BR112020008478A2

BR112020008478A2 - métodos, composições e componentes para edição de crispr-cas9 de tgfbr2 em células t para imunota-rapia

Info

Publication number: BR112020008478A2
Application number: BR112020008478-6A
Authority: BR
Inventors: Stephen Michael Burleigh; Melissa Chin; Fred Harbinski; Christopher Heath Nye; Blythe D. SATHER; Queenie Vong; Gordon Grant Welstead; Chris Wilson
Original assignee: Editas Medicine, Inc.; Juno Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-10-20
Also published as: WO2019089884A2; IL274299A; MA50858A; JP2023179469A; WO2019089884A3; CA3081456A1; EP3704251A2; RU2020117752A; JP2021502113A; AU2018358250A1; CN111527209A; US20230061455A1; SG11202003862PA; MX2020004608A; KR20200075000A

Abstract

A presente invenção refere-se a sistemas de edição de genoma relacionados com CRISPR/CAS, composições e métodos para vetorizar o locos do TGFBR2, bem como células editadas por meio desses sistemas, composições e métodos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS, COMPOSIÇÕES E COMPONENTES PARA EDIÇÃO DE CRISPR-CAS9 DE TGFBR2 EM CÉLULAS T PARA IMUNOTERA- PIA". Pedido Relacionado

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US Nº 62/580,320, depositado em 1 de novembro de 2017, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência. Campo

[002] A presente invenção refere-se a métodos e componentes relacionados com CRISPR/Cas9 para edição de uma sequência de ácidos nucleicos alvo, por exemplo, um receptor Il do fator de trans- formação do crescimento (TGFBR2), ou para modução da expressão de uma sequência de ácidos nucleicos alvo, por exemplo, um gene de TGFBR?2. Antecedentes

[003] A transferência adotiva de células T utilizando células T ge- neticamente modificadas passou para a fase de testes clínicos como um terápico para malignidades sólicas e hematológicas. Os ensaios de fase | e Il envolvendo malignidades hematolócias (por exemplo, linfo- ma, leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia linfocítica aguda (ALL)), muitos pacientes apresentaram uma resposta pelo menos par- cial, com alguns pacientes apresentando respostas completas (Ko- chenderfer, J. N. et al., 2012 Blood 119, 2709-2720). No entanto, as respostas observadas em tipos de tumor sólido (incluindo melanoma, carcinoma de células renais e câncer colorretal) nem sempre foram tão robustas (Johnson, L. A. et al., 2009 Blood 114, 535—546; Lamers, C. H. et al., 2013 Mol. Ther. 21, 904—912; Warren, R. S. et al., 1998 Can- cer Gene Ther. 5, S1-S2).

[004] Embora sem desejarmos nos ater a qualquer teoria em par-

ticular, as terapias adotivas com células T em pacientes com tumor sólido pode ser influenciado por inúmeros fatores, tais como: (1) proli- feração das células T, por exemplo, proliferação limitada das células T subsequente à transferência adotiva; (2) sobrevivência das células T, por exemplo, indução de apoptose de células T por fatores na célula alvo, por exemplo, célula cancerosa, ambiente; e (3) função das célu- las T, por exemplo, inibição da função citotóxica das células T por fato- res inibitórios secretados por células imunes hospedeiras e células al- vo, por exemplo, células cancerosas. Estes fatores, por sua vez, po- dem sofrer a influência da atividade do fator de transformação do cres- cimento B (TGF-B), uma citocina produzida por uma ampla variedade de tipos de tumor que já mostrou suprimir diretamente linfócitos infil- trantes de tumor, assim como induzir e promover a função de células T reguladoras (Tregs) capazes de prevenir a imunidade antitumoral.

[005] TGFBR2 é um receptor para TGF-B que é expresso em uma miríade de tipos de célula incluindo células imunes. Já foi de- monstrado que a ligação do TGF-B pelo TGFBR?2 infra-regula a ativa- ção, a proliferação e a diferenciação de células T. O desenvolvimento de inibidores de TGFBR2 que podem melhorar a atividade do TGFBR2 em células T reativas ao tumor tem sido complicado devido à falta de modelos de camundongo pré-clínicos por causa do severo fenótipo autoimune observado em camundongos contendo células T genetica- mente modificadas para, como condição, não conter TGFBR2. Conse- quentemente, são necessárias estratégias eficazes para reduzir ou eliminar o impacto inibitório das cels do TGF-B, incluisive no contexto de imunoterapia mediada por células T.

[006] As CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palin- dromic Repeats) se desenvolveram em bactérias e arqueias como um sistema imunológico adaptivo para defesa contra-ataque viral. Com a exposição a um vírus, segmentos curtos de DNA viral são integrados no locos da CRISPR. RNA é transcrito a partir de uma porção do locos da CRISPR que inclui a sequência viral. Aquele RNA, que contém uma sequência complementar ao genoma viral, medeia a vetorização de uma nuclease guiada por RNA para uma sequência alvo no genoma viral. A nuclease guiada por RNA, por sua vez, cliva e dessa forma si- lencia o alvo viral.

[007] Recentemente, o sistema CRISPR/Cas9 foi adaptado para edição de genoma. A introdução de quebras no cordão duplo (DSBs) síitio-específicas possibilita a alteração de sequências alvo através de mecanismos de reparo de DNA endógenos, por exemplo, junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou reparo direcionado para ho- mologia (HDR). CRISPR/Cas9 representa uma seara promissora abordar a inibição mediada por TGF-B de células T no contexto de te- rapia de tumores, mas até o momento não foi identificada nenhuma abordagem viável para resolver este problema em células T para uso em terapia de tumores. Sumário

[008] Em certos aspectos, neste pedido são apresentados siste- mas de edição de genoma e composições e métodos relacionados pa- ra a edição vetorizada da sequência de ácidos nucleicos do TGFBR?2. Em certas modalidades, tal edição vetorizada resulta na alteração (por exemplo, infrarregulação) da expressão do TGFBR2. Em certas moda- lidades, tal alteração da expressão ocorre em células T. Em certas modalidades, a alteração da expressão do TGFBR2 em células T en- volve o uso de um complexo de ribonucleoproteínas (RNP) como um sistema de edição de genoma compreendendo uma proteína nuclease guiada por RNA complexada com um gRNA vetorizando o gene de TGFBR2. Em certas modalidades, a alteração na expressão do TGFBR?2 ocorre como resultado de uma quebra no cordão duplo indu- zida pelo RNP e subsequente reparo imperfeito que leva a indels em e/ou adjacentes à sequência alvo no TGFBR?2.

[009] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a sistemas de edição de genoma que incluem um RNA guia com um domínio de vetorizção que é complementar à sequência alvo de um gene de TGFBR2 e onde a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9. O domínio de vetorização pode ser 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% complementar.

[0010] Em certas modalidades, o domínio de vetorização tem um comprimento de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 nucleotí- deos.

[0011] Em certas modalidades, o domínio de vetorização tem pelo menos 18 nucleotídeos contíguos que são complementares ao gene de TGFBR2.

[0012] Em certas modalidades, o domínio de vetorização compre- ende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos seleci- onada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096. Em certas modalidades, o domínio de vetorização é configurado para formar uma quebra no cor- dão duplo ou uma quebra no cordão simples dentro de cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cerca de 25bp, ou cerca de 10bp da posição alvo no TGFBR?2.

[0013] Em certas modalidades descritas neste pedido, o sistema de edição de genoma é capaz de alterar o gene de TGFBR2 nocaute- ando a expressão do gene de TGFBR?2 ou eliminando a expressão do gene de TGFBR?2.

[0014] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma descritos neste pedido incorporam um gRNA compreendendo um do- mínio de vetorização configurado para vetorizar uma região codificado-

ra ou uma região não codificadora do gene de TGFBR2, em que a re- ferida região não codificadora compreende uma região promotora, uma região potencializadora, um intron, a UTR 3', a UTR 5, ou uma região de sinal de poliadenilação do referido gene de TGFBR2; e a re- gião codificadora compreende, por exemplo, uma região codificadora precoce do referido gene de TGFBR?2.

[0015] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma descritos neste pedido possui uma sequência alvo do gene de TGFBR2 compreendendo a sequência selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1,2,e 3.

[0016] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma descritos neste pedido have a target sequence do gene de TGFBR2 compreendendo a sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 a 10.

[0017] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma descritos neste pedido incorporate um domínio de vetorização com- preendendo uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos se- lecionada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096. Em certas modalida- des, o domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleo- tídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (g) SEQ ID NO: 5093. Em certas modalidades, o sistema de edição de genoma incorpora pares de moléculas de gRNA, incluindo, por exemplo, pares de gRNA que possuam as sequências alvo SEQ ID NOS: 5042 e 5041, ou 5042 e 5092, ou SEQ ID NOS: 5042 e 5093, ou SEQ ID NOS: 5093 e 5041.

[0018] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma molécula de gRNA compreen- dendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequên- cia alvo de um gene de TGFBR2. Em certas modalidades, a composi- ção compreende uma, duas, três ou quatro moléculas de gRNA. Em certas modalidades, a composição compreende ainda uma nuclease guiada por RNA, por exemplo, uma molécula de Cas9. Em certas mo- dalidades, o domínio de vetorização incorporado em tais composições compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou dife- re no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096. Em certas modali- dades, o domínio de vetorização compreende uma sequência de nu- cleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (g) SEQ ID NO: 5093. Em certas modalidades, a composição incorpora pares de moléculas de gRNA, incluindo, por exemplo, pares de gRNA que possuem as sequências alvo SEQ ID NOS: 5042 e 5041, ou 5042 e 5092, ou SEQ ID NOS: 5042 e 5093, ou SEQ ID NOS: 5093 e 5041.

[0019] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a um vetor codificando uma molécula de gRNA compreendendo um do- mínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene de TGFBR2. Em certas modalidades, o vetor codifica ainda uma nuclease guiada por RNA, por exemplo, uma molécula de Casº9. Em certas modalidades, o domínio de vetorização do gRNA codificado pelo vetor compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nu- cleotídeos selecionada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096. Em cer- tas modalidades, o domínio de vetorização compreende uma sequên-

cia de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nu- cleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (g) SEQ ID NO: 5093. Em certas modalidades o vetor é um vetor viral. Em certas modalidades, o vetor é um vetor de vírus adeno-associado (AAV) ou um vetor de lentivírus (LV).

[0020] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a um método para alterar um gene de TGFBR2 em uma célula, compre- endendo administrar à referida célula um dentre: (i) um sistema de edição de genoma compreendendo uma molécula de gRNA compre- endendo um domínio de vetorização que é complementar a uma se- quência alvo do referido gene de TGFBR2, e uma molécula de Cas9; (ii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma mo- lécula de gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo do referido gene de TGFBR2, e um polinucleotídeo codificando uma molécula de Cas9; ou (ili) uma composição compreendendo uma molécula de gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo do referido gene de TGFBR2, e uma molécula de Cas9.

[0021] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma célula compreendendo um sistema de edição de genoma descrito neste pedido, uma composição de gRNA descrita neste pedido, ou um vetor descrito neste pedido. Em certas modalidades, a célula expressa TGFBR?2. Em certas modalidades, a célula é uma célula T.

[0022] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a um gRNA e uma nuclease guiada por RNA compreendendo um com- plexo de ribonucleoproteínas (RNP).

[0023] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a administrar a uma célula dois ou mais complexos de RNP compreen-

dendo gRNAs com diferentes domínios de vetorização.

[0024] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a complexos de RNP compreendendo nucleases Cas9 (eaCas9) enzi- maticamente ativas.

[0025] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a complexos de RNP compreendendo nucleases eaCas9 que formam quebras no cordão duplo em ácido nucleico alvo ou quebras no cordão simples em ácido nucleico alvo.

[0026] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a dois complexos de RNP compreendendo gRNAs distintos são usados para formar quebras deslocadas no cordão simples no gene de TGFBR2 em uma célula.

[0027] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma célula que é uma célula T ou uma célula exterminadora natural (NK). Em certas modalidades, a célula compreende ainda um receptor de células T geneticamente modificado (eTCR) ou um receptor de an- tígenos quimérico (CAR).

[0028] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a um método mediado por uma nuclease guiada por RNA para alterar a expressão de um gene de TGFBR2 em uma célula compreendendo: a) colocar a célula em contato com uma quantidade suficiente de um gRNA que vetoriza o TGFBR2 e uma nuclease guiada por RNA; e b) formar uma primeira quebra no cordão duplo do DNA próxima à posi- ção alvo no TGFBR2 em um gene de TGFBR?2 da célula, em que a primeira quebra no cordão duplo do DNA é reparada pelo NHEJ, em que o referido reparo altera a expressão do gene de TGFBR?2.

[0029] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a formar uma segunda quebra no cordão duplo do DNA próxima à posi- ção alvo no TGFBR2. Em certas modalidades, uma primeira quebra no cordão duplo é formanda dentro de cerca de 500bp, cerca de 450bp,

cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cer- ca de 25bp, ou cerca de 10bp da posição alvo no TGFBR2. Em certas modalidades, a primeira e a segunda quebras no cordão duplo são formadas dentro de cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cerca de 25bp, ou cerca de 10bp da posição alvo no TGFBR2. Em certas modalidades, a primeira quebra no cordão duplo é formada em uma região codificado- ra ou uma região não codificadora do referido gene de TGFBR2, em que a referida região não codificadora compreende uma região promo- tora, uma região potencializadora, um intron, uma UTR 3', uma UTR 5', ou uma região de sinal de poliadenilação do referido gene de TGFBR2. Em certas modalidades a primeira e a segunda quebras no cordão duplo são formadas em uma região codificadora ou uma região não codificadora do referido gene de TGFBR2, em que a referida regi- ão não codificadora compreende uma região promotora, uma região potencializadora, um intron, uma UTR 3', uma UTR 5', ou uma região de sinal de poliadenilação do referido gene de TGFBR2.

[0030] Em certas modalidades, a região codificadora é seleciona- da dentre exon 3, exon 4, e exon 5.

[0031] Em certas modalidades, o domínio de vetorização compre- ende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere em no máximo cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 5036 a 5096.

[0032] Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 de S. pyogenes, e o referido domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou dife- re em no máximo cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nu- cleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO:

5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (g) SEQ ID NO:

5093.

[0033] Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 de S. aureus.

[0034] Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 mutante.

[0035] Em certas modalidades, o reparo do NHEJ produz uma in- serção ou uma deleção com uma frequência maior ou igual a 20%.

[0036] Em certas modalidades, a frequência de inserção ou dele- ção é maior ou igual a 30%, 40%, ou 50%.

[0037] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma célula de genoma geneticamente modificada compreendendo uma inserção ou uma deleção próxima ou em uma posição alvo de um gene de TGFBR2, em que a referida posição alvo compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a, ou diferente no má- ximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096.

[0038] Em certas modalidades, a inserção ou deleção se dá dentro de cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cerca de 25bp, ou cerca de 10bp da posição alvo no TGFBR2.

[0039] Em certas modalidades, a célula é uma célula T ou uma célula NK. Em certas modalidades, a célula compreende ainda um eTCR ou um CAR.

[0040] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo: a) uma população de células de genoma geneticamente modificadas compreendendo uma inserção ou uma deleção próxima ou em uma posição alvo de um gene de

TGFBR2, em que a referida posição alvo compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a, ou diferente no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecio- nada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096; e b) um tampão farmaceu- ticamente aceitável.

[0041] Em certas modalidades, a população de células compreen- de células T ou células NK. Em certas modalidades, a célula compre- ende ainda um eTCR ou um CAR.

[0042] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer em um indivíduo, compreen- dendo administrar ao indivíduo células imunes geneticamente modifi- cadas, em que as células imunes geneticamente modificadas apresen- tam expressão reduzida do TGFBR2, e opcionalmente expressam um receptor de células T geneticamente modificado (eTCR) ou um recep- tor de antígenos quimérico (CAR), em que as células imunes geneti- camente modificadas possuem uma inserção ou uma deleção próxima ou em uma posição alvo do gene de TGFBR2.

[0043] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas compreendem células T ou células NK. Em certas modali- dades, a célula compreende ainda um eTCR ou um CAR.

[0044] Em certas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia, linfoma, por exemplo, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma não Hod- gkin, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma folicular re- fratário, linfoma de células do manto, linforma de células B indolentes, malignidades de células B, câncer de cólon, de pulmão, de fígado, de mama, de próstata, de ovário, de pele, melanoma, câncer ósseo e de cérebro, câncer de ovário, cânceres epiteliais, carcinoma de células renais, adenocarcinoma de pâncreas, linfoma de Hodgkin, carcinoma cervical, câncer colorretal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de

Ewing, meduloblastoma, osteossarcoma, sarcoma sinovial, mesoteli- oma, e/ou qualquer tipo de câncer que expresse TGF-RB.

[0045] Em certas modalidades, as células T são células T CD4+ e/ou CD8+.

[0046] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam atividade lítica aumentada contra uma célula cancerosa alvo em relação a uma célula imune não geneti- camente modificada.

[0047] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam expressão aumentada de granzi- ma B e/ou interferon gama na presença de TGFB em relação a células imunes não geneticamente modificadas.

[0048] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam persistência aumentada contra estimulação antigênica repetida em relação a células imunes não ge- neticamente modificadas.

[0049] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam expressão aumentada de CD25 em relação a células imunes não geneticamente modificadas.

[0050] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam expressão reduzida de PD-1 em relação a células imunes não geneticamente modificadas.

[0051] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam proliferação aumentada em rela- ção a células imunes não geneticamente modificadas.

[0052] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma pluralidade de células T gene- ticamente modificadas, em que as referidas células T geneticamente modificadas apresentam expressão reduzida do gene de TGFBR2 em relação a células T não geneticamente modificadas.

[0053] Em certas modalidades, as células T geneticamente modifi- cadas apresentam um nível de expressão do gene de TGFBR2 que é cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% do nível de expressão do TGFBR2 em células T não geneticamente modificadas.

[0054] Em certas modalidades, as células T geneticamente modifi- cadas compreendem ainda a expressão de um eTCR ou de um CAR.

[0055] Em certas modalidades, as células T são células T CD4+ e/ou células T CD8+.

[0056] Em certas modalidades, as células T geneticamente modifi- cadas são ainda caracterizadas por possuírem: a) atividade lítica au- mentada contra uma célula cancerosa alvo em relação a células T não geneticamente modificadas; b) expressão mantida ou aumentada de granzima B e/ou interferon gama na presença de TGFB em relação a células T não geneticamente modificadas; c) persistência mantida ou aumentada contra estimulação antigênica repetida em relação a célu- las T não geneticamente modificadas; d) expressão mantida ou au- mentada de CD25 em relação a células T não geneticamente modifi- cadas; e) expressão mantida ou reduzida de PD-1 em relação a célu- las T não geneticamente modificadas; e/ou f) proliferação mantida ou aumentada em relação a células T não geneticamente modificadas.

[0057] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma pluralidade de células T gene- ticamente modificadas, em que as referidas células T geneticamente modificadas apresentam expressão reduzida do gene de TGFBR2 em relação a células T não geneticamente modificadas, as referidas célu- las T geneticamente modificadas produzidas por meio do contato de células T não geneticamente modificadas com um sistema de edição de genoma compreendendo: um gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene de TGFBR2; e uma nuclease guiada por RNA.

[0058] Em certas modalidades, as células T geneticamente modifi- cadas são ainda transduzidas com um vetor que expressa um eTCR ou um CAR. Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em cer- tas modalidades, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado (AAV) ou um vetor de lentivírus (LV).

[0059] Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 de S. pyogenes, e o referido domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou dife- re em no máximo cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nu- cleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (9) SEQ ID NO:

5093.

[0060] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma pluralidade de células T gene- ticamente modificadas, em que as referidas células T geneticamente modificadas são deficientes em sinalização de TGFBR2.

[0061] Em certas modalidades, a sinalização de TGFBR2 deficien- te é mediada pela expressão de uma forma negativa dominante (DN) do TGFBR?2 nas referidas células T geneticamente modificadas.

[0062] Em certas modalidades, as células T geneticamente modifi- cadas são ainda transduzidas com um vetor que expressa um eTCR ou um CAR. Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em cer- tas modalidades, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado (AAV) ou um vetor de lentivírus (LV).

[0063] Em certas modalidades, as células T são células T CD4+ e/ou células T CD8+.

[0064] Em certas modalidades, as células T geneticamente modifi- cadas são ainda caracterizadas por possuírem: a) atividade lítica au-

mentada contra uma célula cancerosa alvo em relação a células T não geneticamente modificadas; b) expressão mantida ou aumentada de granzima B e/ou interferon gama na presença de TGFB em relação a células T não geneticamente modificadas; c) persistência mantida ou aumentada contra estimulação antigênica repetida em relação a célu- las T não geneticamente modificadas; d) expressão mantida ou au- mentada de CD25 em relação a células T não geneticamente modifi- cadas; e) expressão mantida ou reduzida de PD-1 em relação a célu- las T não geneticamente modificadas; e/ou f) proliferação mantida ou aumentada em relação a células T não geneticamente modificadas.

[0065] Em certas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas compreendem ainda expressão reduzida do TGFBR2 do tipo selvagem.

[0066] Em certas modalidades, a expressão do TGFBR2 do tipo selvagem é reduzida por meio contato das células imunes genetica- mente modificadas com um sistema de edição de genoma compreen- dendo: um gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene de TGFBR2; e uma nuclease guiada por RNA.

[0067] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a um complexo de ribonucleoproteínas (RNP) compreendendo um gRNA que compreende um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene de TGFBR2 e uma nuclease guiada por RNA.

[0068] Em certas modalidades, o RNP da reivindicação 117, em que uma nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9.

[0069] Em certas modalidades, o RNP da reivindicação 117, em que o RNP é eletroporado em células.

[0070] A menos que definido em contrário, todos os termos técni- cos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido pelo especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles descritos neste pedido possam ser usados para a reali- zação ou testagem da presente invenção, métodos e materiais ade- quados estão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de pa- tente, patentes, e outras referências mencionadas neste pedido estão aqui incorporadas em sua íntegra a título de referência. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se desti- nam a ser limitativos.

[0071] Os cabeçalhos, incluindo cabeçalhos e sub-cabeçalhos numéricos e alfabéticos, são para fins de organização e apresentação e não se destinam a ser limitativos.

[0072] Outras características e vantagens da invenção ficarão apa- rentes a partir da descrição detalhada, dos exemplos, dos desenhos, e das reivindicações. Breve Descrição dos Desenhos

[0073] Os desenhos anexos destinam-se a oferecer exemplos ilus- trativos e esquemáticos, e não abrangentes, de certos aspectos e mo- dalidades da presente invenção. Os desenhos não se destinam a ser limitativos ou vinculativos de qualquer teoria ou modelo em particular, e não estão necessariamente em escala. Sem limitar o acima exposto, os ácidos nucleicos e os polipeptídios podem ser representados como sequências lineares, ou como estruturas bi- ou tri- dimensionais es- quemáticas; estas representações destinam-se a ser ilustrativas e não limitativas ou vinculativas de qualquer modelo ou teoria em particular no que diz respeito a sua estrutura.

[0074] A Fig. 1 representa uma lista de gRNAs exemplificativos vetorizando os Exons 1A-5 do receptor |l do fator de tansformação do crescimento B (TGFBR2) e sua atividade % de junção de extremidades não homólogas (NHEJ) associadas

[0075] A Fig. 2 representa a eficiência de edição de genoma de certos pares de gRNA exemplificativos.

[0076] A Fig. 3 representa a % de formação de indel segundo de- terminada por miSeq no gene de TGFBR2. Sete gRNAs foram testa- dos em várias concentrações de RNPs para produzir uma curva de dose resposta.

[0077] A Fig. 4A-Fig. 4B representa a % de células editadas (Fig. 4A) e a % de frequência de indel (Fig. 4B) com vários gRNAs testados vetorizando o TGFBR2 e um gRNA de controle vetorizando o locos AAVS1.

[0078] A Fig. 5 representa uma comparação de dois gRNAs de vetorização do TGFBR2 em sua capacidade de produzir mutãções de indel "out-of-frame".

[0079] A Fig. 6 representa a produção relativa de IFN-gama em células T primárias transduzidas para expressar CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR2 editados, com (10ng/ml) ou sem TGFB. gRNAs simples ou pareados foram comparados.

[0080] A Fig. 7 representa a proliferação celular relativa em célu- las T primárias transduzidas para expressar CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR2 editados, com (10ng/ml) ou sem TGFB. gRNAs simples ou pareados foram comparados.

[0081] A Fig. 8A-Fig. 8B representa a expressão de CD25 (Fig. 8A) e de PD-1 (Fig. 8B) em células T primárias transduzidas para ex- pressar CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR?2 editados, com (10ng/ml) ou sem TGFB. gRNAs simples ou pareados foram com- parados. As células também foram estimuladas com células RPMI 8226 por 48 horas.

[0082] A Fig. 9 representa a fosforilação de Smad 2/3 em células T transduzidas para expressar diferentes CARs em um fundo de genes de TGFBR?2 editados, com (10ng/ml) ou sem TGFB.

[0083] A Fig. 10 representa a expressão relativa de Granzima B em células T transduzidas para expressar diferentes CARs em um fundo de genes de TGFBR?2 editados, com (10ng/ml) ou sem TGFB.

[0084] A Fig. 11 representa a produção de IFN-gama em células T transduzidas para expressar diferentes CARs em um fundo de genes de TGFBR?2 editados, com (10ng/ml) ou sem TGFB.

[0085] A Fig. 12 representa a proliferação relativa de células T em células T transduzidas para expressar diferentes CARs em um fundo de genes de TGFBR?2 editados, com (10ng/ml) ou sem TGFRB.

[0086] A Fig. 13A-Fig. 13B representa a produção de Granzima B (Fig. 13A) e de Interferon gama (Fig. 13B) em células T primárias transduzidas para expressar CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR?2 editados ou um fundo de TGFBR2 DN, com (10ng/ml) ou sem TGFRB.

[0087] A Fig. 14 representa a % relativa de lise de células RPM! 8226 por células T expressando CAR anti-BCMA em um fundo de ge- nes de TGFBR?2 editados ou um fundo de TGFBR2 DN, com (10ng/ml) ou sem TGFRB.

[0088] A Fig. 15A-Fig. 15F representa células T expressando CAR anti-BCMA em um fundo de TGFBR2 não editados, um fundo de ge- nes de TGFBR?2 editados, ou um fundo de TGFBR2 DN com estimula- ção antigênica repetida de TGFRB. As Fig. 15A-Fig. 15C mostram o número de células projetado depois de estimulação com três antíge- nos diferentes. As Fig. 15D-Fig. 15F mostram a % de células T ex pressando CAR anti-BCMA ao longo do tempo com estimulação anti- gênica repetida de TGFB.

[0089] A Fig. 16A-Fig. 16B representa a produção de INF-gama em células T primárias transduzidas para expressar CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR?2 editados ou um fundo de TGFBR2 DN, com (10ng/ml) ou sem TGFB. As células T foram co-incubadas com células RPMI 8226 (Fig. 16A) ou com células OPM?2 (Fig. 16B).

[0090] A Fig. 17A-Fig. 17B representa a expressão de CD25 em células T primárias transduzidas para expressar CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR2 editados ou um fundo de TGFBR2 DN, com (10ng/ml) ou sem TGFB. As células T foram co-incubadas com células RPMI 8226 (Fig. 17A) ou com células OPM?2 (Fig. 17B).

[0091] A Fig. 18A-Fig. 18B representa a expressão de PD-1 em células T primárias transduzidas para expressar CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR2 editados ou um fundo de TGFBR2 DN, com (10ng/ml) ou sem TGFB. As células T foram co-incubadas com células RPMI 8226 (Fig. 18A) ou com células OPM?2 (Fig. 18B).

[0092] A Fig. 19A-Fig. 19B representa a proliferação celular relati- va (Fig. 19A) e a produção relativa de IFN-gama (Fig. 19B) de células T expressando CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR2 editados ou um fundo de TGFBR2 DN, com (10ng/ml) ou sem TGFRB. As células também foram estimuladas com células RPMI 8226.

[0093] A Fig. 20A-Fig. 20B representa a % de células PD-1 + em várias células T CD4+ (Fig. 20A) e CD8+ (Fig. 20B) expressando CAR anti-<BCMA em um fundo de genes de TGFBR2 editados ou um fundo de TGFBR2 DN, com concentrações crescentes de TGFB. As células também foram estimuladas com células RPM! 8226 por 48 horas.

[0094] A Fig. 21 representa o nível de expressão dos genes PME- PA1, SKIL, SKI, e LDLRADA4 da via de sinalização de TGFB em células T expressando CAR anti-BCMA em um fundo de genes de TGFBR2 editados ou em um fundo de TGFBR2 DN. Células T foram isoladas do baço de camundongos ou do tumor derivado de células RPMI 8226.

[0095] A Fig. 22 representa os níveis de fosforilação de Smad 2/3, a proliferação, e a expressão de Granzima B em células T expressan- do CAR anti-CD19 em um fundo de TGFBR2 DN, com e sem TGFB.

[0096] A Fig. 23 representa um esquema para determinar se a edição de genes de TGFBR2 em células T confere alguma vantagem seletiva em relação às célulsa do tipo selvagem.

[0097] A Fig. 24 representa diferentes razões de células TGFBR2- KO de CAR anti-BCMA com células WT (1, 0,75, 0,5, 0,25). As células foram co-cultivadas com células RPMI8226 em uma razão de efetoras para alvo de 1:1 + 10 ng/ml de TGFRB. As células foram coletadas a ca- da 7 dias para análise da % de indel por sequenciamento de alto ren- dimento. As células foram novamente estimuladas com RPMI8226 fresco e novamente ajustadas na razão de efetoras para alvo de 1:1 uma vez por semana. Descrição Detalhada Definições e Abreviações

[0098] A menos que especificado em contrário, cada um dos ter- mos a seguir tem o significado associado ao mesmo nesta seção.

[0099] Os artigos indefinidos "um" e "uma" referem-se a pelo me- nos um dos substantivos associados, e são usados intercambiavel- mente com os termos pelo menos um" e "um ou mais". Por exemplo, "um módulo" significa pelo menos um módulo, ou um ou mais módulos.

[00100] As conjunções "ou" e "e/ou" são usadas intercambiavel- mente como disjunções não exclusivas.

[00101] A expressão "consistindo essencialmente em" significa que as espécies mencionadas são as espécies predominantes, mas que outras espécies podem estar presentes em quantidades de traço ou em quantidades que não afetam a estrutura, a função ou o comporta- mento da composição em questão. Por exemplo, uma composição que consiste essencialmente em uma espécie particular geralmente vai compreender 90%, 95%, 96%, ou mais daquela espécie.

[00102] "Domínio" é usado para descrever um segmento de uma proteína ou de um ácido nucleico. A menos que indicado contrário, não é necessário que um domínio tenha qualquer propriedade funcional específica.

[00103] Um "indel" é uma inserção e/ou deleção em uma sequência de ácidos nucleicos. Um indel pode ser o produto do reparado de uma quebra no cordão duplo do DNA, tal como uma quebra no cordão du- plo formada por um sistema de edição de genoma da presente inven- ção. Mais comumente um indel é formado quando uma quebra é repa- rada por uma via de reparo "propensa a erros" tal como a via de NHEJ descrita abaixo. Um indel pode produzir inserções ou deleções criando mutações "in-frame" ou "out-of-frame" na sequência alvo.

[00104] "Conversão de genes" refere-se à alteração de uma se- quência de DNA pela incorporação de uma sequência homóloga en- dógena (por exemplo, uma sequência homóloga em um arranjo de ge- nes). "Correção de genes" refere-se à alteração de uma sequência de DNA pela incorporação de uma sequência homóloga exógena, tal co- mo um DNA template doador de cordão simples ou de cordão duplo exógeno. Conversão de genes e correção de genes são produtos do reparo das quebras no cordão duplo do DNA por vias do HDR tais co- mo aquelas descritas abaixo.

[00105] Um indel, a conversão de genes, a correção de genes, e outros resultados da edição de genoma são tipicamente avaliados por sequenciamento (mais comumente por métodos de "next-gen" ou "se- quenciamento-por-síntese", embora o sequenciamento de Sanger ain- da possa ser usado) e são quantificados pela frequência relativa de alterações numéricas (por exemplo, +1, +2 ou mais bases) em um sítio de interesse entre todas as leituras de sequenciamento. As amostras de DNA para sequenciamento podem ser preparadas por uma varie- dade de métodos conhecidos no estado da técnica, e podem envolver a amplificação de sítios de interesse por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), a captura das extremidades de DNA geradas por quebras no cordão duplo, como no processo GUIDEseq descrito em

Tsai et al. (Nat. Biotechnol. 34(5): 483 (2016), aqui incorporado a título de referência) ou por outros meios bastante conhecidos no estado da técnica. Os resultados da edição de genoma também podem ser avali- ados por métodos de hibridização in situ tal como o sistema Fiber- Comb'Y comercializado pela Genomic Vision (Bagneux, França), e por qualquer outro método conhecido no estado da técnica.

[00106] "AItHDR", "reparo direcionado por homologia alternativo”, ou "HDR alternativo" são usados intercambiavImente para indicar o processo de reparo do dano no DNA usando um ácido nucleico homó- logo (por exemplo, uma sequência homóloga endógena, por exemplo, um cromatídeo irmão, ou um ácido nucleico éxógeno, por exemplo, um ácido nucleico template). O AIt-HDR distingue-se do HDR canônico pelo fato de que o processo utiliza vias diferentes daquelas do HDR canônico, e pode ser inibido pelos mediadores do HDR canônico, RAD51 e BRCA?2. O AIt-HDR também se distingue pelo envolvimento de um template de ácido nucleico homólogo de cordão simples ou pi- cotado, ao passo que o HDR canônico geralmente envolve um templa- te homólogo de cordão duplo.

[00107] "HDR canônico", "reparo direcionado por homologia canô- nico" ou "cHDR" referem-se ao processo de reparo do dano no DNA usando um ácido nucleico homólogo (por exemplo, uma sequência homóloga endógena, por exemplo, um cromatídeo irmão, ou um ácido nucleico éxógeno, por exemplo, um ácido nucleico template). O HDR canônico age tipicamente quando houve ressecção significativa na quebra no cordão duplo, formando pelo menos uma porção de cordão simples do DNA. Em uma célula normal, o cHDR envolve tipicamente uma série de etapas tais como reconhecimento da quebra, estabiliza- ção da quebra, ressecção, estabilização do DNA de cordão simples, formação de um intermediário de permutação genética de DNA, reso- lução do intermediário de permutação genética, e ligação. O processo requer RAD51 e BRCA2, e o ácido nucleico homólogo é tipicamente de cordão duplo.

[00108] A menos que indicado em contrário, o termo "HDR" con- forme usado neste pedido abrange tanto HDR canônico quanto alt- HDR.

[00109] "União de extremidades não homólogas" ou "NHEJ" refere- se ao reparo mediado por ligação e/ou ao reparo não mediado por template incluindo NHEJ canônica (CNHEJ) e NHEJ alternativa (al- tNHEJ), que por sua vez inclui união de extremidades mediada por mi- cro-homologia (MMEJ), combinação de cordões simples (SSA), união de extremidades mediada por micro-homologia síntese-dependente (SD-MMEJ).

[00110] "Substituição" ou "substituído", quando usado em relação a uma modificação de uma molécula (por exemplo, um ácido nucleico ou proteína), não requer uma limitação do processo, mas indica simples- mente que a entidade de substituição está presente.

[00111] "Indivíduo" significa um animal humano ou não humano. Um indivíduo humano pode ser de qualquer idade (por exemplo, um bebê, uma criança, um adulto jovem, ou um adulto), e pode sofrer de uma doença, ou pode ter necessidade de alteração de um gene. Alter- nativamente, o indivíduo pode ser um animal, este termo incluindo, po- rém sem limitação, mamíferos, pássaros, peixes, répteis, anfíbios, e mais particularmente primatas não humanos, roedores (tais como ca- mundongos, ratos, hamsters, etc.), coelhos, porquinhos-da-índia, ca- chorros, gatos, entre outros. Em certas modalidades desta invenção, o indivíduo é gado, por exemplo, uma vaca, um cavalo, um carneiro, ou uma cabra. Em certas modalidades, o indivíduo é uma ave doméstica.

[00112] "Tratar", "tratando", e "tratamento" significam o tratamento de uma doença em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), incluindo um ou mais dentre inibição da doença, isto é, paralisação ou prevenção de seu desenvolvimento ou evolução; mitigação da doença, isto é, causação da regressão do estado de doença; alívio de um ou mais sintomas da doença; e cura da doença.

[00113] "Prevenir", "prevenindo" e "prevenção" referem-se à pre- venção de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um ser humano, incluindo (a) evitar ou impedir a doença; (b) afetar a predis- posição para doença; ou (c) prevenir ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma da doença.

[00114] Um "kit" refere-se a um conjunto de dois ou mais compo- nentes que juntos constituem uma unidade funcional que pode ser empregado para uma finaliade específica. A título ilustrativo (e não li- mitativo), um kit de acordo com esta invenção pode incluir um RNA guia complexado ou capaz de complexar com uma nuclease guiada por RNA, e acompanhado por (por exemplo, suspendido, ou suspensí- vel) um veículo farmaceuticamente aceitável. O kit pode ser usado pa- ra introduzido o complexo em, por exemplo, uma célula ou um indiví- duo, com a finalidade de causar uma alteração genômica desejada em tal célula ou indivíduo. Os componentes de um kit podem ser embala- dos juntos, ou eles podem ser embalados individualmente. Os kits de acordo com esta invenção também opcionalmente incluir instruções de uso (DFU) que descrevem o uso do kit, por exemplo, de acordo com um método desta invenção. As DFU podem ser fisicamente embaladas com o kit, ou podem ser disponibilizadas para um usuário do kit, por exemplo, por meios eletrônicos.

[00115] Os termos "polinucleotídeo", "sequência de nucleotídeos", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "sequência de ácidos nucleicos" e "oligonucleotídeo" referem-se a uma série de bases nu- cleotídicas (também denominadas "nucleotídeos") no DNA e no RNA, e significam qualquer cadeia de dois ou mais nucleotídeos. Os polinu- cleotídeo, sequências de nucleotídeos, ácidos nucleicos etc. podem ser misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas dos mesmos, de cordão simples ou de cordão duplo. Eles podem ser modi- ficados na porção base, na porção açúcar, ou no esqueleto fosfato, para melhorar a estabilidade da molécula, seus parâmetros de hibridi- zação, etc. Uma sequência de nucleotídeos tipicamente carrega infor- mação genética, incluindo, porém sem limitação, as informações usa- das pelo maquinário celular para fazer proteínas e enzimas. Estes termos incluem DNA genômico de cordão duplo ou de cordão simples, RNA, qualquer polinucleotídeo sintético e geneticamente manipulado, e polinucleotídeos tanto sense quanto antisense. Estes termos tam- bém incluem ácidos nucleicos contendo bases modificadas.

[00116] A notação IUPAC convencional é usada nas sequências de nucleotídeos apresentadas neste pedido, como mostrado na Tabela 1, abaixo (vide, also Cornish-Bowden A, Nucleic Acids Res. 1985 May 10; 13(9):3021-30, aqui incorporado a título de referência). Deve-se observar, no entanto, que "T" denota "Timina ou Uracil" nos casos em que uma sequência pode ser codificada seja pelo DNA seja pelo RNA, por exemplo, nos domínios de vetorização de gRNA. Tabela 1: Notação IUPAC dos ácidos nucleicos A Adenina U Uracil |Y C ou TIU [E esam |

Vv A,CouG H A, C ou T/U NO acenm

[00117] Os termos "proteína", "peptídio" e "polipeptídio" são usados intercambiavelmente para indicar uma cadeia de sequências de ami- noácidos ligadas umas às outras via ligações peptídicas. Os termos incluem proteínas individuais, grupos ou complexos de proteínas que se associam, assim como fragmentos ou porções, variantes, derivados e análogos destas proteínas. As sequências peptídicas estão apresen- tadas neste pedido pela notação convencional, começando com o amino ou o terminal N à esquerda, e prosseguindo até a carboxila ou o terminal C à direita. As abreviações tradicionais de uma letra ou de três letras podem ser usadas.

[00118] O termo "variante" refere-se a uma entidade tal como um polipeptídio, polinucleotídeo ou molécula pequena que apresenta iden- tidade estrutural significativa com uma entidade de referência, mas di- fere da entidade de referência pela presença ou nível de uma ou mais porções químicas em relação à entidade de referência. Em muitas modalidades, uma variante também difere funcionalmente da sua enti- dade de referência. Em geral, o fato de uma entidade particular ser apropriadamente considerada uma "variant" de uma entidade de refe- rência baseia-se em seu grau de identidade estrutural com a entidade de referência. Panorama Geral

[00119] Os sistemas de edição de genoma descritos neste pedido geralmente incluem um ou mais gRNAs compreendendo domínios de vetorização que são complementares a uma ou mais sequências alvo do TGFBR2, sendo que estas sequências alvo, por sua vez, incluem ou são adjacentes a sequências do motivo adjacente ao protoespaça-

dor (PAM) reconhecidas por uma ou mais nucleases guiadas por RNA às quais o um ou mais gRNAs podem se ligar (por exemplo, comple- xar). Por conseguinte, os sistemas de edição de genoma desta inven- ção estão voltados, de maneira síitio-específica, para a uma ou mais sequências alvo no TGFBR2, e operam para introduzir uma alteração nas sequências alvo no TGFBR2 ou perto das mesmas.

[00120] As alterações introduzidas nos sítios alvo no TGFBR2, ou próximo aos mesmos, pelos sistemas de edição de genoma desta in- venção incluirão, mais comumente, quebras no cordão simples do DNA (SSBs ou "picotes") e/ou quebras no cordão duplo (DSBs). Os picotes e as DSBs, por sua vez, são reparados pelas células de uma maneira que pode resultar na introdução de pequenos indels ou inser- ções ou deleções maiores em um ou mais sítios alvo no TGFBR?2, de- leções de sequências entre dois sítios alvo no TGFBR2, e/ou inser- ções de sequências (particularmente de sequências exógenas introdu- zidas nas células via oligonucleotídeos do template doador) em sítios do TGFBR?2, ou entre dois sítios alvo no TGFBR2 de uma maneira que substitui uma sequência de DNA celular endógeno entre aqueles sítios alvo. No entanto, em alguns casos, os sistemas de edição de genoma introduzem uma ou mais de uma mutação pontual (por exemplo, via desaminação da cisteína), uma mudança na marcação do DNA (por exemplo, metilação do DNA, acetilação ou desacetilação da histona, ou outras modificações na cromatina), e/ou o recrutamento de fatores trans-atuantes tais como fatores de transcrição. Alternativamente, os sistemas de edição de genoma desta invenção podem associar-se, de maneira durável (por exemplo, durante um intervalo de semanas, me- ses ou mais longos) ou transitória (durante um intervalo de segundos, minutos, horas ou dias), a uma ou mais sequências alvo no TGFBR?2, impedindo a associação a outros fatores (particularmente RNA polime- rases, mas também DNA polimerases, fatores de transcrição, e/ou ou-

tros fatores cis- ou trans-atuantes que influenciam a expressão genéti- ca a sequências alvo no TGFBR2. Estes e outros modos de ação dos sistemas de edição de genoma e seus componentes estão descritos detalhadamente abaixo, sob os títulos "nucleases guiadas por RNA" e "Modificações nucleases guiadas por RNA".

[00121] As sequências alvo no TGFBR2 e as sequências de domí- nios de vetorização do gRNA correspondentes geralmente, mas não necessariamente, ficam localizadas em exons, onde a introdução de um indel pequeno, ou de uma inserção ou deleção maior pode resultar em uma ou mais mutações (por exemplo, uma mutação "frameshift", uma mutação nonsense, a introdução de um códon para um aminoáci- do que rompe a estrutura da proteína circundante, e/ou a remoção de um códon para um aminoácido que é necessária para a atividade da proteína) que reduzem ou eliminam a função da proteína TGFBR2. À Fig. 1 mostra um mapeamento da atividade de corte de vários RNAs guias de S. pyogenes para os locais que eles vetorizam na estrutura de exons do gene de TGFBR?2. Estas mutações são denominadas, ao longo de todo o relatório descritivo, mutações "nocaute", e seu efeito funcional é o "nocaute" da função da proteína TGFBR2.

[00122] Certas sequências alvo no TGFBR2 podem ser considera- das sítios alvo "mancha quente" para as sequências de domínio de vetorização do gRNA. Conforme usado neste pedido, uma "mancha quente" refere-se a um sítio que preferencialmente vetorizado porque produz altas frequências % de indel ou eliminação ou nocaute efeito do gene de TGFBR2. Os gRNAs que vetorizam um ou mais destes sítios preferidos podem produzir frequências % de indel de 30% ou mais. Por exemplo, um sítio alvo preferido no gene de TGFBR2 pode ter domínios de vetorização de gRNA complementar que produzem frequências % de indel de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais. Sítios alvo mancha quente no gene de TGFBR2 estão descritos neste pedido.

[00123] As regiões de mancha quente do TGFBR?2 preferidas estão mostradas na tabela x: Tabela 2: Sítios alvos do TGFBR?2 preferidos Exon do | Sequência FÉ o Exon 3 — | TTAATAACGACATGATAGTCACTGACAACAACGGTGCAGTCAAGT

TTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGA

CAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTG TGAGAAGCCACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATG (SEQ ID NO: 1) Exon 4 GAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTTGCCATGA

CCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTC TCCAAAGTGCATTATGAAGGAAAAAAAAAAGCCTGGTGAGACTTT

CTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAACATCAT CTTCTCAGAAG (SEQ ID NO: 2) Exon 5 AATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAAGT

GACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTG TCATCATCATCTTCTACTGCTACCGCGTTAACCGGCAGCAGAAGC TGAGTTCAACCTGGGAAACCGGCAAGACGCGGAAGCTCATGGAG TTCAGCGAGCACTGTGCCATCATCCTGGAAGATGACCGCTCTGA CATCAGCTCCACGTGTGCCAACAACATCAACCACAACACAGAGC TGCTGCCCATTGAGCTGGACACCCTGGTGGGGAAAGGTCGCTTT GCTGAGGTCTATAAGGCCAAGCTGAAGCAGAACACTTCAGAGCA GTTTGAGACAGTGGCAGTCAAGATCTTTCCCTATGAGGAGTATGC CTCTTGGAAGACAGAGAAGGACATCTTCTCAGACATCAATCTGAA GCATGAGAACATACTCCAGTTCCTGACGGCTGAGGAGCGGAAGA CGGAGTTGGGGAAACAATACTGGCTGATCACCGCCTTCCACGCC AAGGGCAACCTACAGGAGTACCTGACGCGGCATGTCATCAGCTG GGAGGACCTGCGCAAGCTGGGCAGCTCCCTCGCCCGGGGGATT GCTCACCTCCACAGTGATCACACTCCATGTGGGAGGCCCAAGAT GCCCATCGTGCACAGGGACCTCAAGAGCTCCAATATCCTCGTGA AGAACGACCTAACCTGCTGCCTGTGTGACTTTGGGCTTTCCCTG

CGTCTGGACCCTACTCTGTCTGTGGATGACCTGGCTAACAGTGG GCAG (SEQ ID NO: 3)

[00124] As regiões de mancha quente de TGFBR2 particularmente preferidas estão mostradas na tabela 3: SEQ ID NO: 5 ATGAATCTCTTCACTCTAGG SEQ ID NO: 9 TCATAATGCACTTTGGAGAA

[00125] Uma sequência alvo no TGFBR2 pode estar, por exemplo, localizada no exon 3, 4, ou 5 do gene de TGFBR2. Uma sequência do domínio de vetorização do gRNA correspondente a uma sequência alvo no TGFBR?2 presente no exon 3, 4, ou 5 do gene de TGFBR2 po- de compreender uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere em no máximo 1, 2, ou 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096. Por exemplo, porém sem limitação, um domínio de vetorização exemplifi- cativo pode compreender uma sequência de nucleotídeos que é idên- tica a, ou difere em no máximo 1, 2, ou 3 nucleotídeos de uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NOS: 5041; (b) SEQ ID NOS: 5042; (c) SEQ ID NOS: 5047; (d) SEQ ID NOS: 5050; (e) SEQ ID NOS: 5052; (f) SEQ ID NOS: 5092; e g) SEQ ID NOS: 5093.

Tabela 4 — Sequências de vetorização [SED Tseguência devetarização — PAN Texon — 5041 ATTGCACTCATCAGAGCTAC AGG |4 5043 CCAATGAATCTCTTCACTCT AGG | intronic — adjacente a 4

[00126] Como uma alternativa para o nocaute da expressão do TGFBR2, uma região reguladora da transcrição, por exemplo, uma re- gião promotora (por exemplo, uma região promotora que controla a transcrição do gene de TGFBR2) pode ser vetorizada para alterar (por exemplo, eliminar) a expressão do gene. Uma abordagem de elimina- ção vetorizada pode ser mediada por um sistema CRISPR/Cas com- preendendo uma molécula de Cas9 enzimaticamente inativa (eiCas9) ou uma proteína de fusão de eiCas9 (por exemplo, uma eiCas9 fundi- da a um domínio repressor da transcrição ou proteína modificadora da cromatina), descrito neste pedido. Por exemplo, uma ou mais molécu- las de gRNA compreendendo um domínio de vetorização pode ser configurada para vetorizar uma molécula de eiCas9 ou uma proteína de fusão de eiCas9, suficientemente próxima a uma região reguladora da transcrição, por exemplo, uma região promotora (por exemplo, uma região promotora que controla a transcrição do gene de TGFBR2), de modo que a transcrição do gene de TGFBR?2 é reduzida e/ou elimina- da. Em certas modalidades, uma eiCas9 ou uma proteína de fusão de eiCas9 pode ser usada para eliminar a expressão do TGFBR2 em uma célula T, por exemplo, uma célula T humana.

[00127] O nocaute e/ou eliminação do TGFBR2 pode ser avaliada de qualquer maneira adequada, incluindo, sem limitação, o exame da sequência do gene de TGFBR2, avaliação da expressão da proteína de TGFBR2 na superfície das células (por exemplo, por análise imu- noquímica de manchas e classificação das células, particularmente por classificação de células ativadas por fluorescência ou FACS incluindo citometria de fluxo por coloração intracelular indireta), detecção de al- terações celulares ou moleculares mediadas pelo TGFBR2, avaliação do efeito do TGF-B na proliferaçãou ou sobrevivência das células, por análise da mancha ocidental para detectar os níveis de proteína do TGFBR2. Com relação às células T em particular, o nocaute do TGFBR2 também pode ser confirmado (a) sequenciamento do locos do TGFBR2 ou ensaio de extensão do iniciador de T7E1, e/ou (b) ava- liação por FACS intracelular da fosforilação de SMAD2/3. O sequenci- amento e T7E1 estão descritos mais detalhadamente abaixo, enquan- to que ensaios de fosforilação de SMAD2/3 intracelular estão descritos na literatura, por exemplo, by Chen, et al., J. Experimental Med. Volu- me 198, Number 12, December 15, 2003 1875-1886 (cuja íntegra en- contra-se aqui incorporada a título de referência para todos os fins), particularmente na seção Materials & Methods, página 1877 e Figura Suplementar S2.

[00128] O nocaute e/ou eliminação do TGFBR2 pode corresponder a uma redução de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% na expressão do TGFBR2 em relação a uma me- dida basal ou a uma célula do tipo selvagem.

[00129] Em alguns aspectos, as composições e os métodos apre- sentados incluem aqueles nos quais pelo menos ou mais de cerca de 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% das células em uma composição de células na qual fora introduzido um agente (por exemplo, gRNA/Cas9) para nocaute ou rompimento genético de um gene de TGFBR2 contêm o rompimento genético; não expressam o polipeptídio de TGFBR2 endógeno; não contêm um gene de TGFBR2 contíguo, um gene de TGFBR2, e/ou um gene de TGFBR?2 funcional.

Em algumas modalidades, os métodos, as composições e as células de acordo com a presente invenção incluem aqueles nos quais pelo menos ou mais de cerca de 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% das células em uma composição de células na qual fora introduzido um agente (por exemplo, gRNA/Cas9) para nocaute ou rompimento genético de um gene de TGFBR2 não expressam um po- lipeptídio de TGFBR2, tal como na superfície das células. Em algumas modalidades, pelo menos or greater than cerca de 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% das células em uma composição de células na qual fora introduzido um agente (por exemplo, gRNA/Cas9) para nocaute ou rompimento genético de um gene de TGFBR2 são nocauteados em ambos os alelos, isto é, compreendem uma deleção bialélica, em tal percentagem de células.

[00130] Sistemas de edição de genoma vetorizando TGFBR2 po- dem ser executados de diversas maneiras, e sua execução pode ser ajustada ao cenário no qual as células serão editadas. Certas modali- dades desta invenção envolvem a distribuição de nucleases guiadas por RNA e RNAs guias vetorizando o TGFBR2 para células ex vivo na forma de complexos de ribonucleoproteínas (RNP) por meio de eletro- poração, por exemplo, usando eletroporadores e cubetas disponíveis em fornecedres comerciais tais como MaxCyte (Gaithersburg, MD) ou Lonza (Basel, Switzerland). Outras modalidades, no entanto, podem executar vetores de ácidos nucleicos in vivo, tais como vetores virais ou nanopartículas lipídicas, seja para edição in vivo ou ex vivo. Deta- lhes destas execuções estão descritos mais detalhadamente abaixo, sob o título "Execução de sistemas de edição de genoma".

[00131] O nocaute ou eliminação do TGFBR2 também pode ser útil em diversos cenários, incluindo, sem limitação, no contexto de terapia adaptiva com células T. De acordo com certas modalidades desta in- venção, o TGFBR2 é nocauteado em uma célula imune, tal como uma célula T, que será usada em terapia. Como um exemplo, a célula T pode expessar um receptor geneticamente manipulado tal como um receptor de antígenos quimérico (CAR) ou um receptor de células T heterólogo (TCR), podendo este receptor ser configurado para reco- nhecer um antígeno em uma célula ou tecido que está envolvido em uma patologia tal como um tumor. Se elas expressam ou não receptor geneticamente manipulado, as células T de TGFBR2 nocauteado de acordo com a presente invenção podem ser empregadas na vetoriza- ção de um tecido ou órgão no qual o TGF-f está presente em quanti- dades suficientes para reduzir a proliferação ou a atividade de células T expressando TGFBR?2.

[00132] Células de TGFBR2 nocauteado e/ou eliminado podem ser empregadas em terapia celular "autóloga", nas quais as células são coletadas de um indivíuo, alteradas para nocautear ou eliminar a ex- pressão do TGFBR?2, e então devolvidas para o mesmo indivíduo; al- ternativamente, estas células podem ser administradas a um indivíduo diferente em terapia celular "alogênica". Em qualquer uma das abor- dagens, entre a coleta e administração as células de TGFBR?2 desta invenção podem ser manipuladas de diversas maneiras, tal como elas podem expandidas, estimuladas, purificadas ou classificadas, transdu- zidas com um transgene, congeladas e/ou descongeladas.

[00133] O nocaute ou eliminação da presença do gene de TGFBR2 descrito neste pedido pode: (1) aumentar a proliferação de células T; (2) aumentar a sobrevivência das células T; e/ou (3) melhorar a função das células T. O nocaute da expressão do gene de TGFBR2 descrito neste pedido pode igualmente: (1) aumentar a proliferação de células T; (2) aumentar a sobrevivência das células T; e/ou (3) melhorar a fun- ção das células T. Sistemas de edição de genoma

[00134] O termo "sistema de edição de genoma" refere-se a qual-

quer sistema que tenha atividade de edição de DNA guiada por RNA. Os sistemas de edição de genoma da presente invenção incluem pelo menos dois componentes adaptados de sistemas CRISPR de ocorrên- cia natural: um RNA guia (gRNA) e uma nuclease guiada por RNA. Estes dois componentes formam um complexo que é capaz de se as- sociar uma sequência de ácidos nucleicos específica e editar o DNA naquela sequência de ácidos nucleicos ou em torno da mesma, por exemplo, criando uma ou mais dentre uma quebra no cordão simples (um SSB ou picote), uma quebra no cordão duplo (um DSB) e/ou uma mutação pontual. Em certas modalidades, a quebra no cordão duplo ou no cordão simples está a cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cerca de 25bp, ou cerca de 10bp de uma posição alvo no TGFBR2, induzindo assim uma alteração na expressão do gene de TGFBR?2.

[00135] Sistemas CRISPR de ocorrência natural são organizados em termos de evolução em duas classes e cinco tipos (Makarova et al. Nat Rev Microbiol. 2011 Jun; 9(6): 467477 (Makarova), aqui incorpo- rado a título de referência), e embora os sistemas de edição de geno- ma da presente invenção possam adaptar componentes de qualquer tipo ou classe de sistema CRISPR de ocorrência natural, as modalida- des apresentadas neste pedido geralmente são adaptadas de siste- mas CRISPR Classe 2, e tipo Il ou V. Os sistemas da Classe 2, que abrangem os tipos |l e V, são caracterizados por proteínas nucleases guiadas por RNA relativamente grandes e de múltiplos domínios (por exemplo, Cas9 ou Cpf1) e uma ou mais RNAs guias (por exemplo, um crRNA e, opcionalmente, um tracrRNA) que formam complexos de ri- bonucleoproteínas (RNP) que se associam (isto é, vetorizam) e clivam locos específicos de clivagem complementares à sequência de vetori- zação (ou espaçadora) do crRNA. Os sistemas de edição de genoma de acordo com a presente invenção semelhantemente vetorizam e edi- tam sequência de DNA celular, mas diferem significativamente dos sis- temas CRISPR que ocorrem na natureza. Por exemplo, os RNAs guias unimoleculares descritos neste pedido não ocorrem na natureza, e tan- to os RNAs guias quanto as nucleases guiadas por RNA de acordo com esta invenção podem incorporar qualquer número de modifica- ções de ocorrência não natural.

[00136] Os sistemas de edição de genoma podem ser executados (por exemplo, administrados ou distribuídos para uma célula ou para um indivíduo) de diversas maneiras, e diferentes execuções podem ser adequadas para aplicações distintas. Por exemplo, um sistema de edição de genoma é executado, em certas modalidades, como um complexo de proteína/RNA (uma ribonucleoproteína, ou RNP), que pode estar incluído em uma composição farmacêutica que opcional- mente inclui um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um agente encapsulante, tal como uma micro- ou nano-partícula lipídica ou poli- mérica, uma micela, um lipossoma, etc. Em certas modalidades, um sistema de edição de genoma é executado como um ou mais ácidos nucleicos codificando a nuclease guiada por RNA eos componentes do RNA guia descritos acima (opcionalmente com um ou mais componen- tes adicionais); em certas modalidades, o sistema de edição de geno- ma é executado como um ou mais vetores compreendendo tais ácidos nucleicos, por exemplo, um vetor viral tal como um vírus adeno- associado; e em certas modalidades, o sistema de edição de genoma é executado como uma combinação de quaisquer dos acima. Execu- ções adicionais ou modificadas que operam de acordo com os princí- pios apresentados neste pedido ficarão evidentes para o especialista na técnica e estão dentro do escopo desta invenção.

[00137] Deve-se observar que os sistemas de edição de genoma da presente invenção podem ser vetorizados para uma única sequência de nucleotídeos específica, ou podem ser vetorizados para - e capa- zes de paralelamente editar - duas ou mais sequências de nucleotí- deos específicas através do uso dois ou mais RNAs guias. O uso de múltiplos gRNAs é chamado de "multiplexação" em todo este relatório descritivo, e pode ser empregado para vetorizar múltiplas sequências alvo não relacionadas de interesse, ou para formar múltiplos SSBs ou DSBs em um únic domínio alvo e, em alguns casos, para gerar edi- ções específicas em tal domínio alvo. Por exemplo, a Publicação de Patente Internacional Nº WO 2015/138510 concedida a Maeder et al. (Maeder), que se encontra aqui incorporada a título de referência, des- creve um sistema de edição de genoma para corrigir uma mutação pontual (C.2991+1655A para G) no gene CEP290 humano que resulta na criação de um sítio de emenda críptico, que, por sua vez, reduz ou elimina a função do gene. O sistema de edição de genoma de Maeder utiliza dois RNAs guias vetorizados para sequências em qualquer lado (isto é, flanqueand) da mutação pontual, e forma DSBs que flanqueiam a mutação. Isto, por sua vez, promove a deleção da sequência inter- veniente, inclusive a mutação, eliminando assim o sítio de emenda críptico e restaurando a função normal do gene.

[00138] “Como um exemplo, o documento WO 2016/073990 conce- dido a Cotta-Ramusino, et al. ("Cotta-Ramusino"), aqui incorporado a título de referência, descreve um sistema de edição de genoma que utiliza dois gRNAs em combinação com uma nicase Cas9 (uma Cas9 que faz um picote no cordão simples tal como D10A de S. pyogenes), um arranjo denominado "sistema de nicase dupla". O sistema de nica- se dupla de Cotta-Ramusino é configurado para fazer dois picotes em cordões opostos de uma sequência de interesse que são deslocados por uma ou mais moléculas, sendo que estes picotes se combinam para criar uma quebra no cordão duplo tendo uma saliência (5' no ca- so de Cotta-Ramusino, embora saliências 3' também sejam possíveis).

A saliência, por sua vez, em algumas circunstâncias, pode facilitar eventos de reparo direcionados pela homologia. E, como um outro exemplo, o documento WO 2015/070083 concedido a Palestrant et al. ("Palestrant," aqui incorporado a título de referência) descreve um gRNA vetorizado para uma sequência de nucleotídeos codificando Cas9 (denominada "RNA governante"), que pode ser incluída em um sistema de edição de genoma compreendendo um ou mais gRNAs adicionais para permitir a expressão transitória de uma Cas9 que, do contrário, poderia ser constitutivamente expressa, por exemplo, am alguns células transduzidas de forma viral. Estas aplicações de multi- plexação destinam-se a ser exemplificativas, e não limitativos, e o es- pecialista na técnica vai perceber que outras aplicações de multiplexa- ção geralmente são compatíveis com os sistemas de edição de geno- ma descritos neste pedido.

[00139] Os sistemas de edição de genoma podem, em alguns ca- sos, formar quebras no cordão duplo que são reparadas por mecanis- mos de quebra do cordão duplo de DNA celular tais como NHEJ ou HDR. Estes mecanismos estão descritos em toda a literatura, por exemplo, por Davis & Maizels, PNAS, 111(10):E924-932, March 11, 2014 (Davis) (que descrevem AIt-HDR); Frit et al. DNA Repair 17(2014) 81-97 (Frit) (que descrevem AIt-NHEJ); e lIyama and Wilson Ill, DNA Repair (Amst.) 2013-Aug; 12(8): 620-636 (lIyama) (que des- crevem, de modo geral, vias canônicas de HDR e de NHEJ).

[00140] Onde os sistemas de edição de genoma operam formando DSBs, tais sistemas incluem opcionalmente um ou mais componentes que promovem ou facilitam um modo particular de reparo da quebra de cordão duplo ou um resultado de reparo particular. Por exemplo, Cot- ta-Ramusino também descreve sistemas de edição de genoma nos quais um "template doador" de oligonucleotídeo de cordão simples é adicionado; o template doador sendo incorporado em uma região alvo do DNA celular que é clivado pelo sistema de edição de genoma, e pode resultar em uma alteração na sequência alvo.

[00141] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma modificam uma sequência alvo, ou modificam a expressão de um gene na sequência alvo ou perto da mesma, sem provocar quebras no cor- dão simples ou no cordão duplo. Por exemplo, um sistema de edição de genoma pode incluir uma nuclease guiada por RNA fundida a um domínio funcional que age no DNA, dessa forma modificando a se- quência alvo ou sua expressão. Como um exemplo, uma nuclease guiada por RNA pode ser conectada (por exemplo, fundida) a um do- mínio funcionnal citidina desaminase, e pode operar gerando substitui- ções C-por-A vetorizadas. Fusões de nuclease/desaminase exemplifi- cativas estão descritas em Komor et al. Nature 533, 420424 (19 May 2016) ("Komor"), que se encontra aqui incorporado a título de referên- cia. Alternativamente, um sistema de edição de genoma pode utilizar uma nuclease inativada por clivagem (isto é, "morta"), tal como uma Cas9 morta (dCas9), e pode operar formando complexos estáveis em uma ou mais porções vetorizadas do DNA celular, dessa form interfe- rindo em funções que envolvem as regiões vetorizdas incluindo, sem limitação, transcrição de MRNA, remodelagem da cromatina, etc. Moléculas de RNA quia (GRNA)

[00142] Os termos "RNA guia" e "gRNA'" referem-se a qualquer áci- do nucleico que promova a associação específica (ou "vetorização") de uma nuclease guiada por RNA tal como uma Cas9 ou uma Cpf1 para uma sequênci alvo tal como uma sequência genômica ou epissômica em uma célula. Os gRNAs podem ser unimoleculares (compreenden- do uma única molécula de RNA, também chamada, alternativamente, de quimérica), ou modular (compreendendo mais de uma, e tipicamen- te duas, moléculas de RNA separadas, tal como um crRNA e um tracr»RNA, que usualmente são associados um ao outro, por exemplo,

por duplexação). Os gRNAs e suas partes componentes estão descri- tos em toda a literatura, por exemplo, em Briner et al. (Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014 (Briner), que se encontra aqui incor- porado a título de referência), e em Cotta-Ramusino.

[00143] Nas bactérias e arqueias, os sistemas CRISPR tipo |l ge- ralmente compreendem uma proteína nuclease guiada por RNA tal como Cas9, um CRISPR RNA (crRNA) que inclui uma região 5' que é complementar a uma sequência estranha, e um crRNA trans-ativante (tracrRNA) que inclui uma região 5' que é complementar a, e forma um dúplex com, uma região 3' do cr»RNA. Embora sem desejarmos nos ater a qualquer teoria, acreditamos que este dúplex facilite a formação - e seja necessário para a atividade - do complexo de Cas9/gRNA. Como os sistemas CRISPR tipo 1l foram adaptados para uso na edição de genes, descobriu-se que o crRNA e o tracrRNA poderiam ser uni- dos em um único RNA guia unimolecular ou quimérico, em um exem- plo não limitativo, por meio de uma sequência "tetra-alça" ou "ligadora" de quatro nucleotídeos (por exemplo, GAAA) fazendo a ligação das regiões complementares do crRNA (em sua extremidade 3') e do tracr»RNA (em sua extremidade 5'). (Mali et al. Science. 2013 Feb 15; 339(6121): 823—-826 ("Mali"); Jiang et al. Nat Biotechnol. 2013 Mar; 31(3): 233—239 ("Jiang"); e Jinek et al., 2012 Science Aug. 17; 337(6096): 816-821 ("Jinek"), todos aqui incorporados a título de refe- rência.)

[00144] Os RNAs guias, sejam eles unimoleculares ou modulares, incluem um "domínio de vetorização" que é totalmente ou parcialmente complementar a um domínio alvo em uma sequência alvo, tal como uma sequência de DNA no genoma de uma célula na qual se deseja a edição. Os domínios de vetorização possuem vários nomes na literatu- ra, incluindo, sem limitação, "sequências guias" (Hsu et al., Nat Bio- technol. 2013 Sep; 31(9): 827—832, ("Hsu"), aqui incorporado a título de referência), "regiõês de complementaridade" (Cotta-Ramusino), "espaçadores" (Briner) e genericamente "crRNAs" (Jiang). Indepen- dentemente dos nomes que eles recebem, os domínios de vetorização tipicamente têm 10-30 nucleotídeos de comprimento, e em certas mo- dalidades eles têm 16-24 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 our 24 nucleotídeos de comprimento), e ficam no terminal 5' ou perto do mesmo no caso de um gRNA de Cas9, e no terminal 3' ou perto do mesmo no caso de um gRNA de Cpf1.

[00145] Além dos domínios de vetorização, os gRNAs tipicamente (mas não necessariamente, como discutido abaixo) incluem uma plu- ralidade de domínios que podem influenciar a formação ou a atividade dos complexos de gRNA/Cas9. Por exemplo, como mencionado aci- ma, a estrutura de dúplex formada por um primeiro e um segundo do- mínios de complementaridade de um gRNA (também denominado dú- plex de repetição:antirrepetição) interage com o lobo de reconheci- mento (REC) da Cas9 e pode mediar a formação de complexos de Cas9/gRNA. (Nishimasu et al., Cell 156, 935-949, February 27, 2014 (Nishimasu 2014) e Nishimasu et al., Cell 162, 1113-1126, August 27, 2015 (Nishimasu 2015), ambos aqui incorporados a título de referên- cia). Deve-se observar que o primeiro e/ou o segundo domínio de complementaridade podem conter uma ou mais extensões poli-A, que podem ser reconhecidos por RNA polimerases como um sinal de tér- mino. A sequência do primeiro e do segundo domínios de complemen- taridade são, portanto, opcionalmente modificados para eliminar estas extensões e promover a transcrição in vitro completa dos gRNAs, por exemplo, pelo uso de permutas A-G como descrito em Briner, ou per- mutas A-U. Estas e outras modificações similares no primeiro e no se- gundo domínios de complementaridade estão dentro do escopo da presente invenção.

[00146] Juntocomo primeiro e o segundo domínios de complemen- taridade, os gRNAs de Cas9 incluem tipicamente duas ou mais regiões duplexadas adicionais que estão envolvidas na atividade de nuclease in vivo, mas não necessariamente in vitro. (Nishimasu 2015). Uma primeira alça-tronco na posição 3' do segundo domínio de complemen- taridade é chamada indiscriminadamente de "domínio proximal" (Cotta- Ramusino), "alça tronco 1" (Nishimasu 2014 and 2015) e "nexus" (Bri- ner). Uma ou mais estruturas de alça tronco adicionais geralmente es- tão presentes perto da extremidade 3' do gRNA, com o número vari- ando de acordo com a espécie: os gRNAs de s. pyogenes tipicamente incluem duas alças tronco 3' (para um total de quatro estruturas de al- ça tronco incluindo o dúplex repetição:antirrepetição), ao passo que s. aureus e outras espécies possuem apenas uma (para um total de três estruturas de alça tronco). Uma descrição de estruturas de alça tronco conservadas (e estruturas de gRNA de forma mais geral) orgnizads por espécie está apresentgada em Briner.

[00147] Embora a descrição precedente tenha focado em gRNAs para uso com Cas9, deve-se observar que já foram (ou podem vir a ser, no futuro,) descobertas ou inventadas outras nucleases guiadas por RNA que utilizam gRNAs que diferem de algumas formas daqueles descritas até hoje. Por exemplo, a Cpf1 ("CRISPR de Prevotella e Franciscella 1") é uma nuclease guiada por RNA recentemente desco- berta que não requer um tracrRNA para funcionar. (Zetsche et al, 2015, Cell 163, 759—771 October 22, 2015 (Zetsche |), aqui incorpora- do a título de referência). Um gRNA para uso em um sistema de edi- ção de genoma de Cpf1i geralmente inclui um domínio de vetorização e um domínio de complementaridade (alternativamente denominado "punho"). Deve-se observar também que, nos gRNAs para uso com Cpf1, o domínio de vetorização usualmente está presente na extremi- dade 3' ou perto da mesma, e não na extremidade 5º como descrito acima em relação aos gRNAs de Cas9 (o punho fica na extremidade 5' ou perto da mesma de um gRNA de Cpf1).

[00148] Os especialistas na técnica vão perceber que, embora pos- sam existir diferenças estruturais entre os gRNAs das diferentes espé- cies procarióticas, ou entre os gRNAs da Cpf1 e da Cas9, os princípios pelos quais os gRNAs operam geralmente são compatíveis. Por causa desta compatilbilidade de operação, os gRNAs podem ser definidos, em termos amplos, pelas sequências de seus domínios de vetoriza- ção, e os especialistas na técnica vão perceber que uma sequência de um dado domínio de vetorização pode ser incorporada em gRNA ade- quado, incluindo um gRNA unimolecular ou quimérico, ou um gRNA que inclui uma ou mais modificações químicas e/ou modificações se- quenciais (substituições, nucleotídeos adicionais, truncamentos, etc.). Assim sendo, a título de concisão de apresentação nesta descrição, os gRNAs podem ser descritos exclusivamente em termos das sequên- cias de seus domínios de vetorização.

[00149] De um modo mais geral, os especialistas na técnica vão perceber que alguns aspectos da presente invenção referem-se a sis- temas, métodos e composições que podem ser executados com o uso de múltiplas nucleases guiadas por RNA. Por isso, a menos que espe- cificado em contrário, o termo gRNA deve ser entendido como abran- gendo qualquer gRNA adequado que possa ser usado com qualquer nuclease guiada por RNA, e não apenas os gRNAs que são compatí- veis com uma espécie específica de Cas9 ou Cpf1. A título ilustrativo, o termo gRNA pode, em certas modalidades, incluir um gRNA para uso com qualquer nuclease guiada por RNA que ocorre em um siste- ma CRISPR Classe 2, tal como o sistema CRISPR tipo Il ou tipo V, ou uma nuclease guiada por RNA derivada ou adaptada do mesmo.

[00150] A Tabela2, abaixo, apresenta gRNAs exemplificativos para vetorizar o TGFBR2 com uma Cas9 de S. pyogenes.

Tabela 5.

[00151] “Métodos para seleção e validação de sequências alvo as- sim como análises fora do alvo já foram descritos anteriormente, por exemplo, em Mali; Hsu; Fu et al., 2014 Nat Biotechnol 32(3): 279-84, Heigwer et al., 2014 Nat methods 11(2):122-3; Bae et al. (2014) Bioin- formatics 30(10): 1473-5; e Xiao A et al. (2014) Bioinformatics 30(8): 1180-1182. Cada uma destas referências está aqui incorporada a título de referência. Como um exemplo não limitativo, o desenho do gRNA pode envolver o uso de uma ferramenta de para otimizar a escolha das possíveis sequências alvo correspondentes a uma sequência alvo do usuário, por exemplo, para minimizar a atividade fora do alvo total atra- vés do genoma. Embora a atividade fora do alvo não esteja limitada à clivagem, a eficiência de clivagem em cada sequência fora do alvo pode ser prevista, por exemplo, usando um esquema de ponderação deriva- do experimentalmente. Estes e outros métodos de seleção guia estão detalhadamente descritos em Maeder and Cotta-Ramusino. Modificações do gRNA

[00152] A atividade, a estabilidade, ou outras características dos gRNAs podem ser alteradas pela incorporação de determinadas modi- ficações. Como um exemplo, os ácidos nucleicos expressos ou distriu- bídos de forma transitória podem ser propensos à degradação, por exemplo, por nucleases celulares. Por conseguinte, os gRNAs descri- tos neste pedido podem conter um ou mais nucleosídeos ou nucleotí- deos modificados que introduzem estabilidade para as nucleases. Em- bora sem desejarmos nos ater à teoria, também se acredita que certos gRNAs modificados descritos neste pedido podem apresentar uma resposta imunológica inata reduzida quando introduzidos nas células. Os especialistas na técnica têm conhecimento de algumas respostas celulares comumente observadas em células, por exemplo, em células de mamífero, em resposta a ácidos nucleicos exógenos, particular- mente aqueles de origem viral ou bacteriana. Tais respostas, que po- dem incluir a indução da expressão e a liberação e a morte celular de citocinas, podem ser reduzidas ou eliminadas conjuntamente pelas modificações apresentadas neste pedido.

[00153] Algumas modificações exemplificativas discutidas nesta se- ção podem ser incluídas em qualquer posição em uma sequência de gRNA incluindo, sem limitação, na extremidade 5' ou perto da mesma (por exemplo, em 1-10, 1-5, ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 5") e/ou na extremidade 3' ou perto da mesma (por exemplo, em 1-10, 1- 5, ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 3"). Em alguns casos, as modi- ficações são posicionadas em motivos funcionais, tais como o dúplexo repetição-antirrepetição de um gRNA de Cas9, uma estrutura de alça tronco de um gRNA de Cas9 ou de Cpf1, e/ou um domínio de vetori- zação de um gRNA.

[00154] Como um exemplo, a extremidade 5' de um gRNA pode incluir uma estrutura de capuz ou análogo de capuz de mRNA eucarió- tico (por exemplo, um análogo de capuz G(5)ppp(5)G, análogo de ca- puz m7G(5)ppp(5)G, ou um análogo de capuz anti-reverso (ARCA) 3”- O-Me-m7G(5)ppp(5)G), como mostrado abaixo: LP dota, ae NOS ' aco En QE DP 00%, . em le — à Ss Ss Ki 3 Tor * à Sa OH DOHz | SA

[00155] O capuz ou análogo de capuz pode ser incluído seja duran- te a síntese química ou durante a transcrição in vitro do gRNA.

[00156] Em linhas similares, a extremidade 5' do gRNA pode ter um grupo 5' trifosfato ausente. Por exemplo, gRNAs transcritos in vitro po- dem ser tratados com fosfatase (por exemplo, usando fosfatase alcali- na intestinal bezerro) para remover um grupo 5' trifosfato.

[00157] Uma outra modificação comum envolve a adição, na extremi- dade 3' de um gRNA, de uma pluralidade (por exemplo, 1-10, 10-20, ou 25-200) de resíduos adenina (A) chamados extensões de poliA. A exten-

são de poliA pode ser acrescentada a um gRNA durante a síntese quími- ca, acompanhada por transcrição in vitro usando uma poliadenosina po- limerase (por exemplo, Poli(A)Polimerase de E. coli), in vivo por meio de uma sequência de poliadenilação, como descrito em Maeder.

[00158] Deve-se observar que as modificações descritas neste pe- dido podem ser combinadas de qualquer maneira adequada, por exemplo, um gRNA, seja transcrito in vivo a partir de um vetor de DBA, seja um gRNA transcrito in vitro, pode incluir tanto uma estrutura de capuz ou análogo de capuz 5' quanto uma extensão de poliA 3.

[00159] Os RNAs guias podem ser modificados em uma U ribose 3' terminal. Por exemplo, os dois grupos hidroxila terminais da U ribose podem ser oxidados para grupos aldeído e uma concomitante abertura do anel de ribose para dar um nucleosídeo modificado como mostrado abaixo:

U a 8 4 em que "U" pode ser uma uridina não modificada ou modificada.

[00160] AU ribose 3' terminal pode ser modificada com um 2'3' fos- fato cíclico como mostrado abaixo: Ho. U O. Ê&

A o Do em que "U" pode ser uma uridina não modificada ou modificada.

[00161] Os RNAs guias podem conter 3' nucleotídeos que podem ser estabilizados contra degradação, por exemplo, pela incorporação de um ou mais dos nucleotídeos modificados descritos neste pedido.

Em certas modalidades, as uridinas podem ser substituídas por uridi- nas modificadas, por exemplo, 5-(2-amino)propil uridina, e 5-bromo uridina, ou por qualquer uma das uridinas modificadas descritas neste pedido; as adenosinas e guanosinas podem ser substituídas por ade- nosinas e guanosinas modificadas, por exemplo, com modificações na posição 8, por exemplo, 8-bromo guanosina, ou por qualquer uma das adenosinas ou guanosinas modificadas descritas neste pedido.

[00162] Em certas modalidades, ribonucleotídeos de açúcar modifi- cado podem ser incorporados no gRNA, por exemplo, onde o grupo 2' OH-é substituído por um grupo selecionado dentre H, -OR, -R (em que R pode ser, por exemplo, alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroari- la ou açúcar), halo, -SH, -SR (em que R pode ser, por exemplo, alqui- la, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar), amino (em que o aminoácido pode ser, por exemplo, NH>z; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, di-heteroarilamino, ou aminoácido); ou ciano (-CN). Em certas modalidades, o esqueleto de fosfato pode ser modificado como descrito neste pedido, por exem- plo, com um grupo fosfotioato (PhTx). Em certas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos do gRNA podem ser independentemente um nucleotídeo modificado ou não modificado incluindo, porém sem limi- tação, modificado com 2'-açúcar, tal como, modificado com 2'-O- metila, 2'-O-metoxietila, ou 2'-fluoro incluindo, por exemplo, 2'-F ou 2"- O-metila, adenosina (A), 2-F ou 2'-O-metila, citidina (C), 2-F ou 2-O- metila, uridina (U), 2'-F ou 2'-O-metila, timidina (T), 2-F ou 2'-O-metila, guanosina (G), 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-O-metoxietila- denosina (Aeo), 2'-O-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo), e quaisquer combinações dos mesmos.

[00163] Os RNAs guias também podem incluir ácidos nucleicos "trancados" (LNA) nos quais o grupo 2' OH pode ser conectado, por exemplo, por uma ponte C1-6 alquileno ou C1-6 heteroalquileno, ao carbono 4' do mesmo açúcar ribose. Qualquer porção adequada pode ser usada para fornecer tais pontes, incluindo, sem limitação, pontes de metileno, propileno, éter, ou amino; O-amino (onde o amino pode ser, por exemplo, NH>2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilami- no, diarilamino, heteroarilamino, ou di-heteroarilamino, etilenodiamina, ou poliamino) e aminoalcóxi ou O(CH2)n-amino (onde o amino pode ser, por exemplo, NH>z; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilami- no, diarilamino, heteroarilamino, ou diheteroarilamino, etilenodiamina, ou poliamino).

[00164] Em certas modalidades, um gRNA pode incluir um nucleo- tídeo modificado que é multicíclico (por exemplo, triciclo; e formas "destrancadas", tal como glicol ácido nucleico acid (GNA) (por exem- plo, R-GNA ou S-GNA, onde a ribose é substituída por unidades glicol presas a ligações fosfodiéster), ou treose ácido nucleico (TNA, onde a ribose é substituída por a-L-treofuranosil-(3'2')).

[00165] Geralmente, os gRNAs incluem o grupo açúcar ribose, que é um anel de 5 membros tendo um oxigênio. gRNAs modificados exemplificativos podem incluir, porém sem limitação, a substituição do oxigênio na ribose (por exemplo, por enxofre (S), selênio (Se), ou al- quileno, tal como, por exemplo, metileno ou etileno); a adição de uma ligação dupla (por exemplo, para substituir a ribose por ciclopentenil ou ciclo-hexenil); a contração do anel de ribose (por exemplo, para formar um anel de 4 membros de ciclobutano ou oxetano); a expansão do anel de ribose (por exemplo, para formar um anel de 6 ou 7 membros tendo um carbono ou heteroátomo adicional, tal como, por exemplo, anidro-hexitol, altritol, manitol, ciclo-hexanil, ciclo-hexenil, e morfolino que também possui um esqueleto de fosforamidato). Embora a maioria das alterações do análogo de çúcar fiquem localizadas na posição 2', outros sítios são passíveis de modificação, incluindo a posição 4'. Em certas modalidades, um gRNA compreende uma modificação 4'-S, 4"-

Se ou uma modificação 4'-C-aminometil-2'-O-Me.

[00166] Em certasmodalidades, desaza nucleotídeos, por exemplo, 7-desaza-adenosina, podem ser incorporados no gRNA. Em certas modalidades, nucleotídeos O- e N-alquilados, por exemplo, N6-metil adenosina, podem ser incorporados no gRNA. Em certas modalidades, um ou mais ou todos os nucleotídeos em um gRNA são desoxinucleo- tídeos. Nucleases guiadas por RNA

[00167] As nucleases guiadas por RNA de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, nucleases CRISPR Classe 2 de ocorrência natural tal como Cas9 e Cpf1, asssim como outras nu- cleases derivadas ou obtidas das mesmas. Em termos funcionais, nu- cleases guiadas por RNA são definidas como nucleases que: (a) inte- ragem (por exemplo, complexam com) um gRNA; e (b) junto com o gRNA, se associam, e opcionalmente clivam ou modificam uma região alvo de um DNA que inclui (i) uma sequência complementar ao domí- nio de vetorização do gRNA e, opcionalmente, (ii) uma sequência adi- cional chamada "motivo adjacente ao protoespaçador", ou "PAM," que está descrito mais detalhadamente abaixo. Como será ilustrado pelos exemplos a seguir, nucleases guiadas por RNA podem ser definidas, em termos amplos, pela especificidade de seu PAM e atividade de cli- vagem, ainda que possam existir variações entre as nucleases guia- das por RNA individuais que compartilham a mesma especificidade de PAM ou atividade de clivagem. Os especialistas na técnica vão perce- ber que alguns aspectos da presente invenção referem-se a sistemas, métodos e composições que podem ser executados com a ajuda de qualquer nuclease guiada por RNA adequada que tenha uma certa especificidade de PAM e/ou atividade de clivagem. Por isso, a menos que especificado em contrário, o termo nuclease guiada por RNA deve ser entendido como um termo genérico, e não limitado a qualquer tipo

(por exemplo, Cas9 vs. Cpf1), espécie (por exemplo, S. pyogenes vs. S. aureus) ou variação (por exemplo, comprimento integral vs. trunca- da ou dividida; especificidade de PAM de ocorrência natural vs. espe- cificidade de PAM geneticamente manipulada, etc.) particular da nu- clease guiada por RNA.

[00168] A sequência do PAM tem seu nome a partir de uma relação sequencial com a sequência do "protoespaçador" que é complementar aos domínios de vetorização (ou "espaçadores") do gRNA. Junto com as sequências do protoespaçador, as sequências do PAM definem re- giões ou sequências alco para combinações de nuclease guiada por RNA / gRNA.

[00169] Várias nucleases guiadas por RNA podem requerer rela- ções sequenciais diferentes entre PAMs e protoespaçadores.

[00170] Além das orientações sequenciais reconhecimento-especií- ficas dos PAMs e protoespaçadores, as nucleases guiadas por RNA também podem reconhecer sequências específicas de PAM. A Cas9 de S. aureus, por exemplo, reconhece uma sequência de PAM de NNGRRT ou NNGRRV, na qual os resíduos N ficam imediatamente 3' da região reconhecida pelo domínio de vetorização do gRNA. A Cas9 de S. pyogenes reconhece a sequência NGG do PAM. E a Cpf1 de F. novicida reconhece uma sequência TTN do PAM. Sequências de PAM já foram identificadas por uma variedade de nucleases guiadas por RNA, e uma estratégia para identificar sequências de PAM novas já foi descrita por Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385—397, No- vember 5, 2015. Deve-se observar que nucleases guiadas por RNA geneticamente manipuladas pode ter especificidades de PAM que dife- rem das especificidades de PAM das moléculas de referência (por exemplo, no caso de uma nuclease guiada por RNA geneticamente manipulada, a molécula de referência pode ser a variante de ocorrên- cia natural da qual a nuclease guiada por RNA é derivada, ou a varian-

te de ocorrência natural que tem a maior homologia de sequência de aminoácidos com a nuclease guiada por RNA geneticamente manipu- lada).

[00171] Além de sua especificidade de PAM, as nucleases guiadas por RNA podem ser caracterizadas por sua atividade de clivagem do DNA: as nucleases guiadas por RNA de ocorrência natural tipicamente formam DSBs nos ácidos nucleicos alvo, mas foram produzidas vari- antes geneticamente manipuladas que geram apenas SSBs (discutido acima) Ran & Hsu, et al., Cell 154(6), 1380—1389, September 12, 2013 (Ran), aqui incorporado a título de referência), ou que simplesmente não se dividem. Cas9

[00172] As estruturas cristalinas para a Cas9 de S. pyogenes (Jinek 2014), e para a Cas9 de S. aureus em complexo com um RNA guia unimolecular e um DNA alvo já foram determinadas (Nishimasu 2014; Anders 2014; e Nishimasu 2015).

[00173] Uma proteína Cas9 de ocorrência natural compreende dois lobos: um lobo de reconhecimento (REC) e um lobo de nuclease (NUC); sendo que cada um compreende domínios estruturais e/ou funcionais particulares. O lobo REC compreende um domínio de hélice de transposição (BH) rico em arginina, e pelo menos um domínio REC (por exemplo, um domínio REC1 e, opcionalmente, um domínio REC2). O lobo REC não compartilha semelhanças estruturais com outras pro- teínas conhecidas, indicando que ele é um domínio funcional único. Embora sem desejarmos nos ater a qualquer teoria, as análises muta- cionais sugerem papéis funcionais específicos para os domínios BH e REC: o domínio BH parece desempenhar um papel no reconhecimen- to de gRNA:DNA, ao passo que se acredita que o domínio REC inte- rage com dúplex repetição:antirrepetição do gRNA e medeia a forma- ção do complexo de Cas9/gRNA.

[00174] O lobo NUC compreende um domínio RuvC, um domínio HNH, e um domínio que interage com PAM (PI). O domínio RuvC compartilha semelhanças estruturais com membros da superfamília da integrase retroviral e cliva o cordão não complementar (isto é, inferior) do ácido nucleico alvo. Ele pode ser formado a partir de dois ou mais motivos RuvC dividido (tais como RuvC |, RuvCll, e RuvClll em s. pyogenes e s. aureus). O domínio HNH, entretanto, é estruturalmente similar aos motivos HNN endonuclease, e cliva o cordão complemen- tar (isto é, superior) do ácido nucleico alvo. O domínio PI, como seu nome sugere, contribuir para a especificidade do PAM.

[00175] Embora algumas funções da Cas9 estejam associadas (mas não sejam necessariamente totalmente determinadas) aos domí- nios específicos apresentados acima, estas e outras funções podem ser mediadas ou influenciadas por outros domínios da Cas9, ou por múltiplos domínios em qualquer um dos lobos. Por exemplo, na Cas9 de S. pyogenes, como descrito em Nishimasu 2014, o dúplex repeti- ção:antirrepetição do gRNA cai em um sulco entre os lobos REC e NUC, e os nucleotídeos no dúplex interagem com os aminoácidos nos domínios BH, PI, e REC. Alguns nucleotídeos na estrutura da primeira alça tronco também interage com os aminoácidos em múltiplos domí- nios (Pl, BH e REC1), assim como os nucleotídeos nas segunda e ter- ceiras alças (domínios RuvC e PI). Cpf1

[00176] A estrutura cristalina da Cpf1 de Acidaminococcus sp. em complexo com crRNA e um alvo de DNA de cordão duplo (ds) incluin- do uma sequência TTTN da PAM foi resolvida por Yamano et al. (Cell. 2016 May 5; 165(4): 949—962 (Yamano), aqui incorporado a título de referência). A Cpf1, como a Cas9, possui dois lobos: um lobo REC (de reconhecimento), e um lobo NUC (nuclease). O lobo REC inclui os domínios REC1 e REC2, que não apresentam semelhanças com ne-

nhuma das estruturas de proteína conhecidas. O lobo NUC, entretan- to, inclui três domínios RuvC (RuvC-l, -Il e -Ill) e um domínio BH. No entanto, ao contrário da Cas9, o lobo REC da Cpfi não possui um domínio HNH, e inclui outros domínios que também não apresentam semelhanças com as estruturas de proteína conhecidas: um domínio PI estruturalmente único, três domínios Wedge (WED) (WED-I, -lIl e - 111), e um domínio nuclease (Nuc).

[00177] Embora a Cas9 e a Cpfl compartilhem semelhanças em termos de estrutura e função, deve-se observar que algumas das ati- viddes da Cpfi são mediadas por domínios estruturais que não são análogos a nenhum domínio da Cas9. Por exemplo, a clivagem do cordão complementar do DNA alvo parece ser mediada pelo domínio Nuc, que difere sequencialmente e espacialmente do domínio HNH da Cas9. Adicionalmente, a porção não vetorizadora do gRNA da Cpf1 (o punho) adota uma estrutura falsos laços, e não uma estrutura de alça tronco formada pelo dúplex repetição:antirrepetição nos gRNAs da Cas9. Modificações das nucleases quiadas por RNA

[00178] A nuclease guiada por RNAs descrita acima possui ativida- des e propriedades que podem ser úteis em uma variedade de aplica- ções, mas os especialistas na técnica vão perceber que as nucleases guiadas por RNA também podem ser modificadas em certos casos, para alterar a atividade de clivagem, a especificidade para PAM, ou- tras características estruturais ou funcionais.

[00179] Com relação, primeiro, às modificações que alteram a ativi- dade de clivagem, mutações que reduzem ou eliminam a atividade dos domínios no lobo NUC já foram descritas acima. Mutações exemplifi- cativas que podem ser feitas nos domínios RuvC, no caso do domínio HNH da Cas9, ou no domínio Nuc da Cpf1i estão descritas em Ran e Yamano, assim como em Cotta-Ramusino. Em geral, as mutações que reduzem ou eliminam a atividade em um dos dois domínios nuclease resultam em nucleases guiadas por RNA com atividde de nicase, mas deve-se observar que o tipo de atividade de nicase varia dependendo de qual domínio é inativado. Como um exemplo, a inativação de um domínio RuvC de uma Cas9 vai resultar em uma nicase que cliva o cordão complementar ou superior. Por outro lado, a inativação de um domínio HNH da Cas9 resulta em uma nicase que cliva o cordão infe- rior ou não complementar.

[00180] Modificações da especificidade da PAM em relação às mo- léculas de Cas9 de referência de ocorrência natural já foram descritos por Kleinstiver et al. tanto para S. pyogenes (Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5 (Kleinstiver |) quanto para S. aureus (Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec; 33(12): 1293—1298 (Kli- enstiver |1)). Kleinstiver et al. também já descreveram modificações que aumentam a fidelidade de vetorização da Cas9 (Nature, 2016 Ja- nuary 28; 529, 490-495 (Kleinstiver IlI)). Todas estas referências estão aqui incorporadas a título de referência.

[00181] “Nucleases guiadas por RNA foram divididas em duas ou mais partes, como descrito por Zetsche et al. (Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):139-42 (Zetsche Il), aqui incorporado a título de referência), e por Fine et al. (Sci Rep. 2015 Jul 1;5:10777 (Fine), aqui incorporado a título de referência).

[00182] As nucleases guiadas por RNA podem, em certas modali- dades, ter o tamanho otimizado ou ser truncadas, por exemplo, via uma ou mais deleções que reduzem o tamanho da nuclease, porém ainda conservando as atividades de associação ao gRNA, de reco- nhecimento do alvo e da PAM, e de clivagem. Em certas modalidades, as nucleases guiadas por RNA são ligadas, covalentemente ou não covalentemente, a um outro polipeptídio, nucleotídeo, ou outra estrutu- ra, opcionalmente por meio de um ligador. Nucleases ligadas e ligado-

res exemplificativos estão descritos por Guilinger et al., Nature Bio- technology 32, 577-582 (2014), que está aqui incorporado a título de referência para todos os fins.

[00183] As nucleases guiadas por RNA também incluem opcional- mente uma etiqueta, tal como, porém, sem limitação, um sinal de loca- lização nuclear para facilitar o deslocamento da proteína nuclease gui- ada por RNA para o núcleo. Em certas modalidades, a nuclease guia- da por RNA pode incorporar sinais de localização nuclear C- e/ou N- terminais. Sequências de localização nuclear são conhecidas no esta- do da técnica e estão descritas em Maeder e outros documentos.

[00184] A relação de modificações precedente é de natureza exem- plificativa, e o especialista na técnica vai perceber, tendo em vista a presente invenção, que outras modificações podem ser possíveis ou desejáveis em determinadas aplicações. A título de concisão, portanto, sistemas, métodos e composições exemplificativos da presente inven- ção são apresentados para nucleases guiadas por RNA particulares, mas deve ficar entendido as nucleases guiadas por RNA usadas po- dem ser modificadas de maneiras que não alteram seus princípios operacionais. Tais modificações estão dentro do escopo da presente invenção. Ácidos nucleicos codificando nucleases quiadas por RNA

[00185] Ácidos nucleicos codificando nucleases guiadas por RNA, por exemplo, Cas9, Cpf1 ou fragmentos funcionais das mesmas, são apresentados neste pedido. Ácidos nucleicos exemplificativos codifi- cando nucleases guiadas por RNA já foram anteriormente descritos (vide, por exemplo, Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012).

[00186] Em alguns casos, um ácido nucleico codificando uma nu- clease guiada por RNA pode ser uma sequência de ácidos nucleicos sintética. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico sintética pode ser modificada quimicamente. Em certas modalidades, um mMRNA codifi-

cando uma nuclease guiada por RNA apresentará uma ou mais (por exemplo, todas) das seguintes propriedades: ele pode ser capeado, poliadenilado, e substituído com 5-metilcitidina e/ou pseudouridina.

[00187] As sequências de ácidos nucleicos sintéticas também po- dem ter seus códons otimizados, por exemplo, pelo menos um códon não comum ou menos comum fora substituído por um códon comum. Por exemplo, o ácido nucleico sintético pode direcionar a síntese de MRNA mensageiro otimizado, por exemplo, otimizado para expressão em um sistema de expressão mamífero, por exemplo, descrito neste pedido. Exemplos de sequências codificadoras de Cas de códons oti- mizados estão apresentados em Cotta-Ramusino.

[00188] Adicionalmente, ou alternativamente, um ácido nucleico co- dificando uma nuclease guiada por RNA pode compreender uma se- quência de localização nuclear (NLS). Sequências de localiação nu- clear são conhecidas no estado da técnica. Análise funcional de moléculas candidatas

[00189] As nucleases guiadas por RNA candidatas, gRNAs, e com- plexos das mesmas, podem ser avaliadas por métodos tradicionais conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Cotta-Ramusino. A estabilidade dos complexos RNP pode ser avaliada por fluorimetria diferencial de varredura, como descrito abaixo. Fluorimetria Diferencial de Varredura (DSF)

[00190] A termoestabilidade dos complexos de ribonucleoproteínas (RNP) compreendendo gRNAs e nucleases guiadas por RNA pode ser medida por DSF. A técnica de DSF mede a termoestabilidade de uma proteína, que pode aumentar em condições favoráveis tal como a adi- ção de uma molécula de RNA de ligação, por exemplo, um gRNA.

[00191] Um ensaio de DSF pode ser realizado de acordo com qual- quer protocolo adequado, e pode ser empregado em qualquer cenário adequado, incluindo, sem limitação, (a) testagem de diferentes condi-

ções (por exemplo, diferentes razões estequiométricas de gRNA: pro- teína nuclease guiada por RNA, diferentes soluções tampão, etc.) para identificar as condições ideais para formação da RNP; e (b) testagem das modificações (por exemplo, modificações químicas, alterações de sequência, etc.) de uma nuclease guiada por RNA e/ou um gRNA para identificar as modificações que melhoram a formação ou a estabilidade da RNP. Uma leitura de um ensaio de DSF é um desvio da temperatu- ra de fusão do complexo de RNP; um desvio relativamente alto sugere que o complexo de RNP é mais estável (e pode assim ter atividade mais alta ou cinética de formação mais favorável, cinética de degrada- ção mais favorável, ou alguma outra característica funcional) em rela- ção a um complexo de RNP de referência caracterizado por um desvio menor. Quando o ensaio de DSF é implantado como uma ferramenta de rastreamento, deve-se especificar uma temperatura de fusão limiar, de modo que a saída seja um ou mais RNPs com um desvio de tem- peratura de fusão maior ou igual ao limiar. Por exemplo, o limiar pode ser 5-10ºC (por exemplo, 5º, 6º, 7º, 8º, 9º, 10º) ou mais, e a saída po- de ser uma ou mais RNPs caracterizadas por um desvio de temperatu- ra de fusão maior ou igual ao limiar.

[00192] Dois exemplos não limitativos de condições para o ensaio DSF estão apresentados abaixo:

[00193] Para determinar a melhor solução para formar complexos de RNP, uma concentração fixa (por exemplo, 2 uM) de Cas9 em água+10x SYPRO Orange€ (Life Technologies cat&S-6650) é dispen- sada em placas de 384 poços. Uma quantidade equimolar de gRNA diluído em soluções com pH variado e sal é então adicionada. Depois de incubação à temperatura ambiente por 10' e breve centrifugação para remover as bolhas, um ciclador térmico Bio-Rad CFX384TY Real- Time System C1000 Touch'" com o software Bio-Rad CFX Manager é usado para examinar um gradiente de 20ºC a 90ºC com um aumento de 1ºC na temperatura a cada 10 segundos.

[00194] O segundo ensaio consiste em misturar várias concentra- ções de gRNA com uma concentração fixa (por exemplo, 2 uM) de Cas9 no tampão ideal do ensaio 1 acima e incubar (por exemplo, à temperatura ambiente por 10') em uma placa de 384 poços. Um volu- me igual de tampão ideal + 10x SYPRO Orange€O (Life Technologies catttS-6650) é adicionado à placa vedada com adesivo Microseal& B (MSB-1001). Depois de uma breve centrifugação para remover as bo- lhas, um ciclador térmico Bio-Rad CFX3847Y Real-Time System C1000 Touch'" com o software Bio-Rad CFX Manager é usado para examinar um gradiente de 20ºC a 90ºC com um aumento de 1ºC na temperatura a cada 10 segundos. Estratégias de edição de genoma

[00195] Os sistemas de edição de genoma descritos acima são usados, em várias modalidades da presente invenção, para gerar edi- ções (isto é, alterar) nas regiões alvo do DNA (por exemplo, TGFBR2 DNA) em uma célula ou obtidas de uma célula. Neste pedido estão descritas várias estratégias para gerar edições particulares, e estas estratégias estão descritas em termos gerais em termos do resultado de reparo desejado, do número e do posicionamento das edições indi- viduais (por exemplo, SSBs ou DSBs), e dos sítios alvo de tais edi- ções.

[00196] Estratégias de edição de genoma que envolvem a formação de SSBs ou DSBs são caracterizadas pelos resultados do reparo inclu- indo: (a) deleção de toda ou parte de uma região alvo; (b) inserção ou substituição de toda ou parte de uma região alvo; ou (c) interrupção de toda ou parte de uma região alvo. Este conjunto de resultados não se destina a ser limitativo, ou vinculante de qualquer teoria ou modelo particular, e é oferecido exclusivamente a título de economia de apre- sentação. Os especialistas na técnica vão perceber que os resultados enumerados não são mutuamente exclusivos e que alguns reparos podem resultar em outros resultados. Deve ficar entendido que a des- crição de uma estratégia ou modo de edição particular não requer um resultado de reparo específico, a menos que especificado em contrá- rio.

[00197] A substituição de uma região alvo geralmente envolve a substituição de toda ou parte da sequência existente na região alvo por uma sequência homóloga, por exemplo, por meio de correção de genes ou conversão de genes, dois resultados de reparo que são me- diados por vias de HDR. O HDR é promovido pelo uso de um template doador, que pode ser de cordão simples ou de cordão duplo, como descrito mais detalhadamente abaixo. Os templates de cordão simples ou de cordão duplo podem ser exógenos, em cujo caso eles vão pro- mover a correção de genes, ou eles podem endógenos (por exemplo, uma sequência homóloga em um genoma celular), para prover a con- versão de genes. Os templates exógenos podem ter saliências assi- métricas (isto é, a parte do template que é complementar ao sítio do DSB pode estar deslocada em uma direção 3' ou 5º, em vez de estar centralizada no template doador), por exemplo, como descrito por Ri- chardson et al. (Nature Biotechnology 34, 339—-344 (2016), (Richard- son), aqui incorporado a título de referência). Nos casos em que o template é de cordão simples, ele pode corresponder ao codrão com- plementar (superior) ou não complementar (inferior) da região alvo.

[00198] A conversão de genes e a correção de genes são facilita- das, em alguns casos, pela formação de um ou mais cortes na região alvo ou em torno dela, como descrito em Ran e Cotta-Ramusino. Em alguns casos, usa-se uma estratégia de corte duplo para formar dois SSBs deslocados que, por sua vez, formam um único DSB com uma saliência (por exemplo, uma saliência 5').

[00199] Interrupção e/ou deleção de toda ou parte de uma sequên-

cia alvo pode ser conseguida por uma variedade de resultados de re- paro. Como um exemplo, uma sequência pode ser deletada por gera- ção simultânea de dois ou mais DSBs que flanqueiam uma região al- vo, que é então excisada quando os DSBs são reparados, tal como descrito em Maeder para a mutação LCA10. Como um outro exemplo, uma sequência pode ser interrompida por uma deleção gerada pela formação de uma quebra no cordão duplo com saliências de cordão simples, seguida por processamento exonucleolítico das saliências antes do reparo.

[00200] Um subconjunto específico de interrupções na sequência alvo é mediado pela formação de um indel na sequência alvo, onde o resultado de reparo é tipicamente mediado pelas vias de NHEJ (inclu- indo AIt-NHEJ). NHEJ é chamada de via de reparo "propensa a erros" por causa de sua associação a mutações dos indels. Em alguns ca- sos, no entanto, um DSB é reparado pela NHEJ sem alteração da se- quência em torno dela (um reparo chamado de "perfeito" ou "sem cica- trizes"); isto geralmente requer que as duas extremidades do DSB es- tejam perfeitamente ligadas. Acredita-se, no entanto, que os indels se- jam provenientes do processamento enzimático das extremidades |i- vres do DNA antes de elas serem ligadas o que adiciona e/ou remove nucleotídeos de um ou ambos os cordões de uma ou ambas as extre- midades livres.

[00201] “Como o processamento enzimático das extremidades livres do DSB pode ser de natureza estocástica, as muntações dos indels tendem a ser variáveis, ocorrendo ao longo de uma distribuição, e po- dem ser influenciadas por uma variedade de fatores, incluindo o sítio alvo específico, o tipo de célula usado, a estratégia de edição do ge- noma usada, etc. Mesmo assim, é possível traçar generalizações limi- tadas acerca da formação de indels: as deleções formadas pelo reparo de um único DSB encontram-se mais comumente na faixa de 1-50 bp,

mas podem alcançar mais de 100-200 bp. As inserções formadas pelo reparo de um único DSB tendem a ser mais curtas e frequentemente incluem duplicações curtas da sequência imediatamente circunjacente ao sítio de quebra. No entanto, é possível obter inserções grandes, e nestes casos, a sequência inserida com frequência teve sua origem em outras regiões do genomna ou no DNA plasmídico presente nas células.

[00202] As mutações de indels — e sistemas de edição de genoma configuados para produzir indels — são úteis para interromper sequên- cias alvo, por exemplo, quando a geração de uma sequência final es- pecífica não é necessária e/ou quando uma mutação "frameshift" seria tolerada. Elas também podem ser úteis em cenários nos quais se- quências específicas são preferidas, na medida em que as certas se- quências desejadas tendem a ocorrer preferencialmente a partir do reparo de um SSB ou DSB em um dado sítio. As mutações de indels também representam uma ferramenta útil para avaliação ou rastrea- mento da atividade de sistemas de edição de genoma particulares e seus componentes. Nestes e em outros cenários, os indels podem ser caracterizados por (a) suas frequências relativas e absolutas nos ge- nomas das células colocadas em contato com sistemas de edição de genoma e (b) a distriuição das diferenças numéricas em relação à se- quência não editada, por exemplo, +1, +2, +3, etc. Como um exemplo, em um cenário de busca por condutores ("lead-finding setting"), é pos- sível rastrear múltiplos gRNAs para identificar aqueles gRNAs que in- duzem de forma mais eficiente o corte em um sítio alvo tendo por base uma leitura de indel em condições controladas. Guias que produzem indels em uma frequência maior ou igual a uma frequência limiar, ou que produzem uma distribuição particular de indels, podem ser seleci- onadas para posterior estudo e desenvolvimento. A frequência e a dis- tribuição de indels também podem solução reacional úteis como uma leitura para avaliar diferentes execuções dos sistemas de edição de genoma ou formulações e métodos de distribuição, por exemplo, man- tendo o gRNA constante e variando algumas outras condições reacio- nais ou métodos de distribuição. Estratégias de Multiplexação

[00203] Embora as estratégias exemplicativas discutidas acima te- nham se concentrado nos resultados de reparo mediados por DSBs individuais, os sistemas de edição de genoma de acordo com esta in- venção também podem ser empregados para gerar dois ou mais DSBs, seja no mesmo locos ou em locos diferentes. Estratégias para edição que envolvem a formação de múltiplos DSBs, ou SSBs, estão descritas, por exemplo, em Cotta-Ramusino. Desenho de templates doadores

[00204] O desenho de templates doadores está descrito detalha- damente na literatura, por exemplo, em Cotta-Ramusino. Templates doadores de DNA oligomérico (oligodesoxinucleotídeos ou ODNs), que podem ser de cordão simples (ssSODNs) ou de cordão duplo (dsO- DNs), podem ser usados para facilitar o reparo de DSBs com base no HDR, e são particularmente úteis para introduzir alterações em uma sequência de DNA alvo, inserir uma sequência nova na sequência al- vo, ou substituir a sequência alvo totalmente.

[00205] Seja de cordão simples ou de cordão duplo, os templates doadores geralmente incluem regiões que são homólogas a regiões de DNA em uma sequência alvo a ser clivada ou perto (por exemplo, flanqueando ou contígua) da mesma. Estas regiões homólogas são, neste pedido, chamadas de "braços de homologia", e estão ilustradas de forma esquemática abaixo: braço de homologia 5'] — [sequência substituinte] —- [braço de homo- logia 37.

[00206] Os braços de homologia podem ter qualquer comprimento adequado (incluindo O nucleotídeos se for usado apenas um braço de homologia), e os braços de homologia 3' e 5' podem ter o mesmo comprimento, ou podem ter comprimentos diferentes. A seção do comprimento apropriado dos braços de homologia pode ser influencia- da por uma variedade de fatores, tal como o desejo de evitar homolo- gias ou micro-homologias com certas sequências tais como repetições Alu ou outros elementos muito comuns. Por exemplo, um braço de homologia 5' pode ser encurtado para evitar um elemento repetitivo da sequência. Em outras modalidades, um braço de homologia 3' pode ser encurtado para evitar um elemento repetitivo da sequência. Em algumas modalidades, ambos os braços de homologia podem ser en- curtados para evitar um elemento repetitivo da sequência 5' e 3' para evitar a inclusão de certos elementos repetitivos da sequência. Além disso, alguns desenhos de braço de homologia podem melhorar a efi- ciência de edição ou aumentar a frequência de um resultado de reparo desejado. Por exemplo, Richardson et al. Nature Biotechnology 34, 339—-344 (2016) (Richardson), que está aqui incorporado a título de referência, verificaram que a assimetria relativa dos braços de homo- logia 3' e 5' de templates doadores de cordão simples influenciavam as taxas e/ou resultados de reparo.

[00207] Sequências de substituição em templates doadores já fo- ram descritas, inclusive em Cotta-Ramusino et al. Uma sequência substituinte pode ser de qualquer comprimento adequado (incluindo zero nucleotídeo), onde o resultado de reparo desejado é uma dele- ção), e inclui tipicamente uma, duas, três ou mais modificações de se- quência em relação à sequência de ocorrência natural em uma célula na qual se deseja edição. Uma modificação de sequência comum en- volve a alteração da sequência de ocorrência natural para reparar uma mutação que é relacionada a uma doença ou condição para a qual se deseja tratamento. Uma outra modificação de sequência comum en-

volve a alteração de uma ou mais sequências que são complementa- res à, ou codificam a, sequência PAM da nuclease guiada por RNA ou do domínio de vetorização do(s) gRNA(s) sendo usado(s) para gerar um SSB ou DSB, para reduzir ou eliminar a clivagem repetida do sítio alvo depois de a sequência substituinte ter sido incorporada no sítio alvo.

[00208] “Quando se usa ssODN linear, ele pode ser configurado pa- ra (i) se combinar com o cordão picotado do ácido nucleico alvo, (ii) se combinar com o cordão intato do ácido nucleico alvo, (iii) se combinar com o cordão mais do ácido nucleico alvo, e/ou (iv) se combinar com o cordão menos do ácido nucleico alvo. Um ssODN pode ter qualquer comprimento adequado, por exemplo, cerca de pelo menos ou não mais de 150-200 nucleotídeos (por exemplo, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 nucleotídeos).

[00209] Deve ser observado que um ácido nucleico matriz também pode ser um vetor de ácido nucleico, tal como um genoma viral ou DNA de cordão duplo circular, por exemplo, um plasmídio. Vetores de ácido nucleico compreendendo templates doadores podem incluir ou- tros elementos codificadores ou não codificadores. Por exemplo, um ácido nucleico matriz pode ser distribuído como parte de um genoma viral (por exemplo, em um genoma de AAV ou lentiviral) que inclui cer- tos elementos do esqueleto genômico (por exemplo, repetições termi- nais invertidas, no caso de um genoma de AAV) e inclui opcionalmente sequências adicionais codificando um gRNA e/ou uma nuclease guia- da por RNA. Em certas modalidades, o template doador pode ser ad- jacente ou flanqueadao por sítios alvo reconhecidos por um ou mais gRNAs, para facilitar a formação de DSBs livres em uma ou ambas as extremidades do template doador que pode participar no reparo dos SSBs ou DSBs correspondentes formados no DNA celular usando os mesmos gRNAs. Vetores de ácido nucleico exemplificativos adequa-

dos para uso como templates doadores estão descritos em Cotta- Ramusino.

[00210] “Qualquer que seja o formato usado, um ácido nucleico ma- triz pode ser desenhado para evitar sequências indesejáveis. Em cer- tas modalidades, um ou ambos os braços de homologia podem ser encurtados para evitar sobreposição com certos elementos repetitivos da sequência, por exemplo, repetições de Alu, elementos de LINE, etc. Células alvo

[00211] Os sistemas de edição de genoma de acordo com esta in- venção podem ser usados para manipular ou alterar uma célula, por exemplo, para editar ou alterar um ácido nucleico alvo. A manipulação pode ocorrer, em várias modalidades, in vivo ou ex vivo.

[00212] Vários tipos de célula podem ser manipulados ou alterados de acordo com as modalidades desta invenção, e em alguns casos, tal como em aplicações in vivo, uma pluralidade de tipos de células são alteradas ou manipuladas, por exemplo, por meio da distribuição dos sistemas de edição de genoma de acordo com esta invenção para uma pluralidade de tipos de célula. Em outros casos, no entanto, pode ser desejável limitar a manipulação ou alteração para um tipo ou tipos de célula particulares. Por exemplo, pode ser desejável, em alguns casos, editar uma célula com potencial de diferenciação limitado ou uma célula terminalmente diferenciada, tal como uma célula fotorre- ceptora no caso de Maeder, na qual se espera que a modificação de um genótipo resulte em uma alteração no fenótipo da célula. Em ou- tros casos, no entanto, pode ser desejável editar uma célula-tronco ou célula progenitora, multipotente ou pluripotente, menos diferenciada. À título de exemplo, a célula pode ser uma célula-tronco embrionária, uma célula-tronco pluripotente induzida (IPSC), células-tronco/células progenitoras hematopoieticas (HSPC), ou outro tipo de célula-tronco ou progenitora que se diferencie em um tipo de célula relevante para uma dada aplicação ou indicação. Em certas modalidades, a célula é uma célula T.

[00213] “Como um corolário, a célula sendo alterada ou manipulada é, diferentemente, uma célula divisória ou uma célula não divisória, dependendo do(s) tipo(s) de célula sendo vetorizado(s) e/ou do resul- tado de edição desejado.

[00214] “Quando as células são manipuladas ou alteradas ex vivo, as células podem ser usadas (por exemplo, administradas a um indiví- duo) imediatamente, ou elas podem ser mantidas ou armazenadas pa- ra uso posterior. Os especialistas na técnica vão perceber que as célu- las podem ser mantidas em cultura ou armazenadas (por exemplo, congeladas em nitrogênio líquido) por meio de qualquer método ade- quado conhecido na literatura. Execução dos sistemas de edição de genoma: distribuição, formula- ções, e vias de administração

[00215] Como discutido acima, os sistemas de edição de genoma desta invenção podem ser executados de qualquer maneira adequada, o que significa que os componentes destes sistemas, incluindo, sem limitação, a nuclease guiada por RNA, o gRNA, e opcionalmente o ácido nucleico do template doador, podem ser distribuídos, formulados ou administrados em qualquer forma ou combinação de formas ade- quada que resulte na transdução, expressão ou introdução de um sis- tema de edição de genoma e/ou que cause um resultado de reparo desejado em uma célula, tecido ou indivíduo. As Tabelas 3 e 4 apre- sentam vários exemplos não limitativos de execuções de sistemas de edição de genoma. Os especialistas na técnica, no entanto, vão per- ceber que estas listagens não são exaustivas, e que outras execuções são possíveis. Com referência em particular à Tabela 3, a tabela lista diversas execuções exemplificativas de um sistema de edição de ge- noma compreendendo um único gRNA e um template doador opcional.

No entanto, os sistemas de edição de genoma de acordo com esta in- venção podem incorporar múltiplos gRNAs, múltiplas nucleases guia- das por RNA, e outros componentes tais como proteínas, e uma varie- dade de execuções ficarão evidentes para o especialista na técnica com base nos princípios ilustrados na tabela.

Na tabela, [N/A] indica que o sistema de edição de genoma não inclui o componente indicado.

Tabela 6 Nuclease guiada Template | Comentários Uma proteína nuclease guiada por RNA Proteína RNA [N/A] complexada com uma molécula de gRNA (um complexo de RNP) Um complexo de RNP como descrito acima Proteína RNA DNA mais uma template doador de cordão sim- ples ou de cordão duplo. mem ja fe Lnstanrmntaen Proteína DNA [N/A] mais gRNA transcrito a partir de DNA.

Uma proteína nuclease guiada por RNA Proteína DNA DNA mais DNA codificador de gRNA e uma tem- plate doador de DNA separada.

Uma proteína nuclease guiada por RNA e Proteína DNA um DNA simples codificando tanto um gRNA quanto uma template doador.

Um DNA ou vetor de DNA codificando uma DNA nuclease guiada por RNA, um gRNA e uma template doador.

Dois DNAs separados, ou dos vetores de DNA DNA [N/A] DNA separados, codificando a nuclease guiada por RNA e o gRNA, respectivamente.

Três DNAs separados, ou três vetores de DNA DNA DNA DNA separados, codificando codificando a nuclease guiada por RNA, o gRNA e a tem- plate doador, respectivamente. nuclease guiada por RNA e um gRNA

Nuclease guiada Template | Comentários (porão ea RR Um primeiro DNA ou vetor de DNA codifi- DNA DNA cando uma nuclease guiada por RNA e um gRNA, e um segundo DNA ou vetor de DNA codificando uma template doador. Um primeiro DNA ou vetor de DNA codifi- cando uma nuclease guiada por RNA e um

DNA DNA segundo DNA ou vetor de DNA codificando - |) EEE Um primeiro DNA ou vetor de DNA codifi- cando uma nuclease guiada por RNA e uma template doador, e um segundo DNA ou vetor de DNA codificando um gRNA Um DNA ou vetor de DNA codificando uma nuclease guiada por RNA e uma template doador, e um gRNA Um RNA ou vetor de RNA codificando uma RNA [N/A] nuclease guiada por RNA e compreendendo um gRNA Um RNA ou vetor de RNA codificando uma nuclease guiada por RNA e compreendendo

RNA DNA um gRNA, e um DNA ou vetor de DNA codi- - db EEE

[00216] A Tabela 7 resume vários métodos de distribuição para os componentes de sistemas de edição de genoma descritos neste pedi- do. Mais uma vez, a lista destina-se a ser exemplificativa e não, limita- tiva.

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Distribuição baseada em ácidos nucleicos de sistemas de edição de genoma

[00217] Os ácidos nucleicos codificando os vários elementos de um sistema de edição de genoma de acordo com a presente invenção po- dem ser administrados a indivíduos ou distribuídos em células por mé- todos bastante conhecidos ou descritos neste pedido. Por exemplo, DNA codificando nuclease guiada por RNA e/ou DNA codificando gRNA, assim como ácidos nucleicos de templates doadores podem ser distribuídos, por exemplo, por vetores (por exemplo, vetores virais ou não virais), métodos não baseados em vetores (por exemplo, usan- do DNA nu ou complexos de DNA), ou uma combinação dos mesmos.

[00218] Os ácidos nucleicos codificando elementos de um sistema de edição de genoma podem incluir sequências que codificam um, dois, três, quatro ou mais gRNAs. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem codificar tanto uma primeira quanto uma segunda molécula de gRNA, por exemplo, onde o segundo gRNA tem um segundo domínio de vetorização que é complementara a uma segunda sequência alvo do gene de TGFBR2. Os ácidos nucleicos descritos neste pedido po- dem compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica uma terceira molécula de gRNA tendo um terceiro domínio de vetori- zação que é complementar a uma terceira sequência alvo do gene de TGFBR2. As composições de ácido nucleico descritas neste pedido podem compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifi- ca uma quarta molécula de gRNA descrita neste pedido tendo um quarto domínio de vetorização que é complementar a uma quarta se- quência alvo do gene de TGFBR2. Em certas modalidades, a segun- da, terceira e/ou quarta molécula de gRNA compreende um domínio de vetorização compreendendo uma sequência de nucleotídeos sele- cionadas dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096.

[00219] Os ácidos nucleicos codificando sistemas de edição de ge-

noma ou componentes dos mesmos podem ser distibuídos diretamen- te paras as células como DNA ou RNA nu, por exemplo, por meio de transfecção ou eletroporação, ou podem ser conjugados a moléculas (por exemplo, N-acetilgalactosamina) que promovem a absorção pelas células alvo (por exemplo, eritrócitos, HSCs). Vetores de ácido nuclei- co, tais como os vetores resumidos na Tabela 4, também podem ser usados.

[00220] Os vetores de ácido nucleico podem compreender uma ou mais sequências codificando componentes do sistema de edição de genoma, tais como uma nuclease guiada por RNA, um gRNA e/ou um template doador. Um vetor também pode compreender uma sequência codificando um peptídio sinal (por exemplo, para localização nuclear, localização nucleolar, ou localização mitocondrial) associado (por exemplo, inserido ou fundido) a uma sequência codificando uma prote- Ína. Como um exemplo, um vetor de ácido nucleico pode incluir uma sequência codificadora de Cas9 que inclui uma ou mais sequências de localização nuclear (por exemplo, uma sequência de localização nu- clear de SV40).

[00221] O vetor de ácido nucleico também pode incluir qualquer número adequado de elementos reguladores/de controle, por exemplo, promotores, potencializadores, introns, sinais de poliadenilação, se- quências de consenso de Kozak, ou sítios internos de entrada de ri- bossomas (IRES). Estes elementos são bastante conhecidos na litera- tura, e estão descritos em Cotta-Ramusino.

[00222] Os vetores de ácido nucleico de acordo com esta invenção incluem vetores virais recombinantes. Vetores virais exemplificativos estão apresentados na Tabela 7, e vetores virais adequados adicio- nais e o uso e a produção dos mesmos estão descritos em Cotta- Ramusino. Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral, por exem- plo, um vetor de vírus adeno-associado (AAV) ou um vetor de lentiví-

rus (LV). Outros vetores virais conhecidos na literatura também podem ser usados. Além disso, partículas virais podem ser usadas para distri- buir os componentes do distema de edição de genoma na forma de ácido nucleico e/ou de peptídio. Por exemplo, partículas virais "vazias" podem ser reunidas para formar qualquer carga adequada. Os vetores virais e as partículas virais também podem geneticamente modificados para incorporar ligandos de vetorização para alterar a especificidade do tecido alvo.

[00223] Além dos vetores virais, vetores não virais podem ser usa- dos para distribuir ácidos nucleicos codificando sistemas de edição de genoma de acordo com a presente invenção. Uma categoria importan- te de vetores de ácido nucleico não virais são as nanopartículas, que podem ser orgânicas ou inorgânicas. Nanopartículas são bastante co- nhecidas na literatura, e estão resumidas em Cotta-Ramusino. Qual- quer desenho de nanopartícula adequado pode ser usado para distri- buir os componentes do sistema de edição de genoma ou os ácidos nucleicos codificando tais componentes. Por exemplo, nanopartículas orgânicas (por exemplo, lipídio e/ou polímero) podem ser adequadas para uso como veículos de distribuição em certas modalidades desta invenção. Lipídios exemplificativos para uso em formulações de nano- partículas, e/ou transferência de genes estão mostrados na Tabela 8, e a Tabela 9 lista polímeros exemplificativos para uso na transferência de genes e/ou em formulações de nanopartículas.

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Tabela 9: Polímeros usados para transferência de genes Poli(etileno)glico! PEG | Ditiobis(succinimidilpropionato) | DSP Dimetil-3,3'-ditiobispropionimidato DTBP Poli(L-lisina) PLL (PLEmodifieado comístidita o (Polpropienimina) [PP Polilamidoamina) PAMAM Trietilenotetramina TETA Poli(B-aminoéster) [Polfailamiga) Ácido poli(a-[4-aminobutil]-L-glicólico) PAGA Ácido poli(D,L-láctico-co-glicólico) PLGA [Brometo de polidvetiavíniirifíiod o Poli(fosforamidato)s PPA Poli(2-aminoetil propileno fosfato) PPE-EA [Qurtesaro o [Quitosano galaetositado Quitosano N-dodacilado Histona Cotágeno de

[00224] Vetores não virais incluem especificamente modificações de vetorização para melhorar a absorção e/ou seletividade de certos tipos de células. Estas modificações de vetorização podem incluir, por exemplo, antígenos célula-específicos, anticorpos monocionais, anti- corpos de cadeia simples, aptâmeros, polímeros, açúcares (por exem- plo, N-acetilgalactosamina (GalNAc)), e peptídios penetrantes de célu- las. Tais vetores também podem opcionalmente usar peptídios/polí- meros fusogênicos e desestabilizantes de endossomas, sofrer altera- ções conformacionais desencadeadas por ácidos (por exemplo, para acelerar o escape endossômico da carga), e/ou incorporar um políme- ro clivável por estímulos, por exemplo, para liberação em um compar- timento celular. Por exemplo, é possível usar polímeros catiônicos à base de dissulfeto que são clivados no ambiente celular redutor.

[00225] Em certas modalidades, são distribuídas uma ou mais mo- léculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de DNA) que não os componentes de um sistema de edição de genoma, por exemplo, o componente nuclease guiada por RNA e/ou o componente gRNA des- critos neste pedido. Em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é distribuída ao mesmo tempo em que um ou mais dos compo- nentes do sistema de edição de genoma. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico é distribuída antes ou depois (por exemplo, menos de cerca de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 1 semana, 2 semanas, ou 4 se- manas) da distribuição de um ou mais dos componentes do sistema de edição de genoma. Em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é distribuída por um meio diferente daquele pelo qual são distri- buídos um ou mais dos componentes do sistema de edição de geno- ma, por exemplo, o componente nuclease guiada por RNA e/ou o componente gRNA. A molécula de ácido nucleico pode ser distribuída por qualquer um dos métodos de distribuição deste pedido. Por exem- plo, a molécula de ácido nucleico pode ser distribuída por um vetor vi- ral, por exemplo, um lentivírus deficiente de integração, e o componen-

te molécula de nuclease guiada por RNA e/ou o componente gRNA podem ser distribuídos por eletroporação, por exemplo, de modo que a toxicidade causada por ácidos nucleicos (por exemplo, DNAs) pode ser reduzida. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína terapêutica, por exemplo, uma proteína descrita neste pedido. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma molécula de RNA, por exemplo, uma molécula de RNA descrita neste pedido. Distribuição de RNPs e/ou RNA codificando componentes do sistema de edição de genoma

[00226] RNPs (complexos de gRNAs e nucleases guiadas por RNA, isto é, complexos de ribonucleoproteínas) e/ou RNAs codificando nu- cleases guiadas por RNA e/ou gRNAs, podem ser distribuídos para células ou administrados aos indivíduos por métodos conhecidos no estado da técnica, alguns deles estando descritos em Cotta-Ramusino. RNA codificando nuclease guiada por RNA e/ou RNA codificando gRNA in vitro, pode ser distribuído, por exemplo, por microinjeção, de células (vide, por exemplo, Lee 2012). Transfecção mediada por lipí- dios, distribuição mediada por lipídios, distribuição mediada por Gal- NAc ou por outros conjugados, e combinações destes, também podem ser usadas para distribuição in vitro e in vivo.

[00227] A distribuição in vitro via eletroporação compreende a mis- turação das células no RNA codificando nucleases guiadas por RNA e/ou gRNAs, com ou sem moléculas de ácido nucleico da matriz do doador, em um cartucho, câmara ou cubeta e a aplicação de um ou mais impulsos elétricos de duração e amplitude definidas. Sistemas e protocolos para eletroporação são conhecidos no estado da técnica, e qualquer ferramenta e/ou protocolo de eletroporação adequado pode ser usado junto com as várias modalidades desta invenção.

[00228] Em certas modalidades, os complexos de RNP da presente invenção, incluindo, por exemplo, composições farmacêuticas de RNP. Podem ser usados: (1) aumentar a proliferação cassete de expressão células T; (2) aumentar a sobrevivência de células T; e/ou (3) melhorar a função de células T. Por exemplo, porém não a título limitativo, dois ou mais complexos de RNP compreendendo gRNAs distintos podem ser empregados concomitantemente ou sequencialmente para alterar a expressão do gene de TGFBR2 em uma célula, por exemplo, uma célula T. Tais complexos de RNP podem compreender gRNAs distin- tos vetorizando sequências distintas do gene de TGFBR2. Os comple- xos de RNP podem, em determinados casos, induzir um evento de cli- vagem, por exemplo, uma quebra no cordão duplo ou no cordão sim- ples. Por exemplo, os complexos de RNP podem compreender molé- culas de Cas9 enzimaticamente ativas (eaCas9) que formam quebras no cordão duplo em um ácido nucleico alvo ou moléculas de eaCas9 que formam quebras no cordão simples em um ácido nucleico alvo (por exemplo, moléculas de nicase). Em certas modalidades, é possí- vel uma estratégia dupla de nicase RNP para formar duas quebras deslocadas no cordão simples que, por sua vez, formam uma única quebra no cordão duplo tendo uma saliência (por exemplo, uma sali- ência 5").

Via de administração

[00229] Os sistemas de edição de genoma, ou células alteradas ou manipuladas usando tais sistemas, podem ser administrados aos indi- víduos por qualquer modo ou via adequada, seja local ou sistêmica. Modos de administração sistêmica incluem as vias orais e parenterais. As vias parenterais incluem, a título de exemplo, as vias intravenosa, intramedular, intra-arterial, intramuscular, intradérmica, subcutâneas, intranasais e intraperitoneais. Os componentes administrados sistemi- camente podem ser modificados ou formulados para atingir, por exem- plo, HSCs, células-tronco hematopoiética/células progenitora, ou pro-

genitores de eritroides ou células precursoras.

[00230] Modos de administração local incluem, a título de exemplo, injeção intramedular no osso trabecular ou injeção intrafemoral no es- paço medular, a infusão na veia portal. Em certas modalidades, quan- tidades significativamente menores dos componentes (comparadas às abordagens sistêmicas) podem exercer um efeito quando administra- das localmente (por exemplo, diretamente na medula óssea) em com- paração com quando administradas sistemicamente (por exemplo, por fia intravenosa). Os modos de administração local podem reduzir ou eliminar a incidência de efeitos colaterais potencialmente tóxicos que podem ocorrer quando quantidades terapeuticamente eficazes de um componente são administradas sistemicamente.

[00231] A administração pode ser feita como um bolo periódico (por exemplo, por via intravenosa) ou como infusão contínua a partir de um reservatório interno ou a partir de um reservatório externo (por exem- plo, a partir de uma bolsa intravenosa ou de uma bomba implantável). Os componentes podem ser administrados localmente, por exemplo, por liberação contínua a partir de um dispositivo de liberação de fár- macos de liberação sistemática.

[00232] Além disso, os componentes podem ser formulados de for- ma a permitir a liberação durante um período de tempo prolongado. Um sistema de liberação pode incluir uma matriz de um material bio- degradável ou de um material que libera os componentes incorporados por difusão. Os componentes podem estar homogêneos ou heteroge- neamente distribuídos no sistema de liberação. Vários sistemas de |li- beração podem ser úteis, no entanto, a escolha do sistema apropriado vai depender da taxa de liberação requerida por uma aplicação parti- cular. Sistemas de liberação tanto não degradáveis como degradáveis podem ser usados. Sitemas de liberação adequados incluem políme- ros e matrizes poliméricas, matrizes não poliméricas, ou excipientes e diluentes inorgânicos e orgânicos, tais como, porém, sem limitação, carbonato de cálcio e açúcar (por exemplo, trealose). Os sistemas de liberação podem ser naturais ou sintéticos. No entanto, sistemas de liberação sintéticos são preferidos porque geralmente eles são mais confiáveis, mais reproduzíveis e produzem perfis de liberação mais definidos. O material do sistema de liberação pode ser selecionado de maneira que componentes com pesos moleculares diferentes sejam liberados por difusão através do material ou degradação deste.

[00233] Polímeros bioldegradáveis sintéticos representativos inclu- em, por exemplo: poliamidas tais como poli(aminoácidos) e poli(pepti- dios); poliésteres tais como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), po- liéácido láctico-co-glicólico), e poli(caprolactona); poli(anidridos); polior- toésteres; policarbonatos; e derivados químicos dos mesmos (substi- tuições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquil, alquileno, hidroxilações, oxidações, e outras modificações feitas rotineiramente pelos especialistas na técnica), copolímeros e misturas dos mesmos. Polímeros não degradáveis sintéticos representativos incluem, por exemplo: poliéteres tais como poli(óxido de etileno), poli(etileno glicol), e polilóxido de tetrametileno); polímeros viníilicos-poliacrilatos e poli- metacrilatos tais como metil, etil, outro alquil, hidroxietil metacrilato, ácidos acrílicos e metacrílicos, e outros tais como poli(vinil álcool), po- li(vinil pirolidona), e poli(vinil acetato); polifuretanos); celulose e seus derivados tais como alquil, hidroxialquil, éteres, ésteres, nitrocelulose, e vários acetatos de celulose; polissiloxanos; e qualquer derivado quíi- micos dos mesmos (substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquil, alquileno, hidroxilações, oxidações, e e outras modifi- cações feitas rotineiramente pelos especialistas na técnica), copolíme- ros e misturas dos mesmos.

[00234] “Microesferas de poli(lactídeo-co-glicolídeo) também podem ser usadas. Tipicamente, as microesferas são compostas de um polí-

mero de ácido láctico e ácido glicólico, que são estruturados para for- mar esferas ocas. As esferas podem ter aproximadamente 15-30 mi- crons de diâmetro e podem ser carregadas com os componentes des- critos neste pedido. Distribuição multi-modal ou diferencial dos componentes

[00235] Os especialistas na técnica vão perceber, tendo em vista a presente descrição, que os diferentes componentes dos sistemas de edição de genoma descritos neste pedido podem ser distribuídos jun- tos ou separadamente e simultaneamente ou não simultaneamente. À distribuiição separada e/ou assíncrona dos componentes do sistema de edição de genoma pode ser particularmente desejável para propor- cionar controle temporal ou espacial da função dos sistemas de edição de genoma e limitar certos efeitos causados pela atividade dos mes- mos.

[00236] Modos diferentes ou diferenciais, conforme usado neste pedido, referem-se a modos de distribuição que conferem diferentes propriedades farmacodinâmicas ou farmacocinéticas à molécula de componente individual, por exemplo, uma molécula de nuclease guia- da por RNA, gRNA, ácido nucleico matriz, ou carga útil. Por exemplo, os modos de distribuição podem resultar em distribuição tecidual dife- rente, meia-vida diferente, ou distribuição temporal diferente, em um compartimento, tecido ou órgão separado.

[00237] Alguns modos de distribuição, por exemplo, distribuição por um vetor de ácido nucleico que persiste em uma célula, ou na progê- nie de uma célula, por exemplo, por replicação autônoma ou inserção em um ácido nucleico celular, resulta na expressão mais persistente e na presença de um componente. Exemplos incluem distribuição viral, por exemplo, AAV ou lentiviral.

[00238] A título de exemplo, os componentes de um sistema de edição de genoma, por exemplo, uma nuclease guiada por RNA e um gRNA, podem ser distribuídos por modos que diferem em termos da meia-vida resultante ou da persistência do componente distribuído no corpo, ou em um compartimento, tecido ou órgão particular. Em certas modalidades, um gRNA pode ser distribuído por tais modos. O com- ponente molecular de nuclease guiada por RNA pode ser distribuído por um modo que resulta em menos persistência ou menos exposição no corpo ou em um compartimento, tecido ou órgão particular.

[00239] Mais genericamente, em certas modalidades, um primeiro modo de distribuição é usado para distribuir um primeiro componente e um segundo modo de distribuição é usado para distribuir um segundo componente. O primeiro modo de distribuição confere uma primeira propriedade farmacodinâmica ou farmacocinética. A primeira proprie- dade farmacodinâmica pode ser, por exemplo, distribuição, persistên- cia, ou exposição do componente, ou de um ácido nucleico que codifi- ca o componente, no corpo, em um compartimento, tecido ou órgão. O segundo modo de distribuição confere uma segunda propriedade far- macodinâmica ou farmacocinética. A segunda propriedade farmacodi- nâmica pode ser, por exemplo, distribuição, persistência, ou exposição do componente, ou de um ácido nucleico que codifica o componente, no corpo, em um compartimento, tecido ou órgão.

[00240] Em certas modalidades, a primeira propriedade farmacodi- nâmica ou farmacocinética, por exemplo, distribuição, persistência ou exposição, é mais limitada que a segunda propriedade farmacodinâmi- ca ou farmacocinética.

[00241] Em certas modalidades, o primeiro modo de distribuição é selecionado para otimizar, por exemplo, minimizar, uma propriedade farmacodinâmica ou farmacocinética, por exemplo, distribuição, persis- tência ou exposição.

[00242] Em certas modalidades, o segundo modo de distribuição é selecionado para otimizar, por exemplo, minimizar, uma propriedade farmacodinâmica ou farmacocinética, por exemplo, distribuição, persis- tência ou exposição.

[00243] Em certas modalidades, o primeiro modo de distribuição compreende o uso de elemento relativamente persistente, por exem- plo, um ácido nucleico, por exemplo, um plasmídio ou vetor viral, por exemplo, um AAV ou lentivírus. Como tais vetores são relativamente persistentes, um produto transcrito a partir dos mesmos também seria relativamente persistente.

[00244] Em certas modalidades, o segundo modo de distribuição compreende um elemento relativamente transitório, por exemplo, um RNA ou proteína.

[00245] Em certas modalidades, o primeiro componente compreen- de gRNA, e o modo de distribuição é relativamente persistente, por exemplo, o gRNA é transcrito a partir de um plasmídio ou vetor viral, por exemplo, um AAV ou lentivírus. A transcrição destes genes seria de pouca consequência fisiológica porque os genes não codificam um produto proteico, e os gRNAs são incapazes de agir isolados. O se- gundo componente, uma molécula de nuclease guiada por RNA, é dis- tribuído de maneira transitória, por exemplo, como mMRNA ou como proteína, garantindo que o complexo inteiro de molécula de nuclease guiada por RNA/gRNA esteja presente e ativa apenas por um curto período de tempo.

[00246] Além disso, os componentes podem ser distribuídos em formas moleculares diferentes ou com vetores de distribuição diferen- tes que se complementam para aumentar a segurança e a especifici- dade tecidual.

[00247] O uso de modos de distribuição diferenciais pode melhorar o desempenho, a segurança, e/ou a eficácia, por exemplo, a probabili- dade de uma eventual modificação fora do alvo pode ser reduzida. À distribuição de componentes imunogênicos, por exemplo, moléculas de Cas9, por modos menos persistentes pode reduzir a imunogenici- dade, uma vez que os peptídios da enzima Cas derivada de bactéria são exibidos na superfície da célula pelas moléculas de MHC. Um sis- tema de distribuição em duas partes pode aliviar estes inconvenientes.

[00248] “Modos de distribuição diferenciais podem ser usados para distribuir componentes para regiões alvo diferentes, porém sobrepos- tas. A formação de complexo ativo é minimizada fora da sobreposição das regiões alvo. Assim sendo, em certas modalidades, um primeiro componente, por exemplo, um gRNA é distribuído por um primeiro modo de distribuição que resulta em uma primeira distribuição espaci- al, por exemplo, tecidual. Um segundo componente, por exemplo, uma molécula de nuclease guiada por RNA é distribuído por um segundo modo de distribuição que resulta em uma segunda distribuição espaci- al, por exemplo, tecidual. Em certas modalidades, o primeiro modo compreende um primeiro elemento selecionado dentre um lipossoma, uma nanopartícula, por exemplo, uma nanopartícula polimérica, e um ácido nucleico, por exemplo, um vetor viral. O segundo modo compre- ende um segundo elemento selecionado do grupo. Em certas modali- dades, o primeiro modo de distribuição compreende um primeiro ele- mento de vetorização, por exemplo, um receptor célula-específico ou um anticorpo, e o segundo modo de distribuição não inclui aquele ele- mento. Em certas modalidades, o segundo modo de distribuição com- preende um segundo elemento de vetorização, por exemplo, um se- gundo receptor célula-específico ou um ou um segundo anticorpo.

[00249] “Quando a molécula de nuclease guiada por RNA é distribu- ída em um vetor de distribuição viral, um lipossoma, ou uma nanopar- tícula polimérica, há potencial para distribuição para múltiplos tecidos e para atividade terapêutica nos mesmos, quando pode ser que seja de- sejável atingir um único tecido. Um sistema de distribuição em duas partes pode resolver este problema e melhorar a especificidade teci-

dual. Se o gRNA e a molécula nuclease guiada por RNA forem acon- dicionados em veículos de distribuição separados com tropismos teci- duais distintos, porém sobrepostos, o complexo totalmente funcional será formado somente no tecido que é vetorizado por ambos os veto- res. Células Geneticamente Modificadas e Métodos de Produção de Célu- las Expressando um Receptor Recombinante

[00250] Neste pedido são apresentadas células para terapia celular adotiva, por exemplo, imunoterapia adotiva, e métodos para produzir ou gerar as células. As células incluem células imunes tais como célu- las T. As células geralmente são geneticamente modificadas por intro- dução de um ou mais ácidos nucleicos geneticamente modificados ou produtos dos mesmos. Entre estes produtos estão receptores de antíge- nos geneticamente modificados, incluindo receptores de células T gene- ticamente modificados (TCRs) e receptores de antígenos não TCR fun- cionais, tais como receptores de antígenos quiméricos (CARs), inclu- indo CARs ativadores, estimulantes e coestimulantes, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células também são intro- duzidas, seja simultaneamente ou sequencialmente, com o ácido nu- cleico codificando o receptor de antígenos geneticamente modificado, com um agente (por exemplo, Cas9/gRNA RNP) que é capaz de rom- per um gene codificando o TGFBR2.

[00251] Em algumas modalidades, as células (por exemplo, células T) podem ser incubadas ou cultivadas antes, durante e/ou subsequen- te à introdução da molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante e/ou o agente (por exemplo, Cas9/g9RNA RNP). Em al- gumas modalidades, as células (por exemplo, células T) podem ser incubadas ou cultivadas antes, durante e/ou subsequente à introdução da molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante, tal como antes, durante ou subsequente à transdução das células com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentiviral) codificando o receptor recombinante. Em algumas modalidades, as células (por exemplo, cé- lulas T) podem ser incubadas ou cultivadas antes, durante e/ou sub- sequente à introdução do agente (por exemplo, Cas9/gRNA RNP), tal como antes, durante ou subsequente ao contato das células com o agente, ou antes, durante ou subsequente à distribuição do agente pa- ra as células, por exemplo, via eletroporação. Em algumas modalida- des, a incubação pode ocorrer tanto no contexto de introdução da mo- lécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante como no contexto de introdução do agente, por exemplo, Cas9/g9RNA RNP. Em algumas modalidades, a incubação pode ser na presença de uma cito- cina, tal como IL-2, IL-7 or IL-15, ou na presença de um agente estimu- lante ou ativador que induz a proliferação ou a ativação de células, tal como um anticorpo anti-CD3/anti-CD28.

[00252] Em algumas modalidades, o método inclui ativar ou estimular as células com um agente estimulante ou ativador (por exemplo, anti- corpos anti-CD3/anti-CD28) antes da introdução da molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante e o agente, por exemplo, Cas9/gRNA RNP. Em algumas modalidades, a incubação também po- de ser realizada na presença de uma citocina, tal como IL-2 (por exemplo, 1 U/mL a 500 U/mL, tal como 10 U/mL a 200 U/mL, por exemplo, pelo menos ou cerca de 50 U/mL ou 100 U/mL), IL-7 (por exemplo, 0,5 ng/mL a 50 ng/mL, tal como 1 ng/ml a 20 ng/mL, por exemplo, pelo menos ou cerca de 5 ng/mL ou 10 ng/mL) ou I1L-15 (por exemplo, 0,1 ng/mL a 50 ng/mL, tal como 0,5 ng/mL a 25 ng/mL, por exemplo, pelo menos ou cerca de 1 ng/mL ou 5 ng/mL). Em algumas modalidades, as células são incubadas por 6 horas a 96 horas, tal co- mo 24-48 horas ou 24-36 horas antes da introdução da molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante (por exemplo, via transdução).

Células e Preparação de Células para Modificação Genética

[00253] Receptores recombinantes que se ligam a um antígeno e agentes específicos (por exemplo, Cas9/gRNA RNP) para edição ge- nética de um gene de TGFBR?2 codificando um polipeptídio TGFBR2 podem ser introduzidos em uma ampla variedade de células. Em al- gumas modalidades, um receptor recombinante é geneticamente mo- dificado e/ou o gene de TGFBR?2 alvo é manipulado ex vivo e as célu- las geneticamente modificadas são administradas a um indivíuo. Fon- tes de células alvo para manipulação ex vivo podem incluir, por exem- plo, sangue do indivíduo, sangue do cordão do indivíduo, ou a medula óssea do indivíduo. Fontes de células alvo para manipulação ex vivo também podem incluir, por exemplo, sangue, sangue de cordão ou medula óssea de doador heterólogo.

[00254] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células geneticamente modificadas, são células eucarióticas, tais como células de mamífero, células humanas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, da medula óssea, da linfa ou de órgões lin- foides, são células do sistema imunológico, tais como células da imu- nidade inata ou adotiva, por exemplo, células mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente células T e/ou células NK. Outras célu- las exemplificativas incluem células-tronco, tais como células-tronco multipotentes e pluripotentes, incluindo células-troinco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em alguns aspectos, as células são células huma- nas. Em relação ao indivíduo a ser tratado, as células podem alogêni- cas e/ou autólogas. As células são tipicamente células primárias, tais como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e/ou isoladas de um indivíduo e congeladas.

[00255] Em algumas modalidades, a célula alvo uma célula T, por exemplo, uma célula T CD8+ (por exemplo, uma célula T virgem CD8+, uma célula T de memória central, ou uma célula T de memória efetora), uma célula T CD4+, uma célula T exterminadora natural (cé- lulas NKT), uma célula T reguladora (Treg), uma célula T de memória de células-tronc, uma célula progenitora linfoide, uma célula-tronco hematopoiética, uma célula exterminadora natural (NK cell) ou uma célula dendrítica. Em algumas modalidades, as células são monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófi- los, células dendríticas, mastócitos, eosinófilos, e/ou basófilos. Em uma modalidade, a célula alvo é uma célula-tronco pluripotente induzi- da (iPS) ou uma célula derivada de uma célula iPS, por exemplo, uma célula iPS gerada a partir de um indivíduo, manipulada para alterar (por exemplo, induzir uma mutação) ou manipular a expressão de um ou mais genes alvo, e diferenciada, por exemplo, em uma célula T, por exemplo, uma célula T CD8+ (por exemplo, uma célula T virgem CD8+, uma célula T de memória central, ou uma célula T de memória efetora), uma célula T CD4+, uma célula T de memória de células- tronco, uma célula progenitora linfoide ou uma célula-tronco hemato- poiética.

[00256] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais subgrupos de células T ou outros tipos de células, tais como popula- ções de células T inteiras, células CD4+, células CD8+, e subpopula- ções das mesmas, tais como aquelas definidas pela função, estado de ativação, maturidade, potencial para diferenciação, expansão, recircu- lação, localização, e/ou capacidade de persistência, especificidade pa- ra antígeno, tipo de receptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento particular, perfil de secreção de marcador ou citocina, e/ou grau de diferenciação.

[00257] Entre os subtipos e subpopulações de células T e/ou de célu- las T CD4+ e/ou CD8+ T estão células T virgens (TN), células T efeto- ras (TEFF), células T de memória e subtipos destas, tais como células T de memória de células-tronco (TSCM), células T de memória central

(TCM), células T de memória efetora (TEM), ou células T de memória efetora terminalmente diferenciada, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, célu- las T citotóxicas, células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), células T reguladoras de ocorrência natural e adaptivas (Treg), células T auxiliares, tais como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, célu- las T alfa/beta, e células T delta/gama.

[00258] Em algumas modalidades, os métodos incluem isolamento de células do indivíduo, preparação, processamento, cultivo, e/ou manipu- lação genética das mesmas. Em algumas modalidades, a preparação das células geneticamente modificada inclui uma ou mais etapas de cultura e/ou preparação. As células para a manipulação genética des- crita podem ser isoladas de uma amostra, tal como uma amostra bio- lógica, por exemplo, uma amostra obtida ou derivada de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual a célula é isolada é um indivíduo que tem a doença ou condição ou precisa de uma terapia celular ou ao qual a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalidades é um ser humano com necessidade de uma in- tervenção terapêutico particular, tal como a terapia celular adotiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas, e/ou genetica- mente manipuladas.

[00259] Por conseguinte, as células em algumas modalidades sãp células primárias, por exemplo, células humanas primárias. As amos- tras incluem tecido, líquido, e outras amostras coletadas diretamente do indivíduo, assim como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, tal como separação, centrifugação, manipulação genética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e/ou in- cubação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamen- te de uma fonte biológica ou uma amostra que foi processada. Amos-

tras biológicas incluem, porém sem limitação, líquidos corporais, tais como sangue, plasma, soro, líquido cerebroespinhal, líquido sinovial, urina e suor, amostras de tecidos e órgãos, incluindo amostras pro- cessadas derivadas dos mesmos.

[00260] Em alguns aspectos, a amostra da qual as células são deri- vadas ou isoladas é sangue ou uma amostra derivada de sangue, ou é derivada de um produto de aferece ou leucoferese. Amostras exempli- ficativas incluem sangue total, células mononucleares de sangue peri- férico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia tecidual, tu- mor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfoide associado ao intesti- no, tecido linfoide associado à mucosa, baço, outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, os- so, próstata, cérvice, testículo, ovário, amígdala, ou outro órgão e/ou células derivadas dos mesmos. As amostras incluem, no contexto de terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fon- tes autólogas e alogênicas.

[00261] Em algumas modalidades, as células são derivadas de linha- gens celulares, por exemplo, linhagens de células T. As células em algumas modalidades são obtidas de uma fonte xenogênica, por exemplo, de um camundongo, um rato, um primata não humano, ou um porco.

[00262] Em algumas modalidades, isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou separação das células com base na afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifuga- das, e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exem- plo, para remover os componentes indesejados, enriquecer para com- ponentes desejados, lisar ou remover as células sensíveis a reagentes particulares. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, tal como densidade, propriedades ade- rentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes particu-

lares.

[00263] Em alguns exemplos, células do sangue circulante de um in- divíduo são obtidas, por exemplo, por aferese ou leucaferese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outras células sanguíneas brancas nucleadas, células sanguíneas vermelhas, e/ou plaquetas, e, em al- guns aspectos, contêm células diferentes de células sanguíneas ver- melhas e plaquetas.

[00264] Em algumas modalidades, as células sanguíneas coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração plasmá- tica e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para sub- sequentes etapas de processamento. Em algumas modalidades, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem não contém cálcio e/ou magnésio e/ou muitos ou todos os cátios divalentes. Em alguns aspectos, a etapa de lavagem é realizada em uma centrífuga de "es- coamento" semiautomática (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, Baxter) de acordo com as instruções dos fabricantes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, as células são ressuspendidas em uma varie- dade de tampões biocompatíveis depois da lavagem, tal como, por exemplo, PBS livre de Ca++/Mg++. Em certas modalidades, os com- ponentes de uma amostra de célula sanguínea são removidos e as células são diretamente ressuspendidas em meio de cultura.

[00265] Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, tal como a preparação de células sanguíneas brancas de sangue periférico por lise das célu- las sanguíneas vermelhas e centrifugação através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.

[00266] Em algumas modalidades, os métodos de isomento incluem a separação de diferentes tipos de célula com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, tais como marcadores superficiais, por exemplo, proteínas superficiais, marcado- res intracelulares, ou ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido para separação com base em tais marca- dores também pode ser usado. Em algumas modalidades, a separa- ção é uma separação com base na afinidade ou na imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento, em alguns aspectos, inclui a separação das células e populações de células com base na expressão das célu- las ou no nível de expressão de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, geralmente seguida por etapas de lavagem e separação das células que se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação, das células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação.

[00267] Tais etapas de separação podem basear-se na seleção posi- tiva, na qual as células que se ligaram aos reagentes são retidas para uso posterior, e/ou na seleção negativa, na qual as células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso posterior. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil quando não há qualquer anticorpo disponível que identifique epe um tipo de célula em uma população heterogênea, de modo que a separação é realiza- da melhor com base em marcadores expressos por células diferentes daquelas da população desejada.

[00268] A separação não precisa resultar em 100% de enriquecimen- to ou remoção de uma população de células particular ou de células expressando um marcador particular. Por exemplo, a seleção positiva ou enriquecimento para céloulas de um tipo particular, tal como aque-

las que expressam um marcador, refere-se ao aumento do número ou da percentagem de tais células, mas não precisa resultar na ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma for- ma, a seleção negativa, remoção, ou deplenção de células de um tipo particular, tal como aquelas que expressam um marcador, refere-se à diminuição do número ou da percentagem de tais células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas estas células.

[00269] Em alguns exemplos, são realizadas múltiplas rodadas de etapas de separação, onde a fração positivamente ou negativamente selecionada de uma etapa é submetida à outra etapa de separação, tal como uma seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode depletar as células ex- pressando simultaneamente múltiplos marcadores, tal como por incu- bação das células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada um sendo específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Da mesma forma, múltiplos tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente por incubação das células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação ex- pressos nos vários tipos de célula.

[00270] Em algumas modalidades, uma ou mais das populações de células T é enriquecida ou depeletada de células que são positivas pa- ra (marcador+) ou expressam níveis elevados (marcadorº"*Y2%) de um ou mais marcadores particulares, tais como marcadores superficiais, ou que são negativos para (marcador -) ou expressam níveis relativa- mente baixos (marcador"**º) de um ou mais marcadores. Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, tais co- mo células positivas ou expressando níveis elevados de um ou mais marcadores superficiais, por exemplo, células T CD28+, CD62L+, CCOR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, e/ou CD45RO+ T, são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em alguns casos, tais marcadores são aqueles que estão ausentes ou são ex- pressos em níveis relativamente baixas em determinadas populações de células T (tais como células sem memória), mas estão presentes ou são expressos em níveis relativamente mais altos em determinadas outras populações de células T (tais como células de memória). Em uma modalidade, as células (tais como as células CD8+ ou as células T, por exemplo, células CD3+) são enriquecidas para (isto é, positiva- mente selecionadas para) células que são positivas ou expressam ní- veis superficiais elevados de CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127, e/ou CD62L e/ou depletadas de (por exemplo, negativamente selecionadas para) células que são positivas para ou expressam níveis superficiais elevados de CD45RA. Em algumas modalidades, as célu- las são enriquecidas para ou depeletadas de células positivas para ou que expressam níveis superficiais elevados de CD122, CD95, CD25, CD27, e/ou IL7-Ra (CD127). Em alguns exemplos, células T CD8+ T são enriquecidas para células positivas para CD45RO (ou negativas para CD45RA) e para CD62L.

[00271] Por exemplo, células T CD3+, CD28+ T podem ser positiva- mente selecionadas com a ajuda de contas magnéticas conjugadas de CD3/CD28 (por exemplo, DYNABEADSGEO M-450 CD3/CD28 T Cell Ex- pander).

[00272] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de célula mononuclear do sangue periférico (PBMC) por seleção negativa de marcadores expressos em células diferentes de células T, tais como células B, monócitos, ou outras células sanguí- neas brancas, tais como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção de CD4+ ou CD8+ é usada para separar as células T auxilia- res CD4+ e as células T citotóxicas CD8+. Tais populações de CD4+ e CD8+ podem ser ainda classificadas em subpopulações por seleção positiva ou negativa de marcadores expressos ou expressos em um nível relativamente mais alto em uma ou mais subpopulações de célu- las T virgens, de memória, e/ou efetoras.

[00273] Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda enri- quecidas para ou depletadas de células-tronco naive, de memória cen- tral, de memória efetora, e/ou de memória central, tal como por sele- ção positiva ou negativa baseada nos antígenos superficiais associa- dos à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enrique- cimento para células T de memória central (TCM) é efetuado para au- mentar a eficácia, tal como para aumentar a sobrevivência de longo prazo, a expansão, e/ou a enxertia subsequente à administração, que, em alguns aspectos, é particularmente robusta em tais subpopulações. (Vide, Terakura et al. (2012) Blood,1:72—82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.) Em algumas modalidades, combinar cé- lulas T CD8+ enriquecidas de TCM e células T CD4+ aumenta ainda mais a eficácia.

[00274] Nas modalidades, células T de memória estão presentes em ambos os subgrupos CD62L+ e CD62L- de linfócitos sanguíneos peri- féricos CD8+. As PBMC podem ser enriquecidas para ou depletadas de frações CD62L-CD8+ e/ou CD62L+CDB8+, tal como pelo uso de an- ticorpos anti-CD8 e anti-CD62L.

[00275] Em algumas modalidades, uma população de células T CD4+ e uma subpopulação de células T CD8+, por exemplo, uma subpopu- lação enriquecida para células T de memória central (TOM). Em algu- mas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) baseia-se na expressão superficial positiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, e/ou CD 127; em alguns aspectos, ela ba- seia-se na seleção negativa para células expressando ou expressando em alto grau CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isola- mento de uma população de CD8+ enriquecida para células TOM é efetuado por depleção de células expressando CD4, CD14, CD45RA,

e seleção positiva ou enriquecimento para células expressando CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é realizado partindo-se de uma fração negativa de célu- las selecionadas com base na expressão de CDA4, que é submetida a uma seleção negativa baseada na expressão de CD14 e CD45RA, e uma seleção positiva baseada em CD62L. Tais seleções, em alguns aspectos, são efetuadas simultaneamente e, em outros aspectos, são efetuadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção baseada na expressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de células CD8+ também é usada para a população ou subpopulação de células CD4+, de mod que tanto a fração postiva quanto a fração negativa da separação ba- seada em CD4 são retidas e usadas em etapas subsequentes dos mé- todos, opcionalmente subsequente a uma ou mais outras etapas de seleção positiva ou negativa.

[00276] Em um exemplo particular, uma amostra de PBMCs ou uma amostra de outra célula sanguínea branca é submetida à seleção de células CD4+, onde tanto a fração negativa quanto a fração positiva são retidas. A fração negativa é então submetida à seleção negativa baseada na expressão de CD14 e CD45RA ou CD19, e seleção positi- va baseada em um marcador característico de células T de memória central, tal como CD62L ou CCR7, onde as seleções positiva e negati- va são efetuadas em qualquer ordem.

[00277] As células T auxiliares CD4+ são classificadas em células virgens, de memória central, e efetora identificando-se populações de células que possuem antígenos de superfície celular. Linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos traicionais. Em algumas modalidades, os linfócitos T naíve CD4+ são células CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. Em algumas modalidades, as células de memória central CD4+ são CD62L+ e CD45RO+. Em algumas modalidades, as células efeto-

ras CD4+ são CD62L- e CD45RO.

[00278] Em um exemplo, para enriquecer para células CD4+ por se- leção negativa, um coquetel de anticorpos monoclionais tipicamente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, e CD8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação é ligado a um suporte ou matriz sólida, tal como uma conta magnética ou uma conta paramagnética, para possibilitar a separação de células para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalida- des, as células e populações de células são separadas ou usadas por meio de técnicas de separação imunomagnéticas (ou afinidademagné- ticas) (revisadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metasta- sis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17- Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher O Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[00279] Em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cul- tivadas antes ou junto com a manipulação genética. As etapas de in- cubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação, e/ou propagação. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou de um agen- te estimulante. Tais condições incluem aquelas desenhadas para in- duzir a proliferação, expansão, ativação, e/ou sobrevivência das célu- las na população, para mimetizar a exposição a antígenos, e/ou prepa- rar as células para modificação genética, tal como para a introdução de um receptor de antígeno recombinante.

[00280] As condições podem incluir um ou mais dentre meios, tempe- raturas, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons, e/ou fatores estimuladores particulare, tais como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombi- nantes, e quaisquer outros agentes desenhados para ativar as células.

[00281] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimu- lantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que sejam capazes de ativar um domínio sinalizador intracelular de um complexo de TCR. Em alguns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de si- nalização intracelular de TCOR/CD3 em uma célula T. Tais agentes po- dem incluir anticorpos, tais como aqueles específicos para para um componente do TCR e/ou receptor coestimulador, por exemplo, anti- CD3, anti-CD28, por exemplo, ligado a um suporte sólido tal como uma conta, e/ou uma ou mais citocinas. Opcionalmente, o método de expansão pode compreender ainda a etapa de acionar um anticorpo anti-CD3 e/ou anti CD28 ao meio de cultura (por exemplo, a uma con- centração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml). Em algumas modalida- des, os agentes estimulantes incluem IL-2 e/ou IL-15, por exemplo, uma concentração de IL-2 de pelo menos cerca de 10 unidades/mL.

[00282] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com técnicas tais como aquelas descritas na Patente US Nº 6,040,1 77 concedida a Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Inmunother. 35(9): 651-—660, Terakura et al. (2012) Blood,1:72-82, e/ou Wang et al. (2012) J Inmunother. 35(9):689-701.

[00283] Em algumas modalidades, as células T são expandidas por adição de células alimentadoras de composições iniciadoras de cultu- ras, tais como PBMCs não divisórias (por exemplo, para que a popula- ção de células resultante contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20, ou 40 ou mais células alimentadoras PBMC para cada linfócito T na popu- lação inicial a ser expandida), e incubação da cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir os números de células T). Em alguns aspectos, as células alimentadoras não divisórias podem com- preender células alimentadoras PBMC gama-irradiadas. Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para impedir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.

[00284] Em algumas modalidades, as condições estimulantes inclu- em temperatura adequada para o desenvolvimento de linfócitos T hu- manos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geral- mente pelo menos cerca de 30 graus Celsius, e geralmente a cerca de 37 graus Celsius. Opcionalmente, a incubação pode compreender ain- da a adição de células linfobastoides transformadas com EBV e não divisórias (LCLS) como células alimentadoras. As LCLs podem ser ir- radiadas com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células alimentadoras LCL, em alguns aspectos, são apresentadas em qualquer quantidade adequada, tal como uma proporção de células alimentadoras LCL para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1.

[00285] Em algumas modalidades, os métodos de preparação inclu- em etapas de congelamento, por exemplo, criopreservação, das célu- las, seja antes ou depois do isolamento, incubação, e/ou manipulação genética. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e sub- sequente descongelamento remove os granulócitos e, até certo ponto, os monócitos na população de células. Em algumas modalidades, as células são suspendidas em uma solução de congelamento, por exemplo, depois de uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de várias soluções e parâmetros de con- gelamento conhecidos pode ser usada em certos aspectos. Um exem- plo envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina sérica humana (HSA), ou outro meio de congelamento de células ade- quado. Este é então diluído 1:1 com um meio de modo que a concen- tração final de DMSO e de HSA seja de 10% e 4%, respectivamente. Geralmente as células são então congeladas a -80º C a uma taxa de 1º por minuto e armazenadas na fase vapor de um tanque de armaze-

namento com nitrogênio líquido.

[00286] Em algumas modalidades, os métodos incluem a reintrodu- ção de células geneticamente modificadas no mesmo paciente, antes ou depois da criopreservação. Receptores Recombinantes

[00287] Em algumas modalidades, as células compreendem um ou mais ácidos nucleicos codificando um receptor recombinante introdu- zido via manipulação genética, e produtos geneticamente modificados de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, as células podem ser produzidas ou geradas pela introdução em uma célula (por exem- plo, via transdução de um vetor viral, tal como um vetor retroviral ou lentiviral) de uma molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são he- terólogos, isto é, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida a partir da célula, tal como aquela obtida a partir de ou- tro organismo ou célula, que, por exemplo, normalmente não é encon- trado na célula que está sendo geneticamente modificada e/ou um or- ganismo do qual tal célula deriva. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não são de ocorrência natural, tal como um ácido nucleico não encontrado na natureza, incluindo um compreendendo combina- ções quiméricas de ácidos nucleicos codificando vários domínios de vários tipos de célula diferentes.

[00288] Em algumas modalidades, a célula alvo fora alterada para se ligar a um ou mais antígenos alvo, tal como um ou mais antígenos tu- morais. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é selecionado den- tre ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase car- bônica 9 (CAIX), teEGFR, Her2/neu (tirosina quinase receptora erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, e antígeno superficial da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial

40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vIll, proteína ligadora do folato (FBP), FCRL5, FORH5, receptor da acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, 1L-22R-alfa, I11-13R-alfa2, receptor do domínio de inserção de quinase (Kdr), cadeia leve capa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (LI-CAM), antígeno asso- ciado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-AG6, antígeno pre- ferencialmente expresso de melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa 2 de I1L-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, re- ceptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, integrina avb6, 8H9, NCAM, re- ceptores de VEGF, 5T4, AchR fetal, ligandos de NKG2D, CD44v6, antí- geno dual, um antígeno cancerígeno de testículo, mesotelina, CMV muri- no, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carci- noembrionário (CEA), , Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL, CD138, um antígeno patógeno-específico e um antígeno associado a um tag universal.

Em algumas modalidades, a célula alvo fora alterada para se ligar a um ou mais dos seguintes antígenos tumorais, por exemplo, por um TCR ou um CAR.

Antígenos tumorais podem incluir, porém sem limitação, ADO34, AKT1, BRAP, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, Fibulina-1, HAGE, HCA587/MAGE-C?2, hcAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/Galectin9, HOM- MEEL-40/SSX2, HOM-RCC-3,1,3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB], KM-HN-3, KM-KN-1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGE-1, MAGE-1, MAGE-4a, MPP11, MSLN, NNP-1, NY-BR-1, NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NY-ESO-1, NY-ESO-5, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK11, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN- 3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9,

NY-SAR-35, OGFr, PLU-1, Rab38, RBPJkappa, RHAMM, SCP1, SCP- 1, SSX3, SSX4, SSX5, TOP2A, TOP2B, ou tirosinase. Receptores de Antígenos: Receptores de Antígenos Quiméricos (CARs)

[00289] As células geralmente expressam receptores recombinantes, tais como receptores de antígenos incluindo receptores de antígenos não TCR funcionais, por exemplo, receptores de antígenos quiméricos (CARs), e outros receptores ligadores de antígenos tais como recepto- res de células T transgênicas (TCRs). Entre os receptores também es- tão outros receptores quiméricos.

[00290] Rreceptores de antígenos exemplificativos, incluindo CARs, e métodos para modificação genética e introdução de tgais receptores em células, incluem aqueles descritos, por exemplo, nas publicações de pedido de patente internacional números WO200014257, WO 2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO?2013/071154, WOZ2013/123061 publicações de pedido de patente US número US2002131960, US2013287748, US20130149337, Paten- te US Nº: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, e 8,479,118, e publicação de patente europeia número EP2537416,e/ou aqueles descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388—398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633- 39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. Em alguns aspectos, os receptores de antígenos incluem um CAR descrito na Patente US Nº 7,446,190, e aqueles descritos na Publicação do pedido de patente Internacional Nº WO/2014055668 A1. Exemplos dos CARs incluem os CARs descritos em qualquer uma das publicações mencionadas aci- ma, tal como WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Patente US Nº 7,446,190, Patente US Nº 8,389,282,

Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267- 276 (2013); Wang et al. (2012) J. Inmunother. 35(9): 689-701; e Bren- tjens et al., Sci Trans! Med. 2013 5(177). Vide também os documentos WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Pa- tente US Nº 7,446,190, e Patente US Nº 8,389,282. Os receptores quiméricos, tais como CARs, geralmente incluem um domínio ligador de antígeno extracelular, tal como uma porção de uma molécula de anticorpo, geralmente uma região de cadeia pesada variável (VH) e/ou uma região de cadeia leve variável (VL) do anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo scFv.

[00291] Em algumas modalidades, o antígeno vetorizado pelo recep- tor é um polipeptídio. Em algumas modalidades, ele é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno é seletiva- mente expresso ou superexpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, nas células tumorais ou patogênicas, em relação às célu- las ou tecidos normais ou não vetorizados. Em outras modalidades, o antígeno é expresso em células normais e/ou é expresso nas células geneticamente modificadas.

[00292] Antígenos que podem ser vetorizados pelos receptores inclu- em, porém sem limitação, integrina avB6 (integrina avb6), antígeno de maturação das células B (BCMA), B7-H6, anidrase carbônica 9 (CAS9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno cancerígeno de testículo, antígeno 1B de câncer de testículo (CTAG, também conheci- do como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 da quimiocina do motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteína do fator de cres- cimento epidérmico (EGFR), proteína do fator de crescimento epidér- mico truncada (tEGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo Ill (EGFR vil), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glico-

proteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, like 5 do receptor de Fc (FCRL5; também co- nhecido como hómologo 5 do receptor de Fc ou FCRH5), receptor da acetilcolina fetal (fetal AChR), uma proteína ligadora do folato (FBP), receptor alfa de folato, receptor da acetilcolina fetal, gangliosídeo GD?2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Her2/neu (tirosina quinase receptora erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado a melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno superficial da he- patite B, antígeno leucociário humano A1 (HLA-AI), antígeno leucociá- rio humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de 11-22 (IL-22Ra), receptor alfa 2 de 11-13 (IL-13Ra2), receptor do domínio de inserção de quina- ses (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1ICAM), epítopo CE7 de LI-CAM, proteína 8A contendo repetição rica em leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-AG6, mesotelina, c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos do membro D do grupos 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRA- ME), receptor de progesterona, um antígeno próstata-específico, antí- geno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana prostática (PSMA), receptor 1 da tirosina quinase receptora órfã (ROR1), survivina, glicoproteína trofobástica (TPBG também conheci- da como 5T4), glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), e um antígeno patógeno-específico.

[00293] Em algumas modalidades, os antígenos vetorizados pelos receptores em algumas modalidades incluem o receptor da tirosina quinase receptora órfã ROR1, tEGFR, Her2, LI--CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, e antígeno superficial da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-?2, EGP-4, OEPHa2, ErbB2, 3, ou 4, FBP, receptor da acetilcolina fetal e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadeia leve ca- pa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carci- noembrionário (CEA), antígeno próstata-específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinB2, CD123, c- Met, GD-2, e MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, tal como ciclina A1 (CCNA1), e/ou moléculas biotiniladas, e/ou molécu- las expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.

[00294] Em algumas modalidades, o CAR apresenta especificidade de ligação para um antígeno associado a tumor, por exemplo, CD19, CD?20, anidrase carbônica IX (CAIX), CD171, CEA, ERBB2, GD?2, re- ceptor de alfa-folato, antígeno Y de Lewis, antígeno da membrana da próstata (PSMA) ou glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72).

[00295] Em algumas modalidades, o CAR liga um antígeno patógeno- específico. Em algumas modalidades, o CAR é específico para antíge- nos virais (tais como HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos, e/ou antígenos parasitários.

[00296] Entre os receptores quiméricos estão os receptores de antí- genos quiméricos (CARs). Os receptores quiméricos, tais como CARs, geralmente incluem um domínio de ligação de antígeno extracelular, tal como uma porção de uma molécula de anticorpo, geralmente uma região de cadeia pesada variável (Vs) e/ou uma região de cadeia leve variável (V.) do anticorpo, por exemplo, um fragmento scFv do anticor- po.

[00297] Em algumas modalidades, a porção de anticorpo do receptor recombinante, por exemplo, CAR, inclui ainda pelo menos uma região constante de imunoglobulina, tal como uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça IgG4, e/ou uma região CH1/CL e/ou Fc. Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, tal como IgG4 ou IgG1. Em alguns aspectos, a por- ção da região constante funciona como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento do antígeno, por exemplo, scFv, e o domínio transmembranar. O espaçador pode ter um comprimento que proporcione maior responsividade da célula subsequente à ligação do antígeno, em comparação com aquela na ausência do espaçador. Es- paçadores exemplificativos, por exemplo, regiões de dobradiça, inclu- em aqueles descritos na publicação do pedido de patente internacional número WO2014031687. Em alguns exemplos, o espaçador tem cerca de 12 aminoácidos de comprimento ou no máximo 12 aminoácidos de comprimento. Espaçadores exemplificativos incluem aqueles tendo pelo menos cerca de 10 a 229 aminoácidos, cerca de 10 a 200 amino- ácidos, cerca de 10 a 175 aminoácidos, cerca de 10 a 150 aminoáci- dos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 100 aminoácidos, cerca de 10 a 75 aminoácidos, cerca de 10 a 50 aminoácidos, cerca de 10 a 40 aminoácidos, cerca de 10 a 30 aminoácidos, cerca de 10 a aminoácidos, ou cerca de 10 a 15 aminoácidos, e incluindo qual- quer inteiro entre os limites de qualquer uma das faixas listadas. Em algumas modalidades, uma região espaçadora tem cerca de 12 ami- noácidos ou menos, cerca de 119 aminoácidos ou menos, ou cerca de 229 aminoácidos ou menos. Espaçadores exemplificativos incluem apenas a dobradição de IgG4, a dobradiça de IgG4 ligante aos domí- nios CH2 e CH3, ou a dobradiça de IgG4 ligado ao domínio CH3.

[00298] Espaçadores exemplificativos incluem, porém sem limitação, aqueles descritos em Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 ou na publicação do pedido patente internacional número WO2014

031687.

[00299] Este domínio de reconhecimento de antígeno geralmente es- tá ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelulares, tais como componentes de sinalização que mimetizam a ativação através de um complexo de receptores de antígenos, tal como um complexo de TCR, no caso de um CAR, e/ou sinal via outro receptor da superfí- cie celular. Assim sendo, em algumas modalidades, o componente de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpo) está ligado a um ou mais domínios transmembranares e intracelulares. Em algumas modalida- des, o domínio transmembranar é fundido ao domínio extracelular. Em uma modalidade, usa-se um domínio transmembranar que normal- mente é associado a um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR. Em alguns casos, o domínio transmembranar é selecionado ou modifi- cado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais do- mínios aos domínios transmembranares das mesmas proteínas da membrana superficial ou de proteínas da membrana superficial dife- rentes para minimizar as interações entre os membros do complexo de receptor.

[00300] O domínio transmembranar em algumas modalidades é deri- vado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Quando a fonte é natural, o domínio, em alguns aspectos, é derivado de qualquer prote- íÍna ligada à membrana ou proteína transmembranar. Regiões trans- membranares incluem aquelas derivadas (isto é, compreende pelo menos as regiões transmembranares) da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, o domínio transmembranar em al- gumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio trans- membranar sintético compreende resíduos predominantemente hidró- fobos tais como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembranar sintético. Em algumas modalidades, a ligação é por meio de ligadores, espaçadores, e/ou domínios trans- membranares.

[00301] Entre os domínios sinalizadores intracelulares estão aqueles que mimetizam ou se assemelham a um sinal através de receptor de antígenos natural, um sinal através de tal receptor em combinação com um receptor coestimulador, e/ou um sinal através de apenas um receptor coestimular. Em algumas modalidades, um ligador oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, um ligador de entre 2 e 10 aminoáci- dos de comprimento, tal como um ligador contendo glicinas e serinas, por exemplo, um dubleto de glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o domínio transmembranar e o domínio sinalizador cito- plasmático do CAR.

[00302] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente inclui pelo me- nos um componente ou componentes de sinalização intracelulares. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente intracelu- lar de um complexo de TCR, tal como uma cadeia CD3 do TCR que medeia a ativação e a citotoxicidade de células T, por exemplo, a ca- deia CD3 zeta. Assim sendo, em alguns aspectos, a porção de ligação de antígeno é ligada a um ou mais módulos de sinalização celulares. Em algumas modalidades, módulos de sinalização celulares incluem domínio transmembranar de CD3, domínios sinalizadores intracelula- res de CD3, e/ou outros domínios transmembranares de CD. Em al- gumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, inclui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais tais como receptor y de Fc, CD8, CD4, CD25, ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR ou outro receptor quimérico inclui uma molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-7) ou receptor y de Fc, e CD8, CD4, CD25 ou CD16.

[00303] Em algumas modalidades, com a ligação do CAR ou outro receptor quimérico, o domínio citoplasmático ou o domínio sinalizador intracelular do receptor ativa pelo menos uma das funções efetoras ou respostas normais da célula imune, por exemplo, células T genetica- mente modificadas para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célula T tal como a ativi- dade citolítica ou a atividade auxiliar de T, tal como a secreção de cito- cinas ou outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção trun- cada de um domínio sinalizador intracelular de um componente do re- ceptor de antígenos ou molécula coestimuladora é usada no lugar uma cadeia imunoestimuladora intata, por exemplo, se ela transduzir o sinal da função efetora. Em algumas modalidades, o domínio ou domínios sinalizadores intracelulares incluem as sequências citoplásmáticas do receptor de células T (TCR), e em alguns aspectos, também aqueles de co-receptores que no contexto natural agem em sintonia com tais receptores para dar início à transdução de sinais subsequente ao à ligação do receptor de antígenos, e/ou qualquer derivado ou variante de tais moléculas, e/ou qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.

[00304] No contexto de um TCR natural, a ativação total geralmente requer não apenas sinalização através do TOR, mas também um sinal coetimulador. Assim sendo, em algumas modalidades, para estimular a ativação total, um componente para gerar um sinal secundário ou coestimulador também é incluída no CAR. Em outras modalidades, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coestimulador. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulador.

[00305] A ativação das células T é, em alguns aspectos, descrita co- mo sendo mediada por duas classes de sequências sinalizadoras cito- plasmáticas: aquelas que iniciam a ativação primária antígeno-depen- dente através do TCR (sequências sinalizadoras citoplasmáticas pri-

márias), e aquelas que agem de maneira antígeno-independente para forncer um sinal secundário ou coestimulador (sequências sinalizado- ras citoplasmáticas secunárias). Em alguns aspectos, o CAR inclui um ou ambos de tais componentes sinalizadores.

[00306] Em alguns aspectos, o CAR inclui uma sequência sinalizado- ra citoplasmática primária que regula a ativação primária do complexo de TCR. As sequências sinalizadoras citoplasmáticas primárias que agem de maneira estimuladora podem conter motivos sinalizadores que são conhecidos como motivos de ativação à base de tirosina imu- noreceptora ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo sequências sina- lizadoras citoplasmáticas primárias incluem aqueles derivados da ca- deia CD3 zeta, FCºR gama, CD3 gama, CD3 delta e CD3 epsilon. Em algumas modalidades, as moléculas sinalizadoras citoplasmáticos no CAR contêm um domínio sinalizador citoplasmático, uma porção do mesmo, ou uma sequência derivada de CD3 zeta.

[00307] Em algumas modalidades, o CAR inclui um domínio sinaliza- dor e/ou uma transmembrane portion of um receptor coestimulador, tal como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, e ICOS. Em alguns aspectos, o mesmo CAR inclui tanto os componentes ativadores como os coesti- muladores.

[00308] Em algumas modalidades, o domínio ativador é incluído em um CAR, enquanto que o componente coestimulador é fornecido por outro CAR que reconhece outro antígeno. Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores, CARs coestimu- latodores, ambos expressos na mesma célula (vide, WO2014/055668). Em alguns aspectos, as células incluem um ou mais CARs estimulado- res ou ativadores e/ou um CAR coestimulador. Em algumas modalida- des, as células incluem ainda CARs inibidores (ICARs, vide Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December 2013), tal como um CAR que reconhece um antígeno diferente daquele associado e/ou especí-

fico para a doença ou condição sendo que um sinal de ativação distri- buído através do CAR direcionado para doença é diminuído ou inibido pela ligação do CAR inibidor ao seu ligante, por exemplo, para reduzir os efeitos fora do alvo.

[00309] Em certas modalidades, o domínio sinalizador intracelular compreende um domínio transmembranar e de sinalização CD28 liga- do a um domínio intracelular CD3 (por exemplo, CD3-zeta). Em algu- mas modalidades, o domínio sinalizador intracelular compreende um domínio co-estimulador CD28 e CD137 (4-1BB, TNFRSF9) quimérico, ligado a um domínio intracelular CD3 zeta.

[00310] Em algumas modalidades, o CAR contém um ou mais, por exemplo, dois ou mais, domínios coestimuladores e um domínio ativa- dor, por exemplo, um domínio ativador primário, na porção citoplasmá- tica. CARs exemplificativos incluem componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28, e 4-1BB.

[00311] Em algumas modalidades, o CAR ou outro receptor de antí- genos inclui ainda um marcador, tal como um marcador de superfície celular, que pode ser usado para confirmar a transdução ou modifica- ção genética da célula para expressar o receptor, tal como uma versão truncada de um receptor de superfície celular, tal como um EGFR truncco (tEGFR). Em alguns aspectos, o marcador todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, a NGFR, ou receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR). Em algumas modali- dades, o ácido nucleico codificando o marcador é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando uma sequência ligadora, tal como uma sequência ligadora clivável, por exemplo, T2A. Vide docu- mento WO2014031687. Em algumas modalidades, a introdução de um construto codificando o CAR e EGFRt separado por uma troca de ri- bossoma T2A pode expressar duas proteínas do mesmo construto, de modo que o EGFRt pode ser usado como um marcador para detectar células expressando tal construto. Em algumas modalidades, uma ma- cador, e opcionalmente uma sequência ligadora, pode ser qualquer uma daqueles descritos no Pedido publicado Nº WO 2014/031687. Por exemplo, o marcador pode ser um EGFR truncado (tEGFR) que é op- cionalmente ligado a uma sequência ligadora, tal como uma sequência ligadora clivável de T2A.

[00312] Em algumas modalidades, o marcador é uma molécula, por exemplo, uma proteína da superfície celular, não encontrada natural- mente naas células T ou não encontrada naturalmente na superfície das células T, ou uma porção das mesmas.

[00313] Em algumas modalidades, a molécula é uma molécula não própria, por exemplo, uma proteína não próxpria, isto é, que não é re- conhecida como "própria" pelo sistema imunológico do hospedeiro pa- ra o qual as células serão transferidas de forma adotiva.

[00314] Em algumas modalidades, o marcador não tem qualquer fun- ção terapêutica e/ou não produz qualquer efeito além do fato de ser usado como um marcador para modificação genética, por exemplo, para selecionar células geneticamente modificadas com sucesso. Em outras modalidades, o marcador pode ser uma molécula terapêutica ou uma molécula que exerce algum efeito desejado, tal como um |i- gante para uma célula a ser encontrada in vivo, tal como uma molécu- la de ponto de verificação coestimuladora ou imune para melhorar e/ou amortecer as respostas das células mediante transferência adotiva e encontro com o ligante.

[00315] Em alguns casos, os CARs são indicados como CARs de primeira, segunda, e/ou terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que fornece exclusivamente um sinal induzido pela cadeia CD3 mediante a ligação de um antígeno; em alguns aspectos, um CAR de segunda geração é aquele fornece tal sinal e um sinal coestimulador, tal como um sinal incluindo um domínio sinalizador intracelular de um receptor coestimulador tal como CD28 ou CD137; em alguns aspectos, um CAR de terceira geração é aquele que inclui vários domínios coetimuladores de diferentes receptores co- estimuladores.

[00316] Em algumas modalidades, o receptor de antígenos quimérico inclui uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento do anticorpo. Em alguns aspectos, o receptor de antígenos quimérico in- clui uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento do anticorpo e um domínio sinalizador intracelular. Em algumas modali- dades, o anticorpo ou o fragmenti inclui um scFv e o domínio intracelu- lar contém um ITAM. Em alguns aspectos, o domínio sinalizador intra- celular inclui um domínio sinalizador de uma cadeia zeta de uma ca- deia CD3-zeta (CD36). Em algumas modalidades, o receptor de antí- genos quimérico inclui um domínio transmembranar ligando o domínio extracelular e o domínio sinalizador intracelular. Em alguns aspectos, o domínio transmembranar contém uma porção transmembranar de CD28. O domínio extracelular e a transmembrana podem ser ligados de forma direta ou indireta. Em algumas modalidades, o domínio ex- tracelular e a transmembrana são ligados por um espaçador, tal como qualquer um daqueles descritos neste pedido. Em algumas modalida- des, o receptor de antígenos quimérico contém um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de célula T, tal como entre o domínio transmembranar e o domínio sinalizador intracelular. Em alguns as- pectos, a molécula coestimuladora de célula T é CD28 ou 41BB.

[00317] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo, um domínio transmembranar que é ou contém a porção transmembranar de CD28 ou uma variante funcional da mesma, e um domínio sinalizador intracelular contendo uma porção sinalizadora de CD28 ou uma variante funcional da mes- ma e uma porção sinalizadora de CD3 zeta ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, fragmento de anticorpo, um domínio transmembranar que é ou contém a porção transmembranar de CD28 ou uma variante funcional da mesma, and um domínio sinalizador intracelular contai- ning uma porção sinalizadora de a 4-1BB ou uma variante funcional da mesma e uma porção sinalizadora de CD3 zeta ou uma variante funci- onal da mesma. Em algumas destas modalidades, o receptor inclui ainda um espaçador contendo uma porção de uma molécula de lg, tal como uma molécula de lg humana, tal como uma dobradição de Ig, por exemplo, uma dobradiça da IgGA4, tal como um espaçador somente com dobradiça.

[00318] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar do re- ceptor, por exemplo, o CAR é um domínio transmembranar da CD28 humana ou variante da mesma, por exemplo, um domínio transmem- branar de 27 aminoácidos de uma CD28 humana (Acesso Nº: P10747.1).

[00319] Em algumas modalidades, o receptor de antígenos quimérico contém um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de célula T. Em alguns aspectos, a molécula coestimuladora de célula T é CD28 ou 41BB.

[00320] Em algumas modalidades, o domínio sinalizador intracelular compreende um domínio sinalizador coestimulador intracelular da CD28 humana ou variante funcional ou porção da mesma, tal como um domínio de 41 aminoácidos da mesma e/ou tal como um domínio com uma substituição de LL por GG nas posições 186-187 de uma proteína CD28 nativa. Em algumas modalidades, o domínio intracelu- lar compreende um domínio sinalizador coestimulador intracelular de 41BB ou variante funcional ou porção da mesma, tal como um domínio citoplasmático de 42 aminoácidos de uma 4-1BB humana (Acesso Nº Q07011.1) ou variante funcional ou porção da mesma.

[00321] Em algumas modalidades, o domínio sinalizador intracelular compreende um domínio sinalizador estimulador de CD3 zeta humana ou uma variante funcional do mesmo, tal como um domínio citoplas- mático 112 AA da isoforma 3 da CD36 humana (Acesso Nº P20963.2) ou um domínio sinalizador de CD3 zeta descrito na Patente US Nº 7,446,190 ou na Patente US Nº 8,911,993.

[00322] Em alguns aspectos, o espaçador contém somente uma regi- ão de dobradiçã de uma IgG, tal como somente um dobradição da IgG4 ou IgG1. Em outras modalidades, o espaçador é uma dobradiça de lg, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, ligada a um domínio CH2 e/ou CH3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, ligada aos domínios CH2 e CH3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma dobradiça de lg, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, ligada apenas a um domínio CH3. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende uma sequência rica em glicina-serina ou outro ligador flexível tal como liga- dores flexíveis conhecidos.

[00323] Por exemplo, em algumas modalidades, o CAR inclui um an- ticorpo ou fragmento que liga especificamente um antígeno, um espa- çador tal como qualquer espaçador contendo a dobradiça de Ig, um domínio transmembranar de CD28, um domínio sinalizador intracelular de CD28, e um domínio sinalizador de CD3 zeta. Em algumas modali- dades, o CAR inclui um anticorpo ou fragmento que liga especifica- mente um antígeno, um espaçador tal como qualquer espaçador con- tendo a dobradiça de lg, um domínio transmembranar de CD28, um domínio sinalizador intracelular de CD28, e um domínio sinalizador de CD3 zeta. Em algumas modalidades, tais construtos de CAR incluem ainda um elemento de esquiva do ribossoma T2A e/ou uma sequência de tEGFR, por exemplo, a jusante do CAR.

[00324] Os termos "polipeptídio" e "proteína" são usados intercambi-

avelmente para indicar um polímero de resíduos aminoacídicos, e não estão limitados a um comprimento mínimo. Polipeptídios, incluindo os receptores apresentados e outros polipeptídios, por exemplo, ligadores ou peptídios, podem incluir resíduos aminoacídicos incluindo resíduos aminoacídicos naturais e/ou sintéticos. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídio, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação e fosforilação. Em alguns aspectos, os polipeptí- dios podem conter modificações em relação a uma sequência nativa ou natural, contanto que a proteína conserve a atividade desejada. Es- tas modificações podem ser intencionais, como por mutagênese sítio- direcionada, ou podem ser acidentais, tal como por mutações de hos- pedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR. Receptores de células T

[00325] Em algumas modalidades, os receptores de antígenos gene- ticamente modificados incluem receptores de células T recombinantes (TCORs) e/ou TCRs clonados a partir de células T de ocorrência natural. Assim sendo, em algumas modalidades, a célula alvo fora alterada pa- ra conter genes específicos do receptor de células T (TCR) (por exem- plo, um gene TRAC e TRBC). Os TCRs ou porções de ligação de antí- geno dos mesmos incluem aqueles que reconhecem um epítopo de peptídio ou um epítopo de célula T de um polipeptídio alvo, tal como um antígeno de uma proteína tumoral, viral ou autoimune. Em algumas modalidades, o TCR tem especificidade de ligação para um antígeno associado a tumor, por exemplo, antígeno carcinoembrionário (CEA), GP100, antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MART1), antígeno de melanoma A3 (MAGEA3), NYESO1 ou p53.

[00326] Em algumas modalidades, um "receptor de células T" ou "TCR" é uma molécula que contém uma cadeia variável a e uma ca- deia variável B (também conhecidas como TCRa e TCRB, respectiva-

mente), ou uma cadeia variável y e uma cadeia variável ô (também conhecidas como TCRy e TCRô, respectivamente), ou porções ligado- ras de antígeno das mesmas, e que é capaz de se ligar especifica- mente a um peptídio ligado a uma molécula de MHC. Em algumas modalidades, o TCR está na forma af. Tipicamente, os TCRs que existem nas formas af e yô geralmente são estruturalmente similares, mas as células T que expressam os mesmos podem ter localizações anatômicas ou funções distintas. Geralmente, um TCR é pode ser ex- presso na superfície de células T (ou linfócitos T) onde ele geralmente é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas do maior complexo de histocompatibilidade (MHC).

[00327] Em algumas modalidades, o TCR é um TCR inteiro ou uma porção de ligação de antígeno ou um fragmento de ligação de antíge- no do mesmo. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR intato ou de comprimento integral, incluindo TOCRs na forma afB ou na forma vô. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação de antíge- no que é menor que um TCR de comprimento integral que se liga a um peptídio específico ligado a uma molécula de MHC, tal como um que se liga a um complexo de MHC-peptídio. Em alguns casos, uma por- ção de ligação de antígeno ou fragmento de um TCR pode conter apenas uma porção dos domínios estruturais de um TCR de compri- mento integral ou intato, mas ainda é capaz de se ligar ao epítopo de peptídio, tal como um complexo de MHC-peptídio, ao qual o TCR intei- ro se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação de antígeno con- tém os domínios variáveis de um TCR, tal como a cadeia variável ae a cadeia variável É de um TCR, suficiente para formar um sítio de liga- ção para ligação a um complexo de MHC-peptídio específico. Geral- mente, as cadeias variáveis de um TCR contêm regiões determinantes de complementaridade (CDRs) envolvidas no reconhecimento do pep- tídio, do MHC e/ou do complexo de MHC-peptídio.

[00328] Em algumas modalidades, os domínios variáveis do TCR contêm alças hipervariáveis, ou CDRs, que geralmente são os contri- buintes primários para reconhecimento do antígeno e capacidade e especificidade de ligação. Em algumas modalidades, uma CDR de um TCR, ou uma combinação da mesma forma todo ou substancialmente todo o sítio de ligação de antígeno de uma dada molécula de TCR. As várias CDRs em uma região variável de uma cadeia do TCR geral- mente são separadas por regiões de estrutura (FRs), que geralmente apresentam menos variabilidade entre as moléculas de TOR em com- paração com as CDRs (vide, por exemplo, Jores et al., Proc. Nat' Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al, EMBO J. 7:3745, 1988; vide também Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). Em algumas modalidades, a CDR3 é a principal CDR responsável pela ligação ou especificidade para o antígeno, ou é a mais importante en- tre as três CDRs em uma dada região variável do TOR para reconhe- cimento do antígeno, e/ou para interação com a porção peptídio pro- cessada do complexo de peptídio-MHC. Em alguns contextos, a CDR1 da cadeia alfa pode interagir com a parte N-terminal de determinados peptídios antigênicos. Em alguns contextos, a CDR1 da cadeia beta pode interagir com a parte C-terminal do peptídio. Em alguns contex- tos, a CDR2 contribui mais fortememente ou é a princial CDR respon- sável pela interação ou pelo reconhecimento da porção MHC do com- plexo de peptídio-MHC. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia B pode conter uma região hipervariável adicional (CDR4 ou HVR4), que geralmente está envolvida na super-ligação do antígeno e não no reconhecimento do antígeno (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).

[00329] Em algumas modalidades, um TCR contém um domínio vari- ável alfa (Va) e/ou um domínio variável beta (Vgs) fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos. Em algumas modalidades, a cadeia a e/ou a cadeia B de um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio transmembranar e/ou uma cauda citoplasmática curta (vide, por exemplo, Janeway et al., Inmunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3"* Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). Em algumas modalidades, o domínio constante da cadeia a é codificado pelo gene TRAC (nomenclatura IMGT) ou é uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia B é codificada pelos genes TRBC1 ou TRBC2 (nomenclatura IMGT) ou é uma variante da mesma. Em algumas modalidades, o domínio cons- tante é adjacente à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formada pelas duas cadeias contém dois domínios constantes próximos à membrana, e dois domínios variáveis distais da membrana, sendo que cada um destes domínios variáveis contém CDRs.

[00330] O especialista na técnica sabe como determinar ou identificar os vários domínios ou regiões de um TCR. Em alguns aspectos, os resíduos de um TCR são conhecidos ou podem ser identificados com a ajuda do sistema de numeração "International Immunogenetics In- formation System" (IMGT) (vide, por exemplo, www.imgt.org; vide, também, Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immu- nology, 2&;55-77; e The T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and Le- Franc Academic Press 2001). Com o uso deste sistema, as sequên- cias da CDR1 em uma cadeia Va e/ou em uma cadeia VB de um TCR correspondem aos aminoácidos presentes entre os resíduos de núme- ro 27-38, inclusive, as sequências da CDR2 em uma cadeia Va e/ou em uma cadeia VB de um TCR correspondem aos aminoácidos pre- sentes entre os resíduos de número 56-65, inclusive, as sequências da CDR3 em uma cadeia Va e/ou em uma cadeia VB de um TCR corres- pondem aos aminoácidos presentes entre os resíduos de número 105- 117, inclusive.

[00331] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um heterodímero de duas cadeias a e B (ou opcionalmente y e 5) que estão ligadas, tal como por uma ligação dissulfeto ou por ligações dissulfeto. Em algu- mas modalidades, o domínio constante do TOR pode conter sequên- cias de ligação curtas nas quais um resíduo cisteína forma uma liga- ção dissulfeto, ligando assim as duas cadeias do TOR. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo cisteína adicional em cada uma das cadeias a e B, de modo que o TCR contém duas ligações dissulfeto nos domínios constantes. Em algumas modalidades, cada um dos domínios constante e variáveis contém ligações dissulfeto for- mados por resíduos cisteína.

[00332] Em algumas modalidades, o TCR para as células genetica- mente modificadas descritas é um TCR gerado a partir de uma se- quência(s) de TCR conhecida(s), tal como sequências das cadeias Va,B, para as quais uma sequência codificadora de comprimento subs- tancialmente integral encontra-se facilmente disponível. Métodos para obtenção de sequências de TCR de comprimento integral, incluindo sequências das cadeias V, a partir de fontes celular são bastante co- nhecidos. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos codificando o TCR podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, tal como por amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de ácidos nucleicos codificando TOR em uma célula ou células dadas ou isola- dos a partir das mesmas, ou síntese de sequências de DNA de TCR conhecidas do público. Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, tal como de células tal como de uma cé- lula T (por exemplo, células T citotóxicas), hibridomas de células T ou outra fonte conhecida do público. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas de células isoladas in vivo. Em algumas modali- dades, as células T podm ser um hibridoma ou clone de células T cul- tivadas. Em algumas modalidades, o TCR ou a porção de ligação de antígeno do mesmo pode ser gerado sinteticamente a partir do conhe- cimento da sequência do TCR.

[00333] Em algumas modalidades, um clone de células T de alta afi- nidade para um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno cancerígeno) é identificado, isolado de um paciente, e introduzido nas células. Em algumas modalidades, o clone de TOR para um antígeno alvo fora ge- rado em camundongos transgênicos geneticamente modificados com gentes do sistema imunológico humano (por exemplo, o sistema de antígenos leucocitários humanos, ou HLA). Vide, por exemplo, antíge- nos tumorais (vide, por exemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169—180 e Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808. Em algumas modalidades, a exibição em fagos é usada para isolar TCRs contra um antígeno alvo (vide, por exemplo, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390—1395 e Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349—

354.

[00334] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação de antígeno do mesmo é um TCR que fora modificado ou geneticamente modificado. Em algumas modalidades, métodos de evolução direcio- nada são usados para gerar TORs com propriedades alteradas, tal como com maior afinidade para um complexo de MHC-peptídio espe- cífico. Em algumas modalidades, a evolução direcionada é obitda por métodos de exibição que incluem, porém sem limitação, exibição em leveduras (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), exibição em fagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), ou exibição em células T (Chervin et al. (2008) J Inmunol Methods, 339, 175-84). Em algumas modalidades, as abordagens de exibição envolvem modificação gené- tica, ou modificação, de um TCR parental ou de referência conhecido. Por exemplo, em alguns casos, um TCR de tipo selvagem pode ser usado como uma matriz para produzir TORs mutagenizados nos quais um ou mais resíduos das CDRs são mutados, e mutantes com uma propriedade alterada desejada, tal como maior afinidade para um antí- geno alvo desejado, são selecionados.

[00335] Em algumas modalidades descritas, o TOR pode conter uma ligação ou ligações dissulfeto introduzidas. Em algumas modalidades, as ligações dissulfeto nativas não estão presentes. Em algumas moda- lidades, a uma ou mais das cisteínas nativas (por exemplo, no domínio constante da cadeia a e da cadeia B) que formam uma ligação dissul- feto nativa intercadeias são substituídas por outro resíduo, tal como uma serina ou alanina. Em algumas modalidades, uma ligação dissu variável N-terminal de imunoglobulina, um domínio constante de imu- noglobulina, uma região transmembranar, e uma cauda citoplasmática cura na extremidade C-terminal. Em algumas modalidades, um TCR, por exemplo, via a cauda citoplasmática, é associado a proteínas inva- riantes do complexo de CD3 envolvido na mediação da transdução de sinais. Em alguns casos, a estrutura permite que o TCR se associe a outras moléculas como CD3 e subunidades das mesmas. Por exem- plo, um TCR contendo regiões constantes com um domínio trans- membranar pode ancorar a proteína na membrana celular e associar- se a subunidades invariantes do aparelho ou complexo de sinalização de CD3. As caudas intracelulares das subunidades de sinalização de CD3 (por exemplo, as cadeias CD3y, CD35, CD3e e CD37) contêm um ou mais motivos de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAM que estão envolvidos na capacidade de sinalização do complex- to de TCR.

[00337] Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de comprimento integral. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação de antígenos. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR dimérico (ATOR). Em algumas modalidades, o TOR é um TCR de cadeia sim- ples (sc-TCR). Um TCR pode estar em uma forma ligada a uma célula ou em uma forma solúvel. Em algumas modalidades, para os métodos apresentados, o TCR está em uma forma ligada a uma célula expres- sa na superfície de uma célula.

[00338] Em algumas modalidades, um dTCR contém um primeiro po- lipeptídio em que uma sequência correspondente a uma sequência da região variável da cadeia a do TCR é fundida ao terminal N de uma sequência correspondente a uma sequência extracelular da região constante da cadeia a do TCR, e um segundo polipeptídio em que uma sequência correspondente a uma sequência da região variável da cadeia B do TCR é fundida ao terminal N de uma sequência corres-

pondente a uma sequência extracelular da região constante da cadeia B do TCR, o primeiro e o segundo polipeptídios sendo ligados por uma ligação dissulfeto. Em algumas modalidades, a ligação pode corres- ponder à ligação dissulfeto intercadeias nativa presente nos TCRs ab diméricos nativos. Em algumas modalidades, as ligações dissulfeto intercadeias não estão presentes em um TCR nativo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cistéinas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do par de polipep- tídios do dTCR. Em alguns casos, podem ser desejáveis tanto uma ligação dissulfeto nativa como uma não nativa. Em algumas modalida- des, o TCR contém uma sequência transmembranar para ancorar a membrana.

[00339] Em algumas modalidades, um dTCR contém uma cadeia a do TCR contendo um domínio a variável, um domínio a constante e um primeiro motivo de dimerização preso ao terminal C do domínio à constante, e uma cadeia À do TOR compreendendo um domínio É va- riável, e um domínio B constante domain e um primeiro motivo de di- merização preso ao terminal C do domínio B constante, em que um primeiro e um segundo motivos de dimerização interagem facilmente para formar uma ligação covalente entre um aminoácido no primeiro motivo de dimerização e um aminoácido no segundo motivo de dimeri- zação ligando a cadeia a do TCR e a cadeia B do TOR uma à outra.

[00340] Em algumas modalidades, o TOR é um scTCR, que é um cordão de aminoácido simples contendo uma cadeia a e uma cadeia B que é capaz de se lligar a complexos de MHC-peptídio. Tipicamente, um ScTCR pode ser gerado por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Vide, por exemplo, PCTs Internacionais publicados Nºº WO 1996/13593, WO 1996/18105, WO 1999/18129, WO 2004/033685, WO 2006/037960, WO 2011/044186; Patente US Nº 7,569,664; e Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996).

[00341] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de aminoácidos correspon- dente a uma região variável da cadeia a do TOR, e um segundo seg- mento constituído por uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência da região variável da cadeia À do TCR fundido ao terminal N de uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência extracelular do domínio constante da cadeia É do TCR, e uma sequência ligadora ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.

[00342] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de aminoácidos correspon- dente a uma região variável da cadeia B do TOR, um segundo seg- mento constituído por uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência da região variável da cadeia a do TCR fundido ao terminal N de uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência extracelular do domínio constante da cadeia a do TCR, e uma sequência ligador ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.

[00343] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência da região variável da cadeia a fundido ao terminal N de uma sequência do domínio constante ex- tracelular da cadeia a, e um segundo segmento constituído por uma sequência da região variável da cadeia B fundido ao terminal N de uma sequência constante e transmembranar extracelular da cadeia B e, op- cionalmente, uma sequência ligadora ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.

[00344] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência da região variável da cadeia B do TCR fundido ao terminal N da sequência do domínio constante extracelular da cadeia B, e um segundo segmento constituído por uma sequência da região variável da cadeia a fundido ao terminal N de uma sequência constante e transmembranar extracelular da cadeia, e, op- cionalmente, uma sequência ligadora ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.

[00345] Em algumas modalidades, para o scTCR ligar um complexo de MHC-peptídio, as cadeias a e devem ser pareadas para que as sequências de suas regiões variáveis sejam orientadas para tal liga- ção. Vários métodos para promover o pareamento de a e À em um SCcTCR já são conhecidos no estado da técnica. Em algumas modali- dades, inclui-se uma sequência ligadora que liga as cadeias a e B para formar o cordão simples de polipeptídio. Em algumas modalidades, o ligador deve ter um comprimento suficiente para cobrir a distância en- tre o terminal C da cadeia a e o terminal N da cadeia B, ou vice-versa, porém garantindo também que o comprimento do ligador não seja tão longo a ponto de bloquear ou reduzir a ligação do scTCR ao complexo de peptídio-MHC alvo.

[00346] Em algumas modalidades, o ligador de um scTCRs que liga o primeiro e o segundo segmentos do TCR pode ser qualquer ligador capaz de formar um cordão simples de polipeptídio, porém conservan- do a espeficidade de ligação do TOR. Em algumas modalidades, a se- quênica ligadora pode ter, por exemplo, a fórmula -P-AA-P-, na qual P é prolina e AA representa uma sequência de aminoácidos na qual os aminoácidos são glicina e serina. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo segmentos são pareados para que as sequências de su- as regiões variáveis sejam orientadas para tal ligação. Assim, em al- guns casos, o ligador e cases, o ligador tem um comprimento suficien- te para cobrir a distância entre o terminal C do primeiro segumento e o terminal N do segumento segmento, ou vice-versa, mas não tão longo a ponto de bloquear ou reduzir a ligação do scTCR ao ligante alvo. Em algumas modalidades, o ligador pode conter de cerca de 10 a 45 ami-

noácidos, tal como 10 a 30 aminoácidos ou 26 a 41 resíduos aminoa- cídicos, por exemplo, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos. Em algumas mo- dalidades, o ligador tem a fórmula -PGGG-(SGGGG)s-P- ou -PGGG- (SGGGG)s-P-, na qual P é prolina, G é glicina e S é serina. Em algu- mas modalidades, o ligador tem a sequência GSADDAKKDAAKKD- GKS).

[00347] Em algumas modalidades, um scTCR contém uma ligação dissulfeto entre resíduos do cordão simples de aminoácido, o que, em alguns casos, pode estimular a estabilidade do pareamento entre as regiões a e B regions da molécula de cadeia simples (vide, por exem- plo, Patente US Nº 7,569,664). Em algumas modalidades, o scTCR contém uma ligação dissulfeto covalente ligando um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia a a um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia B da molé- cula de cadeia simples. Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto corresponde à ligação dissulfeto nativa presente em um dTCR nativo. Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto em um TCR nativo não está presente. Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto é uma ligação dissulfeto não nativa introduzida, por exemplo, incorporando uma ou mais cisteínas nas sequências extracelulares da região cons- tante da primeira e da segunda regiões da cadeia do polipeptídio do scTCR polypeptide. Mutações de cisteína exemplificativas incluem qualquer uma das descritas acima. Em alguns casos, tanto uma liga- ção dissulfeto nativo como uma não nativa podem estar presentes.

[00348] Em algumas modalidades, um scTCR é um TCR truncado sem ligação dissulfeto no qual zíperes de leucina heteróloga fundidos aos terminais C do mesmo facilitam a associação de cadeias (vide, por exemplo, PCT Internacional publicado Nº WO 1999/60120). Em algu- mas modalidades, um scTCR contém um domínio variável do TCRa ligado covalentemente um domínio variável do TOCRB via um ligador peptídico (vide, por exemplo, PCT Internacional publicado Nº WO 1999/18129).

[00349] Em algumas modalidades, qualquer um dos TCRs, incluindo um dTCR ou um scTCR, pode ser ligado a domínios sinalizadores que produzem um TCR ativo na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, o TCR é expresso na superfície das células. Em algu- mas modalidades, o TOR contém uma sequência correspondente a uma sequência transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar pode ser um domínio transmembranar Ca ou CB. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar pode ser oriundo de uma origem não TCR, por exemplo, uma região transmembranar de CD3z, CD28 ou B7.1. Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência correspondente a sequências citoplasmáticas. Em algumas modalidades, o TCR contém um domínio sinalizador de CD3z. Em al- gumas modalidades, o TCR é capaz de formar um complexo de TCR com CD3.

[00350] Em algumas modalidades, o TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo apresenta uma afinidade com uma constante de ligação de equilíbrio para um antígeno alvo entre cerca de 10º e 107? M e todos os valores e faixas individuais entre estes. Em algumas mo- dalidades, o antígeno é um complexo ou ligante de MHC-peptídio.

[00351] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode ser uma proteína natural produzida de forma recombinante ou uma forma mutada da mesma na qual uma ou mais propriedades, tal como a característica de ligação. Foram alteradas. Em algumas modalidades, um TCR pode ser derivado de várias espé- cies animais, tal como humanos, camundongos, ratos, ou outro mamí- fero. Em algumas modalidades, para gerar um vetor codificando um TCR, as cadeias a e B podem ser amplificadas por PCR a partir do CDNA total isolado de um clone de célula T expreesando o TCR de interesse e clonado em um vetor de expressão. Em algumas modali- dades as cadeias a e 8 podem ser podem ser geradas sinteticamente.

[00352] Em algumas modalidades, as cadeias alta e beta do TOR são isoladas e clonadas em vetor de expressão genético. Em algumas modalidades, unidades de transcrição podem ser geneticamente modi- ficadas como uma unidade bicistrônica contendo um IRES (sítio de entrada de ribossomas interno), que possibilita a coexpressão de pro- dutos genéticos (por exemplo, codificando as cadeias a e B) por uma mensagem proveniente de um único promotor. Alternativamente, em alguns casos, um único promotor pode direcionar a expressão de um RNA que contém, em uma única fase de leitura aberta (ORF), múlti- plos genes (por exemplo, codificando as cadeias a e B) separados um do outro por sequências que codificam um peptídio de auto-clivagem (por exemplo, T2A) ou um sítio de reconhecimento de protease (por exemplo, furina). A ORF codifica assim uma única poliproteína, que, seja durante (no caso de T2A) ou depois da translação, é clivada nas proteínas individuais. Em alguns casos, o peptídio, tal como T2A, pode fazer com que o ribossoma se esquive (esquiva do ribossoma) da sín- tese de uma ligação peptídica no terminal C de um elemento 2A, resul- tando na separação entre a extremidade da sequência 2A e o peptídio a jusante subsequente. Exemplos de peptídios de clivagem 2A, inclu- indo aqueles que podem induzir a esquiva do ribossoma, são T2A, P2A, E2A e F2A. Em algumas modalidades, as cadeias a e B são clo- nados em diferentes vetores. Em algumas modalidades, as cadeias a e B geradas são incorporadas em um vetor retroviral, por exemplo, len- tiviral.

[00353] Em algumas modalidades, os genes alfa e beta do TOR são ligados via um peptídio de esquiva de ribossoma 2A de picornavírus de modo que ambas as cadeias são co-expressas. Em algumas moda- lidades, a transferência genética do TCR é realizada via vetores retro-

virais ou lentivirais, ou via transposons (vide, por exemplo, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Ge- ne Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748—1757; e Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683. Vetores e Métodos de Manipulação Genética

[00354] Os métodos apresentados incluem a expressão dos recepto- res recombinantes, incluindo CARs ou TCRs, para produzir as células geneticamente modificadas expressando tais moléculas de ligação. À manipulação genética geralmente envolve a introdução de um ácido nucleico codificando componente recombinante ou geneticamente mo- dificado na célula, tal como por transdução, transfecção ou transfor- mação retroviral.

[00355] Em algumas modalidades, a transferência de genes é reali- zada, primeiro, por estimulação da célula, tal como combinando a mesma com um estímulo que induz uma resposta tal como prolifera- ção, sobrevivência, e/ou ativação, por exemplo, medida pela expres- são de uma citocina ou de um marcador de ativação, seguida pela transdução das células ativadas, e expansão em cultura até números suficientes para aplicações clínicas.

[00356] Vários métodos para a introdução de componentes geneti- camente modificados, por exemplo, receptores de antígenos, por exemplo, CARs, são conhecidos e podem ser usados com os métodos e as composições apresentados. Métoos exemplificativos incluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos codificando os recepto- res, incluindo via transdução viral, por exemplo, retroviral ou lentiviral, transposons, e eletroporação.

[00357] Em algumas modalidades, um ácido nucleico codificando um receptor recombinante pode ser clonado em um vetor ou vetores de expressão adequados. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor de expressão recombinante adequado, e pode ser usado para trans- formar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. Vetores adequa- dos incluem aqueles projetados para a propagação e expansão ou pa- ra expressão ou ambos, tal como plasmídios e vírus.

[00358] Em algumas modalidades, o vetor pode ser um vetor da sé- rie puC (Fermentas Life Sciences), da série pBluescript (Stratagene, La Jolla, Calif.), da série pET (Novagen, Madison, Wis.), da série pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), ou da série pEX (Clon- tech, Palo Alto, Calif.). Em alguns casos, vetores bacteriofágicos, tais como AG10, AGT11, AZapll (Stratagene), AEMBLA4, e ANM1149, tam- bém podem ser usados. Em algumas modalidades, vetores de expres- são vegetais podem ser usados e incluem pBI01, pBI101,2, pBI101,3, pBI121 e pBIN1I9 (Clontech). Em algumas modalidades, vetores de expressão animais incluem pEUK-CI, pMAM e pMAM neo (Clontech). Em algumas modalidades, usa-se um vetor viral, tal como um vetor retroviral.

[00359] Em algumas modalidades, os vetores de expressão recombi- nantes podem ser preparados por técnicas de DNA recombinante tra- dicionais. Em algumas modalidades, os vetores podem conter sequên- cias reguladoras, tais como códons de início e término de transcrição e translação, que são específicos para o tipo de hospedeiro (por exem- plo, bactéria, fungo, planta, ou animal) no qual o vetor deverá ser in- troduzido, conforme apropriado e levando em conta o fato de o vetor ser baseado em DNA ou em RNA. Em algumas modalidades, o vetor pode conter um promotor não nativo operacionalmente ligado à se- quência de nucleotídeos codificador o receptor recombinante. Em al- gumas modalidades, o promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, tal como um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de RSV, e um promotor encontrado na repetição terminal longa do vírus de células-tronco murino. Outros promotores conhecidos pelo especialista na técnica também são con- templados.

[00360] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células com a ajuda de partículas virais infeccio- sas recombinantes, tais como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adeno-associado (AAV). Em algu- mas modalidades, ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células T com a ajuda de vetores lentivirais ou vetores retrovirais recombinantes, tais como vetores gama-retroviral (vide, por exemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10,1038/gt,2014,25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550—557.

[00361] Em algumas modalidades, o vetor retroviral tem uma se- quência de repetição terminal longa (LTR), por exemplo, um vetor re- troviral derivado do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus de células-tronco embrionárias murino (MESV), vírus de células-tronco murino (MSCV), vírus formadores de focos no baço (SFFV), ou vírus adeno-associado (AAV). A maioria dos vetores retrovirais é derivada de retrovírus muri- nos. Em algumas modalidades, os retrovírus incluem aqueles deriva- dos de qualquer fonte de células aviárias ou de mamíferos. Os retrovií- rus são tipicamente anfotrópicos, o que significa que eles são capazes de infectar células hospedeiras de diversas espécies, inclusive huma- nos. Em uma modalidade, o gene a ser expresso substitui as sequên- cias de gag, pol e/ou env retrovirais. Já foram descritos inúmeros sis- temas retrovirais ilustrativos (por exemplo, Patentes US Nºº 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980- 990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al.

(1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

[00362] Métodos de transdução lentiviral são conhecidos no estado da técnica. Métodos exemplificativos estão descritos, por exemplo, em Wang et al. (2012) J. Inmunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-—1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; e Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

[00363] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células T via eletroporação (vide, por exemplo, Chicaybam et al., (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 e Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células T via transposição (vide, por exemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, ef4; e Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Outros métodos de introdução e expressão de material genético em células imunes in- cluem transfecção com fosfato de cálcio (por exemplo, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), fusão de protoplastos, transfecção mediada por liposso- mas catiônicos; bombardeamento de micropartículas facilitado por par- tículas tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e copreci- pitação de DNA com fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol, 7: 2031-2034 (1987)).

[00364] Outras abordagens e vetores para transferência dos ácidos nucleicos codificando os produtos recombinantes são aquelas descri- tas, por exemplo, na Publicação do pedido de patente internacional Nº WO 2014/055668, e na Patente US Nº 7,446,190.

[00365] Em alguns contextos, a superexpressão de um fator estimu- lador (por exemplo, uma linfocina ou uma citocina) pode ser tóxica pa-

ra um indivíduo. Assim sendo, em alguns contextos, as células geneti- camente modificadas incluem segmentos genéticos que fazem com que as células fiquem suscetíveis à seleção negativa in vivo, tal como mediante administração em imunoterapia adotiva. Por exemplo, em alguns aspectos, as células são geneticamente modificadas para que possam ser eliminadas como resultado de uma alteração na condição in vivo do paciente ao qual elas são administradas. O fenótipo selecio- nável negativo pode resultar da inserição de um gene que confere sensibilidade a um agente administrado, por exemplo, um composto. Genes selecionáveis negativos incluem o gene da timidina quinase tipo | do vírus do herpes simples (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 11 :223, 1977) que confere sensibilidade ao ganciclovir; o gene da hipoxantina fosforribosiltransferase celular (HPRT), o gene da adenina fosforribosil- transferase celular (APRT), citosina desaminase bacteriana, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

[00366] Em alguns aspectos, as células são ainda geneticamente modificadas para estimular a expressão de citocinas ou outros fatores.

[00367] Entre os ácidos nucleicos adicionais, por exemplo, genes pa- ra introdução são aqueles para melhorar a eficácia da terapia, tal como pelo estímulo da viabilidade e/ou função das células transfectadas; genes para oferecer um marcador genético para seleção e/ou avalia- ção das células, tal como para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo; genes para aumentar a segurança, por exemplo, deixando a célula suscetível à seleção negativa in vivo como descrito por Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); vide também as publicação do PCT/US91/08442 e do PCT/US94/05601 de Lupton et al. que descre- vem o uso de genes de fusão selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um mar- cador selecionável negativo. Vide, por exemplo, Riddell et al., Patente

US Nº 6,040,177, colunas 14-17. Composições e Formulações

[00368] Também são apresentadas populações de tais células, com- posições contendo tais células e/ou enriquecidas com tais células, tais como aquelas em que as células expressando o receptor recombinan- te constituem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais das células totais na composição ou células de um certo tipo tal como células T ou células CD8+ ou CD4+t. Entre as composições encontram-se composições e formulações farmacêuticas para administração, tal como para terapia celular adotiva. Também são apresentados métodos terapêuticos para administração das células e composições a indivíduos, por exemplo, pacientes.

[00369] Também são apresentadas composições incluindo as células para administração, incluindo composições e formulações farmacêuti- cas, tais como composições na forma de dose unitária incluindo o nú- mero de células para administração em uma dose dada ou fração da mesma. As composições e formulações farmacêuticas geralmente in- cluem um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitá- veis opcionais. Em algumas modalidades, a composição inclui pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00370] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma prepara- ção que está em uma forma tal para permitir que a atividade biológica de um princípio ativo contido na mesma seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada.

[00371] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um in- grediente em uma formulação farmacêutica, que não um princípio ati- vo, que é atóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, porém sem limitação, um tampão, excipiente, estabili-

zante, ou conservante.

[00372] Em alguns aspectos, a escolha do veículo é em parte deter- minada pela célula particular e/ou pelo método de administração. Por conseguinte, existem várias formulações adequadas. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter conservantes. Conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propilparabe- no, benzoato de sódio, e cloreto de benzalcônio. Em alguns aspectos, usa-se uma mistura de dois ou mais conservantes. Os conservantes ou misturas dos mesmos estão tipicamente presentes em uma quanti- dade de cerca de 0,0001% a cerca de 2% em peso da composição total. Veículos estão descritos, por exemplo, por Remington's Pharma- ceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Os veículos farma- ceuticamente aceitáveis geralmente são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, porém sem limitação: tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgâni- cos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexa- metôniom; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil para- beno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); poli- peptídios de baixmo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; mo- nossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formado- res de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, com- plexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como polieti- leno glicol (PEG).

[00373] Agentes tamponantes, em alguns aspectos, são incluídos nas composições. Agentes tamponantes adequados incluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio, e váios outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, usa-se uma mistura de dois ou mais agentes tamponantes. Os agentes tamponantes ou misturas dos mesmos estão tipicamente presentes em uma quantida- de de cerca de 0,001% a cerca de 4% em peso da composição total. Métodos para a preparação de composições farmacêuticas adminis- tráveis são conhecidos. Métodos exemplificativos estão descritos de forma mais detalhada, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).

[00374] As formulações podem incluir soluções aquosas. A formula- ção ou composição também pode conter mais de um princípio ativo útil para a indicação, doença ou condição específica sendo tratada com as células, de preferência com aquelas com atividades complementares para as células, onde as respectivas atividades não afetam adversa- mente uma à outra. Tais princípios ativos estão adequadamente pre- sentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finali- dade desejada. Assim sendo, em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ainda outros ou fármacos farmaceuticamente ati- vos, tais como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, asparagi- nase, busulfan, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracil, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituxi- mab, vimblastina, e/ou vincristina.

[00375] A composição farmacêutica em algumas modalidades con- tém as células em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a do- ença ou condição, tal como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática em algumas modalidades é monitorada por avaliação perió-

dica dos indivíduos tratados. A dosagem desejada pode ser distribuída por administração de um único bolo das células, por administração de vários bolos das células, ou por administração por infusão contínua das células.

[00376] As células e composições podem ser administradas por téc- nicas de administração, formulações e/ou dispositivos tradicionais. À administração das células pode ser autóloga ou heteróloga. Por exem- plo, células ou progenitores imunorsesponsivos podem ser obtidos de um indivíduo, e administrados ao mesmo indivíduo ou a um outro indi- víduo compatível. Células imunorresponsivas derivadas do sangue pe- riférico ou sua progênie (por exemplo, derivadas in vivo, ex vivo ou in vitro) podem ser administradas via injeção localizada, incluindo admi- nistração por meio de cateter, injeção sistêmica, injeção localizada, injeção intravenosa, ou injeção parenteral. Ao administrar uma compo- sição farmacêutica terapêutica (por exemplo, uma composição farma- cêutica contendo uma célula imunorresponsiva geneticamente modifi- cada), ela geralmente será formulada em uma forma injetável de do- sagem unitária (solução, suspensão, emulsão).

[00377] Formulações incluem aquelas para administração oral, intra- venosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intra- muscular, intranasal, bucal, sublingual, ou supositório. Em algumas modalidades, as populações de células são administradas por via pa- renteral. O termo "parenteral", conforme usado neste pedido, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal, e intraperitoneal. Em algumas modalidades, as células são administra- das ao indivíduo por distribuição sistêmica periférica por injeção intra- venosa, intraperitoneal, ou subcutânea.

[00378] As composições em algumas modalidades são apresentadas como preparações líquidas estéreis, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões, ou composições visco-

sas, que podem, em alguns aspectos, ser tamponadas para um pH selecionado. Preparações líquidas normalmente são mais fáceis de preparar do que géis, outras composições visocsas, e composições sólidas. Adicionalmente, composições líquidas são bem mais conveni- entes de administrar, especialmente por injeção. Composições visco- sas, por outro lado, podem ser formuladas dentro da faixa de viscosi- dade apropriada para proporcionar períodos de contato mais longos com tecidos específicos. As composições líquidas ou viscosas podem compreender veículos, que podem ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, poliol, (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e misturas adequadas dos mesmos.

[00379] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incor- poração das células em um solvente, tal como em mistura com um ve- ículo, diluente, ou excipiente adequado tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose, dextrose, entre outros. As composições po- dem conter substâncias auxiliares tais como agentes umectantes, dis- persantes ou emulsificantes (por exemplo, metilcelulose), agentes tamponantes de pH, aditivos gelificantes ou melhoradores da viscosi- dade, conservantes, agentes flavorizantes, e/ou corantes, dependendo da via de além disso e da preparação desejada. Textos clássicos po- dem, em alguns aspectos, ser consultados para preparar preparações adequadas.

[00380] Vários aditivos que melhoram a estabilidade e a esterilidade das composições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidan- tes, agentes quelantes, e tampões, podem ser adicionados. A preven- ção da ação de micro-organismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo- robutanol, fenol, a ácido sórbico. A absorção prolongada da forma far- macêutica injetável pode ser obtida pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00381] As formulações a serem usadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilidade pode ser facilmente consse- guida, por exemplo, por filtração por membranas de filtração estéreis. Métodos de Administração e Usos em Terapia Celular Adotiva

[00382] Neste pedido são apresentados métodos para administração das células, populações, e composições descritas neste pedido, e usos de tais células, populações, e composições descritas neste pedi- do, para o tratamento ou a prevenção de doenças, condições e distúr- bios, incluindo cânceres. Em algumas modalidades, as células, popu- lações, e composições são administradas a um indivíduo ou paciente tendo a doença ou condição específica a ser tratada, por exemplo, via terapia celular adotiva, tal como terapia adotiva com células T. Em al- gumas modalidades, as células e composições preparadas pelos mé- todos apresentados, tais como composições geneticamente modifica- das e composições finais subsequente à incubação e/ou outras etapas de processamento, são administradas a um indivíduo, tal como um in- divíduo que tem ou apresenta o risco de ter a doença ou condição. Em alguns aspectos, os métodos tratam assim, por exemplo, melhoram um ou mais sintomas, a doença ou condição, tal como reduzindo a carga tumoral em um câncer expressando um antígeno reconhecido por uma célula T geneticamente modificada.

[00383] Métodos para administração de células para terapia celular adotiva são conhecidos e podem ser usados junto com os métodos e composições apresentados. Por exemplo, métodos de terapia adotiva com células T estão descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US Nº 2003/0170238 concedida a Gruenberg et al.; Paten- te US Nº 4,690,915 concedida a Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Vide, por exemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Bio-

chem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

[00384] Conforme usado neste pedido, um "indivíduo" é um mamiífe- ro, tal como um ser humano ou outro animal, e é tipicamente um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo, por exemplo, pacien- te, ao qual as células, populações de células, ou composições são adminitradas é um mamífero, tipicamente um primata, tal como um ser humano. Em algumas modalidades, o primata é um macaco ou um chimpanzé. O indivíduo pode ser macho ou fêmea e pode ter qualquer idade adequada, incluindo bebês, crianças, adolescentes, adultos, e idosos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não pri- mata, tal como um roedor.

[00385] Conforme usado neste pedido, "tratamento" (e suas varia- ções gramaticais tais como "tratar" ou "tratando") refere-se à melhora ou redução completa ou parcial de uma doença ou condição ou distúr- bio, ou de um sintoma, efeito ou desfecho adverso, ou fenótipo associ- ado ao mesmo. Efeitos de tratamento desejáveis incluem, porém sem limitação, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas di- retas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, redução da ta- xa de evolução da doença, melhora ou mitigação do estado de doen- ça, e remissão ou prognóstico melhorado. Os termos não implicam a cura completa de uma doença ou a eliminação completa de qualquer sintoma ou efeito em todos os sintomas ou desfechos.

[00386] Conforme usado neste pedido, "retardar o desenvolvimento de uma doença" significa adiar, impedir, atrasar, retardar, estabilizar, suprimir e/ou postergar o desenvolvimento da doença (tal como cân- cer). Este atraso pode ser de períodos de tempo variáveis, dependen- do do histórico da doença e/ou do indivíduo sendo tratamento. Como é óbvio para o especialista na técnica, um atraso suficiente ou significa-

tivo pode, na prática, abranger prevenção, no sentido de que o indiví- duo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio avançado, tal como o desenvolvimento de metástase, pode ser retar- dado.

[00387] "Prevenção", conforme usado neste pedido, inclui proporcio- nar profilaxia em relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo que possa ser predisposto à doença, mas que ainda não fora diagnosticaco com a doença. Em algumas modalidades, as células e as composições apresentadas são usadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou impedir a evolução de uma doen- ça.

[00388] Conforme usado neste pedido, "suprimir" uma função ou ati- vidade é reduzir a função ou atividade em comparação com as mes- mas condições à exceção de uma condição ou parâmetro de interesse ou, alternativamente, em comparação com uma outra condição. Por exemplo, células que suprimem o crescimento tumoral reduzem a taxa de crescimento do tumor em comparação com a taxa de crescimento do tumor na ausência das células.

[00389] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, células, ou composição, no contexto da ad- ministração, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens/quanti- dades e pelos períodos de tempo necessários para obter um resultado desejado, tal como um resultado terapêutico ou profilático.

[00390] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica ou células, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens/quantidades e pelos períodos de tempo necessários para obter um resultado terapêutico desejado, tal como para o tratamento de uma doença, condição, ou distúrbio, e/ou efeito farmacocinético ou farmacodinâmico do tratamento. A quantida- de terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores tais co-

mo o estado de doença, a idade, o sexo, e o peso do indivíduo, e as populações de células administradas. Em algumas modalidades, os métodos apresentados envolvem a administração de células e/ou composições em quantidades eficazes, por exemplo, quantidades te- rapeuticament eeficazes.

[00391] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens/quantidades e pelos períodos de tempo necessários para obter o resultado profilático desejado. Tipica- mente, mas não necessariamente, como que uma dose profilática é usada nos indivíduos antes da doença ou em um estágio inicial da do- ença, a quantidade profilaticamente eficaz será mais baixa que a quantidade terapeuticamente eficaz. No contexto de carga tumoral mais baixa, a quantidade profilaticamente eficaz, em alguns aspectos, será mais alta que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[00392] Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença per- sistente ou reincidente, por exemplo, depois de tratamento com outra intervenção terapêutica, incluindo quimioterapia, radioterapia, e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT), por exemplo, HSCT alogênicas. Em algumas modalidades, a administração trata efetivamente o indivíduo apesar de ele ter criado resistência à alguma outra terapia.

[00393] Métodos para a administração de células para terapia celular adotiva são conhecidos e podem ser usados em conjunto com os mé- todos e as composições apresentados. Por exemplo, métodos de tera- pia adotiva com células T estão descritos, por exemplo, na Publicação do pedido de patente US Nº 2003/0170238 concedida a Gruenberg et al.; Patente US Nº 4,690,915 concedida a Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Vide, por exemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS

ONE 8(4): e61338.

[00394] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, te- rapia adotiva com células T, é realizada por transferência autóloga, na qual as células são isoladas e/ou de alguma forma preparadas a partir do indivíduo que vai receber a terapia celular, ou a partir de uma amostra proveniente de tal indivíduo. Assim sendo, em alguns aspec- tos, as células são provenientes de um indivíduo, por exemplo, pacien- te, com necessidade de tratamento e as células, depois de isolamento de processamento, são administradas ao mesmo indivíduo.

[00395] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, te- rapia adotiva com células T, é realizada por transferência alogênica, na qual as células são isoladas e/ou de alguma forma preparadas a partir de um indivíduo que não aquele que vai receber ou que essenci- almente recebe a terapia celular, por exemplo, um primeiro indivíduo. Em tais modalidades, as células são então administradas a um outro indivíduo, por exemplo, um segundo indivíduo, da mesma espécie. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo são geneticmente idên- ticos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo são geneti- cmente similares. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo ex- pressa a mesma classe ou super-tipo de HLA que o primeiro indivíduo.

[00396] Em algumas modalidades, o indivíduo já fora tratado com um agente terapêutico vetorizado para a doença ou condição, por exem- plo, o tumor, antes da administração das células ou da composição contendo as células. Em alguns aspectos, o indivíduo é refratário ou não responsivo ao outro agente terapêutico. Em algumas modalida- des, o indivíduo apresenta uma doença persistente ou reincidente, por exemplo, depois de tratamento com alguma outra intervenção terapêu- tica, incluindo quimioterapia, radioterapia, e/ou terapia com células- tronco hematopoiéticas (HSCT), por exemplo, HSCT alogênicas. Em algumas modalidades, a administração trata o indivíduo de forma efi-

caz apesar de o indivíduo ter ficado resistente a alguma outra teapia.

[00397] Em algumas modalidades, o indivíduo é responsivo ao outro agente terapêutico, e o tratamento com o agente terapêutico reduz a carga da doença. Em alguns aspectos, o indivíduo inicialmente é res- ponsivo ao agente terapêutico, mas apresenta uma recidiva da doença ou condição com o tempo. Em algumas modalidades, o indivíduo não apresentou recidiva. Em algumas destas modalidades, determinou-se que o indivíduo apresentava risco de recidiva, tal como um alto risco de recidiva, e assim as células são administradas profilaticamente, por exemplo, para reduzir a probabilidade de recidiva ou prevenir uma re- cidiva.

[00398] Em alguns aspectos, o indivíduo não recebera tratamento anterior com outro agente terapêutico.

[00399] Entre as doenças, condições e distúrbios para tratamento com as composições, células, métodos e usos apresentados estão tumores, incluindo tumores sólidos, malignidades hematológicas, e melanomas, e doenças infecciosas, tais como infecção com um vírus ou outro patógfeno, por exemplo, HIV, HCV, HBV, CMV, e doenças parasitárias. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um tumor, câncer, malignidade, neoplasma, ou outras doenças ou distúr- bios proliferativos. Tais doenças incluem, porém sem limitação, leuce- mia, linfoma, por exemplo, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma folicular refratário, linfoma de células do manto, linforma de células B indolentes, malignidades de células B, câncer de cólon, de pulmão, de fígado, de mama, de próstata, de ová- rio, de pele, melanoma, câncer ósseo e de cérebro, câncer de ovário, cânceres epiteliais, carcinoma de células renais, adenocarcinoma de pâncreas, linfoma de Hodgkin, carcinoma cervical, câncer colorretal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, meduloblastoma,

osteossarcoma, sarcoma sinovial, e/ou mesotelioma.

[00400] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma do- ença ou condição infecciosa tal como, porém, sem limitação, infecções virais, retrovirais, bacterialhas e protozoárias, imunodeficiência, cito- megalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), adenovírus, poliomaví- rus BK. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doen- ça ou condição autoimune ou inflamatória, tal como artrite, por exem- plo, artrite reumatoide (RA), diabetes tipo |, lúpus eritemtoso sistêmico (SLE), doença intestinal inflamatória, psoríase, esclerodermia, doença autoimune da tireoide, doença de Grave, doença de Crohn, esclerose múltipla, asma, e/ou uma doença ou condição associada a transplante.

[00401] Em algumas modalidades, o antígeno associado à doença, distúrbio ou condição é selecionado dentre ROR1, antígeno de matu- ração das células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (tirosina quinase receptora erbB2), LI-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, e antígeno superficial da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoprote- ína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa?2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vill, proteína de liga- ção de folato (FBP), FCRL5, FOCRH5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor do domínio de inserção de quinases (kdr), cadeia leve capa, Lewis Y, molécula de adesão celular L1, (LI-CAM), antígeno associado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-AG6, antígeno preferencialmente ex presso de melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa 2 de 11-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AIl MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, integrina avb6, 8H9, NOAM, receptores de VEGF, 5T4, AchR fetal, ligandos de NKG2D, CD44v6, antígeno dual, um antí- geno cancerígeno de testículo, mesotelina, CMV murino, mucina 1

(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antíge- no oncofetal, ROR1I, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), , Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, ephrinB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, um antíge- no patógeno-específico.

[00402] Em algumas modalidades, o antígeno associado à doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em receptor de tirosina quinase órfão ROR1, tEGFR, Her2, LI-CAM, CD19, CD20, CD22, me- sotelina, CEA, e antígeno superficial da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP, OEPHa?2, ErbB2, 3, or 4, FBP, acetilcolina e receptor fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadeia leve capa, Lewis Y, molécula de adesão celular L1, MAGE-A1I, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, an- tígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrioná- rio (CEA), antígeno específico da próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, ephrinB2, CD123, CS-1, c- Met, GD-2, e MAGE A3 e/ou moléculas biotiniladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.

[00403] Em algumas modalidades, as células são administradas em uma dosagem desejada, que, em alguns aspectos, inclui uma dose ou número de células ou tipos de células desejados e/ou uma proporção desejada de tipos de célula. Assim sendo, a dosagem de células em algumas modalidades beaseia-se no número total de células (ou nú- mero por kg de peso corporal) e na proporção desejada das popula- ções ou subtipos individuais, tal como a proporção de CD4+ para CD8+. Em algumas modalidades, a dosagem de células em algumas modalidades beaseia-se em um número total desejado (ou número por kg de peso corporal) nas populações individuais ou de tipos de células individuais. Em algumas modalidades, a dosagem baseia-se em uma combinação de tais características, tal como um número desejado de células totais, em uma proporção desejada, e em um número total de- sejado de células nas populações individuais.

[00404] Em algumas modalidades, as populações ou subtipos de cé- lulas, tais como células T CD8* e CD4*, recebem a administração de uma dose desejada de células totais ou de uma dose dentro de uma diferença tolerada de uma dose desejada de células totais, tal como uma dose desejada de células T. Em alguns aspectos, a dose deseja- da é um número desejado de células ou um número desejado de célu- las por unidade de peso corpor

[00406] Assim sendo, em algumas modalidades, a dosagem baseia- se em uma dose fixa desejada de células totais e uma proporção de- sejada, e/ou baseia-se em uma dose fixa desejada de uma ou mais, por exemplo, cada um, dos subtipos ou subpopulações individuais. Assim sendo, em algumas modalidades, a dosagem baseia-se em uma dose fixa ou mínima desejada de células T e uma proporção de- sejad de células CD4* para células CD8*, e/ou baseia-se em uma dose fixa desejada de células CD4* e/ou CD8*.

[00407] Em certas modalidades, as células, ou populações individuais de subtipos de células, são administradas ao indivíduo em uma faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células, tal como, por exemplo, 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cer- ca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bi- lhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores precedentes), tal como cerca de 10 milhões a cerca de 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 milhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de cé- lulas, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 milhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores pre- cedentes), e em alguns casos cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões de célu- las, cerca de 250 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 milhões de células, cerca de 650 milhões de células, cer- ca de 800 milhões de células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células) ou qualquer valor dentro destas faixas.

[00408] Em algumas modalidades, a dose de células totais e/ou a dose de subpopulações individuais de células varia dentro de uma fai- xa entre cerca de 10º e cerca de 10º células/quilo (kg) de peso corpo- ral, tal como entre 10º e 10º células / kg de peso corporal, por exemplo, cerca de 1 x 10º células/kg, 1,5 x 10º células/kg, 2 x 10º células/kg, ou 1x 108º células/kg de peso corporal. Por exemplo, em algumas modali- dades, as células são administradas dentro de uma certa faixa de erro entre cerca de 10º e cerca de 10º células T/quilo (kg) de peso corporal, tal como entre 10º e 10º células T / kg de peso corporal, por exemplo, cerca de 1 x 10º células T/kg, 1,5 x 10º células T/kg, 2 x 10º células T/Kkg, ou 1 x 10º células T/kg de peso corporal.

[00409] Em algumas modalidades, as células são administradas den- tro de uma certa faixa de erro entre cerca de 10º e cerca de 10º células CD4* e/ou CD8*/quilo (kg) de peso corporal, tal como entre 10º e 10º células CD4* e/ou CD8* / kg de peso corporal, por exemplo, cerca de 1 x 10º células CD4* e/ou CD8*/kg, 1,5 x 10º células CD4* e/ou CD8*/kg, 2 x 10º células CD4* e/ou CD8*/kg, ou 1 x 10º células CD4* e/ou CD8*/kg de peso corporal.

[00410] Em algumas modalidades, as células são administradas den- tro de uma certa faixa de erro maior que, e/ou pelo menos igual a cer- ca de 1 x 106, cerca de 2,5 x 106, cerca de 5 x 106, cerca de 7,5 x 10º, ou cerca de 9 x 10º células CD4*, e/ou pelo menos cerca de 1 x 108, cerca de 2,5 x 108, cerca de 5 x 108, cerca de 7,5 x 108, ou cerca de 9 x 108 células CD8+, e/ou pelo menos cerca de 1 x 106, cerca de 2,5 x 108, cerca de 5 x 108, cerca de 7,5 x 106, ou cerca de 9 x 10º células T. Em algumas modalidades, as células são administradas dentro de uma certa faixa de erro entre cerca de 10º e 10º? ou entre cerca de 10*º e 10º? T cells, entre cerca de 108 e 10"? ou entre cerca de 10º e 10"? células CD4*, e/ou entre cerca de 10º e 10"? ou entre cerca de

10º e 10 células CD8*.

[00411] Em algumas modalidades, as células são administradas den- tro de uma faixa tolerada de uma proporção de saída desejada de vá- rias populações ou subtipos de células, tais como células CD4+ e CD8+ ou subtipos. Em alguns aspectos, a proporção desejada pode ser uma proporção específica ou pode ser uma gama de proporções. Por exemplo, em algumas modalidades, a proporção desejada (por exemplo, a proporção de células CD4* para células CD8*) varia entre cerca de 5:1 e cerca de 5:1 (ou mais de cerca de 1:5 e menos de cer- ca de 5:1), ou entre cerca de 1:3 e cerca de 3:1 (ou mais de cerca de 1:3 e menos de cerca de 3:1), tal como entre cerca de 2:1 e cerca de 1:5 (ou mais de cerca de 1:5 e menos de cerca de 2:1, tal como cerca de 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,51, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:16, 1:1,7, 1:1,8, 1:1,9: 1:2, 1:2,5, 1:3, 1:3,5, 1:4, 1:4,5, ou 1:5. Em alguns aspectos, a diferença tolerada é de cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4% cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50% da proporção desejada, incluindo qual- quer valor dentro destas faixas.

[00412] Para a prevenção ou o tratamento de doenças, a dosagem apropriada pode depender do tipo da doença a ser tratada, do tipo de células ou de receptores recombinantes, da severidade e da evolução da doença, do fato de as células serem administradas com fins pre- ventivos ou terapêuticos, do histórico clínico do indivíduo e da resposta às células, e do critério do médico assistente. As composições e célu- las em algumas modalidades são administradas de forma adequada ao indivíduo uma só vez ou durante uma série de tratamentos.

[00413] As células podem ser administradas por qualquer meio ade- quado, por exemplo, por infusão de bolo, por injeção, por exemplo, in-

jeções intravenosas ou subcutâneas, injeção intraocular, injeção perio- cular, injeção subretiniana, injeção intravítrea, injeção trans-septal, in- jeção subescleral, injeção intracoroidal, injeção intracameral, injeção subconjectval, injeção subconjuntival, injeção sub-tenoniana, injeção retrobulbar, injeção peribulbar, ou distribuição juxtaescleral posterior. Em algumas modalidades, elas são administradas por administração parenteral, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem admi- nistração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Em algumas modalidades, uma dada dose é administrada por administração de um único bolo das células. Em algumas modali- dades, ela é administrada por administração de múltiplos bolos das células, por exemplo, por um período de no máximo 3 dias, ou por administração por infusão contínua das células.

[00414] Em algumas modalidades, as células são administradas co- mo parte de um tratamento combinado, tal como simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem, com qualquer outra intervenção terapêutica, tal como um anticorpo ou uma célula geneticamente modi- ficada ou receptor ou agente, tal como um agente citotóxico ou tera- pêutico. As células em algumas modalidades são coadministradas com um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou junto com alguma outra intervenção tearpêutica, seja simultaneamente ou sequencial- mente em qualquer ordem. Em alguns contextos, as células são co- administradas com outra terapia em um espaço de tempo suffciente- mente próximo para que as populações de células potencializem o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células são administradas antes do um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células são administradas depois do um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes adicio-

nais incluem uma citocina, tal como IL-2, por exemplo, para potenciali- zar a persistência. Em algumas modalidades, os métodos compreen- dem a administração de um agente quimioterapêutico.

[00415] Depois da administração das células, a atividade biológica das populações de células geneticamente modificadas em algumas modalidades é medida, por exemplo, por qualquer um de inúmeros métodos conhecidos. Os parâmetros para avaliação incluem a ligação específica de uma célula T natural ou geneticamente modificada ou outra célula imune ao antígeno, in vivo, por exemplo, por imagem, ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas mo- dalidades, a capacidade das células geneticamente modificadas para destruir as células alvo pode ser medida por meio de qualquer método adequado conhecido na literatura, tal como os ensaios de citotoxicida- de descritos, por exemplo, em Kochenderfer et al., J. Inmunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), e Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). Em certas modalidades, a atividade biológica das células é medida por análise da expressão e/ou secreção de uma ou mais citocinas, tal como CD 107a, IFNy, IL-2, e TNF. Em alguns aspectos, a atividade biológica das células é medida por avaliação do resultado clínico, tal como redução na carga tumoral.

[00416] Em certas modalidades, as células geneticamente modifica- das são ainda modificadas de inúmeras maneiras. Para que sua eficá- cia terapêutica ou profilática seja aumentada. Por exemplo, o CAR ou TCR geneticamente modificado expresso pela população pode ser conjugado direta ou indiretamente através de um ligador a uma porção de vetorização. A prática de conjugar compostos, por exemplo, o CAR ou TCR, a porções de vetorizção é conhecida no estado da técnica. Vide, por exemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) e Patente US 5,087,616.

EXEMPLOS

[00417] Os Exemplos a seguir são meramente ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo ou o teor da invenção de forma alguma. Exemplo 1 - Sequenciamento inicial de gRNAs.

[00418] RNAs guias foram rastreados complexando gRNAs sinteti- zados comercialmente com Cas9 in vitro e distribuindo o gRNA/ribonu- cleoproteína Cas9 (RNP) para células via eletroporação.

[00419] A Fig. 1 representa a % de frequência de indel dos gRNAs de teste. A Fig. 2 representa a eficiência de edição do genoma de cer- tos pares de gRNA exemplificativos. Exemplo 2 — Análise dos gRNA candidatos contra TGFBR2 em cé- lulas T.

[00420] O objetivo da edição de células por CRISPR-Cas9 é atingir o percentual mais alto de nocaute do gene alvo usando a mais baixa concentração possível do complexo de gRNA/Cas9 e o número míni- mo de eventos de corte fora do alvo. Para determinar os melhores gRNAs candidatos possíveis para edição do gene de TGFBR?2, foram testados sete potenciais gRNAs. Células T foram transfectadas com RNPs de gRNA/Cas9 em várias concentrações. A frequência percen- tual de indels foi então determinada por análise de miSeq Illumina. Os resultados mostram que a frequência % de indels para diferentes gRNAs variou de 20% a 80%, com todos os gRNAs atingindo a fre- quência % de indels mais alta a uma concentração de RNP de 2 uM (Fig. 3). A concentração de 2 uM de RNP foi subsequentemente usado em todos os experimentos.

[00421] —gRNAs seletos da análise de miSeq foram escolhidos para nova análise em células T BCMA CAR. Os gRNAs de SEQ ID Nos: 5050, 5052, 5093, e 5043 foram usados em um novo ensaio de corte de RNP para determinar a % de edição do gene de TGFBR2. Uma abordagem de gRNA dual também foi testada com a combinação das

SEQ ID NO: 5043/5093. Enquanto os gRNAs individuais de SEQ ID NO: 5043 e 5093 atingiram apenas 20-40% de edição, constatou-se que a combinação era mais eficaz, produzindo um valor editado % de aproximadamente 80% (Fig. 4A).

[00422] Análise de sequenciamento de alto rendimento foi realizada com gRNAs seletos para determinar a frequência % de indels. Os gRNAs de SEQ ID NO: a e b e a combinação de gRNA dual de c/d fo- ram testados. Extraordinariamente, frequências % de indels tão altas quanto 95% foram atingidas a partir dos gRNAs seletos (Fig. 4B).

[00423] Embora a frequência % de indels seja uma medida útil da efetividade de um gRNA, uma parte dos indels produzidos pode ser de inserções ou deleções "in-frame". Tais indels "in-frame" podem produ- zir um gene modificado cujo produto proteico conserva uma certa ati- vidade. Na tentativa de produzir o nocaute de um gene, indels "out-of- frame" são preferidos. Para garantir que os gRNAs testados estavam, de fato, produzindo os indels "out-of-frame" desejados, os resultados do sequenciamento foram analisados quanto aos tipos específicos de indels produzidos. Os resultados mostram que enquanto a SEQ ID NO: 5052 produziu a frequência % mais alta de indels, a SEQ ID NO: 5050 gerou a a frequência % mais alta de indels "out-of-frame" (Fig. 5). Exemplo 3 — Eficácia in vitro da edição de genes em células T primárias e em células T geneticamente modificadas.

[00424] Os efeitos inibitórios do TGFRB foram analisados em células T primárias modificadas para expressar CAR vetorizado para BCMA. As células T expressando CAR anti-BCMA foram adicionalmente modi- ficadas para ter o gene de TGFBR?2 editado via o sistema CRISPR- Cas9 usando gRNAs seletos. Controle de AAVS1 para a edição de ge- nes e células T expressando CAR anti-BCMA com gene de TGFBR2 não editado foram usados como controles. As linhagens celulares fo- ram co-cultivadas com a linhagem celular RPMI 8226 de mieloma múl-

tiplo com ou sem 10 ng/ml de TGFB. Na presença de excesso de TGFRB, as células T primárias e as células T expressando CAR anti- BCMA apresentam os efeitos inibitórios esperados de produção redu- zida de Interferon-gama (IFNy). No entanto, nas células T expressando CAR anti-BCMA, os efeitos inibitórios do TGFB recuperados, restau- rando a produção de IFNy para os níveis encontrados sem a adição de TGFRB (Fig. 6).

[00425] Inibição da proliferação de células T é um dos efeitos cau- sados pela sinalização de TGFRB (Tiemessen et al. Int. Immunol. 15:1495-1504. 2003). Para tratar dos efeitos da sinalização de TGFB na proliferação celular, a proliferação de células T expressando CAR anti-BCMA foi monitorada em um fundo de genes de TGFBR?2 edita- dos usando diversos gRNAs. Com o gene de TGFBR?2 editado, as cé- lulas T expressando CAR anti-BCMA foram capazes de proliferar na presença de excesso de TGFRB (Fig. 7).

[00426] A atividade das células T é influenciada pela expressão de vários receptores estimuladores e inibitórios. A expressão de CD25 foi avaliada em células T expressando CAR anti-<BCMA com genes de TGFBR?2 editados. A edição de genes de TGFBR?2 leva a níveis mais altos de expressão de CD25 comparado com as células de controle quando expostas ao TGFB (Fig. 8A). A expressão do receptor inibitó- rio, PD-1, também foi avaliada medindo-se a % de células PD-1+ com e sem excesso de TGFB. As células T expressando CAR anti-BCMA com genes de TGFBR2 editados apresentou um aumento menor de PD-1 em relação às células de controle. Surpreendentemente, as célu- las de genes editados também levaram a um menor número de células PD-1+ mesmo quando TGFB não foi adicionado (Fig. 8B).

[00427] A ativação da via de sinalização de TGFB leva à fosforila- ção do complexo de Smad 2/3 que, por sua vez, regula muitos dos processos a jusante da via de sinalização de TGFB. Por este motivo, o

Smad 2/3 fosforilado é frequentemente usado como uma medida de sinalização de TGFB nas células. Smad2/3 fosforilado foi detectado em células T transduzidas para expressar diferentes CARs, com ou sem edição de genes de TGFBR?2. Células T expressando CAR incluindo a edição de genes de AAVS1 de controle, com (10ng/ml) ou sem TGFRB, foram usadas como controles. Embora o excesso de TGFB resulte no aumento esperado na fosforilação de Smad 2/3 em células não edita- das, as células com genes de TGFBR?2 editados mantiveram o mesmo nível de fosforilação de Smad 2/3 com e sem a adição de TGFB (Fig. 9). Os resultados demonstram que a abordagem de edição de genes de TGFBR2 por CRISPR é eficaz no silenciamento da via de sinaliza- ção de TGFRB.

[00428] Para analisar ainda os efeitos da edição do gene de TGFBR2 em diferentes fundos de células T expressando CAR, os níveis de GzmB foram detectados com e sem TGFB. Células T expressando CAR inclu- indo a edição de genes de AAVS1 de controle, com (10ng/ml) ou sem TGFRB, foram usadas como controles. Os resultados da coloração in- tracelular de GzmB revelam que a edição de genes de TGFBR2 man- tém a expressão de GzmB na presença de TGFB (Fig. 10).

[00429] A produção de IFNy foi analisada em um experimento simi- lar descrito na Fig. 10 usando um ensaio de detecção de citocinas. Consistente com os resultados anteriores de expressão de GzmB, a produção de IFNy foi mantida e até mesmo aumentada no fundo de genes de TGFBR2 editados em relação aos controles em condições de excesso de TGFRB (Fig. 11).

[00430] A proliferação celular foi analisada em um experimento si- milar descrito na Fig. 10 e na Fig. 11 usando o ensaio Edu Click-lt da ThermofFisher. A proliferação celular foi mantida no fundo de genes de TGFBR?2 editados em relação aos controles em condições de excesso de TGFB (Fig. 12).

[00431] Os resultados conjuntos do Exemplo 3 demonstram as vantagens de empregar o sistema de edição de genes CRISPR-Cas9 para editar o gene de TGFBR2. Usando a abordagem de gRNA sim- ples e dual, a via de sinalização de TGFB pode ser efetivamente su- primida em um fundo de células T expressando CAR. Exemplo 4 — Comparação da abordagem negativa dominante de TGFBR?2 com a abordagem de edição de genes por CRISPR-Cas9.

[00432] Uma abordagem alternativa de anular a sinalização TGFB é expressar uma forma negativa dominante de TGFBR2 (DN). Esta versão de TGFBR2 compete com o TGFBR?2 do tipo selvagem pela ligação ao TGFB, minimizando assim a resposta de sinalização eficaz.

[00433] Os efeitos inibitórios do TGFB foram analisados em células T primárias transduzidas para expressar CAR anti-BCMA. As células T expressando CAR anti-BCMA foram adicionalmente modificadas seja para expressar o DN ou para ter o gene de TGFBR?2 editado via o sis- tema CRISPR-Cas9. As células editadas por CRISPR-Cas9 foram edi- tadas com gRNAs duais de SEQ ID Nos: 5043 e 5093. AAVS1 de con- trole para edição de genes, células T expressando CAR anti-BCMA com gene de TGFBR2 não editado, e células T expressando CAR anti- BCMA incluindo edição do gene de AAVS1 de controle foram usados como controles. As linhagens celulares foram co-cultivadas com a li- nhagem celular RPMI 8226 de mieloma múltiplo com ou sem 10 ng/ml de TGFB. Na presença de excesso de TGFB, as células T primárias e as células T expressando CAR anti-BCMA apresentam os efeitos inibi- tórios esperados de produção reduzida de GzmB (Fig. 13A) e de IFNy (Fig. 13B). Entretanto, nas células T DN ou nas células T expressando CAR anti-BCMA editadas por CRISPR, os efeitos inibitórios do TGFB são recuperados, restaurando a produção de GzmB e de IFNy para os níveis encontrados sem adição de TGFRB.

[00434] Para demonstrar ainda a utilidade de recuperação dos efei-

tos inibitórios da sinalização de TGFB, as células T expressando CAR anti-BCMA no fundo DN ou no fundo editado por CRISPR foram anali- sadas quanto a sua atividade de destruição. Células T expressando CAR anti-BCMA com gene de TGFBR2 não editado foram usadas co- mo controle. As células T expressando CAR anti-BCMA foram co- cultivadas com células RPMI 8226 em uma proporção de 1 célula T expressando CAR anti-BCMA para 4 células RPMI, com ou sem 10 ng/ml de TGFRB. A atividade lítica das células T expressando CAR anti- BCMA foi mantida tanto no fundo DN como no fundo editado por CRISPR na presença de TGFRB. Surpreendemente, as células T ex- pressando CAR anti-BCMA editadas por CRISPR apresentaram ativi- dade lítica superior quando comparadas com as células DN (Fig. 14). A atividade lítica das células T expressando CAR anti-BCMA editadas por CRISPR foi mais alta que aquela das células de controle mesmo sem a adição de excesso de TGFB.

[00435] Estimulação antigênica repetida de células T, incluindo cé- lulas T exppressando CAR, leva à persistência diminuída de células T e pode causar morte celular induzida por ativação (AICD) (Gargett et al. Mol. Ther. 24: 1135-1149. 2016). Estratégias para manter a ativida- de das células T contra um antígeno específico são de grande impor- tância para aumentar a eficácia das terapias à base de células T. As células T expressando CAR anti-BCMA no fundo DN ou fundo editado por CRISPR foram analisadas quanto a sua capacidade proliferativa na presença de estimulação repetida com TGFRB. Células T expres- sando CAR anti-BCMA com gene de TGFBR2 não editado foram usa- das como controle. Enquanto que as células T expressando CAR anti- BCMA não modificadas não proliferaram durante vários dias de esti- mulação com TGFRB, as células TGBR2 DN ou as células editadas por CRISPR continuaram a proliferar ao longo do tempo na presença de TGFRB (Fig. 15A-Fig. 15C). A percentagem de células T expressando

CAR anti-BCMA também não foi diminuída durante a estimulação re- petida com TGFB (Fig. 15D-Fig. 15F).

[00436] A produção de IFNy foi novamente analisada no fundo DN e no fundo com gene editado usando uma abordagem de gRNA sim- ples e não, dual. Uma linhagem celular de mieloma múltiplo adicional, OPM;?, foi usada para comparação com a linhagem celular RPMI 8226 usada anteriormente, descrita na Fig. 13. Consistente com os resulta- dos anteriores, inibição da sinalização de TGFB manteve efetivamente a produção de IFNy na presença de excesso de TGFRB. Isto também ocorre com as linhagens celulares RPM! (Fig. 16A) e OPM?2 (Fig. 16B).

[00437] A expressão de CD25 também foi analisada no fundo DN e no fundo com gene editado usando uma abordagem de gRNA simples. À expressão de CD25 foi mantida na presença de excesso de TGFB nas linhagens celulares RPMI (Fig. 17A) e OPM2 (Fig. 17B). Surpreendente- mente, a expressão de CD25 nas células DN e nas células com gene editado foi aumentada em relação às células T não modificadas.

[00438] A expressão de PD-1 foi detectada de maneira similar no fundo DN e no fundo com gene editado. A repressão da sinalização de TGFB com qualquer uma das abordagens preveniu efetivamente a ex- pressão aumentada de PD-1 na presença de excesso de TGFRB (Fig. 18A e 18B).

[00439] Os experimentos anteriores usaram TGFB em uma dose estabelecida de 10ng/ml para estimulação. Para melhor entender co- mo a edição do gene de TGFBR2 afeta a sinalização de TGFB em condições fisiológicas, foi usada uma faixa de O a 100 ng/ml de TGFB. Esta faixa baseia-se em um trabalho anterior demonstrando que os níveis séricos de TGFB variam de aproximadamente 3 a 88 ng/ml (Aref et al. Hematological Oncology. 35: 51-57. 2017) e de aproximadamen- te 3 a 10 ngíml na medula óssea com mieloma múltiplo (Bruns et al. Blood. 120: 2620-2630. 2012). Foi usado um ensaio de proliferação celular para determinar a expansão relativa das células no fundo DN e no fundo com gene editado. Células T expressando CAR anti-BCMA foram co-cultivadas com células RPMI 8226 em uma proporção de 1:1. Inesperadamente, os efeitos positivos na proliferação celular podem ser vistos a concentrações tão baixas quanto 0,1 ng/ml de TGFB, bem abaixo dos níveis fisiológicos em um cenário normal ou de câncer (Fig. 19A). Esta responsividade é ainda demonstrada pela produção au- mentada de IFNy (Fig. 19B).

[00440] A mesma faixa de concentrações de TGFB foi usada para analisar a expressão de PD-1 em células T CD4+ e CD8+ expressan- do CAR. Mais uma vez, o fundo TGFBR2 DN e o fundo com gene edi- tado foram capazes de manter níveis baixos de expressão de PD-1 tão baixos quanto 0,1 ng/ml de TGFB (Fig. 20A e 20B).

[00441] A estratégia de DN TGFBR?2 foi usada para determinar a proliferação celular, a expressão de Granzima B, e a fosforilação de Smad 2/3 em células T transduzidas para expressar três CARs dife- rentes. O TGFBR2 DN foi capaz de recuperar os efeitos antiproliferati- vos do excesso de TGFB nos fundos com células T expressando CAR. O DN foi capaz de manter a expressão de Granzima B na presença de excesso de TGFB nos fundos com células T expressando CAR testa- dos. Por fim, o DN foi capaz de suprimir efetivamente a sinalização de TGFRB na presença de excesso de TGFB segundo medido pela fosfori- lação reduzida de Smad 2/3 nos fundos com células T expressando CAR testados (Fig. 22). São mostrados os dados para apenas um dos três fundos com células T expressando CAR, no entanto resultados similares também foram observados para os outros dois fundos com células T expressando CAR. Exemplo 5 — Perfil transcricional de células T expressando BCMA CAR in vivo.

[00442] Para que a estratégia de edição do gene de TGFBR2 des-

crita neste pedido constitua uma terapia eficaz, a via imunossupresso- ra de TGFB deve estar presente em um cenário in vivo. Se a referida via imunossupressora de TGFB estiver presente, então a estratégia de edição do gene de TGFBR2 deve insentar eficazmente as células T dos efeitos imunossupressores de TGFB. Para abordar estes dois pon- tos, o perfil transcricional de células T expressando CAR anti-BCMA CAR T foi traçado a partir de células T expressando CAR anti-BCMA isoladas do microambiente tumoral em camundongos. O modelo de xenoenxerto de tumor foi gerado implantando-se nos camundongos células RPMI 8226 de mieloma múltiplo que foram deixadas propaga- rem/formarem um tumor por 21 dias. Depois do período de incubação de 21 dias, células T expressando CAR anti-BCMA de um fundo de edição do gene AAVS do tipo selvagem de controle, ou de um fundo TGFBR2 DN, ou de um fundo com gene de TGFBR2 editado foram inje- tadas nos camundongos portadores de tumor. Deixou-se que o tumor regredisse por 14 dias antes que leucócitos infiltrantes de tumor (TILs) e células T expressando CAR fossem isolados do tumor e do baço (um tecido não canceroso de controle negativo). Depois do isolamento, análise de RNAsegq foi efetuadas nas células para determinar os perfis de expressão gênica dos membros da via de sinalização de TGFB.

[00443] Os resultados dos perfis transcricionais revelam que a edi- ção do gene de TGFBR2 em células T expressando CAR limita com sucesso a expressão de diversos membros da via de sinalização de TGFB no tumor, onde ocorre sinalização repressora de TGFB (Fig. 21). Como mostrado na Fig. 21, os membros da via de sinalização de TGFB são supra-regulados células T expressando CAR anti-BCMA isoladas do tumor, mas não do baço. Os dados indicam que as células T expressando CAR anti-BCMA ficam expostas no microambiente tu- moral enriquecido de TGFB (TME). Além disso, células T expressando CAR anti-<BCMA com fundo de TGFBR2 DN ou com fundo de gene de

TGFBR?2 editado revertem a supra-regulação dos membros da via de sinalização de TGFB. Os dados indicam que a via de sinalização de TGFRB foi efetivamente abolida. Exemplo 6 — Vantagem seletiva da estratégia de edição do gene de TGFBR2.

[00444] Para determinar se as células T expressando CAR com ge- ne de TGFBR?2 editado apresentam alguma vantagem seletiva de pro- liferação, células T expressando CAR anti-BCMA tiveram o gene edi- tado para produzir diferentes frequências % de indels. Estas popula- ções de células T expressando CAR de % de indels diferentes foram co-cultivadas com células RPMI 8226 em uma proporção de 1:1 para estimulação, com ou sem 10 ng/ml de TGFB. As células foram avalia- das por meio de sequenciamento de alto rendimento, aproximadamen- te a cada 7 dias, para determinar qual porção das células tem o gene editado e qual porção ainda é do tipo selvagem (Fig. 23). As células são novamente estimuladas com células RPMI frescas, com a propor- ção de 1:1 sendo reajustada uma vez por semana. Os resultados mos- tram que a edição do gene de TGFBR2 confere uma vantagem seleti- va de proliferação em relação às células do tipo selvagem em um am- biente imunoestimulador (vide Fig. 24). Incorporação a título de referência

[00445] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente men- cionados neste pedido estão encontram-se aqui incorporados em sua íntegra a título de referência como se cada publicação, patente ou pe- dido de patente individual estivesse específica e individualmente indi- cado como incorporado a título de referência. Em caso de conflito, prevalece o presente pedido, incluindo todas as definições aqui apre- sentadas. Equivalentes

[00446] Os especialistas na técnica vão reconhecer, ou serão capa-

zes de determinar por meio de experimentação de rotina, muitos equi- valentes às modalidades específicas descritas neste pedido.

Tais equivalentes estão abrangidos pelas reivindicações que se seguem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema de edição de genoma, caracterizado pelo fato de compreender um gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene do receptor |l do fator de transformação do crescimento B (TGFBR2); e uma nuclease guiada por RNA.

2. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo do gene do TGFBR2 compreende a sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1,2,e 3.

3. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo do gene do TGFBR2 compreende a sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 a 10.

4. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de vetorização tem pelo menos 85% de complementaridade com a sequência alvo do ge- ne do TGFBR?2.

5. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de vetoriza- ção é configurado para formar uma quebra no cordão duplo ou uma quebra no cordão simples centro de cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cer- ca de 25bp, ou cerca de 10bp de uma posição alvo do TGFBR2, dessa forma alterando o referido gene do TGFBR?2.

6. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivindi- cação 5, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene do TGFBR?2 é nocauteada ou eliminada.

7. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido gRNA vetoriza uma região codificadora ou uma região não codificado- ra do referido gene do TGFBR2, em que a referida região não codifi- cadora compreende uma região promotora, uma região potencializado- ra, um intron, uma UTR 3', uma UTR 5', ou uma região de sinal de po- liadenilação do referido gene do TGFBR2.

8. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivindi- cação 7, caracterizado pelo fato de que a referida região codificadora é selecionada dentre exon 3, exon 4, e exon 5.

9. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5036 a 5096.

10. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que: a referida nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 de S. pyogenes, e o referido domínio de vetorização compreende uma se- quência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e

(g) SEQ ID NO: 5093.

11. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 10, caracterizado pelo fato de que: a referida nuclease Cas9 de S. pyogenes reconhece um motivo adjacente protoespaçador (PAM) de NGG; o sistema de edição de genoma vetoriza o TGFBR2; e o referido domínio de vetorização compreende uma se- quência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5041-5042, 5047, 5050, 5052, e 5092-

5093.

12. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a referida nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 de S. aureus.

13. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida uma nuclease Cas9 de S. aureus reconhece um PAM de NNNRRT ou o NNNRRV, e o sistema de edição de genoma vetoriza o TGFBR?2.

14. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a referi- da nuclease guiada por RNA é uma uma nuclease Cas9 mutante.

15. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o referi- do gRNA é um gRNA modular ou um gRNA quimérico.

16. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o referi- do domínio de vetorização tem um comprimento de cerca de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 nucleotídeos.

17. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de veto-

rização compreende pelo menos cerca de 18 nucleotídeos contíguos que são complementares ao gene do TGFBR?2.

18. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de compreen- der dois, três ou quatro gRNAs.

19. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 9, caracterizado pelo fato de compreender: pelo menos uma nuclease Cas de S. pyogenes Cas9; e um gRNA compreendendo uma combinação das SEQ ID NOS: 5042 e 5041, ou uma combinação de 5042 e 5092, ou uma combinação das SEQ ID NOS: 5042 e 5093, ou uma combinação das SEQ ID NOS: 5093 e 5041.

20. Sistema de edição de genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para uso na alteração do referido gene do TGFBR2 em uma célula.

21. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 20, caracterizado pelo fato de que a referida célula é oriunda de um indivíduo que sofre de câncer.

22. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão do TGFBR2 é reduzida em 30% ou mais em relação a uma medida basal.

23. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 22, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína do TGFBR?2 é determinada por análise da mancha ocidental ou por cito- metria de fluxo por coloração intracelular indireta.

24. Sistema de edição de genoma de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizado pelo fato de que uma mutação "frame-shift" é introduzida no gene do TGFBR2.

25. Composição caracterizada pelo fato de compreender um gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é comple-

mentar a uma sequência alvo de um gene do TGFBR?2.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada pelo fato de que a sequência alvo do gene do TGRBR2 com- preende a sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1,2,63.

27. Composição de acordo com a reivindicação 25, carac- terizada pelo fato de que a sequência alvo do gene do TGRBR2 com- preende a sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 a 10.

28. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada pelo fato de que o domínio de vetorização tem pelo menos 85% de complementaridade com a sequência alvo do gene do TGRBR?2.

29. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada pelo fato de que o referido domínio de vetorização tem um comprimento de cerca de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 nucleotídeos.

30. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracte- rizada pelo fato de que o referido domínio de vetorização compreende pelo menos cerca de 18 nucleotídeos contíguos que são complemen- tares ao gene do TGRBR2

31. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada pelo fato de que o referido domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeos seleci- onada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5036 a 5096.

32. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 31, caracterizada pelo fato de compreender um, dois, três ou quatro gRNAs.

33. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 25 a 32, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma nuclease Cas9.

34. Composição de acordo com a reivindicação 33, caracte- rizado pelo fato de que a referida Cas9 nuclease é uma nuclease Cas9 de S. pyogenes ou uma nuclease Cas9 de S. aureus.

35. Composição de acordo com a reivindicação 33, caracte- rizada pelo fato de compreender ainda uma ou as duas de uma nu- clease Cas9 do tipo selvagem ou uma nuclease Cas9 mutante.

36. Composição de acordo com a reivindicação 33, caracte- rizada pelo fato de que a referida molécula de Cas9 é uma molécula de Cas9 de S. pyogenes, e o referido domínio de vetorização compre- ende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de uma sequência de nucleotí- deos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (g) SEQ ID NO: 5093.

37. Composição de acordo com a reivindicação 36, caracte- rizada pelo fato de que a referida nuclease Cas9 de S. pyogenes Cas9 reconhece um motivo adjacente protoespaçador (PAM) de NGG, a composição vetoriza o TGFBR2, e o referido domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou dife- re no máximo em 3 nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5041-5042, 5047, 5050, 5052, 5092, e5093.

38. Composição de acordo com a reivindicação 34, caracte- rizada pelo fato de que a referida nuclease Cas9 de S. aureus reco-

nhece um PAM de NNNRRT ou de NNNRRV, e a composição vetoriza o TGFBR?2.

39. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 25 a 38, caracterizada pelo fato de compreender: pelo menos uma nuclease Cas9 de S. pyogenes; e um gRNA compreendendo uma combinação das SEQ ID NOS: 5042 e 5041, ou uma combinação de 5042 e 5092, ou uma combinação das SEQ ID NOS: 5042 e 5093, ou uma combinação das SEQ ID NOS: 5093 e 5041.

40. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 25 a 39, caracterizada pelo fato de ser para uso na redução ou na eliminação da expressão do referido gene do TGFBR2 em uma cé- lula.

41. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracte- rizada pelo fato de que a referida célula é oriunda de um indivíduo que sofre de câncer.

42. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender um poli- nucleotídeo codificando um gRNA que compreende um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene do TGFBR?2.

43. Vetor de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeos seleciona- da do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5036 a 5096.

44, Vetor de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracte- rizado pelo fato de compreender ainda um polinucleotídeo codificando uma nuclease Cas9.

45. Vetor de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a referida nuclease Cas9 é uma nuclease Cas9 de S.

pyogenes ou uma nuclease Cas9 de S. aureus.

46. Vetor de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracte- rizado pelo fato de que a referida nuclease Cas9 compreende ainda uma ou as duas de uma nuclease Cas9 do tipo selvagem e de uma nuclease Cas9 mutante.

47. Vetor de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a referida nuclease Cas9 é uma nuclease Cas9 de S. pyogenes, e o referido domínio de vetorização compreende uma se- quência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecio- nada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (9) SEQ ID NO: 5093.

48. Vetor de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a referida nuclease Ca9 de S. pyogenes reconhece um motivo adjacente protoespaçador (PAM) de NGG, o vetor codifica um gRNA que vetoriza o TGFBR2, e o referido domínio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou dife- re no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de uma sequência de nu- cleotídeos selecionada dentre as SEQ ID NOS: 5041-5042, 5047, 5050, 5052, e 5092-5093.

49. Vetor de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a referida nuclease Ca9 de S. aureus Cas9 reconhece um PAM de NNNRRT ou de NNNRRV, e o vetor codifica um gRNA que vetoriza o TGFBR?2.

50. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 49, caracterizado pelo fato de que é um vetor viral.

51. Vetor de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado (AAV) ou um vetor de lentivírus (LV).

52. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 51 caracterizado pelo fato de ser para uso na redução ou na eli- minação da expressão do referido gene do TGFBR2 em uma célula.

53. Vetor de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a referida célula é oriunda de um indivíduo que sofre de câncer.

54. Método para alterar a expressão de um gene do TGFBR2 em uma célula, caracterizado pelo fato de compreender ad- ministrar à referida célula um dentre: (i) um sistema de edição de genoma compreendendo um gRNA que compreende um domínio de vetorização que é comple- mentar a uma sequência alvo do referido gene do TGFBR2, e uma nu- clease guiada por RNA; ou (ii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codifican- do um gRNA que compreende um domínio de vetorização que é com- plementar a uma sequência alvo do referido gene do TGFBR2, e um polinucleotídeo codificando uma nuclease guiada por RNA.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que a referida alteração compreende nocaute da ex- pressão do referido gene do TGFBR2 ou eliminação da expressão do referido gene do TGFBR2.

56. Método de acordo com a reivindicação 54 ou 55, carac- terizado pelo fato de que a referida célula é oriunda de um indivíduo que sofre de câncer.

57. Método de acordo com a reivindicação 54, caracteriza-

do pelo fato de que o gRNA e a nuclease guiada por RNA compreende um complexo de ribonucleoproteínas (RNP).

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracteriza- do pelo fato de compreender administrar à célula dois ou mais com- plexos de RNP compreendendo gRNAs com diferentes domínios de vetorização.

59. Método de acordo com a reivindicação 57, caracteriza- do pelo fato de que os complexos de RNP compreendem nucleases Cas9 (eaCas9) enzimaticamente ativas.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que os complexos de RNP compreendem nucleases eaCas9 que formam quebras do cordão duplo em uma ácido nucleico alvo ou quebras do cordão simples eum um ácido nucleico alvo.

61. Método de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que dois complexos de RNP compreendendo gRNAs distintos são usados para formar quebras deslocadas do cordão sim- ples no gene do TGFBR2 na célula.

62. Célula caracterizada pelo fato de compreender o siste- ma de edição de genoma como definido em qualquer uma das reivin- dicações | a 24, a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 41, ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 42 a 53.

63. Célula de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de expressar TGFBR?2.

64. Célula de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracte- rizada pelo fato de ser uma célula T ou uma célula exterminadora na- tural (NK).

65. Célula de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de compreender ainda um receptor de células T genetica- mente modificado (eTCR) ou um ou receptor de antígenos quimérico

(CAR).

66. Célula caracterizada pelo fato de ser alterada como de- finida em qualquer uma das reivindicações 54 a 61.

67. Método mediado por nuclease guiada por RNA para al- terar a expressão do gene do TGFBR2 em uma célula, caracterizado pelo fato de compreender: a) colocar a célula em contato com uma quantidade sufici- ente de um gRNA que vetoriza o TGFBR2 e uma nuclease guiada por RNA; e b) formar uma primeira quebra no cordão duplo do DNA próxima a uma posição alvo do TGFBR2 em um gene do TGFBR?2 da célula, em que a primeira quebra no cordão duplo do DNA é reparada pelo NHEJ, em que o referido reparo altera a expressão do gene do TGFBR?2.

68. Método de acordo com a reivindicação 68, caracteriza- do pelo fato de compreender ainda formar uma segunda quebra no cordão duplo do DNA próxima à posição alvo do TGFBR?2.

69. Método de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do pelo fato de que a primeira quebra no cordão duplo é formada den- tro de cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cerca de 25bp, ou cerca de 10bp da posição alvo do TGFBR?2.

70. Método de acordo com a reivindicação 68, caracteriza- do pelo fato de que a primeira e a segunda quebras no cordão duplo são formadas dentro de cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cerca de 25bp, ou cerca de 10bp da posição alvo do TGFBR?2.

71. Método de acordo com a reivindicação 67, caracteriza-

do pelo fato de que a primeira quebra no cordão duplo é formada em uma região codificadora ou em uma região não codificadora do referi- do gene do TGFBR?2, em que a referida região não codificadora com- preende uma região promotora, uma região potencializadora, um in- tron, uma UTR 3', uma UTR 5', ou uma região de sinal de poliadenila- ção do referido gene do TGFBR?2.

72. Método de acordo com a reivindicação 68, caracteriza- do pelo fato de que a primeira e a segunda qubras no cordão duplo são formadas em uma região codificadora ou em uma região não codi- ficadora do referido gene do TGFBR2, em que a referida região não codificadora compreende uma região promotora, uma região potencia- lizadora, um intron, uma UTR 3', uma UTR 5', ou uma região de sinal de poliadenilação do referido gene do TGFBR?2.

73. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 67 a 72, caracterizado pelo fato de que a referida região codifica- dora é selecionada dentre exon 3, exon 4, e exon 5.

74. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 67 a 73, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de ve- torização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5036 a 5096.

75. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 67 a 74, caracterizado pelo fato de que a referida nuclease guia- da por RNA é uma nuclease Cas9 de S. pyogenes, e o referido domí- nio de vetorização compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042;

(c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (9) SEQ ID NO: 5093.

76. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 67 a 74, caracterizado pelo fato de que a referida nuclease guia- da por RNA é uma nuclease Cas9 de S. aureus.

77. Método de acordo com a reivindicação 75 ou 76, carac- terizado pelo fato de que a referida nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 mutante.

78. Método de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do pelo fato de que o reparo pelo NHEJ produz uma inserção ou uma deleção com uma frequência maior ou igual a 20%.

79. Método de acordo com a reivindicação 78, caracteriza- do pelo fato de que a frequência de inserção ou deleção é maior ou igual a 30%, 40%, ou 50%.

80. Célula de genoma geneticamente modificada, caracteri- zada pelo fato de compreender uma inserção ou uma deleção próxima a ou em uma posição alvo em um gene do TGFBR2, em que a referida posição alvo compreende uma sequência de nucleotídeos que é com- plementar a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos seleionada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a

5096.

81. Célula de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que a inserção ou a deleção fica dentro de cerca de 500bp, cerca de 450bp, cerca de 400bp, cerca de 350bp, cerca de 300bp, cerca de 250bp, cerca de 200bp, cerca de 150bp, cerca de 100bp, cerca de 50bp, cerca de 25bp, ou cerca de 10bp da posição alvo do TGFBR?2.

82. Célula de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de uma célula T ou uma célula NK.

83. Célula de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de compreender ainda um eTCR ou CAR.

84. Composição caracterizada pelo fato de compreender: a. uma população de células de genoma geneticamente modificadas compreendendo uma inserção ou uma deleção próxima a ou em uma posição alvo em um gene do TGFBR2, em que a referida posição alvo compreende uma sequência de nucleotídeos que é com- plementar a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre as SEQ ID NOS: 5036 a 5096; e b. um tampão farmaceuticamente aceitável.

85. Composição de acordo com a reivindicação 84, caracte- rizada pelo fato de que a população de células compreende células T ou células NK.

86. Composição de acordo com a reivindicação 85, caracte- rizada pelo fato de que as células T ou células NK compreendem ain- da um eTCR ou um CAR.

87. Método para tratamento de câncer em um indivíduo, ca- racterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo células imunes geneticamente modificadas, caracterizado pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas apresentam expressão re- duzida do TGFBR?2, e opcionalmente expressam um receptor de célu- las T geneticamente modificado (eTCR) ou um receptor de antígenos quimérico (CAR), em que as células imunes geneticamente modifica- das possuem uma inserção ou uma deleção próxima a ou em uma po- sição alvo no gene do TGFBR2.

88. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas compreendem células T ou células NK.

89. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que o eTCR ou CAR tem especificidade antigênica pa- ra uma célula cancerosa.

90. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia, linfoma, por exemplo, leucemia linfocítica crônica (CLL), leu- cemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma não Hodgkin, leucemia mie- loide aguda, mieloma múltiplo, linfoma folicular refratário, linfoma de células do manto, linforma de células B indolentes, malignidades de células B, câncer de cólon, de pulmão, de fígado, de mama, de prósta- ta, de ovário, de pele, melanoma, câncer ósseo e de cérebro, câncer de ovário, cânceres epiteliais, carcinoma de células renais, adenocar- cinoma de pâncreas, linfoma de Hodgkin, carcinoma cervical, câncer colorretal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, medulo- blastoma, osteossarcoma, sarcoma sinovial, mesotelioma, e/ou qual- quer tipo de câncer que expressa TGF-B.

91. Método de acordo com a reivindicação 88, caracteriza- do pelo fato de que as células T são células T CD4+ e/ou CD8+.

92. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam atividade de lise aumentada contra uma célula cancerosa alvo em relação a uma célula imune não geneticamente modificada.

93. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam expressão aumentada de granzima B e/ou in- terferon gama na presença de TGFB em relação a células imunes não geneticamente modificadas.

94. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza-

do pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam persistência aumentada contra estimulação antigênica repetida em relação a células imunes não geneticamente modificadas.

95. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam expressão aumentada de CD25 em relação a células imunes não geneticamente modificadas.

96. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam expressão reduzida de PD-1 em relação a cé- lulas imunes não geneticamente modificadas.

97. Método de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes geneticamente modificadas mantêm ou apresentam proliferação aumentada em relação a células imunes não geneticamente modificadas.

98. Composição compreendendo uma pluralidade de célu- las T geneticamente modificadas, caracterizada pelo fato de que as referidas células T geneticamente modificadas apresentam expressão reduzida do gene do TGFBR2 em relação a células T não genetica- mente modificadas.

99. Composição de acordo com a reivindicação 98, caracte- rizada pelo fato de que as células T geneticamente modificadas apre- sentam um nível de expressão do gene do TGFBR2 que é cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% do nível de expressão do TGFBR2 em células T não ge- neticamente modificadas.

100. Composição de acordo com a reivindicação 98, carac- terizada pelo fato de que as células T geneticamente modificadas compreendem ainda a expressão de um eTCR ou de um CAR.

101. Composição de acordo com a reivindicação 98, carac- terizada pelo fato de que as células T são células T CD4+ e/ou células T CD8+.

102. Composição de acordo com a reivindicação 98, carac- terizada pelo fato de que as células T geneticamente modificadas são ainda caracterizadas por possuir: a) atividade de lise aumentada contra uma célula can- cerosa alvo em relação a células T não geneticamente modificadas; b) expressão mantida ou aumentada de granzima B e/ou interferon gama na presença de TGFB em relação a células T não geneticamente modificadas; c) persistência mantida ou aumentada contra estimula- ção antigênica repetida em relação a células T não geneticamente modificadas; d) expressão mantida ou aumentada de CD25 em re- lação a células T não geneticamente modificadas; e) expressão mantida ou reduzida de PD-1 em relação a células T não geneticamente modificadas; e/ou f) proliferação mantida ou aumentada em relação a cé- lulas T não geneticamente modificadas.

103. Composição compreendendo uma pluralidade de célu- las T geneticamente modificadas, caracterizada pelo fato de que as referidas células T geneticamente modificadas apresentam expressão reduzida do gene do TGFBR2 em relação a células T não genetica- mente modificadas, as referidas células T geneticamente modificadas produzidas por meio do contato de células T não geneticamente modi- ficadas com um sistema de edição de genoma compreendendo: um gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene do TGFBR2; e uma nuclease guiada por RNA.

104. Composição de acordo com a reivindicação 103, ca- racterizada pelo fato de que as células T geneticamente modificadas são ainda transduzidas com um vetor que expressa um eTCR ou um CAR.

105. Composição de acordo com a reivindicação 104, ca- racterizada pelo fato de que o vetor é um vetor viral.

106. Composição de acordo com a reivindicação 105, ca- racterizada pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adeno- associado (AAV) ou um vetor de lentivírus (LV).

107. Composição de acordo com a reivindicação 103, ca- racterizada pelo fato de que a referida nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9 de S. pyogenes, e o referido domínio de vetoriza- ção compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a, ou difere no máximo em cerca de 3 nucleotídeos de, uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5041; (b) SEQ ID NO: 5042; (c) SEQ ID NO: 5047; (d) SEQ ID NO: 5050; (e) SEQ ID NO: 5052; (f) SEQ ID NO: 5092; e (9) SEQ ID NO: 5093.

108. Composição compreendendo uma pluralidade de célu- las T geneticamente modificadas, caracterizada pelo fato de que as referidas células T geneticamente modificadas são deficientes na sina- lização do TGFBR?2.

109. Composição de acordo com a reivindicação 108, ca- racterizada pelo fato de que a sinalização deficiente do TGFBR2 é mediada pela expressão de uma forma negativa dominante (DN) do TGFBR?2 nas referidas células T geneticamente modificadas.

110. Composição de acordo com a reivindicação 109, ca- racterizada pelo fato de que as células T geneticamente modificadas são ainda transduzidas com um vetor que expressa um eTCR ou um CAR.

111. Composição de acordo com a reivindicação 110, ca- racterizada pelo fato de que o vetor é um vetor viral.

112. Composição de acordo com a reivindicação 111, ca- racterizada pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adeno- associado (AAV) ou um vetor de lentivírus (LV).

113. Composição de acordo com a reivindicação 108, ca- racterizado pelo fato de que as células T são células T CD4+ e/ou cé- lulas T CD8+ T.

114. Composição de acordo com a reivindicação 108, ca- racterizada pelo fato de que as células T geneticamente modificadas são ainda caracterizadas por possuir: a) atividade de lise aumentada contra uma célula can- cerosa alvo em relação a células T não geneticamente modificadas; b) expressão mantida ou aumentada de granzima B e/ou interferon gama na presença de TGFB em relação a células T não geneticamente modificadas; c) persistência mantida ou aumentada contra estimula- ção antigênica repetida em relação a células T não geneticamente modificadas; d) expressão mantida ou aumentada de CD25 em re- lação a células T não geneticamente modificadas; e) expressão mantida ou reduzida de PD-1 em relação a células T não geneticamente modificadas; e/ou f) proliferação mantida ou aumentada em relação a cé- lulas T não geneticamente modificadas.

115. Composição de acordo com a reivindicação 109, ca-

racterizada pelo fato de que as células imunes geneticamente modifi- cadas compreendem ainda expressão reduzida do TGFBR2 do tipo selvagem.

116. Composição de acordo com a reivindicação 115, ca- racterizada pelo fato de que a expressão do TGFBR?2 do tipo selvagem é reduzida por meio do contato das células imunes geneticamente modificadas com um sistema de edição de genoma compreendendo: um gRNA compreendendo um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene do TGFBR2; e uma nuclease guiada por RNA.

117. Complexo de ribonucleoproteínas (RNP) caracterizado pelo fato de compreender um gRNA que compreende um domínio de vetorização que é complementar a uma sequência alvo de um gene do TGFBR?2 e uma nuclease guiada por RNA.

118. RNP de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9.

119. RNP de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de ser eletroporado em células.