CN116507719A

CN116507719A - 产生自然杀伤细胞的新的细胞系、方法及其用途

Info

Publication number: CN116507719A
Application number: CN202180072352.6A
Authority: CN
Inventors: J·余; M·A·卡利朱里; 陆婷
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2023-07-28

Abstract

本公开的特征在于用于产生人自然杀伤(NK)细胞的新的细胞系和相关方法、由这些方法产生的NK细胞的组合物及其用途。

Description

产生自然杀伤细胞的新的细胞系、方法及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年8月31日提交的美国临时专利申请63/072,657；和2021年7月8日提交的美国临时专利申请63/219,760的优先权和权益，其内容和公开通过引用以其整体并入本文。

序列表的引用

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且其据此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年8月24日，命名为40056-0065WO1_SL.txt并且大小为43,592字节。

技术领域

用于产生人自然杀伤(NK)细胞，特别是具有改善的扩增效率和增强的细胞功能的NK细胞的新的细胞系和相关方法，以及使用扩增的NK细胞进行抗癌和抗病毒治疗的方法。更特别地，本申请涉及NK细胞与新的Tyro3⁺饲养细胞的离体或体外共培养，从而促进扩增的NK细胞群的产生。

背景

癌症是全球第二大死亡的主要原因，在2018年中，占估计960万的死亡，或六分之一的死亡。基于自然杀伤(NK)细胞的免疫疗法是用于癌性肿瘤和血液恶性肿瘤的有前景的治疗方法。当NK细胞遭遇缺乏自身MHC I类分子的细胞时，它们发挥强烈的细胞毒性作用。因此，NK细胞能够识别和消除肿瘤细胞，这可以下调MHC I类分子，使它们成为肿瘤免疫疗法的理想候选物。同样，NK细胞还介导对病毒感染的细胞的免疫应答，这下调MHC I类表达。因此，NK细胞免疫疗法是用于抗病毒疗法的有前景的工具。

尽管NK细胞在杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞方面具有优势特性，但它们仍然难以在免疫疗法中起作用和应用于免疫疗法，这主要是由于难以获得足够数量的活化NK细胞用于过继性转移。此外，在培养和扩增期间维持它们的肿瘤靶向和杀肿瘤能力可能具有挑战性。因此，需要用于扩增NK细胞群的改善的体外和离体方法以产生大量具有改善功能的NK细胞，使得它们在体内使用时可以有效靶向和消除肿瘤细胞和病毒感染的细胞。

概述

本文描述了通过使用表达Tyro3的饲养细胞(例如Tyro3⁺ K562细胞)产生扩增的NK细胞群的新的细胞系和相关方法以及包含通过此类方法产生的扩增的NK细胞群的组合物。本文还描述了使用本公开的组合物治疗癌症和病毒感染的方法。

本公开基于令人惊讶的观察，当人NK细胞(在它们的细胞表面上不表达内源性Tyro3)在培养物中与过表达Tyro3的K562肿瘤细胞(Tyro3⁺ K562细胞)得到接触时，NK细胞能够经由胞啃作用(trogocytosis)从K562细胞的表面获得Tyro3并且在NK细胞表面上展示获得的Tyro3。与Tyro3^- NK细胞相比，因此产生的Tyro3⁺ NK细胞具有更好的扩增效率，以及显著增强的细胞毒性、IFN-γ产生和活化表面标志物表达。

本文描述了经修饰的K562髓系白血病细胞，其中经修饰的K562细胞(Tyro3⁺ K562细胞)外源性表达人Tyro3多肽。Tyro3多肽包含与SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列。例如，Tyro3多肽包含与SEQ ID NO:2至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。Tyro3⁺K562细胞表达膜结合白细胞介素21(IL-21)和4-1BB配体(4-1BBL)。

在一些实施方案中，与不表达外源性人Tyro3的K562细胞(Tyro3^- K562细胞)相比，Tyro3⁺ K562细胞可以使接触该K562细胞的人自然杀伤(NK)细胞的扩增增强了至少约10％。与接触Tyro3^- K562细胞的人NK细胞的扩增相比，Tyro3⁺ K562细胞可以使接触该K562细胞的人NK细胞的扩增增强了至少约10％、15％、20％、25％或大于30％。在多个实施方案中，K562细胞中的人Tyro3表达处于强启动子的控制之下。在一些实施方案中，强启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，强启动子是逆转录病毒启动子。

本文还描述了扩增人NK细胞群的方法，其包括将NK细胞群与经修饰的K562髓系白血病细胞共培养。经修饰的K562细胞(Tyro3⁺ K562细胞)外源性表达人Tyro3多肽。Tyro3多肽包含与SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列。例如，Tyro3多肽包含与SEQ ID NO:2至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。Tyro3⁺ K562细胞表达膜结合白细胞介素21(IL-21)和4-1BB配体(4-1BBL)。在各种实施方案中，K562细胞中的人Tyro3表达处于强启动子的控制之下。在一些实施方案中，强启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，强启动子是逆转录病毒启动子。

在上述方法的各种实施方案中，Tyro3通过胞啃作用从Tyro3⁺ K562细胞转移至人NK细胞以获得Tyro3⁺ NK细胞。这可以通过例如共培养Tyro3⁺K562细胞和NK细胞来完成。在一些实施方案中，人NK细胞在白细胞介素2(IL-2)的存在下扩增。在一些实施方案中，人NK细胞与Tyro3⁺ K562细胞的比率可以在约0.1:1至约10:1的范围内。例如，人NK细胞与K562细胞的比率可以为约0.1:1、0.3:1、0.4:1、0.7:1、0.9:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或大于10:1。

在上述方法的一些实施方案中，将NK细胞和Tyro3⁺ K562细胞共培养约5分钟至约6周的持续时间。例如，可以将NK细胞和Tyro3⁺ K562细胞共培养约5分钟、30分钟、1小时、2小时、12小时、24小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周或大于6周。

在上述方法的一些实施方案中，IL-2以约0IU/mL至约5000IU/mL的浓度存在。在一些实施方案中，IL-2以约50IU/mL至约2000IU/mL的浓度存在。在其他实施方案中，IL-2以约150IU/mL至约900IU/mL的浓度存在。

在上述方法的一些实施方案中，扩增的NK细胞是活化NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞是工程化NK细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。

在上述方法的一些实施方案中，扩增的NK细胞是程序性死亡配体1(PD-L1)⁺细胞。在一些实施方案中，扩增的NK细胞具有以下至少一项：(a)当与对照中相应mRNA和/或蛋白质的参考水平相比时，以下标志物中的一种或多种的较高水平的mRNA和/或蛋白质：磷酸化信号转导物及转录激活子3(p-STAT3)、磷酸化-NF-κB p65(p-P65)、pSTAT5、磷酸化-Akt(p-AKT)和磷酸化细胞外信号相关激酶(p-ERK)、干扰素-γ(IFNγ)、分化簇107a(CD107a)、CD25、CD69、杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1(KLRG1)；以及(b)当与对照中相应活性的参考水平相比时，以下标志物中的一种或多种的较高水平的活性：p-STAT3、p-P65、pSTAT5、p-AKT、p-ERK、IFNγ、CD107a、CD25、CD69和KLRG1。

在一些实施方案中，Tyro3⁺ K562细胞携带编码人Tyro3的外源性核苷酸序列。

在一些实施方案中，Tyro3⁺细胞进一步表达CD64(FcγRI)、CD86(B7-2)和截短的CD19(tCD19)中的一种或多种。在一些实施方案中，Tyro3⁺ K562细胞进一步表达膜结合IL15、可溶性IL15或IL15 sushi受体复合物。

本文还描述了包含通过上述方法产生的扩增的NK细胞群的组合物。

本文还描述了包含扩增的NK细胞的组合物，其中群体中的NK细胞的至少20％是Tyro3⁺ NK细胞。

本文还描述了治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本公开的组合物，从而治疗受试者的癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：肺癌、乳腺癌、尤文肉瘤、中枢神经系统赘生物、皮肤癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、肛门癌、胃癌、胃肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、脑干胶质瘤、垂体癌、肾上腺皮质癌、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、淋巴瘤、肝癌、肾癌、骨癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤。

本文还描述了治疗有此需要的受试者的病毒感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本公开的组合物，从而治疗受试者的病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染是由人类免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)和冠状病毒引起的。

还描述了抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括使肿瘤细胞与治疗有效量的本公开的组合物接触。在一些实施方案中，肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、急性髓细胞性白血病细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞、前列腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。

材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均出于任何和所有目的通过引用整体并入。所描述的组合物和方法的其他特征和优点将从以下详细描述和附图以及从权利要求书中显而易见。

附图描述

图1A-E描绘了原代人NK细胞与或不与K562细胞以10:1的效应物(E)/肿瘤(T)比率共培养24小时后CD56⁺ NK细胞中Tyro3、Axl和Mertk的表达水平。图1A显示了来自4个不同供体的代表性流式细胞术图。图1A的汇总数据显示在图1B中。配对t检验用于两组比较。图1C描绘了当原代人NK细胞与K562细胞以1:1E/T比率共培养指示的时间点时，通过流式细胞术测量的NK细胞上的Tyro3表达。数据汇总自4个不同的供体。图1D描绘了当原代人NK细胞用或不用IL-2(150IU/mL)预处理过夜，然后以1:1E/T比率与K562细胞共培养时，通过流式细胞术测定的NK细胞上的Tyro3表达。数据汇总自7个不同的供体。图1E描绘了来自图1D的两个NK细胞亚群(CD56^亮和CD56^暗NK亚群)中Tyro3表达的汇总数据。代表性流式细胞术图和数据汇总自7个不同的供体。单因素方差分析(One-way ANOVA)用于图1B、1D和1E。通过Holm-Sidak方法调整P值。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。数据以平均值±SD表示。

图2A-2D描绘了在各种条件下共培养的NK细胞上Tyro3的表达水平。图2A描绘了以1:1的E/T比率与或不与transwell板中的K562细胞共培养、或者与或不与K562细胞直接共培养、或者与或不与来自K562培养物的上清液共培养1小时的NK细胞上Tyro3表达的表达水平。图2B描绘了显示来自IL-2刺激的NK细胞的NK细胞上的Tyro3表达的代表性流式细胞术图和汇总数据(n＝5)，该IL-2刺激的NK细胞以1:1的E/T比率与或不与K562直接共培养、或者与或不与来自NK细胞和K562共培养的上清液共培养1小时。图2C描绘了来自IL-2刺激的NK细胞的NK细胞上的Tyro3表达的代表性流式细胞术图和汇总数据(n＝4)，该IL-2刺激的NK细胞以1:1的E/T比率与K562或K562^Tyro3-KO细胞共培养1小时。图2D描绘了显示来自IL-2刺激的NK细胞的NK细胞上的Tyro3表达的代表性流式细胞术图和汇总数据，该IL-2刺激的NK细胞以1:1的E/T比率与Molm-13或Molm-13^Tyro3-OE细胞共培养1小时。图2E描绘了NK细胞上获得的Tyro3的百分比与它们在K562细胞上的相应Tyro3％之间的相关性的非线性回归分析。通过皮尔森(Pearson)检验计算出的相关性是统计学上显著的。数据汇总自3个不同的供体。图2F-2G描绘了来自用或不用IL-2(150IU/mL)预处理并与K562细胞以1:1的E/T比率共培养1小时的NK细胞的4个独立实验的NK细胞上获得的Tyro3的持久性(分选分离后)的动力学汇总。图2F显示了在存在或不存在IL-2的情况下的相对％Tyro3⁺ NK细胞。图2G显示了在存在或不存在IL-2的情况下，由CD56^亮或CD56^暗细胞分选的相对％Tyro3⁺ NK细胞。单因素方差分析用于图2A-2D并且皮尔森相关系数用于图2E。通过Holm-Sidak方法调整P值。*P<0.05，***P<0.001；ns，不显著。数据以平均值±SEM表示。

图3A-3C描绘了Tyro3^- EGFP融合蛋白可以经由胞啃作用从肿瘤细胞转移到人NK细胞。图3A显示了亲代K562细胞和抗原呈递K562(APC-K562)细胞上Axl、Mertk和Tyro3表达的代表性流式细胞术图。图3B显示了以1:1的E/T比率与K562或APC K562共培养1小时的CD56⁺ NK细胞上的Tyro3表达。每个实验用4个不同的供体进行。图3C显示了Tyro3^- EGFP融合蛋白的构建体设计。G4S接头，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:27)。图3D显示了代表性流式细胞术图，其显示了NK细胞与过表达具有C端融合EGFP的Tyro3的APC K562细胞(APCK562^Tyro3-EGFP)的共培养。在共培养1小时(1H)、2小时(2H)或4小时(4H)后进行流式细胞术。每个实验用3个不同的供体进行。图3E显示了与APC K562^Tyro3-EGFP共培养的NK细胞中Tyro3表达的RT-PCR分析。将K562细胞用作内源性Tyro3转录本的阳性对照，并用充当转基因Tyro3转录本的阴性对照。Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞在整个4小时的共培养期间均缺乏内源性和转基因Tyro3转录本的表达。将甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作cDNA合成质量的对照。每个实验用3个不同的供体进行。

图4A-4D描绘了在NK细胞与K562细胞共培养后，未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞的功能评估。图4A描绘了来自7个不同供体的流式细胞术图和汇总数据，其显示了在NK细胞与K562细胞以10:1的E/T比率共培养24小时后，未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)中CD107a的表达。图4B描绘了来自7个不同供体的流式细胞术图和汇总数据，其显示了在NK细胞与K562细胞以10:1的E/T比率共培养24小时后，未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)中IFN-γ的表达。图4C描绘了在NK细胞与K562细胞以10:1的E/T比率共培养24小时后，FACS分选的未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)中由qRT-PCR评估的IFN-γ的表达。汇总数据为来自5个不同供体的代表。图4D描绘了在IL-2刺激的NK细胞与K562细胞以1:1的E/T比率用GolgiPlug^TM共培养4小时后，FACS分选的Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)中由免疫印迹评估的GZMB和穿孔素的蛋白质水平。汇总数据针对3个不同供体。图4E描绘了Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞的％特异性裂解，这些细胞为在NK细胞与K562细胞以10:1的E/T比率共培养24小时，然后与⁵¹Cr标记的K562或⁵¹Cr标记的721.221细胞共培养4小时后由FACS分选的，然后量化特异性K562或721.221细胞裂解。数据汇总自4个不同的供体。对于图4F-4I，原代人NK细胞与或不与K562细胞以10:1的E/T比率温育24小时。图4F描绘了来自6个不同供体的未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(每组从左到右显示于图中)上的活化受体(CD25、CD62L、CD69、CD94、TRAIL和NKp80)的汇总数据。图4G描绘了来自6个不同供体的未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)上的KLRG1的平均荧光强度(MFI)汇总数据。图4H描绘了来自至少5个不同供体的未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺NK细胞(在每个图中从左到右)上的耗竭标志物(Tim-3和TIGIT)的MFI汇总数据。图4I描绘了来自6个不同供体的未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)上的PD-L1的NK亚群中的％汇总数据。单因素方差分析用于图4A-4C和4G-4I，配对t检验用于图4D，多重t检验用于图4E，双因素方差分析用于图4F。通过Holm-Sidak方法调整P值。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。图4A、4B、4D和4F-4I的数据以平均值±SD表示，图4C和4E的数据以平均值±SEM表示。

图5A-5D描绘了从表达Tyro3的APC K562细胞获得Tyro3后的离体NK细胞扩增。图5A描绘了当Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞经FACS分选并与灭活的APC K562细胞在IL-2(50IU/mL)的存在下温育7天，然后在第7天计数活的NK时，Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)的倍数变化(n＝9)。图5B描绘了当Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞经FACS分选并在IL-2(150IU/mL)存在下培养7天，然后在第7天计数活的NK时，未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(图中从左到右)的倍数变化(n＝4)。图5C描绘了当将原代人NK细胞与灭活的APC K562细胞(图中左栏)或APC K562^Tyro3(图中右栏)在IL-2(50IU/mL)存在下温育7天，然后在第7天计数活的NK时，NK细胞的倍数变化(n＝9)。图5D描绘了将原代人NK细胞与APC K562细胞(图中左栏)或APCK562^Tyro3(图中右栏)温育1小时时NK细胞的倍数变化。然后将NK细胞与肿瘤细胞分离，然后与IL-2(50IU/mL)共培养7天，然后在第7天计数活的NK细胞(n＝3)。图5E描绘了将原代人NK细胞与APC K562细胞(图中左栏)或APC K562^Tyro3(图中右栏)温育1小时时NK细胞中的p-STAT5^Ser727、p-AKT或p-ERK表达。然后将NK细胞与肿瘤细胞分离，然后进行免疫印迹测定。将汇总数据归一化为β-肌动蛋白表达后呈现。每个实验用至少3个不同的供体重复。图5F描绘了在IL-2刺激的原代人NK细胞与APC K562^ED-Tyro3细胞以1:1的E/T比率共培养1小时后的Tyro3表达(n＝3)。图5G描绘了将原代人NK细胞与APC K562细胞、APC K562^Tyro3或APCK562^ED-Tyro3(图中从左到右)在IL-2(50IU/mL)存在下温育7天，然后在第7天计数活的NK细胞(n＝5)时，NK细胞的倍数变化。图5H显示了在按照对图5G所描述的与APC K562细胞、APCK562^Tyro3或APC K562^ED-Tyro3(图中从左到右)温育后来自3个不同供体的％BrdU阳性NK细胞。图5I描绘了将原代人NK细胞与APC K562细胞、APC K562^Tyro3或APC K562^Tyro3_^K550A(图中从左到右)在IL-2(50IU/mL)存在下温育7天，然后在第7天计数活的NK时，NK细胞的倍数变化(n＝6)。图5J描绘了在IL-2刺激的原代人NK细胞与APC K562^Tyro3_^K550A细胞以1:1的E/T比率共培养后的Tyro3表达(n＝3)。配对t检验用于图5A、5C和5E，双因素方差分析用于图5B和5D，单因素方差分析用于图5G-5I。P值通过Turkey或Holm-Sidak方法进行调整。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。数据以平均值±SD表示。

图6A-6D描绘了NK细胞的体外和体内效应物功能。对于图4A-4C，将原代人NK细胞与灭活的APC K562细胞或APC K562^Tyro3细胞在IL-2(50IU/mL)存在下温育7天。图6A描绘了来自3个不同供体的NK细胞的％汇总数据，其显示了在用APC K562细胞或APC K562^Tyro3细胞扩增的NK细胞上表面标志物的表达(图中每组从左到右)。图6B描绘了来自3个不同供体的代表性流式细胞术图和汇总数据，其显示了在与亲代K562细胞以4:1的E/T比率共培养4小时后，用APC K562细胞或APC K562^Tyro3细胞(图中从左到右)扩增的NK细胞上CD107a的表达。图6C描绘了用与⁵¹Cr标记的K562细胞系共培养4小时的APC K562细胞或APC K562^Tyro3扩增的NK细胞，然后对特异性K562细胞裂解进行量化。数据汇总自3个不同的供体。图6D描绘了小鼠第9天和第14天的生物发光成像。将原代人NK细胞与APC K562^Tyro3或APC K562细胞在IL-2(50IU/mL)存在下温育4天。然后用表达可溶性IL-15(sIL15)的逆转录病毒载体转导细胞达48小时。在第6天，用第二批APC K562^Tyro3或APC K562细胞在IL-2(50IU/mL)存在下刺激转导的NK细胞达另外的7天，之后收获并储存用于后续使用。在第0天，给小鼠注射1×10⁶个K562_Luc细胞，然后用由APC K562(APC K562_sIL15NK)或APC K562^Tyro3(APC K562^Tyro3_sIL15 NK)扩增的10×10⁶个sIL15 NK细胞处理。在第1天，用第2剂这些NK细胞处理小鼠。每组中N＝5。双因素方差分析用于A。**，P<0.01；***，P<0.001。数据以平均值±SD表示。

图7A描绘了代表性流式细胞术图，其显示了来自4个不同供体的不同细胞因子刺激条件下(150IU/mL IL-2和10ng/mL所有其他细胞因子)Tyro3⁺NK细胞的百分比。NC：无细胞因子。图7B描绘了将原代人NK细胞与K562以1:1的E/T比率在有/没有IL-2刺激的情况下共培养1小时后的Tyro3、Axl和Mertk表达。汇总数据来自3个不同的供体。图7C描绘了Tyro3⁺表达的百分比。将EnrNK或FACS纯化的NK细胞与K562细胞以10:1的E/T比率共培养24小时，然后通过流式细胞术确定NK细胞上的Tyro3表达。数据显示了来自4个不同供体的汇总数据。图7D显示了不同肿瘤细胞系(Jurkat、U937、Molm-13、K562和ISO，如图中从上到下所示)上Tyro、Axl和Mer表达的表达归一化直方图。数据代表3个独立实验。图7E描绘了CD56⁺ NK细胞上Tyro3表达的流式细胞术图。将原代人NK细胞用或不用IL-2(150IU/mL)预处理过夜，然后以1:1的E/T比率与不同的白血病细胞系K562、U937、Molm-13和Jurkat共培养1小时，然后通过流式细胞术评估NK细胞上的Tyro3表达。显示了来自3个独立实验的代表性流式细胞术图。单因素方差分析用于图7B，配对t检验用于图7C。P值通过Turkey方法进行调整。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。数据以平均值±SD表示。

图8A描绘了代表性流式细胞术数据，其显示了WT和K562^Tyro3-KO细胞上的Tyro3表达。图8B描述了代表性流式细胞术图，其显示了IL-2刺激的NK细胞与亲代Jurkat或Jurkat^Tyro3-OE细胞以1:1的E/T比率共培养1小时后的Tyro3表达。图8C描绘了在CD56^亮或CD56^暗NK细胞(分选分离后)中Tyro3获取动力学的代表性流式细胞术图。用或不用IL-2(150IU/mL)预处理的NK细胞与K562共培养1小时。CD56^亮或CD56^暗NK细胞(分选分离后)中Tyro3获取动力学的代表性流式细胞术图。每个实验用4个不同的供体进行。

图9A描绘了以10:1的E/T比率与K562细胞共培养24小时的FACS分选的未刺激的、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(每个图中从左到右)中通过qRT-PCR的颗粒酶B(GZMB)和穿孔素的表达。5个不同供体的汇总数据。图9B-9C描绘了4个不同供体的代表性流式细胞术图和汇总数据，其显示了以4:1的E/T比率与K562细胞共培养4小时的未刺激的NK细胞、Tyro3^-和Tyro3⁺NK细胞(每个图中从左到右)中CD107a(图9B)和IFN-γ(图9C)的表达。图9D描绘了在NK细胞与K562细胞以10:1的E/T比率共培养24小时后，来自至少5个不同供体的未刺激的细胞、Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞(每个图中从左到右)上活化受体(CD16、DNAM-1、NKG2D和NKp30)的汇总数据。图9E描述了来自5个不同供体的未刺激的NK细胞、Tyro3^-NK细胞和Tyro3⁺ NK细胞(每个图中从左到右)上NKG2A的汇总数据。单因素方差分析用于图9A-9C和9E，并且双因素方差分析用于图9D。P值通过Turkey或Holm-Sidak方法进行调整。**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。数据以平均值±SD表示。

图10A描绘了未刺激的原代人NK细胞与没有灭活/灭活的过表达Tyro3的APC K562细胞以1:1的E/T比率共培养1小时后的Tyro3表达。数据汇总自3个不同的供体。将原代人NK细胞与灭活的APC K562、APC K562^Tyro3或APC K562^ED-Tyro3细胞在IL-2(50IU/mL)存在下温育7天。图10B描绘了代表性流式细胞术图和汇总数据。将来自不同饲养细胞系的扩增的NK细胞用羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CSFE)染料标记，然后培养24小时。这些组是APCK562、APC K562^Tyro3或APC K562^ED-Tyro3(从左到右)。图10C描绘了NK细胞中膜联蛋白V与Sytox Blue表达以及关于NK细胞用不同饲养细胞进行7天扩增后的凋亡细胞和活细胞百分比的汇总数据。每个实验用5个不同的供体进行。这些组是APC K562、APC K562^Tyro3或APCK562^ED-Tyro3(每个分组从左到右)。图10D描绘了在与APC K562、APC K562^Tyro3或APC K562^ED ^-Tyro3共培养的NK细胞中0小时、24小时、48小时和72小时(0H、24H、24H和72H)时的扩增NK细胞的相对细胞数量的百分比(在每个分组中从左到右指示APC K562、APC K562^Tyro3或APCK562^ED-Tyro3细胞)。在不存在IL-2的情况下培养扩增的NK细胞后，每天进行细胞计数。每个实验用3个不同的供体进行。图10E显示了NK细胞的扩增倍数变化。用GFP-EV或GFP-Tyro3转导原代人NK细胞，然后在存在或不存在IL-2的情况下进行培养。将FACS分选的GFP⁺或Tyro3⁺转导细胞在没有或有IL-2(150IU/mL)的情况下温育96小时。每天进行细胞计数。显示的数据是4个不同供体的汇总。单因素方差分析用于图10A和10B，双因素方差分析用于图10C-10E。通过Holm-Sidak方法调整P值。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。数据以平均值±SD表示。

图11A描绘了代表性流式细胞术图，其显示了在来自小鼠不同器官的人NK细胞中的Tyro3表达。每个流式图代表来自具有类似结果的4只小鼠的数据。图11B描绘了来自小鼠不同器官或组织的人NK细胞中Tyro3表达的RT-PCR分析。将K562细胞系用作内源性Tyro3在mRNA水平上的阳性对照。所有人NK细胞样品均缺乏内源性Tyro3转录本的表达。将GAPDH用作cDNA合成质量的对照。每个实验进行两次。BM，骨髓；LV，肝脏；SP，脾脏；PB，外周血。

详细描述

除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应该具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，与本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学有关的使用的命名法和技术是本领域众所周知和常用的。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

除非另有说明，否则本申请的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有完整的解释，如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,second edition(Sambrook et al,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather andP.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell编,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos编,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994)；Sambrook and Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow and Lane UsingAntibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY(1998)；Coligan et al.,Short Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY(2003)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)。

在本说明书整篇和实施方案中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体将理解为暗含包括所述的完整物或完整物组但不排除任何其他完整物或完整物组。应当理解，在本文中用语言“包含”来描述实施方案的情况下，也提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”所描述的其他类似实施方案。

术语“包括”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可以互换使用。

术语“例如(e.g.)”或“例如(for example)”之后的任何示例不意味着穷举或限制。

除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。

冠词“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”在本文中用于指代冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。例如，“一个元素”意指一个元素或多于一个的元素。本文提及“约”值或参数包括(并且描述)指向该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括定义范围的数字。如本文所用，术语“约”允许在有效数字范围内±10％的变化。

尽管所公开的数值范围和参数是近似值，但尽可能准确地报告了具体实施例中列出的数值。然而，任何数值都固有地含有某些误差，这些误差必然是由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖包含在其中的任何和所有子范围。例如，“1到10”的规定范围应当视为包括最小值1和最大值10之间(包括最小值1和最大值10)的任何和所有子范围；也就是说，所有子范围都以1或更大的最小值开始，例如1到6.3，并且以10或更小的最大值结束，例如5.7到10。

在根据马库什组或其他替代物的分组描述方面或实施方案的情况下，本申请不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且单独地涵盖组中的每个成员并涵盖主要组的所有可能的亚组，并且还涵盖缺少组成员的一个或多个的主要组。本申请还设想明确排除马库什组或其他替代物的分组中的任何组成员中的一个或多个。

定义

如本文所述，术语“经修饰以外源性表达”是指迫使感兴趣的基因在细胞中表达。在本公开的上下文中，Tyro3在饲养细胞(如K562细胞)中外源性表达。“外源性表达”是指感兴趣的蛋白(Tyro3；SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2至少95％相同的蛋白在饲养细胞表面上的强制表面表达或“过表达”。为了诱导Tyro3的外源性表达，可以将Tyro3的编码序列(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1至少95％相同的核酸克隆到表达载体中并通过质粒转染或慢病毒颗粒转导递送至K562细胞。递送至K562的Tyro3可以处于“强启动子”的控制之下，该启动子是导致高水平的mRNA转录的启动子。在一些情况下，强启动子可以是“组成型启动子”，其是在所有情况下都具有活性的不受调控的启动子并容许其相关基因的连续转录。在一些情况下，强启动子是逆转录病毒启动子，或本领域已知的任何其他启动子。

如本文所述，术语“扩增细胞群”是指通过本领域已知的常规细胞培养方法在体外或离体培养细胞的过程。在本公开的上下文中，培养细胞或“培养”包括通过本公开的方法将人NK细胞与Tyro3⁺饲养细胞(Tyro3⁺ K562细胞)“共培养”的步骤。培养提供了NK细胞和饲养细胞维持所需的化学和物理条件(例如，温度、气体、压力等)以及生长因子。培养NK细胞包括为NK细胞提供扩增或增殖条件。可以支持NK细胞扩增的化学条件的示例包括但不限于缓冲液、血清、营养物、维生素、抗生素、细胞因子和其他生长因子，将它们定期提供(或者可以手动给予)在适用于NK细胞扩增的细胞培养基中。

在一个实施方案中，NK细胞培养基包括补充有0-20％ AB型人血清(LifeTechnologies)和0-2000IU/mL的白细胞介素-2(IL-2)(Proleukin S，Novartis)的TexMACS研究培养基(Miltenyi Biotec GmbH)。在另一个实施方案中，NK细胞培养基包括补充有0-20％ AB型人血清(Life Technologies)和0-2000IU/mL的IL-2(Proleukin S，Novartis)的干细胞生长培养基SCGM(Cell Genix)。适用于扩增NK细胞的其他培养基是本领域众所周知的。

细胞培养基或液体提供了NK细胞和饲养细胞维持所需的化学条件。可以支持NK细胞和饲养细胞维持以及NK细胞扩增的化学条件的示例包括但不限于溶液、缓冲液、血清、血清组分、营养物、维生素、细胞因子和其他生长因子，将它们定期提供(或者可以手动给予)在细胞培养基中。适用于培养本领域已知的NK细胞的培养基包括TexMACS(Miltenyi)、CellGro SCGM(CellGenix)、X-Vivo 10、X-Vivo 15、BINKIT NK细胞初始培养基(Cosmo BioUSA)、AIM-V(Invitrogen)、DMEM/F12、NK细胞培养基(Upcyte Technologies)。

如本文所用，术语“扩增”、“增殖”、“繁殖(multiplication)”或其同源词是指细胞培养期间细胞数量的增加。在培养过程中，细胞经历一系列细胞分裂，并且因此在数量上扩大。如本文所用，扩增涉及在本公开的方法中公开的细胞培养过程中发生的Tyro3⁺ NK细胞数量增加。在一个实施方案中，术语“扩增的NK细胞”是指一组活化的NK细胞，这些细胞(a)在细胞培养期间经由胞啃作用从Tyro3⁺饲养细胞(例如，Tyro3⁺ K562细胞)获得在其表面的Tyro3；(b)经由本领域已知的技术(例如，荧光活化细胞分选或FACS)进行分选，以产生纯的Tyro3⁺ CD56⁺ NK细胞群，并且(c)Tyro3⁺ CD56⁺ NK细胞随后在IL-2存在下在细胞培养物中扩增。扩增的NK细胞群随后可能从细胞表面失去Tyro3表达。然而，扩增的NK细胞仍然可以保留其活化状态和细胞毒性功能，即，当与静息NK细胞、NK细胞、和/或Tyro3^- NK细胞相比时，由本公开的方法产生的扩增的NK细胞可以具有增强的细胞毒性和更高的活化表面标志物的表达。本公开的NK细胞可以在特定的cGMP级环境和cGMP级培养基中扩增。

如本文所用，术语“原代NK细胞”是指可以使用本领域已知的技术从任何常规来源(如从外周血、骨髓、脐带血、诱导多能干细胞(iPSC)、细胞系、细胞因子刺激的外周血等)获得的NK细胞。参见例如Fang F,et al.Cancer Biol Med.2019；16:647-54.doi:10.20892/j.issn.2095-3941.2019.0187。原代NK细胞是从健康供体或患者分离的具有典型NK细胞标志物(如CD56)的免疫细胞。在一些实施方案中，原代NK细胞可以是先前已经与Tyro3⁺饲养细胞接触但未经由胞啃作用获得Tyro3或在经纯化或FACS分选后失去Tyro3⁺表达的细胞。

如本文所述，术语“胞啃作用”(也称为削刮(shaving))是指在两种不同类型的活细胞之间(例如，在本公开的方法中从饲养细胞到NK细胞)的快速、细胞间接触依赖性膜片和相关分子摄取的过程。因此，膜结合蛋白和膜组分从供体细胞(饲养细胞)转移到接受者细胞(NK细胞)。当NK细胞与饲养细胞(如K562细胞)相互作用时，形成足够强大的免疫突触，以容许小的膜分子从饲养细胞到NK细胞的交换。在本公开的方法中，蛋白质Tyro3经由胞啃作用从Tyro3⁺饲养细胞转移到人NK细胞的表面。

不受理论的束缚，相信在本公开的方法中Tyro3从饲养细胞到NK细胞的胞啃作用出人意料地增强了NK细胞增殖的能力，并且还增强了扩增的NK细胞的活化和细胞毒性功能。

接受者细胞中胞啃作用的表型和生物学功能结果可以不同(Campana S,etal.Immunol Lett.2015；168(2):349-54)。在从HLA-G1转染的黑色素瘤细胞系获得HLA-G1后，IL-2活化的NK细胞系NKL成为抑制性NK细胞(Caumartin J,et al.EMBO J.2007；26(5):142)。在NKG2D从NK细胞胞内转移到靶细胞后，观察到NK细胞的细胞毒性降低(Roda-Navarro P,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2006；103(30):11258-63)。比较而言，如本公开的实施例所示，在遭遇NK易感肿瘤细胞(K562)并被其活化后，发现Tyro3⁺ NK细胞与Tyro3^- NK细胞相比具有显著增强的细胞毒性、IFN-γ产生和活化表面标志物的表达。此外，与Tyro3^- NK细胞亚群相比，已经显示在遭遇K562细胞后在NK细胞上将会上调的PD-L1的表达(Dong W,et al.2019；9(10):1422-37)在Tyro3⁺ NK细胞亚群中增加。

如本文所用，术语“Tyro3+ NK细胞”是指其外表面包含Tyro3蛋白或其肽衍生物的NK细胞。NK细胞表面上的大部分Tyro3蛋白或其肽衍生物(>98％)可以经由胞啃作用从K562细胞或任何遭遇的细胞获得，而不是由细胞内的mRNA编码并表达。因此，由NK细胞本身内源性产生非常少(如果有的话，即小于5％)的存在于Tyro3+ NK细胞表面的Tyro3。

如本文所用，术语“Tyro3⁺ K562细胞”是工程化K562细胞，其中表达在细胞表面上的Tyro3蛋白通过Tyro3的强制表达在K562细胞中合成。Tyro3表达可以处于强启动子的控制之下。

因此，在本公开的上下文中，术语“Tyro3⁺”在用于NK细胞时是指在其外部细胞表面上获得Tyro3的NK细胞，其表面表达不由内源性mRNA编码。比较而言，术语“Tyro3⁺”在用于经修饰的K562细胞系或其他饲养细胞系(例如Molm-13或U937)时是指从包含编码Tyro3的序列的表达载体强制表达递送至K562细胞或其他饲养细胞的Tyro3。

如本文所用，术语“工程化细胞”和“遗传修饰的细胞”可以互换使用。该术语意指含有和/或表达外来基因或核酸序列，其进而修饰细胞或其后代的基因型或表型。特别地，该术语是指可以通过本领域众所周知的重组方法操纵细胞以稳定地或瞬时地表达在这些细胞中在天然状态下不表达的肽或蛋白质的事实。细胞的遗传修饰可以包括但不限于转染、电穿孔、核转染、使用逆转录病毒载体的转导、慢病毒载体、非整合逆转录或慢病毒载体、转座子(例如，睡美人转座子系统)、包括锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas的设计者核酸酶。在一个实施方案中，遗传修饰的NK细胞可以表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR能够针对所有表达它们所结合的抗原的细胞重定向细胞毒性免疫应答。CAR可以用于癌症免疫疗法，其中携带靶向肿瘤抗原的CAR的NK细胞可以针对表达由CAR靶向的抗原的细胞产生强烈的抗肿瘤应答(Sadelain et al.,Cancer Discovery.2013.3(4):388-98)。在一些实施方案中，可以使用本公开的方法扩增CAR-NK细胞。“活化的Tyro3⁺ NK细胞”是指本公开的NK细胞，将其在Tyro3⁺饲养细胞(如K562细胞)存在下扩增，从而使其活化并获得细胞毒性表型并具有增强的NK细胞功能。在通过本公开的方法产生的扩增的NK细胞群的表面上可以上调许多活化和细胞毒性功能的标志物。NK细胞的活化途径还包括一系列不同的受体。活化受体不直接通过其细胞质尾发出信号，而是与含有ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)的其他分子非共价结合，从而充当信号转导蛋白。因此，根据一个实施方案，离体扩增和活化的NK细胞具有至少一种活化受体的上调表达。活化的Tyro3⁺ NK细胞可以上调细胞表面活化标志物，例如CD25和/或CD69，并且上调杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1)，其在最成熟的NK细胞上表达并且是NK细胞成熟的受体。在一些情况下，在NK细胞活化后，此类细胞上调IFNγ和/或CD107a的表达，它们是NK细胞脱粒和细胞因子产生的功能标志物。此外，活化的Tyro3⁺ NK细胞可以上调PD-L1表达，这是增强NK细胞功能的指示。本公开的活化的Tyro3⁺ NK细胞可以具有增强的细胞信号传导分子(如p-STAT3、p-P65、p-STAT5、pAKT、p-ERK等)的表达和活性。

在一些实施方案中，活化的Tyro3⁺ NK细胞中IFNγ和/或CD107a的mRNA或蛋白质水平比对照中的水平高至少约2.0x或3.0x或4.0x或5.0x或6.0x或7.0x或8.0x或9.0x或10x、或20X或50X、或75X或大于约100x。在一些实施方案中，活化的Tyro3⁺ NK细胞中IFNγ的mRNA或蛋白质水平比对照中的水平高至少约50X、或100X、或250X、或500X、或750X、或1000X、或2000X或大于约2000x。在一些实施方案中，活化的Tyro3⁺ NK细胞中的细胞表面活化标志物、细胞信号传导分子、KLRG1和/或PD-L1的mRNA或蛋白质水平比对照中的水平高至少约2.0x或3.0x或4.0x或5.0x或6.0x或7.0x或8.0x或9.0x或10x、或20X或50X或大于约100x。mRNA水平的倍数变化可以通过本领域已知的任何方法测量，包括但不限于Northern印迹或斑点印迹分析、逆转录酶-PCR(RT-PCR；例如定量RT-PCR)、原位杂交(例如，定量原位杂交)或核酸阵列(例如，寡核苷酸阵列或基因芯片)分析。此类方法的详细信息在例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual Second Edition vol.1,2and 3.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York,USA,Nov.1989；Gibson et al.(1999)Genome Res.,6(10):995-1001；和Zhang et al.(2005)Environ.Sci.Technol.,39(8):2777-2785；美国公开号2004086915；欧洲专利号0543942；和美国专利号7,101,663中；其中每个的公开内容均通过引用整体并入本文。蛋白质水平的倍数变化可以通过本领域已知的任何方法测量，包括但不限于Western印迹或斑点印迹分析、免疫组织化学(例如，定量免疫组织化学)、免疫细胞化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫吸附斑点(ELISPOT；Coligan,J.E.等编(1995)Current Protocols inImmunology.Wiley,New York)、放射免疫测定、化学发光免疫测定、电化学发光免疫测定、乳胶比浊免疫测定、乳胶光度免疫测定、免疫层析测定和抗体阵列分析(参见，例如，美国公开号2003/0013208和2004/171068，其中每个的公开内容通过引用整体并入本文)。上述许多方法的进一步描述和用于检测蛋白质表达的其他方法可以在例如Sambrook等人中找到。在一些实施方案中，活化的Tyro3⁺ NK细胞中标志物的细胞表面蛋白水平与对照(例如，未刺激的NK细胞、Tyro3^-细胞等)相比的倍数变化可以如“实施例”中所述通过流式细胞术确定感兴趣的标志物的平均荧光强度(MFI)来测量。

本公开的NK细胞是扩增的、有活性的并且具有针对肿瘤细胞，优选自体肿瘤细胞的细胞毒性表型。

如本文所用，术语“对照”指静息NK细胞、原代NK细胞、未刺激的NK细胞和/或Tyro3^- NK细胞，取决于上下文。

在本公开的内容中，具有“细胞毒性表型”的NK细胞涉及具有细胞毒性的细胞，即它们诱导其他细胞，诸如但不限于肿瘤细胞、病毒感染的细胞或以其他方式受损或功能失调的细胞的死亡。本公开的细胞毒性细胞主要对肿瘤细胞和病毒感染的细胞具有毒性。NK细胞对细胞的细胞毒性可以容易地测量，例如，通过在暴露于本公开的扩增的NK细胞之前和之后进行传统细胞计数。此类方法是本领域技术人员众所周知的。合适方法的示例是但不限于荧光细胞计数测定、免疫荧光细胞计数测定、铬-51释放测定、细胞存活力测定和基于流式细胞术的细胞毒性测定。

如本文所用，术语“细胞表面密度”是指特定蛋白质(例如Tyro3)在细胞(例如NK细胞)的外膜表面上的表面表达。细胞表面密度可以通过本领域已知的方法直接或间接测量，包括但不限于流式细胞术(Robins R.A.(1998)In:Pound J.D.(编)ImmunochemicalProtocols.Methods in Molecular Biology^TM,vol 80.Humana Press.；Donnenberg,V.S.,et al.Cytometry,93:803-810.doi:10.1002/cyto.a.23525)、超分辨率光学波动成像(Lukes T et al.,Nat Commun.2017；8:1731)、液体闪烁计数、荧光减法(fluorescencesubtraction)、荧光相关光谱学(Chen Y et al.,Chemistry.2009；15(21):5327–5336)等。当使用流式细胞术时，细胞表面密度可以如本领域已知的方法所述通过测量平均荧光强度来确定。参见例如Robins RA.Methods Mol Biol.1998；80:319-36和Moskalensky AE,etal.J Immunol Methods.2015 Mar；418:66-74。在某些情况下，获得几何平均荧光强度并将其转换为每种蛋白质或标志物的抗原密度，并在对数标尺上绘制。细胞表面上蛋白质或标志物的细胞表面密度也可以用直径为35nm的脂质包裹的荧光纳米金刚石作为生物标记物来确定，如Hsieh FJ,et al.Micromachines(Basel).2019；10(5):304所述。使用上述技术，可以获得膜表面上Tyro3的细胞表面密度范围。Tyro3细胞表面密度的范围可以为约10、约100、约1000、约10⁴、约10⁵、约10⁶或约10⁷个Tyro3抗原/细胞。

如本文所用，“组合物”是指本公开的扩增的NK细胞的制剂。组合物可以具有生理上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或其他成分，如IL-2或其他细胞因子或细胞群。此类组合物可以包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本公开的组合物可以包含a)NK细胞群，其中所述NK细胞扩增至治疗有效量；和b)一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。本公开的组合物中的NK细胞的施用可以是自体的或异种的。例如，NK细胞可以从一个受试者获得，并且施用于同一受试者或不同的、相容的受试者。本公开的组合物可以配制用于经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用本发明的治疗组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答性细胞的药物组合物)时，其将通常配制成单位剂量可注射形式(溶液、混悬剂、乳剂)。

通过过继性免疫疗法施用包含细胞的组合物的方法是本领域已知的并且包括诸如美国专利号4,844,893和4,690,915以及国际专利申请号PCT/US2014/018667中所示例的那些规程。

本公开的组合物可以以适合于待治疗的病况的方式施用。尽管合适的剂量可以通过临床试验来确定，施用的量和频率将由诸如有此需要的受试者的病况和受试者病况的类型和严重程度等因素来确定。用本公开的方法获得的扩增的NK细胞可以用于后续的治疗性或非治疗性应用。

NK细胞

自然杀伤(NK)细胞构成人外周血淋巴细胞的5％至20％，并且衍生自CD34⁺造血祖细胞。NK细胞具有大颗粒淋巴细胞的形态，并且在表型上由CD56的表达以及CD3和T细胞受体分子的缺乏来定义。NK细胞主要在直接的细胞毒性和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中发挥作用。NK细胞的功能由活化和抑制信号之间的平衡来调节。当遭遇正常细胞后，NK细胞识别它们的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子并诱导抑制信号以覆盖活化信号(Gasser S,and Raulet DH.Immunol Rev.2006；214:130-42)。比较而言，当NK细胞遭遇缺乏自身MHC I类分子的细胞时，它们经由多种机制(包括释放细胞毒性颗粒，如穿孔素和颗粒酶)发挥强烈的细胞毒性作用(Liao NS,et al.Science.1991；253(5016):199-202)。

NK细胞与自然杀伤T细胞(NKT)在表型、起源和各自的效应物功能方面有所不同；通常，NKT细胞活性通过分泌IFNγ促进NK细胞活性。与NKT细胞形成对比，NK细胞不表达T细胞抗原受体(TCR)或泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B细胞受体，但是它们通常在人中表达表面标志物CD 16(FcγRIII)和CD56。

NK细胞的扩增

用于治疗癌症的基于自然杀伤细胞的免疫疗法需要过继性转移大量活化的NK细胞。获得足够数量的活化NK细胞对于有效的基于NK细胞的免疫疗法很重要(Kweon S etal.,Front.Immunol.,24)April 2019)。

NK细胞可以通过用细胞因子的组合培养、通过向细胞培养基补充小分子(例如烟酰胺)以及通过细胞因子、抗体和饲养细胞的组合进行体外扩增。然而，基于细胞因子的NK细胞培养通常仅导致细胞数量的轻微增加，这不足以为多个患者或从小NK细胞亚群制造NK细胞产品。在这些方案中，NK细胞可能会在3周后停止生长，并且长时间的培养并不总是会导致更高的NK细胞数量。基于饲养细胞的NK细胞扩增方案生成更高的NK细胞数量。然而，需要能可预测地产生具有治疗价值的扩大数量的NK细胞的有效方案。本公开提供了新的基于胞啃作用的NK细胞体外扩增方法，该细胞从饲养细胞的表面获得Tyro3。本公开的方法可以用于生成足以在患者中临床应用扩增的NK细胞的NK细胞数量。

本公开的方法可以在与细胞培养物和扩增相容的任何容器中进行，例如烧瓶、试管、烧杯、皿、多孔板(例如，)、袋等。在特定的实施方案中，NK细胞与饲养细胞的共培养发生在袋中，例如，柔性、透气的碳氟化合物培养袋(例如，来自美国Fluoroseal)。在特定的实施方案中，其中培养NK细胞的容器适合于运输，例如，到诸如医院或军事区的场所，其中扩增的NK细胞被进一步扩增。

细胞系

本公开的新的细胞系是添加到NK细胞培养物中以支持NK细胞生存和/或生长的饲养细胞或供体细胞。本公开的饲养细胞有助于NK细胞的离体或体外扩增。饲养细胞提供完整并有功能的细胞外基质和基质相关因子，并且将已知和未知的细胞因子分泌到条件培养基中。饲养细胞通常受到生长阻滞以防止它们在培养物中增殖，但是它们的生存得以维持。可以通过用有效剂量的辐照或用有效剂量的化学品如丝裂霉素C处理来实现生长阻滞。在本公开的上下文中，在本文公开的方法中有用的饲养细胞包括但不限于癌细胞系(例如，慢性髓细胞性白血病(CML)细胞，如K562等)、成纤维细胞、干细胞(例如，干细胞)、血细胞(例如，同种异体或自体的经辐照或未经辐照的NK细胞消减的外周血单核细胞(PBMC))、基因工程化癌细胞系、通过天然感染有爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)而永生化的淋巴细胞等。优选地，饲养细胞是K562细胞。K562细胞可以通过基因工程化改造来表达某些配体，例如OX40配体(Kweon S et al.,Front.Immunol.,24April 2019)。表达膜结合IL-21和41-BB配体(APCK562)的K562细胞优选用于本公开的方法中。APC K562细胞系可以通过本领域已知的方法从市售的K562细胞中生成。在所公开的方法中有用的其他细胞系是K562-s(CRL3343^TM)、K562(/>CCL-243^TM)、K562-s(/>CRL-3344^TM)和美国专利号7435596、8026097、9623082和10463715中描述的细胞系，其中每个的公开内容通过引用整体并入本文。除了K562细胞外，其他细胞系如MHC I类阴性或低的细胞系(例如，人B淋巴母细胞系721.221、急性髓细胞性白血病-3(AML3)细胞系或黑色素瘤细胞(如缺乏MHC I类))也可以经修饰以表达膜结合IL-21和41-BB配体，用于本公开的方法。此类细胞系是本领域众所周知的。参见例如Dong W et al.,Cancer Discov.2019Oct；9(10):1422-1437和Porgador A,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1997 Nov 25；94(24):13140-5。

可以通过本领域已知的方法对本公开的任何饲养细胞进行工程化改造以外源性表达Tyro3。然后通过强制表达在饲养细胞中合成的Tyro3展示在饲养细胞表面上。在某些实施方案中，饲养细胞任选地通过辐照(例如，γ-辐照)或用抗有丝分裂剂如丝裂霉素C处理来灭活，以防止它们长得超过它们所支持的细胞，但允许合成支持NK细胞的重要因子。例如，可以以抑制饲养细胞增殖但允许合成支持NK细胞的重要因子的剂量辐照饲养细胞。

除了Tyro3、膜结合IL21和41-BBL之外，本公开的任何饲养细胞可以经工程化改造以表达CD64(FcγRI)、CD86(B7-2)和截短的CD19(tCD19)中的一种或多种。在一些实施方案中，饲养细胞表达膜结合IL15、可溶性IL15或IL15 sushi受体复合物。此类分子是本领域已知的。参见例如，Ye et al.Journal of Translational Medicine 2011,9:131；和Rushworth D.et al.,J Immunother.2014May；37(4):204–213；Suhoski MM,et al.MolTher.2007 May；15(5):981-8；Wei X,et al.J Immunol.2001 Jul 1；167(1):277-82；以及Hu,Q.,et al.Sci Rep 8,7675(2018)。这些基因和蛋白质的序列如下：CD64蛋白质序列：UniProtKB ID P12314(SEQ ID NO:28)。CD64核酸序列：NM_000566.3(SEQ ID NO:29)。CD86(B7-2)蛋白质序列：UniProtKB P42081(SEQ ID NO:30)。CD86(B7-2)核酸序列：NM_175862.4(SEQ ID NO:31)。tCD19蛋白序列：NP_001171569.1的氨基酸1-313(SEQ ID NO:32)。CD19核酸序列：NM_001178098.2的核酸序列(SEQ ID NO：33)，其代表SEQ ID NO:32的氨基酸1-313。IL15蛋白质序列：UniProtKB P40933(SEQ ID NO:34)。IL15核酸序列：NM_000585.4(SEQ ID NO:35)。

Tyro3

Tyro3属于TAM(Tyro3、Axl和Mertk)受体家族，该家族是受体酪氨酸激酶(RTK)组(Rothlin CV,Annu Rev Immunol.2015；33:355-91)。在造血细胞中，TAM受体主要由先天免疫系统的细胞，如巨噬细胞(Zagorska A,et al.Nat Immunol.2014；15(10):920-8)和DC(Carrera Silva EA,et al.Immunity.2013；39(1):160-70)表达。小鼠NK细胞具有高表达的TAM受体，而人NK细胞通过PCR方法仅产生微弱的Mer条带(Paolino M,etal.Nature.2014；507(7493):508-12；Park IK,et al.Blood.2009；113(11):2470-7)。值得注意的是，人NK细胞不内源性表达Tyro3，或仅表达微量的Tyro3。研究表明，Tyro3在不同类型的癌症中表达，并且在癌症进展中发挥重要作用。因此，TAM家族受体被认为是理想的治疗靶标(Chen D,et al.Aging(Albany NY).2020；12(3):2261-74；Tsai CL,et al.ClinCancer Res.2020；26(5):1185-97；Morimoto M,et al.Cancer Lett.2020；470:149-60)。

治疗方法

与本领域已知的方法相比，本文所述的方法可以用于产生扩增的Tyro3⁺NK细胞群。由于NK细胞的细胞毒性活性，由此产生的细胞可以用于治疗癌症和抑制肿瘤的增殖。例如，扩增的Tyro3⁺ NK细胞可以用于治疗范围广泛的癌症，包括但不限于肺癌、乳腺癌、尤文肉瘤、中枢神经系统赘生物、皮肤癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、肛门癌、胃癌、胃肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、脑干胶质瘤、垂体癌、肾上腺皮质癌、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、淋巴瘤、肝癌、肾癌、骨癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤。

本公开的细胞还可以用于治疗急性或慢性病毒感染，如由人类免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)和冠状病毒等引起的感染。在一个实施方案中，本公开的扩增的Tyro3⁺NK细胞可以用于治疗由SARS-CoV-2引起的COVID-19。

此外，Tyro3⁺ NK细胞可以表达抗肿瘤或抗病毒嵌合抗原受体(CAR-NK)。工程化NK细胞疗法(如基于Tyro3⁺ CAR-NK细胞的免疫疗法)可以用于癌症疗法或抗病毒疗法。例如，Tyro3⁺ CAR-NK细胞系疗法可以为复发性和难治性B细胞恶性肿瘤提供有利的治疗替代方案(Ochsner J.2019Fall；19(3):186–187.)。

在一些实施方案中，待使用本公开的方法扩增的NK细胞是CAR修饰的NK细胞，其中CAR对来自广泛靶标的任何一个靶标具有特异性，包括但不限于用于血液恶性肿瘤的CAR靶标如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CD123、Kappa、NKG2D配体、ROR1；用于实体瘤的CAR靶标如B7H3 CD44 v6/v7、CD171、CEA、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EphA2、ErbB2(HER2)、ErbB受体家族、ErbB3/4、HLA-A1/MAGE1、HLA-A2/NY-ESO-1、FR-α、FAP、FAR、GD2、GD3、HMW-MAA、IL11Rα、IL13Rα2、Lewis Y、间皮素、Muel、PSCA、HPB、PSMA、TAG72和VEGFR-2。此类靶标在本领域中是众所周知的。参见例如Dotti,et al.,Immunol Rev.2014January；257(1)；以及美国专利号US10765701、US10155038、US10577417、US10799536，其中每个的公开内容通过引用整体并入本文。

本公开的Tyro3⁺ NK细胞和Tyro3⁺ CAR-NK细胞可以作为免疫佐剂发挥作用，当与化疗等传统治疗组合时具有加强抗癌疗法的功效的能力(Hu Wet al.,FrontImmunol.2019；10:1205)。此外，本公开的NK细胞也可以用于产生应用于癌症疗法的细胞外囊泡(EV)。EV是具有抗肿瘤活性的纳米尺寸囊泡，其由NK细胞天然分泌并且提供无细胞的免疫疗法途径(Hu W et al.,Front Immunol.2019；10:1205)。

本公开的Tyro3⁺ NK细胞和Tyro3⁺ CAR-NK细胞可以单独施用或与其他癌症疗法(诸如但不限于外科手术、放射疗法和细胞毒性药物)组合使用。类似地，本公开的NK细胞可以单独施用或与其他抗病毒疗法组合使用。本公开的NK细胞可以在癌症疗法或抗病毒疗法之前、同时或之后施用。

本公开的扩增的Tyro3⁺ NK细胞和Tyro3⁺ CAR-NK细胞可以通过过继性细胞转移(ACT)施用于有此需要的受试者，其中NK细胞可以起源于同一受试者或不同受试者。此外，本公开的扩增的NK细胞可以用于如癌症和病毒感染的病况中的过继性免疫疗法。例如，自体性离体扩增的Tyro3⁺ NK细胞和Tyro3⁺ CAR-NK细胞可以防治性或治疗性地施用于正在经历针对疾病如多发性骨髓瘤的自体造血干细胞移植的患者，这些疾病在移植后通常预后不良且具有高发生率的疾病进展。供体来源的离体扩增的Tyro3⁺ NK细胞和Tyro3⁺ CAR-NK细胞可以用于治疗同种异体干细胞移植后复发的恶性疾病。自体性离体扩增的NK细胞可以防治性或治疗性地施用于正在经历针对癌症的自体干细胞移植的患者。其他示例包括使用自体性扩增的Tyro3⁺ NK细胞离体清除收获物中的恶性细胞，用于治疗患有血液恶性肿瘤的患者，以及作为实体瘤的细胞疗法。

还可以将本公开的扩增的NK细胞施用于患者以防止恶性疾病的复发。在一个例子中，样品(例如，来自外周血、骨髓或脐带)取自患有恶性疾病的患者。在一个实施方案中，患者已经接受常规癌症疗法治疗，但是治疗不成功或恶性肿瘤复发。方法也可以是防治性治疗，例如，以预防恶性疾病的复发。在用Tyro3⁺饲养细胞培养原代NK细胞之前，根据本领域众所周知的方法纯化和分离原代NK细胞。此后根据本公开和“实施例”中的方法离体或体外扩增细胞。随后，将扩增的细胞施用于患者。此后对患者进行仔细随访以确定患者是否对治疗响应良好并确定是否要重复治疗。例如，样品可以取自血液、骨髓和或尿液，以固定的时间间隔进行治疗随访。

在本公开的方法中，NK细胞离体扩增至少约1天、4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天或大于约28天。优选地，在施用于患者之前，NK细胞已经离体扩增约6-28天。在另一个实施方案中，在施用于患者之前，与扩增的第0天相比，NK细胞已经扩增至少约50倍至约50,000倍。

本公开的治疗方法可以进行一次或重复若干次。在一个实施方案中，根据需要将本公开的扩增的NK细胞施用于患者约1-10次，优选约1-7次，更优选约1-5次，并且最优选约1-3次。施用途径可以是本领域技术人员熟知的任何合适的施用方式，例如但不限于；静脉内、腹膜内和瘤内施用。剂量可以在所有施用中相同或例如在第一次施用中高，随后在后续施用中较低。疗法可以是单一疗法或与其他药剂的组合疗法。

本公开的扩增的NK细胞可以单独施用或者与IL-2或其衍生物、免疫调节药物(如沙利度胺)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)组合施用可以进一步提高所施用细胞的效果。

实施例

除非另有说明，否则本公开的方法和组合物的实践采用分子生物学(包括重组技术)、细胞培养、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些完全在本领域技术人员的技术范围内。此类技术在文献中有完整的解释，如，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”,second edition(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Animal Cell Culture”(Freshney,1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors forMammalian Cells”(Miller and Calos,1987)；“Current Protocols in MolecularBiology”(Ausubel,1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,1991)。这些技术适用于本公开的方法和组合物。对于特定实施例的特别有用的技术将在以下部分中讨论。以下材料、试剂和方法用于本文所述的实施例。

原代人NK细胞的分离和扩增

根据机构审查委员会批准的方案，从希望之城国家医疗中心血库获得血锥(bloodcones)，并使用RosetteSep^TM人NK细胞富集混合物(StemCell Technologies)和Ficoll-Paque(GE Healthcare)分离NK细胞。使用抗CD56(Beckman Coulter，Cat#B46024)和抗CD3(Miltenyi Biotec，Cat#130-113-134)抗体用流式细胞术确认原代NK细胞的纯度。分离的NK细胞直接用于实验，或者在IL-2(50IU/mL，NIH)存在下用表达mbIL-21和4-1BBL的K562饲养细胞(APC K562)(有或没有共表达Tyro3(APC K562^Tyro3))扩增后用于实验。使用前，将K562饲养细胞用丝裂霉素(10ug/mL)灭活达2小时。

细胞系

K562细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。Molm-13和U937细胞购自莱布尼茨研究所DSMZ。GP2-293包装细胞系购自Takara Bio。K562、Molm-13和Jurkat细胞系在含有10％热灭活FBS(Sigma-Aldrich)的RPMI中培养。GP2-293在补充有1％ GlutaMax和10％FBS的DMEM中培养。所有细胞均在37℃下在5％ CO₂加湿恒温箱中培养。在研究期间监测细胞形态和生长特征，并且与已发表的报道进行比较以确保它们的真实性。使用来自Lonza的MycoAlert支原体检测试剂盒常规检测所有细胞系是否存在支原体。实验中使用的所有细胞系均培养少于10代。

质粒，病毒产生和基因转导

为了生成逆转录病毒，将GP2-293细胞培养至70-80％的汇合度，然后通过使用Lipofectamine 3000试剂(Thermo Fisher Scientific)，用表达Tyro3、Tyro3融合EGFP、ED-Tyro3的pCIR逆转录病毒载体或GFP-空载体(GFP-EV)质粒与包膜质粒RD114或RD114TR进行转染。使用pCIR逆转录病毒载体(CytoImmune Therapeutics，CA)通过逆转录病毒构建系统构建质粒。对于逆转录病毒转导，根据制造商的方案进行了用RetroNectin(TakaraBio)的包被板。

实施例中所述的实验中使用的各种构建体具有以下序列：

Tyro3 DNA(SEQ ID NO:1):

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Tyro3蛋白(SEQ ID NO:2) (UniProtKB ID Q06418)：

/>

Tyro3-EGFP融合物DNA序列(SEQ ID NO:3)：

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Tyro3-EGFP蛋白质序列(SEQ ID NO:4)：

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ED-Tyro3 DNA序列(SEQ ID NO:5)：

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ED-Tyro3蛋白质序列(SEQ ID NO:6)：

PDGFRB跨膜结构域DNA序列(SEQ ID NO:7)：

PDGFRB跨膜结构域蛋白质序列(SEQ ID NO:8)：

膜结合IL-21和4-1BBL的蛋白质和核酸序列如下：IL-21蛋白质序列：UniProtKBID - Q9HBE4 (SEQ ID NO:23)。IL-21核酸序列：NM_001207006.3(SEQ ID NO:24)。4-1BBL(TNF超家族成员9)蛋白质序列：UniProtKB/Swiss-Prot: P41273 (SEQ ID NO:25)。4-1BBL核酸序列：NM_003811.4 (SEQ ID NO:26)。

在一些实施方案中，细胞系中使用的Tyro3序列是SEQ ID NO:2的氨基酸41-890。在一些实施方案中，细胞系中使用的膜结合IL21序列是SEQ ID NO:23的氨基酸25-162。在一些实施方案中，细胞系中使用的4-1BBL序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-28(细胞质结构域)、SEQ ID NO:25的氨基酸29-49(跨膜结构域)和/或SEQ ID NO:25的氨基酸50-254(细胞外结构域)中的至少一个。

在转染后48小时收获含有逆转录病毒的培养物上清液并过滤。使用含有病毒的上清液以感染细胞系，然后用标志物(如GFP)进行筛选，以建立转导的细胞系。对于基因转导，根据制造商的方案进行用于逆转录病毒感染的RetroNectin(Takara Bio)包被板。

Tyro3-敲除细胞系

使用购自Santa Cruz(Cat#sc-401412和sc-401412-HDR)的CRISPR/Cas9敲除质粒生成Tyro3敲除K562细胞，并根据制造商的说明使用。将K562细胞与同源定向DNA修复(HDR)质粒共转染，该质粒掺入红色荧光蛋白(RFP)以用于选择在基因组DNA中含有成功的Cas9诱导的位点特异性Tyro3敲除的细胞。然后用Aria Fusion对细胞进行单细胞分选。通过流式细胞术检查Tyro3的表达。

反转录-聚合酶链式反应

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从原代NK细胞中分离总RNA。互补DNA(cDNA)由莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(Invitrogen)生成，并通过qPCR用SYBR Green(ThermoFisher Scientific)和基因特异性引物或通过RT-PCR用Q5 PCR Master Mix(NEB)和基因特异性引物进行扩增。引物序列示于下表2中。相对扩增值相对于GAPDH和/或18S rRNA的扩增进行归一化。

表2：用于PCR的引物集

免疫印迹测定

将细胞收获并悬浮在RIPA裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中冰上达20分钟。等量的蛋白质通过5-15％ Criterion TGX凝胶(Bio-Rad)分离，然后转移到硝酸纤维素(NC)或PVDF膜(Thermo Fisher Scientific)上。将膜与一抗在4℃下温育过夜，并在室温下与IRDye二抗(Li-COR Biosciences)温育1小时。免疫印迹用Odyssey CLx Imager可视化。用Image J进行光密度分析以量化凝胶条带的强度。

51Cr-释放细胞毒性测定

⁵¹Cr细胞毒性测定如先前所述进行(Mrozek et al.,1996)。将原代NK细胞与K562细胞和IL-2(150IU/mL；NIH)共培养24小时，然后用FACSAria Fusion(BD Bioscience)分选Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞。纯化的Tyro3^-和Tyro3⁺ NK细胞与⁵¹Cr标记的K562细胞在96孔U型底板中以多种ET比率在37℃下5％ CO₂中一式三份共培养4小时。从每个孔中收获上清液并转移到96孔Luma板中，并使用Microbeta闪烁计数器(Wallac，PerkinElmer)进行分析。

脱粒测定

将原代NK细胞与K562细胞和IL-2(150IU/mL；NIH)共培养24小时，然后将NK细胞铺板于具有抗人CD107a抗体(BD Biosciences)和1mg/mL GolgiPlug(BD Biosciences)的96孔圆底板中温育4小时。然后用抗CD56抗体对细胞进行染色并通过流式细胞术进行分析。

流式细胞术

在使用Fortessa X 20流式细胞术(BD Biosciences)分析之前，将细胞在室温下用单克隆抗体染色20分钟并用FACS缓冲液清洗。对于IFN-γ细胞内流式细胞术分析，在细胞收获前添加1mg/mL GolgiPlug(BD Biosciences)达4小时。然后使用Cytofix/Cytoperm固定/透化溶液试剂盒(BD Biosciences)对细胞进行透化和固定。使用Flowjo V10软件(Tree Star，Ashland，OR，USA)分析数据。有关流式抗体的信息示于下表1中。

NSG异种移植模型

NOD-SCID-IL2Rγ–/–(NSG)小鼠购自杰克逊实验室并且饲养在希望之城动物设施处。将原代人NK细胞与在使用前由丝裂霉素(10ug/mL)灭活的APC K562细胞或APC K562^Tyro3细胞在IL-2(50IU/mL)存在下温育4天，然后用可溶性IL-15(sIL15)逆转录病毒转导达48小时，然后与灭活的APC K562细胞或APC K562^Tyro3细胞在IL-2(50IU/mL)存在下温育另外的7天，之后收获并冷冻用于小鼠注射。对于体内研究，在第0天，给小鼠静脉内(i.v.)注射1×10⁶个K562-荧光素酶(K562_Luc)细胞，然后用10×10⁶个上述用APC K562或APC K562^Tyro3扩增的sIL15NK细胞(APC K562_sIL15 NK或APC K562^Tyro3 sIL15 NK)进行i.v.处理。在第1天，用第2剂这些NK细胞对小鼠进行i.v.处理。在第9天和第14天进行生物发光成像。所有动物实验均经希望之城动物护理和使用委员会批准。

统计学分析

通过学生双尾t检验或配对t检验比较两个独立或配对组。使用单因素或双因素方差分析比较多个组。使用具有重复测量的线性混合模型或单因素方差分析模型来解释由于来自同一受试者的重复测量引起的方差-协方差结构。通过Tukey或Holm-Sidak规程调整用于多重比较的P值。认为0.05或更小的P值具有统计学显著性。GraphPad 9.1.0用于当前研究中的统计学分析。

表1：实施例中使用的抗体来源如下

实施例1：由Tyro3⁺肿瘤细胞快速诱导的原代人NK细胞上的Tyro3表达

为研究活化的NK细胞是否表达TAM家族受体，用不同的细胞因子(例如细胞因子IL-2)启动人原代NK细胞或容许NK细胞遭遇K562髓样白血病细胞系达24小时。流式细胞术分析表明，在遭遇K562细胞后，NK细胞主要表达Tyro3，但仅表达极少的Axl和Mertk(图1A)。然而，静息NK细胞在表面不表达任何TAM家族受体，并且当在不存在K562细胞的情况下用单一或组合的细胞因子启动NK细胞时，阴性表达没有改变(图7A)。接下来，当原代人NK细胞与K562细胞共培养时，在不同时间点测量Tyro3的表达。即使在与K562细胞共培养的5分钟内也可以在NK细胞上大量检测到Tyro3表达，并且在共温育15分钟后达到平台(图1C)。NK细胞表面上Tyro3的快速检测(可以发生在5分钟内)表明Tyro3的上调可能不依赖于基因转录和翻译过程。尽管单独的IL-2不能诱导NK细胞上的Tyro3表达(图1D和7A)，但在与用K562细胞温育但不用IL-2启动的静息NK细胞相比时，用IL-2首先启动NK的细胞在与K562细胞温育后表达更多的Tyro3(图1D和7B)。有趣的是，在与K562细胞温育1小时后，IL-2启动的CD56^亮NK细胞表达比IL-2启动的CD56^暗NK细胞更多的Tyro3(图1E)。这些结果表明，在遭遇K562细胞后，活化的NK细胞比静止的NK细胞表达更多的Tyro3。此外，在富集的NK细胞和高度纯化的(>97％)NK细胞之间K562诱导的Tyro3表达没有发现差异(图7C)。

接下来，流式细胞术分析显示K562和U937细胞系具有高Tyro3表达水平，而Molm-13和Jurkat细胞系几乎不表达Tyro3(图7D)。在NK细胞与不同肿瘤细胞系共培养后，在IL-2存在下NK细胞在与K562或U937细胞温育后比与Molm-13或Jurkat细胞温育表达更高水平的Tyro，表明肿瘤细胞中Tyro3表达水平与NK细胞中Tyro3诱导水平相关(图7E)。

NK细胞中Tyro3上调的机制通过测试Tyro3诱导是否需要直接细胞接触来确定。在transwell中温育的K562细胞不能诱导NK细胞上的Tyro3表达(图2A)。然后在来自单独的K562细胞的上清液中培养NK细胞，或用来自与NK细胞温育的K562细胞的上清液培养NK细胞。两组条件培养基均不能诱导NK细胞上的Tyro3表达(图2A-B)。这些数据表明，NK细胞与K562髓系白血病细胞之间的直接相互作用是诱导NK细胞上快速的Tyro3表达所必需的。

实施例2：由Tyro3⁺肿瘤细胞快速诱导的NK细胞上的Tyro3表达需要细胞-细胞接触

由于肿瘤细胞表面上的Tyro3表达水平与NK细胞中Tyro3的水平增加相关(图7D和7E)，因此通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑建立了Tyro3^-缺陷的K562细胞(K562^Tyro3-KO)(图8A)。当与K562^Tyro3-KO细胞共培养时，NK细胞上Tyro3表达的诱导失败(图2C)。另一方面，相比于与亲代Molm-13细胞共培养的NK细胞，与过表达Tyro3的Molm-13细胞(Molm-13^Tyro3 ^-OE)共培养的NK细胞上的Tyro3表达显著上调(图2D)，而NK细胞无法从过表达Tyro3的Jurkat细胞(Jurkat^Tyro3-OE)获得Tyro3(图8B)。由于供体细胞中的蛋白质表达水平似乎会影响转移的蛋白质的量，因此使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑规程生成了具有不同Tyro3敲除效率的不同K562细胞系。NK细胞中Tyro3表达的渐增速率与K562细胞的Tyro3表达水平呈正相关(r＝0.8703，p<0.001)(图2E)。此外，无论是否有IL-2启动，已从K562细胞获得Tyro3的NK细胞中有一半在已经纯化并与K562细胞分离8小时后不再展示它(图2F和8C)，这表明靶细胞的持续存在是维持NK细胞上Tyro3表达所需要的。有趣的是，无论是否有IL-2启动，CD56^亮NK细胞获得的Tyro3显示出比CD56^暗NK细胞获得的Tyro3更好的持久性(图2G和8C)，这与IL-2启动的CD56^亮NK细胞获得比CD56^暗细胞更多Tyro3的观察一致(图1E)。总的来说，这些结果证明Tyro3⁺肿瘤细胞对NK细胞上Tyro3表达的诱导快速发生并且需要细胞-细胞接触。

实施例3：Tyro3-EGFP融合蛋白可以经由胞啃作用从肿瘤细胞转移至人NK细胞

研究了Tyro3通过与肿瘤细胞的短期直接接触从肿瘤细胞转移到NK细胞的可视化。表达膜结合IL-21(mbIL-21)和4-1-BBL(APC K562)的K562细胞系通常用于体外扩增NK细胞。建立了APC K562细胞的临床级主细胞库和工作细胞库用于NK细胞扩增。流式细胞术分析显示APC K562细胞没有或具有低蛋白表达水平的Tyro3、Axl或Mertk，而亲代K562细胞表达所有这三种蛋白，其中Tyro3水平最高(图3A)。与此一致，未发现原代人NK细胞与APCK562细胞共温育诱导NK细胞上的Tyro3表达(图3B)。为了测试异位表达的Tyro3是否可以从APC K562细胞转移到NK细胞，用Tyro3-EGFP融合蛋白转导APC K562细胞，其中Tyro3的细胞内部分以G4S(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)接头(SEQ ID NO:27)紧跟在EGFP蛋白C端，(APCK562^Tyro3-EGFP)。在NK细胞与APC K562^Tyro3-EGFP细胞的共温育后，EGFP荧光以及Tyro3细胞外结构域从APC K562^Tyro3-EGFP细胞转移到原代人NK细胞，表明完整的蛋白质而不是蛋白质的一部分(如脱落的细胞外结构域)从肿瘤细胞转移到NK细胞(图3D)。

为了表明在与肿瘤细胞共温育后展示在NK细胞上的Tyro3不是内源性产生的，将Tyro3⁺ NK细胞和Tyro3^- NK细胞在不同时间点从与APC K562^Tyro3-EGFP细胞的共培养物中分选出来并通过PCR测量Tyro3的转录。所使用的一对引物(SEQ ID NO:17-18)是天然Tyro3mRNA特异性的，并且缺乏扩增衍生自转染的APC K562^Tyro3-EGFP细胞的Tyro3 mRNA的能力，而所使用的另一对引物(SEQ ID NO:19-20)是转染的APC K562^Tyro3-EGFP细胞特异性的，并且不能扩增天然Tyro3 mRNA。所使用的引物序列如上表2所示。

在与APC K562^Tyro3-EGFP细胞的共温育后，NK细胞展示细胞表面Tyro3(图3D)，但不展示Tyro3 mRNA，无论是内源性还是转导的Tyro3(图3E)。总的来说，这些数据表明NK细胞经由胞啃作用过程从K562髓系白血病细胞系获得Tyro3。

实施例4：经由胞啃作用获得Tyro3的NK亚群(Tyro3⁺ NK细胞)具备改善的效应物功能

研究了Tyro3⁺ NK细胞的功能。NK细胞活化后，CD107a和IFN-γ的NK细胞表达通常分别用作NK细胞脱粒和细胞因子产生的功能标志物。在NK细胞与K562细胞共培养24小时后，发现与Tyro3^- NK细胞相比，Tyro3⁺NK细胞中CD107a和IFN-γ的表达显著增加(图4A和4B)。与Tyro3^- NK细胞亚群相比，Tyro3⁺ NK细胞亚群中的IFN-γmRNA表达水平也显著增加(图4C)，而Tyro3⁺和Tyro3^- NK细胞亚群之间的颗粒酶B(GZMB)和穿孔素mRNA表达水平没有显著差异(图9A)。此外，与Tyro3^- NK细胞相比，即使在IL-2启动的NK细胞与K562细胞共培养4小时后，在Tyro3⁺ NK细胞中CD107a和IFN-γ的表达显著增加(图9B和9C)，GZMB而非穿孔素的蛋白质水平明显增加(图4D)。⁵¹Cr释放测定证实，与Tyro3^- NK细胞相比，Tyro3⁺NK细胞的细胞毒性水平显著增加(图4E)。这些结果进一步表明Tyro3⁺ NK细胞是高度活化的免疫效应细胞。总的来说，这些数据证明NK细胞在遭遇肿瘤细胞后获得Tyro3，并且与Tyro3^-NK细胞相比，Tyro3⁺ NK细胞具有更稳健的针对靶细胞的效应物功能。

实施例5：Tyro3⁺和Tyro3^- NK细胞上的表面标志物表达

由于NK细胞表面受体表达的变化在癌症中很常见(Nieto-Velazquez NG,etal.Transl Oncol.2016；9(5):384-91；Kono K,et al.Clin Cancer Res.1996；2(11):1825-8；Fauriat C,et al.Leukemia.2006；20(4):732-3)并且以上数据显示Tyro3⁺和Tyro3^- NK细胞可以具有不同的功能作用，使用流式细胞术评估了这两个不同NK细胞亚群上表面标志物的表达。NK细胞与K562细胞的共温育导致若干激活标志物CD25、CD69和TRAIL的表达增加，发现与Tyro3^- NK细胞和未刺激的NK细胞相比，这些标志物在Tyro3⁺ NK细胞上显著增加(图4F)，而其他活化受体如NKG2D和NKp30在Tyro3⁺和Tyro3^-NK细胞之间的表达没有显示出显著差异(图9D)。此外，与未刺激的NK细胞相比，CD62L表达在Tyro3⁺ NK细胞中维持，而在Tyro3^- NK细胞中降低。与Tyro3^- NK细胞亚群或未刺激的NK细胞相比，细胞成熟标志物CD94、NKp80和KLRG1在Tyro3⁺ NK细胞亚群中显示出表达增加，而抑制受体NKG2A在Tyro3⁺和Tyro3^- NK细胞亚群之间的表达没有显示出任何差异(图4F-4G和9E)。此外，NK细胞与K562细胞的共温育诱导了两种耗竭相关标志物Tim-3和TIGIT的表达，在Tyro3⁺ NK细胞中的表达水平显著高于Tyro3^- NK细胞(图4H)。

先前已经显示，在遭遇K562细胞后PD-L1在NK细胞上被诱导，表明NK细胞功能增强并防止细胞耗竭(Dong W,et al.Cancer discovery.2019；9(10):1422-37)。表面标志物表达数据显示，在NK细胞遭遇K562细胞达24小时后，与Tyro3^- NK细胞亚群相比，Tyro3⁺ NK细胞亚群中的PD-L1表达显著上调(图4I)。

实施例6：NK细胞从表达Tyro3的APC K562细胞获得Tyro3增强NK细胞离体扩增

在将NK细胞与亲代K562细胞温育24小时后，分选Tyro3⁺和Tyro3^-NK细胞，然后用APC K562细胞扩增，该APC K562细胞在IL-2(50IU/mL)存在下表达4-1BBL和mbIL-21。7天后，在与Tyro3^- NK细胞的扩增倍数相比时，Tyro3⁺ NK细胞的扩增倍数显著更高(图5A)。与Tyro3^- NK细胞相比，IL-2(150IU/mL)本身也增强了Tyro3⁺ NK细胞增殖(图5B)，表明Tyro3⁺NK细胞比Tyro3^- NK细胞对IL-2更具响应性。与未经工程化改造的亲代K562相比，APC K562在表面表达低得多的Tyro3(图3A)。通过用Tyro3或ED-Tyro3以逆转录病毒方式转导K562细胞制备稳定过表达全长Tyro3(APC K562^Tyro3)或具有PDGFRB跨膜结构域的Tyro3的细胞外结构域(APC K562^ED-Tyro3)的APC K562细胞系。由于灭活的APC K562细胞被用于扩增未经修饰的原代人NK细胞或工程化NK细胞(如CAR NK细胞)以用于临床用途，测试了原代人NK细胞从丝裂霉素灭活的APC K562细胞获得Tyro3的能力。实际上，观察到原代人NK细胞从灭活的APC K562^Tyro3细胞捕获Tyro3，这与从非灭活的APC K562^Tyro3细胞捕获相似(图10A)。与APCK562^Tyro3和IL-2共温育7天的NK细胞的扩增显著高于与APC K562和IL-2共温育7天的NK细胞的扩增(图5C)。在IL-2处理的情况下，用APC K562^Tyro3预温育的NK细胞比用APC K562预温育的那些NK细胞增殖显著更多(图5D)。

此外，与APC K562或APC K562^Tyro3共温育1小时后，将NK细胞与肿瘤细胞分离，然后通过免疫印迹法评估NK细胞中STAT5p-AKT和p-ERK的水平。与APC K562刺激相比，用APCK562^Tyro3刺激在NK细胞中STAT5、p-AKT和p-ERK的量增加得更多(图5E)。当NK细胞与APCK562^ED-Tyro3共培养1小时时，在NK细胞表面检测到Tyro3的表达(图5F)。然而，APC K562^ED ^-Tyro3并未显示出如用APC K562^Tyro3观察到的相同的对NK细胞扩增的益处(图5G)。在用APCK562^Tyro3扩增的NK细胞中，BrdU掺入DNA的百分比(图5H)和增殖率(图10B)显著高于那些用APC K562或APC K562^ED-Tyro3扩增的细胞，而这三个不同的扩增的NK细胞组之间的细胞凋亡或细胞存活不存在差异(图10C-10D)。接下来，生成了稳定过表达具有K550A突变(34)的激酶死亡全长Tyro3的APC K562细胞(APC K562^Tyro3_^K550A)。与APC K562^ED-Tyro3类似，APCK562^Tyro3_^K550A未显示出如用APC K562^Tyro3观察到的相同的对NK细胞扩增的益处(图5I)，而当NK细胞与APC K562^Tyro3_^K550A共培养时，在NK细胞的表面上检测到Tyro3的表达(图5J)。

总之，结果表明Tyro3经由胞啃作用转移到NK细胞可以起始信号传导以控制NK细胞活化。与先前的报道一致(Paolino M,et al.Nature.2014；507(7493):508-12)，无论存在或不存在IL-2，通过转导在NK细胞中过表达Tyro3都不增强NK细胞扩增(图10E)。

实施例7：相同数量的由K562饲养细胞扩增的NK细胞和它们表达Tyro3的对应物具有可比的体外和体内效应物功能

由于NK细胞从表达Tyro3的APC K562细胞获得Tyro3增强了NK细胞离体扩增，因此在体内和体外都评估了NK细胞功能。将原代人NK细胞与灭活的APC K562或APC K562^Tyro3在IL-2(50IU/mL)存在下温育7天，然后检测这些NK细胞上表面标志物的表达。关于NK细胞的活化表面标志物，CD16、DNAM-1、NKG2D、NKp30和NKp46的表达在APC K562^Tyro3和APC K562扩增的NK细胞之间没有显示出任何差异。由APC K562^Tyro3扩增的NK细胞比由APC K562扩增的NK细胞表达更高水平的CD25和CD62L但更低水平的CD69和NKp44(图6A)。还经由CD107a降解测定和⁵¹Cr细胞毒性评估评估了扩增的NK细胞的功能，并且数据显示用APC K562^Tyro3和APCK562扩增的NK细胞显示出相似水平的CD107a脱粒(图6B)和细胞毒性(图6C)。

接下来，研究了由APC K562^Tyro3扩增的NK细胞在体内控制肿瘤的能力，该研究是通过将表达荧光素酶的K562细胞植入NOD-SCID-IL2Rγ^–/–(NSG)小鼠，然后用或不用由APCK562或APC K562^Tyro3扩增的表达可溶性(s)IL-15的NK细胞(APC K562_sIL15 NK细胞或APCK562^Tyro3_sIL15 NK细胞)处理它们。发现APC K562^Tyro3_sIL15 NK细胞以与APC K562_sIL15NK细胞的水平相似的水平显著抑制肿瘤负荷，这是通过全身生物发光成像评估的(图6D)。因此，APC K562^Tyro3 sIL15 NK细胞在体外和体内展示出与APC K562_sIL15 NK细胞相似的功能。

最后，在体内研究了从肿瘤细胞到NK细胞的Tyro3胞啃作用的发生。出于此目的，将K562_Luc细胞植入NSG小鼠达14天，然后用sIL15 NK细胞处理，并且在处理后2天在不同的小鼠器官或组织中检测人NK细胞中的Tyro3表达。发现Tyro3在来自骨髓和肝脏的人NK细胞中高度表达，在脾脏中适度表达，但在小鼠的外周血中几乎不表达(图11A)。为了评估这些人NK细胞中的Tyro3是否是由于Tyro3基因的内源性表达，从小鼠的不同器官或组织中分选出人NK细胞，然后通过RT-PCR在mRNA水平上检测Tyro3。我们的数据显示Tyro3在这些人NK细胞中的内源性表达是检测不到的(图11B)，表明那些NK细胞上的Tyro3是经由胞啃作用从体内的K562_Luc细胞获得的。

其他实施方案

应当理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围。

序列表

<110> 希望之城公司

<120> 产生自然杀伤细胞的新的细胞系、方法及其用途

<130> 40056-0065WO1

<140>

<141>

<150> 63/219,760

<151> 2021-07-08

<150> 63/072,657

<151> 2020-08-31

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2673

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多核苷酸"

<400> 1

atggcgctga ggcggagcat ggggcggccg gggctcccgc cgctgccgct gccgccgcca 60

ccgcggctcg ggctgctgct ggcggctctg gcttctctgc tgctcccgga gtccgccgcc 120

gcaggtctga agctcatggg agccccggtg aagctgacag tgtctcaggg gcagccggtg 180

aagctcaact gcagtgtgga ggggatggag gagcctgaca tccagtgggt gaaggatggg 240

gctgtggtcc agaacttgga ccagttgtac atcccagtca gcgagcagca ctggatcggc 300

ttcctcagcc tgaagtcagt ggagcgctct gacgccggcc ggtactggtg ccaggtggag 360

gatgggggtg aaaccgagat ctcccagcca gtgtggctca cggtagaagg tgtgccattt 420

ttcacagtgg agccaaaaga tctggcagtg ccacccaatg cccctttcca actgtcttgt 480

gaggctgtgg gtccccctga acctgttacc attgtctggt ggagaggaac tacgaagatc 540

gggggacccg ctccctctcc atctgtttta aatgtaacag gggtgaccca gagcaccatg 600

ttttcctgtg aagctcacaa cctaaaaggc ctggcctctt ctcgcacagc cactgttcac 660

cttcaagcac tgcctgcagc ccccttcaac atcaccgtga caaagctttc cagcagcaac 720

gctagtgtgg cctggatgcc aggtgctgat ggccgagctc tgctacagtc ctgtacagtt 780

caggtgacac aggccccagg aggctgggaa gtcctggctg ttgtggtccc tgtgcccccc 840

tttacctgcc tgctccggga cctggtgcct gccaccaact acagcctcag ggtgcgctgt 900

gccaatgcct tggggccctc tccctatgct gactgggtgc cctttcagac caagggtcta 960

gccccagcca gcgctcccca aaacctccat gccatccgca cagattcagg cctcatcttg 1020

gagtgggaag aagtgatccc cgaggcccct ttggaaggcc ccctgggacc ctacaaactg 1080

tcctgggttc aagacaatgg aacccaggat gagctgacag tggaggggac cagggccaat 1140

ttgacaggct gggatcccca aaaggacctg atcgtacgtg tgtgcgtctc caatgcagtt 1200

ggctgtggac cctggagtca gccactggtg gtctcttctc atgaccgtgc aggccagcag 1260

ggccctcctc acagccgcac atcctgggta cctgtggtcc ttggtgtgct aacggccctg 1320

gtgacggctg ctgccctggc cctcatcctg cttcgaaaga gacggaaaga gacgcggttt 1380

gggcaagcct ttgacagtgt catggcccgg ggagagccag ccgttcactt ccgggcagcc 1440

cggtccttca atcgagaaag gcccgagcgc atcgaggcca cattggacag cttgggcatc 1500

agcgatgaac taaaggaaaa actggaggat gtgctcatcc cagagcagca gttcaccctg 1560

ggccggatgt tgggcaaagg agagtttggt tcagtgcggg aggcccagct gaagcaagag 1620

gatggctcct ttgtgaaagt ggctgtgaag atgctgaaag ctgacatcat tgcctcaagc 1680

gacattgaag agttcctcag ggaagcagct tgcatgaagg agtttgacca tccacacgtg 1740

gccaaacttg ttggggtaag cctccggagc agggctaaag gccgtctccc catccccatg 1800

gtcatcttgc ccttcatgaa gcatggggac ctgcatgcct tcctgctcgc ctcccggatt 1860

ggggagaacc cctttaacct acccctccag accctgatcc ggttcatggt ggacattgcc 1920

tgcggcatgg agtacctgag ctctcggaac ttcatccacc gagacctggc tgctcggaat 1980

tgcatgctgg cagaggacat gacagtgtgt gtggctgact tcggactctc ccggaagatc 2040

tacagtgggg actactatcg tcaaggctgt gcctccaaac tgcctgtcaa gtggctggcc 2100

ctggagagcc tggccgacaa cctgtatact gtgcagagtg acgtgtgggc gttcggggtg 2160

accatgtggg agatcatgac acgtgggcag acgccatatg ctggcatcga aaacgctgag 2220

atttacaact acctcattgg cgggaaccgc ctgaaacagc ctccggagtg tatggaggac 2280

gtgtatgatc tcatgtacca gtgctggagt gctgacccca agcagcgccc gagctttact 2340

tgtctgcgaa tggaactgga gaacatcttg ggccagctgt ctgtgctatc tgccagccag 2400

gaccccttat acatcaacat cgagagagct gaggagccca ctgcgggagg cagcctggag 2460

ctacctggca gggatcagcc ctacagtggg gctggggatg gcagtggcat gggggcagtg 2520

ggtggcactc ccagtgactg tcggtacata ctcacccccg gagggctggc tgagcagcca 2580

gggcaggcag agcaccagcc agagagtccc ctcaatgaga cacagaggct tttgctgctg 2640

cagcaagggc tactgccaca cagtagctgt tga 2673

<210> 2

<211> 890

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多肽"

<400> 2

Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Gly Arg Pro Gly Leu Pro Pro Leu Pro

1 5 10 15

Leu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser

20 25 30

Leu Leu Leu Pro Glu Ser Ala Ala Ala Gly Leu Lys Leu Met Gly Ala

35 40 45

Pro Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys

50 55 60

Ser Val Glu Gly Met Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly

65 70 75 80

Ala Val Val Gln Asn Leu Asp Gln Leu Tyr Ile Pro Val Ser Glu Gln

85 90 95

His Trp Ile Gly Phe Leu Ser Leu Lys Ser Val Glu Arg Ser Asp Ala

100 105 110

Gly Arg Tyr Trp Cys Gln Val Glu Asp Gly Gly Glu Thr Glu Ile Ser

115 120 125

Gln Pro Val Trp Leu Thr Val Glu Gly Val Pro Phe Phe Thr Val Glu

130 135 140

Pro Lys Asp Leu Ala Val Pro Pro Asn Ala Pro Phe Gln Leu Ser Cys

145 150 155 160

Glu Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Thr Ile Val Trp Trp Arg Gly

165 170 175

Thr Thr Lys Ile Gly Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Val Leu Asn Val

180 185 190

Thr Gly Val Thr Gln Ser Thr Met Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Leu

195 200 205

Lys Gly Leu Ala Ser Ser Arg Thr Ala Thr Val His Leu Gln Ala Leu

210 215 220

Pro Ala Ala Pro Phe Asn Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Ser Ser Asn

225 230 235 240

Ala Ser Val Ala Trp Met Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Leu Leu Gln

245 250 255

Ser Cys Thr Val Gln Val Thr Gln Ala Pro Gly Gly Trp Glu Val Leu

260 265 270

Ala Val Val Val Pro Val Pro Pro Phe Thr Cys Leu Leu Arg Asp Leu

275 280 285

Val Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Leu Arg Val Arg Cys Ala Asn Ala Leu

290 295 300

Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Asp Trp Val Pro Phe Gln Thr Lys Gly Leu

305 310 315 320

Ala Pro Ala Ser Ala Pro Gln Asn Leu His Ala Ile Arg Thr Asp Ser

325 330 335

Gly Leu Ile Leu Glu Trp Glu Glu Val Ile Pro Glu Ala Pro Leu Glu

340 345 350

Gly Pro Leu Gly Pro Tyr Lys Leu Ser Trp Val Gln Asp Asn Gly Thr

355 360 365

Gln Asp Glu Leu Thr Val Glu Gly Thr Arg Ala Asn Leu Thr Gly Trp

370 375 380

Asp Pro Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Val Cys Val Ser Asn Ala Val

385 390 395 400

Gly Cys Gly Pro Trp Ser Gln Pro Leu Val Val Ser Ser His Asp Arg

405 410 415

Ala Gly Gln Gln Gly Pro Pro His Ser Arg Thr Ser Trp Val Pro Val

420 425 430

Val Leu Gly Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu

435 440 445

Ile Leu Leu Arg Lys Arg Arg Lys Glu Thr Arg Phe Gly Gln Ala Phe

450 455 460

Asp Ser Val Met Ala Arg Gly Glu Pro Ala Val His Phe Arg Ala Ala

465 470 475 480

Arg Ser Phe Asn Arg Glu Arg Pro Glu Arg Ile Glu Ala Thr Leu Asp

485 490 495

Ser Leu Gly Ile Ser Asp Glu Leu Lys Glu Lys Leu Glu Asp Val Leu

500 505 510

Ile Pro Glu Gln Gln Phe Thr Leu Gly Arg Met Leu Gly Lys Gly Glu

515 520 525

Phe Gly Ser Val Arg Glu Ala Gln Leu Lys Gln Glu Asp Gly Ser Phe

530 535 540

Val Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ala Asp Ile Ile Ala Ser Ser

545 550 555 560

Asp Ile Glu Glu Phe Leu Arg Glu Ala Ala Cys Met Lys Glu Phe Asp

565 570 575

His Pro His Val Ala Lys Leu Val Gly Val Ser Leu Arg Ser Arg Ala

580 585 590

Lys Gly Arg Leu Pro Ile Pro Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His

595 600 605

Gly Asp Leu His Ala Phe Leu Leu Ala Ser Arg Ile Gly Glu Asn Pro

610 615 620

Phe Asn Leu Pro Leu Gln Thr Leu Ile Arg Phe Met Val Asp Ile Ala

625 630 635 640

Cys Gly Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Asn Phe Ile His Arg Asp Leu

645 650 655

Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Ala Glu Asp Met Thr Val Cys Val Ala

660 665 670

Asp Phe Gly Leu Ser Arg Lys Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln

675 680 685

Gly Cys Ala Ser Lys Leu Pro Val Lys Trp Leu Ala Leu Glu Ser Leu

690 695 700

Ala Asp Asn Leu Tyr Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val

705 710 715 720

Thr Met Trp Glu Ile Met Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Ala Gly Ile

725 730 735

Glu Asn Ala Glu Ile Tyr Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Asn Arg Leu Lys

740 745 750

Gln Pro Pro Glu Cys Met Glu Asp Val Tyr Asp Leu Met Tyr Gln Cys

755 760 765

Trp Ser Ala Asp Pro Lys Gln Arg Pro Ser Phe Thr Cys Leu Arg Met

770 775 780

Glu Leu Glu Asn Ile Leu Gly Gln Leu Ser Val Leu Ser Ala Ser Gln

785 790 795 800

Asp Pro Leu Tyr Ile Asn Ile Glu Arg Ala Glu Glu Pro Thr Ala Gly

805 810 815

Gly Ser Leu Glu Leu Pro Gly Arg Asp Gln Pro Tyr Ser Gly Ala Gly

820 825 830

Asp Gly Ser Gly Met Gly Ala Val Gly Gly Thr Pro Ser Asp Cys Arg

835 840 845

Tyr Ile Leu Thr Pro Gly Gly Leu Ala Glu Gln Pro Gly Gln Ala Glu

850 855 860

His Gln Pro Glu Ser Pro Leu Asn Glu Thr Gln Arg Leu Leu Leu Leu

865 870 875 880

Gln Gln Gly Leu Leu Pro His Ser Ser Cys

885 890

<210> 3

<211> 3414

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多核苷酸"

<400> 3

atggcgctga ggcggagcat ggggcggccg gggctcccgc cgctgccgct gccgccgcca 60

ccgcggctcg ggctgctgct ggcggctctg gcttctctgc tgctcccgga gtccgccgcc 120

gcaggtctga agctcatggg agccccggtg aagctgacag tgtctcaggg gcagccggtg 180

aagctcaact gcagtgtgga ggggatggag gagcctgaca tccagtgggt gaaggatggg 240

gctgtggtcc agaacttgga ccagttgtac atcccagtca gcgagcagca ctggatcggc 300

ttcctcagcc tgaagtcagt ggagcgctct gacgccggcc ggtactggtg ccaggtggag 360

gatgggggtg aaaccgagat ctcccagcca gtgtggctca cggtagaagg tgtgccattt 420

ttcacagtgg agccaaaaga tctggcagtg ccacccaatg cccctttcca actgtcttgt 480

gaggctgtgg gtccccctga acctgttacc attgtctggt ggagaggaac tacgaagatc 540

gggggacccg ctccctctcc atctgtttta aatgtaacag gggtgaccca gagcaccatg 600

ttttcctgtg aagctcacaa cctaaaaggc ctggcctctt ctcgcacagc cactgttcac 660

cttcaagcac tgcctgcagc ccccttcaac atcaccgtga caaagctttc cagcagcaac 720

gctagtgtgg cctggatgcc aggtgctgat ggccgagctc tgctacagtc ctgtacagtt 780

caggtgacac aggccccagg aggctgggaa gtcctggctg ttgtggtccc tgtgcccccc 840

tttacctgcc tgctccggga cctggtgcct gccaccaact acagcctcag ggtgcgctgt 900

gccaatgcct tggggccctc tccctatgct gactgggtgc cctttcagac caagggtcta 960

gccccagcca gcgctcccca aaacctccat gccatccgca cagattcagg cctcatcttg 1020

gagtgggaag aagtgatccc cgaggcccct ttggaaggcc ccctgggacc ctacaaactg 1080

tcctgggttc aagacaatgg aacccaggat gagctgacag tggaggggac cagggccaat 1140

ttgacaggct gggatcccca aaaggacctg atcgtacgtg tgtgcgtctc caatgcagtt 1200

ggctgtggac cctggagtca gccactggtg gtctcttctc atgaccgtgc aggccagcag 1260

ggccctcctc acagccgcac atcctgggta cctgtggtcc ttggtgtgct aacggccctg 1320

gtgacggctg ctgccctggc cctcatcctg cttcgaaaga gacggaaaga gacgcggttt 1380

gggcaagcct ttgacagtgt catggcccgg ggagagccag ccgttcactt ccgggcagcc 1440

cggtccttca atcgagaaag gcccgagcgc atcgaggcca cattggacag cttgggcatc 1500

agcgatgaac taaaggaaaa actggaggat gtgctcatcc cagagcagca gttcaccctg 1560

ggccggatgt tgggcaaagg agagtttggt tcagtgcggg aggcccagct gaagcaagag 1620

gatggctcct ttgtgaaagt ggctgtgaag atgctgaaag ctgacatcat tgcctcaagc 1680

gacattgaag agttcctcag ggaagcagct tgcatgaagg agtttgacca tccacacgtg 1740

gccaaacttg ttggggtaag cctccggagc agggctaaag gccgtctccc catccccatg 1800

gtcatcttgc ccttcatgaa gcatggggac ctgcatgcct tcctgctcgc ctcccggatt 1860

ggggagaacc cctttaacct acccctccag accctgatcc ggttcatggt ggacattgcc 1920

tgcggcatgg agtacctgag ctctcggaac ttcatccacc gagacctggc tgctcggaat 1980

tgcatgctgg cagaggacat gacagtgtgt gtggctgact tcggactctc ccggaagatc 2040

tacagtgggg actactatcg tcaaggctgt gcctccaaac tgcctgtcaa gtggctggcc 2100

ctggagagcc tggccgacaa cctgtatact gtgcagagtg acgtgtgggc gttcggggtg 2160

accatgtggg agatcatgac acgtgggcag acgccatatg ctggcatcga aaacgctgag 2220

atttacaact acctcattgg cgggaaccgc ctgaaacagc ctccggagtg tatggaggac 2280

gtgtatgatc tcatgtacca gtgctggagt gctgacccca agcagcgccc gagctttact 2340

tgtctgcgaa tggaactgga gaacatcttg ggccagctgt ctgtgctatc tgccagccag 2400

gaccccttat acatcaacat cgagagagct gaggagccca ctgcgggagg cagcctggag 2460

ctacctggca gggatcagcc ctacagtggg gctggggatg gcagtggcat gggggcagtg 2520

ggtggcactc ccagtgactg tcggtacata ctcacccccg gagggctggc tgagcagcca 2580

gggcaggcag agcaccagcc agagagtccc ctcaatgaga cacagaggct tttgctgctg 2640

cagcaagggc tactgccaca cagtagctgt ggaggaggag gaagtgcggc cgccatggtg 2700

agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 2760

gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 2820

ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 2880

accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 2940

gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 3000

gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 3060

cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 3120

gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 3180

aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 3240

taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 3300

agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 3360

gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaa 3414

<210> 4

<211> 1137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多肽"

<400> 4

Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Gly Arg Pro Gly Leu Pro Pro Leu Pro

1 5 10 15

Leu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser

20 25 30

Leu Leu Leu Pro Glu Ser Ala Ala Ala Gly Leu Lys Leu Met Gly Ala

35 40 45

Pro Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys

50 55 60

Ser Val Glu Gly Met Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly

65 70 75 80

Ala Val Val Gln Asn Leu Asp Gln Leu Tyr Ile Pro Val Ser Glu Gln

85 90 95

His Trp Ile Gly Phe Leu Ser Leu Lys Ser Val Glu Arg Ser Asp Ala

100 105 110

Gly Arg Tyr Trp Cys Gln Val Glu Asp Gly Gly Glu Thr Glu Ile Ser

115 120 125

Gln Pro Val Trp Leu Thr Val Glu Gly Val Pro Phe Phe Thr Val Glu

130 135 140

Pro Lys Asp Leu Ala Val Pro Pro Asn Ala Pro Phe Gln Leu Ser Cys

145 150 155 160

Glu Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Thr Ile Val Trp Trp Arg Gly

165 170 175

Thr Thr Lys Ile Gly Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Val Leu Asn Val

180 185 190

Thr Gly Val Thr Gln Ser Thr Met Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Leu

195 200 205

Lys Gly Leu Ala Ser Ser Arg Thr Ala Thr Val His Leu Gln Ala Leu

210 215 220

Pro Ala Ala Pro Phe Asn Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Ser Ser Asn

225 230 235 240

Ala Ser Val Ala Trp Met Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Leu Leu Gln

245 250 255

Ser Cys Thr Val Gln Val Thr Gln Ala Pro Gly Gly Trp Glu Val Leu

260 265 270

Ala Val Val Val Pro Val Pro Pro Phe Thr Cys Leu Leu Arg Asp Leu

275 280 285

Val Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Leu Arg Val Arg Cys Ala Asn Ala Leu

290 295 300

Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Asp Trp Val Pro Phe Gln Thr Lys Gly Leu

305 310 315 320

Ala Pro Ala Ser Ala Pro Gln Asn Leu His Ala Ile Arg Thr Asp Ser

325 330 335

Gly Leu Ile Leu Glu Trp Glu Glu Val Ile Pro Glu Ala Pro Leu Glu

340 345 350

Gly Pro Leu Gly Pro Tyr Lys Leu Ser Trp Val Gln Asp Asn Gly Thr

355 360 365

Gln Asp Glu Leu Thr Val Glu Gly Thr Arg Ala Asn Leu Thr Gly Trp

370 375 380

Asp Pro Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Val Cys Val Ser Asn Ala Val

385 390 395 400

Gly Cys Gly Pro Trp Ser Gln Pro Leu Val Val Ser Ser His Asp Arg

405 410 415

Ala Gly Gln Gln Gly Pro Pro His Ser Arg Thr Ser Trp Val Pro Val

420 425 430

Val Leu Gly Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu

435 440 445

Ile Leu Leu Arg Lys Arg Arg Lys Glu Thr Arg Phe Gly Gln Ala Phe

450 455 460

Asp Ser Val Met Ala Arg Gly Glu Pro Ala Val His Phe Arg Ala Ala

465 470 475 480

Arg Ser Phe Asn Arg Glu Arg Pro Glu Arg Ile Glu Ala Thr Leu Asp

485 490 495

Ser Leu Gly Ile Ser Asp Glu Leu Lys Glu Lys Leu Glu Asp Val Leu

500 505 510

Ile Pro Glu Gln Gln Phe Thr Leu Gly Arg Met Leu Gly Lys Gly Glu

515 520 525

Phe Gly Ser Val Arg Glu Ala Gln Leu Lys Gln Glu Asp Gly Ser Phe

530 535 540

Val Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ala Asp Ile Ile Ala Ser Ser

545 550 555 560

Asp Ile Glu Glu Phe Leu Arg Glu Ala Ala Cys Met Lys Glu Phe Asp

565 570 575

His Pro His Val Ala Lys Leu Val Gly Val Ser Leu Arg Ser Arg Ala

580 585 590

Lys Gly Arg Leu Pro Ile Pro Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His

595 600 605

Gly Asp Leu His Ala Phe Leu Leu Ala Ser Arg Ile Gly Glu Asn Pro

610 615 620

Phe Asn Leu Pro Leu Gln Thr Leu Ile Arg Phe Met Val Asp Ile Ala

625 630 635 640

Cys Gly Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Asn Phe Ile His Arg Asp Leu

645 650 655

Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Ala Glu Asp Met Thr Val Cys Val Ala

660 665 670

Asp Phe Gly Leu Ser Arg Lys Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln

675 680 685

Gly Cys Ala Ser Lys Leu Pro Val Lys Trp Leu Ala Leu Glu Ser Leu

690 695 700

Ala Asp Asn Leu Tyr Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val

705 710 715 720

Thr Met Trp Glu Ile Met Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Ala Gly Ile

725 730 735

Glu Asn Ala Glu Ile Tyr Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Asn Arg Leu Lys

740 745 750

Gln Pro Pro Glu Cys Met Glu Asp Val Tyr Asp Leu Met Tyr Gln Cys

755 760 765

Trp Ser Ala Asp Pro Lys Gln Arg Pro Ser Phe Thr Cys Leu Arg Met

770 775 780

Glu Leu Glu Asn Ile Leu Gly Gln Leu Ser Val Leu Ser Ala Ser Gln

785 790 795 800

Asp Pro Leu Tyr Ile Asn Ile Glu Arg Ala Glu Glu Pro Thr Ala Gly

805 810 815

Gly Ser Leu Glu Leu Pro Gly Arg Asp Gln Pro Tyr Ser Gly Ala Gly

820 825 830

Asp Gly Ser Gly Met Gly Ala Val Gly Gly Thr Pro Ser Asp Cys Arg

835 840 845

Tyr Ile Leu Thr Pro Gly Gly Leu Ala Glu Gln Pro Gly Gln Ala Glu

850 855 860

His Gln Pro Glu Ser Pro Leu Asn Glu Thr Gln Arg Leu Leu Leu Leu

865 870 875 880

Gln Gln Gly Leu Leu Pro His Ser Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ala

885 890 895

Ala Ala Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro

900 905 910

Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val

915 920 925

Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys

930 935 940

Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val

945 950 955 960

Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His

965 970 975

Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val

980 985 990

Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg

995 1000 1005

Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu

1010 1015 1020

Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

1025 1030 1035

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala

1040 1045 1050

Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His

1055 1060 1065

Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln

1070 1075 1080

Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His

1085 1090 1095

Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

1100 1105 1110

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile

1115 1120 1125

Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

1130 1135

<210> 5

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多核苷酸"

<400> 5

atggcgctga ggcggagcat ggggcggccg gggctcccgc cgctgccgct gccgccgcca 60

ccgcggctcg ggctgctgct ggcggctctg gcttctctgc tgctcccgga gtccgccgcc 120

gcaggtctga agctcatggg agccccggtg aagctgacag tgtctcaggg gcagccggtg 180

aagctcaact gcagtgtgga ggggatggag gagcctgaca tccagtgggt gaaggatggg 240

gctgtggtcc agaacttgga ccagttgtac atcccagtca gcgagcagca ctggatcggc 300

ttcctcagcc tgaagtcagt ggagcgctct gacgccggcc ggtactggtg ccaggtggag 360

gatgggggtg aaaccgagat ctcccagcca gtgtggctca cggtagaagg tgtgccattt 420

ttcacagtgg agccaaaaga tctggcagtg ccacccaatg cccctttcca actgtcttgt 480

gaggctgtgg gtccccctga acctgttacc attgtctggt ggagaggaac tacgaagatc 540

gggggacccg ctccctctcc atctgtttta aatgtaacag gggtgaccca gagcaccatg 600

ttttcctgtg aagctcacaa cctaaaaggc ctggcctctt ctcgcacagc cactgttcac 660

cttcaagcac tgcctgcagc ccccttcaac atcaccgtga caaagctttc cagcagcaac 720

gctagtgtgg cctggatgcc aggtgctgat ggccgagctc tgctacagtc ctgtacagtt 780

caggtgacac aggccccagg aggctgggaa gtcctggctg ttgtggtccc tgtgcccccc 840

tttacctgcc tgctccggga cctggtgcct gccaccaact acagcctcag ggtgcgctgt 900

gccaatgcct tggggccctc tccctatgct gactgggtgc cctttcagac caagggtcta 960

gccccagcca gcgctcccca aaacctccat gccatccgca cagattcagg cctcatcttg 1020

gagtgggaag aagtgatccc cgaggcccct ttggaaggcc ccctgggacc ctacaaactg 1080

tcctgggttc aagacaatgg aacccaggat gagctgacag tggaggggac cagggccaat 1140

ttgacaggct gggatcccca aaaggacctg atcgtacgtg tgtgcgtctc caatgcagtt 1200

ggctgtggac cctggagtca gccactggtg gtctcttctc atgaccgtgc aggccagcag 1260

ggccctcctc acagccgcac atcctgg 1287

<210> 6

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多肽"

<400> 6

Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Gly Arg Pro Gly Leu Pro Pro Leu Pro

1 5 10 15

Leu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser

20 25 30

Leu Leu Leu Pro Glu Ser Ala Ala Ala Gly Leu Lys Leu Met Gly Ala

35 40 45

Pro Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys

50 55 60

Ser Val Glu Gly Met Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly

65 70 75 80

Ala Val Val Gln Asn Leu Asp Gln Leu Tyr Ile Pro Val Ser Glu Gln

85 90 95

His Trp Ile Gly Phe Leu Ser Leu Lys Ser Val Glu Arg Ser Asp Ala

100 105 110

Gly Arg Tyr Trp Cys Gln Val Glu Asp Gly Gly Glu Thr Glu Ile Ser

115 120 125

Gln Pro Val Trp Leu Thr Val Glu Gly Val Pro Phe Phe Thr Val Glu

130 135 140

Pro Lys Asp Leu Ala Val Pro Pro Asn Ala Pro Phe Gln Leu Ser Cys

145 150 155 160

Glu Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Thr Ile Val Trp Trp Arg Gly

165 170 175

Thr Thr Lys Ile Gly Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Val Leu Asn Val

180 185 190

Thr Gly Val Thr Gln Ser Thr Met Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Leu

195 200 205

Lys Gly Leu Ala Ser Ser Arg Thr Ala Thr Val His Leu Gln Ala Leu

210 215 220

Pro Ala Ala Pro Phe Asn Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Ser Ser Asn

225 230 235 240

Ala Ser Val Ala Trp Met Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Leu Leu Gln

245 250 255

Ser Cys Thr Val Gln Val Thr Gln Ala Pro Gly Gly Trp Glu Val Leu

260 265 270

Ala Val Val Val Pro Val Pro Pro Phe Thr Cys Leu Leu Arg Asp Leu

275 280 285

Val Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Leu Arg Val Arg Cys Ala Asn Ala Leu

290 295 300

Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Asp Trp Val Pro Phe Gln Thr Lys Gly Leu

305 310 315 320

Ala Pro Ala Ser Ala Pro Gln Asn Leu His Ala Ile Arg Thr Asp Ser

325 330 335

Gly Leu Ile Leu Glu Trp Glu Glu Val Ile Pro Glu Ala Pro Leu Glu

340 345 350

Gly Pro Leu Gly Pro Tyr Lys Leu Ser Trp Val Gln Asp Asn Gly Thr

355 360 365

Gln Asp Glu Leu Thr Val Glu Gly Thr Arg Ala Asn Leu Thr Gly Trp

370 375 380

Asp Pro Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Val Cys Val Ser Asn Ala Val

385 390 395 400

Gly Cys Gly Pro Trp Ser Gln Pro Leu Val Val Ser Ser His Asp Arg

405 410 415

Ala Gly Gln Gln Gly Pro Pro His Ser Arg Thr Ser Trp

420 425

<210> 7

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多核苷酸"

<400> 7

gctgtgggcc aggacacgca ggaggtcatc gtggtgccac actccttgcc ctttaaggtg 60

gtggtgatct cagccatcct ggccctggtg gtgctcacca tcatctccct tatcatcctc 120

atcatgcttt ggcagaagaa gccacgt 147

<210> 8

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的多肽"

<400> 8

Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu

1 5 10 15

Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu

20 25 30

Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro

35 40 45

Arg

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 9

ctaattattc ggtaactgac ttga 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 10

acagttcagc catcacttgg a 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 11

tgggggaccc agagattaaa a 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 12

tttcgtccat aggagacaat gc 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 13

cgcctacctc aggcttatct c 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 14

cctcgacagt caggcagtc 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 15

tgcatggccg ttcttagttg 20

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 16

agttagcatg ccagagtctc gtt 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 17

cagtgactgt cggtacatac tc 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 18

catcaagcca aggcctaaac 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 19

cagtgactgt cggtacatac tc 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 20

ctgaacttgt ggccgtttac 20

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 21

atggggaagg tgaaggtcgg agtcaa 26

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的引物"

<400> 22

cggaggggcc atccacagtc ttct 24

<210> 23

<211> 162

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met

1 5 10 15

Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln

20 25 30

Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln

35 40 45

Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro

50 55 60

Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln

65 70 75 80

Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile

85 90 95

Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala

100 105 110

Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr

115 120 125

Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu

130 135 140

Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asp Ser

<210> 24

<211> 716

<212> DNA

<213> 智人

<400> 24

ctcagtcaag ctgaagtgaa aacgagacca aggtctagct ctactgttgg tacttatgag 60

atccagtcct ggcaacatgg agaggattgt catctgtctg atggtcatct tcttggggac 120

actggtccac aaatcaagct cccaaggtca agatcgccac atgattagaa tgcgtcaact 180

tatagatatt gttgatcagc tgaaaaatta tgtgaatgac ttggtccctg aatttctgcc 240

agctccagaa gatgtagaga caaactgtga gtggtcagct ttttcctgct ttcagaaggc 300

ccaactaaag tcagcaaata caggaaacaa tgaaaggata atcaatgtat caattaaaaa 360

gctgaagagg aaaccacctt ccacaaatgc agggagaaga cagaaacaca gactaacatg 420

cccttcatgt gattcttatg agaaaaaacc acccaaagaa ttcctagaaa gattcaaatc 480

acttctccaa aaggtatcta ccttaagttt catttgattt tctgctttat ctttacctat 540

ccagatttgc ttcttagtta ctcacggtat actatttcca cagatgattc atcagcatct 600

gtcctctaga acacacggaa gtgaagattc ctgaggatct aacttgcagt tggacactat 660

gttacatact ctaatatagt agtgaaagtc atttctttgt attccaagtg gaggag 716

<210> 25

<211> 254

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 26

<211> 1634

<212> DNA

<213> 智人

<400> 26

agtctctcgt catggaatac gcctctgacg cttcactgga ccccgaagcc ccgtggcctc 60

ccgcgccccg cgctcgcgcc tgccgcgtac tgccttgggc cctggtcgcg gggctgctgc 120

tgctgctgct gctcgctgcc gcctgcgccg tcttcctcgc ctgcccctgg gccgtgtccg 180

gggctcgcgc ctcgcccggc tccgcggcca gcccgagact ccgcgagggt cccgagcttt 240

cgcccgacga tcccgccggc ctcttggacc tgcggcaggg catgtttgcg cagctggtgg 300

cccaaaatgt tctgctgatc gatgggcccc tgagctggta cagtgaccca ggcctggcag 360

gcgtgtccct gacggggggc ctgagctaca aagaggacac gaaggagctg gtggtggcca 420

aggctggagt ctactatgtc ttctttcaac tagagctgcg gcgcgtggtg gccggcgagg 480

gctcaggctc cgtttcactt gcgctgcacc tgcagccact gcgctctgct gctggggccg 540

ccgccctggc tttgaccgtg gacctgccac ccgcctcctc cgaggctcgg aactcggcct 600

tcggtttcca gggccgcttg ctgcacctga gtgccggcca gcgcctgggc gtccatcttc 660

acactgaggc cagggcacgc catgcctggc agcttaccca gggcgccaca gtcttgggac 720

tcttccgggt gacccccgaa atcccagccg gactcccttc accgaggtcg gaataacgtc 780

cagcctgggt gcagcccacc tggacagagt ccgaatccta ctccatcctt catggagacc 840

cctggtgctg ggtccctgct gctttctcta cctcaagggg cttggcaggg gtccctgctg 900

ctgacctccc cttgaggacc ctcctcaccc actccttccc caagttggac cttgatattt 960

attctgagcc tgagctcaga taatatatta tatatattat atatatatat atatttctat 1020

ttaaagagga tcctgagttt gtgaatggac ttttttagag gagttgtttt gggggggggg 1080

gggtcttcga cattgccgag gctggtcttg aactcctgga cttagacgat cctcctgcct 1140

cagcctccca agcaactggg attcatcctt tctattaatt cattgtactt atttgcttat 1200

ttgtgtgtat tgagcatctg taatgtgcca gcattgtgcc caggctaggg ggctatagaa 1260

acatctagaa atagactgaa agaaaatctg agttatggta atacgtgagg aatttaaaga 1320

ctcatcccca gcctccacct cctgtgtgat acttgggggc tagctttttt ctttctttct 1380

tttttttgag atggtcttgt tctgtcaacc aggctagaat gcagcggtgc aatcatgagt 1440

caatgcagcc tccagcctcg acctcccgag gctcaggtga tcctcccatc tcagcctctc 1500

gagtagctgg gaccacagtt gtgtgccacc acacttggct aactttttaa tttttttgcg 1560

gagacggtat tgctatgttg ccaaggttgt ttacatgcca gtacaattta taataaacac 1620

tcatttttcc tccc 1634

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列描述: 合成的肽"

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.经修饰的K562髓系白血病细胞(Tyro3⁺K562细胞)，所述细胞表达包含与SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列的人Tyro3多肽，并且其中所述Tyro3⁺K562细胞表达膜结合白细胞介素21(IL-21)和4-1BB配体(4-1BBL)。

2.权利要求1的Tyro3⁺K562细胞，其中与不表达外源性人Tyro3的K562细胞(Tyro3^-K562细胞)相比，所述Tyro3⁺K562细胞使接触所述K562细胞的人自然杀伤(NK)细胞的扩增增强了至少约10％。

3.权利要求1或2的Tyro3⁺K562细胞，其中所述人Tyro3表达处于强启动子的控制之下。

4.权利要求3的Tyro3⁺K562细胞，其中所述强启动子是逆转录病毒启动子。

5.扩增人NK细胞群的方法，所述方法包括共培养所述NK细胞群与K562髓系白血病细胞，其中所述K562细胞(Tyro3⁺K562细胞)经修饰以外源性表达人Tyro3多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列，其中所述人Tyro3表达处于组成型启动子的控制之下，并且其中所述K562细胞表达膜结合白细胞介素21(IL-21)和4-1BB配体(4-1BBL)。

6.权利要求5的方法，其中Tyro3通过胞啃作用从所述Tyro3⁺K562细胞转移至所述人NK细胞以获得Tyro3⁺NK细胞。

7.权利要求5的方法，其中所述人NK细胞在白细胞介素2(IL-2)的存在下扩增。

8.权利要求5的方法，其中人NK细胞与K562细胞的比率在约0.1:1至约10:1的范围内。

9.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述NK细胞和所述K562细胞共培养约5分钟至约6周的持续时间。

10.权利要求7的方法，其中所述IL-2以约0IU/mL至约5000IU/mL的浓度存在。

11.权利要求7的方法，其中所述IL-2以约50IU/mL至约2000IU/mL的浓度存在。

12.权利要求7的方法，其中所述IL-2以约150IU/mL至约900IU/mL的浓度存在。

13.权利要求5的方法，其中所述扩增的NK细胞是活化NK细胞。

14.权利要求5的方法，其中所述NK细胞是工程化NK细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述工程化NK细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。

16.权利要求15的方法，其中所述工程化NK细胞中表达的所述嵌合抗原受体(CAR)选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CD123、Kappa、NKG2D配体、ROR1；用于实体瘤的CAR靶标如B7H3 CD44 v6/v7、CD171、CEA、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EphA2、ErbB2(HER2)、ErbB受体家族、ErbB3/4、HLA-A1/MAGE1、HLA-A2/NY-ESO-1、FR-α、FAP、FAR、GD2、GD3、HMW-MAA、IL11Rα、IL13Rα2、Lewis Y、间皮素、Muel、PSCA、HPB、PSMA、TAG72和VEGFR-2。

17.权利要求5-16中任一项的方法，其中所述扩增的NK细胞是程序性死亡配体1(PD-L1)⁺细胞。

18.权利要求5-17中任一项的方法，其中所述扩增的NK细胞具有以下至少一项：

(a)当与对照中相应mRNA和/或蛋白质的参考水平相比时，以下标志物中的一种或多种的较高水平的mRNA和/或蛋白质：磷酸化信号转导物及转录激活子3(p-STAT3)、磷酸化-NF-κB p65(p-P65)、磷酸化-Akt(p-AKT)和磷酸化细胞外信号相关激酶(p-ERK)、干扰素-γ(IFNγ)、分化簇107a(CD107a)、CD25、CD69、杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1(KLRG1)；以及

(b)当与对照中相应活性的参考水平相比时，以下标志物中的一种或多种的较高水平的活性：p-STAT3、p-P65、p-AKT、p-ERK、IFNγ、CD107a、CD25、CD69和KLRG1。

19.权利要求5-17中任一项的方法，其中所述扩增的NK细胞具有以下至少一项：

(a)当与对照中相应mRNA和/或蛋白质的参考水平相比时，以下标志物中的一种或多种的较高水平的mRNA和/或蛋白质：磷酸化信号转导物及转录激活子5(p-STAT5)、磷酸化-Akt(p-AKT)和磷酸化细胞外信号相关激酶(p-ERK)、干扰素-γ(IFNγ)、分化簇107a(CD107a)、CD25、CD69、杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1(KLRG1)；以及

20.组合物，所述组合物包含由权利要求5-19中任一项所述的方法产生的扩增的NK细胞的群体。

21.组合物，所述组合物包含扩增的NK细胞，其中群体中的所述NK细胞的至少20％是Tyro3⁺NK细胞。

22.治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求19或20的组合物，从而治疗所述受试者的癌症。

23.权利要求22的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、乳腺癌、尤文肉瘤、中枢神经系统赘生物、皮肤癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、肛门癌、胃癌、胃肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、脑干胶质瘤、垂体癌、肾上腺皮质癌、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、淋巴瘤、肝癌、肾癌、骨癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤。

24.治疗有此需要的受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求19或20的组合物，从而治疗所述受试者的所述病毒感染。

25.权利要求24的方法，其中所述病毒感染是由人类免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)和冠状病毒引起的。

26.抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与治疗有效量的权利要求20或21的组合物接触。

27.权利要求26的方法，其中所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、急性髓细胞性白血病细胞、慢性髓细胞性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞、前列腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。

28.权利要求1的Tyro3⁺K562细胞，其中所述细胞携带编码人Tyro3的外源性核苷酸序列。

29.权利要求1的Tyro3⁺K562细胞，其中所述细胞进一步表达CD64(FcγRI)、CD86(B7-2)和截短的CD19(tCD19)中的一种或多种。

30.权利要求1或29的Tyro3⁺K562细胞，其中所述细胞进一步表达膜结合IL15、可溶性IL15或IL15 sushi受体复合物。