CN111527209A - Crispr-cas9编辑t细胞中的tgfbr2以用于免疫疗法的方法、组合物和组分 - Google Patents

Crispr-cas9编辑t细胞中的tgfbr2以用于免疫疗法的方法、组合物和组分 Download PDF

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Abstract

提供了用于靶向TGFBR2基因座的CRISPR/CAS相关基因组编辑系统、组合物和方法，以及使用这些系统、组合物和方法编辑的细胞。

Description

CRISPR-CAS9编辑T细胞中的TGFBR2以用于免疫疗法的方法、 组合物和组分
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月1日提交的美国临时申请号62/580,320的权益，将其通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开文本涉及用于编辑靶核酸序列(例如转化生长因子β受体II(TGFBR2)基因)或调节靶核酸序列(例如TGFBR2基因)的表达的CRISPR/Cas9相关方法和组分。
背景技术
利用基因修饰的T细胞的过继T细胞转移作为实体和血液恶性肿瘤的治疗方法已经进入临床测试。在涉及血液恶性肿瘤(例如淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL))的I和II期试验中，许多患者展现出至少部分反应，一些展现出完全反应(Kochenderfer,J.N.等人,2012 Blood 119,2709-2720)。然而，在实体瘤类型(包括黑色素瘤、肾细胞癌和结直肠癌)中观察到的反应并不总是那么稳固(Johnson,L.A.等人,2009Blood 114,535-546；Lamers,C.H.等人,2013Mol.Ther.21,904-912；Warren,R.S.等人,1998 Cancer Gene Ther.5,S1-S2)。
尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但过继T细胞疗法在实体瘤患者中的功效可能受多种因素的影响，所述多种因素例如：(1)T细胞增殖，例如过继转移后T细胞的有限增殖；(2)T细胞存活，例如通过靶细胞(例如癌细胞)环境中的因子对T细胞凋亡的诱导；和(3)T细胞功能，例如通过由宿主免疫细胞和靶细胞(例如癌细胞)分泌的抑制因子对细胞毒性T细胞功能的抑制。这些因素转而可能会受到转化生长因子β(TGF-β)活性的影响，所述转化生长因子β(TGF-β)是由多种肿瘤类型产生的已显示直接抑制肿瘤浸润性淋巴细胞、以及诱导和促进能够防止抗肿瘤免疫的调节性T细胞(Treg)的功能的细胞因子。
TGFBR2是TGF-β的受体，其在大量细胞类型(包括免疫细胞)上表达。已经证明TGF-β被TGFBR2结合下调了T细胞激活、增殖和分化。由于在含有经工程化为有条件地缺乏TGFBR2的T细胞的小鼠中观察到严重的自身免疫表型，因此缺乏临床前小鼠模型已使可改善肿瘤反应性T细胞上TGFBR2活性的TGFBR2抑制剂的开发变得复杂。因此，存在对于可减少或消除TGF-β对T细胞的抑制影响的有效策略的需要，包括在T细胞介导的免疫疗法的情境中也如此。
CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)在细菌和古细菌中进化为适应性免疫系统以防御病毒攻击。一旦暴露于病毒，病毒DNA的短区段就被整合到CRISPR基因座中。从包含病毒序列的CRISPR基因座的一部分转录RNA。含有与病毒基因组互补的序列的RNA介导RNA指导的核酸酶靶向病毒基因组中的靶序列。RNA指导的核酸酶转而切割病毒靶标，并因此使病毒靶标沉默。
最近，CRISPR/Cas9系统已经适用于真核细胞中的基因组编辑。位点特异性双链断裂(DSB)的引入允许通过内源DNA修复机制(例如非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR))来改变靶序列。CRISPR/Cas9代表解决在肿瘤疗法的情境中TGF-β介导的T细胞抑制的有前途的方法，但迄今为止，尚未鉴定出在用于肿瘤疗法的T细胞方面的这一问题的可行的解决方法。
发明内容
在某些方面，本文提供了用于TGFBR2的核酸序列的靶向编辑的基因组编辑系统以及相关组合物和方法。在某些实施方案中，这种靶向编辑导致TGFBR2表达的改变(例如下调)。在某些实施方案中，这种表达改变发生在T细胞中。在某些实施方案中，T细胞中TGFBR2表达的改变涉及使用核糖核蛋白(RNP)复合物作为基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含与靶向所述TGFBR2基因的gRNA复合的RNA指导的核酸酶蛋白。在某些实施方案中，由于通过所述RNP诱导的双链断裂和随后的不完美修复而发生TGFBR2表达的改变，所述随后的不完美修复导致在靶向的TGFBR2序列处和/或邻近的插入缺失(indel)。
在某些实施方案中，本公开文本涉及基因组编辑系统，其包含具有与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域的指导RNA，并且其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9核酸酶。所述靶向结构域可以是70％、80％、85％、90％、95％或100％互补的。
在某些实施方案中，所述靶向结构域的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸。
在某些实施方案中，所述靶向结构域具有与所述TGFBR2基因互补的至少18个连续核苷酸。
在某些实施方案中，所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述靶向结构域被配置为形成所述TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内的双链断裂或单链断裂。
在本文公开的某些实施方案中，所述基因组编辑系统能够通过敲除所述TGFBR2基因的表达或敲低所述TGFBR2基因的表达来改变TGFBR2基因。
在某些实施方案中，本文公开的基因组编辑系统并入了包含靶向结构域的gRNA，所述靶向结构域被配置为靶向所述TGFBR2基因的编码区或非编码区，其中所述非编码区包含所述TGFBR2基因的启动子区域、增强子区域、内含子、3'UTR、5'UTR或聚腺苷酸化信号区域；并且所述编码区包含例如所述TGFBR2基因的早期编码区。
在某些实施方案中，本文公开的基因组编辑系统具有所述TGFBR2基因的靶序列，所述TGFBR2基因的靶序列包含选自SEQ ID NO:1、2和3的序列。
在某些实施方案中，本文公开的基因组编辑系统具有所述TGFBR2基因的靶序列，所述TGFBR2基因的靶序列包含选自SEQ ID NO:4至10的序列。
在某些实施方案中，本文公开的基因组编辑系统并入了靶向结构域，所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO:5041；(b)SEQ ID NO:5042；(c)SEQ ID NO:5047；(d)SEQ ID NO:5050；(e)SEQ ID NO:5052；(f)SEQ ID NO:5092；和(g)SEQ ID NO:5093。在某些实施方案中，所述基因组编辑系统并入了gRNA分子对，包括例如具有靶序列SEQ ID NO:5042和5041、或5042和5092、或SEQ ID NO:5042和5093、或SEQ ID NO:5093和5041的gRNA对。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含gRNA分子的组合物，所述gRNA分子包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。在某些实施方案中，所述组合物包含一、二、三或四种gRNA分子。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含RNA指导的核酸酶，例如Cas9分子。在某些实施方案中，并入此类组合物中的所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO:5041；(b)SEQ ID NO:5042；(c)SEQ ID NO:5047；(d)SEQ ID NO:5050；(e)SEQ ID NO:5052；(f)SEQ ID NO:5092；和(g)SEQ ID NO:5093。在某些实施方案中，所述组合物并入了gRNA分子对，包括例如具有靶序列SEQ ID NO:5042和5041、或5042和5092、或SEQ ID NO:5042和5093、或SEQ ID NO:5093和5041的gRNA对。
在某些实施方案中，本公开文本涉及编码gRNA分子的载体，所述gRNA分子包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。在某些实施方案中，所述载体进一步编码RNA指导的核酸酶，例如Cas9分子。在某些实施方案中，由所述载体编码的gRNA的靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO:5041；(b)SEQ ID NO:5042；(c)SEQ ID NO:5047；(d)SEQID NO:5050；(e)SEQ ID NO:5052；(f)SEQ ID NO:5092；和(g)SEQ ID NO:5093。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
在某些实施方案中，本公开文本涉及改变细胞中的TGFBR2基因的方法，所述方法包括向所述细胞给予以下中的一种：(i)包含gRNA分子和Cas9分子的基因组编辑系统，所述gRNA分子包含与所述TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域；(ii)包含编码gRNA分子的多核苷酸以及编码Cas9分子的多核苷酸的载体，所述gRNA分子包含与所述TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域；或(iii)包含gRNA分子和Cas9分子的组合物，所述gRNA分子包含与所述TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含如本文所述的基因组编辑系统、如本文所述的gRNA组合物或如本文所述的载体的细胞。在某些实施方案中，所述细胞表达TGFBR2。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含gRNA和RNA指导的核酸酶的核糖核蛋白(RNP)复合物。
在某些实施方案中，本公开文本涉及向细胞给予包含具有不同靶向结构域的gRNA的两种或更多种RNP复合物。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含酶促活性Cas9(eaCas9)核酸酶的RNP复合物。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含形成靶核酸中的双链断裂或靶核酸中的单链断裂的eaCas9核酸酶的RNP复合物。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含不同gRNA的两种RNP复合物，所述不同gRNA用于在细胞中的TGFBR2基因中形成偏移的单链断裂。
在某些实施方案中，本公开文本涉及细胞，所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方案中，所述细胞进一步包含工程化T细胞受体(eTCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
在某些实施方案中，本公开文本涉及RNA指导的核酸酶介导的改变细胞中TGFBR2基因表达的方法，所述方法包括：a)使所述细胞与足够量的靶向TGFBR2的gRNA和RNA指导的核酸酶接触；和b)在所述细胞的TGFBR2基因中的TGFBR2靶位置附近形成第一DNA双链断裂，其中所述第一DNA双链断裂被NHEJ修复，其中所述修复改变所述TGFBR2基因的表达。
在某些实施方案中，本公开文本涉及在所述TGFBR2靶位置附近形成第二DNA双链断裂。在某些实施方案中，第一双链断裂是在所述TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内形成。在某些实施方案中，所述第一和第二双链断裂是在所述TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内形成。在某些实施方案中，所述第一双链断裂是在所述TGFBR2基因的编码区或非编码区中形成，其中所述非编码区包含所述TGFBR2基因的启动子区域、增强子区域、内含子、3'UTR、5'UTR或聚腺苷酸化信号区域。在某些实施方案中，所述第一和第二双链断裂是在所述TGFBR2基因的编码区或非编码区中形成，其中所述非编码区包含所述TGFBR2基因的启动子区域、增强子区域、内含子、3'UTR、5'UTR或聚腺苷酸化信号区域。
在某些实施方案中，所述编码区选自外显子3、外显子4和外显子5。
在某些实施方案中，所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述RNA指导的核酸酶是酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶，并且所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO:5041；(b)SEQ ID NO:5042；(c)SEQ ID NO:5047；(d)SEQ IDNO:5050；(e)SEQ ID NO:5052；(f)SEQ ID NO:5092；和(g)SEQ ID NO:5093。
在某些实施方案中，所述RNA指导的核酸酶是金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9核酸酶。
在某些实施方案中，所述RNA指导的核酸酶是突变型Cas9核酸酶。
在某些实施方案中，所述NHEJ修复产生频率大于或等于20％的插入或缺失。
在某些实施方案中，所述插入或缺失频率大于或等于30％、40％或50％。
在某些实施方案中，本公开文本涉及基因组工程化细胞，其在TGFBR2基因的靶位置处或附近包含插入或缺失，其中所述靶位置包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列互补或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述插入或缺失是在所述TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内。
在某些实施方案中，所述细胞是T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，所述细胞进一步包含eTCR或CAR。
在某些实施方案中，本公开文本涉及组合物，其包含：a)含有在TGFBR2基因的靶位置处或附近的插入或缺失的基因组工程化细胞的群体，其中所述靶位置包含与选自SEQ IDNO:5036至5096的核苷酸序列互补或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列；和b)药学上可接受的缓冲液。
在某些实施方案中，所述细胞群体包含T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，所述细胞进一步包含eTCR或CAR。
在某些实施方案中，本公开文本涉及治疗受试者中癌症的方法，其包括向所述受试者给予工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞具有降低的TGFBR2表达，并且任选地表达工程化T细胞受体(eTCR)或嵌合抗原受体(CAR)，其中所述工程化免疫细胞在所述TGFBR2基因的靶位置处或附近具有插入或缺失。
在某些实施方案中，所述工程化免疫细胞包括T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，所述细胞进一步包含eTCR或CAR。
在某些实施方案中，所述癌症选自：白血病，淋巴瘤例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤，结肠癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，皮肤癌，黑色素瘤，骨癌和脑癌，卵巢癌，上皮癌，肾细胞癌，胰腺腺癌，霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，结直肠癌，胶质母细胞瘤，神经母细胞瘤，尤因肉瘤，髓母细胞瘤，骨肉瘤，滑膜肉瘤，间皮瘤和/或表达TGF-β的任何癌症类型。
在某些实施方案中，所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。
在某些实施方案中，所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增强的针对靶癌细胞的裂解活性。
在某些实施方案中，在存在TGFβ的情况下，所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增加的颗粒酶B和/或干扰素γ的表达。
在某些实施方案中，所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞改善的针对重复抗原刺激的持久性。
在某些实施方案中，所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增加的CD25表达。
在某些实施方案中，所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞降低的PD-1表达。
在某些实施方案中，所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增加的增殖。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含多个工程化T细胞的组合物，其中所述工程化T细胞展现出相对于非工程化T细胞降低的TGFBR2基因表达。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞展现出TGFBR2基因表达水平是非工程化T细胞中TGFBR2表达水平的约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞进一步包含eTCR或CAR的表达。
在某些实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞的特征进一步在于具有：a)相对于非工程化T细胞增强的针对靶癌细胞的裂解活性；b)在存在TGFβ的情况下，相对于非工程化T细胞维持或增加的颗粒酶B和/或干扰素γ的表达；c)相对于非工程化T细胞维持或增加的针对重复抗原刺激的持久性；d)相对于非工程化T细胞维持或增加的CD25的表达；e)相对于非工程化T细胞维持或降低的PD-1的表达；和/或f)相对于非工程化T细胞维持或增加的增殖。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含多个工程化T细胞的组合物，其中所述工程化T细胞展现出相对于非工程化T细胞降低的TGFBR2基因表达，所述工程化T细胞通过使非工程化T细胞与基因组编辑系统接触而产生，所述基因组编辑系统包含：gRNA，其含有与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域；和RNA指导的核酸酶。
在某些实施方案中，将所述工程化T细胞进一步用表达eTCR或CAR的载体转导。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
在某些实施方案中，所述RNA指导的核酸酶是酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶，并且所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO:5041；(b)SEQ ID NO:5042；(c)SEQ ID NO:5047；(d)SEQ IDNO:5050；(e)SEQ ID NO:5052；(f)SEQ ID NO:5092；和(g)SEQ ID NO:5093。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含多个工程化T细胞的组合物，其中所述工程化T细胞在TGFBR2信号传导方面有缺陷。
在某些实施方案中，所述有缺陷的TGFBR2信号传导是通过在所述工程化T细胞中表达所述TGFBR2的显性阴性(DN)形式来介导。
在某些实施方案中，将所述工程化T细胞进一步用表达eTCR或CAR的载体转导。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
在某些实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞的特征进一步在于具有：a)相对于非工程化T细胞增强的针对靶癌细胞的裂解活性；b)在存在TGFβ的情况下，相对于非工程化T细胞维持或增加的颗粒酶B和/或干扰素γ的表达；c)相对于非工程化T细胞维持或增加的针对重复抗原刺激的持久性；d)相对于非工程化T细胞维持或增加的CD25的表达；e)相对于非工程化T细胞维持或降低的PD-1的表达；和/或f)相对于非工程化T细胞维持或增加的增殖。
在某些实施方案中，所述工程化免疫细胞进一步包含降低的野生型TGFBR2表达。
在某些实施方案中，通过使所述工程化免疫细胞与基因组编辑系统接触来降低所述野生型TGFBR2表达，所述基因组编辑系统包含：gRNA，其含有与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域；和RNA指导的核酸酶。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含gRNA和RNA指导的核酸酶的核糖核蛋白(RNP)复合物，所述gRNA包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。
在某些实施方案中，根据权利要求117所述的RNP，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在某些实施方案中，根据权利要求117所述的RNP，其中所述RNP通过电穿孔进入细胞。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用以其整体而并入。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并不意在是限制性的。
标题(包括数字和字母标题以及子标题)仅用于组织和表示，并不旨在进行限制。
从具体实施方式、实施例、附图以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得清楚。
附图说明
附图旨在提供本公开文本的某些方面和实施方案的说明性和示意性例子而不是全面的例子。附图并非旨在限制或约束为任何特定的理论或模型，并且不一定是按比例绘制。在不限制前述内容的情况下，核酸和多肽可以描述为线性序列或示意性的二维或三维结构；这些描述旨在是说明性的，而不是限制或约束为有关其结构的任何特定模型或理论。
图1描绘了靶向转化生长因子β受体II(TGFBR2)的外显子1A-5的示例性gRNA及其相关的非同源末端连接(NHEJ)活性％的列表。
图2描绘了某些示例性gRNA对的基因组编辑效率。
图3描绘了如通过miSeq确定的在TGFBR2基因中的插入缺失形成％。在多种RNP浓度下测试了七种gRNA以产生剂量响应曲线。
图4A至图4B描绘了在若干个靶向TGFBR2的测试gRNA和一个靶向AAVS1基因座的对照gRNA的情况下编辑的细胞％(图4A)和插入缺失频率％(图4B)。
图5描绘了两种靶向TGFBR2的gRNA在其产生框外插入缺失突变的能力方面的比较。
图6描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑的背景中被转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中的相对IFN-γ产生。比较了单个或配对的gRNA。
图7描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑的背景中被转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中的相对细胞增殖。比较了单个或配对的gRNA。
图8A至图8B描绘了在(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑的背景中被转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中的CD25(图8A)和PD-1(图8B)表达。比较了单个或配对的gRNA。同样用RPMI 8226细胞刺激细胞48小时。
图9描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑的背景中被转导以表达不同CAR的T细胞中的Smad 2/3磷酸化。
图10描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑的背景中被转导以表达不同CAR的T细胞中的相对颗粒酶B表达。
图11描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑的背景中被转导以表达不同CAR的T细胞中的IFN-γ产生。
图12描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑的背景中被转导以表达不同CAR的T细胞中的相对T细胞增殖。
图13A至图13B描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中被转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中的颗粒酶B(图13A)和干扰素γ(图13B)产生。
图14描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中表达抗BCMA CAR的T细胞对RPMI 8226细胞的相对裂解％。
图15A至图15F描绘了在重复的TGFβ抗原刺激的情况下，在TGFBR2未编辑、TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中的表达抗BCMA CAR的T细胞。图15A至图15C显示了用三种不同抗原刺激后的推断细胞数量。图15D至图15F显示了在重复的TGFβ抗原刺激的情况下表达抗BCMA CAR的T细胞％随着时间的变化。
图16A至图16B描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中被转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中的INF-γ产生。将T细胞与RPMI8226细胞(图16A)或OPM2细胞(图16B)一起共孵育。
图17A至图17B描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中被转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中的CD25表达。将T细胞与RPMI8226细胞(图17A)或OPM2细胞(图17B)一起共孵育。
图18A至图18B描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中被转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中的PD-1表达。将T细胞与RPMI8226细胞(图18A)或OPM2细胞(图18B)一起共孵育。
图19A至图19B描绘了在有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中表达抗BCMA CAR的T细胞的相对细胞增殖(图19A)和相对IFN-γ产生(图19B)。同样用RPMI 8226细胞刺激细胞。
图20A至图20B描绘了在渐增浓度的TGFβ的情况下，在TGFBR2基因编辑或TGFBR2DN背景中若干种表达抗BCMA CAR的CD4+(图20A)和CD8+(图20B)T细胞中的PD-1+细胞％。同样用RPMI 8226细胞刺激细胞48小时。
图21描绘了在TGFBR2基因编辑或TGFBR2 DN背景中表达抗BCMA CAR的T细胞中的TGFβ信号传导途径基因PMEPA1、SKIL、SKI和LDLRAD4的表达水平。从小鼠脾脏或从源自RPMI8226细胞的肿瘤分离T细胞。
图22描绘了在有和没有TGFβ的情况下，在TGFBR2 DN背景中表达抗CD19 CAR的T细胞中的Smad 2/3磷酸化水平、增殖和颗粒酶B表达。
图23描绘了用于确定T细胞中TGFBR2基因编辑是否赋予相对于野生型细胞的选择性优势的示意图。
图24描绘了抗BCMA CAR、TGFBR2-KO细胞与WT细胞的不同比率(1、0.75、0.5、0.25)。将细胞与RPMI8226细胞以1:1效应物与靶标的比率±10ng/ml TGFβ共培养。将细胞每7天收集一次，以用于通过高通量测序分析插入缺失的％。每周用新鲜的RPMI8226重新刺激细胞并将效应物与靶标比率重新调整至1:1。
具体实施方式
定义和缩写
除非另有说明，否则以下每个术语均具有与本节相关联的含义。
不定冠词“一个”和“一种”是指至少一个/一种相关名词，并且与术语“至少一个/一种”和“一个/一种或多个/多种”可互换使用。例如，“模块”意指至少一个模块或一个或多个模块。
连词“或”和“和/或”可互换地用作非排他性析取词。
短语“本质上由……组成”意指所列举的种类是主要种类，但是其他种类可以以痕量或不影响主题组合物的结构、功能或行为的量存在。例如，本质上由特定种类组成的组合物通常将包含90％、95％、96％或更多的该种类。
“结构域”用于描述蛋白质或核酸的区段。除非另有说明，否则结构域不需要具有任何特定的功能特性。
“插入缺失”是核酸序列中的插入和/或缺失。插入缺失可以是DNA双链断裂(如由本公开文本的基因组编辑系统形成的双链断裂)的修复的产物。插入缺失最常在通过“易错”修复途径(如以下所述的NHEJ途径)修复断裂时形成。插入缺失可以产生插入或缺失，从而在靶序列中产生框内或框外突变。
“基因转化”是指通过并入内源同源序列(例如基因阵列内的同源序列)来改变DNA序列。“基因修正”是指通过并入外源同源序列(如外源单链或双链供体模板DNA)来改变DNA序列。基因转化和基因修正是通过HDR途径(如下文所述的那些)修复DNA双链断裂的产物。
插入缺失、基因转化、基因修正和其他基因组编辑结果通常通过测序(最常见的是通过“下一代”或“合成测序”方法，但仍然可以使用桑格测序)来评估，并通过所有测序读段中目的位点处的数值变化(例如，±1、±2或更多个碱基)的相对频率来量化。用于测序的DNA样品可以通过多种本领域中已知的方法制备，并且可涉及通过聚合酶链反应(PCR)对目的位点的扩增，对通过双链断裂生成的DNA末端的捕获(如在Tsai等人(Nat.Biotechnol.34(5):483(2016)，通过引用并入本文)中所述的GUIDEseq方法中或通过本领域熟知的其他手段)。基因组编辑结果也可以通过原位杂交方法(如通过Genomic Vision(法国巴纽)商业化的FiberCombTM系统)以及通过本领域已知的任何其他合适的方法来评估。
“Alt-HDR”、“替代性同源定向修复”或“替代性HDR”是指使用同源核酸(例如，内源同源序列，例如姐妹染色单体；或外源核酸，例如模板核酸)修复DNA损伤的过程。Alt-HDR与经典HDR的不同之处在于，所述过程利用与经典HDR不同的途径并且可以被经典HDR介导物RAD51和BRCA2抑制。Alt-HDR的区别还在于涉及单链或带切口的同源核酸模板，而经典HDR通常涉及双链同源模板。
“经典HDR”、“经典同源定向修复”或“cHDR”是指使用同源核酸(例如，内源同源序列，例如姐妹染色单体；或外源核酸，例如模板核酸)修复DNA损伤的过程。经典的HDR通常在双链断裂处有显著切除时起作用，形成DNA的至少一个单链部分。在正常细胞中，cHDR通常涉及一系列步骤，例如断裂的识别、断裂的稳定、切除、单链DNA的稳定、DNA交换中间体的形成、交换中间体的拆分、和连接。所述过程需要RAD51和BRCA2，并且同源核酸通常是双链的。
除非另有说明，否则本文所用的术语“HDR”包括经典HDR和alt-HDR二者。
“非同源末端连接”或“NHEJ”是指连接介导的修复和/或非模板介导的修复，包括经典NHEJ(cNHEJ)和替代性NHEJ(altNHEJ)，所述替代性NHEJ(altNHEJ)转而包括微同源介导的末端连接(MMEJ)、单链退火(SSA)、和合成依赖性微同源介导的末端连接(SD-MMEJ)。
当关于分子(例如，核酸或蛋白质)的修饰而使用时，“替代”或“被替代”不需要过程限制，而仅指示存在替代实体。
“受试者”意指人或非人动物。人受试者可以是任何年龄(例如，婴儿、儿童、年轻成人或成人)，并且可能患有疾病或者可能需要基因的改变。可替代地，受试者可以是动物，所述术语包括但不限于哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、两栖动物，并且更特别地是非人灵长类动物、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔子、豚鼠、狗、猫等。在本公开文本的某些实施方案中，受试者是家畜，例如牛、马、绵羊或山羊。在某些实施方案中，受试者是家禽。
“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)意指治疗受试者(例如人受试者)的疾病，包括以下中的一种或多种：抑制疾病，即阻止或预防其发展或进展；减轻疾病，即引起疾病状态的消退；减轻疾病的一种或多种症状；和治愈疾病。
“预防”(“prevent”、“preventing”和“prevention”)是指预防哺乳动物(例如人)的疾病，包括(a)避免或防止疾病；(b)影响疾病的易感性；或(c)预防或延缓疾病的至少一种症状的发作。
“试剂盒”是指共同构成可用于特定目的的功能单元的两个或更多个组分的任何集合。举例说明(而非限制性的)，根据本公开文本的一个试剂盒可以包含指导RNA，所述指导RNA与RNA指导的核酸酶复合或能够与RNA指导的核酸酶复合，并且伴有药学上可接受的载体(例如，悬浮于或可悬浮于所述药学上可接受的载体中)。试剂盒可用于将复合物引入例如细胞或受试者中，以用于引起这种细胞或受试者中所需的基因组改变的目的。试剂盒的组分可以包装在一起，或者它们可以单独地包装。根据本公开文本的试剂盒还任选地包含使用说明书(DFU)，其描述了试剂盒例如根据本公开文本的方法的使用。DFU可以与试剂盒物理地包装在一起，或者其可以例如通过电子方式提供给试剂盒的使用者。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多个核苷酸的任何链。多核苷酸、核苷酸序列、核酸等可以是单链或双链的其嵌合混合物或衍生物或修饰形式。它们可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上进行修饰，例如以改善分子的稳定性、其杂交参数等。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括但不限于由制造蛋白质和酶的细胞机器所用的信息。这些术语包括双链或单链基因组DNA、RNA、任何合成的和基因操纵的多核苷酸，以及有义和反义多核苷酸二者。这些术语还包括含有修饰的碱基的核酸。
常规IUPAC表示法用于本文呈现的核苷酸序列，如下表1所示(还参见Cornish-Bowden A,Nucleic Acids Res.1985年5月10日；13(9):3021-30，通过引用并入本文)。然而，应注意，在序列可由DNA或RNA编码的那些情况下，例如在gRNA靶向结构域中，“T”表示“胸腺嘧啶或尿嘧啶”。
表1：IUPAC核酸表示法
字符 碱基
A 腺嘌呤
T 胸腺嘧啶或尿嘧啶
G 鸟嘌呤
C 胞嘧啶
U 尿嘧啶
K G或T/U
M A或C
R A或G
Y C或T/U
S C或G
W A或T/U
B C、G或T/U
V A、C或G
H A、C或T/U
D A、G或T/U
N A、C、G或T/U
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，是指经由肽键连接在一起的连续的氨基酸链。术语包括单独的蛋白质、缔合在一起的蛋白质的组或复合物，以及此类蛋白质的片段或部分、变体、衍生物和类似物。本文使用常规表示法从左边的氨基或N末端开始进行至右边的羧基或C末端来呈现肽序列。可以使用标准的一个字母或三个字母的缩写。
术语“变体”是指如下实体(如多肽、多核苷酸或小分子)，其与参考实体显示出显著的结构同一性，但是与参考实体相比，在一个或多个化学部分的存在方面或一个或多个化学部分的水平上与参考实体在结构上不同。在许多实施方案中，变体在功能上也不同于其参考实体。通常，是否将特定实体适当地视为参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。
概述
本文所述的基因组编辑系统通常包含一种或多种gRNA，所述一种或多种gRNA包含与一种或多种TGFBR2靶序列互补的靶向结构域，所述靶序列转而包括或邻近于由一种或多种RNA指导的核酸酶识别的原型间隔子邻近基序(PAM)序列，所述一种或多种gRNA可以与所述一种或多种RNA指导的核酸酶结合(例如复合)因此，本公开文本的基因组编辑系统以位点特异性的方式针对一种或多种TGFBR2靶序列，并且操作以在那些TGFBR2靶序列内或接近于那些TGFBR2靶序列引入改变。
通过本公开文本的基因组编辑系统引入至或接近于TGFBR2靶位点中的改变将最常见地包括DNA单链断裂(SSB或“切口”)和/或双链断裂(DSB)。切口和DSB转而被细胞以可导致如下的方式修复：在一个或多个TGFBR2靶位点处引入小插入缺失或较大插入或缺失，在两个TGFBR2靶位点之间的序列缺失，和/或序列(特别是经由供体模板寡核苷酸引入细胞中的外源序列)以替代那些靶位点之间的内源细胞DNA序列的方式插入TGFBR2位点中或两个TGFBR2靶位点之间。然而，在一些情况下，基因组编辑系统引入以下中的一种或多种：点突变(例如经由半胱氨酸脱氨基)、DNA标记的变化(例如DNA甲基化、组蛋白乙酰化或脱乙酰化或其他染色质修饰)和/或反式作用因子(如转录因子)的募集。可替代地，本公开文本的基因组编辑系统可以以持久的(例如在数周、数月或更长时间的间隔内)或短暂的(在数秒、数分钟、数小时或数天的间隔内)方式与一种或多种TGFBR2靶序列缔合，从而防止其他因子(特别是RNA聚合酶，但也可以是DNA聚合酶、转录因子和/或影响基因表达的其他顺式或反式作用因子)与TGFBR2靶序列缔合。基因组编辑系统及其组分的这些和其他作用模式在下文的标题“RNA指导的核酸酶”和“RNA指导的核酸酶的修饰”下进行了详细描述。
TGFBR2靶序列和相应的gRNA靶向结构域序列通常但不一定位于外显子中，在所述外显子中引入小插入缺失或较大的插入或缺失可导致一种或多种突变(例如移码突变、无义突变、破坏周围蛋白质结构的氨基酸的密码子的引入、和/或蛋白质活性所需的氨基酸的密码子的去除)，从而降低或消除TGFBR2蛋白的功能。图1显示了多种酿脓链球菌指导RNA对它们在TGFBR2基因的外显子结构内所靶向的位置的剪切活性的图谱。在本说明书全文中，这些突变被称为“敲除”突变，并且其功能作用是“敲除”TGFBR2蛋白功能。
某些TGFBR2靶序列可以被视为gRNA靶向结构域序列的“热点”靶位点。如本文所用，“热点”是指被优先靶向的位点，因为其产生高插入缺失频率％或TGFBR2基因的有效敲低或敲除。靶向这些优选位点中的一个或多个的gRNA可以产生30％或更高的插入缺失频率％。例如，TGFBR2基因中的优选靶位点可以具有互补的gRNA靶向结构域，所述互补的gRNA靶向结构域产生30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更高的插入缺失频率％。本文描述了TGFBR2基因内的热点靶位点。
表x中显示了优选的热点TGFBR2区域：
表2：优选的TGFBR2靶位点
Figure BDA0002556467540000171
表3中显示了特别优选的热点TGFBR2区域：
TGFBR2靶标 序列
SEQ ID NO:4 GTAGCTCTGATGAGTGCAAT
SEQ ID NO:5 ATGAATCTCTTCACTCTAGG
SEQ ID NO:6 ACAGGAGTACCTGACGCGGC
SEQ ID NO:7 CTGTTAGCCAGGTCATCCAC
SEQ ID NO:8 GGGTGTCCAGCTCAATGGGC
SEQ ID NO:9 TCATAATGCACTTTGGAGAA
SEQ ID NO:10 TGACTTTATTCTGGAAGATG
TGFBR2靶序列可以例如位于TGFBR2基因的外显子3、4或5中。与TGFBR2基因的外显子3、4或5中存在的TGFBR2靶序列相对应的gRNA靶向结构域序列可以包含与选自SEQ IDNO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。例如但并非限制性地，示例性靶向结构域可以包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO:5041；
(b)SEQ ID NO:5042；
(c)SEQ ID NO:5047；
(d)SEQ ID NO:5050；
(e)SEQ ID NO:5052；
(f)SEQ ID NO:5092；和
g)SEQ ID NO:5093。
表4-靶向序列
SEQ ID 靶向序列 PAM 外显子
5041 ATTGCACTCATCAGAGCTAC AGG 4
5043 CCAATGAATCTCTTCACTCT AGG 内含子-与4邻近
5047 GCCGCGTCAGGTACTCCTGT AGG 5
5050 GTGGATGACCTGGCTAACAG TGG 5
5052 GCCCATTGAGCTGGACACCC TGG 5
5092 TTCTCCAAAGTGCATTATGA AGG 4
5093 CATCTTCCAGAATAAAGTCA TGG 4
作为敲除TGFBR2表达的替代方案，可以靶向转录调节区域(例如启动子区域(例如控制TGFBR2基因转录的启动子区域))，以改变(例如敲除)基因的表达。如本文所述，靶向敲除方法可以通过包含无酶促活性的Cas9(eiCas9)分子或eiCas9融合蛋白(例如与转录阻遏物结构域或染色质修饰蛋白融合的eiCas9)的CRISPR/Cas系统介导。例如，包含靶向结构域的一种或多种gRNA分子可以被配置为将eiCas9分子或eiCas9融合蛋白靶向为足够接近转录调节区域，例如启动子区域(例如控制TGFBR2基因的转录的启动子区域)，从而减少和/或消除TGFBR2基因的转录。在某些实施方案中，eiCas9或eiCas9融合蛋白可以用于敲低T细胞(例如人T细胞)中的TGFBR2表达。
TGFBR2敲除和/或敲低可以通过任何合适的方式进行评估，所述合适的方式包括但不限于检查TGFBR2基因的序列、评估在细胞表面上的TGFBR2蛋白表达(例如通过免疫染色和细胞分选，特别是通过荧光激活细胞分选或FACS(包括间接细胞内染色流式细胞术))、检测通过TGFBR2介导的细胞或分子变化、评估TGF-β对细胞增殖或存活的作用、或通过蛋白质印迹检测TGFBR2蛋白水平。特别是对于T细胞，可以通过以下方式来确认TGFBR2敲除：(a)对TGFBR2基因座测序或T7E1引物延伸测定和/或(b)SMAD2/3磷酸化的细胞内FACS评估。测序和T7E1在下文中进行了更详细地描述，而细胞内SMAD2/3磷酸化测定描述在如下文献中，例如Chen,等人,J.Experimental Med.第198卷,第12期,2003年12月15日,1875-1886(将该参考文献通过引用以其整体并入并用于本文的所有目的)，特别是第1877页的“材料和方法”章节和补充图S2。
TGFBR2的敲除和/或敲低可对应于相对于基线测量值或野生型细胞而言TGFBR2表达减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些方面，提供的组合物和方法包括如下这些，其中：细胞(在所述细胞中引入了用于TGFBR2基因的敲除或基因破坏的药剂(例如gRNA/Cas9))的组合物中至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞含有基因破坏；不表达内源TGFBR2多肽；不含有连续的TGFBR2基因、TGFBR2基因和/或功能性TGFBR2基因。在一些实施方案中，根据本公开文本的方法、组合物和细胞包括如下这些，其中细胞(在所述细胞中引入了用于TGFBR2基因的敲除或基因破坏的药剂(例如gRNA/Cas9))的组合物中至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞不表达TGFBR2多肽(如在细胞表面上)。在一些实施方案中，细胞(在所述细胞中引入了用于TGFBR2基因的敲除或基因破坏的药剂(例如gRNA/Cas9))的组合物中至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞被敲除了两个等位基因，即在此类百分比的细胞中包含双等位基因缺失。
靶向TGFBR2的基因组编辑系统可以以多种方式实现，并且其实现可以针对编辑细胞的环境进行定制。本公开文本的某些实施方案涉及借助于电穿孔例如使用可从商业供应商如MaxCyte(马里兰州盖瑟斯堡)或Lonza(瑞士巴塞尔)获得的电穿孔仪和试管将RNA指导的核酸酶和靶向TGFBR2的指导RNA以核糖核蛋白(RNP)复合物的形式递送至离体细胞。然而，其他实施方案可以实现体内核酸载体(如病毒载体或脂质纳米颗粒)用于体内或离体编辑。这些实现的细节在下文的标题“基因组编辑系统的实现”下进行了更详细地描述。
TGFBR2的敲除和/或敲低可用于多种环境(包括但不限于适应性T细胞疗法的情境)中。根据本公开文本的某些实施方案，TGFBR2在将用于疗法中的免疫细胞(如T细胞)中被敲除。作为一个例子，T细胞可以表达工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)或异源T细胞受体(TCR)，所述受体可以被配置为识别参与病理学(如肿瘤)的细胞或组织上的抗原。无论它们是否表达工程化受体，根据本公开文本的TGFBR2敲除T细胞都可以用于靶向组织或器官，在所述组织或器官中TGF-β以足以降低表达TGFBR2的T细胞的增殖或活性的量存在。
TGFBR2敲除和/或敲低细胞可以用于“自体”细胞疗法，其中从受试者收获细胞，将其改变为敲除或敲低TGFBR2表达，然后返回同一受试者；可替代地，可以在“同种异体”细胞疗法中将这些细胞给予至不同的受试者。在任一种方法中，在收获与给予本公开文本的TGFBR2细胞之间，可以用多种方式(如扩增、刺激、纯化或分选、用转基因转导、冷冻和/或解冻)操纵。
如本文所述敲除或敲低TGFBR2基因的存在可以：(1)改善T细胞增殖；(2)改善T细胞存活；和/或(3)改善T细胞功能。如本文所述敲低TGFBR2基因的表达可以类似地：(1)改善T细胞增殖；(2)改善T细胞存活；和/或(3)改善T细胞功能。
基因组编辑系统
术语“基因组编辑系统”是指具有RNA指导的DNA编辑活性的任何系统。本公开文本的基因组编辑系统包含改编自天然存在的CRISPR系统的至少两种组分：指导RNA(gRNA)和RNA指导的核酸酶。这两种组分形成复合物，所述复合物能够与特定的核酸序列缔合并例如通过制造单链断裂(SSB或切口)、双链断裂(DSB)和/或点突变中的一种或多种来编辑该核酸序列中或周围的DNA。在某些实施方案中，双链或单链断裂在TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp或约10bp内、从而诱导TGFBR2基因表达的改变。
天然存在的CRISPR系统在进化上分为两种类别和五种类型(Makarova等人NatRev Microbiol.2011年6月；9(6):467-477(Makarova)，通过引用并入本文)，并且尽管本公开文本的基因组编辑系统可以改编任何类型或类别的天然存在的CRISPR系统的组分，但是本文呈现的实施方案通常是改编自2类和II或V型CRISPR系统。涵盖II和V型的2类系统的特征在于形成核糖核蛋白(RNP)复合物的相对较大的多结构域RNA指导的核酸酶蛋白(例如Cas9或Cpf1)和一种或多种指导RNA(例如crRNA和任选的tracrRNA)，所述核糖核蛋白(RNP)复合物缔合(即靶向)并切割与crRNA的靶向(或间隔子)序列互补的特定基因座。根据本公开文本的基因组编辑系统类似地靶向并编辑细胞DNA序列，但是与天然存在的CRISPR系统显著不同。例如，本文所述的单分子指导RNA不是天然存在的，并且根据本公开文本的指导RNA和RNA指导的核酸酶二者都可以并入任何数量的非天然存在的修饰。
基因组编辑系统可以用多种方式来实现(例如，给予或递送至细胞或受试者)，并且不同的实现可以适合于不同的应用。例如，在某些实施方案中，将基因组编辑系统实现为可包含在药物组合物中的蛋白质/RNA复合物(核糖核蛋白或RNP)，所述药物组合物任选地包含药学上可接受的载体和/或包囊剂(如脂质或聚合物微粒或纳米颗粒、胶团、脂质体等)。在某些实施方案中，将基因组编辑系统实现为编码上述RNA指导的核酸酶和指导RNA组分的一种或多种核酸(任选地具有一种或多种另外的组分)；在某些实施方案中，将基因组编辑系统实现为包含此类核酸的一种或多种载体，例如病毒载体，如腺相关病毒；并且在某些实施方案中，将基因组编辑系统实现为前述任何一项的组合。根据本文阐述的原理进行操作的另外或修改的实现对于熟练技术人员而言将是清楚的，并且在本公开文本的范围内。
应当注意，本公开文本的基因组编辑系统可以靶向单一特定核苷酸序列，或者可以通过使用两种或更多种指导RNA靶向、并且能够并行编辑两种或更多种特定核苷酸序列。在整个本公开文本中，多种gRNA的使用被称为“多路复用”，并且可用于靶向多种不相关的目的靶序列或在单个靶结构域内形成多个SSB或DSB，并且在一些情况下在这种靶结构域内生成特定编辑。例如，通过引用并入本文的Maeder等人(Maeder)的国际专利公开号WO2015/138510描述了用于修正人CEP290基因中的点突变(C.2991+1655A至G)的基因组编辑系统，所述点突变导致产生隐蔽剪接位点，这转而降低或消除了基因的功能。Maeder的基因组编辑系统利用靶向点突变两侧(即侧翼)的序列的两种指导RNA，并形成在突变侧翼的DSB。这转而促进了间插序列的缺失(包括突变)，从而消除了隐蔽剪接位点并恢复了正常的基因功能。
作为另一个例子，通过引用并入本文的Cotta-Ramusino等人(“Cotta-Ramusino”)的WO 2016/073990描述了基因组编辑系统，其利用两种gRNA与Cas9切口酶(制造单链切口的Cas9，如酿脓链球菌D10A)的组合，称为“双切口酶系统”的组件。Cotta-Ramusino的双切口酶系统被配置为在目的序列的相对链上制造两个切口，所述相对链偏移一个或多个核苷酸，所述切口结合在一起形成具有突出端(在Cotta-Ramusino的情况下为5'，但也可能是3'突出端)的双链断裂。在一些情况下，突出端转而可以促进同源定向修复事件。并且作为另一个例子，Palestrant等人(“Palestrant”，通过引用并入本文)的WO 2015/070083描述了靶向编码Cas9的核苷酸序列的gRNA(称为“调控RNA”)，其可以包含在含有一种或多种另外的gRNA的基因组编辑系统中，以允许瞬时表达原本可能在例如一些病毒转导的细胞中组成性表达的Cas9。这些多路复用应用旨在是示例性的而非限制性的，并且熟练技术人员将理解，多路复用的其他应用通常与此处描述的基因组编辑系统是相容的。
在一些情况下，基因组编辑系统可以形成双链断裂，所述双链断裂通过细胞DNA双链断裂机制(如NHEJ或HDR)修复。这些机制在整个如下文献中进行了描述：例如Davis和Maizels,PNAS,111(10):E924-932,2014年3月11日(Davis)(描述Alt-HDR)；Frit等人DNARepair 17(2014)81-97(Frit)(描述Alt-NHEJ)；以及Iyama和Wilson III,DNA Repair(Amst.)2013年8月；12(8):620-636(Iyama)(通常描述经典HDR和NHEJ途径)。
在基因组编辑系统通过形成DSB进行操作的情况下，此类系统任选地包含促进或促进特定的双链断裂修复模式或特定的修复结果的一个或多个组分。例如，Cotta-Ramusino还描述了基因组编辑系统，其中添加了单链寡核苷酸“供体模板”；将供体模板并入被基因组编辑系统切割的细胞DNA靶区域中，并且可以导致靶序列的变化。
在某些实施方案中，基因组编辑系统在不引起单链或双链断裂的情况下修饰靶序列或修饰靶序列中或附近的基因的表达。例如，基因组编辑系统可以包含RNA指导的核酸酶，所述RNA指导的核酸酶与作用于DNA的功能结构域融合从而修饰靶序列或其表达。作为一个例子，RNA指导的核酸酶可以与胞苷脱氨酶功能结构域连接(例如融合)，并且可以通过生成靶向的C至A取代来操作。示例性的核酸酶/脱氨酶融合物描述在Komor等人Nature533,420-424(2016年5月19日)(“Komor”)中，将其通过引用并入。可替代地，基因组编辑系统可以利用切割失活(即“死”)的核酸酶(如死Cas9(dCas9))，并且可以通过如下方式来操作：在细胞DNA的一个或多个所靶向的区域上形成稳定的复合物，从而妨碍涉及一个或多个所靶向的区域的功能，包括但不限于mRNA转录、染色质重塑等。
指导RNA(gRNA)分子
术语“指导RNA”和“gRNA”是指促进RNA指导的核酸酶(如Cas9或Cpf1)特异性缔合(或“靶向”)细胞中的靶序列(如基因组序列或游离序列)的任何核酸。gRNA可以是单分子的(包含单个RNA分子，并且也可替代地称为嵌合体)，或者是模块的(包含多于一个、通常是两个单独的RNA分子(如crRNA和tracrRNA)，它们通常彼此例如通过双链体化缔合)gRNA及其组成部分在整个如下文献中进行了描述，例如Briner等人(Molecular Cell56(2),333-339,2014年10月23日(Briner)，将其通过引用并入)以及Cotta-Ramusino。
在细菌和古细菌中，II型CRISPR系统通常包含RNA指导的核酸酶蛋白(如Cas9)、包含与外来序列互补的5'区域的CRISPR RNA(crRNA)和包含与crRNA的3'区域互补并与其形成双链体的5'区域的反式激活crRNA(tracrRNA)。尽管不希望受到任何理论的束缚，但是认为此双链体促进Cas9/gRNA复合物的形成并且对于其活性是必需的。由于II型CRISPR系统适用于基因编辑，因此发现crRNA和tracrRNA可以连接成单个单分子或嵌合指导RNA，在一个非限制性例子中所述连接是借助于桥接crRNA(在其3'末端)和tracrRNA(在其5'末端)的互补区域的四个核苷酸(例如GAAA)“四环”或“接头”序列。(Mali等人Science.2013年2月15日；339(6121):823-826(“Mali”)；Jiang等人Nat Biotechnol.2013年3月；31(3):233-239(“Jiang”)；以及Jinek等人,2012Science Aug.17；337(6096):816-821(“Jinek”)，将所有文献通过引用并入本文)
指导RNA无论是单分子的还是模块的都包含与靶序列(如是需要编辑的细胞基因组中的DNA序列)内的靶结构域完全或部分互补的“靶向结构域”。靶向结构域在文献中以多种名称被提及，所述多种名称包括但不限于“指导序列”(Hsu等人,Nat Biotechnol.2013年9月；31(9):827-832,(“Hsu”)，将其通过引用并入本文)、“互补区域”(Cotta-Ramusino)、“间隔子”(Briner)以及统称的“crRNA”(Jiang)。不管给出的名称如何，靶向结构域的长度通常为10-30个核苷酸，并且在某些实施方案中长度为16-24个核苷酸(例如长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且在Cas9 gRNA的情况下所述靶向结构域位于5'末端处或附近，并且在Cpf1 gRNA的情况下位于3'末端处或附近。
除靶向结构域外，gRNA通常(但不一定，如下所述)包含可影响gRNA/Cas9复合物的形成或活性的多个结构域。例如，如上所述，由gRNA的第一和第二互补结构域形成的双链体结构(也称为重复序列:抗重复序列双链体)与Cas9的识别(REC)叶片相互作用，并且可以介导Cas9/gRNA复合物的形成。(Nishimasu等人,Cell 156,935-949,2014年2月27日(Nishimasu 2014)和Nishimasu等人,Cell 162,1113-1126,2015年8月27日(Nishimasu2015)，将这两篇文献通过引用并入本文)。应当注意的是，第一和/或第二互补结构域可以含有可由RNA聚合酶识别为终止信号的一个或多个聚A段。因此，第一和第二互补结构域的序列被任选地修饰(例如通过使用如Bnerer中所述的A-G交换或A-U交换)以消除这些段并促进gRNA的完整体外转录。对第一和第二互补结构域的这些和其他类似的修饰在本公开文本的范围内。
与第一和第二互补结构域一起，Cas9 gRNA通常包含在体内但不一定在体外参与核酸酶活性的两个或更多个另外的双链体区域。(Nishimasu 2015)。在第二个互补结构域的3'部分附近的第一个茎环一被不同地称为“近端结构域”(Cotta-Ramusino)、“茎环1”(Nishimasu 2014and 2015)和“联结”(Briner)。一个或多个另外的茎环结构通常存在于gRNA的3'末端附近，其数量随着物种而变化：酿脓链球菌gRNA通常包含两个3'茎环(总共四个茎环结构，包括重复序列:抗重复序列双链体)，而金黄色葡萄球菌和其他物种只有一个(总共三个茎环结构)。Briner中提供了按物种组织的保守茎环结构(并且更一般地说是gRNA结构)的描述。
尽管前面的描述已经集中在与Cas9一起使用的gRNA上，但是应该理解，已经(或将来可能会)发现或发明其他RNA指导的核酸酶，所述RNA指导的核酸酶利用了与关于这一点所述的那些在某些方面不同的gRNA。例如，Cpf1(“来自普氏菌属和弗朗西丝氏菌属1的CRISPR”)是最近发现的不需要tracrRNA起作用的RNA指导的核酸酶。(Zetsche等人,2015,Cell 163,759-7712015年10月22日(Zetsche I)，通过引用并入)。用于Cpf1基因组编辑系统中的gRNA通常包含靶向结构域和互补结构域(替代地称为“手柄”)。还应注意，在与Cpf1一起使用的gRNA中，靶向结构域通常存在于3'末端处或附近，而不是上文关于Cas9 gRNA所描述的5'末端(手柄位于Cpf1 gRNA的5'末端处或附近)。
本领域技术人员将理解，尽管来自不同原核物种的gRNA之间或Cpf1与Cas9 gRNA之间可能存在结构差异，但是gRNA操作的原理总体上是一致的。由于操作的这种一致性，gRNA可以通过其靶向结构域序列而在广义上被定义，并且熟练技术人员将理解，可以将给定的靶向结构域序列并入任何合适的gRNA中，所述合适的gRNA包括单分子或嵌合gRNA或包含一个或多个化学修饰和/或序列的修饰(取代、另外的核苷酸、截短等)的gRNA。因此，为了方便在本公开文本中呈现，gRNA可以仅关于其靶向结构域序列而被描述。
更一般地，熟练技术人员将理解，本公开文本的一些方面涉及可使用多种RNA指导的核酸酶实现的系统、方法和组合物。因此，除非另有说明，否则术语gRNA应该理解为涵盖可与任何RNA指导的核酸酶一起使用的任何合适的gRNA，而不仅限于与特定物种的Cas9或Cpf1相容的那些gRNA。举例说明，在某些实施方案中，术语gRNA可以包括与存在于2类CRISPR系统(如II型或V型CRISPR系统)中的任何RNA指导的核酸酶或者源自或改编自所述2类CRISPR系统的RNA指导的核酸酶一起使用的gRNA。
下表2提供了与酿脓链球菌Cas9一起靶向TGFBR2的示例性gRNA。
表5.
Figure BDA0002556467540000251
Figure BDA0002556467540000261
gRNA设计
用于靶序列的选择和验证方法以及脱靶分析先前已经描述在例如以下文献中：Mali；Hsu；Fu等人,2014Nat Biotechnol 32(3):279-84，Heigwer等人,2014Nat methods11(2):122-3；Bae等人(2014)Bioinformatics 30(10):1473-5；以及Xiao A等人(2014)Bioinformatics 30(8):1180-1182。将这些参考文献的每一个都通过引用并入本文。作为非限制性例子，gRNA设计可以涉及使用软件工具来优化与使用者的靶序列相对应的潜在靶序列的选择，例如以最小化整个基因组的脱靶活性。尽管脱靶活性不限于切割，但是可以例如使用从实验得到的加权方案来预测每个脱靶序列处的切割效率。这些和其他指导选择方法详细地描述在Maeder和Cotta-Ramusino中。
gRNA修饰
gRNA的活性、稳定性或其他特征可以通过并入某些修饰而改变。作为一个例子，瞬时表达或递送的核酸可能易于被例如细胞核酸酶降解。因此，本文所述的gRNA可以含有引入了对核酸酶的稳定性的一种或多种修饰的核苷或核苷酸。尽管不希望受到理论的束缚，但是也可以相信，当本文所述的某些修饰的gRNA被引入细胞中时可以展现出降低的固有免疫应答。本领域技术人员将意识到在细胞(例如哺乳动物细胞)中通常观察到的对外源核酸、特别是病毒或细菌来源的那些的某些细胞反应。此类反应可以通过本文呈现的修饰来降低或完全消除，所述此类可以包括细胞因子表达和释放以及细胞死亡的诱导。
本节中所述的某些示例性修饰可以包括在gRNA序列内的任何位置，包括但不限于5'末端处或附近(例如在5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)和/或在3'末端处或附近(例如在3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)。在一些情况下，修饰位于功能基序(如Cas9gRNA的重复序列-抗重复序列双链体、Cas9或Cpf1 gRNA的茎环结构和/或gRNA的靶向结构域)内。
作为一个例子，gRNA的5'末端可以包含真核mRNA帽结构或帽类似物(例如G(5’)ppp(5’)G帽类似物、m7G(5’)ppp(5’)G帽类似物或3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G抗反向帽类似物(ARCA))，如下所示：
Figure BDA0002556467540000271
在gRNA的化学合成或体外转录过程中可以包含帽或帽类似物。
类似地，gRNA的5'末端可以缺少5'三磷酸基团。例如，可以对体外转录的gRNA进行磷酸酶处理(例如，使用小牛肠碱性磷酸酶)以去除5'三磷酸基团。
另一种常见的修饰涉及在gRNA的3'末端处添加多个(例如1-10、10-20或25-200个)腺嘌呤(A)残基，称为聚A段。在使用聚腺苷聚合酶(例如大肠杆菌(E.coli)聚(A)聚合酶)进行体外转录后或在体内借助于聚腺苷酸化序列，可以在化学合成过程中将聚A段添加到gRNA，如在Maeder中所述。
应当注意，本文描述的修饰可以以任何合适的方式组合，例如gRNA(无论是在体内从DNA载体转录的还是在体外转录的gRNA)可以包含5'帽结构或帽类似物和3'聚A段中的一个或两个。
指导RNA可以在3'末端U核糖处进行修饰。例如，U核糖的两个末端羟基基团可以被氧化为醛基团，并伴随核糖环的开放从而提供修饰的核苷，如下所示：
Figure BDA0002556467540000281
其中“U”可以是未修饰的或修饰的尿苷。
3'末端U核糖可以用2'3'环状磷酸酯修饰，如下所示：
Figure BDA0002556467540000282
其中“U”可以是未修饰的或修饰的尿苷。
指导RNA可以含有3'核苷酸，所述3'核苷酸可以例如通过并入本文所述的一种或多种修饰的核苷酸而对于降解是稳定的。在某些实施方案中，尿苷可以用修饰的尿苷(例如5-(2-氨基)丙基尿苷和5-溴尿苷)或本文所述的任何修饰的尿苷替代；腺苷和鸟苷可以用修饰的腺苷和鸟苷(例如用8位置处的修饰，例如8-溴鸟苷)或者用本文所述的任何修饰的腺苷或鸟苷替代。
在某些实施方案中，可以将糖修饰的核糖核苷酸并入gRNA中，例如其中2'OH-基团被选自以下的基团替代：H、-OR、-R(其中R可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、卤素、-SH、-SR(其中R可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或氰基(-CN)。在某些实施方案中，磷酸骨架可以如本文所述例如用硫代磷酸酯(PhTx)基团来修饰。在某些实施方案中，gRNA的一个或多个核苷酸可以各自独立地是修饰的或未修饰的核苷酸，包括但不限于2'-糖修饰的(如2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基)或2'-氟修饰的(包括例如2'-F或2'-O-甲基腺苷(A)、2'-F或2'-O-甲基胞苷(C)、2'-F或2'-O-甲基尿苷(U)、2'-F或2'-O-甲基胸苷(T)、2'-F或2'-O-甲基鸟嘌呤(G)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任何组合)。
指导RNA也可以包括“锁”核酸(LNA)，其中2'OH-基团可以例如通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥与相同核糖的4'碳连接。可以使用任何合适的部分来提供此类桥，所述此类桥包括但不限于亚甲基、丙烯、醚或氨基桥；O-氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基或O(CH2)n-氨基(其中氨基可以是例如、NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。
在某些实施方案中，gRNA可以包含多环(例如三环；和“非锁”形式，如乙二醇核酸(GNA)(例如R-GNA或S-GNA，其中核糖被附接至磷酸二酯键的乙二醇单元替代)或苏糖核酸(TNA，其中核糖被α-L-苏式呋喃糖基-(3’→2’)替代))的修饰的核苷酸。
通常，gRNA包含糖基核糖，所述糖基核糖为含氧的5元环。示例性的修饰的gRNA可以包括但不限于核糖中的氧(例如被硫(S)、硒(Se)或亚烷基(例如亚甲基或亚乙基))的替代；双键的加成(例如以将核糖用环戊烯基或环己烯基替代)；核糖的环缩(例如以形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如以形成具有另外的碳原子或杂原子的6元或7元环，例如也具有氨基磷酸酯骨架的脱水己糖醇、阿卓糖醇、甘露糖醇、环己基、环己烯基和吗啉代)。尽管大多数糖类似物的改变都定位在2'位置，但其他位点(包括4'位置)也可以进行修饰。在某些实施方案中，gRNA包含4'-S、4'-Se或4'-C-氨基甲基-2'-O-Me修饰。
在某些实施方案中，可以将脱氮核苷酸(例如7-脱氮腺苷)并入gRNA中。在某些实施方案中，可以将O-和N-烷基化的核苷酸(例如N6-甲基腺苷)并入gRNA中。在某些实施方案中，gRNA中的一个或多个或所有核苷酸是脱氧核苷酸。
RNA指导的核酸酶
根据本公开文本的RNA指导的核酸酶包括但不限于天然存在的2类CRISPR核酸酶(如Cas9和Cpf1)以及从其得到或获得的其他核酸酶。在功能方面，RNA指导的核酸酶被定义为如下那些核酸酶，所述核酸酶：(a)与gRNA相互作用(例如复合)；和(b)与gRNA一起缔合并任选地切割或修饰DNA的靶区域，所述靶区域包含(i)与gRNA的靶向结构域互补的序列，以及任选的(ii)另外的称为“原型间隔子邻近基序”或“PAM”的序列，其将在下面进行更详细地描述。如以下例子所示，RNA指导的核酸酶可以通过其PAM特异性和切割活性在广义上定义，即使在共有相同的PAM特异性或切割活性的单独RNA指导的核酸酶之间也可能存在变化。熟练技术人员将理解，本公开文本的一些方面涉及可以使用具有特定PAM特异性和/或切割活性的任何合适的RNA指导的核酸酶来实现的系统、方法和组合物。因此，除非另有说明，否则术语“RNA指导的核酸酶”应被理解为通用术语，并且不限于RNA指导的核酸酶的任何特定类型(例如，Cas9与Cpf1)、物种(例如，酿脓链球菌与金黄色葡萄球菌)或变种(例如，全长与截短或分割的；天然存在的PAM特异性与工程化PAM特异性等)。
PAM序列的名称源于与互补于gRNA靶向结构域(或“间隔子”)的“原型间隔子”序列的序列关系。PAM序列与原型间隔子序列一起定义了针对特定的RNA指导的核酸酶/gRNA组合的靶区域或靶序列。
多种RNA指导的核酸酶可能需要PAM与原型间隔子之间的不同序列关系。
除了识别PAM与原型间隔子的特定序列取向外，RNA指导的核酸酶还可以识别特定的PAM序列。例如，金黄色葡萄球菌Cas9识别NNGRRT或NNGRRV的PAM序列，其中N残基紧接由gRNA靶向结构域识别的区域的3'。酿脓链球菌Cas9识别NGG PAM序列。并且新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)Cpf1识别TTN PAM序列。已鉴定了针对多种RNA指导的核酸酶的PAM序列，并且Shmakov等人,2015,Molecular Cell 60,385-397,2015年11月5日已经描述了鉴定新型PAM序列的策略。还应注意，工程化RNA指导的核酸酶可以具有与参考分子的PAM特异性不同的PAM特异性(例如，在工程化RNA指导的核酸酶的情况下，参考分子可以是RNA指导的核酸酶所来源的天然存在的变体，或与工程化RNA指导的核酸酶具有最大的氨基酸序列同源性的天然存在的变体)。
除了其PAM特异性外，RNA指导的核酸酶的特征还可以在于其DNA切割活性：天然存在的RNA指导的核酸酶通常在靶核酸中形成DSB，但是已经产生了仅生成SSB(如上所述)(Ran&Hsu,等人,Cell 154(6),1380-1389,2013年9月12日(Ran)，通过引用并入本文)或完全不剪切的工程化变体。
Cas9
已确定酿脓链球菌Cas9(Jinek 2014)和金黄色葡萄球菌Cas9在与单分子指导RNA和靶DNA(Nishimasu 2014；Anders 2014；和Nishimasu 2015)的复合物中的晶体结构。
天然存在的Cas9蛋白包含两个叶片：识别(REC)叶片和核酸酶(NUC)叶片；每个都包含特定的结构域和/或功能结构域。REC叶片包含富含精氨酸的桥螺旋(BH)结构域和至少一个REC结构域(例如，REC1结构域和任选的REC2结构域)。REC叶片与其他已知蛋白质没有结构相似性，这指示它是独特的功能结构域。尽管不希望受到任何理论的束缚，但突变分析表明了BH和REC结构域的特定功能作用：BH结构域显现出在gRNA:DNA识别方面发挥作用，而REC结构域被认为与gRNA的重复序列:抗重复序列双链体相互作用并介导Cas9/gRNA复合物的形成。
NUC叶片包含RuvC结构域、HNH结构域和PAM相互作用(PI)结构域。RuvC结构域与逆转录病毒整合酶超家族成员具有结构相似性，并且切割靶核酸的非互补(即底部)链。它可能由两个或更多个分割的RuvC基序(如酿脓链球菌和金黄色葡萄球菌中的RuvC I、RuvCII和RuvCIII)形成。同时，HNH结构域在结构上与HNN内切核酸酶基序相似，并且切割靶核酸的互补(即顶部)链。顾名思义，PI结构域有助于PAM特异性。
虽然Cas9的某些功能与上述特定结构域有联系(但不一定完全由上述特定结构域决定)，但这些和其他功能可能被其他Cas9结构域或任一叶片上的多个结构域介导或影响。例如，在酿脓链球菌Cas9中，如Nishimasu 2014中所述，gRNA的重复序列:抗重复序列双链体落在REC与NUC叶片之间的凹槽中，并且双链体中的核苷酸与BH、PI和REC结构域中的氨基酸相互作用。第一茎环结构中的一些核苷酸还与多个结构域(PI、BH和REC1)中的氨基酸相互作用，第二和第三茎环中的一些核苷酸也是如此(RuvC和PI结构域)。
Cpf1
氨基酸球菌属的物种(Acidaminococcus sp.)Cpf1在与crRNA和包含TTTN PAM序列的双链(ds)DNA靶标的复合物中的晶体结构已经由Yamano等人(Cell.2016年5月5日；165(4):949-962(Yamano)，通过引用并入本文)解析。像Cas9一样，Cpf1也有两个叶片：REC(识别)叶片和NUC(核酸酶)叶片。REC叶片包含与任何已知的蛋白质结构缺乏相似性的REC1和REC2结构域。同时，NUC叶片包含三个RuvC结构域(RuvC-I、-II和-III)和BH结构域。然而，与Cas9相比，Cpf1 REC叶片缺少HNH结构域，并且包括与已知蛋白质结构也缺乏相似性的其他结构域：结构独特的PI结构域、三个Wedge(WED)结构域(WED-I、-II和-III)和核酸酶(Nuc)结构域。
虽然Cas9和Cpf1在结构和功能上共有相似性，但应该理解，某些Cpf1活性是由与任何Cas9结构域都不相似的结构域介导的。例如，靶DNA的互补链的切割显现出是由Nuc结构域介导的，所述Nuc结构域与Cas9的HNH结构域在序列上和空间上不同。此外，Cpf1 gRNA的非靶向部分(手柄)采用假结结构，而不是由Cas9 gRNA中的重复序列:抗重复序列双链体形成的茎环结构。
RNA指导的核酸酶的修饰
上述RNA指导的核酸酶具有可用于多种应用的活性和特性，但是熟练技术人员将理解，RNA指导的核酸酶在某些情况下也可以被修饰以改变切割活性、PAM特异性或其他结构或功能特征。
首先是改变切割活性的修饰，上文已经描述了降低或消除NUC叶片内结构域活性的突变。可在RuvC结构域中、在Cas9 HNH结构域中或在Cpf1 Nuc结构域中制造的示例性突变描述在Ran和Yamano以及Cotta-Ramusino中。通常，降低或消除两个核酸酶结构域之一的活性的突变导致具有切口酶活性的RNA指导的核酸酶，但应注意，切口酶活性的类型根据失活的结构域而变化。作为一个例子，Cas9的RuvC结构域的失活将导致切割互补链或顶部链的切口酶。另一方面，Cas9 HNH结构域的失活导致切割底部或非互补链的切口酶。
Kleinstiver等人已经描述了对于酿脓链球菌(Kleinstiver等人,Nature.2015年7月23日；523(7561):481-5(Kleinstiver I))和金黄色葡萄球菌(Kleinstiver等人,NatBiotechnol.2015年12月；33(12):1293-1298(Klienstiver II))二者的相对于天然存在的Cas9参考分子的PAM特异性修饰。Kleinstiver等人也已经描述了改善Cas9的靶向保真度的修饰(Nature,2016年1月28日；529,490-495(Kleinstiver III))。将这些参考文献的每一个都通过引用并入本文。
RNA指导的核酸酶已分割为两个部分或更多个部分，如由Zetsche等人(NatBiotechnol.2015年2月；33(2):139-42(Zetsche II)，通过引用并入)和由Fine等人(SciRep.2015年7月1日；5:10777(Fine)，通过引用并入)所述。
在某些实施方案中，RNA指导的核酸酶可以是(例如经由减小核酸酶大小同时仍保留gRNA缔合、靶标和PAM识别以及切割活性的一个或多个缺失)被大小优化的或截短的。在某些实施方案中，RNA指导的核酸酶与另一个多肽、核苷酸或其他结构共价或非共价地任选借助于接头结合。示例性的结合的核酸酶和接头由Guilinger等人,Nature Biotechnology32,577-582(2014)描述，将其出于所有目的通过引用并入本文。
RNA指导的核酸酶还任选地包含标签，例如但不限于核定位信号以促进RNA指导的核酸酶蛋白向核中移动。在某些实施方案中，RNA指导的核酸酶可以并入C和/或N末端核定位信号。核定位序列是本领域已知的并且描述在Maeder中和其他地方。
前述修饰的列表本质上旨在是示例性的，并且鉴于本公开文本，熟练技术人员将理解，在某些应用中其他修饰是可能的或期望的。因此，为了简洁起见，本公开文本的示例性系统、方法和组合物是参考特定的RNA指导的核酸酶来呈现的，但是应当理解，所使用的RNA指导的核酸酶可以用不改变其操作原理的方式进行修饰。此类修饰在本公开文本的范围内。
编码RNA指导的核酸酶的核酸
本文提供了编码RNA指导的核酸酶(例如Cas9、Cpf1或其功能片段)的核酸。先前已经描述了编码RNA指导的核酸酶的示例性核酸(参见例如Cong2013；Wang 2013；Mali 2013；Jinek 2012)。
在一些情况下，编码RNA指导的核酸酶的核酸可以是合成核酸序列。例如，合成核酸分子可以进行化学修饰。在某些实施方案中，编码RNA指导的核酸酶的mRNA将具有以下特性中的一种或多种(例如全部)：其可以被加帽；聚腺苷酸化；以及被5-甲基胞苷和/或假尿苷取代。
也可以对合成核酸序列进行密码子优化，例如至少一个非常见密码子或不太常见密码子已经被常见密码子替代。例如，合成核酸可以引导优化(例如针对在哺乳动物表达系统中的表达而优化)的信使mRNA的合成，例如本文所述。在Cotta-Ramusino中呈现了密码子优化的Cas9编码序列的例子。
另外或可替代地，编码RNA指导的核酸酶的核酸可以包含核定位序列(NLS)。核定位序列是本领域已知的。
候选分子的功能分析
候选RNA指导的核酸酶、gRNA及其复合物可以通过本领域已知的标准方法来评价。参见例如Cotta-Ramusino。可以通过差示扫描荧光法评价RNP复合物的稳定性，如下所述。
差示扫描荧光法(DSF)
包含gRNA和RNA指导的核酸酶的核糖核蛋白(RNP)复合物的热稳定性可以经由DSF测量。DSF技术测量蛋白质的热稳定性，所述热稳定性可以在有利的条件(如添加结合性RNA分子，例如gRNA)下增加。
DSF测定可以根据任何合适的方案进行，并且可以用于任何合适的环境，包括但不限于(a)测试不同的条件(例如，不同的gRNA:RNA指导的核酸酶蛋白化学计量比、不同的缓冲液等)以鉴定RNP形成的最佳条件；和(b)测试RNA指导的核酸酶和/或gRNA的修饰(例如化学修饰、序列改变等)以鉴定改善RNP形成或稳定性的那些修饰。DSF测定的一个读出是RNP复合物的熔解温度的改变；相对较高的改变表明，RNP复合物相对于以较低改变为特征的参考RNP复合物更稳定(并因此可能具有更大的活性或更有利的形成动力学、降解动力学或另一种功能特征)。当将DSF测定用作筛选工具时，可以指定阈值熔解温度改变，使得输出是具有等于或高于阈值的熔解温度改变的一种或多种RNP。例如，阈值可以是5℃-10℃(例如5°、6°、7°、8°、9°、10°)或更高，并且输出可以是以大于或等于阈值的熔解温度改变为特征的一种或多种RNP。
DSF测定条件的两个非限制性例子如下所示：
为了确定形成RNP复合物的最佳溶液，将在水+10x SYPRO
Figure BDA0002556467540000341
(LifeTechnologies cat#S-6650)中的固定浓度(例如2μM)的Cas9分配到384孔板中。然后添加等摩尔量的在具有不同pH和盐的溶液中稀释的gRNA。在室温下孵育10'并短暂离心以去除任何气泡后，使用具有Bio-Rad CFX Manager软件的Bio-Rad CFX384TM实时系统C1000TouchTM热循环仪运行从20℃至90℃每10秒温度升高1℃的梯度。
第二种测定由以下组成：将各种浓度的gRNA与固定浓度(例如2μM)的Cas9在来自上述测定1的最佳缓冲液中混合，以及在384孔板中孵育(例如在室温下持续10')。添加等体积的最佳缓冲液+10x SYPRO
Figure BDA0002556467540000351
(Life Technologies cat#S-6650)，并用
Figure BDA0002556467540000352
B粘合剂(MSB-1001)密封板。短暂离心以去除任何气泡后，使用具有Bio-RadCFX Manager软件的Bio-Rad CFX384TM实时系统C1000 TouchTM热循环仪运行从20℃至90℃每10秒温度升高1℃的梯度。
基因组编辑策略
在本公开文本的各个实施方案中，上述基因组编辑系统用于编辑(即改变)在细胞内的或从细胞获得的DNA(例如，TGFBR2 DNA)的所靶向的区域。本文描述了用于生成特定编辑的多种策略，并且通常关于所需的修复结果、各个编辑(例如SSB或DSB)的数量和定位以及此类编辑的靶位置来描述这些策略。
涉及SSB或DSB形成的基因组编辑策略的特征在于如下修复结果，所述修复结果包括：(a)所靶向的区域的全部或部分缺失；(b)插入或替代所靶向的区域的全部或部分；或(c)所靶向的区域的全部或部分的中断。该分组不旨在限制或约束任何特定理论或模型，而仅为了方便呈现而提供。熟练技术人员将理解，所列结果并非互斥的，并且一些修复可能导致其他结果。除非另有说明，否则不应将对特定编辑策略或方法的描述理解为需要特定的修复结果。
所靶向的区域的替代通常涉及所靶向的区域内的全部或部分现有序列被同源序列替代，例如通过基因修正或基因转化(这是由HDR途径介导的两个修复结果)。通过使用供体模板促进HDR，所述供体模板可以是单链或双链的，如下文更详细的描述。单链或双链的模板可以是外源的，在这种情况下它们将促进基因修正，或者它们可以是内源的(例如，细胞基因组内的同源序列)以促进基因转化。外源模板可以具有不对称的突出端(即模板中与DSB的位点互补的部分可以在3'或5'方向上偏移，而不是在供体模板内的中央)，例如由理查森Richardson等人(Nature Biotechnology 34,339-344(2016),(Richardson)，通过引用并入)所述。在模板是单链的情况下，它可以对应于所靶向的区域的互补(顶部)或非互补(底部)链。
如在Ran和Cotta-Ramusino中所述，在一些情况下，通过在所靶向的区域内或周围形成一个或多个切口来促进基因转化和基因修正。在一些情况下，使用双切口酶策略形成两个偏移SSB，所述偏移SSB转而形成单个具有突出端(例如5'突出端)的DSB。
可以通过多种修复结果实现全部或部分所靶向的序列的中断和/或缺失。作为一个例子，可以通过同时生成位于所靶向的区域侧翼的两个或更多个DSB而使序列缺失，然后在修复DSB时所述所靶向的区域被切除，如Maeer针对LCA10突变所述。作为另一个例子，序列可以通过形成具有单链突出端的双链断裂生成的缺失而中断，接着对突出端进行核酸外切处理，然后修复。
靶序列中断的一个特定子集是由所靶向的序列内插入缺失的形成介导的，其中修复结果通常由NHEJ途径(包括Alt-NHEJ)介导。NHEJ由于其与插入缺失突变相关，因此被称为“易错”的修复途径。然而，在一些情况下，通过NHEJ修复DSB而不改变其周围的序列(所谓的“完美”或“无疤”修复)；这通常需要将DSB的两端完美连接。同时，人们认为插入缺失是由游离DNA末端在它们被连接之前的酶促处理产生的，所述酶促处理从任一个或两个游离末端的任一条或两条链添加和/或去除核苷酸。
由于游离DSB末端的酶促处理本质上可能是随机的，因此插入缺失突变往往是可变的，沿着分布发生，并且可以受多种因素影响，所述多种因素包括特定的靶位点、所使用的细胞类型、所使用的基因组编辑策略等。即使如此，也可以对插入缺失的形成进行有限的概括：通过修复单个DSB形成的缺失最常在1-50bp范围内，但可以达到大于100-200bp。通过修复单个DSB形成的插入往往更短，并且通常包括紧接断裂位点周围的序列的短重复。然而，有可能获得大的插入，并且在这些情况下，插入的序列已通常被追踪到基因组的其他区域或细胞中存在的质粒DNA。
插入缺失突变和配置为产生插入缺失的基因组编辑系统可用于，例如在不需要生成特定的最终序列时和/或在容许移码突变的情况下使靶序列中断。它们也可用于优选特定序列的环境，只要所需的某些序列倾向于优先从修复给定位点处的SSB或DSB产生即可。插入缺失突变也是用于评价或筛选特定基因组编辑系统及其组分的活性的有用工具。在这些和其他环境中，插入缺失的特征可在于(a)与基因组编辑系统接触的细胞基因组中它们的相对和绝对频率，以及(b)相对于未编辑序列的数值差异(例如，±1、±2、±3等)的分布。作为一个例子，在先导物发现环境中，可以根据在控制的条件下的插入缺失读出筛选多种gRNA，以鉴定最有效地驱动靶位点处的剪切的那些gRNA。可以选择产生等于或低于阈值频率的插入缺失或者产生特定插入缺失分布的指导物，以供进一步研究和开发。插入缺失频率和分布也可以用作读出以用于例如通过保持gRNA恒定并改变某些其他反应条件或递送方法来评价不同基因组编辑系统实现或配制和递送方法。
多路复用策略
尽管上文所述的示例性策略集中于由单个DSB介导的修复结果，但是根据本公开文本的基因组编辑系统也可以用于在相同基因座或不同基因座中生成两个或更多个DSB。例如，涉及形成多个DSB或SSB的编辑策略描述在Cotta-Ramusino中。
供体模板设计
供体模板设计详细地描述在文献例如Cotta-Ramusino中。可以作为单链(ssODN)或双链(dsODN)的DNA寡聚物供体模板(寡脱氧核苷酸或ODN)可用于促进基于HDR的DSB修复，并且尤其可用于将改变引入靶DNA序列中、将新序列插入靶序列中或完全替代靶序列。
无论是单链还是双链，供体模板通常包含与待切割的靶序列内或附近(例如，侧翼或邻接)的DNA区域同源的区域。这些同源区域在此处称为“同源臂”，并在下面进行了示意性说明：
[5'同源臂]-[替代序列]-[3'同源臂]。
同源臂可以具有任何合适的长度(如果仅使用一个同源臂，则包含0个核苷酸)，并且3'和5'同源臂可以具有相同的长度或者可以长度不同。合适的同源臂长度的选择可能受多种因素影响，所述多种因素例如希望避免与某些序列(如Alu重复序列)或其他非常常见的元件的同源性或微同源性。例如，可以缩短5'同源臂以避免序列重复元件。在其他实施方案中，可以缩短3'同源臂以避免序列重复元件。在一些实施方案中，可以缩短5'和3'同源臂二者以避免包含某些序列重复元件。另外，一些同源臂设计可以提高编辑效率或增加所需修复结果的频率。例如，通过引用并入的Richardson等人Nature Biotechnology 34,339-344(2016)(Richardson)发现单链供体模板的3'和5'同源臂的相对不对称影响修复率和/或结果。
供体模板中的替代序列已描述在其他地方，包括Cotta-Ramusino等人。替代序列可以是任何合适的长度(包括零个核苷酸，其中所需的修复结果是缺失)，并且通常包含相对于需要编辑的细胞内天然存在的序列的一、二、三个或更多个序列修饰。一种常见的序列修饰涉及改变天然存在的序列以修复与需要治疗的疾病或病症相关的突变。另一种常见的序列修饰涉及改变互补于或编码RNA指导的核酸酶的PAM序列的一个或多个序列或者用于生成SSB或DSB的一种或多种gRNA的靶向结构域，以减少或消除在将替代序列并入靶位点中后靶位点的重复切割。
在使用线性ssODN的情况下，可将其配置为(i)退火至靶核酸的切口链、(ii)退火至靶核酸的完整链、(iii)退火至靶核酸的正链和/或(iv)退火至靶核酸的负链。ssODN可以具有任何合适的长度，例如约、至少或不超过150-200个核苷酸(例如150、160、170、180、190或200个核苷酸)。
应当注意，模板核酸也可以是核酸载体，如病毒基因组或环状双链DNA(例如质粒)。包含供体模板的核酸载体可以包含其他编码或非编码元件。例如，模板核酸可以作为病毒基因组(例如，在AAV或慢病毒基因组中)的一部分递送，所述病毒基因组包含某些基因组骨架元件(例如，在AAV基因组的情况下，反向末端重复序列)，并且任选地包含编码gRNA和/或RNA指导的核酸酶的另外的序列。在某些实施方案中，供体模板可以与由一种或多种gRNA识别的靶位点邻近或侧接，以促进在供体模板的一端或两端上形成游离DSB，所述供体模板可以参与使用相同gRNA在细胞DNA中形成的相应SSB或DSB的修复。适合用作供体模板的示例性核酸载体描述在Cotta-Ramusino中。
无论使用哪种形式，都可以将模板核酸设计为避免不需要的序列。在某些实施方案中，可以缩短一个或两个同源臂以避免与某些序列重复元件(例如，Alu重复序列、LINE元件等)重叠。
靶细胞
根据本公开文本的基因组编辑系统可以用于操纵或改变细胞，例如以编辑或改变靶核酸。在各个实施方案中，操纵可以在体内或离体发生。
根据本公开文本的实施方案，可以操纵或改变多种细胞类型，并且在一些情况(如体内应用)下，多种细胞类型是例如通过将根据本公开文本的基因组编辑系统递送至多种细胞类型进行改变或操纵的。然而，在其他情况下，可能需要将操纵或改变限制为一种或多种特定细胞类型。例如，在一些情况下，可能需要编辑分化潜能有限的细胞或终末分化的细胞，如在Maeder的情况下的感光细胞，其中期望基因型的修饰导致细胞表型的变化。然而，在其他情况下，可能需要编辑分化程度较低、多潜能或多能的干细胞或祖细胞。举例来说，细胞可以是胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、造血干/祖细胞(HSPC)或分化成与给定应用或适应症相关的细胞类型的其他干细胞或祖细胞类型。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞。
作为推论，根据所靶向的一种或多种细胞类型和/或所需的编辑结果，被改变或操纵的细胞不同地是分裂细胞或非分裂细胞。
当离体操纵或改变细胞时，细胞可立即使用(例如给予至受试者)，或者可将其维持或储存以备后用。本领域技术人员将理解，可以使用本领域已知的任何合适方法将细胞维持在培养物中或储存(例如在液氮中冷冻)。
基因组编辑系统的实现：递送、配制和给予途径
如上所述，本公开文本的基因组编辑系统可以用任何合适的方式实现，这意味着此类系统的组分(包括但不限于RNA指导的核酸酶、gRNA和任选的供体模板核酸)可以用导致基因组编辑系统的转导、表达或引入和/或在细胞、组织或受试者中引起所需的修复结果的任何合适的形式或形式的组合来递送、配制或给予。表3和表4列出了基因组编辑实现的若干个非限制性例子。然而，本领域技术人员将理解，这些列表并不全面并且其他实现也是可能的。特别参考表3，该表列出了包含单一gRNA和任选的供体模板的基因组编辑系统的若干种示例性实现。然而，根据本公开文本的基因组编辑系统可以并入多种gRNA、多种RNA指导的核酸酶和其他组分(如蛋白质)，并且熟练技术人员将基于表中所展示的原理明白多种实现。在表中，[N/A]指示基因组编辑系统不包含所指示的组分。
表6
Figure BDA0002556467540000401
表7总结了用于如本文所述的基因组编辑系统的组分的多种递送方法。同样，所述列表旨在是示例性的而不是限制性的。
表7
Figure BDA0002556467540000411
基因组编辑系统的基于核酸的递送
可以通过本领域已知的方法或如本文所述将编码根据本公开文本的基因组编辑系统的各种元件的核酸给予至受试者或递送至细胞中。例如，编码RNA指导的核酸酶和/或编码gRNA的DNA以及供体模板核酸可以通过例如载体(例如病毒或非病毒载体)、基于非载体的方法(例如使用裸DNA或DNA复合物)或其组合来递送。
编码基因组编辑系统的元件的核酸可以包含编码一、二、三、四或更多种gRNA的序列。例如，核酸可以编码第一和第二gRNA分子二者，例如，其中第二gRNA具有与TGFBR2基因的第二靶序列互补的第二靶向结构域。本文公开的核酸可以进一步包含编码第三gRNA分子的核苷酸序列，所述第三gRNA分子具有与TGFBR2基因的第三靶序列互补的第三靶向结构域。本文公开的核酸组合物可以进一步包含编码本文所述的第四gRNA分子的核苷酸序列，所述第四gRNA分子具有与TGFBR2基因的第四靶序列互补的第四靶向结构域。在某些实施方案中，第二、第三和/或第四gRNA分子包含含有选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列的靶向结构域。
编码基因组编辑系统或其组分的核酸可以作为裸DNA或RNA的形式例如借助于转染或电穿孔直接递送至细胞，或者可以与促进靶细胞(例如红细胞、HSC)摄取的分子(例如N-乙酰半乳糖胺)缀合。也可以使用核酸载体，如表4中总结的载体。
核酸载体可以包含编码基因组编辑系统组分(如RNA指导的核酸酶、gRNA和/或供体模板)的一个或多个序列。载体也可以包含编码信号肽(例如用于核定位、核仁定位或线粒体定位)的序列，其缔合(例如插入或融合至)编码蛋白质的序列。作为一个例子，核酸载体可以包含Cas9编码序列，其包括一个或多个核定位序列(例如来自SV40的核定位序列)。
核酸载体也可以包含任何合适数量的调节/控制元件，例如启动子、增强子、内含子、聚腺苷酸化信号、Kozak共有序列或内部核糖体进入位点(IRES)。这些元件在本领域中是熟知的，并且描述在Cotta-Ramusino中。
根据本公开文本的核酸载体包括重组病毒载体。示例性病毒载体在表7中列出，并且另外的合适的病毒载体及其用途和产生描述在Cotta-Ramusino中。在某些实施方案中，载体是病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。也可以使用本领域已知的其他病毒载体。另外，病毒颗粒可以用于递送核酸和/或肽形式的基因组编辑系统组分。例如，“空”病毒颗粒可以被组装以容纳任何合适的装载物。病毒载体和病毒颗粒也可以被工程化为并入靶向配体以改变靶组织特异性。
除了病毒载体之外，也可以使用非病毒载体来递送编码根据本公开文本的基因组编辑系统的核酸。一类重要的非病毒核酸载体是纳米颗粒，其可以是有机或无机的。纳米颗粒在本领域中是熟知的，并且总结在Cotta-Ramusino中。可以使用任何合适的纳米颗粒设计来递送基因组编辑系统组分或编码此类组分的核酸。例如，有机(例如脂质和/或聚合物)纳米颗粒可以适合用作本公开文本的某些实施方案中的递送媒介物。表8显示了用于纳米颗粒配制品和/或基因转移的示例性脂质，并且表9列出了用于基因转移和/或纳米颗粒配制品的示例性聚合物。
表8：用于基因转移的脂质
Figure BDA0002556467540000431
表9：用于基因转移的聚合物
聚合物 缩写
聚乙二醇 PEG
聚乙烯亚胺 PEI
二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯) DSP
3,3'-二硫代二丙亚氨酸二甲酯 DTBP
聚(乙烯亚胺)二氨基甲酸酯 PEIC
聚(L-赖氨酸) PLL
组氨酸修饰的PLL
聚(N-乙烯基吡咯烷酮) PVP
聚(丙烯亚胺) PPI
聚(酰胺胺) PAMAM
聚(氨基乙烯亚胺) SS-PAEI
三亚乙基四胺 TETA
聚(β-氨基酯)
聚(4-羟基-L-脯氨酸酯) PHP
聚(烯丙胺)
聚(α-[4-氨基丁基]-L-乙醇酸) PAGA
聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸) PLGA
聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鎓)
聚(磷腈) PPZ
聚(磷酸酯) PPE
聚(氨基磷酸酯) PPA
聚(N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺) pHPMA
聚(2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯) pDMAEMA
聚(2-氨乙基丙烯磷酸酯) PPE-EA
壳聚糖
半乳糖化壳聚糖
N-十二烷基化壳聚糖
组蛋白
胶原蛋白
葡聚糖-精胺 D-SPM
非病毒载体任选地包含靶向修饰以改善摄取和/或选择性靶向特定细胞类型。这些靶向修饰可以包括例如细胞特异性抗原、单克隆抗体、单链抗体、适体、聚合物、糖(例如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))和细胞穿透肽。此类载体还任选地使用促融合和内体不稳定的肽/聚合物，经历酸触发的构象变化(例如，以加速装载物的内体逃逸)，和/或并入刺激可切割的聚合物，例如以在细胞室中释放。例如，可以使用在还原性细胞环境中切割的基于二硫化物的阳离子聚合物。
在某些实施方案中，递送除基因组编辑系统的组分(例如本文所述的RNA指导的核酸酶组分和/或gRNA组分)以外的一种或多种核酸分子(例如DNA分子)。在某些实施方案中，核酸分子与基因组编辑系统的一种或多种组分同时递送。在某些实施方案中，在递送基因组编辑系统的一种或多种组分之前或之后(例如少于约30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周或4周)，递送核酸分子。在某些实施方案中，通过与基因组编辑系统的一种或多种组分(例如RNA指导的核酸酶组分和/或gRNA组分)的递送不同的方式来递送核酸分子。可以通过本文描述的任何递送方法来递送核酸分子。例如，核酸分子可以通过病毒载体(例如整合缺陷型慢病毒)来递送，并且RNA指导的核酸酶分子组分和/或gRNA组分可以通过电穿孔来递送，例如使得可以减小核酸(例如DNA)引起的毒性。在某些实施方案中，核酸分子编码治疗性蛋白质，例如本文所述的蛋白质。在某些实施方案中，核酸分子编码RNA分子，例如本文所述的RNA分子。
RNP和/或编码基因组编辑系统组分的RNA的递送
可以通过本领域已知的方法将RNP(gRNA和RNA指导的核酸酶的复合物，即核糖核蛋白复合物)和/或编码RNA指导的核酸酶和/或gRNA的RNA递送至细胞中或给予至受试者，其中一些方法已描述在Cotta-Ramusino中。在体外，可以例如通过显微注射、电穿孔、瞬时细胞压缩或挤压来递送编码RNA指导的核酸酶和/或编码gRNA的RNA(参见例如Lee 2012)。脂质介导的转染、肽介导的递送、GalNAc或其他缀合物介导的递送及其组合也可以用于体外和体内递送。
在体外，经由电穿孔的递送包括将细胞与编码RNA指导的核酸酶和/或gRNA的RNA在有或没有供体模板核酸分子的情况下混合在盒、室或试管中，以及施加具有确定持续时间和振幅的一个或多个电脉冲。用于电穿孔的系统和方案在本领域中是已知的，并且任何合适的电穿孔工具和/或方案可以与本公开文本的各个实施方案结合使用。
在某些实施方案中，本公开文本的RNP复合物(包括例如RNP药物组合物)可用于：(1)改善T细胞增殖；(2)改善T细胞存活；和/或(3)改善T细胞功能。例如但并非限制性地，可以同时或依序使用两种或更多种包含不同gRNA的RNP复合物，以改变细胞(例如T细胞)中的TGFBR2基因表达。此类RNP复合物可以包含靶向不同TGFBR2基因序列的不同gRNA。在某些情况下，RNP复合物可以诱导切割事件，例如双链或单链断裂。例如，RNP复合物可以包含在靶核酸中形成双链断裂的酶促活性Cas9(eaCas9)分子或在靶核酸中形成单链断裂的eaCas9分子(例如切口酶分子)。在某些实施方案中，双切口酶RNP策略可以用于形成两个偏移的单链断裂，其转而形成具有突出端(例如5'突出端)的单个双链断裂。
给予途径
基因组编辑系统或使用此类系统改变或操纵的细胞可以通过任何合适的模式或途径(无论是局部的还是全身的)给予至受试者。全身性给予模式包括口服和肠胃外途径。肠胃外途径包括例如静脉内、骨髓内、动脉内、肌内、皮内、皮下、鼻内和腹膜内途径。全身性给予的组分可以被修饰或配制为靶向例如HSC、造血干细胞/祖细胞或红系祖细胞或前体细胞。
局部给予模式包括例如向骨小梁内的骨髓内注射或向骨髓腔内的股骨内注射以及向门静脉内的输注。在某些实施方案中，与全身性(例如静脉内)给予时相比，当局部(例如直接向骨髓内)给予时，显著更少量的组分(与全身性方法相比)可以发挥作用。局部给予模式可以减少或消除全身性给予治疗有效量的组分时可能发生的潜在毒副作用的发生。
给予可以提供为周期性推注(例如静脉内)或从内部储器或从外部储器(例如从静脉输液袋或可植入式泵)连续输注的形式。组分可以例如通过从持续释放药物递送装置连续释放而局部地给予。
另外，组分可以被配制为允许在长时间内释放。释放系统可以包含可生物降解材料或通过扩散释放并入的组分的材料的基质。组分可以均匀或不均匀地分布在释放系统内。可以使用多种释放系统，然而适当系统的选择将取决于特定应用所需的释放速率。可以使用不可降解和可降解的释放系统二者。合适的释放系统包括聚合物和聚合物基质、非聚合物基质或无机和有机赋形剂和稀释剂，例如但不限于碳酸钙和糖(例如海藻糖)。释放系统可以是天然的或合成的。然而，合成释放系统是优选的，因为通常它们更可靠、更可再现并且生成更确定的释放曲线。可以选择释放系统材料，使得具有不同分子量的组分通过材料的扩散或通过材料的降解而释放。
代表性的合成的可生物降解的聚合物包括例如：聚酰胺，如聚(氨基酸)和聚(肽)；聚酯，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(己内酯)；聚(酸酐)；聚原酸酯；聚碳酸酯；及其化学衍生物(取代、化学基团(例如烷基、亚烷基)的添加、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、共聚物及其混合物。代表性的合成的不可降解的聚合物包括例如：聚醚，如聚(环氧乙烷)、聚(乙二醇)和聚(四氢呋喃)；乙烯基聚合物-聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯(如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、其他烷基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸和甲基丙烯酸)，以及其他(如聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和聚(乙酸乙烯酯))；聚(尿烷)；纤维素及其衍生物，如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝化纤维素和各种乙酸纤维素；聚硅氧烷；及其任何化学衍生物(取代、化学基团(例如烷基、亚烷基)的添加、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、其共聚物和混合物。
也可以使用聚(丙交酯-共-乙交酯)微球体。通常，微球体由乳酸和乙醇酸的聚合物构成，其结构形成空心球。球的直径可以为约15-30微米，并且可以装载本文所述的组件。
组分的多方式或差异递送
鉴于本公开文本，熟练技术人员将理解，本文公开的基因组编辑系统的不同组分可以一起或单独地且同时或非同时递送。可能特别需要基因组编辑系统组分的单独和/或非同步递送，以提供对基因组编辑系统的功能的时间或空间控制并限制由其活性引起的某些影响。
本文所用的不同或差异模式是指赋予本发明组分分子(例如RNA指导的核酸酶分子、gRNA、模板核酸或有效载荷)不同的药效动力学或药代动力学特性的递送模式。例如，递送模式可以导致例如在选择的室、组织或器官中不同的组织分布、不同的半衰期或不同的时间分布。
一些递送模式(例如通过在细胞或细胞后代中持续存在的核酸载体的递送，例如通过自主复制或插入细胞核酸中的递送)导致组分的更持久表达和存在。例子包括病毒(例如AAV或慢病毒)递送。
举例来说，基因组编辑系统的组分(例如RNA指导的核酸酶和gRNA)可以通过在所递送的组分在身体或特定的室、组织或器官中的所得半衰期或持久性方面不同的模式来递送。在某些实施方案中，可以通过此类模式递送gRNA。RNA指导的核酸酶分子组分可以以导致较小持久性或较少暴露于身体或特定的室或组织或器官的模式来递送。
更一般地，在某些实施方案中，第一递送模式用于递送第一组分，并且第二递送模式用于递送第二组分。第一递送模式赋予第一药效动力学或药代动力学特性。第一药效动力学特性可以是例如组分或编码组分的核酸在身体、室、组织或器官中的分布、持久性或暴露。第二递送模式赋予第二药效动力学或药代动力学特性。第二药效动力学特性可以是例如组分或编码组分的核酸在身体、室、组织或器官中的分布、持久性或暴露。
在某些实施方案中，第一药效动力学或药代动力学特性(例如分布、持久性或暴露)比第二药效动力学或药代动力学特性更受限制。
在某些实施方案中，选择第一递送模式以优化(例如最小化)药效动力学或药代动力学特性，例如分布、持久性或暴露。
在某些实施方案中，选择第二递送模式以优化(例如最大化)药效动力学或药代动力学特性，例如分布、持久性或暴露。
在某些实施方案中，第一递送模式包括使用相对持久的元件(例如核酸，例如质粒或病毒载体(例如AAV或慢病毒))。由于此类载体是相对持久的，从它们转录的产物将是相对持久的。
在某些实施方案中，第二递送模式包括相对短暂的元件，例如RNA或蛋白质。
在某些实施方案中，第一组分包含gRNA，并且递送模式是相对持久的，例如gRNA是从质粒或病毒载体(例如AAV或慢病毒)转录的。这些基因的转录几乎没有生理学意义，因为这些基因不编码蛋白质产物，并且gRNA无法单独发挥作用。第二组分RNA指导的核酸酶分子以短暂方式(例如以mRNA或蛋白质的形式)递送，从而确保完整的RNA指导的核酸酶分子/gRNA复合物仅在短时间内存在并具有活性。
此外，组分可以以不同的分子形式或用相互补充以增强安全性和组织特异性的不同递送载体来递送。
使用差异递送模式可以增强性能、安全性和/或功效，例如可以降低最终脱靶修饰的可能性。免疫原性组分(例如Cas9分子)以不那么持久的模式递送可以降低免疫原性，因为MHC分子将来自细菌来源的Cas酶的肽展示在细胞表面。两部分递送系统可以减轻这些缺点。
差异递送模式可以用于将组分递送至不同但重叠的靶区域。活性复合物的形成在靶区域的重叠之外最小化。因此，在某些实施方案中，第一组分(例如gRNA)通过导致第一空间(例如组织)分布的第一递送模式来递送。第二组分(例如RNA指导的核酸酶分子)通过导致第二空间(例如组织)分布的第二递送模式来递送。在某些实施方案中，第一模式包括选自脂质体、纳米颗粒(例如聚合物纳米颗粒)和核酸(例如病毒载体)的第一元件。第二模式包括选自所述组的第二元件。在某些实施方案中，第一递送模式包括第一靶向元件(例如细胞特异性受体或抗体)，并且第二递送模式不包括该元件。在某些实施方案中，第二递送模式包括第二靶向元件，例如第二细胞特异性受体或第二抗体。
当在病毒递送载体、脂质体或聚合物纳米颗粒中递送RNA指导的核酸酶分子时，在可能需要仅靶向单个组织的情况下存在向多个组织递送并在其中具有治疗活性的可能。两部分递送系统可以解决这一难题并增强组织特异性。如果将gRNA和RNA指导的核酸酶分子包装在具有不同但重叠的组织趋向性的分离的递送媒介物中，则仅在两种载体都靶向的组织中形成功能完全的复合物。
基因工程化细胞和产生表达重组受体的细胞的方法
本文提供用于过继细胞疗法(例如过继免疫疗法)的细胞，以及产生或生成细胞的方法。细胞包括免疫细胞，如T细胞。通常，通过引入一种或多种基因工程化核酸或其产物来将细胞工程化。此类产物包括基因工程化抗原受体，包括工程化T细胞受体(TCR)和功能性非TCR抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR)，包括激活的、刺激的和共刺激的CAR)、及其组合。在一些实施方案中，还同时或依序将编码基因工程化抗原受体的核酸与能够破坏编码TGFBR2的基因的药剂(例如，Cas9/gRNA RNP)引入细胞。
在一些实施方案中，可以在引入编码重组受体的核酸分子和/或药剂(例如，Cas9/gRNA RNP)之前、期间和/或之后，孵育或培育细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，可以在引入编码重组受体的核酸分子之前、期间或之后，如在用编码重组受体的病毒载体(例如慢病毒载体)转导细胞之前、期间或之后，孵育或培育细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，可以在引入药剂(例如Cas9/gRNA RNP)之前、期间或之后，如在使细胞与药剂接触之前、期间或之后，或者在将药剂递送至(例如经由电穿孔)细胞之前、期间或之后，孵育或培育细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，所述孵育在引入编码重组受体的核酸分子和引入药剂(例如Cas9/gRNARNP)的情境中均可进行。在一些实施方案中，所述孵育可以在存在细胞因子(如IL-2、IL-7或IL-15)的情况下，或在存在诱导细胞的增殖或激活的刺激剂或激活剂(如抗CD3/抗CD28抗体)的情况下进行。
在一些实施方案中，所述方法包括在引入编码重组受体的核酸分子和药剂(例如Cas9/gRNARNP)之前，用刺激剂或激活剂(例如抗CD3/抗CD28抗体)激活或刺激细胞。在一些实施方案中，所述孵育也可以在存在如下细胞因子的情况下进行，所述细胞因子例如IL-2(例如1U/mL至500U/mL，如10U/mL至200U/mL，例如至少或约50U/mL或100U/mL)、IL-7(例如0.5ng/mL至50ng/mL，如1ng/mL至20ng/mL，例如至少或约5ng/mL或10ng/mL)或IL-15(例如0.1ng/mL至50ng/mL，如0.5ng/mL至25ng/mL，例如至少或约1ng/mL或5ng/mL)。在一些实施方案中，在引入编码重组受体的核酸分子(例如经由转导)之前，将细胞孵育6小时至96小时，如24-48小时或24-36小时。
用于基因工程化的细胞和细胞的制备
可以将与特异性抗原结合的重组受体和用于对编码TGFBR2多肽的TGFBR2基因进行基因编辑的药剂(例如Cas9/gRNARNP)引入多种细胞中。在一些实施方案中，将重组受体工程化和/或对TGFBR2靶基因进行离体操纵，并将所得的基因工程化细胞给予至受试者。用于离体操纵的靶细胞的来源可以包括例如受试者的血液、受试者的脐带血或受试者的骨髓。用于离体操纵的靶细胞的来源也可以包括例如异源的供体血液、脐带血或骨髓。
在一些实施方案中，所述细胞(例如工程化细胞)是真核细胞(如哺乳动物细胞，例如人细胞)。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。在一些方面，所述细胞是人细胞。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。
在一些实施方案中，所述靶细胞是T细胞，例如CD8+T细胞(例如CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、调节性T细胞(Treg)、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)或树突细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一个实施方案中，所述靶细胞是诱导多能干(iPS)细胞或源自iPS细胞的细胞，所述iPS细胞例如这样的iPS细胞，其由受试者生成，被操纵以改变(例如诱导一种或多种靶基因中的突变)或操纵一种或多种靶基因的表达，并分化成例如T细胞(例如CD8+T细胞(例如CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、干细胞记忆T细胞)、淋巴祖细胞或造血干细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助细胞T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞，对它们进行制备、处理、培养和/或工程化。在一些实施方案中，所述工程化的细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。如本文所述用于工程化的细胞可以从样品(如生物样品，例如获得自或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如所分离、处理和/或工程化的细胞所用于的过继细胞疗法)的人。
因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个处理步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其得到的经处理的样品。
在一些方面，细胞从其中来源或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性的样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情境中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，所述细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的所述血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，洗涤步骤是通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明书完成的。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过溶解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度进行离心来从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中的表达或存在来分开不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如，通过与和此类标记特异性地结合的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未与所述抗体或结合配偶体结合的那些细胞分离。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除所需群体之外的细胞表达的标记来实施分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一分离步骤，如后续阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
在一些实施方案中，一个或多个T细胞群体富集或耗尽对于一种或多种特定标记(如表面标记)呈阳性(标记+)或表达高水平的一种或多种特定标记(如表面标记)(标记高)的细胞、或对于一种或多种标记呈阴性(标记-)或表达相对低水平的一种或多种标记(标记低)的细胞。例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。在一些情况下，此类标记是在某些T细胞群体(如非记忆细胞)上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其他T细胞群体(如记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些标记。在一个实施方案中，针对对CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L呈阳性或表达高表面水平的CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞对细胞(如CD8+细胞或T细胞，例如CD3+细胞)进行富集(即，阳性选择)，和/或针对对CD45RA呈阳性或表达高水平的CD45RA的细胞对细胞(如CD8+细胞或T细胞，例如CD3+细胞)进行耗尽(例如，阴性选择)。在一些实施方案中，针对对CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Rα(CD127)呈阳性或表达高表面水平的CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Rα(CD127)的细胞对细胞进行富集或耗尽。在一些例子中，针对对CD45RO呈阳性(或对CD45RA呈阴性)并且对CD62L呈阳性的细胞对CD8+T细胞进行富集。
例如，CD3+、CD28+T细胞可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0002556467540000541
M-450CD3/CD28 T细胞扩增器)进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)，将T细胞与外周血单核细胞(PBMC)样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。(参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701.)在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，CD4+T细胞群体和CD8+T细胞亚群，例如富含中枢记忆(TCM)细胞的亚群。在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，对所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依序进行的。在一些方面，用于制备CD8+细胞群体或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群体或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性两种级分。然后使阴性级分经历基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆T细胞特有的标记(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中阳性和阴性选择是以任一顺序来进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群体，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许分离细胞以供阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群体(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0002556467540000561
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦(Totowa,NJ))。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或与基因工程化结合孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如与固体支持物(如珠)结合的抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，根据多种技术进行孵育，例如以下文献中所述的那些：授予Riddell等人的美国专利号6,040,1 77、Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂PBMC)(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群体之前将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，孵育可以还包括添加非分裂的EBV变换的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，低温保存)所述细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如，在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，使所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在某些方面可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所述方法包括在低温保存之前或之后将工程化细胞重新引入同一患者中。
重组受体
在一些实施方案中，所述细胞包含经由基因工程化引入的编码重组受体的一种或多种核酸以及此类核酸的基因工程化产物。在一些实施方案中，可以通过将编码重组受体的核酸分子引入细胞(例如经由病毒载体(如逆转录病毒或慢病毒载体)的转导)中来产生或生成细胞。在一些实施方案中，所述核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生出这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的，如在自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，所述靶细胞已被改变以与一种或多种靶抗原(如一种或多种肿瘤抗原)结合。在一些实施方案中，所述靶抗原选自ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFRvIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGEAl、HLA-A2NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。在一些实施方案中，靶细胞已被改变(例如通过TCR或CAR)以结合一种或多种以下肿瘤抗原。肿瘤抗原可以包括但不限于AD034、AKT1、BRAP、CAGE、CDX2、CLP、CT-7、CT8/HOM-TES-85、cTAGE-1、腓骨蛋白-1、HAGE、HCA587/MAGE-C2、hCAP-G、HCE661、HER2/neu、HLA-Cw、HOM-HD-21/半乳糖凝集素9、HOM-MEEL-40/SSX2、HOM-RCC-3.1.3/CAXII、HOXA7、HOXB6、Hu、HUB1、KM-HN-3、KM-KN-1、KOC1、KOC2、KOC3、KOC3、LAGE-1、MAGE-1、MAGE-4a、MPP11、MSLN、NNP-1、NY-BR-1、NY-BR-62、NY-BR-85、NY-CO-37、NY-CO-38、NY-ESO-1、NY-ESO-5、NY-LU-12、NY-REN-10、NY-REN-19/LKB/STK11、NY-REN-21、NY-REN-26/BCR、NY-REN-3/NY-CO-38、NY-REN-33/SNC6、NY-REN-43、NY-REN-65、NY-REN-9、NY-SAR-35、OGFr、PLU-1、Rab38、RBPJκ、RHAMM、SCP1、SCP-1、SSX3、SSX4、SSX5、TOP2A、TOP2B或酪氨酸酶。
抗原受体：
嵌合抗原受体(CAR)
所述细胞通常表达重组受体，如抗原受体(包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR))和其他抗原结合受体(如转基因T细胞受体(TCR))。受体还包括其他嵌合受体。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337，美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.20135(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是所述抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。
在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
由受体靶向的抗原包括但不限于：αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AI)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养细胞糖蛋白(TPBG，又称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)和病原体特异性抗原。
在一些实施方案中，受体所靶向的抗原包括孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2和MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))和/或生物素化分子和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，CAR对肿瘤相关抗原具有结合特异性，所述肿瘤相关抗原例如CD19、CD20、碳酸酐酶IX(CAIX)、CD171、CEA、ERBB2、GD2、α-叶酸受体、路易斯Y抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)。
在一些实施方案中，CAR结合病原体特异性抗原。在一些实施方案中，CAR对病毒抗原(如HIV、HCV、HBV等)、细菌抗原和/或寄生虫抗原具特异性。
嵌合受体包括嵌合抗原受体(CAR)。嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是所述抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。
在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的抗体部分进一步包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如铰链区(例如IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供在抗原结合后增加的细胞反应性。示例性间隔子(例如，铰链区)包括国际专利申请公开号WO 2014031687中所述的那些。在一些例子中，间隔子的长度为或为约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。
示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153或国际专利申请公开号WO 2014031687。
该抗原识别结构域通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)进行激活和/或经由另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一种或多种跨膜结构域和细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的那些(即，包含以下的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD 16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。
所述细胞内信号传导结构域包括通过天然抗原受体模拟或接近信号、通过这种受体与共刺激受体的组合模拟或接近信号、和/或仅通过共刺激受体模拟或接近信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分与一种或多种细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，所述受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情境中，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如条件是所述截短部分转导效应子功能信号。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然情境中与这种受体协同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情境中，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞质信号传导序列)以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3γ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括激活组分和共刺激组分二者。
在一些实施方案中，激活结构域包括在一个CAR中，而所述共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括激活或刺激CAR、共刺激CAR，它们均在相同细胞上表达(参见WO 2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，其中通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，CAR或其他抗原受体进一步包括标记，如细胞表面标记，其可以用于确认所述细胞被转导或工程化以表达所述受体，如细胞表面受体的截短形式，如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)(例如tEGFR)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸可操作地连接。参见WO 2014031687。在一些实施方案中，引入编码由T2A核糖体开关分隔开的CAR和EGFRt的构建体可以表达来自同一构建体的两种蛋白质，使得EGFRt可以用作检测表达这种构建体的细胞的标记。在一些实施方案中，标记和任选的接头序列可以是公开的申请号WO 2014/031687中公开的任何一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地与接头序列，如T2A可切割接头序列连接。
在一些实施方案中，标记是并未在T细胞上天然发现的或并未在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。
在一些实施方案中，分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被宿主的免疫系统识别为“自身”的分子，所述细胞将被过继转移至所述宿主中。
在一些实施方案中，标记不起任何治疗作用和/或不产生除了用作基因工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内将遇到的细胞的配体，如共刺激性或免疫检查点分子，以在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱所述细胞的应答。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的信号；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含41BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸胞质结构域或其功能变体或部分。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激性信号传导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112个AA的细胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括特异性结合抗原的抗体或片段、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子)、CD28跨膜结构域、CD28细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括特异性结合抗原的抗体或片段、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子)、CD28跨膜结构域、CD28细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，此类CAR构建体还包括例如CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体和其他多肽，例如接头或肽)可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可含有关于原生或天然序列的修饰，只要蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
T细胞受体
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体包括从天然存在的T细胞克隆的重组T细胞受体(TCR)和/或TCR。因此，在一些实施方案中，靶细胞已被改变为含有特异性T细胞受体(TCR)基因(例如TRAC和TRBC基因)。TCR或其抗原结合部分包括识别靶多肽(如肿瘤的抗原、病毒或自身免疫蛋白)的肽表位或T细胞表位的那些。在一些实施方案中，TCR对肿瘤相关抗原具有结合特异性，所述肿瘤相关抗原例如癌胚抗原(CEA)、GP100、由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART1)、黑色素瘤抗原A3(MAGEA3)、NYESO1或p53。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的分子或其抗原结合部分，并且所述分子或其抗原结合部分能够与结合至MHC分子的肽特异性地结合。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上总体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。通常，TCR是在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上或可以在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上表达，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
在一些实施方案中，TCR是完整TCR或其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合，如与MHC-肽复合物结合。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与该肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有高变环或CDR，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上在三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经处理的肽部分的相互作用最重要。在一些情境中，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境中，β链的CDR1可以与肽的C末端部分相互作用。在一些情境中，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，β链的可变区可以含有其他高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR含有可变α结构域(Vα)和/或可变β结构域(Vβ)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR的α-链和/或β-链还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health andDisease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些实施方案中，α链恒定结构域由TRAC基因(IMGT命名法)编码或是其变体。在一些实施方案中，β链恒定区由TRBC1或TRBC2基因(IMGT命名法)编码或是其变体。在一些实施方案中，恒定结构域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。
确定或鉴定TCR的各种结构域或区域在熟练技术人员的水平内。在一些方面，TCR的残基是已知的，或者可以根据国际免疫遗传学信息系统(IMGT)编号系统来鉴定(参见例如www.imgt.org；也参见Lefranc等人(2003)Developmental and ComparativeImmunology,2&；55-77；和The T Cell Factsbook第2版,Lefranc and LeFranc AcademicPress 2001)。使用此系统，TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR1序列对应于残基编号27-38(包含端值)之间存在的氨基酸，TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR2序列对应于残基编号56-65(包含端值)之间存在的氨基酸，并且TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR3序列对应于残基编号105-117(包含端值)之间存在的氨基酸。
在一些实施方案中，TCR可以是如通过一个或多个二硫键连接的两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体。在一些实施方案中，TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接该TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，恒定和可变结构域中的每一个含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。
在一些实施方案中，用于将细胞工程化的TCR是从一个或多个已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是容易获得的TCR。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，T细胞可以是经培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以从TCR序列的知识合成地产生。
在一些实施方案中，从患者鉴定、分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)JImmunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-354。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已修饰或工程化的TCR或其抗原结合部分。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法实现定向进化，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)ProcNatl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示方法涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生经诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在如所述的一些实施方案中，TCR可以含有引入的一个或多个二硫键。在一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸(例如在α链和β链的恒定结构域中)被另一种残基(如丝氨酸或丙氨酸)取代。在一些实施方案中，可以通过将α链和β链上(如在α链和β链的恒定结构域中)的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO2006/000830和WO 2006/037960中。在一些实施方案中，可以在α链的残基Thr48和β链的残基Ser57处、在α链的残基Thr45和β链的残基Ser77处、在α链的残基Tyr10和β链的残基Ser17处、在α链的残基Thr45和β链的残基Asp59处和/或在α链的残基Ser15和β链的残基Glu15处引入半胱氨酸。在一些实施方案中，重组TCR中非天然半胱氨酸残基的存在(例如产生一个或多个非天然二硫键)可以有利于在引入它的细胞中产生所需重组TCR，而不是表达含有天然TCR链的错配TCR对。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些方面中，TCR的每条链(例如α或β)可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和C末端处的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR(例如经由胞质尾)与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，键可以对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附接于恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附接于恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR，其是含有能够与MHC-肽复合物结合的α链和β链的单氨基酸链。通常，scTCR可以使用本领域技术人员已知的方法产生，参见例如国际公开的PCT号WO 1996/13593、WO 1996/18105、WO 1999/18129、WO 2004/033685、WO 2006/037960、WO 2011/044186；美国专利号7,569,664；以及Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(其由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成)和接头序列(其将第一区段的C末端与第二区段的N末端连接)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(其由对应于TCRα链可变区序列(该序列与对应于TCRα链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合)的氨基酸序列构成)和接头序列(其将第一区段的C末端与第二区段的N末端连接)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端与第二区段的N末端连接)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端与第二区段的N末端连接)。
在一些实施方案中，对于待结合MHC-肽复合物的scTCR，该α和β链必须配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。促进scTCR中α和β配对的各种方法在本领域是熟知的。在一些实施方案中，包括接头序列，其连接α和β链以形成单多肽链。在一些实施方案中，接头应该具有足够的长度以跨越该α链的C末端与该β链的N末端之间的距离，或反之亦然，同时还确保接头长度不那么长以使其阻断或减少该scTCR与该靶肽-MHC复合物的结合。
在一些实施方案中，scTCR的连接第一和第二TCR区段的接头可以是能够在保持TCR结合特异性的同时形成单条多肽链的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸，并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，接头具有足够的长度以跨越第一区段的C末端与第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长而阻断或减少scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从或从约10个至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26个至41个氨基酸残基，例如29个、30个、31个或32个氨基酸。在一些实施方案中，该接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-或-PGGG-(SGGGG)6-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸。在一些实施方案中，接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS)。
在一些实施方案中，scTCR在该单氨基酸链的残基之间含有二硫键，其在一些情况下可以促进该单链分子的α与β区之间配对的稳定性(参见例如美国专利号7,569,664)。在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将该单链分子的α链恒定结构域的免疫球蛋白区的残基与β链恒定结构域的免疫球蛋白区的残基连接。在一些实施方案中，二硫键对应于天然dTCR中存在的天然二硫键。在一些实施方案中，天然TCR中不存在二硫键。在一些实施方案中，该二硫键是引入的非天然二硫键，例如通过将一个或多个半胱氨酸掺入该scTCR多肽的第一和第二链区的恒定区细胞外序列中。示例性半胱氨酸突变包括如上所述的任何突变。在一些情况下，可以存在天然和非天然二硫键。
在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C-末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如国际公开PCT号WO1999/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有通过肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如国际公开PCT号WO 1999/18129)。
在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，TCR在细胞表面上表达。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是Cα或Cβ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以来自非TCR来源，例如来自CD3z、CD28或B7.1的跨膜区。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR含有CD3z信号传导结构域。在一些实施方案中，TCR能够形成与CD3的TCR复合物。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现出亲和力，所述平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，该α和β链可以从总cDNA(其分离自表达该目标TCR的T细胞克隆)进行PCR扩增并克隆到表达载体中。在一些实施方案中，α和β链可以合成地产生。
在一些实施方案中，将TCRα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，转录单元可以被工程化以含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的信息来共表达基因产物(例如编码α和β链)。可替代地，在一些情况下，单个启动子可以指导RNA的表达，其在单个开放阅读框(ORF)中含有通过编码自切割肽(例如，T2A)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶)的序列彼此分开的多个基因(例如，编码α和β链))。因此，该ORF编码单个多聚蛋白，其在翻译期间(在T2A的情况下)或翻译后被切割成单个蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开。2A切割肽的例子(包括可以诱导核糖体跳跃的那些)是T2A、P2A、E2A和F2A。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
在一些实施方案中，TCRα和β基因通过小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，TCR的遗传转移是通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子完成(参见例如Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal of theAmerican Society of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人(2010)MolecularTherapy:The Journal of the American Society of Gene Therapy.18:1748-1757；和Hackett等人(2010)Molecular Therapy:The Journal of the American Society ofGene Therapy.18:674-683。
工程化的载体和方法
提供的方法包括表达重组受体(包括CAR或TCR)，以用于产生表达此类结合分子的基因工程化细胞。基因工程化通常涉及将编码重组或工程化组分的核酸引入细胞中，如通过逆转录病毒转导、转染或转化。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
用于引入基因工程化的组分(例如，抗原受体，例如CAR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
在一些实施方案中，可以将编码重组受体的核酸克隆到合适的一个或多个表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，重组表达载体可以使用标准的重组DNA技术来制备。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具有特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有与编码重组受体的核苷酸序列可操作地连接的非天然启动子。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还考虑了熟练技术人员已知的其他启动子。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是本领域已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505中。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014/055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些情境中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对受试者有毒性。因此，在一些情境中，所述工程化细胞包括导致细胞在体内(如在过继免疫疗法中给予时)对阴性选择易感的基因区段。例如，在一些方面，将所述细胞工程化，使得它们可以由于给予它们的患者的体内状况的改变而被消除。所述阴性选择性表型可以由赋予对所给予的药剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入而产生。阴性选择性基因包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell II:223,1977)，其赋予更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些方面，细胞被进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改进治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用于提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改进安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择敏感，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，所述文献描述了使用通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而衍生的双功能选择性融合基因。参见例如Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
组合物和配制品
还提供了此类细胞的群体、含有此类细胞和/或富含此类细胞的组合物，例如在所述组合物中表达重组受体的细胞构成组合物中总细胞的或某种类型的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。组合物包括用于给予(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。还提供了用于向受试者(例如，患者)给予所述细胞和组合物的治疗方法。
还提供了用于给予的包含细胞的组合物，包括药物组合物和配制品，如包括用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量的单位剂型组合物。药物组合物和配制品通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含至少一种另外的治疗剂。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其所采取的形式允许其中所含活性成分的生物活性有效，并且其不含对待给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的任何另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲液或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。所需剂量可以通过细胞的单次推注给予、通过细胞的多次推注给予或通过细胞的连续输注给予来递送。
可以使用标准给予技术、配制品和/或装置来给予所述细胞和组合物。细胞的给予可以是自体的或异源的。例如，免疫反应性细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并给予同一受试者或不同但相容的受试者。外周血源免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射给予，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给予。在给予治疗组合物(例如，含有基因修饰的免疫反应性细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，肠胃外给予细胞群体。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送将细胞给予受试者。
在一些实施方案中，组合物被提供为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物)，其在一些方面可以被缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保对微生物作用的防止。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
用于体内给予的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
过继细胞疗法的给予方法和用途
提供了给予本文所述的细胞、群体和组合物的方法，以及本文所述的此类细胞、群体和组合物治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症)的用途。在一些实施方案中，将细胞、群体和组合物给予至受试者或患者，所述受试者或患者患有要例如通过过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)治疗的特定疾病或病症。在一些实施方案中，将通过所提供的方法制备的细胞和组合物(如孵育和/或其他处理步骤后的工程化组合物和生产结束组合物)给予至受试者，如患有疾病或病症或具有患上疾病或病症的风险的受试者。在一些方面，方法由此治疗所述疾病或病症(例如，改善其一种或多种症状)，例如通过减轻表达由工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷来治疗。
用于过继细胞疗法的细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，向其给予细胞、细胞群体或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗”(“treatment”)(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结果或表型的完全或部分改善或减轻。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改进预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一种或多种影响。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员清楚的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发生。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数以外的原本相同的条件相比时，或者与另一种条件相比时，降低功能或活性。例如，与不存在细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在给予的情境中，药剂(例如，药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需治疗结果(如针对疾病、病症或障碍的治疗)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重、和所给予的细胞群体。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)给予细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者中使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的情境中，在一些方面，预防有效量将高于治疗有效量。
在一些实施方案中，受试者例如在用另一种治疗性干预(包括化学疗法、辐射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT)进行治疗之后患有持续或复发的疾病。在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生抗性，但所述给予有效治疗所述受试者。
用于过继细胞疗法的细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)是通过自体转移来进行，其中所述细胞是从要接受所述细胞疗法的受试者或者从衍生自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将所述细胞给予同一受试者。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者与所述第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
在一些实施方案中，在给予细胞或含有细胞的组合物之前，受试者已经用靶向疾病或病症(例如肿瘤)的治疗剂进行治疗。在一些方面，受试者对于其他治疗剂是难以治疗的或无反应的。在一些实施方案中，受试者例如在用另一种治疗性干预(包括化学疗法、辐射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT)进行治疗之后患有持续或复发的疾病。在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生抗性，但所述给予有效治疗所述受试者。
在一些实施方案中，受试者对另一种治疗剂有反应，并且用治疗剂进行治疗减少了疾病负荷。在一些方面，受试者最初对治疗剂有反应，但是随着时间的变化展现出疾病或病症的复发。在一些实施方案中，受试者尚未复发。在一些此类实施方案中，确定受试者具有复发风险，如高复发风险，并且因此预防性地给予细胞，例如以降低复发的可能性或防止复发。
在一些方面，受试者尚未接受用另一种治疗剂的先前治疗。
用于采用提供的组合物、细胞、方法和用途治疗的疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤；以及感染性疾病，如受病毒或其他病原体(例如，HIV、HCV、HBV、CMV)的感染；以及寄生性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、赘生物或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病，淋巴瘤，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤，结肠癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，皮肤癌，黑色素瘤，骨癌和脑癌，卵巢癌，上皮癌，肾细胞癌，胰腺腺癌，霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，结直肠癌，胶质母细胞瘤，神经母细胞瘤，尤因肉瘤，髓母细胞瘤，骨肉瘤，滑膜肉瘤和/或间皮瘤。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与疾病、障碍或病症相关的抗原选自ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原。
在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原选自孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGE A3和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV表达的分子或其他病原体。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量给予，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数目的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单独群体或亚型的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量基于所需的单独群体中的细胞或单独细胞类型的总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，所述剂量基于此类特征的组合，此类特征是例如所需的总细胞数、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如所需剂量的T细胞)的容忍差异或在所述容忍差异之内给予细胞的群体或亚型如CD8+和CD4+T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被给予所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小细胞数量。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+的比率)存在，例如在这种比率的一定容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量的一种或多种单独细胞群体或亚型(如所需剂量的CD4+细胞和/或所需剂量的CD8+细胞)的容忍差异或在所述容忍差异之内给予。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或所需的被给予所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于群体或亚型的最小细胞数量或每单位体重的所述群体或亚型的最小细胞数量。
因此，在一些实施方案中，所述剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比率，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如，各自)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，所述剂量基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+细胞的比率，和/或基于所需的CD4+和/或CD8+细胞的固定或最小剂量。
在某些实施方案中，将细胞、或单独的细胞亚型群体以约100万至约1000亿个细胞的范围给予至受试者，例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞或在这些范围之间的任何值)。
在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或单独细胞亚群的剂量在或约104与在或约109个细胞/公斤(kg)体重之间的范围内，如在105与106个细胞/kg体重之间，例如，在或约1x105个细胞/kg体重、1.5x 105个细胞/kg体重、2x105个细胞/kg体重、或1x 106个细胞/kg体重。例如，在一些实施方案中，将细胞以在或约104与在或约109个T细胞/公斤(kg)体重之间，如在约105与106个T细胞/kg体重之间，例如，在或约1x 105个T细胞/kg体重、1.5x 105个T细胞/kg体重、2x 105个T细胞/kg体重、或1x 106个T细胞/kg体重，或在其一定误差范围内给予。
在一些实施方案中，将细胞以在或在约104与或与约109个CD4+和/或CD8+细胞/公斤(kg)体重之间，如在105与106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重之间，例如为或为约1x 105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、1.5x 105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、2x 105个CD4+和/或CD8+细胞/kg或1x 106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重，或在其一定误差范围内给予。
在一些实施方案中，将细胞以大于和/或至少约1x 106、约2.5x 106、约5x 106、约7.5x 106、或约9x 106个CD4+细胞，和/或至少约1x 106、约2.5x 106、约5x 106、约7.5x 106、或约9x 106个CD8+细胞，和/或至少约1x 106、约2.5x 106、约5x 106、约7.5x 106、或约9x106个T细胞，或在其一定误差范围内给予。在一些实施方案中，将细胞以在约108与1012个T细胞之间或在约1010与1011个T细胞之间、在约108与1012个CD4+细胞之间或在约1010与1011个CD4+细胞之间、和/或在约108与1012个CD8+细胞之间或在约1010与1011个CD8+细胞之间，或在其一定误差范围内给予。
在一些实施方案中，所述细胞是以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率来给予，或在所述所需输出比率的容忍范围内给予。在一些方面，所需比率可以是特定比率或者可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在等于或约1:5与等于或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在等于或约1:3与等于或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在等于或约2:1与等于或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。
为了预防或治疗疾病，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、细胞是否针对预防或治疗目的而被给予、先前的治疗、受试者的临床病史和对细胞的应答以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物和细胞以合适的方式一次或经一系列治疗给予受试者。
所述细胞可以通过任何合适的方式给予，例如通过推注输注，通过注射(例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注给予来给予。在一些实施方案中，给定剂量是例如在不超过3天的时间段内通过所述细胞的多次推注给予来给予，或通过所述细胞的连续输注给予来给予。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或其他药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依序给予。细胞在一些实施方案中是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依序共给予。在一些情境中，细胞是与另一种疗法共给予，其时间足够接近，使得细胞群体增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)例如以增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括给予化学治疗剂。
在给予细胞后，工程化细胞群体的生物学活性在一些实施方案中是例如通过许多已知方法中的任一种来测量。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，细胞的生物学活性是通过测定一种或多种细胞因子(如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物学活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量。
在某些实施方案中，将工程化细胞以许多方式进一步修饰，使得增加其治疗或预防功效。例如，可以将群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践在本领域是已知的。参见例如Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:111(1995)和美国专利5,087,616。
实施例
以下实施例仅是说明性的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1-gRNA的初步筛选。
通过将商业合成的gRNA与Cas9在体外复合并经由电穿孔将gRNA/Cas9核糖核蛋白(RNP)递送至细胞来筛选指导RNA。
图1描绘了测试gRNA的插入缺失频率％。图2描绘了某些示例性gRNA对的基因组编辑效率。
实施例2-在T细胞中针对TGFBR2的gRNA候选物的分析。
CRISPR-Cas9编辑细胞的目的是使用最低的可能浓度的gRNA/Cas9复合物和最少数目的脱靶切割事件来实现最高的靶基因敲除百分比。为了确定用于TGFBR2基因编辑的最佳可能的gRNA候选物，测试了七种潜在的gRNA。用不同浓度的gRNA/Cas9 RNP转染T细胞。然后使用Illumina miSeq分析来确定插入缺失频率百分比。结果显示，不同gRNA的插入缺失频率百分比范围为20％至80％，并且所有gRNA在2μM的RNP浓度下均达到其最高的插入缺失频率％(图3)。随后将2μM RNP浓度用于所有实验。
根据miSeq分析选择的gRNA被选择用于在BCMACAR T细胞中的进一步分析。将SEQID NO:5050、5052、5093和5043的gRNA用于RNP重剪切测定中，以确定TGFBR2基因的编辑％。也使用SEQ ID NO:5043/5093的组合测试双重gRNA方法。尽管SEQ ID NO:5043和5093的单独gRNA仅实现20％-40％编辑，但是发现组合更为有效，产生了约80％的编辑值％(图4A)。
使用选择的gRNA进行高通量测序分析以确定插入缺失频率％。测试了SEQ ID NO:a和b的gRNA以及c/d的双重gRNA组合。值得注意的是，从选择的gRNA实现高达95％的插入缺失频率％(图4B)。
尽管插入缺失频率％是gRNA有效性的有用量度，但产生的插入缺失的某个部分可能是框内插入或缺失。此类框内插入缺失可以产生修饰的基因，其蛋白质产物保留某种活性。当试图产生基因敲除时，优选框外插入缺失。为了确保测试的gRNA实际上产生所需的框外插入缺失，分析了测序结果中产生的特定类型的插入缺失。结果显示，虽然SEQ ID NO:5052产生了最高的插入缺失频率％，但SEQ ID NO:5050生成了较高的框外插入缺失频率％(图5)。
实施例3-原代和工程化T细胞中基因编辑的体外功效。
分析了在修饰为表达靶向BCMA的CAR的原代T细胞中TGFβ的抑制作用。另外对抗BCMACAR T细胞进行了修饰，以经由CRISPR-Cas9系统使用选择的gRNA对TGFBR2基因进行编辑。将用于基因编辑的AAVS1对照和具有未编辑的TGFBR2基因的表达抗BCMA CAR的T细胞用作对照。将细胞系与RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞系在有或没有10ng/ml TGFβ的情况下共培养。在存在过量TGFβ的情况下，原代T细胞和抗BCMACAR T细胞展示出所期望的抑制作用，即减少的干扰素-γ(IFNγ)产生。然而，在基因编辑的抗BCMA CAR T细胞中，TGFβ的抑制作用被挽救，从而将IFNγ的产生恢复到不添加TGFβ时所发现的水平(图6)。
抑制T细胞增殖是TGFβ信号传导所造成的影响之一(Tiemessen等人Int.Immunol.15:1495-1504.2003)。为了解决TGFβ信号传导对细胞增殖的影响，在使用若干种gRNA的TGFBR2基因编辑的背景下监测抗BCMA CAR T细胞增殖。在编辑TGFBR2基因的情况下，抗BCMA CAR T细胞能够在存在过量TGFβ的情况下增殖(图7)。
T细胞活性受各种刺激性和抑制性受体的表达影响。评估TGFBR2基因编辑的抗BCMA CAR T细胞中的CD25表达。当暴露于TGFβ时，与对照细胞相比，TGFBR2基因编辑导致更高的CD25表达水平(图8A)。还在有和没有过量TGFβ的情况下通过测量PD-1+细胞％来评估抑制性受体PD-1的表达。TGFBR2基因编辑的抗BCMA CAR T细胞显示出相对于对照细胞较低的PD-1增加。出乎意料的是，即使没有添加TGFβ，基因编辑的细胞也导致更少的PD-1+细胞(图8B)。
TGFβ信号传导途径的激活导致Smad 2/3复合物的磷酸化，这转而调节TGFβ信号传导的许多下游过程。由于这一原因，磷酸化的Smad 2/3通常被用作细胞中TGFβ信号传导的量度。在有或没有TGFBR2基因编辑的情况下，在转导以表达不同CAR的T细胞中均检测到磷酸化Smad2/3。将有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下表达CAR的T细胞(包括AAVS1基因编辑对照)用作对照。尽管过量的TGFβ导致未编辑的细胞中Smad 2/3磷酸化的预期增加，但在添加和不添加TGFβ的情况下，TGFBR2基因编辑的细胞维持相同水平的Smad 2/3磷酸化(图9)。结果表明，TGFBR2 CRISPR基因编辑方法有效地使TGFβ信号传导途径沉默。
为了进一步分析TGFBR2基因编辑在不同CAR T细胞背景下的作用，检测了在有和没有TGFβ的情况下的GzmB水平。将有(10ng/ml)或没有TGFβ的情况下表达CAR的T细胞(包括AAVS1基因编辑对照)用作对照。GzmB细胞内染色的结果揭示，在存在TGFβ的情况下TGFBR2基因编辑维持GzmB表达(图10)。
使用细胞因子检测测定在如图10所示的类似实验中分析了IFNγ的产生。与先前的GzmB表达结果一致，在过量TGFβ的条件下，在TGFBR2基因编辑的背景下相对于对照维持甚至增加了IFNγ的产生(图11)。
使用来自ThermoFisher的Edu Click-It测定，在如图10和图11所述的类似实验中分析了细胞增殖。在过量TGFβ的条件下，在TGFBR2基因编辑的背景下相对于对照维持了细胞增殖(图12)。
实施例3的总体结果表明了使用CRISPR-Cas9基因编辑系统编辑TGFBR2基因的优点。使用单一和双重gRNA方法，可以在CAR T细胞背景下有效地抑制TGFβ信号传导途径。
实施例4-TGFBR2显性阴性方法与CRISPR-Cas9基因编辑方法的比较。
废除TGFβ信号传导的替代方法是表达TGFBR2的显性阴性形式(DN)。此形式的TGFBR2与野生型TGFBR2竞争结合TGFβ，从而使有效的信号传导反应最小化。
分析了在转导以表达抗BCMA CAR的原代T细胞中TGFβ的抑制作用。另外对表达抗BCMA CAR的T细胞进行了修饰以表达DN或经由CRISPR-Cas9系统编辑TGFBR2基因。用SEQ IDNO:5043和5093的双重gRNA编辑CRISPR-Cas9编辑的细胞。将用于基因编辑的AAVS1对照、具有未编辑的TGFBR2基因的表达抗BCMA CAR的T细胞、和表达抗BCMA CAR的T细胞(包括AAVS1基因编辑对照)用作对照。将细胞系与RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞系在有或没有10ng/mlTGFβ的情况下共培养。在存在过量TGFβ的情况下，原代T细胞和抗BCMA CAR T细胞展示出所期望的抑制作用，即减少的GzmB(图13A)和IFNγ(图13B)产生。然而，在DN或CRISPR编辑的抗BCMA CAR T细胞中，TGFβ的抑制作用被挽救，从而将GzmB和IFNγ的产生恢复到不添加TGFβ时所发现的水平。
为了进一步证明挽救TGFβ信号传导的抑制作用的效用，分析了在DN或CRISPR编辑背景下抗BCMA CAR T细胞的杀伤活性。具有未编辑的TGFBR2基因的表达抗BCMA CAR的T细胞用作对照。将抗BCMA CAR T细胞与RPMI8226细胞以1个抗BCMA CAR T细胞与4个RPMI细胞的比率在有或没有10ng/ml TGFβ的情况下共培养。在存在TGFβ的情况下，在DN和CRISPR编辑背景下均维持了抗BCMA CAR T细胞的裂解活性。出乎意料的是，CRISPR编辑的抗BCMACAR T细胞展示出与DN细胞相比优越的裂解活性(图14)。即使没有添加过量的TGFβ，CRISPR编辑的抗BCMA CAR T细胞的裂解活性也高于对照细胞。
对T细胞(包括CAR T细胞)的重复抗原刺激导致T细胞持久性降低，并且可引起激活诱导的细胞死亡(AICD)(Gargett等人Mol.Ther.24:1135-1149.2016)。维持针对特定抗原的T细胞活性的策略对于提高基于T细胞的疗法的功效非常重要。分析了在存在用TGFβ重复刺激的情况下在DN或CRISPR编辑背景下抗BCMA CAR T细胞的增殖能力。具有未编辑的TGFBR2基因的表达抗BCMA CAR的T细胞用作对照。尽管未修饰的抗BCMA CAR T细胞在TGFβ刺激的数天内未增殖，但TGBR2 DN或CRISPR编辑的细胞在存在TGFβ的情况下随时间继续增殖(图15A至图15C)。在用TGFβ重复刺激期间，抗BCMA CAR T细胞的百分比也没有减少(图15D至图15F)。
使用单一而不是双重gRNA方法在DN和基因编辑背景下再次分析了IFNγ的产生。使用另外的多发性骨髓瘤细胞系OPM2与先前使用的如图13所示的RPMI 8226细胞系进行比较。与先前的结果一致，在存在过量的TGFβ的情况下，抑制TGFβ信号传导有效地维持IFNγ的产生。这在RPMI(图16A)和OPM2(图16B)细胞系二者中均成立。
还使用单一gRNA方法在DN和基因编辑背景下分析了CD25的表达。在RPMI(图17A)和OPM2(图17B)细胞系中在存在过量TGFβ的情况下维持了CD25表达。出乎意料的是，相对于未修饰的T细胞，在DN和基因编辑的细胞中的CD25表达增加。
在DN和基因编辑背景中类似地检测PD-1表达。在存在过量TGFβ的情况下，用任一种方法抑制TGFβ信号传导均有效地阻止了PD-1表达的增加(图18A和图18B)。
先前的实验使用设定剂量为10ng/ml的TGFβ进行刺激。为了更好地了解TGFBR2基因编辑如何在生理条件下影响TGFβ信号传导，使用0到100ng/ml的TGFβ。这个范围是基于先前的工作，所述先前的工作表明TGFβ血清水平的范围为约3至88ng/ml(Aref等人Hematological Oncology.35:51-57.2017)并且在多发性骨髓瘤骨髓中为约3至10ng/ml(Bruns等人Blood.120:2620-2630.2012)。细胞增殖测定用于确定在DN和基因编辑背景下细胞的相对扩增倍数。将抗BCMA CAR T细胞与RPMI 8226细胞以1:1的比率共培养。意外地，在低至0.1ng/ml TGFβ的浓度下可以看到对细胞增殖的积极影响，所述浓度远低于正常或癌症环境中的生理水平(图19A)。通过增加的IFNγ产生进一步证明了这种响应性(图19B)。
使用相同范围的TGFβ浓度分析CD4+和CD8+CAR T细胞上的PD-1表达。再次，TGFBR2DN和基因编辑背景能够维持低至0.1ng/ml TGFβ下的低PD-1表达水平(图20A和图20B)。
DN TGFBR2策略用于在转导以表达三种不同CAR的T细胞中达到细胞增殖、颗粒酶B表达和Smad 2/3磷酸化。DN TGFBR2能够挽救过量TGFβ在测试的CAR T细胞背景下的抗增殖作用。在测试的CAR T细胞背景下，DN能够在存在过量TGFβ的情况下维持颗粒酶B的表达。最终，DN在存在过量TGFβ的情况下能够有效抑制TGFβ信号传导，如通过在测试的CAR T细胞背景下减少的Smad 2/3磷酸化所测量的(图22)。仅显示了三种CAR T细胞背景之一的数据，然而对于其他两种CAR T细胞背景也观察到了相似的结果。
实施例5-体内BCMA CAR T细胞的转录谱分析。
为了使本文公开的TGFBR2基因编辑策略形成有效的疗法，TGFβ免疫抑制途径必须存在于体内环境中。如果存在所述TGFβ免疫抑制途径，则TGFBR2基因编辑策略必须有效地从TGFβ免疫抑制作用释放T细胞。为了解决这两个问题，根据从小鼠的肿瘤微环境分离的抗BCMA CAR T细胞进行了抗BCMA CAR T细胞的转录谱分析。异种移植模型是通过向小鼠植入多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞，并使其繁殖/形成肿瘤持续21天而生成的。孵育21天的时间后，将野生型的抗BCMA CAR T细胞、AAVS基因编辑对照、TGFBR2DN或TGFBR2基因编辑背景注入荷瘤小鼠中。允许肿瘤消退14天，然后从肿瘤和脾脏(非癌性阴性对照组织)分离出肿瘤浸润性白细胞(TIL)和CAR T细胞。分离后，对细胞进行RNAseq分析，以确定TGFβ信号传导途径成员的基因表达谱。
转录谱分析的结果揭示，CAR T细胞中的TGFBR2基因编辑成功地限制了发生TGFβ抑制性信号传导的肿瘤中的若干个TGFβ信号传导途径成员的表达(图21)。如图21所示，在从肿瘤而非脾脏分离出的表达抗BCMA CAR的T细胞中TGFβ信号传导途径成员被上调。数据指示表达抗BCMA CAR的T细胞暴露于富含TGFβ的肿瘤微环境(TME)中。此外，具有TGFBR2 DN或TGFBR2基因编辑背景的表达抗BCMA CAR的T细胞逆转了TGFβ信号传导成员的上调。数据指示，TGFβ信号传导途径被有效地消除。
实施例6-TGFBR2基因编辑策略的选择性优势。
为了确定TGFBR2基因编辑的CAR T细胞是否具有选择性增殖优势，对抗BCMA CART细胞进行基因编辑以产生不同的插入缺失频率％。在有或没有10ng/ml TGFβ的情况下，以1:1的比率将这些单独的插入缺失％的CAR T细胞群体与RPMI 8226细胞共培养以进行刺激。使用高通量测序大约每7天对细胞进行一次评价，以确定哪些部分的细胞是基因编辑的以及哪些部分仍是野生型的(图23)。将细胞每周用新鲜的RPMI细胞重新刺激并且重新调整至1:1的比率。结果显示，在免疫刺激环境中，TGFBR2基因编辑赋予优于野生型细胞的选择性增殖优势(参见图24)。
通过引用并入
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体特此并入，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指出通过引用并入一样。在矛盾的情况下，将以包括本文的任何定义在内的本申请为准。
等同物
本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的具体实施方案的许多等同方案。此类等同物旨在被以下权利要求涵盖。

Claims (119)

1.一种基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含：
gRNA，其包含与转化生长因子β受体II(TGFBR2)基因的靶序列互补的靶向结构域；和
RNA指导的核酸酶。
2.根据权利要求1所述的基因组编辑系统，其中所述TGFBR2基因的靶序列包含选自SEQID NO:1、2和3的序列。
3.根据权利要求1所述的基因组编辑系统，其中所述TGFBR2基因的靶序列包含选自SEQID NO:4至10的序列。
4.根据权利要求1所述的基因组编辑系统，其中所述靶向结构域与所述TGFBR2基因的靶序列具有至少85％互补性。
5.根据权利要求1所述的基因组编辑系统，其中所述靶向结构域被配置为形成TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内的双链断裂或单链断裂，从而改变所述TGFBR2基因。
6.根据权利要求5所述的基因组编辑系统，其中所述TGFBR2基因表达被敲除或敲低。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基因组编辑系统，其中所述gRNA靶向所述TGFBR2基因的编码区或非编码区，其中所述非编码区包含所述TGFBR2基因的启动子区域、增强子区域、内含子、3'UTR、5'UTR或聚腺苷酸化信号区域。
8.根据权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述编码区选自外显子3、外显子4和外显子5。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的基因组编辑系统，其中所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的基因组编辑系统，其中：
所述RNA指导的核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶，并且
所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO:5041；
(b)SEQ ID NO:5042；
(c)SEQ ID NO:5047；
(d)SEQ ID NO:5050；
(e)SEQ ID NO:5052；
(f)SEQ ID NO:5092；和
(g)SEQ ID NO:5093。
11.根据权利要求10所述的基因组编辑系统，其中：所述酿脓链球菌Cas9核酸酶识别NGG的原型间隔子邻近基序(PAM)；
所述基因组编辑系统靶向TGFBR2；
并且所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5041-5042、5047、5050、5052和5092-5093的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的基因组编辑系统，其中所述RNA指导的核酸酶是金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶。
13.根据权利要求12所述的基因组编辑系统，其中所述金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶识别NNNRRT或NNNRRV的PAM，并且所述基因组编辑系统靶向TGFBR2。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的基因组编辑系统，其中所述RNA指导的核酸酶是突变型Cas9核酸酶。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的基因组编辑系统，其中所述gRNA是模块gRNA或嵌合gRNA。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的基因组编辑系统，其中所述靶向结构域的长度为约16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸。
17.根据权利要求16所述的基因组编辑系统，其中所述靶向结构域包含与所述TGFBR2基因互补的至少约18个连续核苷酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的基因组编辑系统，其包含二、三或四种gRNA。
19.根据权利要求9所述的基因组编辑系统，其包含：
至少一种酿脓链球菌Cas9核酸酶；和含有SEQ ID NO:5042和5041的组合、或5042和5092的组合、或SEQ ID NO:5042和5093的组合、或SEQ ID NO:5093和5041的组合的gRNA。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的基因组编辑系统，其用于改变细胞中的所述TGFBR2基因。
21.根据权利要求20所述的基因组编辑系统，其中所述细胞来自患有癌症的受试者。
22.根据权利要求1所述的基因组编辑系统，其中TGFBR2的表达相对于基线测量值降低了30％或更多。
23.根据权利要求22所述的基因组编辑系统，其中通过蛋白质印迹或间接细胞内染色流式细胞术确定TGFBR2蛋白的表达。
24.根据权利要求1所述的基因组编辑系统，其中移码突变被引入所述TGFBR2基因中。
25.一种包含gRNA的组合物，所述gRNA包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述TGRBR2基因的靶序列包含选自SEQ IDNO:1、2和3的序列。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述TGRBR2基因的靶序列包含选自SEQ IDNO:4至10的序列。
28.根据权利要求25所述的组合物，其中所述靶向结构域与所述TGRBR2基因的靶序列具有至少85％互补性。
29.根据权利要求25所述的组合物，其中所述靶向结构域的长度为约16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述靶向结构域包含与所述TGFBR2基因互补的至少约18个连续核苷酸。
31.根据权利要求25所述的组合物，其中所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
32.根据权利要求25或31所述的组合物，其包含一、二、三或四种gRNA。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的组合物，其进一步包含Cas9核酸酶。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述Cas9核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶或金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶。
35.根据权利要求33所述的组合物，其进一步包含野生型Cas9核酸酶和突变型Cas9核酸酶中的一种或两种。
36.根据权利要求33所述的组合物，其中所述Cas9分子是酿脓链球菌Cas9分子，并且所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO:5041；
(b)SEQ ID NO:5042；
(c)SEQ ID NO:5047；
(d)SEQ ID NO:5050；
(e)SEQ ID NO:5052；
(f)SEQ ID NO:5092；和
(g)SEQ ID NO:5093。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述酿脓链球菌Cas9核酸酶识别NGG的原型间隔子邻近基序(PAM)，所述组合物靶向TGFBR2，并且所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5041-5042、5047、5050、5052、5092和5093的核苷酸序列相同或相差不超过3个核苷酸的核苷酸序列。
38.根据权利要求34所述的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶识别NNNRRT或NNNRRV的PAM，并且所述组合物靶向TGFBR2。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的组合物，其包含：
至少一种酿脓链球菌Cas9核酸酶；和含有SEQ ID NO:5042和5041的组合、或5042和5092的组合、或SEQ ID NO:5042和5093的组合、或SEQ ID NO:5093和5041的组合的gRNA。
40.根据权利要求25-39中任一项所述的组合物，其用于降低或消除细胞中的所述TGFBR2基因表达。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述细胞来自患有癌症的受试者。
42.一种包含编码gRNA的多核苷酸的载体，所述gRNA包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。
43.根据权利要求42所述的载体，其中所述靶向结构域包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
44.根据权利要求42或43所述的载体，其进一步包含编码Cas9核酸酶的多核苷酸。
45.根据权利要求44所述的载体，其中所述Cas9核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶或金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶。
46.根据权利要求44或45所述的载体，其中所述Cas9核酸酶进一步包含野生型Cas9核酸酶和突变型Cas9核酸酶中的一种或两种。
47.根据权利要求44所述的载体，其中所述Cas9核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶，并且所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO:5041；
(b)SEQ ID NO:5042；
(c)SEQ ID NO:5047；
(d)SEQ ID NO:5050；
(e)SEQ ID NO:5052；
(f)SEQ ID NO:5092；和
(g)SEQ ID NO:5093。
48.根据权利要求47所述的载体，其中所述酿脓链球菌Cas9核酸酶识别NGG的原型间隔子邻近基序(PAM)，所述载体编码靶向TGFBR2的gRNA，并且所述靶向结构域包含与选自SEQID NO:5041-5042、5047、5050、5052和5092-5093的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
49.根据权利要求45所述的载体，其中所述金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶识别NNNRRT或NNNRRV的PAM，并且所述载体编码靶向TGFBR2的gRNA。
50.根据权利要求42-49中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
51.根据权利要求50所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
52.根据权利要求42-51中任一项所述的载体，其用于降低或消除细胞中的所述TGFBR2基因表达。
53.根据权利要求52所述的载体，其中所述细胞来自患有癌症的受试者。
54.一种改变细胞中的TGFBR2基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞给予以下中的一种：
(i)包含gRNA和RNA指导的核酸酶的基因组编辑系统，所述gRNA包含与所述TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域；或
(ii)包含编码gRNA的多核苷酸和编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸的载体，所述gRNA包含与所述TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述改变包括敲除所述TGFBR2基因表达或敲低所述TGFBR2基因表达。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述细胞来自患有癌症的受试者。
57.根据权利要求54所述的方法，其中所述gRNA和所述RNA指导的核酸酶包含核糖核蛋白(RNP)复合物。
58.根据权利要求57所述的方法，其包括向所述细胞给予包含具有不同靶向结构域的gRNA的两种或更多种RNP复合物。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述RNP复合物包含酶促活性Cas9(eaCas9)核酸酶。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述RNP复合物包含eaCas9核酸酶，所述eaCas9核酸酶在靶核酸中形成双链断裂或在靶核酸中形成单链断裂。
61.根据权利要求58所述的方法，其中使用包含不同gRNA的两种RNP复合物在所述细胞中的TGFBR2基因中形成偏移的单链断裂。
62.一种细胞，其包含根据权利要求1-24中任一项所述的基因组编辑系统、根据权利要求24-41中任一项所述的组合物或根据权利要求42-53中任一项所述的载体。
63.根据权利要求62所述的细胞，其中所述细胞表达TGFBR2。
64.根据权利要求62或63所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
65.根据权利要求64所述的细胞，其进一步包含工程化T细胞受体(eTCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
66.一种根据权利要求54-61中任一项改变的细胞。
67.一种RNA指导的核酸酶介导的改变细胞中TGFBR2基因表达的方法，所述方法包括：
a)使所述细胞与足量的靶向TGFBR2的gRNA和RNA指导的核酸酶接触；和
(b)在所述细胞的TGFBR2基因中的TGFBR2靶位置附近形成第一DNA双链断裂，其中所述第一DNA双链断裂通过NHEJ修复，其中所述修复改变了所述TGFBR2基因的表达。
68.根据权利要求68所述的方法，其进一步包括在所述TGFBR2靶位置附近形成第二DNA双链断裂。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述第一双链断裂是在所述TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内形成。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述第一和第二双链断裂是在所述TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内形成。
71.根据权利要求67所述的方法，其中所述第一双链断裂是在所述TGFBR2基因的编码区或非编码区中形成，其中所述非编码区包含所述TGFBR2基因的启动子区域、增强子区域、内含子、3'UTR、5'UTR或聚腺苷酸化信号区域。
72.根据权利要求68所述的方法，其中所述第一和第二双链断裂是在所述TGFBR2基因的编码区或非编码区中形成，其中所述非编码区包含所述TGFBR2基因的启动子区域、增强子区域、内含子、3'UTR、5'UTR或聚腺苷酸化信号区域。
73.根据权利要求67-72中任一项所述的方法，其中所述编码区选自外显子3、外显子4和外显子5。
74.根据权利要求67-73中任一项所述的方法，其中所述靶向结构域包含与选自SEQ IDNO:5036至5096的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
75.根据权利要求67-74中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶，并且所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO:5041；
(b)SEQ ID NO:5042；
(c)SEQ ID NO:5047；
(d)SEQ ID NO:5050；
(e)SEQ ID NO:5052；
(f)SEQ ID NO:5092；和
(g)SEQ ID NO:5093。
76.根据权利要求67-74中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶是金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶。
77.根据权利要求75或76所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶是突变型Cas9核酸酶。
78.根据权利要求67所述的方法，其中所述NHEJ修复产生频率大于或等于20％的插入或缺失。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述插入或缺失频率大于或等于30％、40％或50％。
80.一种基因组工程化细胞，其在TGFBR2基因的靶位置处或附近包含插入或缺失，其中所述靶位置包含与选自SEQ ID NO:5036至5096的核苷酸序列互补或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列。
81.根据权利要求80所述的细胞，其中所述插入或缺失是在所述TGFBR2靶位置的约500bp、约450bp、约400bp、约350bp、约300bp、约250bp、约200bp、约150bp、约100bp、约50bp、约25bp、或约10bp内。
82.根据权利要求80所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
83.根据权利要求82所述的细胞，其进一步包含eTCR或CAR。
84.一种组合物，其包含：
a基因组工程化细胞的群体，所述基因组工程化细胞在TGFBR2基因的靶位置处或附近包含插入或缺失，其中所述靶位置包含与选自SEQ IDNO:5036至5096的核苷酸序列互补或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列；以及
b药学上可接受的缓冲液。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中所述细胞群体包含T细胞或NK细胞。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述T细胞或NK细胞进一步包含eTCR或CAR。
87.一种治疗受试者中癌症的方法，其包括向所述受试者给予工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞具有降低的TGFBR2表达，并且任选地表达工程化T细胞受体(eTCR)或嵌合抗原受体(CAR)，其中所述工程化免疫细胞在所述TGFBR2基因的靶位置处或附近具有插入或缺失。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述工程化免疫细胞包括T细胞或NK细胞。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述eTCR或CAR对癌细胞具有抗原特异性。
90.根据权利要求87所述的方法，其中所述癌症选自：白血病，淋巴瘤例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤，结肠癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，皮肤癌，黑色素瘤，骨癌和脑癌，卵巢癌，上皮癌，肾细胞癌，胰腺腺癌，霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，结直肠癌，胶质母细胞瘤，神经母细胞瘤，尤因肉瘤，髓母细胞瘤，骨肉瘤，滑膜肉瘤，间皮瘤和/或表达TGF-β的任何癌症类型。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。
92.根据权利要求87所述的方法，其中所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增强的针对靶癌细胞的裂解活性。
93.根据权利要求87所述的方法，其中在存在TGFβ的情况下，所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增加的颗粒酶B和/或干扰素γ的表达。
94.根据权利要求87所述的方法，其中所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞改善的针对重复抗原刺激的持久性。
95.根据权利要求87所述的方法，其中所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增加的CD25表达。
96.根据权利要求87所述的方法，其中所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞降低的PD-1表达。
97.根据权利要求87所述的方法，其中所述工程化免疫细胞维持或具有相对于非工程化免疫细胞增加的增殖。
98.一种包含多个工程化T细胞的组合物，其中所述工程化T细胞展现出相对于非工程化T细胞降低的TGFBR2基因表达。
99.根据权利要求98所述的组合物，其中所述工程化T细胞展现出TGFBR2基因表达水平是非工程化T细胞中TGFBR2表达水平的约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。
100.根据权利要求98所述的组合物，其中所述工程化T细胞进一步包含eTCR或CAR的表达。
101.根据权利要求98所述的组合物，其中所述T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
102.根据权利要求98所述的组合物，其中所述工程化T细胞的特征进一步在于具有：
(a)相对于非工程化T细胞增强的针对靶癌细胞的裂解活性；
(b)在存在TGFβ的情况下，相对于非工程化T细胞维持或增加的颗粒酶B和/或干扰素γ的表达；
(c)相对于非工程化T细胞维持或增加的针对重复抗原刺激的持久性；
(d)相对于非工程化T细胞维持或增加的CD25的表达；
(e)相对于非工程化T细胞维持或降低的PD-1的表达；和/或
(f)相对于非工程化T细胞维持或增加的增殖。
103.一种包含多个工程化T细胞的组合物，其中所述工程化T细胞展现出相对于非工程化T细胞降低的TGFBR2基因表达，所述工程化T细胞通过使非工程化T细胞与基因组编辑系统接触而产生，所述基因组编辑系统包含：gRNA，其包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域；和
RNA指导的核酸酶。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中将所述工程化T细胞进一步用表达eTCR或CAR的载体转导。
105.根据权利要求104所述的组合物，其中所述载体是病毒载体。
106.根据权利要求105所述的组合物，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
107.根据权利要求103所述的组合物，其中所述RNA指导的核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶，并且所述靶向结构域包含与选自以下的核苷酸序列相同或相差不超过约3个核苷酸的核苷酸序列：
(a)ID NO:5041；
(b)SEQ ID NO:5042；
(c)SEQ ID NO:5047；
(d)SEQ ID NO:5050；
(e)SEQ ID NO:5052；
(f)SEQ ID NO:5092；和
(g)SEQ ID NO:5093。
108.一种包含多个工程化T细胞的组合物，其中所述工程化T细胞在TGFBR2信号传导方面有缺陷。
109.根据权利要求108所述的组合物，其中有缺陷的TGFBR2信号传导是通过在所述工程化T细胞中表达所述TGFBR2的显性阴性(DN)形式来介导。
110.根据权利要求109所述的组合物，其中将所述工程化T细胞进一步用表达eTCR或CAR的载体转导。
111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述载体是病毒载体。
112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
113.根据权利要求108所述的组合物，其中所述T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
114.根据权利要求108所述的组合物，其中所述工程化T细胞的特征进一步在于具有：
(a)相对于非工程化T细胞增强的针对靶癌细胞的裂解活性；
(b)在存在TGFβ的情况下，相对于非工程化T细胞维持或增加的颗粒酶B和/或干扰素γ的表达；
(c)相对于非工程化T细胞维持或增加的针对重复抗原刺激的持久性；
(d)相对于非工程化T细胞维持或增加的CD25的表达；
(e)相对于非工程化T细胞维持或降低的PD-1的表达；和/或
(f)相对于非工程化T细胞维持或增加的增殖。
115.根据权利要求109所述的组合物，其中所述工程化免疫细胞进一步包含降低的野生型TGFBR2表达。
116.根据权利要求115所述的组合物，其中通过使所述工程化免疫细胞与基因组编辑系统接触降低野生型TGFBR2表达，所述基因组编辑系统包含：gRNA，其包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域；和
RNA指导的核酸酶。
117.一种包含gRNA和RNA指导的核酸酶的核糖核蛋白(RNP)复合物，所述gRNA包含与TGFBR2基因的靶序列互补的靶向结构域。
118.根据权利要求117所述的RNP，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9核酸酶。
119.根据权利要求117所述的RNP，其中所述RNP通过电穿孔进入细胞。
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