CN112969793B - 经修饰的t细胞、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

提供通过基因编辑制备经修饰的T细胞例如CAR‑T细胞的方法，以及通过所述方法制备的经修饰的T细胞及其用途。

Description

经修饰的T细胞、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及基因编辑和肿瘤免疫疗法领域。具体而言，本发明涉及通过基因编辑制备经修饰的T细胞例如CAR-T细胞的方法，以及通过所述方法制备的经修饰的T细胞及其用途。
背景技术
T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而，在肿瘤患者体内，特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)含量很少，其获取和体外扩增比较困难，且CTL的亲和力低，限制了其在肿瘤的临床治疗中的应用。
T细胞过继转移是近年来获得较高关注的特异性、低毒性的抗肿瘤方法。例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对T细胞进行遗传修饰是最常用的生成肿瘤特异性T细胞的方法。
TCR基因转移技术是从肿瘤反应性T细胞中克隆TCR的α和β链，通过基因工程技术，以逆转录病毒或慢病毒等作为载体，对初始T细胞进行抗原特异性TCR修饰，从而赋予T细胞特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，并提高T细胞与肿瘤的亲和力。利用TCR基因转移技术对患者自体来源的T细胞进行TCR基因修饰，经体外扩增，获取大量具有特异高效识别能力的T细胞，再过继回输给肿瘤患者，使之在体内发挥抗肿瘤作用。
CAR由胞外结构域、铰链、跨膜结构域和胞内结构域组成，所述胞外结构域通常衍生自单链可变片段(scFv)，所述胞内结构域具有一个或多个共刺激结构域和/或信号传导结构域(Kakarla and Gottschalk,2014)。尽管CAR-T细胞疗法在治疗CD19阳性的恶性血液肿瘤的早期临床研究中获得成功(Daviala et al,2014；Lee et al,2015；Maude et al,2014)，然而用CAR-T细胞靶向实体瘤抗原的临床应答非常有限，原因包括实体肿瘤异质性大，肿瘤微环境复杂，CAR-T细胞不容易浸润等。
因此，仍然需要获得能够有效抑制或杀伤肿瘤尤其是实体瘤的T细胞。
发明简述
在一方面，本发明提供一种制备经修饰的T细胞的方法，包括减少或消除T细胞中至少一种抑制性蛋白表达的步骤，所述抑制性蛋白选自T细胞表面抑制性受体和/或T细胞衰竭相关蛋白，例如选自TGFβ受体(如TGFBRII)、TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、A2aR、IL10RA、ADRB2、BATF、GATA3、IRF4、RARA、LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2、SHP1、DGKa、Fas、FasL或其组合。
在一些实施方案中，所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
在一些实施方案中，通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA、大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统实施所述减少或消除。
在一些实施方案中，所述CRISPR系统是CRISPR/Cas9系统。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统靶向所述T细胞内选自SEQ ID NO:1-21中一或多种的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域选自单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述CAR包含针对间皮素的scFv、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种通过本发明的方法制备的经修饰的T细胞。
在另一方面，本发明提供一种修饰的T细胞，其中与未修饰的T细胞相比，所述T细胞中的至少一种抑制性蛋白的表达被减少或消除，所述抑制性蛋白选自是T细胞表面抑制性受体和/或T细胞衰竭相关蛋白，例如选自TGFβ受体(如TGFBRII)、TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、A2aR、IL10RA、ADRB2、BATF、GATA3、IRF4、RARA、LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2、SHP1、DGKa、Fas、FasL或其组合。
在一些实施方案中，所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
在一些实施方案中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。
在一些实施方案中，所述所述抗原结合结构域选自单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述所述CAR包含针对间皮素的scFv、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供本发明的经修饰的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗癌症的药物组合物，包含本发明的经修饰的T细胞和药学可接受的载体。
在本发明各方面的实施方案中，所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本发明的方法或药物组合物治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。在一些优选实施方式中，所述癌症是实体瘤癌症。在一些具体实施方式中，所述癌症是肺癌如肺鳞癌。在一些具体实施方式中，所述癌症是卵巢癌。在一些具体实施方式中，所述癌症是结肠癌。
在另一方面，本发明还提供试剂盒，其用于通过本发明的方法制备经修饰的T细胞。
附图说明
图1显示不同CAR结构。
图2显示具有不同CAR结构的CAR-T细胞的作用。
图3显示不同效靶比和处理时间下TIGIT基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图4显示不同效靶比和处理时间下TIGIT基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图5显示不同效靶比和处理时间下BTLA基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图6显示不同效靶比和处理时间下BTLA基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图7显示不同效靶比和处理时间下CD160基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图8显示不同效靶比和处理时间下CD160基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图9显示不同效靶比和处理时间下2B4基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图10显示不同效靶比和处理时间下2B4基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图11显示不同效靶比和处理时间下CD200R基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图12显示不同效靶比和处理时间下CD200R基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图13显示不同效靶比和处理时间下BATF基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图14显示不同效靶比和处理时间下BATF基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图15显示不同效靶比和处理时间下GATA3基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图16显示不同效靶比和处理时间下GATA3基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图17显示不同效靶比和处理时间下RARA基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图18显示不同效靶比和处理时间下A2aR基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图19显示不同效靶比和处理时间下A2aR基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图20显示不同效靶比和处理时间下IL10Ra基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图21显示不同效靶比和处理时间下ADRB2基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图22显示不同效靶比和处理时间下DNMT3A基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图23显示不同效靶比和处理时间下LAYN基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci和CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图24显示不同效靶比和处理时间下LAYN基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞HCT116-luci和OVCAR3-luci的作用。
图25显示不同效靶比和处理时间下PHLDA1基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图26显示不同效靶比和处理时间下RGS1基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图27显示不同效靶比和处理时间下RGS2基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图28显示不同效靶比和处理时间下MYO7A基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图29显示不同效靶比和处理时间下Fas基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图30显示不同效靶比和处理时间下FasL基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图31显示不同效靶比和处理时间下SHP1基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图32显示不同效靶比和处理时间下DGKA基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-luci的特异性裂解。
图33显示TGFβ1对P4-CAR-T细胞功能产生负面影响。A：在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1的P4-CAR-T细胞的CRL5826肿瘤细胞特异性裂解能力。B-C：在与CRL5826细胞温育24小时后，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1时，P4-CAR-T细胞释放的IL-2(B)和IFN-γ(C)的浓度。T：T细胞；P4：P4-CAR-T细胞；CRL：CRL5826。
图34显示TGFβ1可诱导P4-CAR-T细胞向有功能的Treg转化。A：在与OVCAR3肿瘤细胞温育3天后，在培养基中加入或不加入5ng/ml TGFβ1，在P4-CAR-T细胞上的FOXP3表达情况。B：TGFβ1对P4-CAR-T细胞的增殖抑制能力，P4-CAR-T细胞与OVCAR3肿瘤细胞一起培养3天，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。在进行增殖抑制测定之前，通过FACS分选GFP阳性P4-CAR-T细胞。C：P4-CAR-T细胞的细胞裂解能力，其与OVCAR3肿瘤细胞一起培养3天，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。在进行细胞裂解能力测定之前，通过FACS分选GFP阳性P4-CAR-T细胞。
图35显示TGFβ1影响P4-CAR-T细胞抗原诱导的增殖能力和细胞的状态。A：在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1时，肿瘤细胞诱导P4-CAR-T细胞的增殖。B：在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1后，与CRL5826温育后4天的P4-CAR-T细胞的典型图像。P4：P4-CAR-T细胞。
图36显示TGFBR II sgRNA选择。A：通过流式细胞术(FCM)和TIDE检测用sgRNA-1/4/5/8电穿孔的HepG2上的TGFBR II敲除(KO)效率。B：在条件优化后通过FCM和TIDE检测用sgRNA-8电穿孔的HepG2上的TGFBR II的KO效率。
图37显示敲除TGFBR II或FOXP3改善P4-CAR-T细胞的功能。A：P4-CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO P4-CAR-T细胞的肿瘤细胞特异性裂解能力，在培养基中添加0、2.5、5和10ng/ml TGFβ1。效靶比(E:T)为0.25:1。B-C：与肿瘤细胞一起培养24小时后，P4-CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO P4-CAR-T细胞释放的IL-2(B)和IFN-γ(C)的浓度，在培养基中加入或不加入5ng/ml TGFβ1。
图38显示敲除TGFBR II或FOXP3改善P4-CAR-T细胞的功能。A：在与肿瘤细胞温育3天后，在培养基中加入或不加入5ng/ml TGFβ1，P4-CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO P4-CAR-T细胞的FOXP3表达。B：P4-CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO P4-CAR-T细胞的细胞裂解能力，其与CRL5826肿瘤细胞一起培养3天，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。在进行细胞裂解测定之前，通过FACS分选GFP阳性P4-CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO P4-CAR-T细胞。
图39显示TGFBR II敲除明显改善在TGFβ1存在下P4-CAR-T细胞抗原诱导的增殖能力和细胞的状态。A：在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1时，肿瘤细胞诱导P4-CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO P4-CAR-T细胞的增殖。B：与培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1，与肿瘤细胞孵育4天后，P4-CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO P4-CAR-T细胞的典型图像。FKO：FOXP3敲除；TKO：TGFBR II敲除。
图40显示经基因编辑的P4 CAR-T细胞的生长曲线、GFP阳性细胞比例和T细胞亚群分析。A：体外培养后P4 CAR-T细胞和TGFBR II KO/FOXP3 KO P4 CAR-T细胞的生长曲线。B：体外培养后P4 CAR-T细胞和TGFBR II KO/FOXP3 KO CAR-T细胞中GFP阳性细胞的比例。C：电穿孔后6天和15天CD4+和CD8+CAR-T细胞和TGFBRII KO/FOXP3 KO CAR-T细胞中的T细胞亚群分析。P4：P4-CAR-T细胞；FKO：FOXP3敲除；TKO：TGFBR II敲除。
图41显示TGBR II或FOXP3敲除改善CD4+CAR-T细胞的功能。A：在培养基中添加0、1.25、5和10ng/ml TGFβ1的CD4+CAR-T细胞的肿瘤细胞特异性裂解能力。效靶比(E:T)为1:1。B：CD4+CAR-T细胞和TGFBR II/FOXP3 KO CD4+CAR-T细胞的肿瘤细胞特异性裂解能力，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。效靶比(E:T)为1:1。C-F：与肿瘤细胞孵育3天后，CD4+CAR-T细胞和TGFBR II/FOXP3 KO CD4+CAR-T细胞的FOXP3(C)、IL-2(D)、IFN-γ(E)和GZMB(F)的相对mRNA表达水平，在培养基中加入或不加入5ng/ml TGFβ1。在mRNA提取之前通过FACS分选GFP阳性CAR-T细胞。ctrl：对照；FKO：FOXP3 KO；TKO：TGFBR II KO；CRL：CRL5826；w/o：不添加。
图42显示TGBR II或FOXP3敲除改善CD4+CAR-T细胞的功能。A：与肿瘤细胞孵育48小时后CD4+CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO CD4+CAR-T细胞释放的IL-2(左)和IFN-γ(右)浓度，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。B：肿瘤细胞诱导CD4+CAR-T细胞和TGTBRII/FOXP3 KO CD4+CAR-T细胞的增殖，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。C：与肿瘤细胞孵育第8天，CD4+CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO CD4+CAR-T细胞的特异性裂解能力，培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。ctrl：对照；FKO：FOXP3 KO；TKO：TGFBR II KO；CRL：CRL5826。
图43显示TGBR II或FOXP3敲除改善CD8+CAR-T细胞的功能。A：在培养基中添加0、1.25、5和10ng/ml TGFβ1的CD8+CAR-T细胞的肿瘤细胞特异性裂解能力。效靶比(E:T)为1:1。B：CD8+CAR-T细胞和TGFBR II/FOXP3 KO CD8+CAR-T细胞的肿瘤细胞特异性裂解能力，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。效靶比(E:T)为1:1。C-F：与肿瘤细胞孵育3天后，CD8+CAR-T细胞和TGFBR II/FOXP3 KO CD8+CAR-T细胞的IL-2(C)、IFN-γ(D)、GZMA(E)和GZMB(F)的相对mRNA表达水平，在培养基中加入或不加入5ng/ml TGFβ1。在mRNA提取之前通过FACS分选GFP阳性CAR-T细胞。ctrl：对照；FKO：FOXP3 KO；TKO：TGFBR II KO；CRL：CRL5826；w/o：不添加。
图44显示TGBR II或FOXP3敲除改善CD8+CAR-T细胞的功能。A：与肿瘤细胞孵育48小时后CD8+CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3 KO CD8+CAR-T细胞释放的IL-2(左)和IFN-γ(右)浓度，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。B：肿瘤细胞诱导CD8+CAR-T细胞和TGTBRII/FOXP3 KO CD8+CAR-T细胞的增殖，在培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。C：与肿瘤细胞孵育第8天，CD8+CAR-T细胞和TGTBR II/FOXP3KO CD8+CAR-T细胞的特异性裂解能力，培养基中添加或不添加5ng/ml TGFβ1。ctrl：对照；FKO：FOXP3 KO；TKO：TGFBR II KO；CRL：CRL5826。
图45显示不同效靶比和处理时间下IRF4基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞CRL5826-PDL1-luci的特异性裂解。
图46示出添加TGFβ1后M28z中PD1 mRNA表达显著增加。
图47示出TGFβ1通过上调PD1加速CAR-T细胞耗竭，同时阻断TGFβ和PD1信号传导可以进一步改善CAR-T对抑制性TME的抗性。
图48示出TGFBR II/PD1双重编辑的CAR-T细胞对PDL1过表达的CDX模型具有更好的肿瘤消除作用。
发明详述
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
“基因组”在用于真核细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。
针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在细胞中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。
本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。表达调控元件指的是能够控制感兴趣的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。
调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子、增强子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方式中，启动子是能够控制细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于所述细胞。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
“基因编辑”，也称为基因组编辑，其使用工程化的核酸酶或“分子剪刀”在生物体基因组中进行DNA插入、缺失或取代。基因编辑通过在基因组中期望的位置导致位点特异性双链断裂(DSB)，然后在修复DSB的过程中引入期望的DNA插入、缺失或取代。基因编辑通常使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR系统。
“大范围核酸酶”是一类具有巨大的识别位点(12-40bp的双链DNA序列)的脱氧核糖核酸内切酶，其识别位点在任何给定的基因组中通常只出现一次。例如，I-SceI大范围核酸酶所识别的18bp序列平均需要在比人基因组大20倍的基因组中才会偶然出现一次。
“锌指核酸酶”是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备的人工限制性酶。单个ZFN的锌指DNA结合结构域通常含有3-6个单独的锌指重复序列，每个锌指重复序列可以识别例如3bp。
“转录激活因子样效应物核酸酶”是可以经工程化而可以切割特定DNA序列的限制性酶，通常通过将转录激活因子样效应物(TALE)的DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备。TALE经工程化后可以结合几乎任何想要的DNA序列。
“成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)”是含有短的重复序列的原核DNA区段。CRISPR系统是原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件如存在于质粒和噬菌体的元件的抗性，这种抗性提供后天免疫。在此系统中Cas蛋白或类似蛋白在RNA的指导下切割外来核酸。
如本文所用，术语“CRISPR核酸酶”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶，以及其修饰形式、其变体(包括切口酶突变体)、或其催化活性片段。CRISPR核酸酶可以通过与向导RNA(如crRNA和任选的tracrRNA或人工gRNA(如sgRNA))一起相互作用来识别、结合和/或切割靶核酸结构。该术语涵盖基于CRISPR系统的能够在细胞内实现基因编辑的任何核酸酶或其功能性变体。本领域已知多种CRISPR核酸酶的功能性变体，例如高特异性变体或切口酶变体。本领域技术人员知晓如何选择合适的CRISPR核酸酶功能性变体以实现本发明的目的。
“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。
“向导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用，通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够相似性以便指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性结合的序列。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。然而，基于其他CRISPR核酸酶如Cpf1的gRNA的设计也在本领域技术人员的能力范围内。
“T细胞受体(TCR)”又称T细胞抗原受体，是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构，通常与CD3分子呈复合物形式存在于T细胞表面。大多数T细胞的TCR由α和β肽链组成，少数T细胞的TCR由γ和δ肽链组成。
“嵌合型抗原受体(CAR)”又称人工T细胞受体、嵌合型T细胞受体、嵌合型免疫受体，是一种人工设计的受体，可以赋予免疫效应细胞某一种特异性。普遍来讲，这一技术被用于赋予T细胞特异性识别肿瘤表面抗原的特性。通过这种方法，可以产生大量的靶向杀伤肿瘤细胞。
如本文所用“对象”是指患有或者易于患有可以通过本发明的方法、或药物组合物治疗的疾病(如癌症)的生物体。非限制性例子包括人、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在优选实施方案中，对象是人。
二、制备经修饰T细胞的方法
在第一方面，本发明提供一种制备经修饰的T细胞的方法，包括减少(敲低)或消除(敲除)T细胞中至少一种抑制性蛋白表达的步骤。
如本发明所用，T细胞“抑制性蛋白”是指与T细胞活性抑制相关的蛋白质。在一些实施方案中，所述抑制性蛋白选自T细胞表面抑制性受体或T细胞衰竭相关蛋白。
在一些实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体可以是识别表达于肿瘤细胞或其周围的基质细胞表面的配体的T细胞表面受体。此类受体的实例包括但不限于TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、RARA或它们的组合。
在另一些实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体可以是识别肿瘤微环境中存在的分泌物例如腺苷、肾上腺素等或细胞因子如IL-10、TGFβ等的受体。此类分泌物或细胞因子可能影响T细胞的肿瘤杀伤功能。此类受体的实例包括但不限于A2aR、IL10RA、ADRB2、TGFBRII或它们的组合。
本发明人特别令人惊奇地发现，通过抑制TGFβ信号通路可以增强治疗性T细胞如CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力。因此，在一些优选实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体是TGFβ受体。在一些优选实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体是识别抑制性细胞因子TGFβ1的T细胞受体，如TGFBRII。此外，本发明还涵盖减少(敲低)或消除(敲除)T细胞中的TGFβ信号通路相关蛋白如FOXP3的表达。在本发明一些实施方案中，减少(敲低)或消除(敲除)T细胞中TGFβ受体(如TGFBRII)和/或FOXP3的表达。
在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白是T细胞衰竭相关转录因子，例如，在衰竭的T细胞中表达显著上调的转录因子。此类转录因子的实例包括但不限于BATF、GATA3、IRF4或其组合。
据报道，衰竭的T细胞较没有衰竭的T细胞，表观遗传发生很大的变化。因此，在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白是表观遗传相关蛋白，例如甲基转移酶。在一些实施方案中，所述甲基转移酶是DNMT3A。
近年来兴起的单细胞测序技术，获得了一些在衰竭的T细胞中高表达，但是具体如何影响T细胞功能还不清楚的一类新的蛋白。此类在衰竭的T细胞中高表达的蛋白也涵盖在本发明的范围内。例如，在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白选自LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2或其组合。
在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白是与T细胞衰竭内源机制相关的蛋白，例如T细胞凋亡相关蛋白。此类T细胞衰竭内源机制相关的蛋白的实例包括但不限于SHP1、DGKa、Fas、FasL或其组合。
在一些实施方案中，本发明的方法包括减少或消除T细胞中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或更多种上文所述抑制性蛋白的表达，所述抑制性蛋白例如选自TGFβ受体(如TGFBRII)、TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、A2aR、IL10RA、ADRB2、BATF、GATA3、IRF4、RARA、LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2、SHP1、DGKa、Fas、FasL。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括减少或消除T细胞中PD1的表达。在一些实施方案中，本发明的方法包括减少或消除T细胞中TGFβ受体(如TGFBRII)和PD1的表达。
本发明的T细胞可以是通过扩增抗原特异性T细胞或通过遗传工程化重定向T细胞而产生的用于过继性免疫疗法的T细胞。所述T细胞还可以是分离自对象的原代T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)的T细胞。在另一些实施方式中，所述T细胞是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方式中，所述方法还包括提供分离自对象的未经修饰的T细胞的步骤，以及向所述未经修饰的T细胞导入TCR或CAR的步骤。在一些实施方式中，向所述未经修饰的T细胞导入TCR或CAR的步骤在减少或消除T细胞中的抑制性蛋白表达的步骤之前或之后或同时进行。
在一些实施方式中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域，例如胞外抗原结合结构域。
所述肿瘤相关抗原包括但不限于CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。在一优选实施方式中，所述抗原是间皮素。
本发明中，所述抗原结合结构域例如可以是单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的单克隆抗体。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv P4，例如，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：22。
在一些实施方式中，所述CAR包含跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，优选CD28跨膜结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：23的CD28跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述CAR进一步包括位于胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区域，例如，所述铰链区域为CD8铰链区，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：24的CD8铰链区。
在一些实施方式中，所述CAR包含可用于T细胞活化的信号转导结构域，例如选自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的信号转导结构域。在一些优选实施方式中，所述CAR包含CD3ζ信号转导结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：25的CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还包含一或多个选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB和4-1BBL的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含CD28共刺激结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：26的CD28共刺激结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还可以包含用于显示或追踪CAR表达的报道分子，如GFP蛋白。
在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含针对间皮素的scFv P4、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ信号转导结构域和任选的GFP蛋白。在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列。
本领域已知若干在细胞中减少或消除蛋白质表达的方法。在一些实施方式中，通过导入反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA减少或消除T细胞中抑制性蛋白的表达。在另一些实施方式中，通过基因编辑的方法，例如通过导入大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统减少或消除T细胞中抑制性蛋白的表达。在本发明方法优选的实施方式中，使用CRISPR系统减少或消除T细胞中抑制性蛋白的表达。
在一些实施方式中，CRISPR系统使用的核酸酶(CRISPR核酸酶)例如可以选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3或C2c2蛋白，或这些核酸酶的功能性变体。
在一些具体实施方式中，所述CRISPR系统是CRISPR/Cas9系统。在一些具体实施方式中，所述CRISPR系统例如CRISPR/Cas9系统靶向所述细胞中选自SEQ ID NO:1-21和28-31中的一或多个核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述CRISPR系统在体外组装，并转入T细胞。在一些实施方式中，将编码所述CRIPSR系统的所有元件的表达构建体转入T细胞。在一些实施方式中，将编码所述CRIPSR系统的部分元件的表达构建体以及其它已转录或已翻译的元件转入T细胞。
本发明还提供一种用于制备经修饰的T细胞的CRISPR基因编辑系统，其包含以下i)至v)中至少一项：
i)CRISPR核酸酶，和至少一种向导RNA；
ii)包含编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列的表达构建体，和至少一种向导RNA；
iii)CRISPR核酸酶，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
iv)包含编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
v)包含编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列和编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
其中所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的抑制性蛋白编码基因，所述抑制性蛋白选自T细胞表面抑制性受体和/或T细胞衰竭相关蛋白，例如选自TGFβ受体(如TGFBRII)、TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、A2aR、IL10RA、ADRB2、BATF、GATA3、IRF4、RARA、LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2、SHP1、DGKa、Fas、FasL或其组合。在一些实施方案中，其中所述至少一种向导RNA还包括靶向T细胞中的PD1编码基因的向导RNA。在一些实施方案中，其中所述至少一种向导RNA包括靶向T细胞中的TGFβ受体(如TGFBRII)和PD1编码基因的向导RNA。
在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中选自SEQ ID NO:1-21和28-31中的一或多个核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述CRISPR核酸酶例如可以选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3或C2c2蛋白，或这些核酸酶的功能性变体。在一些具体实施方式中，所述CRISPR核酸酶是Cas9核酸酶或其功能性变体。
在本发明的方法的一些实施方案中，包括将本发明的CRISPR基因编辑系统导入所述T细胞。在一些实施方案中，本发明的CRISPR基因编辑系统在导入所述T细胞后，导致减少或消除所靶向的蛋白的表达(敲低或敲除)。
本发明的CRISPR系统可以通过本领域已知的方法转入T细胞，例如：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)等。
本发明的经修饰的T细胞可以在任何修饰步骤之前或之后被活化和扩增。T细胞可以在体外或体内扩增。通常，本发明的T细胞可以例如通过与刺激CD3 TCR复合物和T细胞表面上的共刺激分子以产生T细胞活化信号的试剂接触来扩增。例如，可以使用诸如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、或有丝分裂凝集素如植物血凝素(PHA)的化学品来产生T细胞的活化信号。在一些实施方案中，T细胞群体可以通过在体外与例如抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触被活化，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)连同钙离子载体的接触来活化。例如，在适合于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞群可与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适用于T细胞培养的条件包括可能含有增殖和活力所必需的因子的合适培养基(例如Minimal Essential Media或RPMI Media1640、或X-vivo 5、(Lonza))，其中必需的因子包括血清(例如胎牛或人类血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ和TNF，或本领域技术人员已知的用于细胞生长的添加剂。其它用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉、和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙酸。培养基可以包括RPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer、氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或适量补充的血清(或血浆)或一组明确的激素、和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。靶细胞可以保持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和环境(例如，空气加5％CO2)。
三、经修饰的T细胞
在本发明的另一方面，提供了经修饰的T细胞，其中与未修饰的T细胞相比，所述经修饰的T细胞中的抑制性蛋白的表达被减少或消除。在一些实施方式中，所述经修饰的T细胞通过本发明的方法制备。
在一些实施方案中，所述抑制性蛋白选自T细胞表面抑制性受体或T细胞衰竭相关蛋白。
在一些实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体可以是识别表达于肿瘤细胞或其周围的基质细胞表面的配体的T细胞表面受体。此类受体的实例包括但不限于TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、RARA或它们的组合。
在另一些实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体可以是识别肿瘤微环境中存在的分泌物例如腺苷、肾上腺素等或细胞因子如IL-10、TGFβ等的受体。此类分泌物或细胞因子可能影响T细胞的肿瘤杀伤功能。此类受体的实例包括但不限于A2aR、IL10RA、ADRB2、TGFBRII或它们的组合。
本发明人特别令人惊奇地发现，通过抑制TGFβ信号通路可以增强治疗性T细胞如CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力。因此，在一些优选实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体是TGFβ受体。在一些优选实施方案中，所述T细胞表面抑制性受体是识别抑制性细胞因子TGFβ1的T细胞受体，如TGFBRII。此外，本发明还涵盖TGFβ信号通路相关蛋白如FOXP3的表达被减少(敲低)或消除(敲除)的T细胞。在本发明一些实施方案中，T细胞中TGFβ受体(如TGFBRII)和/或FOXP3的表达被减少(敲低)或消除(敲除)。在本发明一些实施方案中，T细胞中TGFβ受体(如TGFBRII)和/或PD1的表达被减少(敲低)或消除(敲除)。
在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白是T细胞衰竭相关转录因子，例如，在衰竭的T细胞中表达显著上调的转录因子。此类转录因子的实例包括但不限于BATF、GATA3、IRF4或其组合。
据报道，衰竭的T细胞较没有衰竭的T细胞，表观遗传发生很大的变化。因此，在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白是表观遗传相关蛋白，例如甲基转移酶。在一些实施方案中，所述甲基转移酶是DNMT3A。
近年来兴起的单细胞测序技术，获得了一些在衰竭的T细胞中高表达，但是具体如何影响T细胞功能还不清楚的一类新的蛋白。此类在衰竭的T细胞中高表达的蛋白也涵盖在本发明的范围内。例如，在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白选自LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2或其组合。
在一些实施方案中，所述T细胞衰竭相关蛋白是与T细胞衰竭内源机制相关的蛋白，例如T细胞凋亡相关蛋白。此类T细胞衰竭内源机制相关的蛋白的实例包括但不限于SHP1、DGKA、Fas、FasL或其组合。
在一些实施方案中，与未修饰的T细胞相比，本发明的经修饰的T细胞中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或更多种上文所述抑制性蛋白的表达被减少或消除，所述抑制性蛋白例如选自TGFβ受体(如TGFBRII)、TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、A2aR、IL10RA、ADRB2、BATF、GATA3、IRF4、RARA、LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2、SHP1、DGKa、Fas、FasL。在一些进一步的实施方案中，与未修饰的T细胞相比，本发明的经修饰的T细胞中PD1的表达被减少或消除。在一些实施方案中，与未修饰的T细胞相比，本发明的经修饰的T细胞中TGFβ受体(如TGFBRII)和PD1的表达被减少或消除。
在一些实施方式中，所述T细胞中编码所述抑制性蛋白的基因被敲除，例如通过导入本发明的基因编辑系统而敲除。
在本发明中，所述经修饰的T细胞具有与未修饰的T细胞相当的扩增能力和类似的免疫特性，并且由于免疫抑制被解除而具有增强的生物学活性，例如抗肿瘤活性，尤其是抑制或杀伤实体瘤细胞的活性。
本发明中，所述T细胞可以是包含外源T细胞受体(TCR)的T细胞，或者所述T细胞可以是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR-T细胞)。在本发明一些优选实施方式中，所述经修饰的T细胞是CAR-T细胞。
在一些实施方式中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域，例如胞外抗原结合结构域。
所述肿瘤相关抗原包括但不限于CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。在一优选实施方式中，所述抗原是间皮素。
本发明中，所述抗原结合结构域例如可以是单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的单克隆抗体。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv P4，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：22。
在一些实施方式中，所述CAR包含跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，优选CD28跨膜结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：23的CD28跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述CAR进一步包括位于胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区域，例如，所述铰链区域为CD8铰链区，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：24的CD8铰链区。
在一些实施方式中，所述CAR包含可用于T细胞活化的信号转导结构域，例如选自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的信号转导结构域。在一些优选实施方式中，所述CAR包含CD3ζ信号转导结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：25的CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还包含一或多个选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB和4-1BBL的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含CD28共刺激结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：26的CD28共刺激结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还可以包含用于显示或追踪CAR表达的报道分子，如GFP蛋白。
在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含针对间皮素的scFv P4、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ信号转导结构域和任选的GFP蛋白。在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列。
在本发明一具体实施方式中，所述经修饰的T细胞是包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的CAR的CAR-T细胞，其中至少一种选自以下的抑制蛋白或抑制蛋白的组合的表达被减少或消除TGFβ受体(如TGFBRII)、TIGIT、BTLA、2B4、CD160、CD200R、A2aR、IL10RA、ADRB2、BATF、GATA3、IRF4、RARA、LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2、SHP1、DGKa、Fas、FasL或其任意组合。
本发明的T细胞可以通过各种非限制性方法从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，细胞可以衍生自健康供体或来自诊断为癌症的患者。在一些实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的细胞的混合群体的一部分。在一些实施方式中，所述T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是CD8+T细胞。
在本发明各方面的一些实施方案中，所述T细胞衍生自对象的自体细胞。如本文所用，“自体”是指用于治疗对象的细胞、细胞系或细胞群源自所述对象。在一些实施方案中，所述T细胞衍生自异体细胞，例如源自与所述对象人类白细胞抗原(HLA)相容的供体。可以使用标准方案将来自供体的细胞转化为非同种异体反应性细胞，并根据需要进行复制，从而产生可以施用至一个或多个患者的细胞。
本发明的CAR T细胞或TCR T细胞可以通过本领域已知的多种手段制备。例如，可以用包含CAR或TCR编码序列的表达构建体转导T细胞来获得CAR-T细胞或TCR-T细胞。本领域技术人员能够容易地构建适合于蛋白表达的表达构建体例如病毒载体。
四、药物组合物和应用
在本发明的另一方面，还提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含本发明的经修饰的T细胞和药学可接受的载体。此外，本发明还提供本发明的经修饰的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。
在本发明的另一方面，还提供一种用于治疗癌症的方法，包括给有需要的对象施用治疗有效量的本发明的经修饰的T细胞或本发明的药物组合物。
在一些实施方式中，所述方法还进一步包括给所述对象施用放疗和/或化疗和/或另外的肿瘤靶向药物(例如靶向其它抗原的单克隆抗体或小分子化合物)。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或“有效量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或细胞的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
例如，“有效量”的本发明的细胞或药物组合物优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的细胞或药物组合物优选地将肿瘤细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制肿瘤细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。
实际应用中，本发明药物组合物中细胞的剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
令人惊奇的是，本发明的经修饰的T细胞，相对于对照T细胞(抑制蛋白的表达未被减少或消除)，能够以更低的剂量实现更优的治疗效果。例如，本发明的经修饰的T细胞能够在低效靶比和/或更长的时间上获得比对照T细胞更优的肿瘤杀伤效果。这特别有利于减少制备时间和成本，同时能够减少高剂量施用时带来的副作用。
例如，本发明的经修饰的T细胞的施用剂量比所述抑制蛋白的表达未被减少或消除的对照T细胞的施用剂量低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、低约6倍、低约7倍、低约8倍、低约9倍、低约10倍、低约15倍、低约20倍、低约30倍、低约40倍、低约50倍、低约100倍、低约150倍、低约200倍或更低。
可通过本发明的细胞或药物组合物治疗的癌症的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本发明的方法或药物组合物治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。优选地，所述癌症是实体瘤癌症。在一些具体实施方式中，所述癌症是肺癌如肺鳞癌。在一些具体实施方式中，所述癌症是卵巢癌。在一些具体实施方式中，所述癌症是结肠癌。
五、试剂盒
本发明还提供一种试剂盒，其用于本发明的制备经修饰T细胞的方法，所述试剂盒包含本文所述的用于制备经修饰的T细胞的CRISPR基因编辑系统，以及合适的将所述基因编辑系统导入细胞中的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含CRISPR核酸酶例如Cas9蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一或多种sgRNA，例如，所述sgRNA靶向SEQ ID NO：1-21和28-31中任意一或多种靶序列。在另一些实施方式中，所述试剂盒包含用于体外转录sgRNA的试剂。
所述试剂盒还可以包含用于检测T细胞、分离T细胞、活化T细胞和/或扩增T细胞的试剂。所述试剂盒还可以包含用于将CAR或TCR导入T细胞的试剂、检测和/分离表达所述CAR或TCR的细胞的试剂。所述试剂盒还可以包含实施本发明方法的说明。
实施例
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实验材料与方法
1.sgRNA的体外转录
首先由生物公司合成包含T7启动子和20bp靶序列(sgRNA)的正向引物，然后以pX330质粒(Addgene plasmid#4223)为PCR模板体外扩增T7-sgRNAPCR产物并利用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。再以纯化的T7-sgRNAPCR产物为模板，利用MEGAshortscript T7 kit(Thermo Fisher Scientific)体外转录sgRNA，并用MEGAclear columns(Thermo FisherScientific)回收sgRNA，用无RNA酶的去离子水溶解sgRNA，分装冻存或备用。
2.Cas9蛋白与sgRNA的复合
首先在无RNA酶的EP管中加入适量的相应的sgRNA，然后缓慢加入Cas9蛋白，轻混匀，室温孵育15分钟，形成核糖核蛋白(RNP)备用。
3.电穿孔转化方法
1)使用P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit；
2)向12孔板中加入1.5ml/孔完全培养基37摄氏度预热30min以上；同时用15ml离心管预热一支培养基；预热50ml PBS；
3)向RNase-free EP管中分别加入相应的sgRNA，然后缓慢加入相应量的Cas9蛋白，轻轻混匀，室温孵育20min，形成RNP复合物；
4)配置电转缓冲液:100ul体系：nuclepfector溶液82μl+18μl supplement；
5)在sgRNA和cas9蛋白孵育的期间，准备电转所需的细胞：
6)收集活化3天的T细胞，并计数，取出所需要的细胞量(3e6细胞/样品)；
7)200g，室温离心5min；
8)弃上清，用预热好的PBS将细胞洗一次，200g，室温离心5min；
9)弃上清，尽量去除残留液体；
10)用配好的电转缓冲液重悬细胞，轻柔混匀；
11)从重悬好的细胞中取出200μl/样品(包括复孔)加入孵育好的RNP中，轻柔混匀，然后将混合物100μl/样品加入电转杯；
12)电转，程序为stimulated T cells(EO-115)；
13)迅速向电转后的电转杯中加入预热好的培养基500μl，用移液管轻混匀，吸出细胞，加入预热好的12孔板中，将细胞放回培养箱培养，37℃，5％CO2；
14)电转6小时后半量换液，小心从培养箱取出细胞，不要晃动，沿着孔壁小心吸出1ml/孔培养基，然后向培养孔中补充1ml预热好的T细胞培养基；
15)之后根据细胞生长状态，按时传代，维持细胞密度在1e6细胞/ml。
4.CD3+细胞的分离及CAR-T细胞的制备
将外周血或者脐带血用淋巴细胞分离液(Histopaque-1077)分选成单个核细胞(PBMC)后，再将PBMC用EasySeq human T cell Enrichment的试剂盒将CD3+细胞分离出来。得到CD3+细胞后，进行CAR慢病毒侵染，得到CAR-T细胞。
随后如上所述，将各RNP电穿孔进入CAR-T细胞中，将靶基因敲除，得到基因编辑后的CAR-T细胞。
5.肿瘤细胞系
肿瘤细胞CRL5826(NCI-H226人肺鳞癌细胞系)、OVCAR3(人卵巢癌细胞)和HCT116(人结肠癌细胞)购买于ATCC，全部表达抗原Mesothelin。将细胞系用用于表达luciferase的病毒进行侵染，得到稳定表达luciferase的细胞系(CRL5826-luci、OVCAR3-luci、HCT116-luci)。在此基础上再转染表达PDL1的病毒，得到高表达PDL1的细胞系(CRL5826-PDL1-luci)。
6.CAR-T细胞的体外杀伤
将肿瘤细胞以104/100ul的密度放到micro-assay-plate的96孔板中(greinerbio-one)。将CAR-T细胞精确计数，按不同的效应细胞:靶细胞比例进行稀释，加入到相应的孔中100ul，对照组是加入100ul的培养基。到达时间后，所有的孔加入Luciferase Assay System 10ul，5分钟后，在酶标仪下读数。得到读数后，计算杀伤的百分比：杀伤(％)＝100-(实验组读数/对照组读数)*100。
实施例1、具有不同CAR结构的CAR-T细胞的作用
设计了4种结构的CAR(P4-z、P4-BBz、P4-28z和P4-28BBz，结构如图1所示，其中P4是抗间皮素scFv)，并制备CAR-T细胞。
以1:1的效应细胞:靶细胞比例，将所得到的CAR-T细胞与H226细胞共培养20h，测量IFN-γ和IL-2的释放。
以2:1的效应细胞:靶细胞比例，将所得到的CAR-T细胞与表达荧光素酶的H226细胞(H226-luci)共培养3天，通过测量剩余肿瘤细胞的荧光素酶活性计算靶细胞裂解的百分比。
如图2所示，与P4-z、P4-BBz和P4-28BBz相比，P4-28z显示更高的IFN-γ和IL-2的释放(图2A)，以及更高的特异性细胞裂解(图2B，*表示P<0.05，****表示P<0.0001)。
以下实验均使用包含P4-28z的CAR-T细胞，简称P4-CAR-T细胞。
实施例2、CAR-T细胞中抑制性受体的基因编辑对肿瘤杀伤的作用
本实施例研究了CAR-T细胞中抑制性受体TIGIT、BTLA、CD160、2B4和CD200R通过基因编辑被敲除后对肿瘤杀伤的影响。
TIGIT敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图3)
TIGIT敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1”1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图4)
BTLA敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图5)
BTLA敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图6)
CD160敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤效果。(图7)
CD160敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图8)
2B4敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果。(图9)
2B4敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图10)
CD200R敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中比对照CAR-T细胞较强的杀伤效果。(图11)
CD200R敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图12)
实施例3、CAR-T细胞中T细胞衰竭相关转录因子的基因编辑对肿瘤杀伤的作用
本实施例研究了CAR-T细胞中T细胞衰竭相关转录因子BATF、GATA3、IRF4、RARA通过基因编辑被敲除后对肿瘤杀伤的影响。
BATF敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中比对照CAR-T细胞非常明显的杀伤优势。(图13)
BATF敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞非常明显的杀伤优势。(图14)
GATA3敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果。(图15)
GATA3敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果。(图16)
RARA敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2：1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天RARA敲除组均表现出很强的杀伤优势。(图17)
IRF4敲除组在靶细胞为CRL5826-luci-PDL1的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，敲除组表现出比对照CAR-T组杀伤很强的优势，当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出IRF4敲除组比对照CAR-T组较强的杀伤优势。(图45)
实施例4、CAR-T细胞中肿瘤微环境相关受体的基因编辑对肿瘤杀伤的作用
本实施例研究了CAR-T细胞中肿瘤微环境相关受体A2aR、IL10RA、ADRB2通过基因编辑被敲除后对肿瘤杀伤的影响。
A2aR敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中比对照CAR-T细胞非常明显的杀伤优势。(图18)
A2aR敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图19)
IL10RA敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出IL10RA敲除组较强的杀伤优势。(图20)
ADRB2敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出ADRB2敲除组较强的杀伤优势。(图21)
实施例5、CAR-T细胞中T细胞衰竭相关表观遗传基因的基因编辑对肿瘤杀伤的作用
本实施例研究了CAR-T细胞中T细胞衰竭相关表观遗传基因如甲基转移酶DNMT3A通过基因编辑被敲除后对肿瘤杀伤的影响。
DNMT3A敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出DNMT3A敲除组比对照CAR-T组相对微弱的杀伤优势。(图22)
实施例6、CAR-T细胞中衰竭T细胞高表达基因的基因编辑对肿瘤杀伤的作用
本实施例研究了在衰竭T细胞中高表达的一些功能未知基因通过基因编辑在CAR-T细胞中被敲除后对肿瘤杀伤的影响。这些基因包括：LAYN、MYO7A、PHLDA1、RGS1、RGS2。
LAYN敲除组在靶细胞为CRL5826-luci、CRL5826-PDL1-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤能力。(图23)
LAYN敲除组在靶细胞为OVCAR3-luci、HCT116-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在低效靶比长时间的杀伤中表现出比对照CAR-T细胞较强的杀伤优势。(图24)
PHLDA1敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出PHLDA1敲除组比对照CAR-T组较强的杀伤优势，尤其在第七天。(图25)
RGS1敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出RGS1敲除组比对照的CAR-T组较强的杀伤优势。(图26)
RGS2敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出RGS2敲除组较对照CAR-T组很强的杀伤优势，尤其在第七天。(图27)
MYO7A敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出MYO7A敲除组比对照CAR-T组相对微弱的杀伤优势。(图28)
实施例7、CAR-T细胞中T细胞衰竭内源机制相关基因的基因编辑对肿瘤杀伤的作用
本实施例研究了CAR-T细胞中T细胞衰竭内源机制相关基因SHP1、DGKa、Fas、FasL通过基因编辑被敲除后对肿瘤杀伤的影响。
Fas敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出Fas敲除组比对照CAR-T组较强的杀伤优势。(图29)
FasL敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出FasL敲除组比对照CAR-T组较强的杀伤优势。(图30)
SHP1敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出SHP1敲除组比对照CAR-T组很强的杀伤优势。(图31)
DGKa敲除组在靶细胞为CRL5826-luci的高效靶比(1:1)短时间(24h、48h)的杀伤中表现出不低于对照CAR-T细胞的杀伤效果，在较低效靶比0.2:1下，第四天和第七天杀伤均到70％以上，敲除组表现出不低于对照CAR-T的杀伤作用，而当效靶比降为0.1:1时，第四天和第七天均表现出DGKa敲除组比对照CAR-T组较强的杀伤优势。(图32)
实施例8、通过抑制TGFβ信号通路改善CAR-T细胞治疗实体瘤的效果
1.TGFβ1负调P4-CAR-T细胞功能，并可诱导P4-CAR-T细胞向有功能的调节性T细胞(Treg)转化。
为验证TGFβ1是否会影响CAR-T细胞的杀伤功能，发明人将靶向间皮素的P4-CAR-T细胞与CRL5826间皮瘤细胞以1:1的效靶比共孵育，并在培养体系中添加或不添加5ng/ml的TGFβ1。结果显示，在共孵育24小时后，添加有TGFβ1组的P4-CAR-T细胞的靶向杀伤能力明显低于未添加组(图33A)。为初步探究添加TGFβ1组的P4-CAR-T细胞杀伤能力下降的原因，检测了培养液中IL-2和IFN-γ的释放情况。发现当P4-CAR-T细胞与CRL5826共孵育后,产生大量的IL-2和IFN-γ。然而，当添加TGFβ1后，IL-2和IFN-γ的释放量下降了约50％(图33B和C)。
据报道，在TCR激活和有TGFβ1存在的条件下，T细胞可转化为诱导型Treg。发明人在P4-CAR-T与间皮素强表达的OVCAR-3细胞共孵育体系中添加5ng/ml的TGFβ1，以观察是否能诱导Treg的产生。共孵育3天后，将P4-CAR-T细胞分选出来，发现在添加TGFβ1组，P4-CAR-T细胞FOXP3的表达水平明显升高(图34A)。将这些P4-CAR-T细胞以2:1和1:1的比例与violet标记的CD4+CD25-responder细胞共孵育，发现添加TGFβ1组的P4-CAR-T细胞能明显抑制responder细胞的增殖(图34B)。此实验说明在有TGFβ1存在的情况下，CAR-T细胞可转化为有功能的Treg，Treg具有增殖抑制能力。将这些P4-CAR-T细胞再次与OVCAR-3进行孵育，发现添加TGFβ1组的P4-CAR-T细胞杀伤能力明显低于未添加TGFβ1组(图34C)。
此外，观察了TGFβ1对P4-CAR-T细胞抗原诱导的增殖能力的影响。在P4-CAR-T细胞无IL-2培养体系中，通过每2天添加一次CRL5826肿瘤细胞，以诱导P4-CAR-T细胞增殖，同时添加或不添加TGFβ1。可以看到CRL5826可诱导P4-CAR-T细胞的大量增殖，然而在添加TGFβ1组，P4-CAR-T细胞基本无增殖(图35A)。同时，观察到在添加TGFβ1组，P4-CAR-T细胞的状态也明显差于未添加TGFβ1组(图35B)。
2.敲除TGFBR II或FOXP3可改善P4-CAR-T细胞的功能
如上所述，已观察到TGFβ1确实能负向调控P4-CAR-T细胞的功能，本实验将P4-CAR-T细胞上的TGFβ1结合受体TGFBR II或Treg产生的重要转录因子FOXP3敲除对有TGFβ1存在下P4-CAR-T细胞功能的影响。发明人利用CRISPR/Cas9技术，将P4-CAR-T细胞的TGFBRII或FOXP3进行了敲除。
如图36所示，测试了针对TGFBR II四种不同靶序列的sgRNA：sgRNA-1(靶序列：TGCTGGCGATACGCGTCCAC，SEQ ID NO：28)、sgRNA-4(靶序列：CCATGGGTCGGGGGCTGCTC，SEQ IDNO：29)、sgRNA-5(靶序列：CGAGCAGCGGGGTCTGCCAT，SEQ ID NO：30)、sgRNA-8(靶序列：CCTGAGCAGCCCCCGACCCA，SEQ ID NO：31)。这四种sgRNA均能实现TGFBR II敲除(图36A)，其中sgRNA-8效率最高，在优化后敲除效率能达到80％以上。类似地敲除了FOXP3。
发现在敲除TGFBR II后，即便添加10ng/ml的TGFβ1，P4-CAR-T细胞的杀伤功能也没有受到任何影响，FOXP3敲除也能部分改善CAR-T细胞的杀伤功能(图37A)。同时，发现TGFBR II敲除能明显增加在有TGFβ1存在情况下P4-CAR-T细胞IL-2和IFN-γ的释放。然而，FOXP3敲除后并未增加P4-CAR-T细胞IL-2和IFN-γ的释放(图37B和C)。此外，发现TGFBR II或FOXP3敲除，能够明显降低TCR激活和TGFβ1添加导致P4-CAR-T细胞中FOXP3表达(图38A)，且能明显改善P4-CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力(图38B)。另外，TGFBR II敲除能明显改善在有TGFβ1存在情况下抗原诱导的P4-CAR-T细胞的增殖和生存状态，然而，FOXP3敲除没有明显改善(图39A和B)。值得一提的是，TGFBR II或FOXP3敲除并未影响P4-CAR-T细胞自身的增殖能力、CAR的表达以及T细胞亚群的分布(图40)。
3.TGBR II或FOXP3敲除可改善CD4+CAR-T细胞的功能
本实验分别考察了TGFβ1对P4-CAR-T细胞中的CD4和CD8亚群的影响。在CD4+CAR-T细胞与CRL5826共孵育体系中，添加了不同浓度的TGFβ1。发现添加5或10ng/ml TGFβ1时，可明显抑制P4-CAR-T细胞的靶向杀伤能力(图41A)，而TGFBR II或FOXP3敲除后能明显改善CD4+CAR-T细胞的杀伤能力(图41B)。同时，发现TGFβ1可调控CD4+CAR-T细胞中诸多基因转录水平的表达，如上调FOXP3，下调IL-2和IFN-γ。TGBR II敲除后，能降低FOXP3，上调IL-2和IFN-γ(图41C-E)。然而GZMB的表达受TGFβ1的影响不明显(图41F)。也在蛋白水平也观察到IL-2和IFN-γ表达的类似变化(图42A)。此外，也观察到TGFβ1能明显抑制CD4+CAR-T细胞抗原诱导的增殖能力，TGFBR II敲除能明显改善这一现象，然而FOXP3敲除的作用却不明显(图42B)。同时TGBR II或FOXP3敲除的CD4+CAR-T细胞在多轮抗原刺激后的杀伤能力明显优于未编辑的CD4+CAR-T细胞(图42C)。
4.TGBR II或FOXP3敲除可改善CD8+CAR-T细胞的功能
在CD8+CAR-T细胞与CRL5826共孵育体系中，添加了不同浓度的TGFβ1，发现随着添加浓度的升高，CD8+CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力被抑制得越明显(图43A)，而TGFBR II或FOXP3敲除后能明显改善CD8+CAR-T细胞的杀伤能力(图43B)。同时，发现TGFβ1可调控CD8+CAR-T细胞中诸多基因转录水平的表达，如下调IL-2、IFN-γ、GZMA和GZMB。TGBR II敲除后，能上调这些基因的表达(图43C-F)。我们也在蛋白水平也观察到IFN-γ的表达有类似变化(图44A)，然而除在TGBR II敲除的CD8+CAR-T细胞中有比较明显的IL-2表达外，其他各组中都没有明显的表达(图44A)。此外，也观察到TGFβ1能明显抑制CD8+CAR-T细胞抗原诱导的增殖能力，TGFBR II敲除能明显改善这一现象，然而FOXP3敲除的作用却不明显(图44B)。同时TGBR II或FOXP3敲除的CD8+CAR-T细胞在多轮抗原刺激后的杀伤能力明显优于未编辑的CD8+CAR-T细胞(图44C)。然而值得一提的是，CD8+CAR-T细胞的抗原刺激增殖能力和多轮杀伤能力都明显弱于CD4+CAR-T细胞。
实施例9、TGFBR II/PD1双重编辑的CAR-T细胞具有改善的实体瘤治疗效果
9.1 TGFβ1通过上调PD1加速CAR-T细胞耗竭
持续激活T细胞信号传导导致耗竭，并且耗竭的T细胞具有降低的增殖能力和效应子功能，并且具有免疫检查点基因(例如PD1)过表达。观察到添加TGFβ1后M28z中PD1mRNA表达显著增加(图46)，进一步使用多轮抗原刺激测定研究了TGFβ1是否加速CAR-T细胞耗竭。发现TGFβ1在多次肿瘤细胞攻击后显著影响CAR-T细胞的增殖。在第四次攻击中，几乎所有CAR-T细胞在TGFβ1存在下死亡，而对照细胞存活良好。敲除TGFBR II使得CAR-T细胞对TGFβ1效应无反应，导致与对照组相似的存活(图47A和47B)。在TGFβ1存在下，两次挑战后CAR-T细胞的肿瘤溶解活性降低至无，而M28z-TKO(TGFBR II KO)细胞保持活性(图47C)。因此，在三轮肿瘤挑战后，添加TGFβ1在CAR-T细胞中显著上调PD-1的表达，并且敲除TGFBR II降低了这种效果。相比之下，TIM3、LAG3和CTLA4的表达对TGFβ1的反应较弱，进一步表明PD1是TGFβ1驱动的CAR-T耗竭所诱导的主要靶标(图47D)。值得注意的是，在M28z-TKO中仍然存在显著数量的表达PD1的细胞，表明尽管它们对TGFβ1信号传导没有反应，但它们仍然倾向于被TME(肿瘤微环境)中的相应配体抑制。
为了评估PD1上调如何促成TGFβ的抑制作用，生成了PD1 KO(M28z-PKO)和PD1/TGFBR II双KO(M28z-DKO)CAR-T细胞，并且也过表达PDL1来建模一个更具抑制性的TME。与TGFβ1诱导的M28z中PD1的上调相比，在M28z-PKO和-DKO细胞中PD1的表达降低至基础水平，表明该基因编辑有效。在多次肿瘤攻击时，敲除PD1确实改善了CAR-T增殖，但它仍然比TKO和DKO更差(图47F)。在存在TGFβ1和PDL1过表达的情况下，M28z的肿瘤裂解能力在第2轮减少并且在第3轮完全丧失。在第3轮时，M28z-PKO能够实现超过90％的肿瘤溶解，并且在第4轮时丧失功效。相反，M28z-TKO在第4轮能够维持约60％的肿瘤溶解能力(图47G)。所有这些数据显示PD1上调部分地促成TGFβ的负调节作用。另一方面，TGFβ信号传导仅是PD1表达的部分原因，因为部分TKO细胞仍然表达PD1，因此受到PDL1抑制。DKO CAR-T细胞具有最佳性能，在第4轮消除了约90％的肿瘤(图47G)，表明同时阻断TGFβ和PD1信号传导可以进一步改善CAR-T对抑制性TME的抗性。
9.2 TGFBR II/PD1双重编辑的CAR-T细胞对PDL1过表达的CDX模型具有更好的肿瘤消除作用
在证实TGFBR II和PD1双KO对在体外针对CAR-T细胞的抗TGFβ1和PDL1双重免疫抑制的协同作用后，进一步探讨了M28z-DKO在CRL5826-PDL1 CDX模型中的体内肿瘤消除优势(图48A和48B)。与PBS组的快速增加和M28z组的缓慢增加相比，肿瘤体积控制在基础水平，并且在M28z-TKO组中除去了20％的肿瘤。然而，在该实验结束时，M28z-PKO和-DKO组中分别有80％的肿瘤完全消失(图48C)。在肿瘤大小和肿瘤重量中检测到相同的趋势(图48D和48E)。值得注意的是，没有观察到GvHD症状的小鼠，并且所有小鼠体重保持良好(图48F)。外周血分析显示hCD3和GFP阳性细胞的比例低，并且与M28z组相比，其在编辑的CAR-T细胞处理组中增加但不是显著地增加(图48G)。
考虑到肿瘤负荷不足以呈现M28z-DKO的消除优势的可能性，在M28z-PKO和-DKO组中对去除肿瘤的小鼠对侧重新接种相同的CDX。与对照组的快速生长相比，在M28z-PKO和-DKO组中重新接种后28天再次根除肿瘤(图48I，左图)。同时，没有小鼠出现GvHD症状并且体重保持良好(图48I，右图)，并且hCD3和GFP阳性细胞的比例仅为约2％(图48J)。然而，在消除对侧再接种的肿瘤后，在根除10周后在M28z-PKO组中有50％的原发性肿瘤复发(图48H)。这些数据表明M28z-DKO具有体内持久的肿瘤消除能力的优势，这与其体外更好的抗耗竭能力一致。
实验结果说明，本发明的一或多种抑制性蛋白被敲除的CAR-T细胞在高效靶比下与未敲除CAR-T细胞效果相当，出乎意料的是，本发明的被敲除的CAR-T细胞在低效靶比、较长作用时间下优于未敲除CAR-T细胞。这特别有利于降低成本，减少制备时间，减少高剂量施用时带来的副作用。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 经修饰的T细胞、其制备方法及用途
<130> P2021TC5531CB
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TIGIT靶序列
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tcctcctgat ctgggcccag 20
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<223> BTLA靶序列
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<223> CD200R靶序列
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<223> IRF4靶序列
<400> 8
ctgatcgacc agatcgacag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RARA靶序列
<400> 9
ccattgaggt gcccgccccc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A2AR靶序列
<400> 10
ctcctcggtg tacatcacgg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL10RA靶序列
<400> 11
gcgccgccag cagcactacg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADRB2靶序列
<400> 12
caagaaggcg ctgccgttcc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LAYN靶序列
<400> 13
tagcgcggtt cccggcctca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYO7A靶序列
<400> 14
agcttcacca ccgccccgat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PHLDA1靶序列
<400> 15
ggcgcacgcc tcattaactt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGS1靶序列
<400> 16
gtcgtctaga agtgaatgag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGS2靶序列
<400> 17
agacccatgg acaagagcgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHP1靶序列
<400> 18
tcggcccagt cgcaagaacc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DGKa靶序列
<400> 19
gttgcttgga cctcttcaga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fas靶序列
<400> 20
gagggtccag atgcccagca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FasL靶序列
<400> 21
gtaattgaag ggctgctgca 20
<210> 22
<211> 258
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 针对间皮素的scFv(P4)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro Tyr
165 170 175
Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu
180 185 190
Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Pro
195 200 205
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val Leu
210 215 220
Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met
225 230 235 240
Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr
245 250 255
Val Leu
<210> 23
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 23
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 24
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8铰链区
<400> 24
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ信号转导结构域
<400> 25
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 26
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28共刺激结构域
<400> 26
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 27
<211> 483
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P4-CAR
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro Tyr
165 170 175
Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu
180 185 190
Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Pro
195 200 205
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val Leu
210 215 220
Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met
225 230 235 240
Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr
245 250 255
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
260 265 270
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
275 280 285
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
290 295 300
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
305 310 315 320
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
325 330 335
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
340 345 350
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
355 360 365
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
370 375 380
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
385 390 395 400
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
405 410 415
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
420 425 430
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
435 440 445
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
465 470 475 480
Pro Pro Arg
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGFBRII sgRNA-1靶序列
<400> 28
tgctggcgat acgcgtccac 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGFBRII sgRNA-4靶序列
<400> 29
ccatgggtcg ggggctgctc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGFBRII sgRNA-5靶序列
<400> 30
cgagcagcgg ggtctgccat 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGFBRII sgRNA-8靶序列
<400> 31
cctgagcagc ccccgaccca 20

Claims (9)

1.一种制备经修饰的T细胞的方法，包括减少或消除T细胞中至少一种抑制性蛋白表达的步骤，其中所述表达被减少或消除的抑制性蛋白是TGFβ受体，其还包括减少或消除T细胞中PD1表达的步骤，
其中通过CRISPR/Cas9系统实施所述减少或消除，其中所述CRISPR/Cas9系统靶向所述细胞内选自SEQ ID NO:28-31中一或多种的核苷酸序列，
其中所述T细胞是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，所述CAR由SEQ ID NO：27所示氨基酸序列组成。
2.权利要求1的方法，其中所述TGFβ受体是TGFBRII。
3.通过权利要求1-2任一项的方法制备的经修饰的T细胞。
4.修饰的T细胞，其中与未修饰的T细胞相比，所述T细胞中的至少一种抑制性蛋白的表达被减少或消除，其中所述表达被减少或消除的抑制性蛋白是TGFβ受体，且其中与未修饰的T细胞相比，所述T细胞中的PD1的表达被减少或消除，
其中所述T细胞是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述CAR由SEQ ID NO：27所示氨基酸序列组成。
5.权利要求4的经修饰的T细胞，其中所述TGFβ受体是TGFBRII。
6.权利要求3-5任一项的经修饰的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
7.用于治疗癌症的药物组合物，包含权利要求3-5任一项的经修饰的T细胞和药学可接受的载体。
8.权利要求6的用途或权利要求7的药物组合物，其中所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、宫颈癌、子宫体瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、脊柱肿瘤、垂体腺瘤、鳞状细胞癌、环境诱发的癌症，以及所述癌症的组合。
9.权利要求6的用途或权利要求7的药物组合物，其中所述癌症选自何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、慢性或急性白血病、鼻咽癌、喉癌。
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