JP7366014B2 - アデノウイルス及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、バイオテクノロジーに関する。より詳細には、抗原を送達し、宿主において免疫応答を誘発するための複製欠損アデノウイルスベクターなどのアデノウイルスベクターの分野及び使用に関する。
組換えアデノウイルスベクターは、遺伝子治療適用及びワクチンに広く応用されている。ＡｄＶ－５ベクターに基づくワクチンは、様々な動物モデルにおいて強力で保護的な免疫応答を誘発することが示されている（例えば、国際公開第２００１／０２６０７号パンフレット；国際公開第２００２／２２０８０号パンフレット；Ｓｈｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：３３１（２００２）；Ｌｅｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７３（２００２）；Ｓｈｉｖｅｒ ａｎｄ Ｅｍｉｎｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５５：３５５（２００４））。しかしながら、組換えＡｄＶ－５ベクターに基づくワクチンの有用性は、ヒト集団におけるＡｄＶ－５特異的中和抗体（ＮＡｂ）の高い血清有病率によって制限される可能性が高い。抗ＡｄＶ－５免疫の存在は、マウス、アカゲザル、及びヒトにおける研究において、ＡｄＶ－５に基づくワクチンの免疫原性を大幅に抑制することが示されている。
最も一般的なヒトアデノウイルス、例えば、ＡｄＶ－５により以前に感染又は治療された個体における既存の免疫の存在を回避するための一つの有望な戦略は、そのような既存の免疫に遭遇しないアデノウイルス血清型からの組換えベクターの開発を含む。１つのこのような戦略は、非ヒトサルアデノウイルスの使用に基づいているが、これは非ヒトサルアデノウイルスが通常ヒトに感染せず、ヒト試料では低い血清有病率を示すためである。非ヒトサルアデノウイルスは、これらのウイルスがインビトロでヒト細胞に感染できたことが示されたため、ヒトへの適用が可能である（国際公開第２００３／０００２８３号パンフレット；国際公開第２００４／０３７１８９号パンフレット）。
したがって、大量に生産可能で、宿主の既存の免疫に遭遇しないが依然として免疫原性があり、ベクターに挿入された異種核酸によってコードされる抗原に対して強い免疫応答を誘導することができる代替的なアデノウイルスベクターが、この分野では必要とされている。
ヘキソンポリペプチドをコードする単離された核酸配列が提供される。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含む。
特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体は、ＢＬＹ６ヘキソンポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
また、ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ファイバーポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列；配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体は、ＢＬＹ６ファイバーポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明の実施形態はまた、本発明のファイバー及びヘキソン核酸配列によってコードされる単離されたファイバー及びヘキソンポリペプチドを含む。
さらに本明細書では、本明細書で開示されるヘキソンポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードするヘキソン核酸配列、及び本明細書で開示されるファイバーポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードするファイバー核酸配列を含む単離された核酸が提供される。特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載される単離された核酸を含むベクターが提供される。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。好ましい一実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。より好ましくは、ベクターはさらに導入遺伝子を含む。
本明細書に記載されるベクターを含む組換え細胞も提供される。このような細胞は、組換えタンパク質の産生、組換えタンパク質の発現、又はベクター若しくはウイルス粒子の産生のために使用することができる。また、ベクターを作製する方法も提供される。方法は、（ａ）本明細書で開示される組換え細胞を、ベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び（ｂ）組換え細胞からベクターを単離することを含む。
特定の実施形態では、本明細書で開示されるベクターを含む免疫原性組成物が提供される。また、本明細書で開示される免疫原性組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法も提供される。
特定の実施形態では、（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子；及び（ｂ）本発明の実施形態によるヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターが提供される。ヘキソンポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含み得る。ヘキソンポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチドは、ＢＬＹ６ヘキソンポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子；及び（ｂ）本発明の実施形態によるファイバーポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターが提供される。特定の実施形態では、ファイバーポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列；配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列のうちの少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態では、ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体は、ＢＬＹ６ファイバーポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の実施形態はまた、（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子；（ｂ）本発明の実施形態によるヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列；及び（ｃ）本発明の実施形態によるファイバーポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクター（ｒＡｄ）である。一実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失を含み得る。特定の実施形態では、本明細書で提供されるアデノウイルスベクターはさらに、Ｅ３欠失を含み得る。アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス（例えば、ＣｈＡｄ３）；ゴリラアデノウイルス；又はアカゲザルアデノウイルス（例えば、ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２又はｒｈＡｄ５３）などの１種以上のサルアデノウイルス（ＳＡｄＶ）に由来するアデノウイルス核酸配列を含むサルアデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスベクターは、１種以上のヒトアデノウイルス（例えば、ｈＡｄＶ－４、ｈＡｄＶ－５、ｈＡｄＶ－２６、ｈＡｄＶ－３５）に由来するアデノウイルス配列を含むヒトアデノウイルスベクターであり得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、１種以上のヒトアデノウイルス核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターである。ヒトアデノウイルス核酸配列は、例えば、ヒトアデノウイルス－４（ｈＡｄＶ－４）、ヒトアデノウイルス－５（ｈＡｄＶ－５）、ヒトアデノウイルス－２６（ｈＡｄＶ－２６）、又はヒトアデノウイルス－３５（ｈＡｄＶ－３５）に由来し得る。アデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス－５（ｈＡｄＶ－５） Ｅ４ ｏｒｆ６及びｏｒｆ６／７を含み得る。
特定の実施形態では、導入遺伝子は、逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接して位置する。特定の実施形態では、導入遺伝子は、例えば、Ｅ４領域と右ＩＴＲ（ＲＩＴＲ）の間において、Ｅ１欠失にあるか又はＥ１欠失に隣接し、Ｅ３欠失にあるか又はＥ３欠失に隣接し、且つ／又はＩＴＲにあるか又はＩＴＲに隣接して位置する。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるアデノウイルスベクターは、配列番号１３又は配列番号１４の核酸配列を含む。
また、本明細書に記載されるアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物又はワクチンが提供される。さらに、必要とする対象において免疫応答を誘導するための方法が提供される。方法は、対象に本明細書で開示されるワクチンを投与することを含む。さらに、ベクターを作製する方法が提供される。方法は、本明細書で開示されるアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む。
上述の概要、及び下記の本願の好ましい実施形態の詳細な説明は、添付した図面とともに読む場合により十分に理解されることになる。しかしながら、本願は、図面に示される明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
本開示は、アデノウイルス種Ｅに割り当てられた新規のゴリラアデノウイルス単離物の単離及び同定、並びに前記ゴリラアデノウイルスのヘキソン及びファイバーポリペプチドの可変領域をコードする核酸を含むワクチンベクターの構築及び評価に少なくとも部分的に基づく。アデノウイルスベクターは、ヒトにおいて免疫応答を誘発するとともに、低い血清有病率を有することができる。アデノウイルスベクターは、ワクチンのために製剤化され、且つ目的の特異抗原に対する防御免疫を誘導するために使用され得る。
背景技術の項で、また本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文及び特許が引用又は記載されており、これらの参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明の文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれか又は全てが、開示されている、又は特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
別途定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。さもなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。
本明細書で使用する場合、及び添付した特許請求の範囲においては、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数及び値の分数を含む。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者は、通例の実験だけを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識することになるか、又は確認することがきできるであろう。このような等価物は、本発明に包含されるものとする。
本明細書で使用する場合、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｓ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、若しくは「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又はそれらの任意の他の変形は、記載された整数又は整数群を包含することを意味するものと理解されるが、任意の他の整数又は整数群の排除を意味するものではなく、非排他的又はオープンエンドであることが意図されている。例えば、構成要素の一覧を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は必ずしもそれらの構成要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されていない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置が本来具備している他の構成要素を含むことができる。さらに、明確に反対のことを述べない限り、「又は」は包括的「又は」を意味し、排他的「又は」を意味しない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真であり（又は、存在し）且つＢが偽である（又は、存在しない）、Ａが偽であり（又は、存在しない）且つＢが真である（又は、存在する）、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は、存在する）。
本明細書で使用する場合、多数の列挙された要素間の接続語「及び／又は」は、個々の選択肢及び組み合わせた選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１選択肢は第２要素を伴わない第１要素の適用性を指す。第２選択肢は、第１要素を伴わない第２要素の適用性を指す。第３選択肢は、第１及び第２要素を合わせた適用性を指す。これらの選択肢のいずれか１つは、本明細書で使用する用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解される。２つ以上の選択肢の同時の適用性は、さらに用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解される。
本明細書で使用する場合、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語、又は「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」若しくは「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などのその変形は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数又は整数群を全て包含するが、その特定の方法、構造、又は組成物にさらなる整数又は整数群を加えることはできないことを意味する。
本明細書で使用する場合、「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語、又は「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」若しくは「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などのその変形は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数又は整数群を全て包含し、且つ、その特定の方法、構造、又は組成物の基本の又は新規の特性を実質的に変化させない記載された整数又は整数群を任意選択的に包含することを意味する。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．２１１１．０３節を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態による方法によってワクチン接種されることになるか又はワクチン接種されたあらゆる動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用する場合、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ネズミ、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられるが、これに限定されない。
語「右」、「左」、「下」及び「上」は、参照される図面における方向を指定する。
また、本明細書で好ましい発明の構成要素の寸法又は特性に言及するときに使用される「約」、「略」、「一般に」、「実質的に」などの用語は、当業者に理解されるとおり、記載された寸法／特性が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じか又は類似している、そこからのわずかな変形を排除しないことを示すことは理解されたい。少なくとも、そのような数値パラメータを含む言及は、当該技術分野で受容されている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又はその他の系統誤差、製造上の公差など）を使用して、最下位数を変化させない変動を含むであろう。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、ヘキソン及びファイバーポリペプチド並びにそれらをコードするポリヌクレオチド）の文脈における用語「同一」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は目視による調査によって測定されるとおり、最大の一致について比較及び整列される場合に、同じあるか、又は特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。
配列比較のために、通常１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は目視による調査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，の合弁事業（１９９５年増補版）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）によって実行され得る。
パーセント配列同一性及び配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２において記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さの文字列とアラインメントさせた場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致又はそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは隣接文字列スコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、より長いＨＳＰを含む文字列を探し出すための探索を開始するためのシードとして作用する。次に、文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。
累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一致残基の対に関する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不適正残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリックスは、累積スコアを計算するために使用される。各方向における文字列ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Ｘ減少する場合；１つ以上の負のスコアの残基のアラインメントが蓄積することにより、累積スコアが０以下となる場合；又はいずれかの配列の端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを初期設定として使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９））。
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３））。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりもたらされる類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるとおり、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは通常、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるとおり、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用する場合、用語「防御免疫」又は「防御免疫応答」は、ワクチン接種された対象が、このワクチン接種を行った対象の病原性因子による感染を防除できることを意味する。病原性因子は、例えば、抗原性遺伝子産物若しくは抗原性タンパク質、又はその断片であり得る。通常、「防御免疫応答」が発現された対象は、軽度～中程度の臨床症状を発現するにすぎないか又は症状を全く発現しない。通常、特定の因子に対する「防御免疫応答」又は「防御免疫」を有する対象は、前記因子による感染の結果として死亡しない。
用語「アジュバント」は、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫応答を増強させるために使用される。
本明細書で使用する場合、用語「抗原性遺伝子産物又はその断片」又は「抗原性タンパク質」は、細菌、ウイルス、寄生虫、若しくは真菌タンパク質、又はその断片を含み得る。好ましくは、抗原性タンパク質又は抗原性遺伝子産物は、宿主において防御免疫応答を高め、例えば、疾患又は感染症（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、若しくは真菌疾患又は感染症）に対する免疫応答を誘導し、且つ／又は疾患又は感染症に対して対象を保護する免疫を対象において疾患又は感染症に対してもたらす（すなわち、ワクチン接種する）ことができる。
アデノウイルスベクター
特定のアデノウイルスへの曝露は、特定のアデノウイルス血清型に対する免疫応答をもたらし、アデノウイルスベクターの有効性に影響を及ぼす可能性がある。ヒトアデノウイルスによる感染はヒトにおいて一般的であるため、ヒト集団におけるヒトアデノウイルスに対する中和抗体の有病率は高い。個体におけるこのような中和抗体の存在は、ヒトアデノウイルス骨格に基づく遺伝子導入ベクターの有効性を低減すると予想され得る。有効性の低減を回避するための１つの方法は、中和抗体の標的であるアデノウイルスカプシドタンパク質上のエピトープを置き換えることである。カプシドタンパク質上の標的配列は、低い有病率であり、したがって中和抗体がヒト集団において希少である他のアデノウイルスに由来するタンパク質配列で置き換えられ得る。
特定のアデノウイルスへの曝露は、特定のアデノウイルス血清型に対する免疫応答をもたらし、アデノウイルスベクターの有効性に影響を及ぼす可能性がある。ヒトアデノウイルスによる感染はヒトにおいて一般的であるため、ヒト集団におけるヒトアデノウイルスに対する中和抗体の有病率は高い。個体におけるこのような中和抗体の存在は、ヒトアデノウイルス骨格に基づく遺伝子導入ベクターの有効性を低減すると予想され得る。有効性の低減を回避するための１つの方法は、中和抗体の標的であるアデノウイルスカプシドタンパク質上のエピトープを置き換えることである。カプシドタンパク質上の標的配列は、低い有病率であり、したがって中和抗体がヒト集団において希少である他のアデノウイルスに由来するタンパク質配列で置き換えられ得る。
「カプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型及び／又は向性の決定に関与する、アデノウイルス（例えば、ＢＬＹ６、ＨＡｄＶ－４）又はその機能的断片若しくは誘導体のカプシド上のタンパク質を指す。カプシドタンパク質は通常、ファイバー、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、アデノウイルスの全体又は全長カプシドタンパク質である。他の実施形態では、カプシドタンパク質は、アデノウイルスの全長カプシドタンパク質の断片又は誘導体である。特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターによってコードされるヘキソン、ペントン及びファイバーは、同じ又は異なるアデノウイルス骨格（すなわち、ＢＬＹ６ヘキソン及びＢＬＹ６ファイバー、ＢＬＹ６ヘキソン及びヒトアデノウイルスファイバー、ヒトアデノウイルスヘキソン及びＢＬＹ６ファイバーなど）のものである。
「ヘキソンポリペプチド」は、アデノウイルスヘキソンコートタンパク質、その機能的断片、及び誘導体を指す。
「ファイバーポリペプチド」は、アデノウイルスファイバータンパク質、その機能的断片、及び誘導体を指す。
アデノウイルスに対する中和抗体の１つの標的は、主要なコートタンパク質であるヘキソンタンパク質である。血清型を定義し、中和抗体に結合するヘキソンタンパク質又はヘキソンタンパク質内の可変配列を、本明細書に記載されるそれらのゴリラ配列などの、ヒト集団では希少なアデノウイルスに由来するヘキソンタンパク質又はヘキソンタンパク質内の可変配列で置き換えることは、ヒトで一般的に見られる抗体による中和の影響を受けにくいアデノウイルスベクターの構築を可能にし得る。
アデノウイルスに対する中和抗体の第２の標的は、ファイバータンパク質である。ファイバータンパク質又はファイバータンパク質内の可変配列を、本明細書に記載されるそれらのゴリラ配列などの、ヒト集団では希少なアデノウイルスに由来するファイバータンパク質又はファイバータンパク質内の可変配列で置き換えることは、ヒトで一般的に見られる抗体による中和の影響を受けにくいアデノウイルスベクターの構築を可能にし得る。上記のファイバー置換とヘキソン置換との組合せは、ヒト集団に一般的に存在する抗体による中和に対する追加の抵抗性を付与することができる。
本開示は、単離されたサルアデノウイルス血清型に由来するヘキソンポリペプチド及び／又はファイバーポリペプチドをコードする単離された核酸配列並びに単離された核酸配列のうちの少なくとも１つを含むアデノウイルスベクターを提供する。
ポリペプチドの「機能的誘導体」は、適宜、例えば、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が、欠失、挿入、改変及び／又は置換され得る、ポリペプチドの改変されたバージョンを指す。非改変アデノウイルスカプシドタンパク質の誘導体は、例えば：
（ａ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は低い血清有病率を保持し；且つ／又は
（ｂ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は高い宿主細胞感染性を保持し；且つ／又は
（ｃ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は高い免疫原性を保持し；且つ／又は
（ｄ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は高いレベルの導入遺伝子生産性を保持する場合、機能的であると考えられる。
（ａ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は低い血清有病率を保持し；且つ／又は
（ｂ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は高い宿主細胞感染性を保持し；且つ／又は
（ｃ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は高い免疫原性を保持し；且つ／又は
（ｄ）そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、非改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じ又は高いレベルの導入遺伝子生産性を保持する場合、機能的であると考えられる。
「アデノウイルスベクター」は、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するか又は含有する組換えベクターを指す。
好ましい実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、ヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体は、ＢＬＹ６ヘキソンポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体は、配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、単離された核酸配列は、ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする。ファイバーポリペプチドは、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド；配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチドのうちの少なくとも１つを含み得る。好ましい実施形態では、ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体は、ＢＬＹ６ファイバーポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、本明細書で開示されるヘキソンポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードするヘキソン核酸配列、及び本明細書で開示されるファイバーポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸配列を含む単離された核酸が提供される。
好ましい実施形態では、本発明の実施形態による、単離されたヘキソン核酸配列及び／又は単離されたファイバー核酸配列のうちの少なくとも１つを含むベクター、好ましくはアデノウイルスベクターが提供される。アデノウイルスベクターは、例えば、少なくとも１つの導入遺伝子；並びにヘキソンポリペプチド及び／又はファイバーポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ヘキソンポリペプチドは、本明細書で開示されるヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むポリペプチドを含み、且つファイバーポリペプチドは、本明細書に記載されるファイバーポリペプチドを含む。
典型的には、本発明のアデノウイルスベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、又はバキュロウイルスベクター上に組換えアデノウイルスゲノム全体を含む。本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるか、又は合成的に生成されるＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。
当業者であれば、複数の血清型に由来する要素が単一の組換えアデノウイルスベクター、例えば、ヒト又はサルアデノウイルスにおいて組み合わせ得ることを認識するであろう。したがって、異なる血清型から望ましい特性を組み合わせるキメラアデノウイルスベクターが生成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスベクターは、サルヘキソン及び／又はファイバーポリペプチド配列の既存の免疫の不在を、ｒＡｄ４、ｒＡｄ５、ｒＡｄ２６又はｒＡｄ３５などの現存するアデノウイルスベクターの高いレベルの抗原送達能力及び抗原提示能力と組み合わせることができた。
ワクチンとして使用するためのアデノウイルスベクターの利点としては、報告されている膨大な数のアデノウイルスベクターを用いた研究、開発、製造及び臨床試験における長年の経験に基づく、操作の容易性、良好な大規模での製造可能性、及び優れた安全性の記録が挙げられる。ワクチンとして用いられるアデノウイルスベクターは一般に、導入遺伝子にコードされたタンパク質に対する良好な免疫応答、例えば細胞免疫応答をもたらす。本発明によるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの任意の型に基づいてもよく、特定の実施形態では、ヒトアデノウイルスであり、それは任意の群又は血清型であってもよい。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧに由来するヒトアデノウイルスに基づく。他の好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９、又は５０に基づく。他の実施形態では、それはサルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルス又はゴリラアデノウイルスであり、それらは任意の血清型であってもよい。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、チンパンジーアデノウイルス１、３、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０、６７、又はＳＡ７Ｐ型に基づく。
より好ましい実施形態では、第２の組成物のチンパンジーアデノウイルスベクターは、ＣｈＡｄＶ３である。組換えチンパンジーアデノウイルス血清型３（ＣｈＡｄ３又はｃＡｄ３）は、ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のものと類似した特性を有する亜群Ｃのアデノウイルスである。ＣｈＡｄ３は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のための候補ワクチンを評価するヒト試験において安全であり且つ免疫原性であることが示されている（Ｂａｒｎｅｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１１５ｒａ１）。ＣｈＡｄ３に基づくワクチンは、ヒトＡｄ５ベクターワクチンに匹敵する免疫応答を誘導できたことが報告された。例えば、Ｐｅｒｕｚｚｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：１２９３－３００及びＱｕｉｎｎ ＫＭ，ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０：２７２０－３５；国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット；国際公開第２０１１／０１３０６２７号パンフレット等を参照されたい。
アデノウイルスベクター、その構築方法及びその増殖方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書及び同第６，１１３，９１３号明細書、並びにそれぞれＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）の６７及び６８章に収録のＴｈｏｍａｓ Ｓｈｅｎｋ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ」、並びに本明細書で言及している他の参考文献に記載されている。一般的には、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｄ ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、並びに本明細書で言及している他の参考文献に記載されているものなど、標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失及び／又はＥ３欠失を含む。Ｅ１又はＥ３欠失は、例えば、遺伝子の完全な欠失又は部分的な欠失を含むことができ、これによりＥ１又はＥ３遺伝子産物が機能的に欠損する。したがって、特定の実施形態では、アデノウイルスは、複製欠損であり、例えば、これは、ゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。当業者に知られるとおり、アデノウイルスゲノムから必須領域が欠失している場合、これらの領域でコードされる機能は、好ましくは、プロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわち、Ｅ１、Ｅ２及び／又はＥ４領域の一部又は全部がアデノウイルスから欠失している場合、これらは、プロデューサー細胞内、例えばそのゲノムに組み込まれるか、又はいわゆるヘルパーアデノウイルス若しくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内にも欠失を有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要はない。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４領域のうちの１つ以上はまた、目的の導入遺伝子（通常、プロモーターに連結されている）を不活性化されることになる領域に挿入するなど、他の手段によっても不活性化され得る。
使用可能なプロデューサー細胞（当該技術分野及び本明細書では、「パッケージング細胞」又は「補完細胞」と称される場合がある）は、所望のアデノウイルスが増殖し得る任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくは、それらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。任意のＥ１を補完するプロデューサー細胞、例えばＥ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１又はＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）、Ｅ１形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１：２１３－１９）、２９３などを用いることができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞、又は９１１細胞、又はＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。プロデューサー細胞内でのアデノウイルスベクターの産生は（Ｋｏｖｅｓｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２：１６８１－７０３）において概説される。
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、１種以上のヒトアデノウイルス核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターである。ヒトアデノウイルス核酸は、例えば、ヒトアデノウイルス－４（Ａｄ－４）、ヒトアデノウイルス－５（Ａｄ－５）、ヒトアデノウイルス－２６（Ａｄ－２６）、又はヒトアデノウイルス－３５（Ａｄ－３５）から選択され得る。特定の実施形態では、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターは、ヒトＡｄ５のアデノウイルスのＥ４－ｏｒｆ６コード配列を含む。これは、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現するよく知られた補完細胞株、例えば２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるそのようなアデノウイルスの増殖を可能にする（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＦａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：１９０９－１７，Ｈａｖｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８７：２１３５－４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照のこと）。
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは導入遺伝子を含む。「導入遺伝子」は、ベクター中において天然に存在しない核酸である異種核酸を指し、本発明によれば、導入遺伝子は、対象において免疫応答を誘発する抗原性遺伝子産物又は抗原性タンパク質をコードし得る。導入遺伝子は、例えば、標準的な分子生物学的手法によってベクターに導入され得る。導入遺伝子は、例えば、アデノウイルスベクターの欠失したＥ１若しくはＥ３領域内、又はＥ４領域とｒＩＴＲとの間の領域内にクローン化され得る。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子挿入部位で挿入される。
必要に応じて、本発明の実施形態によるヘキソン及び／又はファイバーポリペプチドをコードする核酸配列、及び／又は導入遺伝子は、治療される宿主（例えば、ヒト）における適切な発現を確実にするためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術である。
導入遺伝子は、アデノウイルス由来のプロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下に置かれ得る（すなわち、作動可能に連結され得る）か、又は異種プロモーターの制御下に置かれ得る。好適な異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター及びＲＳＶプロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内部の目的の異種遺伝子の上流に位置する。
好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、配列番号１３又は配列番号１４から選択される核酸配列を含む。
免疫原性組成物
免疫原性組成物は、本発明における使用のための免疫学的有効量の精製された又は部分的に精製されたヒト又はサル（例えば、ゴリラ）アデノウイルスベクターを含む組成物である。前記組成物は、当該技術分野においてよく知られる方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも称される）として製剤化され得る。このような組成物は、免疫応答を増強させるためのアジュバントを含み得る。製剤における各々の構成成分の最適な比は、本開示に鑑みて当業者によく知られる技術によって決定され得る。
免疫原性組成物は、本発明における使用のための免疫学的有効量の精製された又は部分的に精製されたヒト又はサル（例えば、ゴリラ）アデノウイルスベクターを含む組成物である。前記組成物は、当該技術分野においてよく知られる方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも称される）として製剤化され得る。このような組成物は、免疫応答を増強させるためのアジュバントを含み得る。製剤における各々の構成成分の最適な比は、本開示に鑑みて当業者によく知られる技術によって決定され得る。
本発明の実施形態による免疫原性組成物は、本開示に鑑みて当業者に知られる方法を用いて作製され得る。液体医薬組成物としては、一般に、水、石油、動物油若しくは植物油、鉱油、又は合成油などの液体担体が挙げられる。生理食塩水溶液、ブドウ糖若しくは他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。
本発明に有用な免疫原性組成物は、アジュバントを含み得る。本発明による同時投与に好適なアジュバントは、人において潜在的に安全であり、十分に耐容性を示し且つ有効であるものであるべきであり、ＱＳ－２１、Ｄｅｔｏｘ－ＰＣ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭｏＧＭ－ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ－Ｇ、ＣＲＬ－１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ－０２６、ＧＳＫ－Ｉ，ＡＳ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＡＳ１５、ＧｃＭＡＦ、Ｂ－ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ－０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、Ａｌｕｍ、及びＭＦ５９を含む。
投与され得る他のアジュバントとしては、レクチン、増殖因子、サイトカイン及びリンホカイン、例えばアルファ－インターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－Ｉ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１２又はこれらのコード核酸が挙げられる。
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者によく知られる他の物質を含み得る。このような物質は、無毒性でなければならず、活性成分の効力を阻害してはならない。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内又は腹腔内経路に依存し得る。
防御免疫を誘導するための方法
本発明の別の一般的な態様は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法に関する。方法は、例えば、本明細書に記載されるアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含むワクチンを対象に投与することを含み得る。また、本明細書ではワクチンを作製する方法も提供される。方法は、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む。
本発明の別の一般的な態様は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法に関する。方法は、例えば、本明細書に記載されるアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含むワクチンを対象に投与することを含み得る。また、本明細書ではワクチンを作製する方法も提供される。方法は、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む。
本明細書に記載されるものを含むが、それらに限定されない本発明の実施形態による免疫原性組成物のいずれかは、本発明の方法においてワクチンとして使用され得る。
ベクターを含む免疫原性組成物／ワクチンの投与は通常、筋肉内又は皮下である。しかしながら、静脈内、皮膚、皮内又は経鼻などの他の投与様式も同様に想定され得る。免疫原性組成物の筋肉内投与は、アデノウイルスベクターの懸濁剤を注射するためのニードルを使用することにより行われ得る。代替法は、組成物を投与する無針注射デバイスの使用（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）を使用する）、又はワクチンを含有する凍結乾燥粉末である。
静脈内、皮膚若しくは皮下注射、又は罹患部位での注射のために、ベクターは、パイロジェンフリーであり且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態となる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張媒体を用いて好適な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が含まれ得る。徐放性製剤もまた利用され得る。
通常、投与は、感染又は症状の発症の前に目的の抗原（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、及び／又は真菌病原体）に対する免疫応答を発生させる予防的な目的を有することになる。本発明により治療又は予防され得る疾患及び障害は、免疫応答が防御的又は治療的な役割を果たすことができるものを含む。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、曝露後の予防のために投与され得る。
ヒト又はサル（例えば、ゴリラ）アデノウイルスベクターを含有する免疫原性組成物を対象に投与すると、対象において目的の抗原に対する免疫応答が生じる。検出可能な免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量は、組成物の「免疫原的有効用量」又は「有効量」と定義される。本発明の免疫原性組成物は、体液性及び細胞性免疫応答を誘導することができる。典型的な実施形態において、免疫応答は、防御免疫応答である。
投与される実際の量、及び投与の速度及び時間経過は、投与されているものの性質及び重症度に依存することになる。治療の処方、例えば、投与量などの決定は、一般開業医や他の医師、又は獣医の場合は獣医師の責任の範囲内であり、通常、治療対象の障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に知られるその他の要因を考慮する。上述の手法及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．，１９８０において見出され得る。
アデノウイルスベクターの作製及びこのような粒子の組成物への任意選択的な製剤化後、ベクターは、個体、特にヒト又は他の霊長類に投与され得る。投与は、ヒト又は別の哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、サル、イヌ又はネコに対するものであり得る。非ヒト哺乳動物への送達は、治療目的である必要はないが、実験の状況、例えばアデノウイルスベクターに対する免疫応答の機構の究明に使用するためであり得る。
１つの例示的なレジメンにおいて、アデノウイルスベクターは、約１０4～１０12ウイルス粒子／ｍｌの濃度を含有する約１００μｌ～約１０ｍｌの範囲の量で投与される（例えば、筋肉内）。好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．１～２．０ｍｌの範囲の量で投与される。例えば、アデノウイルスベクターは、１００μｌ、５００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌで投与され得る。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．５ｍｌの量で投与される。任意選択により、アデノウイルスベクターは、約１０7ｖｐ／ｍｌ、１０8ｖｐ／ｍｌ、１０9ｖｐ／ｍｌ、１０10ｖｐ／ｍｌ、５×１０10ｖｐ／ｍｌ、１０11ｖｐ／ｍｌ、又は１０12ｖｐ／ｍｌの濃度で投与され得る。通常、アデノウイルスベクターは、ヒト対象に１回の投与で約１０9～約１０12ウイルス粒子（ｖｐ）の量、より典型的には約１０10～約１０12ｖｐの量で投与される。
初回ワクチン接種の後、目的の抗原をコードする同じアデノウイルスベクターを含むワクチン／組成物又は目的の同じ抗原をコードする異なるアデノウイルスベクターを含むワクチン／組成物からのブースト又はキックが続き得る。
組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つ以上の単位投薬形態を含むものであり得るキット、パック又はディスペンサーで提示され得る。キットは、例えば、金属又はプラスチックのホイル、例えばブリスターパックを含み得る。キット、パック又はディスペンサーに投与のための使用説明書を付随させてもよい。
本発明の組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、治療対象の状態に応じて同時に又は順次に投与され得る。
実施形態
本発明はまた、以下の非限定的な実施形態を提供する。
本発明はまた、以下の非限定的な実施形態を提供する。
実施形態１は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列である。
実施形態２は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする単離された核酸配列である。
実施形態３は、ヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体が、ＢＬＹ６ヘキソンポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２のいずれか１つの単離された核酸配列である。
実施形態４は、実施形態１～３の核酸配列のいずれか１つを含み、且つファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列をさらに含む、単離された核酸配列である。
実施形態５は、ファイバーポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列を含む、実施形態４の単離された核酸配列である。
実施形態６は、ファイバーポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列を含む、実施形態４の単離された核酸配列である。
実施形態７は、ファイバーポリペプチドが、配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列を含む、実施形態４の単離された核酸配列である。
実施形態８は、ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体が、ＢＬＹ６ファイバーポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態４～７のいずれか１つの単離された核酸配列である。
実施形態９は、ファイバーノブポリペプチド配列が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列を含むファイバーポリペプチドをコードする単離された核酸配列である。
実施形態１０は、ファイバーシャフトポリペプチド配列が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列を含むファイバーポリペプチドをコードする単離された核酸配列である。
実施形態１１は、ファイバーテールポリペプチド配列が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列を含むファイバーポリペプチドをコードする単離された核酸配列である。
実施形態１２は、ファイバーポリペプチドが、ＢＬＹ６ファイバーポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸配列を含む、実施形態９～１１のいずれか１つの単離された核酸配列である。
実施形態１３は、実施形態１～１２のいずれかの核酸を含むベクターである。
実施形態１４は、アデノウイルスベクターであり、且つ導入遺伝子をさらに含む、実施形態１３のベクターである。
実施形態１５は、実施形態１３又は１４のベクターを含む組換え細胞である。
実施形態１６は、（ａ）実施形態１５の組換え細胞を、ベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び（ｂ）組換え細胞からベクターを単離することを含む、ベクターを作製する方法である。
実施形態１７は、実施形態１４のベクターを含む免疫原性組成物である。
実施形態１８は、実施形態１７の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法である。
実施形態１９は、（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子；及び（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターである。
実施形態２０は、（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子；及び（ｂ）ＢＬＹ６ヘキソンポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列を含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターである。
配列番号２１は、（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子；ＢＬＹ６ヘキソンポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列を含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列；及び（ｃ）ＢＬＹ６ファイバーポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸配列を含むファイバーポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターである。
実施例１：新規のアデノウイルス単離物ＢＬＹ６に基づくＥ１及びＥ３欠失ベクターの作製
新規のゴリラアデノウイルス単離物のＢＬＹ６（ＪＡｄ１－ＷＴとも命名される）が、同定され、且つ配列決定された。このゴリラアデノウイルス単離物は、系統学的にヒトアデノウイルス種Ｅ（ＨＡｄＶ－Ｅ）に属することが見出された。ＢＬＹ６の全ゲノムヌクレオチド配列は、配列番号５であると決定された。
新規のゴリラアデノウイルス単離物のＢＬＹ６（ＪＡｄ１－ＷＴとも命名される）が、同定され、且つ配列決定された。このゴリラアデノウイルス単離物は、系統学的にヒトアデノウイルス種Ｅ（ＨＡｄＶ－Ｅ）に属することが見出された。ＢＬＹ６の全ゲノムヌクレオチド配列は、配列番号５であると決定された。
ＢＬＹ６に基づくＡｄベクターの作製のために使用される単一のプラスミド系の説明
ｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３（配列番号８；図５）及びｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ＩＸＰ（配列番号９；図６）は、単離物ＢＬＹ６に基づく全長のＥ１及びＥ３欠失アデノウイルスベクターゲノムを保有するプラスミドである。これらのプラスミド内に含有されるＡｄベクターゲノム配列は、それぞれ配列番号１３又は配列番号１４において記載される。これらのプラスミドの各々の内部において、アデノウイルスベクターゲノムは、２つのＳｗａＩ制限酵素部位に隣接する（すなわち、１つのＳｗａＩ部位が、ベクターゲノムいずれの末端にも位置する）。これらのＳｗａＩ部位は、好適なＥ１補完細胞（ＨＥＫ２９３、９１１、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞など）のトランスフェクションによるウイルスレスキューの前にプラスミド骨格からのＡｄベクターゲノムの切除を容易にすることを意味する。これらのプラスミドによって構成されるＡｄベクターゲノムはさらに、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失の位置、及び右逆位末端配列（ＲＩＴＲ）に隣接して導入される特定の制限酵素部位を保有する。これらの制限酵素部位は、完全Ａｄゲノムプラスミドの文脈において固有なものとして選択された。それらは、前記のそれぞれの位置又はその任意の組合せのいずれかで挿入される１つ以上の導入遺伝子発現カセットを保有するＡｄベクターの標準的な分子クローニング手法による容易な構築を可能にする「導入遺伝子挿入部位」となる。Ａｄベクターの設計及びプラスミドの構築は、以下の節においてより詳細に記載される。
ｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３（配列番号８；図５）及びｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ＩＸＰ（配列番号９；図６）は、単離物ＢＬＹ６に基づく全長のＥ１及びＥ３欠失アデノウイルスベクターゲノムを保有するプラスミドである。これらのプラスミド内に含有されるＡｄベクターゲノム配列は、それぞれ配列番号１３又は配列番号１４において記載される。これらのプラスミドの各々の内部において、アデノウイルスベクターゲノムは、２つのＳｗａＩ制限酵素部位に隣接する（すなわち、１つのＳｗａＩ部位が、ベクターゲノムいずれの末端にも位置する）。これらのＳｗａＩ部位は、好適なＥ１補完細胞（ＨＥＫ２９３、９１１、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞など）のトランスフェクションによるウイルスレスキューの前にプラスミド骨格からのＡｄベクターゲノムの切除を容易にすることを意味する。これらのプラスミドによって構成されるＡｄベクターゲノムはさらに、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失の位置、及び右逆位末端配列（ＲＩＴＲ）に隣接して導入される特定の制限酵素部位を保有する。これらの制限酵素部位は、完全Ａｄゲノムプラスミドの文脈において固有なものとして選択された。それらは、前記のそれぞれの位置又はその任意の組合せのいずれかで挿入される１つ以上の導入遺伝子発現カセットを保有するＡｄベクターの標準的な分子クローニング手法による容易な構築を可能にする「導入遺伝子挿入部位」となる。Ａｄベクターの設計及びプラスミドの構築は、以下の節においてより詳細に記載される。
ＢＬＹ６に基づくＡｄベクターゲノムの設計
ＢＬＹ６に基づくＡｄベクターゲノムはそれぞれ、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失、異なる導入遺伝子挿入部位、並びに天然Ｅ４オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）６及びｏｒｆ６／７のヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）のものとの置換を含むように設計された。各アデノウイルスのＥ１領域は、ＡｓｉＳＩ制限酵素部位配列を含む導入遺伝子挿入部位により欠失され、且つ置換された。各アデノウイルスのＥ３領域は、ＦｓｅＩ制限酵素部位配列を含む導入遺伝子挿入部位により欠失され、且つ置換された。別の導入遺伝子挿入部位は、各アデノウイルスの右逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接するＰａｃＩ制限酵素部位配列の挿入によって作製された。Ｅ４ ｏｒｆ６及びｏｒｆ６／７コード配列を含むＢＬＹ６配列は、配列番号６によって置換された。この置換配列は、ヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）のＥ４ ｏｒｆ６及びｏｒｆ６／７コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＣ＿０００００８の塩基対３２９１４～３４０７７）を含む。
ＢＬＹ６に基づくＡｄベクターゲノムはそれぞれ、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失、異なる導入遺伝子挿入部位、並びに天然Ｅ４オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）６及びｏｒｆ６／７のヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）のものとの置換を含むように設計された。各アデノウイルスのＥ１領域は、ＡｓｉＳＩ制限酵素部位配列を含む導入遺伝子挿入部位により欠失され、且つ置換された。各アデノウイルスのＥ３領域は、ＦｓｅＩ制限酵素部位配列を含む導入遺伝子挿入部位により欠失され、且つ置換された。別の導入遺伝子挿入部位は、各アデノウイルスの右逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接するＰａｃＩ制限酵素部位配列の挿入によって作製された。Ｅ４ ｏｒｆ６及びｏｒｆ６／７コード配列を含むＢＬＹ６配列は、配列番号６によって置換された。この置換配列は、ヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）のＥ４ ｏｒｆ６及びｏｒｆ６／７コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＣ＿０００００８の塩基対３２９１４～３４０７７）を含む。
２種類のＥ１領域欠失が設計され、構築された。ｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３によって構成されるＢＬＹ６に基づくＡｄベクターゲノムは、配列番号５のヌクレオチド４５３～３０１６の除去に相当するＥ１領域欠失を保有する。対照的に、ｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ＩＸＰによって構成されるＢＬＹ６に基づくＡｄベクターゲノムは、ＢＬＹ６の全てのＥ１コード配列（すなわち、配列番号５のヌクレオチド４５３～３３６６）を除去するより広いＥ１領域を含む配列欠失を保有する。さらに、この後者のＡｄベクターゲノムは、Ｅ１Ｂ ５５ＫとｐＩＸコード配列の間の非コード配列区間のＨＡｄＶ－５のものによる置換を保有するように追加的に設計された（すなわち、配列番号５のヌクレオチド３３６７～３４５４に相当する配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ＿０００００８のヌクレオチド３５１０～３６０８（すなわち、配列番号７）によって置換された）。
ＢＬＹ６に基づくＡｄベクターゲノムを含む単一のプラスミドの構築
ｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３（配列番号８）は、遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって実施される）及び標準的な分子クローニング手順のいくつかの工程によって構築された。第一に、所望のＡｄベクターゲノムの左末端を含有する（すなわち、前述のＥ１欠失を内部に持つ）３５８６ｂｐ ＤＮＡ断片（配列番号１５）が合成され、ＭｆｅＩ－ＮｄｅＩ制限断片として、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩ消化ｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号－Ｊ０１７４９．１）に結合されて、ＢＬＹ６中間体プラスミド１を得た。第二に、所望のＡｄベクターゲノムの右末端を含有する（すなわち、前述のＥ３欠失、部分的なＥ４配列置換、及びｒＩＴＲに隣接する導入遺伝子挿入部位を内部に持つ）４１３８ｂｐ断片（配列番号１６）が合成され、ＢａｍＨＩ－ＮｄｅＩ制限断片として、ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩ消化ＢＬＹ６中間体プラスミド１に結合されて、ＢＬＹ６中間体プラスミド２を得た。第三に、中間のＡｄベクターゲノム断片を含有する４５６３ｂｐ断片（配列番号１７）が合成され、ＢａｍＨＩ－ＭｆｅＩ制限断片として、ＢａｍＨＩ及びＭｆｅＩ消化ＢＬＹ６中間体プラスミド２に結合されて、ＢＬＹ６中間体プラスミド３（配列番号１８）を得た。第四に、ＢＬＹ６ウイルスゲノム（配列番号５）の１８９８７ｂｐ ＢｓｒＧＩ－ＢｓｒＧＩ制限断片が、ＢｓｒＧＩ消化ＢＬＹ６中間体プラスミド３に結合されて、最終プラスミドｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３（配列番号８）を得た。
ｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３（配列番号８）は、遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって実施される）及び標準的な分子クローニング手順のいくつかの工程によって構築された。第一に、所望のＡｄベクターゲノムの左末端を含有する（すなわち、前述のＥ１欠失を内部に持つ）３５８６ｂｐ ＤＮＡ断片（配列番号１５）が合成され、ＭｆｅＩ－ＮｄｅＩ制限断片として、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩ消化ｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号－Ｊ０１７４９．１）に結合されて、ＢＬＹ６中間体プラスミド１を得た。第二に、所望のＡｄベクターゲノムの右末端を含有する（すなわち、前述のＥ３欠失、部分的なＥ４配列置換、及びｒＩＴＲに隣接する導入遺伝子挿入部位を内部に持つ）４１３８ｂｐ断片（配列番号１６）が合成され、ＢａｍＨＩ－ＮｄｅＩ制限断片として、ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩ消化ＢＬＹ６中間体プラスミド１に結合されて、ＢＬＹ６中間体プラスミド２を得た。第三に、中間のＡｄベクターゲノム断片を含有する４５６３ｂｐ断片（配列番号１７）が合成され、ＢａｍＨＩ－ＭｆｅＩ制限断片として、ＢａｍＨＩ及びＭｆｅＩ消化ＢＬＹ６中間体プラスミド２に結合されて、ＢＬＹ６中間体プラスミド３（配列番号１８）を得た。第四に、ＢＬＹ６ウイルスゲノム（配列番号５）の１８９８７ｂｐ ＢｓｒＧＩ－ＢｓｒＧＩ制限断片が、ＢｓｒＧＩ消化ＢＬＹ６中間体プラスミド３に結合されて、最終プラスミドｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３（配列番号８）を得た。
ｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ＩＸＰ（配列番号９）は、前述のＢＬＹ６中間体プラスミド３（配列番号１８）が最初に所望のＥ１欠失及びＡｄ５ ｐＩＸプロモーター挿入を含有するように改変されたことを除いてｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３と同じ方法で構築された。これは、後にＡｓｉＳＩ－ＡｇｅＩ制限断片としてＡｓｉＳＩ及びＡｇｅＩ消化ＢＬＹ６中間体プラスミド３に結合された６３８ｂｐ断片（配列番号１９）の合成によって行われた。
ｐＢＬＹ６．ＦＬｕｃ（配列番号２０）及びｐＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ（配列番号２１）は、それぞれＥ１欠失の位置で挿入された導入遺伝子発現カセットを備えるＢＬＹ６に基づくＡｄベクターゲノムを内部に持つｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３由来プラスミドである。これらのプラスミド内に保有されるＡｄベクターゲノム配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号２３において記載される。ｐＢＬＹ６．ＦＬｕｃは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に関する導入遺伝子発現カセットを保有する。このカセットは、サイトメガロウイルス主要前初期プロモーター（すなわち、「ＣＭＶプロモーター」）によって駆動され、且つＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナルを含有する。ｐＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－Ｇｌｕｃは、「ＲＳＶ－ＦA2－２Ａ－ＧＬｕｃ」（ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ）に関する導入遺伝子発現カセットを保有し、これは、呼吸器多核体ウイルス株Ａ２融合糖タンパク質、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド、及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）で構成されるキメラタンパク質である。ＦＬｕｃカセットのように、このカセットは、ＣＭＶプロモーターによって駆動され、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを保有する。加えて、このカセットは、５’非翻訳領域内にヒトアポリポタンパク質Ａ１遺伝子のイントロン２を含む配列を含有する。Ｆｌｕｃ及びＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ発現カセットはそれぞれ、いくつかの標準的な遺伝子合成及び分子クローニング工程によって構築された後、それらは、それぞれｐＢＬＹ６．ｄＥ１．ｄＥ３の固有のＡｓｉＳＩ制限酵素部位に結合されて、ｐＢＬＹ６．ＦＬｕｃ及びｐＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－Ｇｌｕｃを生成した。
ＢＬＹ６に基づくアデノウイルスベクターの作製及び生産
それぞれアデノウイルスベクターゲノム配列配列番号２２及び配列番号２３を含む、アデノウイルスベクターＢＬＹ６．Ｆｌｕｃ（ＪＡｄ１ＮＶＴ００３とも命名される）及びＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ（ＪＡｄ１ＮＶＴ００１とも命名される）は、対応するＡｄベクターゲノムプラスミド（すなわち、ｐＢＬＹ６．Ｆｌｕｃ及びｐＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ）のＥ１補完ＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクションによって作製された。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ2が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の接着培養物として増殖されたＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクションの前に、Ａｄベクターゲノムプラスミドは、ＳｗａＩで消化されて、プラスミドから対応するアデノウイルスベクターゲノムを放出した。トランスフェクションは、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて標準的な手順に従って実施された。ウイルスレスキュートランスフェクションの回収後、ＰＥＲ．Ｃ６細胞培養物に対する複数回の連続的な感染ラウンドによって、ウイルスをさらに増幅した。ウイルスを、以前に記載された２工程の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心法を用いて粗製のウイルス回収物から精製した（Ｈａｖｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｂ－ｇｒｏｕｐ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ ｖｅｃｔｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｉｎ ＰＥＲ．Ｃ６ ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７（８）：２１３５－４３（２００６））。ウイルス粒子（ＶＰ）力価は、以前に記載された分光光度法に基づく手順によって測定された（Ｍａｉｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ａｎｄ ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ２，７Ａ，ａｎｄ １２」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ３６（１）：１１５－２５（１９６８））。
それぞれアデノウイルスベクターゲノム配列配列番号２２及び配列番号２３を含む、アデノウイルスベクターＢＬＹ６．Ｆｌｕｃ（ＪＡｄ１ＮＶＴ００３とも命名される）及びＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ（ＪＡｄ１ＮＶＴ００１とも命名される）は、対応するＡｄベクターゲノムプラスミド（すなわち、ｐＢＬＹ６．Ｆｌｕｃ及びｐＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ）のＥ１補完ＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクションによって作製された。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ2が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の接着培養物として増殖されたＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクションの前に、Ａｄベクターゲノムプラスミドは、ＳｗａＩで消化されて、プラスミドから対応するアデノウイルスベクターゲノムを放出した。トランスフェクションは、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて標準的な手順に従って実施された。ウイルスレスキュートランスフェクションの回収後、ＰＥＲ．Ｃ６細胞培養物に対する複数回の連続的な感染ラウンドによって、ウイルスをさらに増幅した。ウイルスを、以前に記載された２工程の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心法を用いて粗製のウイルス回収物から精製した（Ｈａｖｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｂ－ｇｒｏｕｐ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ ｖｅｃｔｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｉｎ ＰＥＲ．Ｃ６ ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７（８）：２１３５－４３（２００６））。ウイルス粒子（ＶＰ）力価は、以前に記載された分光光度法に基づく手順によって測定された（Ｍａｉｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ａｎｄ ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ２，７Ａ，ａｎｄ １２」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ３６（１）：１１５－２５（１９６８））。
新規のアデノウイルスベクターによって誘導される細胞性及び体液性免疫応答
実施例２及び３は、本明細書で生成された新規のベクターであるＢＬＹ６に基づくアデノウイルスベクターの免疫原性を評価するために実施された実験を記載する。これらの実験では、筋肉内免疫後のマウスにおいて、ベクターにコードされる（モデル）抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を誘導する能力について新規のベクターが評価された。ベクターは、２つの異なる抗原：ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）及びＲＳＶ－ＦA2－２Ａ－ＧＬｕｃ（ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ）を用いて試験された。ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃは、呼吸器多核体ウイルス株Ａ２融合糖タンパク質、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド、及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）で構成されるキメラタンパク質である。各ベクターは、同じ抗原をコードする導入遺伝子カセットを保有するヒトアデノウイルス２６型（ＨＡｄＶ－２６、本明細書ではＡｄ２６とも称される）又はヒトアデノウイルス４９型（ＨＡｄＶ－４９、本明細書ではＡｄ４９とも称される）に基づくベンチマークベクターと並べて比較された。それぞれの抗原に対する免疫応答は、酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、及びＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ抗原の場合は呼吸器多核体ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）などのよく知られる免疫学的アッセイを用いて測定された。
実施例２及び３は、本明細書で生成された新規のベクターであるＢＬＹ６に基づくアデノウイルスベクターの免疫原性を評価するために実施された実験を記載する。これらの実験では、筋肉内免疫後のマウスにおいて、ベクターにコードされる（モデル）抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を誘導する能力について新規のベクターが評価された。ベクターは、２つの異なる抗原：ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）及びＲＳＶ－ＦA2－２Ａ－ＧＬｕｃ（ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ）を用いて試験された。ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃは、呼吸器多核体ウイルス株Ａ２融合糖タンパク質、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド、及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）で構成されるキメラタンパク質である。各ベクターは、同じ抗原をコードする導入遺伝子カセットを保有するヒトアデノウイルス２６型（ＨＡｄＶ－２６、本明細書ではＡｄ２６とも称される）又はヒトアデノウイルス４９型（ＨＡｄＶ－４９、本明細書ではＡｄ４９とも称される）に基づくベンチマークベクターと並べて比較された。それぞれの抗原に対する免疫応答は、酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、及びＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ抗原の場合は呼吸器多核体ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）などのよく知られる免疫学的アッセイを用いて測定された。
実施例２：ＢＬＹ６．ＦＬｕｃによって誘導される細胞性免疫応答
新規のアデノウイルスベクターＢＬＹ６の細胞性免疫原性を評価するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、Ａｄ２６．ＦＬｕｃ、Ａｄ４９．Ｆｌｕｃ（陽性対照）、ホタルルシフェラーゼを発現するＢＬＹ６ベクター（ＢＬＹ６．ＦＬｕｃ）、又は導入遺伝子をコードしないアデノベクター（空のＡｄ２６）で筋肉内注射によって免疫化した。投与のために２つのベクター用量が試験された：マウス毎に１０9及び１０10ウイルス粒子（ｖｐ）。免疫化の２週間後、マウスを屠殺し、脾細胞を１５量体の重複ＦＬｕｃペプチドプールで一晩刺激した（実験構成 図１Ａ）。細胞性免疫応答を、ＩＦＮ－γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した（図１Ｂ）。結果は、高用量の免疫化（１０10）で、ＢＬＹ６により誘導される細胞性免疫応答が、Ａｄ２６．Ｆｌｕｃに関して見られる応答とほとんど同程度に高かったことを示す。対照的に、低用量の免疫化（１０9）で、ＢＬＹ６．Ｆｌｕｃは、Ａｄ２６．Ｆｌｕｃより強い応答をもたらした。
新規のアデノウイルスベクターＢＬＹ６の細胞性免疫原性を評価するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、Ａｄ２６．ＦＬｕｃ、Ａｄ４９．Ｆｌｕｃ（陽性対照）、ホタルルシフェラーゼを発現するＢＬＹ６ベクター（ＢＬＹ６．ＦＬｕｃ）、又は導入遺伝子をコードしないアデノベクター（空のＡｄ２６）で筋肉内注射によって免疫化した。投与のために２つのベクター用量が試験された：マウス毎に１０9及び１０10ウイルス粒子（ｖｐ）。免疫化の２週間後、マウスを屠殺し、脾細胞を１５量体の重複ＦＬｕｃペプチドプールで一晩刺激した（実験構成 図１Ａ）。細胞性免疫応答を、ＩＦＮ－γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した（図１Ｂ）。結果は、高用量の免疫化（１０10）で、ＢＬＹ６により誘導される細胞性免疫応答が、Ａｄ２６．Ｆｌｕｃに関して見られる応答とほとんど同程度に高かったことを示す。対照的に、低用量の免疫化（１０9）で、ＢＬＹ６．Ｆｌｕｃは、Ａｄ２６．Ｆｌｕｃより強い応答をもたらした。
全体的に見て、本発明のＦＬｕｃ発現組換えＢＬＹ６アデノウイルスベクターにより誘導される細胞性免疫応答は、明らかにマウスにおけるこのベクターの強力な免疫原性を示している。
実施例３：ＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃによって誘導される細胞性及び体液性免疫応答
新規のアデノウイルスベクターＢＬＹ６の免疫原性はさらに、ベクターにコードされた（モデル）ワクチン抗原としてＲＳＶ－ＦA2－２Ａ－ＧＬｕｃ（ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ）を用いて評価された。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ（陽性対照）若しくはＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ（両方ともにマウス毎に１０8、１０9及び１０10ウイルス粒子）、又はＡｄ２６．ＦＬｕｃ若しくはＢＬＹ６．ＦＬｕｃ（両方ともにマウス毎に１０10ウイルス粒子）で筋肉内において免疫化した。８週後にマウスを屠殺し、血清試料及び脾細胞を回収した（図２Ａ）。様々な免疫パラメータを下記のとおりに評価した。
新規のアデノウイルスベクターＢＬＹ６の免疫原性はさらに、ベクターにコードされた（モデル）ワクチン抗原としてＲＳＶ－ＦA2－２Ａ－ＧＬｕｃ（ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ）を用いて評価された。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ（陽性対照）若しくはＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ（両方ともにマウス毎に１０8、１０9及び１０10ウイルス粒子）、又はＡｄ２６．ＦＬｕｃ若しくはＢＬＹ６．ＦＬｕｃ（両方ともにマウス毎に１０10ウイルス粒子）で筋肉内において免疫化した。８週後にマウスを屠殺し、血清試料及び脾細胞を回収した（図２Ａ）。様々な免疫パラメータを下記のとおりに評価した。
ウイルス中和アッセイを、呼吸器多核体ウイルス中和抗体を誘発するＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃの能力を評価するために実施した。図２Ｂは、免疫化の８週後に回収された血清試料について測定された呼吸器多核体ウイルス株Ａ２（ＲＳＶ Ａ２）ＶＮＡ力価を示す。各点は１頭のマウスを表し、バーは群平均を表し、点線は定量下限に相当する（ＬＬＯＱ＝６，８８；直線性試料の平均終点力価）。結果は、ＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃによる１０10ｖｐ用量の免疫化により、同じ抗原をコードするベンチマークのＡｄ２６について見られたものより高いＲＳＶ Ａ２中和力価が生じたことを示す。ＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃに対する力価は、免疫化のために使用される最大用量１０10ｖｐで主に検出された。予想されるとおり、ＲＳＶ Ａ２特異的応答は、ホタルルシフェラーゼをコードするアデノベクターに対して検出されなかった。
ベクターにコードされた抗原に対する細胞性免疫の誘導は、ＲＳＶ－ＦA2特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価された。この目的のため、免疫化の８週間後、免疫化されたマウスから脾細胞を単離し、ＲＳＶ－ＦA2タンパク質を架橋する１５量体の重複ペプチドで一晩刺激し、細胞性免疫応答を、ＩＦＮ－γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。データは、ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃをコードする新規のベクターＢＬＹ６によって誘発される抗原特異的細胞性免疫応答が、用量依存的であり、且つベンチマークベクターであるＡｄ２６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃによって誘導されるものと用量毎に同様の大きさであったことを示す（図２Ｃ）。予想されるとおり、ＲＳＶＦ－ＦA2特異的応答は、ホタルルシフェラーゼをコードするアデノベクターで免疫化されたマウスの脾細胞から測定されなかった。
ＲＳＶ－ＦA2特異的ＩｇＧ抗体を誘発するＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ発現ベクターの能力を、ＥＬＩＳＡによって評価した。ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃ導入遺伝子又はホタルルシフェラーゼ（対照）を発現するＡｄ２６（陽性対照）及びＢＬＹ６ベクターで免疫化されたマウスから免疫化の８週間後に回収された血清が、抗ＲＳＶ ＦA2 ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡにおいて試験された。特に、このＥＬＩＳＡは、組換え安定型プレ融合ＲＳＶ－ＦA2タンパク質（プレ－ＲＳＶ－Ｆ）に対して結合可能なＩｇＧ抗体を検出する。結果は、ＢＬＹ６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃが、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ－２Ａ－ＧＬｕｃによって誘導されるものより高いプレＲＳＶ－Ｆ特異的ＩｇＧ抗体力価を用量依存的に誘発したことを示す（図２Ｄ）。予想されるとおり、ＲＳＶ－ＦA2特異的抗体力価は、ホタルルシフェラーゼのみをコードするベクターで免疫化されたマウス由来の血清において検出されなかった。
まとめると、データは、ＢＬＹ６ベクターが、ＨＡｄＶ－２６に基づくベンチマークベクターによって誘導されるものと同様の又はより高い、コードされた抗原に対する強力な細胞性及び体液性免疫応答を誘導したことを示す。これらの免疫応答は、明らかにマウスにおけるＢＬＹ６ベクターの強力な免疫原性を示す。
実施例４：新規及び既存のアデノウイルスベクター間の血清学的交差中和の評価
新規のＢＬＹ６アデノウイルスワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な有用性に関して、本明細書で作製される新規アデノウイルスベクターは、好ましくは、ヒトアデノウイルス血清型ＨＡｄＶ－５及びＨＡｄＶ－３５に基づくベクターなどの、ワクチンベクターとして現在既に開発中の既存のアデノウイルスベクターとは血清学的に異なるであろう。したがって、交差中和試験を、ＨＡｄＶ－４、ＨＡｄＶ－５、ＨＡｄＶ－２６、ＨＡｄＶ－３５及びＨＡｄＶ４９に基づく新規のＢＬＹ６アデノウイルスベクター及びいくつかの既存のベクター間で実施した。この目的のため、これらのアデノウイルスベクターの１つに対してそれぞれ産生されるマウス抗血清は、アデノウイルス中和アッセイにおいて各種ベクターの各々に対して試験された。このアッセイのために使用されるマウス抗血清は、マウス当たり１０10ベクター粒子によるそれらの免疫化の２週間又は８週間後にＢａｌｂ／Ｃマウスから回収された。アデノウイルス中和アッセイは、以前に記載されたとおりに行われた（Ｓｐａｎｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：５０４６－５０５２）。簡潔に述べると、１：１６の希釈度から始めて、血清を２倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、Ａ５４９細胞とともに（細胞当たり５００個のウイルス粒子の感染の多重度で）一晩インキュベートした。感染の２４時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の９０％の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた：＜１６（中和なし）、１６～２００、２００～２，０００、及び＞２，０００。結果は、試験されたベクターの間で大部分が交差中和を示さない（図３）。ベクターＢＬＹ６とＡｄ２６の間で見られたいくつかのわずかな、一方向の交差中和があっただけで、ＢＬＹ６抗血清は、１６．１２（すなわち、１６の検出下限値のすぐ上）のＡｄ２６に対して中和力価を表示し、Ａｄ２６抗血清は、ＢＬＹ６に対して中和力価を示さなかった。このように、新規のアデノウイルスベクターＢＬＹ６は、試験されたパネルに含まれるヒトアデノウイルスベクター、すなわち、Ａｄ２６、Ａｄ３５、Ａｄ４９、Ａｄ５及びＡｄ４と交差中和を示さないか、又は非常にわずかに示した。したがって、このベクターは、場合によっては、例えば、異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンの文脈において、或いは又はさらに、異なる疾患若しくは抗原に対する一連の２回以上の継続的なワクチン接種の文脈において、連続的な免疫化におけるこれらの又は他の異なるアデノウイルスベクターの１種以上と組み合わせて使用され得る。
新規のＢＬＹ６アデノウイルスワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な有用性に関して、本明細書で作製される新規アデノウイルスベクターは、好ましくは、ヒトアデノウイルス血清型ＨＡｄＶ－５及びＨＡｄＶ－３５に基づくベクターなどの、ワクチンベクターとして現在既に開発中の既存のアデノウイルスベクターとは血清学的に異なるであろう。したがって、交差中和試験を、ＨＡｄＶ－４、ＨＡｄＶ－５、ＨＡｄＶ－２６、ＨＡｄＶ－３５及びＨＡｄＶ４９に基づく新規のＢＬＹ６アデノウイルスベクター及びいくつかの既存のベクター間で実施した。この目的のため、これらのアデノウイルスベクターの１つに対してそれぞれ産生されるマウス抗血清は、アデノウイルス中和アッセイにおいて各種ベクターの各々に対して試験された。このアッセイのために使用されるマウス抗血清は、マウス当たり１０10ベクター粒子によるそれらの免疫化の２週間又は８週間後にＢａｌｂ／Ｃマウスから回収された。アデノウイルス中和アッセイは、以前に記載されたとおりに行われた（Ｓｐａｎｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：５０４６－５０５２）。簡潔に述べると、１：１６の希釈度から始めて、血清を２倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、Ａ５４９細胞とともに（細胞当たり５００個のウイルス粒子の感染の多重度で）一晩インキュベートした。感染の２４時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の９０％の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた：＜１６（中和なし）、１６～２００、２００～２，０００、及び＞２，０００。結果は、試験されたベクターの間で大部分が交差中和を示さない（図３）。ベクターＢＬＹ６とＡｄ２６の間で見られたいくつかのわずかな、一方向の交差中和があっただけで、ＢＬＹ６抗血清は、１６．１２（すなわち、１６の検出下限値のすぐ上）のＡｄ２６に対して中和力価を表示し、Ａｄ２６抗血清は、ＢＬＹ６に対して中和力価を示さなかった。このように、新規のアデノウイルスベクターＢＬＹ６は、試験されたパネルに含まれるヒトアデノウイルスベクター、すなわち、Ａｄ２６、Ａｄ３５、Ａｄ４９、Ａｄ５及びＡｄ４と交差中和を示さないか、又は非常にわずかに示した。したがって、このベクターは、場合によっては、例えば、異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンの文脈において、或いは又はさらに、異なる疾患若しくは抗原に対する一連の２回以上の継続的なワクチン接種の文脈において、連続的な免疫化におけるこれらの又は他の異なるアデノウイルスベクターの１種以上と組み合わせて使用され得る。
実施例５：ヒト集団における新規のアデノウイルスベクターの血清有病率
有効なワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な使用のために重要なことは、本明細書に記載される新規のアデノウイルスベクターが、ワクチン標的集団における高レベルの既存の抗ベクター体液性免疫によって妨げられないことである。したがって、ＢＬＹ６ベクターは、米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）に居住する１８歳～５５歳までの成人に由来する２００名のヒトコホート血清試料内のそれらの血清有病率について評価された。ベクターは、実施例３において実行され且つ以前に記載されたとおりの標準的なアデノウイルス中和アッセイを実施することによって、ヒト血清試料による中和について試験された（Ｓｐａｎｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：５０４６－５０５２）。簡潔に述べると、１：１６の希釈度から始めて、血清を２倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、Ａ５４９細胞とともに（細胞当たり５００個のウイルス粒子の感染の多重度で）一晩インキュベートした。感染の２４時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の９０％の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた：＜１６（中和なし）、１６～３００、３００～１，０００、１，０００～４０００及び＞４０００。
有効なワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な使用のために重要なことは、本明細書に記載される新規のアデノウイルスベクターが、ワクチン標的集団における高レベルの既存の抗ベクター体液性免疫によって妨げられないことである。したがって、ＢＬＹ６ベクターは、米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）に居住する１８歳～５５歳までの成人に由来する２００名のヒトコホート血清試料内のそれらの血清有病率について評価された。ベクターは、実施例３において実行され且つ以前に記載されたとおりの標準的なアデノウイルス中和アッセイを実施することによって、ヒト血清試料による中和について試験された（Ｓｐａｎｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：５０４６－５０５２）。簡潔に述べると、１：１６の希釈度から始めて、血清を２倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、Ａ５４９細胞とともに（細胞当たり５００個のウイルス粒子の感染の多重度で）一晩インキュベートした。感染の２４時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の９０％の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた：＜１６（中和なし）、１６～３００、３００～１，０００、１，０００～４０００及び＞４０００。
結果は、ＢＬＹ６アデノウイルスベクターが、試験されたヒト対象において対照Ａｄ５ベクター及びベンチマークＡｄ２６及びＡｄ３５ベクターより著しく低い血清有病率を有することを示す（図４）。さらに、新規のＢＬＹ６ベクターに対して見られた陽性中和力価は一般に、非常に低く、概して３００より高くなかった。対照的に、Ａｄ２６及びＡｄ５に対して見られた陽性中和力価の大部分は、３００より高かった。
まとめると、上のデータは、ＢＬＹ６ベクターに対する既存の体液性抗ベクター免疫が、評価されたワクチン標的集団において低いと考えられ得ることを示し、これらのベクターがこれらの集団において有効なワクチンベクターとしての可能性を有することを示唆している。
実施例６：懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞中のアデノウイルスベクター生産性
臨床試験及びそれ以降に使用されるアデノウイルスベクターは、スケーラブルな無血清アデノウイルス生産プラットフォームで高力価まで容易に生産可能である必要がある。本明細書で懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はｓＰＥＲ．Ｃ６とも呼ばれる懸濁適応ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、バイオリアクターでのアデノウイルスベクターの大規模製造を支援し、高力価で臨床グレードのベクター製剤、例えば、ＨＡｄＶ－２６又はＨＡｄＶ－３５に基づくＥ１欠損ベクターを大量にもたらすことが示されているため、このようなプラットフォームとなる（欧州特許第２５３６８２９Ｂ１号明細書、欧州特許第２３５０２６８Ｂ１号明細書）。
臨床試験及びそれ以降に使用されるアデノウイルスベクターは、スケーラブルな無血清アデノウイルス生産プラットフォームで高力価まで容易に生産可能である必要がある。本明細書で懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はｓＰＥＲ．Ｃ６とも呼ばれる懸濁適応ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、バイオリアクターでのアデノウイルスベクターの大規模製造を支援し、高力価で臨床グレードのベクター製剤、例えば、ＨＡｄＶ－２６又はＨＡｄＶ－３５に基づくＥ１欠損ベクターを大量にもたらすことが示されているため、このようなプラットフォームとなる（欧州特許第２５３６８２９Ｂ１号明細書、欧州特許第２３５０２６８Ｂ１号明細書）。
本明細書に記載される新規のベクターが、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞に基づく生産プロセスに合うかどうかに関する最初の評価として、小規模のベクター生産性実験を、振盪フラスコ中で培養されたｓＰＥＲ．Ｃ６細胞に対して実施した。これらの生産性実験は、実施例１において記載される新規のＡｄベクターＢＬＹ６のＦｌｕｃコード化バージョンを用いて実行された。ベンチマーク対照として、ＨＡｄＶ－２６に基づくベクターＡｄ２６．Ｆｌｕｃを使用した。４ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を補充した１０ｍｌの総量のＰＥＲＭＥＸＣＩＳ（登録商標）培地（Ｌｏｎｚａから入手可能）中において１×１０6細胞／ｍｌの密度で振盪フラスコに播種された懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞培養物が、様々なウイルス粒子（ＶＰ）対細胞比率で各種ベクターにより感染され、４日間インキュベートされた。感染のために使用された様々なＶＰ対細胞比率は、７０、１５０及び９００であった。感染細胞培養物の試料を毎日採取し、ＶＰ力価を、これらの試料中においてＣＭＶプロモーター（試験された全てのベクターに存在する）に特異的なプライマー及びプローブを用いる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に基づくプロトコルによって決定した。このプロトコルでは、遊離のベクターＤＮＡ（すなわち、ウイルス粒子にパッケージされていないベクターゲノム）を除去するために、ｑＰＣＲの前に試験試料をＤＮＡ分解酵素処理する必要がある。
新規のベクターＢＬＹ６．Ｆｌｕｃについて得られた生産性の結果を図８に示す。ＢＬＹ６．Ｆｌｕｃは、全てのＶＰ対細胞感染比率及び試験された回収時点で、ベンチマーク対照ベクターＡｄ２６．Ｆｌｕｃよりも高いＶＰ力価を示した。これらの結果は、ｓＰＥＲ．Ｃ６に基づく無血清懸濁細胞培養物モデルに対して新規のベクターＢＬＹ６の良好な生産性を実証している。
まとめると、上で示されるとおりの本発明の新規のＢＬＹ６に基づく組換えアデノウイルスベクターによって誘導される体液性及び細胞性免疫応答の試験は、明らかにマウスにおけるこれらのベクターの強力な免疫原性を示す。加えて、これらのベクターは、特定の既存のアデノウイルスワクチンベクター候補（例えば、Ａｄ２６及びＡｄ３５）に対して交差中和抗体応答を誘導しないか、若しくはほとんど誘導しないことを実証した。さらに、新規のベクターは、ヒトにおいて低い血清有病率を示した。最後に、新規のベクターは、高い収量で容易に生産され得る。低い血清有病率、強力な免疫原性及び生産性の組合せは、本発明の新規のアデノウイルスベクターが、様々な病原体に対する新規のワクチンベクター候補として有用である可能性があり、且つさらに遺伝子治療及び／又は診断において有用性を有し得ることを示唆する。
上記の実施形態に対して、この広い発明概念から逸脱することなく変更を加えることができることが当業者に理解されるであろう。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、本明細書によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形形態を包含することが意図されることを理解されたい。
以下の態様を包含し得る。
［１］ 配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列。
［２］ 前記ヘキソンポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含む、上記［１］に記載の単離された核酸配列。
［３］ 前記ヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体が、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、上記［２］に記載の単離された核酸配列。
［４］ ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする核酸配列をさらに含む、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の単離された核酸配列。
［５］ 前記ファイバーポリペプチドが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列、（２）配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列、及び（３）配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列からなる群から選択される少なくとも１つを含み、好ましくは、前記ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体が、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、上記［４］に記載の単離された核酸配列。
［６］ （１）配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列；（２）配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列、及び（３）配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列からなる群から選択される少なくとも１つを含むファイバーポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
［７］ 前記ファイバーポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、上記［６］に記載の単離された核酸配列。
［８］ 上記［１］～［７］のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
［９］ アデノウイルスベクターであり、且つ導入遺伝子をさらに含む、上記［８］に記載のベクター。
［１０］ 前記アデノウイルスベクターがさらに、Ｅ１欠失及びＥ３欠失のうちの少なくとも１つを含む、上記［９］に記載のアデノウイルスベクター。
［１１］ 前記アデノウイルスベクターが、１種以上のヒトアデノウイルス核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターであり、好ましくは、前記ヒトアデノウイルス核酸配列が、ヒトアデノウイルス－４、ヒトアデノウイルス－５、ヒトアデノウイルス－２６、又はヒトアデノウイルス－３５のうちの少なくとも１つに由来する、上記［９］又は［１０］に記載のアデノウイルスベクター。
［１２］ 前記アデノウイルスベクターが、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択される核酸配列を含む、上記［９］～［１１］のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
［１３］ 上記［８］～［１２］のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え細胞。
［１４］ （ａ）上記［１３］に記載の組換え細胞を、前記ベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び
（ｂ）前記組換え細胞から前記ベクターを単離することを含む、
ベクターを作製する方法。
［１５］ 上記［９］～［１２］のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物。
［１６］ 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、上記［１５］に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
［１７］ 上記［９］～［１２］のいずれかに記載のアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、ワクチンを作製する方法。
以下の態様を包含し得る。
［１］ 配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列。
［２］ 前記ヘキソンポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含む、上記［１］に記載の単離された核酸配列。
［３］ 前記ヘキソンポリペプチド又はその機能的誘導体が、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、上記［２］に記載の単離された核酸配列。
［４］ ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体をコードする核酸配列をさらに含む、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の単離された核酸配列。
［５］ 前記ファイバーポリペプチドが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列、（２）配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列、及び（３）配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列からなる群から選択される少なくとも１つを含み、好ましくは、前記ファイバーポリペプチド又はその機能的誘導体が、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、上記［４］に記載の単離された核酸配列。
［６］ （１）配列番号１０のアミノ酸配列を含むファイバーノブポリペプチド配列；（２）配列番号１１のアミノ酸配列を含むファイバーシャフトポリペプチド配列、及び（３）配列番号１２のアミノ酸配列を含むファイバーテールポリペプチド配列からなる群から選択される少なくとも１つを含むファイバーポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
［７］ 前記ファイバーポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、上記［６］に記載の単離された核酸配列。
［８］ 上記［１］～［７］のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
［９］ アデノウイルスベクターであり、且つ導入遺伝子をさらに含む、上記［８］に記載のベクター。
［１０］ 前記アデノウイルスベクターがさらに、Ｅ１欠失及びＥ３欠失のうちの少なくとも１つを含む、上記［９］に記載のアデノウイルスベクター。
［１１］ 前記アデノウイルスベクターが、１種以上のヒトアデノウイルス核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターであり、好ましくは、前記ヒトアデノウイルス核酸配列が、ヒトアデノウイルス－４、ヒトアデノウイルス－５、ヒトアデノウイルス－２６、又はヒトアデノウイルス－３５のうちの少なくとも１つに由来する、上記［９］又は［１０］に記載のアデノウイルスベクター。
［１２］ 前記アデノウイルスベクターが、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択される核酸配列を含む、上記［９］～［１１］のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
［１３］ 上記［８］～［１２］のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え細胞。
［１４］ （ａ）上記［１３］に記載の組換え細胞を、前記ベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び
（ｂ）前記組換え細胞から前記ベクターを単離することを含む、
ベクターを作製する方法。
［１５］ 上記［９］～［１２］のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物。
［１６］ 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、上記［１５］に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
［１７］ 上記［９］～［１２］のいずれかに記載のアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、ワクチンを作製する方法。
Claims (8)
- 配列番号１３の核酸配列を含む、アデノウイルスベクター。
- 配列番号８の核酸配列を含む、アデノウイルスベクター。
- アデノウイルスベクターの導入遺伝子挿入部位に、導入遺伝子が挿入された、請求項１又は２に記載のアデノウイルスベクター。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え細胞。
- （ａ）請求項４に記載の組換え細胞を、前記ベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び
（ｂ）前記組換え細胞から前記ベクターを単離することを含む、
ベクターを作製する方法。 - 請求項１～３のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物。
- 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法で用いるための、請求項６に記載の免疫原性組成物であって、前記方法が、前記免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、免疫原性組成物。
- 請求項１～３のいずれかに記載のアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、ワクチンを作製する方法。
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