ES2955408T3 - Nucleasas modificadas genéticamente optimizadas que tienen especificidad para el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos t humanos - Google Patents
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Abstract
La presente invención abarca nucleasas diseñadas que reconocen y escinden una secuencia de reconocimiento dentro del primer exón del gen de la región constante alfa del receptor de células T humanas (TCR). Las meganucleasas diseñadas pueden exhibir al menos una característica optimizada, tal como especificidad o eficiencia de escisión mejorada (es decir, aumentada), en comparación con la meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación. La presente invención también abarca métodos de uso de dichas nucleasas diseñadas para producir células modificadas genéticamente y el uso de dichas células en una composición farmacéutica y en métodos para tratar enfermedades, tales como el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Nucleasas modificadas genéticamente optimizadas que tienen especificidad para el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos t humanos
Campo de la invención
La invención se refiere a los campos de la oncología, la inmunoterapia contra el cáncer, la biología molecular y la tecnología del ácido nucleico recombinante.
Antecedentes de la invención
La inmunoterapia adoptiva de linfocitos T es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer. Esta estrategia utiliza linfocitos T humanos aislados que han sido modificados genéticamente para mejorar su especificidad para un antígeno específico asociado a un tumor. La modificación genética puede implicar la expresión de un receptor de antígeno quimérico o un receptor de linfocitos T exógeno para injertar la especificidad del antígeno en el linfocito T. A diferencia de los receptores exógenos de linfocitos T, los receptores de antígeno quiméricos derivan su especificidad de los dominios variables de un anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, los linfocitos T que expresan receptores de antígeno quiméricos (linfocitos T CAR) inducen inmunorreactividad tumoral de una manera no restringida del complejo mayor de histocompatibilidad. La inmunoterapia adoptiva de linfocitos T se ha utilizado como terapia clínica para una cantidad de cánceres, incluyendo neoplasias malignas de linfocitos B (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda, linfoma no hodgkiniano de linfocitos B, leucemia mieloide aguda y leucemia linfocítica crónica), mieloma múltiple, neuroblastoma, glioblastoma, gliomas avanzados, cáncer ovárico, mesotelioma, melanoma, cáncer prostático, cáncer pancreático y otros.
A pesar de su posible utilidad como tratamiento contra el cáncer, la inmunoterapia adaptativa con linfocitos T CAR se ha visto limitada, en parte, por la expresión del receptor endógeno de linfocitos T en la superficie de la célula. Los linfocitos T CAR que expresan un receptor de linfocitos T endógeno pueden reconocer antígenos de histocompatibilidad mayores y menores después de la administración a un paciente alogénico, lo que puede conducir al desarrollo de enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD). Como resultado, los ensayos clínicos se han centrado en gran medida en el uso de linfocitos T CAR autólogos, en donde los linfocitos T de un paciente se aíslan, se modifican genéticamente para incorporar un receptor de antígeno quimérico y luego se reinfunden en el mismo paciente. Un enfoque autólogo proporciona tolerancia inmunitaria a los linfocitos T CAR administrados; sin embargo, este enfoque está limitado por el tiempo y el gasto necesarios para producir linfocitos T CAR específicos del paciente después de que se diagnosticó el cáncer de un paciente.
Por lo tanto, sería ventajoso desarrollar linfocitos T CAR “disponibles”, preparados usando linfocitos T de un donante sano (de un tercero) que tienen una expresión reducida del receptor endógeno de linfocitos T y no inician GVHD tras la administración. Esos productos podrían generarse y validarse antes del diagnóstico y podrían ponerse a disposición de los pacientes tan pronto como fuera necesario. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar linfocitos T CAR alogénicos que carecen de un receptor de linfocitos T endógeno para evitar la aparición de GVHD.
La modificación genética del ADN genómico se puede realizar usando endonucleasas raras de escisión específicas de sitio que se modifican genéticamente para reconocer secuencias de ADN en el locus de interés. Las endonucleasas homing son un grupo de nucleasas de origen natural que reconocen 15 a 40 sitios de escisión de pares de bases comúnmente encontrados en los genomas de plantas y hongos. A menudo se asocian con elementos de ADN parásitos, como los intrones e inteínas de autoempalme del grupo 1. Promueven naturalmente la recombinación homóloga o la inserción de genes en ubicaciones específicas en el genoma hospedero al producir una ruptura de cadena doble en el cromosoma, que recluta la maquinaria de reparación de ADN celular (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38: 49- 95). Las endonucleasas homing se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2), la familia GIY-YIG, la familia de caja His-Cyst y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan la actividad catalítica y la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) se caracterizan por tener una o dos copias de LAGLIDADG conservado (SEQ ID NO: 2) patrón (véase Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). Las endonucleasas homing LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) las endonucleasas homing con una sola copia del patrón LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del patrón LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) se encuentran como monómeros.
I-CreI (SEQ ID NO: 1) es un miembro de la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) endonucleasas homing que reconocen y cortan una secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases en el cromosoma cloroplástico de las algas Chlamydomonas reinhardtii. Las técnicas de selección genética se han utilizado para modificar la preferencia de sitio de escisión de I-CreI de tipo silvestre (Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Chames et al. (2005), Nucleic Acids Res. 33: e178; Seligman et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9, Arnould et al. (2006), J. Mol. Biol. 355: 443-58). Más recientemente, un método de diseño racional de endonucleasas homing mono-LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) fue descrito como capaz de rediseñar comprensivamente I-CreI y otras endonucleasas homing para activar sitios de ADN ampliamente divergentes, incluyendo sitios en genomas de mamífero, levadura, plantas, bacterianos y virales (WO 2007/047859).
Como primero se describió en WO 2009/059195, I-Crel y sus derivados diseñados son normalmente diméricos pero se pueden fusionar en un solo polipéptido utilizando un enlazador peptídico corto que une el C-terminal de una primera subunidad al N-terminal de una segunda subunidad (Li et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37:1650-62; Grizot et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37:5405-19). De esta forma, una meganucleasa de “cadena única” puede ser expresada a partir de una transcripción individual.
Se ha descrito el uso de nucleasas para alterar la expresión del TCR endógeno, incluido el uso de ARN de horquilla pequeña, nucleasas de dedos de cinc (ZFN), nucleasas efectoras tipo activador de transcripción (TALEN), megaTAL y sistemas CRISPR (por ejemplo, Osborn et al. (2016), Molecular Therapy 24(3): 570-581; Eyquem et al. (2017), Nature 543: 113-117; Patente de EE.UU. núm. 8.956.828; Publicación de EE.UU. núm. US2014/0301990; Publicación de EE.UU. núm.US2012/0321667).
También se ha descrito previamente el uso específico de meganucleasas modificadas genéticamente para escindir blancos de ADN en el gen de región constante alfa del TCR humano. Por ejemplo, la publicación internacional núm. WO 2014/191527 describió variantes de la meganucleasa I-OnuI que también se modificaron genéticamente para dirigirse a una secuencia de reconocimiento (SEQ ID NO: 3 de la publicación con terminación 527) dentro del exón 1 del gen de la región constante alfa del TCR. Aunque la publicación con terminación 527 discute que un receptor de antígeno quimérico puede expresarse en células con t Cr inactivado, los autores no divulgaron la inserción de la secuencia codificante CAR en el sitio de escisión de meganucleasa.
Además, en las Publicaciones Internacionales Núms. WO 2017/062439, WO 2017/062451 y WO 2017/112859, los Solicitantes divulgaron meganucleasas modificadas genéticamente que tienen especificidad para secuencias de reconocimiento en el exón 1 del gen de la región constante alfa de TCR. Estos incluyeron “meganucleasas TRC 1-2” que tienen especificidad para la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5) en el exón 1. Las publicaciones con terminaciones 439 y 451 también divulgaron métodos para la inserción dirigida de una secuencia codificante CAR o una secuencia codificante TCR exógena en el sitio de escisión de meganucleasa TCR 1-2.
En la presente invención, los Solicitantes han hecho mejoras respecto a las nucleasas y métodos enseñados en el estado de la técnica. A través de una amplia experimentación, los Solicitantes han generado novedosas meganucleasas TRC 1 2 de segunda generación que comprenden exclusivas e impredecibles combinaciones de residuos y son inesperadamente superiores a las meganucleasas TRC 1-2 de primera generación que se muestran en las solicitudes con terminaciones 439 y 451. Por ejemplo, las meganucleasas TRC 1-2 de segunda generación de la invención poseen una especificidad mejorada (es decir, aumentada) y una reducida escisión inespecífica del blanco, muestran un reducido tiempo de persistencia en las células después de la expresión de ARNm, son funcionalmente superiores in vitro cuando se usan para generar linfocitos T CAR (por ejemplo, inactivación TCR mejorada/aumentada, inserción CAR mejorada/aumentada, expansión de T CAR mejorada/aumentada, fenotipo mejorado de linfocitos T CAR, etc.) y producen poblaciones mejoradas de linfocitos T CAR cuando se usan en un proceso de diseño de linfocitos T CAR a escala completa.
Breve descripción de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 y que reconocen y escinden una secuencia de reconocimiento consistente en SEQ ID NO: 5 dentro del primer exón del gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos (TCR) (SEQ ID NO: 3). Dichas meganucleasas son útiles para alterar el gen de región constante alfa de TCR y, en consecuencia, alterar la expresión y/o función del TCR de superficie celular. La escisión de la meganucleasa puede alterar la función génica ya sea por la acción mutagénica de la unión de extremos no homólogos o mediante la promoción de la introducción de un polinucleótido exógeno en el gen mediante recombinación homóloga. En algunas modalidades, el polinucleótido exógeno introducido comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un receptor de antígeno quimérico (CAR), de modo que la meganucleasa sea útil para generar un linfocito T CAR alógeno que carece de un TCR endógeno. En algunas modalidades, las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 presentan al menos una característica optimizada en comparación con la meganucleasa de primera generación TRC 1-2x.87EE. Dichas características optimizadas incluyen especificidad mejorada (es decir, aumentada) que resulta en una reducción de la escisión inespecífica del blanco, tiempo de persistencia reducido en las células (por ejemplo, después de la expresión de ARNm) y/o eficiencia mejorada (es decir, aumentada) de modificación del gen de la región constante alfa del TCR. Además, las células que han sido modificadas genéticamente con las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 exhiben características mejoradas, que incluyen una escisión del blanco inespecífico reducida y efectos similares, tiempo de persistencia reducido de la meganucleasa en la célula, expansión de T CAR mejorada (es decir, aumentada), y están menos diferenciadas en comparación con las células que han sido modificadas genéticamente con la meganucleasa TRC1-2x.87EE. Además, las poblaciones de células en las que se han introducido las meganucleasas que comprenden la secuencia de aminoácidos
de la SEQ ID NO: 7 u 8 (o un ácido nucleico que codifica para las mismas) tienen un mayor porcentaje de células modificadas y un mayor porcentaje de células menos diferenciadas en comparación con aquellas poblaciones de células en las que se ha introducido la meganucleasa TRC 1- 2x.87EE (o un ácido nucleico que codifica para la misma).
La presente invención proporciona, además, métodos que comprenden la administración de la proteína de meganucleasa modificada genéticamente, o genes que codifican la meganucleasa modificada genéticamente, a una célula eucariota con el fin de producir una célula eucariota modificada genéticamente. Por lo tanto, se proporcionan adicionalmente células eucariotas modificadas genéticamente y poblaciones de estas, así como composiciones farmacéuticas que comprenden las células eucariotas modificadas genéticamente y poblaciones de estas.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona una meganucleasa modificada genéticamente que reconoce y escinde la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5) en el exón 1 del gen de la región constante alfa del TCR humano (SEQ ID NO: 3).
La meganucleasa modificada genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 u 8.
En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8. En determinadas modalidades, el polinucleótido es un ARNm.
En modalidades adicionales, el ARNm es un ARNm policistrónico que codifica una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 y al menos un polipéptido o ácido nucleico adicional.
En otro aspecto, la invención proporciona un constructo de ADN recombinante que comprende el polinucleótido descrito en la presente.
En determinadas modalidades, el constructo de ADN recombinante codifica un vector viral. En modalidades particulares, el vector viral es un vector adenovírico, un vector lentivírico, un vector retrovírico o un vector viral adenoasociado (AAV). En modalidades específicas, el vector viral es un vector de AAV recombinante.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector viral que comprende el polinucleótido descrito en la presente.
En determinadas modalidades, el vector viral es un vector adenovírico, un vector lentivírico, un vector retrovírico o un vector AAV. En modalidades particulares, el vector viral es un vector de AAV recombinante.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente que comprende una secuencia exógena de interés insertada en un cromosoma de la célula eucariota. El método comprende introducir en una célula eucariota uno o más ácidos nucleicos que incluyen: (a) un primer ácido nucleico que codifica una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8, en donde la meganucleasa modificada genéticamente se expresa en la célula eucariota; y (b) un segundo ácido nucleico que incluye la secuencia de interés; en donde la meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende la SEQ ID NO: 5; y en donde la secuencia de interés se inserta en el cromosoma en el sitio de escisión.
En determinadas modalidades del método, el segundo ácido nucleico además comprende secuencias homólogas a secuencias que flanquean el sitio de escisión y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga.
En determinadas modalidades del método, el segundo ácido nucleico no comprende secuencias homólogas a secuencias que flanquean el sitio de escisión y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante inserción no homóloga.
En determinadas modalidades del método, la expresión en la superficie celular de un receptor de linfocitos T endógeno (por ejemplo, un receptor de linfocitos T alfa/beta) se reduce en comparación con una célula control no modificada. En algunas modalidades del método, la célula eucariota es un linfocito T humano, o una célula derivada de este o una célula NK humana, o una célula derivada de este.
En algunas modalidades del método, la secuencia de interés comprende una secuencia codificante para un receptor de antígeno quimérico o un receptor de linfocitos T exógeno. En modalidades particulares del método, el receptor de antígeno quimérico o el receptor de linfocitos T exógeno comprende un dominio de unión a ligando extracelular que tiene especificidad para un antígeno específico de tumor.
En algunas modalidades del método, al menos el primer ácido nucleico se introduce en la célula eucariota mediante un ARNm.
En determinadas modalidades del método, al menos el segundo ácido nucleico se introduce en la célula eucariota mediante un vector viral. En modalidades particulares del método, el vector viral es un vector adenovírico, un vector lentivírico, un vector retrovírico o un vector de AAV. En modalidades específicas del método, el vector viral es un vector AAV recombinante.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente que comprende una secuencia exógena de interés insertada en un cromosoma de la célula eucariota. El método comprende: (a) introducir una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 en una célula eucariota; y (b) introducir un ácido nucleico que incluye la secuencia de interés en la célula eucariota; en donde la meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende la SEQ ID NO: 5; y en donde la secuencia de interés se inserta en el cromosoma en el sitio de escisión.
En determinadas modalidades del método, el ácido nucleico además comprende secuencias homólogas a secuencias que flanquean el sitio de escisión y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga. En determinadas modalidades del método, el ácido nucleico no comprende secuencias homólogas a secuencias que flanquean el sitio de escisión y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante inserción no homóloga. En determinadas modalidades del método, la expresión en la superficie celular de un receptor de linfocitos T endógeno (por ejemplo, un receptor de linfocitos T alfa/beta) se reduce en comparación con una célula control no modificada. En algunas modalidades del método, la célula eucariota es un linfocito T humano, o una célula derivada de este, o una célula NK humana, o una célula derivada de este.
En algunas modalidades del método, la secuencia de interés comprende una secuencia codificante para un receptor de antígeno quimérico o un receptor de linfocitos T exógeno. En modalidades particulares del método, el receptor de antígeno quimérico o el receptor de linfocitos T exógeno comprende un dominio de unión a ligando extracelular que tiene especificidad para un antígeno específico de tumor.
En determinadas modalidades del método, el ácido nucleico se introduce en la célula eucariota mediante un vector viral. En modalidades particulares del método, el vector viral es un vector adenovírico, un vector lentivírico, un vector retrovírico o un vector de a Av . En modalidades específicas del método, el vector viral es un vector AAV recombinante.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente al interrumpir una secuencia blanco en un cromosoma de la célula eucariota. El método comprende introducir en una célula eucariota un ácido nucleico que codifica una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8, en donde la meganucleasa modificada genéticamente se expresa en la célula eucariota, y en donde la meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende la SEQ ID NO: 5, y en donde la secuencia blanco se interrumpe mediante la unión terminal no homóloga en el sitio de escisión.
En determinadas modalidades del método, la expresión en la superficie celular de un receptor de linfocitos T endógeno (por ejemplo, un receptor de linfocitos T alfa/beta) se reduce en comparación con una célula control no modificada. En algunas modalidades del método, la célula eucariota es un linfocito T humano, o una célula derivada de este, o una célula NK humana, o una célula derivada de este.
En algunas modalidades del método, el ácido nucleico se introduce en la célula eucariota mediante un ARNm.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente al interrumpir una secuencia blanco en un cromosoma de la célula eucariota. El método comprende introducir en una célula eucariota una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8, en donde la meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende la SEQ ID NO: 5, y en donde la secuencia blanco se interrumpe mediante la unión terminal no homóloga en el sitio de escisión.
En determinadas modalidades del método, la expresión en la superficie celular de un receptor de linfocitos T endógeno (por ejemplo, un receptor de linfocitos T alfa/beta) se reduce en comparación con una célula control no modificada. En algunas modalidades del método, la célula eucariota es un linfocito T humano, o una célula derivada de este, o una
célula NK humana, o una célula derivada de este.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 Secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T humano. La secuencia de reconocimiento TRC 1-2, como blanco específico de las meganucleasas modificadas genéticamente de la invención, comprende dos semisitios de reconocimiento. Cada semisitio de reconocimiento comprende 9 pares de bases, separados por una secuencia central de 4 pares de bases. La secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5) comprende dos semisitios de reconocimiento denominados TRC1 y TRC2.
Figura 2 Las meganucleasas modificadas genéticamente de la invención comprenden dos subunidades, en donde la primera subunidad que comprende la región HVR1 se une a un primer sitio medio de reconocimiento (por ejemplo, TRC1) y la segunda subunidad que comprende la región HVR2 se une a un segundo sitio medio de reconocimiento (por ejemplo, TRC2). En modalidades donde la meganucleasa modificada genéticamente es una meganucleasa de cadena simple, la primera subunidad que comprende la región HVR1 puede colocarse como la subunidad N-terminal o C-terminal. Asimismo, la segunda subunidad que comprende la región HVR2 puede posicionarse como la subunidad N-terminal o C-terminal.
Figura 3 Esquema del ensayo indicador en células CHO para evaluar las meganucleasas modificadas genéticamente de la invención. Se produjo una línea celular CHO en la que un casete indicador estaba integrado de forma estable en el genoma de la célula. El casete indicador comprendía, en orden 5' a 3': un promotor temprano SV40; el 5' 2/3 del gen GFP; la secuencia de reconocimiento para una meganucleasa modificada genéticamente de la invención (por ejemplo, la secuencia de reconocimiento TRC 1-2); la secuencia de reconocimiento para la meganucleasa c Ho 23/24 (WO/2012/167192); y el 3' 2/3 del gen GFP. Las células transfectadas de forma estable con este casete no expresaron GFP en ausencia de un agente inductor de rotura de ADN. Las meganucleasas se introdujeron mediante transducción de ADN plasmídico o ARNm que codifica para cada meganucleasa. Cuando se indujo una ruptura de ADN en cualquiera de las secuencias de reconocimiento de meganucleasa, las regiones duplicadas del gen GFP se recombinaron entre sí para producir un gen GFP funcional. El porcentaje de células que expresan GFP luego se podría determinar mediante citometría de flujo como una medida indirecta de la frecuencia de escisión del genoma mediante las meganucleasas.
Figuras 4A a 4C Eficiencia de meganucleasas modificadas genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en un ensayo indicador de células CHO. Las meganucleasas TRC 1-2L.1592, TRC 1-2L.1775 y TRC 1-2L.1843 se modificaron genéticamente para dirigirse a la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5), y se analizaron para determinar su eficacia en el ensayo de indicador de células CHO. Los resultados mostrados proporcionan el porcentaje de células que expresan GFP observadas, lo que indica la eficacia de cada meganucleasa para escindir la secuencia de reconocimiento blanco o la secuencia de reconocimiento CHO 23/24. Un control negativo (bs) y TRC 1-2x.87EE de primera generación se incluyeron adicionalmente en el ensayo para su comparación. A) Ensayo del indicador CHO que evalúa TRC 1-2L.1592. B) Ensayo del indicador CHO que evalúa TRC 1- 2L.1775. C) Ensayo del indicador CHO que evalúa TRC 1-2L.1843.
Figuras 5A a 5C Eficiencia de meganucleasas modificadas genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC Off1 (SEQ ID NO: 16) y la secuencia de reconocimiento TRC Off2 (Se Q ID NO: 17) en un ensayo indicador de células CHO. Se transfectaron ARNm que codifican meganucleasas TRC 1-2 de la invención en células indicador CHO que contienen la secuencia de reconocimiento Off1 seleccionada en contra o la secuencia de reconocimiento Off2 entre las repeticiones directas GFP, así como una secuencia de reconocimiento CHO 23-24. Las meganucleasas de segunda generación se compararon en cada ensayo contra la meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación. A) Separación de las secuencias de reconocimiento de blanco inespecíficas por TRC 1-2L.1592 y TRC 1-2x.87EE. B) Separación de las secuencias de reconocimiento de blanco inespecíficas por TRC 1-2L.1775 y TRC 1-2x.87EE. C) Separación de las secuencias de reconocimiento de blanco inespecíficas por TRC 1-2L.1843 y TRC 1-2x.87EE.
Figura 6 Eficiencia de meganucleasas modificadas genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en un ensayo indicador de células CHO. Las meganucleasas TRC 1-2x.87EE (primera generación), TRC 1-2L.1108 (intermedia) y TRC 1-2L.1469 (intermedia) se modificaron genéticamente para dirigirse a la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5), y se analizaron para determinar la eficacia en el ensayo indicador de células CHO a los 2, 5 y 7 días después de la nucleofección con el fin de determinar la toxicidad. Los resultados mostrados proporcionan el porcentaje de células que expresan GFP observadas durante el período de análisis de 7 días, que indica la eficacia de cada meganucleasa para escindir una secuencia de reconocimiento blanco o la secuencia de reconocimiento CHO 23/24 en función del tiempo.
Figura 7 Eficiencia de meganucleasas modificadas genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en un ensayo indicador de células CHO. Las meganucleasas TRC 1-2L.1592, TRC 1-2L.1775 y TRC 1-2L.1843 de segunda generación se optimizaron para dirigirse a la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID
NO: 5), y se analizaron para determinar la eficacia en el ensayo indicador de células CHO a los 2, 5 y 7 días después de la nucleofección con el fin de determinar la toxicidad. La meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación y la meganucleasa TRC 1-2L.1469 intermedia también se incluyeron en este ensayo para su comparación. Los resultados mostrados proporcionan el porcentaje de células que expresan GFP observadas durante el período de análisis de 7 días, que indica la eficacia de cada meganucleasa para escindir una secuencia de reconocimiento blanco o la secuencia de reconocimiento CHO 23/24 en función del tiempo.
Figuras 8A a 8B Eficiencia de meganucleasas modificadas genéticamente para reconocer y escindir las secuencias de reconocimiento TRC Off1 y Off2 en un ensayo indicador de células CHO. La meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación, la meganucleasa TRC 1-2L.1469 intermedia y las meganucleasas TRC 1-2L.1592, TRC 1-2L.1775 y TRC 1-2L.1843 de segunda generación se analizaron en células indicadoras CHO GFFP que comprenden las secuencias de reconocimiento TRC Off1 (SEQ ID NO: 16) o Off2 (SEQ ID NO: 17) para eficacia en el ensayo indicador de células CHO a los 2, 5 y 7 días después de la nucleofección para determinar la toxicidad. Los resultados mostrados proporcionan el porcentaje de células que expresan GFP observadas durante el período de análisis de 7 días. A) Escisión de la secuencia de reconocimiento Off1. B) Escisión de la secuencia de reconocimiento Off2.
Figura 9 Visualización gráfica de datos de oligo-captura como una medida de la cantidad de sitios inespecíficos potencialmente válidos. Cada escisión inespecífica generada por una nucleasa particular se grafica en función de la cantidad de lecturas de secuencia únicas para un oligo de sonda que se captura en ese sitio. El sitio previsto (es decir, la secuencia de reconocimiento TRC 1-2) tiene el recuento de lectura más alto para cada meganucleasa probada (en círculos).
Figura 10 Visualización gráfica de datos de oligo-captura donde los sitios inespecíficos se grafican de acuerdo con su cantidad de lecturas alineadas en el eje X, y la cantidad de pares de bases no coincidentes en comparación con el sitio deseado se indican por color, con colores más oscuros que indican coincidencias generales más cercanas entre los sitios inespecíficos y el sitio de unión deseado. Las casillas indican las zonas de mayor confianza.
Figura 11 Tabla que resume el análisis in vitro de linfocitos T CAR generados usando la meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación, la meganucleasa TRC 1-2L.1469 intermedia o las meganucleasas TRC 1-2L.1592, TRC 1-2L.1775 y TRC 1- 2L.1843 de segunda generación. Las meganucleasas se analizaron para determinar la eficiencia de edición génica, la expansión posterior a la edición y el potencial de diferenciación. Los linfocitos T CAR se prepararon a partir de células obtenidas de tres donantes humanos sanos diferentes, y los experimentos fueron realizados por tres operadores diferentes.
Figura 12 Visualización gráfica de los datos de oligo-captura generados en poblaciones de linfocitos T obtenidas de tres donantes humanos sanos diferentes.
Figuras 13A a 13C Análisis in vitro de linfocitos T CAR generados usando la meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación, o las meganucleasas TRC 1-2L.1592, TRC 1-2L.1775 y TRC 1-2L.1843 de segunda generación. A) Número total de células en los días 0, 4 y 8 después de la edición. B) Número total de células editadas (es decir, TCR negativo) en los días 0, 4 y 8 después de la edición. C) Número total de células TCR-negativas/CAR-positivas en los días 0, 4 y 8 después de la edición.
Figura 14 Expansión de linfocitos T CAR después del cocultivo con células blanco portadoras de antígenos. La expansión se evaluó después del cocultivo de linfocitos T CAR con las líneas tumorales CD19+ Raji o Nalm6 a proporciones E:T de 1:1 y 1:2 durante 5 días. El número de ingreso de células se identifica mediante la línea discontinua.
Figuras 15A a 15B Expansión de linfocitos T CAR después del cocultivo con células blanco portadoras de antígenos. La expansión se evaluó luego del cocultivo de linfocitos T CAR con la línea tumoral Raji CD19+ a una proporción E:T de 1:2 durante 5 días. A) Número total de células CAR positivas en cultivo luego del cocultivo con células Raji. B) Número total de linfocitos CD19 positivos restantes en cultivo luego del cocultivo de linfocitos T CAR con linfocitos Raji.
Figuras 16A a 16E Secreción de citocinas de linfocitos T CAR en sobrenadantes de cultivo después de cocultivo con células blanco portadoras de antígeno durante 2 días. La secreción de citocinas se evaluó después del cocultivo de linfocitos T CAR con las líneas tumorales CD19+ Raji o Nalm6 a proporciones E:T de 1:1 y 1:2. Se utilizaron células leucémicas mielógenas K562 negativas para CD19 como controles. A) Secreción de IL-2. B) Secreción de TNF-alfa. C) Secreción de INF-gamma. D) Secreción de granzima B. E) Secreción de perforina.
Figura 17 Análisis de Western blot de la expresión de la meganucleasa en linfocitos T CAR. Las células se electroporaron con ARNm que codifica para las meganucleasas TRC 1-2x.87EE o TRC 1-2L.1592 y posteriormente se transdujeron con un vector AAV6 recombinante que portaba una plantilla donante que codificaba para un CAR anti-CD19 diseñado para su inserción en el sitio TRC 1-2. A las 6 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas y 168 horas después de la electroporación, se determinó la expresión de proteína de meganucleasa mediante análisis de Western blot. Las células en falso del mismo
donante se activaron y cultivaron en el mismo medio que los grupos de tratamiento con nucleasa y se recolectaron a las 24 horas después de que los grupos de tratamiento con nucleasa se hubieran electroporado.
Figura 18 Número total de células viables en los días 0, 3, 8 (antes y después del agotamiento de células positivas para CD3) y 13 del proceso de fabricación CAR T a gran escala se ejecuta usando TRC 1-2x.87EE o TRC 1-2L.1592.
Figura 19 La cantidad total de células CD3-negativas viables en el día 8 del proceso de fabricación de T CAR a gran escala se ejecuta usando TRC 1-2x.87EE o TRC 1-2L.1592.
Figura 20 Porcentaje de células CD3-negativas que son CAR-positivas en el día 8 (antes y después del agotamiento de células CD3-positivas) y el día 13 del proceso de fabricación CAR T a gran escala se ejecuta utilizando TRC 1-2x.87EE o TRC 1-2L.1592.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa silvestre tipo I-CreI de Chlamydomonas reinhardtii.
SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos del motivo LAGLIDADG.
SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de ácido nucleico del gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos (gen del NCBI ID NO. 28755).
SEQ ID NO: 4 establece la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos.
SEQ ID NO: 5 establece la secuencia de ácido nucleico de la cadena sensorial de la secuencia de reconocimiento TRC 1 2.
SEQ ID NO: 6 establece la secuencia de ácido nucleico de la cadena antisentido de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
SEQ ID NO: 7 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2L.1592.
SEQ ID NO: 8 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2L.1775.
SEQ ID NO: 9 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE.
SEQ ID NO: 10 establece la secuencia de aminoácidos de la subunidad de unión de la meganucleasa TRC 1-2L.1592. SEQ ID NO: 11 establece la secuencia de aminoácidos de la subunidad de unión de la meganucleasa TRC 1-2L.1775. SEQ ID NO: 12 establece la secuencia de aminoácidos de la subunidad de unión de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE TRC1.
SEQ ID NO: 13 establece la secuencia de aminoácidos de la subunidad de unión de la meganucleasa TRC 1-2L.1592. SEQ ID NO: 14 establece la secuencia de aminoácidos de la subunidad de unión de la meganucleasa TRC 1-2L.1775. SEQ ID NO: 15 establece la secuencia de aminoácidos de la subunidad de unión de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE TRC2.
SEQ ID NO: 16 establece la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de reconocimiento de Off1.
SEQ ID NO: 17 establece la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de reconocimiento de Off2.
SEQ ID NO: 18 establece la secuencia de aminoácidos de un enlazador de polipéptidos.
Descripción detallada de la invención
1.1 Referencias y definiciones
La literatura de patentes y científica citada en la presente establece el conocimiento que está disponible para los técnicos en la materia.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizadosen el presente documento tienen los
mismos significados al momento de la fecha de prioridad como frecuentemente los interpretaría un experto en la materia a la que pertenece esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención en este documento es solo para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no pretende ser limitante de la invención.
Tal como se usa en la presente, “un", "una” o “el" pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, “una” célula puede significar una sola célula o una multiplicidad de células.
Tal como se usa en la presente, a menos que se indique específicamente lo contrario, la palabra “o” se usa en el sentido inclusivo de “y/o" y no en el sentido exclusivo de “cualquiera/o.”
Tal como se usa en la presente, el término “endonucleasa” se refiere a enzimas que escinden un enlace fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos.
Tal como se usa en la presente, con respecto al ADN de cadena doble, los términos “escindir” o “escisión” se refieren a la hidrólisis mediada por endonucleasa de enlaces fosfodiéster dentro de la estructura principal de una secuencia de reconocimiento dentro de una secuencia blanco que resulte en una ruptura de cadena doble dentro de la secuencia blanco, denominada en la presente como un "sitio de escisión”. Dependiendo de la endonucleasa, la escisión puede dar como resultado fragmentos de cadena doble con extremos romos o fragmentos con las protuberancias de base 5' o 3'.
Tal como se usa en la presente, el término “meganucleasa” se refiere a una endonucleasa que se une al ADN de cadena doble en una secuencia de reconocimiento que es mayor que 12 pares de bases. En algunas modalidades, la secuencia de reconocimiento para una meganucleasa de la presente descripción es 22 pares de bases. Una meganucleasa puede ser una endonucleasa derivada de I-Crel y puede hacer referencia a una variante modificada genéticamente de I-Crel que se ha modificado con respecto a I-Crel natural con respecto, por ejemplo, a la especificidad de unión a ADN, la actividad de escisión de ADN, la afinidad de unión a ADN o las propiedades de dimerización. Los métodos para producir dichas variantes modificadas de I-Crel se conocen en la materia (por ejemplo, WO 2007/047859). Una meganucleasa, tal como se usa en la presente, se une al ADN de cadena doble como un heterodímero. Una meganucleasa también puede ser una “meganucleasa de cadena simple” en la que un par de dominios de unión a ADN se unen en un único polipéptido usando un enlazador peptídico. El término “endonucleasa homing’’ es sinónimo del término “meganucleasa". Las meganucleasas de la presente descripción son sustancialmente no tóxicas cuando se expresan en las células blanco como se describe en la presente, particularmente en linfocitos T humanos, de modo que las células se pueden transfectar y mantener a 37 °C sin observar efectos perjudiciales sustanciales sobre la viabilidad celular general o reducciones significativas en la actividad de escisión de meganucleasa cuando se miden usando los métodos descritos en la presente.
Tal como se usa en la presente, el término “meganucleasa de cadena simple” se refiere a un polipéptido que comprende un par de subunidades de nucleasa unidas por un enlazador de modo que las subunidades interactúen funcionalmente como un heterodímero para escindir un sitio de reconocimiento de cadena doble. Una meganucleasa de cadena simple tiene la organización: Subunidad N-terminal - Enlazador - Subunidad C-terminal. Las dos subunidades de meganucleasa generalmente no serán idénticas en la secuencia de aminoácidos y reconocerán sitios medios de ADN no idénticos dentro de una secuencia de reconocimiento. Por lo tanto, las meganucleasas de cadena simple generalmente escinden secuencias de reconocimiento pseudo-palindrómicas o no palindrómicas. Una meganucleasa de cadena simple se puede denominar “heterodímero de cadena simple” o “meganucleasa heterodimérica de cadena simple” aunque, de hecho, no es dimérica. Para mayor claridad, a menos que se especifique otra cosa, el término "meganucleasa” puede referirse a una meganucleasa dimérica o de cadena simple.
Tal como se usa en la presente, el término "enlazador” se refiere a una secuencia de péptidos exógenos usada para unir dos subunidades de meganucleasa en un único polipéptido. Un enlazador puede tener una secuencia que se encuentra en proteínas naturales, o puede ser una secuencia artificial que no se encuentra en ninguna proteína natural. Un enlazador puede ser flexible y carecer de estructura secundaria o puede tener una propensión a formar una estructura tridimensional específica en condiciones fisiológicas. Un enlazador puede incluir, de modo no limitante, cualquiera de las abarcadas por las patentes de EE.UU. Núms. 8,445,251, 9,340,777, 9,434,931 y 10,041,053. Un enlazador puede tener al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90%, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o más, de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 18, que establece los residuos 154 a 195 de SEQ ID NO: 7 u 8. Un enlazador puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:18, que establece los residuos 154 a 195 de SEQ ID NO: 7 u 8.
Tal como se usa en la presente, con respecto a una proteína, el término “recombinante” o “modificado genéticamente” significa que tiene una secuencia de aminoácidos alterada como resultado de la aplicación de técnicas de ingeniería genética a ácidos nucleicos que codifican la proteína, y células u organismos que expresan la proteína. Con respecto a un ácido nucleico, el término “recombinante” o “diseñado” significa que tiene una secuencia de ácidos nucleicos alterada como resultado de la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Las técnicas de ingeniería genética incluyen, entre otras, tecnologías de clonación de PCR y ADN; tecnologías de transfección, transformación y otras tecnologías de transferencia
génica; recombinación homóloga; mutagénesis dirigida al sitio; y fusión génica. De acuerdo con esta definición, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína de origen natural, pero producida por clonación y expresión en un hospedador heterólogo, no se considera recombinante.
Tal como se usa en la presente, el término "silvestre” se refiere al alelo de origen natural más común (es decir, secuencia de polinucleótidos) en la población de alelos del mismo tipo de gen, en donde un polipéptido codificado por el alelo silvestre tiene sus funciones originales. El término “silvestre” también se refiere a un polipéptido codificado por un alelo de origen silvestre. Los alelos y polipéptidos de origen natural (es decir, polinucleótidos) se pueden distinguir de los alelos y polipéptidos mutantes o variantes, que comprenden una o más mutaciones y/o sustituciones con respecto a las secuencias de origen natural. Mientras que un alelo o polipéptido silvestre puede conferir un fenotipo normal en un organismo, un alelo o polipéptido mutante o variante puede, en algunos casos, conferir un fenotipo alterado. Las nucleasas de tipo silvestre se distinguen de las nucleasas recombinantes o de existencia no natural. El término “silvestre” también puede hacer referencia a una célula, un organismo y/o un sujeto que posee un alelo silvestre de un gen particular, o una célula, un organismo y/o un sujeto utilizado con fines comparativos.
Tal como se usa en la presente, el término “modificado genéticamente” se refiere a una célula u organismo en el que, o en un antepasado del cual, una secuencia de ADN genómico se ha modificado deliberadamente mediante tecnología recombinante. Tal como se usa en la presente, el término “modificado genéticamente” comprende el término “transgénico.”
Tal como se usa en la presente con respecto a proteínas recombinantes, el término “modificación” significa cualquier inserción, eliminación o sustitución de un residuo aminoacídico en la secuencia recombinante con respecto a una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia tipo silvestre o nativa).
Tal como se usa en la presente, los términos “secuencia de reconocimiento” o “sitio de reconocimiento” se refieren a una secuencia de ADN que se une y se escinde mediante una endonucleasa. En el caso de una meganucleasa, una secuencia de reconocimiento comprende un par de “sitios medios” invertidos de 9 pares de bases que están separados por cuatro pares de bases. En el caso de una meganucleasa de cadena simple, el dominio N-terminal de la proteína entra en contacto con un primer sitio medio y el dominio C-terminal de la proteína entra en contacto con un segundo sitio medio. La escisión por una meganucleasa produce "protuberancias" 3' de cuatro pares de bases. Las "protuberancias” o los “extremos pegajosos” son segmentos de ADN de cadena simple cortos que se pueden producir mediante escisión de endonucleasa de una secuencia de ADN de cadena doble. En el caso de meganucleasas y meganucleasas de cadena simple derivadas de I-Crel, la protuberancia comprende las bases 10 a 13 de la secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases.
Tal como se usa en la presente, el término “sitio blanco” o “secuencia blanco” se refiere a una región del ADN cromosómico de una célula que comprende una secuencia de reconocimiento para una nucleasa.
Tal como se usa en la presente, el término “afinidad de unión al ADN” o “afinidad de unión” significa la tendencia de una meganucleasa a asociarse de manera no covalente con una molécula de ADN de referencia (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento o una secuencia arbitraria). La afinidad de unión se mide mediante una constante de disociación, Kd. Tal como se usa en la presente, una nucleasa tiene afinidad de unión “alterada” si la Kd de la nucleasa para una secuencia de reconocimiento de referencia aumenta o disminuye en un cambio porcentual estadísticamente significativo o cantidad biológicamente significativa (por ejemplo, al menos 2x, o 2x a 10x), con respecto a una nucleasa de referencia.
Tal como se usa en la presente, el término “especificidad” significa la capacidad de una nucleasa para reconocer y escindir moléculas de ADN de cadena doble solo en una secuencia particular de pares de bases denominada secuencia de reconocimiento, o solo en un conjunto particular de secuencias de reconocimiento. El conjunto de secuencias de reconocimiento compartirá determinadas posiciones conservadas o motivos de secuencia, pero puede encontrarse degenerada en una o más posiciones. Una nucleasa altamente específica es capaz de escindir solo una o muy pocas secuencias de reconocimiento. La especificidad se puede determinar mediante cualquier método conocido en la materia.
Tal como se usa en la presente, una nucleasa tiene especificidad “alterada” si se une y escinde una secuencia de reconocimiento que no está unida y escindida por una nucleasa de referencia (por ejemplo, un tipo silvestre) en condiciones fisiológicas, o si la velocidad de escisión de una secuencia de reconocimiento aumenta o disminuye en una cantidad biológicamente significativa (por ejemplo, al menos 2*, o 2*-10*) con respecto a una nucleasa de referencia.
Las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 han mejorado (es decir, aumentado) la especificidad para la secuencia de reconocimiento blanco que comprende SEQ ID NO: 5 (es decir, TRC 1-2) en comparación con la meganucleasa TRC 1-2x.87EE (cuya secuencia de aminoácidos se establece como SEQ ID NO: 9). Por lo tanto, en determinadas modalidades, las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 presentan una escisión de blanco inespecífico reducida en comparación con la meganucleasa TRC 1-2x.87EE. La escisión de blanco inespecífico mediante una meganucleasa se puede medir usando cualquier método conocido en la materia, que incluye, por ejemplo, análisis de oligo-captura como se describe en la presente, un ensayo de endonucleasa I (T7E) T7, PCR digital, secuenciación dirigida
de sitios de blanco inespecífico particulares, secuenciación de exornas, secuenciación de genomas completos, enriquecimiento en estreptavidina de etiquetado de rupturas in situ directas y secuenciación de nueva generación (BLESS), identificación no sesgada de todo el genoma, de DSB, habilitada por secuenciación (GUIDE-seq) y secuenciación de translocación de todo el genoma de alto rendimiento mediada por amplificación lineal (LAM-HTGTS) (véase, por ejemplo, Zischewski et al. (2017) Biotechnology Advances 35(1):95-104).
Tal como se usa en la presente, el término “recombinación homóloga” o “HR” se refiere al proceso celular natural en el que se repara una ruptura del ADN bicatenario usando una secuencia de ADN homóloga como plantilla de reparación (véase, por ejemplo, Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La secuencia homóloga de ADN puede ser una secuencia cromosómica endógena o un ácido nucleico exógeno que se administró a la célula.
Tal como se usa en la presente, el término “unión terminal no homóloga” o “NHEJ” se refiere al proceso celular natural en el que se repara una ruptura del ADN bicatenario mediante la unión directa de dos segmentos de ADN no homólogos (véase, por ejemplo, Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La reparación del ADN por unión terminal no homóloga es propensa a errores y con frecuencia da como resultado la adición o eliminación sin plantilla de secuencias de ADN en el sitio de reparación. En algunos casos, la escisión en una secuencia de reconocimiento blanco da como resultado NHEJ en un sitio de reconocimiento blanco. La escisión inducida por nucleasa de un sitio blanco en la secuencia codificante de un gen seguida de reparación del ADN por NHEJ puede introducir mutaciones en la secuencia codificante, tales como mutaciones de cambio de marco, que interrumpen la función génica. Por lo tanto, las nucleasas modificadas genéticamente se pueden utilizar para inactivar eficazmente un gen en una población de células. Tal como se usa en la presente, “alterar una secuencia blanco” se refiere a la introducción de una mutación (por ejemplo, mutación de cambio de marco) que interfiere con la función génica y evita la expresión y/o función del polipéptido/producto de expresión codificado por este.
Tal como se usa en la presente, un “brazo de homología” o “secuencias homólogas a secuencias que flanquean un sitio de escisión de meganucleasa” se refiere a secuencias que flanquean los extremos 5' y 3' de una molécula de ácido nucleico que promueven la inserción de la molécula de ácido nucleico en un sitio de escisión generado por una meganucleasa. En general, los grupos de homología pueden tener una longitud de al menos 50 pares de bases, preferentemente al menos 100 pares de bases, y hasta 2000 pares de bases o más, y pueden tener al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, o más, de homología de secuencia a sus secuencias correspondientes en el genoma.
Tal como se usa en la presente, un “receptor de antígeno quimérico” o “CAR” se refiere a un receptor modificado genéticamente que confiere o injerta especificidad para un antígeno en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T humano). Un receptor de antígeno quimérico comprende generalmente al menos un dominio o fracción de unión a ligando extracelular y un dominio intracelular que comprende uno o más dominios de señalización y/o dominios coestimuladores.
En algunas modalidades, el dominio o fracción de unión a ligando extracelular se encuentra en forma de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal, que proporciona especificidad para un epítopo o antígeno particular (por ejemplo, un epítopo o antígeno preferentemente presente en la superficie de una célula, tal como una célula cancerosa u otra célula o partícula causante de enfermedad). En algunas modalidades, el scFv se une mediante una secuencia enlazadora. En diversas modalidades, el dominio de unión al ligando extracelular es específico para cualquier antígeno o epítopo de interés. En algunas modalidades, el scFv es murino, humanizado o completamente humano.
El dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico también puede comprender un autoantígeno (véase, Payne et al. (2016), Science 353 (6295): 179-184), que se puede reconocer mediante receptores de linfocitos B específicos para autoantígeno en linfocitos B, dirigiendo así a los linfocitos T para dirigirse específicamente y destruir linfocitos B autorreactivos en enfermedades autoinmunitarias mediadas por anticuerpos. Dichos CAR se pueden denominar receptores de autoanticuerpos quiméricos (CAAR, por sus siglas en inglés), y su uso está abarcado por la invención.
El dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico también puede comprender un ligando de origen natural para un antígeno de interés, o un fragmento de un ligando de origen natural que retiene la capacidad de unirse al antígeno de interés.
El dominio estimulador intracelular puede incluir uno o más dominios de señalización citoplásmica que transmiten una señal de activación a la célula efectora inmunitaria después de la unión al antígeno. Dichos dominios de señalización citoplásmica pueden incluir, entre otros, CD3I. El dominio estimulador intracelular también puede incluir uno o más dominios coestimuladores intracelulares que transmiten una señal de supervivencia celular y/o proliferativa después de la unión al ligando. Dichos dominios coestimuladores intracelulares pueden ser cualquiera de los conocidos en la técnica y pueden incluir, de modo no limitante, CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LUZ, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con
CD83, N1, N6, o cualquier combinación de los mismos.
Un receptor de antígeno quimérico puede incluir además elementos estructurales adicionales, que incluyen un dominio transmembranal que se une al dominio de unión al ligando extracelular mediante una secuencia bisagra o espadadora. El dominio transmembranal puede derivarse de cualquier proteína transmembranal o unida a membrana. Por ejemplo, el polipéptido transmembranal puede ser una subunidad del receptor de linfocitos T (es decir, un polipéptido a, p, y o Z que constituye el complejo CD3), receptor de IL2 p55 (una cadena), cadena p75 (cadena p) o y, cadena de subunidad de receptores Fc (por ejemplo, receptor Fcy III) o proteínas CD tales como la cadena alfa CD8. Alternativamente, el dominio transmembranal puede ser sintético y puede comprender predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina.
La región bisagra se refiere a cualquier oligo- o polipéptido que funciona para unir el dominio transmembranal al dominio de unión al ligando extracelular. Por ejemplo, una región bisagra puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente 10 a 100 aminoácidos y más preferiblemente 25 a 50 aminoácidos. Las regiones bisagras pueden derivarse de la totalidad o parte de moléculas de origen natural, tal como de la totalidad o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de la totalidad o parte de una región constante de anticuerpo. Alternativamente, la región bisagra puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia bisagra de origen natural, o puede ser una secuencia bisagra completamente sintética. En ejemplos particulares, un dominio bisagra puede comprender una parte de una cadena alfa CD8 humana, receptor de FcyRllla o IgGl.
Tal como se usa en la presente, un “receptor de linfocitos T exógeno” o “TCR exógeno” se refiere a un TCR cuya secuencia se introduce en el genoma de una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T humano) que puede o no expresar endógenamente el TCR. La expresión de un TCR exógeno en una célula efectora inmunitaria puede conferir especificidad para un epítopo o antígeno específico (por ejemplo, un epítopo o antígeno presente preferentemente en la superficie de una célula cancerosa u otra célula o partícula causante de enfermedad). Dichos receptores de linfocitos T exógenos pueden comprender cadenas alfa y beta o, alternativamente, pueden comprender cadenas gamma y delta. Los TCR exógenos útiles en la invención pueden tener especificidad para cualquier antígeno o epítopo de interés.
Tal como se usa en la presente, el término “expresión reducida” se refiere a cualquier reducción en la expresión del receptor endógeno de linfocitos T (por ejemplo, un receptor de linfocitos T alfa/beta) en la superficie celular de un linfocito T modificado genéticamente en comparación con una célula control. El término reducido también puede referirse a una reducción en el porcentaje de células en una población de células que expresan un polipéptido endógeno (es decir, un receptor de linfocitos T endógeno) en la superficie celular en comparación con una población de células control. Dicha reducción puede ser de hasta 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o hasta 100 %. Por consiguiente, el término “reducido” comprende tanto una inactivación parcial como una inactivación completa del receptor endógeno de linfocitos T. Una supresión (es decir, un noqueo completo) de la expresión en la superficie celular de un receptor endógeno de linfocitos T puede resultar de la inactivación genética del gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T usando las meganucleasas modificadas genéticamente descritas en la presente. El dominio constante alfa codificado por el gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T es necesario para el ensamblaje del complejo TCR endógeno en la superficie celular. Por lo tanto, noquear el gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T usando meganucleasas modificadas genéticamente descritas en la presente resulta en un noqueo de la expresión del receptor de linfocitos T de superficie celular.
Tal como se usa en la presente con respecto a ambas secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos, los términos “porcentaje de identidad”, “identidad de secuencia", “porcentaje de similitud", “similitud de secuencia” y similares se refieren a una medida del grado de similitud de dos secuencias en función de una alineación de las secuencias que maximiza la similitud entre residuos de aminoácidos alineados o nucleótidos, y que es una función del número de residuos o nucleótidos idénticos o similares, el número de residuos o nucleótidos totales y la presencia y longitud de espacios en la alineación de secuencia. Se dispone de una variedad de algoritmos y programas informáticos para determinar la similitud de secuencia utilizando parámetros de uso convencional. Tal como se usa en la presente, la similitud de secuencia se mide usando el programa BLASTp para secuencias de aminoácidos y el programa BLASTn para secuencias de ácidos nucleicos, ambos disponibles a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov/), y se describen, por ejemplo, en Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish y States (1993), Nature Genet. 3:266-272; Madden et al. (1996), Meth. Enzymol.266:131-141; Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol. 7(1-2):203-14. Tal como se usa en la presente, el porcentaje de similitud de dos secuencias de aminoácidos es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTp: tamaño de palabra =3; penalización por apertura de brecha =-11; penalización por extensión de brecha =-1; y matriz de puntuación = BLOSUM62. Tal como se usa en la presente, el porcentaje de similitud de dos secuencias de ácido nucleico es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTn: tamaño de palabra =11; penalización por apertura de brecha =-5; penalización por extensión de brecha =-2; recompensa de coincidencia =1; y penalización por desajuste =-3.
Tal como se usa en la presente con respecto a modificaciones de dos proteínas o secuencias de aminoácidos, el término “correspondiente a” se usa para indicar que una modificación especificada en la primera proteína es una sustitución del mismo residuo aminoacídico que en la modificación en la segunda proteína, y que la posición de aminoácidos de la modificación en la primera proteína corresponde o se alinea con la posición de aminoácidos de la modificación en la segunda proteína cuando las dos proteínas se someten a alineaciones de secuencia estándar (por ejemplo, usando el programa BLASTp). Por lo tanto, la modificación del residuo “X” al aminoácido “A” en la primera proteína corresponderá a la modificación del residuo “Y” al aminoácido “A” en la segunda proteína si los residuos X e Y corresponden entre sí en una alineación de secuencia, y a pesar del hecho de que X e Y pueden ser números diferentes.
Tal como se usa en la presente, el término “sitio medio de reconocimiento”, “sitio medio de secuencia de reconocimiento” o simplemente “sitio medio” significa una secuencia de ácido nucleico en una molécula de ADN bicatenario que es reconocida por un monómero de una meganucleasa homodimérica o heterodimérica, o por una subunidad de una meganucleasa de cadena simple.
Tal como se usa en la presente, el término “región hipervariable” se refiere a una secuencia localizada dentro de un monómero o subunidad de meganucleasa que comprende aminoácidos con variabilidad relativamente alta. Una región hipervariable puede comprender aproximadamente 50 a 60 residuos contiguos, aproximadamente 53 a 57 residuos contiguos o preferentemente aproximadamente 56 residuos. Los residuos de una región hipervariable corresponden a las posiciones 24 a 79 o posiciones 215 a 270 de la SEQ ID NO: 7. Una región hipervariable puede comprender uno o más residuos que entran en contacto con bases de ADN en una secuencia de reconocimiento y pueden modificarse para alterar la preferencia de base del monómero o subunidad. Una región hipervariable también puede comprender uno o más residuos que se unen a la estructura principal de ADN cuando la meganucleasa se asocia con una secuencia de reconocimiento de ADN de cadena doble. Dichos residuos se pueden modificar para alterar la afinidad de unión de la meganucleasa a la estructura principal de ADN y la secuencia de reconocimiento blanco.
Tal como se usa en la presente, los términos “gen alfa del receptor de linfocitos T” o “gen alfa TCR” son intercambiables y se refieren al locus en un linfocito T que codifica la subunidad alfa del receptor de linfocitos T. El receptor alfa de linfocitos T puede hacer referencia al gen del NCBI con ID número 6955, antes o después de la reorganización. Después de la reorganización, el gen alfa del receptor de linfocitos T comprende un promotor endógeno, segmentos V y J reorganizados, el sitio donante de empalme endógeno, un intrón, el sitio aceptor de empalme endógeno y el locus de región constante del receptor alfa de linfocitos T, que comprende los exones codificantes de subunidad.
Tal como se usa en la presente, el término “región constante alfa del receptor de linfocitos T” o “región constante alfa TCR” se refiere a la secuencia codificante del gen alfa del receptor de linfocitos T. La región constante alfa de TCR incluye la secuencia silvestre y variantes funcionales de esta, identificadas mediante el gen del NCBI ID NO. 28755.
Los términos “constructo de ADN recombinante”, “constructo recombinante", “casete de expresión", “constructo de expresión", “constructo quimérico", “constructo” y “fragmento de ADN recombinante” se utilizan indistintamente en la presente y son polinucleótidos mono- o bicatenarios. Un constructo recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y de codificación que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por ejemplo, un constructo quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero ordenadas en una manera distinta a la que se observa en la naturaleza. Se puede utilizar dicho constructo por sí mismo o se puede utilizar junto con un vector.
Tal como se usa en la presente, un “vector” o “vector de ADN recombinante” puede ser un constructo que incluya un sistema de replicación y secuencias que sean capaces de transcripción y traducción de una secuencia codificante de polipéptidos en una célula hospedera dada. Si se utiliza un vector, entonces la elección del vector depende del método que se utilizará para transformar las células hospederas como es conocido por los expertos en la materia. Los vectores pueden incluir, entre otros, vectores de plásmidos y vectores virales recombinantes (por ejemplo, vectores de AAV), o cualquier otro vector conocido en esa técnica adecuado para administrar un gen que codifica una meganucleasa de la invención a una célula blanco. El experto en la técnica conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar con éxito células hospederas que comprenden cualquiera de los nucleótidos aislados o secuencias de ácido nucleico de la invención.
Tal como se usa en la presente, un “vector” también puede hacer referencia a un vector viral. Los vectores virales pueden incluir, sin limitación, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales y vectores virales adenoasociados (AAV).
Tal como se usa en la presente, un ARNm “policistrónico” se refiere a un único ARN mensajero que comprende dos o más secuencias codificantes (es decir, cistrones) y codifica más de una proteína. Un ARNm policistrónico puede comprender cualquier elemento conocido en la técnica para permitir la traducción de dos o más genes de la misma molécula de ARNm
que incluye, entre otros, un elemento IRES, un elemento T2A, un elemento P2A, un elemento E2A y un elemento F2A.
Tal como se usa en la presente, un “linfocito T humano” o “linfocito T” se refiere a un linfocito T aislado de un donante, particularmente un donante humano. Los linfocitos T, y linfocitos derivados de estos, incluyen linfocitos T aislados que no se han pasado en cultivo, linfocitos T que se han pasado y mantenido en condiciones de cultivo celular sin inmortalización, y linfocitos T que se han inmortalizado y se pueden mantener en condiciones de cultivo celular indefinidamente.
Tal como se usa en la presente, un “control” o “célula control” se refiere a una célula que proporciona un punto de referencia para medir cambios en el genotipo o fenotipo de una célula modificada genéticamente. Una célula control puede comprender, por ejemplo: (a) una célula de tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo que el material de partida para la alteración genética que dio como resultado la célula modificada genéticamente; (b) una célula del mismo genotipo que la célula modificada genéticamente pero que se ha transformado con un constructo nulo (es decir, con un constructo que no tiene un efecto conocido sobre el rasgo de interés); o, (c) una célula genéticamente idéntica a la célula modificada genéticamente pero que no está expuesta a condiciones o estímulos o modificaciones genéticas adicionales que inducirían la expresión de genotipo o fenotipo alterado.
Tal como se usa en la presente, los términos “tratamiento” o “tratamiento de un sujeto” se refieren a la administración de un linfocito T modificado genéticamente o población de linfocitos T modificados genéticamente de la invención a un sujeto que tiene una enfermedad. Por ejemplo, el sujeto puede tener una enfermedad tal como cáncer, y el tratamiento puede representar inmunoterapia para el tratamiento contra la enfermedad. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, entre otros, prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminución de la tasa de evolución de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos aspectos, una célula eucariota modificada genéticamente o población de células eucariotas modificadas genéticamente descritas en la presente es administrable durante el tratamiento en forma de una composición farmacéutica de la invención.
El término “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para producir resultados biológicos y/o clínicos beneficiosos o deseables. La cantidad terapéuticamente efectiva variará según la formulación o composición utilizada, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, condición física y capacidad de respuesta del sujeto a tratar. En modalidades específicas, una cantidad eficaz de un linfocito T modificado genéticamente o población de linfocitos T modificados genéticamente de la invención, o composiciones farmacéuticas descritas en la presente, reduce al menos un síntoma de una enfermedad en un sujeto. En aquellas modalidades en donde la enfermedad es un cáncer, una cantidad eficaz de la meganucleasa modificada genéticamente o composiciones farmacéuticas descritas en la presente reduce el nivel de proliferación o metástasis de cáncer, provoca una respuesta parcial o completa o remisión de cáncer, o reduce al menos un síntoma de cáncer en un sujeto.
Tal como se usa en la presente, el término “cáncer” debe entenderse que abarca cualquier enfermedad neoplásica (ya sea invasiva o metastásica) que se caracteriza por una división celular anormal e incontrolada que causa crecimiento o tumor maligno.
Tal como se usa en la presente, el término “carcinoma” se refiere a un crecimiento maligno compuesto de células epiteliales.
Tal como se usa en la presente, el término "leucemia” se refiere a neoplasias malignas de los órganos/sistemas hematopoyéticos y se caracteriza generalmente por una proliferación y desarrollo anormales de leucocitos y sus precursores en la sangre y la médula ósea.
Tal como se usa en la presente, el término “sarcoma” se refiere a un tumor que se compone de una sustancia como el tejido conectivo embrionario y generalmente está compuesto por células estrechamente empaquetadas incrustadas en una sustancia fibrilar, heterogénea u homogénea.
Tal como se usa en la presente, el término “melanoma” se refiere a un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos.
Tal como se usa en la presente, el término “linfoma” se refiere a un grupo de tumores de células sanguíneas que se desarrollan a partir de linfocitos.
Tal como se usa en la presente, el término “blastoma” se refiere a un tipo de cáncer causado por neoplasias malignas en células precursoras o blastos (tejido inmaduro o embrionario).
Tal como se usa en la presente, la recitación de un intervalo numérico para una variable pretende transmitir que la invención se puede poner en práctica con la variable igual a cualquiera de los valores dentro de ese intervalo. Por lo tanto, para una variable que es inherentemente discreta la variable puede ser igual a cualquier valor entero dentro del intervalo numérico,
incluyendo los extremos de dicho intervalo. Del mismo modo, para una variable que es inherentemente continua, la variable puede ser igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, incluyendo los extremos de dicho intervalo. Como ejemplo, y de modo no limitante, una variable que se describe como que tiene valores entre 0 y 2 puede tomar los valores 0, 1 o 2 si la variable es inherentemente discreta, y puede tomar los valores 0.0, 0.1, 0.01, 0.001, o cualquier otro valor real §0 y ^2 si la variable es inherentemente continua.
2.1 Principio de la invención
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de meganucleasas optimizadas de segunda generación que tienen propiedades mejoradas en comparación con las meganucleasas parentales de primera generación, tales como especificidad mejorada (es decir, aumentada) y escisión de blanco inespecífico reducido, tiempo de persistencia reducido en las células después de la expresión de ARNm, características celulares mejoradas cuando se usan in vitro con linfocitos T humanos y características celulares mejoradas cuando se usan en un proceso de fabricación de linfocitos T CAR a escala completa.
Al igual que la meganucleasa TRC 1-2x.87EE descrita anteriormente, estas meganucleasas optimizadas de segunda generación que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 reconocen la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5) en el exón 1 del gen de la región constante alfa del TCR. La escisión en esta secuencia de reconocimiento puede permitir NHEJ en el sitio de escisión y alterar la expresión de la subunidad alfa de cadena del receptor de linfocitos T humanos, lo que lleva a una expresión y/o función reducida del receptor de linfocitos T en la superficie celular. Además, la escisión en esta secuencia de reconocimiento puede permitir además la recombinación homóloga de secuencias de ácido nucleico exógenas directamente en el gen de región constante alfa de TCR. Dichas secuencias de ácido nucleico exógenas pueden comprender una secuencia de interés, tal como una secuencia que codifica para un receptor de antígeno quimérico, un receptor TCR exógeno o cualquier otro polipéptido de interés. Por lo tanto, las composiciones y métodos descritos actualmente permiten tanto la inactivación del receptor de linfocitos T endógeno (por ejemplo, un receptor de linfocitos T alfa/beta) como la expresión de una secuencia de ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico o TCR exógeno). Dichas células pueden mostrar una inducción reducida o nula de la enfermedad de injerto contra hospedero (EICH) cuando son administrables a un sujeto alogénico.
2.2 Meganucleasas optimizadas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 dentro del gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T
Se sabe en la técnica que es posible usar una nucleasa específica del sitio para hacer una ruptura de ADN en el genoma de una célula viva, y que dicha ruptura de ADN puede dar como resultado una modificación permanente del genoma mediante recombinación homóloga del sitio blanco escindido con una secuencia de ADN idéntica o altamente homóloga dentro del genoma. La invención se pone en práctica usando meganucleasas recombinantes modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8.
Las nucleasas utilizadas para poner en práctica la invención son meganucleasas de cadena simple. Una meganucleasa de cadena simple comprende una subunidad N-terminal y una subunidad C-terminal unidas por un péptido enlazador. Cada uno de los dos dominios reconoce la mitad de la secuencia de reconocimiento (es decir, un sitio medio de reconocimiento) y el sitio de escisión de ADN se encuentra en el centro de la secuencia de reconocimiento cerca de la interfaz de las dos subunidades. Las rupturas de cadenas de ADN se compensan con cuatro pares de bases de modo que la escisión de ADN por una meganucleasa genera un par de protuberancias de cadena simple 3' de cuatro bases.
Las meganucleasas recombinantes de la invención se modificaron genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5) dentro del exón 1 del gen de región constante alfa de TCR (SEQ ID NO: 3). Las meganucleasas modificadas genéticamente de la invención comprenden una primera subunidad, que comprende una primera región hipervariable (HVR1), y una segunda subunidad, que comprende una segunda región hipervariable (HVR2). Además, la primera subunidad se une a un primer sitio medio de reconocimiento en la secuencia de reconocimiento (es decir, el sitio medio TRC1), y la segunda subunidad se une a un segundo sitio medio de reconocimiento en la secuencia de reconocimiento (es decir, el sitio medio TRC2). La primera y segunda subunidades estan orientadas de modo que la primera subunidad, que comprende la región HVR1 y se une al primer sitio medio, esté posicionada como la subunidad C-terminal, y la segunda subunidad, que comprende la región HVR2 y se une al segundo sitio medio, esté posicionada como la subunidad N-terminal. En la tabla 1 se proporcionan ejemplos de meganucleasas modificadas genéticamente que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Tabla 1. Ejemplares de las meganucleasas modificadas genéticamente que reconocer y cortar la secuencia de reconocimiento TCR 1-2 (SEQ ID NO: 5).
*"HVR1 %" y "HVR2 %" representan la identidad de la secuencia de aminoácidos entre las regiones HVR1 y HVR2, respectivamente, de cada meganucleasa y las regiones HVR1 y HVR2, respectivamente, de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE.
Las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 presentan al menos una característica optimizada en comparación con la meganucleasa de primera generación TRC 1-2x.87EE. Dichas características optimizadas incluyen especificidad mejorada (es decir, aumentada) que resulta en una escisión del blanco inespecífico reducida, tiempo de persistencia reducido en las células después de la expresión de ARNm y eficiencia mejorada (es decir, aumentada) de escisión y modificación del gen de la región constante alfa de TCR. Por lo tanto, en modalidades particulares, las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 cuando son administrables a una población de células eucariotas son capaces de generar un mayor porcentaje de células con una escisión y/o modificación en el gen de la región constante alfa de TCR. En algunas de estas modalidades, la población de células eucariotas comprende al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o más de células eucariotas que comprenden una escisión y/o inserción/deleción (“indel”) en el gen de la región constante alfa del TCR. La escisión y/o modificación del gen de región constante alfa del TCR mediante una meganucleasa se puede medir usando cualquier método conocido en la materia, que incluye un ensayo de endonucleasa I T7, PCR digital, ensayos de detección de desajuste, ensayo de escisión de desajuste, análisis de fusión de alta resolución (HRMA), ensayo de movilidad heterodúplex, secuenciación y electroforesis de gel capilar de PCR fluorescente (véase, por ejemplo, Zischewski et al. (2017) Biotechnology Advances 35(1):95-104).
En determinadas modalidades, las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 presentan un tiempo de persistencia reducido en las células, particularmente cuando se introducen como un ARNm, en comparación con la meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación. La persistencia de un ARNm o proteína dentro de una célula se puede medir usando cualquier método conocido en la materia, que incluye, entre otros, RT-PCR, Northern blot, ensayos de protección de nucleasas, hibridación in situ, inmunocitoquímica, inmunotransferencia e inmunoprecipitación.
2.3 Métodos para administrar y expresar meganucleasas optimizadas
La invención proporciona métodos para producir linfocitos T modificados genéticamente y poblaciones de estos usando meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 y que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NO: 5 que se encuentra dentro del gen de la región constante alfa del TCR humano (SEQ ID NO: 3). Los linfocitos T se pueden obtener a partir de una serie de fuentes, incluidas células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas modalidades de la presente descripción, se puede utilizar cualquier cantidad de líneas de linfocitos T disponibles en la materia. En algunas modalidades de la presente descripción, los linfocitos T se obtienen a partir de una unidad de sangre recolectada a partir de un sujeto usando cualquier cantidad de técnicas conocidas por el experto en la técnica. En una modalidad, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen mediante aféresis.
El gen alfa del receptor de linfocitos T modificados comprende una secuencia exógena de interés insertada en el primer exón del gen de la región constante alfa del TCR (es decir, el exón blanco) mediante escisión de cadena doble mediante una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8. Los sitios de escisión generados por dichas meganucleasas pueden permitir la recombinación homóloga de la secuencia exógena de interés directamente en el exón blanco.
Tal como se usa en la presente, el término “exógeno” o “heterólogo” con referencia a una secuencia de nucleótidos pretende significar una secuencia que es puramente sintética, que se origina de una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico mediante intervención
humana deliberada.
En diversas modalidades, la secuencia exógena de interés puede comprender una secuencia codificante para una proteína de interés. Se prevé que la secuencia codificante puede ser para cualquier proteína de interés.
En determinadas modalidades, la secuencia exógena de interés comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un receptor de antígeno quimérico (CAR). En general, un CAR de la presente descripción comprenderá al menos un dominio extracelular y un dominio intracelular. En algunas modalidades, el dominio extracelular comprende un elemento de unión específico para el blanco al que de otro modo se hace referencia como un dominio o fracción de unión al ligando. En algunas modalidades, el dominio intracelular, o dominio citoplásmico, comprende al menos un dominio coestimulador y uno o más dominios de señalización tales como, por ejemplo, CD3Z.
En algunas modalidades, un CAR útil en la invención comprende un elemento de unión específico de blanco extracelular al que se hace referencia de otro modo como un dominio o porción de unión a ligando. La elección del dominio de unión a ligandos depende del tipo y número de ligandos que definen la superficie de una célula blanco. Por ejemplo, el dominio de unión al ligando se puede elegir para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular en células blanco asociadas con un estado de enfermedad particular. Por lo tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos para el dominio de unión al ligando en un CAR pueden incluir aquellos asociados con virus, infecciones bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas. En algunas modalidades, un CAR se modifica genéticamente para dirigirse a un antígeno específico para tumor de interés mediante la modificación genética de un grupo funcional de unión al ligando deseado que se une específicamente a un antígeno en una célula tumoral. En el contexto de la presente descripción, “antígeno tumoral” o “antígeno específico de tumor” se refiere a antígenos que son comunes a trastornos hiperproliferativos específicos tales como cáncer.
En algunas modalidades, el dominio de unión al ligando extracelular CAR es específico para cualquier antígeno o epítopo de interés, particularmente cualquier antígeno tumoral o epítopo de interés. Como ejemplos no limitantes, en algunas modalidades el antígeno del blanco es un antígeno de superficie asociado a tumor, tal como ErbB2 (HER2/neu), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), variante III de EGFR (EGFRvlII), CD19, Cd2o, CD22, CD30, CD40, ClL-1, disialogangliósido GD2, mucina ductal-epitelial, gp36, TAG-72, glucoesfingolípidos, antígeno asociado a glioma, gonadotropina coriónica B-humana, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, telomerasa humana transcriptasa inversa, RU1, RU2 (AS), carboxil esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, próstata, antígeno prostático específico (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-la, p53, prosteína, PSMA, sobrevivientes y telomerasa, antígeno tumoral de carcinoma de próstata-1 (PCTA-1), MAGO, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrina b2, factor de crecimiento de insulina (IGFl)-l, IGF-II, receptor IGFI, mesotelina, una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un epítopo peptídico específico de tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2 D, antígenos estromales tumorales, el dominio adicional A (EDA) y el dominio adicional B (EDB) de fibronectina y el dominio Al de tenascina-C (TnC Al) y proteína asociada a fibroblastos (fap); un antígeno específico de linaje o específico de tejido tal como CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD38, CDl23, CD133, CD138, CTLA-4, B7- 1 (Cd 80), B7-2 (CD86), endoglina, una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF 17), CS1 o un antígeno de superficie específico de virus tal como antígeno específico del VIH (tal como HIV gμl20); un antígeno específico de EBV, un antígeno específico de CMV, un antígeno específico de HPV tal como las oncoproteínas E6 o E7, un antígeno específico del virus Lassa, un antígeno específico del virus de la influenza, así como cualquier derivado o variante de estos marcadores de superficie. En una modalidad particular de la presente descripción, el dominio de unión al ligando es específico para CD19.
En algunas modalidades, el dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico además comprende un autoantígeno (véase, Payne et al. (2016) Science, Vol. 353 (6295): 179-184), que se puede reconocer mediante receptores de linfocitos B específicos para autoantígenos en linfocitos B, lo que dirige a los linfocitos T a dirigirse específicamente a linfocitos B autorreactivos y destruirlos en enfermedades autoinmunitarias mediadas por anticuerpos. Dichos CAR se pueden denominar receptores de autoanticuerpos quiméricos (CAAR, por sus siglas en inglés).
En algunas modalidades, el dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico puede comprender un ligando de origen natural para un antígeno de interés, o un fragmento de un ligando de origen natural que conserva la capacidad de unirse al antígeno de interés.
En algunas modalidades, un CAR comprende un dominio transmembranal que une el dominio de unión al ligando extracelular o autoantígeno con los dominios coestimuladores y de señalización intracelular mediante una secuencia bisagra o espaciadora. El dominio transmembranal puede derivarse de cualquier proteína transmembranal o unida a membrana. Por ejemplo, el polipéptido transmembranal puede ser una subunidad del receptor de linfocitos T (es decir, un polipéptido a, p, y o Z que constituye el complejo CD3), receptor de IL2 p55 (una cadena), cadena p75 (cadena p) o y, cadena de subunidad de receptores Fc (por ejemplo, receptor Fcy III) o proteínas CD tales como la cadena alfa CD8. Alternativamente, el dominio transmembranal puede ser sintético y puede comprender predominantemente residuos
hidrófobos tales como leucina y valina. En ejemplos particulares, el dominio transmembranal es un polipéptido transmembranal CD8a.
La región bisagra se refiere a cualquier oligo- o polipéptido que funciona para unir el dominio transmembranal al dominio de unión al ligando extracelular. Por ejemplo, una región bisagra puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente 10 a 100 aminoácidos y más preferiblemente 25 a 50 aminoácidos. Las regiones bisagras pueden derivarse de la totalidad o parte de moléculas de origen natural, tal como de la totalidad o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de la totalidad o parte de una región constante de anticuerpo. Alternativamente, la región bisagra puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia bisagra de origen natural, o puede ser una secuencia bisagra completamente sintética. En ejemplos particulares, un dominio bisagra puede comprender una parte de una cadena alfa CD8 humana, receptor de FcyRllla o IgGl.
Los dominios de señalización intracelular de un CAR son responsables de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula en la que se ha colocado el CAR y/o la activación de vías de supervivencia celular y proliferativa. El término “función efectora” se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas. Un dominio de señalización intracelular, tal como CD3Z, puede proporcionar una señal de activación a la célula en respuesta a la unión del dominio extracelular. Tal como se mencionó, la señal de activación puede inducir una función efectora de la célula tal como, por ejemplo, actividad citolítica o secreción de citocinas.
El dominio intracelular del CAR puede incluir uno o más dominios coestimuladores intracelulares que transmiten una señal coestimuladora para promover la proliferación celular, la supervivencia celular y/o la secreción de citocinas después de la unión del dominio extracelular. Dichos dominios coestimuladores intracelulares incluyen aquellos conocidos en la técnica tales como, de modo no limitante, N1, N6, CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LUZ, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83.
El CAR puede ser específico para cualquier tipo de célula cancerosa. Dichos cánceres pueden incluir, de modo no limitante, carcinoma, linfoma, sarcoma, blastomas, leucemia, cánceres de origen celular B, cáncer mamario, cáncer gástrico, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer pulmonar, melanoma, cáncer prostático, cáncer colónico, carcinoma celular renal, cáncer ovárico, rabdomiosarcoma, leucemia y linfoma de Hodgkin. En determinadas modalidades, los cánceres originados a partir de linfocitos B incluyen, de modo no limitante, leucemia linfoblástica aguda de linaje B, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma no Hodgkin de linfocitos B y mieloma múltiple.
La secuencia de interés puede codificar además un receptor de linfocitos T exógeno (TCR). Dichos receptores de linfocitos T exógenos pueden comprender cadenas alfa y beta o, alternativamente, pueden comprender cadenas gamma y delta. Los TCR exógenos útiles en la invención pueden tener especificidad para cualquier antígeno o epítopo de interés.
En otras modalidades, la secuencia de interés puede codificar para la versión modificada o silvestre de un gen endógeno de interés.
La secuencia de interés puede comprender un elemento o péptido conocido en la técnica para permitir la traducción de dos genes más del mismo promotor, que incluyen, entre otros, elementos IRES y elementos 2A, tales como, un elemento T2A, un elemento P2A, un elemento E2A y un elemento F2A. En modalidades específicas, dichos elementos en la secuencia exógena de interés pueden ubicarse 5' corriente arriba o 3' corriente abajo de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína de interés (por ejemplo, un CAR).
La secuencia exógena de interés descrita en la presente puede comprender además secuencias control adicionales. Por ejemplo, las secuencias de interés pueden incluir secuencias potenciadoras de recombinación homólogas, secuencias de Kozak, secuencias de poliadenilación, secuencias de terminación transcripcional, secuencias marcadoras de selección (por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos), orígenes de replicación y similares. Las secuencias de interés descritas en la presente también pueden incluir al menos una señal de localización nuclear. Los ejemplos de señales de localización nuclear son conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105).
Las meganucleasas modificadas genéticamente de la invención se pueden administrar en una célula en forma de proteína o, preferentemente, como un ácido nucleico que codifica para la meganucleasa modificada genéticamente. Dicho ácido nucleico puede ser ADN (por ejemplo, ADN plásmido circular o linealizado o productos de PCR) o ARN (por ejemplo, ARNm). Para modalidades en las que la secuencia codificante de meganucleasa modificada genéticamente es administrable en forma de ADN, debe estar unida funcionalmente a un promotor para facilitar la transcripción del gen de meganucleasa. Los promotores de mamíferos adecuados para la invención incluyen promotores constitutivos tales como el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) (Thomsen et al. (1984), Proc Natl Acad Sci USA. 81(3):659-63) o el promotor temprano SV40 (Benoist y Chambon (1981), Nature. 290(5804):304-10) así como promotores inducibles tales como el promotor inducible por tetraciclina (Dingermann et al. (1992), Mol Cell Biol. 12(9):4038-45). Una meganucleasa
modificada genéticamente de la invención también puede estar unida funcionalmente a un promotor sintético. Los promotores sintéticos pueden incluir, entre otros, al promotor JeT (WO 2002/012514).
En algunas modalidades, el ARNm que codifica la meganucleasa modificada genéticamente es administrable a la célula porque esto reduce la probabilidad de que el gen que codifica la meganucleasa modificada genéticamente se integre en el genoma de la célula. Dicho ARNm que codifica una meganucleasa modificada genéticamente se puede producir utilizando métodos conocidos en la materia tales como transcripción in vitro. En algunas modalidades, el ARNm tiene una caperuza o capuchón en los extremos 5' usando 7-metil-guanosina, análogos de terminaciones en cadena anti-inversas (ARCA) (US 7,074,596), análogos de CleanCap® tales como análogos de Cap 1 (Trilink, San Diego, CA), o enzimáticamente coronado en los extremos usando enzima de Vaccinia en los extremos o lo similar. En algunas modalidades, el ARNm puede estar poliadenilado. El ARNm puede contener varios elementos de secuencia no traducidos 5' y 3' para mejorar la expresión de la meganucleasa modificada genéticamente codificada y/o la estabilidad del propio ARNm. Dichos elementos pueden incluir, por ejemplo, elementos reguladores postraduccionales tales como un elemento regulador postraduccional del virus de la hepatitis de la marmota. El ARNm puede contener análogos de nucleósidos o nucleósidos de origen natural, tales como pseudouridina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 5-metiluridina o 2-tiouridina. Los análogos de nucleósidos adicionales incluyen, por ejemplo, los descritos en US 8,278,036.
En modalidades particulares, un ARNm que codifica una meganucleasa modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 puede ser un ARNm policistrónico que codifica dos o más meganucleasas que se expresan simultáneamente en la célula. Un ARNm policistrónico puede codificar dos o más meganucleasas que se dirigen a diferentes secuencias de reconocimiento en el mismo gen blanco. De manera alternativa, un ARNm policistrónico puede codificar al menos una meganucleasa que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 y al menos una nucleasa adicional que se dirige a una secuencia de reconocimiento separada posicionada en el mismo gen, o que se dirige a una segunda secuencia de reconocimiento posicionada en un segundo gen de modo que se produzcan sitios de escisión en ambos genes. Un ARNm policistrónico puede comprender cualquier elemento conocido en la técnica para permitir la traducción de dos o más genes (es decir, cistrones) de la misma molécula de ARNm que incluye, entre otros, un elemento IRES, un elemento T2A, un elemento P2A, un elemento E2A y un elemento F2A.
En otra modalidad particular, se puede introducir un ácido nucleico que codifica para una meganucleasa modificada genéticamente de la invención en la célula usando una plantilla de ADN de cadena simple. El ADN de cadena simple puede comprender además una repetición terminal invertida (ITR) de AAV 5' y/o 3' corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia que codifica para la meganucleasa modificada genéticamente. En otras modalidades, el ADN de cadena simple puede además comprender un brazo de homología 5' y/o 3' corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia que codifica para la meganucleasa modificada genéticamente.
En otra modalidad particular, se pueden introducir genes que codifican para una meganucleasa de la invención en una célula usando una plantilla de ADN linealizada. En algunos ejemplos, un ADN plasmídico que codifica para una meganucleasa se puede digerir mediante una o más enzimas de restricción de modo que el ADN plasmídico circular se linealice antes de introducirse en una célula.
Las proteínas de meganucleasa purificadas se pueden administrar en células para escindir ADN genómico, lo que permite la recombinación homóloga o la unión terminal no homóloga en el sitio de escisión con una secuencia de interés, mediante una variedad de mecanismos diferentes conocidos en la materia, que incluyen los que se detallan más adelante en la presente.
En algunas modalidades, las proteínas de meganucleasa, o ADN/ARNm que codifican para la meganucleasa, se acoplan a un péptido de penetración celular o ligando de direccionamiento para facilitar la absorción celular. Los ejemplos de péptidos penetrantes celulares conocidos en la materia incluyen poliarginina (Jearawiriyapaisarn, et al. (2008) Mol Ther.
16:1624-9), péptido TAT del virus del VIH (Hudecz et al. (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736), MPG (Simeoni, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2717-2724), Pep-1 (Deshayes et al. (2004) Biochemistry 43: 7698-7706), y HSV-1 VP-22 (Deshayes et al. (2005) Cell Mol Life Sci. 62:1839-49). En una modalidad alternativa, las proteínas de meganucleasa o ADN/ARNm que codifican meganucleasas, se acoplan covalentemente o no covalentemente a un anticuerpo que reconoce un receptor de superficie celular específico expresado en células blanco de manera que la proteína de meganucleasa/ADN/ARNm a y se internaliza por las células blanco. Alternativamente, la proteína de meganucleasa/ADN/ARNm se pueden acoplar covalentemente o no covalentemente al ligando natural (o una porción del ligando natural) para dicho receptor de superficie celular. (McCall, et al. (2014) Tissue Barriers. 2(4):e944449; Dinda, et al. (2013) Curr Pharm Biotechnol. 14:1264-74; Kang, et al. (2014) Curr Pharm Biotechnol. 15(3):220-30; Qian et al. (2014), Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10(11):1491-508).
En algunas modalidades, las proteínas de meganucleasa o ADN/ARNm que codifican meganucleasas, se acoplan covalentemente o no a una nanopartícula o se encapsulan dentro de dicha nanopartícula utilizando métodos conocidos en
la técnica (Sharma et al. (2014) Biomed Res Int. 2014). Una nanopartícula es un sistema de suministro de nanoescala cuya escala de longitud es de ≤1 |jm, preferiblemente, ≤100 nm. Dichas nanopartículas pueden diseñarse utilizando un núcleo compuesto de metal, lípido, polímero o macromolécula biológica y pueden adherirse o encapsularse múltiples copias de las proteínas de meganucleasa recombinante, ARNm o ADN con el núcleo de la nanopartícula. Esto aumenta la cantidad de copias de la proteína/ARNm/ADN que es administrable a cada célula y, por lo tanto, aumenta la expresión intracelular de cada meganucleasa modificada genéticamente para maximizar la probabilidad de que se corten las secuencias de reconocimiento blanco. La superficie de dichas nanopartículas se puede modificar adicionalmente con polímeros o lípidos (por ejemplo, quitosano, polímeros catiónicos o lípidos catiónicos) para formar una nanopartícula de carcasa central cuya superficie confiere funcionalidades adicionales para mejorar el suministro celular y la absorción de la carga útil (Jian et al. (2012) Biomaterials. 33(30): 7621-30). Además, las nanopartículas pueden acoplarse ventajosamente a moléculas de direccionamiento para dirigir la nanopartícula al tipo de célula adecuado y/o aumentar la probabilidad de absorción celular. Los ejemplos de dichas moléculas de direccionamiento incluyen anticuerpos específicos para receptores de superficie celular y los ligandos naturales (o partes de los ligandos naturales) para receptores de superficie celular.
En algunas modalidades, las proteínas de meganucleasa o ADN/ARNm que codifican las meganucleasas están encapsuladas dentro de liposomas o formando complejos usando lípidos catiónicos (véase, por ejemplo, Lipofectamine™, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA; Zuris et al. (2015) Nat Biotechnol. 33: 73-80; Mishra et al. (2011) J Drug Deliv.
2011:863734). Las formulaciones de liposomas y lipoplejos pueden proteger la carga útil de la degradación y facilitar la absorción celular y la eficiencia de suministro a través de la fusión y/o alteración de las membranas celulares de las células blanco.
En algunas modalidades, las proteínas de meganucleasa, o ADN/ARNm que codifican meganucleasas, se encapsulan dentro de andamiajes poliméricos (por ejemplo, PLGA) o se forman en complejos usando polímeros catiónicos (por ejemplo, PEI, PLL) (Tamboli et al. (2011) Ther Deliv. 2(4): 523-536). Los vehículos poliméricos se pueden diseñar para proporcionar velocidades de liberación de fármacos sintonizables a través del control de la erosión de polímeros y la difusión de fármacos, y las altas eficiencias de encapsulación de fármacos pueden ofrecer protección de la carga útil terapéutica hasta la administración intracelular a la población celular blanco deseada.
En algunas modalidades, las proteínas de meganucleasa, o ADN/ARNm que codifican meganucleasas recombinantes, se combinan con moléculas anfifílicas que se autoensamblan en micelas (Tong et al. (2007) J Gene Med. 9(11): 956-66). Las micelas poliméricas pueden incluir una cubierta micelar formada con un polímero hidrófilo (por ejemplo, polietilenglicol) que puede prevenir la agregación, las interacciones de carga de máscara y reducir las interacciones no específicas.
En algunas modalidades, las proteínas de meganucleasa, o ADN/ARNm que codifican meganucleasas, se formulan en una emulsión o nanoemulsión (es decir, que tiene un diámetro de partícula promedio de ≤ 1 nm) para administración y/o administración a la célula blanco. El término “emulsión” se refiere, de modo no limitante, a cualquier dispersión o gotícula de aceite en agua, agua en aceite, agua en aceite en agua, o aceite en agua en aceite, que incluye estructuras lipídicas que se pueden formar como resultado de fuerzas hidrófobas que alejan los residuos apolares (por ejemplo, cadenas largas de hidrocarburos) del agua y grupos de cabezales polares hacia el agua, cuando una fase inmiscible en agua se mezcla con una fase acuosa. Estas otras estructuras lipídicas incluyen, entre otros, vesículas lipídicas, micelas y fases laminares unilaminares, paucilamelares y multilamelares. Las emulsiones se componen de una fase acuosa y una fase lipófila (que generalmente contiene un aceite y un solvente orgánico). Las emulsiones también contienen con frecuencia uno o más tensioactivos. Las formulaciones de nanoemulsión son bien conocidas, por ejemplo, tal como se describe en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos Núms.2002/0045667 y 2004/0043041, y las Patentes de Estados Unidos Núms.6,015,832, 6,506,803, 6,635,676 y 6,559,189.
En algunas modalidades, las proteínas de meganucleasa, o ADN/ARNm que codifican meganucleasas, están unidas covalentemente o no covalentemente asociadas con conjugados poliméricos multifuncionales, dendrímeros de ADN y dendrímeros poliméricos (Mastorakos et al. (2015) Nanoscale. 7(9): 3845-56; Cheng et al. (2008) J Pharm Sci. 97(1): 123 43). La generación de dendrímeros puede controlar la capacidad de carga útil y el tamaño, y puede proporcionar una alta capacidad de carga útil de fármacos. Además, se puede aprovechar la visualización de múltiples grupos superficiales para mejorar la estabilidad, reducir las interacciones no específicas y mejorar el direccionamiento específico de células y la liberación de fármacos.
En algunas modalidades, los genes que codifican para una meganucleasa son administrables usando un vector viral. Dichos vectores son conocidos en la materia e incluyen vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovíricos y vectores de virus adenoasociado (AAV) (revisado en Vannucci, et al. (2013 New Microbiol. 36:1-22). Los vectores de AAV recombinantes útiles en la invención pueden tener cualquier serotipo que permita la transducción del virus en la célula y la inserción del gen de nucleasa en el genoma celular. En modalidades particulares, los vectores de AAV recombinantes tienen un serotipo de AAV2 o AAV6. Los vectores de AAV también pueden ser autocomplementarios de modo que no requieran síntesis de ADN de segunda cadena en la célula hospedera (McCarty, et al. (2001) Gene Ther. 8:1248-54).
Si los genes de meganucleasa son administrares en forma de ADN (por ejemplo, plásmido) y/o a través de un vector viral (por ejemplo, AAV), deben estar unidos funcionalmente a un promotor. En algunas modalidades, esto puede ser un promotor viral tal como promotores endógenos del vector viral (por ejemplo, la LTR de un vector lentivírico) o los promotores tempranos del virus SV40 o citomegalovirus conocidos. En una modalidad preferida, los genes de meganucleasa están unidos funcionalmente a un promotor que impulsa la expresión génica preferentemente en la célula blanco (por ejemplo, un linfocito T).
La invención proporciona además la introducción de una secuencia exógena de interés en el gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. En algunas modalidades, la secuencia exógena de interés comprende un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3' que flanquean los elementos del inserto. Dichos grupos de homología tienen homología de secuencia con las secuencias correspondientes 5' corriente arriba y 3' corriente abajo de la secuencia de reconocimiento de nucleasa donde se produce un sitio de escisión. En general, los grupos de homología pueden tener una longitud de al menos 50 pares de bases, preferentemente al menos 100 pares de bases, y hasta 2000 pares de bases o más, y pueden tener al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, o más, de homología de secuencia a sus secuencias correspondientes en el genoma.
La secuencia exógena de interés de la invención se puede introducir en la célula mediante cualquiera de los medios descritos anteriormente. En una modalidad particular, la secuencia exógena de interés se introduce mediante un vector viral, tal como un lentivirus, retrovirus, adenovirus o preferentemente un vector de AAV recombinante. Los vectores de AAV recombinantes útiles para introducir un ácido nucleico exógeno pueden tener cualquier serotipo que permita la transducción del virus en la célula y la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos exógenos en el genoma celular. En modalidades particulares, los vectores de AAV recombinantes tienen un serotipo de AAV2 o AAV6. Los vectores de AAV recombinantes también pueden ser autocomplementarios de modo que no requieran síntesis de ADN de segunda cadena en la célula hospedera.
En otra modalidad particular, la secuencia exógena de interés se puede introducir en la célula usando una plantilla de ADN de cadena simple. El ADN monocatenario puede comprender la secuencia exógena de interés y, en modalidades preferidas, puede comprender brazos de homología 5' y 3' para promover la inserción de la secuencia de ácido nucleico en el sitio de escisión de meganucleasa mediante recombinación homóloga. El ADN monocatenario puede comprender además una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV 5' corriente arriba del brazo de homología 5' y una secuencia ITR 3' de AAV 3' corriente abajo del brazo de homología 3'.
En otra modalidad particular, se pueden introducir genes que codifican para una nucleasa modificada genéticamente de la invención y/o una secuencia exógena de interés de la invención en la célula mediante transfección con una plantilla de ADN linealizado. En algunos ejemplos, un ADN de plásmido se puede digerir mediante una o más enzimas de restricción de modo que el ADN de plásmido circular se linealice antes de la transfección en la célula.
Los linfocitos T modificados por la presente invención pueden requerir activación antes de la introducción de una meganucleasa y/o una secuencia exógena de interés. Por ejemplo, los linfocitos T pueden ponerse en contacto con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 que son solubles o conjugados con un soporte (es decir, perlas) durante un período de tiempo suficiente para activar las células.
Las células modificadas genéticamente de la invención se pueden modificar adicionalmente para expresar uno o más genes suicidas inducibles, cuya inducción provoca la muerte celular y permite la destrucción selectiva de las células in vitro o in vivo. En algunos ejemplos, un gen suicida puede codificar un polipéptido citotóxico, un polipéptido que tiene la capacidad de convertir un profármaco no tóxico en un fármaco citotóxico y/o un polipéptido que activa una vía génica citotóxica dentro de la célula. Es decir, un gen suicida es un ácido nucleico que codifica un producto que causa la muerte celular por sí solo o en presencia de otros compuestos. Un ejemplo representativo de dicho gen suicida es uno que codifica la timidina cinasa del virus del herpes simple. Ejemplos adicionales son genes que codifican timidina cinasa del virus de la varicela zóster y el gen bacteriano citosina desaminasa que puede convertir 5-fluorocitosina en el compuesto altamente tóxico 5-fluorouracilo. Los genes suicidas también incluyen como ejemplos no limitantes genes que codifican caspasa-9, caspasa-8 o citosina desaminasa. En algunos ejemplos, la caspasa-9 se puede activar usando un inductor químico específico de dimerización (CID). Un gen suicida también puede codificar un polipéptido que se expresa en la superficie de la célula que hace que las células sean sensibles a anticuerpos monoclonales terapéuticos y/o citotóxicos. En ejemplos adicionales, un gen suicida puede codificar polipéptido antigénico recombinante que comprende un motivo antigénico reconocido por el mAb Rituximab anti-CD20 y un epítopo que permite la selección de células que expresan el gen suicida. Véase, por ejemplo, el polipéptido RQR8 descrito en WO2013153391, que comprende dos epítopos de unión a Rituximab y un epítopo de unión a QBEnd10. Para dicho gen, Rituximab puede administrarse a un sujeto para inducir el agotamiento celular cuando sea necesario. En ejemplos adicionales, un gen suicida puede incluir un epítopo de unión a QBEnd10 expresado combinado con un polipéptido EGFR truncado.
Las células eucariotas modificadas por los métodos y composiciones descritos en la presente pueden tener expresión
reducida de un receptor de linfocitos T endógeno (es decir, un receptor de linfocitos T alfa/beta) y, opcionalmente, pueden expresar además una proteína de interés (por ejemplo, un CAR). Por lo tanto, la divulgación proporciona además una población de células eucariotas (que no forman parte de la invención) que expresan la proteína de interés y no expresan el receptor endógeno de linfocitos T (por ejemplo, un receptor de linfocitos T alfa/beta). Por ejemplo, la población puede incluir múltiples células eucariotas modificadas genéticamente que expresan un CAR (es decir, son CAR+) o un receptor de linfocitos T exógeno (es decir, exoTCR+), y tienen expresión reducida de un receptor de linfocitos T endógeno (es decir, son TCR-). Al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85%, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o hasta 100 % de las células en la población pueden ser una célula eucariota modificada genéticamente como se describe en la presente. En un ejemplo particular, la población puede comprender al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o hasta 100 % de células que son tanto TCR-como CAR+.
En algunas modalidades, cuando se introducen en una población de células, las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 dan como resultado un mayor porcentaje de la población de células que son TCR- y CAR+ que cuando la meganucleasa TCR 1-2x.87EE de primera generación se introduce en una población de células.
Además, las células que han sido modificadas genéticamente con las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 exhiben características mejoradas, que incluyen una escisión del blanco inespecífico reducida y efectos similares, tiempo de persistencia reducido de la meganucleasa en la célula, expansión de T CAR mejorada (es decir, aumentada), y están menos diferenciadas en comparación con las células que han sido modificadas genéticamente con la meganucleasa TRC1-2x.87EE. Además, las poblaciones de células en las que se han introducido las meganucleasas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 (o un ácido nucleico que codifica para las mismas) tienen un mayor porcentaje de células modificadas y un mayor porcentaje de células menos diferenciadas en comparación con aquellas poblaciones de células en las que se ha introducido la meganucleasa TRC1-2x.87EE (o un ácido nucleico que codifica para las mismas). En modalidades particulares, las poblaciones de células en las que se han introducido las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 exhiben un mayor porcentaje de linfocitos T de memoria centrales (por ejemplo, aquellos que expresan CD45RO, CCR7 y CD62L) que aquellas poblaciones de células en las que se introdujo la meganucleasa TRC1-2x.87EE de primera generación.
2.4 Composiciones Farmacéuticas (que no forman parte de la invención)
La divulgación proporciona también una composición farmacéutica que comprende una célula eucariota modificada genéticamente descrita en la presente, o una población de células eucariotas modificadas genéticamente descritas en la presente, y un CAR farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden preparar de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Remington, The Science And Practice of Pharmacy (21a ed., Filadelfia, Lippincott, Williams & Wilkins, 2005). En la fabricación de una formulación farmacéutica, las células se mezclan generalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable y la composición resultante es administrable a un sujeto. El CAR debe, por supuesto, ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente en la formulación y no debe ser perjudicial para el sujeto. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden comprender además uno o más agentes adicionales útiles en el tratamiento contra una enfermedad en el sujeto. En modalidades adicionales, las composiciones farmacéuticas pueden incluir además moléculas biológicas, tales como citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21), que promueven la proliferación celular in vivo y el injerto de linfocitos T modificados genéticamente. Las composiciones farmacéuticas que comprenden células eucariotas modificadas genéticamente descritas en la presente se pueden administrar en la misma composición que un agente adicional o molécula biológica o, alternativamente, se pueden administrar conjuntamente en composiciones separadas.
La presente descripción proporciona células modificadas genéticamente, o poblaciones de estas, descritas en la presente para usarse como un medicamento. La presente descripción proporciona además el uso de células modificadas genéticamente o poblaciones de estas descritas en la presente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento contra una enfermedad en un sujeto que lo necesite. En uno de dichos aspectos, el medicamento es útil para la inmunoterapia contra el cáncer en sujetos que la necesiten.
Dado que las células en las que se introducen las meganucleasas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 7 u 8 pueden tener una reducida escisión del blanco inespecífica, tiempo de persistencia reducido de la meganucleasa en la célula, mayor eficiencia de interrupción del gen de la región constante alfa del TCR, expansión de T CAR mejorada (es decir, aumentada), y las células pueden estar menos diferenciadas en comparación con las células que
han sido modificadas genéticamente con la meganucleasa TRC1-2x.87EE, en algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente que comprenden células modificadas genéticamente también tienen una eficacia mejorada en el tratamiento de enfermedades (por ejemplo, cáncer) cuando son administrables a un sujeto que lo necesita, en comparación con la administración de composiciones farmacéuticas que comprenden células que han sido modificadas genéticamente por la meganucleasa TRC1-2x.87EE.
En algunas modalidades, cuando se introducen en una población de células, las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 dan como resultado un mayor porcentaje de la población de células que son TCR- y CAR+ que cuando la meganucleasa TCR 1-2x.87EE de primera generación se introduce en una población de células.
Además, las células que han sido modificadas genéticamente con las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 exhiben características mejoradas, que incluyen una escisión del blanco inespecífico reducida y efectos similares, tiempo de persistencia reducido de la meganucleasa en la célula, expansión de T CAR mejorada (es decir, aumentada), y están menos diferenciadas en comparación con las células que han sido modificadas genéticamente con la meganucleasa TRC1-2x.87EE. Además, las poblaciones de células en las que se han introducido las meganucleasas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 (o un ácido nucleico que codifica para las mismas) tienen un mayor porcentaje de células modificadas y un mayor porcentaje de células menos diferenciadas en comparación con aquellas poblaciones de células en las que se ha introducido la meganucleasa TRC1-2x.87EE (o un ácido nucleico que codifica para la misma). En modalidades particulares, las poblaciones de células en las que se han introducido las meganucleasas modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8 exhiben un mayor porcentaje de linfocitos T de memoria centrales (por ejemplo, aquellos que expresan CD45RO, CCR7 y CD62L) que aquellas poblaciones de células que se han introducido la meganucleasa TRC1-2x.87EE original.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser útiles para tratar cualquier estado de enfermedad que se puede dirigir mediante inmunoterapia adoptiva de linfocitos T. En una modalidad particular, las composiciones farmacéuticas y medicamentos son útiles en el tratamiento contra el cáncer. Los ejemplos no limitantes de cáncer que pueden tratarse con las composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente descripción son carcinomas, linfomas, sarcomas, melanomas, blastomas, leucemias y tumores de células germinales, que incluyen, de modo no limitante, cánceres de origen celular B, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer prostático, carcinoma celular renal, rabdomiosarcoma, cáncer hepático, cáncer gástrico, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer cutáneo, cáncer de cabeza o cuello, cáncer mamario, cáncer pulmonar, melanoma cutáneo o intraocular maligno, cáncer renal, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer colorrectal, cáncer colónico, cáncer rectal, cáncer anal, cáncer estomacal, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma endometrial, carcinoma cervical, carcinoma vaginal, carcinoma vulvar, linfoma no hodgkiniano, cáncer esofágico, cáncer de intestino delgado, cáncer endocrino, cáncer tiroideo, cáncer paratiroideo, cáncer suprarrenal, sarcoma blando, cáncer uretral, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer vesical, cáncer renal o uréter, carcinoma pélvico renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma troncoencefálico, adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, carcinoma de células escamosas, cánceres ambientalmente inducidos incluyendo los inducidos por asbestos, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfomas no hodgkinianos, linfoma mieloide agudo, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide crónica, linfoma inmunoblástico de células grandes, leucemia linfoblástica aguda, micosis fúngica, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma de linfocitos T, y cualquier combinación de tales cánceres. En determinadas modalidades, los cánceres originados a partir de linfocitos B incluyen, entre otros, leucemia linfoblástica aguda de linaje B, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma de linfocitos B grandes difuso, pre-B ALL (indicación pediátrica), linfoma de linfocitos del manto, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple y linfoma no hodgkiniano de linfocitos B.
En algunas de estas modalidades, en donde el cáncer se somete a tratamiento con las células modificadas genéticamente descritas en la presente o poblaciones de las mismas, al sujeto al que se le administran las células modificadas genéticamente o poblaciones de las mismas se le administra además un agente terapéutico adicional, tal como radiación, cirugía o un agente quimioterapéutico.
Además se divulga una población de células modificadas genéticamente que comprende múltiples células modificadas genéticamente descritas en la presente, que comprenden en su genoma una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica para una secuencia de interés, en donde la molécula de ácido nucleico exógeno se inserta en el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T, y en donde la expresión en la superficie celular del TCR endógeno se reduce. Por lo tanto, en diversas modalidades de la invención, se proporciona una población de células modificadas genéticamente donde al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o hasta 100 % de las células en la población son una célula modificada genéticamente descrita en la presente. En
modalidades adicionales de la invención, se proporciona una población de células modificadas genéticamente donde al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o hasta 100 % de las células en la población son una célula modificada genéticamente descrita en la presente que expresa además un receptor de antígeno quimérico.
2.5. Métodos de administración de células modificadas genéticamente (que no forman parte de la invención)
Otro aspecto descrito en la presente es la administración de una cantidad eficaz de las células eucariotas modificadas genéticamente o poblaciones de estas de la presente descripción a un sujeto que lo necesite. En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente son administrables a un sujeto que necesite de las mismas. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una población de células se puede administrar a un sujeto que tiene una enfermedad. En modalidades particulares, la enfermedad puede ser cáncer, y la administración de las células eucariotas modificadas genéticamente de la invención representa una inmunoterapia. Las células administradas son capaces de reducir la proliferación, reducir la cantidad o destruir células blanco en el receptor. A diferencia de las terapias de anticuerpos, las células eucariotas modificadas genéticamente de la presente descripción son capaces de replicarse y expandirse in vivo, lo que resulta en una persistencia a largo plazo que puede conducir al control sostenido de una enfermedad.
Los ejemplos de posibles vías de administración incluyen administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC) o infusión). Además, la administración puede realizarse mediante infusión continua o mediante bolos únicos o múltiples. En modalidades específicas, el agente se infunde durante un período de menos de aproximadamente 12 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora. En incluso otras modalidades, la infusión se produce lentamente al principio y luego se aumenta con el tiempo.
En algunas modalidades, una célula eucariota modificada genéticamente o población de esta de la presente descripción se dirige a un antígeno tumoral con fines de tratamiento contra el cáncer. Dichos cánceres pueden incluir, de modo no limitante, carcinoma, linfoma, sarcoma, blastomas, leucemia, cánceres de origen celular B, cáncer mamario, cáncer gástrico, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer pulmonar, melanoma, cáncer prostático, cáncer colónico, carcinoma celular renal, cáncer ovárico, rabdomiosarcoma, leucemia y linfoma de Hodgkin. En modalidades específicas, los cánceres y trastornos incluyen, entre otros, pre-B ALL (indicación pediátrica), ALL de adulto, linfoma de células del manto, linfoma difuso de linfocitos B grandes, rescate posterior al trasplante de médula ósea alogénico, y lo similar. Estos cánceres pueden someterse a tratamiento usando una combinación de CAR con especificidad de blanco, por ejemplo, CD19, CD20, CD22 y/o ROR1. En algunos ejemplos no limitantes, una célula eucariota modificada genéticamente o población de las mismas, de la presente descripción, tienen acción selectiva hacia carcinomas, linfomas, sarcomas, melanomas, blastomas, leucemias y tumores de células germinales, que incluyen, de modo no limitante, cánceres de origen celular B, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer prostático, carcinoma celular renal, rabdomiosarcoma, cáncer hepático, cáncer gástrico, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer cutáneo, cáncer de cabeza o cuello, cáncer mamario, cáncer pulmonar, melanoma cutáneo o intraocular maligno, cáncer renal, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer colorrectal, cáncer colónico, cáncer rectal, cáncer anal, cáncer estomacal, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma endometrial, carcinoma cervical, carcinoma vaginal, carcinoma vulvar, linfoma no hodgkiniano, cáncer esofágico, cáncer del intestino delgado, cáncer endocrino, cáncer tiroideo, cáncer paratiroideo, cáncer suprarrenal, sarcoma blando, cáncer uretral, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer vesical, cáncer renal o uréter, carcinoma pélvico renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma troncoencefálico, adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, carcinoma de células escamosas, cánceres ambientalmente inducidos incluyendo los inducidos por asbestos, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfomas no hodgkinianos, linfoma mieloide agudo, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide crónica, linfoma inmunoblástico de células grandes, leucemia linfoblástica aguda, micosis fúngica, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma de linfocitos T, y cualquier combinación de tales cánceres. En determinadas modalidades, los cánceres originados a partir de linfocitos B incluyen, entre otros, leucemia linfoblástica aguda de linaje B, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma de linfocitos B grandes difuso, pre-B ALL (indicación pediátrica), linfoma de linfocitos del manto, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple y linfoma no hodgkiniano de linfocitos B.
Cuando se indica una “cantidad eficaz” o “cantidad terapéutica”, un médico puede determinar la cantidad precisa que se administrará teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor (si está presente), grado de infección o metástasis y condición del paciente (sujeto). En algunas modalidades, una composición farmacéutica que comprende las células modificadas genéticamente o poblaciones de las mismas descritas en la presente es administrable a una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. En modalidades adicionales, la dosificación es de 105 a 106 células/kg de peso corporal, lo que incluye todos los valores enteros dentro de esos intervalos. En algunas modalidades, las composiciones celulares son administrables múltiples veces en estas dosificaciones. Las células se pueden administrar mediante el uso de técnicas de infusión que se conocen
comúnmente en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). La dosificación óptima y el régimen de tratamiento para un paciente particular pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia del medicamento mediante el monitoreo del paciente para detectar signos de enfermedad y ajustar el tratamiento en consecuencia.
En algunas modalidades, la administración de células eucariotas modificadas genéticamente o poblaciones de estas de la presente descripción reduce al menos un síntoma de una enfermedad o afección blanco. Por ejemplo, la administración de linfocitos T genéticamente modificados o poblaciones de estos de la presente descripción puede reducir al menos un síntoma de un cáncer. Los síntomas de cánceres son conocidos en la materia y se pueden determinar mediante técnicas conocidas.
2.6 Métodos para producir vectores virales recombinantes
En algunas modalidades, la invención proporciona vectores virales (por ejemplo, vectores de AAV recombinantes) para su uso en los métodos de la invención. Los vectores de AAV recombinantes se producen generalmente en líneas celulares de mamífero tales como HEK-293. Debido a que los genes virales de empaquetamiento o ensamblaje de la cápside y de replicación (cap y rep) se eliminan del vector para evitar su autorreplicación y para dejar espacio para que los genes terapéuticos se administren (por ejemplo, el gen de meganucleasa), es necesario proporcionarlos en trans en la línea celular de empaquetamiento. Además, es necesario proporcionar los componentes “auxiliares” (por ejemplo, adenovíricos) necesarios para respaldar la replicación (Cots et al. (2013), Curr. Gene Ther. 13(5): 370-81). Frecuentemente, los vectores de AAV recombinantes se producen usando una triple transfección en la que se transfecta una línea celular con un primer plásmido que codifica los componentes “auxiliares”, un segundo plásmido que comprende los genes cap y rep, y un tercer plásmido que comprende las ITR virales que contienen la secuencia de ADN de intervención que se empaquetará en el virus. Las partículas virales que comprenden un genoma (ITR y genes intermedios de interés) encerradas en una cápside luego se aíslan de las células mediante ciclos de congelación-descongelación, sonicación, detergente u otros medios conocidos en la materia. Las partículas luego se purifican usando centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio o cromatografía de afinidad y posteriormente son administrables al gen o genes de interés para células, tejidos o un organismo tal como un paciente humano.
Debido a que las partículas de AAV recombinante se producen (fabrican) generalmente en las células, se deben tomar precauciones al poner en práctica la presente invención para garantizar que la meganucleasa modificada genéticamente no se exprese en las células de empaque. Debido a que los genomas virales de la invención pueden comprender una secuencia de reconocimiento para la meganucleasa, cualquier meganucleasa expresada en la línea celular de empaquetamiento puede ser capaz de escindir el genoma viral antes de que pueda empaquetarse en partículas virales. Esto resultará en una eficiencia de envasado reducida y/o el envasado de genomas fragmentados. Se pueden utilizar varios enfoques para prevenir la expresión de meganucleasa en las células de empaque, que incluyen:
La meganucleasa puede colocarse bajo el control de un promotor específico del tejido que no está activo en las células de empaque. Por ejemplo, si se desarrolla un vector viral para la administración de (a) genes de meganucleasa al tejido muscular, se puede utilizar un promotor específico del músculo. Los ejemplos de promotores específicos de músculo incluyen C5-12 (Liu, et al. (2004) Hum Gene Ther. 15:783-92), el promotor de creatina cinasa específica para músculo (MCK) (Yuasa, et al. (2002) Gene Ther. 9:1576-88), o el promotor de músculo liso 22 (SM22) (Haase, et al. (2013) BMC Biotechnol. 13:49-54). Los ejemplos de promotores específicos del SNC (neurona) incluyen los promotores NSE, Sinapsina y MeCP2 (Lentz, et al. (2012) Neurobiol Dis. 48:179-88). Los ejemplos de promotores específicos para el hígado incluyen promotores de albúmina (tal como Palb), a1-antitripsina humana (tal como Pa1AT) y hemopexina (tal como Phpx) (Kramer et al., (2003) Mol. Therapy 7:375-85), promotor híbrido específico para el hígado (región control del locus hepático del gen ApoE (ApoE-HCR) y un promotor de alfa-1-antitripsina específico para el hígado), promotor de globulina de unión a tiroxina humana (TBG) y promotor de apolipoproteína A-II. Los ejemplos de promotores específicos del ojo incluyen opsina y promotores K12 específicos del epitelio corneal (Martin et al. (2002) Métodos (28): 267-75) (Tong et al., (2007) J Gene Med, 9:956-66). Estos promotores, u otros promotores específicos de tejido conocidos en la materia, no son altamente activos en células HEK-293 y, por lo tanto, no se esperará que produzcan niveles significativos de expresión génica de meganucleasa en células de empaque cuando se incorporan en vectores virales de la presente invención. De manera similar, los vectores virales de la presente invención contemplan el uso de otras líneas celulares con el uso de promotores específicos de tejido incompatibles (es decir, la línea celular HeLa conocida (célula epitelial humana) y el uso del promotor de hemopexina específico para el hígado). Otros ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen: sarcomas sinoviales PDZD4 (cerebelo), C6 (hígado), ASB5 (músculo), PPP1 R12 B (corazón), SLC5A12 (riñón), APo M de regulación de colesterol (hígado), ADPRHL1 (corazón) y síndromes de malformación monogénica TP73L (músculo). (Jacox et al., (2010), PLoS One v.5(8):e12274).
Alternativamente, el vector se puede empaquetar en células de una especie diferente en la que no es probable que se exprese la meganucleasa. Por ejemplo, las partículas virales se pueden producir en células microbianas, de insectos o vegetales usando promotores de mamíferos, tales como promotores tempranos del virus SV40 o citomegalovirus bien
conocidos, que no son activos en las células de empaque no de mamíferos. En una modalidad preferida, las partículas virales se producen en células de insecto usando el sistema baculovirus como se describe en Gao, et al. (Gao et al. (2007), J. Biotechnol. 131(2):138-43). Es poco probable que una meganucleasa bajo el control de un promotor de mamífero se exprese en estas células (Airenne et al. (2013), Mol. Ther. 21(4):739-49). Además, las células de insecto utilizan diferentes motivos de empalme de ARNm que las células de mamífero. Por lo tanto, es posible incorporar un intrón de mamífero, tal como el intrón de hormona de crecimiento humano (HGH) o el intrón de antígeno T grande SV40, en la secuencia codificante de una meganucleasa. Debido a que estos intrones no se empalman eficientemente a partir de transcripciones pre-ARNm en células de insectos, las células de insectos no expresarán una meganucleasa funcional y empaquetarán el genoma de longitud completa. A diferencia, las células de mamífero a las que son administrables las partículas de AAV recombinante resultantes empalmarán adecuadamente el pre-ARNm y expresarán proteína de meganucleasa funcional. Haifeng Chen ha informado el uso de los intrones HGH y SV40 de antígenos T grandes para atenuar la expresión de las proteínas tóxicas barnasa y fragmento A de la toxina difetérica en células de empaquetamiento de insectos, lo que permite la producción de vectores de AAV recombinantes que transportan estos genes de toxina (Chen (2012), Mol Ther Nucleic Acids. 1(11): e57).
El gen de meganucleasa puede estar unido funcionalmente a un promotor inducible de modo que se requiera un inductor de molécula pequeña para la expresión de meganucleasa. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el sistema Tet On (Clontech; Chen et al. (2015), BMC Biotechnol. 15(1):4)) y el sistema RheoSwitch (Intrexon; Sowa et al. (2011), Spine, 36(10): E623-8). Ambos sistemas, así como sistemas similares conocidos en la materia, se basan en factores de transcripción inducibles por ligando (variantes del Represor Tet y el receptor de ecdisona, respectivamente) que activan la transcripción en respuesta a un activador de molécula pequeña (doxiciclina o ecdisona, respectivamente). Poner en práctica la presente invención usando dichos activadores de transcripción inducibles por ligando incluye: 1) colocar el gen de meganucleasa bajo el control de un promotor que responde al factor de transcripción correspondiente, en donde el gen de meganucleasa tiene (a) sitios de unión para el factor de transcripción; y 2) incluir el gen que codifica el factor de transcripción en el genoma viral empaquetado. Esta última etapa es necesaria porque la meganucleasa no se expresará en las células o tejidos blanco después de la administración de AAV recombinante si el activador de transcripción no se proporciona también a las mismas células. El activador de la transcripción entonces induce la expresión génica de meganucleasa solo en células o tejidos que se tratan con el activador de molécula pequeña cognado. Este enfoque es ventajoso porque permite que la expresión génica de meganucleasa se regule de una manera espacio-temporal seleccionando cuándo y a qué tejidos es administrable el inductor de molécula pequeña. Sin embargo, el requisito de incluir el inductor en el genoma viral, que tiene una capacidad de carga significativamente limitada, crea un inconveniente para este enfoque.
En otra modalidad preferida, las partículas de AAV recombinante se producen en una línea celular de mamífero que expresa un represor de transcripción que evita la expresión de la meganucleasa. Los represores de transcripción son conocidos en la materia e incluyen el represor Tet, el represor Lac, el represor Cro y el represor Lambda. Muchos receptores de hormonas nucleares como el receptor de ecdisona también actúan como represores de la transcripción en ausencia de su ligando hormonal cognado. Para poner en práctica la presente invención, las células de empaque se transfectan/transducen con un vector que codifica para un represor de transcripción y el gen de meganucleasa en el genoma viral (vector de empaque) está unido funcionalmente a un promotor que se modifica para comprender sitios de unión para el represor de modo que el represor silencie al promotor. El gen que codifica el represor de transcripción se puede colocar en una variedad de posiciones. Puede codificarse en un vector separado; puede incorporarse en el vector de empaque fuera de las secuencias de ITR; puede incorporarse en el vector de cap/rep o el vector auxiliar adenovírico; o puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula de empaque de modo que se exprese constitutivamente. Los métodos para modificar promotores de mamíferos comunes para incorporar sitios represores de transcripción son conocidos en la materia. Por ejemplo, Chang y Roninson modificaron los promotores de CMV y RSV fuertes y constitutivos para comprender operadores para el represor Lac y mostraron que la expresión génica de los promotores modificados se atenuó en gran medida en células que expresan el represor (Chang y Roninson (1996), Gene 183:137-42). El uso de un represor de transcripción no humano garantiza que la transcripción del gen de meganucleasa se reprimirá solo en las células de empaque que expresan el represor y no en células o tejidos blanco transducidos con el vector de AAV recombinante resultante.
Ejemplos
Esta invención además se ilustra a través de los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser construidos como limitantes.
Ejemplo 1
Caracterización de meganucleasas que tienen especificidad para la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
1. Meganucleasas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Las meganucleasas TRC 1-2 de segunda generación, denominadas TRC 1-2L.1592 (SEQ ID NO: 7) y TRC 1-2L.1775 (SEQ ID NO: 8), se modificaron genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5), que está presente en la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos. Cada una de estas meganucleasas de segunda generación comprende una señal de localización de nucleasa N-terminal derivada de SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia enlazante y una segunda subunidad de meganucleasa. Una primera subunidad en cada meganucleasa TRC 1-2 se une al sitio medio de reconocimiento TRC1 de SEQ ID NO: 5, mientras que una segunda subunidad se une al sitio medio de reconocimiento TRC2 (ver figura 1). Cada una de las subunidades de unión a TRC1 y subunidades de unión a TRC2 comprende una región hipervariable de 56 pares de bases, denominadas HVR1 y HVR2, respectivamente.
La región HVR1 de cada subunidad de unión a TRC1 consiste en residuos 215 a 270 de SEQ ID NO: 7 y 8 Las subunidades de unión a TRC1 de TRC 1-2L.1592 y TRC 1-2L.1775 son idénticas entre sí fuera de la región HVR1. La región HVR1 de cada meganucleasa TRC 1-2 comprende modificaciones con respecto a la secuencia I-CreI de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) en las posiciones 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 266 y 268. Aunque no se modificó con respecto a I-CreI de tipo silvestre, el residuo arginina en la posición 261 de SEQ ID NO: 7 y 8 se cree que contribuye, en combinación con los residuos HVR1 modificados, a la especificidad de la nucleasa. La región HVR1 de TRC 1-2L.1592 comparte 96.43 % de identidad de secuencia con la región HVR1 de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE. La región HVR1 de TRC 1-2L.1775 comparte 100 % de identidad de secuencia con la región HVR1 de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE.
La región HVR2 de cada subunidad de unión a TRC2 consiste en los residuos 24 a 79 de SEQ ID NO: 7 y 8 Las subunidades de unión a TRC2 de TRC 1-2L.1592 y TRC 1-2L.1775 son idénticas entre sí fuera de la región HVR2, excepto en la posición 80 de las SEQ ID NO: 7 y 8 que pueden ser E (TRC 1-2L.1592) o Q (TRC 1-2L.1775). La región HVR2 de cada meganucleasa TRC 1-2 comprende modificaciones con respecto a la secuencia I-CreI de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) en las posiciones 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 48 , 50, 68, 70, 75 y 77. La meganucleasa TRC 1-2L.1592 contiene adicionalmente modificaciones en las posiciones 71,72 y 73 con respecto a I-CreI de tipo silvestre También es notable que el residuo de arginina en la posición 139 de las SEQ ID NO: 7 y 8 se modifica con respecto a la secuencia I CreI de tipo silvestre, y se cree que contribuye, en combinación con los residuos HVR2 modificados, a la especificidad de la nucleasa. La región HVR2 de TRC 1-2L.1592 comparte solo 80.36 % de identidad de secuencia con la región HVR2 de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación. La región HVR2 de TRC 1- 2L.1775 comparte solo 85.71 % de identidad de secuencia con la región HVR2 de la meganucleasa TRC 1-2x.87EE.
2.Optimizac¡ón de nucleasas TRC 1-2 de primera generación
La meganucleasa TRC 1-2x.87EE previamente reportada se evaluó para determinar la especificidad del sitio de reconocimiento utilizando un método muy similar a GUIDE-seq (Tsai et al. (2015), Nat Biotechnology 33:187-197) pero ajustado para encontrar posibles sitios de blanco inespecífico para meganucleasas. En términos generales, los sitios potenciales de blanco inespecífico se identifican mediante la captura de un oligonucleótido sonda en la ruptura del ADN bicatenario. Las meganucleasas TRC 1-2 generan una protuberancia en 3' de cuatro pares de bases, por lo que el oligo sonda también contiene las protuberancias de cuatro pares de bases aleatorizadas para mejorar la eficiencia de ligadura en sitios más probablemente creados por la escisión de nucleasa.
El análisis de especificidad de TRC 1-2x.87EE descubrió una variedad de posibles sitios de blanco inespecífico en linfocitos T de humanos. Estos blancos inespecíficos podrían agruparse en dos categorías relativas: blancos únicos que se alcanzaron a alta frecuencia y blancos repetidos que se alcanzaron a baja frecuencia. Los aminoácidos clave que están involucrados en el reconocimiento de estos blancos inespecíficos se volvieron a aleatorizar. Posteriormente, se ejecutó la selección simultánea para cortar el sitio deseado y la contraselección para no cortar un sitio de blanco inespecífico. El sitio blanco inespecífico se alternó entre rondas sucesivas de selección para aislar respuestas (es decir, nucleasas) que discriminarían contra ambos blancos inespecíficos. Los dos blancos inespecíficos que se usaron fueron Off1: 5' -TGGCCTGGAGaAACAgtgtaaa - 3' (SEQ ID NO: 16), que es un corte de baja frecuencia, pero un sitio altamente repetido en el genoma, y Off2: 5' - cGGCCTGtAGtAcaggAcCTGA - 3' (SEQ ID NO: 17), que es un blanco inespecífico único y frecuentemente alcanzado (las letras minúsculas representan desajustes del sitio previsto). Se utilizaron una variedad de bibliotecas de nucleasas.
Después de la selección, se prepararon placas de 96 pocillos de clones aislados de cada biblioteca exitosa para aislar ADN plasmídico. Cada ADN de plásmido se transfectó individualmente en células CHO que contenían un sitio blanco integrado en una interrupción entre dos repeticiones directas en un gen GFP. La escisión del sitio blanco da como resultado la reparación del gen GFP mediante hibridación de cadena simple y la frecuencia de escisión del sitio blanco se puede contar contando la cantidad de células GFP positivas en un citómetro de flujo. Analizamos los plásmidos nucleicos contra las células con el sitio previsto y los sitios blanco Off1. De esta manera, podríamos evaluar qué nucleasas todavía estaban cortando el sitio deseado, pero discriminando mejor contra los inespecíficos de blanco. Identificamos cinco candidatos. Tres candidatos fueron vueltos a aislar de la biblioteca original para TRC 1-2: L.1462, L.1466 y L.1469. Las tres respuestas fueron exclusivas pero relacionadas entre sí. Dos candidatos fueron aislados de la biblioteca TRC 2: L.1108 y L.1118.
Cada uno de estos candidatos representa nucleasas intermedias en el desarrollo de las nucleasas de segunda generación de la invención.
Para mejorar aún más las nucleasas, se aleatorizaron aminoácidos clave involucrados en la especificidad del sitio de reconocimiento. L.1462, L.1466 y L.1469 se reunieron en una biblioteca y L.1108 y L.1118 en una segunda biblioteca. Se introdujo una nueva aleatorización por PCR en ambos. Se siguió una estrategia de selección similar con las nuevas bibliotecas; seleccionando simultáneamente para el sitio deseado y contra Off1 u Off2. Los blancos inespecíficos se alternaron entre rondas de selección. Se generaron placas de 96 pocillos de respuestas individuales a partir de las selecciones y se analizaron en el ensayo CHO iGFFP para determinar la escisión del sitio deseado y de tanto Off1 como Off2. Se identificaron varias nucleasas nuevas a partir de esta ronda adicional de optimización. Las respuestas de las bibliotecas basadas en L.1462, L.1466 y L.1469 incluyeron: L.1775 y L.1843. Una respuesta de la biblioteca basada en L.1108 y L.1118: L.1592. Todas las nuevas nucleasas demostraron una fuerte actividad hacia el blanco previsto y una fuerte discriminación contra ambos blancos inespecíficos (como se describe adicionalmente a continuación). Las nuevas nucleasas se ejecutaron a través de un ensayo de oligo-captura (descrito más adelante) para determinar los sitios potencialmente de blanco inespecífico y demostraron que, en general, se redujo la cantidad de sitios potencialmente de blanco inespecífico y, en particular, L.1592 tenía muy pocos sitios de blanco inespecífico potencialmente legítimos. L.1108, L.1469, L.1592, L.1775 y L.1843 se evaluaron adicionalmente en el ensayo iGFFP durante un período de siete días para evaluar la estabilidad de la señal de GFP a lo largo del tiempo, que es una medición general de toxicidad. L.1469, L.1592, L.1775 y L.1843 se analizaron adicionalmente en linfocitos T primarios para determinar su función.
3.Evaluación de la escisión de secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y escisión de blanco inespecífico
Para determinar si las meganucleasas TRC 1-2 podrían reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5), cada meganucleasa TRC 1-2 se evaluó usando el ensayo indicador de células CHO descrito anteriormente (véase WO/2012/167192, figura 3). Para realizar el ensayo, se produjeron un par de líneas indicadoras de células CHO que portaban un casete de expresión génica de proteína verde fluorescente (GFP) no funcional integrado en el genoma de la célula. El gen GFP en cada línea celular se interrumpió mediante un par de secuencias de reconocimiento de modo que la escisión intracelular de cualquiera de las secuencias de reconocimiento mediante una meganucleasa estimularía un evento de recombinación homólogo que resultaría en un gen GFP funcional. En ambas líneas celulares, una de las secuencias de reconocimiento se derivó del gen TRC 1-2 y la segunda secuencia de reconocimiento se reconoció específicamente mediante una meganucleasa control llamada "CHO 23/24”. Células indicadoras CHO que comprenden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de reconocimiento CHO 23/24 se denominan en la presente como “células TRC 1-2.”
Se transfectaron células TRC 1-2 con ADN de plásmido que codifica una de las meganucleasas TRC 1-2 (por ejemplo, TRC 1-2x.87EE, TRC 1-2L.1592, TRC 1-2L.1775 o TRC 1-2L.1843) o que codifica la meganucleasa CHO 23/34. Se transfectaron células CHO 4e5 con 50 ng de ADN plasmídico en una placa de 96 pocillos usando Lipofectamine 2000 (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 48 horas después de la transfección, las células se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células GFP positivas en comparación con un control negativo no transfectado (1-2 b). Se descubrió que todas las meganucleasas TRC 1-2 producen células GFP positivas en líneas celulares que comprenden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 a frecuencias que exceden significativamente el control negativo y comparables o superiores al control positivo CHO 23/24, lo que indica que cada meganucleasa TRC 1-2 fue capaz de reconocer y escindir eficientemente la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 prevista en una célula (figura 4A a 4C).
De manera alternativa, las meganucleasas TRC 1-2 también se transfectaron en células TRC Off1 y TRC Off2 que contienen las secuencias de blanco inespecíficas seleccionadas por contador entre las repeticiones directas GFP. A diferencia de las células TRC 1-2 CHO del sitio blanco previsto, una nucleasa deseable en células TRC Off1 y TRC Off2 CHO tiene solo células positivas para GFP de nivel de fondo porque es capaz de discriminar contra la escisión de la secuencia blanco inespecífica. El sitio blanco CHO 23-24 actúa como un control positivo en estos experimentos, demostrando que el GFP todavía se puede producir si el sitio blanco se corta mediante la nucleasa CHO 23-24. Las nuevas nucleasas demostraron una discriminación significativamente mejorada (es decir, aumentada) contra los sitios blanco Off1 y Off2 en comparación con TRC 1-2 x.87EE, con %GFP en niveles comparables al control negativo TRC 1-2 bs (figura 5A a 5C).
La eficacia de las meganucleasas modificadas genéticamente TRC 1-2.L1469, L.1592, L.1775 y L.1843 también se determinó de manera dependiente del tiempo 2, 5 y 7 días después de la introducción del ARNm de meganucleasas en células TRC 1-2. En este estudio, se electroporaron células TRC 1-2 (1.0x106) con 1x106 copias de ARNm de meganucleasa por célula usando un sistema de electroporación BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 48 horas después de la transfección, las células se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células g Fp positivas. También se incluyó una meganucleasa CHO 23/24 en cada momento como control positivo. Cada una de las meganucleasas mostró un porcentaje GFP-positivo comparable con
respecto a CHO 23-24 (figura 6 y figura 7). Solo L.1469 demostró una tendencia decreciente en células GFP positivas a lo largo del tiempo, lo que indica que tuvo algunos problemas de toxicidad no resueltos que mejoraron en la optimización posterior. Las nucleasas restantes exhibieron células GFP positivas estables o en aumento con el tiempo a niveles equivalentes o superiores al control CHO 23-24.
El ensayo iGFFP extendido también se utilizó para evaluar el mismo grupo de meganucleasas para la discriminación contra los dos blancos inespecíficos, Off1 y Off2, durante un período de 7 días. En este caso, las células que contenían Off1 o Off2 y CHO 23-24 se electroporaron con 1x106 copias de ARNm de meganucleasa por célula usando un sistema de electroporación BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A los 2 días, 5 días y 7 días después de la transfección, las células se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células GFP positivas. También se incluyó una meganucleasa CHO 23-24 en cada momento como control positivo. Cada una de las nucleasas mostró una discriminación mejorada contra blanco inespecífico en comparación con TRC 1- 2x.87EE (figura 8A y 8B). L.1592 mostró una escisión mínima de Off1 u Off2, comparable a células control simuladas. L.1469 mostró alguna escisión detectable de Off1 y Off2, aunque fue dramáticamente menor que el observado por TRC 1-2x.87EE. L.1775 y L.1843 muestran una mejora con respecto a su parental, L.1469, en la discriminación contra blancos inespecíficos.
4.Ensayo de oligo-captura y análisis de escisión de blanco inespecífico
En estos estudios, se utilizó un ensayo de oligo-captura para identificar la escisión del blanco inespecífico inducida por las meganucleasas TRC 1-2. De manera similar a GUIDE-seq, el ensayo de oligo-captura identifica posibles sitios de blanco inespecífico producidos por las meganucleasas TRC 1-2 mediante la captura de un oligonucleótido en sitios de ruptura dentro del a Dn genómico de la célula. GUIDE-seq se desarrolló para las rupturas de ADN generadas por CRISPR-Cas9 y hay algunas modificaciones clave a la química y el análisis con el fin de aplicar esta técnica a las nucleasas de la presente. A diferencia de CRISPR-cas9, las meganucleasas modificadas genéticamente de la invención generan una protuberancia 3' de cuatro pares de bases. Para adaptarse a esta diferencia, los oligonucleótidos utilizados en la oligocaptura tienen protuberancias de cuatro pares de bases aleatorizadas que podrían ser compatibles con las protuberancias generadas con la meganucleasa TRC 1-2. Se observa una mayor frecuencia de inserción debido a la mayor eficiencia de ligar extremos pegajosos en lugar de extremos romos. Las células se transfectaron con ARNm que codifica para la nucleasa y los oligonucleótidos de ADN de cadena doble. Después de dos días, el ADN genómico de estas células se aisló y sonicó para cizallar el ADN a tamaños más pequeños. Se ligó un adaptador de oligonucleótido al ADN cizallado y se utilizó PCR para amplificar cualquier pieza de ADN que contenga un adaptador en un extremo y el oligonucleótido capturado en el otro extremo. El ADN amplificado se purificó y las bibliotecas de secuenciación se prepararon usando kits comerciales estándar.
Las bibliotecas de secuenciación se ejecutaron en una Illumina MiSeq usando kits V2 2x150. Los datos se filtraron y analizaron para detectar sitios válidos que capturaron un oligonucleótido y se predice un sitio potencial de blanco inespecífico. Una vez más, el protocolo necesitaba ajustarse de la búsqueda pAm utilizada para CRISPR-cas9 a la búsqueda de meganucleasa TRC 1-2. El software desarrollado comprueba cada secuencia para asegurarse de que haya un adaptador y oligo capturado flanqueando la secuencia para verificar que sea una lectura válida. El software también comprueba si hay duplicados de PCR y elimina lecturas que son idénticas para ayudar a reducir el sesgo de PCR. Las lecturas de secuencia se alinean con un genoma de referencia y las secuencias agrupadas dentro de ventanas de mil pares de bases se escanean en busca de un sitio potencial de meganucleasa TRC 1-2.
Cada meganucleasa TRC 1-2 es un dímero enlazado. Cada monómero reconoce un sitio medio de nueve pares de bases con un separador de cuatro pares de bases en el centro entre los dos sitios medios. El software busca la coincidencia de secuencia más cercana para cada sitio medio sin espacios permitidos. Los cuatro pares de bases centrales no se consideran en la selección de blanco inespecífico porque las meganucleasas TRC 1-2 generalmente pueden tolerar una mayor cantidad de degeneración en estas posiciones en el sitio blanco. El software genera una lista de posibles sitios inespecíficos con el número de desajustes de base en los sitios medios combinados, pero sin contar los desajustes de cuatro pares de bases en el medio. El software no elimina ningún inespecífico basado en un filtro de desajuste arbitrario, a diferencia de CRISPR-Cas9 que elimina cualquier inespecífico identificado con más de seis pares de bases desajustados. En cambio, el ruido de fondo generado a partir de la captura aleatoria del oligo en puntos frágiles o puntos calientes dentro del genoma se puede reducir de dos maneras. En primer lugar, una muestra en falso no tratada también se ejecuta a través de la oligo-captura y las ventanas de los sitios de integración sin la nucleasa presente se pueden restar de las muestras que contienen nucleasa. También hemos encontrado que ejecutar el ensayo por triplicado y eliminar cualquier sitio que no se repita en al menos dos de las tres repeticiones es una buena manera de eliminar empíricamente el ruido de integración aleatoria.
Aunque el recuento de lecturas no se correlaciona directamente con la frecuencia de escisión en un sitio en particular, generalmente puede resaltar blancos inespecíficos que son potencialmente más preocupantes o más válidos porque ocurren con más frecuencia. En la figura 9 se muestra una manera de visualizar gráficamente los datos de oligo-captura como una medida de la cantidad de sitios potencialmente válidos de blanco inespecífico. Cada inespecífico generado por
una nucleasa particular se grafica en función de la cantidad de lecturas de secuencia únicas para un oligo de sonda que se captura en ese sitio. El sitio previsto debe tener el recuento de lectura más alto, que es el caso de todas las meganucleasas TRC 1-2 probadas. Mejores nucleasas eliminan los sitios de recuento más altos y tienen menos puntos por encima del ruido de fondo en el extremo izquierdo de la trama. Usando este gráfico, está claro, por ejemplo, que TRC 1-2L.1592 elimina más de los sitios de recuento de lectura más altos que TRC 1-2x.87EE de primera generación.
Los métodos de visualización adicionales nos permiten observar los datos de oligo-captura no solo en términos de la cantidad de lecturas recuperadas en un sitio particular, sino también por la cantidad de desajustes entre un sitio inespecífico putativo y el sitio previsto. Esto permite una determinación más precisa de los sitios de integraciones de oligo reales en comparación con la integración aleatoria o el ruido de secuenciación. En la figura 10, los sitios de blanco inespecífico se grafican de acuerdo con su cantidad de lecturas alineadas en el eje X, y la cantidad de pares de bases no coincidentes en comparación con el sitio deseado se indican por color, con colores más oscuros que indican coincidencias generales más cercanas entre los sitios de blanco inespecífico y el sitio de unión deseado. Las casillas indican las zonas de mayor confianza. Los blancos inespecíficos dentro de estas casillas tienen recuentos de lectura alineados altos o similitudes muy altas con el sitio previsto, cualquiera de los cuales disminuye la probabilidad de que el sitio sea ruido de fondo. Comparando los sitios en la zona de confianza, la figura 10 demuestra el aumento de la especificidad de las meganucleasas optimizadas, y particularmente TRC 1-2L.1592, en comparación con TRC 1-2x.87 e E. TRC 1-2L.1592 muestra una disminución en la cantidad de sitios de recuento de lectura más altos, así como una disminución en sitios más similares a los previstos.
Ejemplo 2
Análisis in vitro de meganucleasa TRC 1-2 optimizada
1. Evaluación de la eficiencia de edición génica, expansión de posedición y diferenciación
En una primera serie de experimentos, se analizaron cuatro meganucleasas TRC 1-2 optimizadas de segunda generación para determinar sus eficiencias de edición génica y su potencial de diferenciación y expansión posterior a la edición. Tres operadores diferentes evaluaron cada uno todas las variantes de nucleasa en linfocitos T obtenidas de un donante de linfocitos T humanos sanos diferente. El material de aféresis se obtuvo de los donantes K708, K799 y K6784 de Key Biologics (Memphis, TN). Los linfocitos T K708 y K6784 se procesaron de acuerdo con el siguiente protocolo: Enriquecimiento de linfocitos T usando reactivos de selección positivos para CD3 humanos (StemCell Technologies), estimulación usando ImmunoCult anti-CD2/CD3/CD28 (StemCell Technologies) y administración de ARN de nucleasa usando el NucleoFEctor 4D (Lonza). Los linfocitos T de K799 se procesaron de acuerdo con el siguiente protocolo: Enriquecimiento de linfocitos T usando microesferas CD4 y CD8 y el aislador celular CliniMACS (Miltenyi Biotec), estimulación usando TransAct (Miltenyi) y administración de ARN de nucleasa usando MaxCyte-GT.
Se compararon eficiencias de edición, expansión y diferenciación de cuatro variantes de nucleasa optimizadas (TRC 1-2L.1496, L.1592, L.1775 y L.1843) contra la nucleasa progenitora TRC 1-2x.87EE y contra linfocitos T que se electroporaron en falso. Tres días después de la estimulación inicial con ImmunoCult/TransAct, los linfocitos T se recolectaron, se electroporaron con ARN que codifica una de las nucleasas y se transdujeron inmediatamente con un vector de AAV6 que codifica un gen CAR para insertarse en el sitio de escisión TRC 1-2. Los cultivos control que no recibieron AAV se ensamblaron en paralelo.
En los días 4 y 8 después de la edición, se determinó la celularidad de cultivo total con el NucleoCounter NC-200 (ChemoMetec). La eficacia de edición se determinó mediante la tinción de muestras de cultivo con anticuerpos dirigidos contra CD3-PE humano (clon BioLegend UCHT1) y anti-FMC63scFv-AlexaFluor647 (clon novedoso producido y conjugado internamente). La diferenciación se evaluó comparando frecuencias de células de memoria efectora, memoria de transición y memoria central en los compartimientos CD4 y CD8 usando CD4- BV786 (clon OKT4 BioLegend), CD8-BV711 (clon RPA-T8, BioLegend), CD62L-BB515 (clon SK11 BD Biosciences) y CD45RO-PE/Cy7 (clon UCHL1, BioLegend).
En la figura 11 se resumen los resultados de estos experimentos. La frecuencia de inactivación del receptor endógeno de linfocitos T (medida mediante la conversión de linfocitos T de un fenotipo CD3-positivo a CD3-negativo) se determinó para cada nucleasa en 3 donantes diferentes. Para los 3 donantes analizados (y usando ambos métodos de preparación celular), tanto TRC 1- 2L.1592 como L.1775 generaron células inactivadas a una eficiencia similar o mayor que TRC 1-2x.87EE. En comparación, L.1469 y L.1843 generaron frecuencias de inactivación más bajas. Esto fue cierto para los 3 donantes analizados. L.1775 demostró eficiencias de edición ligeramente mayores que L.1592. El aumento en la edición de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 se asoció con una mayor tasa de inserción del gen CAR. En los tres donantes, L.1592 y L.1775 apoyaron una frecuencia de edición e inserción equivalente o superior.
En el día 8 después de la edición, se utilizaron datos de conteo de células para calcular la expansión exponencial de linfocitos T CAR. A través de los tres donantes, L.1592, L.1775 y L.1843 promovieron una mayor expansión después de la electroporación quex.87EE. Por el contrario, L.1469 promovió menos expansión que x.87EE. En dos de los tres donantes,
L.1843 permitió la expansión más extensa de las tres nucleasas optimizadas. L.1775 apoyó un grado de expansión que variaba de un donante a otro.
Los datos de relación CD4:CD8 y subconjunto de memoria también se capturaron el día 8 después de la edición. En comparación con x.87EE, no se observaron perturbaciones importantes a la relación CD4:CD8 de ninguna de las nucleasas optimizadas, aunque L.1592, L.1775 y L.1843 generalmente dieron como resultado una mayor frecuencia de células CD4+. En comparación con x.87EE, se observó un mayor grado de diferenciación lejos de la memoria central y en poblaciones de memoria efectora y de transición en células editadas con L.1469. A diferencia, una frecuencia equivalente o mayor de células mantuvo un fenotipo de memoria central cuando se editó con L.1592, L.1775 o L.1843.
Estos estudios muestran que tres de las cuatro nucleasas optimizadas superaron a TRC 1-2 x.87EE en términos de eficiencia de edición, expansión celular y características de diferenciación. Una nucleasa, L.1469, no funcionó tan bien como x.87EE. De las tres variantes con función in vitro mejorada, la variante L.1775 admite la frecuencia más alta de células editadas en cultivo, pero admite la cantidad más baja de expansión de posedición y acelera la diferenciación de linfocitos T en cultivo. La variante L.1843 permite la mayor cantidad de expansión de posedición y conserva una frecuencia de memoria central favorable, pero es menos eficiente que L.1775 o L.1592 en términos de frecuencia de inactivación. De manera inesperada, L.1592 representa una mejora con respecto a la primera generación x.87EE utilizando estos tres criterios.
2. Ensayo de oligo-captura y análisis de escisión de blanco inespecífico
La oligo-captura se realizó para tres réplicas de linfocitos T obtenidos de cada uno de los tres donantes usando métodos como se describió anteriormente en el ejemplo 1. En la figura 12 se muestran los resultados de la oligo-captura. Los puntos representan la cantidad de lecturas de secuenciación recuperadas en cada sitio de blanco inespecífico putativo, así como el sitio blanco previsto. Se eliminaron los sitios putativos con más de 7 desajustes con el blanco previsto, ya que no se demostró que ningún sitio con más de 7 desajustes se escindiera por TRC 1-2L.1592 en estudios anteriores. El sitio blanco previsto para cada muestra se resalta con un círculo. La cantidad de desajustes en comparación con el blanco previsto se indica por la oscuridad de cada círculo con menos desajustes que tienen colores más oscuros. La gráfica representa los datos de oligo-captura sin fondo en falso eliminado y con recuentos de lectura normalizados al número de lecturas únicas por muestra para tener en cuenta las diferencias en la cantidad total de lecturas recuperadas. Tal como se muestra, TRC 1-2L.1592 muestra una baja cantidad de sitios de recuento de lectura más altos, así como una baja cantidad de sitios más similares a los previstos cuando se utilizan para la edición y la inserción dirigida en poblaciones de linfocitos T CAR.
3. Estudios in vitro de eficiencia de edición, expansión y secreción de citocinas
En una segunda serie de estudios in vitro, se evaluaron las meganucleasas TRC 1-2 optimizadas de segunda generación para determinar su eficiencia en la edición de linfocitos T, la capacidad de los linfocitos T editados para expandirse después de la edición y la capacidad de los linfocitos T CAR generados con las variantes de nucleasa para responder al encuentro con linfocitos blanco portadores de antígeno.
El material de aféresis se obtuvo del donante K708 de Key Biologics (Memphis, TN) y los linfocitos T se enriquecieron usando reactivos de selección positivos para CD3 humanos (StemCell Technologies), se estimularon usando ImmunoCult anti-CD2/CD3/CD28 (StemCell Technologies) y el ARN de nucleasa se administró usando el NucleoFector 4D (Lonza). Las muestras triplicadas se ejecutaron en paralelo.
Se compararon eficiencias de edición, expansión y diferenciación de tres meganucleasas optimizadas (TRC 1-2L.1592, L.1775 y L.1843) contra la nucleasa progenitora t Rc 1-2x.87EE y contra linfocitos T que se electroporaron en falso. Tres días después de la estimulación inicial con ImmunoCult/TransAct, los linfocitos T se recolectaron, se electroporaron con ARN que codifica una de las nucleasas y se transdujeron inmediatamente con un vector de AAV6 que codifica un gen CAR para insertarse en el sitio de escisión TRC 1-2. En los días 4 y 8 después de la edición, se tomaron muestras de cultivos para determinar la eficiencia de edición y expansión usando un citómetro de flujo Citoflex-LX Beckman-Coulter. La eficiencia de inactivación del receptor de linfocitos T endógenos se evaluó usando anti-CD3-PE (clon UCHT1 de BioLegend) y la inactivación CAR se midió usando anti-FMC62scFv-AlexaFluor647 (clon novedoso producido y conjugado internamente).
La proliferación, citotoxicidad y producción de citocinas se evaluaron mediante el co-cultivo de linfocitos T CAR con las líneas tumorales CD19+ Raji o Nalm6 en proporciones E:T de 1:1 y 1:2. Se utilizaron células leucémicas mielógenas K562 negativas para CD19 como controles. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y analizaron para detectar citocina secretada usando el instrumento Luminex MAGPIX y el conjunto de perlas MilliPlex MAP 15-plex (Millipore). La proliferación y la destrucción de blanco se evaluaron mediante tinción de muestras celulares de cultivo con anti-CD4-APC (clon BioLegend OKT4), anti-CD8-FITC (clon BioLegend RPA-T8) y anti-CD19-PE (clon BioLegend HIB19) y adquisición de datos de fluorescencia junto con recuentos celulares usando CytoFLEX-LX.
En comparación con los linfocitos T electroporados sin ARN (control en falso), la celularidad total del cultivo en el día 8 se redujo aproximadamente un 50 % para los linfocitos T editados con las meganucleasas TRC 1-2 x.87EE y L.1775 (figura 13A). Los cultivos editados con L.1592 o L.1843 no mostraron reducciones en la celularidad total del cultivo en esta medida. Al tomar en consideración la eficiencia de edición y calcular la cantidad total de células editadas generadas en el proceso, L.1592 generó la mayor cantidad de células inactivadas TCR (figura 13B). Las variantes x.87EE y L.1775 generaron números casi equivalentes de células editadas, mientras que L.1843 generó el menor número. Este patrón también se observó al medir la cantidad de células CAR+/TCR- en cultivo (figura 13C).
Cuando los linfocitos T CAR se co-cultivaron con linfocitos blanco portadores de antígeno, los linfocitos T CAR producidos con TRC 1-2 x.87EE se expandieron casi tres veces sobre el número de entrada (definido por línea discontinua horizontal -figu ra 14). De manera inesperada, los linfocitos T CAR producidos con nucleasas optimizadas proliferaron mucho más ávidamente que x.87EE, acercándose a una expansión de 10 veces después de 5 días. Cuando la proporción E:T se aumentó a 1:2, la proliferación de linfocitos T cAr editados con x.87EE y L.1843 se redujo en aproximadamente ^ con respecto a la proporción 1:1. Esto no se observó en los linfocitos T CAR producidos usando L.1775 o L.1592, que se descubrió que rinden significativamente mejor (p≤0.0001, figura 15A) que las otras nucleasas TRC 1-2. Cuando se midió la cantidad restante de células Raji CD19+ (a una proporción E:T 1:2 figura 15B), los 4 productos T CAR demostraron reducciones en las cantidades de Raji de 90 % o más en comparación con un cultivo control que no recibió linfocitos T CAR. Los linfocitos T CAR producidos usando nucleasas optimizadas eliminaron los linfocitos Raji significativamente mejor que los linfocitos producidos usando x.87EE.
Los análisis de sobrenadantes de co-cultivo mostraron que se produjeron niveles más altos de citocinas efectoras cuando se produjeron linfocitos T CAR usando nucleasas optimizadas en lugar de x.87EE. Los linfocitos T CAR editados con L.1592 secretaron los niveles más altos de IL-2, TNFa, IFNy y granzima B (figura 16A a 16D), y los segundos niveles más altos de perforina (figura 16E). En los casos de IL-2 y TNFa, las diferencias entre la producción de citocinas de linfocitos T editados con x.87EE y linfocitos T editados con L.1592 fueron de 2 a 3 veces más, mientras que todas las demás diferencias fueron menores.
En general, las meganucleasas TRC 1-2 optimizadas L.1775, L.1592 y L.1843 fueron funcionalmente superiores a x.87EE. Esto fue cierto en términos de las capacidades relativas de las nucleasas para apoyar la fabricación de linfocitos T CAR (figuras 13A a 13C), así como la capacidad de los linfocitos T CAR para responder al encuentro con su antígeno blanco (figuras 14 a 16). A partir de múltiples experimentos, parece que, mientras que L.1775 generalmente soportaba la mayor eficiencia de edición (frecuencia de inactivación), y L.1843 permitía la mayor expansión de linfocitos T después de la edición, L.1592 combinó la segunda mayor eficiencia de edición con la mayor o segunda expansión más alta para producir la mayor cantidad total de linfocitos T CAR. Es importante destacar que los linfocitos T CAR producidos con L.1592 mostraron ventajas funcionales (proliferación, destrucción de células blanco y producción de citocinas) sobre las otras meganucleasas optimizadas.
4. Tiempo de permanencia de meganucleasa TRC 1-2 optimizada in vitro
Los estudios se llevaron a cabo adicionalmente para determinar si las meganucleasas TRC 1-2 de segunda generación optimizadas tenían un tiempo de residencia in vitro más corto que las TRC 1- 2x.87EE de primera generación. Un tiempo de residencia más corto puede ser ventajoso en el contexto de edición génica y una reducción potencial en la escisión del blanco inespecífico.
En estos estudios, los linfocitos T se obtuvieron de un producto de aféresis (Key Biologics) mediante enriquecimiento magnético de linfocitos CD4+y CD8+ usando microesferas CD4 y CD8 y una columna LD (Miltenyi). Las células se activaron durante tres días con reactivo TransAct anti-CD3/anti-CD28 (Miltenyi) en medio Xuri (GE) que contenía FBS al 5 % (Hyclone GE), 10 ng/mL de IL-2 (Cellgenix) y solución antibiótica/antimicótica al 1 % (Gibco). Luego, las células se electroporaron con ARNm transcrito in vitro que codifica nucleasas TRC 1-2x.87EE o TRC 1-2L.1592 (Trilink), 1 |jg de ARNm por células 1e6, usando el sistema de electroporación MaxCyte. Las células se transdujeron posteriormente con un vector AAV6 recombinante que portaba una plantilla donante que codificaba un receptor de antígeno quimérico anti-CD19 diseñado para su inserción en el sitio TRC 1-2 mediante recombinación homóloga (sAb Tech) en medio Xuri libre de suero que contenía 30 ng/mL de IL-2 y solución antibiótica/antimicótica al 1 %. A las 6 horas después de la electroporación, las muestras se cuantificaron y volvieron a suspender en medio Xuri que contenía FBS al 5 %, 30 ng/mL de IL-2 y solución antibiótica/antimicótica al 1 %. En el punto de tiempo de 96 horas, los linfocitos T CD3+ no editados residuales se retiraron del grupo electroporado TRC mediante agotamiento magnético usando columnas LD, amortiguador CliniMACS y microesferas CD3 (Miltenyi). Las células se cultivaron luego en medios Xuri FBS al 5 %/anti- anti+ al 1% 10 ng/mL de IL-15 e IL-21 a 37 ° C durante el resto del experimento.
A las 6 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas y 168 horas después de la electroporación, se cuantificaron las muestras de linfocitos T y se sedimentó y resuspendió la misma cantidad de células viables en amortiguador RIPA (EMD Millipore) con inhibidores de proteasa añadidos (Roche), se mezcló bien y se criopreservó o incubó en hielo durante 30 minutos antes
del procesamiento adicional como se describe a continuación para los Western blot.
Las células en falso del mismo donante se activaron y cultivaron en el mismo medio que los grupos de tratamiento con nucleasa y se recolectaron a las 24 horas después de que los grupos de tratamiento con nucleasa se hubieran electroporado.
Para el análisis de Western blot, los lisados se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y se colocaron en hielo. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo BCA (Pierce), y 15 |jg de proteína total para cada muestra fueron amortiguador de muestra DTT (NuPage), y se incubaron a 90 °C durante 10 min. Se cargaron 5 jg de cada muestra en cada pocillo de los geles. Se utilizó una única muestra en falso del punto de tiempo posterior a la electroporación de 24 horas como un control. Después de la electroforesis, las muestras se transfirieron (sistema de electroforesis NuPage y reactivos) a membranas PVDf (Novex). Las membranas se bloquearon con 5 % de leche seca sin grasa en TBS-T y se tiñeron con anticuerpos primarios:
Blots Anticuerpos primarios
A Antinucleasa policlonal de conejo, (propiedad de Precision BioSciences, utilizada a 1:6500)
B Anti B-actina de ratón (Sigma, utilizado a 1:15000)
Las membranas se lavaron 6 veces y luego se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados:
Blots Anticuerpos Secundarios
A HRP de cabra anti-ratón (Invitrogen, utilizado a 1:50000)
B HRP de cabra anti-ratón (Invitrogen, utilizado a 1:75000)
Después de los pasos de lavado, las membranas se expusieron a ECL Prime (Amersham), se envolvieron en envoltura Saran y se capturaron imágenes usando el UVP ChemiDoc-It 815 Imager.
Como se muestra en la figura 17, no se pudo detectar expresión de nucleasa en la muestra simulada, como se anticipa. En muestras electroporadas con ARNm que codifica para las nucleasas TRC1-2x.87EE o TRC1-2L.1592, la proteína de nucleasa se expresó altamente en el punto de tiempo más temprano analizado, 6 horas después de la electroporación. A las 24 horas posteriores a la electroporación, la proteína permanece detectable; sin embargo, se observó que la expresión es sustancialmente menor que a las 6 horas posteriores a la electroporación para ambas nucleasas, y notablemente menor para TRC 1-2L.1592 que Tr C 1-2x.87EE en este punto temporal. En la muestra tratada con ARNm TRC 1-2L.1592, ninguna proteína de nucleasa es detectable 48 horas después de la electroporación o en puntos de tiempo posteriores, mientras que la expresión de proteína TRC 1-2x.87EE todavía es detectable en este punto de tiempo. La expresión de actina es consistente en todas las muestras y puntos de tiempo, lo que indica que se agregaron cantidades equivalentes de proteína para cada muestra.
Estos estudios demostraron que las nucleasas TRC1-2x.87EE y TRC1-2L.1592 se expresaron a niveles altos a las 6 horas después de la electroporación del ARNm. Sin embargo, la expresión de TRC 1-2L.1592 en linfocitos T disminuyó más rápidamente que TRC 1-2x.87EE. Como se demostró en la figura 11, TRC 1-2L.1592 no exhibe una eficiencia de edición génica disminuida en comparación con TRC 1-2x.87EE, aunque se expresa durante un período de tiempo más corto. La retención de alta actividad de edición génica mientras se reduce la duración de la expresión son características deseables de TRC 1-2L.1592 y representan una mejora inesperada y ventajosa sobre TRC 1-2x.87EE, ya que estas propiedades se correlacionan con una mejor (es decir, mayor) tolerabilidad y mayor capacidad proliferativa de los linfocitos T, y menor actividad de blanco inespecífico con TRC 1-2L.1592 en comparación con TRC 1-2x.87EE.
Ejemplo 3
Evaluación de meganucleasas TRC 1-2 optimizadas en la producción de T CAR
La meganucleasa TRC 1-2L.1592 se evaluó adicionalmente en una ejecución de proceso a gran escala para determinar si la producción de linfocitos T CAR a escala mejoró en comparación con la meganucleasa TRC 1-2x.87EE de primera generación.
El proceso a gran escala utilizado para generar linfocitos T CAR alogénicos con TRC 1-2x.87EE comenzó con un Leucopak fresco de un donante sano y precalificado. El producto Leukopak se lavó para eliminar plaquetas antes de someterse al enriquecimiento inmunomagnético de los linfocitos T blanco. Los linfocitos T enriquecidos luego se lavaron en medio de crecimiento y se activaron usando un reactivo de activación. Después de un período de activación de 3 días, las células se lavaron y concentraron en amortiguador de electroporación. Se agregó ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE, y la mezcla
de células y ARNm se procesó a través de un dispositivo de electroporación. Las células electroporadas se diluyeron con medio de crecimiento que contenía un vector de a Av que codificaba para el gen de inserción CAR. Después de un período de expansión, las células se recogieron el día 8 y se realizó un agotamiento inmunomagnético de la población CD3-positiva. Después del agotamiento, las células CD3-negativas blanco se expandieron en medios de crecimiento durante un período adicional. Finalmente, las células se recolectaron el día 13, se lavaron y concentraron en una solución crioprotectora y se congelaron. El proceso a gran escala utilizado para generar linfocitos T CAR alogénicos con TRC 1-2L.1592 se realizó esencialmente el mismo que se describió para TRC 1-2x.87EE, excepto que la formulación de medio de crecimiento en la corrida TRC 1-2L.1592 era libre de origen animal (AOF, por sus siglas en inglés).
La cantidad total de células viables se determinó en puntos de tiempo clave en los procesos de producción (figura 18). El número de células es comparable desde el día 0 hasta el paso de agotamiento del día 8. Sin embargo, debido a una eficiencia de inactivación del receptor de linfocitos T significativamente mayor con TRC 1-2L.1592, la etapa de agotamiento en el proceso TRC 1-2L.1592 recuperó ventajosamente más del doble del número de células recuperado en la ejecución del proceso TRC 1-2x.87EE. Las tasas de expansión son similares entre el día 8 y 13, lo que conduce a aproximadamente dos veces más células viables totales en el día 13.
La eficiencia de inactivación de CD3 (es decir, un indicador de inactivación del receptor de linfocitos T endógeno) se determinó mediante citometría de flujo el día 8 de cada ejecución de producción (figura 19). De manera inesperada, el porcentaje de células modificadas genéticamente CD3 negativas (de células vivas totales) fue casi 20 % mayor en la ejecución del proceso TRC 1-2L.1592 que en la ejecución del proceso TRC 1-2x.87EE.
Por último, se midió la eficiencia de inserción de CAR mediante citometría de flujo en 3 momentos clave en cada proceso de producción (figura 20). Inesperadamente, el porcentaje de células transducidas y con resultado positivo para CAR (de células CD3 negativas) es aproximadamente un 25 % mayor en la ejecución del proceso TRC 1- 2L.1592 que en la ejecución del proceso TRC 1-2x.87EE. Los porcentajes de inactivación CAR son estables para ambos procesos entre el día 8 y el final del proceso el día 13, lo que resulta en un porcentaje similarmente mayor de células positivas para CAR al final de la ejecución del proceso TRC 1-2L.1592.
En conclusión, estos estudios mostraron de manera inesperada que la nucleasa TRC 1-2L.1592 mejoró significativamente la cantidad, así como la calidad del producto de terapia celular alogénica final. TRC 1-2L.1592 inactivó de manera más eficiente el receptor endógeno de linfocitos T, lo que resultó en una población mayor de linfocitos CD3 negativos modificados genéticamente, lo que mejoró el rendimiento general del proceso de producción en aproximadamente el doble. Además, TRC 1-2L.1592 proporciona potencialmente un entorno mejorado para la recombinación homóloga con el inserto génico CAR en la ruptura de doble cadena blanco, como lo demuestra la eficiencia mejorada de inserción CAR. El aumento en el porcentaje positivo para CAR da como resultado una pureza de producto farmacéutico significativamente mayor con menos células negativas para CAR.
Claims (14)
1. Una meganucleasa modificada genéticamente que reconoce y escinde una secuencia de reconocimiento que consiste en la SEQ ID NO: 5 dentro de un gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos (TCR), en donde dicha meganucleasa modificada genéticamente comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8.
2. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicha meganucleasa modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1.
3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho polinucleótido es un ARNm.
4. Un constructo de ADN recombinante que comprende dicho polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2.
5. Un vector viral que comprende dicho polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, opcionalmente en donde dicho vector viral es un vector retrovírico o un vector de AAV recombinante.
6. Un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente mediante la interrupción de una secuencia blanco en un cromosoma de dicha célula eucariota, dicho método comprende introducir en una célula eucariota:
(a) dicha meganucleasa modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1; o
(b) dicho polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2 or la reivindicación 3, en donde dicha meganucleasa modificada genéticamente se exprese en dicha célula eucariota;
en donde dicha meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en dicho cromosoma en una secuencia de reconocimiento que consiste en la SEQ ID NO: 5, en donde dicha secuencia blanco se interrumpe mediante la unión terminal no homóloga en dicho sitio de escisión, y en donde dicho método no es un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho polinucleótido es un ARNm.
8. Un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente que comprende una secuencia exógena de interés insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota, dicho método comprende introducir en una célula eucariota: (a) dicha meganucleasa modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1 o
dicho polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2 or la reivindicación 3, en donde dicha meganucleasa modificada genéticamente se exprese a partir de dicho polinucleótido en dicha célula eucariota; y
(b) un ácido nucleico que incluye dicha secuencia de interés;
en donde dicha meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en dicho cromosoma en una secuencia de reconocimiento que consiste en la SEQ ID NO: 5, en donde dicha secuencia de interés se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión, y en donde dicho método no es un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha secuencia de interés comprende una secuencia codificante para un receptor de antígeno quimérico o un TCR exógeno.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde dicho ácido nucleico que incluye dicha secuencia de interés además comprende secuencias homólogas a secuencias que flanquean dicho sitio de escisión y dicha secuencia de interés se inserta en dicho sitio de escisión mediante recombinación homóloga.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde dicho polinucleótido es un ARNm.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde dicho ácido nucleico se introduce en dicha célula eucariota mediante un vector viral, opcionalmente en donde dicho vector viral es un vector de AAV recombinante, y opcionalmente en en donde dicho vector de AAV recombinante tiene un serotipo de AAV2 o AAV6.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-12, en donde dicha célula eucariota es un linfocito T humano.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-13, en donde dicha célula eucariota modificada genéticamente no expresa un TCR endógeno en la superficie celular.
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