CN113286874A - 嵌合抗原受体(CARs)组合物及使用方法 - Google Patents

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蒋迅
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Abstract

本发明提供了工程细胞，其具有至少一种嵌合抗原受体多肽，以及任选地细胞因子和趋化因子中的至少一种。

Description

嵌合抗原受体(CARs)组合物及使用方法
相关申请案之交叉引用
本申请根据2018年10月12日先前的美国临时申请第62/745120号和2019年2月9日先前提交的美国临时申请第62/803462号，所有这些都通过引用并入本文。
背景技术
T细胞，淋巴细胞的一种，在细胞介导之免疫性中起重要作用。其与其他淋巴细胞(诸如B细胞及自然杀伤细胞(NK细胞))之区别在于细胞表面上存在T细胞受体(TCR)。T辅助细胞，亦称为CD4+ T或CD4 T细胞，在其表面上表达CD4糖蛋白。辅助T细胞在暴露于由MHC(主要组织相容复合体)II类分子呈递之肽抗原时活化。一旦活化，此等细胞快速增殖且分泌可调节免疫反应之细胞因子。细胞毒性T细胞，亦称为CD8+ T细胞或CD8 T细胞，在细胞表面上表达CD8糖蛋白。CD8+ T细胞在暴露于由MHC I类分子呈递之肽抗原时活化。记忆T细胞，一种T细胞亚群，长期留存并回应于其等同源抗原，因此向免疫系统提供针对过去感染及/或肿瘤细胞之“记忆”。
经基因改造后，T细胞可于其表面产生特殊受体，称为嵌合抗原受体(CAR)。CAR T细胞识别肿瘤细胞上的特定蛋白(抗原)。此等经工程改造的CAR T细胞接着在实验室中生长直至其数目达到十亿。接着将扩增的CAR T细胞群输注至患者中。
迄今为止，临床试验已证实嵌合抗原受体(CAR)T细胞在对标准化学疗法具有抗性的血液科恶性疾病中具有巨大前景。最值得注意的是，特定的CD19CAR(CD19CAR)T细胞疗法具有显著效果，包括B细胞恶性肿瘤的长期缓解(Kochenderfer,Wilson等人2010，Kalos,Levine等人2011，Porter,Levine等人2011，Davila,Riviere等人2013，Grupp,Frey等人2013，Grupp,Kalos等人2013，Kalos,Nazimuddin等人2013，Kochenderfer,Dudley等人2013，Kochenderfer,Dudley等人2013，Lee,Shah等人2013，Park,Riviere等人2013，Maude,Frey等人2014)。
尽管CAR疗法在B细胞白血病及淋巴瘤中取得成功，但尚未有明确之CAR疗法应用于软组织肿瘤。鉴于恶性软组织肿瘤之疗法比B细胞恶性肿瘤之疗法具有明显更差之效果(Abramson,Feldman等人2014)，因此CAR疗法具有进一步解决巨大临床需求之潜力。
现时存在一些阻碍CAR治疗性方法之更广泛应用之障碍。其中最常见挑战为：(1)抗原标靶及嵌合抗原受体之选择；(2)CAR设计；(3)肿瘤异质性，尤其肿瘤抗原之表面表达之差异。靶向单一抗原具有免疫逃逸之风险，此可由靶向多个所需抗原来解决。
大部分CAR嵌合抗原受体为来源于单株抗体之scFv且部分此等单株抗体已用于临床试验或疾病治疗。然而，单株抗体具有有限功效，表明需要替代的及更强效的靶向方法，诸如CAR。
靶点发现和选择是第一步，因为没有通用规则来确保或指导CAR设计的有效性。
scFvs为CAR之最常用的嵌合抗原受体。然而，抗原上所识别之抗原决定基之CAR亲和结合及位置可影响功能。此外，T细胞或NK细胞之表面CAR表达量受适合的前导序列及启动子影响。然而，过表达之CAR蛋白可对细胞具有毒性。
因此，现时仍然需要经改良之基于嵌合抗原受体之疗法，其可慮及T细胞相关恶性肿瘤之更有效、安全及有效靶向。
此外，CAR靶向神经母细胞瘤由于存在异质性肿瘤群体以及肿瘤微环境抑制而具有相当的挑战性。长期以来针对神经母细胞瘤的抗原特异性免疫治疗一直致力于改善患者的治疗效果，但迄今为止成功率有限，因为许多此类治疗要么在临床上无效，要么对患者的治疗效果产生不确定的影响。神经母细胞瘤或其他软组织肿瘤(如肉瘤)，抗原多样性很强的疾病的理想靶点目前尚未确定。确定合适的靶点是CAR设计的重要步骤，CAR设计需要解决肿瘤异质性、CAR持续性和肿瘤微环境抑制等问题。CAR设计的有效性和安全性没有一般规律可循。
因此，仍然需要改进以嵌合抗原受体为基础的治疗方法，使软组织肿瘤的靶向性更加有效、安全和高效。
发明内容
在一个实施例中，本公开提供了一种工程细胞，其含有的第一抗原受体多肽包含第一抗原识别结构域，包括第一信号肽，第一铰链区，第一跨膜结构域，第一共刺激结构域和第一信令域；和第二嵌合抗原受体多肽包含第二抗原识别结构域，第二信号肽，第二铰链区，第二跨膜结构域，第二共刺激结构域和第二信号传导结构域；其中第一抗原识别结构域不同于第二抗原识别结构域，并且第一抗原识别结构域和第二抗原排斥结构域选自白介素6受体，NY-ESO-1，甲胎蛋白(AFP)，甘氨吡啶-3(GPC3)，BAFF-R，BAFF，APRIL，BCMA，TACI，LeY，CD5，CD13，CD14，CD15 CD19，CD20，CD22，CD33，CD30，CD41，CD45 CD61，CD64，CD68，CD117，CD123，CD138，CD267，BCMA(CD269)，CD38，MMG49表位,Flt3受体，CD4，CLL-1和CS1(SLAMF7)。
在另一实施例中，本发明提供一种工程多肽，包括嵌合抗原受体和增强子。
在另一实施例中，本发明提供一种减少靶细胞数量的方法，其步骤包括(i)将所述靶细胞与有效量的具有至少一种嵌合抗原受体多肽的工程细胞接触，对于具有多个嵌合抗原受体多肽的工程细胞，每个嵌合抗原受体多肽是独立的；并且(ii)可选地，检测所述细胞数量的减少。靶细胞包括至少一种细胞表面抗原，选自GD2、GD3、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3、糖脂、glypican 3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2/neu、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、甲胎蛋白、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4，MUC5、CD30、MMG49表位、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、免疫球蛋白kappa和lambda、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、NKG2D受体、April受体、BAFF受体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2和CD138。靶抗原还可以包括病毒或真菌抗原，例如来自人乳头瘤病毒(HPV)或EBV(ebstein-Barr病毒)抗原的E6和E7。
在另一实施例中，本发明提供了治疗B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓性白血病、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征、慢性骨髓增生性肿瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和细胞增殖性疾病，即向有需要的患者施用上述任何工程细胞。
在另一个实施例中，本公开提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本文所述的工程细胞；其中所述自身免疫性疾病或紊乱包括系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)，炎性肠病(IBD)，类风湿性关节炎，干燥综合征，皮肌病，自身免疫性溶血性贫血，视神经脊髓炎(NMO)，NMO频谱失调(NMOSD)，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，与系统性自身免疫性小血管血管炎综合征或显微镜下多管炎(MPA)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ANCAs)，肉芽肿伴多管炎(GPA，Wegener肉芽肿病)，或嗜酸性肉芽肿伴多管炎(EGPA，Churg-Strauss综合征)和TTP(血小板减少性紫癜)或存在同种异体抗体因子VII的IA型血友病。
本发明提供了针对非血液系统恶性肿瘤的嵌合抗原受体(CARS)，其组成和使用方法。
在一个实施例中，本发明提供了具有第一嵌合抗原受体多肽的工程改造细胞，所述第一嵌合抗原受体多肽包括第一抗原识别结构域，第一信号肽，第一铰链区，第一跨膜结构域，第一共刺激结构域和第一信号域；第二嵌合抗原受体多肽，包括第二抗原识别结构域，第二信号肽，第二铰链区，第二跨膜结构域，第二共刺激结构域和第二信号结构域；其中第一抗原识别结构域不同于第二抗原识别结构域。
在另一实施例中，本发明提供一种工程多肽，包括嵌合抗原受体和增强子。在另一个实施例中，增强子可从包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-15/IL-15sush、IL-15/IL-15sushi锚、IL-15/IL-15RA、IL-18、IL-21、IL-21锚、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、IL-15受体α、4-1BBL、IL-21、IL-21锚和TGFRβ,受体组中选择至少一个。
在一些实施例中，具有抗原识别域的CAR是表达盒的一部分。在优选实施例中，所述表达基因或盒可包括辅助基因或标签或其部分。副基因可以是诱导自杀基因或其一部分，包括但不限于caspase 9基因。“自杀基因”消融方法提高了基因治疗的安全性，只有在特定化合物或分子激活时才能杀死细胞。在一些实施例中，表位标记是c-myc标记、CD52、链霉亲和素结合肽(SBP)、截短的EGFR基因(EGFRt)或其部分或组合。
在一些实施例中，可通过向受试者施用抗CD52单克隆抗体(CAMPATH)来消融CAR细胞。
在另一实施例中，本发明提供通过向需要的患者施用上述任何工程细胞来治疗软组织肿瘤、癌、肉瘤、白血病和细胞增殖性疾病的方法。
附图说明
图1：CAR构造和表达
(A)两个离散的CAR单元：一个由CD8衍生的铰链(H)和跨膜(TM)区域以及与CD3ζ信号结构域相连的4-1BB共激活结构域组成的抗BCMA-CAR，通过一个自裂解的P2A肽与一个完整的抗CS1-CAR融合。用启动子SFFV和CD8引导序列在T细胞表面高效表达BC1cCAR(BCMA-CS1 cCAR)分子。(B)用流式细胞仪检测对照T细胞BC1cCAR的表达。BCMA也叫CD269。
图2：BC1cCAR T细胞对骨髓瘤细胞株的体外抗肿瘤作用
(A)BC1cCAR和对照T细胞与MM1S和RPMI-8226细胞共培养24小时，E:T比分别为2:1和5:1。靶细胞用细胞追踪器染料(CMTMR)染色，以区别于效应T细胞，并显示为红色。对BCMA、CS1和CMTMR种群进行门控。(B)将BC1cCAR和对照T细胞与U266(BCMA+CS1dim)细胞在相似条件下孵育。(C)BC1cCAR T细胞对不同骨髓瘤细胞株体外细胞毒性的图解总结。
图3：原发性患者细胞表型
用流式细胞仪检测BCMA和CS1的表达。密度图代表主要抗原群体。
图4：BC1cCAR T细胞对原发性骨髓瘤细胞抗肿瘤活性的研究
(A)对BCMA+CS1+原发性骨髓瘤细胞(MM7-G)共培养24小时，并用CMTMR预染色靶细胞。用BCMA和CS1以及CMTMR对该群进行门控，流式细胞仪显示目标肿瘤群呈红色(左)。总结体外细胞毒性的条形图(右)。(B)在相同条件下与MM10-G原代细胞共培养。流式细胞术检测BCMA+CS1+双阳性(紫色)和CS1+单阳性(深蓝色)。特异性细胞毒性总结(见下文)。(C)BCMAdimCS1dim原代细胞(MM11-G)在E:T剂量范围内显示BC1cCAR抗肿瘤活性。(D)BC1cCAR体外筛选结果汇总面板图。
图5：BC1cCAR抗原特异性的功能验证
(A)将CML细胞株(K562)转入，使其稳定表达BCMA或CS1。在各自抗原表达范围内的直方图总体变化显示了表达。(B)短期(4小时-8小时)培养的BC1cCAR T细胞对BCMA-K562或CS1-K562具有抗原特异性细胞毒性，与E:T剂量增加相关。以野生型K562细胞为阴性对照。制备CS1单个CAR(红条)，比较BC1cCAR对CS1-K562细胞的作用。(C)用BCMA-K562细胞和CS1-K562细胞的1:1混合物进行长期培养(48小时)。将BC1cCAR、CS1-CAR、BCMA-CAR和对照T细胞按5:1E:T的比例添加到每个处理孔。按治疗条件，直方图显示BCMA或CS1细胞残留群体的(％门)，红线界定T细胞或目标肿瘤群体。
图6:长期序列杀伤试验与肿瘤再激发
(A)在没有外源性细胞因子的情况下，在168小时内进行检测，并使用混合BCMA+CS1+MM1S细胞的CAR细胞或对照细胞的1:1E:T比率进行初始培养。48小时后，对小样本进行流式细胞仪分析，并将MM1S细胞重新导入每个处理孔。在168小时内重复。(B)48小时后T细胞增殖和反应。流式细胞仪采集当天采集图像，用抗BCMA、抗CS1、抗CD3抗体、MM1S细胞(蓝色圆圈)染色。(C)在108小时时，进行类似的图像采集和FACS分析。
图7:BC1cCAR T细胞在体内表现出抗白血病作用
(A)MM1S模型肿瘤通过给小鼠注射1.0x106荧光素酶阳性的细胞制备。用BC1cCART细胞(右)或队中T细胞(左)处理小鼠，并通过IVIS采集图像。(B)测量BC1cCAR T细胞处理小鼠(红色)与对照T细胞处理小鼠(黑色)的平均光强度。(C)BC1CAR(红色)和对照组(黑色)的生存结果。
图8:BC1cCAR T细胞在混合抗原异种小鼠模型中表现出更好的细胞毒性作用
(A)以4:1BCMA:CS1 K562细胞的比例将BCMA和CS1表达的K562细胞注射入小鼠模型(每组n＝5)。用BC1cCAR T细胞、对照T细胞或BCMA特异性CAR治疗小鼠。IVIS显示肿瘤负荷，并绘制出各组的荧光强度(右)。(B)对照组处理(黑色)、BCMA-CAR处理(蓝色)和BC1cCAR处理(红色)小鼠的生存结果。
图9：在单抗原模型中，BC1cCAR T细胞持续性的改善和维持肿瘤抑制
(A)注射BCMA-K562或CS1-K562肿瘤细胞的小鼠处死时，取它的全血(每组5只)。BCMA或CS1阳性峰的直方图总体代表肿瘤的存在。(B)总结小鼠全血和肝脏标本的组织分析。小鼠肿瘤细胞计数通过每250000个样本中抗原阳性细胞的FACS建立，并在每个处理组的所有小鼠中取平均。(C)全血和肝组织也通过CD3表达分析了T细胞在耗竭的持续性，总结了所有处死小鼠(右)。
图10：分别注射BCMA-K562或CS1-K562的小鼠全血分析
在不同的处死时间，收集小鼠全血并用抗CD3、CD45、BCMA和CS1的抗体标记。构建直方图以显示肿瘤的存在，并在25000个事件中平均计数以生成图形总结。一些老鼠在处死前死亡，无法采集样本。
图11：分别注射BCMA-K562或CS1-K562的小鼠肝脏分析
在不同的处死时间，收集小鼠肝脏样本并用抗CD3、CD45、BCMA和CS1的抗体标记。构建直方图以显示肿瘤的存在，并在25000个事件中平均计数以生成图形总结。一些老鼠在处理前死亡，无法采集样本。
图12:CD123b-CD33b-cCAR的遗传结构和功能
(A)代表CD123-CD33cCAR。(B)CD123b-CD33b-cCAR T细胞是由CD123b-CD33b-cCAR基因构建的病毒转染的供者T细胞而产生的。转导后的CD123和CD33-CAR蛋白在CAR T细胞表面表达，并能识别和结合白血病细胞表面的CD123和CD33靶蛋白。CD123b-CD33b-cCAR-T细胞的药理作用和机制是通过CD123b-CD33b-cCAR对抗原的识别来介导的，通过在构建物中加入CD28或4-1BB共激活区，CD3zeta/Zap70的典型细胞毒性T细胞活性进一步增强，从而产生“第二代”CAR。
图13:CD123b-CD33b cCAR转导效率
流式细胞术检测T细胞表面CD123b-CD33b-cCAR表达水平。
图14:CD123b-CD33b cCAR T细胞显示MOLM13和U937肿瘤细胞系的靶向溶解
(A)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞对MOLM13(AML细胞系)肿瘤靶细胞的作用。目标细胞群被圈出。(B)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞对U937肿瘤靶细胞的作用。目标细胞群被圈出。(C)MOLM13肿瘤细胞(CD123+CD33+)和U937细胞(CD123-CD33+)单独染色作为标记物，并在两种E:T比率下汇总其溶解百分比。(D)用HL60(CD123dimCD33+)和KG1a(CD123dimCD33+)细胞进行的剂量依赖性培养实验在E:T比为0.25:1到10:1时显示出较高的cCAR杀伤效率。
图15:CD123b-CD33b cCAR T细胞显示对原发性肿瘤细胞的靶向溶解
(A)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞在2:1和5:1E:T比率下对PT1肿瘤靶细胞的杀伤作用。目标细胞群被圈出。(B)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞在2:1和5:1E:T比率下对PT2肿瘤靶细胞的杀伤作用。目标细胞群被圈出。(C)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞在2:1和5:1E:T比率下对PT3肿瘤靶细胞的杀伤作用。靶细胞群(CD123+CD34+)被CD38表达圈出并进一步分解，显示LSC(CD123+CD34+CD38-)消除。(D)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞在2:1和5:1E:T比率下对PT4肿瘤靶细胞的杀伤作用。靶细胞群(CD33+主体疾病)被圈出。(E)CD123b-CD33b cCAR T细胞在2:1和5:1E:T比率下对所有四个患者样本的裂解百分比分析总结。
图16:CD123b-CD33b cCAR T细胞高效地消除表达CD33或CD123抗原的细胞
(A)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞对野生型Jurkat肿瘤细胞和表达CD123(Jurkatxp123)的Jurkat细胞的作用。目标细胞群被圈出。(B)流式细胞术分析对照T细胞和CD123b-CD33b-cCAR T细胞对野生型Jurkat肿瘤细胞和表达CD33(Jurkatxp33)的Jurkat细胞的作用。目标细胞群被圈出。(C)CD123b-CD33b-cCAR T细胞对WT-Jurkat细胞、Jurkat xp33细胞和Jurkat xp123细胞在2:1E:T比率下的消除百分比分析总结。
图17:CD123b-CD33b-cCAR T细胞在两个异种移植小鼠体内模型中对MOLM13和U937细胞系显示出强的抗白血病作用
(A)在第3天、第6天、第9天和第13天对表达荧光素酶的MOLM13细胞进行IVIS成像，以显示肿瘤负荷(每组8个)。CD123b-CD33b cCAR T细胞和对照T细胞治疗小鼠肿瘤负荷随时间变化的图示比较。从第6天开始，肿瘤减少具有统计学意义。Kaplan-Meier生存分析曲线代表生存结果(Mantel-Cox对数秩检验p＝0.0082)。(B)在第3、6、9和13天对表达荧光素酶的U937细胞进行IVIS成像，以显示肿瘤负荷(每组8个)。CD123b-CD33b cCAR T细胞和对照T细胞治疗小鼠肿瘤负荷随时间变化的图示比较。从第6天开始，肿瘤减少具有统计学意义。Kaplan-Meier生存分析曲线代表生存结果(Mantel-Cox对数秩检验p＝0.0082)。(C)MOLM13和U937小鼠肿瘤模型的外周血。流式细胞术可以显示CD45+CD3+T细胞和CD45+CD33+肿瘤细胞。
图18：CAMPATH治疗使注入的CD123b-CD33b cCAR T细胞耗竭
(A)评价CD19b-CD123-cCAR T细胞输注NGS小鼠后给予CAMPATH的效果的实验方案。将10x106 CD19b-CD123-cCAR T细胞静脉注射入亚致死剂量照射的小鼠(n＝6)中，24小时后腹腔注射CAMPATH(0.1mg/kg)或PBS(n＝3/h，对照组n＝2)。6小时和24小时后，采集外周血，测定CAR T细胞的持久性。(B)使用和不使用CAMPATH治疗，6小时后外周血CD19b-CD123-cCART细胞持续性表现。流式细胞术检测CD19b-CD123细胞的存在。(C)使用和不使用CAMPATH治疗，24小时后外周血CD19b-CD123-cCART细胞持续性表现。流式细胞术检测CD19b-CD123-cCAR细胞的存在。
图19:CD19b-CD123 cCAR的结构组织
cCAR-T结构示意图(CD19b-CD123cCAR)。该结构包括一个SFFV启动子，该启动子驱动由P2A肽连接的CARs的多个模块单元的表达。在连接体裂解后，cCARs分离，分别以CD19和CD123抗原为靶点，与表达CD19b CAR和CD123-CAR的靶点接合。作为一种新的cCAR结构，该结构的激活域可以包括但不限于CD19b CAR段上的4-1BB和CD123 CAR上的CD28区域。一个铰链结构域(H)、一个跨膜结构域(TM)、一个共刺激结构域(CD28或4-1BB)和细胞内信号结构域CD3 zeta(CD3)。
图20:CD19b-CD123-cCAR的转导效率
活化的T细胞用表达CD19b-CD123-cCAR的解冻的慢病毒在重组人纤维蛋白涂层板上进行转导。转导后，洗细胞并扩增；进行流式分析(F(Ab')2标记)以确认CAR效率。
图21:CD19b-CD123 cCAR T细胞显示了对CD19+和CD123+白血病/淋巴瘤细胞系的特异性和有效溶解
(A)流式细胞术分析对照T细胞和CD19b-CD123-cCAR T细胞对人工诱导的CD19+K562细胞和对照K562细胞16和48小时在5:1的E:T比值的影响。目标细胞群用红色表示。未转导的CD19-细胞被描绘成深黄色。(B)流式细胞术分析对照T细胞和CD19b-CD123-cCAR T细胞对人工诱导的CD19+K562细胞和对照K562细胞在5：1E:T比的作用。目标细胞群用红色表示。未转导的CD123-Jurkat细胞被描绘成紫色。(C)流式细胞术分析E:T比5:1，16和48h的KG1a肿瘤细胞(CD123+CD19-)和SP53细胞(CD123-CD19+)。(D)肿瘤细胞溶解率汇总图。
图22:CD19b-CD123 cCAR T细胞显示对原发性患者细胞定向溶解
(A)PT1和PT2肿瘤细胞表型的流式细胞术分析。(B)流式细胞术分析在E:T比为5:1，24小时时对照T细胞和CD19b-CD123-cCAR T细胞对PT1肿瘤靶细胞的作用。目标细胞群用红色表示。(C)流式细胞术分析24和48小时，在5:1E:T比时对照T细胞和CD19b-CD123-cCART细胞对PT2肿瘤靶细胞的影响。目标细胞群用红色表示。(D)CD19b-CD123 cCAR T细胞在24小时和48小时以5:1的E:T比率对患者样本消除的百分比分析总结。
图23:CD19b-CD123 cCAR T细胞在两个体内异种移植小鼠模型中对MOLM13和REH细胞系显示出深刻的抗白血病作用
(A)在第3天、第6天、第8天和第11天对表达荧光素酶的MOLM13细胞进行IVIS成像，以显示肿瘤负荷(代表每组小鼠)。(B)肿瘤负荷的图示，CD19b-CD123 cCAR T细胞和对照T细胞治疗小鼠的肿瘤负荷随时间变化的比较，测量背侧和腹侧的肿瘤负荷。从第6天开始，肿瘤减少具有统计学意义。(C)Kaplan-Meier生存分析曲线代表生存结果(Mantel-Cox对数秩检验p＝0.0031)。(D)在第16天对表达荧光素酶的REH细胞进行IVIS成像，以显示肿瘤负荷(每组n＝5)。(E)CD19b-CD123-cCAR T细胞和对照T细胞治疗小鼠肿瘤负荷随时间变化的图示比较。肿瘤缩小有统计学意义。测量背侧和腹侧肿瘤负荷。(F)Kaplan-Meier生存分析曲线代表生存结果(Mantel-Cox对数秩检验p＝0.0016)。
图24.由P2A连接的示意图，显示单个结构中的CAR，4-1BB和IL-21(CAR共表达IL-21)及其在T或NK细胞中的表达
该结构由一个SFFV启动子驱动共刺激域为4-1BB的CAR的表达。在连接体裂解时，CAR和IL-21分裂并与表达抗原的靶点结合。CAR-T细胞不仅通过4-1BB或CD28接受共刺激，还通过4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)或IL-21接受共刺激，CD3-zeta信号结构域完成了CAR-T的组装，IL-21信号肽被IL-2信号肽替代，以更好地分泌IL-21。H、CD8a铰链区，TM，CD8a跨膜区。带有IL-21的CAR可以是CD19-IL-21CAR、BCMA-IL-21CAR、CD4-IL-21CAR和CD45-IL-21CAR。
图25.该结构(CAR共表达IL-21锚)及其在T细胞或NK细胞中的表达的示意图
一个带有IL-21锚的CAR与P2A自裂序列相连。IL-21锚融合由与IL-21融合的IL-2信号肽组成，与CD8铰链区和CD8跨膜区相连。CAR和IL-21融合的结合被组装在一个表达载体上，它们的表达由SFFV启动子驱动。用IL-2信号肽代替IL-21信号肽，可以更好地分泌IL-21并锚定在细胞表面。带有IL-21锚的CAR可以是CD19-IL-21锚CAR、BCMA-IL-21锚CAR、CD4-IL-21锚CAR和CD45-IL-21锚CAR。
图26.由P2A连接，单个结构中的CAR、4-1BB和IL-18(CAR共表达IL-18)的示意图及其在T或NK细胞中的表达
该结构由一个SFFV启动子驱动共刺激域为4-1BB的CAR的表达。在连接体裂解时，CAR和IL-18分裂并与表达抗原的目标结合。CAR-T细胞不仅通过4-1BB或CD28接受共刺激，而且还通过4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)或IL-21接受共刺激，CD3-zeta信号结构域完成了CAR-T的组装，IL-21信号肽被IL-2信号肽取代，以更好地分泌IL-18。H、CD8a铰链区，TM，CD8a跨膜区。CD3-zeta信号域完成了该CAR-T的组装，例如IL-18的CAR可以是CD19-IL-18CAR、BCMA-IL-18CAR、CD4-IL-18CAR和CD45-IL-18CAR。
图27.该结构(CAR共表达IL-18锚)及其在T细胞或NK细胞中的表达的示意图
带有IL-18锚的CAR与P2A自裂序列相连。IL-18锚融合由IL-2信号肽与IL-18融合并与CD8铰链区和CD8跨膜区连接而成。CAR与IL-18锚融合的结合被组装在无CD3 zeta链的表达载体上，其表达由SFFV启动子驱动。用IL-2信号肽代替IL-18信号肽，可以更好地分泌IL-18，然后锚定在细胞表面。带IL-18锚的CAR可为CD19-IL-18锚CAR、BCMA-IL-18锚CAR、CD4-IL-18锚CAR和CD45-IL-18锚CAR。
图28A.不同版本抗BCMA-CAR或cCAR-T细胞的表达。用抗CD3抗体激活白细胞3天。
用对照载体(左上角)或各种CD269 CAR慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图28B.不同版本的BCMA-CS1 cCAR T细胞的表达
用抗CD3抗体激活白细胞3天。用对照载体(左上角)或各种CD269 cCAR慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图29A:CD269-A7D-CD19b CAR T细胞在共培养分析中特异性地裂解合成表达CD19表面抗原(K-19)的K562肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CD19和CD3。每项检测包括K-19靶细胞(左)、对照T细胞(中板)和CD269-A7D-CD19b CAR T细胞(右板)。K-19细胞被圈出。
图29B.在共培养分析中，CD269-A7D-CD19b CAR T细胞特异性地裂解合成表达BCMA表面抗原(K-BCMA)的K562肿瘤细胞系。
以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CD269和CD3。每项检测包括K-BCMA靶细胞(左)、对照T细胞(中板)和CD269-A7D-CD19b CAR T细胞(右板)。K-BCMA细胞被圈出。
图30A.不同版本的BCMA-CS1 cCAR T细胞的表达。
用抗CD3抗体激活白细胞3天。用对照载体(左上角)或各种CD269(BCMA)cCAR慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图30B.不同版本的BCMA-CS1 cCAR T细胞或增强型BCMA CAR T细胞的表达。
用抗CD3抗体激活白细胞3天。用对照载体(左上角)或各种CD269(BCMA)CAR慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图30C.在共培养分析中，CD269-A7D-CD19b CAR T细胞特异性地裂解合成表达BCMA表面抗原(K-BCMA)的K562肿瘤细胞系。
以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CD269和CD3。每项检测包括K-BCMA靶细胞(左)、对照T细胞(中板)和CD269-A7D-CD19b CAR T细胞(右板)。K-BCMA细胞被圈出。
图30D.在共培养分析中，CD269-A7D-CD19b CAR T细胞特异性地裂解合成表达CD19表面抗原(K-19)的K562肿瘤细胞系。
以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CD19和CD3。每项检测包括K-19靶细胞(左)、对照T细胞(中)和CD269-A7D-CD19b CAR T细胞(右)。K-19细胞被圈出。结果汇总在左下角的图表中。(N＝2)。
图30E.CD269-A-7D-CD19b cCAR T细胞对K562-BCMA(K-BCMA)和K562-CD19(K-19)细胞的裂解的分析总结。
图30F.CD269-A7D cCAR T细胞在共培养分析中特异性裂解MM1S肿瘤细胞系。
以5:1的效应靶比进行共培养实验
18小时后，用流式细胞仪直接检测CD269(BCMA)和CMTMR(CellTracker)。每个分析都包括MM1靶细胞(左)、对照T细胞(上中板)、CD269-A7D-41BBL(下中)、CD269-A7D-C11D(右上)和CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T细胞(右下)。MM1S单元格用蓝点表示。(N＝2)。
图30G.不同版本的CD269-CS1 cCAR或增强型CD269 CAR T细胞在共培养分析中特异性地裂解K562-BCMA肿瘤细胞系。
共培养18小时，效应靶比为5:1，流式细胞仪直接检测CD269和CD3。每个检测包括MM1S靶细胞(左)、对照T细胞(上中)、CD269-A7D-41BBL(下中)、CD269-A7D-C11D(靶向BCMA抗原两个不同表位的cCAR)(右上)和CD269-A7D-CS1-hu63 CAR T细胞(右下)。K-BCMA细胞用绿点表示。(N＝2)。
图30H.CD269-A7D-CS1-hu63 CAR T细胞在共培养分析中特异性地裂解K562-CS1肿瘤细胞系，而CD269-A7D-C11D cCAR(一种针对BCMA抗原不同表位的cCAR，不含CS1 CAR)则没有。共培养18小时，效应靶比为5:1，流式细胞仪直接检测CD269和CD3。每个分析都包括MM1S靶细胞(左)、对照T细胞(中面板)、CD269-A7D-C11D(右上角)和CD269-A7D-CS1-hu63CAR T细胞(右下角)。K-CS1细胞由深绿色点表示。(N＝2)。
图30I.CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-C11D和CD269-CS1-hu63 CAR T细胞对MM1S骨髓瘤细胞的裂解分析总结。
图30J.CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-C11D和CD269-CS1-hu63 CAR T细胞对K-BCMA(表达BCMA的K562)细胞的裂解分析总结。
图30K.CD269-A7D-C11D和CD269-CS1-hu63细胞对K-CS1(表达CS1的K562)细胞的裂解分析总结。
图31.CLL1-CD33b CART细胞的表达。用抗CD3抗体激白细胞3天。
用对照载体(左)或CLL1-CD33b CAR(右)慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图32A.在共培养分析中，CLL1-CD33b CAR T细胞不能裂解REH肿瘤细胞系。
用CFSE染料预标记靶细胞，以区别于T细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验,18小时后用流式细胞仪直接检测CFSE和CD3。每项检测包括REH靶细胞(左)、对照T细胞(中板)和CLL1-CD33b CAR T细胞(右板)。REH细胞被表示为紫色点。注：REH细胞不表达CLL1(CLL-1)或CD33。
图32B.共培养分析中，CLL1-CD33b CAR T细胞不裂解CCRF-CEM肿瘤细胞系。
用CFSE染料预标记靶细胞，以区别于T细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CFSE和CD3。每个分析都由CCRF-CEM靶细胞(左)、对照T细胞(中)和CLL1-CD33b CAR T细胞(右)组成。CCRF-CEM细胞用橙色圆点表示。注：CCRF-CEM细胞不表达CLL1或CD33抗原。
图32C.CLL1-CD33b CAR T细胞特异性地裂解Jurkat肿瘤细胞系，该细胞系在共培养分析中合成表达CLL-1表面抗原。
用CFSE染料预标记靶细胞，以区别于T细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CFSE和CD3。每个分析包括Jurkat-CLL1(J-CLL)靶细胞(左)、对照T细胞(中)和CLL1-CD33b CAR T细胞(右)。Jurkat CLL细胞表示为蓝点。
图32D.CLL1-CD33b CAR T细胞在共培养分析中特异性地裂解合成表达CD33表面抗原的Jurkat肿瘤细胞系。
用CFSE染料预标记靶细胞，以和T细胞区别。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CFSE和CD3。每个分析包括Jurkat-CD33(J-33xp)靶细胞(左)、对照T细胞(中板)和CLL1-CD33b CAR T细胞(右板)。Jurkat-CD33(J-33xp)细胞被表示为浅蓝色点。
图32E.CLL1-CD33b cCAR T细胞在共培养试验中有效裂解HL60肿瘤细胞系。
用CFSE染料预标记靶细胞，以区别于T细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析CFSE和CD3。每个分析包括HL60靶细胞(左)、对照T细胞(中板)和CLL1-CD33b CAR T细胞(右板)。HL60细胞用绿点表示。
图32F.CLL1-CD33 cCAR(CLL-1-CD33 cCAR)裂解表达CLL-1或CD33的不同AML细胞系和Jurkat细胞的共培养分析结果的总结。
图32G.CLL1-CD33b复合CAR T细胞消融HL60靶肿瘤细胞
以2:1和5:1的E:T比进行共培养过夜。用CFSE染料预标记CLL-1和CD33双阳性的HL60细胞。第二天用CD3、CLL-1和CD33抗体进行流式细胞分析采集(FACS)。
图32H.CLL1-CD33b复合CAR T细胞消融U937靶肿瘤细胞
以2:1和5:1的E:T比进行共培养过夜。靶细胞U937对CLL-1和CD33均呈高度阳性，并用CFSE染料预标记。第二天用CD3、CLL-1和CD33抗体进行流式细胞仪采集(FACS)。
图32I.CLL1-CD33b复合CAR T细胞最低程度地靶向阴性对照CCRF-CEM细胞
以2:1和5:1的E:T比进行共培养过夜。CCRF-CEM细胞对CLL-1和CD33主要呈阴性，并用CFSE染料预标记。第二天用CD3、CLL-1和CD33抗体进行流式细胞仪采集(FACS)。
图32J:CLL1-CD33b复合CAR T细胞对靶细胞系的体外总结
所有共培养均培养过夜，并用CFSE染料对靶细胞进行预标记。第二天使用CD3、CLL-1和CD33抗体对所有样本进行流式细胞仪采集(FACS)。用HL60靶细胞进行剂量依赖性共培养，采用递增的E:T比方案，在相同的共培养条件下培养。
图32K.混合细胞共培养中CLL1-CD33b复合CAR相对于单个CAR T细胞的抗原消耗。
将表达CD33或CLL-1的cDNA稳定转染野生型Jurkat细胞，获得表达CD33和CLL-1的Jurkat细胞。然后对Jurkat细胞进行分类表达，建立表达CD33或CLL-1的均一稳定细胞系。对于混合细胞共培养，表达CD33(Jurkat-CD33)的Jurkat细胞和表达CLL-1(Jurkat-CLL1)的Jurkat细胞以大约1:1的比例混合在一起，共有200000个细胞。然后以1:2的比例(效应细胞：靶)添加效应细胞，在隔夜培养中总共添加100000个T细胞。第二天使用CD3、CLL-1和CD33抗体对所有样本进行流式细胞仪采集(FACS)。图示各种CAR治疗下抗原耗竭的直方图，条形图(左)描绘T细胞群和抗原表达的Jurkat细胞(右)。
图32L.混合细胞共培养中CLL1-CD33b复合CAR相对于单个CAR T细胞的抗原消耗总结。
总结上一个图的直方图数据的图。总的来说，CLL1-CD33b复合CAR-T细胞对表达CD33和CLL-1的Jurkat细胞都表现出有效和靶向的细胞毒性，对两种细胞的消融率均大于85％。此外，CLL1-CD33b复合CAR-T细胞相对于单个抗CD33b CAR-T细胞或单个抗CLL-1car-T细胞对其自身抗原群具有更好的细胞毒性。复合型CAR比CD33-CAR-T和CLL-1-CAR-T细胞靶向性分别提高60％和40％。
图32M.在体内，CLL1-CD33b CAR T细胞对表达CD33抗原的细胞系显示抗肿瘤作用。NSG小鼠经亚致死照射后静脉注射1.0x106荧光素酶表达的U937细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成，注射肿瘤细胞后3天开始静脉注射10x106CLL1-CD33b CAR T细胞或载体对照T细胞。在第3天、第7天、第11天和第15天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。
图32N.代表生存结果的Kaplan-Meier生存分析曲线(Mantel-Cox对数秩检验p＝0.0004)。
图32O.在体内，CLL1-CD33b CAR T细胞对合成的表达CD33抗原的细胞系显示抗肿瘤作用。对NSG小鼠进行亚致死照射并静脉注射1.0x106荧光素酶表达的REH细胞或REH表达的CLL1(REH CLLxp)或REH表达的CD33(REH-33xp)(第0天)以诱导可测量的肿瘤形成，小鼠静脉注射10x106个CLL1-CD33b CAR T细胞或载体对照T细胞。在第3、7、11和15天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。
图33A.由P2A连接的示意图，显示单个结构中的CD19 CAR和IL-21(CD19CAR共表达IL-21)及其在T或NK细胞中的表达。
图33B.CD19b-IL-21CAR T细胞和CD19-IL-21锚的表达。用抗CD3抗体激活白细胞3天。
用对照载体(左)、CD19b-IL-21或CD19b-IL21-anchor-CAR(右)慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图34.阐明该结构(CD19-CAR共表达IL-21锚)及其在T细胞或NK细胞中的表达的示意图。
带有IL-21锚的CD19-CAR与P2A自裂序列相连。IL-21锚融合由与IL-21融合的IL-2信号肽组成，与CD8铰链区和CD8跨膜区相连。CD19 CAR与IL-21融合后的蛋白在表达载体上组装，由SFFV启动子驱动表达。用IL-2信号肽代替IL-21信号肽，可以更好地分泌IL-21并锚定在细胞表面。
图35.一个P2A连接示意图显示BCMA-CAR和IL-18在单个结构中(BCMA-CAR共表达IL-18)及其在T或NK细胞中表达。
该结构由一个SFFV启动子驱动共刺激域为4-1BB的CAR的表达。在连接体裂解时，BCMA-CAR和IL-18分裂并与表达抗原的靶点结合。CAR-T细胞不仅通过4-1BB或CD28接受共刺激，还通过4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)或IL-18接受共刺激，CD3-zeta信号域完成了CAR-T的组装，IL-21信号肽被IL-2信号肽替代，以更好地分泌IL-21。H、CD8a铰链区，TM，CD8a跨膜区。
图36.BCMA(CAR共表达IL-18锚)的结构及其在T细胞或NK细胞中的表达阐明。
带有IL-18锚的CAR与P2A自裂序列相连。IL-18锚融合由与IL-18融合的IL-2信号肽组成，与CD8铰链区和CD8跨膜区相连。BCMA-CAR与IL-18锚融合的结合被组装在一个表达载体上，其表达由SFFV启动子驱动。用IL-2信号肽代替IL-18信号肽，可以更好地分泌IL-18并锚定在细胞表面。
图37.cCAR结构的示意图(BCMA-CD38 cCAR)。
该结构包括一个SFFV启动子，它驱动由P2A裂解肽连接的CARs的多个模块单元的表达。P2A连接子裂解后，cCARs分裂并与表达BCMA和/或CD38的目标结合。CAR的每个单元都有一个针对抗原的scFv、一个铰链结构域(H)、一个跨膜结构域(TM)，一个共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号结构域CD3zeta链。作为一种新的cCAR结构，该结构的激活域可以包括但不限于BCMA CAR段上的4-1BB和CD38 CAR上的CD28区域。
图38.基于CD38的cCAR结构示意图
该结构包括一个SFFV启动子，其驱动由P2A裂解肽连接的CARs的多个模块单元的表达。P2A连接子裂解后，cCARs裂解并接合到表达X CAR和/或CD38上。每个CAR单元带有一个针对该抗原的scFv，一个铰链结构域(H)、一个跨膜结构域(TM)、一个共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号结构域CD3 zeta链。作为一种新的cCAR结构，该结构的激活域可以包括但不限于X CAR上的4-1BB或CD28和CD38 CAR的CD28或4-1BB区域。X-CAR可以是但不限于CD4、CD5、CD3、CD7、CD2、CD56、CD19、CD20、CD22、BCMA、CD138、CS1、CD123、CD33、CLL-1、BAFF受体、增殖诱导配体APRIL和整合素的CAR。
图39A.CD269-A7D-CD38 cCAR T细胞的表达。用抗CD3抗体激活单个核细胞3天。用对照载体(左)、CD269-A7D-CD38a、CD269-A7D-CD38b或CD269-A7D-CD38c CAR(右)慢病毒上清液导入细胞。培养3天后，收集细胞并标记流式细胞仪。有三种CD269-A7D-CD38 cCAR T细胞，分别为CD269-A7D-CD38a，CD269-A7D-CD38b，CD269-A7D-CD38c CAR。
图39B.通过流式细胞术分析了六种细胞系的BCMA(CD269)和CD38细胞表面表达。细胞用小鼠抗人CD269(APC)和CD38(PE)标记。CD38在骨髓瘤细胞RPMI 8226和MM1S中表达。B-ALL细胞系REH也表达CD38。K562-BCMAxp细胞是AML细胞(K562)，通过使用慢病毒载体表达BCMA。K562-BCMAxp细胞所有细胞表达BCMA。
图39C.用表达BCMA的BCMA-xp慢病毒载体转导表达荧光素酶的REH和U937野生型细胞系。恢复后，用小鼠抗人CD269(BCMA)(APC)和CD38(PE)标记未转导的细胞(左)和转导的细胞(右)，并通过流式细胞仪进行分析。U937-BCMAxp和REH细胞系表达BCMA表面抗原，而野生型细胞系U937或REH不表达。
图39D.在共培养分析中，CD269-A7D-CD38 CAR T细胞特异性地裂解表达CD38表面抗原但是不表达CD269(BCMA)的CD38+REH肿瘤细胞系。以2:1(顶排)或5:1(底排)的效应靶比进行24小时共培养实验，并用流式细胞仪直接分析CD38和CD3。每个分析都包括与对照T细胞(左面板)、CD269-A7D-CD38a(左中面板)或CD269-A7D-CD38b CAR T细胞(右中面板)一起孵育的REH靶细胞，或单独孵育的细胞(最右侧)。REH单元格表示为蓝点。
图39E.在共培养测定中，CD269-A7D-CD38 CAR T细胞特异性裂解表达CD38表面抗原但不表达CD269的REH肿瘤细胞系。共培养实验以效应物与靶标的比例为2：1(上排)或5：1(下排)进行48小时，并通过流式细胞仪分析CD38和CD3。每项分析均由与对照T细胞(左图)，CD269-A7D-CD38(左中图)或CD269-A7D-CD38b CAR T细胞(右中图)或单独的细胞(右图)一起孵育的REH靶细胞组成。REH单元表现为蓝点。
图39F.CD269-A7D-CD38 CAR T细胞在共培养实验中特异性裂解合成的表达CD269(BCMA)表面抗原但不表达CD38的K562肿瘤细胞系。以2:1(顶排)或5:1(底排)的效应靶比进行共培养实验24小时，并用流式细胞仪直接分析CD269和CD3。每个实验均由与对照T细胞(左图)，CD269-A7D-CD38a(左中图)或CD269-A7D-CD38b CAR T细胞(右中图)一起孵育的K562-BCMA(K-BCMA)靶细胞组成，或单独使用细胞(最右边)。K-BCMA细胞以绿点表示。
图39G.在共培养测定中，CD269-A7D-CD38 CAR T细胞特异性裂解K562肿瘤细胞系，该细胞系合成表达CD269(BCMA)表面抗原。共培养实验以效应物与靶标的比例为2：1(上排)或5：1(下排)进行48小时，并通过流式细胞仪分析CD269和CD3。每项分析都包括与对照T细胞(左面板)、CD269-A7D-CD38a(左中面板)或CD269-A7D-CD38b CAR T细胞(右中面板)或单独细胞(最右侧)孵育的K562-BCMA靶细胞。K-BCMA细胞表现为绿点。
图40A.在体内,CD269-A7D-CD38a CAR T细胞对MM.1S肿瘤细胞系表现出比CD269-A7D-CD38b CAR T细胞更强的抗肿瘤作用(背面观)。
对NSG小鼠进行亚致死性照射，并静脉内注射表达4.0x106荧光素酶的MM.1S细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成。注射肿瘤细胞后10天开始，给小鼠静脉注射10x106的CD269-A7D-CD38a，CD269-A7D-CD38b或载体对照T细胞。在第9天和第12天，给小鼠皮下注射RediJect D-荧光素并进行IVIS成像。背视图如图显示。
图40B.在体内,CD269-A7D-CD38a CAR T细胞对MM.1S肿瘤细胞系表现出比CD269-A7D-CD38b CAR T细胞更强的抗肿瘤作用(侧面视图)。对NSG小鼠进行亚致死性照射，并静脉内注射表达4.0x106荧光素酶的MM.1S细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成。注射肿瘤细胞后10天开始，给小鼠静脉注射10x106的CD269-A7D-CD38a，CD269-A7D-CD38b或载体对照T细胞。在第9天和第12天，给小鼠皮下注射RediJect D-荧光素并进行IVIS成像。腹视图如图显示。
图40C.在体内,CD269-A7D-CS1-hu63 CAR T细胞对MM.1S肿瘤细胞系表现出比CD269-A7D-CD38a或CD269-A7D-CD38b CAR T细胞更强的抗肿瘤作用(背面观)。对NSG小鼠进行亚致死性照射，并静脉内注射表达4.0x106荧光素酶的MM.1S细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成。注射肿瘤细胞后10天开始，向小鼠静脉内注射10到106个的CD269-A7D-CD38a，CD269-A7D-CD38b或CD269-A7D-hu63 CAR T细胞或载体对照T细胞。在第9天和第12天，给小鼠皮下注射RediJect D-荧光素并进行IVIS成像。背视图如图显示。
图40D.CD269-A7D-CS1-hu63 CAR T细胞在体内对MM.1S肿瘤细胞系表现出比CD269-A7D-CD38a或CD269-A7D-CD38b CAR T细胞更强的抗肿瘤作用(侧面视图)。对NSG小鼠进行亚致死性照射，并静脉内注射表达4.0x106荧光素酶的MM.1S细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成。注射肿瘤细胞后10天开始，向小鼠静脉内注射10到106个CD269-A7D-CD38a，CD269-A7D-CD38b或CD269-A7D-hu63 CAR T细胞或载体对照T细胞。在第9天和第12天，给小鼠皮下注射RediJect D-荧光素并进行IVIS成像。腹视图如图显示。
图41A.CD19b-IL-15/IL-15sushi(CD19b-IL-15/IL15sushi)CAR T细胞的表达。通过FACS对比对照T细胞测量表达。CD19b-IL-15/IL15sushi CAR T细胞是通过对患者或供体T细胞进行病毒转导，装配CAR基因构建体而产生的。然后将翻译后的抗CD19b蛋白表达在CART细胞表面，识别并结合肿瘤细胞表面的CD19靶蛋白。CD19b-IL-15/IL-15sushi-CAR-T细胞的药理作用和机制是通过CD19b-CAR对抗原的识别来介导的，激活CD3zeta/Zap70的细胞毒性T细胞活性,通过将CD28共激活域掺入到构建物中进一步增强。FACS分析表明，CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR能够在大约35％的T细胞和分泌的IL-15/IL-15sushi复合物中表达。此外，与标准CAR细胞相比，装配IL-15/IL-15sushi为CAR T细胞提供了额外的刺激，使细胞增殖和效能增强。P2A，对照载体。
图41B.CD19b-IL15/IL-15sushi-CAR T细胞能有效溶解CD19+SP53细胞。以1:1-5:1的效应靶比(E:T)共培养24小时，并用流式细胞仪分析小鼠抗人CD3pPerCp和小鼠抗人CD19-PE。每个分析包括与P2A载体对照或CAR T细胞一起培养的靶细胞(Sp53-all-CD19+)。总结细胞毒性活性的条形图(右)。N＝2。这个实验显示了CD19b-IL-15/IL-15sushi CART的剂量依赖性，即使在低E:T比(如1:1)下，肿瘤细胞的有效溶解率也超过60％。在2:1时，几乎所有的肿瘤细胞都被裂解，杀伤能力达到饱和。
图41C.CD19b-IL-15/IL-15sushi-CAR T细胞能有效溶解CD19+Sp53细胞(与CD19b-CAR T细胞相比)。共培养条件如上类似(图41B)。在本实验方案中，将装配好了的CD19b(CD19b-IL-15/IL-15sushi)CART细胞与CD19阳性的REH细胞、B-ALL细胞进行培养，并与对照P2A和抗CD19b-CART细胞进行比较。抗CD19b-CART细胞是用同样的方法产生的，T细胞表面的表达约占所有T细胞的50％(数据未显示)。结果表明，在低E:T比率(如1:1)下，两种CAR T治疗都是同样有效的，效果强大，且近乎所有抗原阳性的Reh细胞都消除。“装配IL-15”对CAR T细胞的细胞毒性没有负面影响。
图42A.基于CD19的CARs在体内对REH细胞的消除，共表达IL-15/IL-15sushi使抗肿瘤的免疫反应有效增强。在第1天给小鼠注射表达荧光素酶的REH肿瘤细胞(0.5x106细胞/小鼠)。第3天，进行IVIS活体成像以检测REH细胞的情况。在第4天，注射对照T细胞、CD19b-CAR和CD19b-IL15/IL15sushi-CAR T细胞(～7.5x106个细胞/小鼠)，在第6天到第22天，进行IVIS成像，以进行半定量评估肿瘤负担和随后的肿瘤消除及T细胞对细胞生长的控制。在这里，两种CART治疗显示出相似的疗效，与标准CART19细胞相比，配有IL-15/IL-15sushi的CAR对REH肿瘤生长的控制能力相当或更好。
图42B.治疗群的IVIS值(估计肿瘤负荷)与时间的关系图。随着对照组内肿瘤负荷的增加，两个CART组均能稳定持续抑制肿瘤，通过统计分析测得的肿瘤数显着降低。
图42C.长期比较CD19b-CAR-T(CART19)与CD19b-IL-15/IL15sushi CAR的抗REH细胞能力。实验方案与上述IVIS方法类似；不同的是，追踪小鼠直到看到肿瘤复发的迹象。在这里，30天后，我们观察到在普通CART19治疗的小鼠中，侵袭性REH肿瘤开始出现复发。在大多数CART19小鼠中可以看到成簇的肿瘤(IVIS成像小鼠上的红色区域)，CD19b-IL-15/IL-15sushi-CART治疗的小鼠在第22天也显示出肿瘤生长。在第30天后，所有CART19小鼠均出现严重肿瘤复发的迹象，而CD19b-IL-15/IL-15sushi-CART治疗的小鼠未出现肿瘤迹象。即使是第22天复发的小鼠在第32天肿瘤也被消除，这表明CD19b-IL-15/IL-15sushi-CART细胞仍有效处于体循环中。
图42D.装配IL-15/IL-15sushi能够防止普通CAR T失败后疾病复发。IVIS趋势值的折线图总结，评估每个治疗组的肿瘤生长随时间的变化。在过去的第30天，与装配有CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR的治疗组相比，普通CD19b-CAR(CART19)治疗组小鼠的肿瘤负担急剧上升，而后者基本上没有肿瘤。小鼠两个视图的值如图(腹侧和背侧图像采集视图)。
图42E.低剂量的CAR T细胞可防止细胞因子风暴。第1天给小鼠注射表达荧光素酶的REH肿瘤细胞(总细胞数为0.5x106个/只)。第3天，通过IVIS成像检测循环中REH细胞的情况。方法与图42C相同；然而，每只小鼠仅注射0.5x106和1.0x106 CAR T或对照细胞，以测定潜在副作用的最低有效剂量。进行这项实验的原因是，尽管图42C中的武装了的CAR(分泌IL-15/IL-15sushi)的小鼠队列在IVIS成像检测时，显示出强大的肿瘤消除作用和肿瘤生长的强大的抑制能力，但最终，由于细胞因子风暴，小鼠到了生存终点。因此，有必要确定CART的剂量，找到最低有效剂量，使严重副作用的风险降到最低。我们发现，尽管在普通CART19或装配好的CAR T队列中，每只小鼠0.5x106总T细胞的剂量太低，
无法控制肿瘤，但在两种CAR T模型中，1.0x106细胞的剂量(比常规剂量少10倍，即小鼠中1000万个CAR T细胞)足以在没有细胞因子风暴的情况下控制肿瘤生长。因此，装甲CAR疗法的转化需要较低剂量的给药，因为IL-15/IL-15sushi装甲CAR的效力和持久性增加也可能与细胞因子释放的风险增加有关，导致危险的副作用。
图43A.小鼠血液数据的总体总结(小鼠体内CAR T细胞的持续性总结)。图42C所示在小鼠处死时分析，小鼠模型血液中T细胞的整体持久性,并通过流式细胞术，使用CD3抗体对大量T细胞群进行筛选。为了进一步了解CD19b-IL-15/IL-15sushi装甲CAR的持久性，有必要采集小鼠血液，以显示细胞植入人体的持久性。总的来说，我们通过流式细胞术分析发现，与标准CART19组相比，装甲CAR组的T细胞平均计数更高。由于体内循环肿瘤的最小刺激，对照组T细胞如预期那样保持在基线水平。
图43B.移植小鼠血液(个体)的表型特征。通过进一步分析CD3阳性亚群中的CD8表达，图42C中的小鼠血液，以了解小鼠存活终点时循环中残留的细胞毒性T细胞的持久性性。特别值得注意的是，装甲CAR队列小鼠血液中的细胞毒性CD8+T细胞数量要高得多，这意味着杀伤肿瘤的T细胞的扩增力大大增强，不仅仅是通过标准靶细胞参与的信号转导，还包括基于IL-15/IL-15sushi的细胞因子分泌复合物，与标准CART19队列的比较，CAR治疗的标准反应通过靶细胞参与作用和随后的信号反应来实现细胞扩张。
图43C.进一步剖析移植的CAR T表型特征。通过分析CD4和CD8群体亚群，进一步比较CD19b(CART19)和CD19b-IL-15/IL-15sushi CART细胞之间的小鼠血液特征(见图42B)。总的来说，装甲CAR队列中CD3+细胞数量较多，与持续性增加相关，装甲CAR队列中CD3+效应T细胞群中CD8+细胞平均数较高，装甲CAR T细胞承载中枢记忆免疫表型的能力增强，与改善免疫监控相关。
图43D.将检测到的剩余CD19b-IL-15/IL-15sushi CART细胞移植到新的小鼠宿主体内。这项实验的基本原理是证明IL-15/IL-15sushi“装甲”CAR T细胞不会因为工程化的细胞因子支架增强自身功能而永生。亚致死照射后，将0.5x106细胞经静脉注射到每只NSG小鼠体内。第二天，将5.6x106个CD19b-CAR-T细胞(CART19)或CD19b w/增强子(CD19b-IL-15/IL-15sushi)CAR-T细胞经静脉注射到每只小鼠体内。这种情况作为第一个基础，注射的CAR-T细胞将与靶细胞结合并扩张，以便为移植提供足够的细胞材料。
第36天，处死两组小鼠，收集全血和脾脏，流式细胞术分析CART19细胞或CD19b-IL-15/IL-15sushi T细胞的存活情况。用BD-Pharm-Lyse缓冲液(BD-Biosciences)裂解血液和均质脾脏中的红细胞。流式细胞仪分析显示小鼠体内持续存在CD19b-IL-15/IL-15sushi CART细胞(蓝点绿色圆圈)。我们观察到循环组织中收集的装甲CART细胞比CART19细胞多。匀浆脾细胞用CD3和CD45抗体标记,以检测任一CAR T细胞。首先用侧散射(SSC)和CD3表达门控CART细胞，以区别于小鼠细胞(A)，然后用CD45和CD3门控CD3阳性细胞(B)。左图为REH和CD19b-CAR-T细胞治疗的小鼠。右图为REH和CD19bCAR-w增强T细胞治疗的小鼠。我们只检测到装甲CAR队列小鼠的CD3阳性CAR T细胞(蓝色圆点用绿色圈起)。为了确定CAR-T细胞的免疫表型，用CD8和CD4抗体标记细胞(C)。FACS数据表明CD19b-IL-15/IL-15sushi-T细胞是CD8阳性细胞，而不是CD4阳性细胞。最后，将每只NSG小鼠脾匀浆中0.5x106个细胞注入2只小鼠，观察装甲CAR T细胞的自主生长情况。
图43E.CD19bCAR和CD19b-IL-15/IL-15sushi T细胞移植小鼠随时间的总通量值(光子/秒)比较。两组小鼠随时间变化的细胞荧光IVIS成像。IVIS荧光在这里代表了移植细胞质量的半定量估计。在这种情况下，自体荧光强度保持在背景水平附近，并且没有表现出可检测的变化或通量的增加，从而界定了有限的细胞生长或新细胞的扩张。移植小鼠未见肿瘤生长及T细胞扩张。
图43F.第64天移植小鼠中检测不到的T细胞和肿瘤群。在第64天，我们收集每只小鼠的面部外周血，并使用CD3和CD19抗体进行标记，使用FACS分析评估REH肿瘤细胞或CAR-T细胞的存在。我们无法在任何一只小鼠的面部外周血样本中检测到REH细胞或CAR T细胞，这意味着移植后，装甲CAR T细胞无法进一步存活和增殖，或者以其他方式成为不朽的细胞。这可能在临床上具有转化作用，因为装甲CART治疗可能导致肿瘤样CAR T细胞的扩张。
图44A.super1 CAR结构的示意图。通过P2A和T2A链接，生成一个super1CAR，显示一个CAR，GD2 CAR配备4-1BBL和IL-15/IL-15sushi在一个单一的结构。该结构由一个SFFV启动子驱动CAR、4-1BBL和IL-15/IL-15sushi三个片段的表达。链接器(P2A和T2A)断裂后，CAR(GD2 CAR)、4-1BBL和IL-15/IL-15sushi分裂并与靶向靶点。CAR具有单链抗体、铰链区、跨膜区、共刺激区(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号转导、CD3-zeta链，4-1BBL或IL-15/IL-sushi或两者均能与CD28或4-1BB协同发挥T或NK细胞活化和持续或抗肿瘤活性。
图44B.GD2-Super1-CAR-T细胞几乎消除了小鼠肝脏中的Y79细胞
(A)流式细胞术分析显示Y79肿瘤(蓝点)在不同形式的抗GD2-CAR T细胞治疗的小鼠肝脏中持续存在。经尾静脉注射Y79细胞(1x106细胞)3天后，静脉注射CAR T细胞(10x106细胞)。Y79肿瘤注射后第30天处死小鼠，取肝脏匀浆，观察CART疗效。用小鼠抗人CD3和CD56抗体标记匀浆肝细胞，分别检测人T细胞和Y79肿瘤细胞。左侧显示了给了的对照T细胞的一个鼠；小鼠使用GD2CAR(左中)、GD2-4-1BBL CAR(右中)和GD2-Super1 CAR(右)T细胞处理。肿瘤细胞的清除与高标记的T细胞有关。GD2-4-BBL-CAR是一种共表达4-1BBL配体的GD2-CAR。
(B)显示每只CAR处理小鼠对Y79细胞的杀伤活性百分比的图表，与对照小鼠相比(n＝2)。特别是从这些数据来看，只有GD2 Super1 CART能够真正清除肝脏中的Y79细胞。
图44C.GD2-Super1-CAR T细胞在小鼠脾脏中表现出更强的持久性
(A)流式细胞术分析显示，不同形式的抗GD2-CAR-T细胞处理的小鼠肝脏中存在CAR-T细胞(环状)。经尾静脉注射Y79细胞(1x106细胞)3天后，静脉注射CAR T细胞(10x106细胞)。Y79肿瘤注射后第30天处死小鼠，取脾脏匀浆，观察CART的疗效。用小鼠抗人CD3和CD45抗体标记匀浆脾细胞，检测人T细胞。左侧显示了一个给了对照T细胞的小鼠表示；小鼠使用GD2CAR(左中)、GD2-4-1BBL CAR(右中)和GD2-super1 CAR(右)T细胞处理。
(B)显示处理组小鼠CAR T细胞比对照组小鼠加倍的图表(n＝2)。从这些数据来看，尤其是GD2超级CAR T细胞在小鼠脾细胞中的扩增效果明显好于对照T细胞。
图44D.小鼠血液中CAR T细胞的持久性
(A)流式细胞术分析显示，不同形式的抗GD2-CAR-T细胞处理后，小鼠全血中的CAR-T细胞(环状)持续存在。经尾静脉注射Y79细胞(1x106细胞)3天后，静脉注射CAR T细胞(10x106细胞)。Y79肿瘤注射后30天处死小鼠，采集全血，观察CART的持续性。用小鼠抗人CD3和CD45抗体标记全血细胞，检测人T细胞。左侧显示了给了对照T细胞小鼠；小鼠用GD2CAR(左中)、GD2-4-1BBL CAR(右中)和GD2-Super1 CAR(右)T细胞处理。
图44E.表示全血样本中人类T细胞持续性百分比的条形图，通过流式细胞术分析的总细胞数(n＝2个)
图45.cCAR-T结构的示意图。该结构体包含驱动由P2A肽连接的CARs的多个模块化单元的表达的SFFV启动子。在连接子裂解时，cCAR分裂并接合在表达CD123b和/或CLL1的靶上。作为新的cCAR结构体，该结构体的激活域可包括但不限于CD123上的4-1BB段和CD28。
图46A.CD123b-CLL1 CAR T细胞的表达。用抗CD3抗体激活外周血单个核细胞3天。用对照载体(左)或CD123b-CLL1-CAR(右)慢病毒上清液转导细胞。孵育3天后，收集细胞并标记流式细胞仪。
图46B.在共培养分析中，CD123b-CLL1 CAR T细胞有效裂解合成表达CLL-1的REH肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比共培养24小时，并通过流式细胞仪直接分析CLL-1和CD3。每个分析包括单独的REH靶细胞(左图)、对照T细胞(中间图)和CLL1-CD33b CAR T细胞(右图)。REH细胞用紫色圆点表示。
图46C.在共培养分析中，CD123bCLL1 CAR T细胞有效裂解合成表达CD123的Jurkat肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比共培养24小时，并通过流式细胞仪直接分析CD123和CD3。每个分析包括对照T细胞(左图)和CD123bCLL1CAR T细胞(中间图)。表达CD123的靶Jurkat细胞和单独的对照T细胞如右图所示。部分表达CD3的Jurkat-123细胞被圈出并用紫色圆点表示。
图46D.共培养试验中CD123b-CLL1 CAR T细胞不裂解野生型REH肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比共培养6小时，并通过流式细胞仪直接分析CD19和CD3。每个分析包括对照T细胞(左图)和CD123b-CLL1 CAR T细胞(中间图)。右侧显示的REH野生型细胞单独用浅蓝色圆点表示。
图46E.共培养试验中CD123bCLL1 CAR T细胞不裂解野生型Jurkat肿瘤细胞系。Jurkat细胞用CMTMR染色，以区别于T细胞。以2:1或5:1的效应靶比共培养6小时，并通过流式细胞仪直接分析CMTMR和CD3。每个分析包括对照T细胞(左图)和CD123bCLL1 CAR T细胞(中间图)。右侧仅显示Jurkat细胞。部分表达CD3的Jurkat细胞被圈出并用橙色圆点表示。
图47.cCAR-T结构的示意图。所述构建体包含驱动由P2A肽连接的CARs的多个模块单元的表达的SFFV启动子。在所述连接子被切割后，所述cCAR、CD20c-CD19b cCAR分裂并接合在表达CD20和/或CD19的靶上。作为新的cCAR构建体，所述构建体的激活域可包括但不限于：CD20c CAR段为4-1BB，CD19bCAR段为CD28区域。
图48A.cCAR-T结构示意图。所述构建体包含驱动由P2A肽连接的CARs的多个模块单元的表达的SFFV启动子。在所述连接子被切割后，所述cCAR、CD20h-CD19b cCAR分裂并接合在表达CD20和/或CD19的靶上。作为新的cCAR构建体，所述构建体的激活域可包括但不限于：CD20h CAR段为4-1BB，CD19bCAR段为CD28区域。cCAR中的CD20h-CAR片段包括针对CD20表达细胞的人源化抗CD20单链抗体。
图48B.CD20cCD19b CAR T细胞的表达。用抗CD3抗体激活单个核细胞3天。用对照载体(左)、CD20cCD19b或CD20hCD19b-CAR(右)慢病毒上清液转导细胞。孵育3天后，收集细胞并标记流式细胞仪。
图48C.共培养试验中，CD20cCD19b和CD20hCD19b CAR T细胞不能消除K562肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比共培养6小时，并通过流式细胞术直接分析CD3和CD45。每个分析由K652靶细胞(右)、对照T细胞(左)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)组成。靶细胞用蓝点表示。(N＝2)
图48D.共培养试验中cCAR T细胞裂解合成表达K562肿瘤细胞系的CD19。以2:1或5:1的效应靶比共培养24小时，并通过流式细胞仪直接分析CD19和CD3。每个分析包括单独的K562-CD19xp靶细胞(K562表达CD19，K-19)(右侧)、对照T细胞(左侧)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)。靶细胞用绿点表示。
图48E.在共培养分析中，cCAR T细胞裂解合成表达K562肿瘤细胞系(K-20)的CD20。以2:1或5:1的效应靶比共培养24小时，并通过流式细胞仪直接分析CD20和CD3。每个分析包括单独的K562-CD20xp靶细胞(K-20)(右侧)、对照T细胞(左侧面板)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)。靶细胞用紫色圆点表示。
图48F.在共培养试验中，cCAR T细胞完全裂解表达CD19的REH肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比共培养24小时，并通过流式细胞仪直接分析CD19和CD3。每个分析由单独的REH靶细胞(右侧)、对照T细胞(左侧面板)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)组成。靶细胞用橙色圆点表示。
图48G.cCAR T细胞完全裂解SP53肿瘤细胞系，其在共培养试验中同时表达CD19和CD20抗原。以2:1或5:1的效应靶比共培养24小时，并通过流式细胞仪直接分析CD19和CD3。每个分析由单独的SP53靶细胞(右侧)、对照T细胞(左侧)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CART细胞(中间)组成。靶细胞用青绿色圆点表示。(N＝2)
图48H.共培养结果总结。K562wt(野生型)：6小时共培养。其他24小时。(N＝2)
图49A.CD20h-CD19b cCAR T细胞对CD19+Reh B-ALL细胞系(FACS)的消融表现出剂量依赖性。为了确定CD20h-CD19b CAR T细胞的抗肿瘤活性的剂量依赖性，我们对CD19+B-ALL肿瘤细胞系进行了共培养，E:T比率从0.25上升到1(25000T细胞到100000REH细胞)。共培养过夜，并用CD3和CD19抗体标记，然后进行FACS分析残余肿瘤细胞。我们发现，一般而言，随着效应细胞数量的增加，靶细胞裂解率越高。如下图。图49B.CD20h-CD19b cCAR T细胞对CD19+Reh B-ALL细胞系的消除表现出剂量依赖性(图)。为了了解CD20h-CD19b CAR T细胞的抗肿瘤活性的剂量依赖性，我们对CD19+B-ALL肿瘤细胞系进行了共培养，E:T比率从0.25上升到1(25000T细胞到100000REH细胞)。共培养过夜，并用CD3和CD19抗体标记，然后进行FACS分析分析残余肿瘤细胞量。
图49C.CD20h-CD19b cCAR T细胞能够靶向清除原代B-ALL细胞，但不能靶向非靶向的白血病细胞。为了进一步检测CD20h-CD19b-CART细胞的抗肿瘤活性，我们对表达CD19和CD20(B-ALL-25)的原代CD19+B-ALL白血病细胞进行了共培养。为了分析CD20h-CD19b-cCAR的特异性，我们还对抗原阴性、CD19和CD20均阴性、CD34阳性的原发性白血病细胞进行了共培养。B-ALL-25和阴性对照原代白血病细胞均预先用细胞追踪染料CFSE标记，以区分效应T和靶肿瘤细胞群。FACS对B-ALL-25(左)共培养的分析显示，靶向的原发性白血病细胞被深度消融，即使E:T比为2:1，也显示完全消融。对阴性对照原代细胞共培养(右)的分析表明，cCAR对大量抗原阴性群体没有效果。
图50.在体内，CD20hCD19b-CAR-T细胞对表达CD19抗原的REH肿瘤细胞株具有抗肿瘤作用。对NSG小鼠进行亚致死照射，并静脉注射1.0x106表达荧光素酶的REH细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后6天开始，给小鼠静脉注射10x106CD20hCD19b CAR T细胞或载体对照T细胞。在第5天、第9天和第12天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。(图50A)背视图；(图50B)腹视图。
图51A.脐血中自然杀伤(NK)细胞扩增步骤。
图51B.自然杀伤(NK)细胞在有或没有CAMPATH刺激的情况下扩张的比较。脐血细胞在含有10％FBS和IL-2的T细胞培养基中，在CAMPATH包被或未包被培养瓶中培养。使用CD56和CD3抗体(蓝色圆圈)标记，通过流式细胞术分析测定总细胞中NK细胞的数量。这些数据表明，在CAMPATH刺激下，NK细胞的数量随培养天数增加而增加。
图52A.使用不同培养基(包括10％FBS和IL-2)，并在CAMPATH刺激进行自然杀伤(NK)细胞扩增的比较。脐血细胞在T细胞培养基或含10％FBS和IL-2的SCGM培养基中培养。使用CD56和CD3抗体(蓝色圆圈)标记，通过流式细胞术分析检测总细胞中NK细胞的数量。这些数据表明，在有CAMAPTH刺激的T细胞培养基中，NK细胞的数量比有CAMAPTH刺激的SCGM培养基中增加更多，且呈日依赖性。
图52B.使用不同培养基(包括10％FBS和IL-2)的自然杀伤(NK)细胞在CAMPATH刺激下的细胞生长曲线。每隔一天对在T细胞培养基和SCGM培养基中NK细胞的数量进行计数。这些数据表明，与使用SCGM培养基相比，使用CAMAPTH刺激的T细胞培养基在NK细胞扩增方面更为优越。
图53A.使用不同培养基(包括5％人血清和IL-2)，并在CAMPATH刺激进行自然杀伤(NK)细胞扩增的比较。脐血细胞在T细胞培养基或含5％人血清和IL-2的SCGM培养基中培养。使用CD56和CD3抗体(蓝色圆圈)标记，通过流式细胞术分析检测总细胞中NK细胞的数量。这些数据表明，在有CAMAPTH刺激的T细胞培养基中，NK细胞的数量比有CAMAPTH刺激的SCGM培养基中增加更多，且呈日依赖性。
图53B.使用不同培养基(包括5％人血清和IL-2)的自然杀伤(NK)细胞在CAMPATH刺激下的细胞生长曲线。为评价不同类型的细胞培养液和人血清替代FBS作为NK细胞培养液的效果，每隔一天对NK细胞进行计数。这些数据表明，与使用SCGM培养基相比，具有CAMAPTH刺激的T细胞培养基可使NK细胞的扩增更多。
图54A.添加或不添加IL-15的情况下，在CAMPATH刺激下，新鲜脐血中自然杀伤(NK)细胞的扩增比较。为探讨细胞培养液中添加IL-15对脐血NK细胞增殖的影响，新鲜脐血细胞在含10％FBS和IL-2的T细胞培养液中，用CAMPATH包被细胞培养瓶培养。使用CD56和CD3抗体(蓝色圆圈)标记，通过流式细胞术分析检测总细胞中NK细胞的数量。这些数据表明，在含有CAMAPTH的T细胞培养基中加入IL-15后，NK细胞的数量以日依赖的方式增加。
图54B.在添加或不添加IL-15的情况下，使用CAMPATH刺激，新鲜脐血中提取的自然杀伤(NK)细胞的细胞生长曲线。为探讨细胞培养液中加入IL-15对新鲜脐血NK细胞增殖的影响，隔日计数NK细胞数。这些数据表明，与不添加IL-15相比，在T细胞培养基中添加IL-15更能促使NK细胞的扩增。
图54C.将CD19b-CAR-、CD19b-IL15/IL15sushi-CAR、BCMA-A7D-IL15/IL15sushi-CAR或GFP转导至NK细胞。通过流式细胞术分析(红色圆圈)测定CAR或GFP慢病毒转导后NK细胞上(A)CD19b-CAR-，(B)CD19b-IL15/IL-15sushi-CAR-，(C)BCMA-A7D-IL15/IL15sushi-CAR-或(D)GFP-的表达水平，并与对照NK细胞进行比较(左图)。和GFP-相比，流式细胞术检测细胞表面CD19b-CAR-(A)、CD19b-IL15/IL15sushi-CAR-(B)、BCMA-A7D-IL15/IL15sushi-CAR-(D)的表达率分别为42％、39％、51％和76％。
图55.此方法可应用于任何与细胞因子释放相关的CAR。
图56.低剂量CD269-A7D-IL15/il15sushi-CAR-T细胞可导致与高剂量T细胞相似的肿瘤细胞消融，但可避免细胞因子释放综合征。两个独立实验的总结。在这两种情况下，NSG小鼠均接受亚致死照射并静脉注射4.0x106
表达荧光素酶的MM.1S细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后9天开始，小鼠静脉注射10x106载体对照T细胞，以及10x106(实验1，左侧)或2x106 CD269-A7D-IL15/IL15sushi(A7D-IL15/IL15sushi)CART细胞(实验2，右)。在第7天或第8天、第11天和第15天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。仅背面视图。
图57.配备了细胞因子和趋化因子的CAR VAC1示意图。该构建体由驱动CAR表达的SFFV启动子、由P2A肽连接的分泌细胞因子和由T2A分离的分泌趋化因子组成。在切割P2A和T2A肽后，VAC1分裂为CAR、细胞因子和趋化因子。CAR包含单链抗体、铰链区(H)、跨膜结构域(TM)、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号传导cd3zeta链。其中铰链区有一个安全开关，即两个CD20模拟表位(也称为Q)，可通过利妥昔单抗(RTX)快速有效地清除CAR T细胞。用于本研究的免疫细胞可包括但不限于：T细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-92细胞。一种共表达下列细胞因子之一的CAR VAC1工程细胞，包括：IL-2、IL-7、IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-12、IL-18和IL-21。
图58.装有IL-15/IL-15sushi和CCL19的VAC1 CAR示意图。该构建体由一个驱动CAR表达的SFFV启动子和一个由P2A肽连接的IL-15/IL-15sushi结构域，以及一个由T2A分离的CCL19组成。在切割该P2A和T2A肽后，CAR VAC1CAR分裂为一个CAR、一个IL-15/IL-15sushi和CCL19。CAR包含单链抗体、铰链区(H)、跨膜结构域(TM)、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号传导cd3zeta链。其中铰链区带有一个安全开关，即两个CD20模拟表位(也称为Q或RQR)，通过利妥昔单抗(RTX)治疗，使CAR T细胞能够快速有效地被消灭。用于本研究的免疫细胞可包括但不限于：T细胞、NK细胞、TNK细胞、NK-92细胞或NKT细胞。
图59.装有IL-15/IL-15sushi锚、一种分泌趋化因子和一种分泌细胞因子的VAC2CAR示意图。该构建体由驱动CAR表达的SFFV启动子、由P2A肽连接的IL-15/IL-15sushi锚(也称为锚)、由T2A分离的趋化因子和由P2A分离的细胞因子组成。当这些启动子被裂解时，CAR VAC2分裂为CAR、IL-15/IL-15sushi锚、分泌趋化因子和分泌细胞因子。锚定的IL-15/IL-15sushi部分由IL-15蛋白通过26个氨基酸的聚脯氨酸连接体与IL-15α受体的sushi结构域融合而成。CAR和锚都由一个铰链(H)区和一个跨膜结构域(TM)组成。其中铰链区域承载一个安全开关，两个CD20模拟表位。CAR还具有单链抗体、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号cd3zeta链，而锚不携带这些成分。IL-15/IL-15sushi锚在T或NK细胞或NK T细胞表面。CAR-VAC2工程细胞共表达以下任一种细胞因子，包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、GM-CSF和TGF-。
图60.装有IL-15/IL-15sushi锚,分泌CCL-19和分泌IL-12的VAC2 CAR示意图。该结构由驱动CAR表达的SFFV启动子、由P2A肽连接的IL-15/IL-15sushi锚(也称为锚)、由T2A分离的CCL-19和由P2A分离的IL-12组成。在这些肽被裂解后，CAR VAC2分裂为CAR、IL-15/IL-15sushi锚、分泌CCL-19和分泌IL-12。锚定的IL-15/IL-15sushi部分由IL-15蛋白通过26个氨基酸的聚脯氨酸连接体与IL-15α受体的sushi结构域融合而成。CAR和锚都由一个铰链(H)区和一个跨膜结构域(TM)组成。其中铰链区带有一个安全开关，即两个CD20模拟表位，通过利妥昔单抗(RTX)治疗可以快速有效地清除CAR T细胞。CAR还具有单链抗体、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号cd3zeta链，而锚定不携带这些成分。IL-15/IL-15sushi锚定在T细胞或NK细胞或NK T细胞表面。
图61A.装有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19的4-Q-XX CAR示意图。该构建体由驱动CAR表达的SFFV启动子和由P2A肽连接的分泌性细胞因子组成，P2A肽是一种由T2A分离的分泌性趋化因子。在P2A和T2A肽切割后，CD4-Q-XX CAR分裂为CAR、细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19。CAR具有抗CD4单链抗体、铰链区(H)、跨膜结构域(TM)、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号传导CD3zeta链。用于本研究的免疫细胞可包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-92细胞。其中铰链区(H)承载一个安全开关、两个CD20模拟表位。
图61B.在转导后第6天产生CD4-Q-XX-CAR表达的人类T细胞。用慢病毒载体转导活化的人外周血T细胞，流式细胞仪分析。a)对照组(左)和转导组(右)用山羊抗小鼠F(Ab')2和小鼠抗人CD3抗体标记T细胞，以测定CAR百分比。b)对照(左)和转导(右)T细胞，标记小鼠抗人CD3和小鼠抗人CD4抗体，以确定CD4+T细胞的自我杀伤效力。c)对照(左)和转导(右)，T细胞标记小鼠抗人CD20(利妥昔单抗)和小鼠抗人CD3抗体，以确定T细胞表达CD20模拟表位的百分比。
图61C.CD4-Q-XX-CAR-T细胞在体外共培养22小时试验中有效裂解靶CCRF-CEM细胞。用膜染色细胞跟踪器对CCRF-CEM细胞进行预标记，以区别于T细胞。用对照T细胞或CD4-Q-XX-CAR T细胞以5：1的效应细胞：靶细胞比例与预先标记的CCRF-CEM肿瘤细胞进行共培养22小时。孵育后，用小鼠抗人CD3和CD4抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。(A)单纯CCRF-CEM细胞(左图)、与对照T细胞(中图)和CD4-Q-XX转导T细胞(右图)共培养的CCRF-CEM细胞的流式细胞术分析。用CellTracker CMTMR染料对靶细胞进行预染色。数据门控如CMTMR和CD3所示。蓝圈红点与效应T细胞共培养显示存活的靶细胞。(B)条形图显示22小时共培养试验后，CD4-Q-XX转导的T细胞与对照T细胞相比对CCRF-CEM细胞的靶细胞裂解百分比(n＝2)。数据以平均值+标准差表示。
图61D.利妥昔单抗治疗后小鼠全血中人类CD4-Q-XX-CAR T细胞的消耗。对5只NSG小鼠进行亚致死照射，并静脉注射10x106 CD4-Q-XX CAR T细胞(第1天)。在第5天、第6天、第7天、第9天和第13天，两只小鼠皮下注射150μL的盐水溶液(对照组；小鼠1和2)，其余三只小鼠注射15μL/150μL的利妥昔单抗(治疗组；小鼠3、4和5)。第15天，收集所有小鼠的外周血。用山羊抗小鼠F(Ab′)2、小鼠抗人CD45、CD3和CD20模拟表位抗体标记血样，流式细胞术检测CD4-CAR表达和重组CD20模拟表位表达。(A)CD45为人细胞(蓝点)。(B)CAR T细胞(红色圆圈)。表达CD20模拟表位的T细胞(绿色圆圈)。
图61E.小鼠中，利妥昔单抗给药对带有“安全开关”的工程化CAR T细胞的影响。图中显示了小鼠接受利妥昔单抗治疗后全血中CD4-Q-XX-CAR T细胞的减少。流式细胞术分析显示，90.4％的CD4-Q-XX CAR T细胞在利妥昔单抗治疗后被消除。
图61F.细胞培养基中存在或不存在外源性IL-2时CD4-Q-XX-CAR-NK92细胞的细胞生长分析。取0.2x106个未转导或分选的CD4-Q-XX转导的NK92细胞悬浮于1ml含或不含外源性IL2的新鲜NK92细胞培养基中。每隔一天(至第6天)计数细胞，并在每个细胞悬浮液中加入等量的含或不含IL2的新鲜NK92细胞培养基。折线图显示有和没有IL-2情况下，未转导和转导NK-92细胞的扩增率
图62A.装有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19的19-Q-XX CAR的示意图。该构建体由驱动CAR表达的SFFV启动子和由P2A肽连接的分泌性细胞因子组成，P2A肽是一种由T2A分离的分泌性趋化因子。在P2A和T2A肽切割后，CD19-Q-XX CAR分裂为CAR、细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19。CAR具有单链抗体、铰链区(H)、跨膜结构域(TM)、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号传导途径CD3zeta链。用于本研究的免疫细胞可包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-92细胞。其中铰链区有一个安全开关，即两个CD20模拟表位(也称为Q)，使CART细胞能被利妥昔单抗(RTX)快速有效地清除。
图62B.CD19b XX和CD19b-IL15/IL15sushiCAR T细胞的表达。用抗人CD3抗体激活人外周血单个核细胞2天。细胞经对照载体(左)、CD19b-IL15/IL15sushi(中心)或CD19B XXCAR慢病毒载体(右)慢病毒上清液进行转染。培养4天后，取细胞，用山羊抗人F(Ab')2和小鼠抗人CD3抗体标记并进行流式细胞仪检测。CAR T细胞表示为绿色点(圆圈)。
图62C.在共培养试验中，CD19b-IL-15/IL-15sushi和CD19b-XX-CAR T细胞完全裂解表达CD19表面抗原的REH肿瘤细胞系。每个实验包括与对照T细胞(左图)、CD19b-IL-15/IL-15-sushi(中图)或CD19b-XX-CAR T细胞(右图)以2:1(上图)和5:1(下图)的效应细胞：目标细胞比率与REH靶细胞共同培养。共培养24h，用小鼠抗人CD3和CD19标记细胞，流式细胞仪直接分析。橙色圆点(带圆圈)表示肿瘤细胞。最右边显示的是REH细胞的表型。
图62D.细胞培养基中存在或不存在外源性IL2时，CD19b-Q-XX-CAR-NK92细胞的细胞生长分析。将分选后的CD19b-XX-CAR-NK细胞和野生型NK-92细胞以每毫升0.5x10e6细胞的体积培养在24孔板中，总体积为1毫升。每个的重复对的一个孔含有300IU/mL的IL-2，而另一个孔没有。48小时后(第2天)，对细胞进行计数，体积增加，浓度约0.5x10e6细胞/mL。在第4天和第6天重复此过程。比较XX-结构域功能对细胞生长的影响，比较未转导或分选的CD19b-Q-XX-CAR转导的NK92细胞在无IL-2或IL-2存在时的生长曲线。图中黑色、红色、灰色和蓝色线分别表示培养基中未转导的NK-92细胞+IL-2、分选的CD19b-Q-XX NK细胞+IL-2、未转导的NK92细胞-IL-2或分选的CD19b-Q-XX NK细胞-IL-2的细胞生长曲线。数据以平均值+标准差表示，n＝3个独立实验。
图62E.在异种小鼠模型中，CD19b-XX-CAR-T细胞显示出显着的抗肿瘤活性，并且比CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR T细胞具有更高的持久性。对NSG小鼠进行亚致命性照射，并静脉内注射1.0x106个荧光素酶表达的REH细胞，以诱导可测量的肿瘤形成。注射肿瘤细胞后7天开始，给小鼠进行静脉低剂量疗程注射～0.3x106 CD19b-IL-15/IL-15sushi(三只小鼠，中)或CD19b-XX(三只小鼠，右)CAR T细胞或载体对照T细胞(三只小鼠，左)。在第6天(注射T细胞之前)，第9天(注射T细胞之后)，14、20、29、34和45天，给小鼠皮下注射RediJectD-荧光素并进行IVIS成像。
图62F.与用CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR T细胞治疗的小鼠相比，用CD19b-XXCAR T细胞治疗的注射REH肿瘤细胞的NSG小鼠存活时间更长。在先前图62E中描述的IVIS成像实验之后，每天观察小鼠的疾病严重情况，一旦运动受到严重损害，将其处死。在第27天可以处死所有对照小鼠(未显示)，并在第53天可以处死所有用CD19b-IL-15/IL-15sushiCAR T处理的小鼠(红线)。而所有用CD19b-XX CAR T细胞治疗的小鼠都存活到至少至第60天(蓝线)。两组之间的这种差异通过Mantel-Cox检验(0.0246)和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验(P＝0.0339)分析，具有显着差异性。
图63A.配备有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19的CAR 38-Q-XX CAR(也称为CD38a-Q-XX CAR)示意图。该构建体由驱动CAR表达的SFFV启动子和由P2A肽连接的分泌细胞因子，由T2A分离的分泌趋化因子组成。切割P2A和T2A肽后，CD38-Q-XX CAR分裂为CAR，细胞因子复合物IL-15/IL15-sushi和趋化因子CCL19。CAR具有抗CD38单链抗体，铰链区(H)，跨膜结构域(TM)，共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号传导，CD3 Zeta链。用于这项研究的免疫细胞可以包括但不限于T细胞，NK细胞，NKT细胞和NK-92细胞。其中铰链区带有一个安全开关，两个CD20模拟表位。
图63B.从人外周血制备的表达CD38a-Q-XX-CAR的人T细胞-(a)表达CD38-Q-XX-CAR T细胞，也称为CD38a-Q-XX-CAR T细胞。用抗人CD3抗体激活人外周血单个核细胞2天。用对照载体(左)或CD38a-Q-XX(右)CAR慢病毒载体上清液转导细胞。孵育4天后，收集细胞并用山羊抗人F(Ab')2和小鼠抗人CD3抗体标记，用于流式细胞术。CAR T细胞用蓝色圆点(带圆圈)表示。(b)用小鼠抗人CD3和CD38抗体对上述细胞进行流式细胞术标记。不再表达CD38的T细胞用黑点(带圆圈)表示。(c)用小鼠抗人CD3和CD20模拟表位抗体对上述细胞进行流式细胞术标记。表达利妥昔单抗识别的CD20模拟表位的T细胞用绿点表示(带圆圈)。
图63C.CD38a-Q-XX-CAR-T细胞在体外22小时共培养试验中有效裂解靶REH细胞。(a)CD38a-Q-XX-CART细胞在共培养实验中完全裂解表达CD38表面抗原的REH肿瘤细胞系。每个实验将REH靶细胞(用CMTMR膜染料预先标记以区分它与T细胞)，与对照T细胞(中)、CD38a-Q-XX(右)、CAR T细胞以效应细胞：靶细胞5:1比例共培养。共培养22小时，用小鼠抗人CD3标记细胞，并用流式细胞仪分析。蓝色圆圈表示肿瘤细胞。左侧仅显示REH细胞的表型。(b)条形图显示了22小时共培养试验后，CD38a-Q-XX转导的T细胞与对照T细胞相比对REH细胞的靶细胞裂解百分比(n＝2)。数据以平均值+标准差表示。
图64A.装有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19的CLL1-Q-XXCAR的示意图。该构建体由驱动CAR表达的SFFV启动子和由P2A肽连接的分泌细胞因子组成，P2A肽是一种由T2A分离的分泌性趋化因子。当P2A和T2A肽切割后，CLL-1-Q-XX CAR分裂为CAR、细胞因子复合物IL-15/IL15sushi和趋化因子CCL19。CAR具有单链抗体、铰链区(H)、跨膜结构域(TM)、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号传导途径cd3zeta链。用于本研究的免疫细胞可包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-92细胞。其中铰链区域承载一个安全开关，两个CD20模拟表位。
图64B.CD33-Q-XX CAR(也称为CD33b-Q-XX CAR)的示意图，该CAR配备有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19。该构建体由驱动CAR表达的SFFV启动子和由P2A肽连接的分泌性细胞因子组成，P2A肽是一种由T2A分离的分泌性趋化因子。在P2A和T2A肽切割后，CD33-Q-XX CAR分裂为CAR、细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19。CAR具有单链抗体、铰链区(H)、跨膜结构域(TM)、共刺激结构域(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号传导途径cd3zeta链。用于本研究的免疫细胞可包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-92细胞。其中铰链区有一个安全开关，即两个CD20模拟表位(也称为Q或RQR)，通过利妥昔单抗(RTX)治疗，使CAR-T细胞快速有效地被清除。
图64C.CD33b-XX和CLL1-XX CAR T细胞的表达。用抗人CD3抗体激活人外周血单个核细胞2天。用对照载体(左)、CD33b-XX(中)或CLL1-XX-CAR慢病毒载体(右)上清液转导细胞。孵育4天后，收集细胞，用山羊抗人F(Ab')2和小鼠抗人CD3抗体标记流式细胞术。CAR T细胞用绿点(带圆圈)表示。
图64D.在共培养实验中，CD33b-XX-CAR T细胞完全裂解表达CD33表面抗原的U937肿瘤细胞系。每个实验都由靶细胞U937与对照T细胞(中间)或CD33b-XX-CAR T细胞(右)以效应细胞：靶细胞2:1的比例共同培养。共培养18小时，用小鼠抗人CD3和CD33标记细胞，流式细胞仪分析。蓝点(带圆圈)表示肿瘤细胞。左侧仅显示U937细胞的表型。
图64E.CLL1-XX CAR T细胞在共培养试验中完全裂解表达CLL-1表面抗原的U937肿瘤细胞系。每个实验由7靶细胞U93与对照T细胞(中间)或CLL1-XX CAR T细胞(右)在效应细胞：靶细胞2:1比例共同培养。共培养18小时，用小鼠抗人CD3和CLL-1标记点细胞，流式细胞仪直接分析。蓝点(带圆圈)表示肿瘤细胞。左侧仅显示U937细胞的表型。
图65A.用各种CAR-IL-15慢病毒载体转导分选的NK-92细胞或T细胞在培养基中分泌IL-15。分选的CD33b-XX、CLL1-XX、CD4-XX(图A)、CD4-Q-XX、CD4-Q-Vac、CD19b-Q-XX和CD19b-Vac(图B)CAR NK细胞和转导的CD38a-XX CAR T细胞(图A，仅右侧)在体外扩增，直到细胞计数超过1x106/mL(NK细胞)或2x106/mL(T细胞)。将从这些培养物中提取的上清液(一式两份)置于涂有人IL-15(Boster Biotech)的ELISA多孔板中，并根据制造商的说明进行ELISA实验。使用Spectramax M2酶标仪(Molecular Devices)读取吸光度读数，并根据试剂盒中提供的标准蛋白质曲线将吸光度转换为ng/uL。
图65B.用各种CAR-IL-15慢病毒载体转导的人CAR T细胞，在小鼠全血中分泌IL-15。用尾静脉注射法将表达CD4-XX、CD4-Q-XX、CD19b-Q-XX、CD19b-XX和CD19b-Vac(CD19b-IL-15/L-15sushi)CARs的CART细胞移植到亚致死照射的NSG小鼠体内。植入后将从小鼠体内取出的全血(一式两份)放入涂有人IL-15(Boster Biotech)的ELISA多孔板中，并按照制造商的说明进行ELISA实验。使用Spectramax M2酶标仪(Molecular Devices)读取吸光度读数，并根据试剂盒中提供的标准蛋白质曲线将吸光度转换为ng/uL。(N＝2)。
图65C.用各种CAR-IL-15慢病毒载体转导的T细胞货分选的NK-92细胞在培养基中分泌CCL19。分选的CD33b-XX、CD4-XX、CD4-Q-XX、CLL1-XX和CD19b-Q-XX CAR NK细胞(A)和CD38a-XX、CD4-7xp-15TM-19x和CD19b-7xp-15TM-19x CAR T细胞(B)在体外扩增，直到细胞计数超过1x106/mL(NK细胞)或2x106/mL(T细胞)。从这些培养物中提取的上清液(在两个孔中)放入涂有人CCL19(Boster Biotech)的ELISA多孔板中，并根据制造商的说明进行ELISA实验。使用Spectramax M2酶标仪(Molecular Devices)读取吸光度读数，并根据试剂盒中提供的标准蛋白质的曲线将吸光度转换为ng/μL。
图65D.用各种CAR-IL-15慢病毒载体转导的人CAR T细胞，在小鼠全血中分泌IL-15。通过尾静脉注射将表达CD4-XX或CD19b-Q-XX-CAR的CART细胞移植到亚致死性照射的NSG小鼠体内。植入后将从小鼠体内取出的全血(一式两份)放入涂有人IL-15(BosterBiotech)的ELISA多孔板中，并按照制造商的说明进行ELISA实验。使用Spectramax M2酶标仪(Molecular Devices)读取吸光度读数，并根据试剂盒中提供的标准蛋白生成的曲线将吸光度转换为ng/uL。(N＝2)。
图66.用CLL-1-CD33-cCAR治疗的患者获得完全缓解。A、在cCAR治疗开始时，白血病细胞占骨髓的98％。B、cCAR输注后19天，患者骨髓中发生了白血病细胞和髓系细胞被消除，仅有CART细胞存在。流式细胞仪检测证实了该结果，流式细胞仪分析和形态学研究显示白血病细胞被消除。胸骨活检也显示了类似的发现。
图67.应用CD123-CD33-cCAR和cCAR清除胸膜腔AML细胞。
图68.BCMA-CD19CART细胞在体内对表达BCMA的MM.1S和表达CD19的REH肿瘤细胞株均有较强的抗肿瘤作用。对NSG小鼠进行亚致死性照射并静脉注射4.0x106表达荧光素酶的MM.1S细胞(第0天)或1.0x106表达荧光素酶的REH细胞以诱导可测量的肿瘤形成。从注射MM.1S肿瘤细胞后8天开始和注射REH肿瘤细胞后4天开始，给小鼠静脉注射BCMA-CD19CART或载体对照T细胞10x106个。在第7天(T细胞注射前)第11天和第15天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。
图69A.BCMA-CD19 CAR T细胞的表达。用抗人CD3抗体激活患者外周血单个核细胞2天。用对照组(左)、BCMA-CD19CD-CAR慢病毒载体(右)上清液转导细胞。孵育4天后，收集细胞，用山羊抗人F(Ab')2和小鼠抗人CD3抗体标记流式细胞术。CAR T细胞用绿点(带圆圈)表示。流式细胞仪分析显示，约15％的T细胞表达BCMA-CD19 CART f(Ab′)2片段。
图69B.该图显示在共培养实验中，患者的BCMA-CD19 CAR T细胞完全裂解表达CD19表面抗原的REH肿瘤细胞系。每个实验包括靶细胞REH与对照T细胞(左图)和CAR T细胞(右图)以效应细胞：靶细胞2:1比率(上图)和5:1(下图)共同培养。共培养24h，用小鼠抗人CD3和CD19标记细胞，流式细胞仪直接分析。红点(带圆圈)表示肿瘤细胞。最右边显示的是REH细胞的表型。
图69C.该图显示患者的BCMA-CD19 CAR T细胞在共培养中有效裂解合成表达BCMA的U933肿瘤细胞系。效应细胞：靶细胞以2:1的比例进行共培养24小时，并通过流式细胞术直接分析CD33和CD3。分析包括对照T细胞(左图)和BCMA-CD19 CAR T细胞(右图)。底部是单独表达BCMA的细胞。红点(带圆圈)表示肿瘤细胞。患者的BCMA-CD19 CAR T细胞表现出有效的强大的细胞毒性，可清除表达每种单独抗原的细胞群。向患者输注BCMA-CD19CART细胞(300万CAR T细胞/kg)。
图69D.该图显示了CAR T细胞治疗前的白血病细胞和浆细胞群。通过流式细胞术分析来自患者骨髓细胞中的CD19+白血病细胞(左上，已圈出)，并进一步标记这些细胞的CD19+/CD10+群体(右上，已圈出)。还检测到浆细胞，它们是BCMA+/CD19-(左下，已圈出)和BCMA+/CD38+(右下，已圈出)浆细胞。
图69E.该图显示，CAR T细胞治疗第14天后，流式细胞术分析无法检测到白血病、正常B细胞和浆细胞。通过流式细胞术分析患者细胞的CD19+B细胞(左上，已圈出)，CD19+/CD10+细胞(右上；无)。注意，未检测到CD19+或BCMA+浆细胞。
图70.cCAR治疗后DSA滴度显著降低。A)分析BCMA-CD19-CART细胞输注前后不同时间点HLA各表位的数据。B)不同时间点BCMA-CD19CART细胞输注后的减少率。
图71.对CD4-CART细胞疗效显著。A&C，CAR治疗前的皮肤外观。治疗后第28天的皮肤外观。E、治疗前皮肤活检。F、CAR治疗后皮肤活检。G、流式细胞术分析显示输注CAR后第13天开始检测不到白血病细胞(CD3-CD4+)。H、输注CAR后CD3+CD8+T细胞扩增。一、输注CAR后NK细胞扩张。
图72.CD4IL-15/IL-15sushi-CAR使Treg完全耗竭。以氟达拉滨/环磷酰胺(F/C)作为CAR前处理方案。第0天，患者接受总剂量为3x10^6/kg的单剂量CAR T细胞。在CAR治疗后的第23天，流式细胞仪分析无法检测到Treg。
【实施方式】
本发明提供嵌合抗原受体(CAR)成分、方法及其制备，以及使用CAR成分的方法。
成分
嵌合抗原受体多肽
在一个实施例中，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其具有一个信号肽、一个抗原识别域、一个铰链区、一个跨膜域、至少一个共刺激域和信号域。
如本文中所使用，术语「肽」、「多肽」及「蛋白质」可互换使用，且是指具有由肽键共价连接之胺基酸残基之化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个胺基酸，且对可包括蛋白质或肽序列之胺基酸最大数目无限制。多肽包括任何具有两个或更多个藉由肽键彼此接合之胺基酸之肽或蛋白质。如本文所使用之术语是指短链(其在此项技术中亦通常称为例如肽、寡肽及寡聚物)及长链(其在此项技术中通常称为蛋白质，其存在多种类型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、实质上同源多肽、寡肽、均二聚体、杂二聚体、多肽变异体、经修饰之多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重组型肽、合成肽或其组合。
「信号肽」包括肽序列，其引导细胞内肽及任何连接之多肽之传递及定位，例如传递及定位至某一细胞器(诸如内质网)及/或细胞表面。
信号肽为任何分泌或跨膜蛋白之肽，其引导所揭示之多肽传递至细胞膜及细胞表面，且提供本发明之多肽之正确定位。特定言之，本发明之信号肽将本发明之多肽引导至细胞膜，其中多肽之细胞外部分在细胞表面上显示，跨膜部分横跨质膜，且活性域位于细胞质部分或细胞之内部中。
在一个实施例中，信号肽在通过内质网(ER)之后裂解，亦即为可裂解之信号肽。在一个实施例中，信号肽为I、II、III或IV型人类蛋白质。在一个实施例中，信号肽包括免疫球蛋白重链信号肽。
“抗原识别域”包括对靶的抗原、受体、肽配体或蛋白质配体具有选择性的多肽；或靶的多肽。
标靶特异性抗原识别域较佳包括来源于针对标靶之抗原之抗体的抗原结合域，或结合标靶之抗原之肽，或结合抗体(其结合标靶之抗原)之肽或蛋白质，或结合标靶上之受体之肽或蛋白质配位体(包括(但不限于)生长因子、细胞激素或荷尔蒙)，或来源于结合标靶上之肽或蛋白质配位体之受体(包括(但不限于)生长因子受体、细胞激素受体
或荷尔蒙受体)之域。靶标包括GD2和GD3。在另一实施例中，靶标包括GD2和GD3的任何部分。在另一实施例中，靶标为神经节苷脂GD2，其结构为GD2＝bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer。在另一实施例中，靶标是神经节苷脂GD3，其结构为GD3＝aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer。
在一些实施例中，靶点包括GD2、GD3、白细胞介素6受体、DLL3、EGFR、叶酸受体α、EpCAM、CD171、c-Met、间皮素、GM2、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3、糖脂、glypican 3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2/neu、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、甲胎蛋白、CA19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP，ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MMG49表位、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受体、免疫球蛋白kappa和lambda、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2或CD138。在一个实施例中，抗原识别域包括针对标靶(对标靶具有选择性)之单株或多株抗体之结合部分或可变区。
在一个实施例中，抗原识别域包括抗原结合片段(Fab)。在另一实施例中，抗原识别域包括单链可变片段(scFv)。单链抗体是免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，与短连接肽相连。
在另一实施例中，抗原识别域包括骆驼科(Camelid)单域抗体，或其部分。在一个实施例中，骆驼科单域抗体包括在骆驼中发现之重链抗体，或VHH抗体。骆驼科(例如骆驼、单峰驼、大羊驼及羊驼)之VHH抗体系指骆驼单链抗体之可变片段(参见Nguyen等人,2001；Muyldermans,2001)，且亦包括经分离之骆驼VHH抗体、重组型骆驼VHH抗体或合成骆驼VHH抗体。
在另一实施例中，抗原识别域包括接合其同源受体之配位体。在另一实施例中，抗原识别域经人类化。
抗原识别域可在其序列内包括一些可变性且仍对本文中所揭示之标靶具有选择性。因此，预期抗原识别域之多肽可与本文中所揭示之抗原识别域多肽具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％一致性，且仍对本文中所描述之标靶具有选择性且属于本发明之范畴内。
在另一个实施例中，抗原识别域对神经节苷脂GD2和神经节苷脂GD3是选择性的。
铰链区为安置于例如包括(但不限于)嵌合抗原受体与至少一个共刺激域及信号传导域之间的序列。可获得铰链序列，包括例如来自任何属之任何适合的序列，包括人类或其部分。此项技术中已知此类铰链区。在一个实施例中，铰链区包括人类蛋白质之铰链区，包括CD-8α、CD28、4-1BB、OX40、CD3-ζ、T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、其功能衍生物及其组合。
在一个实施例中，铰链区包括CD8a铰链区。
在一些实施例中，铰链区包括选自(但不限于)免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgD)之一者。
跨膜域包括横跨细胞膜之疏水性多肽。特定言之，跨膜域自细胞膜之一侧(细胞外)横跨细胞膜之另一侧(细胞内或细胞质)。
跨膜域可呈α螺旋或β筒或其组合形式。跨膜域可包括异地同型蛋白质，其具有多个跨膜区段，各呈α-螺旋、β片或其组合形式。
在一个实施例中，使用与CAR中之一个域天然相关之跨膜域。在另一实施例中，选择跨膜域或藉由胺基酸取代修饰以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白质之跨膜域之结合，从而最小化与受体复合物之其他成员之相互作用。
举例而言，跨膜域包括以下各者之跨膜域：T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、其功能衍生物及其组合。
人工设计的跨膜结构域是一种主要由亮氨酸和缬氨酸等疏水残基组成的多肽。在一个实施例中，在合成跨膜域之各端发现苯丙胺酸、色胺酸及缬胺酸之三联体。
在一个实施例中，跨膜域为CD8跨膜域。在另一实施例中，跨膜域为CD28跨膜域。此类跨膜域为此项技术中已知的。
信号传导域及共刺激域包括可活化免疫细胞以刺激或活化免疫细胞信号传导路径之至少一些态样之多肽。
在一个实施例中，信号传导域包括以下各者之功能性信号传导域之多肽：CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRlla、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DNAX活化蛋白质10(DAP10)、DNAX活化蛋白质12(DAP12)、其活性片段、其功能衍生物及其组合。此类信号传导域为此项技术中已知的。
在一个实施例中，CAR多肽还包含一个或多个共刺激域。在一个实施例中，共刺激结构域是来自至少一个蛋白的功能性信号传导结构域，包括但不限于IL-15受体α。IL-15受体α细胞质结构域；B7-1/CD80；CD28；4-1BB,4-1BBL,B7-2/CD86；CTLA-4；B7-H1/PD-L1；ICOS；B7-H2；PD-1；B7-H3；PD-L2；B7-H4；PDCD6；BTLA；4-1BB/TNFRSF9/CD137；CD40配体/TNFSF5；4-1BB配体/TNFSF9；GITR/TNFRSF18；BAFF/BLyS/TNFSF13B；GITR配体/TNFSF18；BAFF R/TNFRSF13C；HVEM/TNFRSF14；CD27/TNFRSF7；LIGHT/TNFSF14；CD27配体/TNFSF7；OX40/TNFRSF4；CD30/TNFRSF8；OX40配体/TNFSF4；Toll样受体配体；Toll样受体9(TLR9)配体；CD30配体/TNFSF8；TACI/TNFRSF13B；CD40/TNFRSF5；2B4/CD244/SLAMF4；CD84/SLAMF5；BLAME/SLAMF8；CD229/SLAMF3；CD2，CD27，CRACC/SLAMF7；CD2F-10/SLAMF9；NTB-A/SLAMF6；CD48/SLAMF2；SLAM/CD150；CD58/LFA-3；Ikaros；CD53；整合素alpha 4/CD49d；CD82/Kai-1；整合素alpha 4beta 1；CD90/Thy1；整合素α4beta 7/LPAM-1；CD96；LAG-3；CD160；LMIR1/CD300A；CRTAM；TCL1A；DAP12；TIM-1/KIM-1/HAVCR；Dectin-1/CLEC7A；TIM-4；DPPIV/CD26；TSLP；EphB6；TSLP R；和HLA-DR。
本发明还提供一种编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸。编码CAR的多核苷酸很容易通过任何常规方法从指定CAR的氨基酸序列制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以从每个结构域的氨基酸序列的前述NCBI RefSeq id或GenBenk的登录号获得，并且本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序制备。例如，基于碱基序列，可以合成多核苷酸，并且可以通过结合使用聚合酶链反应(PCR)从cDNA文库获得的DNA片段来制备本发明的多核苷酸。
在一个实施例中，本文公开的多核苷酸是基因、表达或克隆盒的一部分。
如本文所使用之术语「聚核苷酸」定义为核苷酸链。聚核苷酸包括DNA及RNA。此外，核酸为核苷酸之聚合物。因此，如本文所使用之核酸及聚核苷酸为可互换的。熟习此项技术者具有核酸为聚核苷酸之常识，聚核苷酸其可水解成单体「核苷酸」。单体核苷酸可水解成核苷。如本文所使用，聚核苷酸包括(但不限于)藉由此项技术中可使用的任何手段获得的所有核酸序列，包括(但不限于)重组手段，亦即使用一般选殖技术自重组型文库或细胞基因体选殖核酸序列，及聚合酶链反应(PCR)，及其类似手段，及藉由合成成段。
多核苷酸载体
上述聚核苷酸可选殖至载体中。「载体」为物质之组合物，其包括经分离之聚核苷酸，且其可用于将经分离之聚核苷酸传递至细胞内部。此项技术中已知的大量载体包括(但不限于)线性聚核苷酸、与离子性或两性化合物相关之聚核苷酸、质体、噬菌粒、黏质体及病毒。病毒包括噬菌体、噬菌体衍生物。因此，术语「载体」包括自主复制质体或病毒。该术语亦应视为包括非质体及非病毒化合物，其促进核酸转移至细胞中，诸如聚离胺酸化合物、脂质体及其类似物。病毒载体之实例包括(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体及其类似物。
在一个实施例中，载体包括选殖载体、表现载体、复制载体、探针产生载体、整合载体及测序载体。
在一实施例中，载体为病毒载体。在一个实施例中，病毒载体为反转录病毒载体或慢病毒载体。在一个实施例中，经工程改造之细胞以病毒方式转导以表现聚核苷酸序列。
已针对基因转移至哺乳动物细胞中开发出许多基于病毒之系统。举例而言，反转录病毒提供基因传递系统之适宜平台。所选基因可插入载体中且使用此项技术中已知之技术封装于反转录病毒粒子中。接着可分离重组型病毒且活体内或离体传递至患者之细胞中。此项技术中已知许多反转录病毒系统。在一些实施例中，使用腺病毒载体。此项技术中已知许多腺病毒载体。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
病毒载体技术为此项技术中熟知的且描述于例如Sambrook等人(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)及其他病毒学及分子生物学手册中。适用作载体之病毒包括(但不限于)反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒。通常，适合的载体含有在至少一种生物体、启动子序列、限制内切酶位点及一或多种可选标记物中具有功能性的复制起点(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美国专利第6,326,193号)。
嵌合抗原受体多核苷酸的表达可使用例如表达载体来实现，所述表达载体包括但不限于SFFV(脾脏病灶形成病毒)或人类延伸因子11α(EF)启动子、CAG(带CMV增强剂的鸡β肌动蛋白启动子)启动子人类延伸因子1α(EF)启动子中的至少一个。使用的弱/低表达启动子的实例可包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、泛素C(UBC)启动子和磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子或其部分。嵌合抗原受体的诱导表达可以使用，例如，四环素应答启动子，包括但不限于TRE3GV(Tet应答元件，包括所有代并且优选地，第三代)、诱导启动子(Clontech Laboratories，Mountain View，CA)或其部分或组合来实现。
适合的启动子之一个实例为前早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为能够驱使任何与其以操作方式连接之聚核苷酸序列之高表达量的强组成性启动子序列。适合的启动子之另一实例为延长生长因子-1a(EF-1a)。然而，亦可使用其他组成性启动子序列，包括(但不限于)猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒前早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人类基因启动子，诸如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子及肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成性启动子，亦涵盖诱导性启动子作为本发明之一部分。诱导性启动子之使用提供分子开关，该分子开关能够在需要此类表达时打开其以操作方式连接之聚核苷酸序列表现，或在不需要时关闭表现。诱导性启动子之实例包括(但不限于)金属硫离子启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子及四环素启动子。
「表现载体」是指包括重组性聚核苷酸之载体，该重组性聚核苷酸包含与待表现之核苷酸序列以操作方式连接之表现控制序列。表现载体包括足够的顺式作用元素用于表现；用于表现之其他元素可由宿主细胞供应或在活体外表现系统中。表现载体包括此项技术中已知之所有表现载体，诸如并入重组性聚核苷酸之黏质体、质体(例如裸露或含于脂质体中)及病毒(例如慢病毒、反转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，它们位于起始点上游30-100bp的区域，尽管最近已经显示出一些增强子也包含起始点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相互反转或移动时，启动子功能得以保留，在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到50bp。根据启动子的不同，似乎单个元素可以协同或独立地激活转录。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，将要导入细胞的表达载体也可以包含可选择的标记基因或报告基因，或者两者都包含，以便于从通过病毒载体转染或感染的细胞群中识别和选择表达细胞；在其他方面，可选择的标记可携带在单独的DNA片段上，并用于共转染过程。可选择的标记和报告基因可与适当的调控序列结合以在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如neo等抗生素抗性基因。
报告基因用于识别潜在的转染细胞和评估调控序列的功能。一般来说，报告基因是指受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，它编码一种多肽，其表达表现为一些易于检测的特性，例如酶活性。报告基因的表达在DNA导入受体细胞后的适当时间进行检测。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui Tei等人，2000FEBS信件479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，可以使用已知的技术制备或商业化获得。一般来说，报告基因表达水平最高的最小的5'区域结构体被确定为启动子。这些启动子区域可以与报告基因相连接，并用于评估调节启动子驱动转录的能力。
本领域已知将基因导入和表达到细胞中的方法。在表达载体的内容中，通过本领域的任何方法，该载体可以容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质感染、粒子轰击、微量注射、电穿孔等。生产包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是众所周知的。例如，参见Sambrook等人。(2001年，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约)。将多核苷酸导入宿主细胞的首选方法是磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(如人类细胞)中最广泛使用的方法。其他病毒载体可衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。例如，见美国专利法第5350674号和第5585362号。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子络合物、纳米胶囊、微球、珠子和脂基系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体(例如，人工膜囊泡)是一种在体内外用作运载工具的典型胶体系统。在使用非病毒递送系统的情况下，典型的递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、体外或体内)。在另一方面，核酸可能与脂质有关。与脂质相关联的核酸可以被包裹在脂质体的水内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸相关联的连接分子连接到脂质体上，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂类的溶液中，与脂类混合，与脂类结合，作为悬浮液包含在脂类中，包含或与胶束复合，或以其他方式与脂类相关。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关成分不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可能以胶束的形式存在于双层结构中，或具有“折叠”结构。它们也可能简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂类是指天然或合成脂类的脂肪物质。例如，脂类包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
可从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二苯乙烯磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma，St.Louis，MO获得；磷酸二苯乙烯(“DCP”)可从K&K实验室(Plainview，NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem Behring获得；二苯乙烯磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipses，Inc.获得。(阿拉巴马州伯明翰)。氯仿或氯仿/甲醇中脂质的储备溶液可储存在-20℃左右。氯仿是唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。
“脂质体”是一个总称，包含由封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单室和多室层脂质载体。脂质体具有囊泡结构，具有磷脂双层膜和内部水介质。多室层脂质体在水介质中具有多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间夹带水和溶解溶质(Ghosh等人，191Glycobiology5；505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的成分也被包围。例如，脂质可能呈现胶束结构，或者仅仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质体-核酸复合物。
无论用于将外源多核苷酸引入宿主细胞或以其他方式使细胞暴露于本发明的多核苷酸中的方法如何，为了确认宿主细胞中存在重组DNA序列，可以执行多种分析。此类分析包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”分析，例如Southern和Northernblotting、RT-PCR和PCR；“生化”分析，例如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫方法(ELLSA和Western blots)或本文所述的分析来识别属于本发明范围内的试剂。
工程细胞
在另一实施例中，本发明提供一种表达上述嵌合抗原受体多肽或编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸的工程细胞。
「经工程改造之细胞」意谓任何生物体之经修饰、经转型或借由基因、DNA或RNA序列或蛋白质或多肽之添加或修饰而操作之任何细胞。本发明之经分离之细胞、宿主细胞及经基因工程改造之细胞包括经分离之免疫细胞，诸如含有编码嵌合抗原受体或嵌合抗原受体复合物之DNA或RNA序列且在细胞表面上表达嵌合受体之NK细胞及T细胞。经分离之宿主细胞及经工程改造之细胞可用于例如增强NK细胞活性或T淋巴细胞活性、治疗癌症及治疗感染性疾病。
可以使用能够表达和/或能够将本文所揭示的嵌合抗原受体多肽整合到其膜中的任何细胞。
在一个实施例中，经工程改造之细胞包括免疫调节细胞。免疫调节细胞包括T细胞，诸如CD4 T细胞(辅助T细胞)、CD8 T细胞(细胞毒性T细胞、CTL)及记忆体T细胞或记忆体干细胞T细胞。在另一实施例中，T细胞包括自然杀手T细胞(NK T细胞)。在另一个实施例中，工程细胞是γδT细胞。在另一实施例中，工程细胞为TNK细胞。
T细胞由CD4和CD8细胞组成。CD4是一种存在于T辅助细胞等免疫细胞表面的糖蛋白，在T细胞活化和HIV受体中起重要作用。一些单核细胞或巨噬细胞也表达CD4。CD4叫做OKT4。细胞毒性T细胞也被称为CD8+T细胞或在其表面表达CD8糖蛋白的CD8T细胞。这些CD8+T细胞一旦暴露在MHCⅠ类抗原肽中就会被激活。
在一个实施例中，工程改造的细胞包括自然杀伤细胞。自然杀手细胞为此项技术中所熟知的。在一个实施例中，自然杀手细胞包括细胞系，诸如NK-92细胞。NK细胞系之其他实例包括NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS细胞及NKL细胞。
NK细胞在无GvHD风险情况下介导抗肿瘤作用且相对于T细胞为短生命期。因此，NK细胞将在毁坏癌细胞之后不久耗竭，减少对CAR构筑体上将消融经修饰之细胞之诱导性自杀基因之需要。
如本文所述，CDXCAR是指具有CDX抗原识别域的嵌合抗原受体。如本文所用，CDX可以是GD2和GD3中的任何一个。
用于运载CAR的缺乏TCR的T细胞
在一个实施例中，经工程改造之细胞,特别是从供体获得的同种异体T细胞，可被修饰以灭活参与MHC识别的TCR(T细胞受体)组分。结果，缺少TCR的T细胞不会引起植物抗宿主病(GVHD)。
细胞来源
工程细胞可从外周血、脐血、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴结组织或胸腺组织中获得。宿主细胞可包括胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。这些细胞可以从人类、猴子、黑猩猩、狗、猫、老鼠、老鼠及其转基因物种中获得。这些细胞可以从已建立的细胞系中获得。
上述细胞可通过任何已知方法获得。这些细胞可以是自体的、同基因的、异基因的或异种的。
“自体”一词是指从同一个人身上获得的任何材料，这些材料随后将被重新引入该个人体内。
“异基因”一词是指从同一物种的不同动物身上获得的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或多个个体被称为彼此异基因。在某些方面，来自同一物种的个体的异基因材料可能与基因完全不同，从而在抗原上相互作用。
“异种”一词是指来自不同物种的动物的移植物。
“同基因”一词是指一种非常接近的遗传相似性或同一性，特别是在抗原或免疫反应方面。同基因系统包括器官和细胞(例如癌细胞及其非癌对应物)来自同一个体的模型，和/或器官和细胞来自同一近交系不同个体动物的模型。
在某些实施方案中，T和NK细胞来源于人类外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞分离产物(PBSC)、人类胚胎干细胞(HESC)、诱导多能干细胞(IPSC)、骨髓或脐带血。
在CAR治疗中使用NK细胞的潜在缺点包括缺乏持久性，这可能会降低长期疗效。
寻找匹配的供体T细胞来产生CAR-T细胞可能是一个挑战，因为不匹配的T细胞可能附着在受体的组织上，导致移植物抗宿主病(GVHD)。
在一个实施例中，本发明包括一种产生嵌合抗原受体(CAR)修饰的NK细胞的方法，该嵌合抗原受体在体内具有长寿命或持久性潜力以治疗疾病。令人惊讶的是，共表达IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚的CAR-NK细胞可以长期存活。
在进一步的实施例中，可以通过共同表达IL-15/IL-15锚来实现CAR-NK细胞存活的延长。
在一些实施例中，共同表达IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚的CAR-NK细胞可扩增并用作现成产品。
在一个实施例中，共表达IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚的CAR-NK细胞能够持续产生细胞因子信号，这对其在患者输注后的存活至关重要。
在进一步的实施方案中，可通过共同表达从IL-7、IL-15、IL-15/IL-15锚、IL-15/IL-15RA、IL-12、IL-18和IL-21中选择的细胞因子来实现CAR-NK细胞存活的延长。
令人惊讶的是，在人类临床试验中发现共表达IL-15/IL-15sushi的CAR，CD8+T细胞和NK细胞显著升高，这与抗肿瘤活性增加和疾病复发率降低相关(图71)。
在一些实施例中，IL-15可以是IL-15N72D突变体并且融合到IL-15Rα的可溶性结构域(sushi)，在溶液中形成稳定的复合物，并且与未复合物的IL-15相比，该复合物生物活性增强。突变IL-15N72D可提高IL-15的生物活性(us20177595a1)。
在一些实施方案中，CAR VAC1或CAR VAC2有不同的免疫防御机制，这些机制：1)通过对肿瘤细胞发起攻击来改变CAR T细胞对肿瘤的反应；2)增强CAR的持久性；3)防止肿瘤的微环境抑制；4)促进肿瘤滤过淋巴细胞的增殖；5)将肿瘤浸润淋巴细胞募集到肿瘤部位。
在一些实施例中，CAR VAC1或CAR VAC2承载至少一个完整的CARs单元，该单元至少共同表达细胞因子和/或趋化因子(图57和59)。在进一步的实施例中，CAR VAC1或CARVAC2可以包含多个完整CAR单元。在CAR VAC1或CAR VAC2中共表达的细胞因子可选自这一组细胞因子，包括但不限于：IL-15/IL-15sushi、IL-15/IL-15sushi锚、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、GM-CSF和TGF-。在CAR VAC1或CAR VAC2中共表达的趋化因子也可选自这一组趋化因子，包括但不限于：CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL19、CXCL1、CXCL2、CXCL9、CXCL10或CXCL12或CCL-21。
在进一步实施例中，CAR的完整单元编码嵌合抗原受体，其中所述CAR由信号肽、抗原识别域、铰链区、跨膜和T细胞激活域组成。
在一个实施例中，CAR VAC中的第一抗原识别结构域的靶选自但不限于以下组：GD2，GD3，白介素6受体，DLL3，EGFR，叶酸受体-α，EpCAM，CD171，c-Met，间皮素，GM2，ROR1，PSMA，PSCA(前列腺干细胞抗原)，MAGE A3，糖脂，glypican 3，F77，GD-2，WT1，CEA，HER-2/neu，MAGE-3，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，甲胎蛋白，CA 19-9，CA 72-4，NY-ESO，FAP，ErbB，c-Met，MART-1，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5，MMG49表位，CD30，EGFRvIII，CD33，CD123，CLL-1，NKG2D，NKG2D受体，免疫球蛋白κ和λ，CD38，CD52，CD47，CD200，CD70，CD19，CD20，CD22，CD38，BCMA，CS1，BAFF受体，TACI，CD3，CD4，CD8，CD5，CD7，CD2和CD138。
在一些实施例中，CAR VAC1带有至少一个共表达IL-7，IL-15/IL-15sushi和CCL19的完整CAR单位。
在一些实施例中，CAR VAC1承载至少一个共表达IL-15和CCL19的完整CAR单位。
在一些实施例中，CAR VAC1承载至少一个完整CAR单位，其共同表达IL-15/IL-15sushi和CCL19(图58)。
较长的CAR分子可导致单个分泌域的分泌效率较低。为了提高这一效率，采用不同的前导序列，IL-2代替IL-15前导序列，实现更高水平的分泌。此外，已知IL-15具有较短的生物半衰期。sushi结构域可通过形成IL-15/IL-15sush复合物而使IL-15半衰期增加10倍，从而导致更长的持久性。
在一些实施例中，CAR VAC1承载至少一个完整CAR单位，其共同表达IL-15/IL-15sushi和CCL21(图58)。
在一些实施例中，CAR VAC1承载至少一个完整CAR单位，其共表达IL-12和CCL19。
在一些实施例中，CAR VAC1承载至少一个完整CAR单位，其共表达IL-21和CCL19。
在一个实施例中，本发明提供了一种通过向需要的患者，提供共表达至少一种细胞因子IL-2、IL-7、IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-12、IL-18、IL-21的CAR VAC1工程细胞来使癌症患者达到长期持久缓解的方法(图57)。
不受到理论的束缚，人们认为，通过增加CAR工程细胞的持久性，将细胞因子IL-2、IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-7、IL-18、IL-12和IL-21中的一种与CAR VAC1共同表达，可使患者获得长期持久的缓解。
令人意想不到的是，包括CCL19在内的一种趋化因子与CAR VAC1多肽的共表达是一种非常有效的癌症治疗策略。这种新方法提供了长期持久的缓解(图62E)。
在不受理论束缚的情况下，人们认为细胞因子IL-2、IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-7、IL-18、IL-12的共同表达，含有CAR-VAC1多肽的IL-21通过影响肿瘤微环境，减少免疫抑制，促进固有细胞增殖或增强效果，为患者提供长期持久的缓解。
不希望受到理论的束缚，人们相信至少一种趋化因子(包括CCL19)与CAR VAC1多肽的共同表达，可通过增强CAR T/NK细胞或T细胞和固有细胞向肿瘤部位的募集，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施例中，CD4 CAR VAC1多肽分别包括SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.75和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.76。
在一个实施例中，CD19 CAR VAC1多肽分别包括SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.79和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.80。
在一个实施例中，CD33 CAR VAC1多肽分别包括SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.89和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.90。
在一个实施例中，BCMA-CAR-VAC1多肽分别包括SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.93和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.94。
在一个实施例中，CLL1 CAR VAC1多肽包括SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.95和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.96。
在一个实施例中，GD2 CAR VAC1多肽包括SEQ ID NO.72和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.73。
在一个实施例中，CD38 CAR VAC1多肽包括SEQ ID NO.83和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.84。
在一个实施例中，CD20 CAR VAC1多肽包括SEQ ID NO.87和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.88。
在一个实施方案中，CD5 CAR VAC1多肽包括SEQ ID NO.85和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.86。
在一个实施方案中，CD123 CAR VAC1多肽包括SEQ ID NO.91和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.92。
在一个实施方案中，CD4 CAR VAC1多肽包括SEQ ID NO.77和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.78。
在特定的实施方案中，可以通过组合以下步骤中的至少一个或多个步骤来消除肿瘤：
(1)通过靶向CAR或NK抗原，使本文公开的CAR工程改造的T细胞或NK细胞与一部分肿瘤细胞结合；
(2)引发大量分泌的因子，包括：IL-15/IL15sushi和CCL19或IL-15和CCL19或IL-15/IL-15sushi和CCL21或IL-15和CCL21。
(3)通过IL-15/IL-15sushi或IL-15刺激CAR T细胞和多种免疫细胞的扩增；
(4)通过CCL19或CCL21募集和刺激多种针对肿瘤的先天性和适应性免疫细胞；和
(5)通过给予检查点阻断剂例如PD-L1和CTLA-4抑制剂来减少肿瘤中存在的肿瘤抑制。
上述(2)的CAR共表达因子，其中编码CAR和因子的核酸通过自切割肽连接(图61A)
在一些实施例中，两个或多个上述(2)选择的CAR和因子，其中它们的核酸序列可并入两个或多个病毒载体中用于表达。
在一些实施例中，两个或多个上述(2)选择的CAR和因子，其中它们的核酸序列可并入相同的载体表达中并且由它们自己的启动子控制表达.
不希望受到理论的束缚，相信上述步骤的组合通过协调的先天性和适应性免疫反应提供有效的抗肿瘤作用。
在一些实施例中，CAR VAC2承载至少一个完整CAR单位，其共同表达IL-15/IL-15锚、CCL9和选自这组细胞因子的细胞因子，所述细胞因子包括但不限于：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、GM-CSF和TGF-(图59)。
在一些实施例中，CAR VAC2承载至少一个完整的CAR单元，其共表达IL-15/IL-15锚、CCL9和IL-7。
在一些实施例中，CAR VAC2至少承载一个完整的CAR单元，该单元共同达IL-15/IL-15sushi锚、CCL9和IL-12(图60)。
在一些实施例中，CAR VAC2至少承载一个完整的CAR单元，该单元共同达IL-15/IL-15sushi锚、CCL9和IL-21。
在一个实施例中，本发明提供了一种通过向需要的患者施用共表达IL-15/IL-15sushi锚的CAR VAC2工程细胞来使癌症患者得到长期持久缓解的方法(图59)。不希望受到理论的束缚，有人认为IL-15/IL-15sushi锚与CAR的共同表达，可通过增加CAR工程细胞的持久性为患者提供了长期持久的缓解。
不希望受到理论的束缚，人们相信，包括CCL19在内的一种趋化因子与CAR VAC2多肽的共同表达，可通过增强CAR T/NK细胞或T细胞和固有细胞对肿瘤部位的募集，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施例中，CD4 CAR VAC2多肽包括SEQ ID NO.48和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.49。
在一个实施方案中，CD19 CAR VAC2多肽包括SEQ ID NO.52和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.53。
在一个实施方案中，CD33 CAR VAC2多肽包括SEQ ID NO.58和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.59。
在一个实施方案中，BCMA CAR VAC2多肽包括SEQ ID NO.62和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.63。
在一个实施方案中，CLL1 CAR VAC2多肽包括SEQ ID NO.66和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO,67。
在一个实施方案中，GD2 CAR VAC2多肽包括SEQ ID NO.70和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.71。
在一些实施方案中，本发明公开了用作新型安全开关的CD20抗体。在其他实施方案中，将利妥昔单抗(抗CD20)识别肽融合至CAR VAC1或CAR VAC2的铰链区。利妥昔单抗结合或识别多肽包括SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.101。
在一个实施方案中，CD19 CAR VAC多肽包括SEQ ID NO.156、81和相应的多核苷酸序列SEQ ID NO.57、82。
自杀和安全开关系统
本发明的工程细胞也可能包括自杀系统。自杀系统提供了一种机制，使得如上所述的工程细胞可以被停用或破坏。这种特性允许对使用工程细胞的任何治疗进行精确的治疗控制。如本文所使用的，自杀系统提供了一种机制，通过该机制，具有自杀系统的细胞可以被停用或破坏。自杀系统是众所周知的技术。
在一个实施例中，自杀系统包括一个基因，该基因可根据需要在药理学上被激活以消除所含细胞。在特定方面，自杀基因对含有多核苷酸或细胞的宿主不具有免疫原性。在一个例子中，自杀系统包括一个基因，该基因导致CD20在工程细胞的细胞表面表达。因此，给药利妥昔单抗可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在一些实施例中，本发明公开了用作安全开关的CD20抗体。在进一步的实施例中，将利妥昔单抗(抗CD20)识别多肽融合至CAR的铰链区。利妥昔单抗结合或识别多肽包括SEQID NO.74。
在一些实施例中，本发明公开了用作安全开关的CD20抗体。在进一步的实施例中，将利妥昔单抗(抗CD20)识别多肽融合至CAR的铰链区。具有利妥昔单抗结合或识别多肽的铰链区包括SEQ ID NO.101。
在一些实施例中，自杀系统包括表位标记。表位标记的例子包括c-myc标记、CD52链霉亲和素结合肽(SBP)和截短的EGFR基因(EGFRt)。在本实施例中，表位标签在工程细胞中表达。因此，针对表位标签施用抗体可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在另一个实施例中，自杀系统包括一个基因，该基因导致截短的表皮生长因子受体在工程细胞表面表达。因此，西妥昔单抗可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在另一实施例中，自杀系统包括CD52以在工程细胞的表面上表达。因此，给药抗-52单克隆抗体(CAMPATH，alemtuzumab)可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在另一个实施例中，自杀系统包括CAMPATH(alemtuzumab)。因此，使用抗-52单克隆抗体(CAMPATH)可以在不表达标记或基因的情况下破坏工程细胞，因为CAR T细胞或T细胞高度表达CD52。
在另一实施例中，自杀基因可包括caspase 8基因、caspase 9基因、胸苷激酶、cytosine deaminase(CD)或细胞色素P450。
进一步自杀系统的例子包括琼斯等人描述的自杀系统。(Jones BS、Lamb LS、Goldman F和Di Stasi A(2014)通过自杀基因转移提高细胞治疗产品的安全性。Front.Pharmacol.5：254.doi:10.3389/fphar.2014.00254)，通过引用将其全部并入本文。
肿瘤微环境与肿瘤疫苗效应
调节性T细胞(Treg)和抑制性程序性细胞死亡-1(PD-1)通路在免疫抑制中起重要作用。CAR细胞作为载体将调控因子传递到靶向肿瘤部位，从而降低高剂量外源性调节因子或细胞因子的全身毒性。
Treg细胞在限制免疫应答和抗癌抑制中起着重要作用。IL-15通过促进T细胞和包括NK细胞在内的固有细胞的增殖而发挥疫苗效应。
本发现基于在患者上令人惊讶的研究结果，通过使用CD4-CAR联合表达IL-15/IL-15sushi。(1)CD4-CAR能消耗Treg，导致患者CD8+T细胞大量扩增(图72)；(2)CAR释放的IL-15/IL-15sushi能显著增强NK细胞的扩增(图71)。
本发现基于人类上的惊人研究成果(图71)，即CAR共表达IL-15/IL-15sushi的组合提供肿瘤疫苗效应和更有效的抗肿瘤活性以及显著改善CAR持久性。
本发现还基于在小鼠中的意外研究成果(图62E)，即联合表达IL-15/IL-15sushi的CAR和CCL19提供比单独表达IL-15/IL-sushi的CAR更有效的抗肿瘤反应。
在本发现中，肿瘤的消除可以通过结合有肿瘤疫苗效应和免疫细胞归巢的CAR的组合来实现，特别是包括以下至少一个或多个步骤的组合：
(1)通过靶向CAR或NK抗原和共表达CAR的分泌性治疗因子，将本文公开的CAR工程化T细胞或NK细胞与部分肿瘤细胞结合；
(2)触发治疗因子的大量分泌，包括组合：IL-15/IL-15sushi和CCL19或IL-15和CCL19或IL-15/IL-15sushi和CCL21或IL-15和CCL21；
(3)IL-15/IL-15sushi或由共表达这些因子的CAR-T细胞释放的IL-15刺激CAR-T细胞和多种免疫细胞的扩增。
(4)通过共表达CCL19或CCL2的CAR-T细胞释放的该治疗因子，募集和刺激多种天然免疫细胞和适应性免疫细胞抗肿瘤；
(5)通过给药检查点阻断剂，如PD-L1和/或CTLA-4抑制剂，减少肿瘤中存在的肿瘤抑制。
根据上述(2)共表达CAR的治疗因子，其中编码CAR和因子的核酸通过自裂解肽连接(图57和图58)
在一些实施例中，根据上述(2)选择的两个或多个选择的CAR和因子，其中它们的核酸序列可并入两个或多个病毒载体中用于表达。
在一些实施例中，根据上述(2)选择了两种或两种以上的CARs和治疗因子，它们的核酸序列可以被整合到同一个载体表达中，并由它们自己的启动子控制表达。
根据(2)，CAR和治疗因子的联合给药可涉及在受试者中同时和/或顺序给药。联合治疗还应包括对治疗中任一治疗成分的多次给药联合治疗方案。
我们不希望受到理论的束缚，相信上述步骤的组合通过协调的先天性和适应性免疫反应能提供有效的抗肿瘤作用。
在本发现中，还可以通过去除Treg、抑制PD-L1免疫抑制途径、通过促进T细胞或NK细胞或固有细胞诱导疫苗效应、刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖以及增强免疫细胞归巢到靶点来实现肿瘤的消除，特别是其中肿瘤的消除可以通过以下步骤中的至少一个或多个步骤的组合来实现：
(1)修饰CD4 CAR-T细胞或NK细胞来消耗Treg和CD4 CAR共表达的分泌治疗因子；
(2)诱导CAR-T或NK细胞大量分泌治疗因子，包括以下组合之一:IL-15/IL15sushi和CCL19或IL-15和CCL19或IL-15/IL-15sushi和CCL21或IL-15和CCL21；
(3)通过共表达IL-15/IL-15sushi或IL-15的CAR-T细胞释放的这些因子来刺激CAR-T细胞和各种免疫细胞的扩张。
(4)通过共表达CCL19或CCL2的CAR-T细胞释放的该治疗因子，募集和刺激多种先天和适应性抗肿瘤免疫细胞；
(5)通过阻断检查点，如PD-L1和/或CTLA-4抑制剂，降低存在于肿瘤中的肿瘤抑制。
根据上述(2)共表达CD4 CAR的治疗因子，其中编码CAR和因子的核酸通过自裂解肽连接(图61A)
在一些实施例中，根据上述(2)选择的两个或多个选择的CAR和治疗因子，其中它们的核酸序列可并入两个或多个病毒载体中用于表达。
(2)根据(2)，CAR和治疗因子的联合给药可涉及在受试者中同时和/或顺序给药。联合治疗还应包括联合治疗方案，包括对治疗中任一治疗成分的多次给药。
根据(2)，CAR和治疗因子的联合给药可涉及在受试者中同时和/或顺序给药。联合治疗还应包括对治疗中任一治疗成分的多次给药联合治疗方案。
在一些实施例中，根据上述(2)可从由抗CD40抗体或CD40配体、抗OX40抗体、抗-4-1BB抗体、TNFR2阻断抗体、抗CTLA4抗体和CpG寡核苷酸(CpG ODNs、TLR9激动剂)组成的组合中选择至少一种额外癌症治疗剂或因子。在特定实施例中，CpG-ODNs可直接施用于肿瘤部位以触发免疫应答。
在一些实施例中，，CD4 CAR可以共表达至少一种癌症治疗药物，这些药物是从由抗CD40抗体或CD40配体、抗ox40抗体、抗4-1bb抗体、tnfr2阻断抗体和抗ctla4抗体组成的组合中选择的。在特定实施例中，CpG-ODNs可直接施用于肿瘤部位以触发免疫应答。
在一些实施例中，抗CD4抗体可以通过与至少一种额外的癌症治疗剂组合来消除Treg，而不是CD4 CAR。其中癌症治疗剂指的是抗CD40抗体或CD40配体、抗OX 40抗体、抗-4-1BB抗体、TNFR2阻断抗体、抗CTLA4抗体、PD-L1抑制剂、，和CpG寡核苷酸(CpG ODNs，TLR9激动剂)。
CpG ODNs是在特定序列背景(CpG基序)中含有未甲基化的CpG二核苷酸的短合成单链DNA分子。合成的CpG ODN与微生物DNA的不同之处在于，它们的主链是部分或完全磷化的(PS)，而不是典型的磷酸二酯主链和在3'端、5'端或两者都有poly G尾。PS修饰可以保护ODN不被体内的核酸酶降解，poly G尾l增强细胞摄取。CpG ODNs一般分为A类、B类和C类。
A类CpG ODNs刺激大量I型干扰素(例如IFNa)的产生，并诱导浆细胞样树突状细胞成熟。A类CpG ODNs也可以通过间接细胞因子信号传导表征为NK细胞的强激活剂。A类的结构特征包括在5'端，3'端或两者上的poly G序列中的至少一个；内部回文序列内部回文中包含的GC二核苷酸；和部分PS修饰的骨架。
B类CpG ODNs是人类B细胞和单核细胞成熟的强大刺激物，并可能刺激pDC的成熟。B类CpG ODNs的结构特征包括至少一个6聚体CpG基序5'-Pu Py C G Py Pu-3'中的至少一个；完全硫代磷酸酯化(PS改性)的骨架；长度约为18至28个核苷酸。
参见Vollmer等人，Immunotherapeutic applications of CpGoligodeoxynucleotide TLR9 agonists；Advanced Drug Delivery Reviews 61(2009)195-204.
在运用中，肿瘤或癌症可以选自但不限于，包括淋巴瘤，白血病，多发性骨髓瘤，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，结肠直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆道癌，小肠或阑尾癌，卵巢癌，膀胱癌，脑或中枢神经系统癌，宫颈癌，子宫或子宫内膜癌，口腔或咽喉癌，唾液癌腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌和肉瘤。
复合CAR(cCAR)
如本文中所使用，复合CAR(cCAR)或多个CAR是指具有至少两种不同且完整的嵌合抗原受体多肽之经工程改造之细胞。如本文中所使用，「不同的嵌合抗原受体多肽」具有独特抗原识别域、信号肽、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及信号传导域。因此，两个独特的嵌合抗原受体多肽将具有不同的抗原识别域。在两个不同的嵌合抗原受体多肽之间，信号肽、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及信号传导域可相同或不同。如本文中所使用，嵌合抗原受体(CAR)单元是指不同的嵌合抗原受体多肽，或编码不同的嵌合抗原受体多肽之聚核苷酸。
如本文中所使用，独特抗原识别域为对单个标靶或标靶之单个抗原决定基具有特异性或靶向其之抗原识别域。
在一些实施例中，复合CAR靶向相同的抗原。例如，cCAR靶向单一抗原的不同表位或部分。在一些实施例中，复合CAR中存在的每个CAR单元靶向针对相同或不同疾病状况或由疾病状况引起的副作用的特异性的不同抗原。
在一些实施例中，一个复合CAR靶向两种不同抗原。
产生携带不同CAR单元之复合CAR可极具挑战性：(1)CAR与CAR之间的相互作用可具有不利影响且适合的CAR设计为抵消此作用之关键；(2)单一构筑体中之复合CAR可增加表达盒之长度，其可引起病毒效价及蛋白质表达量降低；(3)需要适合的设计以包括多种CAR主体元素，尤其选择策略以在单一载体中表达多个CAR；(4)强启动子对于携带其他CAR单元之复合CAR尤其重要；(5)CAR中之铰链区需要经设计使得较佳避免各CAR单元之间铰链区之相互相用；(6)表达于细胞中之两个或更多个CAR单元可引起毒性作用(CAR-CAR相互相用)。本文中之申请人提供可解决此等障碍之新颖及出人意料的CAR组合物及方法。
cCARs的转导效率(CAR T细胞百分比)通常低于单个单位CAR。在转染和转导过程中，有几种方法可以提高效率。为了提高制备cCARs的病毒滴度，最好使用LentiXTM 293t(Clontech/Takara)包装细胞系，用于制备高滴度慢病毒，而不是常用的HEK-293FT，转染包装细胞时，最好将质粒DNA(含cCAR结构)增加1.5-2.0倍，以提高转染效率。在复合物形成过程中，病毒包装质粒和转染试剂的量保持不变。通过在转导过程中降低T细胞与病毒载体的比率，使之达到每毫升0.3x106个细胞，并增加慢病毒上清液或慢病毒的体积，可以进一步提高转导效率。
在一个实施例中，本发明提供具有多个CAR单元之经工程改造之细胞。此使得单个经工程改造之细胞靶向多个抗原。一个多个CAR单元同时靶向多个表面标记物或抗原可防止抗性纯系之选择及减少肿瘤复发。尚未研发用于任何恶性肿瘤之多个CAR T细胞免疫疗法，其中每个个别组分CAR包含多个域及活化位点。
在本发明之一个态样中，cCAR包括多个CAR单元。在一些实施例中，cCAR包括至少两个CAR单元。在另一实施例中，cCAR包括至少三个CAR单元。在另一实施例中，cCAR包括至少四个单元。
在一个实施例中，本发明提供经工程改造之细胞，其具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽，各自具有不同的抗原识别域。
在一个实施例中，具有至少两个不同嵌合抗原受体多肽之经工程改造细胞为T细胞。T细胞可以被改造使其不表达细胞表面抗原。例如，可以改造T细胞使其不表达CD45细胞表面抗原。
在优选实施方案中，具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽的工程细胞是从外周血或脐血和NK-92细胞中分离出来的原代NK细胞，使得其「现成地」投与任何患有疾病或癌症之哺乳动物。
在一个实施例中，经工程改造之细胞包括(i.)第一嵌合抗原受体多肽，其包含第一抗原识别域、第一信号肽、第一铰链区、第一跨膜域、第一共刺激域及第一信号传导域；及(ii.)第二嵌合抗原受体多肽，其包含第二抗原识别域、第二信号肽、第二铰链区、第二跨膜域、第二共刺激域及第二信号传导域。第一抗原识别域与第二抗原识别域不同。
在一个较佳实施例中，每个经工程改造之CAR单元聚核苷酸具有不同核苷酸序列以避免同源重组。
在一个实施例中，第一抗原识别域的靶点选自但不限于GD2、GD3、白细胞介素6受体、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3、糖脂、glypican3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2/neu、DLL3、EGFR、叶酸受体α、EpCAM、CD171、间皮素、GM2、DR5、EGFR、EpCAM、EpHA2、ERα、gp100、LMP1、IL-13R、VEGFR-2、PSMA、PSCA、PD-L、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、甲胎蛋白、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO，FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MMG49表位、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受体、免疫球蛋白kappa和lambda、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2和CD138；第二个识别域的靶点选自GD2、GD3、白细胞介素6受体、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3、糖脂、glypican 3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2/neu、DLL3、EGFR、叶酸受体α、EpCAM、CD171、间皮素、GM2、DR5、EGFR、EpCAM、EpHA2、ERα、gp100、LMP1、IL-13R、VEGFR-2、PSMA、PSCA、PD-L、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、甲胎蛋白、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1，MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、MMG49表位、NKG2D、NKG2D受体、免疫球蛋白kappa和lambda、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF、BAFF受体、April受体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2和CD138。
在一个实施例中，第一抗原识别域的靶点选自但不限于：GD2、GD3、CD19、CD20、CD22、CD38、CD138、BCMA、CS1、BAFF、BAFF受体、TACI、April、April受体、CD3、CD4、CD5、CD7、CD2、CLL-1、CD33、CD123、NKG2D受体、MMG49表位和CD30；第二个识别域的靶点选自由GD2、GD3、CD19、CD20、CD22、CD38、CD138、BCMA、CS1、BAFF、April、April受体、BAFF受体、TACI、CD3、CD4、CD5、CD7、CD2、CLL-1、CD33、CD123、MMG49表位、NKG2D受体和CD30。
在一个实施例中，各CAR单元包括相同或不同铰链区。在另一实施例中，各CAR单元包括相同或不同跨膜区。在另一实施例中，各CAR单元包括相同或不同胞内域。
在一个实施例中，各CAR单元包括CD3ζ链信号传导域。
在一个实施例中，每个不同的CAR单元包括不同的共刺激域。举例而言，第一嵌合抗原受体多肽包括4-1BB共刺激域；且第二嵌合抗原受体多肽包括CD28共刺激域。
在一个实施例中，每个不同的CAR单元包括相同的共刺激域。例如，第一嵌合抗原受体多肽包括4-1BB共刺激结构域；第二嵌合抗原受体多肽包括4-1BB共刺激结构域。
在另一实施例中，铰链区经设计以排除可能引起不合需要的分子内或分子间相互作用之胺基酸。举例而言，铰链区可经设计以排除或最小化半胱胺酸残基以防止形成二硫键。在另一实施例中，铰链区可经设计以排除或最小化疏水性残基以防止不合需要之疏水相互作用。
复合CAR可独立地或组合杀死细胞。多重或复合CAR包含相同或不同铰链区、相同或不同跨膜、相同或不同共刺激及相同或不同细胞内域。较佳选择铰链区以避免相互相用位点。
本发明之复合CAR可靶向T或NK细胞中之相同或不同肿瘤群。第一个CAR例如可靶向大型肿瘤群且随后或第二个CAR例如可根除癌症或白血病干细胞，以避免癌症复发。
根据本发明，意外发现T或NK细胞中靶向不同或相同肿瘤群之复合CAR对抗可引起对CAR杀死活性之抗性之癌细胞的肿瘤因子，借此产生自癌细胞表面之标靶抗原之下调。亦意外发现此能够引起癌细胞「躲避」CAR疗法，称为「抗原逃逸」，及肿瘤非均质性，由此不同肿瘤细胞可呈现不同表面抗原表达概况。如下所述，令人惊讶地发现，由于其多靶向性，复合CAR比单CAR疗法具有显著的优势。虽然在抗原特异性选择压力下单一抗原的丢失是可能的，但同时丢失两种主要抗原的可能性要小得多。
在一个实施例中，抗原识别域包括针对(选择性)靶点的人源化单克隆或人源化多克隆抗体的结合部分或可变区域。
在本发明的一个方面中，抗原识别域可以是包括两个靶向域的双特异性串联嵌合抗原受体。在另一实施例中，存在包含三个或更多靶向结构域的多特异性串联嵌合抗原受体。
在本发明的某些方面中，抗原识别域可以是包括两个靶向域的双特异性嵌合抗原受体(源自双特异性抗体)。
在一个实施例中，双特异性串联嵌合抗原受体或双特异性嵌合抗原受体有效地抵消肿瘤逃逸或抗原丢失，并增加抗原识别的敏感性。
在另一实施例中，抗原识别域包括骆驼单域抗体或其部分。在一个实施例中，骆驼单域抗体包括在骆驼中发现的重链抗体或VHH抗体。骆驼的VHH抗体(例如骆驼、骆驼、骆驼和羊驼)是指骆驼单链抗体的可变片段(见Nguyen等人，2001；Muyldermans，2001)，还包括骆驼的分离VHH抗体、骆驼的重组VHH抗体或骆驼的合成VHH抗体。
在一些实施例中，两个或多个选定的CAR核酸序列可并入两个或多个病毒载体中以在靶细胞中表达，管这样的两个载体方法可能遇到与将独立的病毒载体共转导到同一病毒中相关的一些潜在困难，需要高CAR表达效率以便有足够的T细胞功能。
在一些实施例中，两个或多个选择的CAR核酸序列可并入相同的载体表达中并且由其自身的启动子控制表达。
在一些实施例中，可以分别生成两个或多个不同的CAR T或NK细胞，然后依次向宿主施用。BCMA-CS1复合CAR(BCMA-CS1 cCAR)
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种由浆细胞异常快速增殖引起的血癌，占美国所有血癌的18％。MM的治疗方案包括化疗、皮质类固醇治疗、靶向治疗、干细胞移植大剂量化疗、生物治疗、放射治疗、单克隆抗体、蛋白酶体抑制剂和手术。即使采用这些有效的治疗方法，MM的5年生存率仍为49.6％。然而，对于MM仍然没有治愈的方法，几乎所有的患者在治疗后都会复发。
目前，CAR技术在多发性骨髓瘤中的应用包括使用靶向BCMA(CD269)的CART细胞对抗由James Kochenderfer(NIH)导致的大量疾病。那些在BCMA-CAR治疗后病情缓解的患者最终会复发，这可能是由于一些骨髓瘤细胞对BCMA呈弱(弱)或阴性表达。因此，以CAR为基础的单一靶点治疗可能不足以预防骨髓瘤复发。CS1(SLAMF7)是另一个很好的骨髓瘤靶点，因为它在骨髓瘤细胞中的表达通常很高且均匀，并且与骨髓瘤细胞的粘附性和致瘤性有关。
本发明由单个CAR T细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达2个不同的CAR单位，可作为一种新的靶向多抗原和潜在地避免肿瘤复发的方法。一种复合CAR(cCAR)，包括BCMA-CAR，该BCMA-CAR通过自裂P2A肽连接到CS1-CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
在本发明中，令人惊讶地发现这种BCMA-CS1 cCAR(BC1cCAR)T细胞在体外表现出强大和特异的抗肿瘤活性，并在体内控制显著的肿瘤生长。我们首次证明，一个2单位的不同CAR能够在体外有效地靶向两种抗原，对更全面的临床结果具有潜在的意义。出乎意料的是，以BCMA和CS1为靶点的复合CAR联合治疗多发性骨髓瘤是一种非常有力的策略。这一新的方法，由于复合设计的复合压力，避免了单一CAR治疗因选择压力导致的抗原逃逸(单一抗原的损失)。
BCMA(B细胞成熟抗原)和CS1(SLAMF7)被选为复合CAR的靶点，因为绝大多数骨髓瘤患者表达两种或两种表面抗原，而这些抗原不包括造血干细胞。在浆细胞上广泛表达BCMA和CS1两种不同的靶点，可以增加覆盖率，有效地消除癌细胞，防止抗原逃逸。
在本发明中，令人惊讶地发现，将CS1作为靶点添加到BCMA-CAR中通过消除存活的BCMA-CS1+骨髓瘤细胞来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。BCMA和CS1(CD319)均在MM细胞上广泛表达，这种高表达使BCMA-CS1 cCAR能够全面覆盖所有潜在的癌细胞。这允许癌细胞更彻底的消除，以减少抗原逃逸，在其抵抗发展前通过对多个目标同时猛烈打击。
在一个实施例中，BCMA-CS1指导的BCMA-CS1CAR(BC1cCAR)疗法是骨髓移植(BMT)的“桥梁”或与重型化疗加BMT的组合。BCMA-CS1 cCAR可为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的BMT选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负担(MRD)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，BCMA-CS1 cCAR疗法能够将疾病负担降低到移植前的最低水平或彻底消除MRD，可以预期复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，BCMA-CS1 cCAR疗法可进一步应用于BCMA+和/或CS1+多发性骨髓瘤患者，其范围超过骨髓移植桥。BCMA-CS1CAR治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在一些实施例中，BCMA-CS1cCAR T细胞治疗可发展为“移植桥”、化疗的补充或多发性骨髓瘤患者的独立治疗。
在一些实施例中，本发明提供了一种复合CAR多肽工程细胞，其靶向表达BCMA或CS1抗原或两者的细胞。靶细胞可能是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和冒烟型骨髓瘤。
在不被理论束缚的情况下，人们相信，IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚或4-1bbl与BCMA-CS1 cCAR的共表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，IL-21或IL-21锚与BCMA-CS1cCAR的共同表达，通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
BCMA1-BCMA2复合CAR(BCMA1-BCMA2 cCAR)
大多数B-ALL在CD19-CAR-T治疗中可初步缓解，但10％-20％的出现表位丢失而复发。
目前，CAR技术在多发性骨髓瘤中的应用包括以James Kochenderfer(NIH)为首的BCMA(CD269)靶向的CAR T细胞治疗多发性骨髓瘤。那些在BCMA-CAR治疗后处于初始缓解期的患者最终会复发，这可能是由于一些骨髓瘤细胞对BCMA的表达暗淡(弱)或阴性。此外，单个CAR的效力也是消除患者多发性骨髓瘤细胞的一个问题。因此，以CAR为基础的单一靶点治疗可能不足以预防骨髓瘤复发。
在一个实施例中，抗体识别域包括单克隆抗体的结合变量区域、单链抗体(scFv)。单链抗体包括一种轻链抗体和一种重链抗体。在特定实施例中，抗原识别域由两个不同的重链域(VHH)组成。每个重链结构域与同一抗原或不同抗原的不同表位结合。VHH抗体比整体抗体更稳定和强壮。
在一些实施例中，复合CAR靶向相同抗原。例如，cCAR针对不同的表位或单一抗原的部分。在一些实施例中，复合CAR中存在的每个CAR单元针对特定于相同抗原但不同位置的不同表位。
在一些实施例中，复合CAR靶向一种抗原上的不同表位。
本发明是由一个在具有独立信号结构域的载体中表达两个不相连CAR单元的单个CAR T细胞组成，可作为一种新的靶向一种抗原上不同表位的方法，并且有可能避免肿瘤表位跳跃或表位丢失或表位逃逸。一种复合cCAR(BCMA1-BCMA2-cCAR)由一个BCMA-CAR(BCMA1-CAR)通过自裂P2A肽连接到另一个BCMA-CAR(BCMA2-CAR)并在T细胞表面表达两个功能性CAR分子组成。cCAR中的两个CARs单位都针对同一抗原BCMA。
在一个实施例中，工程细胞包括具有BCMA抗原识别表位的第一嵌合抗原受体多肽和具有不同BCMA识别表位的第二嵌合抗原受体多肽。在一个实施例中，该工程细胞包括SEQID NO.3的多肽和相应的SEQ ID NO.4的多核苷酸。
在本发明中，令人惊讶的是，该BCMA1-BCMA2 cCAR T细胞在体外表现出强大且特异的抗肿瘤活性，并在体内控制显著的肿瘤生长。我们首次证明，一个2单位的不同CAR能够在体外有效地靶向一种抗原BCMA的两个不同表位，这对更全面的临床结果具有潜在的意义。出乎意料的是，联合使用针对不同表位的复合CAR靶向多发性骨髓瘤是一种非常有力的策略。这种新的方法由于复合设计的组合压力而避免了由于单个CAR治疗的选择压力导致的表位逃逸(单个表位丢失或表位跳跃)。
在本发明中，令人惊讶地发现，将表位作为靶点添加到BCMA-CAR中可增强抗肿瘤反应，并降低由于BCMA表位丢失而导致多发性骨髓瘤复发的风险。
在一个实施例中，BCMA1-BCMA2定向治疗作为骨髓移植(BMT)的“桥梁”，或与重型化疗加BMT相结合。BCMA1-BCMA2 cCAR可提高BCMA抗原识别的敏感性，为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的BMT选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负担(MRD)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，BCMA1-BCMA2 cCAR疗法能够将疾病负担降低到移植前的最低水平或彻底消除MRD，可以将复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一些实施例中，本发明提供了一种针对BCMA抗原上两个不同表位的复合CAR多肽工程细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和冒烟型多发性骨髓瘤。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为，IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚或4-1BBL与BCMA1-BCMA2 cCAR的共表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
在不被理论束缚的情况下，人们相信IL-21或IL-21锚与BCMA1-BCMA2cCAR的共同表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
CD123-CD33复合CAR(CD123-CD33 cCAR)
将CAR成功转化针对AML需要仔细了解该疾病特有的特征。急性髓系白血病的特征是有大量的原始细胞，这些细胞具有高度的侵袭性和快速分裂，形成了疾病的主体。与B细胞恶性肿瘤不同，AML由于其在白血病干细胞(LSCs)中的作用而具有独特的治疗挑战性。LSCs是一组表达造血干细胞标志物(CD34+CD38-)的细胞，它们能够引发和维持造血恶性肿瘤，产生超过健康骨髓的克隆细胞群。由于LSCs大多处于细胞周期的静止期，针对快速分裂的肿瘤群体的化疗使LSCs未受影响。最常见的是这种难以捉摸的数量，包括微小残留病(MRD)，并和AML治疗后不可避免的复发有关。成功地将CAR治疗转化针对AML以彻底消除疾病并确保不再复发需要仔细的抗原选择，这将不仅能够根除大量白血病疾病，而且能够根除白血病干细胞。
CD123-CD33 cCAR将在不引起CAR和CAR相互作用的情况下同时消融CD33+和CD123+细胞。在本例中，一个有用的类比是将AML视为具有叶和根的癌树。虽然叶子构成了疾病的大部分(这些是CD33+AML细胞)，但是修剪这些叶子并不能阻止树的进一步生长，除非你把树从根上拔下来(这些是CD123+CD34+CD38-lsc)。对319例AML患者的研究发现，87.8％的患者表达CD33，因此靶向CD33可能是大多数白血病细胞。然而，用吉妥珠单抗治疗的患者，一种与卡利霉素相关的抗CD33抗体疗法，可能由于获得性卡利霉素耐药而复发CD33+AML。因此，在靶向CD33消除大多数疾病的同时，耐药LSCs也必须靶向，否则会复发。这可以通过靶向CD123来实现，与健康造血干细胞相比，CD34+CD38-LSC上的CD123过度表达。考虑到97.2％的AML患者至少表达这两个靶点中的一个，因此靶向CD123和CD33可以消除大多数患者的所有癌细胞，提高治疗效果并根除癌树。
AML是一种进展迅速的血癌，约占儿童急性白血病的15-20％，占成人急性白血病的80％。目前，患者仍采用大剂量多药化疗和造血干细胞移植治疗。尽管这些强化治疗往往伴随着相当大的毒性甚至死亡，但约60-70％的AML患者仍因获得性治疗抵抗或LSC复发而复发。此外，AML的5年生存率仍保持在令人沮丧的27％。然而，有有限的临床试验试图使用CAR治疗AM。
本发明由单个CAR T细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达两个不相连的CAR单元，可作为一种新的靶向多抗原和潜在地避免肿瘤复发的方法。一种复合CAR(cCAR)，包括CD123 CAR，其通过自裂P2A肽连接到CD33 CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
在本发明中，令人惊讶地发现，该CD123-CD33 cCAR T细胞在体外表现出强大和特异的抗肿瘤活性，并在体内控制显著的肿瘤生长。我们首次证明，一个2单位的不同的CAR能够在体外有效地靶向两种抗原，对更全面的临床结果具有潜在的意义。出乎意料的是，通过靶向AML的复合CAR,靶向CD123和Cd33联合是一个非常有力的战略。这种新的方法避免了与LSCs相关的疾病复发，由于复合设计的组合压力，避免了由于单个CAR治疗的选择压力而导致的抗原逃逸(单个抗原的丢失)。
在本发明中，令人惊讶的是，在CD33 CAR中添加CD123作为靶点，通过消除白血病细胞及其根源LSCs来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。这样可以更彻底地清除癌细胞，通过消除生长缓慢的LSC和增殖性白血病细胞来减少疾病复发。
在本发明中，令人惊讶地发现，CD123-CD33 cCAR T细胞能够清除常规白血病细胞和白血病前体细胞，从而降低复发风险，增强抗肿瘤活性。
在本发明中，还令人惊讶地发现CD123-CD33 cCAR T细胞在产生抗性之前，通过同时打击多个靶点来减少抗原逃逸，更彻底地消除癌细胞，。
在一个实施例中，CD123-CD33cCAR T细胞治疗可发展为“移植桥”、化疗的补充或检查点封锁(包括但不限于PD-L1、CTLA-4抑制剂)或作为包括但不限于急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征，慢性粒细胞白血病和慢性骨髓增生性疾病的疾病患者的独立治疗。
在另一实施例中，CD123-CD33cCAR T细胞疗法可用于将疾病负担降至移植前最低水平或彻底消除MRD，预期可以将复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，CD123-CD33cCAR T细胞治疗可进一步应用于CD123+和/或CD33+白血病患者的骨髓移植桥之外的患者。CD123-CD33cCAR T细胞治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在不被理论束缚的情况下，人们相信IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚或4-1bbl与CD123-CD33共表达cCAR通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，IL-21或IL-21锚与CD123-CD33cCAR的共同表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或向癌细胞招募先天性免疫细胞，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施例中，本发明提供一种CD123-CD33-IL-15/IL-15sushi CAR工程细胞，其包括分泌IL-15/IL-15sushi(SED ID NO.24)和相应的多核苷酸(SED ID NO.25)。
CLL-1-CD33复合CAR(CLL-1-CD33 cCAR)
cCAR包含两个CARs单位，CLL-1CAR和CD33 CAR靶向肿瘤细胞，分别表达CLL-1和CD33。CD33b CAR和CLL-1CAR用于构建图92所示的cCAR版本。该结构包括一个SFFV启动子，该启动子驱动由P2A肽连接的CARs的多个模块单元的表达。连接蛋白裂解后，cCARs分裂并与表达CD33和CLL-1的靶结合。该结构的激活域包括CD33b(CD33)CAR单元上的4-1BB和CLL-1CAR单元上的CD28。CD33b-CLL-1cCAR的目的是清除包括白血病干细胞在内的髓系白血病细胞。
目前，MDS、MPN(骨髓增生性肿瘤与慢性骨髓增生性肿瘤)和AML的治疗主要集中在白血病细胞上，因为它们量非常大，并且清楚地代表了患者最直接的问题。重要的是，白血病干细胞(LSCs)与大多数其他白血病细胞(“blast”细胞)截然不同，它们构成了一个罕见的亚群。虽然杀死肿瘤细胞以提供短期缓解，但LSC如果没有被破坏，总是会重新生长，导致患者复发。为了实现MDS疾病的持久治疗，必须销毁LSC。不幸的是，标准药物方案对MDS、MPN或AML-LSCs无效。因此，开发新的治疗方法，特别是针对白血病干细胞群体和庞大的白血病群体是至关重要的。本公开中公开的复合CAR针对两种群，并在此实施。
在本发明的一个方面中，CLL-1抗原是cCAR治疗的靶点之一。C型凝集素样-1(CLL-1)又称为MICL、CLEC12A、CLEC-1和DCAL2。CLL-1是一种糖蛋白受体，在造血细胞中表达。CLL-1不存在于未定型的CD34+/CD38-或CD34+/CD33-干细胞上，但存在于CD34+/CD38+或CD34+/CD33+祖细胞的亚群上(Bakker等，2004)。此外，CLL-1在其他组织中不表达。
CLL-1在急性髓系白血病(AML)细胞和白血病干细胞中表达。CLL-1在多种白血病中均有表达，包括骨髓单核细胞白血病(M4)、急性单核细胞白血病(M5)、急性早幼粒细胞白血病(M3)、慢性髓系白血病(CML)、慢性髓系增生性肿瘤和骨髓增生异常综合征(MDS)。
CLL-1在白血病干细胞(LSCs)相关的白血病细胞亚群中表达，其的消除对预防疾病的难治性和复发至关重要。
CD33(Siglec-3)是一种髓系特异性抗原，在早期髓系祖细胞、多数单核细胞和约90％的AML细胞上表达，但在正常HSCs上不表达。
在本发明的一个方面中，CD33抗原是cCAR治疗的靶点之一。CD33是一种跨膜受体，在急性髓系白血病90％的恶性细胞中均有表达。因此，根据本发明，从安全的角度来看，CLL-1和CD33靶抗原特别具有吸引力。
根据本发明，复合CLL-1-CD33 cCARs可能是治疗慢性粒细胞白血病(CML)人群的高效药物。在慢性粒细胞白血病(CML)中，有一种罕见的细胞亚群是CD34+CD38-。这个群体被认为是由LSCs组成的。LSCs数量的增加与疾病的进展有关。小分子Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂(TKI)能显著提高CP-CML患者的总生存率。然而，LSCs被认为对TKI治疗有抵抗力。治疗CML急需一种针对CML耐药LSCs的新疗法，该新疗法体现在本发明公开的复合CD33CLL-1CAR中。CLL-1在CD34+CD38群中高表达。根据本发明，复合CD33CLL-1CARs对于该群的治疗是高效的。
在本发明的一个实施例中，在cCAR中同时表达CD33和CLL-1的白血病细胞被用作治疗。CD33在髓系细胞、髓系白血病细胞和成熟单核细胞中表达，但在正常多能干细胞中不表达。CD33在CML、骨髓增生性肿瘤和MDS的白血病细胞中广泛表达。
由于大量急性髓系白血病(AML)患者对标准化疗方案难以耐受或治疗后出现疾病复发(Burnett 2012)，因此开发针对AML的CAR T细胞免疫疗法有可能满足巨大的临床需求。在大多数患者中，白血病细胞同时表达CLL-1和CD33，这使得本文所揭示的复合CLL-1-CD33 cCAR具有广泛的临床适用性。因此，本发明公开了一种新的多cCAR T/NK细胞结构，其包含多个靶向多个白血病相关抗原的CAR，从而通过共刺激结构域激活的协同效应来抵消抗原逃逸机制，靶向白血病细胞，包括白血病干细胞，从而提供更有效的，安全有效的治疗。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种根除或杀死表达CLL-1或CD33或两者的白血病干细胞(LSCs)或大量白血病细胞的方法。在本实施例中，向有需要的患者施用具有CD33单元和CLL-1单元的T或NK工程细胞。
在进一步的实施方案中，T或NK细胞中的复合CAR可用于根除或杀死CD34+CD38-白血病干细胞或表达CLL-1或CD33或两者的大量白血病细胞。
本发明还公开了一种复合CAR结构物，其具有增强的抗肿瘤活性，抗共表达靶抗原的细胞的效力，但对仅表达一种抗原的肿瘤细胞保持敏感性。此外，该复合CAR的每个CAR包括一个或两个共刺激域，并且在特定目标的存在下表现出强大的杀伤能力。
在本发明中，令人惊讶地发现，CLL-1-CD33 cCAR T细胞能够清除常规白血病细胞和白血病前体细胞，以降低复发风险，并增强抗肿瘤活性。
在本发明中，还令人惊讶地发现，CLL-1-CD33 cCAR T细胞更彻底地消除癌细胞，在产生抵抗力之前，通过同时靶向多个靶点来减少抗原逃逸。
在本发明中，还令人惊讶地发现，与单个CAR相比，复合CAR的毒性更小。我们最近临床试验的意外的发现支持了这一观点，与单个CAR相比，与先前认为的靶外效应相比，复合CAR的毒性较小。在进一步的公开中，复合CAR可增加对表达两种靶抗原的肿瘤细胞的亲和力或转运，而不是仅表达一种靶抗原的非靶细胞。这样，复合CAR可以诱导选择性，并且更倾向于靶向表达两种靶抗原的细胞而不是仅表达一种抗原的细胞，这可能导致靶外毒性增加。
在一个实施例中，CLL-1-CD33 cCAR T细胞治疗可发展为“移植桥”、化疗的补充或检查点阻断(包括但不限于PD-L1、CTLA-4抑制剂)或作为包括但不限于急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征，慢性粒细胞白血病和慢性骨髓增生性疾病的疾病患者的独立治疗。
在另一实施例中，CLL-1-CD33cCAR T细胞治疗可用于将移植前肿瘤负荷降至最低水平或彻底消除MRD，可以使复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，CLL-1-CD33 cCAR T细胞治疗可进一步应用于CLL-1+和/或CD33+白血病患者的骨髓移植桥之外的患者。CLL-1-CD33cCAR T细胞治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在不被理论束缚的情况下，人们相信IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚或4-1bbl与CLL-1-CD33 cCAR的共表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，IL-21或IL-21锚白与CLL-1-CD33cCAR的共同表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施方案中，本发明公开提供了一种CLL1-CD33b-IL-15/IL-15sushi CAR工程化细胞，其包括分泌IL-15/IL-15sushi(SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.99)和相应的多核苷酸(SEQ ID 29，分别为SEQ ID NO.100)。
CD123-NKG2D cCAR或CLL-1-NKG2D cCAR或CD33-NKG2D cCAR或BCMA-NKG2D cCAR
NKG2D(NKG2D受体)是一种跨膜蛋白，属于C型凝集素样受体CD94/NKG2家族。NKG2D可以与至少8种不同的配体结合，这些配体在AML、多发性骨髓瘤或其他白血病中自然表达。NKG2D配体是诱导的自身蛋白，在正常细胞表面几乎不存在或仅以极低水平存在，但在癌细胞(包括AML和多发性骨髓瘤)中过度表达。因此，他们是很好的CAR目标候选。
cCAR包含两个CARs单元：CD123-CAR和NKG2D-CAR，它们分别靶向表达CD123和NKG2D配体的肿瘤细胞。
cCAR包含两个CARs单元，CLL-1CAR和NKG2D CAR，它们分别靶向表达CLL-1和NKG2D配体的肿瘤细胞。
CD123-NKG2D-cCAR或CLL-1-NKG2D-cCAR或CD33-NKG2D-cCAR均能消除白血病，包括AML、MDS、CML和MPN。
在本发明中，BCMA-NKG2D cCAR能够消除多发性骨髓瘤。
在本发明中，将NKG2D作为靶点添加到CD123-CAR或CLL-1-CAR或CD33-CAR中可增强抗肿瘤反应并降低与疾病复发相关的抗原逃逸风险，因为NKG2D在AML、MDS、CML和MPN中广泛表达。
BCMA和NKG2D配体均广泛表达于多发性骨髓瘤细胞，这种高表达使BCMA-NKG2D-cCAR能够全面覆盖所有潜在的癌细胞。在抗性产生前，通过对多个靶点同时猛烈打击，以减少抗原逃逸使癌细胞更彻底的消除。
BCMA-CD38复合CAR(BCMA-CD38 cCAR)
目前，CAR技术在多发性骨髓瘤中的应用包括使用靶向BCMA(CD269)的CART细胞对抗由James Kochenderfer(NIH)领导的大量疾病。那些在BCMA-CAR治疗后病情缓解的患者最终会复发，这可能是由于一些骨髓瘤细胞对BCMA呈弱(弱)或阴性表达。因此，以CAR为基础的单一靶点治疗可能不足以预防骨髓瘤复发。
CD38又称环状ADP核糖水解酶，是一种糖蛋白，存在于许多免疫细胞表面，包括CD4+、CD8+、B淋巴细胞、浆细胞和自然杀伤细胞。
CD38是骨髓瘤的另一个良好靶点，因为它在骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞中的表达通常很高且均匀。
本发明是由单个CAR T细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达2个不同的CAR单位，可作为靶向多抗原和潜在避免肿瘤复发的新方法。一种复合CAR(cCAR)，包括BCMA-CAR，该BCMA-CAR通过自裂P2A肽连接到CD38-CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。这种复合cCAR的表达由一个强启动子SFFV控制，以确保CAR的充分表达。
在本发明中，BCMA-CD38 cCAR T细胞可在阻止骨髓瘤恶化中提供有效且特异的抗肿瘤活性(图37)。以BCMA和CD38为靶点的复合CAR联合治疗多发性骨髓瘤是一种非常有效的治疗策略。这一新的方法,由于复合设计的组合压力，避免了因单一CAR治疗的选择压力，使抗原逃逸(单一抗原的损失)。
在本发明中，将CD38作为靶点添加到BCMA-CAR中，通过消除存活的BCMA-CD38+骨髓瘤细胞来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。
BCMA和CD38都广泛表达于多发性骨髓瘤细胞，这种高表达使得BCMA-CD38cCAR能够全面覆盖所有潜在的癌细胞。在抗性产生前，通过对多个靶点同时猛烈打击，以减少抗原逃逸，这使癌细胞更彻底的消除。
在一个实施例中，BCMA-CD38引导的BCMA-CD38 cCAR疗法是骨髓移植(BMT)的“桥梁”，或是与重型化疗加BMT相结合。BCMA-CD38 cCAR可以为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的BMT选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负荷(MRD)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，BCMA-CD38 cCAR疗法能够将疾病负荷降低到移植前的最低水平或彻底消除MRD，可以预期复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，BCMA-CD38 cCAR疗法可在BCMA+和/或CD38+多发性骨髓瘤患者的骨髓桥移植之外有进一步的应用。BCMA-CD38 cCAR治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在一些实施例中，本发明提供了一种复合CAR多肽工程细胞，其靶向表达BCMA或CD38抗原或两者的细胞。靶细胞可能是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和冒烟型多发性骨髓瘤。
不希望受到理论的束缚，人们相信IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚或4-1bbl与BCMA-CD38 cCAR的共表达通过提高靶癌细胞的CAR识别敏感性或向癌细胞招募先天免疫细胞，给患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，IL-21或IL-21锚与BCMA-CD38cCAR的共同表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们相信，BCMA-CD38复合CAR工程细胞通过消耗与自身免疫性疾病相关的B细胞和浆细胞，为患有自身免疫性疾病或器官排斥的患者提供更好的治疗结果。
在一些实施例中，负荷CAR(BCMA-CD38 cCAR)靶向表达BCMA或CD38抗原或两者的细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如，但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和冒烟型多发性骨髓瘤。
BCMA-CD38 cCAR靶向细胞是自身免疫性疾病患者的B细胞、未成熟B细胞、记忆B细胞、浆细胞、长寿浆细胞或浆细胞。自身免疫性疾病包括系统性硬皮病、多发性硬化、银屑病、皮炎、炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿关节炎、干燥综合征、多发性肌炎、肺泡蛋白沉积症、肉芽肿和血管炎，艾迪生病、抗原抗体复合物介导的疾病和抗肾小球基底膜疾病。
在另一实施例中，本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病或紊乱的方法。免疫紊乱选自一组疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、炎症性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、
Figure GDA0003109124000000981
综合征、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、视神经脊髓炎(NMO)、NMO谱系障碍(NMOSD)，特发性血小板减少性紫癜(ITP)、与系统性自身免疫性小血管血管炎综合征或显微镜下多脉管炎(MPA)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ANCAs)、肉芽肿伴多脉管炎(GPA)、韦格纳肉芽肿、寻常天疱疮(PV)叶状天疱疮(PF)和已发展出针对VIII因子的同种抗体的A型血友病患者。寻常型天疱疮(PV)和叶状天疱疮(PF)是由自身抗体引起的慢性、危及生命的水疱性疾病。
CD19-CD38复合CAR(CD19-CD38 cCAR)
虽然使用CD19CAR的B-ALL患者的初始缓解率约为90％，但大多数患者在一年内复发。复发至少一部分是由于抗原逃逸。因此，迫切需要更有效的CAR-T细胞治疗来预防复发
CD38是淋巴瘤的另一个良好靶点，因为它在淋巴瘤细胞中的表达通常很高且均匀。CD38在多种淋巴瘤中表达，包括慢性淋巴细胞性淋巴瘤/小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤。
本发明是由单个CAR T细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达两个离散CAR单元，可作为一种新的靶向多抗原和潜在地避免肿瘤复发的方法。一种复合CAR(cCAR)，包括CD19-CAR通过自裂P2A肽连接到CD38-CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。这种复合cCAR的表达由一个强启动子SFFV控制，以确保CAR的充分表达。
在本发明中，CD19-CD38 cCAR T细胞可在阻止淋巴瘤恶化中提供有效且特异的抗肿瘤活性。以BCMA和CD19为靶点的复合CAR联合治疗多发性骨髓瘤是一种非常有效的治疗策略。由于来自复合设计的组合压力，这种新颖的方法避免了单一CAR处理选择压力下的抗原逃逸(单个抗原的丢失)。
在本发明中，将CD38作为靶点添加到BCMA-CAR中，通过消除存活的BCMA-CD38+淋巴瘤来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。
CD19和CD38均广泛表达于多发性骨髓瘤细胞，这种高表达使CD19-CD38-cCAR能够全面覆盖所有潜在的淋巴瘤细胞。通过在抗药性产生之前对多个靶标同时攻击，可以更彻底地消除癌细胞，减少抗原逃逸。
在一个实施例中，CD19-CD38导向的BCMA-CD38 cCAR疗法是骨髓移植(BMT)的“桥梁”，或与重型化疗加BMT相结合。CD19-CD38 cCAR可为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的BMT选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负荷(MRD)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，CD19-CD38 cCAR治疗能够在移植前将疾病负荷降低到最低水平或彻底消除MRD，可以预期复发率将降低，淋巴瘤的长期无病生存率将提高，患者的预后将显著改善。
在一个实施例中，CD19-CD38-cCAR疗法可在骨髓移植桥以外的CD19+和/或CD38+多发性骨髓瘤患者中有进一步的应用。CD19-CD38 cCAR治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在一些实施例中，本发明提供了一种复合的CAR多肽工程细胞，其靶向表达CD19或CD38抗原的细胞或两者。靶细胞可能是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤。在进一步实施例中，淋巴瘤选自无限制性、B-ALL、高级别B细胞淋巴瘤、低级别B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、Burkett淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、CLL、边缘区B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤。
在不希望被理论束缚的情况下，人们认为IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚或4-1bbl与CD19-CD38 cCAR的共表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，人们相信IL-21或IL-21锚与CD19-CD38cCAR的共同表达通过增加靶癌细胞的CAR识别敏感性或向癌细胞招募先天性免疫细胞，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，人们相信，CD19-CD38复合CAR工程细胞通过消耗与自身免疫性疾病相关的B细胞和浆细胞，为患有自身免疫性疾病或器官排斥反应的患者提供更好的治疗结果。
在一个实施方案中，工程细胞包括CD19嵌合抗原受体多肽(SEQ ID NO.30)和相应的核苷酸(SEQ ID NO.31)。
在一些实施例中，复合CAR(BCMA-CD38 cCAR)靶向表达BCMA或CD38抗原或两者的细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如，但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨浆细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和冒烟型多发性骨髓瘤。
BCMA-CD38 cCAR靶向细胞是自身免疫性疾病患者的B细胞、未成熟B细胞、记忆B细胞、浆细胞、长寿浆细胞或浆细胞。自身免疫性疾病包括系统性硬皮病、多发性硬化、银屑病、皮炎、炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿关节炎、干燥综合征、多发性肌炎、肺泡蛋白沉积症、肉芽肿和血管炎，艾迪生病、抗原抗体复合物介导的疾病和抗肾小球基底膜疾病。
在另一实施例中，本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病或紊乱的方法。免疫紊乱选自一组疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、炎症性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、视神经脊髓炎(NMO)、NMO谱系障碍(NMOSD)，特发性血小板减少性紫癜(ITP)、与系统性自身免疫性小血管血管炎综合征或显微镜下多脉管炎(MPA)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ANCAs)、肉芽肿伴多脉管炎(GPA)、韦格纳肉芽肿、寻常天疱疮(PV)、叶状天疱疮(PF)和已发展出针对VIII因子的同种抗体A型血友病患者。寻常型天疱疮(PV)和叶状天疱疮(PF)是由自身抗体引起的慢性、危及生命的水疱性疾病。
BCMA-CD19复合CAR(BCMA-CD19 cCAR)
虽然杀死多发性骨髓瘤细胞可以提供短期缓解，但LSCs(骨髓瘤白血病干细胞)如果不被破坏，总是会重新生长，导致患者复发。必须破坏LSCs，以实现多发性骨髓瘤疾病的持久治疗。在不希望受到理论约束的情况下，人们认为，一小部分多发性骨髓瘤细胞是CD19阳性的干细胞，与疾病的进展和复发有关，而大量的骨髓瘤细胞群是BCMA阳性。因此，开发新的治疗方法，特别是针对骨髓瘤干细胞群体和庞大的骨髓瘤群体是至关重要的。本发明中的复合CAR以多发性骨髓瘤细胞的BCMA+和/或CD19+阳性群为靶点，并在这里实现。
在一些实施例中，本发明提供了一种根除或杀死表达CD19和/或BCMA的骨髓瘤干细胞(LSCs)或大量骨髓瘤细胞的方法。在本实施例中，向需要的患者施用具有BCMA单元和CD19单元的T或NK工程细胞。
在一些实施例中，公开的公开内容包括使用BCMA-CD19 cCAR消除多发性骨髓瘤中BCMA和CD19群体以防止复发的方法和组成。当BCMA和CD19(BCMA-CD19)的两个单位在一个载体或一个细胞中结合在一起时，CAR在清除骨髓瘤细胞方面更为强大。
在进一步的实施方案中，T或NK细胞中的复合CAR BCMA-CD19 cCAR可用于根除或杀死BCMA+CD19+或BCMA+CD19-或BCMA-CD19+种群。
在一些实施例中，本发明的公开内容包括使用BCMA-CD19 cCAR消除多发性骨髓瘤中BCMA和CD19群体以防止复发的方法和成分。当两个BCMA和CD19(BCMA-CD19)单位在载体或细胞中结合在一起时，CAR清除骨髓瘤细胞的能力更强。
在一些实施方案中，CD19+群体可以是多发性骨髓瘤细胞的早期前体，而CD19-BCMA+细胞可以是分化程度更高的恶性多发性骨髓瘤细胞。在一些实施例中，本发明包括使用BCMA-CD19b cCAR(BCMA-cd19cCAR的一个版本)T或NK细胞消除多发性骨髓瘤细胞的早期前体和更具差异性的恶性多发性骨髓瘤细胞的方法和成分。在另一实施例中，所公开的公开内容包括使用BCMA-CD19bcCAR T或NK细胞靶向早期前体和更具分化的恶性细胞以完全消除多发性骨髓瘤恶性克隆的方法和成分。
本发明还公开了一种复合CAR结构物，其具有增强的抗骨髓瘤细胞活性对抗共表达靶抗原的细胞的效力，但对仅表达一种抗原的肿瘤细胞保持敏感性。此外，该复合CAR的每个CAR包括一个或两个共刺激域，并且在特定目标的存在下表现出强大的杀伤能力。
在不希望被理论束缚的情况下，人们相信IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚或4-1bbl与BCMA-CD19 cCAR的共表达通过增加靶骨髓瘤细胞的CAR识别敏感性或向骨髓瘤细胞招募先天免疫细胞，为患者提供长期持久的缓解。
在一些实施例中，复合CAR(BCMA-CD19 cCAR)靶向表达BCMA或CD19抗原或两者的细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如，但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨浆细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)和冒烟型多发性骨髓瘤。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为IL-21或IL-IL-21锚与BCMA-CD19-cCAR的共同表达通过增加靶向骨髓瘤细胞的CAR识别敏感性或将先天免疫细胞招募到骨髓瘤细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为IL-18或IL-IL-18锚与BCMA-CD19cCAR的共同表达通过增加靶向骨髓瘤细胞的CAR识别敏感性或将固有免疫细胞招募到骨髓瘤细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在一些实施例中，本发明提供了通过向患者施用CAR或复合CAR(BCMA-CD19 cCAR)T细胞或NK细胞来消耗清除自身免疫性疾病患者中的B细胞、未成熟B细胞、记忆B细胞、浆母细胞、长寿血浆细胞或血浆细胞的方法。
BCMA-CD19 cCAR靶向清除细胞是自身免疫性疾病患者的B细胞、未成熟B细胞、记忆B细胞、浆细胞、长寿浆细胞或浆细胞。自身免疫性疾病包括系统性硬皮病、多发性硬化、银屑病、皮炎、炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿关节炎、干燥综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、多发性肌炎、肺泡蛋白沉积症、肉芽肿和血管炎，艾迪生病、抗原抗体复合物介导的疾病、抗磷脂综合征和抗肾小球基底膜疾病。
在一些实施例中，自身免疫性疾病患者中的免疫细胞包括B细胞、未成熟B细胞、记忆B细胞、浆母细胞、长寿浆细胞或浆细胞可被BCMA和CD19双特异性CAR T细胞或双特异性抗体消除。
在一些实施方案中，可以将BCMA和CD19 CAR核酸序列整合入两个或更多个病毒载体中以在靶细胞中表达，尽管这种两种载体方法可能遇到与将独立病毒载体共转导至同一宿主相关的潜在困难。需要更高的CAR表达效率使T细胞功能足够。
在一些实施例中，BCMA和CD19 CAR核酸序列可并入相同的载体表达中并且由其自身的启动子控制表达。
在一些实施例中，BCMA-CAR T或NK细胞和CD19-CAR T或NK细胞可分别生成，然后依次施用到宿主。
在另一实施例中，本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病或紊乱的方法。免疫紊乱选自一组疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、炎症性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、视神经脊髓炎(NMO)、NMO谱系障碍(NMOSD)，特发性血小板减少性紫癜(ITP)、与系统性自身免疫性小血管血管炎综合征或显微镜下多脉管炎(MPA)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ANCAs)、肉芽肿伴多脉管炎(GPA)、韦格纳肉芽肿、寻常天疱疮(PV)和叶状天疱疮(PF)和已发展出针对VIII因子的同种抗体A型血友病患者。
器官移植代表一个人的新生命，可以移植的器官包括肾脏、心脏、肺、胰腺和肠。然而，许多患者由于预先存在或后天得到了针对供者抗原(如人类白细胞抗原(HLA))的供者特异性抗体而无法获得潜在的救生的器官。因此，患者可能会失去捐赠的器官。目前，抗体介导的排斥反应的治疗方法很少，而有效治疗抗体介导的排斥反应在这一领域的巨大需求尚未得到满足。使用CAR T/NK细胞去除B细胞或浆细胞或两者，可为抗体介导的排斥反应提供治疗。
BCMA-CD19-cCAR或CD19-CD38-cCAR或BCMA-CD38-cCAR靶向细胞为B细胞、未成熟B细胞、记忆B细胞、浆母细胞、长寿血浆细胞或血浆细胞，患者的抗体介导的排斥反应与器官排斥反应相关。
含有CAR多肽和增强子的工程细胞
在另一实施例中，本发明提供了一种具有至少一种嵌合抗原受体多肽和增强子的工程细胞。
在另一实施例中，本发明提供了一种具有至少一种嵌合抗原受体多肽和至少一种增强子的工程细胞。
在一个实施例中，本发明提供具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽和增强子的工程细胞。
在一个实施例中，本发明提供了一种工程细胞，其具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽和至少一种增强子。
如本文所用，增强子包括促进或增强具有嵌合抗原受体多肽的工程细胞活性的生物分子。促进剂包括细胞因子。在另一实施例中，增强剂包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-21锚、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3和TGFRβ、其受体及其功能片段。
增强子可以由本文所述的工程细胞表达并显示在工程细胞的表面上，或者增强子可以由工程细胞分泌到周围的细胞外空间。表面显示和分泌的方法在本领域中是众所周知的。例如，增强子可以是一种融合蛋白，其具有提供表面展示或向细胞外空间分泌的肽。
增强子的作用可由诸如增强子受体及其功能片段等附加因子来补充。附加因子可以作为融合蛋白与增强子共同表达，或者作为单独的多肽表达并分泌到细胞外空间。
促进剂可以是由工程化的CAR细胞分泌的细胞因子，设计用于与CAR多肽共同表达。当同源抗原与CAR结合时发生大量释放。肿瘤细胞周围的炎性细胞与肿瘤细胞的进展和转移密切相关。炎性细胞包括T细胞和NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞等天然免疫应答细胞，它们的增殖和抗肿瘤活性受细胞因子的调控。像CAR T或NK细胞这样的CAR细胞与靶向癌细胞结合，并通过CART/NK细胞的扩张触发大量的增强子分泌。分泌的促进剂能有效地促进癌细胞免疫应答细胞的存活、分化和活化。增强子与CAR的共表达可以补充CAR T或NK细胞不能消除非靶向癌细胞的缺陷
CAR细胞可以作为细胞因子的载体，通过CAR细胞将细胞因子传递到靶向肿瘤部位，用大剂量外源性细胞因子降低全身毒性。
为了提高CAR细胞的持续存活率或长期存活率，可以将膜结合增强因子与CAR共表达以提高CAR的持续性
在一个实施例中，增强子为IL-15。在这种情况下，上述附加因子是IL-15受体及其功能片段。功能片段包括IL-15受体、IL-15RA和IL-15RA(IL-15sushi)的sushi结构域。可溶性IL-15RA或IL-15sushi通过防止IL-15降解而显著增强IL-15的功能活性。可溶性IL-15/IL-15RA或IL-15/IL-15sushi复合物在体内比单独的IL-15更稳定和刺激。
在一个实施例中，IL-15作为融合蛋白与IL-15受体IL-15RA和IL-15RA的sushi结构域(IL-15sushi)中的至少一个共同表达。在一个实施例中，IL-15受体IL-15RA或IL-15RA的sushi结构域(IL-15sushi)位于IL-15的N-末端。在另一实施例中，IL-15受体IL-15RA或IL-15RA的sushi结构域(IL-15sushi)位于IL-15的C-末端。如本文所用，IL-15/IL-15sushi表示IL-15sushi在融合蛋白中位于IL-15的C-末端；IL-15sushi/IL-15表示IL-15sushi在融合蛋白中位于IL-15的N-末端。
在一些实施例中，IL-15和IL-15受体或其多肽的功能片段位于单个多肽分子上并由肽连接物分离，肽连接物可为1-25个氨基酸残基、25-100个氨基酸残基或50-200个氨基酸残基。该连接器可包括本文所述的高效解理位点。
白细胞介素(IL-15)及其特异性受体链IL-15Rα(IL-15-RA)在NK、CD8T细胞等多种效应细胞中发挥着重要的作用。CD8+T细胞可被修饰以表达自分泌生长因子，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-21或IL-15，以维持体内移植的存活。在不希望被理论束缚的情况下，人们认为IL-15可以克服CD4缺陷，诱导原代和回忆记忆性CD8T细胞。IL-15-RA或IL-15-IL-RA融合物在CD8 T细胞上的过表达显著提高了其在体内外的存活和增殖。在一些实施例中，CD4-CAR或CD19-CAR或CD45-CAR或BCMA-CAR或任何CAR与IL-15、IL15 RA和IL-15/IL-15RA或IL15-RA/IL-15或IL-15/IL-15sush中的至少一个或其部分或组合共同表达，以增强CAR T或NK的存活或增殖，并改善记忆CAR CD8+T细胞或NK细胞的扩增。
在一些实施例中，本文所述的工程细胞共同表达趋化因子。趋化因子包括CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL19、CXCL1、CXCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL12或CCL-21。
在一些实施例中，本文所述的工程细胞表达一种或两种嵌合抗原多肽以及增强子和趋化因子中的至少一种。
CD4CAR或CD19 CAR或CD45CAR或BCMA CAR或任何CAR与IL-15/IL-15sushi或其部分或组合中的至少一种共表达，以增强CAR-NK的存活或增殖，并改善记忆CAR-CD8+T细胞的扩增。
令人惊讶的是，IL-15/IL-15sushi的CAR共表达对T细胞和NK细胞靶向肿瘤细胞的持久性和活性增强具有重要意义。
令人惊讶的是，CAR共表达IL-15/IL-15sushi对T细胞、NK细胞靶向肿瘤细胞和预防肿瘤复发具有重要意义。
令人惊讶的是，当与IL-15/IL-15sushi共表达时，CAR-NK细胞或NK细胞可以延长生存期。
本发明提供了一种工程细胞，其具有如本文所述的CAR多肽以及IL-15、IL-15RA、IL-15sushi、IL-15/IL-15RA、IL-15-RA/IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-15sushi/IL-15中的至少一种及其组合，提高肿瘤患者的生存率、提高CAR T或NK细胞持续性或增殖性。
在另一个实施例中，本发明提供了一种工程细胞，其具有重组IL-15、IL-15RA、IL-15sushi、IL-15/IL-15RA、IL-15-RA/IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-15sushi/IL-15中的至少一个、其功能片段及其组合；以及至少一种不同的CAR多肽，其中抗原识别域包括GD2、GD3、白细胞介素6受体、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3、糖脂、glypican 3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2/neu、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、甲胎蛋白、CA 19-9、CA72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1，MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、免疫球蛋白kappa和lambda、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2和CD138。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为IL-15/IL-15sushi和其他类型的IL-15或IL-15RA蛋白或其蛋白片段与检查点抑制剂或调节剂(如抗PD-1)结合时，提供CAR多肽的协同效应。
在一个实施例中，本发明提供了一种通过向需要IL-21或IL-12锚的患者施用共表达IL-21或IL-12锚的CAR工程细胞来为癌症患者提供长期持久缓解的方法(图24和25)。在不希望受到理论约束的情况下，人们认为IL-21或IL-21锚与CAR共同表达可通过增加CAR工程细胞的持久性，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，我们还认为分泌IL-21与CAR多肽的共同表达通过影响肿瘤微环境，减少免疫抑制，促进先天性细胞增殖或功能，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，我们认为分泌IL-21或IL-21锚的CAR共表达对于T细胞和NK细胞靶向肿瘤细胞的持久性和活性增强具有重要意义。CAR-NK细胞或NK细胞与IL-21或IL-21锚联合表达可延长生存期。
在一个实施例中，本发明提供了一种与靶向肿瘤细胞的CAR T或NK细胞可以是将增强子IL-21递送到肿瘤微环境的载体有关的方法。CAR T或NK细胞被设计成共同表达分泌型IL-21。工程化的CAR-T或NK-T细胞或NK细胞在肿瘤微环境中，靶向肿瘤细胞，与CAR靶向抗原结合，引起肿瘤细胞裂解，并从CAR-T或NK细胞的扩张中大量分泌可溶性IL-21。
在特定实施例中，可通过结合以下至少一个或多个步骤来实现肿瘤的消除：
(1)通过靶向CAR或NK抗原将本文公开的CAR工程T细胞或NK细胞结合到肿瘤细胞的一部分；
(2)从共表达该分子的CAR T/NK细胞的扩增中触发大量分泌IL-21；
(3)招募和刺激多种天然和适应性免疫细胞对抗肿瘤；
(4)通过使用检查点阻断剂，如PD-L1和CTLA-4抑制剂，减少肿瘤中存在的肿瘤抑制。
在不希望受到理论约束的情况下，人们相信，上述步骤的组合通过协调一致的先天性和适应性免疫反应提供了有效的抗肿瘤效果。
在另一个实施例中，本发明提供一种具有IL-21或IL-21锚、其功能片段及其组合的工程细胞；以及至少一种不同的CAR多肽，其中抗原识别域包括GD2、GD3、白细胞介素6受体、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3，糖脂，glypican 3，F77，GD-2，WT1，CEA，HER-2/neu，MAGE-3，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，甲胎蛋白，CA 19-9，CA 72-4，NY-ESO，FAP，ErbB，c-Met，MART-1，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5，CD30，EGFRvIII，CD33，CD123，CLL-1，免疫球蛋白kappa和lambda，CD38，CD52，CD19，CD20，CD22，CD38，BCMA，CS1，BAFF受体，TACI，CD3，CD4，CD8，CD5，CD7，CD2和CD138。
在一个实施方案中，本发明提供了一种通过向需要其的患者施用共表达IL-18或IL-18锚的CAR工程细胞来给患有癌症的患者中提供长期持久缓解的方法(图26和图26。27)。不希望受理论的束缚，据信IL-18或IL-18锚与CAR的共表达通过增加CAR工程细胞的持久性在患者中提供了长期的持久缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，还认为分泌IL-18与CAR多肽的共同表达通过影响肿瘤微环境，减少免疫抑制和促进先天性细胞增殖或功能，为患者提供长期持久的缓解。
不希望受理论的束缚，据信分泌IL-18或IL-18锚的CAR共表达对于靶向肿瘤细胞的T细胞和NK细胞的更长的持久性和增强的活性是重要的。与IL-18或IL-18锚共表达时，CAR NK细胞或NK细胞可以延长生存期。
在一个实施方案中，本发明提供了一种与靶向肿瘤细胞的CAR T或NK细胞可以是将增强子IL-18递送至肿瘤微环境的载体有关的方法。CAR T或NK细胞经过工程改造，可以共表达分泌性IL-18。肿瘤微环境中的工程CAR T或NK细胞靶向肿瘤细胞，与CAR靶向抗原结合，并触发肿瘤细胞的裂解以及CAR T或NK细胞的扩增大量分泌可溶性IL-18。
在特定的实施方案中，可以通过组合以下步骤中的至少一个或多个步骤来消除肿瘤：
(1)通过靶向CAR或NK抗原将本文公开的CAR工程改造的T细胞或NK细胞与一部分肿瘤细胞结合；
(2)共同表达该分子的CAR T/NK细胞扩增引发IL-18大量分泌；
(3)招募和刺激各种针对肿瘤的先天性和适应性免疫细胞；
(4)通过给予检查点阻断剂例如PD-L1和CTLA-4抑制剂来减少存在于肿瘤中的肿瘤抑制。
在不希望受到理论约束的情况下，人们相信，上述步骤的组合通过协调一致的先天性和适应性免疫反应提供了有效的抗肿瘤效果。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种工程细胞，其具有IL-18或IL-18锚定物，其功能片段及其组合。至少一种不同的CAR多肽，其中的抗原识别域包括GD2，GD3，白介素6受体，ROR1，PSMA，PSCA(前列腺干细胞抗原)，MAGE A3，糖脂，glypican 3，F77，GD-2，WT1，CEA，HER-2/neu，MAGE-3，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，甲胎蛋白，CA 19-9，CA 72-4，NY-ESO，FAP，ErbB，c-Met，MART-1，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5，MMG49表位、CD30，EGFRvIII，CD33，CD123，CLL-1，免疫球蛋白kappa和lambda，CD38，CD52，CD47,CD200,CD70,CD19，CD20，CD22，CD38，BCMA，CS1，BAFF受体，TACI，CD3，CD4，CD8，CD5，CD7，CD2和CD138。
在一些实施例中，靶向一种以上不同抗原可通过汇集由至少两个单独的CAR T或NK细胞产生的CAR工程细胞来实现。
如本文所使用的，汇集的CAR工程细胞包括具有多个不同CAR多肽单元的工程细胞群。举例来说，集合工程细胞包括具有不同CAR多肽的工程细胞群和具有不同CAR多肽的工程细胞群。此外，汇集的CAR工程细胞包括具有cCAR多肽的工程细胞。
工程细胞的产生方法
可以通过本领域已知的任何方法将本文公开的任何多核苷酸引入工程改造细胞中。
在一个实施例中，通过本文公开的任何病毒载体将CAR多核苷酸递送至工程改造细胞。
在一个实施例中，为了实现增强的安全性特征或治疗指数，本文公开的任何工程改造细胞可构建为瞬时RNA修饰的“可生物降解的”形式或衍生物，或其组合。可以将本公开中RNA修饰的CAR电穿孔到T细胞或NK细胞中。复合CAR的表达可在几天内逐渐减少。
在本发明的一些实施例中，本文公开的任何工程改造细胞可以在转录系统(也称为“睡美人”)中构建，没有用病毒载体将CAR DNA整合到宿主基因组中。
在本发明的一些实施例中，本文公开的任何工程细胞可以通过两个载体引入，并且每个载体带有CAR或增强子单元。
产生具有多个CAR单元的工程改造细胞的方法
在另一个实施例中，本发明提供了制备具有至少两个CAR单元的工程改造细胞之方法。
在一些实施例中，使用双顺反子或多顺反子表达载体在T或NK细胞中表达多个CAR单位。有几种策略可用于构建双顺反子或多顺反子载体，包括但不限于(1)与CAR的开放阅读框融合的多个启动子；(2)在CAR单元之间插入剪接信号；CAR的融合，其表达由单个启动子驱动；(3)在CAR单元之间插入蛋白水解切割位点(自切割肽)；(4)插入内部核糖体进入位点(IRES)；(5)分离两个来表达不同的CAR单元。
在优选的实施例中，多个CAR单元在单个开放阅读框(ORF)中表达，从而产生具有多个CAR单元的单个多肽。在该实施例中，在每个CAR单元之间设置含有高效切割位点的氨基酸序列或接头。
如本文所用，高切割效率定义为超过50％，超过70％，超过80％或超过90％的转化蛋白质被切割。如Kim 2011所述，可通过蛋白印迹分析测量切割效率。
此外，在优选的实施例中，存在等量的裂解产物，如蛋白质印迹分析所示。
高效切割位点的实例包括猪teschovirus-21A(P2A)，FMDV 2A(本文缩写为F2A)；马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)；和那些甲病毒2A(T2A)，细胞质多角体病毒2A(BmCPV2A)和flacherie病毒2A(BmIFV2A)，或其组合。在优选的实施例中，高效切割位点是P2A，Kim JH，Lee S-R，Li L-H，Park H-J，Park J-H，Lee KY等人(2011)描述了高效切割位点。在人细胞系，斑马鱼和小鼠中源自猪Teschovirus-1的2A肽的高切割效率。PLoS ONE 6(4)：e18556之内容通过引用并入本文。
在其中多个CAR单元在单个开放阅读框(ORF)中表达的实施例中，表达受强启动子的控制。强启动子的实例包括SFFV启动子及其衍生物。
当设计更长的基因结构时，蛋白质表达水平随着附加长度的增加而显著下降。因此，对多个抗原识别序列进行初步筛选，以找到既能产生最高转导效率又能产生最高靶细胞裂解率的组合。另外，它最好避免很高的CAR表达，这会导致细胞表面的单链聚集导致强直效应和不好的溶解。
在实施例中，其中多个CAR单元表示在一个单元中，避免每个单独CAR厢的铰链区域之间的轿厢相互作用。最好排除铰链的相互作用部位，或者每个CAR使用不同的铰链区域以避免其相互作用。
在一些实施例中，其中多个CAR单元在一个细胞中表达，对于每个共同结构域的不同核苷酸序列，例如先导序列、铰链和跨膜区域以及CD3zeta区域，优选以避免同源重组，同时保持相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，其中创建了多个CAR单元，基于将基于医学知识和背景给出最佳治疗效果的目标抗原的选择是优选的。
在一些实施例中，靶向一种以上不同抗原可通过汇集由至少两个单独的CAR T或NK细胞产生的CAR工程细胞来实现。
最好在靶细胞系和非靶细胞系上使用CAR T或NK细胞进行共培养裂解实验，以测试特异性。此外，优选仅表达一种靶向抗原的细胞系，每种细胞系用于证明每种组分CAR的裂解能力。要做到这一点，最好是制造一个非靶细胞系来合成表达所需抗原。
在一些实施例中，靶向一种以上不同抗原可通过汇集由至少两个单独的CAR T或NK细胞产生的CAR工程细胞来实现。
如本文所使用的，汇集的CAR工程细胞包括具有多个不同CAR多肽单元的工程细胞群。举例来说，集合工程细胞包括具有不同CAR多肽的工程细胞群和具有不同CAR多肽的工程细胞群。此外，汇集的CAR工程细胞包括具有cCAR多肽的工程细胞。
具有CAR多肽和增强子的工程改造细胞
在另一个实施例中，本发明提供了制备表达至少一种CAR单元和增强子的工程改造细胞的方法。
在一些实施例中，使用双顺反子或多顺反子表达载体在T或NK细胞中表达至少一种CAR单元和增强子。有几种策略可用于构建双顺反子或多顺反子载体，包括但不限于(1)与CAR的开放阅读框融合的多个启动子；(2)在CAR单元之间插入剪接信号；CAR的融合，其表达由单个启动子驱动；(3)在CAR单元之间插入蛋白水解切割位点(自切割肽)；(4)插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实施例中，至少一个在T细胞或NK细胞中表达的CAR和增强子可以通过两个分离的载体或病毒来实现。
在优选的实施例中，至少一个CAR单元和增强子在单个开放阅读框(ORF)中表达，从而产生具有至少一个CAR单元和增强子的单一多肽。在该实施例中，含有高效切割位点的氨基酸序列或接头位于每个CAR单元之间和CAR单元及增强子之间。在该实施例中，ORF处于强启动子的控制下。强启动子的实例包括SFFV启动子及其衍生物。
此外，在优选的实施例中，存在等量的裂解产物，如蛋白质印迹分析所示。
CD123-CLL-1
与B细胞和浆细胞恶性肿瘤不同，由于白血病干细胞(LSCs)的作用，AML的治疗具有独特的挑战性。LSCs是一种表达造血干细胞(CD34+CD38-)标记的细胞群，能够引发和维持造血恶性肿瘤，产生克隆细胞群速度超越健康骨髓。由于LSCs主要停留在细胞周期的静止期，针对快速分裂的肿瘤细胞群的化疗使LSCs不受影响。大多数情况下，组成最小残留疾病(MRD)的人口是难以捉摸的，它导致AML治疗后不可避免的复发。要想成功地将CAR疗法转化为AML，以彻底消除疾病并确保不复发，需要仔细选择抗原，以便不仅能够根除大量白血病疾病，而且能够根除白血病干细胞。
最近，单一CAR疗法在治疗先前难治性和复发性B细胞恶性肿瘤方面取得了突破，在实现高缓解率方面取得了突破。相反，缺乏针对AML的新治疗方法，CAR治疗提供了希望的灯塔。特别是，将复合CAR疗法应用于AML有可能完全改变其疗法。
CD123和C型凝集素样分子-1(CLL-1)存在于大多数AML患者的CD34+CD38-细胞上。在不受理论约束的情况下，复合CAR表达了这样一种想法：编码两个离散CAR单位的单个T细胞可以同时更广泛地靶向和根除LSCs，从而防止疾病复发。
本公开内容由在具有独立信号传导域的载体中表达两个离散CAR单元的单个CAR-T细胞组成，其可以用作靶向多种抗原并潜在地避免肿瘤复发的新方法。化合物CAR(cCAR)由CD123 CAR组成，该CD123 CAR通过自身裂解的P2A肽与CLL-1CAR连接，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
在一个实施例中，CD123-CLL-1cCAR T细胞疗法可以发展为“移植的桥梁”，化学疗法的补充或检查点的阻滞(包括但不限于PD-L1，CTLA-4抑制剂)或作为一种独立疗法，用于治疗以下患者，包括但不限于：急性髓细胞性白血病，骨髓增生异常综合症，慢性髓细胞性白血病和慢性骨髓增生性疾病。
在另一实施例中，CD123-CLL-1cCAR T细胞治疗可用于彻底消除MRD。可以预期，复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者的预后将显著改善。
在一个实施例中，CD123-CLL1 cCAR T细胞疗法对于具有CD123+和/或CLL-1+白血病患者的患者而言，可以超越骨髓移植的桥梁而具有进一步的应用。CD123-CLL-1cCAR T细胞疗法可以用作独立疗法，也可以作为患者个体免疫化学疗法的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或BMT的合并症患者，这可能是延长患者生存时间并保留更好生活质量的有效策略。
不受理论的束缚，我们认为IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚定或4-1BBL与CD123-CDLL-1cCAR的共同表达可为患者通过提高对目标癌细胞的CAR识别的敏感性或将先天免疫细胞募集到癌细胞中提供长期持久的缓解。
不受理论的束缚，我们认为IL-21或IL-21锚定与CD123-CLL-1cCAR的共同表达通过增加靶癌细胞CAR识别的敏感性或通过向癌细胞募集天然免疫细胞来提供患者的长期持久缓解。
在一个实施例中，本发明提供一种CD123-CLL1 CAR工程改造的细胞，其包括分泌IL-15/IL-15sushi(序列号28)和相应的多核苷酸(序列号29)。
CD123-CLL-1
例子
根据本发明制备了工程化的CD123-CLL-1CAR细胞(图45)。CD123-CLL-1CAR可以溶解表达CD123+和/或CLL-1+抗原的白血病/淋巴瘤。
向通过CD123-CLL-1CAR裂解表达CD123+和/或CLL-1+的靶向细胞进行细胞杀伤测定。
在异种小鼠模型中进行体内抗肿瘤活性和细胞杀伤，并使用PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中描述的方法通过CD123-CLL-1CAR T或NK细胞消除或抑制表达CD123和/或CLL-1的靶细胞。
复合CD38 CAR和CD19-CD38 CAR
CD38(分化簇38)，也称为环状ADP核糖水解酶，是一种糖蛋白。CD38已被用作多种白血病/淋巴瘤的预后指标。
CD38在B-NHL(非霍奇金淋巴瘤)中表达，包括CLL/SLL，弥漫性大细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，浆母细胞性淋巴瘤，浆细胞瘤和原发性渗出性淋巴瘤。CD38还在唐氏综合症，T细胞淋巴瘤，AML，T-ALL和B-ALL的短暂性骨髓增生性疾病中表达。已知CD38表达与不良预后有关。
基于这些表达谱，CD38被认为是恶性肿瘤的理想且几乎通用的靶标。但是，单一CD38 CAR疗法可能不足以完全消除白血病细胞并实现高缓解率，因为CD38并非在所有白血病细胞中都表达。靶向至少两种标记，其中一种包括CD38(基于CD38的化合物CAR)，可以提供一些明显的好处。通过至少两种抗原(或包括CD38的两种表面标志物)靶向白血病的复合CAR可以通过防止由于抗原丢失而复发来克服单一抗原治疗的缺陷。虽然在抗原特异性选择压力下可能会丢失单个抗原，但同时丢失两种抗原的可能性却很小。如我们其他复合CAR系统的研究所述，靶向两种抗原(其中一种包含CD38)的复合CAR可提高效应细胞的功效和持久性。
在一个实施例中，第一抗原识别结构域的靶选自但不限于：GD2，GD3，CD19，CD20，CD22，CD138，BCMA，CS1，BAFF，BAFF受体，TACI，April，April受体，CD3，CD4，CD5，CD7，CD2，CLL-1，CD33，CD123，NKG2D受体，MMG49表位，CD30，CD3，CD4，CD5，CD7和CD2；第二个识别域的目标是CD38。
在一个实施例中，第一抗原识别域的靶点为CD38；第二识别域的靶点选自但不限于：GD2、GD3、CD19、CD20、CD22、CD138、BCMA、CS1、BAFF、BAFF受体、TACI、April、April受体、CD3、CD4、CD5、CD7、CD2、CLL-1、CD33、CD123、NKG2D受体、MMG49表位，CD30、CD3、CD4、CD5、CD7和CD2。
在另一实施例中，本发明提供使用基于CD38的复合CAR治疗B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤/白血病、急变浆细胞样树突状细胞(BPDC)、多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性髓细胞瘤白血病、骨髓增生异常综合征的方法，慢性骨髓增生性肿瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和细胞增殖性疾病，可通过向有此需要的患者施用上述任何一种工程细胞来实现。
在另一个实施例中，本发明提供了使用基于CD38的复合CAR治疗伯克特淋巴瘤或伯克特样淋巴瘤的方法。
在另一实施例中，本发明提供使用基于CD38的复合CAR治疗CLL/SLL、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆细胞性淋巴瘤、浆细胞肿瘤和原发性渗出性淋巴瘤的方法。
在另一实施例中，本发明提供一种使用基于CD38的复合CAR治疗自身免疫疾病的方法；其中所述自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、
Figure GDA0003109124000001191
综合征、皮肌炎，自身免疫性溶血性贫血、视神经脊髓炎(NMO)、NMO谱紊乱(NMOSD)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、与系统性自身免疫性小血管炎综合征或显微镜下多血管炎(MPA)、肉芽肿伴多血管炎(GPA)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ANCAs)，肉芽肿性血管炎或嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(EGPA，过敏性肉芽肿)和TTP(血栓性血小板减少性紫癜)。
本发明内容由在具有独立信号传导域的载体中表达两个离散CAR单元的单个T细胞组成，其可以用作靶向多种抗原并潜在地避免肿瘤复发的新方法。化合物CAR(cCAR)包含通过自切割P2A肽与CD38 CAR连接的CD19 CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
不受理论的束缚，我们认为CD19-CD38 cCAR T细胞能够消除常规的白血病细胞和白血病前体细胞，以降低复发的风险并增强抗肿瘤活性。
不受理论的束缚，我们认为CD19-CD38 cCAR T细胞能够消除非霍奇金淋巴瘤，以降低复发风险并增强抗肿瘤活性。
不受理论的束缚，我们认为CD19-CD38 cCAR T细胞表现出更完全的癌细胞消除，从而通过在抗药性发展之前同时用多个靶标猛击来减少抗原逃逸。
在一个实施例中，CD19-CD38 cCAR T细胞疗法可以被开发为“移植的桥梁”，化学疗法的补充或检查点阻滞(包括但不限于PD-L1，CTLA-4抑制剂)或作为一种针对患有以下疾病的患者的独立疗法：但不限于：淋巴瘤，急性髓细胞性白血病，骨髓增生异常综合症，慢性髓细胞性白血病和慢性骨髓增生性疾病。
在另一个实施例中，CD19-CD38 cCAR T细胞疗法可用于彻底消除MRD。可以预期复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将得到显着改善。
在一个实施例中，CD19-CD38 cCAR T细胞疗法对于具有CD19+和/或CD38+白血病患者的患者可具有超越骨髓移植的桥梁的进一步应用。CD19-CD38 cCAR T细胞疗法可以用作独立疗法，也可以作为患者个体免疫化学疗法的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或BMT的合并症患者，这可能是延长患者生存时间并保留更好生活质量的有效策略。
不受理论的束缚，我们认为IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚定或4-1BBL与CD19-CD38 cCAR的共同表达可为患者通过提高对目标癌细胞的CAR识别的敏感性或将先天免疫细胞募集到癌细胞中提供长期持久的缓解。
不受理论的束缚，我们认为IL-21或IL-21锚定与CD19-CD38 cCAR的共同表达通过增加靶癌细胞CAR识别的敏感性或通过向癌细胞募集天然免疫细胞来提供患者的长期持久缓解。
复合CD38 CARs治疗T细胞恶性肿瘤
本发明由单个T细胞组成，该T细胞在具有独立信号传导域的载体中表达两个离散的CAR单元，该载体可被用作靶向多种抗原和潜在地避免肿瘤复发的新方法。一种基于CD38的复合CAR(cCAR)包括CD4-CAR或CD5-CAR或CD3-CAR或CD7-CAR，所述CD4-CAR或CD5-CAR或CD3-CAR或CD7-CAR通过自切割P2A肽连接到CD38-CAR并且在T细胞表面上表达两种功能性CAR分子。
本发明由单个NK细胞组成，所述NK细胞在载体中表达两个离散的CAR单元，所述载体具有独立的信号传导域，所述信号传导域可用作靶向多种抗原和潜在地避免肿瘤复发的新方法。一种基于CD38的复合CAR(cCAR)包括CD4-CAR或CD5-CAR或CD3-CAR或CD7-CAR，所述CD4-CAR或CD5-CAR或CD3-CAR或CD7-CAR通过自切割P2A肽连接到CD38-CAR并且在T细胞表面上表达两种功能性CAR分子。
在不受理论束缚的情况下，基于CD38的复合cCAR-T或NK-细胞被认为能够消除T细胞淋巴瘤/白血病细胞，从而降低因抗原逃逸而复发的风险，并增强抗肿瘤活性。
包含CD4-CAR的CD4-CD38复合CAR(cCAR)通过自切割P2A肽连接到CD38-CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
包含CD5-CAR的CD5-CD38复合CAR(cCAR)通过自裂解P2A肽连接到CD38-CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
在一个实施例中，工程细胞包括CD5-CD38嵌合抗原受体多肽(SEQ ID NO.18)和相应的核苷酸(SEQ ID NO.19)。
包含CD4-CAR的CD7-CD38复合CAR(cCAR)通过自切割P2A肽连接到CD38-CAR，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
CD56-CD38淋巴瘤/白血病CARs
CD56是一种糖蛋白，具有神经细胞粘附分子的功能。抗原在NK细胞上表达。CD56或CD38通常出现在1)侵袭性NK细胞白血病/淋巴瘤，2)结外NK/T淋巴瘤(鼻腔型)，肝癌性T细胞淋巴瘤和4)慢性NK细胞淋巴瘤。
与CD38一样，CD56也在非血液细胞中表达，如脑细胞。对于单独使用CD56或CD38CAR T细胞的患者，将有严重的靶外效应。
在不受理论束缚的情况下，人们认为，携带两种car靶向不同抗原的复合cCAR T细胞与携带两种抗原的cCAR靶向细胞比携带单一car靶向抗原的细胞具有更高的亲和力。因此，人们相信复合CAR-T细胞比单个CAR-T细胞具有更高的向肿瘤转移的能力。因此，申请人惊讶地发现，当使用基于CAR细胞的复合疗法时，对脱靶效应的担忧显著减少。
CD56是一种糖蛋白，是神经细胞粘附分子。该抗原在NK细胞上表达。与CD38一样，CD56也在非血液细胞中表达，如脑细胞。对于使用CD56-CAR或CD38-CAR T细胞的患者，将有严重的脱靶效应。因此，本发明公开了一种生成CD56-CD38 cCAR的方法，以减少与单独使用CD56-CAR或CD38-CAR相关联的脱靶效应的影响。
本发明由单个T细胞组成，该T细胞在具有独立信号传导域的载体中表达两个离散的CAR单元，该载体可用作同时靶向CD56和CD38并潜在地避免肿瘤复发的新方法。CD56-CD38复合CAR(cCAR)携带CD56-CAR，通过P2A肽与CD38-CAR连接，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
本发明由单个T细胞组成，该T细胞在具有独立信号传导域的载体中表达两个离散的CAR单元，该载体可用作同时靶向CD56和CD38并潜在地避免肿瘤复发的新方法。CD56-CD38复合CAR(cCAR)携带CD56-CAR，通过自解离P2A肽与CD38-CAR相连，并在NK细胞表面表达两种功能性的CAR分子。
CD19-CD38 cCAR
案例
根据本发明制备工程化CD19b-CD38a(CD19-CD38 cCAR的一种版本)细胞。复合CAR(cCAR)由CD19b-CAR(CD19-CAR的一个版本)通过自裂解P2A肽连接到CD38a-CAR(CD38-CAR的一个版本)组成，并在T细胞表面表达两种功能性CAR分子。
外周血单个核血沉棕黄色细胞被激活2或3天，并用CD19b-CD38a cCAR或对照载体转导。用山羊抗鼠Fab抗体和小鼠抗人CD3抗体对转导的T细胞进行染色，流式细胞术检测CD19b-CD38a-cCAR在T细胞表面的表达。
进行细胞杀伤实验，用CD19b-CD38a-cCAR裂解表达CD19和/或CD38的靶细胞。
在异种小鼠模型中进行体内抗肿瘤活性和细胞杀伤，并使用PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中描述的方法通过CD19b-CD38acCAR T或NK细胞消除或抑制表达CD19和/或CD38的靶细胞。
卵巢癌
卵巢癌是女性妇科癌症死亡的主要原因，常见于绝经后妇女。大多数患有卵巢癌的妇女在癌症扩散到卵巢以外时被诊断为晚期。缺乏具体的症状和可靠的早期检测程序是这种现象的原因。促卵泡激素受体(FSHR)在卵巢上皮性卵巢癌和卵巢颗粒细胞中选择性表达，而在正常卵巢上皮细胞中FSHR表达水平较低。FSHR的过度表达已被证明在卵巢癌的发生发展中发挥作用。因此，FSHR可能是治疗卵巢癌的合适靶点，因为卵巢切除术是治疗卵巢癌的外科标准程序，靶向FSHR可能不会引起严重的健康问题。
促性腺激素家族的区别在于其异二聚体结构，其中成员共享一个共同α亚单位和一个β-激素特异性亚单位。亚单位组装对这些激素的功能至关重要，只有二聚体才具有生物活性。二聚体的分泌效率由β亚单位决定。
在一些实施例中，FSHR结合域或多肽是编码促卵泡激素β亚单位和共同α亚单位的生物活性融合基因。
在另一实施例中，FSHR结合域或多肽包含通过在存在或不存在连接子序列的情况下将FSHβ亚基的羧基端遗传性融合到α亚基的氨基端而连接到单链的FSH(促卵泡激素)异二聚体。
异源二聚体的分泌效率被认为是由β亚单位决定的。
在一些实施例中，FSHR-CAR可包括：1)FSHR结合域或针对FSHR的单链抗体；2)铰链区；3)共刺激域和细胞内信号传导域。
在一些实施例中，FSHR的目标可包括FSHR结合域。在另一实施例中，FSHR结合域可为配体或激素或针对FSHR的单链抗体。
一些卵巢细胞暗微弱(弱)或FSHR阴性。为了提高FSHR识别的敏感性，靶向多个识别位点或抗原是至关重要的。在另一个实施例中，复合CAR，cCAR，具有可用于靶向卵巢癌中的多个识别位点或抗原的多个CAR单元。
在一些实施例中，cCAR中的CAR单元可包括：1)FSHR结合域或针对MUC16的单链抗体；2)铰链区；3)共刺激域和细胞内信号传导域。
在一些实施例中，本发明提供一种生成包含FSHR和MU16-CARs的化合物cCAR的方法，以补充一些不能被FSHR-CAR消除的卵巢癌细胞。
在一些实施例中，cCAR中的CAR单元可包含：1)FSHR结合域或针对叶酸受体-α(FRα)的单链抗体；2)铰链区；3)共刺激域和细胞内信号传导域。
在一些实施例中，本发明提供一种生成包含FSHR和FRαCARs的化合物cCAR的方法，以补充一些不能被FSHR CAR消除的卵巢癌细胞。FRαCAR具有FRα特异性单链抗体抗原识别域。
在一些实施例中，cCAR中的CAR单元可包括：1)FSHR结合域或针对HER2的单链抗体；2)铰链区；3)共刺激域和细胞内信号传导域。
在一些实施例中，本发明提供一种生成包含FSHR和HER2 CAR的化合物cCAR的方法，以补充一些不能被FSHR CAR消除的卵巢癌细胞。HER2-CAR携带HER2特异性单链抗体抗原识别域。
在不受理论约束的情况下，有人认为IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚定或4-1BBL与FSHR-CAR的联合表达通过增加CAR对靶癌细胞的识别敏感性或招募癌细胞的天然免疫细胞来提供患者的长期持久缓解。
在不受理论约束的情况下，有人认为IL-21或IL-21锚定与FSHR-CAR的共同表达通过增加CAR对靶癌细胞的识别敏感性或通过向癌细胞募集天然免疫细胞来提供患者的长期持久缓解。
外周血单个核血沉棕黄色细胞被激活2或3天，并用FSHR或对照载体转导。用山羊抗鼠Fab抗体和小鼠抗人CD3抗体对转导的T细胞进行染色，观察FSHR-CAR在T细胞表面的表达。
进行细胞杀伤试验，并用FSHR-CAR或配备有IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚定或4-1BBL的FSHR-CAR裂解表达FSHR的靶细胞。
在异种小鼠模型中进行体内抗肿瘤活性和细胞杀伤，并且使用所述方法，通过配备有IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚定或4-1BBL的FSHR-CAR或配备有IL-15/IL-15sushi锚定或4-1BBL T或NK细胞的FSHR-CAR消除或抑制表达FSHR-CAR或配备有IL-15/IL-15sushi或IL-15sushi锚定的FSHR-CAR的靶细胞如PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306所述。
人血管瘤
人类血管肿瘤可包括婴儿血管瘤和血管畸形。血管畸形包括毛细血管、淋巴管、静脉畸形和动静脉畸形。在血管异常的内皮细胞中发现FSHR，而正常内皮细胞中不存在FSHR。
婴儿血管瘤和血管畸形的生长机制尚不清楚。然而，促卵泡激素的分泌提供了一个线索，与婴儿血管瘤的生命周期有关，并在青春期增加时，血管畸形往往进展。已有研究表明，FSH的分泌与婴幼儿血管瘤和血管畸形的生长方式有关，提示FSH可能参与了这些血管病变的发病机制。FSHR在婴儿血管瘤和血管畸形的干/祖细胞中表达。因此，FSHR可能是治疗这些疾病的合适靶点。
在一些实施例中，FSHR-CAR工程细胞用于去除婴儿血管瘤或血管畸形的干/祖细胞。
在另一实施例中，FSHR-CAR细胞可用于移除肿瘤后患者的后处理以防止疾病复发。
在一些实施例中，本发明包括通过将所述细胞与针对婴儿血管瘤的特异性靶向表达FSHR的干/祖细胞的FSHR CAR工程细胞接触来选择性地去除或消融内源性干/祖细胞群(其中内源性干/祖细胞表达FSHR)的方法，以及血管畸形
在一些实施例中，FSHR-CAR细胞用于治疗或预防外科治疗后的残余疾病。
在一个实施例中，本发明提供了一种包含多核苷酸FSHR-CAR(序列号32)和相应的多核苷酸(序列号33)的FSHR-CAR工程细胞。
在一个实施例中，本发明提供了一种FSHR super1CAR工程细胞，该细胞包括分泌IL-15/IL-15SUI(序号34)和相应的多核化物(序号35)
通用CAR(uCAR)细胞
目前大多数临床试验或治疗都注入自体CAR-T细胞，因为同种异体CAR-T细胞能够诱导受体发生移植物抗宿主病(GVHD)。尽管这种自体移植方法取得了显著的临床成功，但制造患者特异性T细胞产品的过程既耗时又昂贵。此外，从严重预处理的患者身上收集足够的T细胞来成功地产生足够剂量的CAR T细胞并不总是可能的。这就对非自体基因CAR产品的开发提出了很大的要求。NK细胞与T细胞相似，因为它们是高度细胞毒性免疫效应物。与T细胞不同，NK细胞具有通过特定方式杀死靶细胞的特性。NK细胞可以作为一种非自体异基因产品，因为它们通常缺乏引起GVHD的潜力。使用NK细胞的主要缺点是缺乏体内持久性，半衰期仅为一周左右。
在一些实施例中，本发明公开了一种来自健康供体的表达普遍CAR的NK细胞的形式，所述NK细胞可被储存，然后根据需要注入个体中。在进一步的实施例中，本发明包括从异基因健康捐赠者产生可输注到任何患者而不引起GVHD的自体通用CAR-nk的方法。
在一些实施例中，NK细胞从脐带血库和外周血库获得。在另一实施例中，NK是诱导多能干细胞或胚胎干细胞或NK-92细胞。
在一些实施例中，本发明包括在NK细胞中具有共同表达IL-15/IL-15sushi的CAR或复合CAR(cCAR)的方法，这些工程化NK细胞被称为uCAR NK细胞。
在一些实施例中，本发明包括一种方法，用于在NK细胞中具有CAR或复合CAR(cCAR)共同表达IL-15/IL-15sushi和CCL19或CCL21。这些工程化的NK细胞称为uCAR NK细胞。
在一些实施例中，uCAR NK细胞具有共同表达IL-15/IL-15sushi的CAR或cCAR。在进一步实施方案中，uCAR NK细胞能够在体内持续超过一周。
在一些实施例中，本发明包括用于uCAR NK细胞的方法，所述uCAR NK细胞具有用IL-15/IL-15sushi表达CAR或cCAR的载体。
在一些实施例中，本发明包括一种用于uCAR NK细胞的方法，该方法带有表达IL-15/IL-15sushi和CCL19或CCL21的CAR或cCAR载体。
在一些实施例中，IL-15/IL-15sushi与CAR或cCAR的共表达为受试者中的NK细胞提供长期持久性。
在一些实施例中，IL-15/IL-15sushi与CAR或cCAR的共表达通过增加CAR对靶癌细胞识别的敏感性或通过向癌细胞募集固有免疫细胞来提供患者的长期持久缓解。
在一些实施例中，本发明包括用于产生NK细胞的方法，其中一个CAR或cCAR共同表达从IL-15/IL-15sushi、IL-15、IL-15/IL-15sushi锚、CCL19、IL-7、IL-12和CCL21组中选择的至少一个增强子。在进一步实施例中，由CAR中的抗原识别域靶向的特定肿瘤抗原可选自但不限于以下组：GD2、GD3、白细胞介素6受体、FSHR、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3、糖脂、glypican 3、F77、WT1、CEA、HER-2/neu、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6，甲胎蛋白、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MMG49表位、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受体、免疫球蛋白kappa和lambda、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD56、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2和CD138。
在一些实施例中，本发明包括通过输注治疗有效量的NK细胞来治疗疾病或病症的方法，所述NK细胞经基因工程以表达IL-15/IL-15sushi和/或具有针对特定肿瘤抗原的抗原识别域的CAR。在进一步实施例中，抗原识别域靶向的特定肿瘤抗原可选自但不限于以下组：GD2、GD3、白细胞介素6受体、FSHR、ROR1、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、MAGE A3、糖脂、glypican 3、F77、WT1、CEA、HER-2/neu、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、α-甲胎蛋白、CA19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MMG49表位、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受体、免疫球蛋白kappa和lambda、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD56、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2和CD138。
在一些实施例中，给药高剂量的uCAR NK细胞可以导致细胞因子释放综合征(CRS)。本发明包括通过向受试者提供较低剂量或分剂量的uCAR NK细胞来减少或避免CRS的方法。以下是避免使用高剂量uCAR NK细胞引起CRS的策略。
肝癌
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是一种侵袭性肿瘤，是癌症相关死亡的第三大常见原因。有一个未得到满足的医疗需求，以发展一种新的方法来解决这一侵略性疾病。Glypican-3(GPC3)是硫酸肝素蛋白多糖的一个成员，在肝癌中表达较高。正常肝组织或良性肝病变中未检出GPC3。
在一个实施例中，本发明提供一种工程化嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对GPC3选择性的抗原识别域的嵌合抗原受体多肽。
在一个实施例中，本发明提供一种GPC3-CAR工程细胞，其包括多核苷酸GPC3-CAR(序列号36、42)和相应的多核苷酸(序列号37、43)。
在一个实施例中，本发明提供一种GPC3-IL-15/IL-15sushi CAR工程细胞，其包括分泌IL-15/IL-15sushi(序列号38、44)和相应的多核苷酸(序列号39、45)。
在一个实施例中，本发明提供一种GPC3 super1 CAR工程细胞，其包括分泌(序列ID号40、46)和相应的多核苷酸(序列ID号41、47)。
部分肝细胞癌体积大，使CAR-T细胞难以彻底清除肿瘤。此外，需要克服免疫抑制微环境，因为CAR-T细胞在接触肿瘤时可能会被灭活或抑制。
在此基础上，本发明提供了一种通过施用含有本文公开的GPC3-CAR多肽的工程细胞和IL-15/IL-15sushi的共表达来提高GPC3CAR识别靶癌细胞的敏感性或招募天然免疫细胞来治疗癌症的方法，从而为患者提供长期持久缓解细胞。
在一些实施例中，本发明提供在工程细胞中共同表达分泌性IL-15/IL-15sushi和嵌合抗原受体多肽的方法。
在一些实施例中，本发明提供了一种通过在所述工程细胞中共同表达分泌性IL-15/IL-15sushi来增加GPC3 CAR工程细胞在体内的半衰期的方法。在不受理论束缚的情况下，人们认为IL-15/IL-15sushi分泌复合物在功能上是稳定的，并能有效地促进含有GPC3-CAR的工程细胞的存活。
在一些实施例中，本发明提供了使用GCP3-CAR作为载体将IL-15/IL-15sushi递送到靶向癌症部位的方法，以促进针对HHC细胞的固有免疫应答细胞的增殖，防止肿瘤微环境抑制免疫功能，并用大剂量外源性细胞因子降低全身毒性。
在一些实施例中，本发明提供了使用GCP3-CAR作为载体将IL-15/IL-15sushi递送到靶向癌症部位的方法，以招募其他效应免疫细胞到该部位并帮助它们杀死HCC细胞。
在一些实施例中，本研究提供了一种方法，使用GCP3 CAR-T/NK细胞作为载体，将IL-15/IL-15sushi传递到靶向癌症位点，激活旁观者免疫，以清除失去GCP3 CAR-T/NK细胞靶向抗原的癌细胞。
在一个实施例中，工程细胞包括通过P2A和T2A裂解序列连接到4-1BBL和IL-15/IL-15sushi的GPC3-CAR-super(super-CAR)。提供本实施例的多肽包括SEQ ID No.40、46和相应的多核苷酸序列SEQ ID No.41、47。
在不受理论约束的情况下，人们认为GPC3超级CAR(super CAR)在结合4-1BBL和IL-15/IL-15sushi时会变得更强大。
综合疗法
本发明的成分和方法可用于产生一个CAR T淋巴细胞或NK细胞群，其传递初级和共刺激信号以用于癌症治疗中的免疫治疗。在进一步的实施例中，本发明的临床方面与其他有效治疗高增殖性疾病的药物(例如抗癌药物)相结合。抗癌药物能够减轻受试者的肿瘤负担。抗癌药物包括化疗、放疗和免疫治疗。
超过50％的癌症患者将接受某种类型的手术。根治性手术包括切除全部或部分癌组织，切除和/或破坏。
本发明所述的成分和方法可与其他癌症治疗类型(例如化疗、手术、放疗、基因治疗等)结合使用。
根据本发明，自然杀伤(NK)细胞可用于CAR杀伤的替代细胞毒性效应器。与T细胞不同，NK细胞不需要预先激活，并具有细胞溶解功能。cCARs在NK细胞中的进一步表达使NK细胞能够有效地杀死癌症，特别是对NK细胞治疗有抵抗力的癌细胞。
此外，NK细胞可以介导抗癌作用，而不会诱发移植物抗宿主病(GvHD)。
参考下面列出的实施例可以更好地理解本公开。提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的化合物，组合物，制品，装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示例性的并且不旨在限制本公开。
可以通过共同施用CAR增强自来补充本文所述的任何工程改造细胞的施用。CAR增强自的实例包括增强CAR活性的免疫调节药物，例如但不限于靶向免疫检查点途径的药剂，集落刺激因子-1受体(CSF1R)的抑制剂以获得更好的治疗结果。靶向免疫检查点途径的药剂包括结合抑制性免疫受体CTLA-4，PD-1和PD-L1的小分子，蛋白质或抗体，并导致CTLA-4和PD-1/PD-L1阻断。如本文所用，增强子包括如上所述的增强子。
这里使用的“病人”包括哺乳动物。此处所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本法所称哺乳动物，是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，如小鼠、仓鼠等，以及兔等啮齿目哺乳动物。哺乳动物可能来自食肉目，包括猫科和犬科。哺乳动物可能属于偶蹄目，包括牛(牛)和猪(猪)，也可能属于蹄目，包括马(马)。哺乳动物可能属于灵长目、头鲸目或类人猿目(猴子)，也可能属于类人猿目(人类和类人猿)。最好，哺乳动物是人类。病人包括受试者。
在特定的化身,病人是一种人类0到6个月大的时候,6到12个月大的时候,1-5岁,5到10岁,5到12岁,10到15岁,15到20岁,13至19岁,20到25岁,25-30岁,20到65岁,30到35岁,35至40岁,40到45岁,45至50岁,50到55岁,55到60岁,60到65岁,65年到70岁,70-75岁,75年到80岁,80年到85年的历史,85到90岁，90到95岁或者95到100岁。
本文所用的术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以提供所需治疗或生理或效果或结果的工程改造细胞。这样的效果或结果包括减少或改善细胞疾病的症状。不良影响，例如副作用，有时表现出所需的治疗效果；因此，从业者在确定适当的“有效金额”时，将潜在利益与潜在风险进行平衡。所需的确切量将因患者而异，取决于患者的种类，年龄和一般状况，给药方式等。因此，可能无法指定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员仅使用常规实验可确定任何个别情况下的适当“有效量”。通常，工程改造细胞以足以减少靶细胞增殖的量和条件给予。
在施用用于治疗，抑制或预防癌症的递送系统后，可以以本领域技术人员熟知的各种方式评估治疗性工程改造细胞的功效。例如，本领域普通技术人员将理解，通过观察治疗性工程改造细胞减少癌细胞负荷或预防，与化学佐剂联合递送的治疗性工程改造细胞在治疗或抑制患者的癌症方面是有效的。癌细胞负荷进一步增加。癌细胞负荷可以通过本领域已知的方法测量，例如，使用聚合酶链反应测定来检测某些癌细胞核酸的存在或使用例如抗体鉴定血液中的某些癌细胞标记物。用于检测来自受试者或患者的样品(例如但不限于血液)中标志物的存在的测定法，或通过测量患者体内循环癌细胞抗体水平的水平。
在整个说明书中，数量由范围以及范围的下边界和上边界定义。每个下边界可以与每个上边界组合以定义范围。下边界和上边界应分别作为单独的元素。
在整个说明书中对“一个实施例”，“实施例”，“一个示例”或“示例”的引用意味着结合该实施例或示例描述的特定特征，结构或特性包括在至少一个实施例中。本实施例。因此，贯穿本说明书在各个地方出现的短语“在一个实施例中”，“在实施例中”，“一个示例”或“示例”不一定都指代相同的实施例或示例。此外，特定特征，结构或特性可以在一个或多个实施例或示例中以任何合适的组合和/或子组合进行组合。另外，应理解，此处提供的附图仅用于解释本领域普通技术人员的目的，并且附图不一定按比例绘制。
如本文所使用的，术语“包括”，“包含”，“包括”，“包括”，“具有”，“具有”或其任何其他变型旨在涵盖非排他性的包含。例如，包括元素列表的过程，物品或装置不一定仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出的或该过程，物品或装置固有的其他元素。
此外，除非有相反的明确说明，否则“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件A或B由以下任何一个满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，A和B都是真的(或存在)。
另外，本文给出的任何示例或说明不以任何方式被视为对使用它们的任何术语的限制，限制或表达定义。相反，这些示例或说明应被视为关于一个特定实施例进行描述并且仅是说明性的。本领域普通技术人员将理解，利用这些示例或说明的任何术语或术语将包括可以或可以不在其中或在说明书中的其他地方给出的其他实施例，并且所有这些实施例旨在包括在该术语或术语的范围。指定这种非限制性示例和说明的语言包括但不限于：“例如”，“例如”，“例如”和“在一个实施例中”。
在本说明书中，描述了包含多个成员的各种参数的组。在一组参数内，每个成员可以与任何一个或多个其他成员组合以产生另外的子组。例如，如果组的成员是a，b，c，d和e，则特别考虑的其他子组包括任何一个，两个，三个或四个成员，例如a和c；a，d和e；b，c，d和e；等等
如本文所用，XXXX抗原识别结构域是对XXXX具有选择性的多肽。“XXXX”表示如本文和上文所讨论的目标。例如，CD38抗原识别结构域是对CD38特异的多肽。
如本文所用，CDXCAR是指具有CDX抗原识别结构域的嵌合抗原受体。
实例
BCMA-CS1 cCAR靶向多发性骨髓瘤等浆细胞疾病
BCMA-CS1 cCAR(BC1cCAR)T细胞的产生
BC1cCAR结构是一个2单位的CAR，由一个完整的BCMA-CAR与一个完整的CS1-CAR通过一个自裂解的P2A肽融合而成，使两个CAR受体分别在T细胞表面独立表达(图1A)。流式细胞仪检测的显示出不同的转导细胞的表达(图1B)。每个CAR单元中包括一个先导、一个单链抗体、一个铰链结构域(H)、一个跨膜结构域(TM)、一个共刺激结构域(CD28或4-1BB)和细胞内信号结构域CD3zeta(CD3)。用SFFV和CD8引导序列在T细胞表面高效表达BCMA-CS1-cCAR分子。
BC1cCAR T细胞特异性裂解BCMA+和CS1+骨髓瘤细胞系
为了评估BC1cCAR T细胞的细胞毒性，我们对骨髓瘤细胞株MM1S(BMCA+CS1+)、RPMI-8226(BCMA+CS1dim)和U266(BCMA+CS1dim)进行了共培养实验。24小时共培养BC1CAR细胞毒性的FACS分析显示，在所有E:T比率下，MM1S细胞几乎完全溶解(>90％)(图2A)。对培养的RPMI-8226和U266细胞观察到类似的趋势(图2A、2B)，显示出对不同抗原表达水平的靶细胞群的有效的细胞毒性(图2C)。
BC1cCAR T细胞特异性靶向原发性骨髓瘤BCMA+和CS1+细胞群
为了进一步评估BC1cCAR杀伤不同原发性骨髓瘤细胞类型的能力，选择原发性样本展示靶抗原表达谱(图3)。流式细胞术分析MM10-G标本发现一个混合性肿瘤，BCMA+CS1+双阳性，CS1+仅为群体亚群。MM7-G样本显示完全的BCMA+CS1+表型，而骨髓抽吸物MM11-G显示杂乱的BCMAdimCS1dim表型。BC1cCAR T细胞显示了对MM7-G原发性患者样本的强大(>80％)剂量依赖性(图4A)的能力。
在MM10-G共培养中，BC1cCAR通过显著消融BCMA+CS1+和BCMA-CS1+群体亚群，也显示了靶向性和特异性裂解能力。当E:T比为2:1时，BC1CarT细胞消融超过60％的BCMA+CS1+细胞群，70％的CS1+细胞群有轻微的剂量依赖性增加(图4B)。BC1cCAR T细胞对MM11-G细胞也具有剂量依赖性的细胞毒活性(图4C)。通过细胞毒性筛选，BC1cCAR T细胞对表达BCMA和CS1不同组合的骨髓瘤细胞系和原发性肿瘤细胞均表现出强大的抗肿瘤活性(图4D)。
BC1cCAR抗原特异性活性的功能评估
我们建立了一个模型，使我们能够独立测试BC1cCAR scFv功能。骨髓瘤标志物阴性的CML细胞系K562，过表达CS1(CS1-K562)或BCMA(BCMA-K562)。在确认每种细胞系中独立的抗原表达后(图5A)，我们通过共培养实验确定了BC1cCAR T细胞靶向功能。
在短期培养中(过夜)，BC1cCAR T细胞表现出对BCMA-K562细胞的细胞毒活性。对两种抗原均为阴性的野生型K562细胞没有脱靶作用(图5B)。针对CS1-K562细胞的短期培养也显示出对表达CS1的靶细胞的类似反应。此外，BC1cCAR T细胞似乎比针对CS1-K562细胞的CS1特异性CAR具有更强的细胞毒性作用(图5B)。
拥有非靶标抗原的残留肿瘤种群可能导致接受单抗原CAR治疗的患者复发。因此，因此，为了模拟更多临床相关的混合表达抗原的细胞群体，我们进行了联合培养实验。在持续(48h)培养中，以1：1的比例混合BCMA-K562和CS1-K562细胞，以检测残留的抗原阳性群体。接下来，构建直方图，代表T细胞群以及带有的残留门控靶肿瘤群体标记的肿瘤目标细胞的群(图5C)。我们发现，与对照T细胞相比，BCMA特异性CAR和CS1特异性CAR对它们各自的目标人群具有强大的细胞毒性作用。但是，CS1-CAR留下了大量残余的BCMA+群体，而BCMA-CAR获得了高的细胞毒性，但留下了少量的CS1+群体。相反，BC1cCAR T细胞有效地耗尽了两个靶标群体(图5C)。
肿瘤再挑战证明了BC1cCAR T细胞的连续杀伤能力
接下来，我们研究了在不利的微环境下，由细胞裂解，碎片和肿瘤再挑战引起的BC1cCAR T细胞连续杀死肿瘤细胞的能力。使用图6A中的方案，我们使用MM1S细胞作为模型骨髓瘤肿瘤进行了长期共培养，并定期将BC1cCAR T细胞以及单个BCMA-CAR和CS1-CAR T细胞与新鲜的MM1S细胞一起刺激肿瘤扩大或复发。即使没有外源性细胞因子，我们也发现所有CAR治疗都在48小时后消除了靶抗原，具有明显的聚集和T细胞增殖(图6B)。相反，对照T细胞没有反应或增殖，产生的肿瘤细胞数量是其初始大小的两倍。用新鲜的MM1S细胞重新挑战所有处理孔后，我们发现所有CAR仍保留高度的细胞毒性。到108小时时，BCMA-CAR和BC1cCAR几乎耗尽了新的MM1S细胞，而CS1-CAR显示出对新MM1S细胞的不完全杀伤作用(图6C)。168小时后，所有CAR介导的肿瘤溶解和细胞毒性都停止了，但是BCMA-CAR和BC1cCAR仍然显示出可检测到的少数T细胞群，而对照T细胞和CS1-CAR T细胞实际上是不可检测的(数据未显示)。
BC1cCAR T细胞在体内对肿瘤有明显的控制和抑制作用
为了评价BC1cCAR T细胞的体内活性，我们建立了表达荧光素酶的MM1S细胞诱导荧光可见肿瘤形成的骨髓瘤小鼠模型。与对照组相比，注射BC1cCAR T细胞的MM1S的小鼠显著降低了肿瘤负担，延长了存活时间。给予小鼠单剂量BC1cCAR或对照T细胞，用IVIS显像测定肿瘤负荷(图7A)。从第6天开始，对照组和BC1cCAR治疗组在肿瘤负荷的IVIS测量方面有非常显著的差异(P<0.0003)(图7B)。CAR注射小鼠也有更有利的生存结果(图7C)。
混合抗原组小鼠模型显示cCAR表达细胞比单一CAR表达细胞更能控制肿瘤负荷
为了建立异质细胞群和潜在的抗原逃逸模型，我们给小鼠注射了4:1的表达BCMA:CS1的K562细胞混合物，并在第3天用7.5x106的对照、BCMA-CAR或BC1cCAR T细胞治疗。CS1-CAR T细胞因体外疗效差而被排除。第3天，两只对照小鼠因注射程序死亡，排除在分析范围之外。荧光法观察肿瘤负荷(图8A)。在第10天，与GFP对照组相比，两种CARs均表现出50％以上的肿瘤减少，到第12天增加到60％以上(图8A-右)。到第10天，BC1CAR在肿瘤抑制方面超过BCMA-CAR 6％，到第12天，这种扩散增加到17％，这可能是BCMA-CAR无法溶解残留的CS1-K562细胞(注射肿瘤的20％)。与对照组相比，所有经CAR T细胞治疗的小鼠的存活率均显著提高。与BCMA-CAR组相比，BC1cCAR组的生存率也有显著改善(p<0.05)(图8B)。虽然这两种CAR在控制肿瘤生长方面都是有效的，但BC1CAR与单一靶点方案相比，显示出更强大的控制能力。
复合CAR-T细胞增强独立抗原小鼠模型T细胞的持续性及维持肿瘤消退
为了检测特异性BCMA和CS1抗原表达细胞的耗竭并验证复合单链抗体的有效性，建立了4组小鼠模型，每组5只，分别注射BCMA-K562和CS1-K562细胞，对照组和BC1cCAR T细胞给药给每一个肿瘤组(n＝19，因一只小鼠早期自发死亡)。在处死的时候(不同的：30-80天以上)，对小鼠全血和肝组织进行T细胞和肿瘤群的筛选。与cCAR组相比，对照组的两种血液组织类型显示出一致的肿瘤存在(图9A、9B、10、11)。两种组织中平均肿瘤细胞群的聚集组织分析显示cCAR治疗组肿瘤负荷减少的趋势一致(图9B)。在血液和肝脏中，对照T细胞不能持续存在超过标记30天，并且在两种组织类型中都显示出显著的肿瘤负荷(图9B、9C)。相比之下，即使在30+天，cCAR处理的小鼠也显示出显著的T细胞扩张和持续性(图9C)，这与观察到的抗肿瘤活性增加和支持总体生存改善相关。
CD123b-CD33b-cCAR(CD123-CD33-cCAR)T细胞靶向CD123+和/或CD33+白血病/淋巴瘤的例子
CD123b-CD33b cCAR T细胞的产生
慢病毒转导的细胞毒性效应T细胞被设计成表达两个完整的CAR单元，由一个自裂解的P2A肽连接(图12A)。由此产生的复合CAR(CD123b-CD33b-cCAR)能够靶向CD123+和/或CD33+白血病细胞(图12B)。每个CAR单元中包括一个先导、一个单链抗体、一个铰链结构域(H)、一个跨膜结构域(TM)、一个共刺激结构域(CD28或4-1BB)和细胞内信号结构域CD3zeta(CD3)。用强脾灶形成病毒启动子(SFFV)和CD8引导序列在T细胞表面高效表达CD123b-CD33b-cCAR分子。
CD123b-CD33b-cCAR T细胞转导效率
为了评估转导后T细胞表面CD123b-CD33b cCAR的表达水平，采用流式细胞术分析(图13)。转导效率为25％。
CD123b-CD33b-cCAR T细胞有效裂解急性髓系白血病细胞株
为了评价CD123b-CD33b-cCAR(CD123b-CD33b-cCAR)T细胞的抗肿瘤活性，我们用AML细胞株MOLM13(CD33+CD123+)和U937细胞株(CD33+CD123-)进行共培养。在流式细胞术中，为了区分靶向白血病细胞(MOLM13和U927；两者都是CD3-)和效应T细胞(CD3+)。以2:1和5:1的效应靶比(E:T)进行24小时的共培养分析，并使用流式细胞仪分析CD123b-CD33bcCAR T细胞或对照T细胞的细胞裂解率(图14A、14B)。在2:1e:T比下，CD123b-CD33b-cCAR细胞能裂解约98％的CD123+CD33+MOLM13细胞和99.9％的CD33+U937细胞。此外，在5:1的比率下，观察到两种细胞系100％裂解(图14C)。我们还验证了MOLM13和U937细胞株上表达的表面标记(图14C)。总的来说，这些结果表明CD123b-CD33b-cCAR T细胞能够特异而有力地清除表达两种抗原或其中一种的肿瘤细胞。此外，CD123b-CD33b-cCAR T细胞有效地消除了只表达CD33而不表达CD123的U937细胞，这一发现支持了复合CAR的每个离散单元可以独立地靶向其抗原并消除只表达一种抗原或同时表达两种抗原的靶点的事实。
我们进一步评估了剂量依赖的CD123b-CD33b-cCAR T细胞肿瘤溶解能力的，通过对其他两种细胞系：KG1a(CD123dimCD33+)和HL60(CD123dimCD33+)变化和降低E:T比值。以0.25:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1和10:1e:T的比例对KG1a和HL60细胞培养的CD123b-CD33b-cCAR T细胞，即使在0.25:1的比例下，也显示出75％以上的肿瘤溶解能力。总的来说，在5:1的比例下，剂量和肿瘤溶解到饱和之间有很强的相关性(图14D)。
CD123b-CD33b-cCAR细胞有效裂解原发性髓系白血病肿瘤细胞
接下来我们建立了CD123b-CD33b-cCAR T细胞对原发性肿瘤细胞的抗肿瘤特性。用CD3染色细胞，以区分CAR T细胞和CD3白血病细胞。不同的原发性白血病患者样本，包括两个CD123+CD33+AML和两个CD123+B-ALL样本(PT1:AML、PT2:B-ALL、PT3:AML和PT4:B-ALL)，在这个小组中进行分析，并进行流式细胞术分析，以验证肿瘤溶解与被消除的圈出的靶细胞群(图15)。与以往AML细胞株的抗肿瘤细胞毒性结果(图14)相比，CD123b-CD33b-cCAR T细胞对所有患者样本显示出类似的阳性结果，2:1的比例下肿瘤溶解率超过80％，5:1的比例下肿瘤溶解率超过98％(图15)。而且，与我们的细胞株相似，CD123b-CD33b-cCAR T细胞有效地消融了只表达CD123而不表达CD33的PT2细胞，这一发现支持了这样一个事实：复合CAR的每个离散单元可以独立地靶向其抗原，并消除只表达其一个靶抗原(如针对CD33+U937和CD123+PT2细胞所见)或同时表达两个靶抗原的细胞(如对CD123+CD33+MOLM13和PT1细胞所见)。总的来说，这些结果表明CD123b-CD33b-cCAR T细胞对表达一种或两种抗原的病人肿瘤细胞具有很高的杀伤作用。
我们还特别检查了我们的CD123b-CD33b cCAR清除特定细胞群的能力，包括PT3样本中的白血病干细胞(CD123+CD34+CD38-)和PT4样本中的大量髓系白血病(CD34variableCD33+)(图15C、15D)。我们发现CD123b-CD33b-cCAR T细胞成功地消融了LSCs和大量疾病细胞。
CD123b-CD33b cCAR T细胞的离散受体单元以抗原特异性的方式独立地裂解靶细胞
为了进一步证实我们的cCAR的独立抗原靶向能力，我们产生了表达CD123或CD33的Jurkat人工细胞系，并对这些细胞和不表达抗原的野生型Jurkat细胞进行了CD123b-CD33b cCAR T细胞的检测(图16)。我们发现CD123b-CD33b-cCAR T细胞表达CD123或CD33抗原，与不表达两种抗原的野生型Jurkat细胞相比(图16A、16B和16C)，具有特异性和强杀伤性。总之，我们认为我们的CD123b-CD33b cCAR T细胞可以通过刺激任一种CAR受体发挥作用，并且能够靶向表达一种或两种靶抗原的细胞，并且能够高效地消除靶点。
CD123b-CD33b-cCAR T细胞在两只使用MOLM13和U937细胞的AML小鼠模型中均表现出较强的抗肿瘤活性
为了评估CD123b-CD33b-cCAR T细胞的体内抗肿瘤活性，以预测其对患者的治疗效果，我们建立了两个异种移植小鼠模型(图17)。亚致死剂量(2.0gy)照射NSG小鼠，静脉注射1.0x106荧光素酶表达的MOLM13细胞或1.0x106荧光素酶表达的U937细胞。在MOLM13或U937移植后的第4天，小鼠静脉注射CD123b-CD33b-cCAR或对照T细胞的10x106细胞。为了评估小鼠的肿瘤负荷，在第6、9和13天再次注射D-荧光素酶(Perkin Elmer)，并对小鼠进行IVIS成像，以量化荧光素酶活性(Caliper LifeSciences)(图17A、17B)。通过IVIS成像观察到，肿瘤负荷急剧增长的对照组小鼠的总流量水平持续增加。相比之下，CD123b-CD33bcCAR治疗的小鼠早在第3天就显著抑制了肿瘤负荷。到第6天，两种模型中用cCAR治疗的小鼠的肿瘤负担都减少了80％以上(图17A、17B)。随着CD123b-CD33b cCAR治疗小鼠的总流量保持在接近背景零值，且与对照T细胞治疗小鼠相比具有统计学显著差异，这种肿瘤抑制作用在第13天得以维持并增强。
我们还评估了肿瘤细胞和CAR T细胞在死亡时的持续性。在处死时，从每个实验鼠和对照鼠采集外周血，并通过流式细胞仪分析是否存在移植瘤(MOLM13或U937细胞)和T细胞(cCAR或对照)。MOLM13和U937细胞是CD3-细胞，可以与CD3+CAR或对照T细胞区分开来。小鼠外周血细胞通过侧散射和人CD45抗体进行门控，然后用CD3和CD33标记。对照组小鼠在外周血中显示出明显的残留肿瘤群(约75-87％)，而CD123b-CD33b-cCAR治疗组小鼠显示出与对照组小鼠相当的所有肿瘤的几乎都被消除了(图17C)。此外，CD123b-CD33b cCAR处理的小鼠外周血中几乎所有人类细胞都是CAR-T细胞，显示出显著的T细胞扩张。这证实了我们的cCAR T细胞在维持长期反应方面的效力和持久性。此外，与对照组相比，CD123b-CD33bcCAR治疗组小鼠的存活率显著增加(图17A、17B)。
CAMPATH治疗后体内注射的cCAR T细胞的耗竭
对于用CAR-T细胞治疗急性髓性白血病的临床治疗，在肿瘤消失后或在因CAR治疗引起意外副作用的紧急情况下，可能需要建立安全的方法从患者体内清除CAR-T细胞。T细胞和B细胞在细胞表面表达CD52，一种CD52特异性抗体CAMPATH(alemtuzumab)可以清除循环中的CD52+细胞。为了评估CAMPATH治疗消除CAR的效果，我们进行了以下的描述的体内程序(图18A)。我们静脉注射10x106 cCAR T细胞到受照射的小鼠体内。第二天，我们给每组3只小鼠注射0.1mg/kg的CAMPATH或PBS。在CAMPATH治疗后6小时和24小时，我们采集外周血，通过FACS分析确定cCAR T细胞的存在。用侧散射(SSC)和CD3表达及CD3、CD45表达对cCAR T细胞进行门控，以区别于小鼠T细胞。在6小时和24小时，CAMPATH注射耗尽了血液中的cCART细胞(图18B，18C)。这些发现支持使用CAMPATH作为安全开关，快速消耗循环中的CAR-T细胞。
CD19 B-CD123-cCAR靶向B-ALL和其他白血病的例子(CD19-CD123-cCAR的一个版本)
CD19b-CD123细胞的产生
慢病毒转导的细胞毒性效应细胞，即T细胞，被设计成通过自裂P2A肽与抗CD123片段(scFv2，CD123)融合的表达抗CD19单链可变片段(scFv1，CD19b)区域。这些抗体结构域通过CD8衍生的铰链(H)和跨膜(TM)区域与4-1BB和CD28共激活结构域和CD3ζ信号结构域相连(图19)。用强脾灶形成病毒启动子(SFFV)和CD8引导序列在T细胞表面高效表达CD19b-CD123-cCAR分子。
CD19b-CD123-cCAR T细胞转导效率
从脐带血(UCB)白膜层中分离的T细胞活化2天后，用CD19b-CD123-cCAR慢病毒转导。流式细胞术测定CD19b-CD123-cCAR转导效率为26％(图20)。
CD19b-CD123-cCAR-2G细胞能有效裂解CD19阳性和CD123阳性白血病细胞系
为了评估CD19b-CD123-cCAR T细胞的细胞毒性，我们以5:1的效应靶比(E:T)对人工表达CD19和CD123的白血病/淋巴瘤细胞系进行了共培养试验。使用K562细胞(髓样白血病细胞系)通过慢病毒感染表达CD19抗原(命名为K19)，并使用野生型K562细胞系作为对照。用Jurkat细胞表达CD123抗原(J123)，以野生型Jurkat细胞为对照。流式细胞术检测CD19b-CD123-cCAR T细胞对靶细胞的裂解作用。在16小时共培养中，CD19b-CD123 cCAR T细胞在16小时内裂解了超过66％的K19细胞，在48小时内裂解了超过99％(图21A)。超过88％的J123细胞在16小时内溶解，达到饱和(图21B和21D)。对照组K562和对照组Jurkat细胞未发生明显裂解，裂解率小于20％。
CD19b-CD123-cCAR T细胞对人工诱导的单阳性CD19和CD123细胞有效消融的发现，支持了复合CAR的每个离散单元可以独立地靶向其抗原并消除仅表达一种抗原或同时表达两种抗原的靶点的观点。此外，对照K562和Jurkat细胞缺乏细胞裂解，表明CD19b-CD123-cCAR T细胞具有抗原特异性细胞毒性。
接下来，我们评估了CD19b-CD123-cCAR T细胞对自然发生的CD19/CD123抗原表达的白血病/淋巴瘤细胞系的靶向能力：人类套细胞淋巴瘤SP53(CD19+CD123-)和人类急性髓系白血病KG1a(CD19-CD123+)。在16小时共培养中，CD19b-CD123-cCAR显示SP53细胞几乎完全溶解，靶细胞消耗86％，达到饱和(图21C)。在KG1a中，CD19b-CD123-cCAR在16小时内裂解了超过69％的CD123+靶细胞，在48小时内裂解了超过94％(图21C和21D)，总的来说，CD19b-CD123-cCAR T细胞特异而有效地裂解了表达任一抗原靶细胞的靶细胞群，显示出有效的体细胞毒性。
CD19b-CD123-cCAR-2G细胞能有效溶解原发性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和急性髓系白血病(AML)肿瘤细胞
我们使用CD19b-CD123-cCAR T细胞对原发性肿瘤细胞进行共培养，以评估它们杀死不同类型原发性白血病细胞的能力。用CMTMR细胞追踪器染色区分原发性肿瘤细胞和CART细胞。用PT1:B-ALL和PT2:AML共培养，流式细胞仪检测肿瘤溶解情况。流式细胞术分析PT1样本显示接近全部为CD19+表型，明显的CD19+CD123+群体。PT2样本显示混合肿瘤表型和部分CD123+CD19-表型(图22A)。CD19b-CD123 cCAR T细胞对PT1原发性B-ALL样本有较强的消融作用，24小时E:T比为5:1时几乎完全溶解(图22B和22D。CD19b-CD123 cCAR T细胞也消融了PT2原发性AML样本，24小时31％溶解，48小时67％溶解(图22C和22D)。综上所述，CD19b-CD123 cCAR T细胞对白血病细胞系和表达CD19和CD123不同组合的原发性肿瘤细胞均表现出较强的抗肿瘤活性(图22D)。
在AML和使用MOLM-13和REH细胞的B-ALL的两个异种移植小鼠模型中，CD19b-CD123-cCAR-3G T细胞表现出了很强的抗肿瘤活性。
为了评价CD19b-CD123-cCAR-T细胞的体内抗肿瘤活性，我们建立了两种模型，一种是表达荧光素酶的MOLM13细胞(CD123+CD19-)模型，另一种是表达荧光素酶的REH细胞(CD19+CD123-)模型。给予小鼠单剂量CD19b-CD123-cCAR-T细胞或对照GFP细胞，在第3、6、8和11天测量肿瘤负荷(图23A)，在MOLM13模型中，cCAR治疗组和对照组在第6天有显著性差异(P<0.01)，与对照组相比，CD19b-CD123-cCART细胞注射组的光照强度更低，因此肿瘤负担更少(图23B)。到第11天，注射CD19b-CD123-CAR T细胞的小鼠比对照组小鼠的肿瘤负担少99％。接下来，我们比较了两组小鼠的存活率。根据先前描述的IVIS成像实验，每天观察小鼠是否有严重疾病症状，一旦运动受到严重损害就处死小鼠。所有对照组小鼠在第18天死亡，而CD19b-CD123CAR T治疗组小鼠存活时间比对照组小鼠延长15天(p＝0.0031)(图23C)
发现了类似REH小鼠模型中的结果(图23D)。在第16天，注射CD19b-CD123cCAR T细胞的REH白血病小鼠的肿瘤负担比对照小鼠少99％(图23E)。比较cCAR组和对照组小鼠的存活率时，CD19b-CD123 cCAR T注射小鼠比对照小鼠存活时间长得多(图23F)(p＝0.0031)。总之，这些体内数据表明，与对照T细胞相比，CD19b-CD123 cCAR T细胞注射和再注射NSG小鼠显著降低肿瘤负担，延长存活时间。
用共培养杀伤试验筛选和评价几种靶向BCMA+和/或CS1+白血病细胞，特别是多发性骨髓瘤细胞的cCARs。
1.不同版本BCMA(CD269)-CS1 cCARs的产生。
如上所述，创建承载不同CAR单元的复合CAR可能是一个相当大的挑战。我们选择了不同的CAR元素，用一个强启动子和P2A自裂位点在单个载体中表达多个CAR单元。选择了CAR的铰链区，避免了各单元之间铰链区的相互作用。慢病毒转导的细胞毒性效应细胞，即T细胞，被设计成表达抗BCMA(CD269)单链可变片段(scFv1)区域，通过自裂解P2A肽与抗CS1片段(scFv2)融合。这些单链抗体结构域通过CD8衍生的铰链(H)和跨膜(TM)区域连接到4-1BB和CD28共激活结构域和CD3ζ(CD3)信号结构域(图30)。采用强脾灶形成病毒启动子(SFFV)和CD8引导序列在T细胞表面高效表达复合CAR分子。最后，筛选并评估构建物的表达和功能。单链抗体1代表对抗BCMA抗原的不同单链抗体版本(A7D或C11D)。单链抗体2代表针对CS1抗原的不同单链抗体版本(hu63、mu34或mu90)。
2.不同版本BCMA-CS1 cCAR慢病毒转转T细胞后，CAR表达水平不同。
外周血单个核白细胞细胞激活3天，用慢病毒载体转导6种不同序列的cCARs，包括CD269(A7D或C11D)和CS1(hu63、mu34或mu90)CAR或对照载体。用山羊抗鼠Fab抗体和小鼠抗人CD3染色转导的T细胞，观察转导后3d，CAR在T细胞表面的表达。图30A显示了每个CD269-CS1CAR的表面表达：A7D-mu34为11.2％；A7D-mu90为23.1％；A7D-hu63为28.5％；C11D-mu34为28.0％；C11Dmu90为13.6％；C11Dhu63为42％。这表明需要找到一对可以产生最高级别的CAR表达式的CAR单元。高效慢病毒包装细胞系对于产生这些结构物的高滴度至关重要(图30B)。我们使用lent-X 293T细胞系作为包装系统，为复合CAR结构产生高病毒滴度。Lenti-X 293T包装细胞系明显优于其他细胞系，产生的病毒数量是293ft细胞的2-6倍。
cCARs的转导效率(CAR T细胞百分比)通常低于单个单位CAR。在转染和转导过程中，有几种方法可以提高效率。为了提高制备cCARs的病毒滴度，最好使用LentiXTM 293t(Clontech/Takara)包装细胞系，用于制备高滴度慢病毒，而不是常用的HEK-293FT，转染包装细胞时，最好将质粒DNA(含cCAR结构)增加1.5-2.0倍，以提高转染效率。在复合物形成过程中，病毒包装质粒和转染试剂的量保持不变。通过在转导过程中降低T细胞与病毒载体的比率，使之达到每毫升0.3x106个细胞，并增加慢病毒上清液或慢病毒的体积，可以进一步提高转导效率。
3.检测不同抗BCMA慢病毒载体转导的T细胞中CAR的表达。
在上述研究的基础上，CD269-A7D(又称A7D)和CS1-hu63(又称hu63)被选为增强型CAR或复合CAR(cCAR)的良好候选CAR。我们还生成了一个cCAR(CD269-A7D-C11D-2G)，靶向同一抗原BCMA上的两个表位。在该cCAR中，每单位CARs携带不同的单链抗体，针对BCMA的不同表位。增强型CARs是以BCMA抗原为靶点的CD269-A7D-IL15/IL15sushi和CD269-A7D-41BBL-2G。复合CARs是靶向BCMA和CD19抗原的CD269-A7D-CD19b-2G，靶向BCMA和CS1抗原的CD269-A7D-CS1-hu63或CD269-C11D-CS1-hu63-BB。
激活外周血单核白细胞细胞3天，并用抗BCMA慢病毒载体(CD269-A7D-2G、CD269-A7D-IL15/IL15sushi、CD269-A7D-41BBL-2G)和cCARs(CD269-A7D-C11D-2G、CD269-A7D-CD19b-2G、CD269-A7D-CS1-hu63、CD269-C11D-CS1-hu63-BB)或对照载体(图30B)进行转导。用山羊抗鼠Fab抗体和小鼠抗人CD3染色转染的T细胞，观察转染后3d，CAR在T细胞表面的表达。图30B显示了每个慢病毒载体的表面表达：对于CD269-A7D-2G，48.4％；CD269-A7D-IL15/IL15sushi，32.2％；CD269-A7D-41BBL-2G，36％；CD269-A7D-C11D-2G，27.4％；CD269-A7D-CD19b-2G，30.6％；CD269-A7D-CS1-hu63，28.5％；和CD269-C11D-CS1-hu63-BB，42.0％。
4.CD269-A7D-CD19b cCAR T细胞能有效地裂解表达BCMA和/或CD19的肿瘤细胞系
在体外共培养试验中，对CD269-A7D-CD19b cCAR T细胞裂解单个靶细胞系的能力进行了测试(图30C和30D)。对K562细胞进行修饰，使其在细胞表面合成表达BCMA(CD269)(称为K-BCMA)或CD19(称为K-19)。共孵育18小时后，用抗人CD3和抗人CD269或CD19标记细胞，并用流式细胞术分析(图30C和CD30E)。CD269-A7D-CD19b-cCAR细胞在2:1e:T比下能裂解31％的靶细胞，在5:1比下能裂解65％。CD269-A7D-CD19b cCAR T细胞在2:1e:T比下也能裂解60％的靶K-CD19细胞，在5:1比下，几乎裂解所有细胞(图30D和CD30E)。这些结果证实了每一个CAR单元CD269和CD19b-CAR都能有效地裂解其特定的靶细胞。
5.CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-CS1-hu63和CD269-A7D-C11D cCAR T细胞有效地裂解MM1S肿瘤细胞株
在体外共培养试验中，对上述产生的不同版本的BCMA-CS1 cCAR T细胞裂解特定靶细胞系的能力进行了测试。人多发性骨髓瘤细胞系MM1S与CD269-A7D-41BBL CAR、CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR、CD269-A7D-C11D cCAR T细胞或对照T细胞以2:1和5:1的E:T比率共同培养(图30F)。共孵育18h后，用CMTMR和抗人CD269标记细胞，流式细胞仪分析。CD269-A7D-41BBL CAR T细胞在2:1E:T比下能裂解74％的靶MM1S细胞，在5:1比下能裂解90％，而CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T细胞在2:1和5:1比下分别裂解59％和90％，CD269-A7D-C11DCAR T细胞在2:1和5:1比下分别裂解62％和86％(图30F)。这些复合CAR似乎没有显示任何CAR与CAR之间相互作用的证据。体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，表达BCMA或CS1或两者的靶细胞被cCAR T或NK细胞清除或抑制，使用PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中描述的方法
6.CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-CS1-hu63和CD269-A7D-C11D CART细胞能有效地裂解合成表达BCMA或CS1的K562细胞
在体外共培养试验中，对上述产生的不同版本的BCMA-CS1 cCAR T细胞裂解特定靶细胞系的能力进行了测试。将K562细胞修饰为在细胞表面合成表达BCMA(CD269)或CS1，然后与CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-CS1-hu63、CD269-A7D-C11D cCAR T细胞或对照T细胞以2:1和5:1e:T的比例共同培养。共孵育18h后，用抗人CD3和抗人CD269(或CS1)标记细胞，流式细胞仪分析。CD269-A7D-41BBL CAR T细胞能以2:1的E:T比率裂解56％的靶细胞，并以5:1的比率完全消除所有靶细胞，而CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T细胞裂解38％和79％，CD269-A7D-C11D CAR T细胞分别以2:1和5:1的比率裂解16％和74％的K-BCMA细胞(图30G)。只有CD269-A7D-CS1-hu63、CD269-A7D-C11D cCAR T细胞在共培养中与K-CS1细胞进行了对比试验(图30H。CD269-A7D-CS1-hu63cCAR T细胞分别以2:1和5:1的比例溶解了K-562细胞的18％和54％，而CD269-A7D-C11D cCAR T细胞，一种针对BCMA抗原上两个不同表位的复合型CAR，显示以两种比例都没有能力溶解K-CS1细胞，这是预期的，因为没有CS1CAR单元。(图30H)。这些结果证明了每一个CAR单元特异性地裂解其目标群体的能力。
通过CLL1-CD33b cCAR(CLL1-CD33的一个版本)靶向CLL1+和/或CD33+白血病细胞的示例
转导T细胞高效表达CLL1-CD33b-cCAR(CLL1-CD33b-CAR)
外周血单个核白细胞被活化2-3天，用CLL1-CD33b-cCAR或对照载体进行转导。用山羊抗鼠Fab抗体和小鼠抗人CD3染色转染的T细胞，观察转染后3天T细胞表面CLL1-CD33b-cCAR的表达。图31显示，用CLL1-CD33b cCAR病毒转染的细胞中，29.7％的F(ab’)2和CD3均呈阳性，这是通过流式细胞术测定的。
CLL1-CD33b-cCAR T细胞特异性靶向表达CLL1(CLL-1)和CD33的肿瘤细胞系
进行T细胞共培养杀伤测定法来确定CLL1-CD33b cCAR T细胞有效且特异性地裂解表达CLL1(CLL-1)和CD33的细胞系的能力：急性髓细胞白血病细胞系HL60，在细胞表面上表达两种抗原；经修饰以合成表达CLL1(称为Jurkat-CLL-1xp)或CD33(称为Jurkate-CD33xp)的Jurkat细胞。另外，将CLL1-CD33b cCAR T细胞与对CLL1和CD33呈阴性的REH和CCRF-CEM细胞系共培养(图32A和32B)。所有靶细胞均预先用CFSE膜染料标记，以区别于T细胞。共孵育18小时后，将细胞用抗人CD3标记并通过流式细胞仪进行分析。在低的2：1效应子/靶标比率下，CLL1-CD33b cCAR T细胞能够有效裂解HL60细胞(89％)，Jurkat-CLL-1xp细胞(84％)和Jurkat–CD33xp细胞(96％)(图32C，32D和32E)；在E：T比为5：1时，几乎所有靶细胞都被耗尽(图2a-d)。但是，REH(8％)和CCRF-CEM细胞(14％)均脱靶，显示出极少的细胞裂解(图32A和32B)。这证明了CLL1-CD33b cCAR T裂解的显着效力和特异性。条形图总结了结果(图32F)。
CLL1-CD33b复合CAR T细胞能够在体外证明有效和定向的细胞毒性。
我们使用表达大量靶向CLL-1和CD33的AML细胞系HL60和U937进行了共培养测定。我们发现CLL-1CAR T细胞能够以大于90％的高效率有效消融这两种细胞(图32G和32H)。此外，复合CAR对阴性对照细胞系CCRF-CEM的靶向作用基本达到最低水平(图32I)。
此外，CLL1-CD33b cCAR在逐步增加的剂量方案中显示出强效的剂量依赖性细胞毒性，即使在最低剂量阈值0.25：1(效应子：靶标)细胞比时，其活性也约为50％(图32J)。
与单一CAR T选项相比，CLL1-CD33b cCAR T细胞显示出优异的抗肿瘤活性
将表达CLL-1或CD33的Jurkat细胞以1：1的比例合并，并与100,000个效应细胞孵育，以使最终的有效E：T比例为1：2。结果表明，复合CAR对表达CLL-1或CD33的Jurkat细胞组(>85％)表现出高度特异性和强力的细胞毒性，同时证明了其单个抗原相对于单个CAR选项而言具有更高的细胞毒性(图32K和32L)。
CD19b-IL-21CAR(CD19-IL-21CAR的版本)
实例
根据本发明制备了工程化的CD19b-IL-21(CD19b-IL21)CAR细胞(图33A)。配备有分泌IL-2的CD19b CAR裂解表达CD19抗原的白血病/淋巴瘤。
活化外周血单核白细胞两三天，并用CD19b-IL-21或对照载体转导。转导后三天，通过用山羊抗小鼠Fab抗体和小鼠抗人CD3对转导的T细胞染色，证明了CD19b-IL-21在T细胞表面上的表达。图33B显示，通过流式细胞术测定，用CD19b-IL-21CAR病毒转导的细胞中有63.9％的F(ab')2和CD3均为阳性。
进行细胞杀伤测定，并通过IL-19-IL-21CAR裂解表达CD19的靶向细胞。
体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，并使用PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中所述的方法，通过CD19b-IL-21CAR T或NK细胞消除或抑制表达CD19的靶向细胞。
BCMA-IL-18CAR可以使用类似的检测方法(图35)
在一个实施方案中，工程细胞包括CD19嵌合抗原受体多肽和IL-21(SEQ IDNO.16)，以及相应的核苷酸(SEQ ID NO.17)。
在一个实施方案中，工程细胞包括CD19嵌合抗原受体多肽和IL-21锚(SEQ IDNO.1)，以及相应的核苷酸(SEQ ID NO.2)。
在一个实施方案中，工程细胞包括BCMA嵌合抗原受体多肽和IL-18(SEQ IDNO.11)，以及相应的核苷酸(SEQ ID NO.12)。
在一个实施方案中，工程细胞包括BCMA嵌合抗原受体多肽和IL-18锚(SEQ IDNO.13)，以及相应的核苷酸(SEQ ID NO.14)。
CD19b-IL-21锚CAR(CD19-IL-21锚版本)
实例
根据本发明制备了工程改造的CD19b-IL-21锚(CD19b-IL21)CAR细胞(图34)。CD19b-IL-21锚CAR用于溶解表达CD19抗原的白血病/淋巴瘤。
进行细胞杀伤测定，并通过IL-19-IL-21锚CAR裂解表达CD19的靶向细胞。
体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，并使用PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中所述的方法，通过CD19b-IL-21锚CAR T或NK细胞消除或抑制表达CD19的靶向细胞
BCMA-IL-18锚CAR可以使用类似的检测方法(图36)
BCMA-CD38 cCAR靶向多发性骨髓瘤的实例
实例
根据本发明制备了工程改造的BCMA-CD38 cCAR细胞(图37)。慢病毒转染的细胞毒性效应T细胞或NK细胞经过工程改造，可以表达两个完整的CAR单元，这些CAR单元通过自切割P2A肽连接。所得复合CAR能够靶向BCMA+和/或CD38+多发性骨髓瘤细胞或异常浆细胞(图37)。每个CAR单元包括一个先导、一个单链抗体、一个铰链结构域(H)、一个跨膜结构域(TM)、一个共刺激结构域(CD28或4-1BB)和细胞内信号结构域CD3 zeta(CD3)。用强脾灶形成病毒启动子(SFFV)和CD8引导序列在T细胞或NK细胞表面高效表达BCMA-CD38 cCAR分子。
BCMA-CD38 cCAR裂解表达BCMA和/或CD38抗原的多发性骨髓瘤细胞或异常浆细胞。
进行细胞杀伤测定，并且通过BCMA-CD38 cCAR裂解表达BCMA和/或CD38抗原的靶向细胞。
体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，使用PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中所述的方法，表达BCMA和/或CD38抗原的靶向细胞被BCMA-CD38 cCART或NK细胞消除或抑制。
在一个实施例中，CD38抗原识别结构域包括SEQ ID NO.15。
在一个实施方案中，工程细胞包括具有BCMA抗原识别结构域的第一嵌合抗原受体多肽和具有CD38识别结构域的第二嵌合抗原受体多肽。在一个实施方案中，该工程细胞包括SEQ ID NO.5、7、9的多肽和相应多核苷酸SEQ ID NO.6、8、10.
基于CD38的cCAR
基于CD38的cCAR结构的示意图如图38所示。
CD269-A7D-CD38 CAR
实例
为了产生高表达水平的cCAR，使用Lenti-x293T细胞系作为包装细胞来产生慢病毒。用BCMA-CD38慢病毒载体转导活化的人外周血T细胞。图39A显示用对照慢病毒、CD269-A7D-CD38a、CD269-A7D-CD38b或CD269-A7D-CD38cCAR慢病毒转导的活化T细胞的转导效率，用山羊抗小鼠F(Ab')2抗体标记测定。用CAR病毒转导活化T细胞后，CD269-A7D-CD38a、CD269-A7D-CD38b和CD269-A7D-CD38c的F(Ab')2阳性细胞分别为28.6％、21.5％和17.6％。将这些CAR-T细胞用于以下体外杀伤实验。
肿瘤细胞系表型分析
用流式细胞术分析六种不同细胞系的表型(图39B)。CD38在骨髓瘤细胞、RPMI8226和MM1S中均有表达，B-ALL细胞系REH也表达CD38。K562-BCMAxp细胞存在于AML细胞(K562)中，使用表达BCMA的慢病毒载体来表达BCMA。K562-BCMAxp细胞表达BCMA。
转导荧光素酶表达的wt-U937、REH细胞，使其表达BCMA-xp
用BCMA-xp慢病毒载体转染表达荧光素酶的REH和U937野生型细胞系。流式细胞术分析证实U937 BCMAxp和REH细胞系表达BCMA表面抗原，而野生型细胞系U937或REH不表达BCMA表面抗原(图39C)。
体外实验中，CD269-A7D-CD38-2G CAR T细胞有效裂解表达CD38的REH肿瘤细胞或表达CD269(BCMA)的K562细胞
检测CD269-A7D-CD38a或CD269-A7D-CD38b细胞裂解REH(B-ALL)和K562-BCMA细胞的能力。用CMTMR对靶细胞进行预染色，使其更容易与共培养的T细胞区分开来。效应细胞：靶细胞以2:1和5:1比率，共培养24小时。用小鼠抗人CD3和CD38对REH细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析(图39D)。用小鼠抗人CD3和CD269对K562-BCMA细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析(图39F)。共培养结果表明，CD269-A7D-CD38 CART细胞能特异性地裂解表达CD38表面抗原的CD38+REH肿瘤细胞系，而不裂解CD269。48小时共培养后的REH细胞(图39E)和K562-BCMA细胞(图39G)结果。虽然两种CAR(cCAR)对REH靶细胞的裂解都很强，但结果表明CD269-A7D-CD38a-CART细胞以2:1的比例单独使用能够完全清除靶细胞。结果表明，复合CARs的两个CAR结构域(CD269和CD38，a-b)对CD269+和CD38+靶细胞都有很强的杀伤作用，CD269-A7D-CD38a-CAR-T细胞的体外杀伤效果最好。
为了评价CD269-A7D-CD38a CAR T细胞与CD269-A7D-CD38b CAR T细胞对靶肿瘤细胞的体内裂解作用，对NSG小鼠进行亚致死照射并静脉注射4.0x106表达荧光素酶的MM.1S细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成(图40A，B)。从注射肿瘤细胞后10天开始，给小鼠静脉注射CD269-A7D-CD38a、CD269-A7D-CD38b或载体对照T细胞，剂量为10x106。在第9天和第12天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。CD269-A7D-CD38a-CAR-T细胞显示出更强的抗肿瘤作用，与对照组相比，靶MM.1S肿瘤细胞的裂解率为80％，而CD269-A7D-CD38b CAR T细胞对其裂解率为68％。
为了比较CD269-A7D-CS1-hu63、CD269-A7D-CD38a或CD269-A7D-CD38b CAR T细胞对靶MM.1S肿瘤细胞系的体内裂解，将NSG小鼠亚致死照射并静脉注射4.0x106荧光素酶表达的MM.1S细胞(第0天)以诱导可测量的肿瘤形成(图40C，D)。从注射肿瘤细胞后10天开始，给小鼠静脉注射10x106CD269-A7D-CD38a、CD269-A7D-CD38b或CD269-A7D-hu63 CAR T细胞或载体对照T细胞。在第9天和第12天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。CD269-A7D-CS1-hu63 CAR T细胞裂解率为97％，而CD269-A7D-CD38a CAR T细胞裂解率为80％，CD269-A7D-CD38b CAR T细胞裂解率为68％。CD269-A7D-CS1-hu63-CAR-T细胞在体内对MM.1S肿瘤细胞株的抗肿瘤作用强于CD269-A7D-CD38a或CD269-A7D-CD38b-CAR-T细胞。
CD19b-IL15/IL-15sushi CAR
实例
CD19b-IL15/IL-15CAR的表达通过FACS，并与对照T细胞对比进行检测(图41A)。CD19b-IL-15/IL15sushi-CAR T细胞是通过病毒转导患者或捐赠者的T细胞和装甲CAR基因构建而产生的。翻译后的抗CD19b装甲CAR蛋白在CART细胞表面表达，它们可以识别并结合肿瘤细胞表面的CD19靶蛋白。CD19b-IL-15/IL-15sushi-CAR-T细胞的药理作用和机制是通过CD19b-CAR对抗原的识别来介导的，通过将CD28共激活域整合入到构建物中，激活CD3zeta/Zap70，典型细胞毒性T细胞活性进一步增强。FACS分析显示CD19b-IL-15/IL-15sushi-CAR在T细胞上表达大约为35％，而且，与标准CAR细胞相比，IL-15/IL-15sushi“盔甲”能给CAR T细胞提供额外的刺激、促进其增殖并增强潜能。P2A，载体对照数据也展示。CD19b-IL-15/IL-15suhsi-CAR是通过CART细胞分泌IL-15/IL-15sushi来改变肿瘤微环境，增强抗肿瘤细胞毒性，增强CAR的效价和持久性。
共培养杀伤实验，其中表达CD19+表面表型的的靶肿瘤细胞系与CD19b-IL-15/IL15sushi-CAR或P2A对照T细胞共同孵育，用于检测CART细胞在体外对大量CD19+细胞的抗肿瘤功能。以1:1-5:1的效应靶比(E:T)共培养24小时，并用流式细胞仪分析,使用小鼠抗人CD3percp和小鼠抗人CD19-PE标记。每个分析包括与P2A对照细胞或CAR T细胞一起培养的靶细胞(Sp53-all-CD19+)(图41B)。Sp52是一种套细胞淋巴瘤细胞系。细胞毒性活性的条形图总结在右侧。N＝2。本实验揭示了CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR T的剂量依赖性，在低E:T比(如1:1)下，也能有效地溶解60％以上的肿瘤细胞。在2:1时，几乎所有的肿瘤细胞都被裂解，杀伤能力达到饱和。
类似的共培养条件如上所述(图41B)。在本实验方案中，将装甲CD19b(CD19b-IL-15/IL-15sushi)CAR T细胞与CD19阳性的REH细胞进行培养，并与对照P2A和单个抗CD19bCAR T细胞进行比较。用同样的方法产生抗CD19b-CAR T细胞，T细胞表面的表达约为50％(在所有T细胞中，数据未显示)。结果表明，即使在低E:T比率(如1:1)下，两种CAR-T治疗也同样有效，所有抗原阳性的REH细胞都被有效地去除。“IL-15/IL-15sushi护甲”对CAR T细胞的细胞毒性没有有害影响。
通过剂量依赖性共培养，我们证明了其对CD19+REH细胞的杀伤是强大的，即使在低E:T比率下，并且与单一的非装甲的CAR版本，即单一的CD19b CAR T相比，效果完全相当。
为了在体内检测CD19b-IL-15/IL-15sushi-CAR的功能，我们建立了异种小鼠模型。在第1天向小鼠注射表达荧光素酶的REH肿瘤细胞(0.5x106细胞/小鼠)(图42A)。第3天，进行IVIS成像以检测循环REH细胞的情况。在第4天，注射对照T细胞、CD19b-CAR和CD19b-IL15/IL15sushi-CAR T细胞(～7.5x106个细胞/小鼠)，在第6天到第22天，进行IVIS成像，以通过半定量评估分析肿瘤负担和随后的肿瘤耗竭情况以及T细胞对细胞生长的控制。在这里，两种CART治疗疗效相似，与标准CART19细胞相比，IL-15装甲CAR对REH肿瘤生长的抑制相似或更好。以CD19为基础的CARs在体内消除REH细胞，IL15/IL15sushi结合物增强抗肿瘤反应。构建一个线形图，绘制IVIS值(肿瘤负荷估计)与治疗队列时间的关系图(图42B)。随着对照组肿瘤负担的增加，两个CAR-T组均维持稳定的肿瘤抑制，统计分析显示肿瘤数量显著减少。
然后，我们使用类似的实验方案，采用图42A中所述的相同IVIS方法，长期比较对CD19b-CAR-T与CD19b-IL-15/IL15sushi-CAR-T抗REH细胞情况，对小鼠进行跟踪，直到看到肿瘤复发的迹象(图42C)。在这里，30天后，我们观察到在标准CART19治疗的小鼠中，侵袭性REH肿瘤开始发生复发。在大多数CART19小鼠中可以看到成簇的肿瘤(IVIS成像小鼠上的红色区域表示)，CD19b-IL-15/IL-15sushi-CART治疗的小鼠在第22天也出现肿瘤生长。然而，在第30天之后，所有CART19小鼠均出现严重肿瘤复发的迹象，而CD19b-IL-15/IL-15sushiCART治疗的小鼠没有出现肿瘤迹象。即使是第22天复发的小鼠在第32天肿瘤也被消除，这表明CD19b-IL-15/IL-15sushi CART细胞仍处于有效循环中。通过线形图，总结IVIS趋势值，估计每个治疗队列的肿瘤生长随时间的变化(图42D)。在过去的第30天，与CD19b-IL-15/IL-15sushi装甲CART治疗组相比，标准CD19b-CAR(CART19)治疗组小鼠的肿瘤负担急剧上升，肿瘤负担显著增加，而CD19b-IL-15/IL-15sushi装甲CART治疗组基本上没有肿瘤。如图为小鼠两个视图的值(腹侧和背侧图像采集视图)。随着时间的推移，在标准的CART治疗中，REH肿瘤复发；然而，装甲CAR持续存在并消除了复发的肿瘤，使小鼠免于疾病。
然而，由于细胞因子风暴毒性，注射总数为10x106的CD19b-IL-15/IL-15sushi-CART细胞的小鼠在生命终点被处死。因此，我们将每个治疗组的T细胞剂量降低到0.5x106和1.0x106。与对照组相比，为了评估较低剂量的装甲和非装甲CAR T细胞的效果，在第1天向小鼠注射表达荧光素酶的REH肿瘤细胞(总细胞数为0.5x106个/小鼠)(图42E)。第3天，进行IVIS成像以检测循环REH细胞的情况。方法与图42A相同；然而，每只小鼠仅注射0.5x106和1.0x106 CAR T或对照细胞，以测定关于潜在副作用的最低有效剂量。进行这项实验是因为，尽管图42C中的装甲CAR小鼠队列在IVIS检测时显示出强大的肿瘤消除和对肿瘤生长的显著控制，但最终，由于细胞因子风暴，达到了生命终点。因此，确定CART的剂量是有用的，找到最低的有效剂量，可以使给药的严重副作用的风险最小。我们发现，虽然通常来说0.5x106 T细胞太少，无法控制肿瘤生长，但在CD19b-IL-15/IL-15sushi队列中，剂量为1.0x106的T细胞能够控制肿瘤生长，而无细胞因子毒性并发症。基因转导效率约为30％，给这个低剂量群体注射的CAR-T细胞的实际剂量仅为每只小鼠约30万个CAR+细胞。因此，转导装甲CART疗法需要低剂量的给药，因为IL-15装甲CAR的效力和持久性的增加也可能与细胞因子释放导致危险副作用的风险增加有关。我们的结果表明，低剂量的CART细胞可能有助于防止细胞因子风暴。
图42C中模型小鼠血液中T细胞的整体持久性在生命终点时进行分析，通过流式细胞术，使用CD3抗体对大量T细胞群进行筛选(图43A)。为了进一步剖析CD19b-IL-15/IL-15sushi装甲CAR的持久性，有必要采集小鼠血液，以了解植入人体细胞的持久性。总的来说，我们通过流式细胞术分析发现，与标准CART19组相比，装甲CAR组的T细胞平均计数更高。由于体内循环肿瘤的最小刺激，对照组T细胞保持在基线水平。
图42C中的小鼠血液在图43B中通过进一步分析CD3阳性亚群中的CD8表达，以揭示在生命终点处残留在循环中的的持久的细胞毒性T细胞情况。特别值得注意的是，装甲CAR队列小鼠血液中的细胞毒性CD8+T细胞数量要高得多，这意味着杀伤肿瘤的T细胞的扩增力度大大增强，不仅仅是通过标准靶参与的信号转导，还基于细胞因子分泌复合物“装甲”分泌IL-15。与标准CART19队列的比较显示，CAR治疗预期的标准反应是通过靶点结合和随后的信号反应来实现细胞扩张。
通过CD8和CD3群体亚群分析，进一步比较CD19b(CART19)和CD19b-IL-15/IL-15sushi CART细胞之间的小鼠血液特征(图42C)。总的来说，装甲CAR队列中CD3+细胞数量较多，与持续性增加相关，装甲CAR队列中CD3+效应T细胞群中CD8+细胞平均数较高，装甲CART细胞具有中枢记忆免疫表型，与免疫监控改善的有关。
然后将检测到的剩余CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR T细胞移植到新的小鼠宿主中(图43D)。这项实验的原理是证明“IL-15装甲CAR”T细胞不会因为工程化的细胞因子支架增强自身功能而永生。亚致死照射后，将0.5x106细胞经静脉注射到每只NSG小鼠体内。第二天，将5.6x106个CD19b-CAR-T细胞(CART19)或CD19b w/增强子(CD19b-IL-15/IL-15sushi)CAR-T细胞经静脉注射到每只小鼠体内。这种情况作为第一个基础，注射的CAR-T细胞将与靶细胞结合并扩增，以便为移植提供足够的细胞材料。第36天，处死两组小鼠，收集全血和脾脏，用流式细胞术分析CART19细胞或CD19b-IL-15/IL-15sushi T细胞的存活情况。用BD-Pharm-Lyse缓冲液(BD-Biosciences)裂解血液和脾脏均质中的红细胞。流式细胞仪分析显示小鼠体内持续存在CD19b-IL-15/IL-15sushi T细胞(蓝点绿色圆圈)。我们观察到循环组织中收集的装甲CAR T细胞比CART19细胞多。脾匀浆细胞用CD3和CD45抗体标记以检测任一CAR T细胞。首先，用侧散射(SSC)和CD3门控CAR T细胞,使小鼠细胞(43D，A.)区别开，然后用CD45和CD3门控CD3阳性细胞(43D，B.)。左图为REH和CD19b-CAR-T细胞治疗的小鼠。右图为REH和CD19bCAR-w增强T细胞治疗的小鼠。我们检测到装甲CAR队列小鼠的CD3阳性CAR T细胞(蓝色圆点用绿色圈起)。为了确定CAR-T细胞的免疫表型，用CD8和CD4抗体(43D，C)标记细胞。FACS数据表明，大多数CD19b-IL-15/IL-15sushi T细胞是CD8阳性细胞。最后，将每只NSG小鼠脾匀浆中0.5x106个细胞注入2只小鼠，观察装甲CAR T细胞的自主生长情况。与CART19相比，该移植在第36天,CD19b-IL-15sushi CD8 T细胞可小鼠脾脏中可检测到。
通过比较CD19bCAR-和CD19b-IL-15/IL-15sushi T细胞移植小鼠的总通量值(光子/秒)，在移植小鼠中未发现肿瘤生长或T细胞扩张(图43E)。在两组小鼠中随时间变化进行细胞荧光IVIS成像。IVIS荧光在这里为移植细胞质量的半定量估计。在这种情况下，自体荧光强度保持在背景水平附近，并且没有显示出可检测的变化或通量的增加，从而确定了细胞生长或新细胞的扩增有限。在第64天，我们收集每只小鼠的面部外周血，并使用CD3和CD19抗体进行标记，以使用FACS分析评估REH肿瘤细胞或CAR-T细胞的存在(图43F)。我们无法在任何一只小鼠的面部外周血样本中检测到REH细胞或CAR-T细胞，这意味着移植后，装甲CAR T细胞无法进一步存活和增殖，或以其他方式成为不朽细胞。这可能在临床上具有转化作用，因为装甲CAR T治疗可能导致肿瘤样CAR T细胞的扩张。在第64天,移植小鼠中检测不到T细胞和肿瘤细胞群。尽管IL-15/IL-15sushi护甲具有更强的效力和持久性，但这些细胞在植入新小鼠后无法存活，这表明护甲不会导致自我增殖、永生化的细胞毒性T细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了一种CD19 CAR工程细胞，其包括分泌IL-15/IL-15sushi(SEQ ID NO.81)和相应的多核苷酸(SEQ ID NO.82)。
GD2-Super1-CAR
实例
图44A所示的GD2 super1 CAR的组织结构。通过P2A和T2 a原理图链接，生成一个显示CAR的super1CAR、一个结构中装有4-1BBL和IL-15/IL-15sushi的GD2 CAR。该结构由一个SFFV启动子驱动CAR、4-1BBL和IL-15/IL-15sushi三个片段的表达。连接器(P2A和T2A)断裂后，CAR，4-1BBL和IL-15/IL-15sushi分裂并与靶点结合。CAR具有单链抗体、铰链区、跨膜区、共刺激区(包括但不限于CD28或4-1BB)和细胞内信号转导、CD3-zeta链，4-1BBL或IL-15/IL-sushi或两者，能与CD28或4-1BB协同发挥T或NK细胞活化和持续或抗肿瘤作用。
为了评价不同靶向GD2的CAR结构的体内抗肿瘤活性，我们用NSG小鼠亚致死剂量照射并静脉注射表达荧光素酶的Y79视网膜母细胞瘤细胞建立了异种小鼠模型，以诱导可测量的肿瘤形成。肿瘤细胞注射后3天，小鼠静脉注射10x10e6的GD2-CAR、GD2-4-1BBL-CAR、GD2-super1car或载体对照T细胞。为了确定CAR T细胞的持久性，在第30天对小鼠实施了安乐死。取小鼠肝脏、脾脏和全血。
流式细胞术分析显示Y79肿瘤(蓝点)在用不同形式的抗GD2-CAR T细胞治疗的小鼠肝脏中持续存在(图44B)。用小鼠抗人CD3和CD56抗体标记匀浆肝细胞，分别检测人T细胞和Y79肿瘤细胞。左侧显示了一个代表性的给对照T细胞的小鼠；使用GD2CAR(左中)、GD2-4-1BBL CAR(右中)和GD2-super1CAR(右)T细胞治疗的小鼠。图44B显示，相对于给予对照T细胞的小鼠，GD2 CAR T细胞无法从肝脏清除Y79细胞，而用GD2-4-1-BBL CAR T细胞治疗的小鼠肿瘤细胞减少32％。相比之下，GD2-super1 CAR治疗的小鼠肝脏肿瘤细胞减少了85％。构建一个图表，表明与对照小鼠(n＝2)相比，每只CAR处理的小鼠对Y79细胞的杀伤活性百分比(图44B)。从这些数据来看，尤其是GD2超级CAR清除了肝脏中的Y79细胞。对小鼠脾脏的分析显示，与对照组相比，GD2-super1处理的小鼠的人类T细胞增加了1.87倍(图44C)，并且高于GD2CAR(1.15x)和GD2-4-1BBL(1.35)。在小鼠全血分析中，GD2-super1 T细胞的这种增加更为明显，比对照组小鼠增加了近3倍，GD2CAR的百分比增加了一倍多(图44D)。然后创建一个图表，显示全血样本中人类T细胞的持续性，和流式细胞术分析的总细胞数(n＝2个)相关(图44E)。这些数据有力地表明，GD2-super1 CAR具有分泌IL-15/IL-15sushi和4-1BBL结构域，能裂解表达GD2的肿瘤细胞，并且比GD2CAR或GD2-41BBL CAR T细胞具有更大的持久性。
CD123b-CLL1 CAR
实例
CD123bCLL1 CAR T细胞在转导的T细胞上的表达百分比约为27％，如图46A所示。用抗CD3抗体3天后，单个核细胞被激活。用对照载体(左)或CD123b-CLL1-CAR(右)慢病毒上清液转导细胞。孵育3天后，收集细胞并标记流式细胞仪。
检测CD123b-CLL1-2G CAR T细胞在共培养中能特异性裂解合成表达CLL-1抗原的REH细胞(图46B)和合成表达CD123抗原的Jurkat细胞(图46C)。用慢病毒载体转导野生型REH或Jurkat细胞表达CLL-1或CD123抗原，经FACS(FACS-Aria，BD)阳性筛选。效应细胞：靶细胞以2:1和5:1的比例与合成表达的细胞共培养24小时。在这些培养后，使用小鼠抗人CD3抗体(在所有情况下)和CLL-1对REH-CLL-1表达细胞或CD123对Jurkat CD123表达细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。对于两种比率(包括2:1的低比率)表达CD123的Jurkat细胞，24小时后细胞裂解完成(图46C)。表达CLL-1表型的REH细胞分别2:1和5:1的比例下裂解率为89％和92％(图46B)。这些结果表明，CD123b-CLL1-2G CAR T细胞的每个CAR组分都能够裂解其预期的靶细胞。
为了评估CD123b-CLL1-2G CAR T细胞对非靶细胞的特异性靶向裂解力，对不表达CLL-1或CD123抗原的野生型REH(图46D)和Jurkat细胞(图46E)进行了共培养实验。用CMTMR膜染料对野生型Jurkat细胞进行预染色，以区别于T细胞。效应细胞：靶细胞以2:1和5:1的比率与靶细胞共培养，持续6小时。孵育后，用小鼠抗人CD3抗体和CD19(野生型REH细胞)标记细胞，并用流式细胞仪分析。CD123bCLL-1CAR T细胞对REH野生型细胞的裂解能力有限(2:1比率为24％，5:1比率为0；图46D)，而野生型Jurkat细胞在2:1和5:1比率下的裂解率保持在33％左右(图46E)，远低于CAR T细胞对表达CD123的Jurkat细胞的裂解程度(图46C)。这些数据表明CD123b-CLL-1CART细胞不能消除非靶向的Jurkat和REH肿瘤细胞。
在一个实施方案中，工程细胞包括CD123b-CLL-1多肽(SEQ ID NO.26)和相应的核苷酸(SEQ ID NO.27)。
CD20cCD19b和CD20hCD19b CAR
实例
CD20cCD19b或CD20hCD19b-CAR的组织如图47和图48A所示。两种复合CARs，CD20cCD19b和CD20hCD19b-CAR在转导的T细胞上的表达百分比分别为22％和28％(图48B)。用抗CD3抗体3天后，单个核细胞被激活。用对照载体(左)、CD20cCD19b或CD20hCD19b-CAR(右)慢病毒上清液转导细胞。孵育3天后，收集细胞并标记流式细胞仪。
为了评估CD20cCD19b和CD20hCD19b CAR T细胞对非靶向野生型K562细胞的特异性，以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验6小时，并通过流式细胞术直接分析CD3和CD45(图48C)。每个实验包括单独的K652靶细胞(右)、对照T细胞(左)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)。靶细胞用蓝点表示(N＝2)。CD20cCD19b和CD20hCD19b-CAR-T细胞不能裂解K562肿瘤细胞系，而K562肿瘤细胞系在共培养实验中既不表达CD20，也不表达CD19。
为了评估CD20cCD19b和CD20hCD19b CAR T细胞裂解表达CD19的靶细胞的能力，用合成表达CD19抗原(K-19)的靶K562细胞系以2:1或5:1的效应靶比共培养24小时，并通过流式细胞术直接分析CD19和CD3(图48D)。每个分析包括K562-CD19xp靶细胞(右侧)、对照T细胞(左侧)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)。靶细胞用绿点表示。两种类型的复合CAR-T细胞在共培养实验中均裂解了合成表达CD19的K562肿瘤细胞系。
为了评估CD20cCD19b和CD20hCD19b CAR T细胞对表达CD20的靶细胞上的裂解能力，效应细胞与靶细胞以2:1或5:1比率对合成表达CD20抗原的靶K562细胞系进行共培养实验24小时，并通过流式细胞术直接分析CD20和CD3(图48E)。每个分析包括单独的K562-CD20xp靶细胞(K-20)(右侧)、对照T细胞(左侧)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)。靶细胞用紫色圆点表示。两种类型的复合CAR T细胞在共培养试验中均溶解了合成表达CD19或CD20的K562肿瘤细胞系(图48D和48E)。
为了评估CD20cCD19b和CD20hCD19b CAR T细胞对表达CD19的靶REH细胞的特异性，以2:1或5:1的效应靶比与表达CD19的REH细胞系共培养24小时，并通过流式细胞术直接分析CD19和CD3(图48F)。每个分析包括单独的REH靶细胞(右侧)、对照T细胞(左侧)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)。靶细胞用橙色圆点表示。在共培养试验中，发现两种类型的复合CAR T细胞完全裂解表达CD19的REH肿瘤细胞系(图48F)。
为了评估CD20cCD19b和CD20hCD19b CAR T细胞对同时表达CD19和CD20抗原的靶细胞的裂解能力，以2:1或5:1的效应靶比与表达CD19和CD20的SP53 B细胞淋巴瘤细胞系共同培养24小时，并通过流式细胞术直接分析CD19和CD3(图48G)。每个分析包括单独的SP53靶细胞(右侧)、对照T细胞(左侧)和CD20cCD19b或CD20hCD19b CAR T细胞(中间)。靶细胞用绿点表示(N＝2)。两种复合CAR-T细胞在共培养实验中均完全裂解了SP53肿瘤细胞系，该细胞系同时表达CD19和CD20抗原。
共培养结果汇总如图48H所示，与K562wt(野生型)共培养6小时，与其他共培养24小时(N＝2)。与对照T细胞相比，这两种复合CAR类型在靶向裂解方面表现出优越性，与CD20cCD19b-2G CAR T细胞相比，CD20hCD19b-2G CAR T细胞表现出对合成表达CD20抗原的靶向K562细胞更为强烈的杀伤作用。
关于CD20hCD19b-cCAR，我们通过共培养法，分析了CD20h-CD19b-CART细胞对REH-B-ALL细胞系的消融，抗肿瘤活性的剂量依赖性。(图49A)。对CD19+B-ALL肿瘤细胞系进行共培养，E:T比值从0.25上升到1(25000t细胞到100000REH细胞)。共培养过夜，并用CD3和CD19抗体标记，然后进行FACS分析肿瘤细胞的残余情况。结果以条形图表示(图49B)。我们发现，一般而言，随着效应细胞数量的增加，靶细胞裂解率增加。
为了进一步确定CD20h-CD19b CAR T细胞的抗肿瘤活性，我们与表达CD19和CD20(B-ALL-25)的原发性CD19+B-ALL白血病细胞进行共培养(图49C)。为了分析CD20h-CD19b-cCAR的特异性，我们还与抗原阴性、CD19和CD20均阴性、CD34阳性的原发性白血病细胞进行了共培养。B-ALL-25和阴性对照原代白血病细胞均预先用细胞染料CFSE标记，以区分效应T和靶肿瘤细胞群。FACS对B-ALL-25(左)共培养的分析显示，在E:T为2:1的情况下，靶原发性白血病细胞完全被消除。对阴性对照原代细胞共培养(右)的分析表明，cCAR对大量抗原阴性群体没有杀伤。CD20h-CD19b-cCAR-T细胞能靶向杀伤原代B-ALL细胞，但不能靶向非靶向的白血病细胞。
为了证实CD20h-CD19 CAR T细胞在体内的抗肿瘤活性，对NSG小鼠进行亚致死照射并静脉注射1.0x106表达荧光素酶的REH细胞(第0天)，以诱导可测量的肿瘤形成(图50A，B)。从注射肿瘤细胞后6天开始，给小鼠静脉注射10x106 CD20hCD19b CAR T细胞或载体对照T细胞。在第5天、第9天和第12天，给小鼠皮下注射D-荧光素，并进行IVIS成像。到第12天，CD20h-CD19CART细胞对背侧和腹侧肿瘤细胞的消除率达到98％。这些结果表明CD20h-CD19CART细胞对表达CD19抗原的REH细胞表现出强烈的杀伤作用。
在一个实施例中，工程细胞包括CD20-CD19嵌合抗原受体多肽(SEQ ID NO.20，22)和相应的核苷酸(SEQ ID NO.21，23)。
在一个实施例中，工程细胞包括CD20h-CD19b cCAR和靶向CD20的人源化嵌合抗原受体多肽(SEQ ID NO.22)，以及相应的核苷酸(SEQ ID NO.23)。
脐带血中自然杀伤细胞的扩增
例子
使用所述步骤扩增自然杀伤细胞(图51A)。为了确定CAMPATH刺激对脐带血细胞中自然杀伤细胞扩增的作用，脐带血细胞在含有10％胎牛血清和白细胞介素-2的T细胞培养基中在CAMPATH包被的细胞培养瓶或未包被的培养瓶中培养(图51B)。通过使用CD56和CD3抗体的流式细胞术分析来确定总细胞中的NK细胞群(用蓝色圈出)。这些数据表明，自然杀伤细胞的数量随着CAMPATH刺激以一种依赖于一天的方式增加更多。
为了评估在脐带血细胞中使用不同类型的细胞培养基进行自然杀伤细胞扩增的效果，脐带血细胞在含有10％胎牛血清和白细胞介素-2的T细胞培养基或SCGM培养基中在CAMPATH包被的细胞培养瓶中培养(图52A)。使用CD56和CD3抗体通过流式细胞术分析确定总细胞中的NK细胞群(用蓝色圈出)。每隔一天计算自然杀伤细胞的数量，并建立生长曲线(图52B)。这些数据表明，与SCGM培养基相比，用卡马西平刺激的T细胞培养基中的自然杀伤细胞的数量以日依赖的方式增加更多。
为了评估在脐带血自然杀伤细胞扩增的细胞培养基中使用人血清代替胎牛血清的效果，脐带血细胞在含有5％人血清和白介素-2的T细胞培养基或SCGM培养基中在CAMPATH包被的细胞培养瓶中培养(图53A)。通过使用CD56和CD3抗体的流式细胞术分析来确定总细胞中的NK细胞群(用蓝色圈出)。然后每隔一天计算自然杀伤细胞的数量，并形成生长曲线(图53B)。这些数据表明，与SCGM培养基相比，自然杀伤细胞的数量在用卡马西平刺激的T细胞培养基中增加更多，呈日依赖性。
为了评估在细胞培养基中加入白介素-15对新鲜脐带血细胞中自然杀伤细胞扩增的影响，新鲜脐带血细胞在含有10％胎牛血清和白介素-2的T细胞培养基中在CAMPATH包被的细胞培养瓶中培养(图54A)。通过使用CD56和CD3抗体的流式细胞术分析来确定总细胞中的NK细胞群(用蓝色圈出)。然后每隔一天计算自然杀伤细胞的数量，并建立生长曲线(图54B)。这些数据表明，自然杀伤细胞的数量增加更多后，加入白细胞介素-15在T细胞培养基与卡马西平在一天的依赖方式。
为了测量转导后NK细胞表面CD19b、CD19b-IL15/IL15sushi和BCMA-A7D-IL15/IL15sushi CAR的表达水平(与绿色荧光蛋白相比)，进行了流式细胞术(图54C)。流式细胞术分析检测到约42％的CD19b-CAR(A)、39％的CD19b-IL15/IL-15sushi-CAR(B)、51％的BCMA-A7d-IL15/IL-15sushi-CAR和(D)76％的细胞表面绿色荧光蛋白表达。
CD19b-IL15/IL15sushi或BCMA-A7D-IL15/IL15sushi CAR NK细胞可用作uCAR NK细胞，用于裂解靶细胞。
体内持久性分析，CD19b-IL15/IL15sushi或BCMA-A7D-IL15/IL15sushi CAR NK细胞在异种小鼠模型中进行。使用在PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中描述的方法，CD19b-IL15/IL15sushi或BCMA-A7D-IL15/IL15sushi CAR NK细胞可以在小鼠中持续超过两周或一个或两个月.在体内抗肿瘤活性中，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，并使用PCT/US2016/019953和PCT/US2016/039306中描述的方法通过CAR NK细胞消除或抑制表达靶抗原的靶细胞。
白细胞介素-15/白细胞介素-15分泌疗法的策略
分泌白细胞介素15/白细胞介素15的CAR-T细胞治疗策略如图55所示。
限制CD269-A7D-IL15/IL15RA CAR T细胞的剂量可避免细胞因子释放综合征，但不会减少异种小鼠模型中MM.1S肿瘤细胞的消融
为了评估CD269-A7D-IL-15/IL-15sushi(CD269-A7D-IL15/IL-15sushi)CAR T细胞的体内抗肿瘤活性，我们开发了一种异种小鼠模型，该模型使用NSG小鼠亚菌体照射并静脉注射4x106荧光素酶表达的MM.1S多发性骨髓瘤细胞来诱导可测量的肿瘤形成。肿瘤细胞注射后8天，每组2只小鼠静脉注射10x106个疗程的CD269-A7d-IL15/IL15Sushi(A7d-IL15/IL15 Sushi)CAR或载体对照T细胞。在第7、11和15天，小鼠皮下注射重组荧光素并进行IVIS成像。到第11天，CD269-A7D-IL15/IL15经苏士卡T细胞处理的小鼠比对照组小鼠的肿瘤减少97％，在第15天减少99％.(图56，实验1)。
然而，两种治疗的小鼠后来都出现了细胞因子释放综合征(CRS)的症状。一只小鼠死亡，另一只小鼠在用CAMPATH抗体治疗后恢复，以减少CAR T细胞群。第二个实验如上所述进行，但在第9天注射五分之一剂量的CAR T细胞(2x106)，以确定是否可以避免CRS。在第8、12和15天，小鼠皮下注射重组荧光素，并进行IVIS成像。不出所料，剂量越低，肿瘤溶解越慢。到第11天，CD269-A7D-IL15/IL15sushi CAR T细胞处理的小鼠的肿瘤仅比对照组小鼠少54％，但到第15天，肿瘤减少了93％，与第一个实验非常相似。(图56，实验。2).在实验过程中，没有观察到任何一只小鼠在任何时候出现CRS症状，在实验结束前，两只小鼠都存活了两个多月。这些数据表明，较低剂量的CAR T细胞导致等量的肿瘤细胞消融，但没有副作用。
同样出乎意料的是，在我们的临床试验研究中，低分割剂量可以达到杀死癌细胞的显著效果，但没有严重的CRS。
带安全开关的CD4-Q-XX CAR-用CD4-Q-XX-CAR转导的T细胞表达CAR-示意图显示CD4-Q-XX-CAR配备有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19(图61A)。活化的人外周血T细胞用CD4-Q-XX慢病毒载体转导。CAR-。图61B显示了用对照载体或CD4-Q-XXCAR载体转导的活化T细胞之间的转导效率，通过用山羊抗小鼠F(Ab’)2抗体标记来确定。用CAR载体转导的活化T细胞在第6天产生55％的CD4-Q-XX阳性细胞(图61B)，在第10天产生>50％的CD4-Q-XX阳性细胞.同时，还用小鼠抗人CD20模拟表位抗体标记T细胞，检测CD20(利妥昔单抗)在CAR T细胞中的同时表达。在第6天，51％的T细胞对CD20模拟表型呈阳性，48％在第10天呈阳性.正如预期的那样，这些百分比与CAR-T细胞的百分比相当。
用CD4-Q-XX-CAR转导的T细胞导致CD4+ T细胞的自我杀伤-用小鼠抗人CD4抗体标记T细胞以检测CD4+群体。为了确定CD4-Q-XX-CAR转导的T细胞是否会被CD4-CAR结构域裂解，在第6天和第10天收集细胞(与上述抗F(Ab’)2标记同时)。用小鼠抗人CD3和CD4标记细胞，用流式细胞仪分析。如图61B所示，与对照T细胞相比，第6天表达CD4的CAR T细胞的数量增加了三分之二以上(41％至12％)，而第10天几乎所有的CAR细胞都是CD4-(数据未显示)。这证实了CD4+T细胞的自相残杀和CD4表面抗原的下调。这里显示的数据表明，CD4-Q-XX-CAR病毒转导到外周血T细胞成功地产生了CD4-CAR和CD20模拟表位共表达T细胞。这些CART细胞用于以下体外杀伤试验。
CD4-Q-XX-CAR-T细胞在体外22小时共培养试验中有效裂解靶CCRF-CEM细胞.检测CD4-Q-XX-CAR-CAR T细胞特异性裂解表达CD4抗原的CCRF-CEM细胞的能力。CCRF-CEM细胞用膜染料CMTMR预先标记，以区别于T细胞。与对照T细胞或CD4-Q-XX-CAR T细胞以5:1效应细胞:靶细胞的比例与预先标记的CCRF-CEM肿瘤细胞共培养22小时。孵育后，用小鼠抗人CD3和CD4抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。共培养后，近83％的CCRF-CEM肿瘤细胞被裂解(图61C)。这些结果表明CD4-Q-XX-CAR T细胞能够溶解其预期的靶细胞。
移植到小鼠模型中的人CD4-Q-XX CAR T细胞通过利妥昔单抗治疗被消除。用CD4-Q-XX慢病毒载体上清液转导的人外周血T细胞被发现以约40％的比例共表达CAR(F(Ab’)2)和CD20。对五只NSG小鼠进行亚致死性辐射，并静脉注射10x106 CD4-Q-XX CAR T细胞(第1天)。让细胞植入后，在第5天，给两只小鼠皮下注射150μL的盐水溶液(对照组)，给其余三只小鼠注射15μL/150μL的利妥昔单抗(治疗组)。在第6、7、9和13天重复这些注射，共进行5次治疗。在第15天，收集所有小鼠的外周血。血样用山羊抗小鼠F(Ab’)2、小鼠抗人CD45、CD3和CD20模拟表位抗体标记，通过流式细胞术检测CD4-CAR表达和重组CD20模拟表位表达。与对照组相比，利妥昔单抗注射组外周血中CD20模拟表位共表达CD4-Q-XX-T细胞显著减少(图61D)。5次给药后，观察到CD4-Q-XX-CAR T细胞高达90％的耗竭(图61E)。
从CD4-Q-XX CAR NK细胞分泌的白介素-15/白介素-15sushi可以在体外替代白介素-2的功能-为了确定白介素-15是否被分泌，白介素-15依赖的NK-92细胞系用包含CD4-Q-XX CAR的慢病毒载体转导。在BD FACS Aria上分选细胞，以选择F(Ab’)2和CD20模拟表型阳性的NK细胞。然后在24孔板中以每mL0.5x10e6细胞的总体积1mL培养分选的CD4-Q-XX CARNK细胞和野生型NK-92细胞。将细胞添加到重复孔中；每对孔中的一个孔含有300IU/mL的白介素-2，另一个孔不含。48小时后(第2天)，计数细胞，体积增加至约0.5x10e 6细胞/mL的浓度。在第4天和第6天重复该过程.如图61F中的图表所示，在培养物中培养6天而没有白介素-2的CD4-Q-XX NK CAR T细胞以与添加白介素-2的野生型NK-92细胞几乎相同的速率扩增，而培养6天而没有白介素-2的野生型NK-92细胞都已经死亡.这表明自然杀伤细胞分泌的白细胞介素-15可以替代白细胞介素-2的扩增活性。
CD19b CARs
转导的T细胞高效表达CD19b-XX-一个示意图显示CD19-Q-XX CAR配有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19。活化的人外周血T细胞用CD19b-XX或CD19b-IL-15/IL-15sushi慢病毒载体转导。图62B显示了用对照载体或CD19b-IL-15/IL-15/sushi或CD19b-XX CAR构建体转导的活化T细胞之间的转导效率，通过用山羊抗小鼠F(Ab’)2抗体标记来确定。用CAR载体转导的活化T细胞在转导开始后4天产生CD19b-IL-15/IL-15/sushi的60％F(Ab’)2阳性细胞和CD19b-XX的58％F(Ab’)2阳性细胞(图62B)。
CD19b-IL-15/IL-15sushi和CD19b-XX-CAR-T细胞都在体外24小时共培养试验中完全裂解靶REH细胞-检测CD19b-IL-15/IL-15sushi和CD19b-XX-CAR-T细胞特异性裂解表达CD19抗原的REH肿瘤细胞的能力。与任一对照T细胞共培养。CD19b-IL-15/IL-15sushi或CD19b-XX CAR T细胞以2:1和5:1效应细胞与靶细胞的比例对抗REH肿瘤细胞，持续24小时。孵育后，用小鼠抗人CD3和CD19抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析(图62C)。共培养后，几乎所有的肿瘤细胞都以两种比例裂解。这些结果表明CD19b-IL-15/IL-15sushi和CD19b-XX CAR T细胞在完全溶解其预期的靶细胞方面同样有效。
IL15在CD19b-XX CAR NK细胞中的作用-为了确定是否分泌了IL-15，用含有CD19b-XX CAR的慢病毒载体转导依赖IL-15的NK-92细胞系。在BD FACS Aria上分选细胞，以选择F(Ab’)2(CAR)表型阳性的NK细胞(图3)。将分选的细胞扩增，用山羊抗小鼠F(Ab’)2抗体标记，并通过流式细胞术分析，以确认细胞对CAR表型几乎100％阳性。
CD19b-XX CAR NK细胞分泌的IL-15/IL-15sushi在体外可以替代IL-2的功能。分选后的CD19b-XX CAR NK细胞和野生型NK-92细胞在24孔板中以每mL0.5x10e 6细胞的总体积1mL培养。将细胞添加到重复孔中；每对孔中的一个孔含有300IU/mL的白介素-2，另一个孔不含。48小时后(第2天)，计数细胞，体积增加至约0.5x10e 6细胞/mL的浓度。在第4天和第6天重复该过程.如图62D中的图表所示，在培养物中培养6天而没有白介素-2的CD19b-XXNK CAR T细胞以与添加白介素-2的野生型NK-92细胞几乎相同的速率扩增，而培养6天而没有白介素-2的野生型NK-92细胞都已经死亡。这表明自然杀伤细胞分泌的白细胞介素-15可以替代白细胞介素-2的扩增活性。
在异种小鼠模型中，CD19b-XX-CAR-T细胞表现出显著的抗肿瘤活性，并且比CD19b-IL-15/IL-15-SUSHI CAR-T细胞具有更高的持久性
为了评价CD19b-IL-15/IL-15sushi(共表达IL-15/IL-15sushi)和CD19b-XX-CAR-T细胞(共表达IL-15/IL-15sushi加CCL9)对人肿瘤细胞系的体内特异性抗肿瘤活性，我们使用NSG小鼠亚菌体照射并静脉注射1x106表达荧光素酶的REH野生型急性髓系白血病肿瘤细胞(其在细胞表面表达CD19)来建立异种小鼠模型。肿瘤细胞注射后7天，所有小鼠静脉注射一个疗程的低剂量，约0.3x106的对照T细胞或CD19b-IL-15/IL-15sushi或CD19b-XX CART细胞。在第6天(T细胞治疗的前一天)、第9天(T细胞治疗后48小时)和其后定期，对小鼠进行IVIS成像以测量肿瘤负荷(图62E)。将注射
CD19b-IL-15/IL-15sushi或CD19b-XX CAR T细胞的REH小鼠的平均光强与注射对照T细胞的小鼠的平均光强进行比较，以确定靶细胞的溶解百分比。结果表明，在用T细胞治疗后仅3天(第9天)，用任一种CAR T细胞治疗的小鼠的肿瘤负荷远低于给予对照T细胞的小鼠(图62E)。到第27天，三只对照组小鼠全部死亡。然而，到第21天，相对于用CD19b-IL-15/IL-15s hi CAR T细胞处理的小鼠，用CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR T细胞处理的小鼠的肿瘤细胞开始扩增。到第45天，用CD19b-IL-15/IL-15sushi细胞治疗的小鼠比用CD19b-XXsushi细胞治疗的小鼠具有更多的肿瘤细胞。虽然
CD19b-IL-15/IL-15sushi细胞处理的小鼠在第53天死亡，但CD19b-XXsushi细胞处理的小鼠至少存活到第60天(p＝0.02)(图62F)。这些结果表明，与体内抗B-ALL肿瘤细胞系的CD19b-IL-15/IL-15sushi CAR T细胞相比，CD19b-XX CAR T的功效和长期作用增加。
CD38a-Q-XX-CAR人T细胞的产生-图63A中的示意图显示了配备有细胞因子复合物IL-15/IL-15sushi和趋化因子CCL19的CAR 38-Q-XX CAR(也称为CD38a-Q-XX CAR)。
化的人外周血T细胞用来自CD38a-Q-XX CAR的慢病毒载体转导。图63B显示了用对照载体或CD38a-Q-XX CAR载体转导的活化T细胞之间的转导效率，通过用山羊抗小鼠F(Ab’)2抗体标记来确定。用CAR载体转导的活化T细胞产生57％的CD38a-Q-XX阳性细胞(图63B)。这些CAR T细胞用于以下体外杀伤试验。同时，还用小鼠抗人CD20模拟表位抗体(利妥昔单抗)标记T细胞，以检测CD20(利妥昔单抗)在CAR T细胞中的同时表达(55％)。正如预期的那样，这些百分比与CAR-T细胞的百分比相当。
用CD38a-Q-XX CAR转导的T细胞表现出CD38+ T细胞的自我杀伤-为了确定用CD38a-Q-XX CAR转导的T细胞是否会被CD38 CAR结构域裂解，在第6天(与上述抗F(Ab’)2标记相同的一天)收获细胞。
用小鼠抗人CD3和CD38标记细胞，并用流式细胞术分析。如图63B所示，与对照T细胞相比，在第6天表达CD38的CAR T细胞的数量实际上被消除了。这证实了CD38a细胞对CD38+ T细胞的自相残杀或自我杀伤。
在体外试验中，CD38a-Q-XX CAR T细胞能够裂解表达CD38抗原REH肿瘤细胞系.检测CD38a-Q-XX CAR T细胞特异性裂解天然表达CD38抗原的野生型REH肿瘤细胞的能力。
用细胞跟踪器CMTMR预标记野生型REH细胞，以将其与非转导的T细胞(也是CD38+)区分开来。将与对照T细胞或CD38a-Q-XX CAR T细胞和REH细胞的共培养物以效应细胞∶靶细胞的5∶1比例建立22小时。孵育后，用小鼠抗人CD3抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。22小时后，93％的肿瘤细胞被溶解(图63C)。这些结果表明CD38a-Q-XX细胞能够裂解其预期的靶细胞。
在一些实施方案中，T或NK细胞中的CD38a-Q-XX CAR可用于根除或杀死CD38表达的白血病或淋巴瘤，包括T细胞白血病/淋巴瘤、NK细胞白血病/淋巴瘤、AML、MDS和多发性骨髓瘤。
CD33-XX(也称为CD33b-XX)和CLL-1-XX共表达IL-15/IL-15suhi和CCL19(图64A和64B)-活化的人外周血T细胞用CD33b-XX或CLL1-XX CAR的慢病毒载体转导。图64C显示了用对照载体或CD33b-XX和CLL1-XX CAR载体转导的活化T细胞之间的转导效率，通过用山羊抗小鼠F(Ab’)2抗体标记来确定。用CAR载体转导的活化T细胞产生37％的CD33b-XX阳性细胞和32％的CLL1-XX阳性细胞。这些CAR T细胞用于以下体外杀伤试验。
在体外试验中，CD33b-XX CAR T细胞完全裂解表达CD33抗原U937肿瘤细胞系.检测CD33b-XX CAR T细胞特异性裂解天然表达CD33抗原的野生型U937肿瘤细胞的能力。与对照T细胞或CD33b-XX CAR T细胞和U937细胞的共培养物以效应细胞∶靶细胞的2∶1比例建立18小时。孵育后，用小鼠抗人CD3和CD33抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。18小时后，肿瘤细胞完全溶解(图64C)。这些结果表明CD33b-XX细胞能够裂解其预期的靶细胞。
在体外试验中，CLL1-XX CAR T细胞裂解表达CLL-1抗原U937肿瘤细胞系.对CLL1-XX CAR T细胞特异性裂解天然表达CLL-1抗原的野生型U937肿瘤细胞的能力进行了分析。与对照T细胞或CLL1-XX CAR T细胞和U937细胞的共培养物以效应细胞∶靶细胞的5∶1比例建立18小时。孵育后，使用小鼠抗人CD3和CLL-1抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。18小时后，94％的肿瘤细胞被溶解(图64D)。这些结果表明CLL1-XX CAR T细胞能够裂解其预期的靶细胞。
植入小鼠模型的人CD19b-Q-XX CAR T细胞表达并分泌IL-15和CCL 19-用CD19b-Q-XX慢病毒载体转导的人外周血T细胞发现上清液以约40％的比例共表达CAR(F(Ab’)2)和CD20模拟表位。对NSG小鼠进行亚细胞照射，并静脉注射10x106的CD4-Q-XX细胞(第1天)。细胞植入后，收集2只对照(未处理)小鼠和2只给予CAR T细胞的小鼠的外周血，并将其放入包被有人IL-15(见图65B)或人CCL19(见图65D)的酶联免疫吸附试验多孔板(BosterBiotech)，根据制造商的说明进行酶联免疫吸附试验程序。根据试剂盒中提供的标准蛋白质的曲线，获取吸光度读数并将吸光度转换为ng/μL后，确定IL-15的检测浓度为2.5ng/μL，CCL19的检测浓度为11.4ng/μL。因此，CD19-Q-XX CAR T细胞能够在体内表达和分泌人白细胞介素-15和CCL19。
植入小鼠体内的人CD19-Q-XX CAR T细胞表达并分泌IL-15和CCL19-人类外周血T细胞用CD4-Q-XX慢病毒载体上清液转导，发现它们共同表达了两种CAR(F(Ab')2)和CD20拟表位的比例约为40％。对NSG小鼠进行了次致命性照射，并静脉内注射了10x106个CD4-Q-XXCAR T细胞(第1天)。允许细胞移植后，收集来自2只对照(未治疗)小鼠和2只给予CAR T细胞的小鼠的外周血，并将其(一式两份)放入涂有人IL-15的ELISA多孔板(Boster Biotech)中(参见图65B)或人CCL19(参见图65D)，并根据制造商的说明书进行ELISA程序。在获取吸光度读数并将吸光度根据试剂盒中提供的标准蛋白质的曲线转换为ng/uL之后，确定检测到的IL-15浓度为16.8ng/uL，CCL19为7.2ng/uL。因此，CD4-Q-XX CAR T细胞能够在体内表达和分泌人IL-15和CCL19。
CAR在分选的NK92细胞和通过多种构建体转导的T细胞中分泌IL-15和CCL19-将通过构建体转导的排序的NK92细胞扩增至超过1x106细胞/mL。收集培养基并将其(一式两份)放入涂有人IL-15(见图65A)或人CCL19(见图65C)的ELISA多孔板(Boster Biotech)中，并根据制造商的说明书进行ELISA程序。读取吸光度后，根据试剂盒中提供的标准蛋白质的曲线将吸光度转换为ng/uL。因此，CD33b-XX，CLL1-XX，CD4-Q-XX和CD38a-Q-XX CAR能够分泌IL-15或CCL19。
分选的人CD19b-Q-XX CAR NK92细胞表达和分泌IL-15和CCL19-
使分选的CD19b-Q-XX NK92细胞扩增至超过1x106细胞/mL。收集培养基并将其(一式两份)放入涂有人IL-15(见图65A)或人CCL19(见图65C)的ELISA多孔板(BosterBiotech)中，并根据制造商的说明书进行ELISA程序。在获取吸光度读数并将吸光度根据试剂盒中提供的标准蛋白质的曲线转换为ng/uL之后，确定检测到的IL-15的浓度为7.7ng/uL，CCL19为81.9ng/uL。因此，CD19b-Q-XX CAR NK92细胞能够表达和分泌人IL-15和CCL19。
典范的患者治疗
CLL-1-CD33 cCAR
在本研究的一个示例性实施方案中，发现CLL-1/CD33靶对可有效治疗患有AML(急性髓细胞性白血病)的人类患者。在该特定实施方案中，化合物CAR工程细胞具有对CLL-1具有选择性的第一嵌合抗原受体多肽和对CD33具有选择性的第二嵌合抗原受体多肽。并成功治疗了AML患者。
与对照相比，CLL-1-CD33 cCAR(也称为CLL-1-CD33b cCAR)在小鼠中显示出生存优势，并且在小鼠体内中成功开发了终止cCAR的安全开关。前述发现表明，靶向两种离散AML抗原：CLL-1和CD33的工程化cCAR细胞可有效消除表达这两种抗原的细胞。基于这些发现，然后将cCAR用于治疗AML患者，以验证CLL-1-CD33是AML的潜在治疗药物。
一名患者被诊断出患有Fanconi贫血，该病已发展为少年骨髓单核细胞白血病(JMML)，并最终转化为AML。该患者对多种疗法都有抗药性，包括使用FLT3抑制剂进行5个周期的化疗。患者的白血病细胞占外周血单个核细胞的73％和骨髓的81％。
用具有对CLL-1选择性的第一嵌合抗原受体多肽和对CD33选择性的第二嵌合抗原受体多肽的cCAR工程细胞治疗后，患者表现出完全缓解。
特别是，在输注cCAR之前，患者接受了淋巴清除治疗(氟达拉滨和环磷酰胺)。在第1天和第2天分别输注两个分剂量，每个剂量分别由1x106/kg CAR T细胞组成。在第12天，尽管白血病胚细胞仍占骨髓的98％(图66)，但在外周血和骨髓中都检测到了强大的CAR T细胞扩增。在第19天，患者通过骨髓抽吸物获得了完全缓解，显示出髓样细胞的完全消融(图66)。流式细胞术证实不存在白血病母细胞，并显示CAR T细胞占PBMC的36％和骨髓的60％。与常规全身放疗和高剂量化学疗法相比，患者随后接受了非清髓性造血细胞移植，毒性较低。在BMT(骨髓干细胞移植)后第12天，供体细胞的分化达到100％，干细胞迅速重新繁殖，而血细胞(WBC)在BMT后达到正常水平。未检测到残留的白血病。
令人惊奇的是，观察到以下情况：1)CLL-1-CD33 cCAR在人类中的首次使用，治疗了复发性/难治性AML患者；2)CLL-1-CD33 cCAR能够完全根除白血病胚细胞和白血病干细胞。3)CLL-1-CD33 cCAR也被证明(1)允许采用毒性更小的策略进行骨干细胞移植，包括降低强度的条件同种异体移植或非清髓性条件同种异体移植；(2)降低GVHD并提供快速的干细胞恢复。
该数据由发明人在同行评审杂志Blood(Blood 2018 132：901)中发布。此外，还邀请作者在欧洲血液学协会(EHA)第23届总统代表大会上介绍该数据。2018年6月14日至17日；在瑞典斯德哥尔摩。
同种异体干细胞移植的主要限制仍然是高死亡率和发病率。当使用强度降低的同种异体移植或非清髓性同种异体移植时，与常规清髓性移植相比，移植相关的死亡率显着降低。但是，由于疾病复发的显着增加，降低强度的条件同种异体移植或非清髓性条件同种异体移植并不常用。
另一名患者被诊断出患有AML，并且对多种疗法都有抵抗力。该患者残留疾病，骨髓中有约7％的髓母细胞。从患者的T细胞中分离出CLL-1-CD33 CAR T细胞。但是，由于进行了多种化学疗法，患者的T细胞无法在培养物中扩增。寻找替代的源T细胞。最后，患者的兄弟T细胞被用于产生CLL-1-CD33 CAR T细胞。用具有对CLL-1选择性的第一嵌合抗原受体多肽和对CD33选择性的第二嵌合抗原受体多肽的供体cCAR工程细胞处理后，观察到CAR T细胞大量扩增，该细胞由70％以上的白血组成，并且患者在CAR治疗后第10天出现缓解。BMT用于干细胞抢救，然后进行降低强度的训练，包括ATG(抗胸腺细胞球蛋白)，Ara-C，低剂量的BU(busulphan)和cytoxan(环磷酰胺)，然后进行造血干细胞输注。
令人惊讶地发现，当给患者施用CLL-1-CD33 CAR T细胞时，这些细胞可能是同种异体的，而无需进行基因编辑。
在一些实施方案中，当将CLL-1-CD33 CAR T细胞施用给受试者时，细胞对于该受试者可以是同种异体的或自体的。在“异源”给药方法中，受试者从遗传上相似但不相同的供体接收细胞。优先选择，细胞对于受试者是自体的。在“异源”给药方法中，细胞优先选择来自亲戚，包括父母或兄弟姐妹或脐带血。在“异源”施用方法中，细胞已进行基因编辑或未进行基因编辑。
在特定的实施方案中，可以通过组合以下步骤中的至少一个或多个来实现CLL-1-CD33 cCAR消除白血病：
(1)淋巴去饱和预处理，可通过化学疗法与优选的药物：氟达拉滨和细胞毒素进行；
(2)用治疗剂量的CLL-1-CD33 cCAR消除受试者，哺乳动物的AML白血病；
(3)减少强烈的调理或非清髓性调理，并选用以下药物：ATG，Ara-C，氟达拉滨，细胞毒素；
(4)造血干细胞输注。
根据上述(2)所述的治疗剂量的CLL-1-CD33 cCAR T细胞消除AML白血病，其中至少一种治疗剂量选自每剂量约1-6x105/kg体重，每剂1-3x106/kg重量，每剂约1-7x106/kg重量。“公斤体重”是指个人的体重。
根据上述(3)所述的降低强度的调理或非清髓性调理，其中，所述药剂被用于消耗T细胞或CAR T细胞，以避免GVHD并破坏供体干细胞。
根据上述(4)的造血干细胞输注，其中所述造血干细胞可以是同种异体的或自体的。供体造血干细胞可获自匹配或不匹配的单个或脐带血。优先选择，从匹配的个体或亲戚或脐带血中收集供体造血干细胞。
CD123-CD33 cCAR
在本发明的另一个示例性案例研究中，患有AML的患者用化合物CAR工程化的细胞治疗，所述细胞具有对CD123具有选择性的第一嵌合抗原受体多肽和对CD33具有选择性的第二嵌合抗原受体多肽。
构建具有足够的转导效率(CAR T细胞的百分比)的CD123-CD33 cCAR，并证明了在体外和体内通过第一嵌合抗原受体多肽和第二嵌合抗原受体多肽对靶细胞的功能性选择性杀伤。CD123-CD33 cCAR(也称为CD123b-CD33b)具有能够在体外杀死其各自靶细胞的CAR单个单元的功能特性。然后将CD123-CD33 cCAR T细胞用于治疗患有AML的人类患者。
一名36岁的女性患者，被诊断患有AML胸腔积液。胸部CT扫描显示大量胸腔积液。胸腔积液的流式细胞仪分析显示33.6％的AML细胞。该患者对多种化疗方案均耐药。注入了CD123-CD33 cCAR T细胞。在第14天，胸部CT扫描显示积液消失，AML白血病细胞被完全消除(图67)。
此外，上述结果还令人惊讶，这是因为该技术教导了不使用CD33 CAR和CD123 CAR的单独/独立使用。尤其是，本领域教导了与这些抗原的个体靶向有关的重大毒性问题。
本领域普通技术人员不会组合CD33和CD123，因为本领域教导了这些抗原的单一靶向会导致靶上毒性和靶外毒性。因此，考虑到单独靶向CD33或CD123的问题，本领域普通技术人员将不会以同时靶向它们的化合物CAR工程化细胞的形式联合靶向它们
在本研究的一个示例性实施方案中，产生了一种化合物CAR工程细胞，其具有对BCMA具有选择性的第一嵌合抗原受体多肽和对CD19具有选择性的第二嵌合抗原受体多肽。该化合物CAR改造的细胞显示出在体外和体内可有效杀死具有BCMA和CD19细胞表面抗原的细胞。下面进一步描述该实施例。
BCMA-CD19 cCAR
构建了BCMA-CD19 cCAR(也称为BCMA-CD19b cCAR)(也称为CD269-CD19b)，并提供了足够的转导效率(CAR T细胞的百分比)，并证明了第一个嵌合抗原受体对靶细胞的功能性选择性杀伤。体内和体外多肽和第二个嵌合抗原受体多肽(图68)。
BCMA-CD19 cCAR构建体是一个双靶点的CAR，由一个完整的BCMA-CAR通过一个自我切割的P2A肽与一个完整的CD19-CAR融合而成，从而使这两个CAR受体分别在T细胞表面上独立表达。通过FACS测定的用BCMA-CD19 CAR慢病毒载体转导的活化T细胞的表达揭示了不同的转导细胞。
上述BCMA-CD19 cCAR工程改造的T细胞用于治疗具有高滴度的供体特异性抗体(DSA)的B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的人类患者，从而导致干细胞移植被排除在外作为治疗选择。
一名48岁的女性患者被诊断患有B-ALL。该患者对多种化疗方案均耐药。对于她而言，可能的治愈选择是骨髓干细胞移植。但是，患者的DSA滴度很高，因此当时将干细胞移植排除在治疗范围之外。从该患者血液中分离出T细胞，以产生BCMA-CD19 cCAR。BCMA-CD19cCAR T细胞的特征在于其CAR表达(图69A)和体外杀伤靶标(图69B和69C)，
用具有对BCMA选择性的第一嵌合抗原受体多肽和对CD19选择性的第二嵌合抗原受体多肽的cCAR工程细胞进行治疗后，患者在CAR T细胞后第14天表现出B-ALL的完全缓解。通过流式细胞术分析在骨髓和外周血中也检测不到正常的B细胞和浆细胞(图69D)。CAR后两周总IgM水平下降了80％。八种不同的DSA抗体滴度也显着降低。CAR后8周，所有检查的DSA抗体滴度均降低了约80％(图70)。
最终，该患者成功地成功植入了半单倍体骨髓干细胞，而没有移植排斥反应。
令人惊讶的是，观察到以下情况：1)BCMA-CD19 cCAR在白血病细胞，B细胞和浆细胞的耗竭中的首次人类使用；2)BCMA-CD19 cCAR能够完全根除白血病细胞；3)已证明BCMA-CD19 cCAR可以显着降低供体特异性抗体，从而防止移植排斥。4)针对CD19和BCMA抗原的BCMA-CD19 cCAR也表现出IgG，IgM，IgA和IgE的显着降低。
预期BCMA-CD19 cCAR可以在血液疾病之外应用，并有益于接受实体器官移植或治疗其他抗体介导的疾病(例如狼疮，多发性硬化症和与ANCA相关的自身免疫性疾病，包括显微镜性多血管炎(MPA))的患者肉芽肿和多血管炎(GPA)。自身免疫性疾病可用至少一种治疗剂量的BCMA-CD19 cCAR T或NK细胞治疗，其中至少一种治疗剂量选自每剂量约1-6x105/kg体重，1-3x106/每剂公斤体重，每剂约1-7x106/公斤体重。“公斤体重”是指个人的体重。
在一个实施方案中，本发明提供了一种BCMA-CD19 CAR工程改造的细胞，其包括分泌IL-15/IL-15sushi(SEQ ID NO.97)和相应的多核苷酸(SEQ ID NO.98)。
带IL-15/sushi的CAR
在本研究的一个示例性实施方案中，发现表达IL-15/IL-15的CD4 CAR(CD4 CARIL-15/IL-15sushi，也称为CD4 CAR VAC)可有效治疗患有无法治愈的人类患者。T细胞白血病，Sezary综合征。在这个特定的实施方案中，表达IL-5/IL-15sushi的CD4 CAR工程细胞在治疗患有Sezary综合征的患者中具有针对CD4阳性白血病和调节性T细胞(Treg)的嵌合抗原受体。Treg的重要功能之一是限制免疫反应和抗癌抑制的原因。IL-15通过促进T细胞和包括NK细胞在内的先天细胞的增殖促进其疫苗作用。已知IL-15具有非常短的生物学半衰期。我们添加sushi域以形成IL-15/IL-15sushi复合物的过程使该半衰期延长了十倍，从而导致了更长的持久性。
与对照组相比，CD4 CAR IL-15/IL-15sushi在小鼠中显示出生存益处和持久的持久性，并且在需要时并入带有利妥昔单抗(抗CD20抗体)的安全开关以终止CAR。CD4 CARIL-15/IL-15sushi已在小鼠体内中成功开发。前述发现表明，工程化的CD4 CAR IL-15/IL-15sushi靶向组织培养和小鼠动物中的CD4阳性白血病细胞。基于这些发现，然后使用CD4CAR IL-15/IL-15sushi治疗严重的Sezary综合征患者。
一名诊断为Sezary综合征的54岁患者已通过CD4 CAR IL-15/IL-15sushi T细胞疗法获得了完全缓解。入院前，他患有红皮病，瘙痒和皮肤鳞屑的症状已超过10年，并且对多种化疗方案均具有抵抗力。在开始CAR治疗之前，患者的全身皮肤中有80％以上的白血病细胞浸润的皮肤(图71A和71C)经皮肤活检证实(图71E)，骨髓和血液中含有50％的白血病细胞。在第0天，患者接受总剂量为3x10^6/kg的单剂量CAR T细胞。CAR治疗后第12天，患者已完全缓解，通过流式细胞术分析确定外周血中白血病细胞(CD3-CD4+细胞)的百分比降至零(图71G)。此外，Treg细胞被完全耗尽，正常的CD8+细胞迅速扩增(图71H)，随后是NK细胞(图71I)。有趣的是，Treg在CAR后第23天已完全耗尽(图72)。CAR后第28天，皮肤外观与治疗前相比发生了巨大变化。观察到明显的皮肤再生至正常外观(图71B，D)。骨髓流式细胞术证实不存在肿瘤细胞。此外，CAR治疗后多个部位的皮肤活检显示白血病浸润不存在(图71F)。患者随后出院，无需其他药物。患者仍处于分子缓解状态(超过6个月)。在整个治疗过程中，患者未出现C级II级CRS毒性感染。没有观察到其他毒性。CAR治疗后6个月以上，患者一直处于缓解状态。
令人惊讶的是，观察到以下情况：1)首次在人类中治疗了Sezary综合征，CD4 CAR不能治愈的白血病，该治疗方法没有为患者提供任何其他可能的治疗选择；2)CD4 CAR IL-15/IL-15sushi T细胞能够完全耗尽CD4+白血病细胞和Treg。3)发现CAR处理后CD8+细胞和NK细胞显着扩增，发现是出乎意料的；4)对CD4 CAR的毒性是可以控制的；5)新颖的方法为患者提供了其他可能的治疗选择。
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具体实施方案
以下为本发明具体实施例举例。
1.一种工程细胞，包括：
(i)第一嵌合抗原受体多肽，其包含第一抗原识别结构域，所述第一抗原识别结构域根据靶点选自CD38、GD2、CD123、CLL-1、CD19、CD33、BCMA、CS1、CD4、CD5、CD7和CD20组成的组；第一信号肽；第一铰链区；第一跨膜结构域；第一共刺激结构域；以及第一信令域；
(ii)从IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-18、IL-21、GM-CSF和TGF-组成的组中选择至少一种细胞因子；和
(iii)至少从CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL19、CXCL1、CXCL2、CXCL9、CXCL10、CCL21和CXCL12组成的组中选择一种趋化因子。
2.实施例1所述的工程细胞，当所述细胞因子为IL-7时，所述趋化因子不能为CCL19；当所述趋化因子为CCL19时，所述细胞因子不能为IL-7。
3.根据实施例1-2中任一实施例的工程细胞，其中所述抗原识别域选自CD19、CD20、CD4或CD38。
4.根据实施例1-2中任一实施例的工程细胞，其中所述抗原识别域选自对CD33、CLL-1BCMA、CS1、CD4、CD5、GD2或CD7。
5.根据实施例1-4中任一的实施例的工程细胞，其中所述至少一种细胞因子包含至少两种细胞因子。
6.根据实施例1-5中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述细胞因子为IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚；所述趋化因子为CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL19、CXCL1、CXCL2、CXCL9、CXCL10、CCL21或CXCL12。
7.根据实施例1-6中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述趋化因子为CCL19或CCL21。
8.根据实施例1-7中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述细胞因子为IL-15/IL-15sushi；所述趋化因子为CCL19或CCL21。
9.根据实施例1-8中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述细胞因子和趋化因子均由所述工程细胞分泌。
10.根据实施例1-9中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述抗原识别结构域选自CD19，所述细胞因子为IL-15/IL-15sushi和IL-12，所述趋化因子为CCL19。
11.根据实施例1-10中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述工程细胞为T细胞、NKT细胞、自然杀伤细胞或NK92细胞。
12.根据实施例1-11中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述细胞因子和趋化因子是异源表达的。
13.根据实施例1-12中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述细胞因子由所述工程细胞分泌。
14.根据实施例1-13中任一的实施例所述的工程细胞，其中所述趋化因子由所述工程细胞分泌。
15一种治疗细胞增殖疾病的方法，所述方法包括：向有需要的患者施用实施例1-14中任一的实施例的工程细胞。
16根据实施例15所述的方法，其中所述细胞增殖疾病包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓系白血病(CML)、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓增生性肿瘤(MPN)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，软组织肿瘤或实体瘤、癌或肉瘤。
17.根据实施例15和16中任一的实施例的方法，其中所述进一步的方法包括施用PD-L1抑制剂和CpG寡核苷酸(CpG ODN)中的至少一种。
18.根据实施例15-17中任一的实施例的方法，其中所述第一抗原识别结构域选自CD4，所述细胞因子为IL-15/IL-15sushi，所述趋化因子为CCL19；并且其中所述方法还包括施用PD-L1抑制剂和CpG ODN中的至少一种。
19.根据实施例18所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病为软组织肿瘤或实体肿瘤、癌或肉瘤。
20.一种治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的患者施用工程细胞，所述工程细胞包括：
(i)第一嵌合抗原受体多肽，其包含对选自CLL1的第一抗原识别结构域、第一信号肽、第一铰链区、第一跨膜结构域、第一共刺激结构域和第一信号结构域；以及
(ii)第二嵌合抗原受体多肽，其包含第二抗原识别结构域、第二信号肽、第二铰链区、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二信号结构域；以及
其中所述细胞增殖性疾病选自由急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性肿瘤(MPN)和慢性髓系白血病(CML)组成的组。
21.一种治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的患者施用工程细胞，其中所述工程细胞包括：
(i)一种第一嵌合抗原受体多肽，其包含选自BCMA的第一抗原识别结构域、第一信号肽、第一铰链区、第一跨膜结构域、第一共刺激结构域和第一信号结构域；以及
(ii)第二嵌合抗原受体多肽，其包含对选自CD19的第二抗原识别结构域、第二信号肽、第二铰链区、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二信号结构域。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述工程细胞进一步包含IL-15/IL-15sushi。
23.根据实施方案21-22中任一项的方法，其中所述自身免疫疾病选自：系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)，炎性肠病(IBD)，类风湿性关节炎，Sjgren综合征，皮肌病，自身免疫性溶血性贫血，视神经脊髓炎(NMO)，NMO频谱失调(NMOSD)，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，ANCA相关的自身免疫性疾病，包括显微镜性多血管炎(MPA))的患者肉芽肿和多血管炎(GPA)，韦格纳肉芽肿病，寻常型天疱疮(PV)，叶性天疱疮(PF)和已形成针对VIII因子的同种抗体的A型血友病的患者。
24.根据实施方案21-24中任一项的方法，其中所述自身免疫疾病是已经发展出针对因子VIII的同种抗体的A型血友病患者。
25.根据实施方案15-24中任一项的方法，其中所述工程细胞包括NK细胞，T细胞，NK92细胞，γδT细胞或NKT细胞。

Claims (25)

1.一种工程细胞，包括：
(i)第一嵌合抗原受体多肽，其包含对选自靶点的CD38，GD2，CD123，CLL-1，，CD33，BCMA，CS1，CD4，CD5，CD7和CD20的第一抗原识别域；第一信号肽；第一铰链区；第一跨膜结构域；第一共刺激域；第一信令域；
(ii)至少一种选自IL-2，IL-4，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-15/IL-15sushi，IL-15/IL-15sushi锚，IL-18，IL-21，GM-CSF和TGF-的细胞因子；和
(iii)选自CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL7，CCL8，CCL19，CXCL1，CXCL2，CXCL9，CXCL10，CCL21和CXCL12的至少一种趋化因子。
2.根据权利要求1所述的工程细胞，当细胞因子是IL-7时，趋化因子不能是CCL19；而当细胞因子是IL-7时，趋化因子不能是CCL19；当趋化因子为CCL19时，细胞因子不能为IL-7。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的工程细胞，其中所述抗原识别结构域对CD19，CD20，CD4或CD38具有选择性。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的工程细胞，其中所述抗原识别结构域对CD33，CLL-1BCMA，CS1，CD4，CD5，GD2或CD7具有选择性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的工程细胞，其中所述至少一种细胞因子包含至少两种细胞因子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的工程细胞，其中所述细胞因子是IL-15/IL-15sushi或IL-15/IL-15sushi锚，趋化因子是CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL7，CCL8，CCL19，CXCL1，CXCL2，CXCL9，CXCL10，CCL21或CXCL12。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的工程细胞，其中所述趋化因子是CCL19或CCL21。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的工程细胞，其中所述细胞因子是IL-15/IL-15sushi，趋化因子为CCL19或CCL21。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程细胞，其中所述细胞因子和趋化因子均由所述工程细胞分泌。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的工程细胞，其中所述抗原识别结构域对CD19具有选择性，所述细胞因子是IL-15/IL-15sushi锚和IL-12，并且所述趋化因子是CCL19。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的工程细胞，其中所述工程细胞是T细胞，NKT细胞，天然杀伤细胞或NK92细胞。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的工程细胞，其中所述细胞因子和趋化因子是异源表达的。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的工程细胞，其中所述细胞因子由所述工程细胞分泌。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的工程细胞，其中所述趋化因子由所述工程细胞分泌。
15.一种治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括：向有需要的患者施用根据权利要求1-14中任一项的工程细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞增殖疾病包括B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，慢性骨髓性白血病(CML)，急性骨髓瘤白血病(AML)，骨髓增生异常综合症(MDS)，慢性骨髓增生性肿瘤(MPN)，B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，软组织肿瘤或实体瘤，癌瘤或肉瘤。
17.根据权利要求15和16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用PD-L1抑制剂和CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)中的至少一种。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述第一抗原识别结构域对CD4具有选择性，所述细胞因子是IL-15/IL-15sushi，并且所述趋化因子是CCL19，并且其中所述方法进一步包括施用PD-L1抑制剂和CpG ODN中的至少一种。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞增生性疾病是软组织肿瘤或实体瘤，癌或肉瘤。
20.一种治疗细胞增生性疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的患者施用工程细胞，该工程细胞包括：
(i)第一嵌合抗原受体多肽，其包含对CLL1具有选择性的第一抗原识别结构域，第一信号肽，第一铰链区，第一跨膜结构域，第一共刺激结构域和第一信号结构域；和
(ii)第二嵌合抗原受体多肽，其包含对CD33具有选择性的第二抗原识别域，第二信号肽；第二铰链区，第二跨膜结构域，第二共刺激结构域和第二信号传导结构域；和
其中所述细胞增生性疾病选自急性髓性白血病(AML)，骨髓痉挛综合征(MDS)，骨髓增生性肿瘤(MPN)和慢性髓性白血病(CML)。
21.一种治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的患者施用工程细胞，其中所述工程细胞包括：
(i)第一嵌合抗原受体多肽，其包含对BCMA具有选择性的第一抗原识别结构域，第一信号肽，第一铰链区，第一跨膜结构域，第一共刺激结构域和第一信号结构域；和
(ii)第二嵌合抗原受体多肽，其包含对CD19具有选择性的第二抗原识别结构域，第二信号肽，第二铰链区，第二跨膜结构域，第二共刺激结构域和第二信号传导结构域。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述工程细胞还包含IL-15/IL-15sushi。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病选自：系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)，炎性肠病(IBD)，类风湿性关节炎，Sjgren综合征，皮肌病，自身免疫性溶血性贫血，视神经脊髓炎(NMO)，NMO频谱失调(NMOSD)，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，ANCA相关的自身免疫性疾病，包括显微镜性多血管炎(MPA))的患者肉芽肿和多血管炎(GPA)，韦格纳肉芽肿病，寻常型天疱疮(PV)，叶性天疱疮(PF)和已形成针对VIII因子的同种抗体的A型血友病A的患者。
24.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述自身免疫疾病是已经发展出针对因子VIII的同种抗体的A型血友病患者。
25.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中，所述工程细胞包括NK细胞，T细胞，NK92细胞，γδT细胞或NKT细胞。
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