JP2020528911A - 異種ｒｅｐＲＮＡ免疫化のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

ヒトにおいて免疫原に対して免疫応答を誘導するための組成物および方法が記載される。誘導される免疫応答は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）およびアデノウイルスベクターの異種プライム−ブーストの組合せを投与することによって得られる。組成物および方法は、ヒトにおいてウイルス感染症またはがんなどの疾患に対して防御免疫を提供するために使用することができる。【選択図】図１

Description

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本出願は、作成日が２０１７年７月２６日であり、サイズが約２３，０４５バイトである「ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名のＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ−ウェブを通して電子的に提出される配列表を含む。ＥＦＳ−ウェブを通して同時に提出される配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、ヒト対象において免疫応答を誘導するための方法および組成物に関する。詳細には、誘導される免疫応答は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）およびアデノウイルスベクターの異種プライム−ブーストの組合せを投与することによって得られる。本方法および組成物は、ヒト対象における免疫原に対する体液性および細胞性の免疫応答の強力な誘導を提供し、それは、ヒト対象において腫瘍または感染性疾患などの疾患に対して有効な治療および／または保護を提供するために使用することができる。

ウイルス、細菌、真菌または原生動物などの病原体ならびにがんに対して免疫保護を提供するために、ワクチンを使用することができる。

感染性疾患は心血管疾患に次いで世界中で第２の主要な死因であるが、小児および子供においては主要な死因である（Lee and Nguyen, 2015, Immune Network, 15(2):51-7）。ワクチン接種は、様々な感染性疾患を予防するための最も効率的なツールである。ワクチン接種の目標は、感染に対して長期持続保護を提供する病原体特異的免疫応答を生成することである。ワクチンの顕著な奏効にもかかわらず、新しい病原体の出現、古い病原体の再出現および既存のワクチンによって付与される最適以下の保護のために、安全で強力なワクチンの開発がなお必要とされる。近年の重要な出現または再出現した疾患には、以下のものが含まれる：２００３年の重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、２００９年のＨ１Ｎ１インフルエンザの世界的流行病および２０１４年のエボラウイルス。結果として、新興疾患に対する新規で有効なワクチンの開発の必要性がある。

西欧世界で、がんは主要な死因の１つであり、肺、乳房、前立腺および結腸直腸がんが最も一般的である（Butterfield, 2015, BMJ, 350:h988）。手術、化学療法、放射線療法および小分子シグナル伝達経路阻害剤による治療を含む、がん治療へのいくつかの臨床アプローチが利用可能である。これらの標準アプローチの各々は、腫瘍の中で腫瘍抗原の発現を増加させるか、または瀕死の腫瘍細胞からの抗原の放出を引き起こすことによって、および治療的有益性のために抗腫瘍免疫を促進することによって、抗腫瘍免疫をモジュレートすることが示されている。免疫療法は、がんの治療のための代替方法を提供する有望な分野である。がんワクチンは、腫瘍特異的免疫応答、特に腫瘍抗原に特異的である細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を促進するように設計される。がんワクチンが伝統的ながん治療の有効な代替手段または補完手段になるために、臨床効能を向上させなければならない。臨床的に有効ながんワクチンの基本的な必要条件をより良く理解するために、かなりの取り組みがこれまで行われてきた。近年のデータは、重要な必要条件が、とりわけ、（１）おそらく異なる腫瘍抗原に由来する多重エピトープ免疫原の使用；（２）有効なアジュバントの選択；（３）がんワクチンと腫瘍微小環境に存在する調節環境に対抗することができる薬剤との関連；および（４）異なる抗原製剤を比較する正確な予備試験の後にワクチンの確定的製剤およびレジメンを選択する必要性であることを強調する（Fenoglio et al., 2013, Hum Vaccin Immunother, (12):2543-7）。これらの必要条件に対処するために、免疫学的および臨床上の効能を備えた新世代のがんワクチンが必要である。

核酸ベースのワクチンの潜在能力が、長年研究されてきた（Vogel and Sarver N, 1995, Clin Microbiol Rev., 8(3):406-10）。現在、狂犬病ウイルスなどのウイルス標的に対するｍＲＮＡベースのワクチンの治験を含めて、ＤＮＡベースのワクチンまたはｍＲＮＡベースのワクチンを使用して治験が行われている（例えば、clinicaltrials.govのワールドワイドウェブ；Alberer et al., The Lancet, published online July 2017、dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31665-3のワールドワイドウェブ；DeFrancesco et al., Nature Biotechnology, 35: 193-197を参照）。

次世代のｍＲＮＡベースのワクチンは、アルファウイルスなどのプラスセンスＲＮＡウイルスの自己複製機構に基づく、自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）を利用する（例えば、Bogers et al., 2015, J Infect Dis., 211(6):947-55を参照）。そのようなｒｅｐＲＮＡは宿主の中の広範囲の組織において一時的な高レベルの抗原発現を誘導し、分裂および非分裂細胞の両方において作用することができる。

アルファウイルスはトガウイルス科に属し、それらは、それら自身のプロモーターを各々有する２つの機能的セグメントを含む、線状一本鎖のプラスセンスＲＮＡゲノムを有する。ゲノムの５’末端に位置する第１のセグメントは、マイナス鎖のＲＮＡゲノム、プラス鎖のＲＮＡゲノムおよびサブゲノムのＲＮＡを合成する自己集合レプリカーゼを構成する、非構造タンパク質をコードする。第２のセグメントは、構造的エンベロープおよびカプシドタンパク質をコードする。アルファウイルスレプリコンとも呼ばれる自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）は、レプリコンが細胞の中で複製することが可能であるが、ウイルスとして増殖することができないように、構造タンパク質をコードする遺伝子が除去された完全長ウイルスに由来する核酸である。ｒｅｐＲＮＡベースの抗原発現系の場合、抗原をコードする遺伝子は、構造タンパク質をコードする遺伝子の代わりに、サブゲノムのプロモーターの下流に挿入することができる。ＲｅｐＲＮＡは細胞にＤＮＡ分子として送達することができ、それからｒｅｐＲＮＡが送り出され、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の中に、または裸の改変されたもしくは未改変のＲＮＡ分子としてパッケージされる。

ｒｅｐＲＮＡベースのワクチンの研究はまだ前臨床段階にあるが、治験は数年以内に始まると予想される。ＤＮＡから送り出されたかウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）にパッケージされたｒｅｐＲＮＡを、異種プライム−ブーストワクチン接種の形でアデノウイルスベクターと組み合わせることは、免疫応答を刺激することを研究は示している（例えば、ＷＯ２００５０４６６２１；Zhao et al., 2009, Vet Immunol Immunopathol., 131:158-166；およびNaslund et al., 2007, J Immunol, 178:6761-6769を参照）。さらに、ｒｅｐＲＮＡベースのワクチンによって誘導される体液性応答は、タンパク質ベースのワクチンでブーストすることができることが示されている（Bogers et al.、同上）。

しかし、ｒｅｐＲＮＡが送り出されるＤＮＡプラスミドと組み合わせたアデノウイルスベクターを使用した異種ワクチン接種は、いくつかの課題を有する。例えば、ＤＮＡプラスミドは、細菌の生産からの汚染、宿主ゲノムへのＤＮＡの組入れのリスクおよび抗原の自己制限性発現の欠如などの安全性の問題と関連する。他方、ＶＲＰから送り出されるｒｅｐＲＮＡと組み合わせたアデノウイルスベクターを使用した異種ワクチン接種は、ＶＲＰを生成するためにパッケージング細胞系を必要とするが、それは複雑な製造課題を有する高コストで時間のかかる方法である。ｒｅｐＲＮＡと組み合わせたタンパク質ベースのワクチンの使用は、タンパク質ベースのワクチンが、汚染のリスクを伴うタンパク質の高コストで時間のかかる細胞ベースの生成を必要とするという限界を有する。さらに、ほとんどのタンパク質ベースのワクチンは安定性の問題があり、コールドチェーンを必要とし、一般にタンパク質ベースのワクチンは体液性免疫応答の刺激に限定される。

したがって、特に世界的流行の発生の場合に速い応答が必要とされる際に、免疫原に対して保護的な体液性および細胞性の免疫を誘導するために使用することができる、ｒｅｐＲＮＡ技術に基づく改善されたワクチンの必要性が当技術分野にある。そのようなワクチンは、生産のための費用効果がよく、最小限の有害作用を有するであろう。それらは、さらに好ましくは多様な抗原に対して有効であろう。

本発明は、２つの異なるワクチンのプラットホーム、すなわち、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ｍＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）、および（ｉｉ）アデノウイルスベクターベースのワクチンを使用した異種プライム−ブーストの免疫化レジメンを提供することによって、この必要性を満たす。

そのいくつかは上で議論されるＤＮＡベースのワクチン、ＶＲＰにパッケージされたワクチンおよびタンパク質ベースのワクチンの使用に関連した問題が、速く、一般的な無細胞生産プロセスによって生産することができる無ＤＮＡ製品である、ｒｅｐＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ生産を使用して回避することができることが見出されている（Kallen and Thess, 2014, Ther Adv Vaccines, 2(1) 10-31）。本発明者らは、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを異種プライム−ブーストの免疫化レジメンの形でアデノウイルスベクターと組み合わせることが、アデノウイルスベクターまたはＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡによる単一のまたは同種のプライム−ブースト免疫化からもたらされるものより強力である、体液性および細胞性の免疫応答の誘導をもたらすことを予想外にも見出した。したがって、本発明は、広範囲の標的に対する高度に強力なワクチンを生成するために使用することができる。

１つの一般的な態様では、本発明は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターの組合せを含む異種プライム−ブースト免疫化を施すことによって、ヒト対象において免疫応答を誘導する方法に関する。

本発明のある特定の実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターの異種プライム−ブーストの組合せは、ヒト対象において抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドに対して誘導された免疫応答を生成する。抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、任意の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドであってよい。例えば、抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、原生動物、またはがん、例えば腫瘍に由来し得る。

したがって、本発明の１つの一般的な態様は、それを必要とするヒト対象において免疫応答を誘導する方法であって、
ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）の免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物をヒト対象に投与する工程、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を対象に投与する工程を含み、
ここで、組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物であり、
そのことによって、ヒト対象において誘導された免疫応答が得られ、第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有する、方法に関する。

本発明の別の一般的な態様は、ヒト対象において免疫応答を誘導するための組合せであって、
ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を含み、
組成物の１つは免疫応答をプライミングするためにヒト対象に投与され、他の組成物は免疫応答をブーストするためにヒト対象に投与され、
第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有する、組合せに関する。

本発明の別の一般的な態様は、ヒト対象において免疫応答を誘導するための、本発明の実施形態による組合せの使用に関する。

本発明の好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む組成物はプライミング組成物であり、アデノウイルスベクターを含む組成物はブースト組成物である。

本発明の好ましい実施形態では、誘導された免疫応答は、ヒト対象において第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に対して誘導された体液性、または抗体免疫応答を含む。そのような応答は、例えば、高い割合の応答体、例えば酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイによって判定される、試験対象の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または１００％の存在によって特徴付けることができる。

本発明の好ましい実施形態では、誘導された免疫応答は、ヒト対象において第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に対して誘導された細胞性免疫応答を含む。

本発明の一実施形態では、本方法によって生じる増強された免疫応答は、ヒト対象における第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に対する、増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。そのような応答は、例えば、高い割合のＣＤ８＋応答体、例えば酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）または細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによって判定される、試験対象の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または１００％の存在によって特徴付けることができる。本発明の別の実施形態では、本方法によって生じる増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に特異的である多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加または誘導を含む。そのような多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、複数のサイトカイン、例えば２つ以上のＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−アルファを発現する。

本発明の一実施形態では、本方法によって生じる増強された免疫応答は、ヒト対象における第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に対する、増強されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。そのような応答は、例えば、高い割合のＣＤ４＋応答体、例えばＥＬＩＳＰＯＴまたはＩＣＳアッセイによって判定される、試験対象の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または１００％の存在によって特徴付けることができる。本発明の別の実施形態では、本方法によって生じる増強されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に特異的である多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の増加または誘導を含む。そのような多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、複数のサイトカイン、例えば２つ以上のＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−アルファを発現する。

本発明の好ましい実施形態では、誘導された免疫応答は、ヒト対象における第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に対する、誘導された抗体応答、誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答、および誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。

好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスベースのｒｅｐＲＮＡである。好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ骨格は、Frolov et al.（1999, J Virol., 73(5):3854-65）によって記載されるものの１つである。好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ骨格は、ＲＳＶ ｐｒｅ−Ｆタンパク質挿入物のない配列番号３の骨格配列である。

好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）ベクターまたは組換えヒトアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである。

本発明の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１〜５２週後に投与される。本発明の一実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２〜５２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４〜５２週後に投与される。本発明の一実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから８週後に投与される。本発明のさらなる実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから６、１０、１２、１４、１６、２０、２４またはそれよりも多い週の後に投与される。

本発明の実施形態では、第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、病原体、例えばウイルス、細菌、真菌または原生動物に由来する。好ましい実施形態では、第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、ウイルスに由来する。本発明の別の実施形態では、抗原性タンパク質はがんに由来する。好ましい実施形態では、第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、腫瘍に由来する。

本発明の一実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、同じ抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする。本発明の別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、同じ抗原性タンパク質の異なる免疫原性ポリペプチドまたはエピトープをコードする。本発明のさらに別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、異なるが関連した抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする。例えば、関連した抗原性タンパク質は、同じ抗原性タンパク質に由来する実質的に類似のタンパク質、または同じ病原体もしくは腫瘍に由来する異なる抗原性タンパク質であってよい。

好ましい実施形態では、第１および第２の抗原性タンパク質は同一であるかまたは実質的に同一である。

本発明の実施形態では、本発明の方法は、ヒト対象に腫瘍または感染性疾患などの抗原性タンパク質に関連した疾患に対する防御免疫を提供する。好ましい一実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターのプライム−ブーストの組合せは、ヒト対象における腫瘍に対して防御免疫応答を誘導する。別の好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターのプライム−ブーストの組合せは、ヒト対象における病原体に対して免疫応答を誘導する。

好ましい実施形態では、第１または第２の抗原性タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルスからの融合前Ｆタンパク質（ＲＳＶ−ｐｒｅＦ）に由来し、第１および第２の抗原性タンパク質は同一であるかまたは実質的に同一である。

好ましい実施形態では、第１および第２の抗原性タンパク質は、配列番号１、配列番号２、その免疫原性ポリペプチドおよびその組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を各々独立して含む。

好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、ＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質に由来する抗原性タンパク質をコードする核酸を含む。好ましくは、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、配列番号１、配列番号２のアミノ酸配列、またはその免疫原性ポリペプチドもしくは抗原決定基を有する抗原性タンパク質をコードする核酸を含む。最も好ましくは、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、配列番号３の核酸配列を含む。

上の概要ならびに本発明の以下の詳細な記載は、添付された図と一緒に読む場合により良く理解される。本発明は、図に示す正確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。

ＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質をコードするＶＥＥウイルスベースのｒｅｐＲＮＡの模式図を示す図である。 分析をＥＬＩＳＡによって行った同種ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ免疫化研究の実験計画を示す図である。 ＥＬＩＳＡによって評価した、同種ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ免疫化研究からのＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質特異的体液性免疫応答を示す図である。 分析をＥＬＩＳＰＯＴによって行った同種ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ免疫化研究の実験計画を示す図である。 ＰＢＭＣおよびＲＳＶ−ＦからのＣＴＬ活性化ペプチドＫＹＫＮＡＶＴＥＬを使用したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した、同種ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ免疫化研究からのＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質特異的Ｔ細胞応答を示す図である。 分析をＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴによって行った異種ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクター免疫化研究の実験計画を示す図である。 ＥＬＩＳＡによって評価した、異種ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクター免疫化研究からのＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質特異的体液性免疫応答を示す図である。 脾細胞を使用したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した、異種ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクター免疫化研究からのＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質特異的Ｔ細胞応答を示す図である。

様々な刊行物、論文および特許が、背景技術でおよび明細書全体で引用または記載され、これらの参考文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明の状況を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの事項の任意の部分または全部が、開示または請求されるいかなる発明に関しても先行技術の一部を形成することを承認するものでない。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。あるいは、本明細書で使用されるある特定の用語は、本明細書に示す意味を有する。本明細書で引用される全ての特許、公開特許出願および刊行物は、本明細書に完全に示されているように参照により組み込まれる。本明細書および添付の請求項で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれることに留意する必要がある。

別途指示がない限り、一連の要素の前の用語「少なくとも」は、その連続物の中のすべての要素を指すと理解すべきである。当業者は、単に慣例的な実験操作を使用して、本明細書に記載される発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができる。そのような同等物は、本発明に包含されるものである。

文脈上特に必要がない限り、本明細書および以下の請求項全体で、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明示される整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群が含まれることを意味するが、いかなる他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群も除外されることを意味しないものと理解される。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」で、または場合によって、本明細書で使用する場合、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」で置換することができる。本明細書で使用する場合、「からなる」は、請求要素に指定されていないいかなる要素、ステップまたは成分も排除する。本明細書で使用する場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的で新規な特徴に実質的に影響しない材料もステップも排除しない。本明細書の各場合に、用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。

本明細書で使用する場合、複数の列挙された要素の間の接続詞「および／または」は、個々のおよび組み合わせたオプションの両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって結合される場合、第１のオプションは第２のない第１の要素の適用性を指す。第２のオプションは、第１のない第２の要素の適用性を指す。第３のオプションは、一緒にした第１および第２の要素の適用性を指す。これらのオプションの任意の１つはこの意味に入り、したがって、本明細書で使用される用語「および／または」の必要条件を満たすと理解される。複数のオプションの同時適用性もこの意味に入り、したがって、用語「および／または」の必要条件を満たすと理解される。

本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態による方法によって治療されるか治療された、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、限定されずに、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒト等、より好ましくはヒトが含まれる。

防御免疫は、先天性および適応性の両方の免疫応答に依存する。本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」は、本発明の方法によって対象に投与された、抗原に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の対象における発達を指す。「体液性」免疫応答は、Ｂ細胞による抗体の生成を指し、「細胞性」免疫応答は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞およびヘルパーＴ細胞としても知られるＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、体液性および細胞性の免疫応答の両方において重要な役割を果たす。

本明細書で使用する場合、用語「誘導する」または「刺激する」およびその変化形は、細胞活性における任意の測定可能な増加を指す。免疫応答の誘導は、例えば、サイトカインおよび／または増加した免疫機能の別の指標の生成を増加させる、免疫細胞集団の活性化、増殖または成熟を含むことができる。ある特定の実施形態では、免疫応答の誘導は、Ｂ細胞の増殖を増加させること、抗原特異的抗体を生成すること、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を増加させること、樹状細胞抗原提示を向上させることおよび／またはある特定のサイトカイン、ケモカインおよび同時刺激マーカーの発現を増加させることを含むことができる。

本明細書で使用する場合、用語「誘導された抗体応答」または「誘導された体液性免疫応答」は、本発明によるｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターのプライム−ブーストの組合せを投与したヒト対象における抗体応答を指し、それは、同じプライム−ブーストレジメンを使用した同等の投薬量での単独のｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターのいずれかの同種プライム−ブースト免疫化を投与したヒト対象から観察される対応した免疫応答に対して、少なくとも１．５、２、２．５倍またはそれより多く増加する。

本明細書で使用する場合、用語「誘導された細胞性免疫応答」は、本発明によるｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターのプライム−ブーストの組合せを投与したヒト対象における細胞性免疫応答を指し、それは、同じプライム−ブーストレジメンを使用した同等の投薬量での単独のｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターのいずれかの同種プライム−ブースト免疫化を投与したヒト対象から観察される対応した免疫応答に対して、少なくとも１．５、２、２．５倍またはそれより多く増加する。

本明細書で使用する場合、用語「防御免疫」または「防御免疫応答」は、ワクチン接種をした対象が、それに対してワクチン接種を行った抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドに関連した感染症または疾患を制御することができることを意味する。通常、防御免疫応答を起こした対象は、軽度から中等度の臨床症状だけを起こすかまたは症状を全く起こさない。通常、ある特定の抗原性タンパク質に対して防御免疫応答または防御免疫を有する対象は、抗原性タンパク質に関連した感染症または疾患の結果として死亡することはない。

本明細書で使用する場合、用語「免疫学的有効量」は、対象において所望の生物学的または医薬的応答を導き出す有効成分または構成成分の量を指す。明記された目的に関して、免疫学的有効量は経験的に、および慣例的な様式で決定することができる。例えば、最適な投薬量範囲の特定を助けるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを適宜用いることができる。特定の有効用量の選択は、治療または予防する疾患、付随する症状、患者の体量、患者の免疫状態および当業者に公知の他の因子を含む、いくつかの因子を考慮することにより当業者が決定することができる（例えば、治験を通して）。製剤で用いられる正確な用量は、投与経路および疾患の重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の状況によって決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系から導かれる用量反応曲線から推定することができる。

本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」は、ＲＮＡが、例えば細胞抽出物または単離された酵素を使用して、無細胞様式でｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて酵素的に合成される方法を指す。

本明細書で使用する場合、用語「自己複製ＲＮＡ」、「自己複製レプリコンＲＮＡ」または「ｒｅｐＲＮＡ」または「ＲＮＡレプリコン」は、それが後代ウイルスを生成することなく、細胞の中でそれ自身の複製増幅を誘導することができるように、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を発現するＲＮＡ分子を指す。例えば、ｒｅｐＲＮＡは、５’および３’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質のためのコード配列、抗原をコードする異種遺伝子、および抗原を発現するための手段、およびポリアデニル化域を含むことができる。本発明のｒｅｐＲＮＡは、弱毒化突然変異または機能を向上させる突然変異などの、１つまたは複数の突然変異を含有することができる。本発明のｒｅｐＲＮＡは、改変された核酸塩基、例えば、その関連する内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０３００２０５号明細書に記載されるものを含有することができる。例えば、本発明のｒｅｐＲＮＡは、これらに限定されないが、ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）およびｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシンを含む、改変されたヌクレオシドを含有することができる。

本明細書で使用する場合、用語「抗原性タンパク質」は、脊椎動物において免疫応答を刺激することが可能であるタンパク質を指す。本明細書で使用する場合、用語「その免疫原性ポリペプチド」または「その免疫原性断片」は、免疫応答を刺激する能力を保持する抗原性タンパク質の断片を指す。本明細書で使用する場合、用語「抗原決定基」または「エピトープ」は、抗体と特異的に反応する抗原性タンパク質の領域を指す。

本明細書で使用する場合、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有ベシクル、マイクロスフェア、リポソームカプセル化、または医薬製剤で使用するための当技術分野で周知である他の材料を指す。担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定の適用のための投与経路に依存することが理解されよう。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本発明による組成物の有効性または本発明による組成物の生物学的活性に干渉しない無毒の材料を指す。特定の実施形態により、本開示を考慮して、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡベースのまたはアデノウイルスベクターベースの医薬組成物で使用するのに好適な任意の薬学的に許容される担体を、本発明において使用することができる。好適な賦形剤には、これらに限定されないが、滅菌水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せ、ならびに安定剤、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または他の好適なタンパク質および還元糖が含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「プライミング組成物」、「プライミング免疫化」または「プライム免疫化」は、本発明の第１の組成物を使用した一次抗原刺激を指す。具体的には、本明細書で使用する場合、免疫応答を「プライミングする」または「強化する」という用語は、所望の抗原に対して免疫応答を誘導し、同じ抗原による以降の再免疫化の後に所望の抗原に対してより高いレベルの免疫応答を呼び戻す、抗原を使用した第１の免疫化を指す。本明細書で使用する場合、用語「ブースト組成物」、「ブースト化免疫化」または「ブースト免疫化」は、一次免疫化の後に哺乳動物に投与される、またはそこで有効である、さらなる免疫化を指す。具体的には、本明細書で使用する場合、免疫応答を「ブーストする」という用語は、プライミング免疫化でコードされるのと同じ抗原を送達する組成物の投与を指す。

本明細書で使用する場合、用語「病原体」は、その宿主において疾患を引き起こす感染因子、例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫またはプリオンを指す。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、公知であり当業者にとって標準である配列比較アルゴリズムを使用して測定したときに、最大の一致のために比較し、整列させた場合、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定の百分率を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。

本明細書で使用する場合、抗原ポリペプチド配列に関する用語「実質的に同一である」は、参照ポリペプチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する抗原ポリペプチドを指す。核酸配列に関する用語「実質的に同一である」は、参照核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を指す。

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけで異なる場合、ポリペプチドは第２のポリペプチドと一般的に実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いとハイブリダイズすることである。

本発明において、異種プライム−ブーストの組合せ、特に、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターの組合せが、驚くべきことにヒト対象における防御免疫応答の生成に有効であることが発見される。

抗原性タンパク質
本明細書に記載されるｒｅｐＲＮＡ構築物およびアデノウイルスベクターの中に、ｒｅｐＲＮＡおよびベクターからの異種性発現のために任意の目的のＤＮＡを挿入することができる。ウイルスゲノムの中への発現可能な形での挿入のための外来遺伝子は、本開示を考慮して所望の遺伝子を単離するための従来の技術を使用して得ることができる。ＤＮＡゲノムを含有する生物体では、目的の抗原をコードする遺伝子は、ゲノムＤＮＡから単離することができ、ＲＮＡゲノムを有する生物体では、所望の遺伝子は、ゲノムのｃＤＮＡコピーから単離することができる。抗原性タンパク質は、例えば、抗原性応答、遺伝子発現等を最適化するために、天然に存在する配列に基づいて改変される組換えＤＮＡによってコードされてもよい。

本発明のある特定の実施形態では、ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスのプライム−ブーストの組合せは、ヒト対象において抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドに対して誘導された免疫応答を生成する。抗原性タンパク質は、感染症または疾患に関係した任意の抗原性タンパク質であってよい。

本発明の実施形態により、抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、病原体、例えばウイルス（例えば、フィロウイルス、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、デングウイルス、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ−リンホトロピックウイルス、インフルエンザウイルス、ＪＣウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、はしかウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、おたふくかぜウイルス、ノロウイルス、パロウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルス等）、細菌（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、大腸菌（Escherichia coli）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、サルモネラ菌、赤痢菌、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、連鎖球菌等）、真菌（例えば、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・ダーマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、カンジダ属（Candida）の種、アスペルギルス属（Aspergillus）の種等）、原生動物（例えば、プラスモディウム、レーシュマニア、トリパノゾーム、クリプトスポリジウム、イソスポラ、ネグレリア・ファウレリ（Naegleria fowleri）、アカントアメーバ、バラムチア・マンドリラリス（Balamuthia mandrillaris）、トキソプラズマ・ゴンジ（Toxoplasma gondii）、ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）等）、またはがん（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸および直腸がん、子宮体がん、腎臓がん、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん等）から単離することができる、またはそれらに由来し得る。

本発明の実施形態により、抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、がんなどの腫瘍から単離することができる、またはそれらに由来し得る。

一部の実施形態では、核酸は、抗原性タンパク質全体ではなく抗原性ドメインを発現する。これらの断片は、免疫原性または抗原性であるのに十分である任意の長さであってよい。断片は、長さが少なくとも４アミノ酸、好ましくは８〜２０アミノ酸であってよいが、より長くてもよく、例えば１００、２００、６６０、８００、１０００、１２００、１６００、２０００アミノ酸長、またはそれ以上等、またはそれらの間の任意の長さであってもよい。

当業者は、抗原性タンパク質をコードする核酸分子が改変されてもよいこと、例えば、本明細書に示す核酸分子は、改変された発現タンパク質が病原体または疾患に対して免疫応答を導き出す限り、突然変異されてもよいことを認める。したがって、本明細書で使用する場合、用語「抗原性タンパク質」は、上記の病原体または腫瘍の少なくとも１つの抗原決定基を含むタンパク質を指す。抗原性タンパク質という用語は、実質的に類似している抗原性タンパク質も包含する。

ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ

本発明において有用なＲｅｐＲＮＡはアルファウイルスに由来し、それは一本鎖のプラスセンスＲＮＡウイルスである。一実施形態では、本発明において使用することができるＲｅｐＲＮＡは、７−メチルグアノシンキャップ、５’ＵＴＲ、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）ポリタンパク質Ｐ１２３４（すなわち、非構造タンパク質、ｎｓＰ）、サブゲノムのプロモーターエレメント、抗原性タンパク質が発現される目的の可変領域、３’ＵＴＲおよびポリ（Ａ）テールを含有する。

本発明において有用なＲｅｐＲＮＡは、任意の自己複製プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来することができ、例えば、ＲｅｐＲＮＡは、トガウイルス科またはアルテリウイルス科のウイルス科、例えばオーラウイルス、ババンキウイルス、バルマー森林ウイルス、ベバルウイルス、バギークリークウイルス、チクングニヤウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、エバーグレーズウイルス、フォートモーガンウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪウイルス、キジラガシウイルス、マヤロウィルス、ミドルバーグウイルス、ムカンボウイルス、ヌヅムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、ロス川ウイルス、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ユナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ワタロアウイルス、アフリカホリネズミアルテリウイルス、デブラザサルアルテリウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、キバールレッドコロブスウイルス、キバールレッドテールオナガザルウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、ミクミキイロヒヒウイルス１、ペブジャウイルス、ブタ生殖および呼吸器症候群ウイルスに由来することができる。好ましい実施形態では、本発明のｒｅｐＲＮＡは、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスに由来する。本発明の好ましいｒｅｐＲＮＡ骨格の例には、Frolov et al.、同上、によって記載されるもの、およびＲＳＶ ｐｒｅ−Ｆタンパク質挿入物のない配列番号３の骨格配列が含まれる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡの調製は当技術分野で周知であり、本発明において有用なＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを調製するために、本開示を考慮して標準のＩＶＴおよび精製手順を使用することができる。

ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの調製は、例えば、その関連する内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０３００２０５号明細書および米国特許出願公開第２０１３／０１９５９６８号明細書に記載される。例えば、ｒｅｐＲＮＡ分子は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼ等の好適なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡのＩＶＴによって調製することができる。ＩＶＴは、細菌からのプラスミドの中で作製および増殖されるｃＤＮＡ鋳型、または、例えば遺伝子合成および／もしくはＰＣＲベースの方法によって合成的に作製されるｃＤＮＡ鋳型を使用することができる。適当なキャッピング付加反応を必要に応じて使用することができ、ポリＡはＤＮＡ鋳型の中でコードすることができるか、ポリＡ反応によって加えることができる。本発明のＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡ分子を生成するために、好適な合成方法を単独で、または１つまたは複数の他の方法（例えば、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術）と組み合わせて使用することができる。新規合成に好適な方法は当技術分野で周知であり、特定の適用に適合させることができる。

一般的に、本発明において有用なＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、ｒｅｐＲＮＡを転写させることができるＤＮＡ分子を使用して生成される。したがって、本発明は、本発明のｒｅｐＲＮＡをコードする単離された核酸分子も提供する。本発明の核酸分子は、クローニングによって得られるか合成により生成される、ＲＮＡの形またはＤＮＡの形であってよい。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってよい。

本発明において有用なＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、投与のための好適な送達システムに製剤化することができる。好ましい実施形態では、本発明において有用なＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、投与のために非ビリオン粒子に製剤化される。好適な非ビリオン粒子は、例えば、その関連する内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０３００２０５号明細書および米国特許出願公開第２０１３／０１９５９６８号明細書に記載される。例えば、有用な送達システムには、リポソーム、ポリマー粒子、無毒で生分解性の微粒子、電気穿孔法、裸のＲＮＡの注入およびカチオン性のサブミクロンの水中油型乳剤が含まれる。好ましい実施形態では、本発明において有用なＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物に製剤化される（例えば、その関連する内容が参照により本明細書に組み込まれる、Semple et al., 2010, Nat Biotechnol. 28(2):172-176を参照されたい）。

本明細書で使用する場合、用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、これらに限定されないが、リポソームまたはベシクルを含む、治療用製品を送達するのに使用することができる任意の脂質組成物を指し、ここで、水性容量は両親媒性の脂質二重層によって封入されるか、または、治療用製品または脂質凝集体またはミセルを含む内部を脂質がコーティングし、ここで、脂質封入治療用製品は、比較的無秩序な脂質混合物の中に含有される。

特定の実施形態では、ＬＮＰは、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを封入するための、および／または標的細胞へのその送達を増強するための、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味正電荷を有する任意の脂質種であってよい。脂質ナノ粒子は、１つまたは複数のカチオン性脂質、非カチオン性脂質およびＰＥＧ改変脂質を用いた様々な比の多成分脂質混合物を含ませることによって調製することができる。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。例えば、本発明の組成物および方法で使用するための好適なカチオン性脂質には、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）が含まれる。

ＬＮＰ製剤は、アニオン性脂質を含むことができる。アニオン性脂質は、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味負電荷を有する任意の脂質種であってよい。アニオン性脂質は、カチオン性脂質と組み合わせたとき、ＬＮＰの全体的表面電荷を低減するために、およびＬＮＰ二層構造のｐＨ依存性破壊を導入してヌクレオチド放出を促進するために使用される。いくつかのアニオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。例えば、本発明の組成物および方法で使用するための好適なアニオン性脂質には、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が含まれる。

ＬＮＰは、本開示に照らして、当技術分野で周知である方法を使用して調製することができる。例えば、ＬＮＰは、エタノール注入または希釈、薄膜水和、凍結融解、フレンチプレスまたは膜押出、限外濾過、超音波処理、洗浄剤透析、エーテル注入および逆相蒸発を使用して調製することができる。好ましい実施形態では、本発明において有用なＬＮＰは、エタノール希釈によって調製される。

アデノウイルス
本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科に属し、好ましくは、マストアデノウイルス属に属するものである。それは、ヒトアデノウイルスだけでなく、他の種に感染するアデノウイルス、例えば、これらに限定されないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３または５）、またはサルアデノウイルス（サルアデノウイルスおよび類人猿アデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスを含む）を含む、であってもよい。好ましくは、アデノウイルスはヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶまたはＡｄＨｕ；本発明において、種の指示なしでＡｄに言及する場合、ヒトアデノウイルスを意味し、例えば、短い表記「Ａｄ５」はＨＡｄＶ５と同じものを意味し、それはヒトアデノウイルス血清型５である）、または、チンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈまたはＳＡｄＶ）などのサルアデノウイルスである。本発明において、種の指示なしでＡｄに言及する場合、ヒトアデノウイルスを意味し、例えば、短い表記「Ａｄ２６」はＨａｄＶ２６と同じものを意味し、それはヒトアデノウイルス血清型２６である。さらに、本明細書で使用する場合、表記「ｒＡｄ」は組換えアデノウイルスを意味し、例えば、「ｒＡｄ２６」は組換えヒトアデノウイルス２６を指す。

ヒトアデノウイルスを使用して最も進んだ研究が実施されており、本発明のある特定の態様によるとヒトアデノウイルスが好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスに基づく。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９または５０に基づく。本発明の特に好ましい実施形態により、アデノウイルスは血清型２６または３５のうちの１つのヒトアデノウイルスである。

これらの血清型の利点は、ヒト集団における低い血清有病率および／または低い既存の中和抗体力価、ならびに治験におけるヒト対象での使用の経験である。

サルアデノウイルスもヒト集団において低い血清有病率および／または低い既存の中和抗体力価を一般的に有し、チンパンジーアデノウイルスベクターを使用したかなりの数の研究が報告されている（例えば、米国特許第６０８３７１６号；ＷＯ２００５／０７１０９３；ＷＯ２０１０／０８６１８９；ＷＯ２０１００８５９８４；Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17；Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849- 62によるレビュー：およびLasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39によるレビューも参照されたい）。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスに基づく。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルスの１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０またはＳＡ７Ｐの型に基づく。

アデノウイルスベクターｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５
本発明による好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、２つの稀な血清型：Ａｄ２６およびＡｄ３５からのカプシドタンパク質を含む。一般的な実施形態では、ベクターは、ｒＡｄ２６またはｒＡｄ３５ウイルスである。

したがって、本発明において使用することができるベクターは、Ａｄ２６またはＡｄ３５カプシドタンパク質（例えば、繊維、ペントンまたはヘキソンタンパク質）を含む。当業者は、本発明のベクターにおいてＡｄ２６またはＡｄ３５カプシドタンパク質全体を使用する必要性がないことを認める。したがって、Ａｄ２６またはＡｄ３５カプシドタンパク質の少なくとも一部を含むキメラカプシドタンパク質を、本発明のベクターにおいて使用することができる。本発明のベクターは、少なくとも１つのカプシドタンパク質がＡｄ２６またはＡｄ３５に由来する限り、繊維、ペントンおよびヘキソンタンパク質の各々が異なる血清型に由来するカプシドタンパク質を含むこともできる。好ましい実施形態では、繊維、ペントンおよびヘキソンタンパク質は、各々Ａｄ２６に、または各々Ａｄ３５に由来する。

当業者は、複数の血清型に由来する要素を単一の組換えアデノウイルスベクターの中で組み合わせることができることを認める。したがって、異なる血清型からの望ましい特性を組み合わせたキメラアデノウイルスを生成することができる。したがって、一部の実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスは、Ａｄ２６およびＡｄ３５血清型の既存の免疫の不在を、温度安定性、アセンブリー、固着、生成収量、再方向付けまたは改善した感染、標的細胞におけるＤＮＡの安定性などの特徴と組み合わせ得る。

ある特定の実施形態では、本発明において有用な組換えアデノウイルスベクターは、主にまたは完全にＡｄ３５またはＡｄ２６に由来する（すなわち、ベクターはｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６である）。一部の実施形態では、アデノウイルスは、例えばそれがゲノムのＥ１領域に欠失を含有するので、複製欠陥である。Ａｄ２６またはＡｄ３５に由来する本発明のアデノウイルスでは、アデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列をＡｄ５などのヒトサブグループＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と交換することが一般的である。このことは、例えば２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞などの、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞系におけるそのようなアデノウイルスの増殖を可能にする（例えば、Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135-43；国際公開第０３／１０４４６７号を参照されたい）。ある特定の実施形態では、アデノウイルスは血清型３５のヒトアデノウイルスであり、抗原をコードする核酸がその中にクローニングされているＥ１領域に欠失があり、Ａｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する。ある特定の実施形態では、アデノウイルスは血清型２６のヒトアデノウイルスであり、抗原をコードする核酸がその中にクローニングされているＥ１領域に欠失があり、Ａｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する。Ａｄ３５アデノウイルスについては、アデノウイルスのＥ１Ｂ ５５Ｋのオープンリーディングフレームの３’末端、例えば、ｐＩＸオープンリーディングフレームの直ぐ上流の１６６ｂｐまたはこれを含む断片、例えば、Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位によって５’末端でマークされた、ｐＩＸ開始コドンの直ぐ上流の２４３ｂｐ断片を保持することが一般的であり、その理由は、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に部分的に存在しているので、これがアデノウイルスの安定性を増加させるからである（例えば、Havenga et al, 2006, 前掲；ＷＯ２００４／００１０３２を参照されたい）。

組換えアデノウイルスベクターの調製は、当技術分野で周知である。

ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、ＷＯ２００７／１０４７９２およびAbbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63に記載される。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＦ１５３４７４に、およびＷＯ２００７／１０４７９２の配列番号１に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、およびVogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71に記載される。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＣ＿００００１９に見出される。

本発明の実施形態では、本発明のために有用なベクターには、その開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／０８２９１８に記載されたものが含まれる。

一般的に、本発明において有用なアデノウイルスベクターは、組換えアデノウイルスゲノム全体を含む核酸（例えば、プラスミド、コスミドまたはバキュロウイルスベクター）を使用して生成される。したがって、本発明は、本発明のアデノウイルスベクターをコードする単離された核酸分子も提供する。本発明の核酸分子は、クローニングによって得ることができるか、合成により生成することができる。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってよい。

本発明において有用なアデノウイルスベクターは、一般的に複製欠陥である。これらの実施形態では、ウイルスは、Ｅ１領域などのウイルスの複製に重要な領域の欠失または不活性化によって複製欠陥にさせられる。これらの領域は、例えば、目的の遺伝子（通常プロモーターに連結される）を挿入することによって、実質的に欠失または不活性化させることができる。一部の実施形態では、本発明のベクターは、Ｅ２、Ｅ３またはＥ４領域などの他の領域に欠失を、またはプロモーターに連結された異種遺伝子の挿入を含有することができる。Ｅ２および／またはＥ４突然変異アデノウイルスについては、組換えアデノウイルスを生成するために、Ｅ２および／またはＥ４補完細胞系が一般的に使用される。Ｅ３は複製のために必要とされないので、アデノウイルスのＥ３領域の突然変異は細胞系によって補完する必要はない。

本発明のアデノウイルスベクターの十分量を生成するために、パッケージング細胞系が一般的に使用される。パッケージング細胞は、複製欠陥ベクターの中の欠失または不活性化された遺伝子を含む細胞であり、このように、細胞の中でウイルスが複製することを可能にする。好適な細胞系には、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６、９１１、２９３およびＥ１ Ａ５４９が含まれる。

一部の実施形態では、アデノウイルスベクターは、抗原性ペプチドをコードする遺伝子または遺伝子の一部を発現することができる。これらの外来性、異種もしくは外因性のペプチドまたはポリペプチドは、免疫原性である配列、例えば腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、細菌、ウイルス、真菌および原虫の抗原を含むことができる。

抗原性ペプチドをコードする異種遺伝子は、アデノウイルス由来のプロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下にあってよい（すなわち、作動可能に連結される）、または、異種プロモーターの制御下にあってよい。好適な異種プロモーターの例には、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターが含まれる。好ましくは、プロモーターは、発現カセットの中の目的の異種遺伝子の上流に位置する。

免疫原性組成物
免疫原性組成物は、本発明で使用するためのｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む組成物である。組成物は、当技術分野で周知である方法によってワクチン（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）として製剤化することができる。そのような組成物は、免疫応答を増強するアジュバントを含むことができる。製剤中の各構成成分の最適な比は、本開示に照らして当業者に周知である技術によって決定することができる。

免疫原性組成物の調製および使用は、当業者に周知である。液体医薬組成物は、水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を一般的に含む。生理的食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールが含まれてもよい。

本発明の組成物は、１つまたは複数の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドを発現するｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターを含むことができる。これらの抗原性のペプチドまたはポリペプチドは、これらに限定されないが、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、細菌、ウイルス、真菌および原虫の抗原を含む、免疫原性である任意の配列を含むことができる。例えば、抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドは、病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、原生動物に由来することができるか、または、それは腫瘍に由来することもできる。１つまたは複数の好ましい態様では、本発明の組成物は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、エボラウイルス、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、肝炎ウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳウイルス、チクングニヤウイルス、デングウイルスまたは西ナイルウイルスなどのウイルスからの１つまたは複数の抗原性タンパク質を発現するｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターを含む。

抗原性タンパク質は、抗原決定基を含む任意のニューモウイルスからの任意のタンパク質であってよい。好ましい実施形態では、抗原性タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルスからの融合前Ｆタンパク質（ＲＳＶ−ｐｒｅＦ）である。

好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターによってコードされる抗原性タンパク質は、配列番号１、配列番号２、その免疫原性ポリペプチドおよびその組合せのアミノ酸配列を有する。

本発明において有用な免疫原性組成物は、アジュバントを含むことができる。

本発明による同時投与のために好適なアジュバントは、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、ミョウバンおよびＭＦ５９を含む、ヒトにおいて潜在的に安全で、良好な耐容性を示し、有効なものであるべきである。

投与することができる他のアジュバントには、レクチン、増殖因子、サイトカインおよびリンホカイン、例えばアルファ−インターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２またはそれらをコードする核酸が含まれる。

本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者に周知である他の材料を含むことができる。そのような材料は無毒であるべきで、有効成分の効能に干渉するべきでない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、筋肉内、皮下、経口、静脈内、経皮、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内または腹腔内経路によって様々であり得る。

免疫応答を増強するための方法
本発明は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡをアデノウイルスベクターと組み合わせて使用した、ヒト対象における任意の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答をプライミングおよびブーストする、改善された方法を提供する。

本発明の１つの一般的な態様により、それを必要とするヒト対象において免疫応答を誘導する方法は、
ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）の免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物をヒト対象に投与する工程、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を対象に投与し、
それによってヒト対象において誘導された免疫応答を得る工程を含み、ここで、第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である。

本発明の実施形態により、誘導された免疫応答は、ヒト対象における抗原性タンパク質に対して誘導された抗体応答を含む。

好ましくは、増強された免疫応答は、ヒト対象における抗原性タンパク質に対して増強されたＣＤ４＋応答または増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答をさらに含む。本発明の実施形態による方法によって生じる増強されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、例えば、抗原性タンパク質に対する支配的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答の増加もしくは誘導、および／またはヒト対象における抗原性タンパク質に特異的である多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の増加もしくは誘導であってよい。多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、複数のサイトカイン、例えば２つ以上のＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−アルファを発現する。本発明の実施形態による方法によって生じる増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、例えば、ヒト対象における抗原性タンパク質に特異的である多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加または誘導であってよい。

より好ましくは、本発明の実施形態による方法からもたらされる増強された免疫応答は、ヒト対象における抗原性タンパク質に対して増強されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答、増強された抗体応答および増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。

免疫応答を検出するのに使用することができるアッセイは、当技術分野で周知である。そのようなアッセイのいくつかには、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合イムノスポット）およびＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色）が含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイは、例えば、分泌された抗体またはサイトカインのレベルを分析する。体液性免疫応答の指標である、特定の抗原に結合する抗体のレベルを決定するためにＥＬＩＳＡアッセイが使用される場合、それらはＣＤ４＋Ｔ細胞活性を反映することもできるが、その理由は、Ｂ細胞による高度親和性抗体の生成はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性に依存するからである。ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＣＳは、例えば、特定の抗原に対するＴ細胞応答を分析する単一細胞アッセイである。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは個々の細胞の分泌活性を測定し、ＩＣＳアッセイは細胞内サイトカインのレベルを分析する。ＣＤ４＋特異的およびＣＤ８＋特異的Ｔ細胞応答は、ＩＣＳアッセイを使用して決定することができる。

本発明の１つまたは複数の実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは免疫応答をプライミングするために使用され、本発明の実施形態により免疫応答をブーストするために、Ａｄ２６またはＡｄ３５ベクターが使用される。本発明の他の実施形態では、Ａｄ２６またはＡｄ３５ベクターは免疫応答をプライミングするために使用され、本発明の実施形態により免疫応答をブーストするためにＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡが使用される。

プライミング組成物およびブースト組成物における抗原は同一である必要はないが、抗原決定基を共有するべきであるか、お互いと実質的に類似するべきである。

免疫原性組成物の投与は、一般的に筋肉内、皮下または皮内である。しかし、静脈内、経皮または鼻腔内などの他の投与様式を使用することもできる。免疫原性組成物の筋肉内投与は、組成物の懸濁液を注射するために針を使用して達成することができる。代替手段は、組成物を投与する無針注入装置の使用（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）を使用する）または組成物を含有するフリーズドライ粉末の使用である。

静脈内、経皮もしくは皮下注射、または疾病部位への注射のために、組成物は、発熱物質非含有で、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態になる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注入、リンガー液の注入、乳酸加リンガー液注入などの等張性のビヒクルを使用して、好適な溶液を首尾よく調製することができる。本発明のＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、投与のために脂質ナノ粒子に製剤化することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤が組成物に含まれてもよい。組成物の徐放性製剤を用いることもできる。

一般的に、投与は、感染または発症の前に抗原に対して免疫応答を生成する予防的目的を有する。本発明により治療または予防することができる疾患および障害には、免疫応答が保護的または治療的な役割を果たすことができるものが含まれる。他の実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターは、曝露後予防のために投与することができる。

ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターを含有する免疫原性組成物は対象に投与されて、対象において免疫応答を起こす。検出可能な免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量は、「免疫学的有効用量」と定義される。以下に示すように、本発明の免疫原性組成物は、体液性のならびに細胞媒介の免疫応答を誘導する。好ましい実施形態では、免疫応答は、防御免疫応答である。

投与される組成物の実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療する疾患、障害または状態の性質および重症度に依存する。治療の処方、例えば投薬量等についての決定は、一般診療医および他の医師の責任の範囲内であり、治療する疾患、障害または状態、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および診療医に公知である他の因子を一般的に考慮する。上で指摘した技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980に見出すことができる。

ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターの生成およびそのような粒子の組成物への必要に応じた製剤化の後、組成物を個体に、特にヒトに投与することができる。

治療的有効量または投薬量は、様々な因子、例えば、投与手段、標的部位、対象の生理的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトまたは動物であるか、投与される他の医薬品、および治療が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。治療投薬量は、安全性および効能を最適化するために、最適に設定される。

１つの例示的なレジメンでは、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、２００μｇ以下、１００μｇ以下、５０μｇ以下または≦１０μｇ以下のＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの用量を含有する約１００μｌから約１０ｍｌの間の範囲の量で（例えば、筋肉内に）投与されるが、発現はかなりより低いレベル、例えば１用量につき１μｇ以下、１００ｎｇ以下、１０ｎｇ以下または１ｎｇ以下のＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡで見ることができる。好ましくは、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、０．２５ｍｌから１．０ｍｌの間の範囲の量で投与される。より好ましくは、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、０．５ｍｌの量で投与される。

一般的に、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、１用量につき約１０〜１００μｇの量で投与される。好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、１用量につき約１０μｇの量で投与される。別の好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、１用量につき約２５μｇの量で投与される。別の好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、１用量につき約５０μｇの量で投与される。別の好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、１用量につき約７５μｇの量で投与される。別の好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、１用量につき約１００μｇの量で投与される。

１つの例示的なレジメンでは、アデノウイルスベクターは、１ｍｌにつき約１０^４〜１０^１２ウイルス粒子の濃度を含有する、約１００μｌから約１０ｍｌの間の範囲の量で（例えば、筋肉内に）投与される。好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．２５ｍｌから１．０ｍｌの間の範囲の量で投与される。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．５ｍｌの量で投与される。

一般的に、アデノウイルスは、１回の投与の間に約１０^９〜約１０^１２ウイルス粒子（ｖｐ）の量で、より一般的には約１０^１０〜約１０^１２ｖｐの量でヒト対象に投与される。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約５×１０^１０ｖｐの量で投与される。別の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約０．８×１０^１０ｖｐの量で投与される。別の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約２×１０^１０ｖｐの量で投与される。別の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、約４×１０^１０ｖｐの量で投与される。

本発明の組成物は、単独で、または、治療する状態によって同時にまたは逐次的に、他の治療と組み合わせて投与することができる。

ブースト組成物は、プライミング組成物の投与の数週または数カ月後に、例えば、プライミング組成物の投与の約１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週、２１週、２２週、２３週、２４週、２５週、２６週、２７週、２８週、２９週、３０週、３１週、３２週、３３週、３４週、３５週、３６週、３７週、３８週、３９週、４０週、４１週、４２週、４３週、４４週、４５週、４６週、４７週、４８週、４９週、５０週、５１週または１〜２年後に投与される。

好ましくは、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１〜５２週後に投与される。本発明の好ましい実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２〜５２週後に投与される。本発明の別の好ましい実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４〜５２週後に投与される。本発明の別の好ましい実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１週後に投与される。本発明の別の好ましい実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２週後に投与される。本発明の別の好ましい実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４週後に投与される。本発明の別の好ましい実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから８週後に投与される。

本発明のプライミング組成物およびブースト組成物は、１、２、３または複数の用量を各々含むことができる。

一実施形態では、本発明は、ヒト対象において腫瘍に対して免疫応答を誘導する方法に関する。本方法は、
ａ．腫瘍細胞によって生成される抗原性タンパク質、実質的に類似した抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物をヒト対象に投与する工程、および
ｂ．抗原性タンパク質、実質的に類似した抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を対象に投与し、
それによってヒト対象における腫瘍に対して誘導された免疫応答を得る工程を含み、ここで、第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である。

好ましくは、誘導された免疫応答は、ヒト対象に腫瘍に対する防御免疫を提供する。

好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む組成物はプライミング組成物であり、アデノウイルスベクターを含む組成物はブースト組成物である。

本発明の実施形態により、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１〜５２週後に投与される。ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから５２週よりも後に投与することもできる。

本発明の一実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２〜５２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４〜５２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから８週後に投与される。

さらなる実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから少なくとも２週後または少なくとも４週後に投与される。さらに他の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４〜１２週後または４〜８週後に投与される。

好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、ＶＥＥウイルスベースのｒｅｐＲＮＡである。

好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２６またはＡｄ３５ベクターである。

腫瘍細胞によって生成される抗原性タンパク質は、任意の腫瘍抗原であってよい。好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞にだけ存在する腫瘍特異的抗原である。腫瘍抗原は、一部の腫瘍細胞および一部の正常細胞にも存在する腫瘍関連抗原であってもよい。

別の実施形態により、本発明は、ヒト対象においてウイルスに対して免疫応答を誘導する方法に関する。本方法は、
ａ．ウイルスの抗原性タンパク質、実質的に類似した抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物をヒト対象に投与する工程、および
ｂ．抗原性タンパク質、実質的に類似した抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を対象に投与し、
それによってヒト対象におけるウイルスに対して誘導された免疫応答を得る工程を含み、ここで、第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である。

好ましくは、増強された免疫応答は、ヒト対象にウイルスに対する防御免疫を提供する。

好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む組成物はプライミング組成物であり、アデノウイルスベクターを含む組成物はブースト組成物である。

一実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１〜５２週後に投与される。ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから５２週よりも後に投与することもできる。

本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２〜５２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４〜５２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから１週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから２週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４週後に投与される。本発明の別の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから８週後に投与される。

さらなる実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから少なくとも２週後または少なくとも４週後に投与される。さらに他の実施形態では、ブースト組成物は、プライミング組成物が投与されてから４〜１２週後または４〜８週後に投与される。

好ましい実施形態では、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、ＶＥＥウイルスベースのｒｅｐＲＮＡである。

好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２６またはＡｄ３５ベクターである。

抗原性タンパク質は、ウイルスの任意の抗原性タンパク質であってよい。好ましい実施形態では、抗原性タンパク質は、ウイルスの糖タンパク質または核タンパク質である。

実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態も提供する。

実施形態１は、それを必要とするヒト対象において免疫応答を誘導する方法であって、
ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）の免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物をヒト対象に投与する工程、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を対象に投与し、
それによってヒト対象において誘導された免疫応答を得る工程を含み、第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である、方法である。

実施形態２は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む組成物がプライミング組成物であり、アデノウイルスベクターを含む組成物がブースト組成物である、実施形態１による方法である。

実施形態３は、アデノウイルスベクターを含む組成物がプライミング組成物であり、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む組成物がブースト組成物である、実施形態１による方法である。

実施形態４は、誘導された免疫応答が、ヒト対象において第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に対して誘導された抗体免疫応答を含む、実施形態１〜３のいずれか１つによる方法である。

実施形態５は、誘導された抗体免疫応答が、ＥＬＩＳＡによって決定される、実施形態４による方法である。

実施形態６は、誘導された免疫応答が、ヒト対象において第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの抗原決定基に対して誘導された細胞性免疫応答を含む、実施形態１〜３のいずれか１つによる方法である。

実施形態７は、誘導された細胞性免疫応答が、ＩＣＳまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定される、実施形態６による方法である。

実施形態８は、誘導された免疫応答が、ヒト対象に第１および第２の抗原性タンパク質の少なくとも１つに関連した疾患に対する防御免疫を提供する、実施形態１〜７のいずれか１つによる方法である。

実施形態９は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡが、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスベースのｒｅｐＲＮＡである、実施形態１〜８のいずれか１つによる方法である。

実施形態１０は、アデノウイルスベクターが、組換えヒトアデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）ベクターまたは組換えヒトアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである、実施形態１〜９のいずれか１つによる方法である。

実施形態１１は、ブースト組成物が、プライミング組成物が投与されてから１〜５２週後に投与される、実施形態１〜１０のいずれか１つによる方法である。

実施形態１２は、ブースト組成物が、プライミング組成物が投与されてから少なくとも１週後に投与される、実施形態１〜１１のいずれか１つによる方法である。

実施形態１３は、第１または第２の抗原性タンパク質が、病原体または腫瘍に由来する、実施形態１〜１２のいずれか１つによる方法である。

実施形態１４は、第１または第２の抗原性タンパク質が、ウイルスに由来する、実施形態１〜１２のいずれか１つによる方法である。

実施形態１５は、第１または第２の抗原性タンパク質が、ニューモウイルスウイルス、フィロウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、ジカウイルス、インフルエンザウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスに由来する、実施形態１４による方法である。

実施形態１６は、第１および第２の抗原性タンパク質が同一であるかまたは実質的に同一である、実施形態１〜１５のいずれか１つによる方法である。

実施形態１７は、第１または第２の抗原性タンパク質が、呼吸器合胞体ウイルスからの融合前Ｆタンパク質（ＲＳＶ−ｐｒｅＦ）に由来し、第１および第２の抗原性タンパク質は同一であるかまたは実質的に同一である、実施形態１〜１６のいずれか１つによる方法である。

実施形態１８は、第１および第２の抗原性タンパク質が、配列番号１、配列番号２、その免疫原性ポリペプチドおよびその組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を各々独立して含む、実施形態１７による方法である。

実施形態１９は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡが、配列番号１、配列番号２およびその免疫原性ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１８による方法である。

実施形態２０は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡが配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドを含む、実施形態２１による方法である。

実施形態２１は、アデノウイルスベクターが、配列番号１、配列番号２およびその免疫原性ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０による方法である。

実施形態２２は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡが、１用量につき０．１〜１０００μｇのＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの量の脂質ナノ粒子組成物として投与される、実施形態１〜２１のいずれか１つによる方法である。

実施形態２３は、アデノウイルスベクターが、１用量につき１０^９〜１０^１２ウイルス粒子の量で投与される、実施形態１〜２２のいずれか１つによる方法である。

実施形態２４は、ヒト対象において少なくとも１つのニューモウイルスサブタイプに対して免疫応答を誘導する方法であって、
ａ．少なくとも１つのニューモウイルスサブタイプの第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物をヒト対象に投与する工程、および
ｂ．少なくとも１つのニューモウイルスサブタイプの第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を対象に投与し、
それによってヒト対象における少なくとも１つのニューモウイルスサブタイプに対して誘導された免疫応答を得る工程を含み、第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である、方法である。

実施形態２５は、ヒト対象において免疫応答を誘導するための組合せであって、
ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を含み、
組成物の１つは免疫応答をプライミングするためにヒト対象に投与され、他の組成物は免疫応答をブーストするためにヒト対象に投与され、
第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有する、組合せである。

実施形態２６は、ヒト対象において免疫応答を誘導するための医薬の製造のための組合せの使用であって、前記組合せが
ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を含み、
組成物の１つは免疫応答をプライミングするためにヒト対象に投与され、他の組成物は免疫応答をブーストするためにヒト対象に投与され、
第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有する、使用である。

実施形態２７は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む組成物はプライミング組成物であり、アデノウイルスベクターを含む組成物はブースト組成物である、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態２８は、アデノウイルスベクターを含む組成物はプライミング組成物であり、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む組成物はブースト組成物である、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態２９は、第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドが病原体または腫瘍に由来する、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３０は、第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドがウイルスに由来する、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３１は、第１または第２の抗原性タンパク質がＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質に由来し、第１および第２の抗原性タンパク質が同一であるかまたは実質的に同一である、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３２は、第１および第２の抗原性タンパク質が、配列番号１、配列番号２、その免疫原性ポリペプチドおよびその組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を各々独立して含む、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３３は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡが、配列番号１、配列番号２およびその免疫原性ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３４は、アデノウイルスベクターが、配列番号１、配列番号２およびその免疫原性ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３５は、ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡがベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスベースのｒｅｐＲＮＡである、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３６は、アデノウイルスベクターがＡｄ２６ベクターまたはＡｄ３５ベクターである、実施形態２４の方法、実施形態２５の組合せまたは実施形態２６の使用である。

実施形態３７は、それを必要とするヒト対象において免疫応答を誘導する方法であって、
ａ．ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）の免疫学的有効量を、薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物をヒト対象に投与する工程、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むＡｄ２６ベクターまたはＡｄ３５ベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を対象に投与し、
それによってヒト対象において誘導された免疫応答を得る工程を含み、第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、第１の組成物はプライミング組成物であり、第２の組成物はブースト組成物である、方法である。

実施形態３８は、ヒト対象において免疫応答を誘導するための組合せであって、
ａ．ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）の免疫学的有効量を、薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物、および
ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むＡｄ２６ベクターまたはＡｄ３５ベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を含み、
第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、第１の組成物はプライミング組成物であり、第２の組成物はブースト組成物である、組合せである。

実施形態３９は、ヒト対象において免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、実施形態３８の組合せの使用である。

実施形態４０は、第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドが病原体または腫瘍に由来する、実施形態３７の方法、実施形態３８の組合せまたは実施形態３９の使用である。

実施形態４１は、第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドがウイルスに由来する、実施形態３８の方法、実施形態３９の組合せまたは実施形態４０の使用である。

実施形態４２は、第１または第２の抗原性タンパク質がＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質に由来し、第１および第２の抗原性タンパク質が同一であるかまたは実質的に同一である、実施形態３７の方法、実施形態３８の組合せまたは実施形態３９の使用である。

実施形態４３は、第１および第２の抗原性タンパク質が、配列番号１、配列番号２、その免疫原性ポリペプチドおよびその組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を各々独立して含む、実施形態３７の方法、実施形態３８の組合せまたは実施形態３９の使用である。

実施形態４４は、第１の組成物が配列番号３の配列を有するＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を含み、第２の組成物が配列番号１のアミノ酸配列を有する抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡｄ２６ベクターの免疫学的有効量を含む、実施形態３７の方法、実施形態３８の組合せまたは実施形態３９の使用である。

実施形態４５は、第２の組成物が、第１の組成物の投与から２〜１２週後、好ましくは４〜８週後にヒト対象に投与される、実施形態３７〜４４のいずれか１つの方法、実施形態３８〜４４のいずれか１つの組合せまたは実施形態３９〜４４のいずれか１つの使用である。

実施形態４６は、第１の組成物がリポナノ粒子製剤として製剤化される、実施形態３８もしくは４１〜４５のいずれか１つの方法、実施形態３９もしくは４１〜４５のいずれか１つの組合せまたは実施形態４０〜４５のいずれか１つの使用である。

以下の実施例は請求項に係る発明を限定するためではなく、例示するために提供される。

[実施例１]

モデル抗原をコードするｒｅｐＲＮＡベースのワクチンによる同種プライム−ブースト免疫化の能力を探求する目的で、動物研究を行った。使用したモデル抗原は、呼吸器合胞体ウイルスからの融合前Ｆタンパク質（ＲＳＶ−ｐｒｅＦ）であった。研究では、４週の免疫化間隔による同種ワクチン接種の用量範囲を試験した。

動物の取り扱い
研究は、Final Rules of the Animal Welfare Act規則（9 CFR Parts 1, 2, and 3）およびGuide for the Care and Use of Laboratory Animals - National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition（ガイド）の全ての適用可能なセクションに対応した。

合計３０匹の（６週齢）雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ジャクソンラボラトリーから購入した。

ワクチンの材料
使用したＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡワクチンベクターの模式図を、図１に示す。ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡベクターは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなり、最初のものはベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの非構造タンパク質（ＮＳＰ）をコードし、第２のものはＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質をコードする。ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）および精製方法を使用して製造した。簡潔には、Ｔ７プロモーターの５’側およびポリＡテールの３’側のレプリコンを有するＤＮＡプラスミドを消化することによって、Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための線状鋳型ＤＮＡを生成した。消化した生成物は、Ｚｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−２５キットを使用して洗浄した。ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用し、続いて緩衝液構成成分、遊離ＮＴＰおよびタンパク質を除去するためにＧＥ ＣａｐｔｏＣｏｒｅ７００ＨｉＳｃｒｅｅｎカラムを使用したＨＰＬＣ洗浄ステップによって生成した。洗浄の後、Ｃｅｌｌｓｃｒｉｐｔからのキャッピングキットを使用した転写後酵素キャッピング反応によってＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡをキャップし、その後、遠心回転濃縮器でＲＮＡを濃縮し、緩衝液を１〜５μｇ／μｌの最終濃度に交換した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へのｒｅｐＲＮＡの製剤化は、エタノールの中での希釈プロセスによって行った。コレステロールをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）をＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから得た。４８：４０：１０：２のモルパーセントのコレステロール：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧの脂質構成成分（エタノール中）を、８：１のＮ：Ｐのモル比（ＤＯＴＡＰ上の窒素対ＲＮＡ上のリン酸塩）を使用して１０ｍＭクエン酸緩衝液の中でｒｅｐＲＮＡと混合した。１時間の乳化の後、粒子をＰＢＳに対して透析した。ｉｎ ｖｉｖｏ注入の前に、ＰＢＳ中で必要とされるＲＮＡ濃度に粒子をさらに希釈した。

ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、ＶＥＥウイルスのレプリカーゼおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する抗原性ＲＳＶ−ｐｒｅＦタンパク質を発現した。ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを生成するために使用した鋳型ＤＮＡ配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を有していた。

ワクチン接種および実験計画
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ｒｅｐＲＮＡを使用した同種プライム−ブーストレジメンでワクチン接種をした（グループ分けおよび実験計画については、表１および図２を参照されたい）。免疫化の前に、齧歯動物麻酔器を使用して各マウスに酸素中の１〜４％イソフルランで麻酔をかけ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤化ｒｅｐＲＮＡ（５０μＬ）の筋肉内（ＩＭ）注射を投与した。プライミングおよびブースト用量は、４週間隔で与えた（図２）。

抗凝固剤なしに全血を、血清のために処理した。各血清を、ＲＳＶ ｐｒｅＦ特異的ＥＬＩＳＡで分析した。

抗−ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
免疫化の２８および４２日後に、Krarup et al.（A highly stable prefusion RSV F vaccine derived from structural analysis of the fusion mechanism. Nat. Commun. 6:8143）において既に記載されている通り、改変された酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によってＲＳＶ−Ｆ特異的体液性応答を判定した。

簡潔には、ＭａｘｉＳｏｒｐポリスチレン９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）を、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度のヒト抗ＲＳＶ Ｆモノクローナル抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ）により、４℃で一晩コーティングした。その翌日、プレートをＰＢＳＴ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中でブロックし、続いて安定化融合前Ｆタンパク質（ＰＢＳＴ中の０．２５μｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、それを固定化抗ＲＳＶ Ｆ抗体によって捕捉した。

血清試料を１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ中で希釈し、ＢｉｏＲａｄからのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＰＢＳＴに１／５０００の希釈）とインキュベートし、次にＲＳＶ−Ｆ特異的マウスＩｇＧの検出を可能にするために、試料をウェルの中でインキュベートした。検出のために、ＯＰＤ基質を使用した。全てのインキュベーションは、室温で１時間行った。各ステップの後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡアッセイからの結果を図３に示す。０．４μｇ以上の用量によるプライム免疫化は、検出可能なＩｇＧ力価を有する体液性免疫応答をもたらし、同種ブーストはＩｇＧ力価のわずかな増加だけをもたらした（交差用量）。

[実施例２]

同種ｒｅｐＲＮＡブーストの後の細胞性応答を探究するために、ＲＳＶ−Ｆ特異的ペプチドを使用したＥＬＩＳＰＯＴで脾細胞を試験した動物研究を行った。

動物の取り扱い
研究は、Final Rules of the Animal Welfare Act regulations（9 CFR Parts 1, 2, and 3）およびGuide for the Care and Use of Laboratory Animals - National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition（ガイド）の全ての適用可能なセクションに対応した。

雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢）を、ジャクソンラボラトリーから購入した。

ワクチン材料
ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、実施例１に記載の通りに生成し、製剤化した。

ワクチン接種および実験計画
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ｒｅｐＲＮＡを使用した同種プライム−ブーストレジメンでワクチン接種をした（グループ分けおよび実験計画については、表２および図４を参照されたい）。免疫化の前に、齧歯動物麻酔器を使用して各マウスに酸素中の１〜４％イソフルランで麻酔をかけ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤化ｒｅｐＲＮＡ（５０μＬ）の筋肉内（ＩＭ）注射を投与した。プライミングおよびブースト用量は、４週間隔で与えた（図４）。

６週後、ＲＳＶ−Ｆ特異的ＣＴＬペプチドＫＹＫＮＡＶＴＥＬアッセイを使用したＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける試験のための脾細胞を得るために、全てのマウスを屠殺した。

ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。
脾細胞を使用したＲＳＶ−Ｆ特異的細胞性免疫応答は、図４に記載される時点で、ＢＤからのマウス細胞のためのＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴキットを使用したインターフェロンガンマ酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって判定した。簡潔には、１ウェルにつき５００，０００脾細胞を、１μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＴＬ活性化ＲＳＶ−Ｆペプチド（ＫＹＫＮＡＶＴＥＬ）で一晩刺激した。その後、キット製造業者の説明書に従ってスポットを発色させた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図５に示すが、ブーストの後に細胞性応答がわずかに増加しただけだった（統計的に有意でない）ことを示す。

[実施例３]

同種プライム−ブーストレジメンにおけるＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡワクチンのブースト能力の不在のために、モデル抗原を両方ともコードするアデノベースのワクチンと組み合わせたｒｅｐＲＮＡベースのワクチンによる異種プライム−ブースト免疫化の能力を探求する目的で、動物研究を行った。詳細には、この研究は、異種プライム−ブーストワクチン接種が実施例１および２の同種ｒｅｐＲＮＡワクチン接種と比較して体液性または細胞性の免疫応答を向上させるかどうか判定するために、免疫化間隔が４週のｒｅｐＲＮＡおよびＡｄ２６−ＲＳＶ−Ｆを含む２つの異種ワクチン接種を試験した。

動物の取り扱い
これらの研究は、Final Rules of the Animal Welfare Act regulations（9 CFR Parts 1, 2, and 3）およびGuide for the Care and Use of Laboratory Animals - National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition（ガイド）の全ての適用可能なセクションに対応した。

合計３６匹の（６週齢）雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ジャクソンラボラトリーから購入した。

ワクチン材料
ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡは、実施例１に記載の通りに生成し、製剤化した。

Ｅ１位置に挿入されたＲＳＶ−Ｆ遺伝子を含有する精製されたＥ１／Ｅ３欠失複製欠陥組換えアデノウイルス２６型ワクチンベクター（Ａｄ２６）である組換えアデノウイルスベクターは、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒ＆Ｄによって製造された。ベクターをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞から救済し、プラーク精製し、アップスケールし、次に二段階ＣｓＣｌバンド形成手順によって精製し、その後ＴＲＩＳベースの製剤緩衝液に製剤化し、−６５℃未満で保存した。

組換えアデノウイルスベクターは、ＲＳＶ−Ａ２株に由来するＲＳＶ−Ｆを発現した。発現されたＲＳＶ−Ｆタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有した。

ワクチン材料は、温度制御フリーザーの中で、−８０℃で保存した。

ワクチン接種および実験計画
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ｒｅｐＲＮＡおよびアデノベクターを使用した異種プライム−ブーストレジメンでワクチン接種をした（グループ分けおよび実験計画については、表３および図６を参照されたい）。免疫化の前に、各マウスに麻酔をかけ、後ろ腿へのアデノベクターまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤化ｒｅｐＲＮＡ（実施例１に記載の通り）の筋肉内（ＩＭ）注射をした。プライミングおよびブースト用量は、４週間隔で与えた（図６）。

ｒｅｐＲＮＡおよびＡｄ２６−ＲＳＶ−Ｆを使用した異種プライム−ブーストワクチン接種（マウスのグループ分けについては表３を、実験計画については図６を参照されたい）が、実施例１および２で実証される同種ｒｅｐＲＮＡワクチン接種に対比して体液性または細胞性免疫応答を向上させるかどうか探究するために、動物研究を行った。全ての免疫化は、筋肉内であった。マウスの３対照群は、ＰＢＳ、ＬＮＰ製剤化ｒｅｐＲＮＡ（１μｇ）またはＡｄ２６−ＲＳＶ−Ｆ（１×１０^９ｖｐ）によるプライムのみの免疫化（ｉ．ｍ．）を受けた。異種プライム−ブースト免疫化の能力を、マウスのさらなる２群で試験した。８匹のマウスの１群はＬＮＰ製剤化ｒｅｐＲＮＡ（１ｕｇ）でプライミングし、４週後にＡｄ２６−ＲＳＶ−Ｆ（１×１０^９ｖｐ）でブーストした。８匹のマウスの他の群はＡｄ２６−ＲＳＶ−Ｆ（１×１０^９ＶＰ）でプライミングし、４週後にＬＮＰ製剤化ｒｅｐＲＮＡ（１μｇ）によるブーストが続いた。

抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＲＳＶ−Ｆ特異的体液性応答は、実施例１に記載の通りに、抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ分析によって免疫化の４２日後に判定した。ＥＬＩＳＡアッセイからの結果を図７に示す。ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターによる異種プライム−ブースト免疫化は、ｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターによる同種免疫化と比較して増加したＩｇＧ力価を有する体液性免疫応答をもたらした。

ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＲＳＶ−Ｆ特異的細胞性（脾細胞）免疫応答は、実施例２に記載の通りに、インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって免疫化の４２日後に判定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図８に示す。ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターによる異種プライム−ブースト免疫化は、ｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターによるプライムのみの免疫化と比較して増加した細胞性免疫応答をもたらした。

要約すると、本研究は、増加した体液性および細胞性の免疫応答は、ｒｅｐＲＮＡまたはアデノウイルスベクターだけによる同種免疫化と比較して、ｒｅｐＲＮＡおよびアデノウイルスベクターの異種ワクチンによる免疫化によって誘導されたことを実証した。

その広い発明概念を逸脱せずに上記の実施形態に変更を加えることができることは、当業者に理解される。したがって、本発明は開示される特定の実施形態に限定されずに、添付の請求項によって規定される本発明の趣旨および範囲の中でそれが改変を包含するものであることが理解される。

Claims (22)

1. それを必要とするヒト対象において免疫応答を誘導する方法であって、
   ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）の免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物を前記ヒト対象に投与する工程、および
   ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を前記対象に投与し、
   それによって前記ヒト対象において誘導された免疫応答を得る工程を含み、前記第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、前記組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である、方法。
2. 前記ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む前記組成物が前記プライミング組成物であり、前記アデノウイルスベクターを含む前記組成物が前記ブースト組成物である、請求項１に記載の方法。
3. 前記アデノウイルスベクターを含む前記組成物が前記プライミング組成物であり、前記ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む前記組成物が前記ブースト組成物である、請求項１に記載の方法。
4. 誘導された前記免疫応答が、前記ヒト対象において前記第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの前記抗原決定基に対して誘導された抗体免疫応答を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 誘導された前記免疫応答が、前記ヒト対象において前記第１および第２の抗原性タンパク質によって共有される少なくとも１つの前記抗原決定基に対して誘導された細胞性免疫応答を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. 誘導された前記免疫応答が、前記ヒト対象に前記第１および第２の抗原性タンパク質の少なくとも１つに関連した疾患に対する防御免疫を提供する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡがベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスベースのｒｅｐＲＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記アデノウイルスベクターが、組換えヒトアデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）ベクターまたは組換えヒトアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ブースト組成物が、前記プライミング組成物が投与されてから１〜５２週後に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ブースト組成物が、前記プライミング組成物が投与されてから少なくとも１週後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１および第２の抗原性タンパク質が病原体または腫瘍に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１または第２の抗原性タンパク質がウイルスに由来する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第１および第２の抗原性タンパク質が同一であるかまたは実質的に同一である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ヒト対象において免疫応答を誘導するための組合せであって、
    ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物、および
    ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を含み、
    前記第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、前記組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である、組合せ。
15. ヒト対象において免疫応答を誘導するための医薬の製造のための組合せの使用であって、前記組合せが、
    ａ．第１の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含むＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第１の組成物、および
    ｂ．第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む第２の組成物を含み、
    前記第１および第２の抗原性タンパク質は少なくとも１つの抗原決定基を共有し、前記組成物の１つはプライミング組成物であり、他の組成物はブースト組成物である、使用。
16. 前記ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む前記組成物が前記プライミング組成物であり、前記アデノウイルスベクターを含む前記組成物が前記ブースト組成物である、請求項１４に記載の組合せまたは請求項１５に記載の使用。
17. 前記アデノウイルスベクターを含む前記組成物が前記プライミング組成物であり、前記ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡを含む前記組成物が前記ブースト組成物である、請求項１４に記載の組合せまたは請求項１５に記載の使用。
18. 前記第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドが病原体または腫瘍に由来する、請求項１４に記載の組合せまたは請求項１５に記載の使用。
19. 前記第１もしくは第２の抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドがウイルスに由来する、請求項１４に記載の組合せまたは請求項１５に記載の使用。
20. 前記第１および第２の抗原性タンパク質が同一であるかまたは実質的に同一である、請求項１４に記載の組合せまたは請求項１５に記載の使用。
21. 前記ＩＶＴ ｒｅｐＲＮＡがＶＥＥウイルスベースのｒｅｐＲＮＡである、請求項１４に記載の組合せまたは請求項１５に記載の使用。
22. 前記アデノウイルスベクターがＡｄ２６ベクターまたはＡｄ３５ベクターである、請求項１４に記載の組合せまたは請求項１５に記載の使用。