JP2024509769A - 三量体安定化ｈｉｖエンベロープタンパク質変異 - Google Patents
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Abstract
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質であって、そのエンベロープタンパク質の三量体型を安定化する特定の変異を有する、ＨＩＶエンベロープタンパク質が提供される。本明細書に記載されるＨＩＶエンベロープタンパク質は、改善された三量体形成のパーセンテージ及び／又は改善された三量体収率を有する。ＨＩＶエンベロープタンパク質を提示する粒子、ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸分子及びベクター、並びにＨＩＶエンベロープタンパク質、粒子、核酸又はベクターを含有する組成物も提供される。
Description
ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）は、世界中で何百万人もの人々に影響を及ぼしており、有効なワクチンによるＨＩＶの予防は、抗レトロウイルス治療が普及している時代であっても、依然として非常に優先度が高い。ＨＩＶウイルスの異なる株及びクレード間の抗原多様性は、広範な効力を有するワクチンを開発することを困難にする。ＨＩＶ－１は、ウイルスの最も一般的かつ病原性の株であり、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ症例の９０％超がＨＩＶ－１Ｍ群による感染に由来する。Ｍ群は、クレード又はサブタイプに更に細分され、そのうちクレードＣが最大である。有効なワクチンは、理想的には、強力な細胞応答と、異なるクレード由来のＨＩＶ－１株を中和することができる広域中和抗体との両方を誘発することができる。
ＨＩＶ表面上のエンベロープタンパク質スパイク（Ｅｎｖ）は、糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１のヘテロ二量体の三量体から構成される（図１Ａ）。前駆体タンパク質ｇｐ１６０は、フューリンによって、スパイクの頭部であり、ＣＤ４受容体結合部位並びに大きな超可変ループ（Ｖ１～Ｖ５）を含有するｇｐ１２０、及びエンベロープタンパク質スパイクの膜固定ステムであるｇｐ４１に切断される。他のクラスＩ融合タンパク質と同様に、ｇｐ４１は、Ｎ末端融合ペプチド（fusion peptide、ＦＰ）、Ｃ末端膜貫通（transmembrane、ＴＭ）ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。ＨＩＶと標的細胞膜との間の膜融合は、エンベロープタンパク質における一連の立体構造変化を必要とする。ＨＩＶワクチンは、エンベロープタンパク質に基づいて開発され得る。
しかしながら、ＨＩＶ－１の高い遺伝的可変性、エンベロープタンパク質の高密度の炭水化物コート、及びエンベロープタンパク質スパイク構造の比較的動的で不安定な性質を含む様々な要因が、エンベロープタンパク質に基づくＨＩＶワクチンの開発を困難にしている。野生型エンベロープタンパク質は、その機能のために不安定である。したがって、ワクチン候補を生成するために、安定化修飾がエンベロープ構造に導入されることがある。エンベロープタンパク質は、中和抗体のための標的であり、高度にグリコシル化されており、タンパク質エピトープを遮蔽することによって免疫原性を低下させる。全ての既知の広域中和抗体（broadly neutralizing antibody、ｂＮＡｂ）は、これらのグリカンに適応する。
ワクチン開発のために、ｂＮＡｂを誘導することができるエンベロープタンパク質を使用することが好ましい。しかしながら、ほとんどのｂＮＡｂは、任意の立体構造変化を受ける前に天然エンベロープタンパク質立体構造を認識するだけである。したがって、非天然の、それ故に非中和エピトープの提示を最小限に抑えながら、その天然様のコンパクトで閉じた立体構造の安定なエンベロープタンパク質を開発することにより、そのようなｂＮＡｂを生成する効率を改善することができる。ＨＩＶワクチンを製造するためのこれまでの努力は、三量体ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１４０の融合前外部ドメインを含有するワクチンの開発に焦点を当ててきた。ｇｐ１４０は、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞質ドメインを有さないが、ｇｐ１２０とは異なり、三量体構造を形成し得る。更に、これらの以前の努力は、主にクレードＡに焦点を当ててきた。しかしながら、誘導された中和抗体応答の幅は、依然として制限されている。したがって、複数のＨＩＶクレードに対する安定化された天然エンベロープ三量体が利用可能であれば、それはまた有益であろう。
２０年を超える間、広域中和抗体応答を誘導することができるエンベロープタンパク質の可溶性で安定な三量体を産生することにおいて限られた成功のみを有する、その融合前三量体立体構造の安定なエンベロープタンパク質を開発する試みがなされてきた。例えば、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（５０１Ｃ、６０５Ｃ及び５５９Ｐ）が、可溶性ｇｐ１４０三量体画分の形成を改善するためにエンベロープタンパク質配列に導入されている（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１７）：８８７５－８９）。いわゆるＳＯＳＩＰ変異は、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従って、５０１位及び６０５位にシステイン残基、並びに５５９位にプロリン残基を含み、これは、本分野で使用される従来の番号付けスキームである。三次元タンパク質構造において互いに近接している５０１位及び６０５位における２つのシステイン残基の導入は、ジスルフィド架橋をもたらす。ＳＯＳＩＰ変異体エンベロープタンパク質、例えば、ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ及びＢ４１＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異体を有するＨＩＶ株ＢＧ５０５及びＢ４１（すなわち、９０３２－０８．Ａ１．４６８５）株由来のエンベロープタンパク質）は、ワクチン研究において使用されており、層２自己中和Ａｂを誘導することが示されている（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５），３４９（６２２４）：１３９－１４０）。
しかしながら、いわゆるＳＯＳＩＰ変異体がエンベロープタンパク質の三量体型を安定化することができるとしても、そのようなＳＯＳＩＰ変異体の三量体画分は通常１０％未満であり、大量の単量体及び凝集体が依然として産生される。ＳＯＳＩＰ変異体ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰであっても、三量体型安定化能の点で有望なＳＯＳＩＰ変異体エンベロープであり、典型的には、三量体型の収率は２５％にすぎない（Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１５），１１２（３８），１１９４７－５２）。更に、この三量体画分では、三量体は尖部で呼吸するので完全に安定ではない。したがって、ＳＯＳＩＰ変異に加えて、Ｅ６４Ｋ、Ａ３１６Ｗ、及び２０１Ｃ－４３３Ｃなどのいくつかの追加の置換が、尖部を安定化し、それが呼吸するのを防止するように設計されている（ｄｅ Ｔａｅｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５），１６３（７），１７０２－１５、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（７）５２２－３１）。加えて、三量体化収率を改善し、融合前閉鎖型ＨＩＶエンベロープ三量体のフォールディング及び安定性を最適化するための更なる変異及び戦略が報告されている（国際公開第２０１８／０５０７４７号、国際公開第２０１９／０１６０６２号、Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ，（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ２３：５８４－５９５、Ｒａｗｉ ｅｔ ａｌ，（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３３，１０８４３２）。
したがって、改善された三量体形成のパーセンテージ、改善された三量体収率、及び／又は改善された三量体安定性を有する、ＨＩＶエンベロープタンパク質の安定化三量体に対する必要性が存在する。好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質のそのような安定化三量体はまた、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）との良好な結合、及び非広域中和Ａｂ（非ｂＮＡｂ）への比較的限定された結合を示す。本発明の目的は、改善された三量体パーセンテージ、好ましくはまた改善された三量体収率を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提供することである。
本発明は、特定の以前に記載されたＨＩＶエンベロープ三量体と比較して、改善された三量体形成のパーセンテージ及び／又は改善された三量体収率を有する組換えＨＩＶエンベロープタンパク質に関する。得られた安定かつ十分に折り畳まれたＨＩＶ Ｅｎｖ三量体は、免疫目的に有用であり、例えば、組換えＨＩＶ Ｅｎｖ三量体の投与の際に、広域中和抗体を誘導する機会を改善し、非中和抗体及び弱中和抗体の誘導を減少させる。本発明はまた、組換えＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする単離された核酸分子及びベクター、それを含む細胞、並びに組換えＨＩＶエンベロープタンパク質、核酸分子、ベクター、及び／又は細胞の組成物に関する。
一般的な一態様では、本発明は、６５０位にアミノ酸トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、又はロイシン（Ｌｅｕ）のうちの１つ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅを含む、組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（envelope、Ｅｎｖ）タンパク質に関し、位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。特定の実施形態では、そのようなＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、本明細書に示されるように、三量体収率を増加させ、かつ／又は三量体を安定化させる１つ又は２つ以上の変異を更に含む。このようなＥｎｖタンパク質は以前に記載されておらず、６５０位におけるＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕアミノ酸は、三量体収率の増加をもたらす。これは、クレードＢ及びクレードＣ由来のＥｎｖタンパク質の両方について、その位置で最も豊富に見出される元のアミノ酸（グルタミン、Ｇｌｎ、Ｑである）を有するＥｎｖタンパク質と比較して、本明細書において示されている。
特定の好ましい実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、６５０位にＴｒｐを含む。
特定の好ましい実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、６５０位にＰｈｅを含む。
特定の実施形態では、本発明の組換えＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質は、示された位置に以下のアミノ酸残基のうちの１つ又は２つ以上を更に含み、
（ｉ）６５１位にＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位にＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位にＡｓｎ若しくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位にＶａｌ、Ｉｌｅ、若しくはＡｌａ；
（ｖ）５７３位にＰｈｅ若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位にＩｌｅ；
（ｖｉｉ）６４７位にＰｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉｉｉ）６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、若しくはＬｅｕ、好ましくはＶａｌ若しくはＩｌｅ、より好ましくはＶａｌ；
（ｉｘ）５８８位にＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、若しくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｎ若しくはＧｌｕ；
（ｘ）６４位にＬｙｓ若しくは６６位にＡｒｇ、又は６４位にＬｙｓ及び６６位にＡｒｇ；
（ｘｉ）３１６位にＴｒｐ；
（ｘｉｉ）２０１位及び４３３位の両方にＣｙｓ；
（ｘｉｉｉ）５５６位若しくは５５８位にＰｒｏ、又は５５６位及び５５８位の両方にＰｒｏ；
（ｘｉｖ）アミノ酸位置５４８～５６８におけるループ（ＨＲ１－ループ）の、７～１０アミノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば（配列番号９～１４）のうちのいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｖ）５６８位にＧｌｙ、若しくは５６９位にＧｌｙ、若しくは６３６位にＧｌｙ、若しくは５６８位及び６３６位の両方にＧｌｙ、若しくは５６９位及び６３６位の両方にＧｌｙ；
（ｘｖｉ）３０２位にＴｙｒ、若しくは５１９位にＡｒｇ、若しくは５２０位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ及び５１９位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ及び５２０位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ並びに５１９位及び５２０位の両方にＡｒｇ；
（ｘｖｉｉ）ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは５０８～５１１位におけるＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）による置換；
（ｘｖｉｉｉ）５０１位及び６０５位にＣｙｓ若しくは５５９位にＰｒｏ、好ましくは５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏ；
（ｘｉｘ）１０８位にＨｉｓ；並びに／又は
（ｘｘ）５３８位にＨｉｓ、
位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、上記の（ｉ）～（ｖｉｉｉ）からなる群から選択される示された位置の少なくとも２つに示されたアミノ酸残基を含む。
（ｉ）６５１位にＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位にＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位にＡｓｎ若しくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位にＶａｌ、Ｉｌｅ、若しくはＡｌａ；
（ｖ）５７３位にＰｈｅ若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位にＩｌｅ；
（ｖｉｉ）６４７位にＰｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉｉｉ）６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、若しくはＬｅｕ、好ましくはＶａｌ若しくはＩｌｅ、より好ましくはＶａｌ；
（ｉｘ）５８８位にＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、若しくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｎ若しくはＧｌｕ；
（ｘ）６４位にＬｙｓ若しくは６６位にＡｒｇ、又は６４位にＬｙｓ及び６６位にＡｒｇ；
（ｘｉ）３１６位にＴｒｐ；
（ｘｉｉ）２０１位及び４３３位の両方にＣｙｓ；
（ｘｉｉｉ）５５６位若しくは５５８位にＰｒｏ、又は５５６位及び５５８位の両方にＰｒｏ；
（ｘｉｖ）アミノ酸位置５４８～５６８におけるループ（ＨＲ１－ループ）の、７～１０アミノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば（配列番号９～１４）のうちのいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｖ）５６８位にＧｌｙ、若しくは５６９位にＧｌｙ、若しくは６３６位にＧｌｙ、若しくは５６８位及び６３６位の両方にＧｌｙ、若しくは５６９位及び６３６位の両方にＧｌｙ；
（ｘｖｉ）３０２位にＴｙｒ、若しくは５１９位にＡｒｇ、若しくは５２０位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ及び５１９位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ及び５２０位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ並びに５１９位及び５２０位の両方にＡｒｇ；
（ｘｖｉｉ）ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは５０８～５１１位におけるＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）による置換；
（ｘｖｉｉｉ）５０１位及び６０５位にＣｙｓ若しくは５５９位にＰｒｏ、好ましくは５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏ；
（ｘｉｘ）１０８位にＨｉｓ；並びに／又は
（ｘｘ）５３８位にＨｉｓ、
位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、上記の（ｉ）～（ｖｉｉｉ）からなる群から選択される示された位置の少なくとも２つに示されたアミノ酸残基を含む。
特定の実施形態では、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、１０８位にＨｉｓ、又は５３８位にＨｉｓ、又は１０８位にＨｉｓ及び５３８位にＨｉｓを含む。
特定の実施形態では、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ若しくはＰｈｅを含み、（ａ）５０１位及び６０５位にＣｙｓ、又は（ｂ）５５９位にＰｒｏ、又は好ましくは（ｃ）５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏを更に含み（いわゆる「ＳＯＳＩＰ」バリアントＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質）、位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。特定の実施形態では、これは、１０８位にＨｉｓ及び／又は５３８位にＨｉｓと組み合わされる。特定の実施形態では、これは、上記（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に記載される位置のアミノ酸のうちの１つ又は２つ以上と組み合わされる。
特定の実施形態では、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、クレードＣ ＨＩＶに由来する。特定の実施形態では、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、クレードＢ ＨＩＶに由来する。特定の実施形態では、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、クレードＡ ＨＩＶに由来する。特定の実施形態では、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、クレードＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、又はＬ ＨＩＶに由来する。特定の実施形態では、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、又はＬのうちの２つ又は３つ以上に由来するＨＩＶの循環組換え型（circulating recombinant form、ＣＲＦ）に由来する。
特定の実施形態では、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異（例えば、５０８位～５１１位におけるＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）による置換）を更に含む。
一実施形態では、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１４０タンパク質である。
別の実施形態では、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１６０タンパク質である。
特定の実施形態では、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、細胞質領域において短縮化されている。特定の実施形態では、短縮化は、細胞質領域の７アミノ酸の後である。
配列番号２、３、４、５、１６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、６５０位にアミノ酸がＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅである組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質も開示される。この態様では、同一性％を決定する場合、６５０位は考慮されず、番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。また、この態様では、同一性％を決定するために考慮されない示された位置のアミノ酸の１つ又は２つ以上は、好ましくは、上記の（ｉ）～（ｘｘ）において本明細書で好ましいと示されたアミノ酸から選択される。
別の一般的な態様では、本発明は、本明細書に記載される組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のうちのいずれか３つの非共有結合オリゴマーを含む三量体複合体に関する。
別の一般的な態様では、本発明は、粒子、例えばリポソーム又はナノ粒子、例えば自己集合性ナノ粒子に関し、その表面上に本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質又は本発明の三量体複合体を提示する。
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。
別の一般的な態様では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された単離された核酸分子を含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。１つの好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。
別の一般的な態様は、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。このような宿主細胞は、組換えタンパク質産生、組換えタンパク質発現、又は組換えアデノウイルスのようなウイルス粒子の産生のために使用され得る。
別の一般的な態様は、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を産生する方法であって、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞を、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の産生に好適な条件下で増殖させることを含む、方法に関する。
更に別の一般的な態様は、本明細書に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離された核酸分子、又はベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物に関する。
別の一般的な態様では、本発明は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を改善する方法であって、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の６５０位にアミノ酸残基をＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅにより置換することを含み、位置の番号付けが、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う、方法に関する。
上述の「発明の概要」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される正確な実施形態に限定されない点を理解する必要がある。
変異Ｑ６５０Ｗが、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＣ－ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｑ６５０Ｗが、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＣ－ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｑ６５０ＷがＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｑ６５０ＷがＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＱ６５０Ｗバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣにおいて、変異Ｑ６５０Ｆ、Ｑ６５０Ｍ、及びＱ６５０ＬがＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させ、一方、変異Ｑ６５０ＩがＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰにおける三量体形成を減少させることを示す。
変異Ｔ５３８ＨがＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏＮＣ－ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｔ５３８ＨがＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏＮＣ－ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｔ５３８ＨがＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｔ５３８ＨがＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＴ５３８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｉ１０８ＨがＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＣ－ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｉ１０８ＨがＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＣ－ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｉ１０８ＨがＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｉ１０８ＨがＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率を増加させることを示す。Ａ）ＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ及びそのＩ１０８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｉ１０８Ｈ、Ｔ５３８Ｈ、及びＱ６５０Ｗが、Ｉ１０８Ｈ変異のみを含むＣｏｎｃＢ＿ＳＯＳＩＰと比較して、三量体収率を増加させることを示す。Ａ）Ｉ１０８Ｈ、Ｔ５３８Ｈ、及びＱ６５０Ｗ変異を含むＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ並びにＩ１０８Ｈ変異のみを含むＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈ＿Ｔ５３８Ｈ＿Ｑ６５０Ｗ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
変異Ｉ１０８Ｈ、Ｔ５３８Ｈ、及びＱ６５０Ｗが、Ｉ１０８Ｈ変異のみを含むＣｏｎｃＢ＿ＳＯＳＩＰと比較して、三量体収率を増加させることを示す。Ａ）Ｉ１０８Ｈ、Ｔ５３８Ｈ、及びＱ６５０Ｗ変異を含むＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰ並びにＩ１０８Ｈ変異のみを含むＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清を用いた分析ＳＥＣ。Ｂ）ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈ＿Ｔ５３８Ｈ＿Ｑ６５０Ｗ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈバリアントに対する、ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂを有する細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合。全ての測定は３組で実行された。
様々な刊行物、論文及び特許が、「背景技術」において、及び本明細書全体を通して引用又は記載されており、これら参照文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明への文脈を提供する目的のためである。そのような考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるあらゆる発明に関して先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用される全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、あたかも本明細書に完全に記載されているように参照により組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、通常、記載される値の±１０％を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
アミノ酸は、本開示全体を通して参照される。２０の天然に生じるアミノ酸、並びに多くの天然に生じないアミノ酸がある。天然アミノ酸及び非天然アミノ酸の両方を含む各既知のアミノ酸は、フルネーム、短縮された１文字コード、及び短縮された３文字コードを有し、これらは全て当業者に周知である。例えば、２０の天然に生じるアミノ酸について使用される３文字及び１文字の短縮コードは、以下のとおりである：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。アミノ酸は、それらのフルネーム、１文字短縮コード、又は３文字短縮コードによって言及され得る。
文脈が他に明確に指示しない限り、本明細書で使用されるＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列における位置の番号付けは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ １９９８：Ａ Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．）に記載されているＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０の番号付けに従っている。ＨＸＢ２に従う番号付けは、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の分野において慣習的である。ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。目的のＨＩＶ Ｅｎｖ配列とこの配列とのアラインメントを使用して、目的の配列中の対応するアミノ酸番号付けを見出すことができる。
「パーセント（％）配列の同一性」又は「同一性％」という用語は、アミノ酸配列全体の長さを構成するアミノ酸残基の数と比較した、２つ又は３つ以上のアラインされたアミノ酸配列の同一アミノ酸の一致数（「ヒット数」）を記載する。２つ又は３つ以上の配列についてアラインメントを使用する他の用語において、配列が、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合の、又は手動でアライン及び目視検査したときの、最大一致性について比較及びアラインされたとき、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、９５％、９７％、又は９８％の同一性）が判定され得る。したがって、配列同一性を判定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加、又は欠失によって異なり得る。タンパク質配列をアラインするための好適なプログラムは、当業者に既知である。タンパク質配列の配列同一性のパーセンテージは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、又はＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して判定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質における「対応する位置」は、少なくとも２つのＨＩＶ Ｅｎｖ配列がアラインされる場合のアミノ酸残基の位置を指す。他に示されない限り、これらの目的のためのアミノ酸位置の番号付けは、当該分野において慣習的であるように、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。
本明細書で使用される「本発明による変異」は、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質中の６５０位にアミノ酸の、トリプトファンＴｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、又はロイシン（Ｌｅｕ）残基による置換である。これらのうち、Ｔｒｐ又はＰｈｅによる置換が好ましい。本明細書で使用される追加の「安定化変異」は、表１のエントリー（ｉ）～（ｘｖｉ）のいずれかにおいて本明細書に記載される変異であり、これは、変異が親分子中の対応するアミノ酸の置換によって導入される場合（例えば、国際公開第２０１９／０１６０６２号を参照されたい）、親分子と比較して、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体のパーセンテージ及び／又は三量体収率を増加させる（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ又はサイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）アッセイ、例えば、本明細書に記載される分析ＳＥＣアッセイ、又は例えば、国際公開第２０１９／０１６０６２号に記載されるＳＥＣ－ＭＡＬＳに従って測定することができる）。本発明による変異と任意選択で組み合わせることができる他の新規安定化変異は、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質中の１０８位にアミノ酸のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基による置換、又は親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質中の５３８位にアミノ酸のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基による置換、又は１０８位及び５３８位の両方におけるアミノ酸のＨｉｓ残基による置換である。このような安定化変異から生じるアミノ酸は、典型的には、野生型ＨＩＶ分離株のＥｎｖタンパク質において、たとえあったとしても稀にしか見出されない。
別の態様では、本発明は、１０８位にヒスチジン（Ｈｉｓ）を含むＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提供し、位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。このようなＥｎｖタンパク質は以前に記載されておらず、１０８位におけるＨｉｓアミノ酸は、三量体収率の増加をもたらす。これは、クレードＢ及びクレードＣ由来Ｅｎｖタンパク質の両方について、その位置で最も豊富に見出される元のアミノ酸（イソロイシン、Ｉｌｅである）を有するＥｎｖタンパク質と比較して、本明細書において示されている。１０８位にヒスチジン（Ｈｉｓ）を含むＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、任意選択で、６５０修飾及び／若しくは５３８修飾又は本明細書中に記載される他のアミノ酸修飾のいずれかと組み合わされ得る。特定の実施形態では、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、１０８位にＨｉｓを含み、（ａ）５０１位及び６０５位にＣｙｓ、又は（ｂ）５５９位にＰｒｏ、又は好ましくは（ｃ）５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏを更に含み、位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。
「天然」又は「野生型」という用語は、ＨＩＶ株（又はそれに由来するＥｎｖタンパク質）を指す場合、本明細書において互換的に使用され、例えばＨＩＶ感染患者などの天然に存在するＨＩＶ株（又はそれに由来するＥｎｖタンパク質）を指す。
本発明は、一般に、エンベロープタンパク質の三量体型を安定化する、エンベロープタンパク質配列中の示された位置にある特定のアミノ酸置換を含む組換えＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質に関する。本発明の同定されたアミノ酸の置換、及び任意選択で１つ又は２つ以上の更なる安定化変異を、ＨＩＶエンベロープタンパク質の配列に導入することは、三量体形成のパーセンテージの増加及び／又は三量体収率の増加を生じ得る。これは、例えば、三量体特異的抗体、サイズ排除クロマトグラフィ、及び正確に折り畳まれた（安定な三量体）又は代替的に不正確に折り畳まれた（非安定又は非三量体）Ｅｎｖタンパク質に結合する抗体への結合を使用して測定することができ、増加した三量体パーセンテージ及び／又は三量体収率は、安定な天然の正確に折り畳まれたＥｎｖタンパク質を示すと考えられる。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルス科の一部であるレンチウイルス亜科属のメンバーである。ＨＩＶの２つの種：ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２は、ヒトに感染する。ＨＩＶ－１は、ＨＩＶウイルスの最も一般的な株であり、ＨＩＶ－２よりも病原性であることが知られている。本明細書で使用される場合、「ヒト免疫不全ウイルス」及び「ＨＩＶ」という用語は、ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２を指すが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＨＩＶは、ＨＩＶ－１を指す。
ＨＩＶは、高度の遺伝的分岐を有する複数のクレードに分類される。本明細書で使用される場合、「ＨＩＶクレード」又は「ＨＩＶサブタイプ」という用語は、それらの遺伝的類似性の程度に従って分類される関連するヒト免疫不全症ウイルスを指す。ＨＩＶ－１分離株の最大の群は、Ｍ群（主要株）と呼ばれ、少なくとも１２のクレード、Ａ～Ｌからなる。
１つの一般的態様では、本発明は組換え、ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質に関する。用語「組換え」は、タンパク質に関して使用される場合、組換え技術又は化学合成インビトロによって産生されるタンパク質を指す。本発明の実施形態によれば、「組換え」タンパク質は、対応する天然に生じる配列において見出されない少なくとも１つの配列要素（例えば、アミノ酸置換、欠失、付加、配列置換など）を含有するという点で、人工アミノ酸配列を有する。好ましくは、「組換え」タンパク質は、免疫応答を誘導するか、又は１つ又は２つ以上の天然に生じるＨＩＶ株に対する免疫を生じるように最適化されている天然に生じないＨＩＶエンベロープタンパク質である。
「ＨＩＶエンベロープタンパク質」、「ＨＩＶ Ｅｎｖ」、及び「ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質」という用語は、ＨＩＶビリオンのエンベロープ上に天然に発現され、ＨＩＶがＨＩＶ感染細胞の原形質膜を標的とし、それに付着することを可能にするタンパク質、又はその断片若しくは誘導体を指す。「エンベロープ」及び「Ｅｎｖ」という用語は、本開示全体を通して互換的に使用される。ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子は、前駆体タンパク質ｇｐ１６０をコードし、これはタンパク質分解により２つの成熟エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１に切断される。切断反応は、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質前駆体において高度に保存された配列モチーフにおいて、宿主細胞プロテアーゼであるフューリンによって（又はフューリン様プロテアーゼによって）媒介される。より具体的には、ｇｐ１６０は三量体化して（ｇｐ１６０）３となり、次いで、２つの非共有結合的に会合した成熟糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１への切断を受ける。ウイルス侵入は、その後、ｇｐ１２０／ｇｐ４１ヘテロ二量体の三量体によって媒介される。ｇｐ１２０は、受容体結合断片であり、ＣＤ４受容体（及び共受容体）を有する標的細胞上のＣＤ４受容体（及び共受容体）に結合する。ｇｐ１２０に非共有結合的に結合しているｇｐ４１は融合断片であり、ＨＩＶが細胞に侵入する第２の段階を提供する。ｇｐ４１は、元々ウイルスエンベロープ内に埋もれているが、ｇｐ１２０がＣＤ４受容体及び共受容体に結合すると、ｇｐ１２０はその立体構造を変化させてｇｐ４１を露出させ、そこで宿主細胞との融合を助けることができる。ｇｐ１４０は、ｇｐ１６０の外部ドメインである。
本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質」は、ｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０タンパク質、又はそれらの組み合わせ、融合体、短縮化、若しくは誘導体であり得る。例えば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ４１タンパク質と非共有結合的に会合したｇｐ１２０タンパク質を含み得る。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」はまた、短縮化されたＨＩＶエンベロープタンパク質であり得、これには、外部ドメイン（すなわち、細胞外空間に延びるドメイン）におけるＣ末端短縮化、ｇｐ４１における短縮化（例えば、ｇｐ４１の外部ドメインにおける短縮化、ｇｐ４１の膜貫通ドメインにおける短縮化、又はｇｐ４１の細胞質ドメインにおける短縮化）を含むエンベロープタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、ｇｐ１４０外部ドメインに対応するｇｐ１６０、又はｇｐ１４０の伸長バージョン若しくは短縮化されたバージョンであり得る。ｇｐ１４０タンパク質の発現は、いくつかの刊行物に記載されており（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、タンパク質は、例えば異なるＨＩＶ株に基づいて、異なるバリアントでサービス提供者に注文することもできる。本発明によるｇｐ１４０タンパク質は、ｇｐ１２０ドメイン及びｇｐ４１外部ドメインが切断されず、かつ共有結合的に連結しないように切断部位変異を有することができ、又は代替的に、ｇｐ１２０ドメイン及びｇｐ４１外部ドメインが切断され、例えばジスルフィド架橋によって共有結合することができる（例えばＳＯＳＩＰバリアントにおけるように）。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、例えば、フューリン切断部位における配列変異、及び／又はいわゆるＳＯＳＩＰ変異を有する、天然に生じるＨＩＶエンベロープタンパク質の誘導体で更にあり得る。本発明によるＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、ｇｐ１２０及びｇｐ４１外部ドメインが非共有結合的に連結され得るように切断部位を有し得る。
本発明の好ましい実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１４０タンパク質又はｇｐ１６０タンパク質であり、より好ましくはｇｐ１４０タンパク質である。他の好ましい実施形態では、Ｅｎｖタンパク質は、例えば、天然のＥｎｖタンパク質と比較して細胞質領域の第７の残基の後の残基の欠失によって短縮化されている。
本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、三量体又は単量体であってもよく、好ましくは三量体である。三量体は、ホモ三量体（例えば、３つの同一のポリペプチド単位を含む三量体）又はヘテロ三量体（例えば、全てが同一ではない３つのポリペプチド単位を含む三量体）であり得る。好ましくは、三量体は、ホモ三量体である。切断されたｇｐ１４０又はｇｐ１６０の場合、それはｇｐ１２０－ｇｐ４１二量体であるポリペプチド単位の三量体であり、これらの二量体の３つ全てが同じである場合、これはホモ三量体とみなされる。いくつかの場合において、ＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、六量体の形態で存在し得る。
「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、可溶性タンパク質又は膜結合タンパク質であり得る。膜結合エンベロープタンパク質は、典型的には、膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含む全長ＨＩＶエンベロープタンパク質におけるように、膜貫通ドメインを含む。膜結合タンパク質は、細胞質ドメインを有し得るが、膜結合される細胞質ドメインを必要としない。可溶性エンベロープタンパク質は、膜貫通ドメインの少なくとも部分的又は完全な欠失を含む。例えば、全長ＨＩＶエンベロープタンパク質のＣ末端を短縮化して膜貫通ドメインを欠失させ、それによって可溶性タンパク質を産生することができる（例えば、全長及び短縮化された可溶性ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の概略図については、それぞれ国際公開第２０１９／０１６０６２号の図１Ａ及び図１Ｂを参照されたい）。しかしながら、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、国際公開第２０１９／０１６０６２号の図１Ｂに示されるものに対して、より短い短縮化及び代替的な短縮化位置を有して、依然として可溶性であり得る。短縮化は様々な位置で行うことができ、非限定的な例は、アミノ酸６６４、６５５、６８３などの後であり、これらは全て可溶性タンパク質をもたらす。本発明による膜結合Ｅｎｖタンパク質は、天然Ｅｎｖタンパク質と比較して、完全な又は部分的なＣ末端ドメインを含み得る（例えば、Ｃ末端細胞質ドメインの部分的欠失によって、例えば、特定の実施形態では、細胞質領域の第７の残基の後に）。細胞質領域における欠失が、細胞質ドメインの第７の残基以外から、例えば、細胞質ドメインの第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第８の、第９の、第１０の、又はその後の任意の残基の後からであってもよいことは、当業者には明らかであろう。
シグナルペプチドは、典型的には、発現されたときにＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のＮ末端に存在するが、シグナルペプチダーゼによって切断され、したがって成熟タンパク質には存在しない。シグナルペプチドは、他のシグナル配列と交換することができ、シグナルペプチドの２つの非限定的な例は、本明細書において配列番号７及び８で提供される。
本発明の実施形態によれば、ＨＩＶエンベロープタンパク質、例えば、ｇｐ１６０又はｇｐ１４０は、任意のＨＩＶクレード（又は「サブタイプ」）、例えば、クレードＡ、クレードＢ、クレードＣ、クレードＤ、クレードＥ、クレードＦ、クレードＧ、クレードＨなど、又はそれらの組み合わせ（例えば、異なるサブタイプ、例えば、ＢＣ、ＡＥ、ＡＧ、ＢＥ、ＢＦ、ＡＤＧなどのウイルス間の組換えに由来する「循環組換え型」又はＣＲＦなど）由来のＨＩＶエンベロープタンパク質配列に由来し得る。ＨＩＶエンベロープタンパク質配列は、天然に生じる配列、モザイク配列、コンセンサス配列、合成配列、又はそれらの任意の誘導体若しくは断片であり得る。「モザイク配列」は、１つ又は２つ以上のＨＩＶクレードの少なくとも３つのＨＩＶエンベロープ配列に由来する複数のエピトープを含み、Ｔ細胞エピトープの適用範囲を最適化するアルゴリズムによって設計され得る。モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質の配列の例としては、例えば、Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ２０１０，１６：３１９－３２３、国際公開第２０１０／０５９７３２号、及び国際公開第２０１７／１０２９２９号に記載されているものが挙げられる。本明細書で使用される場合、「コンセンサス配列」は、例えば、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用する）によって決定されるような、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくアミノ酸の人工配列を意味する。これは、例えば、少なくとも１０００天然ＨＩＶ単離物由来のＥｎｖの配列に基づいて、配列アラインメント中の各位置で見出される最も頻度の高いアミノ酸残基の計算された順序である。「合成配列」は、免疫応答を誘導するか、又は１つより多くの天然に生じるＨＩＶ株に対する免疫を生じるように最適化された、天然に生じないＨＩＶエンベロープタンパク質である。モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の非限定的な例である。本発明の特定の実施形態では、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、コンセンサスＥｎｖタンパク質又は合成Ｅｎｖタンパク質である。親Ｅｎｖタンパク質では、変異を導入して、６５０位にアミノ酸Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕをもたらす。好ましい実施形態では、変異は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の６５０位にＴｒｐ又はＰｈｅをもたらす。任意選択で、このようなＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、表１において本明細書中に記載される示された位置（ｉ）～（ｘｘ）示されるアミノ酸のうちの少なくとも１つを更に有し得る。特に好ましいのは、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅを有し、（ａ）示された位置（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に示されたアミノ酸残基のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、及び／又は（ｂ）好ましくは更なるＳＯＳＩＰ（例えば、位置（ｘｖｉｉｉ）に示されたアミノ酸）及び／又は（ｃ）フューリン切断部位変異（例えば、以下に記載されるような位置（ｘｖｉｉ）に示されたアミノ酸）のいずれかを更に有するＥｎｖタンパク質である。
本発明の特定の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、天然に生じる配列、モザイク配列、コンセンサス配列、合成配列などのいずれであっても、例えば、フューリン切断部位、及び／又はいわゆるＳＯＳＩＰ変異において、更なる配列変異を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質は、更なる変異を有し、「ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質」である。いわゆるＳＯＳＩＰ変異は、「ＳＯＳ変異」（新たに作製されたシステイン残基間に可能なジスルフィド架橋の導入をもたらす、５０１位及び６０５位にＣｙｓ残基）及び「ＩＰ変異」（５５９位にＰｒｏ残基）を含む三量体安定化変異である。本発明の実施形態によれば、ＳＯＳＩＰ変異体Ｅｎｖタンパク質は、５０１位及び６０５位にＣｙｓ；５５９位にＰｒｏ；好ましくは５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏからなる群から選択される、少なくとも１つの変異を含む。ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、例えば、フューリン切断部位において、他の配列変異を更に含み得る。加えて、特定の実施形態では、Ｅｎｖタンパク質が５５６位若しくは５５８位にＰｒｏ、又は５５６位及び５５８位にＰｒｏを含むような変異を更に加えることが可能であり、これはＳＯＳＩＰバリアントにおける５５９位にＰｒｏに対する代替物としてだけでなく、５５９位にＰｒｏをすでに有するＳＯＳＩＰバリアントの三量体形成を更に改善することができる追加の変異としても作用することができることが見出された。
本発明の特定の好ましい実施形態では、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、５０１位及び６０５位にＣｙｓ、並びに５５９位にＰｒｏを含む。
特定の実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質は、フューリン切断部位に変異を更に含む。フューリン切断配列中の変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入、若しくは１つの配列の別の配列との置換、又はリンカーアミノ酸配列との置換であり得る。好ましくは、本発明において、フューリン切断部位を変異することは、切断部位を最適化するために使用されてもよく、その結果、フューリン切断は、例えば、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）による残基５０８～５１１での配列の置換によって、野生型を超えて改善される［すなわち、５０９～５１０位に４つのアルギニン残基による代表的なアミノ酸配列（例えば、ＥＫ）の置換（すなわち、２つの置換及び２つの付加）、一方、５０８及び５１１位に、ほとんどのＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質中にすでに存在するアルギニン残基が存在し、したがって、これらは代表的には置換される必要はないが、文献における最終結果は、しばしばアミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲと称されるので、本発明者らは、本明細書中でこの命名法を維持する］。フューリン切断を改善する他の変異が知られており、これらも使用することができる。代替的に、フューリン切断部位をリンカーで置換することが可能であり、その結果、フューリン切断はもはや必要ではないが、タンパク質は天然様立体構造をとる（例えば、（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ，２０１５）及び（Ｇｅｏｒｇｉｅｖ ｅｔ ａｌ，２０１５）に記載されている）。
本発明の特定の実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質は、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（好ましくは５０１位及び６０５位にＣｙｓ、並びに５５９位にＰｒｏ）及びフューリン切断部位における配列変異の両方、好ましくは残基５０８～５１１の配列のＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）による置換を更に含む。特定の好ましい実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖは、示されたＳＯＳＩＰ及びフューリン切断部位変異の両方を含み、加えて、５５６位又は５５８位に、最も好ましくは５５６位及び５５８位の両方にＰｒｏ残基を更に含む。
本発明の特定の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサス又はＨＩＶエンベロープクレードＢコンセンサスなどのコンセンサス配列である。
本発明において使用することができる例示的なＨＩＶエンベロープタンパク質としては、ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサス（配列番号２）及びＨＩＶエンベロープクレードＢコンセンサス（配列番号４）が挙げられる。これらのＨＩＶエンベロープクレードＣ及びクレードＢコンセンサス配列は、例えば、安定性及び／若しくは三量体形成を増強する追加の変異、例えば、いわゆるＳＯＳＩＰ変異など、並びに／又は例えば、配列番号３に示されるＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列及び配列番号５に示されるＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ配列などの上記のフューリン切断部位における配列変異を含むことができる。
本発明において使用することができる好ましいＨＩＶエンベロープタンパク質配列の他の非限定的な例は、（「バックグラウンド」又は「親」分子として、その場合、６５０位が、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅに変異される）は、任意選択で上記の更なるＳＯＳＩＰ及び／又はフューリン切断部位変異を有する合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を含む。更なる非限定的な例は、モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質である。
特定の実施形態では、親分子は、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。このような親分子は、任意選択で、上記のようなＳＯＳＩＰ及び／又はフューリン切断部位変異を更に有し得る。
６５０位にアミノ酸がアミノ酸Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕで置換され、任意選択で表１に記載の（ｉ）～（ｘｖｉｉ）位に示されたアミノ酸で更に置換され、及び／又は任意選択で１０８位及び／又は５３８位にアミノ酸がアミノ酸Ｈｉｓで置換される変異を更に含む変異は、ＳＯＳＩＰ変異が存在しないＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質（例えば、Ｅｎｖコンセンサス配列又は野生型ＨＩＶ単離株由来のＥｎｖタンパク質）においても使用することができ、本発明の変異はＳＯＳＩＰ変異から独立しており、異なる作用様式を有するので、その三量体化も改善する可能性が高い。実際、追加の安定化変異は、例えば国際公開第２０１９／０１６０６２号に記載されているように、ＳＯＳ変異の不在下、並びにＨＩＶ Ｅｎｖ三量体化特性を改善するためのＩＰ変異の不在下、並びにＳＯＳＩＰ変異のいずれかの不在下を含めて、いくつかの異なるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質骨格において機能することが示された。したがって、特定の実施形態では、本発明によるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ＳＯＳＩＰ変異のいずれも含まない。更に他の実施形態では、三量体を更に安定化するためにＳＯＳＩＰ変異の代替物を使用することも可能である。特定の代替的な実施形態では、「ＳＯＳ」変異の代わりにリンカーが使用される。特定の代替的な実施形態では、「ＩＰ」変異の代わりに、５５６位及び／又は５５８位の一方若しくは両方がＰｒｏ残基によって置換される。
本発明の実施形態による組換えＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列中の特定の位置に特定のアミノ酸残基を有するＨＩＶエンベロープタンパク質を含む。特に、Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を改善するために、Ｅｎｖタンパク質中の６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕ残基に変異させることができることが示され、位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。加えて、任意の実施形態では、表１において、エンベロープタンパク質中のいくつかの位置、並びに同定された位置の１つ若しくは２つ以上又は各々において望ましい特定のアミノ酸残基が示され、位置の番号付けは、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う。本発明によるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅを有し、任意選択で、表１に提供される示された位置（ｉ）～（ｘｘ）のうちの少なくとも１つに特定のアミノ酸残基を有する。
６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、任意選択で１つ又は２つ以上の他の示された位置に１つ又は２つ以上の望ましいアミノ酸（又は示されたアミノ酸）置換が導入されたＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、「骨格ＨＩＶエンベロープ配列」又は「親ＨＩＶエンベロープ配列」と称される。例えば、配列番号３のＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列における位置６５０がＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕに変異する場合、それからＣｏＮＣ＿ＳＯＳＩＰ配列は、「骨格」又は「親」配列であると考えられる。任意のＨＩＶエンベロープタンパク質は、本発明の実施形態による新規安定化変異すなわち、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕによる６５０位におけるアミノ酸の置換が、単独で、又はいわゆるＳＯＳＩＰ変異及び／若しくはフューリン切断部位における変異などの他の変異と組み合わせて、導入され得る「骨格」又は「親」配列として使用され得る。骨格として使用され得るＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の非限定的な例としては、天然のＨＩＶ単離物由来のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、又はコンセンサスＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が挙げられる。
本発明の特定の実施形態によれば、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕを有することに加えて、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、表１の位置（ｉ）～（ｘｘ）からなる群から選択される示された位置のうちの少なくとも１つに示されたアミノ酸残基を任意選択で有し得る。典型的には、示された位置（ｉ）～（ｘｖｉｉｉ）における少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ等の置換の組み合わせを含む、好ましくは示された位置（ｉ）～（ｖｉｉｉ）における少なくとも２つ、少なくとも３つ等の置換の組み合わせを含むＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、そのような置換を有さないか、又はより少ないそのような置換を有する骨格タンパク質と比較して、改善された三量体化特性を有することが分かっている。例えば、国際公開第２０１９／０１６０６２号を参照されたい。
本発明の特定の実施形態によれば、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅを有することに加えて６５０位において、ＨＩＶエンベロープタンパク質は任意選択でまた、１０８位にＨｉｓ、又は５３８位にＨｉｓ、又は１０８位及び５３８位の両方にＨｉｓを有してもよい。これらは、本明細書中に示されるような改善された特性を独立して生じることが示された他の新規な変異である。これらの位置は互いに独立しており、特定の実施形態では、更なる改善をもたらすために組み合わせることができる。（６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕを有し、５３８位及び／又は１０８位にＨｉｓを有する）このような分子は、表１の位置（ｉ）～（ｘｖｉｉｉ）からなる群から選択される示された位置のうちの少なくとも１つに示されたアミノ酸残基を任意選択で更に有していてもよい。
好ましくは６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、及び／又は（ｉ）～（ｘｘ）のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、アミノ酸置換によって組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に導入される。例えば、示されたアミノ酸残基のうちの全て又は１つ若しくは２つ以上がアミノ酸置換によって組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に導入されるように、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕを含有しないか又は上記（ｉ）～（ｘｘ）のアミノ酸残基を全く含まないか若しくは１つだけを含むＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質から産生され得る。同様に、１０８位及び／又は５３８位にＨｉｓを、アミノ酸置換によって組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に導入することができる。
上記置換が導入されるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＨＩＶクレードＡ、クレードＢ、クレードＣなどからの天然に生じる配列；モザイク配列；コンセンサス配列、例えば、クレードＢ若しくはクレードＣコンセンサス配列；合成配列；又はその任意の誘導体若しくは断片など、本開示を考慮して当該技術分野で既知の任意のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり得る。本発明の特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列は、更なる変異（例えば、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、及び／又はフューリン切断部位における変異）を含む。
特定の一実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ骨格タンパク質は、５０１位及び６０５位にＣｙｓ；５５９位にＰｒｏからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。好ましい実施形態では、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、５０１位及び６０５位にＣｙｓ、並びに５５９位にＰｒｏを含む。この実施形態によれば、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列、及びこの位置にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕを生じる６５０位におけるアミノ酸置換、及び任意選択で、表１のエントリー（ｉ）～（ｘｖｉ）からなる群から選択される示された位置のうちの少なくとも１つにおいて示されたアミノ酸残基による１つ又は２つ以上の更なるアミノ酸置換を含む。
ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、フューリン切断部位における変異、例えば、配列番号６による６０８～５１１位における置換を更に含むことができる。
特定の一実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ骨格タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＣである。特定の実施形態では、配列番号２のＨＩＶコンセンサスクレードＣ配列は、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、すなわち、５０１位及び６０５位にＣｙｓ、並びに５５９位にＰｒｏを更に含み、特定の実施形態では、いわゆるＳＯＳＩＰ変異及びフューリン切断部位における変異、例えば、配列番号６による５０８～５１１位における置換などを更に含む。特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ骨格タンパク質は、配列番号３に示される配列、又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含み、配列番号６によって置換された５０１位、５５９位、６０５位、及び５０８～５１１位におけるアミノ酸は、配列番号３と比較して変異していない。
別の特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ骨格タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＢである。特定の実施形態では、配列番号４のＨＩＶコンセンサスクレードＢ配列は、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、すなわち、５０１位及び６０５位にＣｙｓ、並びに５５９位にＰｒｏを更に含み、特定の実施形態では、いわゆるＳＯＳＩＰ変異及びフューリン切断部位における変異、例えば、配列番号６による５０８位～５１１位における置換などを更に含む。特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ骨格タンパク質は、配列番号５に示される配列、又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含み、配列番号６によって置換された５０１位、５５９位、６０５位、及び５０８～５１１位におけるアミノ酸は、配列番号５と比較して変異していない。
更に別の特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ骨格タンパク質は、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、これは、上記のように、更なるＳＯＳＩＰ（５０１Ｃ、６０５Ｃ、５５９Ｐ）及び／又はフューリン切断部位変異（５０８～５１１ＲＲＲＲＲＲ）を任意選択で有し得る。
更に他の特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ骨格タンパク質は、野生型クレードＡ、クレードＢ、又はクレードＣ ＨＩＶウイルス由来のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、任意選択で、国際公開第２０１８／０５０７４７号及び国際公開第２０１９／０１６０６２号に記載されている方法に従って配列を修復及び／又は安定化するための追加の変異を含む。
本発明の特定の実施形態では、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質（すなわち、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕを有し、任意選択で、上記表１の位置（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に１つ又は２つ以上の示されたアミノ酸を有する）は、表１の（ｉｘ）～（ｘｖｉ）位からなる群より選択される１つ又は２つ以上の更なる示された位置に示されたアミノ酸残基を（例えば、置換を介して）更に含み得る。アミノ酸置換は、以前に、例えば国際公開第２０１９／０１６０６２号に記載されている。これらのアミノ酸置換のいくつか（例えば、（ｉｘ））は、変異（ｉ）～（ｖｉｉｉ）（の組み合わせ）と非常に良好に組み合わされることが見出された（例えば、国際公開第２０１９／０１６０６２号を参照されたい）。しかしながら、本発明者らの知る限りでは、これらの以前に記載された変異は、本明細書に記載される新規置換、すなわち、６５０位におけるＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕと組み合わせて記載されなかった。本発明のアミノ酸の置換と組み合わせたこれらのアミノ酸の変異は、三量体の収率及び／又は三量体形成のパーセンテージを更に増加させることができる。これらのアミノ酸置換は、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕアミノ酸残基による置換に加えて、本明細書に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のいずれかに導入することができ、任意選択で、表１に記載のうちの１つ又は２つ以上の示された位置の示されたアミノ酸残基及び／又は１０８位及び／又は５３８位にＨｉｓによる更なる置換を有する。本発明において同定された置換［６５０位にＷ、Ｆ、Ｍ、又はＬ；並びに同様に５３８位にＨ及び１０８位にＨ］は、本発明者らの知る限り、天然（Ｍ群、すなわち全体）には存在しない。ＨＩＶ Ｅｎｖ配列は、以前に報告されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質配列において表１の置換（ｉ）～（ｘｘ）のいずれとも組み合わせて見出されず、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体化の改善、三量体収率の改善及び／又は三量体安定性の増加をもたらすことは以前に示唆されていなかった。明らかに、以前に記載された変異は、本発明の変異の導入についていかなる示唆も提供せず、ましてや、例えばＰＧＴ１４５結合によって測定されるような閉鎖尖部を有する三量体形成に対するその驚くべき効果を提供しなかった。表１中の点変異（ｉｘ）～（ｘｉｉｉ）とは別に、Ｅｎｖタンパク質のＨＲ１ループ（ＨＸＢ２分離株のｇｐ１６０に従って番号付けを伴う、野生型配列中のアミノ酸残基５４８～５６８）を、７～１０アミノ酸を有するより短く柔軟性の低いループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば（配列番号９～１４）のうちのいずれか１つから選択される配列を有するループによって置換することも可能であり、例えば、ＨＲ１ループを置換するそのようなより短いループを記載しているＫｏｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ｊｕｎ ２８；７：１２０４０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２０４０）を参照されたい。６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕアミノ酸残基を更に有し、任意選択で、示された位置（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの少なくとも１つに示されたアミノ酸残基を有するこのようなＥｎｖバリアントもまた、本発明の実施形態である。（ｉｘ）～（ｘｉｖ）に列挙される変異は、本発明の特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質（すなわち、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕを有する）に付加され得る。更なる実施形態では、これらは、（ｉ）～（ｖｉｉｉ）位における示されたアミノ酸のうちの１つ又は２つ以上への変異と組み合わせられ得る。また、群（ｉｘ）～（ｘｉｖ）内の組み合わせを行うことができる。
再び、これらの実施形態のいずれかは、任意のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、例えば、野生型単離物、コンセンサスＥｎｖ、合成Ｅｎｖタンパク質、ＳＯＳＩＰ変異体Ｅｎｖタンパク質などにおけるものであり得る。
特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、配列番号２～５のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％同一、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％同一、又は１００％同一である配列を含む。同一性％の決定のために、好ましくは６５０位、及び好ましくは更に表１の（ｉ）－（ｘｖｉ）位、及び好ましくは１０８、５０１、５３８、５５９及び６０５位は、考慮されない。６５０位におけるＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅが、Ｅｎｖタンパク質の三量体パーセンテージ及び三量体収率を増加させることが見出された。
本発明の実施形態によれば、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕを有さないが更に同一であるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質と比較して（好ましくは６５０位にＧｌｎを有するが更に同一であるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質と比較して）、（ａ）三量体形成のパーセンテージの改善、及び（ｂ）三量体収率の改善のうちの少なくとも１つを有する。
本明細書で使用される場合、「三量体形成のパーセンテージの改善」は、ＨＩＶエンベロープ配列の骨格配列が６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅを含有する場合に、ＨＩＶエンベロープタンパク質の骨格配列が６５０位にＧｌｎ残基を含有する場合に形成される三量体のパーセンテージと比較して、より高いパーセンテージの三量体が形成されることを意味する（Ｇｌｎは、この位置でＨＩＶ－１ Ｅｎｖの天然クレードＣバリアントの大部分に存在するアミノ酸である）。より一般的には、「三量体形成のパーセンテージの改善」は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の骨格配列がＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅへの６５０位におけるアミノ酸置換、及び任意選択で表１に記載された１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む場合、ＨＩＶエンベロープ配列の骨格配列がこのようなアミノ酸置換を含まない場合に形成される三量体のパーセンテージと比較して、より高いパーセンテージの三量体が形成されることを意味する。本明細書で使用される場合、「改善された三量体収率」は、ＨＩＶエンベロープ配列の骨格配列が６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ（好ましくは、Ｔｒｐ又はＰｈｅ）を含む場合に、ＨＩＶエンベロープ配列の骨格配列が６５０位にＧｌｎ残基を含む場合に得られるエンベロープタンパク質の三量体型の総量と比較して、より多い総量のエンベロープタンパク質の三量体型が得られることを意味する。より一般的には、「改善された三量体収率」は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の骨格配列が表１に記載のアミノ酸置換のうちの１つ又は２つ以上を含有する場合に、ＨＩＶエンベロープ配列の骨格配列がそのようなアミノ酸置換を含有しない場合に得られるエンベロープタンパク質の三量体型の総量と比較して、より多い総量のエンベロープタンパク質の三量体型が得られることを意味する。
三量体形成は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体型に特異的に結合する抗体を用いた抗体結合アッセイによって測定することができる。三量体型を検出するために使用することができる三量体特異的抗体の例としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＧＴ１４５、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧ１６、及びＰＧＴ１５１が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、三量体特異的抗体は、ｍＡｂ ＰＧＴ１４５である。本開示を考慮して、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成のパーセンテージを測定するために、ＥＬＩＳＡ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡなどの当該技術分野で既知の任意の抗体結合アッセイを使用することができる。
特定の実施形態では、三量体形成は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって測定される。ＡｌｐｈａＬＩＳＡは、ドナービーズの高エネルギー照射によって生成された一重項酸素分子が、ドナービーズに対して約２００ｎｍの距離内にあるアクセプタビーズに移動される、ビーズベースの近接アッセイである。一重項酸素分子のアクセプタビーズへの移動は、カスケードする一連の化学反応を開始させ、その結果、化学発光シグナルが生じ、次いで、これを検出することができる（Ｅｇｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，２５（１）：２－１０）。例えば、Ｆｌａｇ－Ｈｉｓタグで標識された組換えＨＩＶエンベロープタンパク質は、三量体特異的ｍＡｂ、三量体特異的ｍＡｂに結合する抗体にコンジュゲートされたドナービーズ、ニッケルをコンジュゲートされたドナービーズ、抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートされたアクセプタビーズ、及び抗Ｆｌａｇ抗体にコンジュゲートされたアクセプタビーズと共にインキュベートされ得る。形成された三量体の量は、三量体特異的ｍＡｂに結合する抗体にコンジュゲートされたドナービーズ及び抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートされたアクセプタビーズの対から生成される化学発光シグナルを測定することによって決定することができる。発現されたＨＩＶエンベロープタンパク質の総量は、ニッケルをコンジュゲートされたドナービーズ及び抗Ｆｌａｇをコンジュゲートされたアクセプタビーズの対から生成された化学発光シグナルを測定することによって決定され得る。例えば、発現される三量体及び総エンベロープタンパク質の量は、国際公開第２０１９／０１６０６２号の実施例３に詳細に記載されているようなＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。三量体形成のパーセンテージは、形成された三量体の量を、発現されたエンベロープタンパク質の総量で割ることによって計算することができる。特定の実施形態では、三量体形成は、広域中和ＨＩＶ Ｅｎｖ結合抗体ＰＧＴ１４５、ＰＧＤＭ１４００、又はその両方への結合によって測定され、同じ条件下で（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて）、本発明の変異を有さない親化合物へのそのような結合と比較される（そのような抗体の各々は、以前に記載されているように（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４６：６９０－７０２を参照されたい、補足情報を含む）、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラムなどの様々な供給源から、若しくはＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能であるか、又はそれらの既知の配列に基づいて組換え産生することができる。本明細書に記載される他の有用な抗体もまた、先行技術から既知であり、同様の手段によって得ることができる）。特定の実施形態では、抗体ＰＧＴ１４５及び／又はＰＧＤＭ１４００への結合は、ＨＩＶ Ｅｎｖ親タンパク質と比較して本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質について増加し、特定の実施形態では、非広域中和抗体１７ｂへの結合は、ＨＩＶ Ｅｎｖ親タンパク質と比較して本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質についてほぼ同じであるか、又は好ましくは減少する。
形成された三量体の量及び発現されたエンベロープタンパク質の総量は、三量体型をＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態、例えば、単量体型から分離し得るクロマトグラフィ技術を使用して決定され得る。使用することができる技術の例としては、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、例えば、分析ＳＥＣ、又はＳＥＣ多角度光散乱（SEC multi-angle light scattering、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、三量体形成のパーセンテージは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ又は（分析）ＳＥＣを使用して決定される。特定の実施形態によれば、三量体収率は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ又は（分析）ＳＥＣを使用して決定される。
本発明は、特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を改善する方法であって、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の６５０位における残基（典型的にはＧｌｎ）を、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅで置換することを含む方法も提供する。これは、例えば、標準的な分子生物学技術を使用して行うことができる。
核酸、ベクター、及び細胞
別の一般的な態様では、本発明は、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸分子、及び核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態であってもよく、又はクローニングによって得られたＤＮＡの形態であってもよく、又は合成的に生成されたものであってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。核酸分子及びベクターは、組換えタンパク質産生、宿主細胞におけるタンパク質の発現、又はウイルス粒子の産生のために使用することができる。
別の一般的な態様では、本発明は、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸分子、及び核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態であってもよく、又はクローニングによって得られたＤＮＡの形態であってもよく、又は合成的に生成されたものであってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。核酸分子及びベクターは、組換えタンパク質産生、宿主細胞におけるタンパク質の発現、又はウイルス粒子の産生のために使用することができる。
特定の実施形態では、本発明に従ってタンパク質をコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、又は昆虫細胞での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は既知であり、以前にも記載されている（例えば哺乳動物細胞の場合は国際公開第９６／０９３７８号）。野生型配列と比較して、少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えられている場合、配列はコドン最適化されていると考えられる。本明細書では、好ましくないコドンは、同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも生物中であまり頻繁に使用されないコドンであり、より好ましいコドンは、好ましくないコドンよりも生物においてより頻繁に使用されるコドンである。特定の生物のコドン使用頻度は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎなどのコドン頻度表に見出すことができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは大部分の又は全ての好ましくないコドンは、より好ましいコドンに置き換えられる。好ましくは、生物中の最も頻繁に使用されるコドンが、コドン最適化配列で使用される。好ましいコドンによる置換は、一般に、より高い発現をもたらす。
多数の異なるポリヌクレオチド及び核酸分子が、遺伝子コードの縮重の結果として同じタンパク質をコードすることができることが当業者によって理解されるであろう。また、当業者であれば、慣例の技術を使用して、核酸分子によってコードされるタンパク質配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行って、タンパク質が発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映することができると理解される。したがって別途記載のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、かつ同一のアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでも含まなくてもよい。
核酸配列は、慣例の分子生物学的技術を使用してクローニングされ、又はＤＮＡ合成によって新規に生成され得るが、これは、ＤＮＡやＲＮＡの合成や分子クローニングの分野で事業を有するサービス会社により慣例の手順を使用して実施され得る。
本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸はまた、例えば、ｍＲＮＡの形態にあってもよい。このようなｍＲＮＡは、例えば、細胞培養においてＥｎｖタンパク質を産生するために直接使用され得るが、ワクチン接種を介して、例えば、リポソーム又は脂質ナノ粒子などの薬物送達ビヒクル中のｍＲＮＡを投与することによっても、使用され得る。核酸又はｍＲＮＡはまた、例えばアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの自己複製機構に基づく自己増幅ＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡの形態であってもよい。そのような自己複製ＲＮＡ（又はｒｅｐＲＮＡ若しくはＲＮＡレプリコン）は、子孫ウイルスを産生することなく、細胞内でそれ自体の複製増幅を指示することができるように、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を発現するＲＮＡ分子の形態にあってもよい。例えば、ｒｅｐＲＮＡは、５’及び３’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列、抗原（例えば、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質）をコードする異種遺伝子、及び抗原を発現するための手段、並びにポリアデニル化トラクトを含み得る。そのようなｒｅｐＲＮＡは、宿主内の広範囲の組織において一過性の高レベル抗原発現を誘導し、分裂細胞及び非分裂細胞の両方において作用することができる。ｒｅｐＲＮＡは、ｒｅｐＲＮＡが放出され、ウイルスレプリコン粒子（viral replicon particle、ＶＲＰ）にパッケージングされるＤＮＡ分子として、又は裸の修飾若しくは非修飾ＲＮＡ分子として細胞に送達することができる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオシド修飾されていてもよく、例えば、ｍＲＮＡ又は複製ＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１１／０３００２０５号に記載されているものなどの修飾核酸塩基を含有することができる。ｒｅｐＲＮＡの非限定的な例は、国際公開第２０１９／０２３５６６号に見出すことができる。非限定的な実施形態では、ｍＲＮＡワクチン及び自己増幅ＲＮＡワクチンは、例えば、（Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １７：２６１－２７９）及び（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５９４）で説明されているワクチンの形式とバリエーションが含まれる場合がある。
本発明の実施形態によれば、組換えＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されており、これは、核酸がプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、相同プロモーター（すなわち、ベクターと同じ遺伝子源に由来する）又は異種プロモーター（すなわち、異なるベクター又は遺伝子源に由来する）であり得る。好適なプロモーターの非限定的な例としては、ヒトサイトメガロウイルス最初期（human cytomegalovirus immediate early、ｈＣＭＶ ＩＥ）（ｈＣＭＶ ＩＥ、又は略して「ＣＭＶ」）プロモーター及びラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内の核酸の上流に位置する。
本発明による核酸は、ベクターに組み込むことができる。特定の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。本発明の実施形態によれば、ベクターは、発現ベクターであり得る。発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、組換えタンパク質を発現させるためのベクター、及びウイルスベクターなどの、対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるためのベクターなどが挙げられる。本発明との使用のために好適なウウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、修飾ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara、ＭＶＡ）ベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウキク脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、ウイルス感染ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。このベクターは非ウイルスベクターでもあり得る。非ウイルスベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられる。
本発明の特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、組換えアデノウイルスベクター）である。組換えアデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ又はＡｄＨｕ）、又はチンパンジー若しくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、又はＳＡｄＶ）などのサルアデノウイルス、又はアカゲザルアデノウイルス（rhesus adenovirus、ｒｈＡｄ）に由来し得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば、組換えヒトアデノウイルス血清型２６、又は組換えヒトアデノウイルス血清型５、４、３５、７、４８などのうちのいずれか１つである。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｒｈＡｄベクター、例えばｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２又はｒｈＡｄ５３である。他の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＣｈＡｄＯｘ １（例えば、国際公開第２０１２／１７２２７７号を参照されたい）、又はＣｈＡｄＯｘ ２（例えば、国際公開第２０１８／２１５７６６号を参照されたい）、又はＢＺ２８（例えば、国際公開第２０１９／０８６４６６号を参照されたい）などのチンパンジーアデノウイルスに基づく。他の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＢＬＹ６（例えば、国際公開第２０１９／０８６４５６号を参照されたい）又はＢＺ１（例えば、国際公開第２０１９／０８６４６６号を参照されたい）などのゴリラアデノウイルスに基づく。
組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野において周知である。例えば、組換えアデノウイルス２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号及びＡｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ．８１（９）：４６５４－６３に記載されている。アデノウイルス２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４及び国際公開第２００７／１０４７９２号の配列番号１に見出される。ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２及びｒｈＡｄ５３についての例示的なゲノム配列は、米国特許出願公開第２０１５／０２９１９３５号に提供されている。
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のいずれかは、本明細書に記載のベクターのいずれかによって発現及び／又はコードされ得る。遺伝的コードの縮重を考慮して、当業者は、当該技術分野において完全に慣例の方法に従って、同じタンパク質をコードするいくつかの核酸配列を設計することができることを十分に承知している。本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸は、任意選択で宿主細胞（例えば、細菌細胞や哺乳動物細胞）における適切な発現を確実にするようにコドン最適化することができる。コドン最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術である。
本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子及びベクターのいずれかを含む細胞、好ましくは単離された細胞を提供する。細胞は、例えば、組換えタンパク質産生のため、又はウイルス粒子の産生のために使用することができる。
したがって、本発明の実施形態はまた、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を作製する方法に関する。この方法は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の実施形態に従う組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることと、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条件下でトランスフェクトされた細胞を増殖させることと、任意選択で、細胞において発現された組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を精製又は単離することと、を含む。組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィなどを含む当該技術分野で既知の任意の方法によって、細胞から単離又は収集され得る。組換えタンパク質発現のために使用される技術は、本開示を考慮して当業者に周知である。発現された組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はまた、例えば、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされ、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条件下で増殖された細胞の上清を分析することによって、発現されたタンパク質を精製又は単離することなく、研究され得る。
好ましい実施形態では、発現された組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、安定化された三量体複合体を形成するように、タンパク質の会合を可能にする条件下で精製される。例えば、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結された組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、３３～３９℃、例えば、３７℃、及び２～１２％ＣＯ２、例えば、８％ＣＯ２で培養され得る。発現はまた、昆虫細胞又は酵母細胞のような代替的な発現系において実施されてもよく、これらは全て当該技術分野において慣習的である。次いで、発現されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を、例えば糖タンパク質に結合するレクチンアフィニティクロマトグラフィによって細胞培養物から単離することができる。カラムに結合したＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をマンノピラノシドで溶出することができる。カラムから溶出されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を、必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィなどの更なる精製工程に供して、あらゆる残留夾雑物、例えば、細胞夾雑物だけでなく、Ｅｎｖ凝集体、ｇｐ１４０単量体及びｇｐ１２０単量体も除去することができる。抗体アフィニティクロマトグラフィ、非ｂＮＡｂによる陰性選択、抗タグ精製、又はイオン交換クロマトグラフィなどの他のクロマトグラフィ法を含む非限定的な例である代替精製法、並びに当該技術分野で既知の他の方法も、発現されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を単離するために使用することができる。
本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸分子及び発現ベクターは、本開示を考慮して当該技術分野で既知の任意の方法によって作製することができる。例えば、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸は、当業者に周知である遺伝子操作技術及び分子生物学技術（例えば、部位特異的変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）など）を使用して、示された位置で１つ又は２つ以上のアミノ酸置換をコードする変異を骨格ＨＩＶエンベロープ配列に導入することによって、調製され得る。次いで、この核酸分子は、また標準的な分子生物学技術を使用して、発現ベクターに導入又は「クローニング」され得る。次いで、組換えＨＩＶエンベロープタンパク質は、宿主細胞において発現ベクターから発現されてもよく、発現されたタンパク質は、本開示を考慮して当該技術分野で既知の任意の方法によって細胞培養物から精製され得る。
三量体複合体
別の一般的な態様では、本発明は、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のうちの３つの非共有結合オリゴマーを含む三量体複合体に関する。三量体複合体は、本明細書に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のいずれかを含むことができる。好ましくは、三量体複合体は、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の３つの同一の単量体（又はｇｐ１４０が切断されている場合は同一のヘテロ二量体）を含む。三量体複合体は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態（例えば、単量体型）から分離され得るか、又は三量体複合体は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態（例えば、単量体型）と一緒に存在し得る。
別の一般的な態様では、本発明は、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のうちの３つの非共有結合オリゴマーを含む三量体複合体に関する。三量体複合体は、本明細書に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のいずれかを含むことができる。好ましくは、三量体複合体は、本発明による組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の３つの同一の単量体（又はｇｐ１４０が切断されている場合は同一のヘテロ二量体）を含む。三量体複合体は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態（例えば、単量体型）から分離され得るか、又は三量体複合体は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態（例えば、単量体型）と一緒に存在し得る。
組成物及び方法
別の一般的な態様では、本発明は、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離された核酸、ベクター、又は宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。組成物は、本明細書に記載される組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離された核酸分子、ベクター、又は宿主細胞のいずれかを含み得る。
別の一般的な態様では、本発明は、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離された核酸、ベクター、又は宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。組成物は、本明細書に記載される組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離された核酸分子、ベクター、又は宿主細胞のいずれかを含み得る。
担体は、結合剤、崩壊剤、膨潤剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤、保存剤、色素、可溶化剤及びコーティングなどの１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば、筋肉内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸内）、鼻腔内又は腹腔内経路などに応じて決まり得る。注射液体製剤の場合、例えば、懸濁液及び溶液、好適な担体及び添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、保存剤、着色剤などが挙げられる。経口固形製剤の場合、例えば、散剤、カプセル剤、カプレット、ゲルキャップ、及び錠剤、好適な担体及び添加剤としては、デンプン、糖類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤が挙げられる。鼻腔スプレー／吸入剤混合物の場合、水溶液／懸濁液は、好適な担体及び添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟化剤、安定剤、湿潤剤、保存剤、芳香剤、香料などを含み得る。
本発明の組成物は、経口（経腸）投与及び非経口注射を含むがこれらに限定されない、投与を容易にし、有効性を改善するために、対象への投与に好適な任意の様式で製剤化することができる。非経口注射には、静脈内注射又は注入、皮下注射、皮内注射、及び筋肉内注射が挙げられる。本発明の組成物は、経粘膜、眼、直腸、長時間作用型移植、舌下投与、舌下、門脈循環を迂回する口腔粘膜から、吸入、又は鼻腔内を含む他の投与経路のために製剤化することもできる。
本発明の実施形態はまた、組成物を作製する方法に関する。本発明の実施形態によれば、組成物を産生する方法は、本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離された核酸、ベクター、又は宿主細胞を、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される担体と混合することを含む。当業者は、このような組成物を調製するために使用される従来の技術に精通している。
ＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子産物に由来するタンパク質又はその断片）及びＨＩＶ抗原を発現するウイルスベクターなどのベクターは、ＨＩＶ感染に対して対象にワクチン接種するために、又は対象においてＨＩＶ感染に対する免疫応答を生じさせるために、免疫原性組成物及びワクチンにおいて以前から使用されている。本明細書で使用される場合、「対象」は、本発明の実施形態に従って免疫原性組成物を投与される、又は投与された動物、哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、好ましくはヒトが挙げられる。本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はまた、それを必要とする対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するための抗原として使用され得る。免疫応答は、クレードＡ、クレードＢ、クレードＣなどの１つ又は２つ以上のＨＩＶクレードに対するものであり得る。組成物は、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が発現されるベクターを含むことができるか、又は組成物は、本発明の実施形態による単離された組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を含むことができる。
例えば、組換えＨＩＶタンパク質又はその三量体複合体を含む組成物を、それを必要とする対象に投与して、対象におけるＨＩＶ感染に対する免疫応答を誘導することができる。本発明の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードするアデノウイルスベクターなどのベクターを含む組成物であって、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質がベクターによって発現される組成物を、それを必要とする対象に投与して、対象におけるＨＩＶ感染に対する免疫応答を誘導することもできる。本明細書に記載の方法はまた、本発明の組成物を、好ましくはアデノウイルスベクター又はＭＶＡベクターなどの１つ又は２つ以上のベクターから発現される１つ又は２つ以上の追加のＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ、及び／又はｅｎｖ遺伝子産物に由来するタンパク質又はその断片）と組み合わせて投与することを含み、免疫応答をプライミング及びブースティングする方法を含む。
特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、任意選択で内因性及び／又は外因性アジュバントと組み合わせて、リポソーム、ウイルス様粒子（virus-like particle、ＶＬＰ）、ナノ粒子、ビロソーム、又はエキソソームなどの粒子上に提示され得る。可溶性又は単量体Ｅｎｖタンパク質それ自体と比較した場合、このような粒子は、代表的には、インビボでの抗原提示の増強された効力を示す。
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提示するＶＬＰの例は、例えば、ＨＩＶ Ｇａｇコア又は他のレトロウイルスＧａｇタンパク質などの自己集合性ウイルスタンパク質とＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を同時発現させることによって、調製することができる。ＶＬＰは、ウイルスに似ているが、ウイルス性遺伝子物質を含まないので非感染性である。ウイルス構造タンパク質（例えば、エンベロープ又はキャプシド）の発現は、ＶＬＰの自己集合を生じ得る。ＶＬＰは、当業者によく知られており、ワクチンにおけるそれらの使用は、例えば、（Ｋｕｓｈｎｉｒ ｅｔ ａｌ、２０１２）に記載されている。
特定の好ましい実施形態では、粒子はリポソームである。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状小胞である。ＨＩＶ Ｅｎｖ三量体タンパク質は、例えば、静電相互作用によって、例えば、ＨｉｓタグをＨＩＶ Ｅｎｖ三量体のＣ末端及びリポソーム中の誘導体化脂質の頭部基に組み込まれたＮｉ２＋又はＣｏ２＋などの二価キレート原子への付加によって、このようなリポソームに非共有結合的に結合させることができる。特定の非限定的かつ例示的な実施形態では、リポソームは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［（Ｎ－（５－アミノ－１－カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］のニッケル塩又はコバルト塩（ＤＧＳ－ＮＴＡ（Ｎｉ２＋）又はＤＧＳ－ＮＴＡ（Ｃｏ２＋））を、６０：３６：４のモル比で含む。好ましい実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ三量体タンパク質は、例えば、リポソーム表面に組み込まれたマレイミド官能基を介して、リポソーム表面に共有結合的に結合される。特定の非限定的な例示的実施形態では、リポソームは、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［４－（ｐ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－カルボキサミド］脂質を、５４：３０：１６のモル比で含む。ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、例えば、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質中の付加されたＣ末端システインを介して、それに結合することができる。共有結合的に結合したバリアントは、より安定であり、高い抗原特異的ＩｇＧ力価を誘発し、Ｅｎｖ三量体の抗原的に関連性の低い「底部」のエピトープがマスクされる。リポソームに結合したＨＩＶ Ｅｎｖ三量体を調製するための方法、並びにそれらの特徴付けは既知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる（Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ，２０１７）に記載されている。本発明はまた、リポソームに融合及び／又はリポソーム上に提示された本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、自己集合性粒子に融合されるか、又はナノ粒子上に提示される。抗原ナノ粒子は、抗原、例えば、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の複数のコピーを提示するポリペプチドの集合体であり、複数の結合部位（アビディティ）をもたらし、改善された抗原安定性及び免疫原性を提供することができる。ワクチンにおける使用のための自己集合性タンパク質ナノ粒子の調製及び使用は、当業者に周知であり、例えば、（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１４）、（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ ｅｔ ａｌ，２０１６）を参照されたい。非限定的な例として、自己集合性ナノ粒子は、フェリチン、バクテリオフェリチン、又はＤＰＳに基づくことができる。表面にタンパク質を提示するＤＰＳナノ粒子は、例えば国際公開第２０１１／０８２０８７号に記載されている。このような粒子上の三量体ＨＩＶ－１抗原の記載は、例えば、（Ｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）に記載されている。他の自己集合性タンパク質ナノ粒子並びにその調製は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１２４３０１号及び米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号に開示されている。本発明はまた、自己集合性ナノ粒子に融合及び／又は自己集合性ナノ粒子上に提示された本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明によるＶＬＰ、リポソーム、又は自己集合性ナノ粒子を含む組成物を提供する。
特定の実施形態では、アジュバントは、本発明の組成物中に含まれるか、又は本発明の組成物と同時投与される。アジュバントの使用は任意選択であり、組成物がワクチン接種目的で使用される場合、免疫応答を更に増強し得る。本発明による組成物中への同時投与又は包含に好適なアジュバントは、好ましくは、潜在的に安全であり、十分に許容され、ヒトにおいて有効であるべきである。そのようなアジュバントは当業者に周知であり、非限定的な例としては、ＱＳ－２１、Ｄｅｔｏｘ－ＰＣ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭｏＧＭ－ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ－Ｇ、ＣＲＬ－１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ－０２６、ＧＳＫ－Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ－アレチン、ＭＰＣ－０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、リン酸アルミニウム（例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ）又は水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、及びＭＦ５９が挙げられる。
それぞれ、ＨＩＶエンベロープコンセンサスクレードＣ配列及びコンセンサスクレードＢ配列を表す配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組換えＨＩＶエンベロープタンパク質もまた、本明細書に開示される。配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組換えＨＩＶエンベロープタンパク質は、例えば、配列番号３、又は５５８位及び／若しくは５５６位にＰｒｏを更に含む配列番号３並びに配列番号５、又は５５８位及び／若しくは５５６位にＰｒｏを更に含む配列番号５に示される配列におけるような、いわゆるＳＯＳＩＰ変異及び／又はフューリン切断部位における変異を、任意選択で更に含み得る。これらの配列の同一性％を決定する場合、変異フューリン切断部位並びに５０１位、６０５位、５５９位、５５６位及び５５８位におけるアミノ酸は、好ましくは考慮されない。このようなタンパク質は、高レベルで発現され、高レベルの安定性及び三量体形成を有する。このようなＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、特定の実施形態では、骨格タンパク質として使用されることがあり、Ｔ５３８のＨへの変異は、本発明の分子を得るためになされ得る。これらの配列をコードする単離された核酸分子、プロモーターに作動可能に連結されたこれらの配列を含むベクター、及びタンパク質、単離された核酸分子、又はベクターを含む組成物もまた開示される。
実施例１：６５０位のＨＩＶエンベロープのＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕへの変異は、三量体収率を増加させる
ＳＯＳＩＰ変異（５０１位及び６０５位にシステイン並びに５５９位にプロリン）を含むＨＩＶクレードＣ及びクレードＢエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質コンセンサス配列、並びに５０８～５１１位にフューリン部位を６アルギニンで置換することによって最適化されたフューリン切断部位を、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成に対する６５０位に変異の影響を研究するための骨格配列として使用した。加えて、Ｃ末端を残基６６４で短縮化して、可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０タンパク質をコードする配列を得た。更に、クレードＣバリアント（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ）において２９５位にＶａｌをＡｓｎ（Ｖ２９５Ｎ）に変異させて、ＨＩＶ株の大部分に存在し、いくつかの実験に使用される特定の抗体への結合を改善することができるＮ連結グリコシル化部位を作製した。上記の置換／修飾の全ての位置は、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに対するものである。それぞれ「ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」及び「ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ」と称される骨格クレードＣ及びクレードＢ ＨＩＶ ｇｐ１４０配列を、（配列番号３及び５）に示す。特に、これらの骨格分子において、６５０位にＧｌｎ残基をＴｒｐ残基により置換した（Ｑ６５０Ｗ変異、「本発明の変異」のうちの１つとも称される）。加えて、６５０位におけるＧｌｎ残基もまた、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ骨格においてＰｈｅ（Ｑ６５０Ｆ）、Ｍｅｔ（Ｑ６５０Ｍ）、Ｉｌｅ（Ｑ６５０Ｉ）又はＬｅｕ（Ｑ６５０Ｌ）残基によって置換されており、そのうちＱ６５０Ｆ、Ｑ６５０Ｍ、及びＱ６５０Ｌは、「本発明の変異」とも称される）。同様に、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ骨格において、１０８位におけるＩｌｅ残基を、Ｈｉｓ残基により置換した（Ｉ１０８Ｈ変異）。同様に、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ骨格において、５３８位におけるＴｈｒ残基を、Ｈｉｓ残基により置換した（Ｔ５３８Ｈ変異）。得られた組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を、可溶性ｇｐ１４０タンパク質として発現させた。実験は、例えば国際公開第２０１８／０５０７４７号に記載されているような既知の方法に従って実施した。
ＳＯＳＩＰ変異（５０１位及び６０５位にシステイン並びに５５９位にプロリン）を含むＨＩＶクレードＣ及びクレードＢエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質コンセンサス配列、並びに５０８～５１１位にフューリン部位を６アルギニンで置換することによって最適化されたフューリン切断部位を、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成に対する６５０位に変異の影響を研究するための骨格配列として使用した。加えて、Ｃ末端を残基６６４で短縮化して、可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０タンパク質をコードする配列を得た。更に、クレードＣバリアント（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ）において２９５位にＶａｌをＡｓｎ（Ｖ２９５Ｎ）に変異させて、ＨＩＶ株の大部分に存在し、いくつかの実験に使用される特定の抗体への結合を改善することができるＮ連結グリコシル化部位を作製した。上記の置換／修飾の全ての位置は、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに対するものである。それぞれ「ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」及び「ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ」と称される骨格クレードＣ及びクレードＢ ＨＩＶ ｇｐ１４０配列を、（配列番号３及び５）に示す。特に、これらの骨格分子において、６５０位にＧｌｎ残基をＴｒｐ残基により置換した（Ｑ６５０Ｗ変異、「本発明の変異」のうちの１つとも称される）。加えて、６５０位におけるＧｌｎ残基もまた、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ骨格においてＰｈｅ（Ｑ６５０Ｆ）、Ｍｅｔ（Ｑ６５０Ｍ）、Ｉｌｅ（Ｑ６５０Ｉ）又はＬｅｕ（Ｑ６５０Ｌ）残基によって置換されており、そのうちＱ６５０Ｆ、Ｑ６５０Ｍ、及びＱ６５０Ｌは、「本発明の変異」とも称される）。同様に、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ骨格において、１０８位におけるＩｌｅ残基を、Ｈｉｓ残基により置換した（Ｉ１０８Ｈ変異）。同様に、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ骨格において、５３８位におけるＴｈｒ残基を、Ｈｉｓ残基により置換した（Ｔ５３８Ｈ変異）。得られた組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を、可溶性ｇｐ１４０タンパク質として発現させた。実験は、例えば国際公開第２０１８／０５０７４７号に記載されているような既知の方法に従って実施した。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）は、ドナービーズの高エネルギー照射によって生成された一重項酸素分子が、約２００ｎｍの距離内にあるアクセプタビーズに移動する、ビーズベースの近接アッセイである。これは、洗浄工程を必要としない高感度ハイスループットスクリーニングアッセイである。化学反応のカスケードシリーズは、化学発光シグナルをもたらす（Ｅｇｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８）。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイのために、構築物は、ソルターゼＡ－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓタグ（配列番号１５）を備えていた。ＨＩＶ構築物をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞中で発現させ、これを９６ウェルプレート（２００μｌ／ウェル）中で３日間培養した。粗上清を、上清を１２倍に希釈した１７ｂベースのアッセイを除き、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０＋０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１２０倍に希釈した。続いて、これらの希釈物１０μｌをハーフエリア９６ウェルプレートに移し、アクセプタビーズ、ドナービーズ及びｍＡｂの４０μｌ混合物と混合した。ビーズを使用前によく混合した。振とうせずに室温で２時間インキュベートした後、シグナルをＮｅｏ（ＢｉｏＴｅｋ）で測定した。ドナービーズを、ｍＡｂに結合することができるＰｒｏｔＡ（カタログ番号：ＡＳ１０２Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートした。アクセプタビーズを抗Ｈｉｓ抗体（カタログ番号：ＡＬ１１２Ｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートし、タンパク質のＨｉｓタグを検出した。総タンパク質レベルの定量化には、ニッケルコンジュゲートドナービーズ（カタログ番号：ＡＳ１０１Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と抗Ｆｌａｇ抗体を有するアクセプタビーズ（カタログ番号：ＡＬ１１２Ｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）との組み合わせを使用した。ｓＣＤ４－Ｈｉｓと組み合わせた１７ｂについては、ＰｒｏｔＡドナービーズ及び抗Ｆｌａｇアクセプタビーズの組み合わせを使用した。偽トランスフェクション（Ｅｎｖなし）の平均シグナルを、異なるＥｎｖタンパク質について測定されたＡｌｐｈａＬＩＳＡカウントから差し引いた。参照として、それぞれ、親ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ又はＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖプラスミドを、クレードＣ及びクレードＢ Ｅｎｖ変異体のために、使用した。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）は、ドナービーズの高エネルギー照射によって生成された一重項酸素分子が、約２００ｎｍの距離内にあるアクセプタビーズに移動する、ビーズベースの近接アッセイである。これは、洗浄工程を必要としない高感度ハイスループットスクリーニングアッセイである。化学反応のカスケードシリーズは、化学発光シグナルをもたらす（Ｅｇｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８）。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイのために、構築物は、ソルターゼＡ－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓタグ（配列番号１５）を備えていた。ＨＩＶ構築物をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞中で発現させ、これを９６ウェルプレート（２００μｌ／ウェル）中で３日間培養した。粗上清を、上清を１２倍に希釈した１７ｂベースのアッセイを除き、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０＋０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１２０倍に希釈した。続いて、これらの希釈物１０μｌをハーフエリア９６ウェルプレートに移し、アクセプタビーズ、ドナービーズ及びｍＡｂの４０μｌ混合物と混合した。ビーズを使用前によく混合した。振とうせずに室温で２時間インキュベートした後、シグナルをＮｅｏ（ＢｉｏＴｅｋ）で測定した。ドナービーズを、ｍＡｂに結合することができるＰｒｏｔＡ（カタログ番号：ＡＳ１０２Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートした。アクセプタビーズを抗Ｈｉｓ抗体（カタログ番号：ＡＬ１１２Ｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートし、タンパク質のＨｉｓタグを検出した。総タンパク質レベルの定量化には、ニッケルコンジュゲートドナービーズ（カタログ番号：ＡＳ１０１Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と抗Ｆｌａｇ抗体を有するアクセプタビーズ（カタログ番号：ＡＬ１１２Ｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）との組み合わせを使用した。ｓＣＤ４－Ｈｉｓと組み合わせた１７ｂについては、ＰｒｏｔＡドナービーズ及び抗Ｆｌａｇアクセプタビーズの組み合わせを使用した。偽トランスフェクション（Ｅｎｖなし）の平均シグナルを、異なるＥｎｖタンパク質について測定されたＡｌｐｈａＬＩＳＡカウントから差し引いた。参照として、それぞれ、親ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ又はＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖプラスミドを、クレードＣ及びクレードＢ Ｅｎｖ変異体のために、使用した。
分析のために使用されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当分野において周知であり（例えば、国際公開第２０１８／０５０７４７号を参照されたい）、それらの特徴のいくつかと共に表２に示されている。
広域中和抗体（ｂＮＡｂ）は、多くのＨＩＶ株由来のＥｎｖの天然の融合前立体構造に結合する。非ｂＮＡｂは、ミスフォールドされた非天然Ｅｎｖ又は高度に可変の露出ループのいずれかに結合する。タンパク質フォールディングはまた、ＣＤ４の結合後にのみ露出されるＨＩＶエンベロープタンパク質の共受容体結合部位に結合することが知られている抗体（ｍＡｂ １７ｂ）に対する可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質バリアントの結合を測定することによって、試験された（データは示さず）。特に、可溶性受容体ＣＤ４（ｓＣＤ４）をｍＡｂ １７と組み合わせて使用して、ＣＤ４誘導性立体構造変化を評価した。エンベロープタンパク質への先のＣＤ４結合を伴わない、ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質バリアントへのｍＡｂ １７ｂの結合は、部分的にアンフォールドされているか又はプレトリガーされたエンベロープタンパク質（すなわち、ＣＤ４結合の不在下で「開いた」立体構造をとる不安定なＥｎｖ）の指標である。
したがって、一般に、これらの実験において親Ｅｎｖ分子と比較して、１つ又は２つ以上のｂＮＡｂの結合が増加し、１つ又は２つ以上の非ｂＮＡｂの結合が増加しないか、又は減少さえする場合、それはＨＩＶ Ｅｎｖバリアントの正の属性である。
分析ＳＥＣ
ＨＩＶ Ｅｎｖバリアントを９６ウェル形式の細胞培養で発現させた。分析サイズ排除クロマトグラフィ（分析ＳＥＣ）実験を行うために、ＯｐｔｉｌａｂμＴ－ＲＥｘ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗｙａｔｔ）に連結された超高速液体クロマトグラフィシステム（Ｖａｎｑｕｉｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びμＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ機器（Ｗｙａｔｔ）を、インラインＮａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳリーダー（Ｗｙａｔｔ）と組み合わせて使用した。清澄化した粗細胞培養上清を、０．３ｍＬ／分でランニング緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）中で平衡化した対応するガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を有するＴＳＫ－Ｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ３０００ ４．６×１５０ｍｍカラムに適用した。上清試料を分析するとき、μＭＡＬＳ検出器はオフラインとし、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ７．２．８．０ソフトウェアパッケージを使用して分析ＳＥＣデータを分析した。トランスフェクトされていない細胞の上清のシグナルを、ＨＩＶ Ｅｎｖトランスフェクト細胞の上清のシグナルから差し引いた。
ＨＩＶ Ｅｎｖバリアントを９６ウェル形式の細胞培養で発現させた。分析サイズ排除クロマトグラフィ（分析ＳＥＣ）実験を行うために、ＯｐｔｉｌａｂμＴ－ＲＥｘ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗｙａｔｔ）に連結された超高速液体クロマトグラフィシステム（Ｖａｎｑｕｉｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びμＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ機器（Ｗｙａｔｔ）を、インラインＮａｎｏｓｔａｒ ＤＬＳリーダー（Ｗｙａｔｔ）と組み合わせて使用した。清澄化した粗細胞培養上清を、０．３ｍＬ／分でランニング緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）中で平衡化した対応するガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を有するＴＳＫ－Ｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ３０００ ４．６×１５０ｍｍカラムに適用した。上清試料を分析するとき、μＭＡＬＳ検出器はオフラインとし、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ７．２．８．０ソフトウェアパッケージを使用して分析ＳＥＣデータを分析した。トランスフェクトされていない細胞の上清のシグナルを、ＨＩＶ Ｅｎｖトランスフェクト細胞の上清のシグナルから差し引いた。
生成された組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質バリアントを三量体形成についてスクリーニングして、Ｑ６５０Ｗ変異が骨格配列に対して形成された三量体のパーセンテージを改善したかどうか、及び／又は三量体収率を改善したかどうかをチェックした。分析ＳＥＣ（図１Ａ、図２Ａ）を使用して、三量体収率を決定した。組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質への広域中和ＨＩＶ抗体（ｂＮＡｂ）及び非ｂＮＡｂのパネルの結合を評価するためのＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを使用して、相対的三量体収率を検証し、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の立体構造特性を決定した（図１Ｂ、図２Ｂ）。
分析ＳＥＣにおいて、変異Ｑ６５０Ｗは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの両方の三量体収率を増加させることが示された（図１Ａ及び図２Ａ）。更に、変異Ｑ６５０Ｗは、変異を有さないその親分子と比較して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡにおけるｂＮＡｂ抗体結合を増加させた。三量体特異的尖部指向性広域中和抗体（ｂＮＡｂ）ＰＧＴ１４５、ＶＲＣ０２６、及びＰＧＤＭ１４００の増加が実証され、これは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率及び／又は三量体フォールディングの改善を示している（図１Ｂ）。安定化に関係なく、このＨＩＶ Ｅｎｖに結合しないＶＲＣ０２６を除いて、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰについて同じ観察がなされた（図２Ｂ）。Ｑ６５０Ｗは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの両方についてＡｌｐｈａＬＩＳＡにおける非ｂＮＡｂ １７ｂの結合を減少させ（図１Ｂ及び図２Ｂ）、これは所望の特徴であり、Ｅｎｖ三量体の閉じた天然の融合前立体構造を示す。ＣＤ４の存在下でのｍＡｂ １７ｂへの結合の増加は、この非ｂＮＡｂ １７ｂについてのエピトープがなおインタクトであることを示す。
６５０位において、トリプトファン（Ｗ）以外のいくつかの他のアミノ酸置換を試験した。それぞれのＨＩＶ Ｅｎｖ ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバリアントをコードするプラスミドによるトランスフェクション後のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清の分析ＳＥＣを使用して示されるように（図３）、フェニルアラニン（Ｆ）は三量体収率を大幅に増加させ、メチオニン（Ｍ）及びロイシン（Ｌ）も三量体を増加させたが、驚くほど対照的に、イソロイシン（Ｉ）は三量体形成を減少させた。
変異Ｔ５３８Ｈは、この変異を有さないその親分子と比較して、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰの両方の三量体収率（図４Ａ及び図５Ａ）、並びにＡｌｐｈａＬＩＳＡにおけるｂＮＡｂ結合を増加させたことも示された。三量体特異的尖部指向性広域中和抗体（ｂＮＡｂ）ＰＧＴ１４５、ＶＲＣ０２６、及びＰＧＤＭ１４００の増加が、Ｔ５３８Ｈ変異について実証され、これは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率及び／又は三量体フォールディングの改善を示している（図４Ｂ）。Ｔ５３８Ｈ安定化に関係なく、このＨＩＶ Ｅｎｖに結合しないＶＲＣ０２６を除いて、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰについて同じ観察がなされた（図５Ｂ）。Ｔ５３８Ｈは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの両方について、ＡｌｐｈａＬＩＳＡにおける非ｂＮＡｂ １７ｂの結合を減少させる（図４Ｂ及び図５Ｂ）。
変異Ｉ１０８Ｈは、この変異を有しないその親分子と比較して、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ－ＳＯＳＩＰの両方の三量体収率（図６Ａ及び図７Ａ）、並びにＡｌｐｈａＬＩＳＡにおけるｂＮＡｂ結合を増加させたことも示された。三量体特異的尖部指向性広域中和抗体（ｂＮＡｂ）ＰＧＴ１４５、ＶＲＣ０２６、及びＰＧＤＭ１４００の増加が、Ｉ１０８Ｈ変異について実証され、これは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率及び／又は三量体フォールディングの改善を示している（図６Ｂ）。Ｉ１０８Ｈ安定化に関係なく、このＨＩＶ Ｅｎｖに結合しないＶＲＣ０２６を除いて、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰについて同じ観察がなされた（図７Ｂ）。Ｉ１０８Ｈは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの両方について、ＡｌｐｈａＬＩＳＡにおける非ｂＮＡｂ １７ｂの結合を強く減少させる（図６Ｂ及び図７Ｂ）。
また、変異Ｉ１０８Ｈ、Ｔ５３８Ｈ及びＱ６５０Ｗの組み合わせが、Ｉ１０８Ｈのみを含むＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰと比較して、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰの三量体収率（図８Ａ）及びＡｌｐｈａＬＩＳＡにおけるｂＮＡｂ結合を増加させたことも示された。ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈ＿Ｔ５３８Ｈ＿Ｑ６５０Ｗについて、三量体特異的尖部指向広域中和抗体（ｂＮＡｂ）ＰＧＴ１４５及びＰＧＤＭ１４００の増加が実証され、これは、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈと比較して改善された三量体収率及び／又は三量体フォールディングを示す（図８Ｂ）。ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈと比較して、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｉ１０８Ｈ＿Ｔ５３８Ｈ＿Ｑ６５０Ｗについて、ＡｌｐｈａＬＩＳＡで測定された非ｂＮＡｂの同じ減少が観察される（図８Ｂ）。
位置６５０Ｗ、６５０Ｆ、６５０Ｍ、又は６５０Ｌ、好ましくは６５０Ｗ又は６５０Ｆの変異はまた、他のクレード由来のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、天然ＨＩＶ Ｅｎｖ配列、ＳＯＳＩＰ変異の１つ又は全てを含まないＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、表１のエントリー（ｉ）～（ｘｖｉ）に示される変異の１つ又は２つ以上を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、Ｔ５３８Ｈ及び／又はＩ１０８Ｈ変異を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質においても行われ、本出願及びＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の知識に基づいて、６５０Ｗ、６５０Ｆ、６５０Ｍ、及び６５０Ｌ変異の各々、好ましくは６５０Ｗ又は６５０Ｆもまた、三量体形成及び／又は三量体収率を増加させるためにそれらのバックグラウンドのほとんど若しくは全てにおいて作用することが妥当である。
本明細書に示されるデータは、本発明の分子、すなわち、６５０位にＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ、好ましくはＴｒｐ又はＬｅｕを有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、その位置に天然に生じるアミノ酸を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質と比較して、驚くほど増加した三量体形成及び／又は三量体収率を有することを実証する。６５０位にＴｒｐを有する得られたＥｎｖ三量体は、閉じた天然の融合前立体構造にある傾向が増加している。
三量体形成のパーセンテージが増加したＨＩＶエンベロープタンパク質は、望ましくない非天然立体構造にある調製物中に存在するエンベロープタンパク質の精製及び除去の必要性が低いため、ワクチンなどの製造の観点から有利である。また、三量体の総発現収率の増加は、ワクチン製品の製造に有利である。閉じた天然の融合前立体構造にあるものが主であるＨＩＶエンベロープタンパク質は、実際に感染中のＥｎｖタンパク質に構造的により近いため、そのような立体構造にあるＥｎｖタンパク質に対して引き起こされる免疫応答が非常に有益であると考えられていることからも、ワクチン接種に望ましい。
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示のみを目的としたものであり、その広範な発明概念から逸脱することなく、上記の実施形態に対して変更がなされ得ることが理解される。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではないが、添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を網羅することを意図するものと理解される。
配列表
配列番号１ ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０（イタリック体のシグナル配列；１０８位におけるＩｌｅ、５３８位におけるＴｈｒ、及び６５０位におけるＧｌｎを下線及び太字で示す）
配列番号１ ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０（イタリック体のシグナル配列；１０８位におけるＩｌｅ、５３８位におけるＴｈｒ、及び６５０位におけるＧｌｎを下線及び太字で示す）
配列番号２ ＨＩＶ Ｅｎｖ例示的コンセンサスクレードＣ（コンセンサス配列のみ、いかなるシグナル配列、膜貫通ドメイン（６６４は最後のアミノ酸である）、ＳＯＳＩＰ変異、及び／又はフューリン切断部位変異も含まない；１０８位におけるＩｌｅ、５３８位におけるＴｈｒ、及び６５０位におけるＧｌｎを下線及び太字で示す）
配列番号３ ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ ＳＯＳＩＰ（変異及びフューリン切断部位、並びにＣ末端短縮化、並びにＣ末端にソルターゼＡ－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓタグを有する成熟クレードＣコンセンサス配列（下線）；１０８位におけるＩｌｅ、５３８位におけるＴｈｒ、及び６５０位におけるＧｌｎを下線及び太字で示す）（ＨＩＶ１５０６０６）
配列番号４ ＨＩＶ Ｅｎｖ例示的コンセンサスクレードＢ（コンセンサス配列のみ、いかなるシグナル配列、膜貫通ドメイン（６６４は最後のアミノ酸である）、ＳＯＳＩＰ変異、及び／又はフューリン切断部位変異も含まない；１０８位におけるＩｌｅ、５３８位におけるＴｈｒ、及び６５０位におけるＧｌｎを下線及び太字で示す）
配列番号５ ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異及びフューリン切断部位、並びにＣ末端短縮化、並びにＣ末端にソルターゼＡ－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓタグを有する成熟クレードＢコンセンサス配列（下線）；１０８位におけるＩｌｅ、５３８位におけるＴｈｒ、及び６５０位におけるＧｌｎを下線及び太字で示す）（ＨＩＶ１５０５９９）
配列番号６（フューリン切断部位変異体配列）
ＲＲＲＲＲＲ
ＲＲＲＲＲＲ
配列番号７（シグナル配列の例（例えば、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰに使用される））
ＭＲＶＲＧＩＬＲＮＷＱＱＷＷＩＷＧＩＬＧＦＷＭＬＭＩＣＮＶＶＧ（注：最後のＶＧは、成熟タンパク質の開始又はシグナル配列の末端であり得る）
ＭＲＶＲＧＩＬＲＮＷＱＱＷＷＩＷＧＩＬＧＦＷＭＬＭＩＣＮＶＶＧ（注：最後のＶＧは、成熟タンパク質の開始又はシグナル配列の末端であり得る）
配列番号８（シグナル配列の例（例えば、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰに使用される）
ＭＲＶＫＧＩＲＫＮＹＱＨＬＷＲＷＧＴＭＬＬＧＭＬＭＩＣＳＡ
ＭＲＶＫＧＩＲＫＮＹＱＨＬＷＲＷＧＴＭＬＬＧＭＬＭＩＣＳＡ
配列番号９（ＨＲ１ループを置換することができる８つのアミノ酸配列の例）
ＮＰＤＷＬＰＤＭ
ＮＰＤＷＬＰＤＭ
配列番号１０（ＨＲ１ループを置換することができる８つのアミノ酸配列の例）
ＧＳＧＳＧＳＧＳ
ＧＳＧＳＧＳＧＳ
配列番号１１（ＨＲ１ループを置換することができる８つのアミノ酸配列の例）
ＤＤＶＨＰＤＷＤ
ＤＤＶＨＰＤＷＤ
配列番号１２（ＨＲ１ループを置換することができる８つのアミノ酸配列の例）
ＲＤＴＦＡＬＭＭ
ＲＤＴＦＡＬＭＭ
配列番号１３（ＨＲ１ループを置換することができる８つのアミノ酸配列の例）
ＤＥＥＫＶＭＤＦ
ＤＥＥＫＶＭＤＦ
配列番号１４（ＨＲ１ループを置換することができる８つのアミノ酸配列の例）
ＤＥＤＰＨＷＤＰ
ＤＥＤＰＨＷＤＰ
配列番号１５（ソルターゼＡ－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓタグ）
ＡＡＡＬＰＥＴＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ
ＡＡＡＬＰＥＴＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号１６（例示的な全長ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（イタリック体のシグナル配列を含む）；１０８位におけるＩｌｅ、５３８位におけるＴｈｒ、及び６５０位におけるＧｌｎを下線及び太字で示す）
参考文献
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２１．ＷＯ２００７／１０４７９２
２２．ＷＯ２０１４／１２４３０１
２３．ＵＳ２０１６／０１２２３９２
２４．ＷＯ２０１８／０５０７４７
２５．ＷＯ２０１９／０１６０６２
２６．ＷＯ２０１７／１０２９２９
２７．ＷＯ２０１２／１７２２７７
２８．ＷＯ２０１８／２１５７６６
２９．ＷＯ２０１９／０８６４６６
３０．ＷＯ２０１９／０８６４５６
３１．ＷＯ９６／０９３７８
３２．ＵＳ２０１１／０３００２０５
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３７．Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ，（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２３：５８４－５９５
３８．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４６：６９０－７０２
３９．Ｒａｗｉ ｅｔ ａｌ，（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３３，１０８４３２
１．Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００２）７６（１７），８８７５－８９
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８．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１０，１６：３１９－３２３
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３９．Ｒａｗｉ ｅｔ ａｌ，（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３３，１０８４３２
Claims (20)
- ６５０位にアミノ酸トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、又はロイシン（Ｌｅｕ）のうちの１つを含む、組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質であって、
位置の番号付けが、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。 - 示された位置に以下のアミノ酸残基のうちの１つ又は２つ以上を更に含み、
（ｉ）６５１位にＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位にＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位にＡｓｎ若しくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位にＶａｌ、Ｉｌｅ、若しくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ若しくはＩｌｅ、より好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位にＰｈｅ若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位にＩｌｅ；
（ｖｉｉ）６４７位にＰｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉｉｉ）６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、若しくはＬｅｕ、好ましくはＶａｌ若しくはＩｌｅ、より好ましくはＶａｌ；
（ｉｘ）５８８位にＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、若しくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｎ若しくはＧｌｕ；
（ｘ）６４位にＬｙｓ若しくは６６位にＡｒｇ、又は６４位にＬｙｓ及び６６位にＡｒｇ；
（ｘｉ）３１６位にＴｒｐ；
（ｘｉｉ）２０１位及び４３３位の両方にＣｙｓ；
（ｘｉｉｉ）５５６位若しくは５５８位にＰｒｏ、又は５５６位及び５５８位の両方にＰｒｏ；
（ｘｉｖ）アミノ酸位置５４８～５６８におけるループ（ＨＲ１－ループ）の、７～１０アミノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば（配列番号９～１４）のうちのいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｖ）５６８位にＧｌｙ、若しくは５６９位にＧｌｙ、若しくは６３６位にＧｌｙ、若しくは５６８位及び６３６位の両方にＧｌｙ、若しくは５６９位及び６３６位の両方にＧｌｙ；
（ｘｖｉ）３０２位にＴｙｒ、若しくは５１９位にＡｒｇ、若しくは５２０位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ及び５１９位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ及び５２０位にＡｒｇ、若しくは３０２位にＴｙｒ並びに５１９位及び５２０位の両方にＡｒｇ；
（ｘｖｉｉ）前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは５０８～５１１位におけるＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）による置換；
（ｘｖｉｉｉ）５０１位及び６０５位にＣｙｓ若しくは５５９位にＰｒｏ、好ましくは５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏ；
（ｘｉｘ）１０８位にＨｉｓ；並びに／又は
（ｘｘ）５３８位にＨｉｓ、
前記位置の番号付けが、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う、請求項１に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。 - ６５０位にＴｒｐを含む、請求項１又は２に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- ６５０位にＰｈｅを含む、請求項１又は２に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- １０８位にＨｉｓを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- ５３８位にＨｉｓを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- ５０１位及び６０５位にＣｙｓ又は５５９位にＰｒｏ、好ましくは５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- ５０１位及び６０５位にＣｙｓ並びに５５９位にＰｒｏを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- ｇｐ１４０若しくはｇｐ１６０タンパク質、又は細胞質領域に短縮化を有するＥｎｖタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- クレードＡ ＨＩＶ、クレードＢ ＨＩＶ、又はクレードＣ ＨＩＶのＥｎｖタンパク質である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載の３つの同一の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の非共有結合オリゴマーを含む、三量体複合体。
- 粒子、好ましくはリポソーム又はナノ粒子であって、その表面上に請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質又は請求項１１に記載の三量体複合体を提示する、粒子。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
- プロモーターに作動可能に連結した、請求項１３に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
- アデノウイルスベクターである、請求項１４に記載のベクター。
- 請求項１３に記載の単離された核酸分子又は請求項１４若しくは１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を産生する方法であって、前記組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の産生に好適な条件下で、請求項１６に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、方法。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、請求項１１に記載の三量体複合体、請求項１２に記載の粒子、請求項１３に記載の単離された核酸分子、又は請求項１４若しくは１５に記載のベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
- ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を改善する方法であって、前記方法が、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の６５０位においてアミノ酸残基をＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕのうちの１つ、好ましくはＴｒｐ又はＰｈｅにより置換することを含み、位置の番号付けが、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う、方法。
- １０８位にヒスチジン（Ｈｉｓ）を含む、組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質であって、位置の番号付けが、ＨＩＶ－１分離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における番号付けに従う、組換えＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
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