CN116333172A - 融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种融合蛋白及其应用，融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域，细胞外抗原结合结构域包括特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段和特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段；特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO.1或其变体所示的序列以及SEQ ID NO.2或其变体所示的序列；特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO.3或其变体所示的序列以及SEQ ID NO.4或其变体所示的序列。本申请的融合蛋白，用于肝癌的治疗，能有效减少肿瘤细胞的抗原逃逸，增强T细胞的杀伤效果。

Description

融合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及癌症治疗技术领域，具体而言，涉及一种融合蛋白及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法是一种过继性细胞免疫疗法，它是利用基因技术，在T细胞内导入一个可以将CAR表达于其表面的融合基因，并使T细胞发挥作用，克服肿瘤局部免疫抑制微环境，打破宿主免疫耐受状态，靶向杀伤肿瘤细胞。
近些年来，CAR-T在临床肿瘤治疗上取得了不错的成效，尤其是对血液系统恶性肿瘤的治疗。然而，CAR-T在治疗实体瘤方面仍存在挑战，例如，T细胞向肿瘤部位的转运通常受到很大限制；密集的血管和肿瘤相关成纤维细胞等结构抑制了T细胞的渗透等等。
如何提高CAR-T的实体瘤治疗效果是肿瘤免疫疗法的难点。
发明内容
为了解决上述问题，提高CAR-T对实体瘤的治疗效果，本申请的第一目的在于提供一种融合蛋白。
在一个实施例中，该融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域，细胞外抗原结合结构域包括特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段和特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段；
特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段包括第一轻链可变区和第一重链可变区；
特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段包括第二轻链可变区和第二重链可变区；
第一轻链可变区具有如SEQ ID NO.1或其变体所示的序列；
第一重链可变区具有如SEQ ID NO.2或其变体所示的序列；
第二轻链可变区具有如SEQ ID NO.3或其变体所示的序列；
第二重链可变区具有如SEQ ID NO.4或其变体所示的序列；
其中，变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在其中一个实施例中，变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加。
在其中一个实施例中，抗体或其抗原结合片段选自单链抗体。
在其中一个实施例中，特异性地结合B7H3的单链抗体具有SEQ ID NO.5所示的序列。
在其中一个实施例中，特异性地结合GC33的单链抗体具有SEQ ID NO.6所示的序列。
在其中一个实施例中，细胞外抗原结合结构域还包括铰链结构域，用于连接跨膜结构域和抗体或其抗原结合片段；
可选地，铰链结构域选自CD8α铰链区；
可选地，铰链结构域具有SEQ ID NO.7所示的序列。
在其中一个实施例中，融合蛋白还包括信号肽、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中的至少一种。
在其中一个实施例中，信号肽选自CD8α信号肽；
在其中一个实施例中，跨膜结构域选自CD8α跨膜结构区；
在其中一个实施例中，信号肽具有SEQ ID NO.8所示的序列
在其中一个实施例中，跨膜结构域具有SEQ ID NO.9所示的序列。
在其中一个实施例中，细胞内信号传导结构域包括4-1BB胞内共刺激域和CD3ζ信号传导域。
在其中一个实施例中，4-1BB胞内共刺激域具有SEQ ID NO.10所示的序列。
在其中一个实施例中，CD3ζ信号传导域具有SEQ ID NO.11所示的序列。
本申请的第二目的在于提供一种核酸分子，编码上述融合蛋白。
本申请的第三目的在于提供一种核酸构建体，包含上述核酸分子。
本申请的第四目的在于提供一种表达载体，表达上述融合蛋白、包含上述核酸分子或者包含上述核酸构建体。
本申请的第五目的在于提供一种细胞，分泌上述融合蛋白、包含上述核酸分子、包含上述核酸构建体或者包含上述表达载体。
在其中一个实施例中，细胞包括免疫细胞。
在其中一个实施例中，细胞包括T细胞。
本申请的第六目的在于提供一种试剂盒，包含上述核酸分子、上述核酸构建体或者上述表达载体。
在其中一个实施例中，试剂盒用于制备上述融合蛋白或上述细胞。
本申请的第七目的在于提供一种药物组合物，包含上述核酸分子、包含上述核酸构建体、包含上述载体或包含上述细胞，以及药学上可接受的辅料。
在其中一个实施例中，药物组合物还包含抗肿瘤活性药物。
在其中一个实施例中，抗肿瘤药物包括干扰素、白细胞介素-2和化疗药物中的至少一种。
在其中一个实施例中，抗肿瘤药物选自：表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇中的一种或多种。
本申请的第八目的在于提供上述融合蛋白、上述核酸分子、上述核酸构建体、上述载体、上述细胞、上述药物组合物中的至少一种在制备用于在受试者中预防或治疗或辅助治疗癌症、或延迟癌症进展、或降低或抑制癌症复发的药物中的用途。
在其中一个实施例中，癌症为肝癌。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1提供的B7H3-GPC3双特异性CAR(s-CAR)的结构示意图；
图2为本申请实施例5提供的CAR-T表达阳性率检测结果；
图3为本申请实施例5提供的CAR-T杀伤率检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
为了至少解决上述技术问题的至少一个，本申请的第一方面提供了一种融合蛋白，包括细胞外抗原结合结构域，细胞外抗原结合结构域包括特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段和特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段；
特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段包括第一轻链可变区和第一重链可变区；
特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段包括第二轻链可变区和第二重链可变区；
第一轻链可变区具有如SEQ ID NO.1或其变体所示的序列；
第一重链可变区具有如SEQ ID NO.2或其变体所示的序列；
第二轻链可变区具有如SEQ ID NO.3或其变体所示的序列；
第二重链可变区具有如SEQ ID NO.4或其变体所示的序列；
其中，变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；
可选地，变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加。
本申请中，“双特异性”是指分子(诸如抗体)特异性结合两个不同抗原的特性。
本申请中，“融合蛋白可”与“嵌合抗原受体”替换使用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”被定义为细胞表面受体，该细胞表面受体包含细胞外靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，全部这些结构域的组合是在单个蛋白质上非天然地一起存在。具体地包括其中细胞外结构域和细胞内信号传导结构域在单个受体蛋白质上非天然地一起存在的受体。本申请的嵌合抗原受体主要旨在与免疫细胞诸如T细胞一起使用。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被T细胞受体结合的任何试剂(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、它们的部分或它们的组合)分子。抗原也能够引起免疫应答。免疫应答的示例可涉及但不限于抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或这两者。技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可通过合成方式生成或者可来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。此类生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体、生物体、蛋白质/抗原的亚基、杀死或灭活的全细胞或溶解物。
“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”是指蛋白质的结合抗原的部分。抗原结合结构域可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程化的多肽，并且包括免疫球蛋白质的结合抗原的部分，诸如VH、VL、VH和VL，由一个VH结构域或一VL结构域组成的结构域抗体(dAb)，结合抗原的替代性支架，及包含抗原结合片段的多特异性蛋白质。抗原结合片段(诸如VH和VL)可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链表达的那些情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双链抗体。抗原结合片段也可以缀合至其它抗体、蛋白质、抗原结合片段或替代性支架缀合，支架可以是单特异性或多特异性的以工程化双特异性和多特异性蛋白质。
B7H3(又称CD276)是一种I型跨膜蛋白，属于B7家族的一种免疫调节蛋白，含有316个氨基酸，分子量约为45-66kDa。研究表明，B7-H3在适应性免疫中具有主要的抑制作用，抑制T细胞激活、增殖和效应细胞因子的释放，主要是IFN-γ和IL-2。由于其在肿瘤组织中过度表达，同时在正常组织中表达有限，并参与肿瘤微环境(TME)的形成和发展。B7H3在肝细胞癌中的表达率最高，可达91.8％。
GPC3全称Glypican-3，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，并通过细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定连接于细胞表面。在人体中，GPC3基因表达的GPC3蛋白在不同的发育时期和不同的组织中表达存在显著差异，如在胃癌、乳腺癌、卵巢癌等癌症中低表达或不表达，而在肝细胞癌中常处于过度表达。
本申请设计同时靶向B7H3和GPC3的双靶点CAR-T细胞，用于肝癌的治疗，相较于单靶点CAR-T细胞，覆盖了更多抗原，能有效减少肿瘤细胞的抗原逃逸，增强T细胞的杀伤效果。
一些实施方案中，上述抗体或其抗原结合片段为单链抗体。其中，单链抗体包括scFv、di-scFv和(scFv)2)中的至少一种。
一些具体实施方案中，特异性地结合B7H3的单链抗体具有SEQ ID NO.5所示的序列。
一些具体实施方案中，特异性地结合GC33的单链抗体具有SEQ ID NO.6所示的序列。
一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域还包括铰链结构域，用于连接跨膜结构域和抗体或其抗原结合片段。
一些实施方案中，铰链结构域选自CD8α铰链区。
一些具体实施方案中，铰链结构域具有SEQ ID NO.7所示的序列。
一些实施方案中，融合蛋白还包括信号肽、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中的至少一种。
一些实施方案中，信号肽选自CD8α信号肽；
一些实施方案中，跨膜结构域选自CD8α跨膜结构区。
一些具体实施方案中，信号肽具有SEQ ID NO.8所示的序列。
一些具体实施方案中，跨膜结构域具有SEQ ID NO.9所示的序列。
一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括4-1BB胞内共刺激域和CD3ζ信号传导域。
一些具体实施方案中，4-1BB胞内共刺激域具有SEQ ID NO.10所示的序列。
一些具体实施方案中，CD3ζ信号传导域具有SEQ ID NO.11所示的序列。
本申请的第二方面提供了一种核酸分子，编码上述融合蛋白。
本申请中，术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的用于在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。
因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同)和非编码链(其用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码该蛋白质，或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并型式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语“核苷酸序列”还可以包括内含子，其程度使得编码该蛋白质的核苷酸序列在一些型式中可以含有内含子。
本申请的第三方面提供了一种核酸构建体，包含上述核酸分子。
本申请中，术语“核酸构建体”，包含上述核酸分子(即上述融合蛋白的编码序列)，和对于在特定宿主细胞中表达经可操作地连接的编码序列(例如，编码产物的插入片段序列，即上述核酸分子)来说必需的合适的核酸序列。具体地，核酸构建体可以是质粒，包含上述核酸分子，以维持上述核酸分子的稳定性，实现在在特定宿主细胞中的表达和克隆。
本申请的第四方面提供了一种表达载体，表达上述融合蛋白、包含上述核酸分子或者包含上述核酸构建体。
本申请中，术语“表达载体”是指包含下述重组多核苷酸的载体：该重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括包装了上述核酸构建体的病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，用于在特定宿主细胞中表达上述融合蛋白。
本申请的第五方面提供了一种细胞，分泌上述融合蛋白、包含上述核酸分子、包含上述核酸构建体或者包含上述表达载体。
一些实施方案中，细胞包括免疫细胞。
一些实施方案中，细胞包括T细胞。
本申请中，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，并且在本文中同义使用。如本文所用，T细胞包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助性(Th)细胞，例如T辅助性1(Th1)或T辅助性2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞或T细胞的任何其他亚群。适用于特定实施方案的T细胞的其他例示性群体包括初始T细胞和记忆T细胞。还包括“NKT细胞”，是指表达半不变αβT细胞受体但也表达通常与NK细胞相关联的多种分子标志物(诸如NK1.1)的特化T细胞群。NKT细胞包括NK1.1+细胞和NK1.1-细胞，以及CD4+细胞、CD4-细胞、CD8+细胞和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR的独特之处在于它识别由MHCI样分子CDId递呈的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可具有保护作用或有害作用。还包括“γ-δT细胞(γδT细胞)”，是指特化的群体，即在其表面上具有独特TCR的T细胞的小子集，并且与其中TCR由被命名为α-TCR链和β-TCR链的两种糖蛋白链组成的大多数T细胞不同，γδT细胞中的TCR由γ-链和δ-链组成。γδT细胞可以在免疫监视和免疫调节中起作用，并且被发现是IL-17的重要来源且诱导强烈的CD8+细胞毒性T细胞应答。还包括“调节性T细胞”或“Treg”，其是指抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。Treg细胞通常是转录因子Foxp3阳性CD4+T细胞，并且还可以包括为产生IL-10的CD4+T细胞的转录因子Foxp3阴性调节性T细胞。
本申请的第六方面提供了一种试剂盒，包含上述核酸分子、上述核酸构建体或者上述表达载体。
一些实施方案中，试剂盒用于制备上述融合蛋白或上述细胞。
本申请的第七方面提供了一种药物组合物，包含上述核酸分子、包含上述核酸构建体、包含上述载体或包含上述细胞，以及药学上可接受的辅料。
一些实施方案中，药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如具有抗肿瘤活性的药物。
一些实施方案中，另外的药学活性剂是干扰素、白细胞介素-2或化疗药物。
一些实施方案中，另外的药学活性剂选自：表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇中的一种或多种。
本申请的第八方面提供了上述融合蛋白、上述核酸分子、上述核酸构建体、上述载体、上述细胞、上述药物组合物中的至少一种在制备用于在受试者中预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症、和/或延迟癌症进展、和/或降低或抑制癌症复发的药物中的用途。
本申请中，术语“受试者”是指动物。术语“受试者”和“患者”在本文中在提及受试者时可以互换使用。因此，“受试者”包括作为患者的正在治疗疾病或预防疾病的人。本文的方法可以用于治疗属于任何分类的动物受试者。此类动物的示例包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于啮齿目(order Rodentia)的哺乳动物(诸如小鼠和仓鼠)和兔形目(orderLogomorpha)的哺乳动物(诸如兔)。哺乳动物可以来自食肉目(order Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科动物(奶牛)和猪科动物(猪)，或者奇蹄目(order Perssodactyla)，包括马科动物(马)。哺乳动物可以是灵长目(order Primate)、四足猴目(order Ceboid)或猴目(order Simoid)(猴)，或者类人猿目(order Anthropoid)(人和猿)。
在一个具体实施方案中，哺乳动物是人。
本申请中，术语“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于身体中异常细胞的不受控制的生长。未受控制的细胞分裂和生长导致形成侵入相邻组织的恶性肿瘤，并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。“癌症”或“癌症组织”可包括肿瘤。
一些实施方案中，癌症为肝癌。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但本申请不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料，试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例构建了抗B7H3的嵌合抗原受体(B7H3单靶点的CAR)、抗GPC3的嵌合抗原受体(GPC3单靶点的CAR)和两个双特异性嵌合抗原受体(B7H3-GPC3双特异性CAR)，结构示意图见图1，嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列(Leader)，抗B7H3的单链抗体序列(anti-B7H3 scFv)或抗GPC3的单链抗体序列(anti-GPC3 scFv)或者B7H3-GPC3双特异性scFv，CD8α的铰链区(Hinge)和跨膜区序列(Transmembrane)，4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列。抗人B7H3抗体序列(克隆号H26B6)的氨基酸序列来源于专利号(CN202110213973)；抗人GPC3抗体(GC33克隆)的氨基酸序列来源于专利号US7919086B2。
H26B6-VL：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMQWYQQKPGLAPRLLIYDTS KLTSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK RTV(SEQ ID NO.1)；
H26B6-VH：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEW IGGINPNTGGTTYNQKFNGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRPY RDDGGFHWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.2)；
H26B6-scFv:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMQWYQQKPGLAPRLLIYDTSKLTSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKRTVGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEWIGGINPNTGGTTYNQKFNGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRPYRDDGGFHWYFDVWGQGTLVTVSS；
H26B6-CAR氨基酸序列:
MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMQWYQQKPGLAPRLLIYDTSKLTSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKRTVGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEWIGGINPNTGGTTYNQKFNGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRPYRDDGGFHWYFDVWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*；
H26B6-CAR核苷酸序列:
ATGGCTCTTCCAGTAACCGCTCTGTTGTTGCCCCTTGCTTTGCTTCTCCACGCTGCCAGGCCTGAGATCGTCCTCACCCAGTCCCCCGCAACCTTGAGTCTTTCACCAGGAGAGCGGGCAACCCTGAGTTGCAGTGCCTCAAGCAGCGTCTCCTATATGCAGTGGTACCAGCAGAAACCTGGTCTGGCCCCTAGACTGCT
TATCTACGACACTTCAAAGTTGACATCCGGAATCCCTGACCGGTTTTCTGG
CAGCGGCAGTGGCACCGATTTTACTCTCACCATAAGCAGACTGGAACCAG
AGGACTTCGCCGTCTACTATTGTCAACAGTGGTCTTCCAATCCCCTGACATT
CGGCGGAGGCACTAAGGTCGAGATCAAAAGAACTGTAGGTGGTGGAGGA
TCAGGAGGTGGAGGAAGTGGGGGCGGTGGAAGTGAAGTGCAGCTTGTCC
AGAGTGGCGCGGAAGTGAAAAAGCCAGGAGCAAGCGTGAAGGTGTCTTG
TAAGGCATCTGGCTATACGTTTACCGAGTACACCATGCATTGGGTGAGGCA
GGCACCAGGTCAGGGACTGGAATGGATCGGCGGAATCAATCCAAACACTG
GCGGCACTACTTACAATCAAAAGTTTAATGGTAGGGTGACTATGACTAGGG
ACACTTCTATATCCACAGCGTACATGGAGCTCAGCTCCTTGAGGAGTGAGG
ATACCGCCGTGTACTACTGCACCCGCCCTTATAGAGATGACGGGGGTTTTC
ACTGGTACTTCGATGTGTGGGGTCAGGGGACGCTCGTCACAGTTTCTTCAA
CCACAACCCCCGCTCCTAGACCTCCTACTCCTGCTCCAACTATTGCCTCCC
AACCACTTTCTCTCAGGCCAGAGGCCTGTAGACCAGCTGCAGGAGGAGCT
GTGCACACAAGGGGCCTGGACTTTGCATGCGACATTTACATCTGGGCCCCA
TTGGCGGGTACATGTGGAGTTCTTCTCCTGAGCCTCGTGATCACATTGTACT
GTAAAAGAGGCCGGAAAAAATTGCTGTATATCTTCAAACAGCCTTTTATGA
GGCCTGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGTAGGTTCCCA
GAGGAAGAGGAGGGCGGTTGCGAGCTGCGAGTGAAATTCTCCAGGAGCG
CAGATGCCCCCGCTTATCAGCAGGGCCAGAATCAGCTTTATAATGAACTGA
ACCTGGGACGGCGCGAGGAGTATGATGTGCTTGATAAAAGGCGGGGAAGA
GACCCCGAAATGGGTGGCAAACCTCGAAGAAAAAACCCTCAGGAGGGAC
TGTACAATGAATTGCAGAAGGATAAAATGGCCGAGGCCTATTCAGAGATCG
GAATGAAGGGCGAGAGGCGAAGGGGGAAGGGGCATGATGGACTTTATCA
GGGCCTGAGTACCGCCACAAAGGACACCTATGACGCGTTGCATATGCAGGCTCTGCCGCCACGCTAG；
GC33-VL:
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO.3)；
GC33-VH:
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.4)；
GC33-scFv:
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA；
GC33-CAR:
MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*；
GC33-CAR核苷酸序列:
ATGGCTTTGCCAGTTACTGCGTTGTTGCTGCCTCTTGCACTGCTGCTGCATGCAGCTCGACCCGATGTGGTGATGACTCAGACTCCCTTGTCTCTCCCAGTTAGCCTGGGAGACCAAGCCTCAATTTCCTGCCGAAGCTCCCAATCATTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCACTGGTATTTGCAGAAACCGGGGCAGTCTCCCAAACTTCTCATATACAAGGTGTCAAACCGGTTTTCAGGAGTTCCTGACAGATTTTCTGGAAGCGGATCAGGAACGGACTTCACCCTGAAAATTAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGCGTGTACTTTTGTAGCCAGAATACACACGTGCCTCCCACTTTCGGCTCCGGAACAAAGCTGGAGATAAAAGGAGGTGGCGGATCTGGTGGTGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGTTCTCAGGTGCAGCTCCAGCAATCAGGCGCCGAGCTTGTCAGACCAGGGGCTTCAGTCAAGCTGAGCTGTAAAGCCTCTGGGTACACTTTCACAGATTACGAAATGCATTGGGTGAAGCAAACACCCGTCCACGGGTTGAAATGGATTGGAGCGCTGGACCCCAAAACTGGCGACACTGCATATTCTCAGAAGTTCAAAGGAAAAGCTACTCTGACAGCCGACAAAAGTAGCAGTACGGCCTATATGGAGCTCCGGTCTCTGACTTCTGAGGACTCCGCTGTGTATTACTGCACCCGGTTTTACTCTTACACTTATTGGGGACAGGGTACACTCGTGACGGTTTCCGCCACCACAACACCTGCTCCTAGGCCACCAACACCAGCCCCTACTATCGCCAGCCAACCTCTCTCACTTCGCCCTGAAGCATGCAGACCAGCCGCTGGAGGGGCTGTTCACACAAGAGGACTGGACTTTGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCTGGTACCTGCGGAGTTCTGCTGCTGTCTCTGGTGATCACATTGTACTGTAAGAGAGGGCGGAAGAAACTTTTGTACATCTTCAAGCAACCATTCATGAGACCTGTGCAGACCACTCAGGAAGAAGATGGGTGCAGTTGTCGATTTCCTGAAGAAGAGGAGGGGGGCTGCGAACTCAGAGTGAAGTTCTCACGGTCAGCAGACGCTCCCGCATACCAACAGGGCCAAAACCAGCTCTATAACGAACTGAATCTGGGGAGGCGCGAGGAGTACGATGTGCTCGATAAAAGACGGGGGAGAGATCCCGAGATGGGTGGCAAGCCACGCAGGAAGAATCCTCAGGAGGGCTTGTATAACGAGCTGCAAAAGGATAAAATGGCCGAAGCCTATAGTGAGATTGGAATGAAAGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGTCACGATGGTTTGTACCAGGGCTTGTCTACGGCTACCAAAGATACGTACGATGCACTTCATATGCAAGCCCTGCCTCCTCGGTAG；
B7H3-GPC3双特异性CAR(s-CAR)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMQWYQQKPGLAPRLLIYDTSKLTSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKRTVGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEWIGGINPNTGGTTYNQKFNGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRPYRDDGGFHWYFDVWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*；
B7H3-GPC3双特异性CAR(s-CAR)核苷酸序列：
ATGGCTTTGCCCGTTACTGCTCTTCTCTTGCCACTTGCTTTGTTGCTGCACGCAGCACGCCCCGAGATTGTTCTGACTCAGTCCCCCGCCACCTTGAGTCTTAGCCCAGGAGAGAGGGCCACTCTCAGCTGTTCAGCTTCAAGTTCTGTGAGTTACATGCAATGGTACCAGCAGAAGCCCGGTCTGGCCCCAAGACTGCTGATCTATGATACGAGCAAGCTCACTAGCGGCATTCCTGATCGGTTTAGTGGCTCAGGCTCTGGAACCGACTTTACTCTGACTATTAGTAGGTTGGAACCCGAGGATTTCGCAGTTTACTACTGCCAGCAGTGGTCATCTAACCCTCTCACATTCGGCGGTGGAACTAAGGTGGAGATCAAAAGGACTGTGGGAGGAGGAGGAAGTGGTGGGGGTGGTAGTGGTGGAGGAGGATCTGAGGTTCAGTTGGTTCAGTCAGGAGCTGAGGTGAAAAAACCCGGCGCGTCCGTCAAAGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACTTTCACTGAGTACACAATGCATTGGGTGCGGCAGGCTCCAGGACAAGGACTGGAATGGATCGGTGGGATCAATCCTAACACCGGTGGAACCACATATAACCAGAAGTTTAACGGTAGGGTGACCATGACACGCGACACGAGCATCTCCACCGCATACATGGAATTGAGCTCCCTTCGGAGTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCACAAGGCCCTACCGGGACGATGGTGGTTTTCATTGGTATTTTGATGTTTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACAGTGTCCTCCG
GGAGTACCTCAGGTTCAGGTAAGCCTGGCAGCGGCGAAGGGTCAACTAAG
GGACAGGTGCAACTCCAACAGAGCGGAGCTGAACTCGTGAGGCCTGGGG
CTAGTGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCGTCTGGCTACACGTTTACCGACTATG
AGATGCACTGGGTGAAGCAGACACCCGTGCACGGCTTGAAGTGGATTGGC
GCACTGGACCCTAAGACTGGAGACACCGCGTACAGCCAGAAATTTAAAGG
CAAAGCAACCCTGACCGCGGACAAGAGTAGCAGTACAGCCTATATGGAAC
TGCGCTCCCTCACGAGTGAGGATTCAGCTGTGTATTATTGCACCAGGTTCT
ACTCCTACACTTATTGGGGACAGGGAACATTGGTGACTGTATCAGCAGGTG
GAGGCGGTTCAGGAGGTGGAGGATCAGGTGGCGGTGGTAGTGATGTGGTG
ATGACCCAGACACCTCTCAGCTTGCCTGTGAGCCTGGGCGATCAAGCCTC
AATATCATGCCGGTCCAGCCAGTCCCTCGTCCATAGTAACGGTAATACTTAT
TTGCACTGGTACCTCCAAAAGCCAGGCCAGAGCCCTAAGCTGTTGATCTAT
AAAGTGTCTAATAGGTTTAGCGGAGTTCCTGATAGGTTCTCCGGATCAGGA
AGCGGCACAGATTTCACTCTCAAAATATCTCGGGTGGAGGCCGAAGATCTC
GGAGTTTACTTTTGTTCCCAGAACACACACGTTCCTCCAACCTTCGGTTCA
GGAACCAAGCTGGAGATCAAGACTACTACCCCTGCTCCCAGACCTCCTAC
TCCTGCCCCTACCATCGCCTCTCAGCCACTTTCCCTGCGACCTGAAGCATG
TAGACCTGCTGCTGGTGGGGCTGTACATACTCGCGGCCTCGACTTCGCCTG
CGACATTTATATTTGGGCGCCACTCGCTGGCACTTGTGGAGTACTGCTGCT
GAGTTTGGTTATCACGCTGTACTGTAAGCGGGGGAGAAAAAAACTGCTGT
ATATTTTCAAGCAGCCTTTTATGAGACCCGTCCAAACCACCCAGGAGGAGG
ATGGTTGCTCCTGCCGATTCCCTGAAGAGGAAGAAGGCGGGTGCGAACTG
AGGGTTAAGTTCTCACGGAGCGCCGATGCTCCAGCCTATCAACAGGGGCA
GAACCAGCTGTATAACGAATTGAACCTCGGGCGCCGCGAGGAATACGACG
TTCTTGATAAGAGACGAGGGCGCGATCCTGAGATGGGGGGAAAACCCAGA
AGAAAGAATCCACAAGAGGGCCTGTACAATGAGTTGCAAAAAGATAAGAT
GGCAGAAGCATACAGCGAGATCGGCATGAAAGGTGAGAGAAGACGGGGA
AAGGGGCACGACGGACTGTACCAGGGCTTGAGTACAGCCACCAAAGATACCTATGATGCACTGCATATGCAAGCACTGCCACCACGC；
特异性结合H26B6的scFv：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMQWYQQKPGLAPRLLIYDTSKLTSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKRTVGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEWIGGINPNTGGTTYNQKFNGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRPYRDDGGFHWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.5)；
特异性结合GC33的scFv：
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO.6)。
B7H3-GPC3双特异性CAR各部分序列具体如下：
CD8α信号肽(leader)的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：MALPVTALLLPLALLLHAARP；
CD8α铰链区(hinge)的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；
CD8α跨膜区(TM)的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；
4-1BB胞内共刺激域(ICD)的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；
CD3ζ信号传导域的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
实施例2
本实施例提供了一种用于表达实施例1的嵌合抗原受体的核酸构建体，其具体构建步骤如下：
(1)根据CAR基因的蛋白理论序列，优化CAR基因，使其能够在人细胞中高效表达，通过密码子优化及全基因合成方法制备CAR基因，在广州艾基生物技术有限公司进行全基因合成；
(2)用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR基因和空载体pCDH-EF1-MCS,于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；
(3)pCDH-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接
连接体系如表9所示：
表9
Figure BDA0004208968180000211
Figure BDA0004208968180000221
连接步骤：于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μL转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。
实施例3
本实施例提供了采用四质粒系统对实施例2中的核酸构建体进行慢病毒包装的表达建体，具体包装步骤如下：
(1)四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及实施例2构建的核酸构建体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，DNA含量为2μg/mL；
(2)将上述质粒与PEI转染试剂混合，加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h；
(3)6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。
实施例4
本实施例提供了利用实施例3中的慢病毒表达载体制备的CAR-T细胞，具体制备步骤如下：
分离PBMC后，用含50ng/mL的OKT3，300IU/mL的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养；利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率，将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内，放于37℃细胞培养箱2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，放于37℃细胞培养箱0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000×g，离心2h；弃上清，加入1×106的激活后的PBMC细胞，1000×g，离心10min，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养。每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持0.5×106-1×106/mL，连续培养8天。用美国Countstar IC1000自动细胞计数仪计数，评估CAR-T细胞的扩增情况。结果发现，各CAR-T组扩增良好，没有显著区别。
实施例5
本实施例提供了CAR-T细胞的表达及其功能评估结果，具体步骤如下：
采用流式细胞仪检测CAR-T细胞表面CAR分子的表达及其与对应抗原蛋白的结合能力，利用APC-anti-CD3抗体标记T细胞群，然后用B7H3蛋白和GPC3蛋白(ACRO Biosystems公司)检测CAR表达阳性率，检测结果如图2所示。结果显示：B7H3(H26B6)CAR-T细胞CAR表达率为53.12％，GPC3(GC33)CAR-T细胞CAR表达率为69.64％。进一步检测B7H3-GPC3双特异性CAR-T(s-CAR-T)识别B7H3和GPC3抗原蛋白的能力，其阳性率分别为62.41％和74.15％，表明双特异性CAR-T能有效识别两种抗原。
用过表达荧光素酶基因的人肝癌细胞Hep3B作为靶细胞，进行杀伤试验。Hep3B铺板后，按1:1的效靶比共孵育6小时后，加入荧光素酶底物，在多功能酶标仪上检测细胞中的荧光素酶与底物反应的发光信号，检测结果如图3所示。结果显示，B7H3(H26B6)CAR-T细胞和GPC3(GC33)CAR-T细胞都能杀伤Hep3B，杀伤率分别为75.45％和78.81％。进一步检测B7H3-GPC3双特异性CAR-T(s-CAR-T)的杀伤能力，其杀伤率为96.11％，表明双特异性CAR-T比单靶点CAR-T的杀伤能力更强。
综上，B7H3-GPC3双特异性CAR-T能同时识别B7H3和GPC3抗原，相比单靶点CAR-T，双特异性CAR-T的杀伤能力更强。本实施例提供的B7H3-GPC3双特异性CAR-T在肝癌的治疗中具有极大的临床转化价值。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.融合蛋白，其特征在于，包括细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包括特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段和特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段；
所述特异性地结合B7H3的抗体或其抗原结合片段包括第一轻链可变区和第一重链可变区；
所述特异性地结合GC33的抗体或其抗原结合片段包括第二轻链可变区和第二重链可变区；
所述第一轻链可变区具有如SEQ ID NO.1或其变体所示的序列；
所述第一重链可变区具有如SEQ ID NO.2或其变体所示的序列；
所述第二轻链可变区具有如SEQ ID NO.3或其变体所示的序列；
所述第二重链可变区具有如SEQ ID NO.4或其变体所示的序列；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；
可选地，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为单链抗体；
可选地，特异性地结合B7H3的单链抗体具有SEQ ID NO.5所示的序列；
可选地，特异性地结合GC33的单链抗体具有SEQ ID NO.6所示的序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞外抗原结合结构域还包括铰链结构域；
可选地，所述铰链结构域选自CD8α铰链区；
可选地，所述铰链结构域具有SEQ ID NO.7所示的序列。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括信号肽、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中的至少一种；
可选地，所述信号肽选自CD8α信号肽；
可选地，所述跨膜结构域选自CD8α跨膜结构区；
可选地，所述信号肽具有SEQ ID NO.8所示的序列；
可选地，所述跨膜结构域具有SEQ ID NO.9所示的序列。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞内信号传导结构域包括4-1BB胞内共刺激域和CD3ζ信号传导域；
可选地，所述4-1BB胞内共刺激域具有SEQ ID NO.10所示的序列；
可选地，所述CD3ζ信号传导域具有SEQ ID NO.11所示的序列。
6.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～5任一项所述的融合蛋白。
7.核酸构建体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子。
8.表达载体，其特征在于，表达权利要求1～5任一项所述的融合蛋白、包含权利要求6所述的核酸分子或者包含权利要求7所述的核酸构建体。
9.细胞，其特征在于，分泌权利要求1～5任一项所述的融合蛋白、包含权利要求6所述的核酸分子、包含权利要求7所述的核酸构建体、或者包含权利要求8所述的表达载体；
可选地，所述细胞包括免疫细胞；
可选地，所述细胞包括T细胞。
10.试剂盒，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的核酸构建体或者权利要求8所述的表达载体；
可选地，所述试剂盒用于制备权利要求1～5任一项所述的融合蛋白或权利要求9所述的细胞。
11.药物组合物，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子、包含权利要求7所述的核酸构建体、包含权利要求8所述的载体、或者包含权利要求9所述的细胞，以及药学上可接受的辅料；
可选地，所述药物组合物还包含抗肿瘤活性药物；
可选地，所述抗肿瘤药物包括干扰素、白细胞介素-2和化疗药物中的至少一种；
可选地，所述抗肿瘤药物选自：表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇中的一种或多种。
12.权利要求1～5任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的核酸构建体、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的细胞、权利要求11所述的药物组合物中的至少一种在制备用于在受试者中预防、治疗或辅助治疗癌症、或延迟癌症进展、或降低或抑制癌症复发的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述癌症为肝癌。
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