EA044813B1 - Аденовирус и его применения - Google Patents
Аденовирус и его применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA044813B1 EA044813B1 EA202091074 EA044813B1 EA 044813 B1 EA044813 B1 EA 044813B1 EA 202091074 EA202091074 EA 202091074 EA 044813 B1 EA044813 B1 EA 044813B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vector
- nucleic acid
- acid sequence
- seq
- adenovirus
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title description 58
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 245
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 109
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 108
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 106
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 71
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 35
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 33
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 31
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 31
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 29
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 241001135572 Human adenovirus E4 Species 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 241000205701 Human adenovirus 26 Species 0.000 claims description 6
- 241000701124 Human adenovirus 35 Species 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 29
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 9
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 101100165660 Alternaria brassicicola bsc6 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100499295 Bacillus subtilis (strain 168) disA gene Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100226894 Phomopsis amygdali PaGT gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 6
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000620147 Human mastadenovirus C Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- -1 devices Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101100113692 Caenorhabditis elegans clk-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000963438 Gaussia <copepod> Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000733802 Homo sapiens Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 208000009602 Human Adenovirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 101710155913 Major envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038611 Vitamin D-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011524 similarity measure Methods 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 108010063191 vitamin D-binding protein-macrophage activating factor Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Более конкретно, к области и применению, связанным с аденовирусными векторами, такими как дефектные по репликации аденовирусные векторы для доставки антигенов и индукции иммунного ответа у хозяев.
Предпосылки к созданию изобретения
Векторы на основе рекомбинантных аденовирусов широко используются в связанных с генной терапией областях применения и для вакцин. Было показано, что вакцины на основе вектора AdV-5 вызывают эффективные и защитные иммунные ответы в ряде различных животных моделей (см., например, WO 2001/02607; WO 2002/22080; Shiver et al., Nature 415:331 (2002); Letvin et al., Ann. Rev. Immunol. 20:73 (2002); Shiver and Emini, Ann. Rev. Med. 55:355 (2004)). Тем не менее, применимость вакцин на основе рекомбинантного вектора AdV-5, вероятно, будет ограничена высокой серопревалентностью AdV5-специфических нейтрализующих антител (NAb) в популяциях людей. В исследованиях на мышах, макаках-резусах и людях было показано, что существование иммунитета против AdV-5 существенно подавляет иммуногенность вакцин на основе AdV-5.
Одна перспективная стратегия, позволяющая обойти наличие предсуществующего иммунитета у индивидуумов, ранее инфицированных или получавших лечение наиболее распространенным аденовирусом человека, например AdV-5, предусматривает разработку рекомбинантных векторов на основе серотипов аденовирусов, которые не подвергаются воздействию таких предсуществующих механизмов иммунной защиты. Одна из таких стратегий основана на применении аденовирусов обезьянообразных, поскольку они, как правило, не инфицируют людей и характеризуются низкой серопревалентностью в образцах от человека. Аденовирусы обезьянообразных пригодны для применения в отношении людей, поскольку было показано, что эти вирусы могут инфицировать клетки человека in vitro (WO 2003/000283; WO 2004/037189).
Таким образом, в данной области техники существует потребность в альтернативных аденовирусных векторах, которые можно получать в больших количествах, которые не сталкиваются с предсуществующими механизмами иммунной защиты у хозяина, но которые тем не менее характеризуются иммуногенностью и способностью индуцировать сильный иммунный ответ на антигены, кодируемые гетерологичными нуклеиновыми кислотами, вставленными в вектор.
Краткое описание изобретения
Были выделены новые аденовирусы человекообразных обезьян, которые филогенетически принадлежат той же группе, что и аденовирус человека вида С. Для удовлетворения нереализованной потребности были разработаны аденовирусные векторы, содержащие новые последовательности нуклеиновой кислоты новых изолятов аденовирусов человекообразных обезьян. Изобретение относится к последовательностям выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды гексона новых изолятов аденовирусов человекообразных обезьян. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона включает полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона и характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).
Также изобретение относится к последовательностям выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид фибры из новых изолятов аденовирусов человекообразных обезьян. В некоторых вариантах осуществления полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
Варианты осуществления настоящего изобретения также относятся к выделенным полипептидам фибры и гексона, кодируемым последовательностями нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Дополнительно настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов гексона, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов фибры. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к векторам, содержащим описанные в настоящем изобретении выделенные нуклеиновые кислоты. В одном варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии. В одном предпочтительном варианте осуществления вектор представляет собой аденовирусный вектор. Более предпочтительно, вектор дополнительно содержит по меньшей мере один трансген.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам, содержащим описанные в настоящем изобретении векторы. Такие клетки можно использовать для получения рекомбинантного белка, экспрессии рекомбинантного белка или получения векторов или вирусных частиц. Настоящее изобретение также относится к способам получения вектора. Способы включают (а) выращивание раскрытой в настоящем изобретении рекомбинантной клетки в условиях, обеспечивающих продуцирование вектора; и (b) выделение вектора из рекомбинантной клетки.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим раскрытые в настоящем изобретении векторы. Также изобретение относится к способам ин- 1 044813 дукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающим введение субъекту раскрытых в настоящем изобретении иммуногенных композиций.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к аденовирусным векторам, содержащим (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Полипептид гексона может, например, включать полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5).
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к аденовирусным векторам, содержащим (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3). Варианты осуществления настоящего изобретения также относятся к аденовирусным векторам, содержащим (а) по меньшей мере один трансген; (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения; и (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления аденовирусные векторы, представленные в настоящем изобретении, представляют собой дефектные по репликации аденовирусные векторы (rAd). В одном варианте осуществления аденовирусные векторы могут включать делецию Е1. В некоторых вариантах осуществления представленные в настоящем изобретении аденовирусные векторы могут дополнительно включать делецию E3. Аденовирусные векторы могут являться векторами на основе аденовирусов обезьян, содержащими последовательности аденовирусной нуклеиновой кислоты от одного или нескольких аденовирусов обезьян (SAdV), таких как аденовирусы шимпанзе (например, ChAd3); аденовирусы гориллы или аденовирусы макака-резуса (например, rhAd51, rhAd52 или rhAd53). Аденовирусные векторы могут представлять собой векторы на основе аденовируса человека, содержащие аденовирусные последовательности от одного или нескольких аденовирусов человека (например, hAdV-4, hAdV-5, hAdV-26, hAdV-35). Предпочтительно аденовирусный вектор представляет собой химерный аденовирусный вектор, содержащий одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека. Последовательности нуклеиновой кислоты аденовируса человека могут, например, происходить от аденовируса-4 человека (hAdV-4), аденовируса-5 человека (hAdV-5), аденовируса-26 человека (hAdV-26) или аденовируса-35 человека (hAdV-35). Аденовирусные векторы могут, например, содержать orf6 и orf 6/7 Е4 аденовируса-5 человека (hAdV-5).
В некоторых вариантах осуществления трансген прилегает к инвертированному концевому повтору (ITR). В некоторых вариантах осуществления трансген расположен в области делеции E1 или прилегает к ней, в области делеции E3 или прилегает к ней и/или в области правого ITR или прилегает к нему (rITR).
В некоторых вариантах осуществления аденовирусные векторы, представленные в настоящем изобретении, содержат последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
Также изобретение относится к иммуногенным композициям или вакцинам, содержащим описанные в настоящем изобретении аденовирусные векторы и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительно настоящее изобретение относится к способам индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Способы включают введение субъекту раскрытых в настоящем изобретении вакцин. Дополнительно настоящее изобретение относится к способам получения вакцины. Способы включают объединение раскрытого в настоящем изобретении аденовирусного вектора с фармацевтически приемлемым носителем.
Краткое описание графических материалов
Вышеизложенное краткое описание, а также нижеследующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения будут более понятны при их рассмотрении в сочетании с прилагаемыми графическими материалами. Следует понимать, однако, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, показанными на графических материалах.
На фиг. 1 показаны клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные BZ1/BZ28.FLuc. На фиг. 1А показана схема эксперимента. На фиг. 1В показан клеточный иммунный ответ, индуцированный Ad26.FLuc и BZ1/BZ28.FLuc, развившийся против кодируемой вектором вставки (т. е. FLuc, люциферазы светлячка) спустя 2 недели после иммунизации, как определено с помощью анализа ELISPOT с применением интерферона гамма (TFN-γ). На фиг. 1С показан график титров FLuc-специфических антител IgG, индуцированных у мышей, спустя 2 недели после иммунизации посредством Ad26.FLuc, BZ1/BZ28.Fluc и пустым вектором Ad26.
- 2 044813
На фиг. 2 показаны титры нейтрализации гомологичных и гетерологичных аденовирусов, индуцированные у мышей, иммунизированных аденовирусными векторами Ad35, Ad26, Ad5, Ad4 и BZ1/BZ28.
На фиг. 3 показана серопревалентность для Ad26 и BZ1/BZ28 в образцах сыворотки крови, полученных от группы из 200 взрослых человек в возрасте от 18 до 55 лет, проживающих в Соединенных Штатах (США) и Европейском союзе (ЕС). Титры нейтрализации, измеренные в данных образцах сыворотки крови для каждого вектора, были разделены на четыре категории (<16 (нейтрализация отсутствовала), от 16 до 300, от 300 до 1000, от 1000 до 4000 и >4000), представленные в указанных диаграммах.
На фиг. 4 показана схема плазмиды pBZ1_BZ28F.
На фиг. 5 показана схема плазмиды pBZ1_BZ28F.5IXP.
На фиг. 6 показана продуктивность в отношении нового вектора BZ1/BZ28.Fluc в линии клетокпродуцентов SPER.C6.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере отчасти, на выделении и идентификации новых серотипов аденовирусов человекообразных обезьян, отнесенных к аденовирусам человека вида Е, а также на создании и оценке вакцинных векторов, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области полипептидов гексона и фибры аденовируса человекообразных обезьян. Настоящее изобретение дополнительно основано, по меньшей мере отчасти, на создании химерных аденовирусных векторов, содержащих остов аденовируса гориллы и последовательность гексона аденовируса шимпанзе. Аденовирусные векторы способны вызывать иммунный ответ и, кроме того, имеют низкую серопревалентность у людей. Аденовирусные векторы можно составлять для получения вакцин и использовать для индукции защитного иммунитета против конкретных представляющих интерес антигенов.
Различные публикации, статьи и патенты цитируются или описываются в разделе Предпосылки изобретения и на протяжении всего описания; при этом каждый из этих литературных источников включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий и т. п., которое было включено в настоящее описание, предназначено для обеспечения контекста настоящего изобретения. Такое обсуждение не является признанием того, что любые или все из этих материалов являются частью предшествующего уровня техники относительно любых раскрытых или заявленных изобретений.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В иных случаях определенные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют значения, изложенные в описании.
Следует отметить, что используемые в настоящем изобретении и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
Если не указано иное, любые числовые значения, такие как концентрация или диапазон концентраций, описанные в настоящем изобретении, во всех случаях следует понимать как модифицированные термином приблизительно. Таким образом, числовое значение обычно включает ±10% от указанного значения. Например, концентрация 1 мг/мл включает в себя все значения в диапазоне от 0,9 до 1,1 мг/мл. Таким же образом диапазон концентраций от 1 до 10% (вес/об.) включает в себя диапазон от 0,9% (вес/об.) до 11% (вес/об.). В данном контексте использование числового диапазона однозначно включает в себя все возможные поддиапазоны, все отдельные численные значения в этом диапазоне, включая целые числа в таких диапазонах и дробные значения, если контекст явно не указано иное.
Если не указано иное, термин по меньшей мере, предшествующий серии элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в серии.
Специалистам в данной области будет известно, или же они смогут установить с помощью постановки стандартного эксперимента многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления описанного в настоящем изобретении настоящего изобретения. Такие эквиваленты подразумеваются как охватываемые настоящим изобретением.
В данном контексте подразумевается, что термины предусматривает, предусматривающий, включает, включающий, имеет, имеющий, содержит, содержащий или любые другие их вариации означают, что они охватывают указанное целое число или группу целых чисел, но не исключают любые другие целые числа или группу целых чисел, и подразумевается, что они являются неисключающими или неограничивающими. Например, композиция, смесь, процесс, способ, изделие или устройство, содержащие перечень элементов не обязательно ограничиваются только этими элементами, но могут включать другие элементы, явно не указанные или являющиеся неотъемлемой частью такой композиции, смеси, процесса, способа, изделия или устройства. Кроме того, если явно не указано иное, или относится к включающему или, а не исключающему или. Например, условию А или В отвечает любое из следующего: А истинно (или в наличии) и В ложно (или отсутствует), А ложно (или отсутствует) и В истинно (или в наличии), и оба А и В истинны (или в наличии).
Используемый в настоящем изобретении связующий термин и/или между несколькими перечисленными элементами понимают как охватывающий как индивидуальные, так и объединенные варианты.
- 3 044813
Например, когда два элемента соединены и/или, первый вариант относится к применимости первого элемента без второго. Второй вариант относится к применимости второго элемента без первого. Третий вариант относится к применимости первого и второго элементов совместно. Любой из этих вариантов понимают как подпадающий под данное значение и, следовательно, удовлетворяющий требованию применяемого в настоящем изобретении термина и/или. Понятно, что одновременную применимость более чем одного из вариантов понимают как подпадающую под данное значение и, следовательно, удовлетворяющий требованию термина и/или.
Применяемый в данном контексте термин состоит из или варианты, такие как состоят из или состоящий(ие) из, используемые во всем описании или формуле изобретения, указывают на включение любого из приведенных целых чисел или группы целых чисел, но при этом дополнительное целое число или группа целых чисел не могут быть добавлены к указанному способу, структуре или композиции.
Применяемый в данном контексте термин по сути состоит из или варианты, такие как по сути состоят из или по сути состоящий(ие) из, используемые во всем описании или формуле изобретения, указывают на включение любого из приведенных целых чисел или группы целых чисел и необязательное включение любых приведенных целого числа или группы целых чисел, которые существенным образом не меняют основные или новые признаки указанного способа, структуры или композиции. См. М.Р.Е.Р. § 2111.03.
В данном контексте субъект означает любое животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человека, которого будут вакцинировать или которое было вакцинировано согласно способу в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В данном контексте термин млекопитающее охватывает любое млекопитающее. Примеры млекопитающих включают без ограничения коров, лошадей, овец, свиней, кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, обезьян, людей и т. д., более предпочтительно человека.
Слова правый, левый, нижний и верхний обозначают направления на графических материалах, на которые делается ссылка.
Термины приблизительно, примерно, как правило, по сути и подобные им, используемые в данном контексте в отношении размера или свойства компонента предпочтительного изобретения, следует рассматривать как указывающие на то, что описываемый размер/свойство не представляет собой строго установленное ограничение или параметр и не исключает небольшие отклонения от него, которые функционально являются идентичными или сходными, как это будет понятно специалисту в данной области техники. Как минимум, ссылки на такие числовые параметры будут включать вариации, которые при использовании математических и промышленных принципов, принятых в области техники (например, округление, ошибки измерения или другие систематические ошибки, допуски при производстве и т.п.), не будут изменять последнюю значащую цифру.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептида (например, полипептидов гексона и фибры и полинуклеотидов, которые их кодируют) относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, что измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального изучения.
При сравнении последовательностей обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонные последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты подпоследовательностей, и задают программные параметры алгоритма сравнения последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для тестируемой(тестируемых) последовательности(последовательностей) относительно эталонной последовательности на основе заданных параметров программы.
Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиска сходства по Пирсону-Липману, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном комплексе Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Сайенс-Драйв 575, Мэдисон, Висконсин) или с помощью визуального изучения (см., в целом, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).
Примерами алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является общедоступным
- 4 044813 посредством Национального центра биотехнологической информации. Данный алгоритм предусматривает первоначальную идентификацию пар последовательностей с высоким показателем сходства (HSP) путем идентификации коротких слов с длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой положительной пороговой оценке Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т называют порогом показателя сходства соседних слов (Altschul et al. выше). Данные начальные совпадения соседних слов выполняют роль затравок для начала поисков с целью выявления более длинных HSP, которые их содержат. Совпадения слов затем продлевают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько можно увеличить совокупный показатель выравнивания.
В случае нуклеотидных последовательностей совокупные оценки рассчитывают с помощью параметров М (вознаграждение за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штраф за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей для расчета совокупной оценки применяют матрицу замен. Продление совпадений слов в каждом направлении останавливают, когда совокупная оценка выравнивания уменьшается на величину X от ее максимального достигнутого значения; совокупная оценка падает до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательной оценкой; или достигнут конец любой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используют длину слова (W), равную 11, ожидаемое значение (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP применяют в качестве значений по умолчанию длину слова (W), равную 3, ожидаемое значение (Е), равное 10, и матрицу сравнения BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
Помимо расчета процента идентичности последовательностей алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Одним из показателей сходства, который выдается алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая указывает на вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно. Например, нуклеиновая кислота считается схожей с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,1, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.
Дополнительным признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидные последовательности являются по сути идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно реактивным с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид обычно по сути идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются практически идентичными, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже.
В данном контексте термин защитный иммунитет или защитный иммунный ответ означает, что вакцинированный субъект в состоянии контролировать инфекцию, вызываемую патогенным возбудителем, в отношении которого была проведена вакцинация. Патогенный агент может, например, представлять собой антигенный продукт гена или антигенный белок или их фрагмент. Обычно у субъекта, у которого выработался защитный иммунный ответ, развиваются клинические симптомы только от легкой до умеренной степени тяжести или симптомы вовсе не развиваются. Обычно субъект, имеющий защитный иммунный ответ на определенного возбудителя или защитный иммунитет к нему, не погибает в результате инфицирования указанным возбудителем.
Термин адъювант определяется как одно или несколько веществ, которые обуславливают стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на аденовирусные векторы по настоящему изобретению.
В данном контексте термин антигенный продукт гена или его фрагмент или антигенный белок может включать бактериальный, вирусный, паразитарный или грибковый белок или его фрагмент. Антигенный белок или антигенный продукт гена предпочтительно способен обуславливать в организме хозяина защитный иммунный ответ, например, индуцировать иммунный ответ на заболевание или инфекцию (например, бактериальное, вирусное, паразитическое или грибковое заболевание или инфекцию) и/или обеспечивать выработку у субъекта иммунитета к заболеванию или инфекции (т. е. вакцинации), который защищает субъекта от заболевания или инфекции.
Аденовирусные векторы.
Воздействие определенных аденовирусов приводит к выработке иммунных ответов на определенные аденовирусные серотипы, что может влиять на эффективность аденовирусных векторов. Поскольку инфекции, вызванные аденовирусами человека, распространены у людей, распространенность нейтрализующих антител к аденовирусам человека в популяциях людей является высокой. Можно ожидать, что
- 5 044813 наличие таких нейтрализующих антител у индивидуумов снизит эффективность переносящего ген вектора, в основе которого лежит остов аденовируса человека. Одним из способов преодоления снижения эффективности является замена эпитопов на аденовирусных капсидных белках, которые являются мишенями для нейтрализующих антител. Целевые последовательности на капсидных белках можно заменить белковыми последовательностями из других аденовирусов, которые имеют низкую распространенность и, следовательно, против которых нейтрализующие антитела редко встречаются в популяциях людей.
Капсидный белок относится к белку на капсиде аденовируса (например, BZ1, BZ28, HAdV-4) или его функциональному фрагменту или производному, который задействуют при определении серотипа и/или тропизма конкретного аденовируса. К капсидным белкам, как правило, относятся белки фибры, пентона и/или гексона. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок представляет собой весь или полноразмерный капсидный белок аденовируса. В других вариантах осуществления капсидный белок представляет собой фрагмент или производное полноразмерного капсидного белка аденовируса. В некоторых вариантах осуществления гексон, пентон и фибра, кодируемые аденовирусным вектором по настоящему изобретению, происходят от одного и того же или различных аденовирусов (т. е. гексон BZ1 и фибра BZ28, гексон BZ1 и фибра BZ1, гексон BZ28 и фибра BZ1, гексон BZ28 и фибра BZ28 и т.д.).
Полипептид гексона относится к гексоновым белкам оболочки аденовируса, их функциональным фрагментам и производным.
Полипептид фибры относится к белкам фибры аденовируса, их функциональным фрагментам и производным.
Одной из мишеней нейтрализующих антител к аденовирусам является основной белок оболочки, белок гексона. Замена белка гексона на белок гексона из редких аденовирусов, более предпочтительно замена вариабельных последовательностей в белке гексона, которые определяют серотип и которые связываются с нейтрализующими антителами, такими как выделенные из описанных в настоящем изобретении аденовирусов обезьянообразных, может позволить сконструировать аденовирусные векторы, которые были бы менее восприимчивы к нейтрализации антителами, обычно встречающимися у людей.
Второй мишенью нейтрализующих антител к аденовирусам является белок фибры. Замена белка фибры на последовательности фибры из редких аденовирусов, которые происходят от отличного от человека животного, более предпочтительно замена вариабельных последовательностей в белке фибры, такими как выделенные из описанных в настоящем изобретении аденовирусов обезьянообразных, также может позволять конструировать аденовирусные векторы, которые были бы менее восприимчивы к нейтрализации антителами, обычно встречающимися у людей. Сочетание описанных выше замен фибр с заменами гексонов может придать дополнительную устойчивость к нейтрализации антителами, обычно присутствующими в популяциях людей.
Настоящим изобретением предусмотрены последовательности выделенных нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды гексона и/или фибры, полученные из выделенных серотипов аденовируса обезьян, и аденовирусные векторы, содержащие по меньшей мере одну из последовательностей выделенных нуклеиновых кислот.
Аденовирусный вектор относится к рекомбинантному вектору, полученному по меньшей мере из части аденовирусного генома или содержащему такую часть аденовирусного генома.
В предпочтительных вариантах осуществления последовательности выделенной нуклеиновой кислоты кодируют полипептиды гексона, предусматривающие полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5).
В предпочтительных вариантах осуществления последовательности выделенных нуклеиновых кислот кодируют полипептиды фибры. Полипептид фибры может, например, содержать аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
В предпочтительных вариантах осуществления предусмотрена выделенная нуклеиновая кислота, предусматривающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов гексона, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов фибры.
В предпочтительных вариантах осуществления предусмотрены векторы, предпочтительно аденовирусные векторы, содержащие по меньшей мере одну из последовательности выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид гексона, и/или последовательности выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фибры, согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Аденовирусные векторы могут, например, предусматривать полипептид гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептид гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5). Аденовирусные векторы могут, например, предусматривать полипептид фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептид фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид
- 6 044813 гексона, где полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5); и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид фибры, где полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3). Аденовирусные векторы могут, например, содержать по меньшей мере один трансген и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона и/или полипептид фибры, при этом полипептид гексона предусматривает раскрытые в настоящем изобретении полипептиды, охватывающие гипервариабельные области гексона, а полипептид фибры предусматривает описанные в настоящем изобретении полипептиды фибры.
Как правило, аденовирусный вектор по настоящему изобретению содержит весь геном рекомбинантного аденовируса, например, в плазмидном, космидном или бакуловирусном векторе. Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть представлены в виде РНК или в виде ДНК, полученных путем клонирования или изготовленных синтетическим путем. ДНК может быть двухнитевой или однонитевой.
Специалист в данной области техники поймет, что элементы, полученные из нескольких серотипов, можно объединить в одном аденовирусном векторе, например, на основе аденовируса человека или обезьян. Таким образом, можно получить химерный аденовирусный вектор, в котором сочетаются требуемые свойства от различных серотипов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления химерный аденовирусный вектор по настоящему изобретению может сочетать отсутствие предсуществующего иммунитета к полипептидным последовательностям гексона и/или фибры аденовируса обезьян с высоким уровнем доставки антигена и презентирующей способности существующих аденовирусных векторов, таких как rAd4, rAd5, rAd26 или rAd35.
Преимущества аденовирусных векторов при применении в качестве вакцин включают легкость использования, хорошую технологичность производства в широком масштабе и превосходные показатели безопасности, основанные на многолетнем опыте исследований, разработки, производства и клинических испытаний с многочисленными аденовирусными векторами, о которых сообщалось. Аденовирусные векторы, которые применяют в качестве вакцин, как правило, обеспечивают хороший иммунный ответ на белок, кодируемый трансгеном, в том числе клеточный иммунный ответ. Аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть основан на любом типе аденовируса и в некоторых вариантах осуществления основан на аденовирусе человека, который может принадлежать к любой группе или любому серотипу. В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе человека из группы А, В, С, D, E, F или G. В других предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе человека серотипа 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 или 50. В других вариантах осуществления он представляет собой аденовирус обезьян, такой как аденовирус шимпанзе или гориллы, который может принадлежать любому серотипу. В некоторых вариантах осуществления данный рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе шимпанзе типа 1, 3, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 67 или SA7P.
В более предпочтительном варианте осуществления вектор на основе аденовируса шимпанзе из второй композиции представляет собой ChAdV3. Рекомбинантный аденовирус шимпанзе серотипа 3 (ChAd3 или cAd3) представляет собой аденовирус подгруппы С со свойствами, сходными со свойствами аденовируса человека серотипа 5 (Ad5). В исследованиях на людях, в которых оценивали кандидатные вакцины к вирусу гепатита С (HCV), было показано, что ChAd3 является безопасным и иммуногенным (Barnes E, et al., 2012 Science translational medicine 4: 115ral). Сообщалось, что вакцины на основе ChAd3 были способны индуцировать иммунный ответ, сравнимый с вакциной, предусматривающей вектор на основе Ad5 человека. См., например, Peruzzi D, et al., 2009 Vaccine 27: 1293-300 и Quinn KM, et al. 2013 J Immunol 190: 2720-35; WO 2005/071093; WO 2011/0130627 и т.д.
Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в патентах США №№ 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913 и Thomas Shenk, Adenoviridae and their Replication, M. S. Horwitz, Adenoviruses, главы 67 и 68 соответственно в Virology, В. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), а также других источниках, упомянутых в настоящем изобретении. Как правило, конструирование аденовирусных векторов предусматривает использование стандартных молекулярно-биологических методик, таких как описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), а также других источниках, упомянутых в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор предусматривает делецию Е1 и/или делецию Е3. Делеция Е1 или E3 может, например, предусматривать полную делецию гена или частичную делецию, что делает продукт гена Е1 или E3 функционально дефектным. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аденовирус является дефектным по репликации, например, потому что он
- 7 044813 предусматривает делецию в участке Е1 генома. Как известно специалисту, в случае делеций существенно важных участков в геноме аденовируса функциональные элементы, кодируемые этими участками, должны быть обеспечены в транс-положении, предпочтительно клеткой-продуцентом, т. е. если части или целые участки E1, E2 и/или Е4 удалены из аденовируса, то они должны присутствовать в клеткепродуценте, например, быть встроенными в ее геном или находиться в виде так называемого вспомогательного аденовируса или вспомогательных плазмид. Аденовирус также может предусматривать делецию в участке E3, который не является существенным для репликации, и, следовательно, такую делецию не следует компенсировать. Одну или несколько областей Е1, Е2, E3 и Е4 также можно инактивировать другими способами, такими как вставка представляющего интерес трансгена (обычно связанного с промотором) в подлежащие инактивации области.
Клетка-продуцент (также иногда называемая в уровне техники и в настоящем изобретении как 'пакующая клетка' или 'дополняющая клетка'), которую можно использовать, может представлять собой любую клетку-продуцент, в которой требуемый аденовирус может быть размножен. Например, размножение векторов на основе рекомбинантного аденовируса проводят в клетках-продуцентах, которые компенсируют дефекты в аденовирусе. Предпочтительно такие клетки-продуценты содержат в своем геноме по меньшей мере последовательность Е1 аденовируса, и таким образом они способны к компенсированию дефектов рекомбинантных аденовирусов с делецией в участке Е1. Можно использовать любую Е1дополняющую клетку-продуцент, такую как клетки сетчатки глаза человека, иммортализированные с использованием Е1, например клетки 911 или PER.C6 (см. патент США № 5994128), Е1трансформированные амниоциты (см. патент EP № 1230354), Е1-трансформированные клетки А549 (см., например, WO 98/39411, патент США № 5891690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Hum Gene Ther 11: 21319), 293 и т. п. В некоторых вариантах осуществления клетками-продуцентами являются, например, клетки НЕК293, или клетки PER.C6, или клетки 911, или клетки IT293SF и т. п. Продуцирование аденовирусных векторов в клетках-продуцентах описано в (Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681-703).
В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор представляет собой химерный аденовирусный вектор, содержащий одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека. Нуклеиновые кислоты аденовируса человека могут, например, быть выбраны из аденовируса-4 человека (Ad-4), аденовируса-5 человека (Ad-5), аденовируса-26 человека (Ad-26) или аденовируса-35 человека (Ad-35). В некоторых вариантах осуществления дефектный по Е1 аденовирусный вектор содержит кодирующую последовательность E4-orf6 из аденовируса Ad5 человека. Это обеспечивает возможность размножения таких аденовирусов в хорошо известных дополняющих линиях клеток, которые экспрессируют гены Е1 из Ad5, таких как, например, клетки 293 или клетки PER.C6 (см., например, Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-17, Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467, включенные в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит трансген. Трансген относится к гетерологичной нуклеиновой кислоте, которая представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в норме отсутствует в векторе, и согласно настоящему изобретению трансген может кодировать антигенный продукт гена или антигенный белок, который вызывает иммунный ответ у субъекта. Например, трансген можно вводить в вектор посредством стандартных методик молекулярной биологии. Трансген можно, например, клонировать в делетированные области Е1 или E3 аденовирусного вектора или в область между областью Е4 и rITR. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. В предпочтительных вариантах осуществления трансген вставлен в сайт вставки трансгена.
При необходимости последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гексон или фибру в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, и/или трансген, можно подвергать оптимизации в отношении кодонов для обеспечения надлежащей экспрессии у подвергаемого обработке хозяина (например, у человека). Оптимизация кодонов представляет собой технологию, широко применяемую в данной области техники.
Трансген может находиться под контролем происходящего из аденовируса промотора (т. е. быть функционально связан с ним) (например, главного позднего промотора) или может находиться под контролем гетерологичного промотора. Примеры подходящих гетерологичных промоторов включают промотор CMV и промотор RSV. Промотор предпочтительно расположен выше представляющего интерес гена в кассете экспрессии.
В предпочтительных вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
Иммуногенные композиции.
Иммуногенные композиции представляют собой композиции, содержащие иммунологически эффективное количество очищенных или частично очищенных векторов на основе аденовируса человека или обезьяны (например, гориллы) для применения в настоящем изобретении. Указанные композиции можно составлять в виде вакцины (также называемой в настоящем изобретении иммуногенной композицией) согласно способам, хорошо известным из уровня техники. Такие композиции могут включать адъюванты для усиления иммунных реакций. Оптимальные доли каждого компонента в составе можно
- 8 044813 определить с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области в свете настоящего изобретения.
Иммуногенные композиции в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения можно получать с помощью известных специалистам в данной области техники способов, принимая во внимание настоящее изобретение. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, вазелин, масла животного или растительного происхождения, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или другого сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.
Иммуногенные композиции, применяемые в настоящем изобретении, могут содержать адъюванты. Адъюванты, подходящие для совместного введения в соответствии с настоящим изобретением, должны быть потенциально безопасными, хорошо переносимыми и эффективными для людей, включая QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, AS01, AS03, AS04, AS 15, GcMAF, В-алетин, МРС-026, Adjuvax, CpG ODN, бетафектин, квасцы и MF59.
К другим адъювантам, которые можно вводить, относятся лектины, факторы роста, цитокины и лимфокины, такие как альфа-интерферон, гамма-интерферон, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (gCSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (gMCSF), фактор некроза опухоли (TNF), эпидермальный фактор роста (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и IL-12 или кодирующие их нуклеиновые кислоты.
Композиции по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны препятствовать эффективности активного ингредиента. Конкретная природа носителя или другого материала может зависеть от пути введения, например, внутримышечного, подкожного, перорального, внутривенного, кожного, внутрислизистого (например, в кишечнике), интраназального или внутрибрюшинного путей.
Способ индукции защитного иммунитета.
Другой общий аспект настоящего изобретения относится к способу индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Способы могут, например, предусматривать введение субъекту вакцины, содержащей описанный в настоящем изобретении аденовирусный вектор и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящим изобретением также предусмотрены способы получения вакцины. Способы предусматривают объединение описанного в настоящем изобретении аденовирусного вектора с фармацевтически приемлемым носителем.
В способах по настоящему изобретению в качестве вакцины можно использовать любую из иммуногенных композиций в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, включая без ограничения описанные в настоящем изобретении.
Введение иммуногенных композиций/вакцин, содержащих векторы, обычно осуществляют внутримышечно или подкожно. Тем не менее, также могут быть предусмотрены другие способы введения, такие как внутривенный, кожный, внутрикожный или назальный и т.д. Внутримышечное введение иммуногенных композиций можно осуществлять с помощью иглы для инъекции суспензии аденовирусного вектора. Альтернативой является применение безыгольного инъекционного устройства для введения композиции (с использованием, например, Biojector™) или лиофилизированного порошка, содержащего вакцину.
В случае внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в участок поражения вектор будет представлен в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и характеризуется подходящим значением pH, изотоничностью и стабильностью. Специалисты в данной области техники вполне способны получить подходящие растворы с применением, например, изотонических сред-носителей, таких как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости можно включать консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Также можно использовать состав с замедленным высвобождением.
Как правило, введение будет предназначено для профилактики с целью выработки иммунного ответа к представляющему интерес антигену (например, бактериального, вирусного, паразитарного и/или грибкового патогена) до инфицирования или развития симптомов. К заболеваниям и нарушениям, которые можно лечить или предупреждать в соответствии с настоящим изобретением, относятся таковые, при которых иммунный ответ может играть защитную или терапевтическую роль. В других вариантах осуществления аденовирусные векторы можно вводить для постконтактной профилактики.
Иммуногенные композиции, содержащие векторы на основе аденовируса человека или обезьяны (например, гориллы), вводят субъекту, вызывая иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта. Количество композиции, достаточное для индукции выявляемого иммунного ответа, определяют как иммунологически эффективную дозу или эффективное количество композиции. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. В типичном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой защитный
- 9 044813 иммунный ответ.
Фактическое вводимое количество, а также частота и продолжительность введения будут зависеть от природы и тяжести подлежащего лечению явления. Назначение лечения, например, принятие решений относительно дозировки и т.д., находится в пределах сферы ответственности врачей общей практики и других врачей или ветеринара в случае ветеринарной практики, и при этом, как правило, учитываются подлежащее лечению нарушение, состояние отдельного пациента, участок доставки, способ введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Примеры методик и протоколов, упоминаемых выше, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980.
После получения аденовирусных векторов и необязательного составления таких частиц в виде композиций векторы можно вводить индивидууму, в частности человеку или другому примату. Введение можно осуществлять людям или другому млекопитающему, например, мыши, крысе, хомяку, морской свинке, кролику, овце, козе, свинье, лошади, корове, ослу, мартышке, собаке или кошке. Доставка отличному от человека млекопитающему не обязательно может предназначаться для терапевтической цели, а может предназначаться для применения в рамках эксперимента, например, при изучении механизмов иммунных ответов на аденовирусные векторы.
В одном иллюстративном режиме аденовирусный вектор вводят (например, внутримышечно) в объеме от приблизительно 100 мкл до приблизительно 10 мл, содержащем концентрации от приблизительно 104 до 1012 вирусных частиц/мл. Предпочтительно аденовирусный вектор вводят в объеме от 0,1 до 2,0 мл. Например, аденовирусный вектор можно вводить в объеме 100 мкл, 500 мкл, 1 мл, 2 мл. Более предпочтительно, аденовирусный вектор вводят в объеме 0,5 мл. Необязательно, аденовирусный вектор можно вводить в концентрации приблизительно 107, 108, 109, 1010 в. ч/мл, 5х1010 в. ч/мл, 1011 или 1012 в. ч/мл. Как правило, аденовирусный вектор вводят в количестве от приблизительно 109 до приблизительно 1012 вирусных частиц (в. ч.) субъекту-человеку за одно введение, более типично в количестве от приблизительно 1010 до приблизительно 1012 в. ч.
После начальной вакцинации может идти бустерная или вторичная инъекция вакцины/композиции, содержащей тот же аденовирусный вектор, кодирующий представляющий интерес антиген, или вакцины/композиции, содержащей другой аденовирусный вектор, кодирующий тот же представляющий интерес антиген.
Композиция может, при необходимости, быть представлена в наборе, упаковке или дозаторе, который может содержать одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Набор, например, может предусматривать металлическую фольгу или полимерную пленку, как например блистерная упаковка. Набор, упаковка или дозатор могут сопровождаться инструкциями по введению.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими средствами лечения либо одновременно, либо последовательно в зависимости от подлежащего лечению состояния.
Варианты осуществления
Настоящим изобретением также предусмотрены следующие неограничивающие варианты осуществления.
Вариант осуществления 1 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.
Вариант осуществления 2 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 1, при этом полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).
Вариант 3 осуществления представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 1 или 2, дополнительно содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры.
Вариант осуществления 4 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 3, при этом полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 5 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры, содержащий аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 6 представляет собой вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 1-5.
Вариант осуществления 7 представляет собой вектор по варианту осуществления 6, представляющий собой аденовирусный вектор и дополнительно содержащий по меньшей мере один трансген.
Вариант осуществления 8 представляет собой рекомбинантную клетку, содержащую вектор по варианту осуществления 6 или 7.
Вариант осуществления 9 представляет собой способ получения вектора, включающий (а) выращи- 10 044813 вание рекомбинантной клетки по варианту осуществления 8 в условиях, обеспечивающих продуцирование вектора; и (b) выделение вектора из рекомбинантной клетки.
Вариант осуществления 10 представляет собой иммуногенную композицию, содержащую вектор по варианту осуществления 7.
Вариант осуществления 11 представляет собой способ индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту иммуногенной композиции по варианту осуществления 10.
Вариант осуществления 12 представляет собой аденовирусный вектор, содержащий (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.
Вариант осуществления 13 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 12, при этом полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).
Вариант осуществления 14 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 12 или 13, дополнительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры.
Вариант осуществления 15 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 14, при этом полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 16 представляет собой аденовирусный вектор, содержащий (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры, содержащий аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 17 представляет собой аденовирусный вектор, содержащий (а) по меньшей мере один трансген; (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5); и (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 18 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-17, при этом аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию Е1.
Вариант осуществления 19 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-18, при этом аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию Е3.
Вариант осуществления 20 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-19, при этом аденовирусный вектор представляет собой химерный аденовирусный вектор, содержащий одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека.
Вариант осуществления 21 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 20, при этом последовательности нуклеиновой кислоты аденовируса человека происходят из аденовируса-4 человека, аденовируса-5 человека, аденовируса-26 человека или аденовируса-35 человека.
Вариант осуществления 22 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 21, при этом аденовирусный вектор содержит orf6 E4 аденовируса-5 человека (HAdv-5).
Вариант осуществления 23 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-22, при этом трансген расположен в участке, прилегающем к инвертированному концевому повтору (ITR).
Вариант осуществления 24 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 23, при этом трансген расположен в области делеции Е1 или прилегает к ней, в области делеции E3 или прилегает к ней и/или в участке, прилегающем к ITR.
Вариант осуществления 25 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-24, при этом аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления 26 представляет собой вакцину, содержащую аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-25 и фармацевтически приемлемый носитель.
Вариант осуществления 27 представляет собой способ индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, при этом способ включает введение субъекту вакцины по варианту осуществления 26.
Вариант осуществления 28 представляет собой способ получения вакцины, включающий объединение аденовирусного вектора по любому из вариантов осуществления 12-25 с фармацевтически приемлемым носителем.
Вариант осуществления 29 представляет собой выделенный полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокис- 11 044813 лотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Вариант осуществления 30 представляет собой выделенный полипептид гексона по варианту осуществления 29, при этом полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).
Вариант осуществления 31 представляет собой выделенный полипептид фибры, при этом полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).
Примеры
Пример 1. Создание предусматривающих делеции Е1 и E3 векторов на основе остова нового изолята аденовируса BZ1 и содержащих последовательность фибры нового изолята аденовируса BZ28.
Идентифицировали новый изолят аденовируса гориллы BZ1 (также обозначаемый JAd4-WT) и полностью секвенировали его геном. Также идентифицировали новый изолят аденовируса шимпанзе BZ28 (также обозначаемый JAd5-WT) и секвенировали его ген фибры и часть его гена гексона. Обнаружили, что новые изоляты аденовируса BZ1 и BZ28 филогенетически принадлежат к виду аденовируса человека С (HAdV-C). Нуклеотидная последовательность полного генома BZ1 определена под SEQ ID NO: 6. Нуклеотидные последовательности фибры и (частично) гексона BZ28 определены под SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5 соответственно.
Описание системы на основе единичной плазмиды, применяемой для создания Ad-векторов на основе BZ1/BZ28 pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9; фиг. 4) и pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10; фиг. 5) представляют собой плазмиды, каждая из которых несет полноразмерные геномы предусматривающих делеции Е1 и E3 аденовирусных векторов на основе изолята BZ1, при этом кодирующая фибру последовательность заменена на таковую из изолята BZ28. Геномные последовательности Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, содержащиеся в этих плазмидах, приведены под SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно. В пределах каждой из этих плазмид геном аденовирусного вектора фланкирован двумя сайтами рестрикционных ферментов SwaI (т. е. на каждом конце генома вектора расположено по одному сайту SwaI). Такие сайты SwaI предназначены для способствования вырезанию генома Ad-вектора из плазмидного остова перед спасением вируса путем трансфекции подходящих Е1-дополняющих клеток (таких как клетки НЕК293, 911 и PER.C6). Геномы Ad-вектора, содержащиеся в этих плазмидах, дополнительно несут определенные сайты рестрикционных ферментов, введенные в местоположении делеции Е1 и участок, прилегающий к правому инвертированному концевому повтору (RITR). Эти сайты рестрикционных ферментов выбирали с обеспечением их уникальности в контексте плазмид с полным геномом Ad. Они представляют собой сайты вставки трансгена, которые обеспечивают легкое конструирование с помощью стандартных методик молекулярного клонирования Ad-векторов, несущих одну или несколько содержащих трансген кассет экспрессии, вставленных в любое из указанных соответствующих местоположений или в любые их комбинации. Схемы Ad-вектора и конструкции плазмид более подробно описаны в разделах ниже.
Схема генома Ad-вектора на основе BZ1/BZ28.
Каждый из геномов Ad-векторов BZ1/BZ28 и BZ1/BZ28.5IXP (т. е. SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно) разрабатывали таким образом, чтобы они предусматривали делецию Е1, делецию E3, разные сайты вставки трансгена и замену нативной открытой рамки считывания Е4 (orf) 6 и orf6/7 на таковую аденовируса-5 человека (HAdV-5). Область Е1 каждого аденовируса удаляли и заменяли сайтом вставки трансгена, содержащим последовательность сайта рестрикционного фермента AsiSI. Другой сайт вставки трансгена создавали путем вставки последовательности сайта рестрикционного фермента PacI в участок, прилегающий к правому инвертированному концевому повтору (ITR) каждого аденовируса. Геномы Ad-векторов дополнительно предусматривали замену кодирующих последовательностей orf6 и orf6/7 E4 (BZ1) на соответствующие последовательностями аденовируса-5 человека (HAdV-5). Заменяющая последовательность HAdV-5, представлена под SEQ ID NO: 7, причем она состоит из нуклеотидов 32914-34077 последовательности под номером в GenBank AC_000008.
Разрабатывали и конструировали два типа делеций области Е1. Геном Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, содержащийся в pBZ1_BZ28F, несет делецию области Е1, соответствующую удалению нуклеотидов 491-3324 из SEQ ID NO: 6. В то же время геном Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, содержащийся в pBZ1_BZ28F.5IXP, несет большую делецию последовательности, охватывающей область Е1, которая предусматривает удаление всех кодирующих последовательностей E1 BZ1 (т. е. нуклеотидов 4913484 из SEQ ID NO: 6). Кроме того, данный последний геном Ad-вектора дополнительно разрабатывали с обеспечением того, чтобы он нес замену некодирующего участка последовательности между последовательностями, кодирующими 55К и pIX Е1В, на последовательность HAdV-5 (т. е. последовательности, соответствующие нуклеотидам 3485-3574 из SEQ ID NO: 6, заменяли на нуклеотиды 3510-3608 из GenBank AC_000008 (т. е. SEQ ID NO: 8)).
Конструирование единичных плазмид, содержащих геномы Ad-вектора на основе BZ1/BZ28 pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9) конструировали за несколько стадий генного синтеза (который был осуществлен компанией GenScript) и стандартных процедур молекулярного клонирования. Во-первых, проводили несколько последовательных стадий синтеза и субклонирования генов, что совместно приводило к замене фрагмента EcoRI-NdeI длиной 2,3 т. п. о. из pBR322 (регистрационный номер GenBank - J01749.1)
- 12 044813 на синтезированную 8,1 т. п. о. нуклеотидную последовательность, предусматривающую фланкированную сайтами рестрикции SwaI последовательность, которая содержала левую и правую концевые части разработанного генома Ad-вектора BZ1/BZ28, при этом указанная левая концевая часть охватывала вышеупомянутую делецию Е1, а указанная правая концевая часть охватывала вышеупомянутую делецию E3, замену фибры BZ28, замену orf6 и orf6/7 Е4 HAdV-5 и вставку сайта рестрикции PacI в участке, прилегающем к rITR (в правой концевой части). Нуклеотидная последовательность полученной плазмиды, промежуточной плазмиды 1 на основе BZ1/BZ28, представлена под SEQ ID NO: 13. Во-вторых, рестрикционный фрагмент NheI-AscI длиной 12,3 т. п. о. из вирусного генома BZ1 (SEQ ID NO: 6) лигировали в расщепленную посредством NheI и AscI промежуточную плазмиду 1 BZ1/BZ28, что приводило к получению промежуточной плазмиды 2 BZ1/BZ28. В-третьих, рестрикционный фрагмент NdeI-HpaI длиной 11,8 т. п. о. из вирусного генома BZ1 лигировали в расщепленную посредством NdeI и HpaI промежуточную плазмиду 2 BZ1/BZ28, что приводило к получению промежуточной плазмиды 3 BZ1/BZ28. Вчетвертых, рестрикционный фрагмент NdeI-NdeI длиной 3,3 т. п. о. из вирусного генома BZ1 лигировали в расщепленную посредством NdeI промежуточную плазмиду 3 BZ1/BZ28, что приводило к получению конечной плазмиды pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9).
pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10) конструировали с помощью стандартных процедур генного синтеза и молекулярного клонирования следующим образом. Сначала 2927 п. о. фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 14), состоящий из модифицированного фрагмента генома вектора BZ1/BZ28, содержащего определенные промоторные последовательности pIX из HAdV-5 (т. е. последовательности, представленные под SEQ ID NO: 8), синтезировали и лигировали в виде рестрикционного фрагмента AsiSI-SalI в расщепленную посредством AsiSI и SalI промежуточную плазмиду 2 BZ1/BZ28, что приводило к получению промежуточной плазмиды 1 BZ1/BZ28.5IXP. Во-вторых, рестрикционный фрагмент SalI-SalI длиной 15,2 т. п. о. из вирусного генома BZ1 (SEQ ID NO: 6) лигировали в расщепленную посредством SalI промежуточную плазмиду 1 BZ1/BZ28.5IXP, что приводило к получению промежуточной плазмиды 2 BZ1/BZ28.5IXP. В-третьих, рестрикционный фрагмент ClaI-SpeI длиной 10,0 т. п. о. из вирусного генома BZ1 лигировали в расщепленную посредством ClaI и SpeI промежуточную плазмиду 2 BZ1.BZ28.5IXP, что приводило к получению конечной плазмиды pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10).
pBZ1_BZ28F.Fluc (SEQ ID NO: 15) и pBZ1_BZ28F.RSVF-2A-GLuc (SEQ ID NO: 16) представляли собой плазмиды, полученные из pBZ1_BZ28F, каждая из которых несет геном Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, снабженный трансгенной кассетой экспрессии, вставленной в местоположение делеции Е1. Последовательности генома Ad-вектора, переносимые в данных плазмидах, представлены под SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 соответственно. pBZ1_BZ28F.Fluc несет трансгенную кассету экспрессии люциферазы светлячка (FLuc). Управление данной кассетой осуществляется главным немедленно-ранним промотором цитомегаловируса (т. е. промотором CMV) и она содержит происходящий от SV40 сигнал полиаденилирования. pBZ1_BZ28F.RSVF-2A-GLuc несет трансгенную кассету экспрессии для RSVFa2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc), который представлял собой химерный белок, состоящий из фузогенного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса штамма А2, пептида вируса ящура 2А и люциферазы Gaussia (GLuc). Как и кассета Fluc, управление данной кассетой обеспечивается промотором CMV и она несет сигнал полиаденилирования SV40. Кроме того, данная кассета содержит в своей 5'нетранслируемой области последовательность, предусматривающую интрон 2 гена аполипопротеина А1 человека. Каждую из кассет экспрессии Fluc и RSVF-2A-GLuc конструировали за несколько стандартных стадий синтеза генов и молекулярного клонирования, после чего их лигировали в уникальный сайт рестрикционного фермента AsiSI pBZ1_BZ28F, с получением pBZ1_BZ28F.Fluc и pBZ1_BZ28F.RSVF-2AGLuc соответственно.
Создание и получение аденовирусных векторов на основе BZ1/BZ28.
Аденовирусные векторы BZ1/BZ28.Fluc (также обозначаемый JAd4C5NVT003) и BZ1/BZ28.RSVF2A-Gluc (также обозначаемый JAd4C5NVT001), которые содержали последовательности генома аденовирусного вектора (SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 соответственно), получали путем трансфекции соответствующими плазмидами с геномом Ad-вектора (т. е. pBZ1_BZ28F.Fluc и pBZ1_BZ28F.RSVF-2AGLuc) E1-комплементарных клеток PER.C6. Перед трансфекцией клеток PER.C6, которые выращивали в качестве адгезивных культур на модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 10 мМ MgCl2, плазмиды с геномом Ad-вектора расщепляли с помощью SwaI для высвобождения соответствующих геномов аденовирусных векторов из плазмиды. Трансфекции выполняли в соответствии со стандартными процедурами с применением реагента для трансфекции липофектамина (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния). После сбора вирусов, спасенных путем трансфекции, вирусы дополнительно размножали с помощью нескольких последовательных циклов инфицирования на культурах клеток PER.C6. Вирусы очищали из собранной неочищенной вирусной биомассы с помощью двухстадийной процедуры ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl), как описано ранее (Havenga et al., Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells, J. Gen. Virol. 87(8):2135-43 (2006)). Титры вирусных частиц (в. ч.) измеряли с помощью ранее описанной спектрофотометрической процедуры (Maizel et al., The polypeptides of adenovirus: I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of
- 13 044813 types 2, 7A, and 12, Virology, 36(1): 115-25 (1968)).
Пример 2. Клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные BZ1/BZ28.FLuc.
Клеточную и гуморальную иммуногенность нового аденовирусного вектора BZ1/BZ28 оценивали с применением люциферазы светлячка (FLuc) в качестве кодируемого вектором (модельного) вакцинного антигена. Мышей Balb/C иммунизировали внутримышечно посредством Ad26.FLuc (положительный контроль) или BZ1/BZ28.FLuc (оба в количестве 10 и 10 вирусных частиц на мышь) либо посредством вектора отрицательного контроля, который не кодировал трансген (пустым Ad26, 1010 вирусных частиц на мышь). Мышей умерщвляли спустя две недели и собирали образцы крови и спленоциты (фиг. 1А).
Индукцию клеточного иммунитета к кодируемому вектором антигену оценивали с помощью анализа ELISPOT, специфичного в отношении FLuc. С этой целью выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи 15-мерными перекрывающимися пептидами, охватывающими белок FLuc, и клеточные иммунные ответы определяли с помощью анализа ELISPOT ex-vivo, измеряя относительное количество секретирующих IFN-γ клеток (фиг. 1В). Из результатов было видно, что при иммунизации в более высоких дозах (1010) клеточные иммунные ответы, индуцированные BZ1/BZ28, были приблизительно такими же высокими, как и ответ, наблюдаемый в случае Ad26.FLuc. В отличие от этого, при иммунизации более низкой дозой (109) BZ1/BZ28.FLuc обеспечивал намного более сильный ответ, чем Ad26.FLuc.
Способность BZ1/BZ28 индуцировать гуморальный иммунитет против кодируемого им антигена оценивали путем измерения антител, выработанных к FLuc. Образцы сыворотки крови от иммунизированных мышей (собранные через 2 недели) тестировали с помощью ELISA с применением антител, специфичных к FLuc. На фиг. 1С видно, что в количестве 10 в. ч. на мышь вектор BZ1/BZ28, экспрессирующий люциферазу светлячка, обеспечивал более высокие конечные титры, чем в случае эталона Ad26.FLuc. Как и ожидалось, титры антител, специфичных к Fluc, в сыворотке крови мышей, иммунизированных пустыми векторами, не кодирующими люциферазу светлячка, обнаружены не были.
В целом, из данных видно, что вектор BZ1/BZ28 может индуцировать сильные клеточный и гуморальный иммунные ответы на кодируемый вектором антиген, которые характеризовались более высокой степенью, чем ответы, которые индуцировались эталонным вектором на основе HAdV-26. Эти иммунные ответы четко указывали на сильную иммуногенность вектора BZ1/BZ28 у мышей.
Пример 3. Оценка серологической перекрестной нейтрализации среди новых и существующих аденовирусных векторов.
Для обеспечения своей потенциальной применимости в качестве новых аденовирусных вакцинных векторов новые аденовирусные векторы BZ1/BZ28, созданные в соответствии с настоящим документом, предпочтительно будут серологически отличаться от существующих аденовирусных векторов, которые в настоящее время уже находятся в разработке в качестве вакцинных векторов, таких как векторы на основе аденовируса человека серотипов HAdV-5 и HAdV-35. Поэтому проводили тесты перекрестной нейтрализации среди новых аденовирусных векторов BZ1/BZ28 и нескольких существующих векторов на основе HAdV-4, HAdV-5, HAdV-26 и HAdV-35. С этой целью антисыворотку мышей, каждая из которых была индуцирована в ответ на один из этих аденовирусных векторов, тестировали в отношении каждого из данных различных векторов в анализе нейтрализации аденовируса. Антисыворотку мышей, применяемую для этого анализа, собирали у мышей Balb/C через две или восемь недель после их иммунизации посредством 10 векторных частиц на мышь. Анализ нейтрализации аденовируса проводили так, как описано ранее (Spangers et al., 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Вкратце, начиная с разведения 1:16, сыворотку крови серийно разводили в 2 раза, затем предварительно смешивали с аденовирусными векторами, экспрессирующими люциферазу светлячка (FLuc), а затем инкубировали в течение ночи с клетками А549 (при множественности инфицирования, составляющей 500 вирусных частиц на клетку). Уровни активности люциферазы в лизатах инфицированных клеток, измеренные через 24 ч после инфицирования, представляли собой эффективность инфицирования вектором. Титры нейтрализации к данному вектору определяли как наибольшее разведение сыворотки, способное понижать эффективность инфицирования вектором на 90%. Титры нейтрализации условно разделяли на следующие категории: <16 (нейтрализация отсутствовала), 16-200, 200-2000 и >2000.
Из результатов видно отсутствие перекрестной нейтрализации среди протестированных векторов (фиг. 2). BZ1/BZ28 демонстрировал гомологичный ответ с выработкой нейтрализующих антител, но не демонстрировал перекрестной нейтрализации с векторами на основе аденовируса человека, включенными в тестируемую панель, т.е. Ad26, Ad35, Ad5 и Ad4. Следовательно, новый аденовирусный вектор BZ1/BZ28 потенциально можно использовать в сочетании с одним или несколькими из этих или других отдельных аденовирусных векторов при последовательных иммунизациях, например, в контексте режима гетерологичной прайм-буст вакцинации или, альтернативно или дополнительно, в контексте серии двух или более последовательных режимов вакцинации против различных заболеваний или антигенов.
Пример 4. Серопревалентность у людей новых аденовирусных векторов.
Важным для их потенциального применения в качестве эффективных вакцинных векторов является то, что описанные в настоящем изобретении новые аденовирусные векторы не сдерживаются высокими уровнями предсуществующего противовекторного гуморального иммунитета в целевых для вакцины популяциях. По этой причине вектор BZ1/BZ28 оценивали на его серопревалентность в образцах сыво- 14 044813 ротки крови, полученных от группы из 200 взрослых человек в возрасте от 18 до 55 лет, проживающих в Соединенных Штатах (США) и Европейском союзе (ЕС). Вектор тестировали в отношении нейтрализации образцами сыворотки крови человека, проводя стандартный анализ нейтрализации аденовируса, который был описан ранее (Sprangers et al., 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Вкратце, начиная с разведения 1:16, сыворотку крови серийно разводили в 2 раза, затем предварительно смешивали с аденовирусными векторами, экспрессирующими люциферазу светлячка (FLuc), а затем инкубировали в течение ночи с клетками А549 (при множественности инфицирования, составляющей 500 вирусных частиц на клетку). Уровни активности люциферазы в лизатах инфицированных клеток, измеренные через 24 ч после инфицирования, представляли собой эффективность инфицирования вектором. Титры нейтрализации к данному вектору определяли как наибольшее разведение сыворотки, способное понижать эффективность инфицирования вектором на 90%. Титры нейтрализации условно разделяли на следующие категории: <16 (нейтрализация отсутствовала), 16-300, 300-1000, 1000-4000 и >4000. Результаты свидетельствовали, что серопревалентность BZ1/BZ28 у субъектов-людей была схожей с таковой для Ad5 (фиг. 3). Тем не менее, по сравнению с Ad5 положительные титры нейтрализующих антител, которые наблюдали в отношении нового вектора BZ1/BZ28, были, в целом, довольно низкими. Например, из всех протестированных образцов сыворотки крови более 25% характеризовались титрами нейтрализующих антител к Ad5 >1000, в то время как лишь приблизительно 3% характеризовались таким уровнем титров нейтрализующих антител к BZ1/BZ28.
В целом, приведенные выше данные указывали на то, что предсуществующий гуморальный противовекторный иммунитет к векторам BZ1/BZ28, выраженный как уровни титров предсуществующих нейтрализующих антител к вектору, можно считать относительно низким в оцененных целевых для вакцины популяциях, что позволяло предположить, что эти векторы потенциально могут являться эффективными вакцинными векторами в этих популяциях.
Пример 5. Продуктивность аденовирусного вектора в суспензии клеток PER.C6.
Аденовирусные векторы, подлежащие применению в клинических испытаниях и за их пределами, должны предусматривать легкое получение высоких титров в масштабируемой бессывороточной платформе для получения аденовирусов. Такой платформой являются адаптированные к суспензии клетки PER.C6®, также называемые данном документе суспендированными клетками PER.C6 или SPER.C6, поскольку было показано, что они поддерживают крупномасштабное производство аденовирусных векторов в биореакторах, обеспечивая большие количества препаратов клинического класса на основе векторов с высоким титром, например предусматривающих делецию Е1 векторов на основе HAdV-26 или HAdV-35 (ЕР 2536829 В1, EP 2350268 В1).
В качестве первоначальной оценки того, будут ли описанные в настоящем изобретении новые векторы подходить для способов производства на основе клеток SPER.C6, проводили мелкомасштабные эксперименты по изучению продуктивности вектора на клетках SPER.C6, культивируемых в шейкерных колбах. Такие эксперименты по изучению продуктивности проводили с помощью кодирующей Fluc версии нового Ad-вектора BZ1/BZ28, описанного в примере 1. В качестве эталонного контроля использовали вектор Ad26.Fluc на основе HAdV-26. Суспензию культур клеток PER.C6, высеянных в шейкерные колбы с плотностью 1x106 клеток/мл в общем объеме 10 мл среды PERMEXCIS® (доступной от Lonza) с добавлением 4 мМ L-глутамина (Lonza), инфицировали различными векторами с различными отношениями вирусных частиц (в. ч.) на клетку, а затем инкубировали в течение 4 дней. Различные отношения в. ч. на клетку, применяемые для инфицирования, составляли 70, 150 и 900. Каждый день собирали образцы инфицированных культур клеток и определяли титры в. ч. в этих образцах с помощью протокола на основе количественной ПЦР (qPCR), который предусматривал использование праймеров и зонда, специфичных к промотору CMV (который присутствовал во всех протестированных векторах). Этот протокол предусматривал обработку ДНКазой тестируемых образцов перед проведением qPCR для удаления любой свободной векторной ДНК (т. е. векторных геномов, которые не были упакованы в вирусные частицы).
Результаты в отношении продуктивности, полученные для нового вектора BZ1/BZ28.Fluc, показаны на фигуре 6. Для BZ1/BZ28.Fluc наблюдали более высокие титры в. ч., чем для эталонного контрольного вектора Ad26.Fluc, при всех протестированных отношениях инфицирования в. ч. на клетку и во всех протестированных моментах времени, когда производили сбор материала. Эти результаты демонстрировали хорошую продуктивность для нового вектора BZ1/BZ28 на модели бессывороточной суспензионной клеточной культуры на основе SPER.C6.
В совокупности, результаты исследований гуморального и клеточного иммунных ответов, индуцированных новыми рекомбинантными аденовирусными векторами на основе BZ1/BZ28 по настоящему изобретению, которые представлены выше, ясно указывали на сильную иммуногенность этих векторов у мышей. Кроме того, было продемонстрировано, что векторы не индуцировали перекрестные ответы нейтрализующих антител в отношении определенных существующих векторов-кандидатов аденовирусных вакцин (например, Ad26, Ad35 и Ad5) или наоборот. Более того, по сравнению с Ad5 новые векторы демонстрировали относительно низкие уровни титра предсуществующих у людей нейтрализующих анти- 15 044813 тел к вектору. Наконец, новые векторы можно легко получать с высокими показателями выхода. Сочетание низкой серопревалентности, высокой иммуногенности и продуктивности позволяет предположить, что новые аденовирусные векторы по настоящему изобретению могут быть пригодны в качестве новых кандидатов на вакцинный вектор к различным патогенам и дополнительно могут быть применимы в генной терапии и/или диагностике.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что в описанные выше варианты осуществления могут быть внесены изменения без отступления от их общего изобретательского замысла. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными раскрытыми вариантами осуществления, но предусматривает охват модификаций в рамках сущности и объема настоящего изобретения, определенных настоящим изобретением.
Claims (14)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид гексона, включающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
- 2. Последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по п.1, где полипептид гексона состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
- 3. Последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры.
- 4. Последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по п.3, где полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
- 5. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-4.
- 6. Вектор по п.5, представляющий собой аденовирусный вектор и дополнительно содержащий трансген.
- 7. Вектор по п.6, где аденовирусный вектор дополнительно включает по меньшей мере одну из делеций Е1 и Е3.
- 8. Вектор по п.6 или 7, где аденовирусный вектор представляет собой химерный аденовирусный вектор, содержащий одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека, при этом предпочтительно последовательности нуклеиновой кислоты аденовируса человека происходят из по меньшей мере одного аденовируса-4 человека, аденовируса-5 человека, аденовируса-26 человека или аденовируса-35 человека.
- 9. Вектор по любому из пп.6-8, где аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
- 10. Рекомбинантная клетка, содержащая вектор по любому из пп.5-9.
- 11. Способ получения вектора, включающий:a) выращивание рекомбинантной клетки по п.10 в условиях, обеспечивающих продуцирование вектора; иb) выделение вектора из рекомбинантной клетки.
- 12. Иммуногенная композиция, содержащая вектор по любому из пп.6-9.
- 13. Способ индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту иммуногенной композиции по п.12.
- 14. Способ получения вакцины, включающий комбинирование аденовирусного вектора по любому из пп.6-9 с фармацевтически приемлемым носителем.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17199354.6 | 2017-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044813B1 true EA044813B1 (ru) | 2023-10-02 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7366014B2 (ja) | アデノウイルス及びその用途 | |
| JP7285833B2 (ja) | アデノウイルス及びその用途 | |
| US11459583B2 (en) | Adenovirus vectors and uses thereof | |
| EP3703722B1 (en) | Adenovirus and uses thereof | |
| EA044813B1 (ru) | Аденовирус и его применения | |
| EA044526B1 (ru) | Аденовирус и пути его применения | |
| US20220372515A1 (en) | Adenovirus vectors and uses thereof | |
| EA042952B1 (ru) | Аденовирус и пути его применения | |
| EA045436B1 (ru) | Аденовирусные векторы и пути их применения | |
| EA047117B1 (ru) | Аденовирусные векторы и их применения |