EA010433B1 - Усовершенствованные аденовирусные векторы и их применение - Google Patents
Усовершенствованные аденовирусные векторы и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA010433B1 EA010433B1 EA200700850A EA200700850A EA010433B1 EA 010433 B1 EA010433 B1 EA 010433B1 EA 200700850 A EA200700850 A EA 200700850A EA 200700850 A EA200700850 A EA 200700850A EA 010433 B1 EA010433 B1 EA 010433B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vectors
- serotype
- vector
- fiber
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 276
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 104
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 claims description 4
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 claims description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 58
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 abstract description 33
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 abstract description 20
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 abstract description 19
- 102100025278 Coxsackievirus and adenovirus receptor Human genes 0.000 abstract 2
- 101710176411 Coxsackievirus and adenovirus receptor Proteins 0.000 abstract 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 84
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 64
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 53
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 34
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 31
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 29
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 26
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 25
- 238000003947 neutron activation analysis Methods 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 21
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 20
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 18
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 101150010065 sad gene Proteins 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 8
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 101710114676 E1B 55 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 5
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 5
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 3
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101100448410 Mus musculus Gkn1 gene Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 101100310222 Caenorhabditis briggsae she-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701124 Human adenovirus 35 Species 0.000 description 2
- 101150092727 KLF10 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026468 Androgen-induced gene 1 protein Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100008049 Caenorhabditis elegans cut-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100036570 Coiled-coil domain-containing protein 177 Human genes 0.000 description 1
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 description 1
- 244000078127 Eleusine coracana Species 0.000 description 1
- 235000013499 Eleusine coracana subsp coracana Nutrition 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000718108 Homo sapiens Androgen-induced gene 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000715214 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 177 Proteins 0.000 description 1
- 241000701190 Human adenovirus 11 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101150036708 NUR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101100509365 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ISU1 gene Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 108010084938 adenovirus receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 101150114014 cagA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007236 host immunity Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 235000002079 ragi Nutrition 0.000 description 1
- 108700028722 receptor-Ck Proteins 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150047903 vapA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 230000009614 wildtype growth Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
- C12N2810/6018—Adenoviridae
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам, основанным на аденовирусах, которые сталкиваются с предсуществующим иммунитетом у меньшинства популяции людей и которые содержат химерный капсид. Химерный капсид включает волоконные белки, которые имеют, по меньшей мере, выступающий домен аденовируса человека, который связывается с рецептором коксакивируса и аденовируса (CAR), и гексонный белок из серотипа аденовируса, который сталкивается с предсуществующим иммунитетом у малой процентной доли популяции людей.
Description
Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, конкретнее, к области терапевтического и профилактического лечения с использованием рекомбинантных, химерных, аденовирусных векторов, включающих терапевтическую нуклеиновую кислоту в вакцинных композициях.
Описание предшествующего уровня техники
Рекомбинатные аденовирусные векторы широко применяются для способов генной терапии и вакцин. К настоящему времени идентифицирован 51 различный серотип аденовируса. Аденовирусы подгруппы С, наиболее интенсивно исследованные для таких видов применения как генная терапия, особенно серотип 2 и 5 (Аб2 и Аб5), широко используют в данной области. Рекомбинантный Аб5 используется в разнообразных целях, включая вакцинацию. Важно, что, как было показано, вакцины, основанные на векторе Аб5, вызывают сильные и защитные иммунные реакции на разнообразных моделях животных. Более того, в настоящее время ведутся крупномасштабные клинические испытания вакцинации против ВИЧ инфекции, при которых используются рекомбинантные векторы на основе Аб5 (\УО 01/02607; \УО 02/22080; 8Ыуег с! а1. 2002; ЬсМп с! а1. 2002; 8Ыуег апб Еш1ш. 2004). Однако возможность использования вакцин, основанных на рекомбинантном векторе Аб5, в отношении ВИЧ и других патогенов, вероятно, будет значительно ограничена высоким доминированием серотипа Аб5-специфичных нейтрализующих антител (ИаЬк) в популяции людей. Было показано, что существование иммунитета против Аб5 существенно подавляет иммуногенность вакцин на основе Аб5 в исследованиях на мышах и макаках резус. Предварительные данные, полученные в клинических испытаниях 1 фазы, показывают, что эта проблема может также возникнуть у людей (8Ыусг 2004).
Одна перспективная стратегия преодоления наличия предсуществующего иммунитета у индивидуумов, ранее инфицированных самыми распространенными аденовирусами человека (такими как Аб5), включает разработку рекомбинантных векторов из серотипов аденовирусов, которые не сталкиваются с такими видами предсуществующего иммунитета. Аденовирусные векторы человека, которые были идентифицированы как особенно полезные, основаны на серотипах 11, 26, 34, 35, 48, 49 и 50, как показано в \УО 00/70071, \УО 02/40665 и \УО 2004/037294 (см. также Уодск с! а1. 2003). Другие авторы обнаружили, что также аденовирус 24 (Аб24) представляет особый интерес, поскольку, как показано, он является редким серотипом (\УО 2004/083418).
Аналогичная стратегия основана на применении аденовирусов обезьян, поскольку они обычно не инфицируют людей. Они проявляют низкое доминирование серотипа в человеческих образцах. Однако их можно применять у людей, поскольку было показано, что эти вирусы могут инфицировать человеческие клетки ίη νίίτο (\УО 03/000283, \УО 2004/037189).
Было показано, что вакцины на основе вектора серотипа 35 (Аб35) аденовируса могут вызвать сильные клеточные иммунные реакции, которые существенно не подавлялись иммунитетом против Аб5 (Вагоисй с! а1. 2004; Уодск с! а1. 2003). Аналогичным образом, было показано, что аденовирусы шимпанзе вызывают иммунные реакции, на которые минимально воздействовал иммунитет против Аб5 (Раппа с! а1. 2001; Ρίη!ο с! а1. 2003). Недавно было продемонстрировано, что и нейтрализующие антитела (ЫАЬ), и реакции СВ8+ Т-лимфоцитов вносят вклад в иммунитет против Аб5, тогда как Аб5-специфичные ЫАЬ, как представляется, играют первостепенную роль (8иш1ба с! а1. 2004). Хотя эта разработка представляется очень полезным подходом, было также продемонстрировано на мышах, что вакцины на основе вектора Аб35 оказались менее иммуногенными, чем вакцины на основе вектора Аб5, в исследованиях, в которых не было предсуществующего Аб5-иммунитета (Вагоисй с! а1. 2004).
Очевидно, что существует потребность в данной области в альтернативных аденовирусных векторах, которые не сталкиваются с предсуществующими видами иммунитета у хозяина, но которые, тем не менее, являются иммуногенными и способны вызвать сильные иммунные реакции против белков, кодируемых гетерологичными нуклеиновыми кислотами, вставленными в нуклеиновую кислоту, переносимую вектором.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 (А) показана процентная доля доминирования серотипа Аб5, Аб11 и Аб35 в образцах из США, Гаити, Ботсваны, Замбии и Южной Африки; (В) показан титр нейтрализующих антител против Аб5, Аб11 и Аб35 в образцах из США и образцах из Африки; (С) показан титр нейтрализующих антител против Аб5, Аб5Г35. Аб5Г35р35. Аб35Г5 и Аб35 в этих образцах.
На фиг. 2 (А) показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей волоконный белок Аб35к5 (8ЕО Ш N0:1; подчеркнута часть, кодирующая выступ волокна Аб5); (В) показывает аминокислотную последовательность Аб35к5 волоконного белка (8ЕО Ш N0:2; подчеркнута часть, представляющая выступ волокна Аб5); (С) показывает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей волоконный белок Аб35Г5 (8ЕО Ш N0:4; подчеркнута часть, кодирующая остающийся фрагмент волокна Аб35, тогда как сайт клонирования Βδίνί представлен в мелких колпачках); (Ό) показывает аминокислотную последовательность волоконного белка Аб35Г5 (8ЕО Ш ЫО:5; подчеркнута часть, представляющая остающийся фрагмент волокна Аб35); (Е) показывает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей волоконный белок Аб35к2 6 (8ЕО Ш N0:80; подчеркнута часть, кодирующая выступ волокна Аб2 6); (Р) показывает аминокислотную последовательность волоконного белка Аб35к2 6 (8ЕО ΙΌ
- 1 010433
N0:81; подчеркнута часть, представляющая выступ волокна Лй2 6); (О) показывает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей волоконный белок Лй35к4 9 (8ЕЦ ГО N0:82; подчеркнута часть, кодирующая выступ волокна Лй4 9); (Н) показывает аминокислотную последовательность волоконного белка Лй35к4 9 (8ЕЦ ГО N0:83; подчеркнута часть, представляющая выступ волокна Лй4 9).
На фиг. 3 показана реакция Т клеток, вызванная в отношении дад 8ГУ (вируса иммунодефицита обезьян), после инъекции интактным мышам с векторами ЛЙ5. Άά35ί 1Ь5.В8И, Άά35.Β8ϋ и ЛЙ35. несущими ген, кодирующий дад 8ГУ, в сравнении с мышами, которым инъецировали пустые векторы (Лй5. пустой и ЛЙ35. пустой). Ось у изображает спленоциты 8ЕС/106.
На фиг. 4 показана иммуногенность векторов Лй5, Лй35к5 и ЛЙ35, экспрессирующих 8ГУ Сад у интактных мышей с 109 νρ (А) и 108 νρ (Β), или при предварительной иммунизации одной (С) или двумя (Ό) инъекциями 1010 νρ Ай5-пустого перед иммунизацией 108 νρ соответствующих векторов. Во всех случаях Сад-специфические реакции СЭ8' Т-лимфоцитов оценивали анализами связывания Пь/АЬ11 тетрамера в множественные точки времени после иммунизации.
На фиг. 5 показан иммунитет против вектора, вызванный векторами Ай35к5 у мышей. (А) Интактные мыши С57/ВЬ6, подвергнутые первичному воздействию антигена в 0 нед. 109 νρ Ай35к5-Оад, и повторно иммунизированные через 4 нед. 109 νρ Ай5-0ад или Ай35-Оад. (В) Образцы сыворотки мышей, которым инъецировали 109 νρ Ай5-0ад, Ай35к5-Оад или Ай35-Оад, оцененные в анализах нейтрализации вируса на основе Ай5 и АЙ35 люциферазы.
На фиг. 6 показана иммуногенность векторов Ай5, Ай35к5 и АЙ35, экспрессирующих НГУ-Г Εην у мышей. Интактных мышей Ва1Ь/е иммунизировали 108 νρ АЮ-Ет; Ай35к5-Епу или Λά35-Εην. (А) Εηνспецифичные клеточные иммунные реакции, оцененные анализами объединенных пептидов и специфичного для пептида МГ10 эпитопа ΓΕΝ-γ ЕЫ8Р0Т. (В) Εην-специфичные гуморальные иммунные реакции по оценке ЕЬГ8А.
На фиг. 7 показана иммуногенность векторов Ай5, Ай35к5 и АЙ35 у макак резус, подвергнутых первичному воздействию антигена в 0 нед. 1011 νρ Ай5-0ад (А, В), Ай35-Оад (С, Ό) и Ай35к5-Оад (Е, Ε). Через 12 нед. все обезьяны получали гомологичную повторную иммунизацию. Епс- и Сад-специфичные клеточные иммунные реакции оценивали анализами объединенных пептидов ΓΕΝ-γ ЕЫ8Р0Т в множественные временные точки после иммунизации (А, С, Е). Вектор-специфические титры №1Ь оценивали анализами нейтрализации вируса Ай5 и АЙ35 (В, Ό, Ε).
На фиг. 8 показаны реакции СЭ4' и СЭ8' Т-лимфоцитов у обезьян в исследовании, описанном на фиг. 7. Анализы объединенных пептидов ΓΕΝ-γ ЕЬГ8Р0Т выполняли, используя РВМС (полинуклеарные клетки периферической крови) с истощенными запасами СИ8 и истощенными запасами СИ4 от обезьян через 16 нед. после иммунизации. Обезьяны получали 1011 νρ (А) Ай5-0ад, (В) Ай35-Оад или (С) Ай35к5-Оад в 0 нед. и через 12 нед.
На фиг. 9 показана иммуногенность векторов Ай5-0ад, Λά5НУΚ48 (1)-Сад и АЙ5НУР48 (1-7) у интактных мышей, получающих (А) 109 νρ, (В) 108 νρ, или (С) 107 νρ. Реакции Сад-специфических СИ8+ Тлимфоцитов оценивали анализами связывания тетрамера ОЬ/АЕ11 во множественные временные точки после иммунизации.
На фиг. 10 показана иммуногенность векторов Ас15-0ад, Λά5НУΚ48 (1)-Сад и Λά5НУΚ48 (1-7) у мышей, получающих (А) 109 νρ, (В) 108 νρ, или (С) 107 νρ, предварительно иммунизированных двумя инъекциями 1010 νρ Ай5-пустого за 8 и 4 нед. до иммунизации.
На фиг. 11 показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:12) гексонного белка на основе Ай5 с включением семи НУР для семи соответствующих НУР (подчеркнуто) из АЙ48 (АЙ5НУР48 (1-7)).
На фиг. 12 показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:13) гексонного белка на основе Ай5 с включением семи НУР для семи соответствующих НУР (подчеркнуто) из АЙ35 (АЙ5НУР35 (1-7)).
На фиг. 13 показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:14) гексонного белка на основе Ай5 с включением семи НУР для семи соответствующих НУР (подчеркнуто) из АЙГ1 (АЙ5НУР11 (1-7)).
На фиг. 14 показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:15) гексонного белка на основе Ай5 с включением семи НУР для семи соответствующих НУР (подчеркнуто) из АЙ26 (АЙ5НУР26 (1-7)).
На фиг. 15 показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:16) гексонного белка на основе Ай5 с включением семи НУР для семи соответствующих НУР (подчеркнуто) из аденовируса Рап9 (Ай5НУРРап9 (1-7)).
На фиг. 16 показано окрашивание внутриклеточного дад в эксперименте сравнения (без инфекции, график 1° и 2° АЬ) и после инфекции Ай35к5 (2 партии: #4, #5), АЙ5НУР26 (2 партии: #3 дважды, #28) и Ай35к49 (3 партии: #4, #5, #9).
На фиг. 17 показана аминокислотная последовательность гексонного белка в АЙ5НУР48 (1-7)* (8Е0 ГО N0:84), в котором последовательность НУР1 подвергнута делеции, как определено в табл. ГУ,
- 2 010433 последовательность ΗνΚ2 в соответствии с табл. IV, замещена линкером ОС и ΗνΚ3-ΗνΚ7, в соответствии с определением табл. IV, были замещены между АЙ5 и АЙ48.
Фиг. 18; как фиг. 17, теперь для Άά5ΗνΚ35 (1-7)* (8Е0 ΙΌ N0:85).
Фиг. 19; как фиг. 17, теперь для Άά5ΗνΚ26 (1-7)* (8Е0 ΙΌ N0:86).
Фиг. 20; как фиг. 17, теперь для Άά5ΗνΚ49 (1-7)* (8Е0 ΙΌ N0:7).
Фиг. 21 представляет собой график, показывающий реакцию СЭ8+ Т-лимфоцитов у мышей после двойной предварительной иммунизации Ай5-пустым, с последующим первичным воздействием антигена в 0 д. Ай35-Сад и повторной иммунизацией на 28 д. тремя различными векторами, как указано.
Краткое описание сущности изобретения
В настоящем описании раскрыты вновь разработанные рекомбинантные аденовирусные векторы для усовершенствованной доставки гена, вакцинации и генной терапии в одном предпочтительном варианте осуществления. Вектор представляет собой рекомбинантный аденовирус на основе аденовируса серотипа 35 (АЙ35), где, по меньшей мере, выступ волокна АЙ35 был замещен выступом волокна серотипа, который связывается с рецептором коксакивируса и аденовируса (САК). Предпочтительнее этот серотип представляет собой выступ волокна АЙ5 (приводящий к получению вектора, обозначаемого Лб35к5. в котором только выступ был замещен, или вектора, обозначаемого Άά35ί5, в котором были замещены выступ, стержень и часть хвоста). Стержень и хвост волокна может быть от серотипа, несущего остов, т.е. АЙ35, тогда как изобретение также относится к векторам, в которых домен стержня относится к такому же серотипу, что и серотип выступа волокна. В АЙ35Г5 часть хвостовой области, оставшаяся от серотипа остова, обеспечивает должное взаимодействие с оставшейся частью капсида для получения стабильных векторов. Векторы по настоящему изобретению включают интересующую терапевтическую нуклеиновую кислоту, предпочтительно нуклеиновую кислоту, которую можно применять в целях вакцинации.
Изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам, которые сталкиваются с низким предсуществующим иммунитетом у большей части человеческой популяции, все же сохраняя способность вызывать сильную иммунную реакцию против антигена, кодируемого нуклеиновой кислотой, содержащейся в векторе. Это достигается получением рекомбинантных векторов на основе серотипов аденовируса, таких как АйП, Ай24, Ай26, Ай34, Ай35, Ай48, Ай49, АО) или аденовирусов обезьяны, несущих химерный капсид. Химерный капсид включает волоконные белки, которые частично основаны на волоконных белках из серотипов аденовируса человека, отличающихся от каркасного вектора, и которые в самом предпочтительном варианте осуществления связываются (через их домен выступа) с рецептором САК.. Многие различные аденовирусы, которые предпочтительно связывают САК, можно использовать для обеспечения выступа волокна, такие как аденовирусы человека из подгрупп А, С, Ό, Е и Е, и аденовирусы овцы, которые также связывают САК. Предпочтительные серотипы аденовируса, которые используются за их домены выступа волокна, представляют собой аденовирусы человека из подгруппы С, предпочтительнее Ай2 и АО
В другом варианте осуществления вирус, полученный в соответствии с изобретением, представляет собой рекомбинантный аденовирус на основе аденовируса подгруппы С, предпочтительно АО который сделан дефектным по репликации функциональной делецией области Е1. и в котором гексонный белок в вирусном капсиде представляет собой химерный белок, такой что одна или несколько из гипервариабельных областей (ΗνΚ) были замещены ΗνΚ, полученной из редкого серотипа аденовируса. Такие редкие серотипы не сталкиваются с NАЬ у большинства индивидуумов в популяции людей. Предпочтительные серотипы, которые используются для предоставления ΗνΚ, представляют собой Ай35 и Ай48. Предпочтительно рекомбинантный вирус включает интересующую гетерологичную нуклеиновую кислоту, которую предстоит доставить хозяину в профилактических или терапевтических целях.
Подробное описание
Как обсуждалось выше, использование рекомбинантных векторов на основе Ай5 затрудняется существованием нейтрализующих антител (Лайк), которые присутствуют у большинства людей вследствие предшествующей инфекции вирусом дикого типа. Хотя различные капсидные белки, присутствующие в вирусной оболочке, индуцируют антитела у хозяина, было продемонстрировано, что первичной мишенью Ай5-специфичных Лайк является белок Ай5 гексона (8ит1йа с1 а1. 2005). Это привело к идее, что изменением гексонного белка так, чтобы его больше не могли выявить предсуществующие ЛАЙ, можно получить усовершенствованные аденовирусные векторы, которые оказывали бы благоприятное воздействие у людей, у которых уже есть ЛАЙ против Ай5, или которые были ранее иммунизированы предыдущими вакцинами на основе АО или которых подвергали первичному воздействию антигена с векторами на основе Ай5 в схеме вакцинации первичного воздействия антигена/повторной вакцинации. Однако оказалось, что изменение гексонного белка является нелегкой задачей. Полные изменения гексона в целом были возможны только между аденовирусами в пределах одной и той же подгруппы Ай и приводили к получению слабо жизнеспособного вируса (Уош1 с1 а1. 2002; Са11 с1 а1. 1998; Коу с1 а1. 1998). Если бы это было ограничение, то вектор на основе Ай5 должен был содержать гексонный белок из других аденовирусов подгруппы С. Однако большинство из них, если не все, являются бесполезными в том смысле, что те серотипы не считаются редкими. Большинство индивидуумов в человеческой популяции
- 3 010433 однажды сталкивались с серотипами из подгруппы С. Было бы предпочтительно использовать гексон из серотипа, который бы не столкнулся с уже присутствующими ЫЛЬ. Те редкие серотипы преимущественно обнаруживаются у серогруппы В (Α6Ι1, Α634, Α635, Α650) и Ό (Α624, Α626, Α648 и Α649).
Авторы настоящего изобретения впервые показали, что путем (пересмотренного) определения определенных частей гексона и использованием консервативного подхода и имеющихся данных о структуре и последовательности, можно идентифицировать определенные области и подвергнуть обмену, приводящему к продуцируемым рекомбинантным вирусам, которые являются жизнеспособными и которые можно получать в достаточно высоких титрах. Предпочтительные серотипы, которые используются для предоставления их гексонного белка или его релевантных частей, представляют собой Α6Ι1, Α624, Л626. Л634. Α635, Α648, Α649 и Α650, поскольку известно, что эти серотипы сталкиваются с низким предсуществующим иммунитетом (см. νθ 00/70071). Более предпочтительными являются Α6Ι1, Α626, Α635 и Α648, тогда как Α648 представляет собой наиболее предпочтительный серотип. В этом отношении также интересны не человеческие аденовирусы. Одним предпочтительным примером является аденовирус шимпанзе Рап9.
Области, которые были идентифицированы, представляют собой 7 поверхностных петель, также известные как гипервариабельные области гексона (НУК). Вариабельность гексона среди серотипов аденовируса концентрируется в этих 7 петлях (Сга\\Тогб-М|к5/а апб Зсйпигг, 1996). Следует понимать, что изобретение не ограничивается использованием НУК Α648, как очерчено в примерах. Это, кроме того, обосновывается идентификацией НУК в Α65, Α6Ι1, Α626, Α634, Α635, Α648, Α649 и Α650 в несколько широком определении (см. табл. ΙΙ) и в несколько более ограниченном, более минималистическом определении (см. табл. IV). Α648 служит в качестве примера всех других серотипов, которые также сталкиваются с низким предсуществующим иммунитетом и которые можно также использовать при получении химерного аденовируса, на который благоприятно воздействуют известные преимущества аденовируса подгруппы С, иллюстрируемой Α65 (сильная иммуногенность, легкое получение и т.д.) с преимуществами редких серотипов (низкий предсуществующий иммунитет). Ясно, что если предусмотреть использование схемы вакцинации в виде первичного воздействия антигена/повторной вакцинации, при которой предпочтительно использовать каркас другого серотипа, такой как Α635, то было бы благоприятным проводить повторную вакцинацию с вектором, который не сталкивается с возросшими уровнями ПАЬ против вектора первичного воздействия антигена. Таким образом, такие комбинации как Α6Ι1, Α624, Α626, Α635, Α648, Α649, Α650 и т.д. с НУК другого редкого серотипа (такого как любой из указанных выше редких серотипов) являются также частью настоящего изобретения. Не ограничивающими примерами таких векторов являются Αб5НУК48, Αб5НУК35, Αб5НУК11, Αб5НУК48, ΑбI1НУК35 и ΑбΠНУК48, имеющие по меньшей мере один, предпочтительнее 6, а наиболее предпочтительно 7 НУК, обмениваемых между серотипами. Таким образом, предпочтительно, чтобы был взят по меньшей мере один НУК из редкого серотипа и вставлен в гексон каркасного серотипа. Авторы настоящего изобретения показали, что замещение всех семи НУК из Α65 соответствующими НУК из Α648, привело к жизнеспособному и продуцируемому вектору, который навряд ли сталкивался с предсуществующим иммунитетом у мышей, иммунизированными пустыми Α65 вирусами. Однако, если замещали только первый НУК (видимый от левого ΙΤΡ до правого ΙΤΡ в вирусном геноме), то эффект не наблюдался. Это не значит, что одно замещение не могло быть достаточным. Полагают, что одна область более иммуногена чем другие, и все еще предстоит исследовать, какая из 7 идентифицированных областей вносит самый большой вклад, и какой из НУК не нужно замещать в определенных наборах или для определенного вида применения. Возможно, что у определенных индивидуумов возникали различные иммунные реакции в отношении различных НУК, по сравнению с другими индивидуумами. Более того, химерные векторы, содержащие гексон, могут оказаться благоприятными в ситуациях, когда имеется лишь умеренная активность НАЬ у хозяина. Предсуществующий иммунитет, выработанный в соответствии с предоставленными примерами, очень высокий, благодаря 2 последовательным дозам 1010 νρ пустого вектора Α65. Тем не менее, наиболее предпочтительно, чтобы все НУК внутри гексонного белка были замещены, поскольку это предоставило бы наилучшую возможность получения вектора, не выявляемого предсуществующими ΝΑΚ присутствующими у хозяина.
Для разработки усовершенствованных аденовирусных векторов, сначала провели картирование эпитопов Αб5-специфического нейтрализующего антитела (ΝΑ^. Было выявлено, что в человеческих популяциях доминирование и титры серотипа Α65 были очень высокими (приблизительно 50% в США и 90% в части развивающихся стран). Более того, как описано здесь, было обнаружено, что функционально значимые Αб5-специфические NΑЬ направлены почти исключительно против гексонного белка (см. также 8иш1ба с1 а1. 2005). Напротив, Αб5-специфические антитела, направленные против волоконного белка, не значительно подавляют иммуногенность Α65 вакцины в релевантных, естественно существующих обстоятельствах, т.е. обстоятельствах, относящихся к титрам анти-Αб5 ΝΑΚ обнаруженных у людей. В отличие от Α65 обнаруживается, что доминирование и титры серотипа Α635 и Α6Ι1 очень низкие у популяций людей во многих различных частях мира.
Настоящее изобретение относится к новым аденовирусным векторам, которые несут гексон редкого (или, по меньшей мере, редко нейтрализованного) серотипа Α6, такого как Α6Ι1, Α624, Α626, Α634,
- 4 010433
А635, А648, Л649 и АО), и предпочтительно домен выступа волокна из серотипа, который взаимодействует с рецептором САК, такого как большинство серотипов аденовируса человека из подгруппы А, С, Ό, Е и Е и аденовирусов овцы. Предпочтительными серотипами, которые используются в качестве каркасного вектора и, таким образом, несут их собственный гексонный белок, в отношении которого редко обнаруживаются ЫАЬ у человеческой популяции, являются АО и А635.
Предпочтительным серотипом, который используется в качестве каркасного вектора и для его волокна, является АО В данной области хорошо известно, что клетки, которые играют основную роль в иммунных реакциях, представляют собой дендритные клетки, поскольку это клетки, которые способны эффективно представлять иммуногенные пептиды на их поверхности, вызывая, посредством этого, сильную иммунную реакцию против такого пептида. Векторами, которые были предпочтительными в данной области, ввиду их способности очень эффективно инфицировать дендритные клетки, являются векторы из подгруппы В аденовируса, или векторы, которые несут волоконные белки из аденовирусов, которые эффективным образом распознают и инфицируют дендритные клетки (см., например, XV О 02/24730 и XVО 00/70071). Эти векторы предположительно используют ΟΌ46 в качестве рецептора. К удивлению, как показано здесь, в настоящее время авторами настоящего изобретения было обнаружено, что вектор, несущий, по меньшей мере, выступ волокна аденовирусного вектора, который, как известно, взаимодействует через САК, а именно АО при клонировании поверх вектора, который сталкивается с низкими уровнями предсуществующего иммунитета, ведет себя так, что иммунные реакции улучшаются. Это очень неожиданно, принимая во внимание желательный путь иммунной реакции через дендритные клетки.
Следует понимать, что домен выступа, который средние специалисты в данной области могут легко отличить от остального волоконного белка (посредством сравнения последовательностей и общих представлений о взаимодействиях рецепторов), представляет собой домен, который преимущественно участвует в распознавании специфических клеточных рецепторов, с которыми связывается аденовирусный вектор. Ранее было показано, что волоконный выступ А65 взаимодействует с САК на поверхности клеток и опосредует эффективное вирусное присоединение перед вирусным вхождением, которое дополнительно облегчается пентоновым основанием и клеточными интегринами (ВсгдсПоп с! а1. 1997; Вс\\'1су с! а1. 1999; КосМпк с! а1. 1998 и 1999; ΧνίοΚΙιαιη с! а1. 1993), хотя вирусы группы В, такие как А611 и А635, взаимодействуют через СЭ46 (Саддсг с! а1. 2003). Настоящее изобретение относится к аденовирусным векторам, в которых обменивается, по меньшей мере, связывающий рецептор домен (определяемый доменом выступа).
Таким образом, последние из указанных векторов еще могут включать волоконные домены, такие как части стержня и/или хвоста из каркасного вектора. Действительно желательно использовать по меньшей мере часть хвостовой области каркасного вектора для обеспечения должного, стабильного взаимодействия с другими капсидными белками, что приводит к получению устойчивых рекомбинантных векторов.
Химерные аденовирусные векторы по настоящему изобретению более эффективны для вакцин и генной терапии, чем векторы, исключительно на основе А65 или А635 без химерных волокон. Химерные аденовирусы, несущие химерные волокна А65-А635, известны в данной области. Были раскрыты векторы АО несущие химерные волокна, в которых, по меньшей мере, домен выступа был получен из А635 (νθ 00/31285, νθ 00/52186; νθ 02/24730; §йауакйшс!оу с! а1. 2003; Кса с! а1. 2001). §шйй с! а1. (2003) описали химерное волокно, в котором хвост и стержень получены из А635, в то время как домен выступа получен из АО Все векторы из этих приведенных ссылок основан на А65, свидетельствуя о том, что векторы еще столкнулись бы с предсуществующим иммунитетом вследствие присутствия гексона А65 в вирусном векторном капсиде. Данные, предоставленные Орйога! с! а1. (2004), подтвердили этот феномен. Рекомбинантные дефектные по репликации векторы А635 и способы их получения также известны в данной области (νθ 00/70071; νθ 02/40665), в то время как Саискй с! а1. (2003) раскрыли использование основанного на А635 вектора, который включает волокно, в котором выступ волокна А635 был замещен выступом волокна АО Однако вектор нес маркерный ген (белок зеленой флюоресценции, СЕР) и, очевидно, проявлял низкую эффективность трансдукции. Следовательно, Сапсй с! а1. не раскрывают или не предлагают вакцины на основе векторов, в которых, по меньшей мере, выступ А635 был замещен выступом АО не касаясь преимуществ, связанных с их использованием. Сапсй с! а1. раскрывают также вектор, основанный на А635, с полным волокном АО Следует отметить, что этот вектор включает полное волокно АО а не химерное волокно, и, таким образом, отличается от векторов, раскрытых здесь. Сапсй с! а1. предупреждают, что была обнаружена низкая эффективность трансдукции с частичным обменом волокон. Векторы в соответствии с изобретением имеют высокую эффективность трансдукции, в то время как химерные волокна обеспечивают устойчивое прикрепление в сохраняющемся капсиде. Специалист в данной области не имел бы побуждения в целях вакцинации заместить выступ волокна серотипов, которые, как известно, очень эффективно инфицируют дендритные клетки (такие как волокна подгруппы В, например, А611, А634 и А635) выступом волокна из серотипа, который инфицирует клетки, главным образом, через САК.
Ввиду того, что нейтрализующая активность со стороны хозяина в отношении аденовирусных век
- 5 010433 торов в первую очередь вызвана ΝΆΒ против гексонного белка, аденовирусные векторы могут также основываться на высоконейтрализованных серотипах, иллюстрируемых А65, в котором гексон замещен гексоном редко нейтрализованного серотипа, таким как А611, Λ624. А626, Λ634. Λ635. А648, А649 и А650. Пример такого вектора обозначается Λ651135 (вектор на основе А65, включающий гексонный белок из А635, вместо гексона А65). Специалист в данной области способен предвидеть и получить различные возможные комбинации на основе раскрытых здесь данных и на основе имеющихся в данной области представлений. Стало ясно, что обмен всех гексонов оказался трудным (Са11 с( а1. 1998; Υοιιίΐ с( а1. 2002). Один новый и полезный путь конструирования химерного гексонного белка раскрыт в примерах. Другой путь клонирования векторов, включающих химерный капсид, используя гексонные белки из других серотипов, был раскрыт в примере 8 ФО 00/03029.
Рекомбинантные аденовирусные векторы по настоящему изобретению, а именно векторы, основанные на серотипах, которые, в целом, сталкиваются с низкой предсуществующей активностью в человеческой популяции (А611, А624, А626, А634, А635, А648, А649 и А650, а также определенные аденовирусы обезьян), несущие домен выступа аденовируса, который в целом вызывает высокую иммунную реакцию, представляют усовершенствование относительно и аденовируса, который, в целом, вызывает высокую иммунную реакцию, а также относительно аденовируса, который избегает предсуществующей нейтрализующей активности, потому что он несет гексонный белок, который не выявляется предсуществующим иммунитетом у высокой процентной доли мировой популяции. Другими словами, и как проиллюстрировано здесь, А635ПЬ5 и А635к5 представляют усовершенствования относительно и вектора А65 и А635.
Учитывая высокие уровни иммунитета против А65 у популяций человека, векторы А65 вероятно существенно подавляются иммунитетом против вектора, по меньшей мере, на основании экспериментов, выполненных на мышах и обезьянах. Учитывая низкие уровни иммунитета против А635 у популяций человека, А635 и связанные с А635 векторы в этом отношении имеют существенное преимущество перед векторами А65. Другими словами, векторы А635, А635ПЬ5 и А635к5 по существу не подавляются иммунитетом против векторов. Однако вакцины на основе вектора А635 менее иммуногенные, чем вакцины на основе вектора А65 с точки зрения антител против антигенной вставки.
Важно, что в настоящее время авторы данного изобретения впервые показали, что низко нейтрализованные векторы, несущие, по меньшей мере, (гетерологичный) домен выступа другого, но высоко иммуногенного вектора, существенно более активны в индукции иммунной реакции, чем каркасный вектор с его нативным волокном. Таким образом, такие векторы представляют техническое и практическое продвижение относительно имеющихся в настоящее время аденовирусных векторов. Специалист в данной области сможет использовать представленную здесь информацию для клонирования других аденовирусных векторов на основе такого же принципа. Например, изобретение также относится к рекомбинантным аденовирусам обезьян, которые несут домен выступа волокна иммуногенного аденовируса человека. Кроме рекомбинантных аденовирусов обезьян, другие не человеческие аденовирусы, такие как рекомбинантные аденовирусы быков и собак, охватываются настоящим изобретением. Оно также относится к другим низко нейтрализованным человеческим аденовирусам, которые можно использовать в качестве каркасных векторов, которые несут, по меньшей мере, домен выступа других иммуногенных аденовирусов. Различные комбинации являются многочисленными, но ограниченными в той степени, чтобы, по меньшей мере, гексонный белок аденовируса не столкнулся с высоким уровнем предсуществующего иммунитета, в то время как, по меньшей мере, домен выступа доставляет распознавание рецептора САК, обеспечивая, посредством этого, высокую иммунную реакцию у хозяина, которому введен вектор. Обычный специалист в данной области сможет отличить описанные признаки с использованием общих представлений в данной области об определении предсуществующего иммунитета, определении уровня вызванных иммунных реакций и стратегий получения рекомбинантных (химерных) векторов, как очерчено настоящим изобретением.
Сильная иммуногенность векторов вакцины А635к5 свидетельствует о функционально релевантной роли белка волокна А65. Выступ волокна А65 определяет связывание с высоко аффинным рецептором САК, а также играет важную роль в эффективной внутриклеточной транспортировке вирусных частиц к ядру. Усиленная иммуногенность векторов А635к5 вероятно отражает известные биологические функции выступа волокна А65, хотя точный механизм еще не был определен. Рекомбинантные векторы А635к5 проявляют в первую очередь профиль нейтрализации рекомбинантного вектора А635 и эффективно избегают низких/умеренных уровней иммунитета против А65, как показано здесь. Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями, демонстрирующими, что А65-специфические NΑЬ в первую очередь направлены против гексонного белка А65. В поддержку этой модели, имеется также наблюдение, что векторы А65, содержащие белок волокна А635, были неспособны обойти иммунитет против А65 (Орйог81 с( а1. 2004). Однако высокие уровни иммунитета против А65 были в действительности способны снизить иммуногенность векторов А635к5, как показано здесь, вероятно, отражая нижний титр, но отчетливо выявляемые NΑЬ, направленные против белка волокна А65. Следует также отметить, что снижение иммуногенности А635к5 иммунитетом против А65 было лишь частичным и выявляемым только при особенно высоких титрах А65-специфических NΑЬ.
Другим ограничением векторов А635к5 может быть их относительно высокие соотношения ур/рЕи,
- 6 010433 которые были приблизительно в 10 раз выше, чем соотношения, обычно наблюдаемые для векторов Аб35. Это наблюдение свидетельствует о том, что вирусная целостность и устойчивость могут быть скомпрометированы включением химерного волоконного белка, хотя это еще требует исследования и подтверждения.
Как указано здесь, исследования на макаках резус, по сравнению иммуногенности векторов Аб5, Аб35к5 и Аб35, подтвердили результаты, полученные у мышей. Это уместно, поскольку у мышей нет оптимального рецептора СЭ46 Аб35, и поэтому можно недооценить иммуногенность векторов Аб35. У макак резус векторы Аб5 вызывали быстрые и высокие титры вектор-специфических ИАЬ, которые эффективно предотвращали гомологичную повторную иммунизацию, как ожидалось. Напротив, векторы и Аб35, и Аб35к5 вызывали более низкие титры вектор-специфических ИАЬ по сравнению с векторами Аб5, которые способствовали усилению этих реакций после повторного введения гомологичных векторов. Предполагается, что сильные иммунные реакции, наблюдаемые у обезьян, которые получали векторы Аб35к5, вероятно, отражали то обстоятельство, что эти векторы и запускали сильные реакции, и могли эффективно стимулироваться повторной иммунизацией.
Настоящее изобретение демонстрирует, что капсидные химерные рекомбинантные векторы Аб можно сконструировать для объединения благоприятных иммунологических и серологических свойств различных серотипов Аб. Генерирование химерных векторов Аб представляет новую стратегию, которая ведет к усовершенствованным векторам Аб второго поколения и для вакцинации, и для генной терапии.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к дефектному по репликации вектору рекомбинантного аденовируса серотипа 35 (Аб35), включающему химерный волоконный белок, включающий, по меньшей мере, домен выступа из серотипа связывающего САК аденовируса, в котором указанный рекомбинантный вектор дополнительно включает представляющую интерес терапевтическую нуклеиновую кислоту. Терапевтическая нуклеиновая кислота определяется как нуклеиновая кислота, которая кодирует терапевтическое белковое вещество, такое как белок, пептид или полипептид, который можно использовать в диагностических, терапевтических и/или профилактических целях у млекопитающих, предпочтительно людей. Примерами терапевтических белков являются белки, которые вызывают иммунные реакции при вакцинации опухоли. Другими примерами являются белки, которые можно использовать при лечении генетических нарушений, такие как белки, используемые при генной терапии. Предпочтительными терапевтическими белками являются белки, полученные или основанные или (непосредственно) клонированные из бактерий, паразитов или инфекционных источников, таких как вирусы. Аденовирусные векторы могут широко применяться в целях вакцинации против вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), 8ГУ (вирус иммунодефицита обезьян), вирус Эбола, вирус бешенства, вирус простого герпеса (Н8У), вирус гепатита С (НСУ) и т.д. Примерами полученных из ВИЧ антигенов, которые могут кодироваться в аденовирусной нуклеиновой кислоте, являются псГ. дад, ро1 и еиу. Примером антигена Н8У является антиген 9Ό. Терапевтические белки из паразитов, таких как паразиты, вызывающие малярию, можно также использовать в векторах по настоящему изобретению. Особенно предпочтительными белками, которые можно клонировать в эти векторы, являются белки из Иаьшобшш Га1с1рагиш, такие как белок циркумспорозоита (С8) и Ь8А-1. Другими предпочтительными белками могут быть белки из штаммов МусоЬас1егшт, в частности, штаммов, которые вызывают туберкулез, таких как МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818. Предпочтительными антигенами из этой бактерии являются антигены 10.4, 85А, 85В и 85С, которые можно, таким образом, также использовать в векторах по настоящему изобретению. Белки, используемые в качестве маркера для исследований ίη уйго, обычно не рассматриваются как терапевтические белки, поэтому СЕР, люцифераза или САТ не рассматриваются как терапевтические.
Подходящие промоторы и поли (А) последовательности, которые можно использовать для экспрессии антигенов, хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются, СМУ, Аб2 МБР, 8У40 и т.д. Подходящие последовательности окончания транскрипции можно, например, получить из 8У40 или ВСН. Кодирующие последовательности антигенов могут быть кодон-оптимизированными для оптимальной экспрессии у млекопитающих, предпочтительно, людей. Способы кодон-оптимизации хорошо известны в данной области.
Изобретение относится к репликационно дефективному рекомбинантному аденовирусу, выбранному из группы, состоящей из серотипов аденовируса 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 и 50, причем указанный аденовирус включает химерный волоконный белок, включающий, по меньшей мере, домен выступа из связывающего САК серотипа аденовируса, и где указанный рекомбинантный вектор, дополнительно, включает гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес терапевтический или антигенный белок. Предпочтительный серотип представляет собой серотип подгруппы В, предпочтительнее серотип 11, 34 и 35, наиболее предпочтительно серотип 35 (Аб35). Изобретение относится к этим серотипам, поскольку они сталкиваются с нейтрализующим предсуществующим иммунитетом в значительно низкой процентной доле образцов сыворотки людей, взятых у здоровых индивидуумов во всем мире. Используемые здесь химерные волоконные белки относятся к волокнам, которые включают части, по меньшей мере, из двух различных серотипов аденовируса, в которых домен выступа получен из аденовируса, который связывается с САК. Предпочтительно, чтобы хвостовой домен волоконного белка
- 7 010433 был из каркасного вектора, так как это дополняет устойчивость вектора посредством должного взаимодействия с капсидом вектора. В предпочтительном варианте осуществления, домен выступа, который связывается с САК, получен из волокна серотипа аденовируса из подгруппы С, предпочтительнее из серотипа А65.
Представляющий интерес терапевтический белок, используемый здесь, относится к белкам, которые можно использовать при терапевтическом лечении млекопитающих, таком как генная терапия. Представляющий интерес антигенный белок, используемый здесь, относится к представляющему интерес белку, в отношении которого иммунная реакция вызывается после экспрессии у хозяина, или в клетках хозяина. Эта иммунная реакция требуется для различных видов программ вакцинации. Одним примером является вакцинация против опухоли, при которой иммунная реакция в отношении представляющего интерес антигенного белка дополняет удаление опухолевых клеток, которые экспрессируют белок, в то время как другое предпочтительное применение представляет собой профилактическое лечение, такое как вакцинация, для предотвращения или значительного ингибирования инфекции хозяина патогенами, такими как вирусы, бактерии, дрожжи или паразиты. Таким образом, предпочтительно, указанный представляющий интерес антигенный белок включает белок из вируса, бактерии, паразита или дрожжевого грибка. Применение рекомбинантных аденовирусов в соответствии с изобретением можно также использовать при вызывании иммунных реакций в отношении представляющих интерес антигенных белков в ходе лечения инфекции, которая уже возникла, таким образом, для предотвращения репликации, упаковки и т.д. Другими словами, векторы можно также использовать для предотвращения распространения вируса от уже инфицированного хозяина на следующего.
В одном варианте осуществления рекомбинантный аденовирус в соответствии с изобретением включает гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая находится под контролем гетерологичного промотора.
В предпочтительном аспекте изобретения указанный антигенный белок включает белок из вируса, причем указанный вирус представляет собой ретровирус, Н8У или вирус Эбола, тогда как предпочтительно, чтобы если антигенный белок представляет собой антигенный белок ретровируса, то чтобы указанный вирус представлял собой ретровирус иммунодефицита обезьян или человека, где указанная гетерологичная нуклеиновая кислота предпочтительно включает один или несколько генов, выбранных из генов, кодирующих группу белков вируса иммунодефицита, состоящую из дад, ро1, еиу и пеГ.
В другом аспекте изобретения указанный представляющий интерес антигенный белок получен из паразита, вызывающего малярию, где указанный белок представляет собой предпочтительно белок циркумспротозоита или специфический печеночный антиген (Ь8А-1, Б8А-3), или его иммуногенную часть, из вида Р1а8шобшш, предпочтительнее Р1а§тобшт Га1с1рагиш.
Изобретение относится к новым дефектным по репликации рекомбинантным аденовирусам, включающим гетерологичную нуклеиновую кислоту и химерное волокно, где указанный аденовирус выбран из группы, состоящей из серотипов 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 и 50 аденовируса для применения в качестве лекарственного средства.
Изобретение, кроме того, относится к применению рекомбинантного аденовирусного вектора в соответствии с изобретением при получении лекарственного средства для профилактического или терапевтического лечения инфекции малярийным плазмодием, вирусом Эбола, Н8У, НСУ или ВИЧ.
В одном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к химерному дефектному по репликации рекомбинантному аденовирусу, включающему домен выступа из волокна А65. имеющего аминокислотную последовательность, как показано на фиг. 2В, и гексоновый белок из серотипа, отличного от А65, причем, кроме того, предпочтительно, чтобы указанный гексоновый белок был представлен из низко нейтрализованного аденовирусного серотипа. Низко нейтрализованные серотипы представляют собой те серотипы, которые сталкиваются с предсуществующей нейтрализующей активностью в форме ЫАЬ в меньшинстве образцов от здоровых индивидуумов. В одном определенном варианте осуществления изобретение относится к химерному дефектному по репликации рекомбинантному вектору А635, включающему гексон А635 и химерный волоконный белок, причем указанный химерный волоконный белок имеет аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:2.
Обмены гексонных НУК.
Поскольку NАЬ, специфичные для доминантного А65, в первую очередь, направлены против белка гексона А65, обосновывалось, что новые рекомбинантные векторы А65, содержащие целевые мутационные обмены в гексоне, могут быть способны избегать NАЬ, специфичных к доминантному гексону А65. Это не новая мысль, и были предприняты попытки получить такие «скрытые» аденовирусные векторы. Однако ни один из них не оказался успешным, как подчеркнуто ниже.
Представляется, что более чем 99% аминокислотной вариабельности среди гексонных белков от различных серотипов концентрируется в семи относительно коротких гипервариабельных областях (НУК), которые расположены на открытой поверхности гексона, как идентифицировано Сга\\Тог6-М|к5/а и 8сЬпигг (1996). Эти авторы сравнили гексонные белки 15 различных аденовирусов (А61, А62, А65, Λάβ, А68, А69, А612, А615, А616, А631, А640, А641, А648, ВАУ3 и МАУ1). Были идентифицированы 7 НУК среди 250 вариабельных остатков в петлях 1 и 2 (также именуемых 11 и 12), где НУК1-НУК6 находятся в
- 8 010433 петле 1 и НУК7 находится в петле 2. Сту§1а1 с соавторами (см. \УО 98/40509; патент США № 6127525; патент США № 6153435) заместили всю петлю 1 и 2 каркасного вектора (Αά5) петлями 1 и 2 Αά2 (Са11 е! а1. 1998) на основании данных Сга\\Тогй-М|к5/а е! а1. (1996). Также было получен вектор, в котором была замещена только петля 2. Были получены жизнеспособные вирусы. Αά2 и Αά5 представляют собой аденовирусы подгруппы С, и еще присутствовала перекрестная нейтрализация даже после замещения обеих петель, указывая на то, что такие обмены не привели бы к получению векторов, которые бы имели сниженную способность или неспособность быть распознанными нейтрализующим антителом, направленным против гексонного белка аденовируса дикого типа, по меньшей мере, когда обмены происходят в пределах одной и той же подгруппы. Тем не менее, для попытки получения таких векторов, они также пытались провести обмен петель Αά5 и заместить их петлями Αά7. Эти попытки были неудачными, жизнеспособный вирус не был получен, указывая на то, что невозможно было произвести замены из одной группы на другую, по меньшей мере, на основании идентификации НУК Сга\\Тогй-М|к5/а. Конечно, располагая знанием вирусной геномной структуры, необходимой генетической модификации можно достичь посредством общих методов молекулярной биологии, приводящих к получению плазмид/космид, которые должны кодировать весь рекомбинантный (химерный) вирус. Однако по неизвестным причинам, но наиболее вероятно вследствие достаточно критических аспектов сложной гексонной структуры и ее роли в формировании капсида, жизнеспособные вирусы не были получены, когда была модифицирована область, кодирующая гескон (Ких е! а1. 2003). Са11 е! а1. (1998) вместо обмена всего гексона предложили обмен только наружных петель. Упоминалось также, что другие капсидные белки, такие как пентон, могут иметь значимые эпитопы нейтрализации для объяснения несостоятельности обменов Αά5Лй2.
Авторы настоящего изобретения также пытались создать химерные аденовирусы на основании Αά5, несущего химерные гексонные белки, включающие НУК Αά35 или Αά48 вместо НУК Αά5, как рекомендовано Сга\\Тогй-М|к5/а апй 8сйпшт (1996) и как, кроме того, подчеркнуто Ких апй Витией (2000). Эти попытки были неудачными. Это согласовывалось с данными Сгу§!а1 е! а1., которые также не смогли показать какую-либо продукцию рекомбинантных вирусов, где был произведен обмен частей гексона от различных подгрупп (см. выше).
Для попытки решения этого вопроса, Ких е! а1. (2003) показали новые высоко разрешающие кристаллографические очищения гексонных структур Αй2 и Αй5, которые были произведены для разрешения ранее найденных различий в гексонных структурах Αй2 и Αй5. Это привело к новому определению областей в белке гексона, указывая на 9 НУК вместо 7. Ких е! а1. (2003) также идентифицировали части белка гексона, которые не должны нарушаться при конструировании новых векторов на основе аденовирусов.
Авторы настоящего изобретения также пытались получить химерные аденовирусы, включающие химерные гексонные белки с замененными НУК, на основании определений, предоставленных Ких е! а1. (2003). Однако снова нельзя было получить жизнеспособные вирусы. Ясно, что на основании определений, предоставленных в данной области, относительно НУК гексона, нельзя получить рекомбинантные аденовирусы, имеющие одну или несколько из НУК, обмененные между каркасным вектором и другим серотипом, по меньшей мере, между серотипами аденовируса различных подгрупп.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали 7 НУК внутри аденовирусов человека, которые отличаются от 7 НУК, идентифицированных Сга\\Тогй-М|к5/а апй 8сйпшт (1996), и которые также отличаются от 9 НУК, идентифицированных Ких е! а1. (2003). Широкое определение в соответствии с изобретением показано в табл. II, тогда как еще более минималистическое определение предоставлено в табл. 1У. Одно замещение этих НУК привело к получению жизнеспособного вируса. Насколько известно авторам, впервые кто-то смог генерировать химерные аденовирусы, включающие химерные гексонные белки, в которых не все петли заменены, но в которых обменены определенные НУК. Считается также, что это первая успешная попытка получения рекомбинантных аденовирусов, включающих химерные гексонные белки, где гексоны включают части из серотипов аденовирусов из двух различных групп. Концептуальной основой для пересмотра определения НУК было использование сохраненных аминокислот в качестве точек соединения. Тем не менее, нельзя исключить, что смещение одной или двух или, вероятно, даже трех аминокислот в направлении Ν- и/или С-конца может дать жизнеспособные векторы. Однако определения, как обеспечено ранее в данной области, были недостаточны для предоставления жизнеспособных векторов с химерными гексонами. Тем не менее, предоставленные здесь определения не следует воспринимать слишком прямолинейно, так как небольшие сдвиги могут также обеспечить хорошие результаты (см. табл. II в сравнении с табл. ГУ). Предпочтительно идентифицированные последовательности НУК (как представлено 8Еф Ш N0:17-79 и 88-150) представляют собой области, которые обменены между серотипами.
Были сконструированы основанные на Αй5 векторы, содержащие одну или несколько НУК, обмененные из Αй35 (подгруппы В) или Αй48 (подгруппы Ό), как раскрыто в примерах. Ясно, что можно произвести обмен одной или нескольких НУК. Поскольку вероятно, что ΝΑΕ направлены на любую из НУК, предпочтительно иметь большинство, если не все, НУК от редкого серотипа вместо НУК дикого типа каркасного вектора. С другой стороны, такие большие обмены могут привести к жизнеспособным
- 9 010433 векторам, которые труднее получить. Здесь раскрыто, что все 7 НУК. идентифицированные в пределах каркасного вектора (иллюстрированного А65). можно заместить семью соответствующими НУК редкого серотипа (иллюстрированного А648). Это также свидетельствует о том. что обмены. основанные на определениях НУК* табл. ГУ. также приведут к жизнеспособным вирусам.
Спейсерные области между НУК предпочтительно продолжают оставаться каркасного серотипа для обеспечения должной укладки белка. Предпочтительный каркас представляет собой Л65. хотя можно использовать другие. в целом широко применяемые серотипы из подгруппы С. такие как Л62. Когда обмениваются НУК. предпочтительно обменивается по меньшей мере одна. предпочтительнее 2. еще предпочтительнее 3. еще предпочтительнее 4. еще предпочтительнее 5. еще предпочтительнее 6. а наиболее предпочтительно 7 НУК.
Векторы Л65НУК35 и Л65НУК48. которые были генерированы. как раскрыто здесь. по существу более иммуногенны. чем рекомбинантные векторы Л65 в присутствии иммунитета против Л65. потому что ЫАЬ. которые в первую очередь направлены против гексонного белка Л65 индивидуумов. инфицированных Л65. больше неспособны нейтрализовать посредством НУК гексона Л635 и А648. Этот признак остается справедливым для всех НУК. полученных из всех известных редких серотипов. которые можно выбрать из Л6Г1. А624. Л626. А634. Л635. А648. А649 и Л650.
Как показано ниже. вирусы А65НУК48 (1-7). содержащие все 7 НУК А648. вместо 7 НУК Л65. приводят к получению вируса. которому не мешает предсуществующий иммунитет. вызванный предварительной инъекцией вируса Л65. Это позволяет использовать векторы на основе Л65 в многочисленных процедурах. например. в схемах первичной и повторной вакцинации. где требуется. чтобы рецептор распознавания между вектором примирования и вектором повторной иммунизации оставался одним и тем же. Другим видом применения была бы вакцинация или терапевтическое применение с вектором на основе Л65 у индивидуумов. которые столкнулись с инфекцией Л65 дикого типа. предшествующей лечению.
На основании идентификации НУК. как раскрыто здесь. теперь возможны многочисленные комбинации между каркасными векторами и другими серотипами аденовирусов. Это представление можно экстраполировать на гексоны всех известных аденовирусов человека и не человека. Когда требуется схема первично-повторной иммунизации (не только для процедур. при которых требуются векторы на основе Л65). то предоставленные здесь знания можно применить для конструкции вектора со способностью сокрытия. а именно обхода предсуществующего иммунитета против гексонных НУК. присутствующих в ранее применявшемся вирусе. Следует понимать. что химерные векторы НУК. как раскрыто здесь. можно. кроме того. модифицировать способами. известными в данной области. Например. волокно можно изменить для получения специфической способности нацеливания (например. волоконных выступов из вирусов подгруппы В. помещенных на векторы. основанные на подгруппе С. можно нацелить на гладкомышечные клетки. в первую очередь. фибробласты. дендритные клетки и т.д.). Примером такого вектора был бы вектор на основе Л65. включающий НУК. например. из А648 и. по меньшей мере. выступ волокна (главную детерминанту распознавания рецептора). например. из Л635. Все такие векторы подпадают под объем настоящего изобретения. относящегося к аденовирусным векторам. включающим гексоны. которые являются химерными в отношении их НУК.
Специалист в данной области теперь сможет. используя предоставленную здесь информацию. сконструировать и получить жизнеспособные рекомбинантные дефектные по репликации аденовирусы. которые имеют одну или несколько НУК. замещенные НУК из других аденовирусов. Более того. предоставленные здесь последовательности НУК теперь предоставят возможность удалить те последовательности и использовать эти положения внутри гексона для введения других веществ. таких как нацеливающие лиганды. для нацеливания аденовирусов на представляющие интерес клетки (ίη νίνο и ίη νίίτο). участки связывания радиоактивной метки для прослеживания аденовирусов ίη νίίτο и определенных В клеточных эпитопов (таких как описано ^отда11 с1 а1. 2005).
Настоящее изобретение относится к партии рекомбинантного дефектные по репликации аденовируса. основанного на серотипе из первой подгруппы. причем указанный аденовирус включает последовательности из серотипа указанной первой подгруппы и по меньшей мере одну последовательность гипервариабельной области (НУК) из серотипа из второй подгруппы. где указанная первая и указанная вторая подгруппа не являются одинаковыми. Предпочтительно указанная первая подгруппа представляет собой подгруппу А. С. Ό. Е или Р. Также предпочтительны партии в соответствии с настоящим изобретением. где указанная вторая подгруппа представляет собой подгруппу В или Ό. Более предпочтительны партии. в которых указанная первая подгруппа представляет собой подгруппу С. а серотип из указанной подгруппы С представляет собой А65. и где указанный серотип из подгруппы В или Ό выбран из группы. состоящей из А6Г1. А624. А626. А634. А635. А648. А649 и А650.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный химерный гексонный белок включает первые 6 последовательностей НУК (НУК1-НУК6) или все 7 последовательностей НУК (НУК1-НУК7) из серотипа из указанной второй подгруппы.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный гексонный белок сохраняет аминокислотные последовательности каркасного вируса между последовательностями НУК. Таким образом.
- 10 010433
144, где последовательность НУК2 (НУК2*) выбрана из 8ЕО ΙΌ
145, где последовательность НУК3 (НУК3*) выбрана из 8ЕО ΙΌ
146, где последовательность НУК4 (НУК4*) выбрана из 8ЕО ΙΌ
147, где последовательность НУК5 (НУК5*) выбрана из 8ЕО ΙΌ
148, где последовательность НУК6 (НУК6*) выбрана из 8ЕО ΙΌ
| 137 | и |
| 138 | и |
| 139 | и |
| 140 | и |
| 141 | и |
одну или несколько определенных здесь последовательностей НУК можно подвергнуть делеции, мутации, замещению линкером или заместить последовательностью НУК из другого серотипа, более предпочтительно последовательности, связывающие НУК, сохраняются и являются неизмененными. Это обеспечивает возможность получения вирусов, которые устойчивы вследствие их гексон-каркасной структуры, обеспеченной не НУК последовательностями. Таким образом, предпочтительно, чтобы последовательности между последовательностями НУК были из серотипа из указанной первой подгруппы.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет партии аденовирусов в соответствии с настоящим изобретением, где первая подгруппа представляет собой подгруппу С и где по меньшей мере одна последовательность НУК из серотипа указанной второй подгруппы выбрана из 8ЕО ΙΌ N0:24-79 и 8Е0 ΙΌ N0:95-150. В еще более предпочтительном варианте осуществления последовательность НУК выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:17, 24, 31, 38, 45, 52, 59, 66 и 73, где последовательность НУК2 выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:18, 25, 32, 39, 46, 53, 60, 67 и 74, где последовательность НУК3 выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:19, 26, 33, 40, 47, 54, 61, 68 и 75, где последовательность НУК4 выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69 и 76, где последовательность НУК5 выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 и 77, где последовательность НУК6 выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 и 78, где последовательность НУК7 выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:23, 30, 37, 44, 51, 58, 65, 72 и 79. В еще одном предпочтительном варианте осуществления последовательность НУК1 (НУК1*) выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:88, 95, 102, 109, 116, 123, 130, N0:89, 96, 103, 110, 117, 124, 131, N0:90, 97, 104, 111, 118, 125, 132, N0:91, 98, 105, 112, 119, 126, 133, N0:92, 99, 106, 113, 120, 127, 134,
N0:93, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 142 и 149, где последовательность НУК7 (НУК7*) выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:94, 101, 108, 115, 122, 129, 136, 143 и 150. Предпочтительнее последовательность НУК1, как представлена или последовательностью НУК1 в табл. ΙΙ, или последовательностями в табл. ГУ, подвергнута делеции из каркасного вектора. Причина делеции области НУК1 заключается в том, что, в соответствии с кристаллической структурой гексонного белка аденовируса, фланкирующие последовательности НУК1 находятся очень близко вместе, указывая на то, что эти фланкирующие последовательности могут быть непосредственно связаны без потери структуры, за исключением делеции. В другом предпочтительном варианте осуществления последовательность НУК2, как представлена или последовательностью НУК2 в табл. ΙΙ, или последовательностями в табл. ЕУ, замещены коротким линкером, предпочтительнее линкером из двух аминокислот, наиболее предпочтительно линкером ОС. Также фланкирующие последовательности НУК2 расположены близко вместе, следуя кристаллической структуре. Однако поскольку они слегка более разделены, чем видно для НУК1, предпочтительно включить небольшой связывающий линкер, предпочтительно линкер из 1, 2, 3 или 4 аминокислот, предпочтительно 2. Удаление НУК из гексона может быть идеальным решением в предотвращении атаки NΑЬ против иммуногенных детерминант, представленных НУК. Однако ввиду кристаллической структуры не представляется вероятной делеция НУК3-7 из гексонного белка без разрушения его общей структуры и, таким образом, возможности его функции и роли в формировании капсида.
Хотя гексон Л624 также предпочтителен для его НУК, последовательность гексонного белка этого специфического «редкого» серотипа была неизвестна заявителям во время подачи. Тем не менее, располагая предоставленным здесь положением, специалист в данной области теперь сможет определить НУК внутри гексонного белка любого аденовируса, включая предпочтительный серотип Л624. Использованием любого из НУК Л624 также представляет собой часть настоящего изобретения.
Изобретение также относится к применению изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну последовательность НУК гексона серотипа человеческого аденовируса из серогруппы В в конструкции химерного гексонного белка, причем гексон дополнительно включает последовательности из аденовируса из подгруппы А, С, Ό, Е или Р. Кроме того, изобретение относится к применению изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну последовательность НУК гексона серотипа человеческого аденовируса из серогруппы Ό в конструкции химерного гексонного белка, причем гексон дополнительно включает последовательности из аденовируса из подгруппы А, В, С, Е или Р. Предпочтительно эта по меньшей мере одна последовательность НУК выбрана из 8Е0 ΙΌ N0:2479 и 95-150.
В табл. ΙΙΙ обобщены различные варианты осуществления изобретения. Таблица указывает, что изобретение относится к химерному дефектному по репликации аденовирусу, основанному на каркасном аденовирусе, включающем белок пентона и гексона серотипа X, где η НУК в гексонном белке относятся к серотипу Υ, кроме того, включающему волокно, включающее хвост и стержень серотипа Р и выступ серотипа К, где
X представляет собой серотип аденовируса, выбранный из группы, состоящей из аденовирусов человека 1-51, серотипа обезьяны, собаки, овцы, свиньи и быка;
Υ представляет собой серотип аденовируса, выбранный из группы, состоящей из аденовирусов человека 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 и 50, где X и Υ могут быть одинаковыми или различными, и где η пред
- 11 010433 ставляет любое количество НУК от 0 до 7, при условии, что если X и Υ, эта п=1-7;
Р представляет собой серотип аденовируса, выбранный из группы, состоящей из аденовирусов человека 1-51, серотипа обезьяны, собаки, овцы, свиньи и быка, где Р, X и Υ могут быть одинаковыми или различными, и
К представляет собой серотип аденовируса, где К, Р, X и Υ могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно по меньшей мере часть хвоста волоконного белка, которая взаимодействует с пентонным белком относится к серотипу X в случае, когда Р не представляет собой X.
Следует понимать, что каркасный аденовирусный вектор может представлять собой любой аденовирус (сделанный рекомбинантным, так что он не реплицируется в нормальных, не упаковывающих клетках), который применим для использования у людей. Любые из известных аденовирусов человека (серотипов 1-51) в пределах шести подгрупп А, В, С, Ό, Е и Р, а также известные аденовирусы обезьяны, собаки, быка, овцы и свиньи можно использовать в качестве каркасного вектора, пока он является дефектным по репликации, и пока он применим для лечения людей. Каркасный вектор является дефектной по репликации делецией по меньшей мере одной функциональной части области Е1, предпочтительно делецией всей функциональной области Е1. Хотя каркасный вектор обычно включает другие ранние и поздние области, специалисту в данной области известны возможности, предоставленные в данной области, для комплементации определенных требуемых аденовирусных белков другими средствами, например посредством комплементации хелперными вирусами или трансформацией упаковочной клетки, так что она включает требуемые нуклеиновые кислоты, устойчиво интегрированные в ее геном. Обычно вирусы по изобретению включают аденовирусный геном с делецией Е1, а предпочтительно также делецией Е3 для обеспечения пространства для представляющих интерес гетерологичных нуклеиновых кислот, которые можно клонировать в области Е1, или в области Е3, или в них обеих. В целом присутствуют остающиеся области, такие как Е2, Е4, 1ТК и поздние области, хотя они могут быть комплементированы отдельно во время продукции в упаковочной клетке. Векторы предпочтительно включают область Е4огГ6 (возможно, из другого серотипа), которая совместима с белком Е1В-55К, присутствующим в линии упаковочных клеток, как раскрыто в \УО 03/104467. Это сделано для обеспечения возможности продукции на известных упаковочных системах, таких как клетки РЕК.С6® или клетки 293, когда рекомбинантный вектор имеет первоначальную область Е4огГ6. которая не совместима с Е1В-55К Αά5, присутствующих в таких клетках.
Каркасный серотип указан выше как X. Кроме того, каркасный вирус можно сконструировать так, что он содержит НУК из одного или более серотипов аденовируса, выбранных из ΑάΙ1, Αά24, Αά26, Αά34, Αά35, Αά48, Αά49 и Αά50 (указанных серотипом Υ). Ясно, что когда X представляет собой один из серотипов Υ, то НУК, которые могут необязательно конструироваться в виде этих серотипов, считаются «редкими» и сталкиваются лишь с низким предсуществующим иммунитетом у большинства индивидуумов в популяции людей. Таким образом, когда X представляет собой один из серотипов Υ, то количество замененных НУК (количество, указанное п), может равняться нулю, но также 1-7, в то время как, когда X не представляет собой один из серотипов Υ, то по меньшей мере одна из НУК происходит из серотипа Υ, где все более предпочтительно иметь больше НУК из серотипа Υ и где наиболее предпочтительно иметь все 7 НУК замененными на соответствующие области из серотипа Υ.
Каркасный вирус по настоящему изобретению включает пентоновый белок того же серотипа, что и каркасный вирус. Каркасный вирус является «химерным» в том смысле, что или гексон является химерным (имеющим одну или более обмененных или замещенных НУК) и/или в том смысле, что волоконный белок является химерным и/или в том смысле, что волоконный белок происходит из серотипа, отличного от каркасного вируса. Существует возможность, что X=Υ=Р=К, например, рекомбинантный вектор Αά48, поскольку Αά48 связывает СУК. Однако такие векторы не являются «химерными» в том смысле, как описано выше, когда п=0. Не химерные рекомбинантные ΑάΙ1, Αά34, Αά35 и Αά50 не подпадают под представленное выше определение, так как выступ волокна должен всегда быть из серотипа, который предпочтительно связывает СΑК, который не связывают эти вирусы подгруппы В.
Волокно относится к серотипу, указанному как Р, включающему хвост из серотипа Р, включающему стержень из серотипа Р и включающему выступ из серотипа, указанного как К. Ясно, что когда К представляет собой тот же серотип, что и Р, то волоконный белок не является химерным. К представляет собой серотип, который предпочтительно взаимодействует с рецептором СΑК, и К может представлять собой тот же серотип, что и X, или другой. Ясно, что определенные серотипы человека, такие как серотипы из подгруппы В, предпочтительно не взаимодействуют с СΑК, но предпочтительно взаимодействуют с другим клеточным рецептором, таким как СЭ46. Так, когда К является таким же как X, то X не является одним из аденовирусов подгруппы В. Также, когда К относится к серотипу, отличному от Р (и, таким образом, волокно является химерным), то по меньшей мере часть хвоста, которая взаимодействует с пентоном в капсиде, относится к серотипу X, так как это привело бы к формированию должного и устойчивого капсида. Поскольку в настоящее время в данной области доступно большинство генов известных аденовирусов, кодирующих капсидный белок, то специалист в данной области сможет идентифицировать область хвоста, стержня и выступа для каждого известного и еще подлежащего обнаружению аденовируса.
- 12 010433
Предпочтительными, но не ограничивающими примерами химерных дефектных по репликации аденовирусов в соответствии с настоящим изобретением являются (Аб5НУК11 (1-7), Аб5НУК24 (1-7), Аб5НУК26 (1-7), Аб5НУК34 (1-7), Аб5НУК35 (1-7), Аб5НУК48 (1-7), Аб5НУК49 (1-7), Аб5НУК50 (1-7), Аб5НУКРап9 (1-7), Аб5НУК11 (1-6), Аб5НУК24 (1-6), Аб5НУК26 (1-6), Аб5НУК34 (1-6), Аб5НУК35 (1-
6), Аб5НУК48 (1-6), Аб5НУК49 (1-6), Аб5НУК50 (1-6), Аб5НУКРап9 (1-6), Аб5НУК11 (1), Аб5НУК24 (1), Аб5НУК26 (1) , Аб5НУК34 (1), Аб5НУК35 (1), Аб5НУК48 (1), Аб5НУК49 (1), Аб5НУК50 (1), Аб5НУКРап9 (1), Аб11к5, Аб24к5, Аб26к5, Аб34к5, Аб35к5, Аб48к5, Аб49к5, Аб50к5, Рап9к5, Аб11Г5, А624Г5. Аб26Г5, Аб34Г5, Аб35Г5, Аб48Г5, Аб49Г5, Аб50Г5, Рап9£5, Аб111к26, Аб34к26, Аб35к26, Аб50к26, Рап9к26, Аб11Г26, Аб34Г26, А635Г26, Аб50Г26, Рап9Г26, Аб11к49, Аб34к49, Аб35к49, Аб50к49, Рап9к49, Аб11Г49, Аб34Г49, Аб35Г49, Аб50Г49, Рап9Г49, Аб2НУК11 (1-7), Аб2НУК24 (1-7), Аб2НУК26 (1-7), Аб2НУК34 (1-7), Аб2НУК35 (1-7), Аб2НУК48 (1-7), Аб2НУК49 (1-7), Аб2НУК50 (1-7), Аб2НУКРап9 (1-
7), Аб2НУК11 (1-6), Аб2НУК24 (1-6), Аб2НУК26 (1-6), Аб2НУК34 (1-6), Аб2НУК35 (1-6), Аб2НУК48 (1-6), Аб2НУК49 (1-6), Аб2НУК50 (1-6), Аб2НУКРап9 (1-6), Аб2НУК11 (1), Аб2НУК24 (1), Аб2НУК26 (1), Аб2НУК34 (1), Аб2НУК35 (1), Аб2НУК48 (1), Аб2НУК49 (1), Аб2НУК50 (1), Аб2НУКРап9 (1), Аб11к2, Аб24к2, Аб26к2, Аб34к2, Аб35к2, Аб48к2, Аб49к2, Аб50к2, Рап9к2, Аб11Г2, Аб24Г2, Аб26Г2, Аб34Г2, Аб35Г2, Аб48Г2, Аб49Г2, Аб50Г2 и Рап9Г2.
Примеры
Пример 1. Международное доминирование серотипа и титры ЫАЬ к Аб5, Аб35 и Аб11.
Реакции Аб-специфических нейтрализующих антител (ЫАЬ) оценивали анализами нейтрализации вируса на основе люциферазы, в целом, как описано Бртапдега с1 а1. (2003). Вкратце, клетки карциномы легких человека А549 высевали с плотностью 1х 104 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и инфицировали подвергнутыми делеции Е1, репликационно некомпетентными конструктами репортера Аблюциферазы при множественности инфекции (то1) 500 с двукратными серийными разведениями сыворотки в реакционных объемах 200 мкл. После инкубации в течение 24 ч активность люциферазы в клетках измеряли, используя аналитическую систему Б1еабу-С1о Ьисйсгаке КеадеШ БуЧет (Рготеда). Титры нейтрализации на 90% определяли как максимальное разведение сыворотки, которое нейтрализовало 90% активности люциферазы.
В дополнение к исследованиям, описанным в XVО 00/70071, выполняли эксперименты для оценки доминирования серотипов и титров ЫАЬ к Аб5 и дополнительным Аб серотипам в развивающихся странах. Анализы нейтрализации вируса на основе люциферазы по Бртапдега е1 а1. (2003) применяли использованием образцов сыворотки, полученных у здоровых индивидуумов в США (N=19), Гаити (N=67), Ботсване (N=57), Замбии (N=29) и Южной Африке (N=59). Как показано на фиг. 1А, доминирование серотипа Аб5 составило 50% с относительно низкой медианой титров в США. Напротив, доминирование серотипа Аб5 составило 82% на Гаити, 93% в Ботсване, 93% в Замбии и 88% в Южной Африке. Более того, медиана титров Аб5-специфичных NАЬ в этих образцах была более чем в 10 раз выше, чем медиана титров, обнаруженных в США (фиг. 1В). Эти данные распространяются на предыдущие данные (Ко§1еи8е е1 а1. 2004; Уодек е1 а1. 2003) и демонстрируют, что Аб5-специфические NАЬ почти универсальны и присутствуют в высоких титрах в развивающихся странах. Напротив, у этих популяций доминирование серотипов и титры Аб11 и Аб35 были существенно ниже.
Пример 2. Иммунодоминантные мишени Аб5-специфических нейтрализующих антител.
Образцы, описанные в предыдущем примере, далее использовали для определения доминантных антигенных мишеней Аб5-специфических NАЬ и в США, и в Африке, южнее Сахары. Учитывая отсутствие выявляемой перекрестной реактивности NАЬ между Аб5 и Аб35, в анализах нейтрализации вирусов в качестве мишеней использовали капсидные химерные Аб5/Аб35 вирусы, экспрессирующие люциферазу. Эти векторы состоят из различных комбинаций гексонных, пентонных и волоконных белков Аб5 и Аб35 в контексте интактных вирусных частиц с кинетикой роста дикого типа (Науепда е1 а1. 2002; Кеа е1 а1. 2001). Химерные векторы, использованные в этом исследовании, включали Аб5Г35 (Аб5, содержащий выступ волокна, стержень Аб35 и химерный хвост Аб35-Аб5), Аб5Г35р35 (Аб5, содержащий волокно и стержень Аб35, химерный хвост Аб35-Аб5 и пентон) и Аб35Г5 (Аб35, содержащий выступ волокна, стержень Аб5 и химерный хвост Аб5-Аб35).
Как показано на фиг. 1С, сравнимые титры NАЬ наблюдались против Аб5, Аб5Г35 и Аб5Г35р35; все на основе Аб5. Поскольку капсид вектора Аб5Г35р35 содержит гексон Аб5, но волокно, полученное из Аб35, и пентон, полученный из Аб35, то эти данные свидетельствуют о том, что большая часть активности Аб5-специфических NАЬ была направлена против гексона Аб5. Более низкие, но отчетливо выявляемые титры также измерялись против рекомбинантного Аб35Г5 (также именуемого здесь Аб35ДЬ5), демонстрируя, что NАЬ, специфичные к волокну Аб5, присутствовали в титрах, которые в 5-10 раз ниже, чем №1Ь, специфичные к гексону Аб5, в этих образцах. При использовании этих вирусов, пентонспецифические NАЬ Аб5 не измерялись, но аналогичные титры NАЬ против Аб5Г35 и Аб5Г35р35 свидетельствовали о том, что пентон-специфические NАЬ играли не более чем относительно небольшую роль в этой нейтрализации.
Пример 3. Генерация Аб35Г5 и Аб35к5.
Вакцины на основе рекомбинантного Аб35 являются иммуногенными в присутствии иммунитета
- 13 010433 против Л65. Однако вакцины рекомбинантного Л635 эндогенно менее иммуногены, чем вакцины рекомбинантного Л65 в отсутствие иммунитета против Л65 (Ватоисй с1 а1. 2004). Эта проблема не была преодолена конструированием капсидных химерных векторов рекомбинантного Л635. в которых, по меньшей мере, выступ волокна А635 замещен выступом волокна Л65 (именуемым Аб35к5 для замещения выступа и А635Г5 для большей части замещения волокна).
Векторы рекомбинантного Аб35к5 получали замещением гена, кодирующего волокно А635, геном, кодирующим химерный волоконный белок, состоящим из хвоста и стержня волокна А635 (аминокислоты 1-132), связанным с выступом волокна А65 (аминокислоты 133-134). Антитела, специфичные для волокна А65, не притупляют иммуногенность вакцины рекомбинантного А65. Выступ волокна А635 не взаимодействует с САК, поскольку это аденовирус подгруппы В (КоеМпк с1 а1. 1998), но, вместо этого, использует СГО46 в качестве его рецептора (Саддег е1 а1. 2003). Различные волоконные белки направляют эти вирусы в различные внутриклеточные пути транспортировки. Предыдущие исследования показали, что выступ волокна А65 содействует быстрому выходу вируса из ранних эндосом в цитозоль, приводя к эффективному перемещению вирусных геномов в ядро, тогда как выступы волокон из аденовирусов подсемейства В, включая А6Г1 и А635, ведут к задержке вирусных частиц в поздних эндосомах и рециклингу большой фракции назад на клеточную поверхность (8Ьауакйте1оу е1 а1. 2003).
Клонирование рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей вектор Аб35к5, проводили следующим образом. Область, кодирующую выступ волокна А65, синтезировали РСК (полимеразной реакцией синтеза цепи) и клонировали в виде фрагмента ΒδίΑΙ-ΝΙκΙ в плазмиду рВК.Аб35.РасГ-тГТК.бЕ3 (= рВг.Аб35.РКпЛЕ3 в АО 2004/001032) для замещения соответствующей области, кодирующей выступ волокна А635. Затем мутантную плазмиду рВК.Аб35к5.РасГ-тГТК.бЕ3 вместе с космидой рАЕ.Аб35.рГХЕсоКУ (АО 2004/001032) и адапторной плазмидой рАбАр135-8ГУСад, включающей ген 8ГУтас239 Сад, совместно трансфецировали в клетки РЕК. С6/55К (см. АО 00/70071 и АО 02/40665), и двойная гомологичная рекомбинация дала рекомбинантный вектор Аб35к5-8ГУСад. Этот вектор был подвергнут очистке от пятен, секвенированию, расширению и очистке центрифугированием в градиенте С§С1 в соответствии с общей методологией очистки, известной специалисту в данной области. Нуклеотидная последовательность химерного волокна показана на фиг. 2А (8ЕО ГО NО:1), тогда как аминокислотная последовательность показана на фиг. 2В (ЪЕЦ ГО NО:2).
Вектор А635Г5 обычно получали как описано для А635ПЫ6 в АО 00/70071, и химер Аб5йЬХХ, как описано в АО 00/03029; где продукт ПЦР, кодирующий частичный хвост волокна А65, связанный со стержнем волокна А65 и выступом волокна А65 помещали на остающуюся часть хвоста волокна А635. Процедуру клонирования также выполняли, используя подвергнутый делеции Е3 каркасный вектор, и используя ВЦАГ и Ν1κ1 в качестве сайтов рестрикции/клонирования. Детали вектора приведены в АО 03/104467 и АО 2004/001032.
В деталях, выполняли следующие процедуры для конструкции рВт/Аб35.расГ-гГТКГ 1Ь5: ПЦР выполняли на плазмиде рВт/Аб35.РасГ-гПК№1Г (= рВт/Аб35.РКп, см. АО 2004/001032) с праймером ΌΕ351: 5'-САС ТСА ССА ССТ ССА АТТ СС-3' (8ЕО ГО ^: 6) и ΌΕ35-2: 5'-СОО САТ ССС СТА ССС СТА САС АСС СТТ САА СС-3' (8ЕЦ ГО NО: 7)), содержащей сайт ВатНГ и ВЦАГ. Эта ПЦР привела к получению фрагмента ДНК приблизительно 650 п.н., начиная в хвостовой области волокна 35, которой вводили и сайт ВЦАГ, и сайт ВатНГ. Затем ПЦР выполняли на плазмиде рВт/Аб35.РКп праймером ΌΕ35-3: 5'-ССС САТ ССС СТА ССТ САА АТА ААС ТТТ ААС ТСТ ТТТ ТАТ ТТА ААА ТСА С-3' (8ЕО ГО
8), содержащей сайт ВатНГ и ΝΜ и ΌΕ35-4: 5'-ССА СТТ ССА ТТС СТТ ССТ ТСС-3' (8ЕО ГО ^:9). Эта ПЦР привела к получению фрагмента ДНК приблизительно 1400 п.н., начиная после терминирующего кодона волокна 35 до области Е4. рВт/Аб35.РКп переваривали МГиГ и Ше1, удаляя фрагмент ДНК 2850 п.н. из каркаса А635 (таким образом, удаляя большую часть области 35 волокна). Фрагмент ПЦР из ΌΕ35-1+ΌΕ35-2 расщепляли МГиГ и ВатНГ, и фрагмент ПЦР из ΌΕ35-3+ΌΕ35-4 расщепляли ВатНГ и Ше1. Оба фрагмента ПЦР лигировали в отрезанную плазмиду рВт/Аб35РКп, получая конструкт рВт/Аб35РКпбЕГВ. Затем вновь введенные сайты ВЦАГ и ΝΜ использовали для введения последовательности волокна А65 в каркас А635 получением продукта ПЦР, используя праймеры 35Е5-5-Е: 5'-ССС САА ССТ АСС АСА ССС ААА ССС СТС СТС С-3' (8ЕО ГО ^:10) и 35Е5-К: 5'-ССС СТА ССТ АСС ТТА ТТС ТТС ССС ААТ СТА ТСА АА-3' (8ЕО ГО ^:11) на ДНК А65 в качестве матрицы. После этого область Е3 подвергали делеции, как выполнялось для конструкта рВ^/Аά35РКNάЕ3.
Специалист в данной области путем применения общих обычных представлений в отношении молекулярного клонирования и получения аденовирусов смогут генерировать эти клоны, вставить фрагменты, генерировать продукты ПЦР и провести делецию определенных фрагментов и в конечном счете получить вирусы в линиях упаковочных клеток. Более того, способы получения и очистки для получения аденовирусных партий, которые можно использовать ίη νί\Ό и ίη νίϋΌ, хорошо известны в данной области.
Все обсужденные здесь векторы были получены с использованием общих способов очистки С§С1 и было обнаружено, что они устойчивы в течение по меньшей мере 5 пассажей на линиях упаковочных клеток РЕК.С6/55К (данные не показаны). Скорости роста и выходы векторов Аб35к5 были сравнимы с материнскими векторами А635 (данные не показаны). Однако отношения вирусных частиц (Ар) к бляш
- 14 010433 кообразующим единицам (рГи) были приблизительно в 10 раз выше для векторов А635к5 (100-1000) в сравнении с векторами Л635 (10-100).
Исследовалось также, были ли еще векторы способны распознавать их соответствующие рецепторы посредством их естественных или замещенных волоконных выступов (связывание волокна Л65 с САК и связывание волокна А635 с СГО4 6). Эти специфические взаимодействия были еще установлены с химерными векторами, а также с векторами на основе первоначального А65 А635 (данные не показаны).
Следуя тем же стратегиям, были получены химерные дефектные по репликации векторы на основе А635. включающие выступ А626 или А649. Эти вирусы называются А635к26 и А635к49 и используют связывающую САК способность выступа волокна редких серотипов А626 и А649 в комбинации с гексоновым белком, присутствующим в капсиде каркасного вектора, который также является редким серотипом, проиллюстрированным здесь А635. Нуклеиновая кислота и аминокислотные последовательности, представляющие соответствующие химерные волокна А635К26 и А635К49, представлены на фиг. 2Е-2Н.
Вирусы А635к5, А635к26 и А635К49 сравнивали по их способности обеспечить трансгенную экспрессию ίη νίΐτο. Все векторы несли трансген 81УСад. 7,5х104 клеток А549 инфицировали исходными вакцинными вирусами (при неизвестной концентрации вируса) в течение 2 ч в объеме 2 мл. Затем клетки промывали и культивировали в течение 48 ч. Окрашивание Сад оценивали внутриклеточным окрашиванием, используя моноклональное антитело 2Е12 против р27 с последующим анализом проточной цитометрией. Ограничение этого эксперимента состоит в том, что определенное количество вирусных частиц не использовали, и, таким образом, нельзя сделать определенный вывод о том, растет ли А635К49 до более высокого титра, чем другие, или он имеет более высокую удельную активность. В любом случае представляется, что эти векторы имеют определенные преимущества перед другими векторами, или в репликации/росте, или в уровнях экспрессии. На фиг. 16 показано, что 3 репрезентативные партии А635К49 проявляли значимо более высокую внутриклеточную экспрессию, по сравнению с репрезентативными партиями А635К5 и А635К26. Рекомбинантный аденовирусный вектор А635К49 представляет собой предпочтительный вариант осуществления изобретения.
Для достаточной продукции аденовирусных векторов на упаковывающих клетках в данной области реализовано, что белок Е1В-55К, в целом доступный в результате устойчивой интеграции его гена в геном упаковывающих клеток, должен быть совместим с белком Е4огГ6, продуцируемым областью Е4 вирусного вектора. Ранее было обнаружено, что белок Е4огГ6 А635 был несовместим с белком Е1В-55К, в целом доступном в известных упаковывающих клетках, таких как клетки 293 и клетки РЕК.С6* (см. \УО 03/104467; \УО 2004/001032; \УО 2004/018627; \УО 95/34671). Для обхода использования новых клеточных линий с Е1В-55К из А635, интегрированными в геном, и, таким образом, для предоставления возможности использования установленных платформ продукции, как тех, которые предоставлены клетками РЕК.С6, были получены дополнительные конструкты, в которых область Е4огГ6 остова А635 была замещена областью Е4огГ6 из А65, в согласии с тем, что было детально описано в \УО 03/104467. Замещение области Е4огГ6 применяли во всех векторах на основе А635, но далее не использовали в описанных здесь исследованиях иммуногенности и исследованиях нацеливания.
Пример 4. Иммуногенность рекомбинантного А635Г5 и А635К5 в сравнении А65 и А635.
Иммуногенность векторов оценивали сравнением векторов, несущих химерное волокно, с А6581УСад и А635-81УСад.
Интактных мышей (Ы=5/группу) иммунизировали внутримышечно 1010 νρ А65-81УСад, А63581УСад, А635.В8и.81УСад и А635Г 1Ь5.В8И.81УСад. Термин В8И относится к использованию эндогенного промотора р1Х в аденовирусной геномной нуклеиновой кислоте, которая обеспечивает должную экспрессию гена р1Х во время получения рекомбинантных вирусов на основе А635. Детали, относящиеся к конструктам В8И, см. \УО 2004/001032. Контрольных мышей (И=3/группу) иммунизировали пустыми векторами А65 и А635. Через 28 д. брали образец крови и иммунные реакции определяли, используя анализ 81У дад ЕЬ18ро1, как описано ниже.
На фиг. 3 показаны результаты этих экспериментов и указано, что все векторы были способны вызвать должную реакцию Т-клеток в отношении белка 81У дад, по сравнению с пустыми векторами, указывая на то, что вставка обеспечивает иммуногенный белок после инъекции мышам.
Другую группу интактных мышей (И=8/группу) иммунизировали 109 νρ или 108 νρ векторов А65Сад, А635-Сад и А635к5-Сад (все кодирующие белок 81У дад). Вызванные вакциной реакции СЭ8' Тлимфоцитов оценивали анализами связывания тетрамера ПЬ/АЬ11, используя следующий способ. Получали тетрамерные комплексы Η-2Ό4, уложенные вокруг пептида доминантного эпитопа 81Ушае239 Сад АЬ11 (ААУКШУМТОТЬ; 8Е0 ГО ЫО:3); Вагоисй е1 а1. 2004) и использовали для окрашивания Р18специфических СГО8' Т-лимфоцитов от мышей, используя способы, известные в данной области. Мышиную кровь собирали в среду КРМ1 1640, содержащую 40 Ед/мл гепарина. После лизиса эритроцитов, 0,1 мкг меченого РЕ тетрамера Э4/Р18 в сочетании с меченым АРС анти-СЭ8альфа гпАЬ (ЬУ-2, Са11ад, Вигйпдате, СА, И8А) использовали для окрашивания Р18-специфичных СГО8' Т-лимфоцитов. Клетки промывали в РВ8 (солевом растворе с фосфатным буфером), содержащем 2% ЕВ8 (фетальной телячьей сыворотки) и фиксировали в 0,5 мл РВ8, содержащих 1,5% параформальдегид. Образцы анализировали двухцветной проточной цитометрией на ЕАС8 СайЬит (Вес1оп Эюкшкоп). СГО8' Т-лимфоциты с откры
- 15 010433 тыми ионными каналами исследовали на окрашивание тетрамером Иб/Р18. СБ8' Т-лимфоциты от интактных мышей использовали в качестве отрицательных контролей и проявляли окрашивание тетрамером <0,1%.
Как показано на фиг. 4, все 3 вакцины были сравнимо иммуногенными в высокой дозе 109 νρ (Α). Важно, что в более низкой дозе 108 νρ (В), иммунные реакции, вызванные рекомбинантным Αб35к5-Сад были значимо более сильными, чем реакции, вызванные рекомбинантным Α635-Οα§ (ρ<0,01 при сравнении средних реакций на тетрамер среди групп мышей на 14 д., используя анализы дисперсии с поправками Бонферрони для учета множественных сравнений), и почти сравнимыми по величине с реакциями, вызванными Α65-Οα§ (р=незначимо). Это согласуется с полученными ранее наблюдениями (Вагоисй с1 а1. 2004; Ьетскей с1 а1. 2005). Эти данные демонстрируют, что генная инженерия вектора Α635 таким образом, что он несет домен выступа аденовируса подгруппы С (например, Α65), обеспечивает существенное улучшение его иммуногенности в отношении антигена, вставленного в вектор.
Эти эксперименты выполняли в отсутствие иммунитета против Α65, и здесь показано, что Α65 и Αб35к5 вызывали сравнимые иммунные реакции, в то время как они были значительно выше, чем у вектора Α635. Важно отметить, что вектор Αб35к5 несет гексон Α635, который добавляет более высокую эффективность в вызове иммунных реакций у индивидуумов, которые имеют нейтрализующую активность против гексонного белка Α65. Таким образом, вектор Αб35к5 значительно более эффективен в присутствии иммунитета против Α65, чем векторы и на основе Α65, и Α635; Α65 менее иммуногенный в этих условиях ввиду его нативного гексонного белка, а Α635 менее иммуногенный в целом ввиду домена выступа его нативного волокна.
Нельзя исключить, что нейтрализующие антитела против волоконного белка могут вырабатываться после инфекции. Однако считается, что в естественных условиях такие нейтрализующие активности минимальны, в то время как основная часть иммунного ответа хозяина будет направлена против гексонного белка. Важно отметить, что эксперименты, в которых рекомбинантные векторы сравниваются с предварительной иммунизацией материнскими векторами, следует выполнять в условиях, которые имитируют естественную ситуацию (у людей), где вирусы дикого типа инфицируют естественного хозяина однократно или дважды, вызывая естественно возникающие уровни нейтрализующих антител. У мышей в лабораторных условиях можно вызвать крайние иммунные реакции многократными инъекциями и введениями высоких титров. Эксперименты, имитирующие естественную ситуацию, указывают на то, действительно ли нейтрализующие антитела, которые могут быть направлены на волоконный белок, важны для нейтрализации введенного аденовирусного вектора. Они также выявляют важность присутствия стержневой области волокна, причем эта часть обычно также доступна для нейтрализующих активностей.
Авторы постулируют, что векторы, включающие, по меньшей мере, выступ из аденовирусов, которые распознают и инфицируют клетки хозяина через СЛК (например, Α62, Α65 и т.д.) и, кроме того, включают основную иммуногенную детерминанту капсида (т.е. гексонного белка) из наименее нейтрализованного серотипа (например, Α6Ι1, Α624, Α626, Α634, Α635, Α648, Α649 и Α650), являются превосходными векторами вакцинации, потому что они комбинируют доселе неизвестные преимущества низкого предсуществующего иммунитета вектора у человеческой популяции, высокой иммунной реакции антигенной вставки, воспроизводимой продукции, эффективной трансдукции и достаточной устойчивости.
Пример 5. Иммуногенность Α65, Αб35к5 и Α635 у мышей с предсуществуюцим иммунитетом.
Затем оценивали воздействие иммунитета против Α65 на иммуногенность этих векторов. Группы мышей С57/ВЬ6 ^=4/группу) предварительно иммунизировали однократно 10 νρ Αб5-пустым за 4 н. до вакцинации для генерирования низких/умеренных уровней иммунитета против Α65. Титры Α65специфического нейтрализующего антитела (ΝΑ^ у этих мышей были 64-128 (Вагоисй е1 а1. 2004; Ьетскей е1 а1. 2005; δρηη^Γδ е1 а1. 2003). Как показано на фиг. 4С, реакции тетрамерных +СИ8+ Тлимфоцитов, вызванные 108 νρ Αб5-^ад, были по существу устранены у этих мышей. Напротив, на реакции 108 νρ Αб35-^ад и Αб35к5-^ад по существу не воздействовал этот уровень иммунитета против Α65. Важно, что Αб35к5-6ад оказался более иммуногенным, чем и Αб5-6ад (р<0,001), и Αб35-6ад (ρ<0,05) у этих мышей на 14 д. после иммунизации.
Способность Αб35к5-^ад избегать низких/высоких уровней иммунитета против Α65 согласуется с ранее полученными данными о том, что Αб5-специфические NΑЬ направлены в первую очередь против гексонного белка Α65 (см. выше; 8ит1ба е1 а1. 2005). Однако в этом предыдущем исследовании были также выявлены низкие уровни ΝΑΓ направленных против волоконного белка Α65. Поэтому этот эксперимент повторили у мышей с высокими уровнями иммунитета против Α65. Мышей предварительно иммунизировали 1010 νρ Αб5-пустым за 8 и 4 нед. перед вакцинацией. Титры Αб5-специфических NΑЬ у этих мышей были 8192-16384 (Вагоисй е1 а1. 2004; Ьетскей е1 а1. 2005; δρηη^Γδ е1 а1. 2003), сравнимыми с самыми высокими титрами, обнаруживаемыми у индивидуумов в Африке, южнее Сахары (КочЪепче е1 а1. 2004; 8ит1ба е1 а1. 2005). Как показано на фиг. 4Ό, реакции тетрамерных +СИ8+ Τ-лимфоцитов, вызванные Αб35к5-^ад, были частично снижены у этих мышей и были сравнимы с реакциями, вызванными Αб35-^ад (р=незначимо). Таким образом, высокие уровни иммунитета против Α65 частично подавляли
- 16 010433 иммуногенность векторов Аб35к5.
Для оценки дальнейших деталей специфического для вектора иммунитета, вызванного химерными векторами Аб35к5-Сад, были выполнены гетерологичные исследования первичной-повторной иммунизации, а также анализы нейтрализации вирусов. Группы интактных мышей С57/ВБ6 (Ы=4/группу) подвергали первичной иммунизации в 0 нед. 109 νρ Аб35к5-Сад и затем повторно иммунизировали через 4 нед. 109 νρ Аб5-Сад или Аб35-Сад. Как показано на фиг. 5А, реакции тетрамерных ' СЭ8' Т-лимфоцитов, вызванные Аб35к5-Сад, эффективно стимулировались Аб5-Сад, но не Аб35-Сад. Эти данные свидетельствуют о том, что Аб35 и Аб35к5 вызывали существенный перекрестно-реактивный антивекторный иммунитет, в то время как Аб35 и Аб35к5 были в значительной мере иммунологически различны. Согласованно с этими наблюдениями мыши, однократно иммунизированные Аб35к5-Сад, генерировали Аб35специфические ЫАЬ, сравнимые с антителами, индуцируемыми Аб35-Сад, но существенно более низкие уровни Аб5-специфических ЫАЬ (фиг. 5В). Таким образом, векторы Аб35к5 проявляли серологические профили, более похожие на векторы Аб35, чем векторы Аб5.
Для оценки возможности обобщения этих результатов, иммуногенность векторов Аб35к5, экспрессирующих другой антиген (Εην: Н1У-1 89.6Р Εην §ρ120, детали см. здесь и Уодск с! а1. 2003) оценивали на другой линии мышей. Группы интактных мышей Ва1Ь/с (Ы=4/группу) иммунизировали однократно внутримышечно 109 νρ А65-Епу, Аб35к5-Епу или А635-Епу. Клеточные и гуморальные иммунные реакции, вызванные векторами Аб35к5-Е^, были промежуточными между реакциями, вызванными векторами А65-Епу, и векторами А635-Епу, по данным измерения анализами ШИ-у ЕБ18РОТ (фиг. 6А) и Εηνспецифическими ЕЫ8А (фиг. 6В).
ЕБ18А выполняли следующим образом. Сывороточные титры антител, специфичных для Н1У-1 Ξην или 81У Сад от иммунизированных мышей, измеряли прямым ЕЬ18А, как описано в публикациях (Вагоисй с! а1. 2003; 8иш1ба с! а1. 2005). 96-луночные планшеты, покрытые в течение ночи 100 мкл/лунку 1 мкг/мл рекомбинантного Н1У-1 ММ Ξην дρ120 или полипептидом 81Утас239 Сад ρ27 (Iттиηο^^адηο5ЙС8) в РВ8, блокировали в течение 2 ч РВ8, содержащей 2% В8А и 0,05% Т\уссп-20. Затем сыворотки добавляли в серийных разведениях и инкубировали в течение 1 ч. Планшеты промывали 3 раза РВ8, содержащим 0,05% Т^ссп-20, и инкубировали в течение 1 ч при разведении 1:2000 конъюгированным пероксидазой, подвергнутым аффинной очистке кроличьим антимышиным вторичным антителом Саск^ом ЬаЬога!опс8, И8А). Планшеты промывали 3 раза, проявляли тетраметилбензидином, реакцию прекращали 1% НС1 и анализировали при 450 нм устройством для считывания планшет ЕЫ8А ОугиЦссй МК5000.
Пример 6. Иммуногенность векторов Аб5, Аб35к5 и Аб35 у макак резус.
Для подтверждения исследований иммуногенности у мышей выполнили поисковое исследование для оценки иммуногенности этих векторов у макак резус. 9 Мати-А*01-отрицательных макак резус (Н=3/группу) иммунизировали внутримышечно 1011 векторов νρ Аб5, Аб35 или Аб35к5, экспрессирующих 81У Сад и Н1У-1 Ену. Первичную иммунизацию обезьян проводили в 0 нед. и гомологичную повторную иммунизацию через 12 нед. На фиг. 7 изображены специфические в отношение антигена и вектора иммунные реакции у этих животных. Сад- и Е^-специфические клеточные иммунные реакции количественно определяли анализами объединенного пептида ШИ-у ЕЬ18РОТ, а титры векторспецифических КАЬ определяли анализами нейтрализации на основе люциферазы в множественные точки времени после иммунизации. Анализ нейтрализации выполняли, как описано выше.
Как ожидалось, векторы Аб5 вызывали высокую частоту реакций ЕЫ8РОТ после первичной иммунизации (средние реакции Сад+Епу 538 8ЕС/106 РВМС через 12 нед.), но эти реакции существенно не увеличивались после гомологичной повторной иммунизации (в среднем 608 8ЕС/106 РВМС через 16 нед.; фиг. 7А), предположительно отражая быстрое генерирование высоких титров Аб5-специфических КАЬ у этих животных (фиг. 7В). Напротив, векторы Аб35 вызывали антиген-специфические реакции ЕЫ8РОТ, которые приблизительно в 2 раза ниже, чем реакции, вызываемые векторами Аб5 после первоначальной иммунизации (в среднем 248 8ЕС/106 РВМС через 12 нед.). Интересно, что эти реакции существенно увеличивались после гомологичной повторной иммунизации (в среднем 876 8ЕС/106 РВМС через 16 нед.; фиг. 7С), что согласуется с более низкими титрами вектор-специфических КАЬ, первоначально генерированных у этих животных (фиг. 7Ό). Эти данные свидетельствуют о том, что векторы Аб35 вызывали и более низкие антиген-специфические иммунные реакции, а также более низкие векторспецифические иммунные реакции, по сравнению с векторами Аб5 у макак резус.
Векторы Аб35к5 вызывали антиген-специфические реакции ЕЫ8РОТ, сравнимые с реакциями, вызываемыми векторами Аб5, после первичной иммунизации (в среднем 578 8ЕС/106 РВМС через 12 нед.; фиг. 7Е). Важно, что эти реакции были существенно усилены после гомологичной повторной иммунизации (в среднем 1736 8ЕС/106 РВМС через 16 нед.), предположительно отражая относительно низкий уровень вектор-специфических КАЬ, первоначально генерированных у этих обезьян (фиг. 7Р). Действительно, после повторной иммунизации векторы Аб35к5 вызывали в 2-3 раза более высокие Сад- и Епуспецифические реакции ЕЬ18РОТ, чем векторы и Аб5, и Аб35. Более того, векторы Аб35к5 вызывали сильные реакции фракционированных СЭ4' и СЭ8' Т-лимфоцитов через 16 нед. после иммунизации, по данным определения анализами ЕБ18РОТ с использованием РВМС с истощенными запасами СЭ8 и СЭ4
- 17 010433 (соответственно фиг. 8А, В, С: АО Ай35, Ай35к5).
Пример 7. Генерирование рекомбинантных векторов АО содержащих химерные гексонные белки.
ΗνΚ Ай2 в соответствии с С’га\\Гогй-М|к8/а апй 8сйпшт (1996), Ай5 в соответствии с Ких апй Вигпе11 (2000), Ай5 в соответствии с Ких с1 а1. (2003) и Ай5 в соответствии с настоящим изобретением изображены в табл. Ι. В табл. ΙΙ представлены 7 последовательностей ΗνΚ человеческих аденовирусов Ай5, Ай11, Ай2 6, Ай35 и Ай48 и аденовируса шимпанзе 68 (Рап9) в соответствии с определением ΗνΚ по настоящему изобретению. Изображены также определенные положения внутри соответствующих последовательностей гексона.
Были сконструированы векторы на основе Ай5, содержащие одну или более ΗνΚ, замененные из Ай35 (подгруппа В) или Ай48 (подгруппа Ό).
В более «минималистическом» варианте осуществления настоящего изобретения ΗνΚ указанных выше серотипов аденовируса определены в неком укороченном виде. Эти ΗνΚ отмечены звездочкой в табл. ίν в виде ΗνΚ (1-7)*. Используя минималистическое определение в рекомбинантных векторах, произведена делеция ΗνΚ1* из остова, ΗνΚ2* замещена коротким спейсером из двух аминокислот (ОС), тогда как ΗνΚ3*, ΗνΚ4*, ΗνΚ5*, ΗνΚ6* и ΗνΚ7* замещены их соответствующими более короткими (*) партнерами из других серотипов. Существеннее всего то, что ΗνΚ7 заново определен гораздо уже (сравнить табл. ΙΙ и табл. Ιν).
Частичные гексонные гены, содержащие желательные последовательности, были синтезированы СепеАг! (Сегтапу) и клонированы в виде фрагментов Аρа1-Ηρа1 в челночную плазмиду, содержащую полный ген гексона Ай5. Затем более крупный фрагмент Акс1-Акс1 вырезали из этой челночной плазмиды и использовали для замещения соответствующего фрагмента Акс1-Акс1 в космиде Ай5 р\УЕ .Ай5 .АГШ-г1ТК. йЕ3 (векторе, несущем делецию области Е3 и основанную на космиде р\УЕ .Ай5 .АГШ-г1ТК, см. \У0 02/40665). Мутантные космиды Ай5 вместе с адапторной плазмидой рАйАр1-Сад (кодирующей белок дад обезьяньего вируса иммунодефицита (8ΐν)) были затем совместно трансфецирозаны в клетки РЕК.С6/55К (включающие ген 55К Е1В из Ай35 в клетках РЕК.С6®, см. \У0 02/40665), и гомологичная рекомбинация давала рекомбинантный Ай5ΗVΚ35(1)-Сад, рекомбинантный Ай5ΗVΚ485(1)-Сад и рекомбинантный Ай5ΗVΚ48(1-7)-Сад вирусы, где 1 указывает на замещение только ΗνΚ1, и где 1-7 указывает на замещение всех семи отдельных ΗνΚ. Эти векторы были очищены от пятен, секвенированы, расширены и очищены центрифугированием в градиенте СкС1, в соответствии с общими процедурами, известными в данной области. Последовательность гексона в Ай5ΗVΚ48 (1-7)-Сад представлена на фиг. 11.
Кроме трех вирусов, указанных выше, получены также следующие рекомбинантные векторы: Ай5ΗVΚ35 (1-6), Ай5ИУК35 (1-7) (фиг. 12), Ай5ИУК11 (1-6), Ай5ИУК11 (1-7) (фиг. 13), Ай5ИУК26 (16), Ай5ΗVΚ26 (1-7) (фиг. 14), Ай5ИУКРап9 (1-6) и Ай5ИУКРап9 (1-7) (фиг. 15). 1-6 Указывает на замещение ΗνΚ1-ΗνΚ6, оставляя ΗνΚ7 материнского вектора. Ясно, что на основании нескольких имеющихся материнских векторов (таких как Ай2 и Ай5) и нескольких редких серотипов возможно создание большего числа комбинаций, используя положения настоящего изобретения. Другие редкие серотипы человеческих аденовирусов, которые можно использовать для предоставления ΗνΚ с целью получения векторов «скрытого» типа, представляют собой Ай24, Ай34, Ай49 и Ай50.
Пример 8. Иммуногенность вирусов Ай5, Ай5ΗVΚ48 (1) И Ай5ΗVΚ48 (1-7) у интактных мышей и у мышей с анти-Ай5 иммунитетом.
Как указано выше, жизнеспособные рекомбинантные вирусы Ай5-Сад, Ай5ΗVΚ48 (1)-Сад и Ай5ΗVΚ48 (1-7)-Сад были получены на упаковывающих клетках. Выход Ай5ΗVΚ48 (1)-Сад был сравним с рекомбинантным вирусом Ай5-Сад, в то время как скорость роста, выход и отношение νρ/рГи вируса Ай5ΗVΚ48 (1-7)-Сад были приблизительно в 2 раза ниже, чем вируса Ай5-Сад. Сначала экспрессию Сад проверяли на клетках А549, инфицированных 109 или 1010 νρ каждого вектора. Данные ВЭЖХ указали на то, что экспрессия внутриклеточного Сад была достаточной и сравнимой между различными векторами (данные не показаны), хотя экспрессия из Ай5ΗVΚ48 (1-7)-Сад была несколько ниже, чем из Ай5-Сад. Это могло быть связано с несколько более медленной скоростью роста.
Сначала иммуногенность вирусов исследовали иммунизацией интактных мышей С57/ВЬ6 (4 мыши на группу) 109, 108 и 107 νρ каждого вектора. Вызванные вакциной реакции СЭ8' Т-лимфоцитов оценивали анализами связывания тетрамера ПЙ/АЬ11, как описано выше, в течение 2 нед. Результаты показаны на фиг. 9. Ясно, что все 3 вектора привели к сравнимым иммунным реакциям у этих интактных мышей, несмотря на небольшие различия скорости роста и трансгенной экспрессии.
В последующем, мышей С57/ВЬ6 предварительно иммунизировали 2 инъекциями 1010 νρ Ай5пустого, соответственно за 8 и 4 нед. до иммунизации представляющими интерес вирусами (титры Ай5 ЛАй 8, 192-16, 384) для получения предсуществующего иммунитета против вектора основания Ай5. Затем (через 8 нед. от первой предварительной иммунизации) мышей иммунизировали, как указано выше, 109, 108 и 107 νρ рекомбинантных Ай5-Сад, Ай5ΗVΚ48 (1)-Сад и Ай5ΗVΚ48 (1-7)-Сад. И снова, вызванные вакциной реакции ΟΩ8' Т-лимфоцитов оценивали анализами связывания тетрамера ПЙ/АЬ11, как описано выше, в течение 2 нед. Результаты показаны на фиг. 10. Результаты ЕЫ8Р0Т были зеркальным отражением анализов тетрамера и дали аналогичные результаты (данные не показаны).
- 18 010433
Как ожидалось, вектор Аб5-Сад сталкивался с предсуществующим иммунитетом у этих предварительно иммунизированных мышей, что привело к трудно выявляемой иммунной реакции. Вирус Аб5НУК48 (1)-Сад также не смог преодолеть высокие уровни анти-Аб5 иммунитета, свидетельствуя о том, что предсуществующий иммунитет, по меньшей мере, не ограничивается одной НУК1. Важно, что на иммуногенность вируса Аб5НУК48 (1-7)-Сад не влиял вызванный Аб5 предсуществующий иммунитет, указывая на то, что мутация 7 НУК гексона (как идентифицировано здесь) Аб5 и замещение их соответствующими НУК редкого серотипа (проиллюстрированные Аб48) приводит к получению вектора, которому не мешает предсуществующий иммунитет против белка дикого типа. Аналогичные результаты были получены в экспериментах, где мышей дважды подвергали первичной иммунизации пустым вектором Аб5, представляя ситуацию с высокими уровнями предсуществующего иммунитета (фиг. 21). Этот эксперимент выполняли с 4 мышами С57/ВБ6 на группу. Группы мышей предварительно иммунизировали двумя инъекциями 1010 νρ Аб5-пустого для индукции анти-Аб5 иммунитета. У мышей, которых предварительно иммунизировали Аб5-пустым, титры Аб5 НАЬ были 8192-16384. Затем у мышей в 0 нед. проводили первичную иммунизацию 109 νρ Аб35-Сад и затем повторно иммунизировали на 28 д. или 109 νρ Аб5-Сад, 109 νρ Аб35-Сад, или 109 νρ Аб5НУК48 (1-7)-Сад. Во всех инъекциях использовали объем 50 мкл. Стрелки на оси X указывают на иммунизации. Образцы крови получали через 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 д. для анализов окрашивания тетрамера ЭЬ/АБ11 для количественного определения вызванных вакциной реакции СЭ8' Т-лимфоцитов. На 56 д. также выполняли анализы ΓΕΝ-гамма ЕЫ8РОТ, и они показали сравнимые результаты (данные не показаны). Аб5-Сад не смог усилить иммунные реакции предположительно вследствие анти-Аб35 иммунитета, вызванного первичной иммунизацией. Аб5НУК48 (1-7) эффективно стимулировали реакции, подтверждая то, что этот вектор функционирует как некий тип нового «серотипа». Сделан вывод, что, таким образом, Аб5НУК48 (1-7) может служить в качестве эффективного стимулирующего вектора в ситуациях, когда Аб5 оказывается несостоятельным, и в ситуациях, когда гетерологичный вектор (такой как Аб35) используется в качестве вектора первичной иммунизации. В комбинации с представленными ранее проведенными исследованиями, заявители приходят к общему выводу, что векторы, представленные Аб5НУК48 (1-7), представляют собой и эффективные векторы первичной иммунизации, и эффективные векторы повторной иммунизации в ситуациях предсуществующего анти-Аб5 иммунитета, где Аб5 оказывается несостоятельным.
Эти результаты в настоящее время обеспечивают возможность использования векторов на основе Аб5 в ситуациях первичной и повторной иммунизации, хотя рецепторное распознавание (главным образом, осуществляемое волоконными и пентонными белками) остается неизменным.
Таблица Г
Определения гипервариабельной области внутри гексонного белка человеческих аденовирусов Аб2 (в соответствии с Сга\\Гогб-М|кзха апб Зсйпигг, 1996), Аб5 (в соответствии с Ких апб Витей. 2000; Ких е1 а1. 2003) и Аб5 (в соответствии с настоящим изобретением). Определения НУК Аб5 Ких апб Витей. (2000) точно соответствуют определениям Сга^Гогб-М|к8/а, основанным на последовательности Аб2. Следует отметить, что все эти определения НУК изменены положением 1 в этой таблице вследствие отсутствия первоначального остатка метионина в определениях Ких апб Витей. (2000) (НУК1: 137-181 и т.д.). _________________________________________________________________________________________________________________
| СгашТогс! -М1к8га (1996) | Ких (2000) | Ких (2003) | Ких (2003) | Настоящее изобретение | |
| Α<12 | Ас15 | Ма51ег | Ас15 | Аб5 | |
| НУК1 | 137-188 | 138-182 | 146-181 | 139-167 | 136-165 |
| НУК2 | 194-204 | 188-194 | 199-221 | 184-198 | 188-194 |
| иио-а ν | οοο_οοα | 04 0-040 £ 1 ф | ОЙЛ-О^А | ПЛПЛ 1IV! | 04 О-ООА С- |
| НУК4 | 258-271 | 248-261 | 288-293 | 254-258 | 248-258 |
| НУК5 | 278-294 | 268-283 | 307-330 | 272-280 | 268-281 |
| НУКб | 316-327 | 305-316 | 358-366 | 308 | 305-310 |
| ΗνΚ7 | 433-465 | 422-450 | 482489 | 420422 | 418451 |
| НУК8 | 503-513 | 435440 | |||
| ΗΥΚ9 | 518-522 | 445446 |
- 19 010433
Таблица II
| А65 | Положение | Последовательность | |
| НУК1 | 136-165 | ΟΕΑΑΤΑίΕΙΝίΕΕΕΟΟΟΝΕΟΕνΟΕΟΑΕΟΟΚ | 5ΕΟ Ю N0:17 |
| НУК2 | 188-194 | νεοοτρκ | 8ΕΟ Ю N0:18 |
| НУЯЗ | 212-220 | ΥΕΤΕΙΝΗΑΑ | 8Ε<2 Ю N0:19 |
| ΗνΚ4 | 248-258 | ΘΙΙ νΚ00Ν6Κ1. | 8ΕΟ Ю N0:20 |
| НУК5 | 268-281 | δΤΤΕΑΤΑΟΝΟΟΝίΤ | 8ΕΟ Ю N0:21 |
| НУК6 | 305-310 | ΤΙΚΕ6Ν | 8ΕΟ Ю N0:22 |
| НУК7 | 418-451 | ΘΘνίΝΤΕΤίΤΚνΚΡΚΤΘΟΕΝΘννΕΚΟΑΤΕΕδΟΚΝΕ | 8ΕΟ Ю N0:23 |
| Α648 | |||
| ΗνΉΙ | 136-150 | ΕΕΚΚΝΘ6Θ80ΑΝΟΜΟ | 3ΕΟ ΐυ N0:24 |
| НУК2 | 173-185 | ΙΟΑΤΚΕΕΟΝΟΚΕΙ | 8ΕΟ Ю N0:25 |
| ΗνΚ3 | 203-210 | ΟϋδϋΝΥΥΟ | 8ΕΟ Ю N0:26 |
| ΗνΗ4 | 238-251 | ΑΚΡΚΤΡΕΚΕ6ΕΕΡΚ | 8ΕΟ Ю N0:27 |
| ΗνΚ5 | 261-277 | ϋΙΡδΤΟΤΟΟΝΟΤΝνΝΡΚ | 8ΕΟ Ю N0:28 |
| НУВб | 301-306 | ΟΚΕϋΑδ | 8ΕΟΙϋΝΟ:29 |
| НУР7 | 414-446 | □ΟΑΟΤΝΑνΥΟΟνκνΚΤΤΝΝΤΕννΕΚΟΤΑνδΕΗΝΟ | 8ΕΟ Ю N0:30 |
| Α635 | |||
| Ηνκΐ | 136-160 | ΙΑΚΟνΡΤΑΑΑΑΟΝΟΕΕΕΗΕΤΕΕΚΤΑ | 8ΕΟ Ю N0:31 |
| НУР2 | 164-175 | (ΈΙδΑΕΝΕδΚΡΙ | 8ΕΟ Ю N0:32 |
| ΗνΚ3 | 193-203 | ТОШОКТЕЕУО | 8ΕΟ Ю N0:33 |
| НУР4 | 231-243 | ΑΚΡΚΝδΕΡδδΕΚΙ | 8ΕΟ Ю N0:34 |
| НУП5 | 253-262 | ϋΝδδΟΡΤΝΕδ | 6ΕΟ Ю N0:35 |
| Ηνκβ | 286-291 | ΟΤΕϋΤδ | 3ΕΟΙΟΝΟ:36 |
| ΗνΚ7 | 399-431 | ΟΟΙΟ\/ΡΤΤ8ΥΚ8ΐνΡΝ(3ΕΟΝΝΝννΚΕΡΕ\/ΝΟΤ8Ε | 8ΕΟ Ю N0:37 |
| Αά11 | |||
| НУК1 | 136-157 | ΙΑΕΟνΚΝΤΤΟΕΕΗνΤΕΕΕΤΝΤΤ | 8ΕΟ Ю N0:38 |
| ΗνΗ2 | 181-191 | ίΕνδΟΕΕδΚΡΙ | 8ΕΟ Ю N0:39 |
| НУКЗ | 209-219 | ΤΟΙ.ΟΘΚΤΕΚΥ© | 8ΕΟ Ю N0:40 |
| ΗνΡ4 | 247-259 | ΑΚΟΚΤΤΕΟΡΝΟΚν | 8ΕΟ Ю N0:41 |
| ΗνΚ5 | 269-278 | ΟΛΛδΟΚΤΝΙ δ | 5ΕΟ Ю N0:42 |
| Ηνκβ | 302-307 | ΟΤΕϋΤδ | 8ΕΟ Ю N0:43 |
| НУК7 | ^415-447 | ΟΟΙΟνΡΤΤδΥΚδίνΡΝΟΟΝΑΡΝνΚΕΡΕνΝΟΤδΕ | 8ΕΟ Ю N0:44 |
| Αά26 | |||
| НУК1 | 146-163 | ΕΤΚΕΚΟΘΤΤΘΘνΟΟΕΚΟν | 8ΕΟ Ю N0:45 |
| НУК2 | 186-197 | ΤΟΕΤΑΕΝΘΚΚΟΙ | 8ΕΟ Ю N0:46 |
| НУКЗ | 215-222 | ΟΕΝΕΑΡΥΘ | 5ΕΟ Ю N0:47 |
| ΗνΚ4 | 250-262 | ΑΚΕΚΡνΝΕΘΕΟΡΚ | 8Ε0 Ю N0:48 |
| НУК5 | 272-288 | ΟνΡΘΘδΡΡΑΘΘδΟΕΕΥΚ | 8ΕΟ Ю N0:49 |
| Ηνκβ | 312-317 | ΟΤδϋΝδ | 8Ε0 Ю N0:50 |
| НУК7 | 425-461 | ΝΘΤ0ΤΝ5ΤΥ00νΚΙΤΝΘΝ06ΑΕΕ5ΕννΕΚ00Α18Κ0Ν0 | 8ΕΟ Ю N0:51 |
| рап9 | |||
| НУК1 | 136-147 | ΤΥΚΑΟΟΕΤΑΤΕΚ | 8Ε0 Ю N0:52 |
| НУК2 | 170-177 | ΤΌΤΟϋΟΡΙ | 8Ε0 Ю N0:53 |
| НУКЗ | 195-205 | ΗϋΙΤΟΤΟΕΚΥ© | 8Ε0 Ю N0:54 |
| НУК4 | 233-243 | ΑΝνΚΤΘΤ6ΤΤΚ | δΕΟ Ю N0:55 |
| ΗνΒ5 | 253-263 | 0ΝΚ8ΑΑΑΑΘΙΑ | 8Ε0 Ю N0:56 |
| НУН6 | 287-292 | ΒΤ0088 | 8Ε0 Ю N0:57 |
| ΗνΚ7 | 400-432 | □ΑνΘΚΤΟΤΥΟΘΙΚΑΝΘΤΟαΤΠΛΠΚΟΟδνΝΟΑΝΕ | 8Ε0 Ю N0:58 |
| Ηνκι | 136-160 | ίΟΚΘνΤδΤΘίνΟΟΘΝΤΟΟΘΕΕΑΚΚΑ | 8Ε0 Ю N0:59 |
| ΗνΠ2 | 184-194 | Ι,ΕνδΤΕΟΡΚΡΙ | 8ΕΟΙΟΝΟ:60 |
| НУКЗ | 212-222 | ΤΟΙ-ΟΘΚΤΕΕΥ© | δΕΟ Ю N0:61 |
| ΗΧ/Ρ4 | 250-263 | ΑΚνΚΡΚΕΟΟΟΤΝΝΙ | 8Ε0 Ю N0:62 |
| НУКб | 273-282 | □Ι ΚδΟΡδΕΙ Κ | 8Ε0 Ю N0:63 |
| НУНб | 306-311 | ονδϋΑδ | 8Ε0 Ю N0:64 |
| ΗνΚ7 | 419-450 | ϋΟνΟΡΡΤΟδΥΚΕΙΚΡΝΟΟΟδΤννΤΝνΟΡΤΟδδΕ | δΕΟ Ю N0:65 |
| Αά49 | |||
| κνκι | 136-147 | ϋΑΚΕΝΝΟΟΘΕΑΚ | 8ΕΟ Ю N0:66 |
| ΗνΡ2 | 170-183 | ΙΟΕΝΚΕΕΟΕΕ6ΡΕΙ | 8ΕΟ Ю N0:67 |
| НУЯЗ | 201-208 | ΟΝΤΕΝΕΥ© | 8Ε0 Ю N0:68 |
| НУК4 | 236-248 | ΑνΕΚΤ©ΕΝΟΚΡΤΕ | 8ΕΟ Ю N0:69 |
| Н\/К5 | 258-270 | □ίΡΟΝΟΤΟΟΝΝΝΟ | 8ΕΟ Ю N0:70 |
| 4νκβ | 294-299 | ΟΤδΟϋδ | 8ΕΟ Ю N0:71 |
| НХ/Я7 | 407-442 | ϋΟδΟδδΤΑΥΟΟνΕΡΟΤΓνΑΟΤΝΟΚννκνΝΑΚνΑΟΗΝΟ 8ΕΟ Ю N0:72 | |
| Α650 | |||
| НУК1 | 136-150 | 1.ΝΚ60ΕΕ06Ε0000Α | 8ΕΟ Ю N0:73 |
| ΗνΚ2 | 174-185 | ίΕνΡδΕΟΟΡΚΡΙ | 8ΕΟ Ю N0:74 |
| НУКЗ | 203-213 | ΤΟΤΟΟΤΟΕΚΥΟ | 8Ε0 Ю N0:75 |
| НУК4 | 241-251 | ΑΚνΚΚΕΕΕΘΚν | 8ΕΟ Ю N0:76 |
| НУК5 | 261-270 | оьк8Омт©бк | 8Ε0 Ю N0:77 |
| НУН6 | 294-299 | ΟΑδϋΑΘ | 3ΕΟ Ю N0:78 |
| НУК7 | 407-439 | □ΟνΟΡΚΙΟδΥΚΟΙΕΤΝΟΟΕΤΤΤννΚΟίΕΡΚΟΙδΕ | 8Ε0 Ю N0:79 |
- 20 010433
Таблица ΙΙΙ
Химерный репликационно дефективный вектор аденовируса в соответствии с настоящим изобретением, включающий идентификацию различных элементов внутри указанного вектора
- 21 010433
Таблица IV
| А55 | Положение | Последовательность | |
| НУК1* | 137-165 | ΕΑΑΤΑΙΕΙΝΙΕΕΕΟϋΟΝΕΟΕνΟΕΟΑΕΟΟΚ | 8ΕΟ Ю N0:88 |
| НУЯ2* | 188-193 | УЕООТР | 3ΕΟ Ю N0:89 |
| НУКЗ* | 213-215 | ЕТЕ | δΕΟ Ю N0:90 |
| НУН4* | 252-258 | КООНСКБ | δΕΟ Ю N0:91 |
| НУК5* | 269-281 | ΓΤΕΑΤΑΟΝΟΌΝίΤ | δΕΟ Ю N0:92 |
| НУК6* | 306-308 | ΙΚΕ | δΕΟ Ю N0:93 |
| НУК7* | 432-445 | ΚΤΟΟΕΝΟννΕΚΟΑΤΕ | δΕΟ Ю N0:94 |
| А548 | |||
| НУКГ | 137-150 | ΕΚΚΝΘΘΘ80ΑΝ0Μ0 | 3ΕΟ ίΟ N0:95 |
| НУК2* | 173-184 | ΙϋΑΤΚΕΕΟΝΘΚΕ | δΕΟ Ю N0:96 |
| НУКЗ* | 204-206 | 080 | 8Ε0 Ю N0:97 |
| НУК4* | 241-251 | ΚΤΡΕΚΕΘΕΕΡΚ | 8ΕΟ Ю N0:98 |
| НУК5* | 262-277 | ΙΡδΤΘΤΘΘΝΘΤΝνΝΡΚ | 8ΕΟ Ю N0:99 |
| НУК6* | 302-304 | ΚΕϋ | 8Ε0Ι0Ν0:1(Χ) |
| НУК7* | 428-440 | ΚΤΤΝΝΤΕννΕΚΟΤΑ | δΕΟ Ю N0:101 |
| АЙ35 | |||
| НУК1* | 137-160 | ΑΚΟνΡΤΑΑΑΑΟΝΟΕΕΕΗΕΤΕΕΚΤΑ | δΕΟ Ю N0:102 |
| НУК2* | 164-174 | Ι.ΕΙ5ΑΕΝΕ3ΚΡ | 8ЕОЮ N0:103 |
| НУКЗ* | 194-196 | σω | δΕΟ Ю N0:104 |
| НУК4* | 234-243 | ΚΝ6ΕΡ88ΕΚΙ | 8Е0Ю N0:105 |
| НУК5* | 254-262 | Μ55ΟΚΤΝΕ8 | δΕΟ Ю N0:106 |
| НУК6* | 287-289 | ΓΕϋ | δΕΟ Ю N0:107 |
| НУК7* | 414-425 | ΝΘΕϋΝΝΝννΚΕΡΕ | δΕΟΙΌ N0:108 |
| А611 | |||
| НУК1* | 137-157 | ΑΕΟνΚΝΤΤΟΕΕΗνΤΕΕΕΤΝΤΤ | δΕΟ Ю N0:109 |
| НУК2* | 181-190 | .ЕУ5ОЕЕ5КР | 6ΕΟ Ю N0:110 |
| НУКЗ* | 210-212 | ΟίΟ | ЗЕО Ю N0:111 |
| НУК4* | 250-259 | ΚΤΤΕΟΡΝΟΚν | δΕΟ Ю N0:112 |
| НУК5* | 270-278 | ΑΑδΟΚΤΝίδ | δΕΟ ΙΟ N0:113 |
| НУК6* | 303-305 | ΤΕϋ | δΕΟ Ю N0:114 |
| НУК7* | 430-441 | ΝΟΟΝΑΡΝΙΛ/ΚΕΡΕ | δΕΟ Ю N0:115 |
| А626 | |||
| НУН1* | 147-163 | ТКЕКОСТТССУаОЕКОУ | δΕΟ Ю N0:116 |
| НУК2* | 186-196 | ΤΟΕΤΑΕΝΘΚΚΟ | δΕΟ Ю N0:117 |
| НУКЗ* | 216-218 | ΕΝΕ | δΕΟ Ю N0:118 |
| НУК4* | 253-262 | ΚΡνΝΕΘΕΟΡΚ | 8ΕΟ!ΟΝΟ:119 |
| НУК5* | 273-288 | УРССЗРРАССЗСЕЕУК | δΕΟ Ю N0:120 |
| НУК6* | 313-315 | Τ8ϋ | 8ΕΟ Ю N0:121 |
| НУК7* | 439-455 | ΤΝΘΝϋΘΑΕΕ3ΕννΕΚΟΟΑ | 8ΕΟ Ю N0:122 |
| рапЭ | |||
| НУК1* | 137-147 | ΥΚΑΟΘΕΤΑΤΕΚ | δΕΟ Ю N0:123 |
| НУК2* | 170-176 | τοτοσορ | 8Ε0 Ю N0:124 |
| НУКЗ* | 196-198 | ϋΙΤ | 8Ε0 Ю N0:125 |
| НУК4* | 236-243 | ΚΤΟΤΟΤΤΚ | 8Ε0 Ю N0:126 |
| НУК5* | 254-263 | ΝΚδΑΑΑΑΘίΑ | δΕΟ Ю N0:127 |
| НУК6* | 288-290 | τοσ | 8Е0Ю N0:128 |
| НУК7* | 414-426 | ΝΘτοατπΛΠΊΚοσδ | 8Ε0 Ю N0:129 |
| НУК1* | 137-160 | ΟΚΘνΤδΤΟίνΟΟΘΝΤΟΟΘΕΕΑΚΚΑ | δΕΟ Ю N0:130 |
| НУК2* | 184-193 | ЬЕУЗТЕОРКР | δΕΟ Ю N0:131 |
| НУКЗ* | 213-215 | ϋίϋ | δΕΟ Ю N0:132 |
| НУК4* | 253-263 | ΚΡΚΕΟϋΟΤΝΝΙ | 8Ε0 Ю N0:133 |
| НУК5* | 274-282 | ЬКЗОКЗЕБК | 8ΕΟ Ю N0:134 |
| НУК6* | 307-309 | УЗО | 8ΕΟ Ю N0:135 |
| НУК7* | 434-444 | ΝΘΟΟδΤννΤΝνΟ | 8ΕΟ Ю N0:138 |
| А549 | |||
| НУЯ1* | 137-147 | ΑΚΕΝΝΘΟΟΕΑΚ | δΕΟ ΙΟ N0:137 |
| НУК2* | 170-182 | ΙΟΕΝΚΕΕΟΕΕΘΚΕ | δΕΟ ΙΟ N0:138 |
| НУКЗ* | 202-204 | ΝΤΕ | δΕΟ Ю N0:139 |
| НУК4* | 239-248 | ΚΤΟΕΝΟΚΡΤΕ | δΕΟ Ю N0:140 |
| НУН5* | 259-270 | ίΗΟΝΟΤΟΟΝΝΝΟ | δΕΟ Ю N0:141 |
| НУК6* | 295-297 | Τδϋ | δΕΟ Ю N0:142 |
| НУК7* | 421-436 | ОТТУАС-ТЪЮЮЛ/КМЫАК | 9ΕΟ Ю N0:143 |
| А850 | |||
| НУК1* | 137-150 | ΝΚ6ΟΕΕΟ6ΕΟΟΟΟΑ | 8ΕΟ ΙΟ N0:144 |
| НУК2* | 174-184 | БЕУРЗЕООРКР | δΕΟ Ю N0:145 |
| НУКЗ* | 204-206 | ϋΤΟ | δΕΟ Ю N0:146 |
| НУК4* | 244-251 | ККЕЕЕОКУ | δΕΟ Ю N0:147 |
| НУК5* | 262-270 | ίΚδΟΜΤΘίΚ | δΕΟ Ю N0:148 |
| НУК6* | 295-297 | Αδϋ | 8ΕΟ Ю N0:149 |
| НУК7* | 422-433 | ΝΘΟΕΤΤΤννΚΟΕΕ | 8ΕΟ Ю N0:150 |
| Ссылки |
ВагоисЬ Ώ.Η. с! а1. (2004) 1ттиподсшс1!у оГ гссотЬтап! адспоу1ги8 8сго1урс 35 уасстс ίη !Ьс ргсзспсс оГ ргс-сх1з!тд апИ-А05 1ттиш1у. I 1ттипо1 172:6290
Всгдс1зоп ГМ. с! а1. (1997) 1зо1а!юп о!' а соттоп гссср!ог 1ог сохзаскго В У1гизс8 апд адспоуц-изсз 2
- 22 010433 апй 5. 8с1епсе 275:1320
ВеМеу М.С. е( а1. (1999) 8(гис(ига1 апа1уз1з ой (йе тесйашзт ой айепоуйиз Ьтйшд (о йз йитап се11и1аг гесер(ог, СЛК. 8с1епсе 286:1579
Раппа 8.Р. е( а1. (2001) Керйсайоп-йеГесйуе уес(ог Ьазей оп а сЫтрапхее айепоуйиз. I У1го1 75:11603 Саддаг Α. е( а1. (2003) СЭ46 1з а се11и1аг гесер(ог йог дгоир В айепоуйизез. №11 Мей 9:1408
Са11 кС.И. е( а1. (1998) Сопзйисйоп апй с11агас(еп/а(юп ой йехоп-сйтепс айепоу1гизез: зресШсабоп ой айепоуйиз зего(уре. I Уйо1 72:10260-10264
СапезН 8. е( а1. (2003) Αйепον^^из 35 уес(огз тейй йЬег сЫтегаз ехЫЬй а1(егей (гор1зт ш угуо. ΑΜΜΛ 134. 2003 Меебпд ой (Не ΑιικιΈιπ 8оае(у ой Сепе Тйегару. Мо1еси1аг Тйегару 7:853
Са11 !С. е( а1. (1998) Сопз(гис(юп апй с11агас(еп/а(юп ой йехоп-сЫтепс айепоу1гизез: зресйгсабоп ой айепоуйиз зего(уре. I Уйо1 72:10260
Науепда М.1. е( а1. (2002) Ехр1ойтд (Не па(ига1 йгуегзйу ш айепоуйиз (гор1зт йог (йегару апй ргеуепйоп ой й1зеазе. I. Уйо1 76:4612
Коз(епзе 8. е( а1. (2004) Αйепον^^из (урез 5 апй 35 зегоргеуа1епсе ш ΑΙΌ8 пзк дгоирз зирройз (уре 35 аз а уассте уес(ог. ΑΙΌ8 18:1213
Ьетскей Α.Α.Ο е( а1. (2005) 1ттиподешсйу ой йе(его1одоиз рпте-Ьооз! гедМепз туоМпд гесотЫпап( айепоу1гиз зего(уре 11 апй 35 уассте уес(огз ш (йе ргезепсе ой ап(^-Αй5 1ттит(у. I Уйо1, ш ргезз
ЬеМп Ы.Ь. е( а1. (2002) Ргозрес(з йог уассте рго(есйоп адатз( Н1У-1 1пСесйоп апй ΑΙΌ8. Αппи Кеу 1ттипо1 20:73
Орйогз( О.к е( а.1 (2004) Αп айепоуйа1 (уре 5 уес(ог саггушд а (уре 35 ПЬег аз а уассте уеЫс1е: ОС (агдейпд, сгозз-пеийаМайоп, апй йптиподешсйу. Уассте 22:3035
Рш(о Α.Ρ. е( а1. (2003) Мисйоп ой СЭ8+ Т се11з (о ап ШУ-Ι апйдеп (йгоидй а роте Ьооз( гедМеп тейй йе(его1одоиз Е1-йе1е(ей айепоу1га1 уассте сатегз. I Iттипο1 171:6774
Кеа Ό. е( а1. (2001) Н1дй1у еййс1еп( йапзйисйоп ой йитап топосу(е-йепуей йепйгШс се11з тейй зиЬдгоир В йЬег-тойгйей айепоуйиз уес(огз епйапсез (гапздепе-епсойей апйдеп ргезеп(а(юп (о су(о(ох1с Т се11з. I Iттипο1 166:5236
КоеМпк Р.^. е( а1. (1998) Тйе сохзаск1еу1гиз-айепоу1гиз гесер(ог рго(ет сап йипсйоп аз а се11и1аг а((асйтеп( рго(еш йог айепоуйиз зего(урез йот зиЬдгоирз Α, С, Ό, Е, апй Р. I Уйо1 72:7909
КоеМпк Р.ЭД·. е( а1. (1999) Иепййсайоп ой а сопзегуей гесер(ог-Ьтйшд зйе оп (йе ПЬег рго(ешз ой СΑК- гесодт/тд айепоутйае. 8с1епсе 286:1568
8йауакйте(оу О.М. е( а1. (2003) Тйе т(егас(юп ЬеМееп (йе йЬег кпоЬ йотат апй (йе се11и1аг айасйтеп( гесер(ог йе(егттез (йе т(гасе11и1аг йаййсктд гои(е ой айепоу1гизез. I Уйо1 77:3712
8й1уег к XV. е( а1. (2002) Кер11са(юп-тсотре(еп( айепоуйа1 уассте уес(ог ейсйз еййесйуе ап(11ттипойейс1епсу-уйиз 1ттипйу. Ыа(иге 415:331
8й1уег Ι.ν. апй Етйи ЕА. (2004) Кесеп( айуапсез ш (йе йеуе1ортеп( ой ШУ-Ι уассшез изшд герйсайоп-шсотре(еп( айепоу1гиз уес(огз. Αппи Кеу Мей 55:355
8й1уег Ι.ν. (2004) Эеуе1ортеп( ой ап ШУ-Ι уассте Ьазей оп герйсайоп-йейесйуе айепоуйиз. Кеуз(опе 8утрозшт оп ШУ Уассте Эеуе1ортеп(: Ргодгезз апй Ргозрес(з, ’№Ыз(1ег, Впйзй Со1итЫа, Сапайа
8тйй ТА.С. е( а1. (2003) Αйепον^^из зего(уре 5 йЬег зйай 1пйиепсез ш угуо депе (гапзйег ш тйе. Нит Сепе Тйег 14:777
8ргапдегз . М.С. е( а1. (2003) ОиапНМпд айепоуМз-пеийаМтд апйЬоФез Ьу 1исйегазе (гапздепе йе(есйоп: аййгеззтд ргеех1з(тд ттипйу (о уассте апй депе (йегару уес(огз. I Сйп М1сгоЬю1 41:5046
8ит1йа 8.М. е( а1. (2004) ЫеийаМтд апйЬоФез апй СЭ8+ Т 1утрйосу(ез Ьо(й соп(пЬи(е (о 1ттипйу (о айепоуйиз зего(уре 5 уассте уес(огз . I Уйо1 78:2666
8ит1йа 8.М. е( а1. (2005) ЫеийаМтд апйЬоФез (о айепоуйиз зего(уре 5 уассте уес(огз аге ййес(ей рптагйу адатз( (йе айепоу1гиз йехоп рго(еш. I Iттипο1 174:7179-7185
Уоде1з К. е( а1. (2003) Кер11са(1оп-йейс1еп( йитап айепоуйиз (уре 35 уес(огз йог депе (гапзйег апй уассшайоп: еГГ^с^еп( йитап се11 ш(егасйоп апй Ьуразз ой рге-ех1зйпд айепоу1гиз 1ттипйу. I Уйо1 77:8263
А1скйат Т.1. е( а1. (1993) Медппз а1рйа ν Ье(а 3 апй а1рйа ν Ье(а 5 ргото(е айепоу1гиз 1п(егпа11ха(1оп Ьи( по( уйиз а((асйтеп(. Се11 73:309
Аогда11 8. е( а1. (2005) Рго(ес(юп адатз( Р. аегидтоза М(й ап айепоуМз уес(ог соп(аштд ап ОргР ер1(оре ш (йе сарз1й. I С1ш Шуез( 115:1281-1289
Уот1 К. е( а1. (2002) Нехоп депе зМ(сй з(га(еду йог (йе депегайоп ой сйтепс гесотЬтап( айепоуйиз. Нит Сепе Тйег 13:311.
Claims (4)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Партия рекомбинантного дефектного по репликации аденовируса на основе серотипа подгруппы С, причем указанный аденовирус включает химерный гексонный белок, где указанный химерный гексонный белок включает последовательности гипервариабельной области с НУК1 по НУК7 из серотипа подгруппы В или Ό или из серотипа Рап9 аденовируса шимпанзе и где последовательности между последовательностями НУК относятся к указанному серотипу подгруппы С.- 23 010433
- 2. Партия по п.1, где последовательность НУК1 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 24, 31, 38, 45, 52, 59, 66 и 73, где последовательность НУК2 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 25, 32, 39, 46, 53, 60, 67 и 74, где последовательность НУК3 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 26, 33, 40, 47, 54, 61, 68 и 75, где последовательность НУК4 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69 и 76, где последовательность НУК5 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 и 77, где последовательность НУК6 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 и 78 и где последовательность НУК7 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 30, 37, 44, 51, 58, 65, 72 и 79.
- 3. Партия по п.1, где последовательность НУК1 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 95, 102, 109, 116, 123, 130, 137 и 144, где последовательность НУК2 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 96, 103, 110, 117, 124, 131, 138 и 145, где последовательность НУК3 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 97, 104, 111, 118, 125, 132, 139 и 146, где последовательность НУК4 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 98, 105, 112, 119, 126, 133, 140 и 147, где последовательность НУК5 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 99, 106, 113, 120, 127, 134, 141 и 148, где последовательность НУК6 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 100, 107, 114, 121, 128, 135, 142 и 149 и где последовательность НУК7 выбрана из 8ЕС) Ш N0: 101, 108, 115, 122, 129, 136, 143 и 150.
- 4. Партия по п.1 или 2, где указанный серотип подгруппы С представляет собой А65.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61846904P | 2004-10-13 | 2004-10-13 | |
| EP04105005 | 2004-10-13 | ||
| US69772405P | 2005-07-08 | 2005-07-08 | |
| PCT/EP2005/055183 WO2006040330A2 (en) | 2004-10-13 | 2005-10-12 | Improved adenoviral vectors and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700850A1 EA200700850A1 (ru) | 2007-08-31 |
| EA010433B1 true EA010433B1 (ru) | 2008-08-29 |
Family
ID=35945186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700850A EA010433B1 (ru) | 2004-10-13 | 2005-10-12 | Усовершенствованные аденовирусные векторы и их применение |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7741099B2 (ru) |
| EP (1) | EP1799836B1 (ru) |
| KR (1) | KR101253363B1 (ru) |
| AP (1) | AP2351A (ru) |
| AU (1) | AU2005293568B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0516048A (ru) |
| CA (1) | CA2583843C (ru) |
| EA (1) | EA010433B1 (ru) |
| IL (1) | IL182330A (ru) |
| MX (1) | MX2007004188A (ru) |
| NZ (1) | NZ553889A (ru) |
| WO (1) | WO2006040330A2 (ru) |
Families Citing this family (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| KR101253363B1 (ko) * | 2004-10-13 | 2013-04-15 | 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 | 개선된 아데노바이러스 벡터 및 그것의 용도 |
| DK1994155T4 (da) | 2006-02-13 | 2022-07-25 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Polynukleotid- og polypeptidsekvenser involveret i fremgangsmåden med knogleremodellering |
| US8168181B2 (en) * | 2006-02-13 | 2012-05-01 | Alethia Biotherapeutics, Inc. | Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15 |
| EP1998804B1 (en) * | 2006-03-27 | 2014-04-16 | Crucell Holland B.V. | Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant |
| PT2185192T (pt) | 2007-08-03 | 2019-02-12 | Pasteur Institut | Vetores de transferência de genes lentivirais e suas aplicações medicinais |
| WO2009065800A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-28 | Crucell Holland B.V. | Recombinant human adenoviruses for eliciting mucosal immune responses |
| EP3335728B8 (en) | 2008-10-10 | 2020-03-11 | Children's Medical Center Corporation | Biochemically stabilized hiv-1 env trimer vaccine |
| DK2350268T3 (en) * | 2008-11-03 | 2015-03-23 | Crucell Holland Bv | PROCEDURE FOR PRODUCING ADENOVIRUS VECTORS |
| LT2358757T (lt) | 2008-11-18 | 2018-11-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Pagerinto ląstelinio imunogeniškumo priešvirusinės vakcinos |
| US9555089B2 (en) | 2009-08-18 | 2017-01-31 | The Rockefeller University | Modification of recombinant adenovirus with immunogenic plasmodium circumsporozoite protein epitopes |
| WO2011129468A1 (en) * | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Mogam Biotechnology Research Institute | Hexon isolated from simian adenovirus serotype 19, hypervariable region thereof and chimeric adenovirus using the same |
| PL2655604T3 (pl) * | 2010-12-14 | 2019-02-28 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Szczepionki adenowirusowe serotyp 26 i serotyp 35 przeciwko filowirusom |
| WO2012083297A2 (en) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectors with modified hexon regions |
| EP2654786B1 (en) * | 2010-12-20 | 2019-02-20 | GenVec, Inc. | Adenoviral vector-based dengue fever vaccine |
| CN102260712B (zh) * | 2011-05-31 | 2013-10-02 | 北京锤特生物科技有限公司 | 溶肿瘤能力增强的B型人腺病毒Ad11突变体的构建和应用 |
| WO2013036791A2 (en) * | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Modified adenoviral vectors and methods of treatment using same |
| US9267153B2 (en) | 2011-12-15 | 2016-02-23 | Washington University | Porcine knob xenotype chimeric adenoviral vector for dendritic cell infection |
| CN105473723A (zh) * | 2012-05-18 | 2016-04-06 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 亚家族e猿腺病毒a1302、a1320、a1331和a1337及其用途 |
| JP6268173B2 (ja) | 2012-07-19 | 2018-01-24 | 第一三共株式会社 | 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体 |
| KR101429696B1 (ko) * | 2012-11-21 | 2014-08-13 | 국립암센터 | 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 |
| EP2983686B1 (en) | 2013-01-07 | 2024-05-29 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Stabilized human immunodeficiency virus (hiv) envelope (env) trimer vaccines and methods of using the same |
| JP6576326B2 (ja) | 2013-03-14 | 2019-09-18 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 腫瘍溶解性アデノウイルス組成物 |
| CN104419717B (zh) * | 2013-08-23 | 2018-04-27 | 长春百克生物科技股份公司 | 逃避预存免疫的重组腺病毒及其构建方法和用途 |
| US10716845B2 (en) | 2013-10-04 | 2020-07-21 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Stabilized human immunodeficiency virus (HIV) clade C envelope (Env) trimer vaccines and methods of using same |
| CN105934252B (zh) | 2013-10-10 | 2020-11-10 | 贝思以色列女会吏医学中心公司 | Tm4sf1结合蛋白及其使用方法 |
| PT3197489T (pt) | 2014-09-26 | 2021-04-30 | Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc | Métodos e composições para induzir a imunidade protetora contra a infeção pelo vírus da imunodeficiência humana |
| MX2018001182A (es) | 2015-07-28 | 2018-04-20 | Univ Pennsylvania | Monocitos/macrofagos modificados que expresan receptores de antigeno quimerico y sus usos. |
| US11266726B2 (en) | 2015-10-30 | 2022-03-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for the treatment of HER2-expressing solid tumors |
| HUE045993T2 (hu) | 2015-12-15 | 2020-01-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Emberi immunhiány vírus antigének, vektorok, készítmények és alkalmazásukra szolgáló eljárások |
| AU2017223589B2 (en) | 2016-02-23 | 2023-08-03 | Salk Institute For Biological Studies | Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics |
| CA3013637A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Salk Institute For Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
| US10273268B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-04-30 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV vaccine formulation |
| EP3506937A1 (en) | 2016-09-02 | 2019-07-10 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| SG10202001956UA (en) | 2016-09-15 | 2020-04-29 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Trimer stabilizing hiv envelope protein mutations |
| EP3526236A4 (en) | 2016-10-17 | 2020-06-03 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | SIGNATURE-BASED HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS VACCINES (ENV) CONTAINING SIGNS AND METHODS OF USE THEREOF |
| WO2018111767A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Salk Institute For Biological Studies | Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof |
| JP7272965B2 (ja) | 2017-06-15 | 2023-05-12 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Ｈｉｖ抗原をコードするポックスウイルスベクターおよびその使用方法 |
| AU2018295421B2 (en) * | 2017-07-05 | 2024-01-25 | Nouscom Ag | Non human great apes adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof |
| CA3069052A1 (en) | 2017-07-19 | 2019-01-24 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Trimer stabilizing hiv envelope protein mutations |
| KR20200083510A (ko) | 2017-10-31 | 2020-07-08 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 및 이의 용도 |
| KR20200074987A (ko) | 2017-10-31 | 2020-06-25 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 및 이의 용도 |
| EA202091074A1 (ru) | 2017-10-31 | 2020-07-22 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Аденовирус и его применения |
| CA3077630A1 (en) * | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus vectors and uses thereof |
| WO2019099970A1 (en) | 2017-11-20 | 2019-05-23 | Janssen Pharmaceuticals Inc. | Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen |
| CN113227361A (zh) | 2018-11-21 | 2021-08-06 | 梅奥医学教育及研究基金会 | 腺病毒和使用腺病毒的方法 |
| NZ779550A (en) | 2019-04-29 | 2024-08-30 | Mayo Foundation For Medical Education And Res | Multivalent pd-l1 binding compounds for treating cancer |
| CN110564768A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-12-13 | 广州佰芮慷生物科技有限公司 | 一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法 |
| TW202204380A (zh) | 2020-01-31 | 2022-02-01 | 美商詹森藥物公司 | 用於預防及治療冠狀病毒感染之組合物及方法－sars-cov-2疫苗 |
| WO2021228842A1 (en) | 2020-05-11 | 2021-11-18 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins |
| JP2023529841A (ja) | 2020-06-04 | 2023-07-12 | カリスマ セラピューティクス インコーポレイテッド | キメラ抗原受容体のための新規コンストラクト |
| CN116096406A (zh) | 2020-06-29 | 2023-05-09 | 扬森疫苗与预防公司 | 针对呼吸道合胞病毒感染的疫苗组合 |
| CA3187149A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized corona virus spike protein fusion proteins |
| US20220118081A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV vaccine regimens |
| WO2022175479A1 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections |
| WO2022175477A1 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion rsv fb antigens |
| US20240197859A1 (en) | 2021-04-01 | 2024-06-20 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized Pre-Fusion PIV3 F Proteins |
| WO2023020939A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-02-23 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
| WO2023026182A1 (en) | 2021-08-24 | 2023-03-02 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
| WO2023047349A1 (en) | 2021-09-24 | 2023-03-30 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins |
| WO2023047348A1 (en) | 2021-09-24 | 2023-03-30 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized corona virus spike protein fusion proteins |
| WO2023111725A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
| EP4448802A1 (en) | 2021-12-16 | 2024-10-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins |
| EP4205759A1 (en) | 2022-01-04 | 2023-07-05 | Veterinärmedizinische Universität Wien | Fowl adenovirus subunit vaccine and production method thereof |
| WO2023198815A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Sequential administration of adenoviruses |
| WO2024061757A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Pre-fusion human piv1 f proteins |
| WO2024061759A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized coronavirus s proteins |
| WO2024074584A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion piv3 f proteins |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998032842A1 (en) * | 1997-01-24 | 1998-07-30 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having altered hexon proteins |
| WO1998040509A1 (en) * | 1997-03-13 | 1998-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| WO2000003029A2 (en) * | 1998-07-08 | 2000-01-20 | Introgene B.V. | Chimaeric adenoviruses |
| WO2000012738A1 (en) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Aventis Pharma S.A. | Targeted adenovirus vectors for delivery of heterologous genes |
| WO2000070071A1 (en) * | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Crucell Holland B.V. | Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35 |
| WO2003062400A2 (en) * | 2002-01-24 | 2003-07-31 | The Scripps Research Institute | Fiber shaft modifications for efficient targeting |
| WO2004037294A2 (en) * | 2002-10-23 | 2004-05-06 | Crucell Holland B.V. | New settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| CA2378539A1 (en) | 1999-07-06 | 2001-01-11 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine |
| CA2422882A1 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Merck & Co., Inc. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol, nef and modifications |
| PT1409012E (pt) | 2001-06-22 | 2009-05-11 | Wistar Inst | Métodos de indução de uma resposta imunitária citotóxica e composições de adenovírus recombinantes de símio úteis para esse efeito |
| US8232255B2 (en) | 2002-10-23 | 2012-07-31 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Methods for vaccinating against malaria |
| US6921582B2 (en) * | 2002-12-23 | 2005-07-26 | General Electric Company | Oxidation-resistant coatings bonded to metal substrates, and related articles and processes |
| US20040185555A1 (en) | 2003-03-17 | 2004-09-23 | Emini Emilio A. | Adenovirus serotype 24 vectors, nucleic acids and virus produced thereby |
| KR101253363B1 (ko) * | 2004-10-13 | 2013-04-15 | 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 | 개선된 아데노바이러스 벡터 및 그것의 용도 |
-
2005
- 2005-10-12 KR KR1020077008494A patent/KR101253363B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-10-12 AP AP2007003990A patent/AP2351A/xx active
- 2005-10-12 BR BRPI0516048-0A patent/BRPI0516048A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-10-12 NZ NZ553889A patent/NZ553889A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-10-12 MX MX2007004188A patent/MX2007004188A/es active IP Right Grant
- 2005-10-12 US US11/665,276 patent/US7741099B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-10-12 EA EA200700850A patent/EA010433B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-10-12 EP EP05815456A patent/EP1799836B1/en active Active
- 2005-10-12 CA CA2583843A patent/CA2583843C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-10-12 WO PCT/EP2005/055183 patent/WO2006040330A2/en active Application Filing
- 2005-10-12 AU AU2005293568A patent/AU2005293568B2/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-03-29 IL IL182330A patent/IL182330A/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998032842A1 (en) * | 1997-01-24 | 1998-07-30 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having altered hexon proteins |
| WO1998040509A1 (en) * | 1997-03-13 | 1998-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| WO2000003029A2 (en) * | 1998-07-08 | 2000-01-20 | Introgene B.V. | Chimaeric adenoviruses |
| WO2000012738A1 (en) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Aventis Pharma S.A. | Targeted adenovirus vectors for delivery of heterologous genes |
| WO2000070071A1 (en) * | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Crucell Holland B.V. | Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35 |
| WO2003062400A2 (en) * | 2002-01-24 | 2003-07-31 | The Scripps Research Institute | Fiber shaft modifications for efficient targeting |
| WO2004037294A2 (en) * | 2002-10-23 | 2004-05-06 | Crucell Holland B.V. | New settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| BAROUCH DAN H. ET AL.: "Immunogenicity of recombinant adenovirus serotype 35 vaccine in the presence of pre-existing anti-Ad5 immunity", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 172, no. 10, 15 May 2004 (2004-05-15), pages 6290-6297, XP002327344, ISSN: 0022-1767, relevant to invention 1, the whole document * |
| CRAWFORD-MIKSZA L. ET AL.: "ANALYSIS OF 15 ADENOVIRUS HEXON PROTEINS REVEALS THE LOCATION AND STRUCTURE OF SEVEN HYPERVARIABLE REGIONS CONTAINING SEROTYPE- SPECIFIC RESIDUES',' JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 70, no. 3, March 1996 (1996-03), pages 1836-1844, XP002071016, ISSN: 0022-538X, relevant to invention 2, the whole document * |
| GALL JASON G.D. ET AL.: "Construction and characterization of hexon-chimeric adenoviruses: Specification of adenovirus serotype", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 72, no. 12, December 1998 (1998-12), p. 10260-10264, XP002327347, ISSN: 0022-538X, relevant to inventions 1 and 2, the whole document * |
| GANESH S. ET AL.: "Adenovirus 35 vectors with fiber chimeras exhibit altered tropism in vivo", MOLECULAR THERAPY, vol. 7, no. 5, May 2003 (2003-05), pages S53-S53, XP002327343, SAN DIEGO, USA, relevant to invention 1, the whole document * |
| ROBERTS DIANE M. ET AL.: "Hexon-chimaeric adenovirus serotype 5 vectors circumvent pre-existing anti-vector immunity", NATURE. 11 MAY 2006, vol. 441, no. 7090, 11 May 2006 (2006-05-11), p. 239-243, XP002385300, ISSN: 1476-4687, relevant to invention 2 * |
| ROY S. ET AL.: "Circumvention of immunity to the adenovirus major coat protein hexon", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 72, no. 8, August 1998 (1998-08), p. 6875-6879, XP002166425, ISSN: 0022-538X, relevant to inventions 1 and 2, the whole document * |
| RUX J.J. ET AL.: "Type-specific epitope locations revealed by X-ray crystallographic study of adenovirus type 5 hexon", MOLECULAR THERAPY: THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY. JAN 2000, vol. 1, no. 1, January 2000 (2000-01), pages 18-30, XP002385298, ISSN: 1525-0016, relevant to invention 2, the whole document * |
| RUX JOHN J. ET AL.: "Structural and phylogenetic analysis of adenovirus hexons by use of high-resolution x-ray crystallographic, molecular modeling, and sequence-based methods", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 77, no. 17, September 2003 (2003-09), pages 9553-9566, XP002385297, ISSN: 0022-538X, relevant to invention 2, the whole document * |
| SAKURAI F. ET AL.: "Efficient gene transfer into human CD34+ cells by an adenovirus type 35 vector", GENE THERAPY, vol. 10, no. 12, June 2003 (2003-06), pages 1041-1048, XP002327345, ISSN: 0969-7128, relevant to invention 1, the whole document * |
| SESHIDHAR REDDY P. ET AL.: "Development of adenovirus serotype 35 as a gene transfer vector", VIROLOGY, ACADEMIC PRESS, ORLANDO, US, vol. 311, no. 2, 5 July 2003 (2003-07-05), pages 384-393, XP004434224, ISSN: 0042-6822, relevant to invention 1, the whole document * |
| SHAYAKHMETOV DMITRY M. ET AL.: "The interaction between the fiber knob domain and the cellular attachment receptor determines the intracellular trafficking route of adenoviruses", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 77, no. 6, March 2003 (2003-03), pages 3712-3723, XP002327346, ISSN: 0022-538X, relevant to invention 1, the whole document * |
| SUMIDA SHAWN M. ET AL.: "Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 174, no. 11, June 2005 (2005-06), pages 7179-7185, XP002385299, ISSN: 0022-1767, relevant to invention 2 * |
| VIGNE E. ET AL.: "RGD inclusion in the hexon monomer provides adenovirus type-5 based vectors with a fiber knob-independent pathway for infection", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 73, no. 6, June 1999 (1999-06), pages 5156-5161, XP002126062, ISSN: 0022-538X, relevant to invention 2, the whole document * |
| VOGELS R. ET AL.: "REPLICATION-DEFICIENT HUMAN ADENOVIRUS TYPE 35 VECTORS FOR GENE TRANSFER AND VACCINATION: EFFICIENT HUMAN CELL INFECTION AND BYPASS OF PREEXISTING ADENOVIRUS IMMUNITY", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, v. 77, no. 15, August 2003 (2003-08), pages 8263-8271, XP009021328, ISSN: 0022-538X, relevant to invention 2, the whole document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2005293568B2 (en) | 2010-10-28 |
| AU2005293568A1 (en) | 2006-04-20 |
| BRPI0516048A (pt) | 2008-08-19 |
| WO2006040330A2 (en) | 2006-04-20 |
| EP1799836B1 (en) | 2010-12-22 |
| US20080199939A1 (en) | 2008-08-21 |
| IL182330A0 (en) | 2007-07-24 |
| AP2351A (en) | 2012-01-25 |
| US7741099B2 (en) | 2010-06-22 |
| CA2583843C (en) | 2010-09-21 |
| EA200700850A1 (ru) | 2007-08-31 |
| EP1799836A2 (en) | 2007-06-27 |
| NZ553889A (en) | 2009-11-27 |
| AP2007003990A0 (en) | 2007-06-30 |
| KR101253363B1 (ko) | 2013-04-15 |
| KR20070085254A (ko) | 2007-08-27 |
| IL182330A (en) | 2013-02-28 |
| MX2007004188A (es) | 2007-10-11 |
| CA2583843A1 (en) | 2006-04-20 |
| WO2006040330A3 (en) | 2006-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA010433B1 (ru) | Усовершенствованные аденовирусные векторы и их применение | |
| JP7366014B2 (ja) | アデノウイルス及びその用途 | |
| JP6262779B2 (ja) | サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用 | |
| US8227243B2 (en) | Settings for recombinant adenoviral-based vaccines | |
| Wang et al. | Recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing a soluble form of glycoprotein B causes durable immunity and neutralizing antibodies against multiple strains of human cytomegalovirus | |
| KR101971808B1 (ko) | 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물 | |
| ES2358523T3 (es) | Vectores adenovirales mejorados y usos de los mismos. | |
| WO2017096341A2 (en) | Adenovirus-vectored multivalent vaccine | |
| EA021391B1 (ru) | Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор | |
| EP1890724A2 (en) | Compositions for inducing an immune response | |
| US7968286B2 (en) | Settings for recombinant adenoviral-based vaccines | |
| TW202146427A (zh) | 用於預防冠狀病毒疾病的疫苗組合物 | |
| Fonseca et al. | A plasmodium promiscuous T cell epitope delivered within the Ad5 hexon protein enhances the protective efficacy of a protein based malaria vaccine | |
| WO2022003083A1 (en) | Gorilla adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof | |
| US20050281844A1 (en) | Immunization for Ebola virus infection | |
| EA047117B1 (ru) | Аденовирусные векторы и их применения | |
| EP3796932A1 (en) | Recombinant measles virus expressing proteins of a plasmodium parasite and their applications | |
| JP2018078894A (ja) | サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |