CN115867294A - 嵌合抗原受体的新型构建体 - Google Patents

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car
extracellular
macrophages
cell
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M·克里钦斯基
N·米努托洛
N·安德森
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Kairisma Treatment Co
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Abstract

本公开涉及包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以及使用包含CAR的免疫细胞的方法。

Description

嵌合抗原受体的新型构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月4日提交的美国临时专利申请第63/034,873号、2020年6月26日提交的第63/044,934号和2020年9月24日提交的第63/082,584号的优先权和权益，将其内容通过引用完整并入本文。
背景技术
虽然已针对包括癌症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、系统性淀粉样变性、朊病毒病、心血管疾病、动脉粥样硬化和纤维化在内的许多疾病和病症研究了免疫疗法，但仍然需要解决已经遇到的功能限制。
因此，对于开发针对靶特异性抗原进行优化的新治疗方式存在着需要。
发明内容
在一个方面，本公开提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的修饰的免疫细胞，所述嵌合抗原受体包含：(a)胞外结构域、(b)跨膜结构域和(c)胞内结构域，其中所述免疫细胞包括巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。虽然已经开发了在多种细胞类型中的多种CAR并用于治疗多种适应症，但本公开包括这样的认识，即，使单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞中的CAR和/或效应子活性最大化需要使用定制的CAR组分。因此，本公开提供了这样的CAR和支持剂、部分和辅助组合物的几个实例，它们在治疗多种疾患的任何一种中特别有用，所述疾患包括例如中枢神经系统的各种癌症、疾病或病症(例如阿尔茨海默病、帕金森病和/或ALS)、心血管疾病、纤维化等。
在另一方面，本公开提供了修饰巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的方法，所述方法包括：向巨噬细胞、单核细胞或树突细胞递送包含一个或多个核酸序列的病毒载体，所述核酸序列编码：(a)胞外结构域、(b)跨膜结构域和(c)胞内结构域，其中所述病毒载体包装有至少一种Vpx蛋白，其中所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包括包含(a)至(c)的嵌合工程化受体(CAR)，并且其中所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体的修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出增加的CAR表达。
在一些实施方案中，病毒载体是或包括慢病毒载体。在一些实施方案中，以约1至约50的感染复数(MOI)递送病毒载体。在一些实施方案中，以约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的MOI递送病毒载体。
在一些实施方案中，相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体的修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出约20％、约30％、约40％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多增加的CAR表达。
在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出延长时间段的CAR表达。在一些实施方案中，CAR表达的延长的时间段为至少5天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天或更长。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出增加的效应子活性。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出增加的肿瘤杀伤能力或吞噬作用。
在一些实施方案中，相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体(例如，腺相关病毒载体(例如，Ad5载体，例如，Ad5f35))的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞未表现出对M1表型的极化增加。在一些实施方案中，相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体(例如，腺相关病毒载体(例如，Ad5载体，例如，Ad5f35))的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞未表现出M1表型的一种或多种标志物的表达增加。在一些实施方案中，M1表型的一种或多种标志物包括或为CD86、CD80、MHC II、IL-1R、TLR2、TLR4、iNOS、SOCS3、CD83、PD-L1、CD69、MHC I、CD64、CD32、CD16、IL1R、IFIT家族成员或ISG家族成员中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种。
在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出一种或多种炎性细胞因子的产生增加。在一些实施方案中，一种或多种炎性细胞因子包括或为TNFα、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-12、IL-18、IL-8、IL-2、IL-23、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-8、IL33、CCL3、CXCL12、CCL22、CCL4、CXCL10或CCL2中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种或12种。
在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出SIRPα活性降低。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包括使用一种或多种核酸内切酶使SIRPα缺失。在一些实施方案中，一种或多种核酸内切酶包括或为CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶中的一种或多种。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包括Cas9、Cas12a或C2c2。在一些实施方案中，已经用一种或多种抗SIRPα抗体处理修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含一种或多种抗SIRPα抗体。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含一种或多种下调SIRPα的siRNA。
在一些实施方案中，CAR的胞外结构域包含一个或多个抗原结合结构域和FcR胞外结构域，和/或CAR的跨膜结构域包含FcR跨膜结构域，和/或CAR的胞内结构域包含FcR胞内结构域。在一些实施方案中，CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域。在一些实施方案中，FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域中的一种或多种是或包括人FcR结构域。在一些实施方案中，FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域一起构成全长FcR。在一些实施方案中，FcR胞外结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。在一些实施方案中，FcR跨膜结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。在一些实施方案中，FcR胞内结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
在一些实施方案中，CAR的胞外结构域包含一个或多个抗原结合结构域和toll样受体(TLR)胞外结构域和/或CAR的跨膜结构域包含TLR跨膜结构域和/或CAR的胞内结构域包含TLR胞内结构域。在一些实施方案中，CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域。在一些实施方案中，TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域中的一种或多种是或包括人TLR结构域。在一些实施方案中，TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域一起构成全长TLR。在一些实施方案中，TLR胞外结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。在一些实施方案中，TLR跨膜结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。在一些实施方案中，TLR胞内结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含以下中的一者或多者：(d)一个或多个胞外前导结构域，(e)一个或多个胞外铰链结构域，和(f)一个或多个胞内共刺激结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞外前导结构域包括CD8胞外前导结构域。
在一些实施方案中，一个或多个胞外抗原结合结构域包括scFv、centyrin或darpin。
在一些实施方案中，一个或多个胞外铰链结构域包括CD28胞外铰链结构域、CD8a胞外铰链结构域或IgG4胞外铰链结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28、CD8a、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TRL1、TLR2、TLR3、TRL4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9跨膜结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包括一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包括CD3-ζ、FcRγ、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ALK、AXL、DDR2、EGFR、EphA1、INSR、cMET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR1、ROS1、RYK、TIE2、TRK、VEGFR、CD40、CD19、CD20、41BB、CD28、OX40、GITR、TREM-1、TREM-2、DAP12、MR、ICOS、MyD88、V/I/LxYxxL/V、SIRPa、CD45、Siglec-10、PD1、SHP-1、SHP-2、KIR-2DL、KIR-3DL、NKG2A、CD170、CD33、BTLA、CD32b、SIRPb、CD22、PIR-B、LILRB1、41BBL(TNFSF9)、CD27、OX40L、CD32b、CD11b、ITGAM、SLAMF7、CD206、CD163、CD209、Dectin-2、IL1R、IL2R、IL3R、IL4R、IL5R、IL6R、IL7R、IL8R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL13R、IL14R、IL15R、IL17R、IFNaR、IFNgR、TNFR、CSF1R、CSF2R、Dap10、CD36、Dectin-1、ICOSL和/或Syk胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包括至少一个胞内共刺激结构域。
在另一方面，本公开提供了包含本文所述的任何方面或实施方案的免疫细胞的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开提供了包含一个或多个核酸序列的核酸构建体(例如，病毒载体)，所述核酸序列编码：(a)胞外结构域、(b)跨膜结构域和(c)胞内结构域，其中所述核酸酸构建体编码包含(a)至(c)的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，核酸构建体还包含一个或多个核酸序列，所述核酸序列编码：(e)一个或多个胞外前导结构域，(f)一个或多个胞外铰链结构域，(g)一个或多个胞内共刺激结构域，(h)切割肽，和(i)一种或多种肽剂。在一些实施方案中，切割肽是或包括P2A、F2A、E2A或T2A肽。
在另一方面，本公开提供了包含本文所述的任何方面或实施方案的核酸构建体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开提供了包含通过本文所述的任何方面或实施方案的方法修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：向所述受试者递送治疗有效量的本文所述的任何方面或实施方案的药物组合物。
在另一方面，本公开提供了修饰免疫细胞的方法，所述方法包括：向免疫细胞递送包含一个或多个核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码：(a)胞外结构域、(b)跨膜结构域和(c)胞内结构域，其中所述修饰的免疫细胞包括包含(a)至(c)的嵌合工程化受体，并且其中所述修饰的免疫细胞包括巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。
在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出SIRPα活性降低。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含或表达至少一种CAR，所述CAR包含抗HER2 scFv、CD8铰链、CD8跨膜结构域或CD3-ζ胞内信号传导结构域中的一种、两种、三种或四种。在一些实施方案中，至少一种CAR包含CD8a信号肽。在一些实施方案中，将编码(a)-(c)的核酸构建体递送至修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包括用病毒载体转导。在一些实施方案中，病毒载体包括或为腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体或γ逆转录病毒载体)。在一些实施方案中，腺相关病毒载体包括或为Ad5载体(例如，Ad5f35病毒载体)。
在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包括使用一种或多种核酸内切酶使SIRPα缺失。在一些实施方案中，一种或多种核酸内切酶包括或为CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶中的一种或多种。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包括Cas9、Cas12a或C2c2中的一种或多种。在一些实施方案中，已经用一种或多种抗SIRPα抗体处理修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含一种或多种抗SIRPα抗体。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含一种或多种下调SIRPα的siRNA。
附图说明
附图仅用于说明目的，而不是限制。
图1A-1B是显示来自用本文所述的构建体(参见图8-44)转染的巨噬细胞的HER2表达的图。活细胞百分比和CAR：在选定样品(图1A)和所有样品(图1B)的点图中显示HER2表达。
图2A-2B是显示来自用本文所述的构建体(参见图8-44)转染的单核细胞的HER2表达的图。活细胞百分比和CAR：在选定样品(图2A)和所有样品(图2B)的点图中显示HER2表达。
图3A-3D是显示CAR巨噬细胞的CAR表达、CAR+百分比、活百分比和肿瘤杀伤能力的图。
图4A-4C是显示CFR和TAR巨噬细胞的嵌合FcR(CFR)和Toll样抗原受体(TAR)表达、CFR+和TAR+百分比以及活百分比的图。
图5A-5B是显示在巨噬细胞和CAR巨噬细胞与CD40配体(CD40L)一起孵育之后肿瘤杀伤能力(图5A)以及M1和M2标志物的表达诱导(图5B)的图。
图6A-6B是显示在巨噬细胞和CAR巨噬细胞与4-1BB一起孵育之后的肿瘤杀伤能力(图6A)以及M1和M2标志物的表达诱导(图6B)的图。
图7A-7B是显示在巨噬细胞和CAR巨噬细胞与4-1BB配体(4-1BBL)一起孵育之后的杀伤能力(图7A)以及M1和M2标志物的表达诱导(图7B)的图。
图8-117是包括以上这些图中所示的那些在内的示例性嵌合抗原受体(CAR)构建体的示意图。
图118是显示表达CAR029、CAR061、CAR062、CAR063、CAR064、CAR071、CAR072、CAR074、CAR074、CAR077、CAR078、CAR079、CAR080和CAR081的CAR巨噬细胞的活百分比的图。
图119是显示用CAR029、CAR061、CAR062、CAR063、CAR064、CAR071、CAR072、CAR074、CAR074、CAR077、CAR078、CAR079、CAR080和CAR081转染的巨噬细胞的CAR表达的百分比的图。
图120是显示用CAR029、CAR061、CAR062、CAR063、CAR064、CAR071、CAR072、CAR074、CAR074、CAR077、CAR078、CAR079、CAR080和CAR081转染的巨噬细胞的CAR表达的强度(MFI)的图。
图121A-121F显示了展示在用细胞因子处理之后的CAR巨噬细胞活力(图121A和图121C)、指示的表面标志物平均荧光强度(图121B、图121D、图121E和图121F)的示例图。
图122显示了展示在用干扰素细胞因子处理的巨噬细胞中CAR表达的持久性的示例图。
图123A和123B显示了展示在用CAR mRNA转染和用各种IFN-β浓度处理之后的CAR巨噬细胞活力、CAR表达以及M1标志物的平均荧光强度(图123A)和诱导(图123B)的示例性图。
图124A和124B显示了展示在用CAR mRNA电穿孔和用IFN-β处理之后两天(图124A)或七天(图124B)的CAR巨噬细胞M2和M1标志物平均荧光强度的示例性图。
图125A-125C显示了展示CAR巨噬细胞的抗肿瘤功能的示例图。图125A显示了用或不用各种浓度的IFN-β引发的用CAR mRNA转染的巨噬细胞的结果。图125B显示了用包含多种修饰的CAR mRNA转染并用IFN-β处理的巨噬细胞的结果。图125C显示了用CAR mRNA转染并用干扰素细胞因子处理的巨噬细胞的结果。
图126显示了展示用干扰素处理CAR巨噬细胞对细胞因子分泌的影响的示例图。
图127A-127C显示了展示用干扰素处理对巨噬细胞中的CAR mRNA持久性和CAR巨噬细胞功能性的持续时间的影响的示例图。
图127A显示了用干扰素细胞因子处理过的CAR巨噬细胞的活力和CAR表达测试的结果。图127B和图127C显示了与用CAR mRNA电穿孔并用干扰素细胞因子处理的巨噬细胞一起培养的癌细胞的肿瘤生长结果。
图128A-128C显示了展示用干扰素处理对巨噬细胞活力、CAR表达、M1标志物表达和CAR巨噬细胞功能性的影响的示例图。图128A显示了用CAR mRNA转染并用干扰素处理的巨噬细胞的活力、CAR表达和M1标志物表达。图128B和图128C显示了与用CAR mRNA电穿孔并用干扰素细胞因子处理的巨噬细胞一起培养的癌细胞的肿瘤杀伤结果。
图129显示了展示IFN-γ对转染的巨噬细胞的影响的示例图。
图130A-130C显示了展示RNA酶L抑制剂对CAR巨噬细胞的影响的示例图。图130A显示了在用IFN-γ和RNA酶L抑制剂舒尼替尼处理之后的转染的巨噬细胞中的mCherry表达。图130B显示了与用舒尼替尼处理的CAR巨噬细胞一起培养的癌细胞的肿瘤生长曲线。图130C显示了用舒尼替尼处理的CAR巨噬细胞的肿瘤杀伤活性。
图131显示了展示用编码mCherry的mRNA和编码RNA酶L抑制剂ABCE1的mRNA共转染的巨噬细胞的巨噬细胞活力和mCherry表达的示例性图。
图132是包含CD28铰链结构域的示例性CAR构建体的示意图。
图133A-133E是显示CAR巨噬细胞的CAR+百分比、CAR表达、活百分比和肿瘤杀伤能力的图。
图134是显示CAR巨噬细胞分泌TNFα和IL6的图。
图135是示例性CAR构建体的示意图。
图136是显示CAR构建体在以0-50的MOI用VPX慢病毒转导的和未转导的巨噬细胞中表达的图(CTX_001包含抗HER2 scFv、CD8铰链、CD8跨膜结构域和CD3-ζ信号传导结构域；图8)。将未转导(UTD)巨噬细胞用作对照。
图137是显示CTX_001在用VPX慢病毒以MOI 1、MOI 5和MOI 10经过30天转导的巨噬细胞中的活力(活的％)和CAR表达(CAR％)的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图138是显示使用α曲妥珠单抗-AF647的CTX_001在用VPX慢病毒以MOI 1、MOI 5和MOI 10经过4、7、15、22和29天转导的巨噬细胞中的表面蛋白表达的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图139是显示CTX_001在用VPX慢病毒以MOI 1、MOI 5和MOI 10经过30天转导的巨噬细胞中的活力(活的)和CAR表达(CAR+)的平均荧光强度(MFI)的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图140是显示CTX_001在用VPX慢病毒以MOI 1、MOI 5和MOI 10转导4天和7天之后的巨噬细胞中的杀伤功能的一系列图。效应巨噬细胞与靶肿瘤细胞的不同比率(E:T)为4:1、2:1、1:1、和1:2。积分强度指示肿瘤负荷。将肿瘤细胞和巨噬细胞共培养72小时之后的结果绘图。UTD巨噬细胞和没有巨噬细胞的AU565 HER2+乳腺癌细胞为对照。
图141A-141B是一系列图，其显示了如使用α曲妥珠单抗-AF647在以MOI 2和MOI 5用VPX慢病毒转导的巨噬细胞中评估的CTX_001和CTX_003(CAR包含抗HER2 scFv、CD8铰链和CD8跨膜结构域；图10)的表面蛋白表达(图141A)，并且显示了CTX_001和CTX_003在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导的巨噬细胞中的活力(活的％)和CAR表达(CAR％)(图141B)。将UTD巨噬细胞用作对照。
图142是显示如使用α曲妥珠单抗-AF647评估的CTX_001和CTX_003在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导的巨噬细胞中的活力(活的)和CAR表达(CAR+)的MFI的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图143是用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞的M2巨噬细胞标志物(CD163和CD206)和M1巨噬细胞标志物(CD80和CD86)的MFI的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图144是显示相对于如使用CD80和CD86评估的用Ad5f35转导的用VPX慢病毒转导的CTX_001巨噬细胞的M1极化的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图145是显示用VPX慢病毒或Ad5f35的转导的CTX_001巨噬细胞在转导后7天和转导后21天对SKOV3卵巢癌细胞的杀伤功能的一系列图。E:T的比率为4:1。将UTD巨噬细胞和没有巨噬细胞的SKOV3细胞用作对照。
图146是显示在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞经过72小时对AU565细胞的杀伤功能的一系列图。E:T的不同比率为4:1和1:2。将UTD巨噬细胞和没有巨噬细胞的AU565细胞用作对照。
图图147是显示在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞对SKOV3卵巢癌细胞的杀伤功能的一系列图。E:T的比率为4:1。将UTD巨噬细胞和没有巨噬细胞的SKOV3细胞用作对照。
图148是显示在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导并且在具有或没有板结合的HER2的情况下培养24小时的CTX001或CTX_003巨噬细胞的TNFα和IL-6产生的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图149是显示CTX_001和CTX_003在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5经过21天转导的巨噬细胞中的活力(活的％)和CAR表达(CAR+％)的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图150是显示如使用α曲妥珠单抗-AF647评估的CTX_001和CTX_003在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5经过21天转导的巨噬细胞中的活力(活的)和CAR表达(CAR+)的MFI的一系列图。将UTD巨噬细胞用作对照。
图151是显示在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞在转导后21天引发的并且经过72小时的对AU565细胞的杀伤功能的一系列图。E:T的不同比率为4:1和1:2。将UTD巨噬细胞用作对照。
图152是显示在用VPX慢病毒以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞在转导后21天引发的并且经过72小时的对SKOV3细胞的杀伤功能的一系列图。E:T的比率为4:1。将UTD巨噬细胞用作对照。
图153A-D是显示使用VPX慢病毒以MOI 2、5或10转导CD14+单核细胞与CTX_001之后的活力(图153A)、CAR表达百分比(图153B)、CAR表达的MFI(图153C)和CAR表达柱状图(图153D)的一系列图。将Ad5f35转导的CAR单核细胞和CAR巨噬细胞作为比较物显示。UTD巨噬细胞也被用作CAR表达柱状图的对照。
图154A-D是显示两个供体中的CTX_001巨噬细胞中的SIRPα敲除的一系列图，如通过SIRPα-APC％POS(图154A)和MFI(图154B)、流式细胞术(图154C)和细胞活力(图154D)评估的。核糖核蛋白(RNP)浓度为165、312、625和1250nM，流式细胞术除外(312和1250nm)。将未经处理的(NT)CAR巨噬细胞或仅Cas9用作对照。
图155A-D是一系列图，其显示了使用流式细胞术的用Cas9和gRNA靶向SIRPα的在CTX_001巨噬细胞中的SIRPα敲除(图155A)、CTX_001在使用流式细胞术的SIRPα敲除巨噬细胞中的表达(图155B)、SIRPα敲除CTX_001巨噬细胞对SKOV-3卵巢癌细胞经过12小时的吞噬作用(图155C)以及量化为曲线下面积的经过12小时测量的总吞噬作用(图155D)。将未经处理的(NT)CAR巨噬细胞、仅gRNA和UTD巨噬细胞用作对照。
图156A-D是一系列图，其显示了使用流式细胞术的用Cas9和gRNA靶向SIRPα的在CTX_001巨噬细胞中的SIRPα敲除(图156A)、CTX_001在使用流式细胞术的SIRPα敲除巨噬细胞中的表达(图156B)、SIRPα敲除CTX_001巨噬细胞对HCC-1954人乳腺癌细胞经过12小时的吞噬作用(图156C)以及量化为曲线下面积的经过12小时测量的总吞噬作用(图156D)。将NTCAR巨噬细胞、仅gRNA和UTD巨噬细胞用作对照。
图157A-E是一系列图，其显示了使用流式细胞术的用Cas9和gRNA靶向SIRPα的在来自不同供体细胞的CTX_001巨噬细胞中的巨噬细胞SIRPα敲除(图157A)、CTX_001在使用流式细胞术的SIRPα敲除巨噬细胞中的表达(图157B)、如标准化的肿瘤负荷指示的SIRPα敲除CTX_001巨噬细胞经过24小时对表达nuclight绿色荧光蛋白的SKOV-3细胞的杀伤(图157C)、基于清除50％靶肿瘤细胞所需小时数的肿瘤杀伤动力学(图157D)和经过12小时测量的总吞噬作用(图157E)。将NT CAR巨噬细胞、仅gRNA和UTD巨噬细胞用作对照。
定义
为了更容易理解本发明，下文首先定义了某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。将为了描述本发明的背景并提供关于其实践的额外细节而在本文中引用的出版物和其他参考材料通过引用并入本文。
本文使用冠词“一个”和“一种”(“a”和“an”)来指代一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“要素”意指一个要素或多一个要素。
大约或约：如本文所用的，当应用于一个或多个感兴趣的值时，术语“大约”或“约”是指与陈述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入陈述参考值的任一方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％(或更小)之内的值的范围，除非另有说明或另外地从上下文中显而易见(这样的数字超过可能值的100％的情况除外)。
活化：如本文所用的，术语“活化”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖或已被刺激以发挥其效应子功能的细胞的状态，所述细胞例如单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。活化还可与诱导的细胞因子产生、细胞因子分泌、吞噬作用、细胞信号传导(例如，基因表达变化)、靶细胞杀伤、代谢变化、炎症介质的产生、增殖、表观遗传重编程、巨噬细胞的表型转换(例如，M1极化)、促肿瘤或M2巨噬细胞的抑制、促肿瘤或M2巨噬细胞的表型转换和/或抗原加工和呈递相关联。
活化的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞：如本文所用的，术语“活化的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞”是指，除其他外，正在经历细胞分裂或发挥效应子功能的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞。术语“活化的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞”是指，除其他外，执行效应子功能或发挥在静息状态下未见的任何活性的细胞，所述功能或活性包括吞噬作用、细胞因子分泌、增殖、基因表达变化、代谢变化、炎症介质的产生、增殖、表观遗传重编程、巨噬细胞的表型转换(例如，M1极化)、促肿瘤或M2巨噬细胞的抑制、促肿瘤或M2巨噬细胞的表型转换以及其他功能。
剂：如本文所用的，术语“剂”(或“生物剂”或“治疗剂”)是指可由本文所述的修饰细胞表达、释放、分泌或递送至靶标的分子。剂包括但不限于核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其片段、抗体剂或其片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子(例如，小分子)、碳水化合物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、包括其中一种或多种的制剂或组合物及其任何组合。剂可以结合任何细胞部分，诸如受体、抗原决定簇或存在于靶标或靶细胞上的其他结合位点。剂可以扩散或被转运到细胞中，在那里它可以在胞内起作用。
抗体：如本文所用的，术语“抗体”是指包含足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域所知，在自然界中产生的完整抗体是大约150kD的四聚体试剂，其包含两个相同的重链多肽(每个约50kD)和两个相同的轻链多肽(每个约25kD)，它们彼此缔合成通常称为的“Y形”结构。每条重链包含至少四个结构域(每个长约110个氨基酸)，一个氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的尖端)，随后是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3(位于Y茎的基部)。称为“转换”的短区域将重链可变区和恒定区连接起来。“铰链”将CH2和CH3结构域连接至抗体的其余部分。这个铰链区中的两个二硫键将完整抗体中的两个重链多肽彼此连接起来。每条轻链包含两个结构域-一个氨基末端可变(VL)结构域，随后是羧基末端恒定(CL)结构域，两者通过另一个“转换”彼此分开。完整抗体四聚体包含两个重链-轻链二聚体，其中所述重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接起来，使得所述二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体通常在CH2结构域上也被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有特征为由两个β片层(例如，3-、4-或5-链片层)彼此相对地堆叠在压缩的反平行β桶中形成的“免疫球蛋白折叠”的结构。每个可变结构域含有被称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的三个高变环和四个在一定程度上不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成了为所述结构域提供结构框架的β片层，并且来自重链和轻链的CDR环区一起聚集在在三维空间中，使得它们产生位于Y结构尖端的单个超变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区与补体系统的元件结合，并且也与效应细胞上的受体结合，所述效应细胞包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域已知的，可以通过糖基化或其他修饰来调节Fc区对Fc受体的亲和力和/或其他结合属性。在一些实施方案中，根据本公开产生和/或利用的抗体(例如，作为CAR的组分)包含糖基化Fc结构域，包括具有修饰或工程化的糖基化的Fc结构域。在一些实施方案中，包含如在天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物均可称为和/或用作“抗体”，无论这样的多肽是天然产生的(例如，由生物体对抗原作出反应而生成)还是通过重组工程化、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，抗体是多克隆的。在一些实施方案中，抗体是单克隆的。在一些实施方案中，抗体具有具备小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特征的恒定区序列。在一些实施方案中，如本领域已知的，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。而且，如本文所用的，术语“抗体”在适当的实施方案(除非另有说明或从上下文显而易见)中可以指在替代表示中利用抗体结构和功能特征的任何本领域已知或开发的构建体或形式。例如，在一些实施方案中，根据本发明利用的抗体的形式选自但不限于完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，
Figure BDA0004047565970000171
等)；抗体片段，诸如Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其组；单链Fv；多肽-Fc融合物；单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体，诸如IgNAR或其片段)；骆驼科(cameloid)抗体；掩蔽抗体(例如，
Figure BDA0004047565970000172
)；小模块免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双抗体
Figure BDA0004047565970000173
VHH；
Figure BDA0004047565970000174
微型抗体；
Figure BDA0004047565970000175
锚蛋白重复蛋白或
Figure BDA0004047565970000176
DART；TCR样抗体；
Figure BDA0004047565970000181
微蛋白；
Figure BDA0004047565970000182
和
Figure BDA0004047565970000183
在一些实施方案中，抗体可能缺乏在天然产生条件下所具有的共价修饰(例如，聚糖的附接)。在一些实施方案中，抗体可含有共价修饰(例如，聚糖、有效负载(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)或其他侧基(例如，聚乙二醇等)的附接)。
抗体剂：如本文所用的，术语“抗体剂”是指与特定抗原特异性结合的剂。在一些实施方案中，术语涵盖包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体剂包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体剂可包括作为小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特征的一个或多个恒定区序列。在一些实施方案中，抗体剂可包括如本领域已知的人源化、灵长类化、嵌合等的一个或多个序列元件。在许多实施方案中，术语“抗体剂”用来指用于在替代表示中利用抗体结构和功能特征的本领域已知或开发的构建体或形式中的一种或多种。例如，在一些实施方案中，根据本发明利用的抗体剂的形式选自但不限于完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，
Figure BDA0004047565970000184
等)；抗体片段，诸如Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其组；单链Fv；多肽-Fc融合物；单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体，诸如IgNAR或其片段)；骆驼科(cameloid)抗体；掩蔽抗体(例如，
Figure BDA0004047565970000185
)；小模块免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双抗体
Figure BDA0004047565970000186
VHH；
Figure BDA0004047565970000187
微型抗体；
Figure BDA0004047565970000188
锚蛋白重复蛋白或
Figure BDA0004047565970000189
DART；TCR样抗体；
Figure BDA00040475659700001810
Figure BDA00040475659700001811
微蛋白；
Figure BDA00040475659700001812
和
Figure BDA00040475659700001813
在一些实施方案中，抗体剂可能缺乏在天然产生条件下所具有的共价修饰(例如，聚糖的附接)。在一些实施方案中，抗体剂可含有共价修饰(例如，聚糖、有效负载(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)或其他侧基(例如，聚乙二醇等)的附接)。在许多实施方案中，抗体剂是或包括其氨基酸序列包括本领域技术人员识别为互补决定区(CDR)的一个或多个结构元件的多肽；在一些实施方案中，抗体剂是或包含其氨基酸序列包括与在参考抗体中发现的CDR基本相同的至少一个CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)的多肽。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，它在序列上相同或含有1-5个氨基酸取代。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为它显示出与参考CDR至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为它显示出与参考CDR至少96％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内至少一个氨基酸被缺失、添加或取代，但是所包括的CDR具有与参考CDR的氨基酸序列原本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但是所包括的CDR具有与参考CDR原本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内至少一个氨基酸被取代，但是所包括的CDR具有与参考CDR的氨基酸序列原本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但是所包括的CDR具有与参考CDR原本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体剂是或包含其氨基酸序列包括本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件的多肽。在一些实施方案中，抗体剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源的结合结构域的多肽蛋白。在一些实施方案中，抗体剂不是/或不包含其氨基酸序列包括本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件的多肽。在一些实施方案中，抗体剂可以是或包含不包括免疫球蛋白结构元件的分子或组合物(例如，包括至少一个抗原结合结构域的受体或其他天然存在的分子)。
抗体片段：如本文所用的，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体以及它们的人和人源化版本。
抗体重链：如本文所用的，术语“抗体重链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较大的一种。
抗体轻链：如本文所用的，术语“抗体轻链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较小的一种。
合成抗体：如本文所用的，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，例如由本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为表示通过合成编码所述抗体的DNA分子或指定所述抗体的氨基酸序列而生成的抗体，其中DNA分子表达抗体蛋白，其中已经使用本领域可用且公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得所述DNA或氨基酸序列。
抗原：如本文所用的，术语“抗原”或“Ag”是指能够激发免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体的产生或特定免疫活性细胞的活化，或两者兼而有之。技术人员将理解的是，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽在内，都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解的是，包含编码引出免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA编码如同本文所用术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解的是，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引出期望的免疫应答。而且，技术人员将理解的是，抗原根本不必由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
抗肿瘤作用：如本文所用的，术语“抗肿瘤作用”是指可表现为肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加或与癌症状况相关的各种生理症状的改善的生物学作用。“抗肿瘤作用”还可以表现为本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先阻止肿瘤发生的能力。
自体的：如本文所用的，术语“自体的”是指源自个体的随后被重新引入到同一个体中的任何材料。
同种异体的：如本文所用的，术语“同种异体的”是指源自同一物种的不同动物的移植物(例如，细胞群)。
异种的：如本文所用的，术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物(例如，细胞群)。
癌症：如本文所用的，术语“癌症”是指其特征在于异常细胞快速且不受控制地生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在某些实施方案中，癌症是甲状腺髓样癌。
保守序列修饰：如本文所用的，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入与各种实施方案相容的抗体中。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的抗体结合抗原的能力。
共刺激配体：如本文所用的，术语“共刺激配体”是指在抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性地结合单核细胞/巨噬细胞/树突细胞上的同源共刺激分子，从而提供介导单核细胞/巨噬细胞/树突细胞细胞应答的信号，所述应答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性地结合的配体。共刺激配体还包括，除其他外，与存在于单核细胞/巨噬细胞/树突细胞上的共刺激分子特异性地结合的抗体，所述共刺激分子例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。
细胞毒性的：如本文所用的，术语“细胞毒性的”或“细胞毒性”是指杀死或破坏细胞。在一个实施方案中，代谢增强的细胞的细胞毒性得到改善，例如巨噬细胞的溶细胞活性增加。
有效量：如本文所用的，“有效量”和“治疗有效量”是可互换的，并且是指如本文所述有效实现特定生物学结果或提供治疗或预防益处的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于通过本领域任何适合的方式确定的抗肿瘤活性。
效应子功能：如本文所用的，“效应子功能”或“效应子活性”是指由免疫细胞响应于免疫细胞的刺激而执行的特异性活性。例如，巨噬细胞的效应子功能通过吞噬作用吞噬和消化细胞碎片、外来物质、微生物、癌细胞和其他不健康细胞。
编码：如本文所用的，“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性，所述特定核苷酸序列用作模板，用于在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的其他聚合物和大分子。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生一种蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。两条编码链(与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列)以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
内源的：如本文所用的“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部的或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
外源的：如本文所用的，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入的或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
扩大：如本文所用的，术语“扩大”是指数量增加，如单核细胞/巨噬细胞的数量增加。在一个实施方案中，相对于培养物中最初存在的数量，离体扩增的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的数量增加。在另一个实施方案中，相对于培养物中的其他细胞类型，离体扩增的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的数量增加。如本文所用的，术语“离体”是指已从活的生物体(例如，人)中移出并在生物体外部(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
表达：如本文所用的，术语核酸序列的“表达”是指从核酸序列生成生任何基因产物。在一些实施方案中，基因产物可以是转录物。在一些实施方案中，基因产物可以是多肽。在一些实施方案中，核酸序列的表达涉及以下中的一者或多者：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
表达载体：如本文所用的，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与要表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括掺入了重组多核苷酸的本领域中所有已知的载体，例如粘粒、质粒(例如裸质粒或包含在脂质体中的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(例如，Ad5载体，例如，Ad5f35))。
同源性：如本文所用的，术语“同源性”是指在聚合物分子之间，例如在核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少为25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％相同，则它们被认为彼此“同源”。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少为25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％相似(例如，在相应位置含有具有相关化学性质的残基)，则它们被认为彼此“同源”。如本领域技术人员将理解的，允许比较序列以便确定它们的同源性程度的多种算法是可用的，包括通过当考虑不同序列中哪些残基彼此“对应”时允许在一个序列中存在相对于另一个序列的指定长度的空位。为了最佳比较目的，例如，可以通过比对两个序列来执行两个核酸序列之间的同源性百分比的计算(为了最佳比对，例如，可以在第一和第二核酸序列的一者或两者中引入空位，并且为了比较的目的，可以忽略非对应序列)。在某些实施方案中，为了比较目的，被比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比较在对应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，则在该位置的分子是相同的；当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置相似的核苷酸占据时，则在该位置的分子是相似的。考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同源性百分比是所述序列所共有的相同和相似位置的数目的函数。
同一性：如本文所用的，术语“同一性”是指在两个聚合分子之间，特别是在两个氨基酸分子之间，诸如在两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基时；例如，如果两个多肽分子的每一个中的一个位置被一个精氨酸占据，那么它们在该位置上是相同的。两个氨基酸序列在比对中的相同位置具有相同残基的同一性或程度通常以百分比表示。在两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或相同位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，聚合物中十个氨基酸长度的五个位置)是相同的，则所述两个序列是50％相同的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或相同，则所述两个氨基酸序列是90％相同的。
基本同一性：如本文所用的，术语“基本同一性”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在对应位置含有相同的残基，则它们通常被认为是“基本上相同的”。如本领域公知的，可以使用多种算法中的任何一种来比较氨基酸或核酸序列，包括商业计算机程序中可用的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。在一些实施方案中，如果两个序列在相关残基段上至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或它们更多的对应残基是相同的，则它们被认为是是基本上相同的。在一些实施方案中，相关段是完整序列。在一些实施方案中，所述相关段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。在CDR的背景下，提及“基本同一性”通常是指具有与参考CDR至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。
免疫球蛋白：如本文所用的，术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指发挥抗体作用的一类蛋白质。B细胞表达的抗体有时称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。这类蛋白质包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的一级抗体，所述分泌物诸如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在大多数受试者的初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，在防御细菌和病毒中是重要的。IgD是没有已知的抗体功能的免疫球蛋白，但可以用作抗原受体。IgE是通过在暴露于变应原后引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
免疫应答：如本文所用的术语“免疫应答”是指当淋巴细胞将抗原分子识别为外源物质并诱导抗体形成时发生的针对抗原的细胞反应和/或激活淋巴细胞以去除抗原。
分离的：如本文所用的，术语“隔离的”是指从自然状态改变或去除的某物。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存物质部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
慢病毒：如本文所用的，术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，在于它们能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。
修饰的：如本文所用的，术语“修饰的”是指改变的本发明的分子或细胞的状态或结构。分子可以通过多种方式加以修饰，包括化学修饰、结构修饰和功能修饰。可以通过引入核酸来修饰细胞。
调节：如本文所用的，术语“调节”是指介导受试者中的反应水平可检测的增加或减少，其与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比较和/或与与原本相同但未经治疗的受试者中的反应水平相比较。所述术语包括扰动和/或影响天然信号或反应，从而在受试者(优选人)中介导有益的治疗反应。
可操作地连接：如本文所用的，术语“可操作地连接”是指在调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致后者的表达。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作地连接的。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列是可操作地连接的。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，它们在同一阅读框中。
过表达的肿瘤抗原：如本文所用的，术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原“过表达”是指相对于来自特定组织或器官的正常细胞中的表达水平，肿瘤抗原在来自疾病区域(如患者的特定组织或器官内的实体瘤)的细胞中的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定法来确定患有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。
多核苷酸：如本文所用的，术语“多核苷酸”是指核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有公知常识，即，核酸是多核苷酸，可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式包括但不限于重组方式，即，从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，使用普通克隆技术和PCRTM等，以及通过合成方式。
多肽：如本文所用的，术语“多肽”是指任何通常通过肽键连接的残基(氨基酸)的聚合链。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有被工程化的氨基酸序列，因为它是通过人工的作用设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、或两者，或由其组成。在一些实施方案中，多肽可以仅包含天然氨基酸或非天然氨基酸，或仅由其组成。在一些实施方案中，多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包含L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可包括一个或多个侧基或其他修饰，例如，在多肽的N-末端、在多肽的C-末端或其任何组合处修饰或附接到一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可选自下组，该组由以下组成：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等(包括其组合)。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可以是或包含钉合多肽。在一些实施方案中，术语“多肽”可以附加到参考多肽、活性或结构的名称；在这种情况下，它在本文中用于指如下多肽，所述多肽共享相关活性或结构，因此可被认为是多肽的同一类别或家族的成员。对于每个这样的类别，本说明书提供和/或本领域技术人员将知晓所述类别内的示例性多肽，其氨基酸序列和/或功能是已知的；在一些实施方案中，此类示例性多肽是针对多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员显示出显著的序列同源性或同一性，与所述类别的参考多肽(在一些实施方案中，与所述类别内的所有多肽)共享共同序列基序(例如，特征序列元件)，和/或共享共同的活性(在一些实施方案中，按相当的水平或在指定的范围内)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示与参考多肽的序列同源性或同一性的总体程度，即至少约30％-40％，并且通常高于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，和/或包括至少一个区域(例如，可能在一些实施方案中是或包括特征序列元件的保守区)，所述区域显示非常高的序列同一性，通常高于90％或甚至95％、96％、97％、98％、或99％。这样的保守区通常包含至少3-4个并且经常多达20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区包含具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个连续氨基酸的至少一段。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含亲本多肽的片段或由其组成。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含多个片段或由其组成，发现在同一亲本多肽中的每个片段相对于彼此以与感兴趣的多肽中的发现的不同空间排列(例如，在亲本中直接连接的片段可能在感兴趣的多肽中被空间分离，反之亦然，和/或片段在感兴趣的多肽中可能以与在亲本中不同的顺序存在)，使得感兴趣的多肽是其亲本多肽的衍生物。
蛋白质：如本文所用的，术语“蛋白质”是指多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白质可以包含除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以被另外加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或没有信号序列)，或者可以是其特征部分。普通技术人员将理解，蛋白质有时可包含例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合的多于一条的多肽链。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者和/或可含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任何一种。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指具有少于约100个氨基酸、少于约50个氨基酸、少于20个氨基酸或少于10个氨基酸的长度的多肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。
信号转导通路：如本文所用的，术语“信号转导通路”是指在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够跨细胞质膜接收信号和传输信号的分子和分子复合物。
单链抗体：如本文所用的，术语“单链抗体”是指通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段通过氨基酸改造段连接至Fv区。生成单链抗体的各种方法是已知的，包括在美国专利第4,694,778号；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward等人，(1989)Nature 334:54454；Skerra等人，(1988)Science 242:1038-1041中描述的那些。
特异性地结合：如本文所用的，术语“特异性地结合”，关于抗原结合结构域，诸如抗体剂，是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域或抗体剂。例如，与来自一个物种的抗原特异性地结合的抗原结合结构域或抗体试剂也与来自一个或多个物种的该抗原结合。但是，这样的跨物种反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体剂为特异的分类。在另一个实例中，与抗原特异性地结合的抗原结合结构域或抗体剂也可以与所述抗原的不同等位基因形式结合。然而，这样的交叉反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体剂为特异的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗原结合结构域或抗体剂、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，以表示所述相互作用取决于所述化学物种上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗原结合结构域或抗体剂识别并结合特定的蛋白质结构而不是一般蛋白质。如果抗原结合结构域或抗体剂对表位“A”是特异的，则在含有标记的“A”和抗原结合结构域或抗体剂的反应中，含有表位A(或游离的未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量。
刺激：如本文所用的，术语“刺激”是指由刺激分子(例如，、FcR复合物、TLR复合物或TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导的初级反应，从而介导信号转导事件，诸如但不限于经由Fc受体机制或经由合成CAR的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。如本文所用的，术语“刺激分子”是指与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性地结合的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的分子。在一些实施方案中，刺激分子包含包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域的FcR胞外结构域。在一些实施方案中，刺激分子包含包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域的TLR胞外结构域。如本文所用的，术语“刺激配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、巨噬细胞、树突细胞、B细胞等)或肿瘤细胞上时可以特异性地与单核细胞、巨噬细胞或树突细胞上的同源结合配偶体(本文称为“刺激分子”)结合的配体，从而介导免疫细胞的应答，包括但不限于激活、启动免疫应答、增殖等。刺激配体是本领域公知的并且包括，除其他外，Toll样受体(TLR)配体、抗Toll样受体抗体、激动剂和单核细胞/巨噬细胞受体抗体。另外，诸如干扰素-γ的细胞因子是巨噬细胞的有效刺激物。
受试者：如本文所用的，术语“受试者”是指生物体，例如哺乳动物(例如，人、非人哺乳动物、非人灵长类动物、灵长类动物、实验动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、猫、狗)。在一些实施方案中，人受试者为成人、青少年或儿科受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病、病症或疾患，例如，如本文所提供的可以治疗的疾病、病症或疾患，例如，本文列出的癌症或肿瘤。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或疾患；在一些实施方案中，易患受试者倾向于和/或表现出增加的产生疾病、病症或疾患的风险(与在参考受试者或人群中观察到的平均风险相比)。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或疾患的一种或多种症状。在一些实施方案中，受试者未表现出疾病、病症或疾患的特定症状(例如，疾病的临床表现)或特征。在一些实施方案中，受试者未表现出疾病、病症或疾患的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者为被施用和/或已被施用诊断和/或治疗的个体。
基本上纯化的：如本文所用的，术语“基本上纯化的”，例如应用于细胞时，是指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经从其他细胞类型中分离出来的细胞，而在其天然存在的状态下通常与其他细胞类型结合。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经从在其自然状态下与其结合的细胞中分离出来的细胞。在一些实施方案中，在体外。在其他实施方案中，细胞不是体外培养的。
靶：如本文所用的，术语“靶”是指体内需要治疗或优先被例如抗体(或其片段)或CAR结合的细胞、组织、器官或部位。
靶位点：如本文所用的，术语“靶位点”或“靶序列”是指基因组核酸序列，其定义结合分子在足以发生结合的条件下与其可特异性地结合的核酸部分。
T细胞受体：如本文所用的，术语“T细胞受体”或“TCR”是指参与响应于抗原呈递的T细胞活化的膜蛋白复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原。TCR包含α(a)和β(β)链的异二聚体，尽管在一些细胞中TCR包含γ和δ(γ/δ)链。TCR可以α/β和γ/δ的形式存在，它们在结构上相似，但具有不同的解剖位置和功能。每条链包含两个胞外结构域、一个可变结构域和一个恒定结构域。在一些实施方案中，可以修饰在包含TCR的任何细胞上的TCR，所述细胞包括例如辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
治疗的：如本文所用的，术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
转染：如本文所用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
治疗：如本文所用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征的发生和/或严重程度的部分或完全减轻、改善、发作延迟、抑制、预防、解除和/或降低。在一些实施方案中，可以向未表现出疾病、病症和/或疾患的体征或特征的受试者施用治疗(例如，可以是预防性的)。在一些实施方案中，可以向仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期或轻度体征或特征的受试者施用治疗，例如为了降低产生与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险的目的。在一些实施方案中，可以向表现出疾病、病症和/或疾患的确定的严重和/或晚期体征的受试者施用治疗。
肿瘤：如本文所用的，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长。在一些实施方案中，肿瘤可包含癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性细胞。在一些实施方案中，肿瘤与癌症相关，或为癌症的表现。在一些实施方案中，肿瘤可以是分散的肿瘤或液体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤可以是实体瘤。
载体：如本文所用的，术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将所述分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因而，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，诸如1至6范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都是适用的。
具体实施方式
免疫细胞
除其他外，本公开提供了包含至少一种如本文所述的嵌合抗原受体(CAR)的修饰的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)。因此，在一些实施方案中，包含至少一种CAR的免疫细胞包含：(a)胞外结构域(例如，如本文所述的胞外结构域)，(b)跨膜结构域(例如，如本文所述的跨膜结构域)，和(c)胞内结构域(例如，如本文所述的胞内结构域)。
如本文所用的，术语“免疫细胞”是指参与免疫应答例如促进免疫应答的细胞。免疫细胞的实例包括但不限于，巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans'cell)、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞。可以从受试者获得免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的来源。受试者的实例包括人、猴子、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。
在一些实施方案中，如本文所述的免疫细胞群包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和/或其前体。在一些实施方案中，免疫细胞群包括纯化的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞群或细胞系。
在一些实施方案中，免疫细胞被激活，例如，免疫细胞表现出，例如，相对于非活性细胞的增加的细胞因子产生、趋化因子产生、吞噬作用、细胞信号传导、靶细胞杀伤和/或抗原呈递。在一些实施方案中，活化的免疫细胞表现出，例如相对于非活性细胞的基因表达的变化，例如，促炎基因表达的诱导(例如，TNF、IL-12、IFN、GM-CSF、G-CSF、M-CSF或IL-1中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)。在某些实施方案中，活化的免疫细胞正在经历细胞分裂。在一些实施方案中，通过抑制CD47和/或SIRPα活性来增强免疫细胞的靶向效应子活性。可以通过用抗CD47或抗SIRPα抗体处理免疫细胞或通过本领域技术人员已知的任何方法来抑制CD47和/或SIRPα活性。
在一些实施方案中，从受试者获得(例如，分离)免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)。免疫细胞可以是自体的或来源于同种异体或通用供体。细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带、肿瘤和/或诱导的多能干细胞，诸如胚胎干细胞(ESC)。在某些实施方案中，可以使用技术人员已知的任何数量的分离技术(诸如Ficoll分离)从采集自受试者的血液单位获得细胞。在一些实施实施方案中，通过血液成分单采术或白细胞单采术获得来自受试者循环血液的细胞。可以洗涤通过血液成分单采术收集的细胞以去除血浆级分，并将所述细胞重悬于多种缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))或培养基中。在一些实施方案中，免疫细胞(例如单核细胞)的富集包括塑料粘附。在一些实施方案中，在富集之后，免疫细胞(例如单核细胞)的分化包括用GM-CSF刺激。在一些实施方案中，将包含血细胞(例如，单核细胞、淋巴细胞、血小板、血浆、和/或红细胞)的组合物，诸如白细胞单采术组合物(例如，leukopak)用于富集。在一些实施方案中，白细胞单采术组合物(例如，leukopak)包含来自健康人供体的样品。在某些实施方案中，免疫细胞(例如单核细胞)的血液成分单采术之后是用GM-CSF动员。在某些实施方案中，免疫细胞(例如，单核细胞)的选择包括使用微珠(例如，CliniMACS Prodigy装置上的
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MicroBeads)的CD14阳性选择。在一些实施方案中，将免疫细胞前体(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的前体)用于本文所述的组合物和方法中。免疫细胞前体可以在体内或离体地分化成免疫细胞。前体免疫细胞的非限制性实例包括造血干细胞、共同髓系祖细胞、原粒细胞、原单核细胞、前单核细胞或其中间体。例如，诱导的多能干细胞可用于生成单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。诱导的多能干细胞(iPSC)可以来源于正常人体组织，诸如外周血、成纤维细胞、皮肤、角质形成细胞或肾上皮细胞。自体、同种异体或通用供体iPSC可以分化为骨髓谱系(例如，单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或其前体)。
如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)可以从外周血中分离，例如，通过溶解红细胞并耗尽淋巴细胞和红细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心。可替代地，可以从脐带组织分离免疫细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的免疫细胞亚群。在一些实施方案中，可以从免疫细胞耗尽表达某些抗原的细胞，所述抗原包括但不限于CD34、CD3、CD4、CD8、CD56、CD66b、CD19或CD20。在一些实施方案中，例如，使用针对阴性选择细胞的独特表面标志物的抗体的联合，可以完成借助于阴性选择的免疫细胞群富集。作为非限制性实例，细胞选择还可以包括负磁性免疫粘附或流式细胞术，其使用针对存在于负选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。
在通过阳性或阴性选择分离如本文所述的期望的免疫细胞群(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)期间，可以改变免疫细胞浓度和表面(例如，诸如珠子的颗粒)。可能希望显著降低珠子和细胞混合在一起的体积，以确保细胞和珠子的最大接触面积。
在一些实施方案中，在施用之前，用促炎剂处理如本文所述(例如，包含本文所述的CAR)的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)。在一些实施方案中，用促炎剂处理增加了本文所述的免疫细胞的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，用至少一种促炎剂处理促成了本文描述的免疫细胞中的M1表型(例如，从M2表型转换为M1表型)。在一些实施方案中，至少一种促炎剂包含或为CD40激动剂(例如，CD40L)。在一些实施方案中，至少一种促炎剂包含或为41BB配体激动剂(例如，4-1BB)。在一些实施方案中，至少一种促炎剂包含或为CD40激动剂(例如，CD40L)和41BB配体激动剂(例如，4-1BB)。
在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含本文所述的CAR(例如，包含一个或多个胞外结构域、一个或多个跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的CAR)。在一些实施方案中，已经用一种或多种促炎剂处理修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。在一些实施方案中，修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞相对于相同类型的未修饰细胞表现出增加的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，一种或多种促炎剂包含或为CD40激动剂(例如，CD40L)。在一些实施方案中，一种或多种促炎剂包含或为41BB配体激动剂(例如，4-1BB)。在一些实施方案中，一种或多种促炎剂包含或为CD40激动剂(例如，CD40L)和41BB配体激动剂(例如，4-1BB)。本公开提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：向所述受试者递送治疗有效量的包含本文所述的修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的药物组合物。
本公开还提供了修饰包含本文所述的CAR(例如，包含一个或多个胞外结构域、一个或多个跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的CAR)的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的方法，其中所述方法包括用一种或多种促炎剂处理巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，从而产生相对于相同类型的未修饰细胞表现出增强的抗肿瘤活性的修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。在一些实施方案中，一种或多种促炎剂包含或为CD40激动剂(例如，CD40L)。在一些实施方案中，一种或多种促炎剂包含或为41BB配体激动剂(例如，4-1BB)。在一些实施方案中，一种或多种促炎剂包含或为CD40激动剂(例如，CD40L)和41BB配体激动剂(例如，4-1BB)。本公开提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：向所述受试者递送治疗有效量的包含通过本文所述的方法修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的药物组合物。
在一些实施方案中，将如本文所述(例如，包含本文所述的CAR)的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)与促炎剂联合施用于受试者。在一些实施方案中，将如本文所述(例如，包含本文所述的CAR)的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)与促炎剂基本上同时、在促炎剂之前或之后施用于受试者。在一些实施方案中，用促炎剂给药增加了本文所述的免疫细胞的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，用促炎剂给药促成了本文描述的免疫细胞中的M1表型(例如，从M2表型转换为M1表型)。在一些实施方案中，促炎剂包含或为CD40激动剂(例如，CD40L)。在一些实施方案中，促炎剂包含或为41BB配体激动剂(例如，4-1BB)。
巨噬细胞
巨噬细胞是专门用于检测、吞噬和破坏靶细胞(诸如病原体或肿瘤细胞)的免疫细胞。巨噬细胞是先天免疫系统的有效效应物，能够执行至少具有三种不同的抗肿瘤功能：吞噬死亡和垂死细胞、微生物、癌细胞、细胞碎片或其他外来物质；对肿瘤细胞的细胞毒性；和肿瘤抗原呈递，以协调适应性抗肿瘤免疫应答。
越来越多的证据表明，巨噬细胞在许多癌症的肿瘤微环境中含量丰富，并且可以采用多种表型，这些表型统称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。肿瘤微环境的免疫抑制性质通常导致更多的M2样TAM，这进一步有助于抗肿瘤免疫应答的普遍抑制。然而，最近的研究鉴定，TAM能够经由促炎信号“重编程”，并且从M2表型转换为更多M1表型与产生抗肿瘤免疫应答相关。诱导内源性TAM转换为M1型细胞和将无法变成M2的巨噬细胞工程改造将大大增强抗肿瘤免疫治疗，并且代表该领域的重大进展。
在一些实施方案中，巨噬细胞包括或为未分化的或M0巨噬细胞。在某些实施方案中，巨噬细胞包含或表达CD14、CD16、CD64、CD68、CD71或CCR5中的一种、两种、三种、四种、五种或六种。暴露于各种刺激可以诱导M0巨噬细胞极化成几个不同的群体，所述群体可以通过巨噬细胞表型标志物、细胞因子产生和/或趋化因子分泌来鉴定。
在一些实施方案中，巨噬细胞包括或为极化的巨噬细胞。在经典激活条件下，M0巨噬细胞可以暴露于诸如LPS、IFNγ和GM-CSF之类的促炎信号，并极化为M1巨噬细胞。通常，M1巨噬细胞与诸如Th1和Th17 T细胞应答之类的促炎免疫应答相关。暴露于其他刺激可以将巨噬细胞极化为一组不同的“替代激活”或M2巨噬细胞。
在一些实施方案中，巨噬细胞包括或为M1巨噬细胞。在一些实施方案中，巨噬细胞表达M1巨噬细胞的一种或多种标志物(例如，CD86、CD80、MHC II、IL-1R、TLR2、TLR4、iNOS、SOCS3、CD83、PD-L1、CD69、MHC I、CD64、CD32、CD16、IL1R、IFIT家族成员或ISG家族成员中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种)。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞分泌相对高水平的一种或多种炎性细胞因子(例如，IL-1、TNF、IL-12、IL-18、IL-23、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-6、IL-8或IL33中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、或12种)或趋化因子(例如，CC或CXC趋化因子中的一种或两种)(例如，CXC趋化因子中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种；例如，CC趋化因子中的一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种或28种；例如，CX3C趋化因子中的一种，例如C趋化因子中的一种或两种)。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞刺激免疫应答和/或炎症。在一些实施方案中，巨噬细胞包括或为M2巨噬细胞(例如，M2a、M2b、M2c和M2d巨噬细胞)。M2a巨噬细胞可以由IL-4、IL-13和/或真菌感染诱导。M2b巨噬细胞可以由IL-1R配体、免疫复合物和/或LPS诱导。M2c巨噬细胞可以由IL-10和/或TGFβ诱导。M2d巨噬细胞可以由IL-6和/或腺苷诱导。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞降低了受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，巨噬细胞表达一种或多种M2巨噬细胞标志物(例如CD206、CD163或CD209中的一种、两种或三种)。在一些实施方案中，例如，相对于没有本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞表现出一种或多种抗炎细胞因子(例如，IL-10或TGFβ中的一种或两种)的分泌增加。
在一些实施方案中，巨噬细胞包含至少一种上调的M1标志物和/或至少一种下调的M2标志物。在一些实施方案中，至少一种M1标志物(例如，HLA DR、CD86、CD80、PD-L1、CD83、CD69、MHC I、CD64、CD32、CD16、IL1R、IFIT家族成员和/或ISG家族成员)在巨噬细胞中上调。在一些实施方案中，至少一种M2标志物(例如，CD206、CD163和/或CD209)在巨噬细胞中下调。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞表现出吞噬作用增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞表现出针对肿瘤细胞的细胞毒性增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的巨噬细胞表现出增加的肿瘤抗原呈递(例如，吞噬后呈递)和/或增加的抗原加工。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的巨噬细胞表现出增加的肿瘤杀伤(例如，通过吞噬作用、溶解、细胞凋亡或肿瘤杀伤细胞因子(例如，TNFα)的产生)。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的巨噬细胞表现出有利基因(例如，CD80、CD86、MHC-I、MHC-II、CD40、41BBL、TNF、IFNa、IFNb、IFNg、IL2、IL12、IL6、IL8、IL1b和/或CXCL12)的表达增加或不利基因(例如，CD163、CD206、TGFb、IL10和/或IL4)的表达降低中的一者或两者。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞表现出ROS的产生增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的巨噬细胞表现出代谢重编程(例如，干扰素信号传导途径、TH1途径、PTEN信号传导、PI3K信号传导、MTOR信号传导、TLR信号传导、CD40信号传导、41BB信号传导、41BBL信号传导、巨噬细胞成熟信号传导、树突细胞成熟信号传导、CD3-ζ信号传导、FcRγ信号传导、CD64信号传导、CD32a信号传导、CD32c信号传导、CD16a信号传导、TLR1信号传导、TLR2信号传导、TLR3信号传导、TLR4信号传导、TLR5信号传导、TLR6信号传导、TLR7信号传导、TLR8信号传导、TLR9信号传导、ALK信号传导、AXL信号传导、DDR2信号传导、EGFR信号传导、EphA1信号传导、INSR信号传导、cMET信号传导、MUSK信号传导、PDGFR信号传导、PTK7信号传导、RET信号传导、ROR1信号传导、ROS1信号传导、RYK信号传导、TIE2信号传导、TRK信号传导、VEGFR信号传导、CD40信号传导、CD19信号传导、CD20信号传导、41BB信号传导、CD28信号传导、OX40信号传导、GITR信号传导、TREM-1信号传导、TREM-2信号传导、DAP12信号传导、MR信号传导、ICOS信号传导、MyD88信号传导、V/I/LxYxxL/V信号传导、SIRPa信号传导、CD45信号传导、Siglec-10信号传导、PD1信号传导、SHP-1信号传导、SHP-2信号传导、KIR-2DL信号传导、KIR-3DL信号传导、NKG2A信号传导、CD170信号传导、CD33信号传导、BTLA信号传导、CD32b信号传导、SIRPb信号传导、CD22信号传导、PIR-B信号传导和/或LILRB1信号传导的重编程)。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞表现出细胞存活机制的诱导。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞表现出细胞死亡机制的诱导。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文描述的CAR的巨噬细胞表现出吞噬检查点抗性增加、趋化因子受体表达增加以帮助运输、趋化因子表达增加以募集其他疫细胞、ECM降解酶(例如，降解肿瘤ECM和/或表现出抗纤维化活性的MMP)的表达增加、或增殖增加中的一者、两者、三者、四者或五者。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的巨噬细胞表现出CAR表达持续时间增加、CAR在细胞表面上的稳定性改善、CAR表达水平提高或CAR背景活性降低中的一者、两者、三者或四者。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的巨噬细胞减少了受试者中的感染(例如，传染因子的感染)。在一些实施方案中，传染因子包括或为病毒、原生动物(例如锥虫、疟疾或弓形虫)、细菌(例如分枝杆菌、沙门菌或李斯特菌)、真菌(例如念珠菌)或其组合。在一些实施方案中，病毒包括肝炎病毒(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎)、逆转录病毒、人免疫缺陷病毒(例如，HIV1或HIV2)、T细胞白血病病毒、嗜淋巴细胞病毒(例如，HTLV1或HTLV2)、单纯疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒1型或2型)、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、日本脑炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、腺病毒、肠道病毒、鼻病毒、冠状病毒(例如，严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、中东呼吸综合征(MERS)病毒或冠状病毒病2019(COVID-19))、埃博拉病毒、西尼罗河病毒或其变体或组合。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的巨噬细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的巨噬细胞经由受试者(例如，患有神经退行性疾病、炎性疾病、心血管疾病、纤维化疾病、淀粉样变性或其组合的受试者)中的至少一种蛋白质聚集体的吞噬作用减少现有聚集体的形成和/或使其降解。在一些实施方案中，神经退行性疾病选自tau蛋白病、α-突触核蛋白病、早老性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹(PSP)、皮克病、原发性进行性失语、额颞叶痴呆、皮质基底节痴呆、帕金森病、路易体痴呆、唐氏综合征、多系统萎缩、肌萎缩侧索硬化(ALS)、Hallervorden-Spatz综合征、多聚谷氨酰胺疾病、三核苷酸重复疾病和朊病毒病。在一些实施方案中，炎性疾病选自系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、鼻窦炎、哮喘、结核病、克罗恩病、慢性感染、遗传性周期性发热、恶性肿瘤、系统性血管炎、囊性纤维化、支气管扩张、大疱性表皮松解症、周期性中性粒细胞减少症、免疫缺陷、Muckle-Wells(MWS)病和家族性地中海热(FMF)。在一些实施方案中，淀粉样变性选自原发性淀粉样变性(AL)、继发性淀粉样变性(AA)、家族性淀粉样变性(ATTR)、β-2微球蛋白淀粉样变性、局限性淀粉样变性、重链淀粉样变性(AH)、轻链淀粉样变性(AL)、原发性系统性淀粉样变性、ApoAI淀粉样变性、ApoAII淀粉样变性、ApoAIV淀粉样变性、载脂蛋白C2淀粉样变性、载脂蛋白C3淀粉样变性、角膜乳铁蛋白淀粉样变性、转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性、透析淀粉样变性、纤维蛋白原淀粉样变性、Lect2淀粉样变性(ALECT2)和溶菌酶淀粉样变性。在一些实施方案中，心血管疾病选自动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、高血压性心脏病、代谢综合征、高血压、脑血管疾病和心力衰竭。在一些实施方案中，纤维化疾病选自肺纤维化、特发性肺纤维化、肝硬化、囊性纤维化、硬皮病、心脏纤维化、辐射诱导的肺损伤、脂肪性肝炎、肾小球硬化、间质性肺病、肝纤维化、纵隔纤维化、腹膜后腔纤维化、骨髓纤维化和皮肤纤维化。
单核细胞
单核细胞是在血液、骨髓和脾脏中循环的多能细胞，在稳态时通常不增殖。单核细胞的大小可以在直径约10-30μm的范围内显著变化。单核细胞的细胞核与细胞质的比率可以在约2:1至约1:1的范围。通常，单核细胞包含诸如在感染期间介导从血液迁移到组织的趋化因子受体和病原体识别受体。单核细胞可以产生炎性细胞因子，吸收细胞和/或毒性分子，并分化成树突细胞或巨噬细胞。
在一些实施方案中，单核细胞包含或表达一种或多种表型标志物。人单核细胞的示例性表型标志物包括但不限于CD9、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD15、CDw17、CD31、CD32、CD33、CD35、CD36、CD38、CD43、CD49b、CD49e、CD49f、CD63、CD64、CD65s、CD68、CD84、CD85、CD86、CD87、CD89、CD91、CDw92、CD93、CD98、CD101、CD102、CD111、CD112、CD115、CD116、CD119、CDwl2lb、CDw123、CD127、CDw128、CDw131、CD147、CD155、CD156a、CD157、CD162、CD163、CD164、CD168、CD171、CD172a、CD180、CD206、CD131a1、CD213 2、CDw210、CD226、CD281、CD282、CD284和CD286。小鼠单核细胞的示例性表型标志物包括但不限于CD11a、CD11b、CD16、CD18、CD29、CD31、CD32、CD44、CD45、CD49d、CD115、CD116、Cdw131、CD281、CD282、CD284、CD286、F4/80和CD49b。在某些实施方案中，单核细胞包含CD11b、CD14或CD16中的一种、两种或三种。在某些实施方案中，单核细胞包括CD14+CD16-单核细胞、CD14+CD16+单核细胞或CD14-CD16+单核细胞。
在一些实施方案中，单核细胞分化成巨噬细胞。在一些实施方案中，单核细胞分化成树突细胞(DC)。可以通过本领域已知的任何技术将单核细胞分化成巨噬细胞或DC。例如，可以通过巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导单核细胞分化成巨噬细胞。可以通过联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4诱导单核细胞分化成DC。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的单核细胞表现出一种或多种细胞因子(例如TNF、IL-12、IFN、GM-CSF、G-CSF、M-CSF或IL-1中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)的分泌增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出吞噬作用增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出存活率提高。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出成为巨噬细胞(例如，M1或M2巨噬细胞)的增强分化。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出向DC的增强分化(例如，驻留的或迁移的DC和/或在淋巴和非淋巴组织中)。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出针对肿瘤细胞的细胞毒性增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的单核细胞表现出增加的肿瘤抗原呈递(例如，吞噬后呈递)和/或增加的抗原加工。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的单核细胞表现出增加的肿瘤杀伤(例如，通过吞噬作用、溶解、细胞凋亡或肿瘤杀伤细胞因子(例如，TNFα)的产生)。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的单核细胞表现出有利基因的表达增加或不利基因的表达降低中的一者或两者。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出ROS的产生增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出代谢重编程。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出细胞存活机制的诱导。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文所述的CAR的单核细胞表现出细胞死亡机制的诱导。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达至少一种本文描述的CAR的单核细胞表现出吞噬检查点抗性增加、趋化因子受体表达增加以帮助运输、趋化因子表达增加以募集其他疫细胞、ECM降解酶(例如，降解肿瘤ECM和/或表现出抗纤维化活性的MMP)的表达增加、或增殖增加中的一者、两者、三者、四者或五者。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的单核细胞，包含或表达本文所述的至少一种CAR的单核细胞表现出CAR表达持续时间增加、CAR在细胞表面上的稳定性改善、CAR表达水平提高或CAR背景活性降低中的一者、两者、三者或四者。
树突细胞
树突细胞(DC)是骨髓来源的特化的抗原呈递细胞，其参与启动免疫应答和维持免疫系统对自身抗原的耐受性。树突细胞可见于淋巴和非淋巴器官中，并且通常被认为来自淋巴或骨髓谱系。
在一些实施方案中，DC包含或表达一种或多种表型标志物。DC的示例性表型标志物包括但不限于CD11c、CD83、CD1a、CD1c、CD141、CD207、CLEC9a、CD123、CD85、CD180、CD187、CD205、CD281、CD282、CD284、CD286和部分CD206、CD207、CD208和CD209。
未成熟DC的特征为抗原捕获能力高，但其T细胞刺激能力相对较低。炎症介质促进DC成熟。一旦DC达到成熟阶段，相对于未成熟DC的特性有巨大变化，诸如抗原捕获能力下降和/或刺激T细胞的能力增强。在一些实施方案中，DC包括或为未成熟DC。在其他实施方案中，DC包括或为成熟DC。
不希望受理论的束缚，例如，相对于没有本文所述的CAR的DC，人们认为修饰DC细胞以包含或表达至少一种本文所述的CAR可以允许成熟的DC同时表现出增加的抗原捕获能力和T细胞刺激。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达本文所述的至少一种CAR的DC介导了肿瘤抗原呈递(例如，增加的肿瘤抗原呈递)。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达本文所述的至少一种CAR的DC介导了肿瘤T细胞刺激(例如，增加的T细胞刺激)。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达本文所述的至少一种CAR的DC表现出一种或多种细胞因子(例如TNF、IL-12、IFN、GM-CSF、G-CSF、M-CSF或IL-1中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)的分泌增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达至少一种本文所述的CAR的DC表现出吞噬作用增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达本文所述的至少一种CAR的DC表现出增加的肿瘤抗原呈递(例如，吞噬后呈递)、增加的抗原加工、增加的抗原交叉呈递、增加的T细胞引发和/或T细胞刺激。
在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达本文所述的至少一种CAR的DC表现出有利基因的表达增加或不利基因的表达降低中的一者或两者。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达至少一种本文所述的CAR的DC表现出ROS的产生增加。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达至少一种本文所述的CAR的DC表现出代谢重编程。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达至少一种本文所述的CAR的DC表现出细胞存活机制的诱导。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达至少一种本文所述的CAR的DC表现出细胞死亡机制的诱导。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达至少一种本文描述的CAR的DC表现出吞噬检查点抗性增加、趋化因子受体表达增加以帮助运输、趋化因子表达增加以募集其他疫细胞、ECM降解酶(例如，降解肿瘤ECM和/或表现出抗纤维化活性的MMP)的表达增加、或增殖增加中的一者、两者、三者、四者或五者。在一些实施方案中，例如，相对于没有如本文所述的CAR的DC，包含或表达本文所述的至少一种CAR的DC表现出CAR表达持续时间增加、CAR在细胞表面上的稳定性改善、CAR表达水平提高或CAR背景活性降低中的一者、两者、三者或四者。
嵌合抗原受体(CAR)
如本文所用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工细胞表面受体，其经工程改造以在免疫效应细胞上表达并特异性地靶向细胞和/或结合抗原。CAR可以用作例如具有过继细胞转移的疗法。例如，在一些实施方案中，将单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞从患者(例如，从血液、肿瘤或腹水)取出并进行修饰，使其表达对特定抗原形式特异的受体。在一些实施方案中，已经针对抗原例如肿瘤相关抗原的特异性表达CAR。在一些实施方案中，CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
在一些实施方案中，通过在其中表达CAR而生成修饰的免疫细胞，例如修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的CAR，其中所述免疫细胞包括巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。
在一些实施方案中，CAR可以还包含以下中的一者或多者：一个或多个胞外前导结构域、一个或多个胞外铰链结构域和一个或多个胞内共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR包含在胞外结构域和跨膜结构域之间的间隔结构域或铰链。在一些实施方案中，CAR包含在胞内结构域和跨膜结构域之间的间隔物结构域或铰链。如本文所用的，术语“间隔物结构域”或“铰链”是指起到将多肽链中的跨膜结构域连接至胞外结构域或胞内结构域的作用的任何寡肽或多肽。在一些实施方案中，间隔物结构域或铰链可包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个氨基酸之间)可以在CAR的跨膜结构域和胞内结构域之间形成键联。接头的实例包括甘氨酸-丝氨酸双联体。
在一些实施方案中，包含CAR的免疫细胞可以包含一个或多个控制系统，包括但不限于：安全开关(例如，开启开关和关闭开关、自杀开关)、逻辑门，例如“与(AND)”门(例如，两种或更多种CAR，每种都缺少一个或多个信号传导结构域，使得两种/所有CAR的激活对于全免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的激活或功能是必需的)、“或(OR)”门(例如，两种或更多种CAR，每种都具有胞内结构域诸如CD3ζ和共刺激结构域)，和/或“非(NOT)”门(例如，两种或更多种CAR，其中之一包含拮抗另一种CAR的功能的抑制结构域)。
本公开还提供了包含编码CAR的核酸序列(例如，分离的核酸序列)的免疫细胞，其中所述核酸序列包含编码胞外结构域的核酸序列、编码跨膜结构域的核酸序列和编码胞内结构域的核酸序列，其中所述细胞是表达CAR的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。
在一些实施方案中，CAR包含与CAR的另一个结构域可操作地连接的胞外结构域，所述另一个结构域比如跨膜结构域或胞内结构域，用于在免疫细胞中表达。在一些实施方案中，编码胞外结构域的核酸与编码跨膜结构域的核酸可操作地连接，并且编码跨膜结构域的核酸与编码胞内结构域的核酸可操作地连接。
在一些实施方案中，包含CAR的免疫细胞的效应子活性针对包含特异性地结合CAR的抗原结合结构域的抗原的靶细胞。在一些实施方案中，针对靶细胞的靶向的效应子活性是或包括吞噬作用、靶向的细胞的细胞毒性、抗原呈递或细胞因子分泌。
在一些实施方案中，本文所述的CAR包含至少一个结构域(例如，胞外结构域、跨膜结构域和/或胞内结构域)，其抑制本文所述免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)中的抗吞噬信号传导。在一些实施方案中，相对于没有CAR的相同类型的细胞，本文所述的CAR，例如，通过增强对CD47的抑制和/或SIRPα活性，改善了本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的效应子活性。在一些实施方案中，本文所述的CAR结合CD47，并且例如，用作抑制SIRPα活性(例如，CD47沉默)的显性负性受体。在一些实施方案中，本文所述的结合SIRPα的CAR例如包含活化受体(例如，包含CD3z胞内结构域)。在一些实施方案中，本文所述的CAR抑制CD47和SIRPα的至少一种相互作用。在一些实施方案中，CAR是或包括吞噬逻辑门。
在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞(例如，包含或表达本文所述的CAR)包含或表达下述的至少一种变体或片段：SIRPα(例如，显性负性SIRPα或SIRPα的高亲和力工程化变体(例如，CV1))、5F9scFv、B6H12 scFv(例如，人源化B6H12 scFv)、PD1(例如，显性负性PD1或HAC-1)、抗PD1 scFv(例如，E27或德瓦鲁单抗)、Siglec(例如，Siglec-10、Siglec-9和/或Siglec-11)和/或SHP-1。在一些实施方案中，变体或片段包含突变的胞内结构域。在一些实施方案中，变体或片段不包含或不表达至少一个胞内结构域(例如，免疫细胞包含或表达抗CD47 scFv、CD8铰链结构域和CD8跨膜)。在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞(例如，包含或表达本文所述的CAR)包含例如阻断抑制性检查点的显性负性受体。
在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含切割肽(例如，P2A、F2A、E2A和/或T2A肽)和至少一种第二CAR，后者包含至少一种抗吞噬信号的抑制结构域。在一些实施方案中，至少一种第二CAR包含SIRPα(例如，SIRPα的高亲和力工程化变体(例如，CV1))、5F9 scFv、B6H12 scFv(例如，人源化B6H12 scFv)或CD47结合胞外结构域或其片段。在一些实施方案中，至少一种第二CAR包含SIRPα跨膜结构域或其片段。在某些实施方案中，第二CAR还包含铰链结构域(例如，CD8铰链结构域)。在某些实施方案中，至少一种第二CAR包含：(i)前导序列(例如，CD8前导序列)；ii)胞外结构域(例如，SIRPα、CV1、5F9 scFv或B6H12 scFv(例如，人源化B6H12 scFv)胞外结构域)；和ii)跨膜结构域(例如，SIRPα跨膜结构域)。在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含切割肽(例如，P2A肽)和至少一种标记蛋白(例如，CD20或其片段、CD19或其片段、NGFR或其片段、合成肽和/或荧光蛋白)。
在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞(例如，包含或表达本文所述的CAR)包含或表达一个或多个磷酸酶死亡结构域(例如，磷酸酶死亡Shp1、磷酸酶死亡72-5ptase(INPP5E)、磷酸酶死亡Shp2和/或磷酸酶死亡SHIP-1结构域)和/或组成型活性激酶结构域(例如，组成型活性LYN结构域)。在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含切割肽(例如，P2A、F2A、E2A和/或T2A肽)和一个或多个磷酸酶死亡结构域(例如磷酸酶死亡Shp1、磷酸酶死亡72-5ptase(INPP5E)、磷酸酶死亡Shp2、和/或磷酸酶死亡SHIP-1结构域)和/或组成型活性激酶结构域(例如，组成型活性LYN结构域)。
胞外结构域
本公开提供了包含胞外结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，胞外结构域包含Fc受体(FcR)胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含toll样受体(TLR)胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含前导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含抗原结合结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含铰链结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含FcR胞外结构域、TLR胞外结构域、前导结构域、抗原结合结构域和铰链结构域中的一种或多种。在一些实施方案中，胞外结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，胞外结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。
FcR胞外结构域
在一些实施方案中，FcR胞外结构域包括全长FcR胞外结构域。在一些实施方案中，FcR胞外结构域包括全长FcR胞外结构域的一部分。在一些实施方案中，FcR胞外结构域(或其部分)是或包括人FcR胞外结构域。在一些实施方案中，FcR胞外结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，FcR胞外结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，FcR胞外结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
TLR胞外结构域
在一些实施方案中，TLR胞外结构域包括全长TLR胞外结构域。在一些实施方案中，TLR胞外结构域包括全长TLR胞外结构域的一部分。在一些实施方案中，TLR胞外结构域(或其部分)是或包括人TLR胞外结构域。在一些实施方案中，TLR胞外结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，TLR胞外结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，TLR胞外结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
前导结构域
在一些实施方案中，CAR包含一个或多个胞外前导结构域。在一些实施方案中，编码CAR的核酸包含编码胞外前导结构域的核酸序列，但在所述CAR在免疫细胞中表达之前，所述胞外前导结构域被从所述CAR切割。在一些实施方案中，胞外前导结构域是或包括人胞外前导结构域。在一些实施方案中，胞外前导结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，胞外前导结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，胞外前导结构域包含CD8胞外前导结构域。在一些实施方案中，胞外前导结构域包括来自刺激或共刺激结构域的前导结构域(例如，TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ALK、AXL、DDR2、EGFR、EphA1、INSR、cMET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR1、ROS1、RYK、TIE2、TRK、VEGFR、CD40、CD19、CD20、41BB、CD28、OX40、GITR、TREM-1、TREM-2、DAP12、MR、ICOS、MyD88结构域)。
抗原结合结构域
在一些实施方案中，CAR包含与例如靶细胞上的抗原结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含与病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、自身免疫性疾病和/或癌细胞相关的抗原结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的抗原。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合肿瘤抗原，诸如对感兴趣的肿瘤或癌症特异的抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原包括一种或多种抗原性癌症表位。在一些实施方案中，肿瘤抗原包括CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体α2亚基(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，与细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶(Prostase)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；伸长因子2突变(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体(prosome)，巨蛋白因子(macropain))亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson小鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW MAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；紧密连接蛋白(claudin)6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组D成员(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性蛋白1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变体基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺癌相关蛋白(prostein)；生存素(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶反转录酶(hTERT)；肉瘤易位断裂点；黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)-ETS融合基因)；N-乙酰葡糖氨基-转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点蛋白2(SSX2)；晚期糖基化终末产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；热休克蛋白70-2突变体(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA-Fc片段受体(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；或免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。在某些实施方案中，肿瘤抗原包括ERBB2(Her2/neu)。在某些实施方案中，肿瘤抗原包括PSMA。在某些实施方案中，肿瘤抗原包括间皮素。在一些实施方案中，抗原结合结构域与错误折叠的蛋白质抗原或蛋白质聚集体的蛋白质(诸如对感兴趣的疾病/病症特异的蛋白质)结合。在一些实施方案中，所述疾病/病症是神经退行性疾病/病症、炎性疾病/病症、心血管疾病/病症、纤维化疾病/病症或淀粉样变性(例如，由免疫球蛋白轻链或转甲状腺素蛋白的蛋白质聚集体介导)。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病/病症选自tau蛋白病、α-突触核蛋白病、早老性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默病(由β-淀粉样蛋白的蛋白质聚集体介导)、与17号染色体相关的帕金森病(FTDP-17)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮克病、原发性进行性失语、额颞叶痴呆、皮质基底节痴呆、帕金森病、帕金森病伴痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、多系统萎缩、肌萎缩侧索硬化(ALS)、Halle rvorden-Spatz综合征、多聚谷氨酰胺疾病、三核苷酸重复疾病、家族性英国痴呆、致死性家族性失眠症、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome)、遗传性脑出血伴淀粉样变性(冰岛型)(HCHW A-I)、散发性致死性失眠症(sFI)、变异型蛋白酶敏感朊蛋白病(VPSPr)、家族性丹麦痴呆和朊病毒病(诸如克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、CJD和变异型克雅病(vCJD))。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括与抗原结合的任何结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体或其任何片段，例如scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包括适体、darpin、centyrin、天然存在的或合成的受体、亲和体或其他工程化蛋白质识别分子。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包括哺乳动物抗体或其片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域全部或部分来源于其中最终使用CAR的相同物种。例如，对于用于人，CAR的抗原结合结构域包括人抗体、人源化抗体或其片段(例如scFv)。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。
在一些实施方案中，CAR包含一个或多个抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR者是双特异性CAR。在一些实施方案中，免疫细胞包含包括一个或多个抗原结合结构域的两种或更多种不同的CAR。在一些实施方案中，通过要求存在两种抗原，包含双特异性CAR和/或包含包括一个或多个抗原结合结构域的两种或更多种不同的CAR的免疫细胞可以减少脱靶效应和/或中靶脱组织效应。在一些实施方案中，免疫细胞包含双特异性CAR和/或包含包括一个或多个抗原结合结构域的两种或更多种不同的CAR，其中所述CAR提供了不同的信号，所述信号单独不足以介导修饰细胞的活化，但一起协同地刺激修饰细胞的活化。在一些实施方案中，这样的构建体可以被称为“与(AND)”逻辑门。
在一些实施方案中，通过要求存在一种抗原并且在细胞的活性受到刺激之前不存在第二种正常蛋白质抗原，包含双特异性CAR和/或包含包括一个或多个抗原结合结构域的两种或更多种不同的CAR的免疫细胞可以减少脱靶效应和/或中靶脱组织效应。在一些实施方案中，这样的构建体可以被称为“非(NOT)”逻辑门。与“与(AND)”门相反，“非(NOT)”门控CAR修饰细胞通过与单一抗原结合而被激活。然而，第二受体与第二抗原的结合可以覆盖通过CAR持续存在的激活信号。通常，这种抑制性受体将被在正常组织中大量表达但在肿瘤组织中不存在的抗原靶向。
铰链结构域
在一些实施方案中，CAR包含一个或多个胞外铰链结构域。在一些实施方案中，胞外铰链结构域是或包括人胞外铰链结构域。在一些实施方案中，胞外铰链结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，胞外铰链结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞外铰链结构域包括CD8a胞外铰链结构域或IgG4或CD28胞外铰链结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞外铰链结构域包括CD28胞外铰链结构域。在一些实施方案中，胞外铰链结构域优化了CAR的物理化学参数，例如，相对于肿瘤抗原的最佳大小(例如，允许排除抑制性分子)、最佳灵活性、最佳蛋白质折叠、最佳蛋白质稳定性、最佳结合、最佳同二聚化和/或同二聚化的缺乏。
跨膜结构域
在一些实施方案中，CAR包含例如将胞外结构域连接至胞内结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与CAR的一个或多个其他结构域天然相关。在一些实施方案中，可以修饰跨膜结构域以避免与其他表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以便将与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。在一些实施方案中，跨膜结构域可以源自天然存在或合成的来源。在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然存在的膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一些实施方案中，跨膜结构域是或包括人跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28、CD8a、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TRL1、TLR2、TLR3、TRL4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ALK、AXL、DDR2、EGFR、EphA1、INSR、cMET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR1、ROS1、RYK、TIE2、TRK、VEGFR、CD40、CD19、CD20、41BB、CD28、OX40、GITR、TREM-1、TREM-2、DAP12、MR、ICOS、MyD88、CD3-ζ、FcRγ、V/I/LxYxxL/V、SIRPa、CD45、Siglec-10、PD1、SHP-1、SHP-2、KIR-2DL、KIR-3DL、NKG2A、CD170、CD33、BTLA、CD32b、SIRPb、CD22、PIR-B、LILRB1、CD36或Syk跨膜结构域。
FcR跨膜结构域
在一些实施方案中，FcR跨膜结构域包括全长FcR跨膜结构域。在一些实施方案中，FcR跨膜结构域包括全长FcR跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，FcR跨膜结构域是或包括人FcR跨膜结构域或其部分。在一些实施方案中，FcR跨膜结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，FcR跨膜结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，FcR跨膜结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
TLR跨膜结构域
在一些实施方案中，TLR跨膜结构域包括全长TLR跨膜结构域。在一些实施方案中，TLR跨膜结构域包括全长TLR跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，TLR跨膜结构域是或包括人TLR跨膜结构域或其部分。在一些实施方案中，TLR跨膜结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，TLR跨膜结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，TLR跨膜结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
胞内结构域
在一些实施方案中，CAR包含一个或多个胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域是或包括人胞内结构域或其部分。在一些实施方案中，胞内结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，胞内结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内结构域和/或其他细胞质结构域负责激活其中表达CAR的细胞(例如，免疫细胞)。在一些实施方案中，CAR的胞内结构域负责在包含所述CAR的免疫细胞中的信号激活和/或转导。
在一些实施方案中，CAR的胞内结构域包括至少一个负责信号激活和/或转导的结构域。在一些实施方案中，胞内结构域是或包括共刺激分子和信号传导结构域中的至少一者。在一些实施方案中，CAR的胞内结构域包括双信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内结构域包括多于两个信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包括表面受体的细胞质部分。在一些实施方案中，胞内结构域包括共刺激分子。在一些实施方案中，胞内结构域包括作用于启动免疫细胞中的信号转导的分子。
在一些实施方案中，CAR的胞内结构域包括一种或多种共刺激分子的任何部分，诸如至少一个信号传导结构域，其来自CD3、FcεRIγ链、其任何衍生物或变体、具有相同的功能能力的其任何合成序列，以及它们的任何组合。
FcR胞内结构域
在一些实施方案中，FcR胞内结构域包括全长FcR胞内结构域。在一些实施方案中，FcR胞内结构域包括全长FcR胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，FcR胞内结构域是或包括人FcR胞内结构域或其部分。在一些实施方案中，FcR胞内结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，FcR胞内结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，FcR胞内结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c(FcγRIIc)、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
TLR胞内结构域
在一些实施方案中，TLR胞内结构域包括全长TLR胞内结构域。在一些实施方案中，TLR胞内结构域包括全长TLR胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，TLR胞内结构域是或包括人TLR胞内结构域或其部分。在一些实施方案中，TLR胞内结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，TLR胞内结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。在一些实施方案中，TLR胞内结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
信号传导结构域
在一些实施方案中，CAR包含一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域是或包括人胞内信号传导结构域或其部分。在一些实施方案中，信号传导结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。
在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包括CD3-ζ、FcRγ、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ALK、AXL、DDR2、EGFR、EphA1、INSR、cMET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR1、ROS1、RYK、TIE2、TRK、VEGFR、CD40、CD19、CD20、41BB、CD28、OX40、GITR、TREM-1、TREM-2、DAP12、MR、ICOS、MyD88、V/I/LxYxxL/V、SIRPa、CD45、Siglec-10、PD1、SHP-1、SHP-2、KIR-2DL、KIR-3DL、NKG2A、CD170、CD33、BTLA、CD32b、SIRPb、CD22、PIR-B、LILRB1、Syk、41BB配体(41BBL；TNFSF9)、CD27、OX40L、CD32b、CD11b、ITGAM、SLAMF7、CD206、CD163、CD209、Dectin-2或一个或多个细胞因子受体信号传导结构域(例如，IL1R、IL2R、IL3R、IL4R、IL5R、IL6R、IL7R、IL8R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL13R、IL14R、IL15R、IL17R、IFNaR、IFNgR、TNFR、CSF1R、CSF2R、Dap10、CD36、Dectin-1或ICOSL胞内信号传导结构域)。
在一些实施方案中，CAR的胞内结构域包括双信号传导结构域，诸如41BB、CD28、ICOS、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、CD116受体β链、CSF1-R、LRP1/CD91、SR-A1、SR-A2、MARCO、SR-CL1、SR-CL2、SR-C、SR-E、CR1、CR3、CR4、dectin1、DEC-205、DC-SIGN、CD14、CD36、LOX-1、CD11b，连同上一段中列出的任何信号传导结构域的任何组合。
共刺激结构域
如本文所用的，“共刺激分子”或“共刺激结构域”是指在免疫细胞中的用于加强或减弱初始刺激物的分子。例如，病原体相关的模式识别受体，诸如TLR或CD47/SIRPα轴，是在免疫细胞上的分别加强或减弱初始刺激物的分子。在一些实施方案中，共刺激结构域包括TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、普通FcRγ、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，一种与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列及其任何组合。
在一些实施方案中，共刺激结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)内源的结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域可以是对特定免疫细胞类型(例如，如本文提供的修饰的免疫细胞)非内源的结构域。
如本文所用的，“共刺激信号”是指与主要信号(诸如免疫细胞上CAR的激活)组合导致免疫细胞激活的信号。
切割肽
如本文所用的，切割肽是指可在细胞中诱导重组蛋白切割的肽。在一些实施方案中，切割肽是2A肽。在一些实施方案中，切割肽是或包括P2A、F2A、E2A或T2A肽。在一些实施方案中，如本文所述的核酸包含一个或多个编码一个或多个切割肽的核酸序列。在一些实施方案中，包含编码切割肽的核酸序列的核酸还包含一个或多个编码一个或多个胞内结构域的核酸序列和一个或多个包含一种或多种肽剂的核酸序列，其中核酸的翻译产生包含一个或多个胞内结构域的蛋白质，所述胞内结构域通过切割肽与一种或多种肽剂分开。在一些实施方案中，第一启动子可操作地连接到一个或多个编码CAR的核酸上，并且第二启动子可操作地连接到一个或多个编码肽剂的核酸上。在一些实施方案中，包含CAR和任选地一种或多种肽剂的核酸序列还包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其启动不依赖帽的核糖体与mRNA的结合，促进翻译的启动。
肽剂
如本文所用的，肽剂是指与免疫细胞中的CAR共表达的肽。在一些实施方案中，肽剂与CAR共表达，以确保CAR的化学计量平衡和最佳信号传导。在一些实施方案中，肽剂与相同的肽剂形成同二聚体。在一些实施方案中，肽剂与不同的肽剂形成异二聚体。在一些实施方案中，如本文所述的核酸包含一个或多个编码一种或多种肽剂的核酸序列。在一些实施方案中，肽剂是或包括FcRγ链。
在一些实施方案中，肽剂包括任何肽、蛋白质、受体、分泌的抗体或其片段(例如，scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc或纳米抗体)。在一些实施方案中，肽剂包括一种或多种细胞因子(例如，IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-a、IFNa、IFNb、IFN-y、GMCSF或MCSF中的一种或多种)、CD40-L、显性负性SIRPa、显性负性PD1、显性负性CD45、显性负性SIGLEC 10或显性负性LILRB。
Fc受体(FcR)
在一些实施方案中，CAR包含一个或多个抗原结合结构域和FcR胞外结构域，和/或所述CAR的跨膜结构域包含FcR跨膜结构域，和/或所述CAR的胞内结构域包含FcR胞内结构域。在一些实施方案中，CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域。在一些实施方案中，所述FcR胞外结构域、所述FcR跨膜结构域和所述FcR胞内结构域中的一种或多种是或包括人FcR结构域。在一些实施方案中，FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域一起构成全长FcR。在一些实施方案中，FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域一起构成全长FcR的一部分。在一些实施方案中，FcR胞外结构域包括全长FcR胞外结构域的一部分。在一些实施方案中，FcR跨膜结构域包括全长FcR跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，FcR胞内结构域包括全长FcR胞内结构域的一部分。
Toll样抗原受体(TLR)
在一些实施方案中，CAR包括一个或多个抗原结合结构域和toll样受体(TLR)胞外结构域和/或所述CAR的跨膜结构域包括TLR跨膜结构域和/或所述CAR的胞内结构域包括TLR胞内结构域。在一些实施方案中，CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域。在一些实施方案中，所述TLR胞外结构域、所述TLR跨膜结构域和所述TLR胞内结构域中的一种或多种是或包括人TLR结构域。在一些实施方案中，TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域一起构成全长TLR。在一些实施方案中，TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域一起构成全长TLR的一部分。在一些实施方案中，TLR胞外结构域包括全长TLR胞外结构域的一部分。在一些实施方案中，TLR跨膜结构域包括全长TLR跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，TLR胞内结构域包括全长TLR胞内结构域的一部分。
核酸构建体
除其他外，本公开提供了编码本文所述的至少一种CAR或其片段的核酸分子。免疫细胞可以包含编码至少一种本文所述的CAR的核酸分子(例如，外源核酸分子)。在一些实施方案中，编码至少一种CAR的核酸分子包含：(a)胞外结构域(例如，如本文所述的胞外结构域)，(b)跨膜结构域(例如，如本文所述的跨膜结构域)，和(c)胞内结构域(例如，如本文所述的胞内结构域)。
除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”还可以包括内含子，其程度为编码所述蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有内含子。术语“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性，所述特定核苷酸序列用作模板，用于在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的其他聚合物和大分子。因而，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生一种蛋白质，则所述基因、cDNA或RNA编码所述蛋白质。两条编码链(与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列)以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作地连接的。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列是可操作地连接的。可操作地连接的DNA序列可以彼此连续，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们在同一阅读框中。
如本文所用的，术语“片段”或“部分”是指包括整体的离散部分但缺乏在整个结构中发现的一个或多个部分的结构。在一些实施方案中，片段由这样的离散部分组成。在一些实施方案中，片段包括或包含在整体中发现的特征性结构元件或部分。在一些实施方案中，核苷酸片段包含或包括如在整个核苷酸中发现的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个单体单元(例如，核酸)。在一些实施方案中，核苷酸片段包含或包括在整个核苷酸中发现的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多单体单元(例如，残基)。整体材料或实体在一些实施方案中可以被称为整体的“亲本”。
编码本文所述的至少一种CAR或其片段的核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或其组合。在一些实施方案中，核酸分子包含或是编码本文所述的至少一种CAR或其片段的信使RNA(mRNA)转录物。在一些实施方案中，核酸分子包含或是编码本文所述的至少一种CAR或其片段的DNA构建体。
在一些实施方案中，本文所述的CAR的全部或片段由例如用于在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达的密码子优化的核酸分子编码。多种密码子优化方法在本领域中是已知的，例如，如美国专利第5,786,464号和第6,114,148号中所公开的，将其各自通过引用完整并入本文。
在一些实施方案中，载体包含编码本文所述的至少一种CAR或其片段的核酸分子。在一些实施方案中，载体包括质粒、病毒载体、噬菌粒、反转录转座子(例如背驮式或睡美人)、定点插入载体(例如CRISPR/Cas系统(例如，包含Cas9、Cas12a或C2c2中的一种或多种的CRISPR/Cas系统)、Zn指核酸酶或用于插入包含编码至少一种如本文所述的CAR的核酸序列的模板供体DNA的TALEN)、自杀表达载体或本领域已知的任何其他载体。载体可适用于真核生物中的复制和整合。载体可包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
载体可包含复制起点、启动子序列(例如，组成型或诱导型启动子)、和/或方便的限制性内切酶位点(参见，例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利第6,326,193号，各自通过引用完整并入本文)。载体还可以包括，例如，促进分泌的信号序列、多聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如，牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号)、允许附加型复制和在原核生物(例如，SV40起源和/或ColE1)中复制的元件、允许选择的元件(例如，氨苄青霉素抗性基因和/或博来霉素(zeocin)标记)和/或报告基因(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白)。
可以通过将编码CAR多肽或其片段的核酸可操作地连接至表达载体中的启动子来实现如本文所述的核酸的表达。示例性启动子(例如，组成型启动子)包括但不限于延伸因子-1α启动子(EF-1α)启动子、立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子、泛素C启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子或肌酸激酶启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。载体还可以包含另外的启动子元件，例如增强子，以调节转录起始的频率。
在一些实施方案中，包含编码如本文所述的至少一种CAR或其片段的核酸分子的载体包括或为病毒载体。病毒载体技术是熟知的并且描述于例如Sambrook等人，2012，MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press，NY)。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体或γ逆转录病毒载体)。在一些实施方案中，载体包括慢病毒载体(例如，如美国专利第9,149,519号或国际公开号WO 2017/044487中所述，将其各自通过引用完整并入本文)。
在一些实施方案中，病毒载体包括腺病毒载体。腺病毒是含有双链DNA的病毒的一大家族。它们使用宿主的细胞机制在宿主细胞的细胞核内复制，以合成病毒的RNA、DNA和蛋白质。本领域已知腺病毒影响复制和非复制细胞，以容纳大型转基因，并且编码蛋白质而不整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，腺病毒载体包括Ad2载体或Ad5载体(例如，Ad5f35腺病毒载体，例如，辅助依赖型Ad5F35腺病毒载体)。
在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。AAV系统在本领域中通常是众所周知的(参见，例如，Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)；Cotten等人，P.N.A.S.U.S.A.,89(13):6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64(1994)；Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol,158:97-129(1992)；和Asokan A等人，Mol.Ther.,20(4):699-708(2012))。用于产生和使用重组AAV(rAAV)载体的方法描述于(例如)美国专利号5,139,941和4,797,368中。
已经表征了几种AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3(例如，AAV3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及它们的变体。通常，任何AAV血清型可用于递送至少一种本文所述的CAR。在一些实施方案中，AAV血清型对特定组织具有向性。
在一些实施方案中，最近已显示，使用腺相关病毒(AAV)载体在同源重组(HR)期间用作供体模板DNA，CRISPR/Cas9系统促进高水平的精确基因组编辑。
在一些实施方案中，载体包括γ逆转录病毒载体(例如，如Tobias Maetzig等人，“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011Jun；3(6):677–713中所述，将其通过引用完整并入本文)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。
在一些实施方案中，载体包含两个或更多个编码CAR的核酸序列，所述CAR例如至少一种本文所述的CAR和第二CAR(例如，本文所述的不同CAR)。在一些实施方案中，编码CAR和第二CAR的两个或更多个核酸序列由单个核酸分子编码，例如，在相同的框架中并且编码为单个多肽链。在一些实施方案中，两个或更多个CAR被一个或多个切割肽位点(例如，自切割位点或胞内蛋白酶的底物)分隔。在某些实施方案中，切割肽包括猪捷申病毒-1(P2A)肽、明脉扁刺蛾病毒(T2A)肽、马鼻炎A病毒(E2A)肽、口蹄疫病毒(F2A)肽或其变体。
在一些实施方案中，载体包含至少一种编码CAR例如本文所述的至少一种CAR的核酸序列和至少一种编码与CAR共表达的至少一种基因的核酸，所述基因例如本文所述的细胞因子(例如，TNF、IL-12、IFN、GM-CSF、G-CSF、M-CSF和/或IL-1)或本文所述的刺激配体(例如，CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM，一种结合Toll配体受体的激动剂或抗体和/或B7-H3配体。
药物组合物
除其他外，本公开提供了药物组合物，其包含本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。
当指示“治疗有效量”、“免疫学有效量”、“抗免疫应答有效量”或“免疫应答抑制有效量”时，包含如本文所述的免疫细胞的药物组合物的精确量(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)可以由医师在考虑患者(受试者)的年龄、体重、免疫应答和状况的个体差异后确定。
包含如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物可包含缓冲剂，包括中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖或甘露醇；蛋白质、多肽或氨基酸(例如，甘氨酸)；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施方案中，药物组合物基本上不含污染物，例如，没有可检测水平的污染物(例如，内毒素)。
可以适合于待治疗或预防的疾病、病症或疾患的方式施用本文所述的药物组合物。给药的量和频率将由诸如患者的状况和患者的疾病、病症或疾患的类型和严重程度等因素来确定，不过适当的剂量可以通过临床试验来确定。
本文所述的药物组合物可以是多种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如可注射和可输注的溶液)、分散体或混悬剂、脂质体和栓剂。优选组合物可以是可注射或可输注的溶液。本文所述的药物组合物可配制为用于静脉内、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、经动脉或腹膜内给药。
在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物配制为用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内)给药。在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物配制为用于静脉输注或注射。在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物配制为用于肌内或皮下注射。本文所述的药物组合物可配制为用于通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术进行施用(参见例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988，将其通过引用完整并入本文)。
如本文所用的，术语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”是指通常通过注射或输注而不是肠内和局部施用的施用方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、瘤内和胸骨内注射和输注。
包含如本文所述的免疫细胞的药物组合物可以以约104至约109个细胞/kg体重(例如，约105至约106个细胞/kg体重)的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值)。在一些实施方案中，如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的剂量包含至少约1x106、约1.1x106、约2x106、约3.6x106、约5x106、约1x107、约1.8x107、约2x107、约5x107、约1x108、约2x108、约5x108、约1x109、约2x109或约5x109个细胞。也可以以某个剂量多次施用本文所述的药物组合物。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案，可以容易地由本领域技术人员通过监测患者的疾病、病症或疾患的体征并相应地调整治疗来确定。
可能希望将包含如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物施用于受试者，然后再抽血(或进行血液成分单采术)，激活收集的免疫细胞，并用激活的免疫细胞重新输注给受试者。这个过程可以进行多次，例如，每隔几周进行一次。可以将来自约10cc至约400cc的抽血中的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)激活。在一些实施方案中，将来自约20cc、约30cc、约40cc、约50cc、约60cc、约70cc、约80cc、约90cc或约100cc的抽血中的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)激活。不受理论的束缚，包括如本文所述的多次抽血和重新输注在内的方法可选择某些免疫细胞群。在一些实施方案中，包含如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物与第二疗法联合(例如，之前、同时或之后)施用。例如，第二疗法可以包括但不限于抗病毒疗法(例如，西多福韦、白细胞介素-2、阿糖胞苷(ARA-C)或那他珠单抗)、嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T)疗法、T-细胞受体(TCR)-T细胞疗法、化学疗法、放射、免疫抑制剂(例如，环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、FK506抗体或糖皮质激素)、拮抗剂(例如，PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA4拮抗剂、CD47拮抗剂、SIRPa拮抗剂、CD40激动剂、CSF1/CSF1R拮抗剂或STING激动剂中的一种或多种)或免疫清除剂(例如，抗CD52抗体(例如，阿仑单抗)、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨(fludaribine)、环孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228或辐照)。
在一些实施方案中，包含如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物与骨髓移植或使用化疗剂(例如，氟达拉滨、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺或利妥昔单抗(Rituxan))的淋巴细胞清除疗法联合施用(例如，之前、同时或之后)。在某些实施方案中，受试者经历高剂量化学疗法的标准治疗，然后接受外周血干细胞移植。在某些实施方案中，移植后，受试者接受包含如本文所述的免疫细胞的药物组合物的输注。可以在手术之前或之后施用本文所述的药物组合物。
有待施用于受试者的任何上述疗法的剂量将随着被治疗的疾病、病症或疾患并且根据特定受试者而变化。可以根据本领域公认的实践来进行用于人给药的剂量定标。例如，对于成人，阿仑单抗的剂量通常为约1mg至约100mg，通常每日施用，持续约1天至约30天的时期，例如每日约1mg至约10mg的日剂量(例如，如美国专利第6,120,766号中所述，将其通过引用完整并入本文)。
治疗方法
除其他外，本公开提供了治疗受试者的疾病或病症(例如，本文所述的疾病或病症)的方法，包括递送包含如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物。在一些实施方案中，将治疗有效量的本文所述的药物组合物施用于患有疾病或病症的受试者。如本文所述的药物组合物可用于制造用于治疗受试者的疾病或病症或刺激受试者中的免疫应答的药物。
有待用本文所述方法治疗的受试者可以是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人(例如，患有本文所述疾病或病症或有其风险的患者)。在一些实施方案中，免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)对于受试者而言可以是自体的、同种异体的或异种的。可以根据本文所述的给药方案，单独地或与一种或多种治疗剂、程序或形式组合将如本文所述的药物组合物施用于受试者。
包含如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物可用于治疗或预防与肿瘤或癌症相关的疾病、神经退行性疾病或病症、炎性疾病或病症、心血管疾病或病症、纤维化疾病或病症、与淀粉样变性相关的疾病及其组合。
提供了用包含如本文所述的免疫细胞(例如巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物治疗受试者的癌症或肿瘤(例如减轻、抑制或延迟其进展中的一者或多者)的方法。受试者可以患有成人或儿科形式的癌症。癌症可以是早期、中期或晚期或转移癌。癌症可包括但不限于实体瘤、血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)或转移性病变。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤和癌，例如腺癌，诸如累及肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、肛管、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如，脑、神经或神经胶质细胞)、头颈部、皮肤(例如，黑色素瘤，例如皮肤黑色素瘤)、胰腺和骨(例如，脊索瘤)的那些肿瘤。
在一些实施方案中，癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)(例如，具有鳞状和/或非鳞状组织学的非小细胞肺癌(NSCLC)、或NSCLC腺癌)、或小细胞肺癌(SCLC))、皮肤癌(例如，梅克尔细胞癌或黑色素瘤(例如，晚期黑色素瘤))、卵巢癌、间皮瘤、膀胱癌、软组织肉瘤(例如，血管外皮细胞瘤(HPC))、骨癌(骨肉瘤)、肾脏癌(例如，肾癌(例如，肾细胞癌))、肝癌(例如，肝细胞癌)、胆管癌、肉瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、前列腺癌、乳腺癌(例如，不表达雌激素受体、孕激素受体或Her2/neu中的一种、两种或全部的乳腺癌，例如，三阴性乳腺癌)、结直肠癌(例如，复发性结直肠癌或转移性结直肠癌，例如，微卫星不稳定性结直肠癌、微卫星稳定性结直肠癌、错配修复熟练的结直肠癌或错配修复缺陷的结直肠癌)、鼻咽癌、十二指肠癌、子宫内膜癌、胰腺癌、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肛门癌、胃食管癌、甲状腺癌(例如，甲状腺未分化癌)、宫颈癌(例如，宫颈鳞状细胞癌)、神经内分泌肿瘤(NET)(例如，非典型肺类癌肿瘤)、淋巴组织增生性疾病(例如，移植后淋巴组织增生性疾病)、淋巴瘤(例如，T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)或白血病(例如，骨髓性白血病或淋巴样白血病)。
在一些实施方案中，癌症是脑肿瘤，例如胶质母细胞瘤、胶质肉瘤或复发性脑肿瘤。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌，例如晚期胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是皮肤癌，例如黑色素瘤(例如，II-IV期黑色素瘤、HLA-A2阳性黑色素瘤、不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤)或梅克尔细胞癌。在一些实施方案中，癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如，转移性肾细胞癌)。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌，例如转移性乳腺癌或IV期乳腺癌，例如三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是病毒相关癌症。在一些实施方案中，癌症是肛管癌(例如，肛管鳞状细胞癌)。在一些实施方案中，癌症是宫颈癌(例如，宫颈鳞状细胞癌)。在一些实施方案中，癌症是胃癌(例如，EB病毒(EBV)阳性胃癌，或胃癌或胃食管结合部癌)。在一些实施方案中，癌症是头颈癌(例如，HPV阳性和阴性头颈部鳞状细胞癌(SCCHN))。在一些实施方案中，癌症是鼻咽癌(NPC)。在一些实施方案中，癌症是结直肠癌，例如复发性结直肠癌、转移性结直肠癌，例如微卫星不稳定性结直肠癌、微卫星稳定性结直肠癌、错配修复熟练的结直肠癌或错配修复缺陷的结直肠癌。
在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，癌症是白血病，例如急性髓系白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性白血病或急性白血病。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，复发性或难治性HL或DLBCL)。在一些实施方案中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
包含如本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的药物组合物可用于增强或调节受试者中的免疫应答。在一个实施方案中，本文所述的药物组合物增强、刺激或增加受试者(例如，患有本文所述疾病或病症或有其风险的受试者)中的免疫应答。在某些实施方案中，受试者是免疫受损的或具有免疫受损的风险。例如，受试者正在经历或已经经历化学疗法治疗和/或放射治疗。
在一些实施方案中，受试者患有炎性病症(例如，慢性或急性炎性病症)或具有发生所述病症的风险。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病或病症或具有其风险。可以用本文所述方法治疗的示例性自身免疫性疾病包括但不限于阿尔茨海默病、哮喘(例如，支气管哮喘)、变态反应(例如，特应性变态反应)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、动脉粥样硬化、贝赫切特病、乳糜泻、心肌病、克罗恩病、肝硬化、糖尿病、糖尿病视网膜病变、湿疹、纤维肌痛、纤维肌炎、肾小球肾炎、移植物抗宿主病(GVHD)、格林-巴利综合征、溶血性贫血、多发性硬化、重症肌无力、骨关节炎、多软骨炎、银屑病、类风湿性关节炎、脓毒症、中风、血管炎、呼吸机诱导的肺损伤、移植排斥、雷诺现象、赖特综合征、风湿热、结节病、硬皮病、干燥综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。
可以任何方便的方式(例如，注射、摄入、输血、吸入、植入或移植)进行本文所述的药物组合物的施用。在一些实施方案中，通过注射或输注施用本文所述的药物组合物。可以经动脉、皮下、静脉内、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内或腹膜内将本文所述的药物组合物施用于患者。在一些实施方案中，经肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内)施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，通过静脉输注或注射施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，通过肌内或皮下注射施用本文所述的药物组合物。可以将本文所述的药物组合物直接注射入受试者的炎症部位、局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤或感染部位。
免疫细胞修饰方法
方法可包括向免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)递送包含一种或多种核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码：(a)胞外结构域(例如，如本文所述的胞外结构域)，(b)跨膜结构域(例如，如本文所述的跨膜结构域)，和(c)胞内结构域(例如，如本文所述的胞内结构域)，使得免疫细胞包含包括(a)-(c)的CAR。在一些实施方案中，包含一种或多种核酸序列的核酸构建体进一步编码以下一者、两者或三者：(d)胞外前导结构域(例如，如本文所述的胞外前导结构域)，(e)胞外铰链结构域(例如，如本文所述的胞外铰链结构域)，或(f)胞内共刺激结构域(例如，如本文所述的胞内共刺激结构域)。
可以通过物理、化学或生物学方法将包含编码如本文所述的至少一种CAR的一种或多种核酸序列的核酸构建体引入免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)中。用于将如本文所述的核酸构建体引入免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)中的物理方法可包括电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射或其组合。可以使用可商购获得的方法将核酸构建体引入免疫细胞中，所述方法包括电穿孔(Amaxa
Figure BDA0004047565970000771
(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)、ECM 830BTX(Harvard Instruments,Boston,Mass.)Gene Pulser
Figure BDA0004047565970000772
(BioRad,Denver,Colo.)或
Figure BDA0004047565970000773
(Eppendort,HamburgGermany))。还可以使用mRNA转染将核酸构建体引入免疫细胞中，所述转染例如阳离子脂质体介导的转染、脂质转染、聚合物封装、肽介导的转染或生物射弹粒子递送系统，诸如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)，将其通过引用完整并入本文)。
用于将如本文所述的核酸构建体引入免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已广泛用于将基因插入哺乳动物细胞(例如，人细胞)中。病毒载体还可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒(例如Adf535)或腺相关病毒(参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号，将其通过引用完整并入本文)。逆转录病毒载体，诸如慢病毒，是实现长期基因转移的适当工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中增殖。
用于将如本文所述的核酸构建体引入免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)中的化学手段包括胶体分散系统、大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统(例如，水包油乳液、胶束、混合胶束、纳米颗粒、脂质体和脂染胺(lipofectamine)-核酸复合物)。
如本文所述的用于递送核酸构建体的示例性系统是基于脂质的系统。可以将如本文所述的核酸构建体封装在脂质体的水性内部，散布在脂质双层中，经由连接分子连接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液或悬浮液中，与脂质混合，与胶束复合，或以其他方式与脂质结合。用于本文所述方法的脂质可以是天然存在的或合成的脂质。脂质也可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱可以从Sigma(St.Louis,MO)获得；磷酸二鲸蜡脂可从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇可以从Calbiochem-Behring获得；并且二肉豆蔻磷脂酰甘油可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。可以将氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液在约-20℃储存。
可以进行多种测定法，以确认如本文所述的核酸构建体在免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)中的存在。例如，这样的测定法包括本领域技术人员熟知的分子生物学测定法，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；以及生物化学测定法，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)。
编码CAR的核酸的VPX介导的病毒递送
本文所述的免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)可能对慢病毒转导有抗性，因为限制因子SAMHD1的表达耗尽了可用于逆转录的核苷三磷酸。例如，SAMHD1可以通过耗尽脱氧核苷三磷酸的胞内池来限制人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的复制。病毒蛋白X(Vpx)是一种与猴免疫缺陷病毒(SIV)和HIV-2相关的辅助蛋白，其诱导SAMHD1的降解。Vpx的使用可以考虑到病毒载体，例如慢病毒，其包含一种或多种编码至少一种针对本文所述免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的CAR的核酸序列。在一些实施方案中，例如相对于用包含一种或多种编码至少一种CAR且未包装至少一种Vpx蛋白的核酸序列的病毒载体转染的相同类型的免疫细胞，包含一种或多种编码至少一种CAR且包装有至少一种Vpx蛋白的核酸序列的病毒载体可以增加本文所述免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的转染。在一些实施方案中，Vpx慢病毒可导致CAR序列的基因组整合，从而使嵌合抗原受体(CAR)能够长期、永久地表达。鉴于CAR是定期再循环进入胞内空间的跨膜蛋白，CAR与Vpx-慢病毒的永久细胞表面表达的证明是本领域的显著发展。Vpx-慢病毒转导的巨噬细胞不因病毒转导而影响表型-发现能够产生具有表型可塑性的CAR巨噬细胞。虽然其他病毒载体(诸如Ad5f35)诱导M1促炎表型，但Vpx-慢病毒对M1/M2表型无影响——使得可能没有基线促炎功能/毒性的M0 CAR巨噬细胞产品成为可能。Vpx-慢病毒转导的CAR巨噬细胞保留了表型可塑性，并且可以通过细胞因子、激动剂、肽、培养基和其他因子进一步极化为M1或M2表型。Vpx-慢病毒转导的CAR巨噬细胞可暴露于促炎信号(例如，一种或多种促炎细胞因子，例如LPS、IFNa、IFNb、IFNγ、CpG、CD40L、GM-CSF、TNFa、IL-6或STING配体(STING-L)中的一种或多种)并极化成M1巨噬细胞。Vpx-慢病毒转导的CAR巨噬细胞可暴露于免疫抑制信号(例如，一种或多种免疫抑制细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-13或TGFb中的一种或多种)和/或至少一种前列腺素或至少皮质类固醇中的一种或两种)并极化成M2巨噬细胞。
在一些实施方案中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白(例如，如国际公开号WO 2017/044487中所述，将其通过引用完整并入本文)。在一些实施方案中，Vpx包含病毒体相关蛋白(例如，用于病毒复制的辅助蛋白)。在一些实施方案中，Vpx蛋白由人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)编码。在一些实施方案中，Vpx蛋白由猴免疫缺陷病毒(SIV)编码。在一些实施方案中，将如本文所述的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)用包装有Vpx蛋白的慢病毒载体转染。在一些实施方案中，Vpx抑制如本文所述的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)的至少一种抗病毒因子。
在一些实施方案中，相对于例如与未包装Vpx蛋白的慢病毒载体，包装有Vpx蛋白的慢病毒载体表现出增加的如本文所述的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)的转染效率。在一些实施方案中，在用病毒载体(例如，腺病毒载体，例如，Ad2载体或Ad5载体(例如，Ad5f35腺病毒载体，例如，辅助依赖型Ad5F35腺病毒载体))转染之前，将如本文所述的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)用至少一种VPX mRNA电穿孔或转染(一者或两者)。
修饰过程中免疫细胞的处理和培养
在一些实施方案中，本公开的方法包括在修饰免疫细胞的过程中处理免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)的一个或多个步骤。
在一些实施方案中，本公开的方法包括用通过体外转录的mRNA激活的途径的调节剂处理免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)的步骤。体外转录(IVT)的mRNA被各种内体先天免疫受体(Toll样受体3(TLR3)、TLR7和TLR8)以及细胞质先天免疫受体(蛋白激酶RNA激活(PKR)、视黄酸诱导基因I蛋白(RIG-I)、黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)和2'-5'-寡腺苷酸合酶(OAS))识别。通过这些不同途径的信号传导导致与1型干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-12和转录程序级联的激活相关的炎症。总体而言，这些创造了为诱导特异性免疫应答做好准备的促炎微环境。而且，下游效应与IVT mRNA的药代动力学和药效学有关，所述下游效应诸如通过真核翻译起始因子2α(eIF2α)磷酸化减缓翻译、通过RNA酶L(RNaseL)增强RNA降解以及自扩增mRNA的过表达和复制抑制。
在一些实施方案中，通过体外转录的mRNA激活的途径的调节剂包括RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，通过体外转录的mRNA激活的途径的调节剂包括RNA酶L、RNA酶T2或RNA酶1抑制剂。在一些实施方案中，通过体外转录的mRNA激活的途径的调节剂包括RNA酶L抑制剂。在一些实施方案中，RNA酶L抑制剂包括舒尼替尼。在一些实施方案中，RNA酶L抑制剂包括ABCE1。
在一些实施方案中，相对于未用RNA酶L抑制剂处理的相同类型的修饰免疫细胞中的mRNA稳定性，用RNA酶L抑制剂处理免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了修饰的免疫细胞中的mRNA稳定性。在一些实施方案中，相对于未用RNA酶L抑制剂处理的相同类型的修饰免疫细胞中的CAR表达，用RNA酶L抑制剂处理免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了修饰的免疫细胞中的CAR表达。在一些实施方案中，相对于未用RNA酶L抑制剂处理的相同类型的修饰免疫细胞中的效应子活性，用RNA酶L抑制剂处理免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了修饰的免疫细胞中的效应子活性。
在本公开的一些实施方案中，处理免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)的步骤发生在将mRNA递送至所述免疫细胞的步骤之前。
在一些实施方案中，本公开的方法包括用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)的步骤。在一些实施方案中，细胞因子包括IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNFα、IL-6、STNGL、LPS、CD40激动剂、4-1BB配体、重组4-1BB、CD19激动剂、TLR激动剂(例如TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8或TLR-9)、TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、糖皮质激素、免疫复合物、白细胞介素1α(IL-1α)、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、TNF-β、CD154、淋巴毒素β(LT-β)、增殖诱导配体(APRIL)、CD70、CD153、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、OX40L(CD252)、TALL-1(肿瘤坏死因子配体超家族成员13B-TNFSF13B)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF相关弱凋亡诱导剂(TWEAK)、TNF相关活化诱导细胞因子(TRANCE)、促红细胞生成素(Epo)、甲状腺过氧化物酶前体(Tpo)、FMS相关酪氨酸激酶3配体(FLT-3L)、干细胞因子(SCF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、裂殖子表面蛋白(MSP)、含核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(NOD)配体(例如NOD1、NOD2或NOD1/2激动剂)、RIG-I样受体(RLR)配体(例如5'ppp-dsRNA、3p-hpRNA、Poly(I:C)或Poly(dA:dT))、C型凝集素受体(CLR)配体(例如，可得然胶、β-葡聚糖、HKCA、昆布多糖、石耳多糖、硬葡聚糖、WGP可分散、WGP可溶、酵母聚糖、酵母聚糖耗尽(zymosan depleted)、furfurman、b-GlcCer、GlcC14C18、HKMT、TDB、TDB-HS15或TDM)、环状二核苷酸传感器配体(例如，C-Gas激动剂或干扰素基因刺激因子(STING)配体)、炎症小体诱导剂(例如，明矾、ATP、CPPD晶体、疟色素、MSU晶体、Nano-SiO2、尼日利亚菌素或TDB)、芳烃(AhR)配体(例如FICZ、靛玉红、ITE或L-犬尿氨酸)、α-蛋白激酶1(ALPK1)配体、多PRR配体、NFKB/NFAT活化剂(例如伴刀豆球蛋白A、离子霉素、PHA-P或PMA)或其组合。在一些实施方案中，细胞因子包括IFN-β。
在本公开的一些实施方案中，培养免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)的步骤发生在将mRNA递送至所述免疫细胞的步骤之后。
在一些实施方案中，相对于未用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养的相同类型的修饰的免疫细胞，用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养修饰的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了所述修饰的免疫细胞的活力。在一些实施方案中，相对于未用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养的相同类型的修饰的免疫细胞，用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养修饰的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了所述修饰的免疫细胞的蛋白质(例如，CAR)表达。在一些实施方案中，相对于未用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养的相同类型的修饰的免疫细胞，用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养修饰的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了蛋白质(例如，CAR)表达的寿命。在一些实施方案中，相对于未用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养的相同类型的修饰的免疫细胞，用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养修饰的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了所述修饰的免疫细胞的效应子活性。在一些实施方案中，相对于未用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养的相同类型的修饰的免疫细胞，用细胞因子或免疫刺激性重组蛋白培养修饰的免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)增加了所述修饰的免疫细胞的M1极化。
将本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献(包括GenBank登录号)通过引用完整并入本文。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的而非意图具有限制性。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料，但在本文中描述了适合的方法和材料。
通过以下实施例进一步说明本公开。提供的实施例仅用于说明的目的。不应被解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。
实施例
提供以下实施例以便向熟练技术人员描述如何产生和使用本文所述的方法和组合物，并且不意图限制本公开的范围。
实施例1：嵌合抗原受体(CAR)巨噬细胞和单核细胞
可以通过用DNA、mRNA或化学修饰的mRNA电穿孔或转染或通过用慢病毒、腺病毒或替代病毒载体的病毒转导将CAR转基因引入单核细胞或巨噬细胞中。将通过流式细胞术、实时PCR或荧光显微镜检查使用抗原特异性染色来证实CAR的表达。这些技术也将用于确定CAR表达的强度和动力学。
将在针对靶阳性细胞系的肿瘤吞噬作用测定和/或肿瘤杀伤试验中测试在巨噬细胞表面表达的CAR构建体的活性。将测试引起靶细胞的吞噬作用和/或杀伤的构建体的细胞因子分泌、趋化因子分泌、免疫细胞募集能力、表型改变(即自极化为M1/M2)和T细胞刺激/抗原呈递功能。
表1显示了用于本文所述的CAR组分的示例性mRNA和多肽序列。CAR组分的示例性CAR构建体显示在图8-117和135中。
表1.本文所述CAR组分的mRNA和多肽序列(分别为GenBank登录号和UniProt KB代码)。
Figure BDA0004047565970000851
Figure BDA0004047565970000861
实施例2：原代人巨噬细胞和单核细胞的病毒转导
对于慢病毒生产，将在补充有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的10mL的DMEM培养基中的HEK293T细胞以3.5x106个细胞/10cm板铺板。在过夜生长之后，使用磷酸钙转染，用pVSV-G(2.5μg)、RSV-Rev(2.5μg)、PMDL-Chp6(10μg)、pVPX(1μg)和含有期望的插入序列(14μg)的慢病毒转移质粒转染平板。转染后16小时弃去上清液，随后添加6mL DMEM。转染后48小时收获上清液，随后以1,200xg离心5分钟，并通过0.45mm过滤器过滤。将病毒储存在-80℃，供以后使用。
对于原代人巨噬细胞的慢病毒转导，将原代人巨噬细胞以给定的密度铺板，并在37℃下孵育2小时。然后以指定的感染复数(MOI)将慢病毒添加到巨噬细胞培养物中。在48-72小时之后，更换培养基并将转导的巨噬细胞用于各种测定。
实施例3：单核细胞和巨噬细胞的受体表达
将CD14+单核细胞衍生的巨噬细胞用培养基(10-20％FBS-TEX-MACS，具有10ng/mlGM-CSF)铺板并培养过夜。转染120nM的CAR mRNA，在培养基中在37℃孵育一天，通过流式细胞术检测具有rHER2结合的CAR表达。约60-70％的CAR和嵌合FcR(CFR)转染的细胞以及40-60％的Toll样抗原受体(TAR)转染的细胞是活的(图1A)。CAR：HER2表达在CAR转染的细胞中为40-60％阳性，在CFR和TAR转染的细胞中为30-40％阳性(图1B)。CAR1和CAR13表达比原代人巨噬细胞中的其他构建体更突出。
用MACS珠纯化的CD14+单核细胞在培养基中静置过夜。转染40nM的CAR mRNA，将细胞在37℃孵育三天，通过流式细胞术检测具有rHER2结合的CAR表达。将Ad5f35用作阳性对照。约50-80％的CAR和TAR转染的细胞以及40-60％的CFR转染的细胞是活的(图2A)。CAR：HER2表达在CAR、CFR和TAR转染的单核细胞中为15-30％阳性(图2B)。这些结果表明CAR、CFR和TAR mRNA可以在原代人单核细胞中表达；然而，表达强度远低于巨噬细胞。
实施例4：CAR巨噬细胞的受体表达和肿瘤细胞杀伤
为了生成表达受体的巨噬细胞，将原代人巨噬细胞以1.0x105至1.0x109个细胞/mL的浓度悬浮在含有50-500nM mRNA(或基于mRNA原液可能的最高浓度)的EP缓冲液中，并进行电穿孔。将细胞从盒中移出，在含有20％ FBS的TexMACS培养基中铺板，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。在24小时后通过流式细胞术的rHER2结合来检测CAR、CFR和TAR表达MFI以及百分比。使用Live/Dead Aqua检测活百分比。对于杀伤，将巨噬细胞与Her2+CRL2351-NucGFP肿瘤细胞以2:1E:T比率共培养并通过
Figure BDA0004047565970000881
监测72小时。通过相对于时间0的每孔积分GFP强度计算肿瘤细胞死亡。
CAR构建体之间的表达和CAR+百分比是可变的(图3A和B以及119和120)。mRNA电穿孔似乎不影响活百分比(图3C和118)。似乎没有CFR或TAR构建体对肿瘤细胞杀伤有作用。构建体CAR001(包含CD8前导序列、HER2 scFv、CD8铰链、CD8 TM和CD3z IC的CAR)、CAR003(包含CD8前导序列、HER2 scFv、CD8铰链和CD8 TM的CAR)、CAR007(包含CD8前导序列、4D5scFv、IgG4铰链、CD8 TM和CD3z IC的CAR)、CAR013(包含CD8前导序列、HER2 scFv、CD8铰链、CD64 TM和CD64 ICD的CAR)、CAR017(包含CD8前导序列、HER2 scFv、CD8铰链、CD64 TM、CD64ICD、P2A和FCER1G的CAR)和CAR039(包含CD8前导序列、HER2 scFv、CD8铰链、TLR4 TM和TLR4ICD的CAR)在原代人巨噬细胞中表达并显示出杀伤功能(图3D)。
在构建体之间的表达以及CFR和TAR+百分比是可变的(图4A和B)。mRNA电穿孔似乎不影响活百分比(图4C)。
实施例5：CAR表达的评估
可以通过流式细胞术评估CAR表达的持续时间。CAR巨噬细胞可以铺板到96孔板的孔中。为了测量抗Her2 CAR的表达，将带有His标签的重组Her2蛋白以及补充有BSA的缓冲液(诸如PBS)添加至细胞并孵育15分钟。然后将细胞以300xg离心5分钟并移出上清液。然后使用Fc阻断溶液(诸如Human TruStain FcX(BioLegend，目录422302))在PBS中阻断Fc受体五分钟。在Fc阻断后，可以完成细胞活力和其他表面标志物的染色。例如，可以使用LIVE/DEADTM可固定Aqua死细胞染色试剂盒(Invitrogen，目录L34957)确定细胞活力。另外，添加抗His抗体，诸如His标签APC缀合的抗体(R&D系统、目录IC050A)。通过流式细胞术确定CAR的表达，首先对单个细胞群进行门控，随后选择活细胞，最后测量细胞的APC荧光。表达CAR的细胞在APC通道中将比未曾暴露于抗His抗体的对照细胞更亮。CAR阳性细胞的亮度决定了表达的程度，而随着时间的推移重复测量允许跟踪随着时间的推移的CAR表达。
对于免疫荧光，在适当时可以在载玻片上培养细胞。然后移出培养基并用PBS洗涤细胞三次。然后可以使用4％多聚甲醛或甲醇固定细胞。在固定剂中孵育的确切时间将取决于其身份。一旦经过正确的时间量，去除固定剂并再用PBS洗涤细胞三次。如果期望细胞内染色，现在将细胞在PBS中的1％ Triton X-100(ThermoFisher，目录BP151-100)中孵育，然后在PBS中洗涤三次。现在将封闭溶液(例如PBS中的BSA)添加至细胞，并使其封闭60分钟。然后移出封闭溶液并洗涤细胞。根据制造商的说明稀释荧光染料缀合抗体，并使其与细胞结合过夜。然后移出抗体溶液并洗涤细胞。最后，将封固液(诸如ProLongTMDiamondAntifade Mountant with DAPI(Invitrogen，目录P36966))施用于细胞上，将盖玻片放在上面。在成像之前允许干燥24小时。通过荧光显微镜检查进行成像。在荧光团的适当通道中，表达CAR的细胞比不表达CAR的细胞更亮。
对于RTPCR，可以按照制造商的说明，通过使用1步试剂盒RTPCR试剂盒(SuperScriptTMIII PlatinumTMOne-Step qRT-PCR试剂盒，Invitrogen目录11732-020)裂解巨噬细胞并收集RNA。将CAR特异性引物用于检测。具有针对CAR的mRNA的巨噬细胞将在RTPCR测定中显示信号，而未转导的巨噬细胞将不显示所述信号。
实施例6：CAR功能的评估
对于细胞的流式吞噬作用测定，根据制造商的说明，用CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(Invitrogen，目录C34554)标记靶阳性和靶阴性肿瘤细胞，或者将细胞工程化为表达荧光蛋白如GFP。然后将表达CAR的巨噬细胞和对照巨噬细胞以1:1巨噬细胞:肿瘤细胞比率铺板在U型底96孔板中，并培养4小时。在孵育结束时，将细胞从孔中取出并染色用于流式细胞术。该板包括活力染料和巨噬细胞特异性标志物，诸如CD11b。在对活细胞进行门控时，CD11b/CFSE双阳性细胞是推测吞噬了细胞的巨噬细胞。与没有CAR的巨噬细胞相比，当与靶阳性肿瘤细胞一起培养时，CAR巨噬细胞应该具有增加的双阳性细胞百分比。另外，当巨噬细胞与靶阴性细胞一起培养时，吞噬作用的特异性未显示显著变化。
对于使用珠子的流式吞噬作用测定法，可以用CAR的靶标或无关蛋白将聚苯乙烯珠子功能化。另外，将这些珠子用pH反应性染料pHrodoTMRed,SE(Invitrogen，目录P36600)标记。酸化后，染料增加其荧光水平。然后将珠子与CAR和未转导的巨噬细胞一起培养。在一段时间之后，可以使用活性染料和巨噬细胞特异性标志物(诸如CD11b)移出巨噬细胞并对其进行流式细胞术染色。在对活细胞进行门控时，CD11b/pHrodo双阳性细胞是推测吞噬了珠子胞的巨噬细胞。与没有CAR的巨噬细胞相比，当与靶阳性珠子一起培养时，CAR巨噬细胞应该具有增加的双阳性细胞百分比。另外，当巨噬细胞与靶阴性珠子一起培养时，吞噬作用的特异性未显示显著变化。
对于细胞的
Figure BDA0004047565970000902
分析，将表达荧光蛋白(如GFP)的靶阳性肿瘤细胞与CAR和未转导的巨噬细胞一起在96孔板中培养。在效应巨噬细胞和靶肿瘤细胞之间的比率在10:1E:T至1:10E:T之间变化，并且0:1E:T为仅靶细胞对照。巨噬细胞的数量恒定保持在每孔10e3个巨噬细胞。可以测量随时间的荧光变化，每四个小时测量一次，以确定在培养物中发生的肿瘤细胞杀伤的量。另外，可以使用图像分析技术来确定培养物中巨噬细胞的位置，并确定还吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞的数量。与未转导的巨噬细胞或仅肿瘤细胞的对照相比，CAR巨噬细胞应该显示出增加的巨噬细胞和肿瘤细胞的共定位，以及增加的杀伤。
对于珠子的
Figure BDA0004047565970000901
分析，将带有CAR的蛋白质靶标的pHrodo功能化珠子添加至96孔板的孔中的CAR和未转导的巨噬细胞。将巨噬细胞以每孔20e3的浓度铺板，并以5:1珠子与巨噬细胞的比率添加珠子。pHrodo的荧光测量持续五小时，每30分钟测量一次。使用在初始时间点和1小时时间点之间的荧光增加比率来确定发生的吞噬作用的量。预期CAR巨噬细胞比未转导的对照具有更高的荧光变化。
对于吞噬作用后的抗原加工和呈递，可以分析T细胞扩增、IL2释放、IFNg释放、TNFa释放和/或CD69上调。可以获得和培养已知对特定抗原(例如卵清蛋白)有反应的T细胞克隆。通常，这些克隆是鼠细胞。将MHC已经与T细胞匹配的小鼠CAR巨噬细胞与表达CAR靶向受体和已知抗原的癌细胞一起培养。然后可以分离巨噬细胞并与T细胞共培养。通过巨噬细胞呈递抗原后，T细胞将分泌IL2(可通过细胞因子测量技术测量)并增殖(可通过计数细胞数或CFSE稀释度测量)。另外，可以通过T细胞与抗原表达细胞系的共培养来检查活化T细胞的细胞毒性功能。与未转导的巨噬细胞对照相比，预期CAR巨噬细胞引起T细胞中更多的增殖和增加的细胞因子产生。
还可以评估除了吞噬作用以外的其他方式的肿瘤杀伤。在条件培养基中，CAR巨噬细胞和靶阳性细胞可以一起共培养一段时间(例如24小时)，以使巨噬细胞感知和响应靶细胞。肿瘤细胞数量之间的比率可以根据肿瘤细胞上靶蛋白的表达水平而变化。经过期望的时间量之后，将上清液从CAR巨噬细胞移出，并通过0.22微米的过滤器过滤或离心去除上清液中剩余的任何细胞。然后将过滤后的上清液置于未曾与CAR巨噬细胞一起培养的其他癌细胞上。可以通过细胞计数、流式细胞术、MTT/XTT测定或显微镜检查测量产生的肿瘤细胞活力和增殖变化。与用相同靶阳性细胞系培养的未转导巨噬细胞的上清液相比，CAR巨噬细胞应该引起用上清液培养的肿瘤细胞的死亡或生长速率降低。
对于靶+/靶-/CAR巨噬细胞的共培养，将CAR巨噬细胞、靶阳性细胞和靶阴性细胞一起共培养。必须有一些方式来区分靶阳性和靶阴性细胞，例如不同荧光蛋白的表达。随着时间的推移，可以通过显微镜检查或流式细胞术确定不同细胞类型的相对数量。比较靶阴性细胞与CAR巨噬细胞在有和没有靶阳性细胞的情况下的生长情况，有助于在一定程度上深入了解未使用吞噬作用的肿瘤细胞杀伤。将预期的是，与未转导的巨噬细胞相比，CAR巨噬细胞将显示靶阴性细胞系的死亡增加或生长速率降低。另外，取决于靶阳性细胞的存在，预期在与CAR巨噬细胞一起培养的靶阴性细胞之间也存在差异。
为了通过流式细胞术产生有利的细胞因子，可以将CAR巨噬细胞与靶阳性细胞或靶阳性珠子以及靶阴性对照共培养。在特定的时间量之后，可以收获培养物的上清液并通过过滤或离心去除杂散细胞。可以通过使用基于流式细胞术的细胞因子珠子测定法测量上清液中各种细胞因子的浓度来测量期望的细胞因子。根据制造商的说明将珠子染色。这种系统的一个实例是BioLegend LEGENDplex系统。另外，通过使用流式细胞术的胞内细胞因子染色的使用，可以从培养系统收获CAR巨噬细胞并对其进行染色，用于细胞因子产生。可以根据制造商的指示，例如固定/透化溶液试剂盒(BD，目录554714)，将细胞固定、透化和染色。与未转导的巨噬细胞或未用靶蛋白刺激的CAR巨噬细胞相比，用靶阳性细胞或珠子培养的CAR巨噬细胞应显示出更高水平的促炎细胞因子。
为了ELISA/MSD分析，可以将CAR巨噬细胞与靶阳性细胞或靶阳性珠子以及靶阴性对照共培养。在特定的时间量之后，可以收获培养物的上清液并通过过滤或离心去除杂散细胞。一个实例是8:1的巨噬细胞与靶的比率，持续24小时。在培养期之后，移出上清液并按照制造商的指示使用ELISA细胞因子试剂盒(ex IL-1β人瞬时ELISATM试剂盒，Invitrogen目录BMS224INST)测量溶液中存在的细胞因子的量。另外，可以按照制造商的指示通过使用MesoScaleDiscovery QuickPlex系统测量细胞因子。预期的是，与未转导的巨噬细胞或未用靶蛋白刺激的CAR巨噬细胞相比，用靶阳性细胞或珠子培养的CAR巨噬细胞应显示出更高水平的促炎细胞因子。
为了通过流式细胞术产生ROS，可以将CAR巨噬细胞与靶阳性细胞或靶阳性珠子以及靶阴性对照共培养。可以在相同条件下培养未转导的巨噬细胞。可以通过使用基于流式细胞术的试剂盒诸如总活性氧(ROS)测定试剂盒520nm(Invitrogen，目录88-5930-74)来测量活性氧(ROS)的产生。可以根据制造商的说明制备细胞。预期的是，相比于与靶阴性细胞或珠子一起培养的CAR巨噬细胞和与靶阳性或阴性细胞或珠子一起培养的未转导巨噬细胞，与靶阳性细胞或珠子一起培养的CAR巨噬细胞将显示出更高水平的ROS。另外的方法描述于Dikalov和HarrisonAntioxid Redox Signal.2014；20(2):372-382，将其通过引用完整并入本文。
对于吞噬检查点的抗性，可以将CAR巨噬细胞与具有不同水平的CD47或其他抗吞噬配体的靶阳性珠子或细胞共培养。通过用于将珠子功能化的蛋白质的量的差异，珠子可以容易地改变CD47或其他抗吞噬配体的水平。改变细胞上的抗吞噬配体的水平需要基因工程，诸如使用shRNA或CRISPR/Cas9系统。如以上章节所述，可以通过显微镜检查或流式细胞术量化吞噬作用的量。预期随着CD47或其他抗吞噬配体的量增加，CAR和未转导的巨噬细胞两者都显示出更小的吞噬作用。与CAR和未转导类型两者的缺乏这样的显性负性受体的巨噬细胞相比，经过工程改造以表达显性负性受体(诸如截短的SIRPa)的巨噬细胞应该显示出增加的吞噬作用水平。
为了与CD47阻断比较，可以通过使用阻断抗体阻断CD47诸如鼠克隆B6H12的作用。改变靶阳性或阴性细胞表面上CD47的量将允许不同水平的吞噬作用。可以通过用不同量的阻断抗体培养靶阳性细胞和靶阴性细胞来确定CD47阻断抗体的剂量-滴定曲线。使用CAR和未转导巨噬细胞两者的吞噬作用测定法应该表明，与未转导的细胞相比，在给定的CD47阻断水平下，Car巨噬细胞对CD47较不敏感，其显示出较低的抑制水平。相反，靶阴性细胞将显示在CAR和未转导的巨噬细胞之间无差异。
为了表达趋化因子受体以帮助运输，可以通过特异性抗体与CAR巨噬细胞的结合来测量趋化因子受体的表达，所述结合然后可以使用流式细胞仪进行测量。预期的是，与未转导的巨噬细胞相比，CAR巨噬细胞将显示出更高水平和更广泛种类的趋化因子受体。
可以裂解CAR和未转导的巨噬细胞并收获RNA用于RNA测序技术。比较细胞内表达的RNA转录物可以允许确定细胞上表达了哪些受体。预期的是，与未转导的巨噬细胞相比，CAR巨噬细胞将显示出更高水平和更广泛种类的趋化因子受体。
对于蛋白质印迹，可以培养、裂解CAR和未转导的巨噬细胞，并收集总蛋白。然后将这个蛋白质通过其在电场中通过凝胶的流动性按大小分级，然后转移到膜上。可以使用对某种蛋白质特异的抗体将膜染色，并且可以通过这种染色确定蛋白质的存在或不存在。预期的是，与未转导的巨噬细胞相比，CAR巨噬细胞将显示出更高水平和更广泛种类的趋化因子受体。
为了表达趋化因子以募集其他免疫细胞，可以将CAR巨噬细胞与靶阳性细胞或靶阳性珠子以及靶阴性对照共培养。在特定的时间量之后，可以收获培养物的上清液并通过过滤或离心去除杂散细胞。可以通过使用基于流式细胞术的细胞因子珠子测定法测量上清液中各种细胞因子的浓度来测量期望的细胞因子。根据制造商的说明将珠子染色。这种系统的一个实例是BioLegend LEGENDplex系统。另外，通过使用流式细胞术的胞内细胞因子染色的使用，可以从培养系统收获CAR巨噬细胞并对其进行染色，用于细胞因子产生。可以根据制造商的指示，例如固定/透化溶液试剂盒(BD，目录554714)，将细胞固定、透化和染色。与未转导的巨噬细胞或未用靶蛋白刺激的CAR巨噬细胞相比，用靶阳性细胞或珠子培养的CAR巨噬细胞应显示出更高水平的促炎细胞因子。
为了ELISA/MSD，可以将CAR巨噬细胞与靶阳性细胞或靶阳性珠子以及靶阴性对照共培养。在特定的时间量之后，可以收获培养物的上清液并通过过滤或离心去除杂散细胞。一个实例是8:1的巨噬细胞与靶的比率，持续24小时。在培养期之后，移出上清液并按照制造商的指示使用ELISA细胞因子试剂盒(ex IL-1β人瞬时ELISATM试剂盒，Invitrogen目录BMS224INST)测量溶液中存在的细胞因子的量。另外，可以按照制造商的指示通过使用MesoScaleDiscovery QuickPlex系统测量细胞因子。预期的是，与未转导的巨噬细胞或未用靶蛋白刺激的CAR巨噬细胞相比，用靶阳性细胞或珠子培养的CAR巨噬细胞应显示出更高水平的促炎细胞因子。
为了跨孔测定，可以将CAR巨噬细胞与靶阳性细胞或靶阳性珠子以及靶阴性对照共培养。另外，可以分开培养巨噬细胞和靶细胞作为对照。在充分孵育之后，例如48小时，可以收获上清液并通过过滤移出剩余的细胞。根据制造商的说明，可以用CFSE标记纯化的免疫细胞亚群，诸如CD3阳性T细胞。可以用胞外基质蛋白(诸如，纤连蛋白或胶原蛋白)将跨孔插入物(例如，具有3.0μm孔聚碳酸酯膜的HTS
Figure BDA0004047565970000951
-96渗透性支持物，Corning目录3386)功能化。将基质蛋白制成溶液并在37℃下施用于膜，持续30分钟。然后移出剩余溶液并用PBS洗涤膜。然后将CFSE标记的细胞重悬于无血清培养基中并放置在插入物的顶面上。允许这些细胞沉降并粘附20分钟。然后转移插入物，使膜的底面暴露于收集的上清液。允许细胞迁移至少2小时。在孵育期之后，移出插入物并测量底板中含有上清液的孔的荧光。预期的是，与未转导的对照相比，CAR巨噬细胞将表现出更高程度的募集。另外，相比于与靶阴性细胞一起培养的CAR巨噬细胞，预期与靶阳性细胞一起培养的CAR巨噬细胞更好地募集标记的免疫细胞。
对于CFSE稀释的增殖，可以根据制造商的指示用CFSE染色剂标记巨噬细胞。然后可以将这些标记的巨噬细胞培养适当的时间段。可以使用细胞内的CFSE稀释水平来确定巨噬细胞的增殖程度。
对于MTT/XTT测定法，将细胞铺板并使用关于MTT(ThermoFisher，目录V13154)或XTT(ThermoFisher，目录X12223)测定法的制造商说明书运行测定法。
为了从诱导的多能干细胞(iPSC)中产生巨噬细胞，可以使用如在Ackermann等人，Nat Commun.2018；9(1):5088；Zhang等人，Circ Res.2015；117(1):17-28；Mucci等人，StemCell Reports.2018；11(3):696-710；Shi等人，Curr Protoc Stem Cell Biol.2019；48(1):e74；和Takata等人，2017；47(1):183-198.e6；Cao等人，Stem Cell Reports.2019；12(6):1282-1297中所述的方法，将其各自通过引用完整并入本文。为了制备IPSC，可以在分化前进行慢病毒转导。
实施例7：巨噬细胞的引发
为了生成表达Her2-ζCAR的巨噬细胞，将原代人巨噬细胞以90x106个细胞/mL的浓度悬浮在含有300nM mRNA(TriLink)的EP缓冲液(MaxCyte)中。将100μL的细胞混合物添加到电穿孔盒(OC100x2；MaxCyte)中，并使用实验性T细胞1设置进行电穿孔。从盒中取出细胞，将其铺板在UpCell板(Thermo Scientific)上的3mL的含有20％FBS(Gibco)的TexMACS培养基(Miltenyi Biotech)中，然后37℃和5％CO2下孵育过夜。
将重组CD40配体(Peprotech)、4-1BB配体(Enzo Life Sciences)和4-1BB受体(Peprotech)重悬于分子级水中，达到储备浓度100μg/mL。然后使用储备溶液产生在PBS中的工作溶液，范围为2–0.002μg/mL。将100uL的工作溶液添加到96孔板的孔中，并在室温下放置4小时。
从培养箱移出板并在室温下放置30分钟。使细胞从板脱离，使用NC-200自动细胞计数仪(Chemomtech)计数，并重悬于具有10％FBS的TexMACS培养基中。用PBS洗涤蛋白质包被板2次，随后以终体积100uL的具有10％ FBS的TexMACS培养基添加巨噬细胞。将板在37℃和5％ CO2下孵育3小时。在3小时之后，将10,000个表达核GFP的CRL-2351细胞添加到每个孔中。在所有孔中GM-CSF的终浓度为10ng/mL。使用
Figure BDA0004047565970000971
分析(Essen Bioscience)检测细胞溶解。通过相对于时间0的每孔积分GFP强度计算肿瘤细胞死亡。
为了检测细胞表面蛋白，将巨噬细胞以200uL TexMACS培养基+10％ FBS+10ng/mLGM-CSF的终体积铺板到包被有激动剂分子的孔中，并且在37℃和5％ CO2下孵育3天。将细胞在300μL Accutase(细胞分离液)(Sigma)中孵育30分钟，然后转移到96孔圆底板中进行染色。将细胞在含有20μg/mL Her2-His的FACS缓冲液中在RT下孵育20分钟，随后在HumanTruStain FcX中在RT下孵育10分钟。使用以下小组进行表面蛋白染色：CD80-FITC、CD86-PE、CD163-APC-Cy7、CD206-BV421、抗His-APC、Aqua Live/Dead。使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fischer)完成表面蛋白表达的检测。
用CD40L处理CAR巨噬细胞显著提高了巨噬细胞和CAR巨噬细胞的肿瘤杀伤能力(图5A)。用CD40L引发还在mRNA转导的CAR巨噬细胞中诱导了M1表型(图5B)。用4-1BB和4-1BBL处理引起相似的结果，尽管不如CD40L有效(图6A-6B和7A-7B)。这些结果表明，用CD40激动剂(诸如CD40L)预处理或引发CAR巨噬细胞可导致疗效提高，并且包含CAR巨噬细胞和CD40激动剂的联合治疗可以具有疗效提高。
实施例8：M1极化增强mRNA持久性和巨噬细胞/CAR巨噬细胞功能
用包含m6AGCap1和PsU修饰的HER2 CAR mRNA将人巨噬细胞电穿孔。将细胞与诱导M1表型的细胞因子一起培养达48小时，所述细胞因子诸如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-γ加脂多糖(LPS)、TNF-α、IL-6或STING配体(STING-L)，然后洗掉细胞因子并加入新鲜培养基。在转染之后第2天和第7天测量CAR表达和M1标志物表达。在转染巨噬细胞两天之后，将荧光标记的HER2+乳腺癌细胞(CRL2351)与HER2 CAR巨噬细胞共培养。经由每四个小时在
Figure BDA0004047565970000981
实时成像显微镜上的荧光监测癌细胞生长。效应子(CAR巨噬细胞)与靶(癌细胞)的比率为5:1。
如图121A所示，测试的干扰素细胞因子在第2天未导致CAR转染的巨噬细胞的活力降低。令人惊讶的是，相比于用对照培养基、IFN-α或IFN-γ处理的巨噬细胞，用IFN-β处理的巨噬细胞表现出更高的CAR表达(图121B)。如图121C所示，用干扰素细胞因子处理巨噬细胞在第7天未导致CAR转染的巨噬细胞的活力降低。令人惊讶的是，相比于用对照培养基、IFN-α或IFN-γ处理的巨噬细胞，用IFN-β处理的巨噬细胞表现出更高的CAR表达-证明IFN-β改善了人巨噬细胞中mRNA编码的转基因(诸如CAR)的表达持续时间(图121D)。另外，用IFN-α、IFN-β或IFN-γ处理mRNA转染的CAR巨噬细胞导致M1表型的诱导(基于CD86表达；图121E)和M2标志物的降低(基于CD163表达；图121F)。IFN-β导致评价的干扰素的最强M1表型，并且M1表型在治疗后持续至少7天(图121E)。
实施例9：IFN处理对CAR表达、CAR巨噬细胞功能、M1表型标志物和细胞因子产生的作用
还测试了五种不同的mRNA修饰，以确定干扰素处理是否不同地影响用包含不同修饰的mRNA转染的巨噬细胞。用包含不同mRNA修饰的HER2 CAR mRNA将人巨噬细胞电穿孔。在电穿孔之后四天通过流式细胞术(Attune)检测CAR表达和M1标志物。然后将第4天的CAR巨噬细胞与Nuc-Light标记的HER2+乳腺癌细胞系(CRL2351)以5:1的效应子(CAR巨噬细胞)与靶(癌细胞)的比率共培养。每四个小时通过
Figure BDA0004047565970000982
实时成像显微镜上的荧光监测癌细胞生长。
为了进一步评价IFN-β对CAR持久性的作用，在第2天和第7天评价用编码HER2 CAR的m6AGCap1/PsU mRNA电穿孔的人巨噬细胞。与未用IFN-β处理的CAR巨噬细胞相比，IFN-β处理导致第7天的CAR表达率显著提高(图122)。
为了验证IFN-β处理对改善CAR表达的作用，并优化IFN-β浓度，将用M6AGCap1/PsU修饰的mRNA转染的巨噬细胞用0、3、10、30或100ng/mL IFN-β处理4小时，并且在电穿孔后4天和7天评价活力、CAR百分比和CAR MFI。观察IFN-β对人巨噬细胞的CAR表达的剂量依赖性作用(图123A)。如实施例4中所述，用IFN-β处理CAR巨噬细胞诱导了M1表型，因此进行了进一步的实验来确定该作用是否是剂量依赖性的。如图123B所示，M1标志物CD80、CD86和HLA-DR的诱导是IFN-β剂量依赖性的。
鉴于巨噬细胞表型被认为是可塑的，并且已知免疫抑制细胞因子诸如IL-10诱导M2表型，因此评价了IL-10处理对经过IFN-β处理或未经处理的HER2 CAR mRNA转染的巨噬细胞的影响。经过IFN-β处理的CAR巨噬细胞抵抗IL-10的作用并且不表达M2标志物CD163，而相反地在处理后48小时(图124A)和用IL-10处理后7天保留M1标志物CD86的表达(图124B)。IFN-β引发的CAR巨噬细胞也抵抗其他M2诱导因子。
为了评价用编码HER2 CAR的mRNA转染的巨噬细胞的抗肿瘤功能，在有或没有用IFN-β引发的情况下，用0、3、10、30或100ng/mL IFN-β引发未转导的(UTD)巨噬细胞或CAR巨噬细胞持续4小时或20小时。然后以3:1或1.5:1的效靶比将这些效应细胞与HER2+乳腺癌细胞系CRL2351-GFP共培养，使用
Figure BDA0004047565970000991
实时成像显微镜基于GFP表达测量抗肿瘤活性。IFN-β引发导致CAR巨噬细胞杀伤癌细胞的能力提高(图125A)。为了评价IFN-β处理是否改善了具有包含修饰的mRNA的CAR巨噬细胞的抗肿瘤活性，评价了用包含独特修饰的mRNA电穿孔的巨噬细胞在有或没有IFN-β处理的情况下的抗肿瘤活性。IFN-β处理导致所有CAR巨噬细胞的抗肿瘤活性改善，但转染5moU mRNA的那些巨噬细胞除外(图125B)。为了评价mRNA转染的CAR巨噬细胞的抗肿瘤作用改善是对所有干扰素普遍还是仅对干扰素β普遍，将用M6AGCap1/PsU mRNA电穿孔的巨噬细胞用IFN-α、β或γ处理，并评价它们的癌细胞杀伤能力。用IFN-β处理的CAR巨噬细胞产生最好的癌细胞杀伤，效果比IFN-α或IFN-γ更好(图125C)。
为了评价巨噬细胞的干扰素处理是否改善了其他抗肿瘤功能，评价了经过干扰素处理或未经其处理的mRNA转染的HER2 CAR巨噬细胞在与HER2+乳腺癌细胞共培养之后的细胞因子分泌。用包含m6AGCap1和PsU修饰的150nM HER2 CAR mRNA将人巨噬细胞电穿孔。在巨噬细胞用CAR mRNA转染之后将HER2+乳腺癌细胞(CRL2351)与CAR巨噬细胞共培养，其中效应子(CAR巨噬细胞)与靶(癌细胞)的比率为3:1。在癌细胞和巨噬细胞共培养48小时之后收集上清液，并使用中尺度发现(MSD)仪器测量细胞因子水平。如图126所示，用IFN-α、IFN-β或IFN-γ处理巨噬细胞导致巨噬细胞分泌细胞因子IL-6、IL-8和TNFα增加。
进行了另外的研究，以确定干扰素处理是否可以进一步改善CAR mRNA在巨噬细胞中的持久性，以及是否可以扩展CAR巨噬细胞的功能。用包含m6AGCap1和PsU修饰的300nMCAR mRNA将人巨噬细胞电穿孔。将细胞用20ng/mL IFN培养24小时，然后洗涤细胞以去除细胞因子。在转染之后第2天通过流式细胞术(Attune)检测CAR表达。然后将细胞与Nuc-Light标记的HER2+乳腺癌细胞系(CRL2351)以3:1的效靶比共培养。通过
Figure BDA0004047565970001001
实时成像显微镜上的荧光监测癌细胞生长。在转染之后7天通过流式细胞术(Attune)检测巨噬细胞中的CAR表达和M1标志物。
如图127A所示，在用CAR mRNA转染两天后，除了已经用IFN-γ处理的巨噬细胞外，CAR巨噬细胞活力和CAR表达非常高。另外，如图127B和图127C所示，IFN处理增强了CAR巨噬细胞的靶细胞杀伤活性。图127C显示了在癌细胞和巨噬细胞共培养72小时之后的靶细胞杀伤。用IFN处理也影响巨噬细胞活力、CAR表达、M1标志物表达和CAR巨噬细胞功能。如图128A所示，相对于在第7天后的时间点未曾用干扰素处理的巨噬细胞，用IFN-β处理转染的巨噬细胞导致细胞活力增加，HER2 CAR表达和M1标志物CD80、CD86和HLA-DR的表达。图128A显示所有巨噬细胞在第7天具有高活力，但IFN-β处理的巨噬细胞以显著的差距表达最高水平的CAR。图128B显示在电穿孔后7天在癌细胞杀伤测定中测试的所有CAR巨噬细胞中，用IFN-β处理的那些导致最高水平的癌症杀伤(肿瘤生长的最大降低)。在巨噬细胞电穿孔后七天，将它们与靶癌细胞共培养72小时。如图128C所示，与未用干扰素处理的CAR巨噬细胞相比，所有干扰素都改善了CAR巨噬细胞的癌细胞杀伤活性。
实施例10：转染的巨噬细胞对IFNγ敏感
用包含m6AGCap1和PsU或N1mPsU修饰的mCherry mRNA转染人巨噬细胞，然后用不同剂量的IFN-γ培养一天。在
Figure BDA0004047565970001011
实时成像显微镜上监测mCherry表达。如图129所示，当用mRNA转染巨噬细胞时，IFN-γ降低了mCherry mRNA表达。
先前已经表明，体外转录的mRNA被各种内体先天免疫受体(例如，Toll样受体(TLR)3、TLR7和TLR8)以及细胞质先天免疫受体(蛋白激酶RNA激活(PKR)、视黄酸诱导基因I蛋白(RIG-I)、黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)和2'-5'-寡腺苷酸合酶(OAS))识别。通过这些不同途径的信号传导导致与1型干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-12和转录程序级联的激活相关的炎症。总体而言，这些创造了为诱导特异性免疫应答做好准备的促炎微环境。而且，下游效应都与IVT mRNA的药代动力学和药效学有关，所述下游效应诸如通过真核翻译起始因子2α(eIF2α)磷酸化降低翻译、通过RNA酶L(RNaseL)增强RNA降解以及自扩增mRNA复制的过表达和抑制。
经由TLR途径激活IFN-γ可以激活2′-5′-寡腺苷酸合酶(OAS)，产生2′-5′-寡腺苷酸(2-5A)，进而可以激活RNA酶L，导致RNA降解和凋亡。
实施例11：RNA酶L抑制剂舒尼替尼和ABCE1对CAR巨噬细胞的作用
为了确定RNA酶L抑制剂是否可以挽救IFN-γ诱导的转染mRNA的不稳定性，在包含m6AGCap1和PsU修饰的mCherry mRNA转染之前两小时，用1μM舒尼替尼(一种RNA酶L抑制剂)处理人巨噬细胞。然后将转染的细胞与不同剂量的IFN-γ培养一天。在
Figure BDA0004047565970001021
实时成像显微镜上监测mCherry表达。如图130A所示，舒尼替尼挽救了IFN-γ诱导的mRNA降解。
为了评价RNA酶L抑制是否可以改善mRNA转染的CAR巨噬细胞的抗肿瘤功能，将巨噬细胞用包含修饰的mRNA转染并用舒尼替尼预处理，然后将巨噬细胞在癌细胞杀伤测定中作为效应细胞进行评价。与未经舒尼替尼预处理的CAR巨噬细胞或经舒尼替尼处理或未经处理的未转染对照巨噬细胞相比，经1nM舒尼替尼预处理的CAR巨噬细胞导致更高的癌细胞杀伤(图130B)。图130C显示舒尼替尼引发的CAR巨噬细胞在48小时CRL2351乳腺癌细胞杀伤测定中的癌症杀伤能力提高。
还测试了另一种RNA酶L抑制剂(RLI或ABCE1)的作用，以进一步验证这一概念。用包含m6AGCap 1和PsU修饰的编码mCherry的mRNA和编码ABCE1的mRNA共转染人巨噬细胞。
如图131所示，ABCE1共表达显著提高了电穿孔后48小时的mRNA编码的感兴趣的转基因的表达。用ABCE1共转染的巨噬细胞的活力未受影响并且仍然高。ABCE1共转染使mCherry表达增加了大约2倍，并且用舒尼替尼预处理进一步增强了这种作用。
实施例12：包含CD28铰链结构域的CAR巨噬细胞的受体表达和肿瘤细胞杀伤
在这个实施例中，生成了CAR构建体，其包含CD8前导序列、4D5 scFv、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域和CD3ζ胞内信号结构域(CTX_219)(图132)。然后将CTX_219的表达与具有CD8铰链结构域和CD8跨膜结构域而不是CD28铰链结构域和CD28跨膜结构域的相同CAR构建体(CTX_001；图8)进行比较。将CTX_219的肿瘤杀伤能力与CTX_001以及还有与CTX_001相同但缺乏胞内信号传导结构域的CAR构建体(CTX_003)进行比较。
将原代人巨噬细胞以1.0x105至1.0x109个细胞/mL的浓度悬浮在含有50-500nMmRNA的EP缓冲液中，并进行电穿孔。将细胞从盒中移出，铺板，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。在24小时之后通过流式细胞术的rHER2结合来检测CAR表达MFI和百分比。在24小时之后使用Live/Dead Aqua检测活百分比。对于杀伤，将巨噬细胞与Her2+CRL2351-NucGFP肿瘤细胞以2:1E:T比率或1:1E:T比率共培养，并通过
Figure BDA0004047565970001031
监测72小时。通过相对于时间0的每孔积分GFP强度计算肿瘤细胞死亡。
包含CD28铰链结构域的CAR构建体(CTX_219)、包含CD8铰链结构域的CAR构建体(CTX_001)以及缺乏胞内信号传导结构域的CAR构建体(CTX_003；参见图133A-133C)的表达和CAR+百分比是相当的。对于CTX_219和CTX_001(图133D)的活百分比也是相当的。令人惊讶的是，相对于CTX_001和CTX_003对照，包含CD28铰链结构域的CAR构建体(CTX_219)显示出增强的杀伤功能(图133E)。这些数据表明，相对于包含CD8铰链结构域的CAR构建体，包含CD28铰链结构域的CAR构建体导致巨噬细胞对肿瘤细胞杀伤改善。
确定了包含CTX_219(相对于CTX_001和CTX_003)的巨噬细胞的TNFα和IL6分泌。将效应细胞与HER2+靶细胞以1:1的E:T比率共培养24小时。根据制造商的说明，收获上清液并使用MSD促炎组1(Meso Scale Discovery)测量TNFα和IL6浓度。令人惊讶的是，包含CD28铰链结构域的CAR构建体(CTX_219)显示出显著增加的TNFα分泌(比CTX_001高约5倍)，而没有进一步增加IL6产生(图134)。这些数据表明，相对于包含CD8铰链结构域的CAR构建体，包含CD28铰链结构域的CAR构建体导致肿瘤杀伤细胞因子TNFα的分泌增加，而没有增加炎性细胞因子IL6的产生。
实施例13：包含CAR的巨噬细胞的VPX介导的慢病毒转导
对于用于CAR表达的巨噬细胞的慢病毒转导，将巨噬细胞解冻并在10mL完全培养基(CM)中以每10cm平板5-10e6个细胞的密度铺板。在静息2-3小时之后，将VPX慢病毒颗粒稀释到CM中，并以指定的MOI添加至巨噬细胞。在慢病毒添加后24小时完全更换培养基。
为了收获用于本文所述实验的巨噬细胞，从培养箱中移出10cm板并在4℃下放置30分钟。将细胞从板移出，使其沉淀，并重悬于CM中。进行细胞计数，将巨噬细胞用于实验，或在以后的时间点重新铺板。
用于评估CAR巨噬细胞的功能测定
对于杀伤测定，将巨噬细胞在100uL的CM中以规定的密度在96孔板中铺板，以实现特定的巨噬细胞与靶的比率(E:T)。在1-2小时的静息时间之后，将10,000个表达nucLightGFP的肿瘤细胞重悬在100uL CM中并添加到每个孔中。将板放入
Figure BDA0004047565970001041
中，每4小时成像一次，在添加肿瘤细胞约1小时之后开始。将杀伤定义为相对于时间0扫描的积分GFP强度。在这些测定中使用的肿瘤细胞是AU565 HER2+乳腺癌和SKOV3卵巢癌细胞。
对于细胞因子分泌研究，将可溶性Her2-His以0.2ug/uL的浓度溶解在分子级水中。然后将Her2-His以指定浓度稀释到PBS中。将100uL的Her2-His稀释液添加到96孔板的孔中。将板在4℃下储存过夜，随后用PBS洗涤2次。将50,000个巨噬细胞添加到每个孔中，CM终体积为200uL。在添加巨噬细胞后约24小时收获上清液，并储存在-20℃下以供进一步评估。使用MSD U-Plex试剂盒进行细胞因子检测。
为了检测细胞表面蛋白和CAR表达，将细胞在含有Human TruStain FcX的FACS缓冲液中在RT下孵育10分钟。使用以下小组进行表面蛋白染色：CD80-FITC、CD86-PE、CD163-APC-Cy7、CD206-BV421、抗-曲妥珠单抗-APC和Aqua Live/Dead。使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fischer)完成表面蛋白表达的检测，并且在FlowJo中进行分析。
为了检测比较的VPX和非VPX慢病毒的CAR表达，将细胞在含有20μg/mL Her2-His的FACS缓冲液中在RT下孵育20分钟，随后在Human TruStain FcX中在RT下孵育10分钟。使用以下小组进行表面蛋白染色：CD80-FITC、CD86-PE、CD163-APC-Cy7、CD206-BV421、抗His-APC、Aqua Live/Dead。使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fischer)完成表面蛋白表达的检测，并且在FlowJo中进行分析。
使用CAR巨噬细胞的VPX进行慢病毒转导的结果
VPX添加导致CAR构建体(CTX_001)在巨噬细胞中的表达显著增加(图136)。CTX_001包含抗HER2 scFv、CD8铰链、CD8跨膜结构域和CD3-ζ胞内信号结构域(图8)。相对于未用VPX转导的相同CAR(CTX_001)(其中在MOI为5-50时具有约20％ CAR(％))，基于VPX的转导在MOI为5时增加CAR(％)超过40％，在MOI为10时超过60％，在MOI为50时超过80％，并且在MOI为50时超过90％。
接下来，随着时间的推移，通过MOI滴定评估针对VPX-慢病毒转导的活力和CAR表达。用VPX-慢病毒转导的CAR-M显示了高活力并且在30天期间表达CTX-001(图137)。以MOI1、5和10用VPX慢病毒转导的CAR-M在约30天的时期中是活的，其中活％的范围为约80％至约100％。随着MOI 1增加至MO1 5和10，CAR％表达增加。将未转导(UTD)巨噬细胞用作对照。
还使用α曲妥珠单抗-AF647评估了CTX_001在用VPX-慢病毒转导的巨噬细胞中的CAR表达，用于分析随着时间的推移的表面蛋白。显示了在MOI为1、MOI为5和MOI为10时的CAR细胞表面表达，其中在第4、7、15、22和29天MOI为5和10时表达增加(图138)。将UTD巨噬细胞用作对照。
还使用α曲妥珠单抗-AF647评估了CTX_001在用VPX-慢病毒转导的巨噬细胞中的CAR表达的平均荧光强度(MFI)，用于分析随着时间的推移的表面蛋白。用VPX-慢病毒转导的CAR巨噬细胞显示了高活力并且在30天的时间段表达CTX-001(图139)。因而，用VPX慢病毒转导的CAR巨噬细胞维持CAR表达至少29天。
还评估了用VPX慢病毒转导的CTX_001巨噬细胞的杀伤功能。效应巨噬细胞与靶肿瘤细胞的比率(E:T)为4:1、2:1、1:1和1:2。积分强度指示肿瘤负荷。将UTD巨噬细胞和没有巨噬细胞的AU565细胞(HER2+乳腺癌细胞)用作对照。在所有E:T比率下，在MOI为1、5和10时，4天后的CTX_001巨噬细胞的杀伤功能是明显的，在7天之后持续(图140)。值得注意的是，在所有E:T比率下，在MOI为5和MOI为10时，CTX_001巨噬细胞表现出相似水平的杀伤功能。绘制共培养后72小时的抗肿瘤活性。
接下来，研究了用于临床转导的MOI范围。研究了具有CD3-ζ结构域(CTX_001)和没有CD3-ζ结构域(CTX_003；包含抗HER2 scFv、CD8铰链和CD8跨膜结构域的CAR；图10)的CAR。MOI 2和MOI5导致CTX_001和CTX_003在用VPX慢病毒转导的巨噬细胞中的CAR细胞表面表达(图141A)。相对于UTD巨噬细胞，用VPX-慢病毒转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞显示有活力并且表达每种CAR(图141B)。在MOI为5时，与在MOI为2时相比，用VPX-慢病毒转导的CTX_001巨噬细胞显示出表达更高的CAR水平(图142)。基于CD80和CD86表达以及CD163和CD206表达的降低，用VPX慢病毒转导还导致CTX_001和CTX_003巨噬细胞的中度、剂量依赖性M1极化(图143)。
还进行了实验来比较用VPX-慢病毒转导的CTX_001巨噬细胞相对于用Ad5f35的腺相关病毒转导的所述巨噬细胞的极化。用Ad5f35而不是VPX-慢病毒转导诱导了M1标志物CD80和CD86(图144)。在转导后7天和转导后21天，相对于Ad5f35转导的CTX_001巨噬细胞，VPX-慢病毒转导的CTX_001巨噬细胞也表现出更持久的抗肿瘤活性(图145)。这些结果表明，在一些情况下，可将不同的病毒载体用于巨噬细胞中的等效CAR表达，当使用VPX-慢病毒时无需M1诱导，这允许维持巨噬细胞的可塑性和随后的表型控制。因而，VPX-慢病毒可用于制造M0 CAR巨噬细胞。随后，Vpx-慢病毒衍生的M0 CAR巨噬细胞可以极化为M1或M2，以制造M1或M2极化的工程化巨噬细胞或CAR巨噬细胞。这样的CAR巨噬细胞还可以编码CAR构建体内的信号传导结构域，以诱导表型转变。这样的CAR巨噬细胞可以用M1细胞因子(例如，IFNa、IFNb、IFNg、LPS或TLR激动剂)或M2细胞因子(例如，IL4、IL10、IL13或TGFb)引发，以制造具有选定表型的CAR巨噬细胞。可以用转录因子、免疫配体或分泌的细胞因子将这样的CAR巨噬细胞工程化，以诱导M1或M2表型。
还在AU565和SKOV3细胞中以MOI 2和MOI 5评估了用VPX慢病毒转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞的杀伤功能。对于AU565，E:T比率是4:1和1:2。在用VPX慢病毒转导之后7天，以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001巨噬细胞在E:T比率4:1和2:1时相对于作为对照的UTD和AU565细胞显示出相似的杀伤能力(图146)。对于SKOV3，E:T比率为4:1。在用VPX慢病毒转导之后7天，以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001巨噬细胞在E:T比率4:1时相对于作为对照的UTD和SKOV3细胞显示出相似的杀伤能力(图147)。
还研究了在用VPX慢病毒转导CTX_001和CTX_003巨噬细胞之后的炎性细胞因子产生。用VPX慢病毒转导CTX_001和CTX_003巨噬细胞，在有或没有板结合的HER2的情况下培养24小时。在HER2存在的情况下，在用VPX慢病毒转导之后7天，以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001巨噬细胞表现出炎性细胞因子分泌的差异，其中TNFα和IL-6产生增加(图148)。
接下来，评估具有MOI 2和MOI 5的CTX_001和CTX_003巨噬细胞的VPX慢病毒转导随着时间的推移的活力和CAR表达。用VPX-慢病毒转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞显示了高活力并表达CTX-001和CTX_003，持续21天的时间段(图149)。将UTD巨噬细胞用作对照。还使用α曲妥珠单抗-AF647评估了用VPX-慢病毒转导的巨噬细胞的CTX_001和CTX_003CAR表达的MFI，用于分析随着时间的推移的细胞表面蛋白。用VPX-慢病毒转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞显示了高活力并且表达CTX-001和CTX-003，持续21天的时间段(图150)。
还在AU565和SKOV3细胞中以MOI 2和MOI 5评估了随着时间的推移用VPX慢病毒转导的CTX_001和CTX_003巨噬细胞的杀伤功能。在转导后21天开始杀伤测定。对于AU565，E:T比率是4:1和1:2。在用VPX慢病毒转导之后21天，以MOI 2和MOI 5转导的CTX_001巨噬细胞在E:T比率4:1和2:1经过72小时相对于作为对照的UTD和AU565细胞显示出相似的杀伤能力(图151)。对于SKOV3，E:T比率为4:1。在用VPX慢病毒转导之后21天，以MOI2和MOI 5转导的CTX_001巨噬细胞在E:T比率4:1时相对于作为对照的UTD和SKOV3细胞显示出相似的杀伤能力(图152)。
还研究了在VPX慢病毒转导之后的单核细胞中的CTX_001(图8)表达和活力。将CD14+人单核细胞解冻、洗涤并计数。将细胞以3e6个细胞/孔在6孔Upcell板中铺板(UTD)，或在适当的MOI下添加慢病毒。在第5天喂养细胞，并在第7天收获用于流式细胞术分析。将使用Ad5f35转导进行转导的CAR巨噬细胞和CAR单核细胞用作对照。CAR单核细胞在以MOI2、5或10用VPX慢病毒转导之后是有活力的，其中Ad5f35转导的CAR单核细胞和CAR巨噬细胞用作活力的比较物(图153A)。以MOI 2、5和10用VPX慢病毒转导的CAR单核细胞显示出增加的CAR表达的百分比(％)，其中在MOI 2时为27.6％，在MOI 5时为51.3％，在MOI 10时为66.3％，其中Ad5f35转导的CAR单核细胞和CAR巨噬细胞用作活力的比较物(图153B)。以MOI2、5和10用VPX慢病毒转导的CAR单核细胞也显示出随着MOI增加而增加的CAR表达的平均荧光强度(MFI)，其中Ad5f35转导的CAR单核细胞和CAR巨噬细胞用作比较物(图153C)。以MOI2、5和10用VPX慢病毒转导的CD14+单核细胞的CAR表达柱状图也显示出随着MOI增加而增加CAR表达，其中Ad5f35转导的CAR单核细胞和CAR巨噬细胞用作比较物(图153D)。UTD巨噬细胞也被用作CAR表达柱状图的对照。这些结果表明单核细胞在VPX慢病毒转导之后表达CAR，并且指示单核细胞在巨噬细胞阶段将保留CAR表达。
实施例14：用于CAR巨噬细胞吞噬作用增强的SIRPα敲除
免疫检查点SIRPα和CD47的相互作用抑制巨噬细胞吞噬作用。因而，表达CAR的巨噬细胞接收来自肿瘤的相反的促吞噬和抗吞噬信号。本文提供的结果表明，敲除SIRPα改善了CAR巨噬细胞的杀伤和吞噬作用。
进行核糖核蛋白(RNP)形成，并且在将巨噬细胞解冻之后一天与巨噬细胞混合。将纯化的Cas9蛋白与三种gRNA的混合物在室温下孵育10-20分钟。使用的gRNA序列来自Synthego的用于人SIRPα的“基因敲除试剂盒”(表2)。使用了1:3的Cas9与总gRNA的比率(因此，Cas9与混合物中每种单独gRNA的比率为1:1)。对于3e7-8e7个细胞/mL，与EP缓冲液中的巨噬细胞混合的RNP的终浓度为2.5μMCas9 RNP。在MaxCyte电穿孔盒中将巨噬细胞电穿孔。恢复培养后，在电穿孔之后至少3天分析细胞，以使基因敲除在蛋白质表达水平生效。然后分析SIRPα表达并进行功能测定。
表2.SIRPαKO的引导RNA序列。
gRNA名称 RNA序列
SIRPa_gKOv2_1 GAGCCCGCCGGCCCGGCCCC
SIRPa_gKOv2_2 GUGCUUACCUGACCAGGCGC
SIRPa_gKOv2_3 CGGGCTCAGGCCTCTCAGAC
在实验开始之前一天从两个不同供体(HCC 163264和HCC151560)获取新鲜巨噬细胞，在第0天用指定RNP浓度的Cas9将巨噬细胞电穿孔，并在第3天评价SIRPα的表达。使用流式细胞术，在巨噬细胞表面进行SIRPα的免疫染色。结果表明，在两个供体中，可以在巨噬细胞中以剂量依赖性方式敲除SIRPα(图154A-B)。在312nM RNP的流式细胞术图中，结果显示两个不同的CAR巨噬细胞群(图154C)，这支持了通过Cas9的基因敲除的全有或全无性质，使得SIRPα基因被敲除或未被敲除，导致二元群体，而不是SIRPα表达的梯度。重要的是，SIRPα敲除不影响细胞活力(图154D)。
SIRPα敲除也显示出增强SKOV-3卵巢癌细胞中的CAR巨噬细胞吞噬作用。在用Cas9RNP电穿孔前一天，将巨噬细胞解冻并用编码CTX_001(包含抗HER2 scFv、CD8铰链、CD8跨膜结构域和CD3-ζ胞内信号传导结构域的CAR；图8)的腺病毒转导。三天后，评价了SIRPα的表达，并开始用SKOV-3的吞噬作用测定。这些结果表明在具有Cas9和靶向SIRPα的gRNA的CTX_001巨噬细胞中的SIRPα敲除(图155A)。CTX_001在转导的巨噬细胞中表达(图155B)。CTX_001巨噬细胞在12小时期间表现出吞噬作用，这通过使用pHrodo-绿信号经由
Figure BDA0004047565970001111
分析测得(图155C)。将在12小时期间测量的总吞噬作用量化为曲线下面积(图155D)。SIRPα敲除和CAR在巨噬细胞中的表达导致最大的吞噬作用，而单独的SIRPα敲除未显著增强UTD巨噬细胞中的吞噬作用。
SIRPαKO还显示出增强HCC-1954人乳腺癌细胞中的CAR巨噬细胞吞噬作用。在用Cas9 RNP电穿孔前一天，将巨噬细胞解冻并用编码CTX_001的腺病毒转导。三天后，评价了SIRPα的表达，并开始用HCC-1954的吞噬作用测定。这些结果表明在具有Cas9和靶向SIRPα的gRNA的CTX_001巨噬细胞中的SIRPα敲除(图156A)。CTX_001在转导的巨噬细胞中表达(图156B)。CTX_001巨噬细胞在12小时期间表现出吞噬作用，这通过
Figure BDA0004047565970001112
分析使用pHrodo-绿信号测得，其中下图在y轴上重新缩放以显示CTX_001巨噬细胞比所有UTD组表现出更多的吞噬作用(图156C)。将在12小时期间测量的总吞噬作用量化为曲线下面积(图156D)。这些结果表明，虽然对照gRNA增加了吞噬作用，但巨噬细胞中的SIRPα敲除以及CAR表达仍然是吞噬作用信号的最大生产者。
与上述实验相比，使用来自不同供体细胞的巨噬细胞，也显示SIRPα敲除增强CAR巨噬细胞在SKOV-3卵巢癌细胞中的杀伤。在用Cas9 RNP电穿孔前一天将巨噬细胞解冻，并且在电穿孔后三天用编码CTX_001的腺病毒转导。两天后，评价了SIRPα的表达，并开始用SKOV-3的吞噬作用测定。这些结果表明在具有Cas9和靶向SIRPα的gRNA的CTX_001巨噬细胞中的SIRPα敲除(图157A)。CTX_001在转导的巨噬细胞中表达(图157B)。将SKOV-3杀伤测量为表达nuclight绿色荧光蛋白的SKOV-3细胞的生长，这通过
Figure BDA0004047565970001113
分析在24小时期间测得(图157C)。人CAR巨噬细胞的SIRPα敲除增加了肿瘤杀伤动力学，所述动力学基于清除50％的靶肿瘤细胞所需要的小时数(图157D)。在12小时期间测量总吞噬作用(图157E)。SIRPα敲除和CAR在巨噬细胞中的表达导致最大的吞噬作用，而单独的SIRPα敲除未显著增强UTD巨噬细胞中的吞噬作用。使用第二供体的吞噬作用结果是一致的。SIRPα敲除CAR巨噬细胞似乎比没有SIRPα敲除的CAR巨噬细胞杀伤更快。
本文提供的这些结果证明了用CRISPR/Cas系统在原代人CAR巨噬细胞中的高效SIRPα敲除，并且用CRISPR/Cas系统的SIRPα敲除可以一致地在原代人CAR巨噬细胞上进行。这些结果与功能数据配对，与没有SIRPα敲除的CAR巨噬细胞相比，通过SIRPα敲除CAR巨噬细胞显示出吞噬作用和杀伤增强。在两个单独的供体和实验运行中，SIRPα敲除增强了CAR巨噬细胞对SKOV-3细胞的吞噬作用。值得注意的是，在不表达CAR的巨噬细胞中敲除SIRPα未增强吞噬作用或肿瘤杀伤；因而，可以认为所述作用是协同的。
等效方案
本领域技术人员应理解，本领域技术人员将容易想到对本公开的各种改变、修改和改进。此类改变、修改和改进旨在成为本公开的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前述描述和附图仅是示例性的，并且本公开中描述的任何发明均由所附权利要求书进一步详细描述。
本领域技术人员应理解可归因于如本文所述的测定或其他方法中获得的值的典型的标准偏差或误差。本文中为了描述本发明的背景并提供关于其实践的额外细节所引用的出版物、网址和其他参考材料由此以引用的方式整体并入。

Claims (80)

1.一种包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体包含：
(a)胞外结构域，
(b)跨膜结构域，和
(c)胞内结构域，
其中所述免疫细胞包括巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。
2.如权利要求1所述的免疫细胞，其中所述CAR的胞外结构域包含一个或多个抗原结合结构域和FcR胞外结构域，和/或所述CAR的跨膜结构域包含FcR跨膜结构域，和/或所述CAR的胞内结构域包含FcR胞内结构域。
3.如权利要求2所述的免疫细胞，其中所述CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域。
4.如权利要求2或权利要求3所述的免疫细胞，其中所述FcR胞外结构域、所述FcR跨膜结构域和所述FcR胞内结构域中的一种或多种是或包括人FcR结构域。
5.如权利要求2-4中任一项所述的免疫细胞，其中所述FcR胞外结构域、所述FcR跨膜结构域和所述FcR胞内结构域一起构成全长FcR。
6.如权利要求2-5中任一项所述的免疫细胞，其中所述FcR胞外结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
7.如权利要求2-6中任一项所述的免疫细胞，其中所述FcR跨膜结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
8.如权利要求2-7中任一项所述的免疫细胞，其中所述FcR胞内结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
9.如权利要求1所述的免疫细胞，其中所述CAR的胞外结构域包含一个或多个抗原结合结构域和toll样受体(TLR)胞外结构域和/或所述CAR的跨膜结构域包含TLR跨膜结构域和/或所述CAR的胞内结构域包含TLR胞内结构域。
10.如权利要求9所述的免疫细胞，其中所述CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域。
11.如权利要求9或权利要求10所述的免疫细胞，其中所述TLR胞外结构域、所述TLR跨膜结构域和所述TLR胞内结构域中的一种或多种是或包括人TLR结构域。
12.如权利要求9-11中任一项所述的免疫细胞，其中所述TLR胞外结构域、所述TLR跨膜结构域和所述TLR胞内结构域一起构成全长TLR。
13.如权利要求9-12中任一项所述的免疫细胞，其中所述TLR胞外结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
14.如权利要求9-13中任一项所述的免疫细胞，其中所述TLR跨膜结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
15.如权利要求9-14中任一项所述的免疫细胞，其中所述TLR胞内结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
16.如权利要求1所述的免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体还包含下列中的一种或多种：
(d)一个或多个胞外前导结构域，
(e)一个或多个胞外铰链结构域，和
(f)一个或多个胞内共刺激结构域。
17.如权利要求16所述的免疫细胞，其中所述一个或多个胞外前导结构域包括CD8胞外前导结构域。
18.如权利要求1-17中任一项所述的免疫细胞，其中所述一个或多个胞外抗原结合结构域包括scFv、centyrin或darpin。
19.如权利要求16-18中任一项所述的免疫细胞，其中所述一个或多个胞外铰链结构域包括CD28胞外铰链结构域、CD8a胞外铰链结构域或IgG4胞外铰链结构域。
20.如权利要求1-19中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包括CD28、CD8a、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TRL1、TLR2、TLR3、TRL4、TLR5、
TLR6、TLR7、TLR8或TLR9跨膜结构域。
21.如权利要求1-20中任一项所述的免疫细胞，其中所述胞内结构域包括一个或多个胞内信号传导结构域。
22.如权利要求21所述的免疫细胞，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包括CD3-ζ、FcRγ、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ALK、AXL、DDR2、EGFR、EphA1、INSR、cMET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR1、ROS1、RYK、TIE2、TRK、VEGFR、CD40、CD19、CD20、41BB、CD28、OX40、GITR、TREM-1、TREM-2、DAP12、MR、ICOS、MyD88、V/I/LxYxxL/V、SIRPa、CD45、Siglec-10、PD1、SHP-1、SHP-2、KIR-2DL、KIR-3DL、NKG2A、CD170、CD33、BTLA、CD32b、SIRPb、CD22、PIR-B、LILRB1、41BBL(TNFSF9)、CD27、OX40L、CD32b、CD11b、ITGAM、SLAMF7、CD206、CD163、CD209、Dectin-2、IL1R、IL2R、IL3R、IL4R、IL5R、IL6R、IL7R、IL8R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL13R、IL14R、IL15R、IL17R、IFNaR、IFNgR、TNFR、CSF1R、CSF2R、Dap10、CD36、Dectin-1、ICOSL和/或Syk胞内信号传导结构域。
23.如权利要求22所述的免疫细胞，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包括至少一个胞内共刺激结构域。
24.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的免疫细胞。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
26.一种核酸构建体，其包含一个或多个核酸序列，所述核酸序列编码：
(a)胞外结构域，
(b)跨膜结构域，和
(c)胞内结构域，
其中所述核酸构建体编码包含(a)至(c)的嵌合抗原受体(CAR)。
27.如权利要求26所述的核酸构建体，其还包含一个或多个核酸序列，所述核酸序列编码：
(e)一个或多个胞外前导结构域，
(f)一个或多个胞外铰链结构域，
(g)一个或多个胞内共刺激结构域，
(h)切割肽，和
(i)一种或多种肽剂。
28.如权利要求27所述的核酸构建体，其中所述切割肽是P2A、F2A、E2A或T2A肽。
29.一种药物组合物，其包含如权利要求26-28中任一项所述的核酸构建体。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
31.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述受试者递送治疗有效量的如权利要求24、25、29或30所述的药物组合物。
32.一种修饰免疫细胞的方法，所述方法包括：
向免疫细胞递送包含一个或多个核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码：
(a)胞外结构域，
(b)跨膜结构域，和
(c)胞内结构域，
其中所述修饰的免疫细胞包含嵌合工程化受体，所述嵌合工程化受体包含(a)至(c)，并且
其中所述修饰的免疫细胞包括巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。
33.一种修饰巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的方法，其包括：
向巨噬细胞、单核细胞或树突细胞递送包含一个或多个核酸序列的病毒载体，所述核酸序列编码：
(a)胞外结构域，
(b)跨膜结构域，和
(c)胞内结构域，
其中所述病毒载体包装有至少一种Vpx蛋白，
其中所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含嵌合工程化受体(CAR)，所述嵌合工程化受体包含(a)至(c)，并且
其中相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体的修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出增加的CAR表达。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述病毒载体是或包括慢病毒载体。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中以约1至约50的感染复数(MOI)递送所述病毒载体。
36.如权利要求35所述的方法，其中以约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的MOI递送所述病毒载体。
37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体的修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出约20％、约30％、约40％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多增加的CAR表达。
38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出延长时间段的CAR表达。
39.如权利要求38所述的方法，其中CAR表达的延长的时间段为至少5天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天或更长。
40.如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出增加的效应子活性。
41.如权利要求39所述的方法，其中相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出增加的肿瘤杀伤能力或吞噬作用。
42.如权利要求33-41中任一项所述的方法，其中相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞未表现出对M1表型的极化增加。
43.如权利要求42所述的方法，其中相对于包含CAR的递送编码所述CAR的未包装至少一种Vpx蛋白的病毒载体的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞未表现出M1表型的一种或多种标志物的表达增加。
44.如权利要求43所述的方法，其中M1表型的一种或多种标志物包括或为CD86、CD80、MHC II、IL-1R、TLR2、TLR4、iNOS、SOCS3、CD83、PD-L1、CD69、MHC I、CD64、CD32、CD16、IL1R、IFIT家族成员或ISG家族成员中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种。
45.如权利要求33-44中任一项所述的方法，其中相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出一种或多种炎性细胞因子的产生增加。
46.如权利要求45所述的方法，其中一种或多种炎性细胞因子包括或为TNFα、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-12、IL-18、IL-8、IL-2、IL-23、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-8、IL33、CCL3、CXCL12、CCL22、CCL4、CXCL10或CCL2中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种或12种。
47.如权利要求32-46中任一项所述的方法，其中相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞，所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞表现出SIRPα活性降低。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包括使用一种或多种核酸内切酶使SIRPα缺失。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种核酸内切酶包括或为CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶中的一种或多种。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统包括Cas9、Cas12a或C2c2。
51.如权利要求47所述的方法，其中已经用一种或多种抗SIRPα抗体处理所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。
52.如权利要求47所述的方法，其中所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含一种或多种抗SIRPα抗体。
53.如权利要求47所述的方法，其中所述修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞包含一种或多种下调SIRPα的siRNA。
54.如权利要求33-53中任一项所述的方法，其中所述CAR的胞外结构域包含一个或多个抗原结合结构域和FcR胞外结构域，和/或所述CAR的跨膜结构域包含FcR跨膜结构域，和/或所述CAR的胞内结构域包含FcR胞内结构域。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、FcR胞外结构域、FcR跨膜结构域和FcR胞内结构域。
56.如权利要求54或55所述的方法，其中所述FcR胞外结构域、所述FcR跨膜结构域和所述FcR胞内结构域中的一种或多种是或包括人FcR结构域。
57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述FcR胞外结构域、所述FcR跨膜结构域和所述FcR胞内结构域一起构成全长FcR。
58.如权利要求54-57中任一项所述的方法，其中所述FcR胞外结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
59.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其中所述FcR跨膜结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
60.如权利要求54-59中任一项所述的方法，其中所述FcR胞内结构域包括CD64(FcγRI)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b(FcγRIIb)、CD32c、CD16a(FcγRIIIa)、CD16b(FcγRIIIb)、FcεRI、FcεRII或FcαRI(CD89)结构域。
61.如权利要求33-53中任一项所述的方法，其中所述CAR的胞外结构域包含一个或多个抗原结合结构域和toll样受体(TLR)胞外结构域和/或所述CAR的跨膜结构域包含TLR跨膜结构域和/或所述CAR的胞内结构域包含TLR胞内结构域。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述CAR从N端到C端包含一个或多个胞外结合结构域、TLR胞外结构域、TLR跨膜结构域和TLR胞内结构域。
63.如权利要求61或62所述的方法，其中所述TLR胞外结构域、所述TLR跨膜结构域和所述TLR胞内结构域中的一种或多种是或包括人TLR结构域。
64.如权利要求61-63中任一项所述的方法，其中所述TLR胞外结构域、所述TLR跨膜结构域和所述TLR胞内结构域一起构成全长TLR。
65.如权利要求61-64中任一项所述的方法，其中所述TLR胞外结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
66.如权利要求61-65中任一项所述的方法，其中所述TLR跨膜结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
67.如权利要求61-66中任一项所述的方法，其中所述TLR胞内结构域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9结构域。
68.如权利要求33-67中任一项所述的方法，其中所述CAR还包含下列中的一种或多种：
(d)一个或多个胞外前导结构域，
(e)一个或多个胞外铰链结构域，和
(f)一个或多个胞内共刺激结构域。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述一个或多个胞外前导结构域包括CD8胞外前导结构域。
70.如权利要求33-69中任一项所述的方法，其中所述一个或多个胞外结合结构域包括scFv、centyrin或darpin。
71.如权利要求68-70中任一项所述的方法，其中所述一个或多个胞外铰链结构域包括CD28胞外铰链结构域、CD8a胞外铰链结构域或IgG4胞外铰链结构域。
72.如权利要求33-71中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域包括CD28、CD8a、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TRL1、TLR2、TLR3、TRL4、TLR5、
TLR6、TLR7、TLR8或TLR9跨膜结构域。
73.如权利要求33-72中任一项所述的方法，其中所述胞内结构域包括一个或多个胞内信号传导结构域。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包括CD3-ζ、FcRγ、CD64、CD32a、CD32c、CD16a、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ALK、AXL、DDR2、EGFR、EphA1、INSR、cMET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR1、ROS1、RYK、TIE2、TRK、VEGFR、CD40、CD19、CD20、41BB、CD28、OX40、GITR、TREM-1、TREM-2、DAP12、MR、ICOS、MyD88、V/I/LxYxxL/V、SIRPa、CD45、Siglec-10、PD1、SHP-1、SHP-2、KIR-2DL、KIR-3DL、NKG2A、CD170、CD33、BTLA、CD32b、SIRPb、CD22、PIR-B、LILRB1、41BBL(TNFSF9)、CD27、OX40L、CD32b、CD11b、ITGAM、SLAMF7、CD206、CD163、CD209、Dectin-2、IL1R、IL2R、IL3R、IL4R、IL5R、IL6R、IL7R、IL8R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL13R、IL14R、IL15R、IL17R、IFNaR、IFNgR、TNFR、CSF1R、CSF2R、Dap10、CD36、Dectin-1、ICOSL和/或Syk胞内信号传导结构域。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包括至少一个胞内共刺激结构域。
76.如权利要求33-75中任一项所述的方法，其中所述病毒载体还包含一个或多个核酸序列，所述核酸序列编码：
(e)一个或多个胞外前导结构域，
(f)一个或多个胞外铰链结构域，
(g)一个或多个胞内共刺激结构域，
(h)切割肽，和
(i)一种或多种肽剂。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述切割肽是P2A、F2A、E2A或T2A肽。
78.一种药物组合物，其包含通过权利要求33-77中任一项所述的方法修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。
79.如权利要求78所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
80.一种治疗受试者的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求78或79所述的药物组合物。
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