CN116867517A - 三聚体稳定性hiv包膜蛋白突变 - Google Patents

三聚体稳定性hiv包膜蛋白突变 Download PDF

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Abstract

提供了一种人免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白，这些HIV包膜蛋白具有稳定包膜蛋白三聚体形式的特定突变。本文所述的这些HIV包膜蛋白具有改善的三聚体形成百分比和/或改善的三聚体产量。还提供了展示这些HIV包膜蛋白的颗粒、编码这些HIV包膜蛋白的核酸分子和载体，以及含有这些HIV包膜蛋白、颗粒、核酸或载体的组合物。

Description

三聚体稳定性HIV包膜蛋白突变
背景技术
人免疫缺陷病毒(HIV)影响着全世界数百万人，并且即使是在广泛的抗逆转录病毒治疗时代，通过有效疫苗来预防HIV仍具有非常高的优先级。HIV病毒的不同菌株和进化枝之间的抗原多样性使得难以开发具有广泛功效的疫苗。HIV-1是该病毒最常见且最具致病性的菌株，其中超过90％的HIV/AIDS病例来源于HIV-1M组的感染。M组进一步细分为进化枝或亚型，其中进化枝C是最大的。理想情况下，有效疫苗将会能够引发有效的细胞应答和广泛中和抗体，能够中和来自不同进化支的HIV-1菌株。
HIV表面的包膜蛋白刺突(Env)由糖蛋白gp120和gp41的异源二聚体的三聚体组成(图1A)。前体蛋白gp160被弗林蛋白酶切割成gp120和gp41，该gp 120是刺突的头部，并且含有CD4受体结合位点以及大的高变环(V1到V5)，该gp41是包膜蛋白刺突的膜锚定茎。像其他I类融合蛋白一样，gp41含有N-末端融合肽(FP)，C-末端跨膜结构域和胞质结构域。HIV和靶细胞膜之间的膜融合需要包膜蛋白的一系列构象变化。HIV疫苗可基于包膜蛋白进行开发。
然而，各种因素使得基于包膜蛋白的HIV疫苗的开发具有挑战性，包括HIV-1的高遗传可变性、包膜蛋白的致密碳水化合物外壳以及包膜蛋白刺突结构的相对动态和不稳定的性质。野生型包膜蛋白由于其功能而不稳定。因此，稳定修饰有时被引入包膜结构中用于生成候选疫苗。包膜蛋白是中和抗体的靶标，并且是高度糖基化的，这通过屏蔽蛋白表位降低了免疫原性。所有已知的广泛中和抗体(bNAb)都适应这些聚糖。
对于疫苗开发，优选的是使用可诱导bNAb的包膜蛋白。然而，大多数bNAb在经历任何构象变化之前仅识别天然包膜蛋白构象。因此，以其天然样紧密和封闭构象开发稳定的包膜蛋白，同时最小化非天然并因此非中和的表位的存在，可以提高生成此类bNAb的效率。先前对生产HIV疫苗的努力已经集中于开发含有三聚体HIV包膜蛋白gp140融合前胞外域的疫苗。Gp140不具有跨膜(TM)结构域和胞质结构域，但与gp120不同，其可形成三聚体结构。此外，这些先前的努力主要已经集中于进化枝A。然而，已经诱导的中和抗体应答的广度仍有限。因此，如果针对多种HIV进化枝的稳定化的天然包膜三聚体是可用的，也将是有益的。
二十多年来，已经尝试开发融合前三聚体构象的稳定包膜蛋白，但仅在生产能够诱导广泛中和抗体应答的可溶性稳定包膜蛋白三聚体方面取得了有限的成功。例如，已经将所谓的SOSIP突变(501C、605C和559P)引入包膜蛋白序列中，以改善可溶性gp140三聚体部分的形成(Sanders等人，(2002)，J.Virol.76(17):8875-89)。根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号，所谓的SOSIP突变包括位于位置501和605处的半胱氨酸残基和位于位置559处的脯氨酸残基，这是本领域中使用的常规编号方案。在三维蛋白结构中彼此靠近的位于位置501和605处的两个半胱氨酸残基的引入导致二硫桥。SOSIP突变体包膜蛋白，诸如BG505_SOSIP和B41_SOSIP(来自具有SOSIP突变的HIV菌株BG505和B41(9032-08.A1.4685)菌株的包膜蛋白))已被用于疫苗研究，并示出诱导2级自体中和Ab(Sanders等人，Science(2015)，349(6224):139-140)。
然而，即使所谓的SOSIP突变能够稳定包膜蛋白的三聚体形式，此类SOSIP突变体的三聚体部分通常低于10％，仍产生大量的单体和聚集体。甚至SOSIP突变体BG505_SOSIP，就其稳定三聚体形式的能力而言，是一种有希望的SOSIP突变体包膜，通常仅产生高达25％的三聚体形式(Julien等人，Proc.Nat.Acad.Sci.(2015)，112(38)，11947-52)。此外，在该三聚体部分中，三聚体并不完全稳定，因为其在尖端处呼吸。因此，除了SOSIP突变之外，已经设计了若干附加的取代，诸如E64K、A316W和201C-433C，以稳定尖端并防止其呼吸(deTaeye等人，Cell(2015)，163(7)，1702-15；Kwon等人，(2015)Nat.Struct.Mol.Biol.22(7)522-31)。此外，已经报道了进一步的突变和策略，以提高三聚产量并优化融合前封闭的HIV包膜三聚体的折叠和稳定性(WO 2018/050747；WO2019/016062；Rutten等人(2018)CellReports23:584-595；Rawi等人(2020)Cell Reports33，108432)。
因此，需要具有改善的三聚体形成百分比、改善的三聚体产量和/或改善的三聚体稳定性的稳定化的HIV包膜蛋白三聚体。优选地，此类稳定化的HIV包膜蛋白三聚体将显示出与广泛中和抗体(bNAb)的良好结合，以及与非广泛中和Ab(非bNAb)的相对有限的结合。本发明的目的是提供具有改善的三聚体百分比，并且优选地提高的三聚体产量的HIV Env蛋白。
发明内容
本发明涉及重组HIV包膜蛋白，该重组HIV包膜蛋白如与某些先前描述的HIV包膜三聚体相比，具有改善的三聚体形成百分比和/或提高的三聚体产量。所得稳定且良好折叠的HIV Env三聚体可用于免疫目的，例如以改善在施用重组HIV Env三聚体时诱导广泛中和抗体，并减少非中和抗体和弱中和抗体诱导的机会。本发明还涉及编码重组HIV包膜蛋白的分离的核酸分子和载体，包含它们的细胞，以及重组HIV包膜蛋白、核酸分子、载体和/或细胞的组合物。
在一个总的方面，本发明涉及一种重组人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(Env)蛋白，该重组HIV Env蛋白包含氨基酸色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或亮氨酸(Leu)中的一者，优选地Trp或Phe位于位置650处，其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在某些实施方案中，此类HIV Env蛋白进一步包含一个或多个突变，该一个或多个突变增加三聚体产量和/或稳定三聚体，如本文所述。此类Env蛋白以前并未被描述过，并且位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu氨基酸导致增加的三聚体产量。如与进化枝B和进化枝C衍生的Env蛋白相比，这已在本文中示出，发现Env蛋白在所述位置处具有最丰富的原始氨基酸(为谷氨酰胺、Gln、Q)。
在某些优选的实施方案中，本发明的HIV Env蛋白包含位于位置650处的Trp。
在某些优选的实施方案中，本发明的HIV Env蛋白包含位于位置650处的Phe。
在某些实施方案中，本发明的重组HIV包膜(Env)蛋白进一步包含位于所示位置处的以下氨基酸残基中的一者或多者：
(i)位于位置651处的Phe、Leu、Met或Trp，优选地Phe；
(ii)位于位置655处的Phe、Ile、Met或Trp，优选地Ile；
(iii)位于位置535处的Asn或Gln，优选地Asn；
(iv)位于位置589处的Val、Ile或Ala；
(v)位于位置573处的Phe或Trp，优选地Phe；
(vi)位于位置204处的Ile；
(vii)位于位置647处的Phe、Met或Ile，优选地Phe；
(viii)位于位置658处的Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu，优选地Val或Ile，更优选地Val；
(ix)位于位置588处的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp或Phe，优选地Gln或Glu；
(x)位于位置64处的Lys或位于位置66处的Arg或位于位置64处的Lys和位于位置66处的Arg；
(xi)位于位置316处的Trp；
(xii)位于位置201和433处的Cys；
(xiii)位于位置556或558处或位于位置556和558两者处的Pro；
(xiv)由具有7至10个氨基酸的环，优选地8个氨基酸的环，例如具有选自(SEQ IDNO:9-14)中任一者的序列的环置换位于氨基酸位置548至568处的环(HR1-环)；
(xv)位于位置568处的Gly，或位于位置569处的Gly，或位于位置636处的Gly，或位于位置568和636两者处的Gly，或位于位置569和636两者处的Gly；
(xvi)位于位置302处的Tyr，或位于位置519处的Arg，或位于位置520处的Arg，或位于位置302处的Tyr和位于位置519处的Arg，或位于位置302处的Tyr和位于位置520处的Arg，或位于位置302处的Tyr和位于位置519和520两者处的Arg；
(xvii)该HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突变，优选地由RRRRRR(SEQ IDNO:6)，位于位置508至511处的置换；
(xviii)位于位置501和605处的Cys或位于位置559处的Pro，优选地位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro；
(xix)位于位置108处的His和/或(xx)位于位置538处的His，
其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在某些实施方案中，本发明的HIV Env蛋白包含选自由以上(i)至(viii)的组成的组的位于所示位置中的至少两个位置处的所示氨基酸残基。
在某些实施方案中，本发明的重组HIV Env蛋白包含位于位置108处的His，或位于位置538处的His，或位于位置108处的His和位于位置538处的His。
在某些实施方案中，本发明的重组HIV Env蛋白包含位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe，并且进一步包含(a)位于位置501和605处的Cys，或(b)位于位置559处的Pro，或优选(c)位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro(所谓的“SOSIP”变体HIV Env蛋白)，其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在某些实施方案中，这与位于位置108处的His和/或位于位置538处的His结合。在某些实施方案中，这与位于上文(i)-(viii)中所述位置处的氨基酸中的一个或多个氨基酸结合。
在某些实施方案中，根据本发明的重组HIV Env蛋白来自进化枝C HIV。在某些实施方案中，根据本发明的重组HIV Env蛋白来自进化枝B HIV。在某些实施方案中，根据本发明的重组HIV Env蛋白来自进化枝A HIV。在某些实施方案中，根据本发明的重组HIV Env蛋白来自进化枝D、E、F、G、H、I、J、K或L HIV。在某些实施方案中，根据本发明的重组HIV Env蛋白来自进化枝A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K或l中的两者或更多者的HIV的循环重组形式(CRF)。
在某些实施方案中，本发明的重组HIV Env蛋白进一步包含HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突变，诸如由RRRRRR(SEQ ID NO:6)，位于位置508至511处的置换。
在一个实施方案中，重组HIV Env蛋白是gp140蛋白。
在另一个实施方案中，重组HIV Env蛋白是gp160蛋白。
在某些实施方案中，重组HIV Env蛋白在细胞质区被截短。在其某些实施方案中，截短物是在细胞质区的7个氨基酸之后。
还公开了重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、16中任一者至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中位于位置650处的氨基酸是Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe。在这一方面，当确定％同一性时，不将位置650考虑在内，并且其中编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。同样在这一方面，确定％同一性时未考虑的位于所示位置处的氨基酸中的一个或多个氨基酸优选地选自本文在上述(i)-(xx)中优选的所示氨基酸。
在另一个总的方面，本发明涉及一种三聚体复合物，该三聚体复合物包含本文所述的任何重组HIV Env蛋白中的三个重组HIV Env蛋白的非共价低聚物。
在另一个总的方面，本发明涉及一种颗粒，例如脂质体或纳米颗粒，例如自组装纳米颗粒，在其表面展示本发明的重组HIV Env蛋白或本发明的三聚体复合物。
在另一个总的方面，本发明涉及一种编码本发明重组HIV Env蛋白的分离的核酸分子。
在另一个总的方面，本发明涉及载体，这些载体包含可操作地连接至启动子的该分离的核酸分子。在一个实施方案中，该载体是病毒载体。在另一个实施方案中，该载体是表达载体。在一个优选的实施方案中，该病毒载体是腺病毒载体。
另一个总的方面涉及宿主细胞，该宿主细胞包含编码本发明的重组HIV Env蛋白的该分离的核酸分子或该载体。此类宿主细胞可用于重组蛋白生产、重组蛋白表达或病毒颗粒，诸如重组腺病毒的生产。
另一个总的方面涉及生产重组HIV Env蛋白的方法，该方法包括使包含编码本发明的重组HIV Env蛋白的分离的核酸分子或载体的宿主细胞在适于生产重组HIV Env蛋白的条件下生长。
另一个总的方面涉及一种组合物，该组合物包含本文所述的重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、分离的核酸分子或载体，以及药学上可接受的载体。
在另一个总的方面，本发明涉及一种改善HIV Env蛋白的三聚体形成的方法，该方法包括由Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe取代亲本HIV Env蛋白中位于位置650处的氨基酸残基，其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。
图1A和图1B示出突变Q650W增加了ConC_SOSIP的三聚体产量。A)用编码HIV EnvConC-SOSIP及其Q650W变体的质粒转染后，用Expi293F细胞培养物上清液进行SEC分析。B)具有HIV Env特异性bNAb和非bNAb的细胞培养物上清液与ConC_SOSIP及其Q650W变体的AlphaLISA结合。所有测量一式三份进行。
图2A和图2B示出突变Q650W增加了ConB_SOSIP的三聚体产量。A)用编码HIV EnvConB-SOSIP及其Q650W变体的质粒转染后，用Expi293F细胞培养物上清液进行SEC分析。B)具有HIV Env特异性bNAb和非bNAb的细胞培养物上清液与ConB_SOSIP及其Q650W变体的AlphaLISA结合。所有测量一式三份进行。
图3示出在具有Expi293F细胞培养物上清液的分析SEC中，突变Q650F、Q650M和Q650L增加了ConC_SOSIP的三聚体产量，而突变Q650I减少了ConC_SOSIP中三聚体的形成。
图4A和图4B示出突变T538H增加了ConC_SOSIP的三聚体产量。A)用编码HIV EnvConC-SOSIP及其T538H变体的质粒转染后，用Expi293F细胞培养物上清液进行SEC分析。B)具有HIV Env特异性bNAb和非bNAb的细胞培养物上清液与ConC_SOSIP及其T538H变体的AlphaLISA结合。所有测量一式三份进行。
图5A和图5B示出突变T538H增加了ConB_SOSIP的三聚体产量。A)用编码HIV EnvConB-SOSIP及其T538H变体的质粒转染后，用Expi293F细胞培养物上清液进行SEC分析。B)具有HIV Env特异性bNAb和非bNAb的细胞培养物上清液与ConB_SOSIP及其T538H变体的AlphaLISA结合。所有测量一式三份进行。
图6A和图6B示出突变I108H增加了ConC_SOSIP的三聚体产量。A)用编码HIV EnvConC-SOSIP及其I108H变体的质粒转染后，用Expi293F细胞培养物上清液进行SEC分析。B)具有HIV Env特异性bNAb和非bNAb的细胞培养物上清液与ConC_SOSIP及其I108H变体的AlphaLISA结合。所有测量一式三份进行。
图7A和图7B示出突变I108H增加了ConB_SOSIP的三聚体产量。A)用编码HIV EnvConB-SOSIP及其I108H变体的质粒转染后，用Expi293F细胞培养物上清液进行SEC分析。B)具有HIV Env特异性bNAb和非bNAb的细胞培养物上清液与ConB_SOSIP及其I108H变体的AlphaLISA结合。所有测量一式三份进行。
图8A和图8B示出，与仅包含I108H突变的ConcB_SOSIP相比，突变I108H、T538H和Q650W增加了三聚体产量。A)在用编码包含I108H、T538H和Q650W突变的HIV Env ConB-SOSIP和仅包含I108H突变的HIV Env ConB-SOSIP的质粒转染后，用Expi293F细胞培养物上清液进行分析SEC。B)具有HIV Env特异性bnab和非bNAb的细胞培养物上清液与ConB_SOSIP_I108H_T538H_Q650W和ConB_SOSIP_I108H变体的AlphaLISA结合。所有测量一式三份进行。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
在贯穿本公开引用了氨基酸。存在二十种天然存在的氨基酸，以及许多非天然存在的氨基酸。每个已知的氨基酸，包括天然的氨基酸和非天然的氨基酸两者，都具有全名、缩写的单字母代码和缩写的三字母代码，所有这些都是本领域普通技术人员所熟知的。例如，用于二十种天然存在的氨基酸的三字母缩写代码和单字母缩写代码如下：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬氨酸(Asp；D)、天冬酰胺(Asn；N)、半胱氨酸(Cys；C)、甘氨酸(Gly；G)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。氨基酸可用其全名、单字母缩写代码或三字母缩写代码来提及。
除非上下文清楚地指明，如本文所用的HIV包膜蛋白的氨基酸序列中的位置编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号，例如Korber等人所述，(Human Retroviruses andAIDS1998:A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences，Korber等人编辑，Theoretical Biology and Biophysics Group,Los Alamos NationalLaboratory,Los Alamos,N.Mex.)，其全部内容通过引用以其整体并入本文。根据HXB2的编号在HIV Env蛋白领域是常规的。HIV-1分离株HXB2的gp160具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。感兴趣的HIV Env序列与该序列的比对可用于在感兴趣的序列中找到对应的氨基酸编号。
术语“序列同一性百分比(％)”或“％同一性”描述与构成氨基酸序列的总长度的氨基酸残基的数量相比，两个或更多个比对氨基酸序列的相同氨基酸的匹配数(“命中”)。换句话说，如使用本领域已知的序列比较算法测量的比较和比对序列的最大对应性时，或当手动比对和目视检查时，使用比对，对于两个或更多个可确定相同的氨基酸残基的百分比(例如，95％、97％或98％同一性)。因此，被比较以确定序列同一性的序列可能因氨基酸的取代、添加或缺失而不同。用于比对蛋白质序列的合适程序是技术人员已知的。可例如使用诸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST的程序，例如使用NCBI BLAST算法来确定蛋白序列的序列同一性百分比(Altschul SF等人，(1997)，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。
HIV Env蛋白中的“对应位置”是指当至少两个HIV Env序列比对时氨基酸残基的位置。除非另外指明，用于这些目的的氨基酸位置编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号，如本领域中的惯例。
如本文所用的“根据本发明的突变”是由色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或亮氨酸(Leu)残基取代亲本HIV Env蛋白中位于位置650处的氨基酸。其中，由Trp或Phe取代是优选的。如本文所用的附加的“稳定突变”是如本文表1的条目(i)-(xvi)中任一项所述的突变，当通过取代所述亲本分子中的对应氨基酸而引入突变时，如与亲本分子相比，其增加了HIV Env蛋白的三聚体百分比和/或三聚体产量(例如其可根据AlphaLISA或尺寸排阻色谱(SEC)测定，例如本文所述的SEC分析测定，或例如WO 2019/016062中所述的SEC-MALS来测量)(参见李，WO 2019/016062)。可任选与根据本发明的突变组合的其他新型稳定突变是由组氨酸(His)残基取代亲本HIV Env蛋白中位于位置108处的氨基酸，或由组氨酸(His)残基取代亲本HIV Env蛋白中位于位置538处的氨基酸，或由His残基取代位于位置108和538处的氨基酸。由此类稳定突变产生的氨基酸通常很少(如果有的话)在野生型HIV分离株的Env蛋白中发现。
在另一方面，本发明提供了HIV Env蛋白，该HIV Env蛋白包含位于位置108处的组氨酸(His)，其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。此类Env蛋白以前并未被描述过，并且位于位置108处的His氨基酸导致增加的三聚体产量。如与进化枝B和进化枝C衍生的Env蛋白相比，这已在本文中示出，发现Env蛋白在所述位置处具有最丰富的原始氨基酸(为异亮氨酸，Ile)。包含位于位置108处的组氨酸(His)的HIV Env蛋白可任选地与650和/或538修饰或如本文所述的任何其他氨基酸修饰组合。在某些实施方案中，本发明的重组HIV Env蛋白包含位于位置108处的His，并且进一步包含(a)位于位置501和605处的Cys，或(b)位于位置559处的Pro，或优选(c)位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro，其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
术语“天然”或“野生型”在本文中可互换使用，当提及HIV菌株(或来自其中的Env蛋白)时，并且是指天然存在的HIV菌株(或来自其中的Env蛋白)，例如诸如，在HIV感染的患者中。
本发明整体涉及重组HIV包膜(Env)蛋白，该重组HIV Env蛋白包含位于包膜蛋白序列的所示位置处的某些氨基酸取代，其稳定了包膜蛋白的三聚体形式。向HIV包膜蛋白序列中引入本发明的所标识的氨基酸取代，并且任选地附加的稳定突变中的一个或多个稳定突变，可导致增加的三聚体形成百分比和/或增加的三聚体产量。这可例如使用三聚体特异性抗体、尺寸排阻色谱以及与正确折叠(稳定三聚体)或另选地与不正确折叠(非稳定或非三聚体)的Env蛋白结合的抗体的结合来测量，并且增加的三聚体百分比和/或三聚体产量被认为是稳定、天然、正确折叠的Env蛋白的指示。
人免疫缺陷病毒(HIV)是逆转录病毒科的一部分的属慢病毒的一员。两个种类的HIV感染人：HIV-1和HIV-2。HIV-1是最常见的HIV病毒菌株，并且已知比HIV-2更具致病性。如本文所用，术语“人免疫缺陷病毒”和“HIV”是指但不限于HIV-1和HIV-2。在优选的实施方案中，HIV是指HIV-1。
HIV被归类为具有高度遗传差异的多个进化枝。如本文所用，术语“HIV进化枝”或“HIV亚型”是指根据其基因相似度分类的相关人免疫缺陷病毒。最大的HIV-1分离株组被称为M组(主要菌株)，并且由至少12个进化枝组成，从A到l。
在一个总的方面，本发明涉及重组HIV包膜(Env)蛋白。当参考蛋白使用时，术语“重组”是指通过重组技术或通过体外化学合成产生的蛋白。根据本发明的实施方案，“重组”蛋白具有人工氨基酸序列，因为其含有至少一个序列元素(例如，氨基酸取代、缺失、添加、序列置换等)未在对应的天然存在的序列中发现。优选地，“重组”蛋白是非天然存在的HIV包膜蛋白，该HIV包膜蛋白被优化以诱导免疫应答或产生针对一种或多种天然存在的HIV菌株的免疫力。
术语“HIV包膜蛋白”、“HIV Env”和“HIV Env蛋白”是指蛋白或其片段或衍生物，其天然表达于HIV病毒颗粒的包膜上，并使HIV能够靶向并附着于HIV感染细胞的质膜。术语“包膜”和“Env”贯穿本公开可互换使用。HIV env基因编码前体蛋白gp160，其被蛋白水解切割成两个成熟的包膜糖蛋白gp120和gp41。切割反应由宿主细胞蛋白酶弗林蛋白酶(或弗林蛋白酶样蛋白酶)在逆转录病毒包膜糖蛋白前体中高度保守的序列基序处介导。更具体地，gp160三聚体化成(gp160)3，并且然后切割成两个非共价关联的成熟糖蛋白gp120和gp41。病毒进入随后由gp120异源二聚体/gp41异源二聚体三聚体介导。Gp120是受体结合片段，并且与具有此类受体的靶细胞上的CD4受体(和共受体)结合，诸如例如T辅助细胞。与gp120非共价结合的Gp41是融合片段，并提供第二步骤，通过该第二步骤HIV进入细胞。Gp41最初埋在病毒包膜内，但当gp120与CD4受体和共受体结合时，gp120改变其构象，导致gp41暴露出来，在那里其可帮助与宿主细胞融合。Gp140是gp160的胞外域。
根据本发明的实施方案，“HIV包膜(Env)蛋白”可以是gp160或gp140蛋白，或其组合、融合、截短物或衍生物。例如，“HIV包膜蛋白”可包括与gp41蛋白非共价关联的gp120蛋白。“HIV包膜蛋白”也可以是截短的HIV包膜蛋白，该截短的HIV包膜蛋白包括但不限于包膜蛋白，该包膜蛋白包含胞外域(即延伸到胞外空间的结构域)中的C-末端截短物、gp41中的截短物，诸如gp41胞外域、gp41跨膜结构域中的截短物或gp41细胞质结构域中的截短物。HIV包膜蛋白也可以是对应于gp160胞外域的gp140，或gp140的延伸或截短版本。gp140蛋白的表达已经在若干出版物中有所描述(例如，张等人，2001；Sanders等人，2002；Harris等人，2011)，并且该蛋白也可以不同的变体(例如基于不同的HIV菌株)从服务提供商处订购。根据本发明的gp140蛋白可具有切割位点突变，使得gp120结构域和gp41胞外域不被切割和共价连接，或另选地gp120结构域和gp41胞外域可被切割和共价连接，例如通过二硫桥(诸如例如在SOSIP变体中)。“HIV包膜蛋白”还可以是天然存在的HIV包膜蛋白的衍生物，其具有序列突变，例如在弗林蛋白酶切割位点中，和/或所谓的SOSIP突变。根据本发明的HIV包膜蛋白也可具有切割位点，使得gp120和gp41胞外域可非共价连接。
在本发明的优选的实施方案中，HIV Env蛋白是gp140蛋白或gp160蛋白，并且更优选地gp140蛋白。在其他优选的实施方案中，Env蛋白被截短，例如如与天然Env蛋白相比，通过细胞质区第7个残基之后的残基的缺失。
根据本发明的实施方案，“HIV包膜蛋白”可以是三聚体或单体，并且优选地三聚体。三聚体可以是同源三聚体(例如，包含三个相同多肽单位的三聚体)或异源三聚体(例如，包含三个不完全相同的多肽单位的三聚体)。优选地，三聚体是同源三聚体。在切割的gp140或gp160的情况下，其为gp120-gp41二聚体的多肽单位的三聚体，并且在所有这些二聚体中的三个二聚体相同的情况下，这被认为是同源三聚体。在一些情况下，HIV包膜蛋白也可以六聚体的形式存在。
“HIV包膜蛋白”可以是可溶性蛋白或膜结合蛋白。膜结合包膜蛋白通常包含跨膜结构域，诸如在全长HIV包膜蛋白中包含跨膜结构域(TM)。膜结合蛋白可具有胞质结构域，但不要求胞质结构域与膜结合。可溶性包膜蛋白包含跨膜结构域的至少部分或完全缺失。例如，全长HIV包膜蛋白的C-末端可被截短以缺失跨膜结构域，由此产生可溶性蛋白(参见例如，WO 2019/016062中的图1A和图1B，分别为全长和截短的可溶性HIV Env蛋白的示意图)。然而，具有较短截短物的HIV包膜蛋白仍可溶，并且另选的截短位置与WO 2019/016062的图1B所示的截短位置相同。截短可在各个位置处完成，并且非限制性实施例是在氨基酸664、655、683等之后，这些都导致可溶性蛋白。如与天然Env蛋白相比，根据本发明的膜结合Env蛋白可包含完整或部分C-末端结构域(例如通过C-末端细胞质结构域的部分缺失，例如在某些实施方案中在细胞质区的第7个残基之后)。本领域技术人员将清楚的是，细胞质区中的缺失也可来自细胞质结构域的第7个残基以外的另一残基，例如在细胞质结构域的第1个残基、第2个残基、第3个残基、第4个残基、第5个残基、第6个残基、第8个残基、第9个残基、第10个残基或任何稍后的残基之后。
当表达时，信号肽通常存在于HIV Env蛋白的N-末端，但被信号肽酶切割掉，并且因此不存在于成熟蛋白中。信号肽可与其他信号序列互换，并且本文在SEQ ID NO:7和8中提供了信号肽的两个非限制性实施例。
根据本发明的实施方案，HIV包膜蛋白，例如gp160或gp140，可来源于来自任何HIV进化枝(或“亚型”)的HIV包膜蛋白序列，例如进化枝A、进化枝B、进化枝C、进化枝D、进化枝E、进化枝F、进化枝G、进化枝H等，或它们的组合(例如“循环重组形式”或来源于不同亚型，例如BC、AE、AG、be、BF、ADG等病毒之间重组的CRF)。HIV包膜蛋白序列可以是天然存在的序列、镶嵌序列、共有序列、合成序列或它们的任何衍生物或片段。“镶嵌序列”包含来源于一个或多个HIV进化枝的至少三个HIV包膜序列的多个表位，并且可通过优化T细胞表位覆盖的算法来设计。镶嵌HIV包膜蛋白序列的示例包括在例如Barouch等人，Nat Med2010，16:319-323；WO 2010/059732；和WO 2017/102929中描述的那些。如本文所用，“共有序列”是指基于同源蛋白的氨基酸序列比对的人工氨基酸序列，例如，如通过同源蛋白的氨基酸序列比对(例如使用Clustal Omega)确定的序列。其是基于例如来自至少1000个天然HIV分离株的Env序列，在序列比对的每个位置处发现的最频繁氨基酸残基的经计算顺序。“合成序列”是非天然存在的HIV包膜蛋白，该HIV包膜蛋白被优化以诱导免疫应答或产生针对多于一种天然存在的HIV菌株的免疫力。镶嵌HIV包膜蛋白是合成HIV包膜蛋白的非限制性实施例。在本发明的某些实施方案中，亲本HIV Env蛋白是共有Env蛋白或合成Env蛋白。在亲本Env蛋白中，引入突变以导致位于位置650处的氨基酸Trp、Phe、Met或Leu。在优选的实施方案中，突变导致HIV Env蛋白的位于位置650处的Trp或Phe。任选地，此类HIV Env蛋白还可具有在本文表1中描述的位于所示位置(i)-(xx)处的所示氨基酸中的至少一个氨基酸。特别优选的是具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu(优选地Trp或Phe)的Env蛋白，其还具有(a)位于所示位置(i)-(viii)处的所示氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基，优选地至少两个氨基酸残基，和/或(b)优选地具有进一步的SOSIP(例如位于位置(xviii)处的所示氨基酸)和/或(c)弗林蛋白酶切割位点突变(例如位于位置(xvii)处的所示氨基酸)，如下所述。
在本发明的某些实施方案中，HIV包膜蛋白，无论是天然存在的序列、镶嵌序列、共有序列、合成序列等包含附加的序列突变，例如在弗林蛋白酶切割位点中，和/或所谓的SOSIP突变。
在本发明的一些实施方案中，本发明的HIV包膜蛋白具有进一步的突变，并且是“SOSIP突变HIV Env蛋白”。所谓的SOSIP突变是三聚体稳定性突变，其包括“SOS突变”(位于位置501和605处的Cys残基，这导致在新产生的半胱氨酸残基之间引入可能的二硫桥)和“IP突变”(位于位置559处的Pro残基)。根据本发明的实施方案，SOSIP突变体Env蛋白包含选自由以下项组成的组的至少一个突变：位于位置501和605处的Cys；位于位置559处的Pro，并且优选地位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro。SOSIP突变体HIV Env蛋白可进一步包含其他序列突变，例如在弗林蛋白酶切割位点中。此外，在某些实施方案中，可以进一步添加突变，使得Env蛋白包含位于位置556或位置558处或位于位置556和558处的Pro，发现其不仅能够充当SOSIP变体中位于位置559处的Pro的替代物，而且能够充当附加的突变，其可进一步改善已经具有位于位置559处的Pro的SOSIP变体的三聚体形成。
在本发明的某些优选的实施方案中，SOSIP突变体HIV Env蛋白包含位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro。
在某些实施方案中，本发明的HIV包膜蛋白进一步包含弗林蛋白酶切割位点中的突变。弗林蛋白酶切割序列中的突变可以是氨基酸取代、缺失、插入或用一个序列置换另一个序列，或用接头氨基酸序列置换。优选地，在本发明中，突变弗林蛋白酶切割位点可用于优化切割位点，使得弗林蛋白酶切割相对于野生型得到改善，例如通过用RRRRRR(SEQ IDNO:6)置换残基508-511处的序列[即用四个精氨酸残基置换位于位置509-510处的典型氨基酸序列(例如EK)(即两个置换和两个添加)，而位于位置508和511处，在大多数HIV Env蛋白中已经存在精氨酸残基，因此这些通常不需要被置换，但是由于文献中的最终结果通常被称为氨基酸序列RRRRRR，我们在本文保留了该命名]。其他改善弗林蛋白酶切割的突变是已知的，并且也可被使用。另选地，可以用接头置换弗林蛋白酶切割位点，从而不再需要弗林蛋白酶切割，但蛋白将采用天然样构象(例如，(Sharma等人，2015)和(Georgiev等人，2015)中所述。
在本发明的特定实施方案中，本发明的HIV包膜蛋白进一步包含所谓的SOSIP突变(优选地位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro)和弗林蛋白酶切割位点中的序列突变，优选地用RRRRRR(SEQ ID NO:6)置换残基508-511处的序列。在某些优选的实施方案中，HIV Env包含所示SOSIP和弗林蛋白酶切割位点突变，并且此外进一步包含位于位置556或558处，最优选地位于位置556和558两者处的Pro残基。
在本发明的某些实施方案中，HIV包膜蛋白的氨基酸序列是共有序列，诸如HIV包膜进化枝C共有或HIV包膜进化枝B共有。
可用于本发明的示例性HIV包膜蛋白包括HIV包膜进化枝C共有(SEQ ID NO:2)和HIV包膜进化枝B共有(SEQ ID NO:4)。这些HIV包膜进化枝C共有序列和进化枝B共有序列可包含附加的突变，例如增强稳定性和/或三聚体形成，诸如例如所谓的SOSIP突变和/或如上所述的弗林蛋白酶切割位点的序列突变，诸如例如SEQ ID NO:3所示的ConC_SOSIP序列和SEQ ID NO:5所示的ConB_SOSIP序列。
可用于本发明的优选的HIV包膜蛋白序列(作为“背景”或“亲本”分子，然后其中650位突变成Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe)的其他非限制性实施例包括合成HIVEnv蛋白，任选地具有如上所述的进一步SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点突变。进一步的非限制性实施例是镶嵌HIV包膜蛋白。
在某些实施方案中，亲本分子是野生型HIV Env蛋白。此类亲本分子可任选地进一步具有如上所述的SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点突变。
导致位于位置650处的氨基酸被氨基酸Trp、Phe、Met或Leu置换的突变，任选地进一步被表1中描述的位于位置(i)-(xvii)处的所示氨基酸置换，和/或任选地进一步包含导致位于位置108和/或538处的氨基酸被氨基酸His置换的突变，也可用于其中不存在SOSIP突变的HIV Env蛋白(例如，在Env共有序列或来自野生型HIV分离株的Env蛋白中)，并且也可能改善其三聚化，因为本发明的突变独立于SOSIP突变，具有不同的作用模式。事实上，例如，如例如WO 2019/016062中所述，附加的稳定突变示出在若干不同的HIV Env蛋白主链中起作用，包括不存在SOS-突变以及不存在IP-突变以改善HIV Env三聚化特性，以及不存在任何SOSIP突变。因此，在某些实施方案中，根据本发明的HIV Env蛋白不包括SOSIP突变中的任何SOSIP突变。在又其他实施方案中，也可以使用SOSIP突变的替代物来进一步稳定三聚体。在某些另选的实施方案中，使用接头代替“SOS”突变。在某些另选的实施方案中，代替“IP”突变，位置556和/或558中的一个或两个被Pro残基置换。
根据本发明的实施方案的重组HIV包膜蛋白包含HIV包膜蛋白，该HIV包膜蛋白具有在HIV包膜蛋白的氨基酸序列的位于特定位置处的某些氨基酸残基。具体地，显示出Env蛋白中的650位可突变为Trp、Phe、Met或Leu残基，以改善Env蛋白的三聚体形成，其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。此外，在任选的实施方案中，在表1中指示了包膜蛋白中的许多位置，以及在所标识位置中的一个或多个所标识位置或每个所标识位置处期望的特定氨基酸残基，其中这些位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。根据本发明的HIV Env蛋白具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe，并且任选地具有位于如表1中提供的所示位置(i)-(xx)中的至少一个所示位置处的指定的氨基酸残基。
表1：根据某些实施方案，在重组HIV Env蛋白中位于所示位置处的附加的期望的 氨基酸
1根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号
HIV包膜蛋白的氨基酸序列被称为“主链HIV包膜序列”或“亲本HIV包膜序列”，位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，并且任选地位于一个或多个其他所示位置处的一个或多个期望的氨基酸(或所示氨基酸)取代被引入其中。例如，如果SEQ ID NO:3的ConC_SOSIP序列中的650位突变为Trp、Phe、Met或Leu，则ConC_SOSIP序列被认为是“主链”或“亲本”序列。任何HIV包膜蛋白都可用作“主链”或“亲本”序列，根据本发明的实施方案，新型稳定突变(即位于位置650处的氨基酸被Trp、Phe、Met或Leu取代)可单独或与其他突变(诸如所谓的SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点中的突变)结合被引入其中。可以用作主链的HIVEnv蛋白的非限制性实施例包括来自天然HIV分离株的HIV Env蛋白、合成HIV Env蛋白或共有HIV Env蛋白。
根据本发明的某些实施方案，除了具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu之外，HIV包膜蛋白可任选地具有选自由表1中位置(i)-(xx)组成的组的位于所示位置中的至少一个所示位置处的所示氨基酸残基。通常，已经看到，如与不具有或具有较少此类取代的主链蛋白相比，HIV Env蛋白包含位于所示位置(i)-(xviii)处的取代的至少两个取代、至少三个取代、至少四个取代、至少五个取代、至少六个取代、至少七个取代等的组合，优选地包含在所示位置(i)-(viii)处的取代的至少两个取代、至少三个取代等的组合的具有改善的三聚化特性，参见例如WO 2019/016062。
根据本发明的某些实施方案，除了具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe，HIV包膜蛋白还可任选地具有位于位置108处的His，或位于位置538处的His，或位于位置108和538两者处的His。这些是其他新型突变，示出独立地导致如本文所示的改善的特性。这些位置是彼此独立的，并且在某些实施方案中可被组合以导致进一步的改善。此类分子(具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，和位于位置538和/或108处的His)可任选地进一步具有选自由表1中位置(i)-(xviii)组成的组的所示位置中的至少一个所示位置处的所示氨基酸残基。
优选地，通过氨基酸取代将位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu和/或(i)-(xx)中的氨基酸中的至少一个氨基酸引入重组HIV Env蛋白。例如，重组HIV Env蛋白可由不含有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu或不含或仅含上述(i)-(xx)中的氨基酸残基中的氨基酸残基的HIV Env蛋白产生，使得通过氨基酸取代将所示氨基酸残基中的所有所示氨基酸残基或一个或多个所示氨基酸残基引入重组HIV Env蛋白中。同样，位于位置108和/或538处的His可通过氨基酸取代引入重组HIV Env蛋白中。
引入了上述取代的HIV Env蛋白的氨基酸序列可以是根据本公开的本领域已知的任何HIV Env蛋白，例如来自HIV进化枝A、进化枝B、进化枝C等的天然存在的序列；镶嵌序列；共有序列，例如进化枝B或进化枝C共有序列；合成序列；或它们的任何衍生物或片段。在本发明的某些实施方案中，HIV Env蛋白的氨基酸序列包含附加的突变，诸如例如所谓的SOSIP突变，和/或弗林蛋白酶切割位点中的突变。
在一个特定实施方案中，HIV Env主链蛋白是SOSIP突变体HIV Env蛋白，该SOSIP突变体HIV Env蛋白包含选自由以下项组成的组的至少一个突变：位于位置501和605处的Cys；位于位置559处的Pro。在一个优选的实施方案中，SOSIP突变体HIV Env蛋白包含位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro。根据该实施方案，重组HIV Env蛋白包含SOSIP突变体HIV Env蛋白的氨基酸序列和位于位置650处的氨基酸取代，导致位于该位置处的Trp、Phe、Met或Leu，并且任选地在选自由表1中条目(i)-(xvi)组成的组的所示位置中的至少一个所示位置处的所示氨基酸残基的一个或多个其他氨基酸取代。
SOSIP突变体HIV Env蛋白可进一步包含弗林蛋白酶切割位点的突变，诸如由SEQID NO:6，位于位置608-511处的置换。
在一个特定实施方案中，HIV Env主链蛋白是HIV Env共有进化枝C，其包含与SEQID NO:2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO:2的HIV共有进化枝C序列进一步包含所谓的SOSIP突变，即位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro，并且在某些实施方案中进一步包含所谓的SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点中的突变，诸如例如由SEQ ID NO:6，位于位置508至511处的置换。在特定实施方案中，HIV Env主链蛋白包含SEQ ID NO:3中所示的序列，或与其至少95％相同的序列，其中如与SEQ ID NO:3相比，如被SEQ ID NO:6置换的位于位置501、559、605和508至511处的氨基酸没有突变。
在另一个特定实施方案中，HIV Env主链蛋白是HIV Env共有进化枝B，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO:4的HIV共有进化枝B序列进一步包含所谓的SOSIP突变，即位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro，并且在某些实施方案中进一步包含所谓的SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点中的突变，诸如例如由SEQ ID NO:6，位于位置508至511处的置换。在特定实施方案中，HIV Env主链蛋白包含SEQ ID NO:5中所示的序列，或与其至少95％相同的序列，其中如与SEQ ID NO:5相比，如被SEQ ID NO:6置换的位于位置501、559、605和508至511处的氨基酸没有突变。
在另一个特定实施方案中，HIV Env主链蛋白是合成HIV Env蛋白，其可任选地具有如上所述的进一步的SOSIP(501C、605C、559P)和/或弗林蛋白酶切割位点突变(508-511RRRRRR)。
在又其他特定实施方案中，HIV Env主链蛋白是来自野生型进化枝A、进化枝B或进化枝C HIV病毒的HIV Env蛋白，任选地包含附加的突变，以根据WO 2018/050747和WO2019/016062中描述的方法修复和/或稳定序列。
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的重组HIV Env蛋白(即，具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，并且任选地具有以上表1中位于位置(i)-(viii)处的一个或多个所示氨基酸)可进一步包含选自由表1中的(ix)-(xvi)位组成的组的位于一个或多个附加的所示位置处的所示氨基酸残基(例如，通过取代)。氨基酸取代先前已有描述，例如在WO2019/016062中。发现这些氨基酸取代中的某些氨基酸取代(例如(ix))与突变(i)-(viii)(的组合)结合得非常好，参见例如WO 2019/016062。然而，就本发明人所知，这些先前描述的突变没有与本文所述的新型取代(即位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu)结合描述。这些氨基酸突变与本发明的氨基酸取代相结合可进一步增加三聚体产量和/或三聚体形成百分比。除了被位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu氨基酸残基取代之外，还可将这些氨基酸取代引入本文所述的重组HIV Env蛋白中的任何重组HIV Env蛋白中，并且任选地进一步具有由如表1所描述的所示位置中的一个或多个所示位置处的所示氨基酸残基和/或位于位置108和/或538处的His的取代。本发明中标识的取代[位于位置650处的W、F、M或L；并且同样对于位于位置538处的H和位于位置108处的H]是本发明人所知的天然(组M，即全部)HIVEnv序列中不存在的，在先前报道的HIV Env蛋白序列中没有发现与表1的取代(i)-(xx)中的任何取代组合，并且先前也没有提出导致HIV Env蛋白的改善的三聚化、提高的三聚体产量和/或增加的三聚体稳定性。显然，先前描述的突变没有提供任何关于引入本发明突变的建议，更不用说其对具有闭合尖端的三聚体形成的令人惊讶的作用，如例如通过抗体PGT145结合进行测量。除了表1中的点突变(ix)-(xiii)之外，还可以用具有7至10个氨基酸，优选地8个氨基酸的环，例如具有选自(SEQ ID NO:9-14)中任一者的序列的更短和较少柔性的环来置换Env蛋白的HR1环(野生型序列中的氨基酸残基548-568，根据HXB2分离株的gp160编号)，参见例如Kong等人(Nat Commun.2016年6月28日；7:12040.doi：10.1038/ncomms12040)，其描述了置换HR1环的此类较短环。此类Env变体，进一步具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu氨基酸残基，并且任选地具有位于所示位置(i)-(viii)中的至少一个所示位置处的所示氨基酸残基也是本发明的实施方案。在本发明的某些实施方案中，可将(ix)-(xiv)中列举的突变添加到本发明的HIV Env蛋白中，即具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu。在另一个实施方案中，这些可与位于位置(i)-(viii)处的所示氨基酸中的一个或多个所示氨基酸的突变相结合。此外，可进行组(ix)-(xiv)内的组合。
同样，那些实施方案中的任何实施方案可以是任何HIV Env蛋白，例如野生型分离株、共有Env、合成Env蛋白、SOSIP突变体Env蛋白等。
在某些实施方案中，HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:2-5中任一者至少95％相同，例如至少96％，97％，98％，99％相同，或100％相同的序列。为了确定％同一性，优选地不考虑位置650，并且优选此外不考虑表1的位置(i)-(xvi)，并且优选地也不考虑位置108、501、538、559和605。发现位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe增加了Env蛋白的三聚体百分比和三聚体产量。
根据本发明的实施方案，与不具有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu但进一步相同的HIV Env蛋白相比(优选地与具有位于位置650处的Gln但进一步相同的HIV Env蛋白相比)，重组HIV Env蛋白具有(a)改善的三聚体形成百分比和(b)提高的三聚体产量中的至少一者。
如本文所用，“改善的三聚体形成百分比”是指当HIV包膜蛋白的主链序列含有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe时，如与当HIV包膜序列的主链序列含有位于位置650处的Gln残基时形成的三聚体百分比相比，形成了更大的三聚体百分比(Gln是在此位置处存在于HIV-1Env的大多数天然进化枝C变体中的氨基酸)。更一般地，“改善的三聚体形成百分比”是指当HIV包膜蛋白的主链序列含有位于位置650处的氨基酸取代为Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe，并且任选地表1中所述的氨基酸取代中的一种或多种氨基酸取代时，如与当HIV包膜序列的主链序列不包含此类氨基酸置换时形成的三聚体百分比相比，形成了更高三聚体百分比。如本文所用，“提高的三聚体产量”是指当HIV包膜蛋白的主链序列含有位于位置650处的Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Phe时，如与当HIV包膜序列的主链序列含有位于位置650处的Gln残基时获得的包膜蛋白三聚体形式的总量相比，获得了更大总量的包膜蛋白三聚体形式。更一般地，“提高的三聚体产量”是指当HIV包膜蛋白的主链序列含有表1中所述的氨基酸取代中的一个或多个氨基酸取代时，如与当HIV包膜序列的主链序列不含有此类氨基酸取代时获得的包膜蛋白三聚体形式的总量相比，获得了更大总量的包膜蛋白三聚体形式。
三聚体形成可通过抗体结合测定来测量，该测定使用特异性结合HIV Env蛋白的三聚体形式的抗体。可用于检测三聚体形式的三聚体特异性抗体的实施例包括但不限于单克隆抗体(mAb)PGT145、PGDM1400、PG16和PGT151。优选地，三聚体特异性抗体是mAbPGT145。根据本公开，本领域中已知的任何抗体结合测定可用于测量本发明的重组HIV Env蛋白的三聚体形成百分比，例如ELISA、AlphaLISA等。
在特定实施方案中，三聚体形成通过AlphaLISA进行测量。AlphaLISA是基于珠粒的亲近测定，其中由供体珠粒的高能辐射生成的单态氧分子被转移到距供体珠约200nm的距离内的受体珠粒。单态氧分子转移到受体珠粒引发了一系列级联的化学反应，产生了然后可被检测的化学发光信号(Eglen等人，Curr.Chem.Genomics，2008，25(1):2-10)。例如，用Flag-His标签标记的重组HIV包膜蛋白可与三聚体特异性mAb、与结合三聚体特异性mAb的抗体缀合的供体珠粒、镍缀合的供体珠粒、与抗His抗体缀合的受体珠粒和与抗Flag抗体缀合的受体珠粒一起温育。形成的三聚体的量可通过测量由一对结合三聚体特异性mAb的抗体缀合的供体珠粒和与抗His抗体缀合的受体珠粒生成的化学发光信号来确定。HIV包膜蛋白表达的总量可通过测量由一对镍缀合的供体珠粒和抗-Flag缀合的受体珠粒生成的化学发光信号来确定。例如，表达的三聚体和总包膜蛋白的量可通过如WO 2019/016062的实施例3中详细描述的AlphaLISA测定来测量。三聚体形成百分比可通过将形成的三聚体的量除以表达的包膜蛋白的总量来计算。在某些实施方案中，通过与广泛中和的HIV Env结合抗体PGT145、PGDM1400或两者结合来测量三聚体形成，并在相同条件下(例如在AlphaLISA测定中)与不具有本发明突变的亲本分子的此类结合进行比较(技术人员可获得此类抗体中的每一者，如先前已经描述的(参见例如Lee等人，2017，Immunity 46:690-702，包括补充信息)并可从各种来源获得，诸如NIH AIDS试剂程序，或从Creative Biolabs，或可基于其已知序列重组产生；本文描述的其他有用的抗体也是现有技术已知的，并且可通过类似的方式获得)。在某些实施方案中，如与HIV Env亲本蛋白相比，本发明的HIV Env蛋白与抗体PGT145和/或PGDM1400的结合增加，并且在某些实施方案中，如与HIV Env亲本蛋白相比，本发明的HIV Env蛋白与非广泛中和抗体17b的结合约相同或优选地降低。
形成的三聚体的量和表达的包膜蛋白的总量也可使用能够将三聚体形式与HIV包膜蛋白的其他形式(例如单体形式)分离的色谱技术来确定。可使用的此类技术的实施例包括但不限于尺寸排阻色谱(SEC)，例如分析SEC或SEC多角度光散射(SEC-MALS)。根据某些实施方案，使用SEC-MALS或(分析)SEC测定三聚体形成百分比。根据某些实施方案，使用SEC-MALS或(分析)SEC测定三聚体产量。
在某些实施方案中，本发明还提供了用于改善HIV Env蛋白三聚体形成的方法，该方法包括用Trp、Phe、Met或Leu，优选地用Trp或Phe取代亲本HIV Env蛋白的位于位置650处的残基(通常为Gln)。这可例如使用标准的分子生物学技术来完成。
核酸、载体和细胞
在另一个总的方面，本发明提供了编码根据本发明的重组HIV Env蛋白的核酸分子，以及包含该核酸分子的载体。本发明的核酸分子可以是通过克隆获得或合成产生的RNA的形式或DNA的形式。DNA可以是双链的或单链的。DNA可例如包含cDNA、基因组DNA或它们的组合。核酸分子和载体可用于重组蛋白生产、蛋白在宿主细胞中的表达或病毒颗粒的生产。
在某些实施方案中，对编码根据本发明的蛋白的核酸分子进行密码子优化以在哺乳动物细胞，优选人细胞或昆虫细胞中表达。密码子优化的方法是已知的并且先前已有描述(例如WO 96/09378对于哺乳动物细胞进行了描述)。如果与野生型序列相比至少一个非优选密码子被更优选的密码子置换，则认为该序列是密码子优化的。在本文中，非优选密码子是在生物体中使用的频率低于编码相同氨基酸的另一密码子的密码子，并且更优选的密码子是在生物体中使用的频率高于非优选密码子的密码子。特定生物体的密码子使用频率可在密码子频率表，诸如在http://www.kazusa.or.jp/codon中找到。优选地，多于一个非优选密码子，优选地大多数或所有非优选密码子被更优选的密码子置换。优选地，生物体中最频繁使用的密码子用于密码子优化的序列中。优选密码子的置换通常导致更高的表达。
技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸分子可以编码相同的蛋白。还应当理解，技术人员可以使用常规技术产生不影响由核酸分子编码的蛋白质序列的核苷酸取代，以反映有待在其中表达蛋白质的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括或者可以不包括内含子。
核酸序列可使用常规的分子生物学技术进行克隆，或通过DNA合成从头生成，这些可由在DNA合成和/或RNA合成和/或分子克隆领域有业务的服务公司使用常规程序进行。
编码本发明的重组HIV Env蛋白的核酸例如也可以mRNA的形式。此类mRNA可直接用于生产Env蛋白，例如在细胞培养物中，但也可通过疫苗接种，例如通过施用在药物递送载体，诸如脂质体或脂质纳米颗粒中的mRNA。核酸或mRNA也可以自扩增RNA或自复制RNA的形式，例如基于正义RNA病毒，诸如甲病毒的自复制机制。此类自复制RNA(或repRNA或RNA复制子)可以表达甲病毒非结构蛋白基因的RNA分子的形式，使得其可在细胞中指导其自身的复制扩增，而不产生子代病毒。例如，repRNA可包含5'甲病毒复制识别序列和3'甲病毒复制识别序列、甲病毒非结构蛋白的编码序列、编码抗原(诸如本发明的HIV Env蛋白)的异源基因、和表达抗原的装置和多腺苷酸化通道。此类repRNAs在宿主内的广泛组织中诱导瞬时、高水平的抗原表达，并且能够在分裂细胞和非分裂细胞两者中起作用。repRNA可作为DNA分子被递送到细胞，repRNA从该细胞中发射，包装在病毒复制子颗粒(VRP)中，或作为裸露的修饰或未经修饰的RNA分子。在某些实施方案中，mRNA可以是核苷修饰的，例如，mRNA或复制RNA可含有修饰的核碱基，诸如US2011/0300205中描述的那些。repRNA的非限制性实施例可在WO 2019/023566中找到。在非限制性实施方案中，mRNA疫苗和自扩增RNA疫苗可例如包括如(Pardi等人，2018，Nature Reviews Drug Discovery 17:261-279)和(Zhang等人，2019，Front.Immunol.10:594)中描述的疫苗形式和变化。
根据本发明的实施方案，编码重组HIV包膜蛋白的核酸可操作地连接至启动子，这意味着核酸处于启动子的控制之下。该启动子可以是同源启动子(即，来源于与载体相同的遗传源头)或异源启动子(即，来源于不同的载体或遗传源头)。合适的启动子的非限制性实施例包括人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE，或简称“CMV”)启动子和劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，启动子位于表达盒内的核酸的上游。
根据本发明的核酸可被并入到载体中。在某些实施方案中，载体包含DNA和/或RNA。根据本发明的实施方案，载体可以是表达载体。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体和用于将核酸递送到受试者中以在受试者的组织中表达的载体(诸如病毒载体)。适于与本发明一起使用的病毒载体的实施例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、经修饰的痘苗安卡拉病毒(MVA)载体、肠道病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒载体、甲病毒载体等。载体也可为非病毒载体。非病毒载体的实施例包括但不限于质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体等。
在本发明的某些实施方案中，载体是腺病毒载体，例如重组腺病毒载体。重组腺病毒载体可例如来源于人腺病毒(HAdV，或AdHu)，或猿腺病毒，诸如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd，AdCh，或SAdV)或恒河猴腺病毒(rhAd)。优选地，腺病毒载体是重组人腺病毒载体，例如重组人腺病毒血清型26，或重组人腺病毒血清型5、4、35、7、48等中的任一者。在其他实施方案中，腺病毒载体是rhAd载体，例如rhAd51、rhAd52或rhAd53。在其他实施方案中，重组腺病毒基于黑猩猩腺病毒，诸如ChAdOx 1(参见例如WO 2012/172277)，或ChAdOx 2(参见例如WO 2018/215766)，或BZ28(参见例如WO 2019/086466)。在其他实施方案中，重组腺病毒基于大猩猩腺病毒，例如BLY6(参见例如WO 2019/086456)或BZ1(参见例如WO 2019/086466)。
重组腺病毒载体的制备是本领域熟知的。例如，重组腺病毒26载体的制备在例如WO 2007/104792和Abbink等人，(2007)Virol.81(9):4654-63中描述。腺病毒26的示例性基因组序列存在于GenBank登录EF 153474和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1。rhAd51、rhAd52和rhAd53的示例性基因组序列在US2015/0291935中提供。
根据本发明的实施方案，本文所述的重组HIV Env蛋白中的任何重组HIV Env蛋白可由本文所述的载体中的任何载体表达和/或编码。鉴于遗传密码的简并性，技术人员很清楚，根据本领域完全常规的方法，可设计编码相同蛋白的若干核酸序列。编码本发明的重组HIV Env蛋白的核酸可任选地进行密码子优化，以确保在宿主细胞(例如，细菌或哺乳动物细胞)中的正确表达。密码子优化是本领域广泛应用的技术。
本发明还提供了细胞，优选地分离的细胞，这些细胞包含本文所述的核酸分子和载体中的任何核酸分子和载体。这些细胞可例如用于重组蛋白生产，或用于病毒颗粒的生产。
因此，本发明的实施方案还涉及制备重组HIV Env蛋白的方法。该方法包括用表达载体转染宿主细胞，该表达载体包含可操作地连接至启动子的编码根据本发明的实施方案的重组HIV Env蛋白的核酸，使转染的细胞在适于重组HIV Env蛋白表达的条件下生长，并且任选地纯化或分离在细胞中表达的重组HIV Env蛋白。重组HIV Env蛋白可通过本领域已知的任何方法从细胞中分离或收集，包括亲和层析、尺寸排阻色谱等。根据本公开，用于重组蛋白表达的技术将为本领域普通技术人员所熟知。也可在不纯化或分离表达的蛋白的情况下研究表达的重组HIV Env蛋白，例如，通过分析用编码重组HIV Env蛋白的表达载体转染并在适于HIV Env蛋白表达的条件下生长的细胞的上清液。
在一个优选的实施方案中，在允许蛋白关联的条件下纯化表达的重组HIV Env蛋白，从而形成稳定化的三聚体复合物。例如，用编码重组HIV Env蛋白的表达载体转染的哺乳动物细胞可在33℃-39℃下，例如37℃下，和2％ CO2-12％ CO2，例如8％ CO2下培养，该重组HIV Env蛋白可操作地连接至启动子(例如CMV启动子)。表达也可在另选的表达系统中进行，诸如昆虫细胞或酵母细胞，所有这些都是本领域常规的。然后可从细胞培养物中分离表达的HIV Env蛋白，例如通过结合糖蛋白的凝集素亲和层析。结合到柱的HIV Env蛋白可用吡喃甘露糖苷洗脱。从柱中洗脱的HIV Env蛋白可根据需要进行进一步的纯化步骤，诸如尺寸排阻色谱，以去除任何残留的污染物，例如细胞污染物，以及Env聚集体、gp140单体和gp120单体。另选的纯化方法，非限制性实施例包括抗体亲和层析、非bNAb阴性选择、抗标签纯化或其他层析方法，诸如离子交换层析等，以及本领域已知的其他方法，也可以用于分离表达的HIV Env蛋白。
根据本公开，编码本发明重组HIV Env蛋白的核酸分子和表达载体可通过本领域已知的任何方法制备。例如，编码重组HIV Env蛋白的核酸可通过使用基因工程技术和分子生物学技术，例如定点诱变、聚合酶链反应(PCR)等，将编码位于所示位置处的一个或多个氨基酸取代的突变引入主链HIV包膜序列中来制备，这对本领域技术人员来说是熟知的。然后也可使用标准分子生物学技术将核酸分子引入或“克隆”到表达载体中。然后可在宿主细胞中从表达载体中表达重组HIV包膜蛋白，并且根据本公开，通过本领域已知的任何方法从细胞培养物中纯化表达的蛋白。
三聚体复合物
在另一个总的方面，本发明涉及一种三聚体复合物，该三聚体复合物包含根据本发明的重组HIV Env蛋白中的三种重组HIV Env蛋白的非共价低聚物。三聚体复合物可包含本文所述的重组HIV Env蛋白中的任何重组HIV Env蛋白。优选地，三聚体复合物包含根据本发明的重组HIV Env蛋白的三个相同的单体(或相同的异源二聚体，如果gp140被切割的话)。三聚体复合物可与其他形式的HIV包膜蛋白(诸如单体形式)分开，或三聚体复合物可与其他形式的HIV包膜蛋白(诸如单体形式)一起存在。
组合物和方法
在另一个总的方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、分离的核酸、载体或宿主细胞以及药学上可接受的载体。该组合物可包含本文所述的重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞中的任一者。
载体可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，诸如粘结剂、崩解剂、溶胀剂、悬浮剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、风味剂、甜味剂、防腐剂、染料、增溶剂和包衣。载体或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如肌内、皮内、皮下、口服、静脉、皮肤、粘膜内(例如，肠)、鼻内或腹膜内途径。对于液体注射制剂，例如混悬剂和溶剂，合适的载体和添加剂包括水、二元醇、油、醇、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂，例如散剂、胶囊剂、囊片、胶囊锭剂和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂等。对于鼻用喷雾剂/吸入剂混合物，水溶液/混悬剂可包含水、乙二醇、油、润肤剂、稳定剂、润剂湿、防腐剂、芳香剂、调味剂等作为合适的载体和添加剂。
本发明的组合物可在适于对受试者施用以促进施用和提高功效的任何物质中配制，包括但不限于口服(经肠)施用和胃肠外注射。非肠道注射包括静脉注射或输液、皮下注射、皮内注射和肌内注射。本发明的组合物还可配制成用于其他施用途径，包括经粘膜、眼、直肠、长效植入、舌下施用、从口腔粘膜绕过门脉循环、吸入或鼻内。
本发明的实施方案还涉及制备该组合物的方法。根据本发明的实施方案，生产组合物的方法包括将本发明的重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、分离的核酸、载体或宿主细胞与一种或多种药学上可接受的载体混合。本领域普通技术人员将熟悉用于制备此类组合物的常规技术。
HIV抗原(例如，来源于HIV gag、pol和/或env基因产物的蛋白或其片段)和表达HIV抗原的载体(诸如病毒载体)先前已经用于免疫原性组合物和疫苗中，用于对受试者接种针对HIV感染的疫苗，或用于在受试者中生成针对HIV感染的免疫应答。如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人，其将被或已经被施用根据本发明的实施方案的免疫原性组合物。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实施例包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴、人等，优选地人。本发明的重组HIV Env蛋白也可用作抗原，在对其有需要的受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答。免疫应答可针对一种或多种HIV进化枝，诸如进化枝A、进化枝B、进化枝C等。该组合物可包含表达重组HIV Env蛋白的载体，或该组合物可包含根据本发明的实施方案的分离的重组HIVEnv蛋白。
例如，可将包含重组HIV蛋白或其三聚体复合物的组合物施用于对其有需要的受试者，以在受试者中诱导针对HIV感染的免疫应答。包含编码本发明的重组HIV Env蛋白的载体(诸如腺病毒载体)的组合物，其中该重组HIV Env蛋白由载体表达，也可施用于对其有需要的受试者，以在受试者中诱导针对HIV感染的免疫应答。本文所述的方法还包括施用与一种或多种附加的HIV抗原(例如，来源于HIV gag、pol和/或env基因产物的蛋白或其片段)组合的本发明的组合物，这些HIV抗原优选地由一种或多种载体，诸如腺病毒载体或MVA载体表达，包括引发和加强免疫应答的方法。
在某些实施方案中，HIV Env蛋白可展示在颗粒上，诸如脂质体、病毒样颗粒(VLP)、纳米颗粒、病毒体或外来体，任选地与内源和/或外源佐剂组合。当与可溶性或单体Env蛋白本身相比时，此类颗粒通常显示出增强的体内抗原呈递功效。
展示HIV Env蛋白的VLP的实施例可通过例如将HIV Env蛋白与自组装病毒蛋白，诸如HIV Gag核心或其他逆转录病毒Gag蛋白共表达来制备。VLP与病毒类似，但是无传染性的，因为其不含病毒遗传物质。病毒结构蛋白(诸如包膜或衣壳)的表达可导致VLP的自组装。VLP是技术人员所熟知的，并且其在疫苗中的用途例如在(Kushnir等人，2012)中描述。
在某些优选的实施方案中，颗粒是脂质体。脂质体是具有至少一个脂质双层的球形囊泡。HIV Env三聚体蛋白可例如通过静电相互作用非共价偶联到此类脂质体，例如通过在HIV Env三聚体的C-末端添加His-标签，以及将二价螯合原子，诸如Ni2+或Co2+掺入脂质体中衍生化脂质的头部基团中。在某些非限制性和示例性实施方案中，脂质体包含摩尔比为60:36:4的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二油酰-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](DGS-NTA(Ni2+)或DGS-NTA(Co2+)的镍或钴盐。在优选的实施方案中，HIV Env三聚体蛋白共价偶联到脂质体表面，例如通过整合在脂质体表面的马来酰亚胺官能团。在其某些非限制性示例性实施方案中，脂质体包含摩尔比为54:30:16的DSPC、胆固醇和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对-马来酰亚胺甲基)环己烷-甲酰胺]脂质。HIV Env蛋白可与之偶联，例如通过在HIV Env蛋白中添加C-末端半胱氨酸。共价偶联的变体更稳定，引发高抗原特异性IgG滴度，并且在抗原性较不相关的Env三聚体“底部”的表位被掩蔽。用于制备与脂质体偶联的HIV Env三聚体的方法及其表征是已知的，并且例如在(Bale等人，2017)中描述，该文献通过引用并入本文。本发明还提供了融合到脂质体和/或展示在该脂质体上的本发明的HIV Env蛋白。
在某些实施方案中，本发明的HIV Env蛋白融合到自组装颗粒，或展示在纳米颗粒上。抗原纳米颗粒是呈递多拷贝抗原的多肽的集合，例如本发明的HIV Env蛋白，其导致多个结合位点(亲合力)，并可提供改善的抗原稳定性和免疫原性。用于疫苗的自组装蛋白纳米颗粒的制备和使用是技术人员所熟知的，参见例如(Zhao等人，2014)，(López-Sagaseta等人，2016)。作为非限制性实施例，自组装纳米颗粒可基于铁蛋白、细菌铁蛋白或DPS。例如在WO2011/082087中描述了在其表面展示蛋白的DPS纳米颗粒。例如，在(He等人，2016)中描述了在此类颗粒上的三聚体HIV-1抗原。其他自组装蛋白纳米颗粒以及其制备例如在WO2014/124301和US2016/0122392中公开，这些文献通过引用并入本文。本发明还提供了融合到自组装纳米颗粒和/或展示在该自组装纳米颗粒上的本发明的HIV Env蛋白。本发明还提供了组合物，该组合物包含根据本发明的VLP、脂质体或自组装纳米颗粒。
在某些实施方案中，佐剂包含在本发明的组合物中或与本发明的组合物共同施用。佐剂的使用是任选的，并且当组合物用于疫苗接种目的时，可进一步增强免疫应答。适于共同施用或包含在根据本发明的组合物中的佐剂应该优选地是潜在安全的、耐受性良好的和对人有效的佐剂。此类佐剂是技术人员所熟知的，并且非限制性实施例包括QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、铝盐，诸如磷酸铝(例如AdjuPhos)或氢氧化铝，以及MF59。
本文还公开了重组HIV包膜蛋白，该重组HIV包膜蛋白包含与分别代表HIV包膜共有进化枝C序列和共有进化枝B序列的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重组HIV包膜蛋白可任选地进一步包含所谓的SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点的突变，诸如例如在SEQID NO:3或SEQ ID NO:3中示出的那些序列中，进一步包含位于位置558处和/或位于位置556处的Pro以及SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5，其还位于位置558处和/或位于位置556处的Pro。当确定这些序列的％同一性时，优选地不考虑突变弗林蛋白酶切割位点和位于位置501、605、559、556和558处的氨基酸。此类蛋白以高水平表达，并具有高水平的稳定性和三聚体形成。在某些实施方案中，此类HIV Env蛋白可用作主链蛋白，其中T538突变为H可获得本发明的分子。还公开了编码这些序列的分离的核酸分子、包含可操作地连接至启动子的这些序列的载体、以及包含蛋白、分离的核酸分子或载体的组合物。
实施例
实施例1：位于位置650处的HIV包膜突变为Trp、Phe、Met或Leu增加了三聚体产量
HIV进化枝C和进化枝B包膜(Env)蛋白共有序列，包括SOSIP突变(位于位置501和605处的半胱氨酸残基和位于位置559处的脯氨酸残基)以及通过用6个精氨酸残基置换残基508-511处的弗林蛋白酶位点而优化的弗林蛋白酶切割位点，被用作研究位于位置650处的突变对HIV Env蛋白三聚体形成的影响的主链序列。此外，C-末端在残基664处被截短，产生编码可溶性HIV gp140蛋白的序列。此外，在进化枝C变体(ConC_SOSIP)中，位于位置295处的Val突变为Asn(V295N)，以产生存在于大多数HIV菌株中的N-连接的糖基化位点，其可改善与一些实验中使用的某些抗体的结合。上述所有取代/修饰位置都是相对于HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。主链进化枝C和进化枝B HIV gp140序列，分别称为“ConC_SOSIP”和“ConB_SOSIP”，示出(SEQ ID NOs:3和5)。具体地，在这些主链分子中，位于位置650处的Gln残基被Trp残基(Q650W突变，也称为“本发明的突变”中的一个突变)置换。此外，ConC_SOSIP主链中位于位置650处的Gln残基也被Phe(Q650F)、Met(Q650M)、Ile(Q650I)或Leu(Q650L)残基置换，其中Q650F、Q650M和Q650L也称为“本发明的突变”)。类似地，在ConC_SOSIP主链和ConB_SOSIP主链中，位于位置108处的Ile残基被His残基(I108H突变)置换。类似地，在ConC_SOSIP主链和ConB_SOSIP主链中，位于位置538处的Thr残基被His残基(T538H突变)置换。所得重组HIV Env蛋白表达为可溶性gp140蛋白。根据已知方法进行实验，例如如WO 2018/050747中所描述的。
AlphaLISA测定
(Perkin-Elmer)是一种基于珠粒的亲近测定，其中通过供体珠粒的高能辐射生成的单态氧分子转移到距约200nm的距离内的受体珠粒。其为灵敏的高通量筛选测定，不需要洗涤步骤。一系列级联的化学反应产生化学发光信号(Eglen等人，CurrChem Genomics，2008)。对于AlphaLISA测定，该构建体配备有分拣酶A-Flag-His标签(SEQID NO:15)。HIV构建体在Expi293F细胞中表达，该细胞在96孔板中培养3天(200μl/孔)。在缓冲液(PBS+0.05％吐温-20+0.5mg/mL BSA)中将粗上清液稀释120倍，但基于17b的测定除外，其中上清液被稀释12倍。随后，将10μl的这些稀释液转移到半面积96孔板中，并与40μl的受体珠粒、供体珠粒和mAb的混合物混合。珠粒在使用前充分混合。在室温下非振荡温育2小时后，用Neo(BioTek)测量信号。供体珠粒与ProtA(目录号：AS102M，Perkin Elmer)缀合，其可与mAb结合。受体珠粒与抗His抗体(目录号：AL112R，PerkinElmer)缀合以检测蛋白的His标签。为了定量总蛋白水平，使用了镍缀合的供体珠粒(目录号：AS101M，Perkin Elmer)和携带抗-Flag抗体的受体珠粒(目录号：AL112R，PerkinElmer)的组合。对于17b与sCD4-His的组合，使用了ProtA供体珠粒和抗Flag受体珠粒的组合。从针对不同Env蛋白测量的AlphaLISA计数中减去模拟转染(无Env)的平均信号。作为参考，亲本ConC_SOSIP或ConB_SOSIP Env质粒分别用于进化枝C和进化枝B Env突变体。
用于分析的单克隆抗体(mAb)在本领域是熟知的(参见例如WO 2018/050747)，并且在表2中指示了它们的特征中的一些特征。
表2：实验中使用的HIV Env抗体
mAb 广泛中和 表位 三聚体特异性
PGT145 是 尖端 是
VRC026 是 尖端 是
PGDM1400 是 尖端 是
PG16 是 尖端 是
PG9 是 尖端 否
35O22 是 gp120-gp41界面 否
PGT128 是 V3基 否
PGT151 是 gp120-gp41界面 是
F105 否 CD4bs 否
447-52d 否 V3冠 否
B6 否 CD4bs 否
14e 否 V3冠 否
17b 否 CCR5bs 否
17b+CD4 NA CD4b和CCR5b 否
定量 NA 标签 否
广泛中和抗体(bNAb)结合来自许多HIV菌株的Env的天然融合前构象。非bNAb结合错误折叠的非天然Env或高度可变的暴露环。还通过测量可溶性HIV gp140 Env蛋白变体与已知结合HIV包膜蛋白的共受体结合位点的抗体(mAb 17b)的结合来测试蛋白折叠，该结合位点仅在结合CD4后暴露(数据未示出)。具体地，可溶性受体CD4(sCD4)与mAb 17结合地使用来评估CD4诱导的构象变化。mAb 17b与HIV gp140 Env蛋白变体的结合，而没有预先与包膜蛋白结合的CD4，是部分解折叠或预触发包膜蛋白(即，在没有CD4结合的情况下采用“开放”构象的不稳定Env)的指示。
一般来讲，如与这些实验中的亲本Env分子相比，如果一种或多种bNAb的结合增加，并且一种或多种非bNAb的结合不增加或甚至减少，则这是HIV Env变体的阳性属性。
分析SEC
HIV Env变体在96孔形式的细胞培养物中表达。使用超高效液相色谱系统(Vanquish，Thermo Scientific)和与OptilabμT-rEX折光率检测器(Wyatt)偶联的μDAWNTREOS仪器(Wyatt)以及在线纳米星DLS读数器(Wyatt)进行分析尺寸排阻色谱(分析SEC)实验。将澄清的粗细胞培养物上清液应用到TSK-Gel UP-SW 3000 4.6×150mm柱上，对应的保护柱(Tosoh Bioscience)在0.3毫升/分钟的运行缓冲液(150mm磷酸钠，50mM氯化钠，pH7.0)中平衡。当分析上清液样品时，μMALS检测器离线并且使用Chromeleon 7.2.8.0软件包对分析SEC数据进行分析。从HIV Env转染细胞上清液的信号中减去未转染细胞上清液的信号。
对生成的重组HIV Env蛋白变体进行三聚体形成筛选，以检查Q650W突变相对于主链序列是否提高了三聚体形成的百分比和/或提高了三聚体产量。使用分析SEC(图1A，图2A)来确定三聚体产量。使用AlphaLISA测定来评估一组广泛中和的HIV抗体(bNAb)和非bNAb与重组HIV Env蛋白的结合，以验证相对三聚体产量并确定HIV Env蛋白的构象特性(图1B，图2B)。
在分析SEC中，示出突变Q650W增加了ConC_SOSIP和ConB_SOSIP的三聚体产量(图1A和图2A)。此外，与不具有突变的亲本分子相比，突变Q650W增加了AlphaLISA中bNAb抗体的结合。证明了三聚体特异性尖端定向广泛中和抗体(bNAb)PGT145、VRC026和PGDM1400的增加，指示ConC_SOSIP的提高的三聚体产量和/或三聚体折叠(图1B)。对ConB_SOSIP进行了相同的观察，除了VRC026，其不与该HIV Env结合，不管其是否稳定(图2B)。对于ConC_SOSIP和ConB_SOSIP两者，Q650W减少了AlphaLISA中非bNAb 17b的结合(图1B和图2B)，这是期望的特性并指示Env三聚体的封闭的天然融合前构象。在CD4存在的情况下，与mAb 17b的结合增加，表明这种非bNAb 17b的表位仍是完整的。
位于位置650处，除了色氨酸(W)之外，还检测了一些其他的氨基酸取代。苯丙氨酸(F)显著增加了三聚体产量，蛋氨酸(M)和亮氨酸(L)也增加了三聚体产量，而异亮氨酸(I)则令人惊讶地减少了三聚体形成，如使用编码相应HIV Env ConC_SOSIP变体的质粒转染后Expi293F细胞培养物上清液的SEC分析所示(图3)。
还示出，与不具有该突变的亲本分子相比，突变T538H增加了AlphaLISA中ConC_SOSIP和ConB-SOSIP两者(图4A和图5A)以及bNAb结合的三聚体产量。对于T538H突变，证明了三聚体特异性尖端定向广泛中和抗体(bNAb)PGT145、VRC026和PGDM1400的增加，指示ConC_SOSIP的提高的三聚体产量和/或三聚体折叠(图4B)；对ConB_SOSIP进行了相同的观察，除了VRC026，其不与该HIV Env结合，不管T538H稳定(图5B)。对于ConC_SOSIP和ConB_SOSIP两者，T538H减少了AlphaLISA中非bNAb 17b的结合(图4B和图5B)。
还示出，与不具有该突变的亲本分子相比，突变I108H增加了AlphaLISA中ConC_SOSIP和ConB-SOSIP两者(图6A和图7A)以及bNAb结合的三聚体产量。对于I108H突变，证明了三聚体特异性尖端定向广泛中和抗体(bNAb)PGT145、VRC026和PGDM1400的增加，指示ConC_SOSIP的提高的三聚体产量和/或三聚体折叠(图6B)；对ConB_SOSIP进行了相同的观察，除了VRC026，其不与该HIV Env结合，不管I108H稳定(图7B)。对于ConC_SOSIP和ConB_SOSIP两者，I108H强烈减少了AlphaLISA中非bNAb 17b的结合(图6B和图7B)。
还示出，如与仅包含I108H的ConB_SOSIP相比，突变I108H、T538H和Q650W的组合增加了AlphaLISA中ConB_SOSIP(图8A)和bNAb结合的三聚体产量。对于ConB_SOSIP_I108H_T538H_Q650W，证明了三聚体特异性尖端定向广泛中和抗体(bNAb)PGT145和PGDM1400的增加，指示如与ConB_SOSIP_I108H相比，提高的三聚体产量和/或三聚体折叠(图8B)。如与ConB_SOSIP_I108H相比，在ConB_SOSIP_I108H_T538H_Q650W中观察到如在AlphaLISA中测量的相同的非bNAb减少(图8B)。
位置650W、650F、650M或650L，优选地650W或650F的突变也在来自其他进化枝的HIV Env蛋白中、在天然HIV Env序列中、在不包含SOSIP突变的一个SOSIP突变或所有SOSIP突变的HIV Env蛋白中、在具有表1的条目(i)-(xvi)中所示的突变的一个或多个突变的HIVEnv蛋白中、在具有T538H突变和/或I108H突变的HIV Env蛋白中，并且基于本申请和对HIVEnv蛋白的了解，似乎650W突变、650F突变、650M突变和650L突变中的每一者，优选地650W或650F，也在大多数或所有这些背景中起作用，以增加三聚体形成和/或三聚体产量。
本文示出的数据证明，如与位于位置650处的具有天然存在的氨基酸的HIV Env蛋白相比，本发明的分子，即位于所述位置处的具有Trp、Phe、Met或Leu，优选地Trp或Leu的HIV Env蛋白，具有令人惊讶地增加的三聚体形成和/或三聚体产量。位于位置650处的具有Trp的所得Env三聚体更倾向于处于封闭的天然融合前构象。
从制造角度来看，具有三聚体形成的增加的百分比的HIV包膜蛋白是有利的，诸如对于疫苗来说，因为需要较少的纯化和去除制剂中以不期望的非天然构象存在的包膜蛋白。此外，增加的三聚体总表达产量有利于制造疫苗产品。主要处于封闭的天然融合前构象的HIV包膜蛋白对于疫苗接种也是期望的，因为据信其在实际感染期间在结构上更接近于Env蛋白，因此对处于此类构象的Env蛋白产生的免疫应答是非常有益的。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是为了进行示意性的说明，并且可在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施方案进行修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖符合本发明实质和范围的修改，如所附权利要求书中定义的。
序列表
SEQ ID NO:1HIV-1分离株HXB2的gp 160(信号序列以斜体表示；位于位置108处的Ile、位于位置538处的Thr和位于位置650处的Gln加下划线并加粗)
SEQ ID NO:2HIV Env示例性共有进化枝C(仅包括共有序列，不包括任何信号序列、跨膜结构域(664是最后一个氨基酸)、SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点突变；位于位置108处的Ile、位于位置538处的Thr和位于位置650处的Gln加下划线并加粗)
SEQ ID NO:3ConC_SOSIP(具有SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点的成熟进化枝C共有序列，和C-末端截短物，和C-末端的分拣酶A-Flag-His标签(加下划线)；位于位置108处的Ile、位于位置538处的Thr和位于位置650处的Gln加下划线并加粗(HIV150606)
SEQ ID NO:4HIV Env示例性共有进化枝B(仅包括共有序列，不包括任何信号序列、跨膜结构域(664是最后一个氨基酸)、SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点突变；位于位置108处的Ile、位于位置538处的Thr和位于位置650处的Gln加下划线并加粗)
SEQ ID NO:5ConB_SOSIP(具有SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点的成熟进化枝C共有序列，和C-末端截短物，和C-末端的分拣酶A-Flag-His标签(加下划线)；位于位置108处的Ile、位于位置538处的Thr和位于位置650处的Gln加下划线并加粗(HIV150599)
SEQ ID NO:6(弗林蛋白酶切割位点突变序列)
RRRRRR
SEQ ID NO:7(信号序列的示例(例如用于ConC_SOSIP))
MRVRGILRNWQQWWIWGILGFWMLMICNVVG(注意：最后一个VG可能是成熟蛋白的开始或信号序列的结束)
SEQ ID NO:8(信号序列的示例(例如用于ConB_SOSIP)
MRVKGIRKNYQHLWRWGTMLLGMLMICSA
SEQ ID NO:9(可置换HR1环的8个氨基酸序列的示例)
NPDWLPDM
SEQ ID NO:10(可置换HR1环的8个氨基酸序列的示例)
GSGSGSGS
SEQ ID NO:11(可置换HR1环的8个氨基酸序列的示例)
DDVHPDWD
SEQ ID NO:12(可置换HR1环的8个氨基酸序列的示例)
RDTFALMM
SEQ ID NO:13(可置换HR1环的8个氨基酸序列的示例)
DEEKVMDF
SEQ ID NO:14(可置换HR1环的8个氨基酸序列的示例)
DEDPHWDP
SEQ ID NO:15(分拣酶A-Flag-His标签)
AAALPETGGGSDYKDDDDKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSHHHHHH
SEQ ID NO:16(示例性全长ConC_SOSIP(包括信号序列，以斜体表示)；位于位置108处的Ile、位于位置538处的Thr和位于位置650处的Gln加下划线并加粗)
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Claims (20)

1.一种重组人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(Env)蛋白，所述重组HIVEnv蛋白包含位于位置650处的氨基酸色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或亮氨酸(Leu)中的一者，
其中所述位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
2.根据权利要求1所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白进一步包含位于所示位置处的以下氨基酸残基中的一者或多者：
(i)位于位置651处的Phe、Leu、Met或Trp，优选地Phe；
(ii)位于位置655处的Phe、Ile、Met或Trp，优选地Ile；
(iii)位于位置535处的Asn或Gln，优选地Asn；
(iv)位于位置589处的Val、Ile或Ala，优选地Val或Ile，更优选地Val；
(v)位于位置573处的Phe或Trp，优选地Phe；
(vi)位于位置204处的Ile；
(vii)位于位置647处的Phe、Met或Ile，优选地Phe；
(viii)位于位置658处的Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu，优选地Val或Ile，更优选地Val；
(ix)位于位置588处的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp或Phe，优选地Gln或Glu；
(x)位于位置64处的Lys或位于位置66处的Arg或位于位置64处的Lys和位于位置66处的Arg；
(xi)位于位置316处的Trp；
(xii)位于位置201和433处的Cys；
(xiii)位于位置556或558处或位于位置556和558两者处的Pro；
(xiv)由具有7至10个氨基酸的环，优选地8个氨基酸的环，例如具有选自(SEQ ID NO:9-14)中任一者的序列的环置换位于氨基酸位置548至568处的环(HR1-环)；
(xv)位于位置568处的Gly，或位于位置569处的Gly，或位于位置636处的Gly，或位于位置568和636两者处的Gly，或位于位置569和636两者处的Gly；
(xvi)位于位置302处的Tyr，或位于位置519处的Arg，或位于位置520处的Arg，或位于位置302处的Tyr和位于位置519处的Arg，或位于位置302处的Tyr和位于位置520处的Arg，或位于位置302处的Tyr和位于位置519和520两者处的Arg；
(xvii)所述HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突变，优选地由RRRRRR(SEQ IDNO:6)，位于位置508至511处的置换；
(xviii)位于位置501和605处的Cys或位于位置559处的Pro，优选地位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro；
(xix)位于位置108处的His；和/或
(xx)位于位置538处的His，
其中所述位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
3.根据权利要求1或2所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白包含位于位置650处的Trp。
4.根据权利要求1或2所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白包含位于位置650处的Phe。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白包含位于位置108处的His。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白包含位于位置538处的His。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白包含位于位置501和605处的Cys或位于位置559处的Pro，优选地位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白包含位于位置501和605处的Cys和位于位置559处的Pro。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白为gp140或gp160蛋白，或在细胞质区中具有截短物的Env蛋白。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组HIV Env蛋白，所述重组HIV Env蛋白为进化枝A HIV、进化枝B HIV或进化枝C HIV的Env蛋白。
11.一种三聚体复合物，所述三聚体复合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的三种相同重组HIV Env蛋白的非共价低聚物。
12.一种颗粒，所述颗粒优选地是脂质体或纳米颗粒，在其表面上展示根据权利要求1至10中任一项所述的重组HIV Env蛋白或根据权利要求11所述的三聚体复合物。
13.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1至10中任一项所述的重组HIV Env蛋白。
14.一种载体，所述载体包含可操作地连接至启动子的根据权利要求13所述的分离的核酸分子。
15.根据权利要求14所述的载体，所述载体是腺病毒载体。
16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求13所述的分离的核酸分子或根据权利要求14或15所述的载体。
17.一种生产重组HIV Env蛋白的方法，所述方法包括使根据权利要求16所述的宿主细胞在适于生产重组HIV Env蛋白的条件下生长。
18.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的重组HIV Env蛋白、根据权利要求11所述的三聚体复合物、根据权利要求12所述的颗粒、根据权利要求13所述的分离的核酸分子或根据权利要求14或15所述的载体，以及药学上可接受的载体。
19.一种改善HIV Env蛋白的三聚体形成的方法，所述方法包括由Trp、Phe、Met或Leu中的一者，优选地由Trp或Phe取代亲本HIV Env蛋白中位于位置650处的氨基酸残基，其中所述位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
20.一种重组人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(Env)蛋白，所述重组HIVEnv蛋白包含位于位置108处的组氨酸(His)，其中所述位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
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