KR20200037818A - 이종성 repRNA 면역접종을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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로날드 보겔스
마린 반 데 노이트 코프쇼튼
대럴 제이. 어빈
론 웨이스
엘리 블랜턴 포터
마리앤 반데리아 멜로
타스쿠 키타다
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얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이.
매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

인간에서 면역원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법이 기재된다. 유도된 면역 반응은 시험관 내 전사된(in vitro transcribed, IVT) 자가 복제 RNA(repRNA) 및 아데노바이러스 벡터의 이종성 프라임-부스트 조합의 투여에 의해 얻어진다. 상기 조성물 및 방법은 인간에서 바이러스 감염 또는 암과 같은 질병에 대한 보호 면역성을 제공하기 위하여 사용될 수 있다.

Description

이종성 repRNA 면역접종을 위한 방법 및 조성물
전자적으로 제출된　서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 ASCII 형식 서열 목록으로서 2017년 7월 26일 작성되고, 23,045 바이트 크기의 파일명 “sequence_listing”인 서열 목록을 포함한다. 상기 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 본 명세서에 전체가 참조로서 통합된다.
발명의 기술분야
본 발명은 인간 대상체 내에서의 면역 반응을 유도하기 위한 방법 및 조성물에 관한다. 구체적으로, 상기 유도된 면역 반응은 시험관 내 전사된(in vitro transcribed, IVT) 자가 복제 RNA(repRNA) 및 아데노바이러스 벡터의 이종성 프라임-부스트 조합의 투여에 의해 얻어진다. 상기 방법 및 조성물은 인간 대상체 내에서 면역원에 대하여 강한 체액 및 세포 면역 반응 유도를 제공하며, 인간 대상체 내에서 종양 또는 감염성 질환과 같은 질병에 대한 유효한 치료 및/또는 보호를 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
발명의 배경기술
백신은 바이러스, 박테리아, 균류, 원생동물과 같은 병원체 뿐만 아니라 암에 대한 면역 보호를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
감염성 질환은 전세계적으로 심혈관계 질환 다음으로 2위의 사망 원인이지만 유아 및 어린이에서는 가장 큰 사망 원인이다(Lee and Nguyen, 2015, Immune Network, 15(2):51-7). 백신접종은 다양한 감염성 질환의 예방에 가장 효율적인 도구이다. 백신접종의 목적은 감염에 대한 장기 지속되는 보호를 제공하는 병원체-특이적 면역반응을 생성하는 것이다. 백신의 현저한 성공에 불구하고, 새로운 병원체의 출현, 구 병원체의 재출현 및 기존 백신에 의해 부여되는 최적화되지 않은 보호로 인해 안전하고 강력한 백신의 개발이 여전히 요구된다. 최근 출현 또는 재출현된 질병은 2003년 중증급성호흡기증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS), 2009년 H1N1 인플루엔자 판데믹(H1N1 influenza pandemic), 및 2014년 에볼라 바이러스를 포함한다. 결과적으로 바이러스 출현에 대한 새롭고 유효한 백신의 개발에 대한 필요가 존재한다.
암은 서방 세계의 주요 사망원인 중 하나이며, 폐, 유방, 전립성 및 대장 암이 가장 흔하다(Butterfield, 2015, BMJ, 350:h988). 수술, 화학요법, 방사선요법 및 소분자 신호 전달 경로 억제제를 이용한 치료를 포함한 암 치료에 대한 몇몇 임상 접근이 가능하다. 이들 표준 접근 각각은 종양 내 종양 항원의 발현을 증가시키거나 사멸하는 종양 세포로부터의 항원 방출을 유발하여 의하여 또는 치료적 이익을 위해 항종양 면역을 촉진하는 것에 의하여 항종양 면역을 조절하는 것으로 나타나왔다. 면역요법은 암 치료를 위한 대체적 방법을 제시하는 유망한 분야이다. 암 백신은 종양 특이적 면역 반응, 구체적으로 종양 항원에 특이적인 세포독성 CD8+ T 세포를 촉진하도록 디자인된다. 암 백신이 기존 암 치료에 대한 유효한 대안 또는 보완물이 되기 위해서는 임상적 효능이 증진되어야 한다. 지금까지 임상적으로 유효한 암 백신을 위한 핵심적인 요건을 보다 잘 이해하기 위해 상당한 노력이 수행되어왔다. 최근 데이터는 무엇보다도 (1) 다중-에피토프 면역원의 사용, 가능하다면 다른 종양 항원 유래인; (2) 유효한 애주번트의 선택; (3) 종양 미세환경에 존재하는 제어 환경에 대응할 수 있는 인자와 암 백신과의 결합; 및 (4) 다른 항원 제형들을 대비하는 정확한 사전 테스트 후 백신의 결정적인 제형 및 요법을 선택할 필요가 중요한 요건이라고 강조한다(Fenoglio et al., 2013, Hum Vaccin Immunother, (12):2543-7). 이러한 요건을 다루기 위하여 면역학적 및 임상적 효능 모두를 제공하는, 암 백신의 새로운 세대가 필요하다.
수년간 잠재적 핵산 기반 백신이 연구되어왔다(Vogel and Sarver N, 1995, Clin Microbiol Rev., 8(3):406-10). 바이러스 타깃, 예컨대 광견병 바이러스에 대한 mRNA 기반 백신의 임상적 시도를 포함하는 DNA 기반 백신 또는 mRNA 기반 백신을 이용한 임상적 시도가 현재 수행되고 있다(예컨대 world wide web at clinicaltrials.gov; Alberer et al., The Lancet, published online July 2017, world wide web at dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31665-3; DeFrancesco et al., Nature Biotechnology, 35: 193-197 참조).
mRNA 기반 백신의 다음 세대는 자가 복제 RNA(repRNA)를 이용하며, 이는 알파바이러스와 같은 포지티브 센스 RNA 바이러스의 자가 복제 기전에 기반한다(예컨대, Bogers et al., 2015, J Infect Dis., 211(6):947-55 참조). 이러한 repRNA는 숙주 내 광역의 조직에서 일시적, 높은 수준의 항원 발현을 유도하며, 분열 및 비분열 세포 모두에 작용할 수 있다.
알파바이러스는 토가바이러스(Togaviridae)과에 속하며, 두 개의 기능 세그먼트와 이들 각각의 프로모터를 포함하는 선형, 단일 가닥, 포지티브 센스 RNA 게놈을 가진다. 게놈의 5' 말단에 위치한 제1 세그먼트는 네거티브 가닥 RNA 게놈, 포지티브 가닥 RNA 게놈 및 서브게놈 RNA를 합성하는 자가 조립 레플리카제(self-assembling replicase)를 이루는 비구조 단백질을 인코딩한다. 제2 세그먼트는 구조적 외피 및 캡시드 단백질을 인코딩한다. 알파바이러스 레플리콘으로도 지칭되는, 자가 복제 RNAs(repRNAs)는 구조 단백질을 인코딩하는 유전자가 제거되어 레플리콘이 세포 내에서 복제될 수 있으나 바이러스로서 증식할 수 없는 전체 길이 바이러스로부터 유래된 핵산이다. repRNA 기반 항원 발현 시스템의 경우, 항원을 인코딩하는 유전자는 구조 단백질을 인코딩하는 유전자 대신 서브게놈 프로모터의 하류부에 삽입될 수 있다. RepRNAs는 이로부터 repRNA가 개시되고, 바이러스 레플리콘 입자(VRP) 내에 패키징되는 DNA 분자로서, 또는 외피비보유(naked) 변형 또는 비변형 RNA 분자로서 세포로 전달될 수 있다.
repRNA 기반 백신에 대한 연구는 여전히 전-임상 단계에 있지만, 수년 내에 임상 시험이 시작될 것으로 예상된다. 연구들은 이종성 프라임-부스트 백신접종에서 DNA로부터 개시되거나 바이러스 레플리콘 입자(VRP) 내에 패키징된 repRNA의 아데노바이러스 벡터와의 조합이 면역 반응을 촉진시키는 것을 보여왔다(예컨대, WO2005046621; Zhao et al., 2009, Vet Immunol Immunopathol., 131:158-166; 및 N
Figure pct00001
slund et al., 2007, J Immunol, 178:6761-6769 참조). 더욱이, repRNA 기반 백신에 의해 유도된 체액 반응이 단백질 기반 백신으로 부스팅될 수 있음이 나타나왔다(Bogers et al., Id.).
그러나, 아데노바이러스 벡터를 repRNA가 개시된 DNA 플라스미드와 조합하여 사용하는 이종성 백신접종은 여러 저항을 갖는다. 예를 들어, DNA 플라스미드는 박테리아 생산물에 의한 오염, 숙주 게놈 내로 NDA 삽입 위험, 및 항원의 자기-제한 발현의 부재와 같은 안전성 문제를 수반한다. 한편, 아데노바이러스 벡터를 VRP로부터 개시된 repRNA와 조합하여 사용하는 이종성 백신접종은 세포주를 패키징하여 VRP를 생산하게 할 필요가 있으며, 이는 복잡한 제조 문제를 갖는 비용이 들고 시간 시간소모가 큰 공정이다. 단백질 기반 백신을 repRNA와 조합하여 사용하는 것은 단백질 기반 백신이 비용이 들고 시간 소모를 요구하는 오염 위험을 갖는 세포 기반 단백질 생산을 필요로 한다는 한계를 갖는다. 덧붙여, 대부분의 단백질 기반 백신은 안정성 문제로 어려움을 겪으며 저온 유통을 필요로 하며, 그리고 일반적으로, 단백질 기반 백신은 체액 면역 반응의 촉진에 한정된다.
따라서, 기술 분야에서 특히, 유행성 전염병 발생의 경우에 필요한 신속한 반응이 필요할 때 면역원에 대하여 보호 체액 및 세포 면역성의 유도에 사용할 수 있는 repRNA 기술에 기반한 증진된 백신에 대한 필요가 존재한다. 이러한 백신은 생산에 비용 효율적이고 최소한의 부정적 영향을 가질 것이다. 또한 이는 항원의 폭넓은 다양성에 대해 보다 바람직하게 효과적일 것이다.
발명의 간략한 요약
본 발명은 두개의 다른 백신 플랫폼 (i) 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 mRNA(repRNA), 및 (ii) 아데노바이러스 기반 백신을 사용하는 이종성 프라임-부스트 면역접종 요법을 제공함으로써 이러한 요구를 만족시킨다.
몇몇은 앞서 논의된, DNA 기반 백신, VRP 패키징 백신, 및 단백질 기반 백신 사용에 수반되는 문제들은 신속하고 고유하며 세포-없는 생산 공정에 의해 생산되는 DNA-없는 생산물인 repRNA의 시험관 내 생산을 사용하는 것에 의해 회피할 수 있음이 발견되었다(Kallen and Thess, 2014, Ther Adv Vaccines, 2(1) 10-31). 본 발명자들은 이종성 프라임-부스트 면역 요법에서 IVT repRNA를 아데노바이러스 벡터를 조합하는 것이 아데노바이러스 벡터나 IVT repRNA로 단일 또는 동종성 프라임 부스트 면역접종한 결과에 비해 강한 유도된 체액 및 세포 면역 반응을 야기하는 것을 예상치 못하게 발견하였다. 따라서 본 발명은 광역 타깃에 대한 고도로 강력한 백신을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
일반적인 양태에서, 본 발명은 IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 조합을 포함하는 이종성 프라임-부스트 면역접종을 투여하는 것에 의해 인간 대상체 내에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한다.
본 발명의 소정 구현예에서, IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 이종성 프라임-부스트 조합은 인간 대상체 내에서 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드에 유도된 면역 반응을 생성한다. 상기 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 임의의 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 병원체, 예컨대 바이러스, 박테리아, 균류, 원생동물, 또는 암, 예컨대 종양으로부터 유래할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일반적인 일 양태는 면역반응을 이를 필요로 하는 인간 대상체 내에서 유도하는 방법에 관하며, 상기 방법은:
a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이며,
이에 따라 인간 대상체 내에서 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가진다.
본 발명의 일반적인 다른 양태는 인간 대상체 내의 면역 반응을 유도하기 위한 조합물에 관하며, 상기 조합물은:
a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IVT repRNA의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제1 조성물, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제2 조성물을 포함하고,
상기 조성물 중 하나는 면역 반응을 프라이밍 하기 위해 인간 대상체에 투여되고 나머지 조성물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 인간 대상체에 투여되며,
상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가진다.
본 발명의 일반적인 다른 양태는 본 발명 구현예에 따른 인간 대상체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 조합물의 용도에 관한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA을 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 유도된 체액, 또는 항체, 면역 반응을 포함한다. 이러한 반응은, 예컨대, 높은 비율, 예컨대 효소-결합 면역흡착(enzyme-linked immunosorbent, ELISA) 검정에 의해 판별된 테스트된 대상체의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%를 초과하거나 100%의 반응자가 존재하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 유도된 세포 면역 반응을 포함한다.
본 발명 일 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성되는 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함한다. 이러한 반응은, 예컨대, 높은 비율, 예컨대 효소-결합 면역점(enzyme-linked immunospot, ELISPOT) 또는 세포내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining, ICS) 검정에 의해 판별된 테스트된 대상체의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%를 초과하거나 100%의 CD8+ 반응자가 존재하는 것을 특징으로 한다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성되는 증진된 CD8+ T 세포 반응은 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 특이적인 다기능성 CD8+ T 세포의 증가 또는 유도를 포함한다. 이러한 다기능성 CD8+ T 세포는 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 IFN-감마, IL-2 및 TNF-알파 중 2 이상을 발현한다.
본 발명 일 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성되는 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함한다. 이러한 반응은, 예컨대, 높은 비율, 예컨대 ELISPOT 또는 ICS 검정에 의해 판별된 테스트된 대상체의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%를 초과하거나 100%의 CD4+ 반응자가 존재하는 것을 특징으로 한다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성되는 증진된 CD4+ T 세포 반응은 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 특이적인 다기능성 CD4+ T 세포의 증가 또는 유도를 포함한다. 이러한 다기능성 CD4+ T 세포는 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 IFN-감마, IL-2 및 TNF-알파 중 2 이상을 발현한다.
본 발명 바람직한 구현예에서, 상기 유도된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 유도된 항체 반응, 유도된 CD4+ T 세포 반응, 및 유도된 CD8+ T 세포 반응을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA는 베네주엘라 이콰인 뇌염(Venezuelan equine encephalitis, VEE) 바이러스 기반 repRNA이다. 바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA 백본은 문헌 Frolov et al. (1999, J Virol., 73(5):3854-65)에 기술된 것 중 하나이다. 바람직한 구현예에서, 상기 repRNA 백본은 RSV pre-F 단백질 삽입체가 없는 서열번호 3의 백본 서열이다.
바람직한 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26(Ad26) 벡터 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 35 (Ad35) 벡터이다.
본 발명 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1-52 주 후에 투여된다. 본 발명 일 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 2-52 주 후에 투여된다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 4-52 주 후에 투여된다. 본 발명 일 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1 주 후에 투여된다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 2 주 후에 투여된다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 4 주 후에 투여된다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 8 주 후에 투여된다. 본 발명 또다른 구현예에서, 본 발명 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 6, 10, 12, 14, 16, 20, 24 주 이상 후에 투여된다.
본 발명 구현예에서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 병원체, 예컨대 바이러스, 박테리아, 균류, 또는 원생동물로부터 유래할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 바이러스 유래일 수 있다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 항원성 단백질은 암 유래일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 종양으로부터 유래할 수 있다.
본 발명 구현예에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일한 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩한다. 본 발명 다른 구현예에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일 항원성 단백질의 상이한 면역원적 폴리펩티드 또는 에피토프를 인코드한다. 본 발명 또 다른 구현예에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상이한, 그러나 연관된, 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩한다. 예를 들어, 상기 연관된 항원성 단백질은 동일 항원성 단백질에서 유래한 실질적으로 유사한 단백질, 또는 동일 병원체 또는 종양에서 유래한 상이한 항원성 단백질일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일하다.
본 발명 구현예에서, 본 발명의 방법은 인간 대상체에 항원성 단백질, 예컨대 종양 또는 감염성 질환에 수반되는 질병에 대한 보호 면역성을 제공한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 프라임-부스트 조합은 인간 대상체 내에서 종양에 대한 보호 면역 반응을 유도한다. 바람직한 다른 구현예에서, 상기 IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 프라임-부스트 조합은 인간 대상체 내에서 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도한다.
바람직한 구현예에서, 제1 또는 제2 항원성 단백질은 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus)로부터의 전-융합(pre-fusion) F 단백질(RSV-preF) 로부터 유래되고, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일하다.
바람직한 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 각각 독립적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 그 면역원적 폴리펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA는 RSV-preF 단백질로부터 유래한 항원성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 바람직하게, 상기 IVT repRNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 그 면역원적 폴리펩티드 또는 항원결정인자의 아미노산 서열을 가지는 항원성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
전술한 요지뿐만 아니라 뒤따르는 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 해석하는 경우 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타난 엄밀한 구현예에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에서:
도 1은 RSV-preF 단백질을 인코딩하는 VEE 바이러스 기반 repRNA의 도식적인 표시를 나타낸다;
도 2는 ELISA로 분석 수행된 동종성 IVT repRNA 면역접종의 실험 설계를 나타낸다;
도 3은 ELISA로 평가된 동종성 IVT repRNA 면역접종 연구로부터의 RSV-preF 단백질 특이적 체액 면역 반응을 나타낸다;
도 4는 ELISPOT으로 분석 수행된 동종성 IVT repRNA 면역접종의 실험 설계를 나타낸다;
도 5는 PBMC 및 RSV-F로부터의 CTL-활성화 펩티드 KYKNAVTEL을 사용한 IFN-γ ELISPOT 검정으로 평가된, 동종성 IVT repRNA 면역접종 연구로부터의 RSV-preF 단백질 특이적 T 세포 반응을 나타낸다;
도 6은 ELISA 및 ELISPOT으로 분석 수행된 이종성 IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터 면역접종 연구의 실험 설계를 나타낸다;
도 7은 ELISA로 평가된 이종성 IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터 면역접종 연구로부터의 RSV-preF 단백질 특이적 체액 면역 반응을 나타낸다;
도 8은 비장세포를 사용한 IFN-γ ELISPOT 검정으로 평가된, 이종성 IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터 면역접종 연구로부터의 RSV-preF 단백질 특이적 T 세포 반응을 나타낸다.
다양한 공보, 기사 및 특허가 배경 및 명세서에 걸쳐 인용되거나 기재된다; 이들 참고문헌은 각각 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 물질, 장치, 제품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 대상의 임의의 것이나 전부가 개시되거나 청구되는 임의의 발명에 대해 선행 발명의 일부를 형성한다는 인정이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다르게는, 본 명세서에서 사용되는 소정 용어는 명세서에 나타낸 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용되는 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 공보는 본 명세서에 전체를 나타낸 것과 마찬가지로 참조로 포함된다. 본 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 단수 형태의 관사는 문맥 상 명확히 달리 지정되지 않는 한 복수의 참조를 포함함이 주지되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 일련의 요소들의 앞에 오는 용어 "적어도(at least)"는 시리즈의 매 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자는 더 이상의 통상적 실험을 하지 않고도 여기에서 기술된 본 발명의 구체예에 대한 많은 균등물들을 인지하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이와 같은 균등물들은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 이하의 청구항 전반에서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)" 라는 단어 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "포함하는(containing)" 또는 "포함하는(including)" 또는 때로는 용어 "갖는"과 함께 사용될 때 대체될 수 있다. 본 명세서에서 "~로 이루어진다(consisting　of)"를 사용할 때 청구항 구성요소에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에 사용될 때, "본질적으로 이루어진(consisting　essentially of)"는 청구항의 기본 및 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다.
본 발명의 양상 또는 실시 예의 맥락에서 사용될 때마다, "포함하는(comprising)", "포함하는(containing)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"의 전술한 용어 중 어느 것을 본 발명의 양태 또는 실시 형태의 내용에 사용할 경우 개시의 범위를 변경하기 위하여 "구성되는(consisting　of)" 또는 "본질적으로 이루어진(consisting　essentially of)"의 용어로 대체할 수 있다. 각 경우에서 "포함하는", "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)" 및 "이루어진(consisting of)" 중 어느 용어는 다른 두 용어로 대체될 수도 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 복수의 요소들 간의 연결 용어 "및/또는"은 개별 옵션 및 결합된 옵션 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소가 없는 첫 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 이들 옵션들 중 임의의 하나는 의미 내에 포함되는 것으로 이해되고, 따라서 본 명세서에서 사용된 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시킨다. 하나 이상의 옵션에 대한 동시 적용 가능성은 또한 그 의미 내에 해당되므로 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시킨다.
본 명세서에 사용되는 "대상체"는 그에 대해 본 발명의 구현예에 따른 벡터, 조성물 또는 백신 조합물이 투여될 것이거나 투여된 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포유류"는 임의의 포유류를 포괄한다. 포유류의 예는 비제한적으로 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아피그, 원숭이, 인간 등, 보다 바람직하게는 인간을 포함한다.
보호 면역성은 선천 및 적응 면역 반응 둘 다에 의존한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “면역 반응”은 본 발명의 방법에 의해 대상체에 투여된 항원에 대한 대상체 내의 체액 및/또는 세포 면역학적 반응의 전개를 지칭한다. “체액” 면역 반응은 B 세포에 의한 항체 생산을 지칭하고, “세포” 면역 반응은 CD8+ 이펙터 T 세포 및 헬퍼 T 세포로도 알려진 CD4+ T 세포의 세포독성 활성을 지칭한다. CD4+ T 세포는 체액 및 세포 면역 반응 둘 다에 핵심적 역할을 수행한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유도” 또는 “자극” 및 그 활용형은 세포 활성의 임의의 측정 가능한 증가를 지칭한다. 면역 반응의 유도는 예컨대, 면역 세포 개체군의 활성화, 증식 또는 성숙, 사이토카인 생산의 증가 및/또는 면역 기능 증가의 다른 지표를 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 면역 반응의 유도는 B 세포 증식의 증가, 항원 특이적 항체의 생산, 항원 특이적 T 세포 증식의 증가, 수지상 세포 항원 제시의 개선 및/또는 소정 사이토카인, 케모카인 및 공-자극 마커의 발현 증가를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유도된 항원 반응” 또는 “유도된 체액 면역 반응”은 동일 프라임-부스트 요법을 사용한, repRNA 또는 아데노바이러스 벡터 만을 대비 가능한 용량으로 동종성 프라임-부스트 면역접종으로 투여받은 인간 대상체에서 관찰되는 대응되는 면역 반응에 비하여 적어도 1.5, 2, 2.5 이상의 배수로 증가된, 본 발명에 따른 repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 프라임-부스트 조합을 투여받은 인간 대상체 내에서의 항체 반응을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유도된 세포 면역 반응”은 동일 프라임-부스트 요법을 사용한, repRNA 또는 아데노바이러스 벡터 만을 대비 가능한 용량으로 동종성 프라임-부스트 면역접종으로 투여받은 인간 대상체에서 관찰되는 대응되는 면역 반응에 비하여 적어도 1.5, 2, 2.5 이상의 배수로 증가된, 본 발명에 따른 repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 프라임-부스트 조합을 투여받은 인간 대상체 내에서의 세포 면역 반응을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “보호 면역성” 또는 “보호 면역 반응”은 백신접종된 대상이 백신접종이 수행된 병원체의 감염 또는 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드에 연관된 질병을 제어할 수 있음을 의미한다. 보통, "보호 면역 반응"이 발생한 대상은 경도 또는 중도 임상 증상만 발생하거나 증상이 전혀 발생하지 않는다. 보통, 소정 병원체에 대해 보호 면역 반응 또는 보호 면역성을 갖는 대상은 상기 병원체의 감염 또는 항원성 단백질에 연관된 질병의 결과 사망하지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “면역학적 유효량”은 대상체 내에서 요망되는 생물학적 또는 의약적 반응을 이끌어내는 활성 성분 또는 구성요소의 함량을 지칭한다. 면역학적 유효량은 언급된 목적과 관련되어, 경험적으로, 그리고 일상적 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 검정은 최적 용량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 도입될 수 있다. 구체적 유효 용량의 선택은 당업자에 의해 여러 인자, 치료 또는 예방될 질병, 수반되는 증상, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자에 알려진 다른 인자의 고려를 기초로 결정될 수 있다(예컨대, 임상 시험을 통해). 제형에 도입될 정밀한 용량은 또한 일상적 투여 및 질병의 심각도에 의존할 것이며, 실무자의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “시험관 내 전사된(in vitro transcribed)”은 RNA가 시험관 내에서 세포-없는 방식으로, 예컨대, 세포 추출물 또는 분리된 효소를 사용하여 효소적으로 합성되는 방법을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “자가 복제 RNA(self-replicating RNA)”, “자가 복제 레플리콘 RNA(self-replicating replicon RNA)” 또는 “repRNA” 또는 “RNA 레플리콘”은 알파바이러스 비구조 단백질 유전자를 발현하여 자손 바이러스(progeny virus) 생산 없이, 세포 내에서 스스로의 복제 증폭을 지시할 수 있는 RNA 분자를 지칭한다. 예를 들어 repRNA는 5' 및 3' 알파바이러스 복제 인식 서열, 알파바이러스 비구조 단백질의 코딩 서열, 항원 및 항원 발현 수단을 인코딩하는 이종성 유전자, 및 폴리아데닐레이션 트랙트(tract)를 포함할 수 있다. 본 발명의 repRNA은 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 약독화 돌연변이 또는 기능성을 증진하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 repRNA는 변형된 핵염기, 예컨대 관련되는 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는 US2011/0300205에 기술된 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 repRNA는, 비제한적으로, m1G(1-메틸구아노신; 1-methylguanosine), m2G(N2-메틸구아노신; N2-methylguanosine), m7G(7-메틸구아노신; 7-methylguanosine), Gm(2'-O-메틸구아노신; 2'-O-methylguanosine), m22G(N2,N2-디메틸구아노신; N2,N2-dimethylguanosine), m2Gm(N2,2'-O-디메틸구아노신; N2,2'-O-dimethylguanosine), 및 m22Gm(N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신; N2,N2,2'-O-trimethylguanosine)을 포함하는 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “항원성 단백질”은 척추동물에서 면역 반응을 자극할 수 있는 단백질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “그 면역원적 폴리펩티드" 또는 “그 면역원적 단편”은 면역 반응 자극능을 보유한 항원성 단백질의 단편을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “항원결정인자(antigenic determinant)” 또는 “에피토프”는 항체와 특이적으로 반응하는 항원성 단백질의 영역을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “담체”는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 소포, 마이크로스피어, 리포좀 캡슐화를 포함하는 지질, 또는 약학적 제형에 사용되는 것으로 기술 분야에 잘 알려진 다른 물질들을 지칭할 수 있다. 상기 담체, 부형제 또는 희석제의 특징은 구체적 적용을 위한 투여 경로에 의존할 것이라는 점이 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “약학적 허용염”은 본 발명에 따른 조성물의 유효성 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 간섭하지 않는 비독성 물질을 지칭한다. 구체적 구현예에 따르면, 본 명세서의 개시의 관점에서, IVT repRNA 기반 또는 아데노바이러스 벡터 기반 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 약학적 허용염을 본 발명에 사용할 수 있다. 적합한 부형제는 비제한적으로 멸균수, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합, 뿐만 아니라 안정화제, 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 적합한 단백질 및 환원당을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이밍 조성물”, “프라이밍 면역접종” 또는 “프라임 면역접종”은 본 발명의 제1 조성물을 사용한 1차 항원 자극을 지칭한다. 특히, 본 명세서에서 사용되는, 용어 면역 반응을 “프라이밍” 또는 “강화”하는 것은 요망되는 항원에 대한 면역 반응을 유도하고 뒤따르는 동일 항원의 재면역접종에 따라 요망되는 항원에 대한 높은 수준의 면역 반응을 회상(recall)하는 항원을 사용한 제1 면역접종을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “부스팅 조성물”, “부스팅 면역접종” 또는 “부스트 면역접종”은 1차 면역접종 후에 포유류에 투여 또는 유효한 추가적인 면역접종을 지칭한다. 특히, 용어 면역 반응을 “부스팅”하는 것은 1차 면역접종에서 인코딩되는 것과 동일한 항원을 전달하는 조성물의 투여를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “병원체”는 감염성 인자, 예컨대 그 숙주 내에서 질병을 야기하는 바이러스, 박테리아, 균류, 기생생물, 또는 프리온을 지칭한다.
항원 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 “동일” 또는 퍼센트 “동일성”은 기준 폴리펩티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항원 폴리펩티드를 지칭한다. 핵산 서열과 관련하여 용어 “실질적으로 동일”은 기준 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가적인 표지는 제1 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성인 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 통상적으로 실질적으로 제2 폴리펩티드와 동일하고 여기서 예컨대 두 펩티드가 오로지 보존적 치환에 의해서만 상이하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표지는 두 분자가 엄격 조건 하에 서로 하이브리드하는 것이다.
본 발명에서 이종성 프라임-부스트 조합, 구체적으로, IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 조합이 인간 대상체 내에서 보호 면역을 생성하는 데에 놀랍도록 효과적이라는 것이 발견되었다.
항원성 단백질
임의의 관심 DNA는 본 명세서에서 기술되는 repRNA 작제물 및 아데노바이러스 벡터 내로 삽입되어 이종적으로 repRNA 및 벡터로부터 발현될 수 있다. 발현 가능한 형태로 바이러스 게놈 내로 삽입되기 위한 외래 유전자는 본 발명 개시의 관점에서 요망되는 유전자를 분리하는 통상적인 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. DNA 게놈을 포함하는 유기체를 위해, 관심 항원을 인코딩하는 유전자는 게놈 DNA로부터 분리될 수 있고; RNA 게놈을 갖는 유기체를 위해, 관심 유전자는 게놈의 cDNA 카피로부터 분리될 수 있다. 항원성 단백질은 또한, 예컨대 항원성 반응, 유전자 발현 등을 최적화하기 위해, 자연적으로 발생하는 서열에 기반하여 변경된 재조합 DNA에 의해 인코딩될 수 있다.
본 발명의 소정 구현예에서, repRNA 및 아데노바이러스 프라임-부스트 조합은 인간 대상체 내에서 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드에 대한 유도된 면역 반응을 생성한다. 상기 항원성 단백질은 감염 또는 질병에 연관된 임의의 항원성 단백질일 수 있다.
본 발명 구현예에 따르면, 상기 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 병원체, 예컨대 바이러스(예컨대, 필로바이러스(filovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아르보바이러스(arbovirus), 아스트로바이러스(astrovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 콕사키 바이러스(coxsackie virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 간염 바이러스(hepatitis virus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 인간파필로마 바이러스(human papilloma virus), 인간T림포트로픽 바이러스(human T-lymphotropic virus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), JC 바이러스(JC virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 홍역 바이러스(measles virus), 몰루스쿰 콘타기오숨 바이러스(molluscum contagiosum virus), 이하선염 바이러스(mumps virus), 노로바이러스(norovirus), 파로파이러스(parovirus), 폴리오바이러스(poliovirus), 광견병 바이러스(rabies virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 리노바이러스(rhinovirus), 로타바이러스(rotavirus), 로타바이러스(rotavirus), 루벨라 바이러스(rubella virus), 천연두 바이러스(smallpox virus), 수두 대상 포진 바이러스(varicella zoster virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 지카 바이러스(Zika virus) 등), 박테리아(예컨대, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 대장균(Escherichia coli), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitides), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 연쇄상구균(Streptococcus) 등), 균류(예컨대, 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 칸디다(Candida) 종, 아스퍼질러스(Aspergillus) 종 등), 원생동물(예컨대, 말라리아원충(Plasmodium), 리슈마니아(Leishmania), 트리파노소마(Trypanosome), 크립토스포리듐 속(cryptosporidiums), 아이소스포라(isospora), 파울러자유아메바(Naegleria fowleri), 가시아메바(Acanthamoeba), 발라무티아 만드릴라리스(Balamuthia mandrillaris), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 폐포자충(Pneumocystis carinii) 등) 또는 암(예컨대, 방광염, 유방암, 결장 및 직장암, 자궁내막암, 신장암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 비호즈킨성림프종, 췌장암, 전립선암, 감상선암 등)으로부터 분리되거나 유래될 수 있다.
본 발명 구현예에 따르면, 상기 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 종양, 예컨대 암으로부터 분리 또는 유래될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 핵산은 전체 항원성 단백질 보다는 항원성 도메인을 발현한다. 이들 단편은 면역원적 또는 항원성이기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 단편은 적어도 4개 아미노산 길이, 바람직하게 8-20 아미노산, 그러나, 예컨대 100, 200, 660, 800, 1000, 1200, 1600, 2000 개 아미노산 길이 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 길이와 같이 더 길 수 있다.
당업자는 항원성 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 변형될 수 있음을, 예컨대 본 명세서에서 제시된 핵산 분자가 변형된 발현된 단백질이 병원체 또는 질병에 대한 면역 반응을 도출하는 한 돌연변이될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 “항원성 단백질”은 상술한 병원체 또는 종양의 적어도 하나의 항원결정인자를 포함하는 단백질을 지칭한다. 용어 항원성 단백질은 또한 유사한 항원성 단백질을 포괄한다.
IVT repRNA
본 발명에서 유용한 repRNA는 단일 가닥 포지티브 센스 RNA 바이러스인 알파바이러스로부터 유래된다. 일 구현예에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 repRNA는 7-메틸구아노신 캡(7-methylguanosine cap), 5' UTR, RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 폴리단백질 P1234(polyprotein P1234) (즉, 비구조 단백질, nsPs), 서브게놈 프로모터 요소(subgenomic promoter element), 항원성 단백질이 발현되는 관심 가변 영역, 3' UTR, 및 폴리(A) 테일을 포함한다.
본 발명에서 유용한 repRNA는 임의의 자가 복제 포지티브 가닥 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 repRNA는 토가바이러스(Togaviridae)과 또는 아테리비리데(Arteriviridae)과, 예컨대 아우라 바이러스(Aura virus), 바반키 바이러스(Babanki virus), 바마포레스트 바이러스(Barmah Forest virus), 베바루 바이러스(Bebaru virus), 부기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern Equine Encephalitis virus), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus), 포트모건 바이러스(Fort Morgan virus), 게타 바이러스(Getah virus), 하일랜드 J 바이러스(Highlands J virus), 키질라크 바이러스(Kyzylagach virus), 마야로 바이러스(Mayaro virus), 미들버그 바이러스(Middleburg virus), 무캄보 바이러스(Mucambo virus), 두무 바이러스(Ndumu virus), 오니옹니옹 바이러스(O'nyong-nyong virus), 피슈나 바이러스(Pixuna virus), 로스리버 바이러스(Ross River virus), S.A. AR86, 사기야마 바이러스(Sagiyama virus), 셈리키포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 우나 바이러스(Una virus), 베네주엘란 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan Equine Encephalitis virus), 웨스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Western Equine Encephalitis virus), 와타로아 바이러스(Whataroa virus), 아프리카 주머니쥐 아테리바이러스(African pouched rat arterivirus), 데브라자 원숭이 아테리바이러스(DeBrazza's monkey arterivirus), 이콰인 아테리티스 바이러스(Equine arteritis virus), 키발레 레드 콜로버스 바이러스(Kibale red colobus virus), 키발레 붉은 긴꼬리원숭이 바이러스( Kibale red-tailed guenon virus), 젖산염 탈수소 효소 향상 바이러스(Lactate dehydrogenase-elevating virus), 미쿠미 노란개코원숭이 바이러스 1(Mikumi yellow baboon virus 1), 페브자 바이러스(Pebjah virus), 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 바람직한 repRNA 백본의 예시는 Frolov et al., Id. 에 기술된 것과 RSV pre-F 단백질 삽입체가 없는 서열번호 3의 백본 서열을 포함한다.
시험관 내 전사된(IVT) RNA의 제조는 기술 분야에 주지이며, 표준 IVT 및 정제 방법은 본 명세서 개시의 관점에서 본 발명에서 유용한 IVT repRNA를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
IVT repRNA의 제조는 예컨대 관련되는 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는 US2011/0300205 및 US2013/0195968에 기술된다. 예를 들어, repRNA 분자는 예컨대 R7 파지 RNA 폴리머라제, SP6 파지 RNA 폴리머라제, T3 파지 RNA 폴리머라제 등과 같은 적합한 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 사용하여 자가 복제 RNA 분자를 인코딩하는 DNA의 IVT에 의해 제조될 수 있다. IVT는 박테리아 유래 플라스미드 내에서 형성 및 증식되거나, 예컨대 유전자 합성 및/또는 PCR 기반 방법에 의해 합성적으로 형성된 cDNA 주형을 사용할 수 있다. 필요에 따라 적절한 캡핑 부가 반응이 사용될 수 있으며, 폴리-A는 DNA 주형 내에 인코딩되거나 폴리-A 반응에 의해 부가될 수 있다. 본 발명의 IVT repRNA 분자를 생산하기 위해 적합한 합성 방법 단독 또는 하나 이상의 다른 방법(예컨대, 재조합 DNA 또는 RNA 기술)과의 조합으로 사용될 수 있다. 드노보(de novo) 합성을 위한 적합한 방법은 기술분야에 주지이며 특정 적용을 위해 개조될 수 있다.
통상적으로, 본 발명에서 유용한 IVT repRNA는 repRNA가 이로부터 전사될 수 있는 DNA 분자를 사용하여 생산된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 repRNA를 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 본 발명의 핵산 분자는 RNA의 형태 또는 클로닝에 의해 얻어지거나 또는 합성적으로 생산된 DNA의 형태일 수 있다. 상기 DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다.
본 발명에서 유용한 IVT repRNA은 투여를 위한 적합한 전달 시스템 내에 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 유용한 IVT repRNA는 투여를 위해 비-비리온(non-virion) 입자 내로 제형화된다. 적합한 비-비리온 입자는 예컨대 관련되는 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는 US2011/0300205 및 US2013/0195968에 기술된다. 예를 들어, 유용한 전달 시스템은 리포좀, 폴리머 입자, 비-도성 및 생분해성 마이크로입자, 전기천공법, 외피비보유(naked) RNA의 주입(injection), 및 양이온성 서브마이크론 수중유 에멀전(cationic submicron oil-in-water emulsion)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 유용한 IVT repRNA는 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP) 조성물 내에 제형화된다(예컨대, 본 명세서에 관련되는 내용이 참조로서 통합되는 Semple et al., 2010, Nat Biotechnol. 28(2):172-176 참조)
본 명세서에서 사용되는 용어 “지질 나노입자(lipid nanoparticle)” 또는 “LNP”는 수성 용적이 양친매성 지질 이중층으로 캡슐화되거나, 지질이 치료 산물을 포함하는 내부를 코팅하는, 리포좀(liposome) 또는 소포(vesicle), 또는 지질-캡슐화된 치료 산물이 상대적으로 무질서한 지질 혼합물 내에 포함된 지질 응집체(lipid aggregate) 또는 마이셀(micelle)을 비제한적으로 포함하는, 치료 산물을 전달하기 위해 사용될 수 있는 임의의 지질 조성물을 지칭한다.
소정 구현예에서, LNP는 캡슐화하거나/하고 IVT repRNA의 타깃 세포 내로의 전달을 향상시키기 위하여 양이온성 지질을 포함한다. 상기 양이온성 지질은 선택된 pH, 예컨대 생리학적 pH에서 순 양전하를 가지는 임의의 지질 종일 수 있다. 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 PEG-변형 지질을 이용한 가변비의 다중-성분 지질 혼합물을 포함하여 제조될 수 있다. 몇몇 양이온성 지질이 문헌에 기술되어왔고, 그들 중 다수가 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되기에 적합한 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP)을 포함한다.
LNP 제형은 음이온성 지질을 포함할 수 있다. 상기 음이온성 지질은 선택된 pH, 예컨대 생리학적 pH에서 순 음전하를 가지는 임의의 지질 종일 수 있다. 상기 음이온성 지질은, 양이온성 지질과 조합될 때, LNP의 전체 표면 전하를 감소시키고 LNP 이중층 구조의 pH 의존성 붕괴를 도입하여 뉴클레오티드 방출을 촉진하기 위해 사용된다. 몇몇 음이온성 지질이 문헌에 기술되어왔고, 그들 중 다수가 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되기에 적합한 음이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에타놀아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)을 포함한다.
LNP는 본 명세서의 개시의 관점에서 기술분야에 주지의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 LNP는 에탄올 주입 또는 희석, 박막 수화(thin film hydration), 동결-융해(freeze-thaw), 프렌치 프레스(French press) 또는 멤브레인 압출(membrane extrusion), 정용여과(diafiltration), 초음파 처리, 세척제 투석법(detergent dialysis), 에테르 인퓨전(ether infusion), 및 역상 증발법(reverse phase evaporation)을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 유용한 LNP는 에탄올 희석에 의해 제조된다.
아데노바이러스
본 발명에 따른 아데노바이러스는 아데노바이러스(Adenoviridae)과에 속하며 바람직하게 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus)속에 속하는 것이다. 인간 아데노바이러스일 수 있으나, 비제한적으로 소 아데노바이러스(예를 들어, 소 아데노바이러스 3, BAdV3) 개 아데노바이러스(예를 들어, CAdV2), 돼지 아데노바이러스 (예를 들어, PAdV3 또는 5), 또는 유인원 아데노바이러스(이는 원숭이 아데노바이러스 및 영장류 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 아데노바이러스 또는 고릴라 아데노바이러스를 포함함)를 포함하는 다른 종들을 감염시키는 아데노바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스(HAdV, 또는 AdHu; 본 발명에서, 인간 아데노바이러스는 종의 표시 없이 Ad로 지칭되는 경우를 의미하고, 예를 들어, "Ad5"라는 간결한 표기는 인간 아데노바이러스 혈청형 5인 HAdV5와 동일한 것을 의미함) 또는 유인원 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스(ChAd, AdCh, 또는 SAdV)이다. 본 발명에서, 인간 아데노바이러스는 종의 표시 없이 Ad로 지칭되는 경우를 의미하고, 예를 들어, "Ad26"라는 간결한 표기는 인간 아데노바이러스 혈청형 26인 HAdV26와 동일한 것을 의미한다. 또한 본 명세서에서, 표기 “rAd”는 재조합 아데노바이러스를 의미하고, 예를 들어 “rAd26”은 재조합 인간 아데노바이러스 26을 지칭한다.
대부분의 진보된 연구들이 인간 아데노바이러스들을 이용함으로써 수행되었으며, 본 발명의 소정 양태들에 따르면 인간 아데노바이러스들이 바람직하다. 바람직한 소정 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스를 기반으로 한다. 바람직한 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 또는 50을 기반으로 한다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 아데노바이러스는 혈청형 26 및 35 중 하나의 인간 아데노바이러스이다.
이러한 혈청형들의 장점은 인간 집단에서 낮은 혈청 유병율 및/또는 낮은 기존 중화 항체 역가, 및 임상 실험에서 인간 대상체에서 대한 사용 경험이다.
유인원 아데노바이러스 또한 인간 집단에서 낮은 혈청 유병율 및/또는 낮은 기존 중화 항체 역가를 가지며, 침팬지 아데노바이러스 벡터를 사용한 상당한 양의 연구가 보고되어왔다(예컨대 US6083716; WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17; 또한 review by Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849- 62; 및 review by Lasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39 참조). 이로부터, 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 유인원 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 아데노바이러스에 기반한다. 소정 구현예에서, 상기 재조합 아데노바이러스는 유인원 아데노바이러스 타입 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 또는 SA7P에 기반한다.
아데노바이러스 벡터 rAd26 및 rAd35
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서 아데노바이러스 벡터는 두 가지 희귀 혈청형: Ad26 및 Ad35로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 전형적 구현예에서, 상기 벡터는 rAd26 또는 rAd35 바이러스이다.
따라서, 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터는 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질(예컨대, 섬유, 펜톤 또는 헥손 단백질)을 포함한다. 당업자는 전체 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질이 본 발명의 벡터에 사용된다는 것이 필요하지 않다는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 적어도 일부의 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질을 포함하는 키메릭 캡시드 단백질이 본 발명의 벡터에 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 또한, 적어도 하나의 캡시드 단백질이 Ad26 또는 Ad35로부터 유래 되는 한, 섬유, 펜톤 및 헥손 단백질이 각각 다른 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 섬유, 펜톤 및 헥손 단백질은 각각 Ad26으로부터 또는 각각 Ad35로부터 유래된다.
당업자는 다중 혈청형으로부터 유래된 요소들이 단일 재조합 아데노바이러스 벡터에서 결합될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 다른 혈청형으로부터 원하는 성질들을 결합한 키메릭 아데오바이러스가 생산될 수 있다. 그러므로, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 Ad26 및 Ad35 혈청형의 기존 면역의 부재를 온도 안정성, 조립, 정착(anchoring), 생산률, 전가된 또는 개선된 감염, 표적 세포에서의 DNA 안정성과 같은 특성과 결합시킬 수 있다.
소정 구현예에서, 본 발명에서 유용한 재조합 아데노바이러스 벡터는 Ad35 또는 Ad26으로부터 주로 또는 전체로서 유래된다 (즉, 벡터는 rAd35 또는 rAd26 이다). 몇몇 구현예에서, 아데노바이러스는 복제결함이고, 예를 들면, 이것은 게놈의 E1 영역에 결실을 함유하기 때문이다. 본 발명의 아데노바이러스의 경우, Ad26 또는 Ad35로부터 유래되므로, 아데노바이러스의 E4-orf6 코딩 서열을 Ad5와 같은 인간 서브그룹 C의 아데노바이러스의 E4-orf6와 교환하는 것이 통상적이다. 이것은 예를 들면, 293 세포, PER.C6 세포 등과 같은 Ad5의 E1 유전자를 발현하는 공지의 보체 세포주에서 이와 같은 아데노바이러스가 증식하는 것을 허용한다 (예컨대, Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467 참조). 소정 구현예에서, 아데노바이러스는 항원을 암호화하는 핵산이 클론되어 있는 E1 영역에 결실을 갖고, Ad5의 E4 orf6 영역을 갖는 혈청형 35의 인간 아데노바이러스이다. 소정 구현예에서, 아데노바이러스는 항원을 암호화하는 핵산이 클론되어 있는 E1 영역에 결실을 갖고, Ad5의 E4 orf6 영역을 갖는 혈청형 26의 인간 아데노바이러스이다. Ad35 아데노바이러스의 경우, 예를 들면, pIX 개방형 해독틀 또는 Bsu36I 제한 부위에 의해 5' 말단에 표시된 pIX 개시 코돈의 243 bp 단편 바로 상류와 같이 이것을 포함하는 단편의 166 bp 바로 상류에서 아데노바이러스에 E1B 55K 개방형 해독틀의 3' 말단을 보유하는 것이 통상적인데, 이것은 pIX 유전자의 프로모터가 이 면적에 부분적으로 거주하므로 아데노바이러스의 안정성을 증가시키기 때문이다 (예컨대, Havenga et al, 2006, supra; WO 2004/001032 참조).
재조합 아데노바이러스 벡터의 제조는 본 분야에 잘 알려져 있다.
rAd26 벡터의 제조는 예를 들면, WO 2007/104792 및 Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63에 기재되어 있다. 예시적인 Ad26의 게놈 서열은 GenBank Accession EF 153474 및 WO 2007/104792의 SEQ ID NO:1에서 발견된다. rAd35 벡터의 제조는 예를 들면, US 특허 제7,270,811호 및 Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71에 기재된다. Ad35의 예시적인 게놈 서열은 GenBank Accession AC_000019에 기재된다.
본 발명 일 구현예에서, 본 발명에서 유용한 벡터는 본 명세서에 그 개시가 전체가 참조로서 통합되는 WO2012/082918에 기술된 것을 포함한다.
통상적으로, 본 발명에서 유용한 아데노바이러스 벡터는 전체 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 핵산을 사용하여 제조된다(예컨대, 플라스미드, 코스미드, 또는 바쿨로바이러스 벡터). 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 클로닝에 의해 얻거나 합성에 의해 생산될 수 있다. 상기 DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.
본 발명에서 유용한 아데노바이러스 벡터는 통상적으로 복제결함이다. 이들 구현예에서, 바이러스는 E1 영역과 같은, 바이러스의 복제에 중요한 영역의 결실 또는 비활성화에 의해 복제결함이 된다. 영역들은 실질적으로 예를 들면, (일반적으로 프로모터에 연결된) 관심의 유전자의 삽입에 의해 결실 또는 비활성화될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 벡터는 E2, E3, 또는 E4 영역과 같은 다른 영역에서의 결실 또는 프로모터에 링크된 이형 유전자의 삽입을 함유할 수 있다. E2- 및/또는 E-4 돌연변이 아데노바이러스, 일반적으로 E2- 및/또는 E4-보체 세포주가 재조합 아데노바이러스를 생성하는데 사용된다. 아데노바이러스의 E3 영역에서의 돌연변이는 세포주에 의해 보충될 필요가 없는데, E3가 복제에 필요하지 않기 때문이다.
패키징 세포주는 통상적으로 본 발명의 충분한 양의 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 사용된다. 패키징 세포는 복제결함 벡터에서 결실되거나 또는 불활성화된 이들 유전자들을 포함하는 세포이고, 그러므로 세포에서 바이러스가 복제되도록 한다. 적절한 세포주는 예를 들면, PER.C6, 911, 293, 및 E1 A549를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 항원성 펩티드를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 부분을 발현할 수 있다. 이들 외래, 이종성 또는 외인성 펩티드 또는 폴리펩티드는 예컨대, 종양 특이적 항원(TSAs), 박테리아 항원, 바이러스 항원, 균류 항원 및 원생동물 항원과 같은 면역원적인 서열을 포함할 수 있다.
상기 항원성 펩티드를 인코딩하는 이종성 유전자는 아데노바이러스 유래 프로모터(예컨대, 메이저 레이트 프로모터(Major Late Promoter))의 제어 하(즉, 작동적으로 연결)에 있을 수 있거나 이종성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 적합한 이종성 프로모터의 예시는 CMV 프로모터 및 RSV 프로모터를 포함한다. 바람직하게는 상기 프로모터는 발현 카세트 내 관심 이종성 유전자의 상류에 위치한다.
면역원적 조성물
면역원적 조성물은 본 발명에서 사용되기 위한 repRNA 또는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 기술 분야에 주지의 방법에 따라 백신(“면역원적 조성물”로도 지칭됨)으로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 면역 반응을 증진하기 위한 애주번트를 포함할 수 있다. 제형 내 각 성분의 최적 비율은 본 명세서 개시의 관점에 에서 기술분야의 숙련자에게 주지의 기술에 의해 결정될 수 있다.
면역원적 조성물의 제조와 용도는 기술 분야에 잘 알려져 있다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염 용액, 덱스트로스 또는 기타 당류 용액 또는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 글리콜류가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 발현하는 repRNA 또는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 이들 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드는 비제한적으로 종양 특이적 항원(TSAs), 박테리아 항원, 바이러스 항원, 균류 항원 및 원생동물 항원을 포함하는 면역원적인 임의의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드는 병원체, 예컨대 박테리아, 균류, 원생동물로부터 유래할 수 있고, 또는 종양으로부터 유래할 수도 있다. 하나 이상의 바라직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 인플루엔자 바이러스, HIV, 에볼라 바이러스, HPV, HSV, CMV, RSV, 간염바이러스, 지카 바이러스, 중증급성호흡기증후군(SARS) 바이러스, 치쿤군야 바이러스, 뎅기바이러스 또는 웨스트나일 바이러스와 같은 바이러스로부터의 하나 이상의 항원성 단백질을 발현하는 repRNa 또는 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
상기 항원성 단백질은 항원결정인자를 포함하는 임의의 폐렴바이러스(pneumovirus)로부터의 임의의 단백질일 수 있다. 바람직한 구현예에서 상기 항원성 단백질은 호흡기 합포체 바이러스로부터의 전-융합 F 단백질(RSV-preF)이다.
바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNa 또는 아데노바이러스 벡터에 의해 인코딩되는 항원성 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 이들의 면역원적 폴리펩티드, 및 이들의 조합의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명에서 유용한 면역원적 조성물은 애주번트를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 공동-투여에 적합한 애주번트는 QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, Alum, 및 MF59을 포함하여, 인간에게 잠재적으로 안전하고, 잘 관용되고(well tolerated) 그리고 효과적인 것이어야 한다.
투여될 수 있는 다른 애주번트는 알파-인터페론, 감마 인터페론, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 과립구집락형성 자극 인자(gCSF), 과립대식세포 집락자극인자(gMCSF), 종양괴사인자 (TNF), 표피성장인자 (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-IO, 및 IL-12 와 같은 렉틴, 성장 인자, 사이토카인 및 림포카인 또는 이들을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 기술분야의 숙련자에게 주지인 기타 물질을 포함할 수 있다. 이와 같은 물질은 비-독성이어야 하고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 기타 재료의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들면, 근육내, 피하, 경구, 정맥 내, 피부 또는 점막내 (예컨대, 거트), 비 내, 또는 복강내 경로에 따른다.
면역 반응을 증진하는 방법
본 발명은 IVT repRNA를 아데노바이러스 벡터와의 조합으로 사용하여 인간 대상체 내에서 임의의 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 프라이밍 및 부스팅하는 개선된 방법을 제공한다.
본 발명 일반적인 일 양태에 따르면, 인간 대상체 내에서 면역 반응을 유도하는 방법은:
a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
이에 따라 인간 대상체 내에서 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이다.
본 발명 구현예에 따르면, 상기 유도된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 항원성 단백질에 대하여 유도된 항체 반응을 포함한다.
바람직하게, 상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 항원성 단백질에 대한 증진된 CD4+ 반응 또는 CD8+ T 세포 반응을 추가로 포함한다. 본 발명의 구현예에 따른 방법에 의해 생성된 상기 증진된 CD4+ T 세포 반응은 예컨대, 인간 대상체 내에서 항원성 단백질에 대한 우성 CD4+ T 세포 반응의 증가 또는 유도, 및/또는 항원성 단백질에 특이적인 다기능성 CD4+ T 세포의 증가 또는 유도일 수 있다. 상기 다기능성 CD4+ T 세포는 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 IFN-감마, IL-2 및 TNF-알파 중 2 이상을 발현한다. 본 발명의 구현예에 따른 방법에 의해 생성된 상기 증진된 CD8+ T 세포 반응은, 예컨대, 인간 대상체 내에서 항원성 단백질에 특이적인 다기능성 CD8+ T 세포의 증가 또는 유도일 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명의 구현예에 따른 방법으로 인한 상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 항원성 단백질에 대하여 증진된 CD4+ T 세포 반응, 증진된 항체 반응 및 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함한다.
면역 반응을 검출하기 위해 사용될 수 있는 검정법들이 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 검정법들 중 일부는 예컨대, ELISA(효소-결합 면역흡착(enzyme-linked immunosorbent)), ELISPOT(효소-결합 면역점(enzyme-linked immunospot)), 및 ICS(세포내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining))를 포함한다. ELISA 검정은 예컨대, 분비된 항체 또는 사이토카인의 수준을 분석한다. ELISA 검정이 체액 면역 반응의 지표인 특정 항원에 결합하는 항체의 수준을 판별하기 위해 사용될 때, B 세포에 의한 고 친화도 항체의 생산은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 활성에 의존하기 때문에 이들은 또한 CD4+ T 세포 활성을 반영할 수 있다. ELISPOT 및 ICS는 예컨대 특정 항원에 대한 T 세포 반응을 분석하는 단일 세포 검정법이다. ELISPOT 검정은 개별 세포의 분비 활성을 측정하고, ICS 검정은 세포내 사이토카인의 수준을 분석한다. CD4+ 특이적 및 CD8+ 특이적 T 세포 반응은 ICS 검정을 사용하여 판별될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 구현예에 따라 IVT repRNA는 면역 반응을 프라임하기 위해 사용되고, Ad26 또는 Ad35 벡터는 면역 반응을 부스트하기 위해 사용된다. 본 발명 다른 구현예에서, 본 발명의 구현예에 따라 Ad26 또는 Ad35 벡터는 면역 반응을 프라임하기 위해 사용되고, IVT repRNA는 면역 반응을 부스트하기 위해 사용된다.
프라이밍 및 부스팅 조성물에서 상기 항원은 동일할 필요는 없으나, 항원결정인자를 공통으로 가지거나 서로 실질적으로 유사해야 한다.
면역원적 조성물의 투여는 통상적으로 근육 내, 피하 또는 피내이다. 그러나 다른 투여 방식, 예컨대 정맥내, 피부 또는 비강내 또한 사용될 수 있다. 면역원적 조성물의 근육 내 투여는 바늘을 사용하여 조성물의 현탁액을 주사하여 달성될 수 있다. 대안은 조성물을 투여하기 위한 무바늘 주입 장치의 사용(예컨대, Biojector(TM)를 사용하여) 또는 조성물을 포함하는 동결건조 분말이다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 환부에 주사를 위하여 상기 조성물은 발열원-미함유(pyrogen-free)이고 및 적합한 pH, 등장도 및 안정도를 갖는 비경구적으로 허용되는 수성 용액의 형태일 것이다. 기술분야의 숙련자는 적합한 용액, 예컨대 소듐클로라이드 주사액(Sodium Chloride Injection), 링거 주사액(Ringer's Injection), 락테이트 링거 주사액(Lactated Ringer's Injection)과 같은 등장성 비히클을 잘 제조할 수 있을 것이다. 본 발명의 IVT repRNA는 투여를 위해 지질 나노입자 내에 제형화될 수 있다. 필요에 따라 조성물 내에 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 조성물의 서방성 제형 역시 이용될 수 있다.
통상적으로 투여는 감염 또는 증상의 발전 이전에 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 예방적 목적을 가질 수 있다. 본 발명에 따라 치료 또는 예방될 수 있는 질병 및 장애는 면역 반응이 보호 또는 치료적 역할을 수행할 수 있는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터는 노출후 예방을 위해 투여될 수 있다.
IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원적 조성물은 대상체에 투여되어 대상체 내에서 면역 반응을 유발한다. 검출 가능한 면역 반응을 유도하기에 충분한 양의 조성물은 “면역학적 유효 용량”으로 정의된다. 이하에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 면역원적 조성물은 체액 뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응을 유도한다. 바람직한 구현예에서 면역 반응은 보호 면역 반응이다.
투여될 조성물의 실질 양, 그리고 투여의 속도 및 시간 경과(time-course)는 치료될 질병, 장애 또는 상태의 성질 및 심각도에 의존할 것이다. 치료 처방, 예컨대 용량 결정 등은 일반적인 실무자 및 다른 의사의 책임 내이며, 통상적으로 치료될 질병, 장애 또는 상태, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 실무자에 알려진 다른 인자들을 고려한다. 상술한 기술 및 프로토콜의 예시는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980]에서 찾을 수 있다.
IVT repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 생산과 이러한 입자의 조성물 내로의 선택적 제형화에 따라, 조성물은 개인, 구체적으로 인간에 투여될 수 있다.
치료적 유효량 또는 용량은 다양한 인자, 예컨대 투여 수단, 타깃 부위, 대상체의 생리적 상태(예컨대, 나이, 체중, 건강을 포함함), 대상체가 인간 또는 동물인지, 다른 투여된 의약, 그리고 치료가 예방적 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 치료 용량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 최적으로 적정된다.
일 예시적 요법에서, IVT repRNA는 ≤200μg, ≤100μg, ≤50μg, 또는 ≤10μg 의 IVT repRNA를 포함하는 약 100 μl 내지 약 10 ml 범위의 부피로 투여(예컨대, 근육 내로)되지만, 발현은 훨씬 낮은 수준, 예컨대, 용량당 ≤1μg, ≤100ng, ≤10ng, 또는 ≤1ng IVT repRNA로 나타날 수 있다. 바람직하게, IVT repRNA는 0.25ml 내지 1.0ml 범위의 부피로 투여된다. 보다 바람직하게, IVT repRNA는 0.5ml의 부피로 투여된다.
통상적으로 IVT repRNA는 용량 당 약 10-100 μg 의 양으로 투여된다. 바람직한 구현예에서 IVT repRNA는 용량 당 약 10 μg 의 양으로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서 IVT repRNA는 용량 당 약 25 μg 의 양으로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서 IVT repRNA는 용량 당 약 50 μg 의 양으로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서 IVT repRNA는 용량 당 약 75 μg 의 양으로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서 IVT repRNA는 용량 당 약 100 μg 의 양으로 투여된다.
일 예시적 요법에서, 아데노바이러스 벡터는 약 104 내지 1012 바이러스입자/ml 의 농도를 포함하는 약 100 μl 내지 약 10 ml 범위의 부피로 투여(예컨대, 근육 내로)된다. 바람직하게, 아데노바이러스 벡터는 0.25ml 내지 1.0ml 범위의 부피로 투여된다. 보다 바람직하게, 아데노바이러스 벡터는 0.5ml의 부피로 투여된다.
통상적으로, 아데노바이러스 벡터는 인간 대상체에 한번의 투여 동안 약 109 내지 약 1012 바이러스입자(viral particles, vp)의 양으로, 보다 통상적으로 약 1010 내지 약 1012 vp 의 양으로 투여된다. 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 약 5x1010 vp 의 양으로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 약 0.8x1010 vp 의 양으로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 약 2x1010 vp 의 양으로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 약 4x1010 vp 의 양으로 투여된다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다.
부스팅 조성물은 프라이밍 조성물의 투여 수주 또는 수개월 후에 투여된다, 예컨대, 프라이밍 조성물의 투여 약 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 15 주, 16 주, 17 주, 18 주, 19 주, 20 주, 21 주, 22 주, 23 주, 24 주, 25 주, 26 주, 27 주, 28 주, 29 주, 30 주, 31 주, 32 주, 33 주, 34 주, 35 주, 36 주, 37 주, 38 주, 39 주, 40 주, 41 주, 42 주, 43 주, 44 주, 45 주, 46 주, 47 주, 48 주, 49 주, 50 주, 51 주, 52 주, 또는 1 내지 2 년 후에 투여된다.
바람직하게, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1-52 주 후에 투여된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 2-52 주 후에 투여된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 4-52 주 후에 투여된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1 주 후에 투여된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 2 주 후에 투여된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 4 주 후에 투여된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 8 주 후에 투여된다.
본 발명의 프라이밍 및 부스팅 조성물은 각각 1, 2, 3 또는 복수 용량일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 대상체 내에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한다. 상기 방법은:
a. 종양의 세포에 의해 생산된 항원성 단백질, 실질적으로 유사한 항원성 단백질, 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IVT repRNA의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
b. 항원성 단백질, 실질적으로 유사한 항원성 단백질, 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 인간 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
이에 따라 인간 대상체 내에서 종양에 대한 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이다.
바람직하게, 유도된 면역 반응은 인간 대상체에 종양에 대한 보호 면역성을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA를 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물이다.
본 발명 구현예에 따르면, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1-52 주 후에 투여된다. 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 52 주 보다 후에 투여된다
본 발명의 일 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 2-52 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 4-52 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 1 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 2 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 4 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 8 주에 투여된다.
추가적인 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 적어도 2주 또는 적어도 4 주에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 4-12 주 또는 4-8 주에 투여된다.
바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA는 VEE 바이러스 기반 repRNA이다.
바람직한 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 Ad26 또는 Ad35 벡터이다.
종양의 세포에 의해 생산되는 항원성 단백질은 임의의 종양 항원일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 종양 항원은 종양 세포에만 존재하는 종양 특이적 항원이다. 종양 항원은 또한 몇몇 종양 세포 및 또한 몇몇 정상 세포에도 존재하는 종양-연관된 항원일 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 인간 대상체 내에서 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한다. 상기 방법은:
a. 바이러스의 항원성 단백질, 실질적으로 유사한 항원성 단백질, 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IVT repRNA의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
b. 항원성 단백질, 실질적으로 유사한 항원성 단백질, 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 인간 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
이에 따라 인간 대상체 내에서 바이러스에 대한 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이다.
바람직하게, 증진된 면역 반응은 인간 대상체에 바이러스에 대한 보호 면역성을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA를 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물이다.
일 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1-52 주 후에 투여된다. 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 52 주 보다 후에 투여된다
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 2-52 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 4-52 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 1 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 2 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 4 주에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 8 주에 투여된다.
추가적인 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 적어도 2주 또는 적어도 4 주에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여된 후 4-12 주 또는 적어도 4-8 주에 투여된다.
바람직한 구현예에서, 상기 IVT repRNA는 VEE 바이러스 기반 repRNA이다.
바람직한 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 Ad26 또는 Ad35 벡터이다.
상기 항원성 단백질은 바이럿의 임의의 항원성 단백질일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 단백질은 바이러스의 당단백질 또는 핵단백질이다.
구현예
본 발명은 또한 이하의 비제한적 구현예를 제공한다.
구현예 1은 면역반응을 이를 필요로 하는 인간 대상체 내에서 유도하는 방법으로서, 상기 방법은:
a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
이에 따라 인간 대상체 내에서 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 2는 구현예 1에 따른 방법으로서, 상기 IVT repRNA을 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 3은 구현예 1에 따른 방법으로서, 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 IVT repRNA를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 4는 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 유도된 항체 면역 반응을 포함한다.
구현예 5는 구현예 4에 따른 방법으로서, 상기 유도된 항체 면역 반응은 ELISA에 의해 판별된다.
구현예 6은 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 유도된 세포 면역 반응을 포함한다.
구현예 7은 구현예 6에 따른 방법으로서, 상기 유도된 세포 면역 반응은 ICS 또는 ELISPOT 검정에 의해 판별된다.
구현예 8은 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체에 제1 및 제2 항원성 단백질 중 적어도 하나에 관련된 질병에 대한 보호 면역성을 제공한다.
구현예 9은 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 IVT repRNA는 베네주엘라 이콰인 뇌염(Venezuelan equine encephalitis, VEE) 바이러스 기반 repRNA이다.
구현예 10은 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 아데노바이러스 벡터는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26(Ad26) 벡터 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 35 (Ad35) 벡터이다.
구현예 11은 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1-52 주 후에 투여된다.
구현예 12는 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 적어도 1 주 후에 투여된다.
구현예 13는 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 병원체 또는 종양으로부터 유래된 것이다.
구현예 14는 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 바이러스로부터 유래된 것이다.
구현예 15는 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 폐렴바이러스, 필로바이러스, HIV, 뎅기 바이러스, 지카 바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 B형 간염 바이러스로부터 유래된 것이다.
구현예 16는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일하다.
구현예 17는 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 전-융합(pre-fusion) F 단백질(RSV-preF) 로부터 유래되고, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일하다.
구현예 18은 구현예 17에 따른 방법으로서, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 각각 독립적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 이들의 면역원적 폴리펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 19는 구현예 18에 따른 방법으로서, 상기 IVT repRNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 및 이들의 면역원적 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 항원성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 20은 구현예 21에 따른 방법으로서, 상기 VIT repRNA는 서열번호 3의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 21은 구현예 20에 따른 방법으로서, 상기 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1, 서열번호 2, 및 이들의 면역원적 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 항원성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 22는 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 IVT repRNA는 지질 나노입자 조성물로서 용량 당 0.1-1000μg IVT repRNA의 양으로 투여된다.
구현예 23은 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 아데노바이러스 벡터는 용량당 109-1012 바이러스 입자의 양으로 투여된다.
구현예 24는 인간 대상체 내에서 적어도 하나의 폐렴바이러스 아형(subtype)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이고, 상기 방법은:
a. 적어도 하나의 폐렴바이러스 아형의 제1 항원성 단백질, 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IVT repRNA의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
b. 적어도 하나의 폐렴바이러스 아형의 제2 항원성 단백질, 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 인간 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
이에 따라 인간 대상체 내에서 바이러스에 대한 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 25는 인간 대상체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 조합물이고, 상기 조합물은:
a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IVT repRNA의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제1 조성물, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제2 조성물을 포함하고,
상기 조성물 중 하나는 면역 반응을 프라이밍 하기 위해 인간 대상체에 투여되고 나머지 조성물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 인간 대상체에 투여되며,
상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가진다.
구현예 26은 인간 대상체 내의 면역 반응을 면역 반응을 유도하기 위한 의약의 제조를 위한 조합물의 용도로서, 상기 용도는:
a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제1 조성물, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제2 조성물을 포함하고,
상기 조성물 중 하나는 면역 반응을 프라이밍 하기 위해 인간 대상체에 투여되고 나머지 조성물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 인간 대상체에 투여되며,
상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가진다.
구현예 27은 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 IVT repRNA을 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 28은 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 IVT repRNA를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 29는 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 병원체 또는 종양으로부터 유래된 것이다.
구현예 30은 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 바이러스로부터 유래된 것이다.
구현예 31은 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 RSV-preF 단백질로부터 유래한 것이고, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일한 것이다.
구현예 32는 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 각각 독립적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 이들의 면역원적 폴리펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 33은 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 IVT repRNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 및 이들의 면역원적 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 항원성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 34는 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1, 서열번호 2, 및 이들의 면역원적 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 항원성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 35는 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 IVT repRNA는 베네주엘라 이콰인 뇌염(Venezuelan equine encephalitis, VEE) 바이러스 기반 repRNA이다.
구현예36은 구현예 24의 방법, 구현예 25의 조합물 또는 구현예 26의 용도로서, 상기 아데노바이러스 벡터는 Ad26 벡터 또는 Ad35 벡터이다.
구현예 37은 면역반응을 이를 필요로 하는 인간 대상체 내에서 유도하는 방법으로서, 상기 방법은:
a. 베네주엘라 이콰인 뇌염(Venezuelan equine encephalitis, VEE) 바이러스의 비구조(non-structural) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Ad26 벡터 또는 Ad35 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
이에 따라 인간 대상체 내에서 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 38은 인간 대상체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 조합물이고, 상기 조합물은:
a. 베네주엘라 이콰인 뇌염(Venezuelan equine encephalitis, VEE) 바이러스의 비구조(non-structural) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제1 조성물, 및
b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Ad26 벡터 또는 Ad35 벡터의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제2 조성물을 포함하고,
상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물이다.
구현예 39는 인간 대상체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 의약의 제조를 위한 구현예 38의 조합물의 용도이다.
구현예 40은 구현예 37의 방법, 구현예 38의 조합물 또는 구현예 39의 용도로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 병원체 또는 종양으로부터 유래된 것이다.
구현예 41은 구현예 38의 방법, 구현예 39의 조합물 또는 구현예 40의 용도로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 바이러스로부터 유래된 것이다.
구현예 42는 구현예 37의 방법, 구현예 38의 조합물 또는 구현예 39의 용도로서, 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 RSV-preF 단백질로부터 유래한 것이고, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일한 것이다.
구현예 43은 구현예 37의 방법, 구현예 38의 조합물 또는 구현예 39의 용도로서, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 각각 독립적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 이들의 면역원적 폴리펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 44는 구현예 37의 방법, 구현예 38의 조합물 또는 구현예 39의 용도로서, 상기 제1 조성물은 서열번호 3의 서열을 가지는 IVT repRNA의 면역학적 유효량을 포함하고, 상기 제2 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 항원성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Ad26 벡터의 면역학적 유효량을 포함한다.
구현예 45는 구현예 37-44 중 어느 하나의 방법, 구현예 38-44 중 어느 하나의 조합물 또는 구현예 39-44 중 어느 하나의 용도로서, 상기 제2 조성물은 제1 조성물의 투여 후 2 내지 12 주, 바람직하게 4 내지 8 주에 인간 대상체에 투여된다.
구현예 46은 구현예 38 또는 41-45 중 어느 하나의 방법, 구현예 39 또는 41-45 중 어느 하나의 조합물 또는 구현예 40-45 중 어느 하나의 용도로서, 상기 제1 조성물은 지질-나노입자 제형으로 제형화된다.
실시예
이하의 실시예들은 설명을 위해 제공되나, 청구된 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
동물 연구는 모델 항원을 인코딩하는 repRNA 기반 백신을 사용한 동종성 프라임-부스트 백신접종의 잠재력을 조사하는 목표로 수행되었다. 사용된 모델 항원은 호흡기 합포체 바이러스로부터의 전-융합 F 단백질(RSV-preF)였다. 상기 연구는 4주 간격 면역접종으로 동종성 백신접종의 용량 범위를 시험하였다.
동물 조작
상기 연구는 동물 복지 조항 규정의 최종 규칙(Final Rules of the Animal Welfare Act regulations)(9 CFR Part 1, 2, 및 3) 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)- 국립 아카데미 프레스(National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition) (the Guide)의 모든 허용 가능한 섹션을 를 준수하였다.
총 30 마리(6 주령) 암컷 Balb/c 마우스를 잭슨 래버러토리(Jackson laboratories)로부터 구입하였다.
백신 재료
사용된 IVT repRNA 백신 벡터의 도식적인 표시가 도 1에 도시된다. IVT repRNA 벡터는 베네주엘라 이콰인 뇌염(Venezuelan equine encephalitis, VEE) 바이러스의 제1 인코딩 비구조 단백질(NSPs), 및 제2 인코딩 RSV-preF 단백질의 두 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frames, ORFs)으로 이루어졌다. IVT repRNA 벡터는 시험관 내 전사(IVT) 및 정제방법을 사용하여 제조되었다. 간략하게, T7 시험관 내 전사를 위한 선형 주형 DNA는 레플리콘-보유 DNA 플라스미드 T7 프로모터의 5' 및 폴리-A 테일의 3'를 분해하여 생성되었다. 상기 분해된 산물은 Zymo DNA Clean & Concentrator™키트를 사용하여 세정되었다. IVT repRNA는 Ambion MEGAscript®T7 transcription kit (Thermo)를 사용하여 생성되고, 이후 GE CaptoCore 700 HiScreen 컬럼을 사용하여 세정 단계로 완충제 성분인 자유 NTPs 및 단백질을 제거하였다. 세정 후 IVT repRNA는 Cellscript로부터의 캐핑 키트를 사용하여 전사후 효소적 캐핑 반응(post-transcriptional enzymatic capping reaction)에 의해 캐핑되었고, 이 후 RNA는 회전 농축기 내에서 농축되고 버퍼 교환되어 최종 농도 1-5 μg/μl가 되었다. 지질 나노입자(LNPs) 내로의 repRNA의 제형화는 에탄올 내 희석 공정에 의해 수행되었다. 콜레스테롤은 Sigma-Aldrich로부터 입수하였고, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC) 및 1,2,- 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DSPE-PEG)는 Avanti Polar Lipids로부터 입수하였다. 콜레스테롤:DOTAP:DSPC:DSPE-PEG 48:40:10:2의 몰 퍼센트 지질 성분(에탄올 내)을 10mM 시트레이트 버퍼 내 repRNA와 8:1 N:P 몰비(RNA 상의 포스페이트에 대한 DTAP 상의 질소)를 이용하여 혼합하였다. 1시간 유화 후 입자를 PBS에 대하여 투석하였다. 생체 내(in vivo) 주입 전에 입자들은 PBS 내에 요구되는 RNA 농도까지 추가로 희석되었다.
IVT repRNA는 VEE 바이러스 레플리카제 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항원성 RSV-preF 단백질을 발현했다. IVT repRNA를 생성하기 위해 사용된 주형 DNA 서열은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 가졌다.
백신접종 및 실험 설계
Balb/c 마우스는 repRNA를 사용한 동종성 프라임-부스트 요법으로 백신접종되었다(분류 및 실험 설계는 표 1 및 도 2 참조). 면역접종 전, 각 마우스는 설치류용 마취기를 사용하여 산소 내에서 1-4% 이소플루란으로 마취되었고, 지질-나노입자(LNP)-제형화된 repRNA(50 μL) 근육내(IM) 주사를 맞았다. 프라이밍 및 부스팅 용량은 4 주 간격으로 주어졌다(도 2).
항응고제를 제외한 총 혈액을 혈청을 위해 처리되었다. 각각의 혈청은 RSV-preF 특이적 ELISA에서 검정되었다.
체액 반응 조사를 위한 동종성 repRNA 면역접종 연구에서의 실험적 동물 분류
동물군
(Balb/c) 		백신 비히클 면역접종 (주) 용량 (μg) 동물/군
1-4 repRNA-RSV-preF LNP 0, 4 5, 1, 0.4, 0.02 6
5 없음 LNP 0, 4 0 6
항-RSV-F IgG ELISA
RSV-F 특이적 체액 반응은 Krarup et al. (A highly stable prefusion RSV F vaccine derived from structural analysis of the fusion mechanism.　Nat. Commun. 6:8143)에서 전술한 바와 같이, 변형된 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의한 면역접종 후 28 및 42일에 판별되었다.
간략하게, MaxiSorp 폴리스티렌 96-웰 플레이트 (NUNC)를 인간 항-RSV F 모노클로날 항체(Synagis) PBS 내 1 μg/ml 농도로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음 날, 플레이트를 PBST 세척 버퍼(PBS, 0.05% Tween)로 세척하고 1% 소혈청 알부민을 포함하는 PBS 내에서 차단하고 이후 고정화된 항-RSV F 항체에 의해 포획된 안정화된 전-융합 단백질(PBST 내 0.25 μg/ml)과 함께 배양하였다.
혈청 샘플은 1% 소혈청 알부민을 포함하는 PBST로 희석되고 Bio-Rad로부터의 염소-항-마우스-IgG-HRP 컨쥬게이트와 배양되었고(PBST 내 1/5000 희석), 그리고 나서 샘플은 웰에서 배양되어 RSV-F 특이적 쥣과 IgG를 판별할 수 있게 하였다. OPD 기질을 판별에 사용하였다. 모든 배양은 1시간 동안 실온에서 수행되었다. 각 단계 후 플레이트는 PBST로 3회 세척되었다. ELISA 검정으로부터의 결과는 도 3에 나타낸다. 0.4 μg 이상 용량의 프라임 면역접종은 검출 가능한 IgG 역가를 갖는 체액 면역을 야기하였고, 동종성 부스팅은 IgG 역가에 근소한 역가만을 야기하였다(용량에 따른, cross-dose).
실시예 2
동종성 repRNA 부스트 후의 세포 반응을 조사하기 위하여, RSV-F 특이적 펩티드를 사용한 ELISPOT에서 비장세포를 시험한 동물 연구가 수행되었다.
동물 조작
상기 연구는 동물 복지 조항 규정의 최종 규칙(Final Rules of the Animal Welfare Act regulations)(9 CFR Part 1, 2, 및 3) 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)- 국립 아카데미 프레스(National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition) (the Guide)의 모든 허용 가능한 섹션을 를 준수하였다.
암컷 Balb/c 마우스(6 주령)를 잭슨 래버러토리(Jackson laboratories)로부터 구입하였다.
백신 재료
IVT repRNA는 실시예 1에서 기술된 대로 생성 및 제형화되었다.
백신접종 및 실험 설계
Balb/c 마우스는 repRNA를 사용한 동종성 프라임-부스트 요법으로 백신접종되었다(분류 및 실험 설계는 표 2 및 도 4 참조). 면역접종 전, 각 마우스는 설치류용 마취기를 사용하여 산소 내에서 1-4% 이소플루란으로 마취되었고, 지질-나노입자(LNP)-제형화된 repRNA(50 μL) 근육내(IM) 주사를 맞았다. 프라이밍 및 부스팅 용량은 4 주 간격으로 주어졌다(도 4).
6 주 후 모든 마우스를 희생시켜 RSV-F 특이적 CTL 펩티드 KYKNAVTEL 검정을 사용한 IFN-g ELISPOT 검정에서 시험하기 위한 비장세포를 얻었다.
세포 반응 조사를 위한 동종성 repRNA 면역접종(i.m.)에서의 실험적 동물 분류
군 프라임 부스트 1
(4주) 		repRNA 용량
(μg) 		마우스/군 백신접종 주(week)
1 PBS - 4 0,6†
2 repRNA - 1 10 0,6†
3 repRNA repRNA 1 10 0,4, 6†
IFN-g ELISPOT 검정
비장세포를 사용한 RSV-F 특이적 세포 면역 반응은 BD로부터의 마우스 세포용 IFNγ ELISPOT 키트를 사용하여 인터페론 감마 효소-결합 면역점 검정(ELISPOT)에 의해 도 4에 기술된 시점에 판별되었다. 간략하게, 웰 당 500,000개 비장세포를 최종 농도 1 μg/ml 로 CTL 활성화 RSV-F 펩티드(KYKNAVTEL)로 밤새 자극하였다. 그 후 키트 제조자의 지시에 따라 점을 현상하였다. ELISPOT 검정의 결과는 도 5에 나타나며, 부스트 후에 세포 반응이 오로지 근소하게 증가(통계적으로 유의하지 않음)하였음을 나타낸다.
실시예 3
동종성 프라임-부스트 요법에서 IVT repRNA의 부스팅 잠재력의 부재로 인하여, 동물 연구는 둘 다 모델 항원을 인코딩하는 repRNA 기반 백신과 아데노-기반 백신의 조합으로의 이종성 프라임-부스트 면역접종의 잠재력을 조사하는 목적으로 수행되었다. 구체적으로, 상기 연구는 4주 간격의 repRNA 및 Ad26-RSV-F 면역접종을 포함하는 두 이종성 백신접종을 시험하여, 이종성 프라임-부스트 백신접종이 체액 또는 세포 면역 반응을 실시예 1 및 2의 동종성 repRNA 백신접종과 비교하여 개선되는지 여부를 판별하였다.
동물 조작
상기 연구는 동물 복지 조항 규정의 최종 규칙(Final Rules of the Animal Welfare Act regulations)(9 CFR Part 1, 2, 및 3) 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)- 국립 아카데미 프레스(National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition) (the Guide)의 모든 허용 가능한 섹션을 를 준수하였다.
총 36 마리(6 주령) 암컷 Balb/c 마우스를 잭슨 래버러토리(Jackson laboratories)로부터 구입하였다.
백신 재료
IVT repRNA는 실시예 1에서 기술된 대로 생성 및 제형화되었다.
E1 위치에 삽입된 RSV-F 유전자를 포함하는, 정제된 E1/E3-삭제된 레플리콘-결함 재조합 아데노바이러스 타입 26 백신 벡터(Ad26)인 재조합 아데노바이러스 벡터는 Janssen R&D에 의해 제조되었다. 상기 벡터는 PER.C6® 세포 내에 레스큐(rescue)되고, 플라크-정제되고, 업-스케일되고, 그리고 나서 2-단계 CsCl 밴딩 공정에 의해 정제되고, 그 후 TRIS-기반 제형 버퍼 내로 제형화되고 -65℃에서 보관되었다.
상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 RSV-A2 균주로부터 유래한 RSV-F를 발현하였다. 상기 발현된 RSV-F 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가졌다.
상기 백신 재료는 제어된 온도 냉동고 내에서 -80℃로 보관되었다.
백신접종 및 실험 설계
Balb/c 마우스는 repRNA 및 아데노 벡터를 사용한 이종성 프라임-부스트 요법으로 백신접종되었다(분류 및 실험 설계는 표 3 및 도 6 참조). 면역접종 전, 각 마우스는 마취되었고, 지질-나노입자(LNP)-제형화된 repRNA(실시예 1에서 기술된 바와 같은)의 근육내(IM) 주사를 뒷다리에 맞았다. 프라이밍 및 부스팅 용량은 4 주 간격으로 주어졌다(도 6).
동물 실험은 실시예 1 및 2에서 보인 바와 같은 동종성 repRNA 백신접종과 대비하여 repRNA 및 Ad26-RSV-F를 사용한 이종성 프라임-부스트 백신접종이 체액 또는 세포 면역 반응을 개선시키는지(분류 및 실험 설계는 표 3 및 도 6 참조) 여부를 조사하기 위하여 수행되었다. 모든 면역접종은 근육 내였다. 3개의 대조군 마우스는 PBS, LNP-제형화된 repRNA (1μg), 또는 Ad26-RSV-F (1x109　vp)로 프라임-단독 면역접종(i.m.)을 맞았다. 이종성 프라임-부스트 면역접종의 잠재력은 추가적인 2개 그룹의 마우스에서 시험되었다. 한 그룹의 8마리 마우스는 LNP-제형화된 repRNA(1 ug)로 프라임되고 4 주 후 Ad26-RSV-F (1x109　vp)로 부스트 되었다. 나머지 그룹의 8마리 마우스는 Ad26-RSV-F (1x109　vp)로 프라임되고 이후 4주 후에 LNP-제형화된 repRNA (1μg)로 부스트되었다.
이종성 면역접종 연구에서의 실험적 동물 분류
군
 프라임 부스트 1
(4주)		 아데노
용량(VPs)		 repRNA
용량(μg)		 마우스/용량 백신접종 주
(week)
1 PBS PBS - - 4 0, 6+
2 repRNA - - 1 8 0, 6+
3 아데노바이러스 - 109 - 8 0, 6+
4 repRNA 아데노바이러스 109 1 8 0, 4, 6+
5 아데노바이러스 repRNA 109 1 8 0, 4, 6+
항-RSV-F IgG ELISA
RSV-F 특이적 체액 반응은 면역접종 후 42일에 실시예 1에 기술된 바와 같이 항-RSV-F IgG ELISA 검정에 의해 판별되었다. ELISA 검정으로부터의 결과는 도 7에 나타낸다. repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 이종성 프라임-부스트 면역접종은 repRNA 또는 아데노바이러스 벡터의 동종성 면역접종에 대하여 증가된 IgG 역가를 가지는 체액 면역 반응을 야기하였다.
IFN-γ ELISPOT 검정
RSV-F 특이적 세포(비장세포) 면역 반응은 실시예 2에 기술된 바와 같이 면역접종 42일 후 인터페론 감마 ELISPOT 분석에 의해 판별되었다. ELISPOT 검정의 결과는 도 8에 나타낸다. repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 이종성 프라임-부스트 면역접종은 repRNA 또는 아데노바이러스 벡터의 프라임-단독 면역접종에 대하여 증가된 세포 면역 반응을 야기하였다.
요약하면, 상기 연구는 증가된 체액 및 세포 면역 반응이 repRNA 또는 아데노바이러스 벡터 단독의 동종성 면역접종과 대비하여 repRNA 및 아데노바이러스 벡터의 이종성 백신으로 면역접종한 것에 의하여 유도되었다는 것을 입증하였다.
기술분야의 숙련자에게 전반적인 발명적 개념에서 벗어나지 않는 한 상술된 구현예들에 변화가 이루어질 수 있음이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 구체적 구현예에 제한되지 않으며, 첨부된 청구항에 규정된 바에 따른 본 발명의 정신 및 범위 내에서의 변형을 포함하는 것으로 의도된 것으로 이해된다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Vaccines & Prevention B.V. Massachusetts Institute of Technology <120> Methods and Compositions for Heterologous repRNA Immunizations <130> 688097.0326WO <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-F protein, strain RSV-A2 <400> 1 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ile Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Val Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-preF <400> 2 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Gly Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Val Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 3 <211> 9676 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> repRNA construct containing the RSV preF antigen <400> 3 taatacgact cactatagat gggcggcgca tgagagaagc ccagaccaat tacctaccca 60 aaatggagaa agttcacgtt gacatcgagg aagacagccc attcctcaga gctttgcagc 120 ggagcttccc gcagtttgag gtagaagcca agcaggtcac tgataatgac catgctaatg 180 ccagagcgtt ttcgcatctg gcttcaaaac tgatcgaaac ggaggtggac ccatccgaca 240 cgatccttga cattggaagt gcgcccgccc gcagaatgta ttctaagcac aagtatcatt 300 gtatctgtcc gatgagatgt gcggaagatc cggacagatt gtataagtat gcaactaagc 360 tgaagaaaaa ctgtaaggaa ataactgata aggaattgga caagaaaatg aaggagctcg 420 ccgccgtcat gagcgaccct gacctggaaa ctgagactat gtgcctccac gacgacgagt 480 cgtgtcgcta cgaagggcaa gtcgctgttt accaggatgt atacgcggtt gacggaccga 540 caagtctcta tcaccaagcc aataagggag ttagagtcgc ctactggata ggctttgaca 600 ccaccccttt tatgtttaag aacttggctg gagcatatcc atcatactct accaactggg 660 ccgacgaaac cgtgttaacg gctcgtaaca taggcctatg cagctctgac gttatggagc 720 ggtcacgtag agggatgtcc attcttagaa agaagtattt gaaaccatcc aacaatgttc 780 tattctctgt tggctcgacc atctaccacg agaagaggga cttactgagg agctggcacc 840 tgccgtctgt atttcactta cgtggcaagc aaaattacac atgtcggtgt gagactatag 900 ttagttgcga cgggtacgtc gttaaaagaa tagctatcag tccaggcctg tatgggaagc 960 cttcaggcta tgctgctacg atgcaccgcg agggattctt gtgctgcaaa gtgacagaca 1020 cattgaacgg ggagagggtc tcttttcccg tgtgcacgta tgtgccagct acattgtgtg 1080 accaaatgac tggcatactg gcaacagatg tcagtgcgga cgacgcgcaa aaactgctgg 1140 ttgggctcaa ccagcgtata gtcgtcaacg gtcgcaccca gagaaacacc aataccatga 1200 aaaattacct tttgcccgta gtggcccagg catttgctag gtgggcaaag gaatataagg 1260 aagatcaaga agatgaaagg ccactaggac tacgagatag acagttagtc atggggtgtt 1320 gttgggcttt tagaaggcac aagataacat ctatttataa gcgcccggat acccaaacca 1380 tcatcaaagt gaacagcgat ttccactcat tcgtgctgcc caggataggc agtaacacat 1440 tggagatcgg gctgagaaca agaatcagga aaatgttaga ggagcacaag gagccgtcac 1500 ctctcattac cgccgaggac gtacaagaag ctaagtgcgc agccgatgag gctaaggagg 1560 tgcgtgaagc cgaggagttg cgcgcagctc taccaccttt ggcagctgat gttgaggagc 1620 ccactctgga agccgatgtc gacttgatgt tacaagaggc tggggccggc tcagtggaga 1680 cacctcgtgg cttgataaag gttaccagct acgatggcga ggacaagatc ggctcttacg 1740 ctgtgctttc tccgcaggct gtactcaaga gtgaaaaatt atcttgcatc caccctctcg 1800 ctgaacaagt catagtgata acacactctg gccgaaaagg gcgttatgcc gtggaaccat 1860 accatggtaa agtagtggtg ccagagggac atgcaatacc cgtccaggac tttcaagctc 1920 tgagtgaaag tgccaccatt gtgtacaacg aacgtgagtt cgtaaacagg tacctgcacc 1980 atattgccac acatggagga gcgctgaaca ctgatgaaga atattacaaa actgtcaagc 2040 ccagcgagca cgacggcgaa tacctgtacg acatcgacag gaaacagtgc gtcaagaaag 2100 aactagtcac tgggctaggg ctcacaggcg agctggtgga tcctcccttc catgaattcg 2160 cctacgagag tctgagaaca cgaccagccg ctccttacca agtaccaacc ataggggtgt 2220 atggcgtgcc aggatcaggc aagtctggca tcattaaaag cgcagtcacc aaaaaagatc 2280 tagtggtgag cgccaagaaa gaaaactgtg cagaaattat aagggacgtc aagaaaatga 2340 aagggctgga cgtcaatgcc agaactgtgg actcagtgct cttgaatgga tgcaaacacc 2400 ccgtagagac cctgtatatt gacgaagctt ttgcttgtca tgcaggtact ctcagagcgc 2460 tcatagccat tataagacct aaaaaggcag tgctctgcgg ggatcccaaa cagtgcggtt 2520 tttttaacat gatgtgcctg aaagtgcatt ttaaccacga gatttgcaca caagtcttcc 2580 acaaaagcat ctctcgccgt tgcactaaat ctgtgacttc ggtcgtctca accttgtttt 2640 acgacaaaaa aatgagaacg acgaatccga aagagactaa gattgtgatt gacactaccg 2700 gcagtaccaa acctaagcag gacgatctca ttctcacttg tttcagaggg tgggtgaagc 2760 agttgcaaat agattacaaa ggcaacgaaa taatgacggc agctgcctct caagggctga 2820 cccgtaaagg tgtgtatgcc gttcggtaca aggtgaatga aaatcctctg tacgcaccca 2880 cctcagaaca tgtgaacgtc ctactgaccc gcacggagga ccgcatcgtg tggaaaacac 2940 tagccggcga cccatggata aaaacactga ctgccaagta ccctgggaat ttcactgcca 3000 cgatagagga gtggcaagca gagcatgatg ccatcatgag gcacatcttg gagagaccgg 3060 accctaccga cgtcttccag aataaggcaa acgtgtgttg ggccaaggct ttagtgccgg 3120 tgctgaagac cgctggcata gacatgacca ctgaacaatg gaacactgtg gattattttg 3180 aaacggacaa agctcactca gcagagatag tattgaacca actatgcgtg aggttctttg 3240 gactcgatct ggactccggt ctattttctg cacccactgt tccgttatcc attaggaata 3300 atcactggga taactccccg tcgcctaaca tgtacgggct gaataaagaa gtggtccgtc 3360 agctctctcg caggtaccca caactgcctc gggcagttgc cactggaaga gtctatgaca 3420 tgaacactgg tacactgcgc aattatgatc cgcgcataaa cctagtacct gtaaacagaa 3480 gactgcctca tgctttagtc ctccaccata atgaacaccc acagagtgac ttttcttcat 3540 tcgtcagcaa attgaagggc agaactgtcc tggtggtcgg ggaaaagttg tccgtcccag 3600 gcaaaatggt tgactggttg tcagaccggc ctgaggctac cttcagagct cggctggatt 3660 taggcatccc aggtgatgtg cccaaatatg acataatatt tgttaatgtg aggaccccat 3720 ataaatacca tcactatcag cagtgtgaag accatgccat taagcttagc atgttgacca 3780 agaaagcttg tctgcatctg aatcccggcg gaacctgtgt cagcataggt tatggttacg 3840 ctgacagggc cagcgaaagc atcattggtg ctatagcgcg gctgttcaag ttttcccggg 3900 tatgcaaacc gaaatcctca cttgaagaga cggaagttct gtttgtattc attgggtacg 3960 atcgcaaggc ccgtacgcac aatccttaca agctttcatc aaccttgacc aacatttata 4020 caggttccag actccacgaa gccggatgtg caccctcata tcatgtggtg cgaggggata 4080 ttgccacggc caccgaagga gtgattataa atgctgctaa cagcaaagga caacctggcg 4140 gaggggtgtg cggagcgctg tataagaaat tcccggaaag cttcgattta cagccgatcg 4200 aagtaggaaa agcgcgactg gtcaaaggtg cagctaaaca tatcattcat gccgtaggac 4260 caaacttcaa caaagtttcg gaggttgaag gtgacaaaca gttggcagag gcttatgagt 4320 ccatcgctaa gattgtcaac gataacaatt acaagtcagt agcgattcca ctgttgtcca 4380 ccggcatctt ttccgggaac aaagatcgac taacccaatc attgaaccat ttgctgacag 4440 ctttagacac cactgatgca gatgtagcca tatactgcag ggacaagaaa tgggaaatga 4500 ctctcaagga agcagtggct aggagagaag cagtggagga gatatgcata tccgacgact 4560 cttcagtgac agaacctgat gcagagctgg tgagggtgca tccgaagagt tctttggctg 4620 gaaggaaggg ctacagcaca agcgatggca aaactttctc atatttggaa gggaccaagt 4680 ttcaccaggc ggccaaggat atagcagaaa ttaatgccat gtggcccgtt gcaacggagg 4740 ccaatgagca ggtatgcatg tatatcctcg gagaaagcat gagcagtatt aggtcgaaat 4800 gccccgtcga agagtcggaa gcctccacac cacctagcac gctgccttgc ttgtgcatcc 4860 atgccatgac tccagaaaga gtacagcgcc taaaagcctc acgtccagaa caaattactg 4920 tgtgctcatc ctttccattg ccgaagtata gaatcactgg tgtgcagaag atccaatgct 4980 cccagcctat attgttctca ccgaaagtgc ctgcgtatat tcatccaagg aagtatctcg 5040 tggaaacacc accggtagac gagactccgg agccatcggc agagaaccaa tccacagagg 5100 ggacacctga acaaccacca cttataaccg aggatgagac caggactaga acgcctgagc 5160 cgatcatcat cgaagaggaa gaagaggata gcataagttt gctgtcagat ggcccgaccc 5220 accaggtgct gcaagtcgag gcagacattc acgggccgcc ctctgtatct agctcatcct 5280 ggtccattcc tcatgcatcc gactttgatg tggacagttt atccatactt gacaccctgg 5340 agggagctag cgtgaccagc ggggcaacgt cagccgagac taactcttac ttcgcaaaga 5400 gtatggagtt tctggcgcga ccggtgcctg cgcctcgaac agtattcagg aaccctccac 5460 atcccgctcc gcgcacaaga acaccgtcac ttgcacccag cagggcctgc tcgagaacca 5520 gcctagtttc caccccgcca ggcgtgaata gggtgatcac tagagaggag ctcgaggcgc 5580 ttaccccgtc acgcactcct agcaggtcgg tctcgagaac cagcctggtc tccaacccgc 5640 caggcgtaaa tagggtgatt acaagagagg agtttgaggc gttcgtagca caacaacaat 5700 gacggtttga tgcgggtgca tacatctttt cctccgacac cggtcaaggg catttacaac 5760 aaaaatcagt aaggcaaacg gtgctatccg aagtggtgtt ggagaggacc gaattggaga 5820 tttcgtatgc cccgcgcctc gaccaagaaa aagaagaatt actacgcaag aaattacagt 5880 taaatcccac acctgctaac agaagcagat accagtccag gaaggtggag aacatgaaag 5940 ccataacagc tagacgtatt ctgcaaggcc tagggcatta tttgaaggca gaaggaaaag 6000 tggagtgcta ccgaaccctg catcctgttc ctttgtattc atctagtgtg aaccgtgcct 6060 tttcaagccc caaggtcgca gtggaagcct gtaacgccat gttgaaagag aactttccga 6120 ctgtggcttc ttactgtatt attccagagt acgatgccta tttggacatg gttgacggag 6180 cttcatgctg cttagacact gccagttttt gccctgcaaa gctgcgcagc tttccaaaga 6240 aacactccta tttggaaccc acaatacgat cggcagtgcc ttcagcgatc cagaacacgc 6300 tccagaacgt cctggcagct gccacaaaaa gaaattgcaa tgtcacgcaa atgagagaat 6360 tgcccgtatt ggattcggcg gcctttaatg tggaatgctt caagaaatat gcgtgtaata 6420 atgaatattg ggaaacgttt aaagaaaacc ccatcaggct tactgaagaa aacgtggtaa 6480 attacattac caaattaaaa ggaccaaaag ctgctgctct ttttgcgaag acacataatt 6540 tgaatatgtt gcaggacata ccaatggaca ggtttgtaat ggacttaaag agagacgtga 6600 aagtgactcc aggaacaaaa catactgaag aacggcccaa ggtacaggtg atccaggctg 6660 ccgatccgct agcaacagcg tatctgtgcg gaatccaccg agagctggtt aggagattaa 6720 atgcggtcct gcttccgaac attcatacac tgtttgatat gtcggctgaa gactttgacg 6780 ctattatagc cgagcacttc cagcctgggg attgtgttct ggaaactgac atcgcgtcgt 6840 ttgataaaag tgaggacgac gccatggctc tgaccgcgtt aatgattctg gaagacttag 6900 gtgtggacgc agagctgttg acgctgattg aggcggcttt cggcgaaatt tcatcaatac 6960 atttgcccac taaaactaaa tttaaattcg gagccatgat gaaatctgga atgttcctca 7020 cactgtttgt gaacacagtc attaacattg taatcgcaag cagagtgttg agagaacggc 7080 taaccggatc accatgtgca gcattcattg gagatgacaa tatcgtgaaa ggagtcaaat 7140 cggacaaatt aatggcagac aggtgcgcca cctggttgaa tatggaagtc aagattatag 7200 atgctgtggt gggcgagaaa gcgccttatt tctgtggagg gtttattttg tgtgactccg 7260 tgaccggcac agcgtgccgt gtggcagacc ccctaaaaag gctgtttaag cttggcaaac 7320 ctctggcagc agacgatgaa catgatgatg acaggagaag ggcattgcat gaagagtcaa 7380 cacgctggaa ccgagtgggt attctttcag agctgtgcaa ggcagtagaa tcaaggtatg 7440 aaaccgtagg aacttccatc atagttatgg ccatgactac tctagctagc agtgttaaat 7500 cattcagcta cctgagaggg gcccctataa ctctctacgg ctaacctgaa tggactacga 7560 catagtctag tccgccaagg ccaccatgga actgctgatc ctgaaggcca acgccatcac 7620 caccatcctg accgccgtga ccttctgctt cgccagcggc cagaacatca ccgaggaatt 7680 ctaccagagc acctgtagcg ccgtgtccaa gggctacctg ggcgccctga gaaccggctg 7740 gtacaccagc gtgatcacca tcgagctgag caacatcaag gaaatcaagt gcaacggcac 7800 cgacgccaag gtcaagctga tcaagcagga actggacaag tacaagaacg ccgtgaccga 7860 gctgcagctg ctgatgcaga gcacccccgc caccaacaac cgggccagac gcgagctgcc 7920 ccggttcatg aactacaccc tgaacaacgc caaaaagacc aacgtgaccc tgagcaagaa 7980 gcggaagcgg cggttcctgg gcttcctgct gggcgtgggc agcgccattg cttctggcgt 8040 ggccgtgtct aaggtgctgc acctggaagg cgaagtgaac aagatcaaga gcgccctgct 8100 gagcaccaac aaggccgtgg tgtccctgag caacggcgtg tccgtgctga ccagcaaggt 8160 gctggatctg aagaactaca tcgacaagca gctgctgccc atcgtgaaca agcagagctg 8220 cagcatcccc aacatcgaga cagtgatcga gttccagcag aagaacaacc ggctgctgga 8280 aatcacccgc gagttcagcg tgaacgccgg cgtgaccacc cccgtgtcca cctacatgct 8340 gaccaacagc gagctgctga gcctgatcaa cgacatgccc atcaccaacg accagaaaaa 8400 gctgatgagc aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagagc tactccatca tgagcatcat 8460 caaagaagag gtgctggcct acgtggtgca gctgcccctg tacggcgtga tcgacacccc 8520 ctgctggaag ctgcacacca gccccctgtg caccaccaac accaaagagg gcagcaacat 8580 ctgcctgacc cggaccgacc ggggctggta ctgcgataat gccggctcag tctcattctt 8640 tccacaggcc gagacatgca aggtgcagag caaccgggtg ttctgcgaca ccatgaacag 8700 cctgaccctg ccctccgaag tgaacctgtg caacgtggac atcttcaacc ctaagtacga 8760 ctgcaagatc atgacctcca agaccgacgt gtccagctcc gtgatcacct ccctgggcgc 8820 catcgtgtcc tgctacggca agaccaagtg caccgccagc aacaagaacc ggggcatcat 8880 caagaccttc agcaacggct gcgactacgt gtccaacaag ggggtggaca ccgtgtccgt 8940 gggcaacacc ctgtactacg tgaacaaaca ggaaggcaag agcctgtacg tgaagggcga 9000 gcccatcatc aacttctacg accccctggt gttccccagc gacgagttcg acgccagcat 9060 cagccaggtc aacgagaaga tcaaccagag cctggccttc atcagaaaga gcgacgagct 9120 gctgcacaat gtgaatgccg tgaagtccac caccaatatc atgatcacca caatcatcat 9180 cgtgatcatc gtcatcctgc tgtccctgat cgccgtgggc ctgctgctgt actgcaaggc 9240 cagatccacc cctgtgaccc tgtccaagga ccagctgagc ggcatcaaca atatcgcctt 9300 ctccaactaa taatatgtta cgtgcaaagg tgattgtcac cccccgaaag accatattgt 9360 gacacaccct cagtatcacg cccaaacatt tacagccgcg gtgtcaaaaa ccgcgtggac 9420 gtggttaaca tccctgctgg gaggatcagc cgtaattatt ataattggct tggtgctggc 9480 tactattgtg gccatgtacg tgctgaccaa ccagaaacat aattgaatac agcagcaatt 9540 ggcaagctgc ttacatagaa ctcgcggcga ttggcatgcc gccttaaaat ttttatttta 9600 tttttctttt cttttccgaa tcggattttg tttttaatat ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa 9660 aaaaaaaaaa aaaaaa 9676

Claims (22)

  1. 면역반응을 이를 필요로 하는 인간 대상체 내에서 유도하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 인간 대상체에 투여하는 단계, 및
    b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 약학적 허용염과 함께 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    이에 따라 인간 대상체 내에서 유도된 면역 반응을 얻으며, 상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IVT repRNA을 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 IVT repRNA를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 유도된 항체 면역 반응을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체 내에서 상기 제1 및 제2 항원성 단백질이 공통으로 가지는 적어도 하나의 항원결정인자에 대한 유도된 세포 면역 반응을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유도된 면역 반응은 상기 인간 대상체에 제1 및 제2 항원성 단백질 중 적어도 하나에 관련된 질병에 대한 보호 면역성을 제공하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IVT repRNA는 베네주엘라 이콰인 뇌염(Venezuelan equine encephalitis, VEE) 바이러스 기반 repRNA인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26(Ad26) 벡터 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 35 (Ad35) 벡터인, 방법
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 1-52 주 후에 투여되는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물이 투여되고 적어도 1 주 후에 투여되는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 병원체 또는 종양으로부터 유래된 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 바이러스로부터 유래된 것인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일한 것인, 방법.
  14. 인간 대상체 내의 면역 반응을 유도하기 위한 조합물로서, 상기 조합물은:
    a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제1 조성물, 및
    b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제2 조성물을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물인, 조합물.
  15. 인간 대상체 내의 면역 반응을 유도하기 위한 의약의 제조를 위한 조합물의 용도로서:
    a. 제1 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내 전사된(IVT) 자가 복제 RNA(repRNA)의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제1 조성물, 및
    b. 제2 항원성 단백질 또는 그 면역원적 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 면역학적 유효량과 약학적 허용염을 함께 포함하는 제2 조성물을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 적어도 하나의 항원결정인자를 공통으로 가지고, 상기 조성물 중 하나는 프라이밍 조성물이고 나머지 조성물은 부스팅 조성물인, 조합물.
  16. 제14항의 조합물 또는 제15항의 용도에 있어서,
    상기 IVT repRNA을 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물인, 조합물 또는 용도.
  17. 제14항의 조합물 또는 제15항의 용도에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 프라이밍 조성물이고 상기 IVT repRNA를 포함하는 조성물은 부스팅 조성물인, 조합물 또는 용도.
  18. 제14항의 조합물 또는 제15항의 용도에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 병원체 또는 종양으로부터 유래된 것인, 조합물 또는 용도.
  19. 제14항의 조합물 또는 제15항의 용도에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 항원성 단백질은 바이러스로부터 유래된 것인, 조합물 또는 용도.
  20. 제14항의 조합물 또는 제15항의 용도에 있어서,
    상기 제1 및 제2 항원성 단백질은 동일 또는 실질적으로 동일한 것인, 조합물 또는 용도.
  21. 제14항의 조합물 또는 제15항의 용도에 있어서,
    상기 IVT repRNA는 VEE 바이러스 기반 repRNA인, 조합물 또는 용도.
  22. 제14항의 조합물 또는 제15항의 용도에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 Ad26 벡터 또는 Ad35 벡터인, 조합물 또는 용도.
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