクト）の活性化後にも起
こり得る。一般的には、共刺激ドメインは、膜貫通共刺激受容体、特に共刺激受容体の細
胞内部分に由来し得る。かかる細胞内共刺激ドメインは、当該技術分野で知られているも
ののいずれかであってもよく、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４－１Ｂ
Ｂ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能
関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、
及びＣＤ８３、Ｎ１、Ｎ６と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせ
を含み得る。
キメラ抗原受容体は、ヒンジ又はスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに
付着している膜貫通ドメインを含む、追加の構造要素を更に含んでもよい。膜貫通ドメイ
ンは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ポリ
ペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット（即ち、α、β、γ又はζ、ＣＤ３複合体を構
成するポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）又はγ鎖、Ｆｃ受
容体のサブユニット鎖（例えば、Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）、又はＣＤ８アルファ鎖等のＣＤ
タンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシン
及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。
ヒンジ領域とは、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能
するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、
好ましくは１０個～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５個～５０個のアミノ酸を含
み得る。ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域の全て若しくは一部、
又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよ
い。或いは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又は
完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣ
Ｄ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体又はＩｇＧｌの一部を含む場合がある。
本明細書で使用される「外因性Ｔ細胞受容体」又は「外因性ＴＣＲ」は、その配列がＴ
ＣＲを内因的に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）
のゲノムに導入されるＴＣＲを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性ＴＣＲの発現は、
特定のエピトープ又は抗原（例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒
子の表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原）に対する特異性を付与することができ
る。かかる外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖及びベータ鎖を含んでもよく、あるいは、
ガンマ鎖及びデルタ鎖を含んでもよい。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、目的の任
意の抗原又はエピトープに対して特異性を有してもよい。
本明細書で使用される「発現の低下」という用語は、対照細胞と比較した場合の遺伝子
改変Ｔ細胞の細胞表面での内因性Ｔ細胞受容体の発現の低下を指す。低下したという用語
はまた、対照細胞の集団と比較した場合に、細胞表面で内因性ポリペプチド（即ち、内因
性Ｔ細胞受容体）を発現する細胞集団における細胞の割合の低下を指す場合がある。かか
る低下は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は最大１００％であってもよ
い。従って、「低下した」という用語は、内因性Ｔ細胞受容体の部分的ノックダウンと完
全なノックダウンの両方を包含する。
アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、用語「パーセン
ト同一性」、「配列同一性」、「パーセンテージ類似性」、「配列類似性」等は、整列し
たアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大化し、同一又は類似の残基又はヌクレ
オチドの数、残基又はヌクレオチドの総数、並びに配列アラインメントのギャップの存在
及び長さの関数である、配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似度の尺度を指す
。標準パラメータを使用して配列類似性を決定するため、様々なアルゴリズム及びコンピ
ュータープログラムを使用することができる。本明細書で使用される配列類似性は、アミ
ノ酸配列についてはＢＬＡＳＴｐプログラムを、核酸配列についてはＢＬＡＳＴｎプログ
ラムを使用して測定され、いずれもＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇ
ｏｖ／）から入手可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎら（１９９６），Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）；Ｚｈａｎｇら（２００
０），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：２０３－１４に記載されている。本
明細書で使用される、２つのアミノ酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリ
ズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３；ギャップ開
始ペナルティ＝－１１；ギャップ拡張ペナルティ＝－１；スコアリングマトリクス＝ＢＬ
ＯＳＵＭ６２。本明細書で使用される、２つの核酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳ
Ｔｎアルゴリズムの以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャ
ップ開放ペナルティ＝－５；ギャップ拡張ペナルティ＝－２；マッチリワード＝１；ミス
マッチペナルティ＝－３。
２つのタンパク質又はアミノ酸配列の修飾に関して本明細書で使用される場合、「に対
応する」という用語は、第１のタンパク質の特定の修飾が第２のタンパク質の修飾と同じ
アミノ酸残基の置換であることを示すために使用され、２つのタンパク質が標準的な配列
アラインメントに供される場合（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用する場合）、第
１のタンパク質の修飾のアミノ酸位置は、第２のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応
する又はそれと整列する。したがって、第１のタンパク質の残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」
への修飾は、配列アラインメントにおいて残基Ｘと残基Ｙが互いに一致する場合、ＸとＹ
が異なる数である可能性があるという事実にもかかわらず、第２のタンパク質の残基「Ｙ
」のアミノ酸「Ａ」への修飾に対応する。
本明細書で使用される「認識ハーフサイト」、「認識配列ハーフサイト」、又は単に「
ハーフサイト」という用語は、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体のメガヌクレアーゼのモ
ノマーによって、又は１本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される
２本鎖ＤＮＡ分子内の核酸配列を意味する。
本明細書で使用される「超可変領域」という用語は、比較的高い可変性を有するアミノ
酸を含むメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニット内の局在化された配列を指す。超可
変領域は、約５０～６０の連続した残基、約５３～５７の連続した残基、又は好ましくは
約５６の残基を含むことができる。幾つかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番
号１２～２７のいずれか１つの位置２４～７９又は位置２１５～２７０に対応し得る。超
可変領域は、認識配列内のＤＮＡ塩基と接触する１又は複数の残基を含むことができ、モ
ノマー又はサブユニットの塩基選択性を変更するように修飾することができる。超可変領
域はまた、メガヌクレアーゼが２本鎖ＤＮＡ認識配列と会合する際にＤＮＡ骨格に結合す
る１又は複数の残基を含むことができる。かかる残基を修飾して、ＤＮＡ骨格及び標的認
識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変更することができる。本発明の異なる
実施形態では、超可変領域は、可変性を示す１個～２０個の残基を含むことができ、塩基
選択性及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように修飾されてもよい。特定の実施
形態では、超可変領域は、可変性を示す約１５残基～１８残基を含み、塩基選択性及び／
又はＤＮＡ結合親和性に影響を与えるように改変されてもよい。幾つかの実施形態では、
超可変領域内の可変残基は、配列番号１２～２７のいずれか１つの位置２４、２６、２８
、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７の１
又は複数に対応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号１２～２
７のいずれか１つの位置２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２
３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８のうちの１又は複
数に対応する。
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子」又は「ＴＣＲアルファ遺伝子」
という用語は同じ意味で使用され、Ｔ細胞受容体アルファサブユニットをコードするＴ細
胞内の遺伝子座を指す。Ｔ細胞受容体アルファは、再編成前又は再編成後のＮＣＢＩ遺伝
子ＩＤ番号６９５５を指す場合がある。再編成後、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、内因
性プロモータ、再編成されたＶセグメント及びＪセグメント、内因性スプライスドナー部
位、イントロン、内因性スプライスアクセプター部位、及びサブユニットコーディングエ
クソンを含むＴＲＡＣ遺伝子座を含む。例えば、図１を参照されたい。
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子内のイントロン」および「標的５
’イントロン」という語句は、図１に示すように、再編成されたＴ細胞受容体アルファ遺
伝子においてＶセグメント及びＪセグメントの３’下流のＴＲＡＣエクソン１の５’上流
に位置するイントロンを指し、内因性スプライスドナー部位と内因性スプライスアクセプ
ター部位に隣接している。標的５’イントロンは、配列番号３を含む配列、及び本発明に
包含されるヌクレアーゼ認識配列を保持するその機能性変異体を有することができる。
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体アルファ定常領域」及び「ＴＲＡＣ」という用語
は同じ意味で使用され、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子のコード配列を指す。ＴＲＡＣは、
ＮＣＢＩ Ｇｅｎ ＩＤ ＮＯ．２８７５５によって特定される野生型配列及びその機能
性変異体を含む。
本明細書で使用される「内因性スプライスドナー部位」という用語は、内因性ＴＣＲア
ルファ遺伝子プロモータの３’下流及び再編成されたＶセグメント及びＪセグメント、並
びに標的イントロンの５’上流に位置する天然起源のスプライスドナー部位を指す。同様
に、「内因性スプライスアクセプター部位」とは、標的イントロンの３’下流及びＴＲＡ
Ｃエクソン１のすぐ５’上流にある天然起源のスプライスアクセプター部位を指す。内因
性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセプター部位を、Ｄｅｓｍｅｔら（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９）３７（９）：ｅ６７）に記載さ
れる方法等、当該技術分野で知られている方法によって遺伝子内で特定することができる
。内因性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセプター部位に関する「機能性
」という用語は、介在イントロン配列のスプライシングを実行するために対になる能力を
指す。
本明細書で使用される「外因性スプライスアクセプター部位」という用語は、目的の外
因性配列に含まれ、標的５’イントロンに導入されるスプライスアクセプター部位を指す
。外因性スプライスアクセプター部位は、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子に天然に存在
する配列を含むことができ、又は遺伝子に天然に存在しないスプライスアクセプター配列
（例えば、コンセンサス配列又は異種配列）を含むことができる。外因性スプライスアク
セプター部位は、イントロンのスプライシングを促進する必要がある場合、外因性分岐部
位を更に含んでもよい。かかる分岐部位は、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子に天然に存在す
る配列を含んでもよく、又は遺伝子に天然に存在しない分岐部位配列（例えば、コンセン
サス配列又は異種配列）を含んでもよい。
「組換えＤＮＡコンストラクト」、「組換えコンストラクト」、「発現カセット」、「
発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、及び「組換え
ＤＮＡ断片」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、１本鎖又は２本鎖のポリ
ヌクレオチドである。組換えコンストラクトは、自然界では一緒に見られない調節配列及
びコード配列を含むがこれらに限定されない１本鎖又は２本鎖のポリヌクレオチドの人工
的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡコンストラクトは、異なる供給源に由来す
る調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、天然に見られるものとは異なる方
法で配列された調節配列及びコード配列を含んでもよい。かかるコンストラクトを単独で
使用してもよく、又はベクターと組み合わせて使用してもよい。
本明細書で使用される「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、所与の宿主細胞
においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製システム及び配列を
含むコンストラクトであってもよい。ベクターが使用される場合であれば、ベクターの選
択は、当業者によく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法
に依存する。ベクターには、プラスミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本発明
のメガヌクレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当該技術分野で
知られている他のベクターが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の単
離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を成功裡に形質転換、選択
及び増殖するため、ベクター上に存在しなければならない遺伝要素に精通している。
また、本明細書で使用される「ベクター」はウイルスベクターを指す場合もある。ウイ
ルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が挙げられるが、これらに限
定されない。
本明細書で使用される「ポリシストロン性」ｍＲＮＡは、２つ以上のコード配列（すな
わち、シストロン）を含み、２つ以上のタンパク質をコードする単一のメッセンジャーＲ
ＮＡを指す。ポリシストロン性ｍＲＮＡは、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ
２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含むがこれらに限定されない同じｍＲＮＡ分子からの２つ以
上の遺伝子の翻訳を可能にする、当該技術分野で知られている任意の要素を含むことがで
きる。
本明細書で使用される「ヒトＴ細胞」又は「Ｔ細胞」は、ドナー、特にヒトドナーから
単離されたＴ細胞を指す。Ｔ細胞及びそれに由来する細胞としては、培養で継代されてい
ない単離されたＴ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代及び維持されたＴ細胞、並び
に不死化されて無期限に細胞培養条件下で維持され得るＴ細胞が挙げられる。
本明細書で使用される「ヒトナチュラルキラー細胞」又は「ヒトＮＫ細胞」又は「ナチ
ュラルキラー細胞」又は「ＮＫ細胞」とは、先天性免疫系にとって重要な細胞傷害性リン
パ球のタイプを指す。ＮＫ細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷
害性Ｔ細胞の役割に類似している。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞に迅速に反応し
、腫瘍形成に反応し、感染後約３日で作用する。
本明細書で使用される「対照」又は「対照細胞」とは、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は
表現型の変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、以下
：（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝的変化の出発物質と同
じ遺伝子型の細胞；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌルコンスト
ラクトで（即ち、目的の特性に既知の影響を与えないコンストラクトで）形質転換されて
いる細胞；又は、（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変更された遺伝子型若
しくは表現型の発現を誘発する条件若しくは刺激、又は更なる遺伝子改変に曝露されてい
ない細胞、を含んでもよい。
本明細書で使用する「治療」又は「被験体の治療」という用語は、疾患を有する被験体
への本発明の遺伝子改変Ｔ細胞の投与を指す。例えば、被験体は癌等の疾患を有する可能
性があり、治療は疾患の治療のための免疫療法となる可能性がある。治療の望ましい効果
としては、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的
結果の減少、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善
が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの態様では、本明細書に記載される遺伝
子改変細胞は、治療中に本発明の医薬組成物の形態で投与される。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益又は望ましい生物学的な及び／又は
臨床上の結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤又は組成物
、疾患及びその重症度、並びに治療される被験体の年齢、体重、身体状態及び反応性に応
じて変化する。
本明細書で使用される「癌」という用語は、悪性の増殖又は腫瘍を引き起こす異常で制
御されない細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患（浸潤性又は転移性を問わない）を包
含すると理解されるべきである。
本明細書で使用される「癌腫」という用語は、上皮細胞で構成される悪性の増殖を指す
。
本明細書で使用される「白血病」という用語は、造血器官／系の悪性腫瘍を指し、一般
的には、血液及び骨髄における白血球及びそれらの前駆体の異常な増殖及び発達を特徴と
する。
本明細書で使用される「肉腫」という用語は、胚性結合組織のような物質で構成され、
一般に線維性、不均一又は均一な物質に埋め込まれた密に詰まった細胞で構成される腫瘍
を指す。
本明細書で使用される「黒色腫」という用語は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系か
ら生じる腫瘍を指す。
本明細書で使用される「リンパ腫」という用語は、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍
のグループを指す。
本明細書で使用される「芽細胞腫」という用語は、前駆細胞又は芽細胞（未成熟又は胚
組織）の悪性腫瘍によって引き起こされる癌のタイプを指す。
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等
しい変数で本発明が実施され得ると伝えることを意図している。したがって、本質的に不
連続な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しい場
合がある。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範
囲内の任意の実数値に等しい場合がある。例として、制限されずに、０～２の間の値を持
つと記載される変数は、該変数が本質的に不連続である場合、値０、１、又は２を取るこ
とができ、該変数が本質的に連続している場合、値０．０、０．１、０．０１、０．００
１、又は０以上２以下の任意の他の実数値を取ることができる。
２．１発明の原理
本発明は、部分的に、目的の配列（外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリ
Ａシグナルを含む）をＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンのヌクレアーゼ
切断部位に挿入することが、インサートが存在する場合にのみＴＣＲ－細胞の産生を可能
にするという発見に基づいている。インサートが存在しない場合、ヌクレアーゼ改変イン
トロンは単純に除去され、内因性遺伝子が発現される。従って、被験体の配列がＣＡＲコ
ード配列を含む例では、本発明は、ほとんど又は全てのＴＣＲ－細胞がＴＣＲ－／ＣＡＲ
＋細胞である集団を産生する方法を提供する。他の任意の目的のペプチドを、ＣＡＲと同
じ方法で目的の配列から発現させることができる。
対照的に、改変Ｔ細胞を生成するための従来のヌクレアーゼベースのアプローチは、Ｔ
ＲＡＣ及び／又はＴＲＡＣエクソン１の５’上流の内因性スプライスアクセプター部位の
コード配列を標的とする。その結果、インデルを作製してタンパク質発現を中断させるヌ
クレアーゼ切断部位でのＮＨＥＪにより、かなりの割合のＴＣＲ－／ＣＡＲ－細胞を含む
ＴＣＲ－細胞の高度に混合された集団を生成することができる。
したがって、ＴＣＲ－細胞の混合集団を精製する必要性を減らすことにより、本発明は
、抗原特異的ＣＡＲを発現し、内因性ＴＣＲの発現が低下している同種異系ＣＡＲ Ｔ細
胞の集団を産生する単純化された方法を提供する。かかる細胞は、同種異系の被験体に投
与された場合、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の誘導の減少を示すか、又はそれを全く示さ
ない可能性がある。さらに、目的の外因性配列に２Ａ要素を含めることにより、外因性プ
ロモータではなく内因性Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子プロモータによって駆動されるコー
ド配列の発現が可能になる。このようにして、ＣＡＲ等のポリペプチドの発現は、ＴＣＲ
発現に通常関連するＴ細胞フィードバック機構によって制御される。
２．２ Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロン内の認識配列を認識して切断
するためのヌクレアーゼ
当該技術分野では、部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノムにおいてＤＮＡ
切断を起こすことが可能であり、かかるＤＮＡ切断によって変異誘発ＮＨＥＪ修復又はト
ランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介するゲノムの永続的な改変をもたらすこ
とができることが既知である。ＮＨＥＪは切断部位で突然変異誘発を引き起こし、対立遺
伝子の不活性化をもたらす。ＮＨＥＪ関連の突然変異誘発は、早期停止コドン、異常な非
機能性タンパク質を産生するフレームシフト変異の生成を介して対立遺伝子を不活性化す
るか、又はナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊等の機構を誘発する可能性がある。ＮＨＥＪを介
した突然変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用を、野生型対立遺伝子に存在する特定の
突然変異又は配列を標的とするために使用することができる。標的遺伝子座の２本鎖切断
を誘導するヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的に相同な配列が隣接するトランスジェ
ニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが知られている。このようにして、外因性
核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。かかる外因性核酸は、例えば、キメラ
抗原受容体、外因性ＴＣＲ、又は目的の任意の配列若しくはポリペプチドをコードしても
よい。
異なる実施形態では、様々な異なるタイプのヌクレアーゼが本発明の実施に有用である
。一実施形態では、本発明を、操作されたメガヌクレアーゼを使用して実施することがで
きる。別の実施形態では、本発明を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲニッカ
ーゼを使用して実施することができる。所定のＤＮＡ部位を認識するＣＲＩＳＰＲ及びＣ
ＲＩＳＰＲニッカーゼを作製する方法は、当該技術分野、例えばＲａｎら（２０１３）Ｎ
ａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１－３０８において知られている。別の実施形態では、
本発明を、ＴＡＬＥＮ又はコンパクトＴＡＬＥＮを使用して実施することができる。所定
のＤＮＡ部位に結合するＴＡＬＥドメインを作製する方法は、当該技術分野、例えばＲｅ
ｙｏｎら（２０１２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：４６０－５において知られ
ている。別の実施形態において、本発明を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を
使用して実施することができる。更なる実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬを使用して本発明
を実施することができる。
好ましい実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは１本鎖メガ
ヌクレアーゼである。１本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって結合された
Ｎ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインはそれぞれ、認識配
列の半分（即ち、認識ハーフサイト）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニッ
トの境界近くの認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ
切断が４塩基対の３’１本鎖オーバーハングを生成するように４塩基対のペアによって相
殺される。
幾つかの例では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１１－１２認識配列
（配列番号４）を認識して切断するように操作されている。かかる操作されたメガヌクレ
アーゼは、本明細書では集合的に「ＴＲＣ１１－１２メガヌクレアーゼ」と称される。例
示的なＴＲＣ１１－１２メガヌクレアーゼが、配列番号１２～１５に提供される。
更なる例では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１５－１６認識配列（
配列番号６）を認識して切断するように操作されている。かかる操作されたメガヌクレア
ーゼは、本明細書では集合的に「ＴＲＣ１５－１６メガヌクレアーゼ」と称される。例示
的なＴＲＣ１５－１６メガヌクレアーゼが、配列番号１６～１９に提供される。
更なる例では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１７－１８認識配列（
配列番号８）を認識して切断するように操作されている。かかる操作されたメガヌクレア
ーゼは、本明細書では集合的に「ＴＲＣ１７－１８メガヌクレアーゼ」と称される。例示
的なＴＲＣ１７－１８メガヌクレアーゼが、配列番号２０～２３に提供される。
更なる例では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１９－２０認識配列（
配列番号１０）を認識して切断するように操作されている。かかる操作されたメガヌクレ
アーゼは、本明細書では集合的に「ＴＲＣ１９－２０メガヌクレアーゼ」と称される。例
示的なＴＲＣ１９－２０メガヌクレアーゼが、配列番号２４～２７に提供される。
本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む第１の
サブユニットと、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットとを含む。更
に、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識ハーフサイト（ＴＲＣ１１、ＴＲＣ１５
、ＴＲＣ１７、又はＴＲＣ１９ハーフサイト等）に結合し、第２のサブユニットは認識配
列の第２の認識ハーフサイト（例えば、ＴＲＣ１２、ＴＲＣ１６、ＴＲＣ１８、又はＴＲ
Ｃ２０のハーフサイト）に結合する。組換えメガヌクレアーゼが１本鎖メガヌクレアーゼ
である実施形態では、第１及び第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み、第１のハー
フサイトに結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２
領域を含み、第２のハーフサイトに結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットと
して配置されるように、方向付けられる。別の実施形態では、第１及び第２のサブユニッ
トは、ＨＶＲ１領域を含み、第１のハーフサイトに結合する第１のサブユニットがＣ末端
サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み、第２のハーフサイトに結合する第２
のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置されるように、方向付けられる。本発明
の例示的なＴＲＣ１１－１２メガヌクレアーゼを表１に提供する。本発明の例示的なＴＲ
Ｃ１５－１６メガヌクレアーゼを表２に提供する。本発明の例示的なＴＲＣ１７－１８メ
ガヌクレアーゼを表３に提供する。本発明の例示的なＴＲＣ１９－２０メガヌクレアーゼ
を表４に提供する。
表１：ＴＲＣ１－２認識配列（配列番号４）を認識して切断するように操作された例示的
な操作されたメガヌクレアーゼ
表２：ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）を認識して切断するように操作された例
示的な操作されたメガヌクレアーゼ
表３：ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）を認識して切断するように操作された例
示的な操作されたメガヌクレアーゼ
表４：ＴＲＣ１９－２０認識配列（配列番号１０）を認識して切断するように操作された
例示的な操作されたメガヌクレアーゼ
２．３ 遺伝子改変細胞を産生する方法
再編成の後、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子は多くの要素を含む。一般に、特定の理
論に拘束されることなく、これらの要素には、５’から３’に、内因性プロモータ、再編
成されたＶセグメント及びＪセグメント、内因性スプライスドナー部位、イントロン（す
なわち、標的５’イントロン）、内因性スプライスアクセプター部位、並びにエクソン及
びインタースペースイントロンをコードするアルファサブユニットを含むＴＲＡＣ遺伝子
座を含む。例えば、図１を参照されたい。
本明細書に開示される発明は、改変されたＴＣＲアルファ遺伝子を含む遺伝子改変Ｔ細
胞を産生する方法を提供する。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血
、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍を含む多くの供給源から取得
され得る。本開示の或る特定の実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細
胞株を使用することができる。本開示の幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は、当業者に知ら
れている任意の数の技術を使用して、被験体から収集された血液単位から得られる。一実
施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得られる。
改変されたＴ細胞受容体アルファ遺伝子は、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置する
ＴＣＲアルファ遺伝子内のイントロンに挿入された目的の外因性配列（即ち、標的５’イ
ントロン）を含む。より具体的には、目的の外因性配列は、再編成されたＶセグメント及
びＪセグメント、並びに内因性スプライスドナー部位の３’下流、並びに内因性スプライ
スアクセプター部位の５’上流に挿入され得る。具体的な実施形態では、標的５’イント
ロンは、配列番号３に記載の配列、又は配列番号３に記載される核酸配列と少なくとも７
５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一
性を有し、本明細書に記載される操作されたヌクレアーゼの認識配列を含む配列を含む。
幾つかの実施形態では、目的の外因性配列は、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフ
ィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
、又はｍｅｇａＴＡＬ等の操作されたヌクレアーゼによって生成された２本鎖切断部位で
イントロンに挿入され得る。かかるヌクレアーゼによって生成された切断部位は、目的の
外因性配列の５’イントロンへの直接の相同組換えを可能にし得る。
「内因性スプライスドナー部位」は、内因性ＴＣＲアルファ遺伝子プロモータの３’下
流及び再編成されたＶセグメント及びＪセグメント、並びに標的イントロンの５’上流に
ある、天然起源のスプライスドナー部位を指す。同様に、「内因性スプライスアクセプタ
ー部位」とは、標的イントロンの３’下流及びＴＲＡＣエクソン１のすぐ５’上流にある
天然起源のスプライスアクセプター部位を指す。図１を参照されたい。
具体的な実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼは、内因性スプ
ライスドナー部位又は内因性スプライスアクセプター部位のいずれも改変しないが、それ
は、両方の部位が本発明を実施するための機能性を保持するはずであるからである。幾つ
かの実施形態では、内因性スプライスドナー部位及び／又は内因性スプライスアクセプタ
ー部位は、各部位が他方と対合する能力を保持し、イントロンをスプライスする（すなわ
ち機能性を保持する）限り、改変することができる。したがって、本明細書で使用される
場合、機能性の内因性スプライスドナー部位は、内因性スプライスアクセプター部位と対
合してイントロンを除去する能力を有する。同様に、本明細書で使用される場合、機能性
の内因性スプライスアクセプター部位は、内因性スプライスドナー部位と対合してイント
ロンを除去する能力を有する。
特定の実施形態では、目的の配列は外因性スプライスアクセプター部位を含むことがで
きる。本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列に関して「外因性」又は「異種」と
いう用語は、純粋に合成される、外来種に由来する、又は同じ種に由来する場合、意図的
な人間の介入により、組成及び／又はゲノム遺伝子座の天然の形態から実質的に改変され
る配列を意味する。したがって、外因性スプライスアクセプター部位は、純粋に合成され
たスプライスアクセプター部位、又は配列もしくはゲノム遺伝子座が改変されたヒトゲノ
ムからのスプライスアクセプター部位であってもよい。
具体的な実施形態では、外因性スプライスアクセプター部位は、介在イントロン配列を
スプライスアウトするために内因性スプライスドナー部位と提携することができる。この
ようにして、外因性スプライスアクセプター部位は、内因性スプライスドナー部位と提携
するために内因性スプライスアクセプター部位と競合することによって、標的５’イント
ロンの自然なスプライシングを妨害する可能性がある。
様々な実施形態において、目的の外因性配列は、目的のタンパク質のコード配列を含む
ことができる。コード配列は、目的の任意のタンパク質に対するものであり得ると想定さ
れる。
或る特定の実施形態では、目的の外因性配列は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。
一般に、本開示のＣＡＲは、少なくとも細胞外ドメイン及び細胞内ドメインを含む。幾つ
かの実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン又はリガンド結合部分とも
称される標的特異的結合要素を含む。幾つかの実施形態では、細胞内ドメイン又は細胞質
ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインと、例えばＣＤ３ζ等の１又は複数のシグ
ナル伝達ドメインとを含む。他の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ３ζ等のシグナル伝達ドメ
インのみを含んでもよく、細胞は、細胞内で発現される別のコンストラクト上に１又は複
数の共刺激ドメインを含んでもよい。
幾つかの実施形態では、本発明において有用なＣＡＲは、リガンド結合ドメイン又はリ
ガンド結合部分とも称される細胞外の標的特異的結合要素を含む。リガンド結合ドメイン
の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、リガン
ド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用
するリガンドを認識するように選択されてもよい。従って、ＣＡＲにおけるリガンド結合
ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌及
び寄生虫の感染症、自己免疫疾患、並びに癌細胞に関連するものを挙げることができる。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガンド
結合部分を操作することにより、目的の腫瘍特異的抗原を標的とするように操作される。
本開示に関して、「腫瘍抗原」とは、癌等の特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す
。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原又
はエピトープ、特に目的の任意の腫瘍抗原又はエピトープに特異的である。非限定的な例
として、幾つかの実施形態では、標的の抗原は、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎
児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ
）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ
３０、ＣＤ４０、ＣＬＬ１、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、
ＴＡＧ－７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、Ｂ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡ
ＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、
腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、
プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－ｌａ、ｐ５
３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、サバイビング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）及びテロメラーゼ、
前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、
エフリンＢ２、インスリン成長因子（ＩＧＦｌ）－１、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、
メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分
子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンの追
加ドメインＡ（ＥＤＡ）及び追加ドメインＢ（ＥＤＢ）並びにテネイシンＣのＡｌドメイ
ン（ＴｎＣ Ａｌ）、並びに維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）等の腫瘍関連表面抗原；
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１
２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ
８６）等の系統特異的又は組織特異的抗原、エンドグリン、主要組織適合複合体（ＭＨＣ
）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＳ１、又はＨＩＶ特異抗原（Ｈ
ＩＶ ｇｐｌ２０等）等のウイルス特異表面抗原；ＥＢＶ特異抗原、ＣＭＶ特異抗原、Ｅ
６又はＥ７腫瘍性タンパク質等のＨＰＶ特異抗原、ラッセウイルス特異抗原、インフルエ
ンザウイルス特異抗原と並んで、これらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体である
。本開示の特定の実施形態では、リガンド結合ドメインはＣＤ１９に特異的である。
幾つかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、Ｂリンパ球上の自己抗
原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原を更に含み（Ｐａｙｎｅら（２０１
６）Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．３５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい）
、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的として殺傷するようにＴ
細胞に指示する。かかるＣＡＲは、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と称される場合が
ある。
幾つかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、目的の抗原に対する天
然に存在するリガンド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガン
ドの断片を含んでもよい。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ又はスペーサ配列を介して、細胞外リガンド
結合ドメイン又は自己抗原を細胞内シグナル伝達及び共刺激ドメインと連結する膜貫通ド
メインを含む。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来
し得る。例えば、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット（即ち、α、β、
γ又はζ、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７
５（β鎖）又はγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖（例えば、Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）、又
はＣＤ８アルファ鎖等のＣＤタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合
成であってもよく、ロイシン及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。特定の例で
は、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ポリペプチドである。
ヒンジ領域とは、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能
するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、
好ましくは１０個～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５個～５０個のアミノ酸を含
み得る。ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域の全て若しくは一部、
又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよ
い。或いは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又は
完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣ
Ｄ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体又はＩｇＧｌの一部を含む場合がある。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが置かれた細胞の正常なエフェクター
機能の少なくとも１つの活性化及び／又は増殖及び細胞生存の経路の活性化を担う。「エ
フェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は
、例えば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってもよい。
ＣＤ３ζ等の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合に応答して細胞に活
性化シグナルを提供することができる。検討されるように、活性化シグナルは、例えば細
胞溶解活性又はサイトカイン分泌等の細胞のエフェクター機能を誘導することができる。
ＣＡＲの細胞内ドメインには、細胞外ドメインの結合後に、細胞増殖、細胞生存、及び
／又はサイトカイン分泌を促進するために共刺激シグナルを伝達する１つ以上の細胞内共
刺激ドメインを含めることができる。かかる細胞内共刺激ドメインとしては、限定されな
いが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、
ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、Ｃ
Ｄ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３、Ｎ１、又はＮ６と特異的に
結合するリガンド等の当該技術分野で知られているものが挙げられる。
ＣＡＲは、任意の種類の癌細胞に特異的であり得る。かかる癌としては、癌腫、リンパ
腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、
黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ
腫が挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌と
しては、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞非ホジ
キンリンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
目的の配列は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を更にコードすることができる。かかる
外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖及びベータ鎖を含んでもよく、あるいは、ガンマ鎖及
びデルタ鎖を含んでもよい。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、目的の任意の抗原又
はエピトープに対して特異性を有してもよい。
他の実施形態では、目的の配列は、目的の内因性遺伝子の野生型又は改変バージョンを
コードすることができる。
目的の配列は、ＩＲＥＳ要素、並びにＴ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２
Ａ要素等の２Ａ要素を含むがこれらに限定されない、同じｍＲＮＡ分子からの更に２つの
遺伝子の翻訳を可能にする、当該技術分野で知られている要素又はペプチドを含むことが
できる。具体的な実施形態では、目的の外因性配列におけるかかる要素は、目的のタンパ
ク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸配列の５’上流に配置することができる。
本明細書に記載される目的の外因性配列は、追加の制御配列を更に含むことができる。
例えば、目的の配列は、相同組換えエンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配
列、転写終結配列、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点等を含
むことができる。また、本明細書に記載される目的の配列は、少なくとも１つの核局在化
シグナルを含んでもよい。核局在化シグナルの例は当該技術分野で知られている（例えば
、Ｌａｎｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１－５１０５を
参照されたい）。
具体的な実施形態では、目的の外因性配列は、ポリアデニル化配列又はポリＡシグナル
を含む。したがって、目的の配列は、目的のタンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする
配列の３’下流に位置するポリＡシグナルを含むことができる。このようにして、Ｔ細胞
受容体アルファ遺伝子、特にＴＲＡＣ遺伝子座のコード配列の転写は、ポリＡシグナルに
よって妨害され、Ｔ細胞受容体アルファサブユニットの発現が妨げられる。
本発明の幾つかの例では、目的の外因性配列は、５’から３’に、外因性スプライスア
クセプター部位、２Ａ要素又はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及びポリ
Ａシグナルを含む。特定の例では、被験体の外因性配列には、５’から３’に、外因性ス
プライスアクセプター部位、２Ａ要素又はＩＲＥＳ要素、ＣＡＲ又は外因性Ｔ細胞受容体
のコード配列、及びポリＡシグナルを含む。幾つかの例では、目的の外因性配列は、外因
性スプライスアクセプター部位の５’上流に位置する外因性分岐部位を更に含むことがで
きる。本発明の様々な例では、２Ａ要素は、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、又は
Ｆ２Ａ要素であってもよいが、これらに限定されない。
本発明の操作されたヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましくは、操作され
たヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。かかる核酸は、ＤＮＡ（例
えば、環状又は線形化されたプラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）又はＲＮＡ（例えば、ｍ
ＲＮＡ）であってもよい。操作されたヌクレアーゼコード配列がＤＮＡ形態で送達される
実施形態では、ヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに制御可能に連結
されなくてはならない。本発明に適した哺乳動物プロモータとしては、サイトメガロウイ
ルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎら（１９８４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６５９－６３）又はＳＶ４０初期プロモータ（
Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０
４）：３０４－１０）等の構成的プロモータと並んで、テトラサイクリン誘導性プロモー
タ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎら（１９９２），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：
４０３８－４５）等の誘導性プロモータが挙げられる。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに
統合される可能性を減らすことから、操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが細
胞に送達される。操作されたヌクレアーゼをコードするかかるｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ転写等の当該技術分野で知られている方法を使用して産生され得る。幾つかの態様で
は、ｍＲＮＡは７－メチル－グアノシンを使用してキャップされる。幾つかの態様では、
ｍＲＮＡはポリアデニル化されていてもよい。
特定の実施形態では、本発明の操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、細胞
内で同時に発現される２つ以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡで
あってもよい。ポリシストロン性ｍＲＮＡは、同じ標的遺伝子内の異なる認識配列を標的
とする２つ以上の本発明のヌクレアーゼをコードし得る。或いは、ポリシストロン性ｍＲ
ＮＡは、本明細書に記載される少なくとも１つのヌクレアーゼ、及び同じ遺伝子に位置す
る別個の認識配列を標的とする、又は両方の遺伝子において切断部位が生成されるように
第２の遺伝子に位置する第２の認識配列を標的とする、少なくとも１つの追加のヌクレア
ーゼをコードし得る。ポリシストロン性ｍＲＮＡは、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ
要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含むがこれらに限定されない同じｍＲＮＡ分子から
の２つ以上の遺伝子（すなわちシストロン）の翻訳を可能にする、当該技術分野で知られ
ている任意の要素を含むことができる。
精製されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に送達してゲノムＤＮＡを切断することがで
き、これにより、当該分野で知られている多様な異なるメカニズムにより、目的の配列と
の切断部位での相同組換え又は非相同末端結合が可能になる。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞への取り込みを促進するために、細胞透過性
ペプチド又は標的リガンドに連結される。当該分野で知られている細胞透過性ペプチドの
例としては、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら（２００８）Ｍ
ｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄ
ｅｃｚら（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓ
ｉｍｅｏｎｉら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２
７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４
３：７６９８－７７０６、及びＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００５
）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９が挙げられる。別の実施
形態では、操作されたヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／
ｍＲＮＡは、共有結合又は非共有結合により、ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮ
Ａが標的細胞に結合し、及び標的細胞によって内在化されるように、標的細胞に発現した
特定の細胞表面受容体を認識する抗体に連結される。或いは、操作されたヌクレアーゼタ
ンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、かかる細胞表面受容体の天然リガンド（又は天然リガン
ドの一部）に共有結合又は非共有結合により連結され得る（ＭｃＣａｌｌら（２０１４）
Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａら（２０１３
）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇら（
２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；
Ｑｉａｎら（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当該技術分野で知られている方法を使用して、ナ
ノ粒子に共有結合若しくは好ましくは非共有結合によって連結されるか、又はかかるナノ
粒子内にカプセル化される（Ｓｈａｒｍａら（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ
．２０１４）。ナノ粒子は、その長さの尺度が１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満の
ナノスケール送達システムである。かかるナノ粒子を、金属、脂質、ポリマー、又は生体
高分子で構成されるコアを使用して設計することができ、組換えメガヌクレアーゼタンパ
ク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又はカプセル化させる
ことができる。これにより、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー
数が増加するため、各操作されたヌクレアーゼの細胞内発現が増加し、標的認識配列が切
断される可能性が最大になる。かかるナノ粒子の表面は、コアシェルナノ粒子を形成する
ため、ポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質
）で更に修飾されてもよく、その表面がペイロードの細胞送達及び取り込みを強化する追
加機能を付与する（Ｊｉａｎら（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：
７６２１－３０）。ナノ粒子はさらに、ナノ粒子を適切な細胞型に誘導し、及び／又は細
胞取り込みの可能性を高めるために、標的分子に有利に結合され得る。かかる標的分子の
例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体の天然リガンド（又は天
然リガンドの一部）が挙げられる。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼ又は操作されたヌクレアーゼをコード
するＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されるか、又はカチオン性脂質を使
用して複合体化される（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓら（２０１５）Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａら（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照されたい）。リポソーム及びリポプレック
ス製剤は、ペイロードを分解から保護し、細胞の細胞膜との融合及び／又は破壊を通じて
細胞の取り込み及び送達効率を促進することができる。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えばＰＬＧＡ）内にカプセル化
されるか、カチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合化される（Ｔａ
ｍｂｏｌｉら（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わさ
れる（Ｔｏｎｇら（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５６－６６）。高
分子ミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的相互作用を低
減し得る親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェル
を含む場合がある。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞への送達のため、エマルジョン又はナノエマ
ルジョン（すなわち、１ｎｍ未満の平均粒子直径を有する）に製剤化される。「エマルジ
ョン」という用語は、水に混和しない相が水相と混合される際に、非極性残基（例えば、
長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水性力の結果として形成す
ることができる脂質構造を含む、水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油中水中油型
の分散液又は液滴のいずれかを指すが、これらに限定されない。これらの他の脂質構造と
しては、単層、少層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）、及び多層の脂質小胞、ミセル、及
びラメラの相が挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相及び親油性
相（典型的には、油及び有機溶媒を含む）で構成されている。エマルジョンはまた、しば
しば１又は複数の界面活性剤を含む。例えば、各々がその全体を引用することで本明細書
の一部をなす、米国特許出願番号第２００２／００４５６６７号及び同第２００４／００
４３０４１号、並びに米国特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同
第６，６３５，６７６号、及び同第６，５５９，１８９号に記載されるように、ナノエマ
ルジョン製剤がよく知られている。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリ
マー、及びポリマーデンドリマーに共有結合的に会合又は非共有結合的に付着され得る（
Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓら（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６；
Ｃｈｅｎｇら（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デン
ドリマーの生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、高いペイロード容量を提供
することができる。更に、複数の表面基の提示を活用して、安定性を改善し、非特異的な
相互作用を減らすことができる。
幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼ及び／又は目的の配列をコードする遺
伝子は、ウイルスベクターを使用して細胞に導入される。かかるベクターは当技術分野で
知られており、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベク
ター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉら（２
０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２で概説される）。本発明において
有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及び細胞ゲノムへのヌクレ
アーゼ遺伝子の挿入を可能にする任意の血清型を有し得る。特定の実施形態では、組換え
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはま
た、宿主細胞において２本鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であってもよい
（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。
操作されたヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡの形（例えばプラスミド）及び／又はウイルス
ベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに制御可能に連
結されなければならない。幾つかの実施形態では、これは、ウイルスベクター由来の内因
性プロモータ（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）、又はよく知られているサイ
トメガロウイルス若しくはＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等のウイルスプロモータであ
ってもよい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞
）において優先的に遺伝子発現を駆動するプロモータに制御可能に連結される。
本発明は更に、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子、特に標的５’イントロン内の認識配列へ
の目的の外因性配列の導入を提供する。幾つかの実施形態では、目的の外因性配列は、イ
ンサートの要素（即ち、外因性スプライスアクセプター部位、ＩＲＥＳ又は２Ａ要素、目
的のタンパク質のコード配列、及び／又はポリＡシグナル）に隣接する５’相同性アーム
及び３’相同性アームを含む。かかる相同性アームは、切断部位が生成される標的５’イ
ントロンのヌクレアーゼ認識配列の５’上流及び３’下流の対応する配列と配列相同性を
有する。一般に、相同性アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００
塩基対、及び最大２０００塩基対以上の長さを持つことができ、ゲノム中のそれらの対応
する配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、又はそれ以上の配
列相同性を有し得る。
本発明の目的の外因性配列は、前述の手段のいずれかによって細胞に導入され得る。特
定の実施形態では、目的の外因性配列は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイ
ルス等のウイルスベクター、又は好ましくは組換えＡＡＶベクターによって導入される。
外因性核酸の導入に有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及び細
胞ゲノムへの外因性核酸配列の挿入を可能にする任意の血清型を有し得る。特定の実施形
態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡ
Ｖベクターはまた、宿主細胞において２本鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的
であってもよい。
別の特定の実施形態では、１本鎖ＤＮＡテンプレートを使用して、目的の外因性配列を
細胞に導入することができる。１本鎖ＤＮＡは、目的の外因性配列を含むことができ、好
ましい実施形態では、相同組換えによるヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進
する５’相同性アーム及び３’相同性アームを含んでもよい。１本鎖ＤＮＡは、５’相同
性アームの５’上流の５’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、及び３’相同性アーム
の３’下流の３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列を更に含んでもよい。
別の特定の実施形態では、本発明の操作されたヌクレアーゼ及び／又は本発明の目的の
外因性配列をコードする遺伝子は、線形化されたＤＮＡテンプレートを用いる形質移入に
より細胞に導入され得る。幾つかの例では、細胞への形質移入の前に環状プラスミドＤＮ
Ａが線形化されるように、プラスミドＤＮＡを１又は複数の制限酵素で消化してもよい。
本発明により改変されたＴ細胞は、ヌクレアーゼ及び／又は目的の外因性配列の導入前
に活性化を必要とする場合がある。例えば、Ｔ細胞は、細胞を活性化するのに十分な期間
、可溶性である又は支持体（即ち、ビーズ）に結合している抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体
と接触させることができる。
本発明の遺伝子改変細胞を更に改変して、１又は複数の誘導性自殺遺伝子を発現させる
ことができ、その誘導は細胞死を引き起こし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの
細胞の選択的破壊を可能にする。幾つかの例では、自殺遺伝子は、細胞毒性ポリペプチド
、非毒性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換する能力を有するポリペプチド、及び／又は
細胞内の細胞毒性遺伝子経路を活性化するポリペプチドをコードし得る。つまり、自殺遺
伝子は、それ自体で、又は他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす生成物をコードする
核酸である。かかる自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを
コードするものである。追加の例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼをコード
する遺伝子、及び５－フルオロシトシンを非常に毒性の高い化合物５－フルオロウラシル
に変換できる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼである。自殺遺伝子には、非限定的な例と
して、カスパーゼ－９、カスパーゼ－８、又はシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子
も含まれる。幾つかの例では、特定の化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ：ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を使用してカスパーゼ－９を活
性化することができる。自殺遺伝子は、細胞を治療及び／又は細胞傷害性モノクローナル
抗体に対して感受性にする細胞の表面で発現されるポリペプチドをコードしてもよい。更
なる例では、自殺遺伝子は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂリツキシマブによって認識される抗原モ
チーフ及び自殺遺伝子を発現する細胞の選択を可能にするエピトープを含む組換え抗原ポ
リペプチドをコードしてもよい。例えば、国際公開第２０１３１５３３９１号に記載され
る２つのリツキシマブ結合エピトープと、１つのＱＢＥｎｄ１０結合エピトープとを含む
ＲＱＲ８ポリペプチドを参照されたい。かかる遺伝子の場合、必要に応じてリツキシマブ
を被験体に投与して細胞枯渇を誘導することができる。更なる例では、自殺遺伝子は、切
断型ＥＧＦＲポリペプチドと組み合わせて発現されるＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含
み得る。
本明細書に記載される方法及び組成物によって改変されたＴ細胞は、内因性Ｔ細胞受容
体の発現を低下させることができ、任意に、目的のタンパク質（例えばＣＡＲ）を更に発
現させることができる。従って、本発明は更に、目的のタンパク質を発現し、内因性Ｔ細
胞受容体を発現しないＴ細胞の集団を提供する。例えば、該集団は、ＣＡＲを発現する（
すなわちＣＡＲ＋である）本発明の複数の遺伝子改変Ｔ細胞又は外因性Ｔ細胞受容体（す
なわちｅｘｏＴＣＲ＋）を含むことができ、内因性Ｔ細胞受容体の発現が低下している（
すなわち、ＴＣＲ－）。本発明の様々な実施形態において、上記集団中の細胞の少なくと
も１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％
、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なく
とも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５
％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１０
０％が、本明細書に記載される遺伝子改変Ｔ細胞である。特定の例では、上記集団は、少
なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも
３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、
少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくと
も７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最
大１００％のＴＣＲ－及びＣＡＲ＋の両方である細胞を含み得る。
２．４ 医薬組成物
幾つかの態様では、本発明は、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞、又は本発明の遺伝子改変Ｔ
細胞の集団、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成
物は、既知の技術に従って調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００
５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、細胞は典型的には薬学的に
許容可能な担体と混合され、得られた組成物が被験体に投与される。担体は、もちろん、
製剤中の他の成分と適合性があるという意味で許容可能でなければならず、被験体に有害
であってはならない。幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、被験体の疾患の治
療に有用な１又は複数の追加の薬剤を更に含み得る。更なる実施形態では、本発明の医薬
組成物は、遺伝子改変Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞増殖及び生着を促進するサイトカ
イン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１）等の生体分子
を更に含むことができる。本発明の遺伝子改変Ｔ細胞を含む医薬組成物を、追加の薬剤又
は生体分子と同じ組成物において投与してもよく、又は代替的には別の組成物において同
時投与してもよい。
本開示はまた、医薬品として使用するための本明細書に記載される遺伝子改変細胞又は
その集団を提供する。本開示は更に、本明細書に記載される遺伝子改変細胞又はその集団
を必要とする被験体の疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される
遺伝子改変細胞又はその集団の使用を提供する。かかる一態様では、医薬は、それを必要
とする被験体の癌免疫療法に有用である。
本発明の医薬組成物は、Ｔ細胞養子免疫療法により標的とされ得るあらゆる病状の治療
に有用となり得る。本開示の医薬組成物及び医薬で治療され得る癌の非限定的な例は、Ｂ
細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、横紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌（
ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚
又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、
胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子
宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状
腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、リンパ球性
リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発
性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒ）
、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって
誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ
腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細胞リ
ンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫
、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、癌腫、リンパ腫
、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍である。ある特定の実施形態では、
Ｂ細胞起源の癌としては、Ｂ細胞系の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白
血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ（小児適
応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫
、多発性骨髄腫、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない
。
本開示の遺伝子改変細胞で癌を治療するこれらの実施形態の幾つかでは、遺伝子改変細
胞が投与された被験体に、放射線、手術、又は化学療法剤等の追加の治療を更に適用する
。
本発明はさらに、ゲノムに目的の配列をコードする外因性核酸分子を含む、本明細書に
記載される複数の遺伝子改変細胞を含む遺伝子改変細胞の集団を提供し、ここで、外因性
核酸分子はＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンに挿入され、内因性ＴＣＲ
の細胞表面発現は低下している。従って、本発明の様々な実施形態において、遺伝子改変
細胞の集団が提供され、該集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なく
とも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０
％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少な
くとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８
５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少
なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％が、本明細書に記載される遺伝子
改変細胞である。本発明の更なる実施形態では、遺伝子改変細胞の集団が提供され、該集
団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５
％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少な
くとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７
０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも
９９％、又は最大１００％が、キメラ抗原受容体を更に発現する本明細書に記載される遺
伝子改変細胞である。
２．５ 遺伝子改変細胞の投与方法
本明細書に開示される別の態様は、それを必要とする被験体への本開示の遺伝子改変Ｔ
細胞の投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、それを必
要とする被験体に投与される。例えば、有効量の細胞集団を、疾患を有する被験体に投与
することができる。特定の実施形態では、疾患は癌であり得、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞
の投与は免疫療法となる。投与された細胞は、レシピエントにおいて増殖を抑え、数を減
らし、標的細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、本開示の遺伝子改変Ｔ細
胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製及び拡大することができ、その結果、疾患の持続的制御につ
ながる可能性のある長期持続性がもたらされる。
可能な投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮
内、皮下（ＳＣ）、又は注入）投与が挙げられる。さらに、投与は、持続注入、又は単回
若しくは複数回のボーラス投与によるものであってもよい。具体的な実施形態では、薬剤
の一方又は両方が、約１２時間、６時間、４時間、３時間、２時間、又は１時間未満の期
間に亘って注入される。さらに他の実施形態では、注入は、最初はゆっくり起こり、その
後は経時的に増加する。
幾つかの実施形態では、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞は、癌を治療する目的で腫瘍抗原を
標的とする。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源
の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、
卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない
。具体的な実施形態では、癌及び障害としては、ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ（小児適応症）、成
人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種骨髄移植後の
サルベージ等が含挙げられるが、これらに限定されない。これらの癌は、例えば、ＣＤ１
９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及び／又はＲＯＲ１を標的とするＣＡＲの組み合わせを使用し
て治療され得る。幾つかの非限定的な例では、本開示の遺伝子改変真核細胞又はその集団
は、Ｂ細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、横紋筋肉腫、肝臓癌、
胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌
、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛
門癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌
腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、
甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、リンパ
球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、
原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏ
ｒ）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによ
って誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリ
ンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細
胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、Ｔ細胞リン
パ腫、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、癌腫、リン
パ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍を標的とする。或る特定の実施
形態では、Ｂ細胞起源の癌としては、Ｂ細胞系の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リ
ンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ｐｒｅ－Ｂ ＡＬ
Ｌ（小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキッ
トリンパ腫、多発性骨髄腫、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限
定されない。
「有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される正確な量は、年齢、体重、腫瘍
サイズ（存在する場合）、感染又は転移の程度、及び患者（被験体）の状態の個人差を考
慮して医師が決定することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝
子改変細胞を含む医薬組成物は、それらの範囲内の全ての整数値を含む１０４細胞／ｋｇ
体重～１０９細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与される。さらなる実施形態では、投与量は、
それらの範囲内の全ての整数値を含めて、１０５細胞／ｋｇ体重～１０６細胞／ｋｇ体重
である。幾つかの実施形態では、細胞組成物はこれらの投与量で複数回投与される。細胞
は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用して投与され得る（例えば、Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参
照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量及び治療計画は、疾患の徴候について患
者をモニターし、それに応じて治療を調整することにより、医学の当業者によって容易に
決定され得る。
幾つかの実施形態では、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞の投与は、標的の疾患又は状態の少
なくとも１つの症状を軽減する。例えば、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞の投与は、癌の少な
くとも１つの症状を軽減することができる。癌の症状は当該技術分野でよく知られており
、既知の技術によって決定され得る。
２．６ 組換えウイルスベクターを産生する方法
幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用する組換えＡＡＶベクターを提
供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ－２９３等の哺乳動物細胞株で産
生される。ウイルスのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子はベクターから除去されて、自己複
製を防ぎ、治療遺伝子（複数の場合もある）（例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子）を送
達する余地を作ることから、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供する必要が
ある。さらに、複製をサポートするのに必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイルス）
構成要素を提供する必要がある（Ｃｏｔｓ Ｄ，Ｂｏｓｃｈ Ａ，Ｃｈｉｌｌｏｎ Ｍ（
２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－８１）。多くの場合、
組換えＡＡＶベクターは、細胞株に「ヘルパー」構成要素をコードする第１のプラスミド
、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージ
ングされるための介在ＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドを用いて
形質移入を行うトリプルトランスフェクションを使用して産生される。次いで、カプシド
に包まれたゲノム（目的のＩＴＲ及び介在遺伝子（複数の場合もある））を含むウイルス
粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当該技術分野で知られている
他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子は塩化セシウム密度勾配遠心分離又は
アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、その後、細胞、組織、又はヒト患
者等の生物に目的の遺伝子（複数の場合もある）を送達する。
組換えＡＡＶ粒子は通常、細胞内で産生（製造）されるため、確実に部位特異的エンド
ヌクレアーゼがパッケージング細胞内で発現しないように、本発明を実施する際には注意
が必要である。本発明のウイルスゲノムはエンドヌクレアーゼの認識配列を含むことから
、パッケージング細胞株で発現されたエンドヌクレアーゼはウイルス粒子にパッケージさ
れる前にウイルスゲノムを切断することができる。これにより、パッケージング効率の低
下及び／又は断片化されたゲノムのパッケージングをもたらす。パッケージング細胞にお
けるエンドヌクレアーゼ発現を防ぐため、次のような幾つかのアプローチを使用すること
ができる：
１．エンドヌクレアーゼは、パッケージング細胞で活性化されていない組織特異的プロ
モータの制御下に置かれてもよい。例えば、筋肉組織へのエンドヌクレアーゼ遺伝子（複
数の場合もある）の送達のためにウイルスベクターが開発された場合、筋肉特異的プロモ
ータを使用することができる。筋肉特異的プロモータの例としては、Ｃ５－１２（Ｌｉｕ
ら（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋肉特異的クレア
チンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａ，ら（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
９：１５７６－８８）、又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅ，ら（２０
１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）が挙げられる。ＣＮＳ（ニュ
ーロン）特異的プロモータの例としては、ＮＳＥ、シナプシン、及びＭｅＣＰ２プロモー
タが挙げられる（Ｌｅｎｔｚら（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９
－８８）。肝臓特異的プロモータの例としては、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂ等）、
ヒトα１－アンチトリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、及びヘモペキシン（Ｐｈｐｘ等）（Ｋｒ
ａｍｅｒ，ＭＧら，（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３７５－８５）が挙げら
れる。眼特異的プロモータの例としては、オプシン、及び角膜上皮特異的Ｋ１２プロモー
タが挙げられる（Ｍａｒｔｉｎ ＫＲＧ，Ｋｌｅｉｎ ＲＬ，ａｎｄ Ｑｕｉｇｌｅｙ
ＨＡ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇ Ｙら（２００７
）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，９：９５６－６６）。これらのプロモータ、又は当技術分野で
知られている他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ－２９３細胞では高活性ではないこと
から、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞において有意
なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現をもたらすとは予想されないであろう。同様に
、本発明のウイルスベクターは、適合しない組織特異的プロモータ（すなわち、よく知ら
れているＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータを使用
）を使用する他の細胞株の使用を想定している。組織特異的プロモータの他の例としては
：滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（
心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、ＡＤＰＲＨＬ
１（心臓）、及び単一遺伝子奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が挙げられる（Ｊａｃｏｘ
Ｅら（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。
２．或いは、エンドヌクレアーゼが発現しそうにない異なる種の細胞にベクターをパッ
ケージすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳類パッケージング細胞では活
性ではない、よく知られているサイトメガロウイルス又はＳＶ４０ウイルス初期プロモー
タ等の哺乳類プロモータを使用して、微生物、昆虫、又は植物の細胞において産生され得
る。好ましい実施形態では、ウイルス粒子は、Ｇａｏら（Ｇａｏ，Ｈ．ら（２００７）Ｊ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８－４３）によって記載されるバキュロウ
イルス系を使用して昆虫細胞で産生される。哺乳類のプロモータの制御下にあるエンドヌ
クレアーゼは、これらの細胞で発現する可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅ，ＫＪら（２０１
３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９－４９）。さらに、昆虫細胞は哺乳動物細胞
とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン（Ｈ
ＧＨ）イントロン又はＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン等の哺乳類イントロンをエンドヌ
クレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞の
ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写産物から効率的にスプライスされないため、昆虫細胞は機能性エン
ドヌクレアーゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージ化する。対照的に、得られた組換え
ＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物細胞は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡを適切にスプライスし、機能
性エンドヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、ＨＧＨ及び
ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを使用して、昆虫パッケージング細胞における毒性タン
パク質バルナーゼ及びジフテリア毒素フラグメントＡの発現を減衰させ、これらの毒素遺
伝子を運ぶ組換えＡＡＶベクターの産生を可能にしたと報告している（Ｃｈｅｎ，Ｈ（２
０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
３．エンドヌクレアーゼ遺伝子は、エンドヌクレアーゼ発現に小分子インデューサが必
要とされるように、誘導性プロモータに制御可能に連結され得る。誘導性プロモータの例
としては、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ Ｈら，（２０１５）Ｂ
ＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））及びＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（
Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ Ｇら（２０１１）Ｓｐｉｎｅ，３６（１０）：Ｅ６２３－
８）が挙げられる。両システムと並んで、当該技術分野で知られている同様のシステムは
、小分子アクチベータ（それぞれドキシサイクリン又はエクジソン）に応答して転写を活
性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサー及びエクジソン受容体の
変異体）に依存する。かかるリガンド誘導性転写活性化因子を使用して本発明を実施する
ことは：１）エンドヌクレアーゼ遺伝子を、対応する転写因子に応答するプロモータの制
御下に置く工程であって、エンドヌクレアーゼ遺伝子が、転写因子に対する結合部位（複
数の場合もある）を有する工程；及び２）パッケージ化されたウイルスゲノムに転写因子
をコードする遺伝子を含める工程、を含む。転写活性化因子も同じ細胞に提供されない場
合、組換えＡＡＶ送達後にエンドヌクレアーゼが標的細胞又は組織で発現しないことから
、後者の工程が必要である。次いで、転写活性化因子は、同族の低分子アクチベータで処
理された細胞又は組織でのみエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチ
は、いつ、どの組織に小分子インデューサを送達するかを選択することにより、エンドヌ
クレアーゼ遺伝子発現を時空間的に調節できるため、有利である。しかしながら、ウイル
スゲノムにインデューサを含める必要があるため、運搬能力が著しく制限され、このアプ
ローチには欠点がある。
４．別の好ましい実施形態では、組換えＡＡＶ粒子は、エンドヌクレアーゼの発現を妨
げる転写抑制因子を発現する哺乳動物細胞株で産生される。転写抑制因子は当該技術分野
で知られており、Ｔｅｔリプレッサー、Ｌａｃリプレッサー、Ｃｒｏリプレッサー、及び
ラムダリプレッサーが含まれる。エクジソン受容体等の多くの核ホルモン受容体は、同族
ホルモンリガンドが存在しない場合、転写抑制因子としても作用する。本発明を実施する
ために、パッケージング細胞は、転写抑制因子をコードするベクターで形質移入／形質導
入され、ウイルスゲノム内のエンドヌクレアーゼ遺伝子（パッケージングベクター）は、
リプレッサーがプロモータをサイレンシングするように、リプレッサーの結合部位を含む
ように改変されたプロモータに制御可能に連結される。転写抑制因子をコードする遺伝子
は、様々な位置に配置され得る。転写抑制因子をコードする遺伝子は、別のベクターにコ
ードされてもよく；ＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込まれてもよく；
ｃａｐ／ｒｅｐベクター若しくはアデノウイルスヘルパーベクターに組み込まれてもよく
、又は最も好ましくは、構成的に発現されるように、パッケージング細胞のゲノムに安定
的に組み込まれてもよい。一般的な哺乳動物プロモータを改変して転写抑制部位を組み込
む方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｃｈａｎｇ及びＲｏｎｉｎｓｏｎは、
Ｌａｃリプレッサーのオペレータを含めるため強力な構成的ＣＭＶ及びＲＳＶプロモータ
を改変し、リプレッサーを発現する細胞では、改変されたプロモータからの遺伝子発現が
大幅に減衰することを示した（Ｃｈａｎｇ ＢＤ，ａｎｄ Ｒｏｎｉｎｓｏｎ ＩＢ（１
９９６）Ｇｅｎｅ １８３：１３７－４２）。非ヒト転写リプレッサーの使用により、リ
プレッサーを発現するパッケージング細胞のみでエンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が抑制
され、得られる組換えＡＡＶベクターで形質導入された標的細胞又は組織では抑制されな
いことを確実にする。
幾つかの実施形態では、遺伝子導入は、レンチウイルスベクターを介して達成される。
他のレトロウイルスとは対照的に、レンチウイルスは、場合によっては、特定の非分裂細
胞の形質導入に使用され得る。レンチウイルスベクターの非限定的な例としては、ヒト免
疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト
Ｔリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ－１）、ＨＴＬＶ－２、又はウマ感染性貧血ウイル
ス（Ｅ１ＡＶ）等のレンチウイルスに由来するものが挙げられる。例えば、例えば、遺伝
子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆを欠失させ、ＨＩＶ病原性遺伝子を減衰
させることでレンチウイルスベクターを生成し、治療目的に対してベクターをより安全な
ものとした。レンチウイルスベクターは当該技術分野で知られており、Ｎａｌｄｉｎｉら
，（１９９６及び１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら，（１９９７）；Ｄｕｌｌら，１９９
８、米国特許第６，０１３，５１６号；及び同第５，９９４，１３６号）を参照されたい
。幾つかの実施形態では、これらのウイルスベクターはプラスミドベース又はウイルスベ
ースであり、外来核酸の取り込み、選択、及び核酸の宿主細胞への導入に不可欠な配列を
保持するように構成される。既知のレンチウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０－２２０９）等の寄託機関又はコ
レクションから容易に入手できるか、又は一般的に利用可能な技術を使用して既知の供給
源から単離され得る。
具体的な実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
からクローニングされたｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、及びｒｅｖの遺伝子をコードするプラ
スミドと、偽型ウイルス粒子に対して使用される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）に
由来するエンベロープタンパク質をコードする第２のプラスミドを使用して調製される。
ｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳベクター等のトランスファーベクターは、適切なプロモータ、
及び必要に応じてコード配列と共に使用され得る。次いで、３つのプラスミド全てをレン
チウイルス細胞（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔ細胞等）に形質移入し、次いで、適切なイン
キュベーション時間後にレンチウイルスを収集、濃縮、スクリーニングすることができる
。したがって、本明細書に記載される目的の外因性配列又は本発明の操作されたヌクレア
ーゼを含む組換えレンチウイルスベクターを産生する方法が本明細書に提供される。
２．７ 操作されたヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載される操作されたヌクレアーゼ、特に操作された
メガヌクレアーゼ、及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に
記載される操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌク
レオチド、及びかかるポリヌクレオチドの変異体を包含する。
本明細書で使用される「変異体」は、実質的に同様の配列を意味することを意図してい
る。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１又は複数の内部部位での１つ若しく
は複数のアミノ酸の欠失又は付加、及び／又は１つ若しくは複数の天然ポリペプチド上の
部位での１つ若しくは複数のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドに由来する
ポリペプチドを意味することを意図する。本明細書で使用される「天然」ポリヌクレオチ
ド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態に包含される変異体ポ
リペプチドは生物学的に活性である。つまり、それらは、天然タンパク質の望ましい生物
学的活性；すなわち、例えば、ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）、ＴＲＣ１５－
１６認識配列（配列番号６）、ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）、及びＴＲＣ１
９－２０認識配列（配列番号１０）を含む、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’
イントロンに見られる認識配列を認識して切断する能力を保持し続ける。かかる変異体は
、例えば人間の操作に起因する場合がある。実施形態の天然ポリペプチドの生物学的に活
性な変異体（例えば、配列番号１２～２７）、又は本明細書に記載される認識ハーフサイ
ト結合サブユニットの生物学的に活性な変異体（例えば、配列番号２８～５９）は、天然
ポリペプチド又は天然サブユニットのアミノ酸配列に対して、少なくとも約４０％、約４
５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８
５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９
７％、約９８％、又は約９９％の配列アラインメントプログラム及び本明細書の他の場所
に記載されるパラメータによって決定される配列同一性を有する。実施形態のポリペプチ
ド又はサブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと
、わずか約１個～４０個のアミノ酸残基、わずか約１個～２０個、わずか約１個～１０個
、わずか約５個、わずか４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸残基が異なる場合がある
。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法
で変更され得る。かかる操作の方法は、一般に当該技術分野で知られている。例えば、ア
ミノ酸配列の変異体は、ＤＮＡの変異によって調製され得る。突然変異誘発及びポリヌク
レオチドの変更の方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１
９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－４９２；Ｋｕ
ｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８
２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ
．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍ
ａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及び
それらの引用文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を与えない適切な
アミノ酸置換に関するガイダンスは、引用することで本明細書の一部をなす、Ｄａｙｈｏ
ｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ， Ｄ．Ｃ．）のモデルに見られる場合がある。１つのアミノ酸を類似の特性を有す
る別のアミノ酸と交換する等の保存的置換が最適な場合がある。
野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインへの相当数のアミノ酸修飾
が以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、単独で又は組み
合わせて、得られる合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素とは異なるハーフ
サイト特異性を有するように、ＤＮＡ認識配列のハーフサイト内の個々の塩基で特異性が
変更された操作されたメガヌクレアーゼをもたらす。表５に、認識ハーフサイトの各ハー
フサイト位置（－１～－９）に存在する塩基に基づいて特異性を高めるために、組換えメ
ガヌクレアーゼモノマー又はサブユニットにおいて行われる潜在的な置換を示す。
太字のエントリは、野生型の接触残基であり、本明細書で使用される「改変」を構成し
ない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖の塩基と接触していることを示す。
ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然ポリヌクレオチド内の１又は複数の部位
での１又は複数のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸
の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識す
るであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体には、遺伝暗号の縮退のため、実施
形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。変異体ポリヌク
レオチドには、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用することにより生成されるが、実
施形態の組換えメガヌクレアーゼを依然としてコードするもの等の合成によって誘導され
たポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は
、その特定のポリヌクレオチドに対して、少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約
５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約
９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約
９９％、又はそれ以上の配列アラインメントプログラム及び本明細書の他の個所に記載さ
れるパラメータによって決定される、配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレ
オチドの変異体（すなわち、参照ポリヌクレオチド）は、変異体ポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
との間のパーセント配列同一性の比較によっても評価され得る。
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特性
に根本的な変化をもたらすとは予想されない。しかしながら、置換、欠失、又は挿入をす
る前に正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺
伝子の標的５’イントロン内に見られる認識配列を優先的に認識して切断する能力につい
てポリペプチドをスクリーニングすることにより効果が評価されることを理解するであろ
う。
本発明は、以下の実施例により更に説明されるが、これらの実施例は限定と解釈される
べきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の物
質及び手順に対する多数の同等物を認識又は確認することができる。かかる同等物は、以
下の実施例に続く特許請求の範囲に含まれることが意図される。
実施例１
Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンの認識配列を認識して切断するメガヌ
クレアーゼの特性評価
１．ＴＲＣ１１－１２認識配列を認識して切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で集合的に「ＴＲＣ１１－１２メガヌクレアーゼ」と称される操作されたメガ
ヌクレアーゼ（配列番号１２～１５）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イ
ントロンに存在する、ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）を認識して切断するよう
操作された。各ＴＲＣ１１－１２組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端
核局在シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガ
ヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＲＣ１１－１２メガヌクレアーゼの第１のサブユ
ニットは配列番号４のＴＲＣ１２認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユニットはＴＲ
Ｃ１１認識ハーフサイトに結合する（図２を参照されたい）。
ＴＲＣ１２結合サブユニット及びＴＲＣ１１結合サブユニットは各々、ＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２と称される５６塩基対の超可変領域をそれぞれ含む。ＴＲＣ１２結合サブユニット
は、ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ１１結合サブユニットもＨ
ＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号１２～１５のＴＲＣ１１結合領域は、そ
れぞれ配列番号２８～３１として提供される。配列番号２８～３１は各々、メガヌクレア
ーゼＴＲＣ１１－１２ｘ．４（配列番号１２）のＴＲＣ１１結合領域である配列番号２８
と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１２～１５のＴＲＣ１２結合領域
は、それぞれ配列番号３２～３５として提供される。配列番号３２～３５は各々、メガヌ
クレアーゼＴＲＣ１１－１２ｘ．４（配列番号１２）のＴＲＣ１２結合領域である配列番
号３２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
２．ＴＲＣ１５－１６認識配列を認識して切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で集合的に「ＴＲＣ１５－１６メガヌクレアーゼ」と称される操作されたメガ
ヌクレアーゼ（配列番号１６～１９）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イ
ントロンに存在する、ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）を認識して切断するよう
に操作された。各ＴＲＣ１５－１６組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末
端核局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２の
メガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＲＣ１５－１６メガヌクレアーゼの第１のサ
ブユニットは配列番号６のＴＲＣ１５認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユニットは
ＴＲＣ１６認識ハーフサイトに結合する（図２を参照されたい）。
ＴＲＣ１５結合サブユニット及びＴＲＣ１６結合サブユニットは各々、ＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２と称される５６塩基対の超可変領域をそれぞれ含む。ＴＲＣ１５結合サブユニット
は、ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ１６結合サブユニットもＨ
ＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号１６～１９のＴＲＣ１５結合領域は、そ
れぞれ配列番号３６～３９として提供される。配列番号３６～３９は各々、メガヌクレア
ーゼＴＲＣ１５－１６ｘ．３１（配列番号１６）のＴＲＣ１５結合領域である配列番号３
６と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１６～１９のＴＲＣ１６結合領
域は、それぞれ配列番号４０～４３として提供される。配列番号４０～４３は各々、メガ
ヌクレアーゼＴＲＣ１５－１６ｘ．３１（配列番号１６）のＴＲＣ１６結合領域である配
列番号４０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
３．ＴＲＣ１７－１８認識配列を認識して切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において集合的に「ＴＲＣ１７－１８メガヌクレアーゼ」と称される操作され
たメガヌクレアーゼ（配列番号２０～２３）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的
５’イントロンに存在する、ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）を認識して切断す
るように操作された。ＴＲＣ１７－１８組換えメガヌクレアーゼは各々、ＳＶ４０に由来
するＮ末端核局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及
び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＲＣ１７－１８メガヌクレアーゼの
第１のサブユニットは配列番号８のＴＲＣ１７認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユ
ニットはＴＲＣ１８認識ハーフサイトに結合する（図２を参照されたい）。
ＴＲＣ１７結合サブユニット及びＴＲＣ１８結合サブユニットは各々、ＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２と称される５６塩基対の超可変領域をそれぞれ含む。ＴＲＣ１７結合サブユニット
は、ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ１８結合サブユニットもＨ
ＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号２０～２３のＴＲＣ１７結合領域は、そ
れぞれ配列番号４４～４７として提供される。配列番号４４～４７はそれぞれ、メガヌク
レアーゼＴＲＣ１７－１８ｘ．１５（配列番号２０）のＴＲＣ１７結合領域である配列番
号４４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号２０～２３のＴＲＣ１８結
合領域は、それぞれ配列番号４８～５１として提供されている。配列番号４８～５１は各
々、メガヌクレアーゼＴＲＣ１７－１８ｘ．１５（配列番号２０）のＴＲＣ１８結合領域
である配列番号４８と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
４．ＴＲＣ１９－２０認識配列を認識して切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において集合的に「ＴＲＣ１９－２０メガヌクレアーゼ」と称される操作され
たメガヌクレアーゼ（配列番号２４～２７）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的
５’イントロンに存在する、ＴＲＣ１９－２０認識配列（配列番号１０）を認識して切断
するように操作された。ＴＲＣ１９－２０組換えメガヌクレアーゼは各々、ＳＶ４０に由
来するＮ末端核局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、
及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＲＣ１９－２０メガヌクレアーゼ
の第１のサブユニットは配列番号１０のＴＲＣ１９認識ハーフサイトに結合し、第２のサ
ブユニットはＴＲＣ２０認識ハーフサイトに結合する（図２を参照されたい）。
ＴＲＣ１９結合サブユニット及びＴＲＣ２０結合サブユニットは各々、ＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２と称される５６塩基対の超可変領域をそれぞれ含む。ＴＲＣ１９結合サブユニット
は、ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ２０結合サブユニットもＨ
ＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号２４～２７のＴＲＣ１９結合領域は、そ
れぞれ配列番号５２～５５として提供される。配列番号５２～５５は各々、メガヌクレア
ーゼＴＲＣ１９－２０ｘ．８５（配列番号２４）のＴＲＣ１９結合領域である配列番号５
２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号２４～２７のＴＲＣ２０結合領
域は、それぞれ配列番号５６～５９として提供される。配列番号５６～５９は各々、メガ
ヌクレアーゼＴＲＣ１９～２０ｘ．８５（配列番号２４）のＴＲＣ２０結合領域である配
列番号５６に対して少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
５．ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＴＲＣ認識配列の切断
ＴＲＣ１１－１２、ＴＲＣ１５－１６、ＴＲＣ１７－１８、及びＴＲＣ１９－２０メガ
ヌクレアーゼがそれぞれの認識配列（それぞれ配列番号４、配列番号６、配列番号８、及
び配列番号１０）を認識して切断できるかどうかを判断するため、各組換えメガヌクレア
ーゼを前述のＣＨＯ細胞レポーターアッセイを使用して評価した（国際公開第２０１２／
１６７１９２号及び図４を参照されたい）。アッセイを実行するため、細胞のゲノムに組
み込まれた非機能性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを持つＣＨＯ細
胞レポーターラインを作製した。各細胞株のＧＦＰ遺伝子は、メガヌクレアーゼによるい
ずれかの認識配列の細胞内切断が相同組換え事象を刺激して機能性ＧＦＰ遺伝子をもたら
すように、一対の認識配列によって中断された。
この研究のために開発されたＣＨＯレポーター細胞株では、ＧＦＰ遺伝子に挿入された
１つの認識配列はＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）、ＴＲＣ１５－１６認識配列
（配列番号６）、ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）、又はＴＲＣ１９－２０認識
配列（配列番号１０）であった。ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列はＣＨＯ－２
３／２４認識配列であり、「ＣＨＯ－２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによ
って認識され、切断される。ＴＲＣ１１－２１認識配列及びＣＨＯ－２３／２４認識配列
を含むＣＨＯレポーター細胞を、本明細書では「ＴＲＣ１１－１２細胞」と称する。ＴＲ
Ｃ１５－１６認識配列及びＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞を、
本明細書では「ＴＲＣ１５－１６細胞」と称する。ＴＲＣ１７－１８認識配列及びＣＨＯ
－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞を、本明細書では「ＴＲＣ１７－１８
細胞」と称する。ＴＲＣ１９－２０認識配列及びＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨ
Ｏレポーター細胞を、本明細書では「ＴＲＣ１９－２０細胞」と称する。
ＣＨＯレポーター細胞に、対応する操作されたメガヌクレアーゼをコードする（例えば
、ＴＲＣ１１－１２細胞を、ＴＲＣ１１－１２メガヌクレアーゼをコードするプラスミド
ＤＮＡで形質移入した）又はＣＨＯ－２３／３４メガヌクレアーゼをコードするプラスミ
ドＤＮＡで形質移入した。各アッセイでは、４ｅ５ ＣＨＯレポーター細胞に、リポフェ
クタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造元の指示に従って使用して、９６
ウェルプレートにおいて５０ｎｇのプラスミドＤＮＡで形質移入した。形質移入後４８時
間に細胞をフローサイトメトリーで評価し、形質移入していない陰性対照（ｂｓ）と比較
したＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄに示すよう
に、全てのＴＲＣメガヌクレアーゼは、陰性対照を有意に超える頻度で対応する認識配列
を含む細胞株においてＧＦＰ陽性細胞を産生することがわかった。
ＴＲＣ１１－１２、ＴＲＣ１５－１６、ＴＲＣ１７－１８、及びＴＲＣ１９－２０の操
作されたメガヌクレアーゼの有効性も、対応するレポーター細胞株へのメガヌクレアーゼ
の導入の２日後、５日後、及び７日後に時間依存的に判断した。この研究では、製造元の
指示に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用し、各レポータ
ー細胞株（１．０×１０６細胞）に、細胞あたり１×１０６コピーの対応するメガヌクレ
アーゼｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。特定の時間間隔で、細胞をフローサイト
メトリーで評価して、ＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び
図６Ｄに示すように、％ＧＦＰ発現は、ＴＲＣ１１－１２、ＴＲＣ１５－１６、ＴＲＣ１
７－１８、及びＴＲＣ１９－２０のメガヌクレアーゼ間で変化し、研究全体を通してほぼ
同じ％ＧＦＰを維持するものもあったが、その他は５日後又は７日後に％ＧＦＰ発現の減
少を示した。
６．結論
これらの研究は、本発明に含まれるＴＲＣ１１－１２メガヌクレアーゼ、ＴＲＣ１５－
１６メガヌクレアーゼ、ＴＲＣ１７－１８メガヌクレアーゼ、及びＴＲＣ１９－２０メガ
ヌクレアーゼが細胞内のそれぞれの認識配列を効率的に標的とし、切断できることを実証
した。
実施例２
ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ認識配列でのインデルの生成
１．背景
この研究は、本発明に含まれる操作されたヌクレアーゼが、ヒトＴ細胞のそれぞれの認
識配列を切断できることを実証した。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気分離によりＰＢＭＣから
単離し、ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体を使用して７２時間活性化した。１ｅ６活性化
ヒトＴ細胞に、製造元の指示に従ってＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使
用し、細胞１個当たり２ｅ６コピーの所与のＴＲＣ１１－１２又はＴＲＣ１５－１６のメ
ガヌクレアーゼｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。形質移入後７２時間で、細胞か
らゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を採取し、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイを
実施して、内因性ＴＲＣ１１－１２又はＴＲＣ１５－１６の認識配列において遺伝子改変
を推定した（図７）。Ｔ７Ｅアッセイでは、ＴＲＣ１１－１２又はＴＲＣ１５－６の遺伝
子座は、２つの認識配列に隣接するプライマーを使用するＰＣＲによって増幅される。標
的遺伝子座内にインデル（ランダムな挿入又は欠失）がある場合、得られるＰＣＲ産物は
、野生型対立遺伝子と変異対立遺伝子のミックスからなるであろう。ＰＣＲ産物を変性し
、ゆっくりと再アニーリングさせた。ゆっくりとした再アニーリングによって、野生型及
び変異型の対立遺伝子からなるヘテロ二重鎖の形成が可能になり、塩基及び／又はバルジ
のミスマッチを生じる。Ｔ７Ｅ１酵素はミスマッチ部位で切断し、ゲル電気泳動で視覚化
可能な切断産物を生じる。
２．結果
モックエレクトロポレーションを行った（Ｍｏｃｋ－ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）
細胞及び対照ｇＤＮＡ（それぞれレーン１及びレーン２）は、Ｔ７Ｅ消化バンドのない全
長ＰＣＲに対応する単一のバンドを示し、インデル又は他の多型がＴＲＣ１１－１２又は
ＴＲＣ１５－１６の認識配列に存在しないことを示す（図７）。ＴＲＣ１１－１２ｘ．４
、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６３、及びＴＲＣ１１－１２ｘ．８２でそれぞれエレクトロポレ
ーションした細胞に対応するレーン３、レーン５及びレーン６は、認識部位内のインデル
を示す、より短いＴ７Ｅ消化バンドと共に全長ＰＣＲバンドを示す。ＴＲＣ１１－１２ｘ
．６０でエレクトロポレーションした細胞に対応するレーン４は、全長ＰＣＲバンドのみ
を示し、認識部位にインデルがないことを示した。ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１、ＴＲＣ１
５－１６ｘ．８７、及びＴＲＣ１５－１６ｘ．８９でそれぞれエレクトロポレーションし
た細胞に対応するレーン７、レーン８、及びレーン１０は、認識部位内のインデルを示す
、より短いＴ７Ｅ消化バンドと共に全長ＰＣＲバンドを示す。ＴＲＣ１５－１６ｘ．６３
でエレクトロポレーションした細胞に対応するレーン９は、全長ＰＣＲバンドのみを示し
、認識部位にインデルがないことを示した。
３．結論
これらのデータは、幾つかのＴＲＣ１１－１２及びＴＲＣ１５－１６のヌクレアーゼが
ヒトＴ細胞のそれぞれの認識配列を切断できることを実証する。ＴＲＣ１１－１２ｘ．４
、ＴＲＣ１１－１２ｘ．６３、ＴＲＣ１１－１２ｘ．８２、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１、
ＴＲＣ１５－１６ｘ．８７、又はＴＲＣ１５－１６ｘ．８９のいずれかでエレクトロポレ
ーションした細胞は全て、それぞれの認識配列にインデルが存在することを示すＴ７Ｅ－
消化バンドを示した。
実施例３
Ｔ細胞受容体発現に対するＴＲＣ認識配列切断の効果
１．背景
これらの実験の目的は、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロン内のＴＲＣ
認識配列の切断、及びその後のＮＨＥＪによる修復が内因性Ｔ細胞受容体の発現に影響を
及ぼすかどうかを実証することであった。
ＣＤ３陽性選択キット及びＲｏｂｏ－Ｓｅｐ自動磁気分離器（いずれもＳｔｅｍ Ｃｅ
ｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用して、ヒトＴ細胞を磁気的に濃縮した。Ｔ細
胞は、補償された健康なヒトボランティアから得られたアフェレーシスサンプルから濃縮
された。Ｔ細胞活性化物質（抗ＣＤ３／抗／ＣＤ２８）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＬｉｆｅＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＩＬ－２の場合１０ｎｇ／ｍｌの存在下で１：１
の細胞：ビーズ比でＴ細胞を３日間刺激した。３日後、Ｔ細胞を採取し、ＤｙｎａＭａｇ
磁石（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤｙｎａｂｅａｄｓを除去し、
Ｌｏｎｚａ ４－Ｄヌクレオフェクターを使用して、１μｇの指定のメガヌクレアーゼＲ
ＮＡをＴ細胞サンプルに導入した。ヌクレオフェクションした細胞は、フローサイトメト
リー分析の前に６日間培養した。ＣＤ３表面ディスプレイは、Ｔ細胞サンプルに２．０ｘ
１０５細胞のサンプルあたり１μｌの抗ＣＤ３－ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７１１
（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製品３００４６４）及び０．３μｌのＧｈｏｓｔＤｙｅ－５１０（
Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて標識することで測定した。Ｂｅｃｋｍａ
ｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓサイトメーターを使用してデータを取得した
。
２．結果
Ｔ細胞をＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥ（ＴＲＡＣエクソン１を標的とする操作されたヌク
レアーゼ）又はＲＮＡなし（モック）でヌクレオフェクションし、それぞれＴＲＡＣ遺伝
子座編集の陽性及び陰性の対照としての役割を果たし、図８Ａ及び図８Ｂに示す。４つの
追加サンプルも、ＴＲＣ１５－１６ファミリーからの１つの異なるヌクレアーゼ変異体を
コードするＲＮＡでヌクレオフェクションし、その全てのメンバーが５’イントロンのＴ
ＲＣ１５－１６認識配列を標的とする。ＴＲＡＣ遺伝子座の編集により遺伝子破壊が起こ
ると、ＴＣＲα鎖は合成されず、編集された細胞の表面にＴＣＲ複合体（ＣＤ３を含む）
は表示されない。ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥで編集されたＴ細胞の半分超が、エクソン１
の切断及びＮＨＥＪによる切断部位のエラーを起こしやすい修復のためＴＲＣ陰性である
ことが示された（図８Ｂ）。比較すると、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１、ＴＲＣ１５－１６
ｘ．６３、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８７、及びＴＲＣ１５－１６ｘ．８９による編集後のＴ
ＣＲ陰性細胞の頻度はわずか４％～８％であった（それぞれ図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、及
び図８Ｆ）。
３．結論
これらの実験は、ＴＲＡＣエクソン１の５’イントロン上流の標的化認識配列がインデ
ルを生成できるが（Ｔ７Ｅアッセイで観察される）、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現
に実質的に影響を与えないことを実証する。本発明者らは、外因性スプライスアクセプタ
ー部位、ＣＡＲコード配列、及びポリＡシグナルを含むこの切断部位へのコンストラクト
の挿入は、細胞内のＴＣＲ発現をノックアウトすると予想する。
実施例４
標的５’イントロンへの目的の配列の挿入
これらの実験の目的は、標的５’イントロンにおいて２本鎖切断を生成し、相同組換え
により目的の外因性配列を切断部位に挿入することで：（ｉ）外因性スプライスアクセプ
ター部位及び／又はポリＡシグナルの存在により内因性Ｔ細胞受容体の発現を妨害し、（
ｉｉ）インサートによってコードされる目的のタンパク質の発現を可能とする。
これらの例では、目的の外因性配列には、図９のコンストラクトに示される多くの要素
が含まれる。各コンストラクトは、５’相同性アームと３’相同性アームに隣接している
。これらのアームは、標的５’イントロンのそれぞれのＴＲＣ認識配列の５’上流及び３
’下流の配列と相同性がある。各相同性のサイズ、及び標的５’イントロン内の対応する
配列に対するアームのパーセント相同性は、切断部位へのコンストラクトの相同組換えを
改善するために必要に応じて調節することができる。５’相同性アームに隣接するのは、
スプライシングのための外因性分岐部位、及び外因性スプライスアクセプター部位の両方
を含むキメライントロンである。次に、シグナルペプチド、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ
８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、Ｎ６共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζシグナル伝達ドメイ
ンを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ配列の５’にＴ２Ａ要素が含まれる。ＣＡＲコーディング配
列の後には、ｂｉ－ポリＡシグナルが続き、最後に３’相同性アームが続く。図９Ａ～図
９Ｃに提供される特定のコンストラクトは、それぞれＴＲＣ１１－１２、ＴＲＣ１５－１
６、及びＴＲＣ１７－１８の認識配列を標的とし、配列番号６０～６２において提供され
る。
先の実施例に記載されるように、ドナーヒトＴ細胞を取得し、活性化し、ＴＲＣメガヌ
クレアーゼｍＲＮＡで形質移入することができる。目的の外因性配列を含むドナーテンプ
レート（例えば、配列番号６０～６２、図９Ａ～図９Ｃ）を、当該技術分野で知られてい
る多くの手段によって導入することができるが、好ましくはドナーテンプレートを含む組
換えＡＡＶの形質導入によって導入することができる。形質導入は、メガヌクレアーゼｍ
ＲＮＡによる形質移入と比べていつでも実施できるが、形質導入及び形質移入を同時に実
施することが好ましい。Ｔ細胞受容体発現のレベル、及びＣＡＲ発現のレベルはそれぞれ
、フローサイトメトリーにより（上記及び当該技術分野で知られている方法により）幾つ
かの時間点において細胞内で決定され得る。切断部位にインサートを持たない任意の細胞
は内因性ＴＣＲを発現し続けるため、この方法で得られるＴＣＲ－細胞の大部分もＣＡＲ
＋になると予想される。
特定の研究では、プロモータのないＧＦＰ又はＣＡＲコード配列を標的５’イントロン
に挿入し、内因性ＴＣＲプロモータが本発明のコンストラクトを使用して導入された場合
にこれらのタンパク質の発現を駆動し得ることを実証する。この研究では、アフェレーシ
スサンプルを、健康で、情報が知らされ、補償されているドナーから採取し、製造業者の
指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＣＤ３陽性選択キット
ＩＩを使用してＴ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、５％ウシ胎仔血清及び１０ｎｇ／ｍｌ Ｉ
Ｌ－２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）でＩｍｍｕｎｏ
Ｃｕｌｔ Ｔ細胞刺激装置（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８－Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、４－Ｄ Ｎ
ｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いたエレクトロポレーションにより、２つの
ＴＲＣヌクレアーゼの１つをコードするＲＮＡをＴ細胞に導入した。Ｔ細胞は、ＴＲＣ１
１－１２ｘ．８２又はＴＲＣ１５－１６ｘ．３１のいずれかをコードするＲＮＡを受け取
った。
ＴＲＣ１１－１２ｘ．８２のＲＮＡを受け取った細胞は、ＴＲＣ１１－１２ｘ．８２認
識配列（即ちＴＲＣ１１－１２認識配列）に隣接するゲノム配列と相同の領域を含む２つ
のＡＡＶ６ベクターの１つで形質導入された。コンストラクト７２２７（配列番号６３）
を含む１つのベクターはＴ２Ａ配列と、それに続くプロモータのないＧＦＰ遺伝子とをコ
ードし、もう一方のベクターは、Ｔ２Ａ配列と、それに続くプロモータのないＣＡＲ遺伝
子とをコードするコンストラクト７２２５（配列番号６４）を含む。
ＴＲＣ１５－１６．ｘ３１ ＲＮＡを受け取った細胞を、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１認
識配列（すなわちＴＲＣ１５－１６認識配列）に隣接するゲノム配列と相同性の領域を含
む２つのＡＡＶ６ベクターの１つで形質導入した。コンストラクト７２２８（配列番号６
５）を含む１つのベクターは、Ｔ２Ａ配列と、それに続くプロモータのないＧＦＰ遺伝子
とをコードし、もう１つのベクターは、Ｔ２Ａ配列と、それに続くプロモータのないＣＡ
Ｒ遺伝子とをコードする、コンストラクト７２２６（配列番号６６）を含む。
全ての形質導入は、５０，０００（ウイルスゲノム／細胞）の感染多重度（ＭＯＩ）で
行われた。５％ＦＢＳ及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＸ－ＶＩＶＯ１５培地で
更に５日間細胞培養を維持した。５日目、ＣＤ３（抗ＣＤ３－ＡＰＣ／７５０又は抗ＢＶ
７１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＡＲ（抗ＦＭＣ６３－ビオチン＋ストレプトアビジ
ン－ＰＥ、社内で作製）に対して細胞を染色し、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙ
ｔｏＦＬＥＸ－Ｓフローサイトメーターでシグナルを測定することにより、ＴＲＣノック
アウト、及びＧＦＰ又はＣＡＲのノックインの分析を行った。
２．結果
ＴＣＲノックアウト細胞の頻度（ＣＤ３＋対ＣＤ３－の頻度）及びＧＦＰノックイン細
胞の頻度を図１０に示す。ＴＲＣ１１－１２ｘ．８２及びＡＡＶ６－７２２７の投与後、
培養中の全てのＴ細胞の１８％はＣＤ３－ＧＦＰ＋である（図１０Ａ）。ＴＣＲ－編集（
ＣＤ３－）集団のみでゲーティングする場合、８５％の細胞がＧＦＰ＋であった（図１０
Ｂ）。ＴＲＣ１５－１６ｘ．３１及びＡＡＶ６－７２２８を投与すると、ＣＤ３－／ＧＦ
Ｐ＋細胞の頻度がわずかに低くなった（１２．６％、図１０Ｃ）が、ＣＤ３－集団のＧＦ
Ｐ＋細胞の頻度はなおも８０％を超えていた（図１０Ｄ）。
標的５’イントロンへのＣＡＲノックイン（ＦＭＣ６３＋）を図１１に示すＣＡＲベク
ターで形質導入されなかった編集細胞と比較して（図１１Ａ）、抗ＦＭＣ６３及び抗ＣＤ
３でサンプルを染色すると、ベクター形質導入サンプルにおけるノックアウト集団と並ん
でノックイン集団が特定される（図１１のヒストグラムはＣＤ３陰性事象でゲートされる
）。ＴＲＣ１１－１２及びＴＣＲ１５－１６の認識配列にプロモータのないＣＡＲコンス
トラクトを挿入すると（それぞれ図１１Ｂ及び図１１Ｃ）、それぞれＣＤ３－／ＣＡＲ＋
事象が発生し、内因性ＴＣＲプロモータが、標的５’イントロンへ挿入時にＣＡＲコード
配列の発現を促進したことを示した。
３．結論
ＴＣＲイントロン特異的メガヌクレアーゼと共に対応する相同性のＴ２Ａトランス遺伝
子コンストラクトの投与後のＣＤ３－／ＧＦＰ＋又はＣＤ３－／ＣＡＲ＋の事象の観察は
、内因性ＴＣＲ転写制御要素を使用して目的のタンパク質の発現を駆動できることを示す
。
目的の外因性配列をＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロンに挿入し、発現させるためのサンプル戦略の図であり、機能性Ｔ細胞受容体アルファサブユニットをコードするように再編成されている。示されるように、目的の外因性配列は、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流にあるＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロンに挿入される。標的５’イントロンに隣接する内因性スプライスアクセプター部位及び内因性スプライスアクセプター部位は無傷のままである。ヌクレアーゼによる切断に続いて、本明細書に記載される目的の外因性配列がイントロンに挿入される。示されるように、目的の配列は、少なくとも外因性スプライスアクセプター部位及び／又はイントロンに挿入された場合に、Ｔ細胞受容体アルファサブユニットの発現を妨害するポリＡシグナルを含む。挿入された目的の配列は、任意にＴ２Ａ要素で表される、２Ａ要素を含めることができる。挿入された目的の配列は、キメラ抗原受容体コード配列で表される、目的のポリペプチドのコード配列も任意に含むことができる。必要に応じて、目的の配列は、外因性スプライスアクセプター部位の５’上流に位置する外因性分岐部位を更に含むことができる。 ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンのＴＲＣ認識配列を示す。本発明の操作されたメガヌクレアーゼによって標的とされる各認識配列は、２つの認識ハーフサイトを含む。各認識ハーフサイトは、４塩基対の中心配列によって隔てられた９塩基対で構成されている。ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）は、ＴＲＣ１１及びＴＲＣ１２と称される２つの認識ハーフサイトを含む。ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）は、ＴＲＣ１５及びＴＲＣ１６と称される２つの認識ハーフサイトを含む。ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）は、ＴＲＣ１７及びＴＲＣ１８と称される２つの認識ハーフサイトを含む。ＴＲＣ１９－２０認識配列（配列番号１０）は、ＴＲＣ１９及びＴＲＣ２０と称される２つの認識ハーフサイトを含む。 本発明の操作されたメガヌクレアーゼは２つのサブユニットを含み、第１のサブユニットは、第１の認識ハーフサイト（例えば、ＴＲＣ１１、ＴＲＣ１５、ＴＲＣ１７又はＴＲＣ１９）に結合するＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットは、第２の認識ハーフサイト（例えば、ＴＲＣ１２、ＴＲＣ１６、ＴＲＣ１８、又はＴＲＣ２０）に結合するＨＶＲ２領域を含む。操作されたメガヌクレアーゼが１本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかのサブユニットとして配置され得る。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかのサブユニットとして配置され得る。 Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンに見られる認識配列を標的とする操作されたメガヌクレアーゼを評価するＣＨＯ細胞のレポーターアッセイの概略を示す。本明細書に記載される操作されたメガヌクレアーゼについて、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定して組み込まれたＣＨＯ細胞株を作製した。レポーターカセットは、５’から３’の順に：ＳＶ４０初期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５’２／３；本発明の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＴＲＣ１１－１２認識配列）；ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号）；及びＧＦＰ遺伝子の３’２／３で構成される。このカセットで安定的に形質移入された細胞は、ＤＮＡ切断誘導物質の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドのＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかでＤＮＡ切断が誘導された場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域が相互に組換えられ、機能性ＧＦＰ遺伝子をもたらした。ＧＦＰを発現する細胞の割合は、操作されたメガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的な尺度として、フローサイトメトリーによって決定され得る。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の標的５’イントロンに見られる認識配列を認識して切断する、操作されたメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号１２～１５に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）を標的とするように操作した。配列番号１６～１９に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）を標的とするように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。配列番号２０～２３に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）を標的とするように操作した。配列番号２４～２７に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１９－２０認識配列（配列番号１０）を標的とするように操作した。示される結果は、各アッセイで観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を示し、これは、標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断する各メガヌクレアーゼの有効性を示す。さらに、陰性対照（ｂｓ）を各アッセイに含めた。図５Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｂは、ＴＲＣ１５－１６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｃは、ＴＲＣ１７－１８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｄは、ＴＲＣ１９－２０認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイでＴＲＡＣエクソン１の５’上流にあるヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロンの認識配列を認識して切断する、操作されたメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号１２～１５に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１１－１２認識配列（配列番号４）を標的とするように操作した。配列番号１６～１９に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１５－１６認識配列（配列番号６）を標的とするように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。配列番号２０～２３に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１７－１８認識配列（配列番号８）を標的とするように操作した。配列番号２４～２７に記載される操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＲＣ１９～２０認識配列（配列番号１０）を標的とするように操作した。ヌクレオフェクション後７日間の複数の時点で、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性について、操作されたメガヌクレアーゼをスクリーニングした。示される結果は、分析の７日間に亘って各アッセイで観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を示し、これは、時間の関数として、標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列の切断に対する各メガヌクレアーゼの有効性を示す。図６Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図６Ｂは、ＴＲＣ１５－１６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図６Ｃは、ＴＲＣ１７－１８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図６Ｄは、ＴＲＣ１９－２０認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。 Ｔ細胞溶解物のＴ７Ｅアッセイを示す。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気分離によりＰＢＭＣから単離し、７２時間活性化した。活性化ヒトＴ細胞にＴＲＣ１１－１２又はＴＲＣ１５－１６メガヌクレアーゼｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションを行い、形質移入後７２時間に細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を採取した。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイを実行し、内因性ＴＲＣ１１－１２又はＴＲＣ１５－１６認識配列での遺伝子改変を推定した。 標的５’イントロンの認識配列での切断は、Ｔ細胞受容体の発現に影響しない。ヒトＴ細胞をヒトドナーから得られたアフェレーシスサンプルから濃縮し、ＩＬ－２の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して３日間刺激した。３日後、Ｔ細胞を採取し、ビーズを取り除き、１μｇの指定のメガヌクレアーゼＲＮＡをＴ細胞サンプルに導入した。ヌクレオフェクションした細胞は、フローサイトメトリー分析の前に６日間培養した。内因性Ｔ細胞受容体の発現を表すＣＤ３表面提示を、抗ＣＤ３－ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７１１及びＧｈｏｓｔＤｙｅ－５１０でＴ細胞サンプルを標識することにより測定した。Ｔ細胞は、ＴＲＣ１～２ｘ．８７ＥＥ（ＴＲＡＣエクソン１を標的とする操作されたヌクレアーゼ）又はＲＮＡなし（モック）のいずれかでヌクレオフェクションされ、それぞれＴＲＡＣ遺伝子座編集の陽性対照及び陰性対照としての役割を果たし、図８Ａ及び図８Ｂに示される。４つの追加サンプルも、ＴＲＣ１５－１６ファミリーからの１つの異なるヌクレアーゼ変異体をコードするＲＮＡでヌクレオフェクションし、その全てのメンバーが５’イントロンのＴＲＣ１５－１６認識配列を標的とする。ＴＲＡＣ遺伝子座の編集により遺伝子破壊が起こると、ＴＣＲα鎖は合成されず、編集された細胞の表面にＴＣＲ複合体（ＣＤ３を含む）は提示されない。ＴＲＣ ｌ－２ｘ．８７ＥＥで編集されたＴ細胞の半分超が、エクソン１の切断及びＮＨＥＪによる切断部位のエラーを起こしやすい修復のためにＴＲＣ陰性であることが示された（図８Ｂ）。比較すると、ＴＲＣ１５－１６ｘ．３ｌ、ＴＲＣ１５－１６ｘ．６３、ＴＲＣ１５－１６ｘ．８７、及びＴＲＣ１５－１６ｘ．８９による編集後のＴＣＲ陰性細胞の頻度はわずか４％～８％であった（それぞれ図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、及び図８Ｆ）。 目的の外因性配列のドナーテンプレートを示す。相同性アーム、外因性スプライスアクセプター部位、ＣＡＲコード配列、及びポリＡシグナルを含むドナーテンプレートを提供する。図９Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列への挿入に適した例示的なドナーテンプレート（配列番号６０）を提供する。図９Ｂは、ＴＲＣ１５－１６認識配列への挿入に適した例示的なドナーテンプレート（配列番号６１）を提供する。図９Ｃは、ＴＲＣ１７－１８認識配列への挿入に適した例示的なドナーテンプレート（配列番号６２）を提供する。 ＧＦＰコード配列の標的５’イントロンへの挿入を示す。Ｔ細胞をＴＲＣ１１－１２ｘ．８２ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのないＧＦＰコード配列をコードする７２２７コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。追加のＴ細胞をＴＲＣ１５－１６．ｘ３１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのないＧＦＰコード配列をコードする７２２８コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。ＴＣＲノックアウト及びＧＦＰ発現を、形質移入／形質導入の５日後にフローサイトメトリーで測定した。図１０Ａは、ＴＲＣ１１－１２認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３（ｘ軸）及びＧＦＰ（ｙ軸）の発現を示す。図１０Ｂは、ＴＲＣ１１－１２認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＧＦＰ発現（ｘ軸）及び細胞数（ｙ軸）を示す。図１０Ｃは、ＴＲＣ１５－１６認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３（ｘ軸）及びＧＦＰ（ｙ軸）発現を示す。図１０Ｄは、ＴＲＣ１５－１６認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＧＦＰ発現（ｘ軸）及び細胞数（ｙ軸）を示す。 標的５’イントロンへの抗ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列の挿入。Ｔ細胞をＴＲＣ１１－１２ｘ．８２ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのない抗ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列をコードする７２２５コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。追加のＴ細胞をＴＲＣ１５－１６．ｘ３１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクションし、Ｔ２Ａ配列とそれに続くプロモータのない抗ＣＤ１９ ＣＡＲコード配列をコードする７２２６コンストラクトを含むＡＡＶ６ベクターで形質導入した。ＴＣＲノックアウト及びＣＡＲの発現を、形質移入／形質導入の５日後にフローサイトメトリーで測定した。図１１Ａは、陰性対照群（ＴＲＣ酵素のみ）のＣＤ３細胞でのＣＡＲ発現を示す。図１１Ｂは、ＴＲＣ１１－１２認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３細胞でのＣＡＲ発現を示す。図１１Ｃは、ＴＲＣ１５－１６認識配列でのドナーテンプレート挿入後のＣＤ３細胞でのＣＡＲ発現を示す。

Claims (144)

  1. ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置するヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子のイントロ
    ン内の認識配列を認識して切断する操作されたメガヌクレアーゼであって、
    該操作されたメガヌクレアーゼが第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、
    該第１のサブユニットが前記認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し、第１の超可変
    （ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットが前記認識配列の第２の認識ハーフサ
    イトに結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、操作されたメガヌクレアーゼ。
  2. 前記イントロンが配列番号３を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが、前記イント
    ロンに隣接する内因性スプライスドナー部位又は内因性スプライスアクセプター部位内に
    認識配列を持たない、請求項１に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  3. 前記認識配列が配列番号４を含む、請求項１又は２に記載の操作されたメガヌクレアー
    ゼ。
  4. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応
    するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項
    ３に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  5. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１
    ９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６
    １、２６６、及び２６８に対応する残基を含む、請求項３又は４に記載の操作されたメガ
    ヌクレアーゼ。
  6. 前記ＨＶＲ１領域が配列番号１２～１５のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む、
    請求項３～５のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  7. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基２４～７９に対応する
    アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３～
    ６のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  8. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３
    ０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応す
    る残基を含む、請求項３～７のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  9. 前記ＨＶＲ２領域が配列番号１２～１５のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請求
    項３～８のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  10. 前記第１のサブユニットが、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基１９８～３４４
    に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユ
    ニットが、配列番号１２～１５のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０
    ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３～９のいずれか１項に記載の操作
    されたメガヌクレアーゼ。
  11. 前記第１のサブユニットが配列番号１２～１５のいずれか１つの残基１９８～３４４を
    含む、請求項３～１０のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  12. 前記第２のサブユニットが配列番号１２～１５のいずれか１つの残基７～１５３を含む
    、請求項３～１１のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  13. 前記操作されたメガヌクレアーゼがリンカーを含み、該リンカーが前記第１のサブユニ
    ットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求項３～１２のいずれか１項に記載
    の操作されたメガヌクレアーゼ。
  14. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号１２～１５のいずれか１つのアミノ酸配
    列を含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  15. 前記認識配列が配列番号６を含む、請求項１又は２に記載の操作されたメガヌクレアー
    ゼ。
  16. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号１６～１９のいずれか１つの残基２４～７９に対応する
    アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５
    に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  17. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号１６～１９のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３
    ０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応す
    る残基を含む、請求項１５又は１６に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  18. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号１６～１９のいずれか１つの残基６４に対応する残基を
    含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  19. 前記ＨＶＲ１領域が配列番号１６～１９のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請求
    項１５～１８のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  20. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号１６～１９のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応
    するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項
    １５～１９のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  21. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号１６～１９のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１
    ９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６
    １、２６６、及び２６８に対応する残基を含む、請求項１５～２０のいずれか１項に記載
    の操作されたメガヌクレアーゼ。
  22. 前記ＨＶＲ２領域が配列番号１６～１９のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む、
    請求項１５～２１のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  23. 前記第１のサブユニットが、配列番号１６～１９のいずれか１つの残基７～１５３に対
    して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニッ
    トが、配列番号１６～１９のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０
    ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の
    操作されたメガヌクレアーゼ。
  24. 前記第１のサブユニットが配列番号１６～１９のいずれか１つの残基７～１５３を含む
    、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  25. 前記第２のサブユニットが配列番号１６～１９のいずれか１つの残基１９８～３４４を
    含む、請求項１５～２４のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  26. 前記操作されたメガヌクレアーゼがリンカーを含み、前記リンカーが前記第１のサブユ
    ニットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求項１５～２５のいずれか１項に
    記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  27. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号１６～１９のいずれか１つのアミノ酸配
    列を含む、請求項１５～２６のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  28. 前記認識配列が配列番号８を含む、請求項１又は２に記載の操作されたメガヌクレアー
    ゼ。
  29. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２０～２３のいずれか１つの残基２４～７９に対応する
    アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８
    に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  30. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２０～２３のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３
    ０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応す
    る残基を含む、請求項２８又は２９に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  31. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２０～２３のいずれか１つの残基６６に対応する残基を
    含む、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  32. 前記ＨＶＲ１領域が配列番号２０～２３のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請求
    項２８～３１のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  33. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２０～２３のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応
    するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項
    ２８～３２のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  34. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２０～２３のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１
    ９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６
    １、２６６、及び２６８に対応する残基を含む、請求項２８～３３のいずれか１項に記載
    の操作されたメガヌクレアーゼ。
  35. 前記ＨＶＲ２領域が配列番号２０～２３のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む、
    請求項２８～３４のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  36. 前記第１のサブユニットが、配列番号２０～２３のいずれか１つの残基７～１５３に対
    して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニッ
    トが、配列番号２０～２３のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０
    ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８～３５のいずれか１項に記載の
    操作メガヌクレアーゼ。
  37. 前記第１のサブユニットが配列番号２０～２３のいずれか１つの残基７～１５３を含む
    、請求項２８～３６のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  38. 前記第２のサブユニットが配列番号２０～２３のいずれか１つの残基１９８～３４４を
    含む、請求項２８～３７のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  39. 前記操作されたメガヌクレアーゼがリンカーを含み、前記リンカーが前記第１のサブユ
    ニットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求項２８～３８のいずれか１項に
    記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  40. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号２０～２３のいずれか１つのアミノ酸配
    列を含む、請求項２８～３９のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  41. 前記認識配列が配列番号１０を含む、請求項１又は２に記載の操作されたメガヌクレア
    ーゼ。
  42. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基２４～７９に対応する
    アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１
    に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  43. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３
    ０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応す
    る残基を含む、請求項４１又は４２に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  44. 前記ＨＶＲ１領域が配列番号２４～２７のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請求
    項４１～４３のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  45. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応
    するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項
    ４１～４４のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  46. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１
    ９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６
    １、２６６、及び２６８に対応する残基を含む、請求項４１～４５のいずれか１項に記載
    の操作されたメガヌクレアーゼ。
  47. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む
    、請求項４１～４６のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  48. 前記第１のサブユニットが、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基７～１５３に対
    して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニッ
    トが、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０
    ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１～４７のいずれか１項に記載の
    操作されたメガヌクレアーゼ。
  49. 前記第１のサブユニットが配列番号２４～２７のいずれか１つの残基７～１５３を含む
    、請求項４１～４８のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  50. 前記第２のサブユニットが、配列番号２４～２７のいずれか１つの残基１９８～３４４
    を含む、請求項４１～４９のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  51. 前記操作されたメガヌクレアーゼがリンカーを含み、前記リンカーが前記第１のサブユ
    ニットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求項４１～５０のいずれか１項に
    記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  52. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号２４～２７のいずれか１つのアミノ酸配
    列を含む、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  53. 請求項１～５２のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする
    核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  54. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
  55. 前記ｍＲＮＡが、請求項１～５２のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレア
    ーゼと、少なくとも１つの追加のポリペプチド又は核酸とをコードするポリシストロン性
    ｍＲＮＡである、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
  56. 請求項５３に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡコンストラクト。
  57. 前記組換えＤＮＡコンストラクトがウイルスベクターをコードする、請求項５６に記載
    の組換えＤＮＡコンストラクト。
  58. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
    ウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項５７に記
    載の組換えＤＮＡコンストラクト。
  59. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項５７又は請求項５８に記
    載の組換えＤＮＡコンストラクト。
  60. 請求項５３に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。
  61. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
    ウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項６０に記載のウイルスベクター。
  62. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項６０又は請求項６１に記
    載のウイルスベクター。
  63. Ｔ細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変Ｔ細胞を産生する方法
    であって、該方法が、Ｔ細胞に対して、
    （ａ）請求項１～５２のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコー
    ドする第１の核酸配列であって、該操作されたメガヌクレアーゼが前記Ｔ細胞において発
    現される第１の核酸配列；及び
    （ｂ）目的の配列を含む第２の核酸配列；の１つ又は複数の核酸を導入することを含み
    、
    前記操作されたメガヌクレアーゼが、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置するヒトＴ
    細胞受容体アルファ遺伝子のイントロン内の認識配列に前記染色体の切断部位を生成し；
    前記目的の配列が、前記切断部位で前記染色体に挿入され；
    前記目的の配列が、外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリＡシグナルを含
    み；
    前記イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセプ
    ター部位が改変されていない及び／又は機能性のままである、方法。
  64. 内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が非改変対照細胞と比較した場合に低下している、
    請求項６３に記載の方法。
  65. 前記イントロンが配列番号３を含む、請求項６３又は６４に記載の方法。
  66. 請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法であって、
    （ａ）前記認識配列が配列番号４を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項３
    ～１４のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼである；
    （ｂ）前記認識配列が配列番号６を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項１
    ５～２７のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼである；
    （ｃ）前記認識配列が配列番号８を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項２
    ８～４０のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼである；又は
    （ｄ）前記認識配列が配列番号１０を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項
    ４１～５２のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼである、方法。
  67. 前記第２の核酸配列が、前記切断部位に隣接する配列と相同な配列を更に含み、前記目
    的の配列が相同組換えにより前記切断部位に挿入される、請求項６３～６６のいずれか１
    項に記載の方法。
  68. 前記Ｔ細胞が、ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項６３～６７のいずれ
    か１項に記載の方法。
  69. 前記目的の配列が、５’から３’に、外因性スプライスアクセプター部位、２Ａ要素又
    はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及びポリＡシグナルを含む、請求項６
    ３～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記２Ａ要素が、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、又はＦ２Ａ要素である、請求
    項６９に記載の方法。
  71. 前記２Ａ要素がＴ２Ａ要素である、請求項６９又は７０に記載の方法。
  72. 前記目的の配列が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む、請
    求項６３～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有
    する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 少なくとも前記第１の核酸配列がｍＲＮＡにより前記Ｔ細胞に導入される、請求項６３
    ～７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 少なくとも前記第２の核酸配列が、ウイルスベクターにより前記Ｔ細胞に導入される、
    請求項６３～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
    ウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項７５又は７６に記載の方
    法。
  78. Ｔ細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変Ｔ細胞を産生する方法
    であって、該方法が、
    （ａ）請求項１～５２のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをＴ細
    胞に導入すること；及び
    （ｂ）前記目的の配列を含む核酸により前記Ｔ細胞を形質移入すること；を含み、
    前記操作されたメガヌクレアーゼが、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置するヒトＴ
    細胞受容体アルファ遺伝子のイントロン内の認識配列に前記染色体の切断部位を生成し；
    前記目的の配列が、前記切断部位で前記染色体に挿入され；
    前記目的の配列が、外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリＡシグナルを含
    み；
    前記イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセプ
    ター部位が、改変されていない及び／又は機能性のままである、方法。
  79. 内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が非改変対照細胞と比較した場合に低下している、
    請求項７８に記載の方法。
  80. 前記イントロンが配列番号３を含む、請求項７８又は７９に記載の方法。
  81. 請求項７８～８０のいずれか１項に記載の方法であって、
    （ａ）前記認識配列が配列番号４を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項３
    ～１４のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼである；
    （ｂ）前記認識配列が配列番号６を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項１
    ５～２７のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼである；
    （ｃ）前記認識配列が配列番号８を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項２
    ８～４０のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼである；又は
    （ｄ）前記認識配列が配列番号１０を含み、前記操作されたメガヌクレアーゼが請求項
    ４１～５２のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼである、方法。
  82. 前記核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、前記目的の配列が
    相同組換えにより前記切断部位に挿入される、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記Ｔ細胞が、ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項８１又は８２に記載
    の方法。
  84. 前記目的の配列が、５’から３’に、外因性スプライスアクセプター部位、２Ａ要素又
    はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及びポリＡシグナルを含む、請求項７
    ８～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記２Ａ要素が、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、又はＦ２Ａ要素である、請求
    項８４に記載の方法。
  86. 前記２Ａ要素がＴ２Ａ要素である、請求項８４又は８５に記載の方法。
  87. 前記目的の配列が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む、請
    求項７８～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有
    する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記核酸が、ウイルスベクターによって前記Ｔ細胞に導入される、請求項７８～８８の
    いずれか１項に記載の方法。
  90. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
    ウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項８９又は９０に記載の方
    法。
  92. 改変されたヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子を含む遺伝子改変Ｔ細胞を産生する方法で
    あって、該方法が、
    （ａ）Ｔ細胞に対して：
    （ｉ）操作されたヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列であって、該操作された
    ヌクレアーゼはＴ細胞で発現される第１の核酸配列、又は
    （ｉｉ）操作されたヌクレアーゼタンパク質、
    を導入すること；並びに
    （ｂ）目的の外因性配列を含む第２の核酸配列を前記細胞に導入すること；
    を含み、
    前記操作されたヌクレアーゼは、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置する前記ヒトＴ
    細胞受容体アルファ遺伝子のイントロン内の認識配列に切断部位を生成し；
    前記目的の配列が、前記切断部位で前記ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子に挿入され；
    前記目的の配列が、外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリＡシグナルを含
    み；
    前記イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセプ
    ター部位が、改変されていない及び／又は機能性のままである、方法。
  93. 内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が非改変対照細胞と比較した場合に低下している、
    請求項９２に記載の方法。
  94. 前記イントロンが配列番号３を含む、請求項９３又は９４に記載の方法。
  95. 前記第２の核酸配列が、５’から３’に：
    （ａ）前記切断部位に隣接する５’上流配列に相同な５’相同性アーム；
    （ｂ）前記目的の外因性配列；及び
    （ｃ）前記切断部位に隣接する３’下流配列に相同である３’相同性アーム；を含み、
    前記目的の外因性配列が、相同組換えにより前記切断部位で前記ヒトＴ細胞受容体アル
    ファ遺伝子に挿入される、請求項９２～９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記遺伝子改変Ｔ細胞が、遺伝子改変ヒトＴ細胞、又はそれに由来する細胞である、請
    求項９２～９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記目的の外因性配列が、５’から３’に、外因性スプライスアクセプター部位、２Ａ
    要素又はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及びポリＡシグナルを含む、請
    求項９２～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記２Ａ要素が、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、又はＦ２Ａ要素である、請求
    項９７に記載の方法。
  99. 前記２Ａ要素がＴ２Ａ要素である、請求項９７又は９８に記載の方法。
  100. 前記目的の配列が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む、請
    求項９２～９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有
    する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 少なくとも前記第１の核酸配列がｍＲＮＡにより前記Ｔ細胞に導入される、請求項９２
    ～１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 少なくとも前記第２の核酸配列が、ウイルスベクターにより前記Ｔ細胞に導入される、
    請求項９２～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロ
    ウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１０３に
    記載の方法。
  105. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項１０３又は１０４に記載
    の方法。
  106. 前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌク
    レアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、コン
    パクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はｍｅｇａＴＡＬである、請求項９２
    ～１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼである、請求項９２～１
    ０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号４を含む認識配列に対して特異性を有す
    る、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、請求項３～１４のいずれか１項に記載の操作され
    たメガヌクレアーゼである、請求項１０７又は１０８に記載の方法。
  110. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号６を含む認識配列に対して特異性を有す
    る、請求項１０７に記載の方法。
  111. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、請求項１５～２７のいずれか１項に記載の操作さ
    れたメガヌクレアーゼである、請求項１０７又は１１０に記載の方法。
  112. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号８を含む認識配列に対して特異性を有す
    る、請求項１０７に記載の方法。
  113. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、請求項２８～４０のいずれか１項に記載の操作さ
    れたメガヌクレアーゼである、請求項１０７又は１１２に記載の方法。
  114. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号１０を含む認識配列に対して特異性を有
    する、請求項１０７に記載の方法。
  115. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、請求項４１～５２のいずれか１項に記載の前記操
    作されたメガヌクレアーゼである、請求項１０７又は１１４に記載の方法。
  116. 請求項６３～１１５のいずれか１項に記載の方法により調製された遺伝子改変Ｔ細胞。
  117. 改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子をそのゲノム中に含む遺伝子改変Ｔ細胞であって
    、該改変ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子は、ＴＲＡＣエクソン１の５’上流に位置する
    Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子内のイントロンに挿入された目的の外因性配列を含み、前記
    目的の外因性配列は、外因性スプライスアクセプター部位及び／又はポリＡシグナルを含
    み、前記イントロンに隣接する内因性スプライスドナー部位及び内因性スプライスアクセ
    プター部位は、改変されておらず、及び／又は機能性のままであり、内因性Ｔ細胞受容体
    の細胞表面発現は、非改変対照細胞と比較した場合に低下している、遺伝子改変Ｔ細胞。
  118. 前記イントロンが配列番号３を含む、請求項１１７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  119. 前記遺伝子改変Ｔ細胞が、遺伝子改変ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求
    項１１７又は１１８に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  120. 前記目的の外因性配列が、５’から３’に、外因性スプライスアクセプター部位、２Ａ
    要素又はＩＲＥＳ要素、目的のタンパク質のコード配列、及びポリＡシグナルを含む、請
    求項１１７～１１９のいずれか１項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  121. 前記２Ａ要素がＴ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、又はＦ２Ａ要素である、請求項
    １２０に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  122. 前記２Ａ要素がＴ２Ａ要素である、請求項１２０又は１２１に記載の遺伝子改変Ｔ細胞
    。
  123. 前記目的の配列が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む、請
    求項１１７～１２２のいずれか１項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  124. 前記キメラ抗原受容体又は前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異的抗原に対する特異性
    を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１２３に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  125. 前記目的の外因性配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識部位、ＴＡＬＥＮ認識部位
    、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識部位、ＣＲＩＳＰＲ認識部位、又はｍｅｇａＴＡＬ
    認識部位で前記イントロンに挿入される、請求項１１７～１２４のいずれか１項に記載の
    遺伝子改変Ｔ細胞。
  126. 前記目的の外因性配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識部位で前記イントロンに挿
    入される、請求項１１７～１２５のいずれか１項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  127. 前記目的の外因性配列が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０内
    で前記イントロンに挿入される、請求項１１７～１２６のいずれか１項に記載の遺伝子改
    変Ｔ細胞。
  128. 請求項１１６～１２７のいずれか１項に記載の複数の前記遺伝子改変Ｔ細胞を含む遺伝
    子改変Ｔ細胞の集団。
  129. 前記集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なく
    とも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５
    ％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
    くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
    ０％、少なくとも９５％、又は最大１００％が、請求項１１６～１２７のいずれか一項に
    記載の前記遺伝子改変Ｔ細胞である、請求項１２８に記載の集団。
  130. 前記遺伝子改変Ｔ細胞が、遺伝子改変されたヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である
    、請求項１２８又は請求項１２９に記載の集団。
  131. 前記目的の配列が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む、請
    求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の集団。
  132. 前記キメラ抗原受容体又は前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異的抗原に対する特異性
    を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１３１に記載の集団。
  133. 内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、非改変対照細胞と比較した場合、前記遺伝子改
    変Ｔ細胞上で低下している、請求項１２８～１３２のいずれか１項に記載の集団。
  134. 医薬組成物であって、それを必要とする被験体における疾患の治療に有用であり、前記
    医薬組成物が、薬学的に許容可能な担体と、治療有効量の請求項１１６～１２７のいずれ
    か１項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞を含む、医薬組成物。
  135. 前記遺伝子改変Ｔ細胞が、遺伝子改変ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求
    項１３４に記載の医薬組成物。
  136. 前記目的の配列が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含む、請
    求項１３４又は１３５に記載の医薬組成物。
  137. 前記キメラ抗原受容体又は前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異的抗原に対して特異性
    を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１３６に記載の医薬組成物。
  138. 内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、非改変対照細胞と比較した場合に、前記遺伝子
    改変Ｔ細胞上で低下している、請求項１３４～１３７のいずれか１項に記載の医薬組成物
    。
  139. 請求項１１６～１２７のいずれか１項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞を被験体に投与するこ
    とを含む、それを必要とする被験体の疾患を治療する方法。
  140. 前記方法が、請求項１３４～１３８のいずれか１項に記載の前記医薬組成物を前記被験
    体に投与することを含む、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記方法が、それを必要とする被験体における癌の治療のための免疫療法であり、前記
    遺伝子改変Ｔ細胞が、遺伝子改変ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞であり、前記目的の
    配列が、キメラ抗原受容体又は腫瘍特異的抗原に特異性を有する細胞外リガンド結合ドメ
    インを含む外因性Ｔ細胞受容体のコード配列を含み、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現
    が、非改変対照細胞と比較した場合に、前記遺伝子改変Ｔ細胞上で低下している、請求項
    １３９又は１４０に記載の方法。
  142. 前記癌が、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病の癌からなる群から選択され
    る、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記癌が、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌
    、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群
    から選択される、請求項１４１又は請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記Ｂ細胞起源の癌が、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病
    、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１４
    ３に記載の方法。
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