JP2015522581A - サイトメガロウイルスタンパク質の複合体 - Google Patents

Abstract

本開示は、単離されたヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）膜タンパク質複合体であって、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む複合体を提供する。一部の実施形態では、複合体は、ｇＨ、ｇＬおよびｇＯからなる。他の実施形態では、複合体はｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａからなる。本開示は、前記複合体を発現させ、精製するためのプロセス、ならびにその後の免疫原性組成物およびワクチンにおける前記複合体の使用も提供する。

Description

本出願は、２０１２年７月６日に出願された米国仮特許出願第６１／６６８，９７５号および２０１３年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／７７０，２５７号の優先権の利益を請求し、各々の上記出願の完全な内容は、本開示によって全ての目的について参照によって本開示に組み込まれる。

本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対するワクチン接種、特に、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む精製された複合体、好ましくは三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体または五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体の単離、およびその後のワクチンにおけるそれらの使用の分野にある。

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅまたはヘルペスウイルスとして公知のウイルスファミリーに属するウイルスの属である。ヒトに感染する種は、一般に、ＨＣＭＶまたはヒトヘルペスウイルス−５（ＨＨＶ−５）として公知である。Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅの中で、ＨＣＭＶはＢｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科に属し、この亜科は他の哺乳動物のサイトメガロウイルスも包含する。

ＨＣＭＶ感染は全身に見いだされ得るが、唾液腺に関連付けられる頻度が高い。ＨＣＭＶは、一般的な集団の大半に抗体が存在することによって示される通り、米国では成人の５０％〜８０％に感染している（世界では４０％）。ＨＣＭＶ感染は、一般には、健康な人では気づかれないが、免疫無防備状態の人、例えば、ＨＩＶ感染した人、臓器移植レシピエント、または新生児などでは生命にかかわる恐れがある（Ｍｏｃａｒｓｋｉ、ＳｈｅｎｋおよびＰａｓｓ ２００６年）。ＨＣＭＶは、発育中の胎児に最も頻繁に伝染するウイルスである。ＨＣＭＶは、感染後、時々潜伏状態から再活性化しながら宿主の生涯にわたって体内に潜伏したままでいることができる。

ＨＣＭＶは、晩年に免疫パラメータに対して大きな影響を有し、罹患率および最終的な死亡率の上昇の一因となり得ると思われる（Ｓｉｍａｎｅｋら（２０１１年））。

現在まで、実験室株および臨床分離株の両方を含め、２０種超の異なるＨＣＭＶ株のゲノムが配列決定されている。例えば、以下のＨＣＭＶ株が配列決定されている：Ｔｏｗｎｅ（ＧＩ：２３９９０９３６６）、ＡＤ１６９（ＧＩ：２１９８７９６００）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＧＩ：２９０５６４３５８）およびＭｅｒｌｉｎ（ＧＩ：１５５５７３９５６）。ＨＣＭＶのＡＤ１６９株、Ｔｏｗｎｅ株およびＭｅｒｌｉｎ株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手することができる（それぞれＡＴＣＣ ＶＲ５３８、ＡＴＣＣ ＶＲ９７７およびＡＴＣＣ ＶＲ１５９０）。

ＨＣＭＶは未知数の膜タンパク質複合体を含有する。ウイルスエンベロープの公知の糖タンパク質およそ３０種のうち、ｇＨおよびｇＬが、いくつかの異なる複合体：二量体ｇＨ／ｇＬ、三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ（ｇＣＩＩＩ複合体としても公知である）および五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ（最後のタンパク質はｐＵＬ１３１とも称される）に存在するので、特に興味深いものとして浮上した。ＨＣＭＶは、五量体複合体を使用して上皮細胞および内皮細胞にエンドサイトーシスおよび低ｐＨ依存性融合によって進入すると考えられているが、線維芽細胞にはｇＨ／ｇＬまたはおそらくｇＨ／ｇＬ／ｇＯを必要とするプロセスで原形質膜における直接融合によって進入すると考えられている。線維芽細胞への感染にはｇＨ／ｇＬ複合体および／またはｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体で十分であるが、内皮細胞および上皮細胞に感染するためには五量体複合体が必要である（Ｒｙｃｋｍａｎ、Ｒａｉｎｉｓｈら、２００８年）。

Ｇｅｎｉｎｉら（２０１１年）には、最初のＨＣＭＶ感染および再活性化したＨＣＭＶ感染におけるＨＣＭＶの五量体複合体に対する血清抗体応答が開示されている。応答は、固定した、または溶解させた、それぞれが１種のＨＣＭＶ遺伝子を保有する１つまたは複数のアデノウイルスベクターを感染させた上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞と、並行して、対照アデノウイルスベクターを感染させた上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞を使用して、間接的な免疫蛍光法（ＩＦＡ）およびＥＬＩＳＡの両方によって決定された。結果の特異性は、複合体の２種のタンパク質、３種のタンパク質、または４種のタンパク質を認識するヒトモノクローナル中和抗体の反応性によって決定された。最初の感染の１４例では、感染開始後２〜４週間以内にＵＬ１２８−１３１遺伝子産物に対するＩｇＧ抗体の抗体陽転が一貫して検出され、一方で抗体は少なくとも１２ヶ月にわたって持続した。ＵＬ１２８−１３１遺伝子産物に対するＩｇＧ抗体応答は、概してｇＨに対する応答よりも優れており、中和抗体応答に続くと思われた（上皮細胞において決定して）。再活性化した感染では、抗体応答には追加刺激応答によく似た傾向が示された。ＩｇＧ抗体は、ＨＣＭＶ血清反応陽性の健康な成人対照では検出されたが、ＨＣＭＶ血清反応陰性の個体では検出されなかった。

Ｋｉｎｚｌｅｒら（２００２年）は、組換えバキュロウイルスを使用してｇＨ、ｇＬ、およびｇＯを昆虫細胞において同時発現させたが、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ三分子複合体を産生することはできなかった。その代わりに、ｇＨ／ｇＬヘテロ二量体、ｇＨ／ｇＬヘテロ多量体、およびｇＯホモ多量体のみが検出された。対照的に、ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯを哺乳動物細胞において同時発現させることにより、ＨＣＭＶ感染細胞において形成されるｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体とよく似た高分子量複合体が産生された。細胞表面免疫蛍光法により、これらの複合体がトランスフェクトされた細胞の表面で発現され、提示されることが示された。

ＵＳ７７０４５１０には、上皮細胞のトロピズムにはｐＵＬ１３１Ａが必要であることが開示されている。ＵＳ７７０４５１０には、ｐＵＬ１２８およびｐＵＬ１３０がｇＨ／ｇＬと複合体を形成し、それがビリオンに組み込まれることも開示されている。この複合体は内皮細胞および上皮細胞に感染するためには必要であるが、線維芽細胞に感染するためには必要ではない。抗ＣＤ４６抗体は上皮細胞のＨＣＭＶ感染を阻害することが見いだされた。しかし、ＵＳ７７０４５１０には、ＨＣＭＶ複合体の単離については開示されていない。

Ｍｏｃａｒｓｋｉ， ＥＳ， Ｔ Ｓｈｅｎｋ， ａｎｄ ＲＦ Ｐａｓｓ． "Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．" Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｍ Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｍ Ｈｏｗｌｅｙ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．， ＵＳＡ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００６． Ｓｉｍａｎｅｋ， Ａｍａｎｄａ Ｍ．， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂｅａｍ Ｄｏｗｄ， Ｇｒａｈａｍ Ｐａｗｅｌｅｃ， Ｄａｖｉｄ Ｍｅｌｚｅｒ， Ａｍｂａｒｉｓｈ Ｄｕｔｔａ， ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ Ｅ． Ａｉｅｌｌｏ． "Ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， Ａｌｌ−Ｃａｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．" ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６ （（２０１１））： ｅ１６１０３． Ｒｙｃｋｍａｎ， ＢＪ， ｅｔ ａｌ． "Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｈａｔ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ．" Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２ （２００８）： ６０−７０．

現在まで、研究者はＨＣＭＶのｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む複合体、例えば、三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体または五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体などを精製することができていない。そのような精製された複合体は、診断に適用するための抗原として、およびＨＣＭＶに対するワクチン用の免疫原として有用である。

本発明は、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体の組換えによる発現および精製に基づく。

本発明は、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を作製するためのプロセスであって、前記ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質が集合してタンパク質複合体が形成される条件下での、ＨＣＭＶのｇＨタンパク質、ＨＣＭＶのｇＬタンパク質、および少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質の組換え同時発現を含むプロセスを提供する。このプロセスは、必要に応じて、タンパク質複合体の単離を伴ってよく、その結果、精製された形態で調製することができる。一部の実施形態では、当該プロセスは、テグメントタンパク質またはカプシドタンパク質などの非エンベロープＨＣＭＶタンパク質のいずれの同時発現も伴わない。

本発明は、このプロセスによって作製されるタンパク質複合体も提供する。例えば、複合体は、（ｉ）ｇＨ、ｇＬおよびｇＯまたは（ｉｉ）ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａを含んでよい。

一部の実施形態では、本発明の複合体を高収率で作製することができる。例えば、本発明の細胞を増殖培地中で増殖させることを伴うプロセスでは、本発明の膜タンパク質複合体を、増殖培地１リットル当たり０．４ｍｇ超（例えば、増殖培地１リットル当たり０．４５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．５５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．６５ｍｇ、０．７ｍｇ、０．７５ｍｇ、０．８ｍｇ、０．８５ｍｇ、０．９ｍｇ、０．９５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．２ｍｇ、１．４ｍｇ、１．６ｍｇ、１．８ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇまたは５ｍｇ、またはそれ以上）のレベルに蓄積することができる。

本発明は、ＨＣＭＶのｇＨ、ＨＣＭＶのｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む単離されたタンパク質複合体も提供する。ｇＨおよびｇＬを含むタンパク質複合体の１つの例は、ｇＨ、ｇＬおよびｇＯからなる三量体複合体である。ｇＨおよびｇＬを含むタンパク質複合体の別の例は、ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａからなる五量体複合体である。

本発明は、本発明のタンパク質複合体を含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、ポリアクリルアミドを含有しない。一部の実施形態では、組成物は、水性液体などの液体であり、ゲルではない。一部の実施形態では、タンパク質複合体は組成物内で固定化されていない。例えば、前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体は、ゲルの中、またはフィルム、膜、紙またはスライドの上に存在しなくてよい。

本発明は、本発明のタンパク質複合体を含む組成物であって、ＨＣＭＶのテグメントまたはＨＣＭＶのカプシドタンパク質などの非エンベロープＨＣＭＶタンパク質のいずれも含有しない組成物も提供する。

本発明は、膜貫通（ＴＭ）ドメインを欠く、修飾されたＨＣＭＶのｇＨポリペプチドも提供する。ＴＭドメインが存在しないことは、この修飾されたポリペプチドが脂質二重層の内部に存在することができないことを意味する。一部の実施形態では、ｇＨポリペプチドは全長の天然ＴＭドメインを欠き、他の実施形態では、ｇＨポリペプチドは天然ＴＭドメインの一部を保持し得るが、当該タンパク質が脂質二重層の内部に存在することが可能になるには不十分である。したがって、当該ポリペプチドは、天然のｇＨのＴＭドメインの最大１０アミノ酸（例えば、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸または１０アミノ酸）を含有してよい。ＴＭドメインの一部または全部を欠くことに加えて、当該ポリペプチドは、ＨＣＭＶのｇＨの天然のＣ末端ドメインを欠いてもよく、Ｃ末端ドメインの一部を欠いてもよい。本発明は、前記修飾されたｇＨポリペプチドをコードする核酸分子、および前記修飾されたｇＨポリペプチドを、例えば、組換えによる発現、または化学合成によって（少なくとも一部において）作製するためのプロセスも提供する。

本発明は、前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体のタンパク質成分をコードする１つまたは複数の核酸分子を細胞に導入することを伴う、トランスフェクションの方法を提供する。前記１つまたは複数の核酸分子は、細胞に安定に導入することもでき（例えば、染色体への組み込みによって）、細胞に一過性に導入することもできる。本発明は、前記トランスフェクションから得られる細胞も提供する。前記トランスフェクションから得られる細胞は、前記１つまたは複数の核酸分子が安定に導入された細胞であることが好ましい。本発明は、前記細胞の後代、前記細胞のクローンまたは前記細胞から継代した細胞も提供する。これらの細胞を培養して本発明の複合体を発現させることができ、次いでそれを精製することができる。

本発明は、ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を産生する細胞であって、（ｉ）ＨＣＭＶゲノムを含有すること、かつ／または（ｉｉ）ＨＣＭＶビリオンを産生すること、かつ／または（ｉｉｉ）非エンベロープＨＣＭＶタンパク質のいずれも発現すること、をしない細胞も提供する。理想的には、細胞は、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のうちの１つを欠き、好ましくはそのうちの２つを欠き、より好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の３つ全てを欠く。

本発明は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を認識するが、単離されたｇＨポリペプチド、ｇＬポリペプチド、ｇＯポリペプチド、ｐＵＬ１２８ポリペプチド、ｐＵＬ１３０ポリペプチドまたはｐＵＬ１３１Ａポリペプチドのいずれにも結合せず、かつ／または、単離されたｇＨ−ｇＬヘテロ二量体に結合しない抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を抗原として使用して生じさせたものであってよい。本発明の抗体は中和抗体であることが好ましい。本発明の抗体は、多様な抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択方法を使用して同定したものであってよい。下記の通り、本発明の抗体は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であってよく、かつ／または、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体であってよい。

本発明は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を使用して抗体を生じさせるための方法も提供する。あるいは、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を使用して、多様な抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択方法を使用して抗体を同定することができる。

本発明の抗体は、診断アッセイにおいて使用することができ、そして直接的にまたは間接的に標識されていてよい。一部の実施形態では、本発明の抗体は、療法において、例えば、ＨＣＭＶ感染症の治療において使用することができる。

図１は、Ｈｉｓタグを付けた可溶性ｇＨを哺乳動物細胞で発現させるために使用する７５９１ｂｐの構築物のプラスミドマップを示す。この構築物のヌクレオチド配列は配列番号２３に示されている。当該構築物は、ＣＭＶプロモーター、ｍｙｃ−ポリヒスチジンタグと融合した、配列番号４（全長のｇＨタンパク質のアミノ酸残基１〜７１５からなるｇＨ可溶性タンパク質）をコードする遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｂｇｈ−ＰｏｌｙＡ）シグナル終結配列、Ｆ１ファージ複製開始点、ＳＶ４０複製開始点、ネオマイシン耐性遺伝子、ｐＵＣサブゲノムのプロモーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。

図２は、ｇＬを哺乳動物細胞で発現させるために使用する５１５６ｂｐの構築物のプラスミドマップを示す。この構築物のヌクレオチド配列は配列番号２４に示されている。当該構築物は、イントロンＡを含有するＣＭＶプロモーター／エンハンサー、配列番号７（ｇＬ）をコードする遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｂｇｈ−ＰｏｌｙＡ）シグナル終結配列、カナマイシン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製開始点を含む。

図３は、ＵＬ１２８を哺乳動物細胞で発現させるために使用する４８３５ｂｐの構築物のプラスミドマップを示す。この構築物のヌクレオチド配列は配列番号２５に示されている。当該構築物は、イントロンＡを含有するＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＵＬ１２８遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｂｇｈ−ＰｏｌｙＡ）シグナル終結配列、カナマイシン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製開始点を含む。

図４は、ＵＬ１３０を哺乳動物細胞で発現させるために使用する４９６４ｂｐの構築物のプラスミドマップを示す。この構築物のヌクレオチド配列は配列番号２６に示されている。当該構築物は、イントロンＡを含有するＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＵＬ１３０遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｂｇｈ−ＰｏｌｙＡ）シグナル終結配列、カナマイシン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製開始点を含む。

図５は、ＵＬ１３１Ａを哺乳動物細胞で発現させるために使用する４７０９ｂｐの構築物のプラスミドマップを示す。この構築物のヌクレオチド配列は配列番号２７に示されている。当該構築物は、イントロンＡを含有するＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＵＬ１３１Ａ遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｂｇｈ−ＰｏｌｙＡ）シグナル終結配列、カナマイシン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製開始点を含む。

レーンＡ〜Ｃは銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対応し、他方でレーンＥ〜Ｋは、ウエスタンブロット分析に対応する。レーンＥ〜Ｇでは、緑色＝抗ＡＰＰタグ（ｇＨ）、赤色＝抗ｇＬであり、他方でレーンＨ〜Ｋでは、赤色＝抗６Ｈｉｓ（ｇＯ）である。レーンＡ、ＥおよびＨにはラダーが示されている。レーンＢ、ＦおよびＩは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下で沸騰近くまで短時間加熱した試料に対応し、レーンＣ、ＧおよびＫは、加熱またはＤＴＴに供しなかった試料に対応する。

図７は、サイズ排除クロマトグラムを示す。５種のタンパク質全てが単一のピークとして溶出し、したがって、インタクトな五量体複合体が存在することが実証される。

図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析について示す。

図９は、ｇＨ／ｇＬ単独、またはＭＦ５９を用いて製剤化したｇＨ／ｇＬのいずれかによって惹起される中和力価と、五量体複合体単独、またはＭＦ５９を用いて製剤化した五量体複合体のいずれかによって惹起される中和力価の比較を示す。ＭＦ５９を用いて製剤化した、精製された五量体複合体により、製剤化していないタンパク質よりも高い中和力価が惹起された。

図１０は、五量体複合体単独（Ａ）ならびにＭＦ５９を用いて製剤化した五量体複合体（Ｂ）、オキシ水酸化アルミニウムを用いて製剤化した五量体複合体（Ｃ）およびＴＬＲ７アゴニストが吸着した水酸化アルミニウムを用いて製剤化した五量体複合体（Ｄ）によって惹起される中和力価を示す。

図１１は、自己増幅性ＲＮＡおよびサブユニット単独で、または組合せにより、高い中和抗体力価が惹起されることを示すグラフである。具体的には、ＨＣＭＶ五量体複合体をコードする自己増幅性ＲＮＡ（ＬＮＰに封入された自己複製ＲＮＡ）；ＭＦ５９を用いてアジュバント化した精製された五量体のサブユニット；自己増幅性ＲＮＡの種々の配列、その後のＭＦ５９中サブユニット；または自己増幅性ＲＮＡとサブユニットの組合せによって惹起された中和力価が示されている。自己増幅性ＲＮＡおよびサブユニットの用量は１μｇであり、混合した用量は１＋１μｇであった。中和アッセイ：補体の存在下でのＡＲＰＥ−１９細胞のＶＲ１８１４感染。

図１２は、精製されたｇＨ／ｇＬおよび五量体のサブユニットを使用したワクチン接種に対する（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞の正味の％、およびＴｈ０ ＣＤ４、Ｔｈ１ ＣＤ４およびＴｈ２ ＣＤ４の％の単位として）を示すグラフである。

図１３は、精製された五量体複合体を使用したワクチン接種に対する（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞の正味の％の単位として）を示すグラフである。

図１４は、精製された五量体複合体を使用したワクチン接種に対する（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ＣＤ８＋Ｔ細胞の正味の％の単位として）を示すグラフである。

図１５は、ｇＨペプチドプール２を使用したワクチン接種に対する（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ＣＤ８＋Ｔ細胞の正味の％の単位として）を示すグラフである。

本発明のタンパク質
ＵＬ７５遺伝子によってコードされるＨＣＭＶ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）は、感染性に必要であり、アルファヘルペスウイルス、ベータヘルペスウイルスおよびガンマヘルペスウイルスのメンバーの間で保存されているビリオン糖タンパク質である。ｇＨは、ｇＬと安定な複合体を形成し、この複合体の形成により、細胞表面でのｇＨの発現が容易になる。ＨＳＶ−２およびＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ複合体の結晶構造に基づいて、ｇＬサブユニットおよびｇＨのＮ末端残基は構造の一端で球状ドメイン（「頭部」）を形成し、これは、ｇＢとの相互作用および膜融合の活性化に関係づけられる。ウイルスの膜の近位にあるｇＨのＣ末端ドメイン（「尾部」）も膜融合に関係づけられる。ｇＨは、宿主因子ＴＬＲ２によって認識される決定因子を提示し、そして宿主因子ＴＬＲ２とＴＬＲ１の間で形成されるヘテロ二量体と直接相互作用する。ＴＬＲ２は、ＮＦ−κＢ活性化および細胞からの炎症性サイトカイン応答を媒介する（Ｂｏｅｈｍｅ、ＧｕｅｒｒｅｒｏおよびＣｏｍｐｔｏｎ、２００６年）。

ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株由来のｇＨは、７４２アミノ酸からなることが報告されている（ＧＩ：５２１３９２４８、配列番号１）。ＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株由来のｇＨ（ＧＩ：１３８３１４、配列番号２）も、７４２アミノ酸からなり、６つのＮ−グリコシル化部位（残基５５、６２、６７、１９２、６４１および７００）を有し、Ｎ末端にある疎水性シグナル配列（アミノ酸残基１〜２３）、細胞から細胞外の空間に突出する外部ドメイン（残基２４〜７１７）、疎水性ＴＭドメイン（残基７１８〜７３６）およびＣ末端の細胞質ドメイン（残基７３７〜７４２）からなることが報告されている。配列番号２は、配列番号１およびＨＣＭＶのＡＤ１６９株由来のｇＨ（ＧＩ：１３８３１３、配列番号３）と、それぞれ９９％および９６％のアミノ酸類似性を共有する。

一般には、ｇＨタンパク質のＮ末端シグナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断されて成熟ｇＨタンパク質が生じる。本発明のＨＣＭＶ膜複合体内のｇＨタンパク質はＮ末端シグナル配列を欠いてよい。成熟型のｇＨ（本発明の単離されたＨＣＭＶ膜複合体に見いだされる）はＮ末端シグナル配列、ＴＭドメインおよびＣ末端ドメインを欠くことが好ましい。

全長のＵＬ７５遺伝子配列が発現されることにより、ｇＨを含む可溶性複合体の精製が妨げられる。逆に、ｇＨのＴＭドメインの少なくとも一部分を省略することにより、ｇＨを含む複合体を高い収率および純度で精製することができる。例えば、ちょうどＮ末端シグナル配列およびｇＨの外部ドメインをコードする（しかしＴＭドメインはコードしない）構築物を使用して、容易に精製される形態のｇＨを発現させることができる。前記構築物は、ｇＨの外部ドメインの大部分（例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）をコードしてよいが、ＴＭドメインはコードしない、またはそのごく一部のみをコードしてよい。本発明のｇＨタンパク質は、ｇＨの外部ドメインの全てを含んでもよく、ｇＨの外部ドメインのトランケート形態を含んでもよい。前記外部ドメインのトランケート形態は、全長のＨＣＭＶのｇＨタンパク質と比較して、Ｎ末端および／またはＣ末端の１〜２０アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸残基）を欠いてよい。本発明のｇＨタンパク質の例は配列番号４であり、これは、配列番号１のアミノ酸残基１〜７１５からなる。本発明の好ましいｇＨタンパク質の例は配列番号２９であり、これは、ｇＨのＮ末端シグナル配列、ＴＭドメインおよびＣ末端ドメインを欠き、そして配列番号１のアミノ酸残基２４〜７１５からなる。

本発明のｇＨタンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端の伸長などの追加的なアミノ酸残基を含有してよい。そのような伸長は、ｇＨタンパク質の検出を容易にすることができるタグ（例えば、モノクローナル抗体によって検出するためのエピトープタグ）および／または精製を容易にすることができるタグ（例えば、ニッケルキレート化樹脂上での精製を可能にするポリヒスチジン−タグ）を１つまたは複数含んでよい。ｍｙｃ−タグおよびポリヒスチジン−タグを含むＣ末端の伸長の例は配列番号５で示される。したがって、本発明のｇＨタンパク質（例えば、配列番号６および配列番号３０）は、Ｃ末端に、配列番号５に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでよい。本発明のｇＨタンパク質は、Ｃ末端の伸長と融合した、トランケートされたｇＨの外部ドメインを含んでよい。

ｇＨの外部ドメインは、疎水性ＴＭを欠くｇＨの一部分に対応する。外部ドメインの位置および長さは、所与の配列と配列番号１のペアワイズアラインメントに基づいて、例えば、目的のｇＨポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１とアラインメントし、配列番号１の残基２４〜７１７と整合した配列を同定することによって予測することができる。同様に、ＴＭドメインおよびＣ末端ドメインの位置は、目的のｇＨポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１とアラインメントし、それぞれ配列番号１の残基７１８〜７３６および残基７３７〜７４２と整合する配列を同定することによって予測することができる。あるいは、外部ドメイン、シグナル配列およびＴＭドメインの位置および長さは、所与のｇＨタンパク質配列の長さに沿って疎水性をコンピュータにより解析することに基づいて予測することができる。シグナル配列およびＴＭドメインの疎水性は最高レベルであり、これらの２つの領域は疎水性の低い外部ドメインと隣接している。

本発明のｇＨタンパク質は、配列番号４に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号４に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｇＨタンパク質は、配列番号６に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号６に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｇＨタンパク質は、配列番号２９に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号２９に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｇＨタンパク質は、配列番号３０に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号３０に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。好ましいｇＨタンパク質は、（ｉ）ＨＣＭＶのｇＬと二量体を形成することができ、（ｉｉ）三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体の一部を形成し、（ｉｉｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体の一部を形成し、（ｉｖ）配列番号４または配列番号２９由来の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｖ）ＨＣＭＶビリオンと免疫学的に交差反応する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで惹起することができる。

ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）は、ＵＬ１１５遺伝子によってコードされる。ｇＬはウイルスの複製に必須であると考えられており、ｇＬの既知の機能的特性は全て、ｇＨとの二量体形成と直接関連付けられる。ｇＬ／ｇＨ複合体は、宿主細胞へのウイルスの進入を導くウイルスと原形質膜の融合に必要である。ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株由来のｇＬ（ＧＩ：３９８４２１１５、配列番号７）およびＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株由来のｇＬ（ＧＩ：２３９９０９４６３、配列番号８）は、２７８アミノ酸の長さであることが報告されている。ＨＣＭＶのＡＤ１６９株由来のｇＬ（ＧＩ：２５０６５１０、配列番号９）は、２７８アミノ酸の長さであり、Ｎ末端にシグナル配列を含み（アミノ酸残基１〜３５）、２つのＮ−グリコシル化部位を有し（残基７４および残基１１４）、ＴＭドメインを欠くことが報告されている（Ｒｉｇｏｕｔｓｏｓら、２００３年）。配列番号７のＮ末端シグナル配列はアミノ酸残基１〜３０を含むことが予測される。配列番号８は、配列番号７と９８％のアミノ酸同一性を共有する。２２〜３９種の臨床分離株、ならびに実験室株ＡＤ１６９、ＴｏｗｎｅおよびＴｏｌｅｄｏ由来の全長のｇＬ遺伝子の配列決定により、分離株の間のアミノ酸配列の変動が２％未満であることが明らかになった（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２００２年）。

一般には、ｇＬタンパク質のＮ末端シグナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断されて成熟ｇＬタンパク質が生じる。本発明のＨＣＭＶ膜複合体内のｇＬタンパク質はＮ末端シグナル配列を欠いてよい。本発明の好ましいｇＬタンパク質の例は配列番号３１であり、これは、Ｎ末端シグナル配列を欠き、そして配列番号７のアミノ酸残基３１〜２７８からなる。

本発明のｇＬタンパク質は、配列番号７に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号７に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｇＬタンパク質は、配列番号３１に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号３１に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。好ましいｇＬタンパク質は、（ｉ）ＨＣＭＶのｇＨと二量体を形成することができ、（ｉｉ）三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体の一部を形成し、（ｉｉｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体の一部を形成し、（ｉｖ）配列番号７または配列番号３１由来の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｖ）ＨＣＭＶビリオンと免疫学的に交差反応する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで惹起することができる。

ＵＬ７４遺伝子によってコードされるＨＣＭＶ糖タンパク質Ｏ（ｇＯ）は、分子シャペロンとしての機能を果たし、ｇＨ／ｇＬのＥＲ輸出およびビリオンへの組み込みを増加させることが報告されている。ｇＯは、ｇＨ／ｇＬへの結合についてｐＵＬ１２８−１３１Ａと競合するが、ｇＨ／ｇＬから放出され、その結果、ｇＨ／ｇＬ（ｐＵＬ１２８−１３１Ａを欠く）がビリオンに組み込まれることが提唱されている（Ｒｙｃｋｍａｎ、ＣｈａｓｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ、２０１０年）。他のウイルス遺伝子と比較して、ＨＣＭＶのｇＯは、種々のＨＣＭＶ株の中で異常に可変性であり、２２〜３９種の臨床分離株、ならびに実験室株ＡＤ１６９、ＴｏｗｎｅおよびＴｏｌｅｄｏの間のｇＯアミノ酸配列の変動性は、４５％に近づいた（すなわち、異なる分離株の間でｇＯアミノ酸配列間の同一性はわずか５５％であった）（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２００２年）。ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株由来のｇＯ（ＧＩ：３９８４２０８２、配列番号１０）、ＡＤ１６９株由来のｇＯ（ＧＩ：１３６９６８、配列番号１１）およびＴｏｗｎｅ株由来のｇＯ（ＧＩ：２３９９０９４３１、配列番号１２）は、それぞれ４７２アミノ酸、４６６アミノ酸および４５７アミノ酸からなることが報告されている。配列番号１０と７３％のアミノ酸類似性を共有するＨＣＭＶのＡＤ１６９株のｇＯは、１８個のＮ−グリコシル化部位（残基７５、残基８３、残基８７、残基１０３、残基１３０、残基１５７、残基１６２、残基１７１、残基２１９、残基２４２、残基２８８、残基２９２、残基３５０、残基３８５、残基３９２、残基３９９、残基４３３および残基４５４）を有し、Ｎ末端に切断可能なシグナル配列を含む可能性があり（アミノ酸残基１〜３０からなることが予測される）、これは成熟ポリペプチドには存在しない。Ｒｉｇｏｕｔｓｏｓ（２００３年）により、ＴＭドメイン（領域１０〜２８および領域１９０〜２１２）およびコイルドコイル領域（残基２４０〜２７２）が存在することが予測された。

一般には、ｇＯタンパク質のＮ末端シグナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断されて成熟ｇＯタンパク質が生じる。本発明のＨＣＭＶ膜複合体内のｇＯタンパク質はＮ末端シグナル配列を欠いてよい。本発明の好ましいｇＯタンパク質の例は配列番号３２であり、これは、Ｎ末端シグナル配列を欠き、そして配列番号１０のアミノ酸残基３１〜４７２からなる。

本発明のｇＯタンパク質は、配列番号１０に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号１０に記載されている配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｇＯタンパク質は、配列番号３２に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号３２に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。好ましいｇＯタンパク質は、（ｉ）三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体の一部を形成することができ、（ｉｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体の一部を形成することができず、（ｉｉｉ）配列番号１０または配列番号３２の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｉｖ）ＨＣＭＶビリオンと免疫学的に交差反応する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで惹起することができる。

ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株由来のｐＵＬ１２８（ＧＩ：３９８４２１２４、配列番号１３）は、１３０アミノ酸からなること、および中途終結を引き起こす１ヌクレオチド置換を含有することが報告されている。ＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株由来のｐＵＬ１２８（ＧＩ：３９８４１８８２、配列番号１４）およびＡＤ１６９株由来のｐＵＬ１２８（ＧＩ：５９８０３０７８、配列番号１５）は、１７１アミノ酸からなることが報告されている。配列番号１３の中途終結に起因して、配列番号１３と配列番号１５は、配列番号１５の全長にわたってわずか７５％の同一性を共有する。ｐＵＬ１２８は、配列番号１３の残基１〜２７に位置するＮ末端シグナル配列を有することが予測されるが、ＴＭドメインを欠くことが予測される。本発明の好ましいｐＵＬ１２８タンパク質の例は配列番号３３であり、これは、Ｎ末端シグナル配列を欠き、そして配列番号１４のアミノ酸残基２８〜１７１からなる。配列番号３３も、配列番号１５のアミノ酸残基２８〜１７１からなる。

本発明のｐＵＬ１２８タンパク質は、配列番号１５に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号１５に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｐＵＬ１２８タンパク質は、配列番号３３に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号３３に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。好ましいｐＵＬ１２８タンパク質は、（ｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体の一部を形成することができ、（ｉｉ）配列番号１５または配列番号３３の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｉｉｉ）ＨＣＭＶビリオンと免疫学的に交差反応する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで惹起することができる。

ＵＬ１３０は、ＵＬ１３１Ａ−１２８遺伝子座の中心の最も大きな（２１４コドン）遺伝子である。遺伝子の概念的な翻訳（ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）により、推定されるケモカインドメイン（アミノ酸４６〜１２０）内の２つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位（Ａｓｎ８５およびＡｓｎ１１８）および独特のＣ末端領域の末端の近くの追加的なＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ２０１）を含有する親水性タンパク質に先行する長い（２５アミノ酸）Ｎ末端シグナル配列が予測される。ｐＵＬ１３０は、ＴＭドメインを欠くことが予測される。ｐＵＬ１３０は、感染細胞から非効率的に分泌されるが、ビリオンエンベロープにゴルジ成熟形態として組み込まれる管腔の糖タンパク質であることが報告されている（Ｐａｔｒｏｎｅら、２００５年）。ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株由来のｐＵＬ１３０の配列およびＴｏｗｎｅ株由来のｐＵＬ１３０の配列が公的に入手可能であり（それぞれＧＩ：３９８４２１２５、配列番号１６およびＧＩ：２３９９０９４７３、配列番号１７）、これらは、それぞれ２１４アミノ酸および２２９アミノ酸からなる。配列番号１７は、ｐＵＬ１３０のＣ末端領域内にフレームシフト突然変異を含有することが報告されており、配列番号１６のＨＣＭＶと配列番号１６の全長にわたって９４％の同一性を共有する。

一般には、ｐＵＬ１３０タンパク質のＮ末端シグナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断されて成熟ｐＵＬ１３０タンパク質が生じる。本発明のＨＣＭＶ膜複合体内のｐＵＬ１３０タンパク質はＮ末端シグナル配列を欠いてよい。本発明の好ましいｐＵＬ１３０タンパク質の例は配列番号３４であり、これは、Ｎ末端シグナル配列を欠き、そして配列番号１６のアミノ酸残基２６〜２１４からなる。

本発明のｐＵＬ１３０タンパク質は、配列番号１６に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号１６に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｐＵＬ１３０タンパク質は、配列番号３４に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号３４に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。その代わりに、本発明のｐＵＬ１３０タンパク質は、配列番号１７に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号１７に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。好ましいｐＵＬ１３０タンパク質は、（ｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体を形成することができ、（ｉｉ）それぞれ配列番号１６、配列番号３４または配列番号１７の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｉｉｉ）ＨＣＭＶビリオンと免疫学的に交差反応する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで惹起することができる。

ｐＵＬ１３１Ａの機能は、内皮細胞におけるＨＣＭＶの複製だけでなく上皮細胞におけるＨＣＭＶの複製にも必要である。ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株由来のｐＵＬ１３１Ａ（ＧＩ：３９８４２１２６、配列番号１８）およびＴｏｗｎｅ株由来のｐＵＬ１３１Ａ（ＧＩ：２３９９０９４７４、配列番号１９）およびＡＤ１６９株由来のｐＵＬ１３１Ａ（ＧＩ：２１９８７９７１２、配列番号２０）は、それぞれ１２９アミノ酸、１２９アミノ酸および７６アミノ酸からなることが報告されている。ｐＵＬ１３１Ａは、配列番号１８の残基１〜１８に位置するＮ末端シグナル配列を含有すること、およびＴＭドメインを欠くことが予測される。ＡＤ１６９株由来のＵＬ１３１Ａは、フレームシフトを引き起こす１塩基対の挿入を含有することが報告されている（ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ、２００５年）。配列番号１８は、配列番号２０とＮ末端の２８アミノ酸にわたって９６％同一であるが、ＡＤ１６９のＵＬ１３１Ａ遺伝子のフレームシフトに起因して、配列番号１８の全長にわたる配列番号２０との同一性はわずか３６％である。

一般には、ｐＵＬ１３１Ａタンパク質のＮ末端シグナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断されて成熟ｐＵＬ１３１Ａタンパク質が生じる。本発明のＨＣＭＶ膜複合体内のｐＵＬ１３１Ａタンパク質はＮ末端シグナル配列を欠いてよい。本発明の好ましいｐＵＬ１３１Ａタンパク質の例は配列番号３５であり、これは、Ｎ末端シグナル配列を欠き、そして配列番号１８のアミノ酸残基１９〜１２９からなる。配列番号３５も、配列番号１９のアミノ酸残基１９〜１２９からなる。

本発明のｐＵＬ１３１Ａタンパク質は、配列番号１７に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号１８に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｐＵＬ１３１Ａタンパク質は、配列番号３５に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号３５に記載されている配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。好ましいｐＵＬ１３１Ａタンパク質は、（ｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体を形成することができ、（ｉｉ）配列番号１８または配列番号３５の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｉｉｉ）ＨＣＭＶビリオンと免疫学的に交差反応する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで惹起することができる。

臨床分離株を線維芽細胞で継代すると、ＵＬ１３１Ａ−１２８遺伝子座における突然変異が非常に急速に蓄積し、他の細胞型に感染する能力が妨げられる可能性がある。実際に、そのような突然変異がウイルスストックに現れるのには、わずか３回の線維芽細胞での継代で十分であり得る。例えば、線維芽細胞で継代されていない臨床分離株と比較して、ＭｅｒｌｉｎおよびＴｏｌｅｄｏはＵＬ１２８に突然変異を有し、ＴｏｗｎｅはＵＬ１３０のＯＲＦに突然変異を有し、ＡＤ１６９は、突然変異したＵＬ１３１ＡのＯＲＦを含有する。臨床分離株は上皮細胞に効率的に感染し、感染性の後代を生じるが、実験室株はそうではないので、内皮細胞のようなこの細胞型は、ＵＬ１３１Ａ−ＵＬ１２８遺伝子座における突然変異に選択されない臨床ＨＣＭＶストックを作製するための実験室における宿主として有望である（ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ、２００５年）。

本発明は、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ複合体、例えば、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯまたはｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａを含む免疫原性組成物を提供する。そのような免疫原性組成物は、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）などの他のＨＣＭＶタンパク質をさらに含んでよい（しかし、非エンベロープＨＣＭＶタンパク質は含まないことが好ましい）。

ｇＢは、ＵＬ５５によってコードされ、ウイルスと細胞膜の間の融合を媒介する。したがって、ｇＢは、ウイルスの進入および感染において重要な役割を果たす。多くの他のウイルスの融合タンパク質と同様に、ｇＢは、細胞膜に挿入する疎水性ループを含有し、そして進入の間に大きな構造的変化を受ける（融合前コンフォメーションおよび融合後コンフォメーション）。ｇＨと同様に、ｇＢは、宿主因子ＴＬＲ２によって認識される決定因子を提示し、そして宿主因子ＴＬＲ２とＴＬＲ１の間で形成されるヘテロ二量体と直接相互作用する。ＴＬＲ２はＮＦ−κＢ活性化および細胞からの炎症性サイトカイン応答を媒介する（Ｂｏｅｈｍｅ、ＧｕｅｒｒｅｒｏおよびＣｏｍｐｔｏｎ、２００６年）。

糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、ヒトヘルペスウイルスのエンベロープ糖タンパク質のうちで最も高度に保存されている。ＨＣＭＶのｇＢの構造は現在のところ未知であるが、ＨＣＭＶのｇＢの構造は、配列相同性に基づいて、ＨＳＶのｇＢおよびＥＢＶのｇＢの構造と同様であることが想定される。また、ＨＳＶ−１のｇＢおよびＥＢＶのｇＢと水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）タンパク質の融合タンパク質（Ｇ）のｇＢの間には配列類似性がないにもかかわらず、ＨＳＶ−１のｇＢおよびＥＢＶのｇＢの融合後コンフォメーションとＶＳＶ−Ｇの融合後コンフォメーションの驚くべき程度の構造的な相同性が示される。

ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株由来のｇＢ（ＧＩ：３９８４２０７６、配列番号２１）およびＴｏｗｎｅ株由来のｇＢ（ＧＩ：１３８１９３、配列番号２２）は９０７アミノ酸からなることが報告されている。ＨＣＭＶのＡＤ１６９株由来のｇＢ（ＧＩ：１３８１９２、配列番号２３）は９０６アミノ酸からなり、１９個のＮ−グリコシル化部位（残基３７、残基６８、残基７３、残基８５、残基２０８、残基２８１、残基２８６、残基３０２、残基３４１、残基３８３、残基４０５、残基４０９、残基４１７、残基４４７、残基４５２、残基４６４、残基４６５、残基５５４、残基および５８５）を有し、Ｎ末端にあるシグナル配列（アミノ酸残基１〜２５）、細胞外領域（残基２６〜７５１）、ＴＭドメイン（残基７５２〜７７２）および細胞質ドメイン（残基７７３〜９０７）からなることが報告されている（Ｒｉｇｏｕｔｓｏｓら、２００３年）。女性５３人の試験において、ｇＢの亜型が５種見いだされ、その間のヌクレオチド多型は２８〜１２４ｂｐにわたる（Ｍｕｒｔｈｙら、２０１１年）。ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株のｇＢとＡＤ１６９株のｇＢは９５％のアミノ酸類似性を共有する。ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株のｇＢではＮ末端シグナル配列は配列番号２１のアミノ酸残基１〜２２からなることが予測される。

一般には、ｇＢタンパク質のＮ末端シグナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断されて成熟ｇＢタンパク質が生じる。本発明のＨＣＭＶ膜複合体内のｇＢタンパク質はＮ末端シグナル配列を欠いてよい。本発明の好ましいｇＢタンパク質の例は配列番号３６であり、これは、Ｎ末端シグナル配列を欠き、そして配列番号２１のアミノ酸残基２３〜９０７からなる。

本発明のｇＢタンパク質は、配列番号２１に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号２１に記載されている配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｇＢタンパク質は、配列番号３６に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号３６に記載されている配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。好ましいｇＢタンパク質は、（ｉ）配列番号１８または配列番号３６の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｉｉ）ＨＣＭＶビリオンと免疫学的に交差反応する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで惹起することができる。

グリコシル化
ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＢおよびｐＵＬ１３０は糖タンパク質と称することができるが、この命名法は、これらのタンパク質が本発明で使用する際にグリコシル化されていなければならないことを意味するものと解釈されるべきではない。それどころか、本発明の一部の実施形態では、ポリペプチドのうちの１つまたは複数はグリコシル化されていない。しかし、通常は、本発明の複合体内の１つまたは複数（または全て）のポリペプチドがグリコシル化されている。一部の実施形態では、本発明の複合体内の１つまたは複数（または全て）のポリペプチドが、突然変異した哺乳動物細胞などの培養細胞のグリコシル化突然変異株によってグリコシル化されている。そのようなグリコシル化突然変異株により、グリコシル化の野生型パターンとは異なるポリペプチドのグリコシル化のパターンが生じる、すなわち、生じるポリペプチドのグリコフォームが野生型グリコフォームとは異なる。

グリコシル化のレベルおよび種類は、宿主細胞の種に左右される。一般に、進化の点でヒトから最も遠い種、例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫および植物などのグリコシル化レパートリーはヒトのグリコシル化レパートリーとの類似性が最も低い。細菌細胞ではタンパク質は通常グリコシル化されていないが、Ｎ結合グリコシル化系のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉへの移入が報告されている（Ｌａｎｇｄｏｎ、ＣｕｃｃｕｉおよびＷｒｅｎ、２００９年）。昆虫細胞ではタンパク質はグリコシル化されている場合がある。しかし、脊椎動物の細胞とは異なり、昆虫細胞は最後から２番目のガラクトースおよび末端シアル酸で複合Ｎ結合側鎖を生成することができない。したがって、昆虫細胞におけるグリコシル化の種類は治療用タンパク質のためには最適ではない可能性がある。酵母細胞はマンノースを使用してＮ結合グリコシル化（アスパラギンと）およびＯ結合グリコシル化（セリン／トレオニンと）を行うことができる。哺乳動物細胞では典型的ではないゴルジにおける過剰グリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）（外側の鎖の伸長）が酵母細胞の特徴であり、これにより、抗体反応性に関する問題が生じる可能性がある。また、哺乳動物細胞とは異なり、酵母細胞はマンノース以外の糖を組み込むことができない。酵母細胞および昆虫細胞とは対照的に、哺乳動物細胞において発現される哺乳動物糖タンパク質は忠実にグリコシル化され、その結果、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて形成されるものと最も類似した組換え産物が生じる。

したがって、本発明の複合体内のグリコシル化されたポリペプチドは、（ｉ）哺乳動物のグリコシル化パターンを有し、かつ／または、（ｉｉ）昆虫細胞のグリコシル化パターンを含有しないことが好ましい。一部の実施形態では、本発明のタンパク質のうちの１つまたは複数は、最後から２番目のガラクトースおよび末端シアル酸の複合Ｎ結合側鎖を含有する。

本発明の膜タンパク質複合体
本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体は、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶタンパク質の間のヘテロオリゴマー結合体である。これらの複合体内のタンパク質は、非共有結合による相互作用および／または共有結合による相互作用によって結びついていてよい。ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ三量体複合体では、ジスルフィド結合によってｇＨがｇＯおよびｇＬと連結している。本発明の五量体複合体では、ｇＨ、ｇＬおよびｐＵＬ１２８は、一般には、ジスルフィド結合によって連結しているが、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａは、一般には、非共有結合による相互作用によって五量体複合体に組み込まれる（実施例７に示されている通り）。一部の実施形態では、本発明のｐＵＬ１３０タンパク質および／または本発明のｐＵＬ１３１Ａタンパク質は非共有結合による相互作用によって五量体複合体に組み込まれる。さらに、本発明のｐＵＬ１３０タンパク質および／またはｐＵＬ１３１Ａは、非共有結合による相互作用によって内部で連結していてよい。

三量体複合体および五量体複合体の化学量論は、それぞれ１：１：１（ＨｕｂｅｒおよびＣｏｍｐｔｏｎ、１９９９年）および１：１：１：１：１（Ｒｙｃｋｍａｎ、ＣｈａｓｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ、２０１０年）であると仮定されるが、これは未だに決定的には確認されていない。

本発明者らは、本発明の膜タンパク質複合体は免疫原性応答を誘導することができることを発見した。したがって、本発明の膜タンパク質複合体はＨＣＭＶ感染に対する免疫を誘導することができる。これらの２つの機能は、本発明の膜タンパク質複合体上の、中和抗体を含めた抗体の産生を惹起することができるエピトープの保持に左右される。五量体複合体について種々の立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）が公知である。例えば、Ｍａｃａｇｎｏ（２０１０年）は、内皮細胞、上皮細胞、および骨髄細胞のＨＣＭＶ感染を中和したヒトモノクローナル抗体のパネルを単離した。ＵＬ１２８遺伝子産物内の保存されたエピトープに結合した抗体を１つ例外として、他の抗体は全て、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１Ａ複合体の２種以上のタンパク質の発現が必要な立体構造エピトープに結合した。本発明の五量体複合体は、Ｍａｃａｇｎｏ（２０１０年）によって同定された立体構造エピトープのうちの１つまたは複数を有することが好ましい。

本発明の各タンパク質は、ＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株および／またはＡＤ１６９株と比較して、挿入、欠失および置換などの突然変異を、これらの突然変異がタンパク質の抗原としての使用に有害でない限り（具体的には、タンパク質が少なくともＨＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株および／またはＡＤ１６９株の膜タンパク質複合体に結合することができる抗体および／または前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体の生物学的効果を中和することができる抗体の産生を惹起することができる１つまたは複数のエピトープを保持する限り）含有してよい。さらに、そのような突然変異により本発明の膜タンパク質複合体を形成するタンパク質の能力が妨げられるべきではない。本発明の膜タンパク質複合体を形成する能力は、タンパク質の精製を実施すること、および非還元ＰＡＧＥによってタンパク質を分析すること、ウエスタンブロットおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーによって試験することができる。タンパク質は、複合体の一部を形成する場合、全てがネイティブなＰＡＧＥゲル上の単一のバンドに存在し得、かつ／またはサイズ排除クロマトグラムの単一のピークに存在し得る。

本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体は、種々のレベルの純度で、例えば、総タンパク質の少なくとも８０質量％、８５質量％、９０質量％、９５質量％、または９９質量％に調製することができる、すなわち、複合体が組成物中の総タンパク質質量の少なくとも８０％を占める。組成物はポリアクリルアミドを含まなくてよい。

発現系
一態様では、本発明は、本発明の膜タンパク質複合体を発現させるためのプロセスを提供する。本発明において使用するための適切な発現系は当業者に周知であり、その多くはＤｏｙｌｅ（２００８年）に詳しく記載されている。一般に、必要な宿主において核酸分子を維持し、増やし、発現させてポリペプチドを産生させることに適した任意の系またはベクターを使用することができる。適切なヌクレオチド配列を、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（２０００年）に記載のものなどの種々の周知であり慣例的な任意の技法によって発現系に挿入することができる。一般に、コードする遺伝子をプロモーター、および必要に応じてオペレーターなどの制御エレメントの制御下に置くことができ、その結果、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列が形質転換された宿主細胞においてＲＮＡに転写される。

適切な発現系の例としては、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母の染色体エレメント、ウイルス、例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス、またはそれらの組合せなどに由来するベクター、例えば、コスミドおよびファージミドを含めたプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメントに由来するものなどを含めた染色体系、エピソーム系およびウイルス由来の系が挙げられる。プラスミドに含有させ、発現させることができるものよりも大きなＤＮＡの断片を送達するために、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）も使用することができる。

適切な発現系としては、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させたもしくはトランスフェクトした昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系も本発明のタンパク質を作製するために使用することができる。本発明のタンパク質は、哺乳動物細胞などの真核細胞で産生されることが好ましい。

組換えポリペプチドは一過性に発現させることも安定に発現させることもできる。組換えタンパク質は安定に発現させることが好ましい。例えば、目的のペプチドを安定に発現する細胞系統に、ウイルス起源の複製および／または内在性発現エレメントならびに同じベクター上または別のベクター上にある選択可能なマーカー遺伝子を含有し得る発現ベクターを使用してトランスフェクトすることができる。ベクターを導入した後、選択培地に切り換える前に細胞を強化培地中で１〜２日間増殖させることができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、これが存在することにより、導入された配列を首尾よく発現する細胞を増殖させ、回収することが可能になる。安定に形質転換された細胞の抵抗性クローンを、細胞型に適した組織培養技法を使用して増殖させることができる。

発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系統は当該分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞およびヒト肝細胞癌（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）細胞ならびにいくつもの他の細胞系統を含めた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系統が挙げられる。哺乳動物細胞における発現は、産生されるタンパク質が忠実な哺乳動物のグリコシル化パターンを有し、したがって、感染性ＨＣＭＶ粒子上に存在するエピトープを保有するので好ましい。したがって、本発明の膜タンパク質複合体を哺乳動物細胞で産生させることにより、感染の間に、天然に存在するＨＣＭＶ粒子に結合することができる抗体の産生が導かれる。

バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料がキットの形態で、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から市販されている。これらの技法は、一般に、当業者に公知であり、Ｓｕｍｍｅｒｓら（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、１９８７年）に十分に記載されている。この系において使用するために特に適した宿主細胞としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２（すなわち、安定にトランスフェクトしたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることによる）およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞が挙げられる。一部の実施形態では、本発明のタンパク質は昆虫細胞では産生されない。

当該分野で公知の多くの植物細胞培養物および植物全体の遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞の遺伝子発現系の例としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号およびＺｅｎｋ（１９９１年）^２３に記載されているものが挙げられる。具体的には、プロトプラストを単離し、培養して再生された植物全体を生じることができる全ての植物を利用することができ、その結果、移入された遺伝子を含有する植物全体が回収される。実際に、これだけに限定されないが、サトウキビ、サトウダイコン、綿、果実および他の木、マメ科植物および野菜の主要な種の全てを含めた全ての植物を培養細胞または組織から再生することができる。

原核生物発現系の例としては、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主細胞として使用するものが挙げられる。

真菌発現系の例としては、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）を宿主細胞として使用するものが挙げられる。

ＨＥＫ２９３細胞は、リン酸カルシウム法およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を含めた種々の技法によるトランスフェクト能が高いので、本発明のＨＣＭＶタンパク質を一過性に発現させるために適している。有用なＨＥＫ２９３の細胞系統は、ＥＢＶのＥＢＮＡ１タンパク質を発現するもの、例えば、２９３−６Ｅなどである（Ｌｏｉｇｎｏｎら、２００８年）。形質変換されたＨＥＫ２９３細胞は、本発明のタンパク質複合体を増殖培地中に高レベルで分泌し、したがって、そのようなタンパク質複合体を増殖培地から直接精製することが可能になることが示されている。

ＣＨＯ細胞は、長期間にわたる安定な遺伝子発現およびタンパク質の高収率が可能になるので、免疫原または抗原として使用するための本発明のＨＣＭＶタンパク質を工業生産するために特に適した哺乳動物宿主である。

一部の実施形態では、本発明の膜タンパク質複合体は、それが発現される細胞から分泌される。本発明の他の実施形態では、本発明のタンパク質は分泌されない。Ｅ．ｃｏｌｉでは、例えば、非分泌タンパク質が封入体内に蓄積され得る。組換えタンパク質を封入体から精製するための方法は当該分野で周知である。

トランスフェクションは、リン酸カルシウムの使用、電気穿孔を含めた種々の方法によって、または細胞膜と融合し、それらのカーゴを内側に沈着するリポソームを作製するための材料とカチオン性脂質を混合することによって行うことができる。

核酸構築物
本発明は、ｇＬ、ＴＭドメインを欠くｇＨ、および少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする組換え核酸を提供する。前記組換え核酸は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子ではなく、（ｂ）アルファウイルスレプリコンではなく、（ｃ）ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４などのアルファウイルス非構造タンパク質のいずれもコードせず、（ｄ）ＥＭＣＶまたはＥＶ７１などの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有せず、かつ／または（ｅ）ＦＭＤＶなどのウイルスの２Ａ部位を含有しないことが好ましい。前記組換え核酸の例は、本発明のｇＬタンパク質、本発明のｇＨタンパク質、本発明のｐＵＬ１２８タンパク質、本発明のｐＵＬ１３０タンパク質および本発明のｐＵＬ１３１タンパク質をコードする単一の構築物であってよい。

本発明は、本発明の１つまたは複数のタンパク質をコードする複数の組換え核酸も提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、２つの核酸構築物：本発明のｇＨタンパク質および本発明のｇＬタンパク質をコードする第１の構築物、ならびに本発明のｐＵＬ１２８タンパク質、本発明のｐＵＬ１３０タンパク質および本発明のｐＵＬ１３１Ａタンパク質をコードする第２の構築物を提供する。

本発明は、本発明のｇＬタンパク質をコードする第１の組換え核酸分子；本発明のｇＨタンパク質をコードする第２の組換え核酸分子；および１つまたは複数の追加的なＨＣＭＶタンパク質をコードする１つまたは複数の第３の組換え核酸分子を含む複数の組換え核酸も提供する。前記第１の組換え核酸分子、第２の組換え核酸分子および／または第３の組換え核酸分子（複数可）は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子ではなく、（ｂ）アルファウイルスレプリコン（複数可）ではなく、（ｃ）ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４などのアルファウイルス非構造タンパク質のいずれもコードせず、（ｄ）ＥＭＣＶまたはＥＶ７１などの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有せず、かつ／または（ｅ）ＦＭＤＶなどのウイルスの２Ａ部位を含有しないことが好ましい。

一実施形態では、第３の組換え核酸分子は、本発明のｇＯタンパク質をコードし、別の実施形態では、第３の組換え核酸分子（複数可）は、本発明のｐＵＬ１２８タンパク質、ｐＵＬ１３０タンパク質およびｐＵＬ１３１Ａタンパク質をコードする。したがって、複合体内の個々のポリペプチドをコードする配列は単一の核酸分子に存在してもよく、２つ以上の核酸分子の間に分布してもよい。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）本発明のｇＬタンパク質をコードする第１の組換え核酸分子、（ｉｉ）本発明のｇＨタンパク質をコードする第２の組換え核酸分子、（ｉｉｉ）本発明のｐＵＬ１２８タンパク質をコードする第３の組換え核酸分子、（ｉｖ）本発明のｐＵＬ１３０タンパク質をコードする第４の組換え核酸分子、および（ｖ）本発明のｐＵＬ１３１Ａタンパク質をコードする第５の組換え核酸分子を含む複数の組換え核酸を提供する。前記第１の組換え核酸分子、第２の組換え核酸分子、第３の組換え核酸分子、第４の組換え核酸分子および／または第５の組換え核酸分子（複数可）は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子ではなく、（ｂ）アルファウイルスレプリコン（複数可）ではなく、（ｂ）ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４などのアルファウイルス非構造タンパク質のいずれもコードせず、（ｃ）ＥＭＣＶまたはＥＶ７１などの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有せず、かつ／または（ｄ）ＦＭＤＶなどのウイルスの２Ａ部位を含有しないことが好ましい。

本発明のｇＨタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２４に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号２４に記載されている配列と少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｇＬタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２５に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号２５に記載されている配列と少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｐＵＬ１２８タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２６に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号２６に記載されている配列と少なくとも７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｐＵＬ１３０タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２７に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号２７に記載されている配列と少なくとも７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。本発明のｐＵＬ１３１Ａタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２８に対して種々の程度の同一性を有してよく、例えば、配列番号２８に記載されている配列と少なくとも７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。

本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含んでよい。ｃＤＮＡとは異なり、ゲノムＤＮＡはイントロンを含有してよい。いくつかの遺伝子はイントロンが存在する場合、より効率的に発現される。ゲノムＵＬ１２８遺伝子およびＵＬ１３１Ａ遺伝子はそれぞれ２つのエクソンからなり、一方ＵＬ１３０はいかなるイントロンも含有しない。ゲノム配列を使用する場合、作製されるタンパク質は、スプライシングに左右され、これは使用する発現系に応じて変動し得る。

本発明は、前記核酸を含むベクターであって、適切なプロモーターおよびターミネーターを含むベクターを提供する。前記組換え核酸はプラスミドであってもよく、細胞のゲノムに組み込むこともできる。これらのベクター内のプロモーターはＨＣＭＶプロモーターであっても非ＨＣＭＶプロモーターであってもよい。

本発明は、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする１つまたは複数の組換え核酸分子を発現系に導入すること；前記１つまたは複数の核酸を前記発現系において発現させること；ならびに前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を精製することによって発現させるためのプロセスも提供する。一部の実施形態では、このプロセスは、細胞に、本発明のｇＨタンパク質、ｇＬタンパク質、ｐＵＬ１２８タンパク質、ｐＵＬ１３０タンパク質およびｐＵＬ１３１Ａタンパク質または本発明のｇＨタンパク質、ｇＬタンパク質およびｇＯタンパク質のいずれかをコードする第１の核酸構築物をトランスフェクトすることを含む。一部の実施形態では、このプロセスは、細胞に、本発明のｇＨタンパク質をコードする第１の核酸構築物、本発明のｇＬタンパク質をコードする第２の核酸構築物、および本発明の１つまたは複数の追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする１つまたは複数の第３の核酸構築物をトランスフェクトすることを含んでよい。一部の実施形態では、このプロセスは、細胞に、本発明のｇＨタンパク質および本発明のｇＬタンパク質をコードする第１の核酸構築物、ならびに本発明の１つまたは複数の追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質、例えば、ｇＯまたはｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａなどをコードする第２の核酸構築物（複数可）をトランスフェクトすることを含んでよい。

前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を哺乳動物細胞において発現させることができる。前記単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体は、必要に応じて精製することができる。

本発明の細胞
本発明は、本発明の１つの核酸分子または複数の核酸分子を発現する細胞であって、完全なＨＣＭＶゲノムを含まない細胞も提供する。前記細胞は、本発明の前記１つの核酸分子または複数の核酸分子を用いて安定に形質転換することができる。前記細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞であることが好ましい。

本発明は、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む細胞であって、ＨＣＭＶゲノムを含有せず、かつ／またはＨＣＭＶビリオンを産生せず、かつ／または非エンベロープＨＣＭＶタンパク質のいずれも発現しない細胞を提供する。

膜タンパク質複合体の単離および精製
本発明の複合体は、単離された形態で調製し、使用することが好ましい。「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、その天然の環境から取り出されたことを意味する。したがって、「単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体」とは、ＨＣＭＶ感染細胞の表面上または感染性ＨＣＭＶビリオン内にあるＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を包含しない。

実施例に記載されている発現方法を使用して、本発明の複合体を高収率で作製することができる。［上記を参照されたい］。

本発明は、本発明のＨＣＭＶ膜複合体を精製するためのプロセスを提供する。そのような本発明のプロセスにより、ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を、ゲル電気泳動によって決定して、総タンパク質の＞８５質量％、＞８６質量％、＞８７質量％、＞８８質量％、＞８９質量％、＞９０質量％、＞９１質量％、＞９２質量％、＞９３質量％、＞９４質量％または＞９５質量％の純度で作製することが可能になる。これらの高レベルの純度により、複合体が診断への適用における免疫原として、またはワクチン製剤における抗原として使用するために適したものになる。

本発明は、本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を精製するためのプロセスであって、前記精製が、１つまたは複数のクロマトグラフィーのステップを含むプロセスを提供する。前記クロマトグラフィーのステップは、Ｎｉ^２＋アフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィー、および／またはサイズ排除クロマトグラフィーを含んでよい。

組成物
本発明は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を含む組成物も提供する。本発明は、本発明の精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を含む組成物も提供する。

ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体は、免疫原性組成物、またはワクチン組成物に組み込むことができる。そのような組成物を使用して、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗体を生じさせることができる。

本発明は、本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を含む医薬組成物を提供する。同様に、本発明は、本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を薬学的に許容される担体と組み合わせることを伴う、医薬組成物を作出するためのプロセスを提供する。

それらの抗原に加えて、本発明の免疫原性組成物および医薬組成物は、一般には、薬学的に許容される担体を含み、そのような担体の詳細な考察はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙにおいて入手可能である。

組成物のｐＨは、通常は６から８の間であり、６．５から７．５の間（例えば、約７）であることがより好ましい。安定なｐＨは、緩衝液、例えば、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を使用することによって維持することができる。したがって、組成物は、一般に、緩衝液を含む。

組成物は滅菌されていてよく、かつ／または発熱物質を含まなくてよい。組成物はヒトに対して等張性であってよい。

組成物は、その抗原（複数可）を免疫学的に有効な量で含む。「免疫学的に有効な量」とは、対象に投与した際に抗原に対する抗体応答を惹起するために有効な量である。この量は、治療される個体の健康状態、個体の年齢、個体の免疫系の抗体を合成する能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、治療担当医師による医学的状況の評価、および他の関連性のある因子に応じて変動し得る。この量は、慣例的な試験によって決定することができる比較的広範な範囲に入ることが予想される。本発明の組成物の抗原含有量は、一般に、用量当たりのタンパク質の質量を単位として表される。抗原当たり１０〜５００μｇ（例えば、５０μｇ）の用量が有用であり得る。

免疫原性組成物は、免疫学的アジュバントを含んでよい。したがって、例えば、免疫原性組成物は、アルミニウム塩アジュバントまたは水中油エマルション（例えば、ＭＦ５９またはＡＳ０３などのスクアレンを含む水中油エマルション）を含んでよい。適切なアルミニウム塩としては、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、ホスフェート（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ…（１９９５年）、Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ． Ｐｌｅｎｕｍの８章＆９章を参照されたい）、またはそれらの混合物が挙げられる。塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非結晶など）を取ってよく、抗原が塩に吸着していることが好ましい。患者に投与するための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、＜４ｍｇ／ｍｌ、＜３ｍｇ／ｍｌ、＜２ｍｇ／ｍｌ、＜１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は０．３ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間である。最大で用量当たり０．８５ｍｇが好ましい。水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントが本発明で使用するために特に適している。

１つの適切な免疫学的アジュバントは、アルミニウム塩に吸着させた、ＷＯ２０１１／０２７２２２において定義されている式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ（１９９５年）に開示されているもののいずれかを含めた多くのさらなるアジュバントを使用することができる。

組成物は、特に複数回投与形式で包装される場合には、抗菌薬を含んでよい。チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗菌薬が一般にワクチンに見いだされるが、水銀を含まない防腐剤を使用するか、防腐剤を全く使用しないことが好ましい。

組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０などのポリソルベートを含んでよい。界面活性剤は、一般に、低レベル、例えば、＜０．０１％で存在する。

組成物は、浸透圧をもたらすためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでよい。ＮａＣｌの濃度は１０＋２ｍｇ／ｍｌ、例えば約９ｍｇ／ｍｌが典型的である。

本発明の組成物は、一般に、対象に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔への注射）によって、または任意の他の適切な経路によって実現することができる。例えば大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針（例えば、皮下針）を介するものであってよいが、無針注射を代わりに使用することができる。典型的な筋肉内投与体積は０．５ｍｌである。

投与は、単回投薬スケジュールを伴っても複数回投薬スケジュールを伴ってもよい。

免疫される対象はヒトであり、任意の年齢、例えば、０〜１２ヶ月齢、１〜５歳、５〜１８歳、１８〜５５歳、または、５６歳以上であってよい。

本発明のワクチンは、予防用（すなわち、疾患を予防するためのもの）であってもよく、治療用（すなわち、疾患の症状を軽減または排除するためのもの）であってもよい。

本発明の単離および／または精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体は、単独で、または、例えば、ＲＮＡ初回刺激（ｐｒｉｍｅ）、その後にタンパク質追加刺激（ｂｏｏｓｔ）などの混合モダリティレジメンにおける初回刺激または追加刺激のいずれかとして、投与することができる。ＲＮＡ初回刺激タンパク質追加刺激の戦略の、タンパク質初回刺激タンパク質追加刺激の戦略と比較した利点としては、例えば、抗体価の上昇、より平衡のとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイル、ウイルス粒子のものと同様のＴＨ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答の誘導、および非中和抗体の産生の減少が挙げられる。ＲＮＡ初回刺激により、組成物がアジュバントを含有するかしないかにかかわらず、組成物の免疫原性を増大させることができる。

ＲＮＡ初回刺激−タンパク質追加刺激戦略では、ＲＮＡおよびタンパク質は同じ標的抗原を対象とする。ＲＮＡを送達する適切な形態の例としては、ウイルス様レプリコン粒子（ＶＲＰ）、アルファウイルスＲＮＡ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入されたレプリコンまたは製剤化されたＲＮＡ、例えば、カチオン性ナノエマルション（ＣＮＥ）を用いて製剤化されたレプリコンなどが挙げられる。適切なカチオン性水中油ナノエマルションは、ＷＯ２０１２／００６３８０に開示されており、例えば、油のコア（例えば、スクアレンを含む）およびカチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ−コレステロールなど）を含む。

ＷＯ２０１２／０５１２１１には、五量体複合体のタンパク質構成物をコードするＶＲＰおよび製剤化されたＲＮＡ（ＣＮＥおよびＬＮＰ）を用いて免疫したマウスにおいて五量体複合体に対する抗体が産生されることが開示されている。これらの抗体は、上皮細胞におけるＨＣＭＶ感染を中和することができることが見いだされている。ＲＮＡ初回刺激−タンパク質追加刺激レジメンは、まず（例えば、０〜８週に）、本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体のタンパク質成分の１つまたは複数をコードするＲＮＡ（ＶＲＰ、ＬＮＰ、ＣＮＥなどとして送達することができる）を用いた１回または複数回の初回刺激免疫を実施し、次いで、必要に応じてアジュバントを用いて製剤化された、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を用いて、または、必要に応じてアジュバントを用いて製剤化された、本発明の精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を用いて１回または複数回の追加刺激免疫を後に（例えば、２４〜５８週に）実施することを伴ってもよい。

したがって、本発明は、第１のエピトープを含む第１のポリペプチドＨＣＭＶ抗原および第２のエピトープを含む第２のポリペプチドＨＣＭＶ抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、（ｉ）病原体由来の第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激用組成物、および（ｉｉ）その病原体由来の第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激用組成物を含むキットにも関する。

抗原は、独立に、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａからなる群から選択することができる。前記第１のポリペプチドＨＣＭＶ抗原は、本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体、例えば、三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体または五量体複合体などであることが好ましい。前記第２のポリペプチドＨＣＭＶ抗原は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体、例えば、三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体もしくは五量体複合体など、または本発明の精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体、例えば、三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体もしくは五量体複合体などであることが好ましい。第１のポリペプチド抗原および第２のポリペプチド抗原は実質的に同じであってよい。第１のポリペプチド抗原は可溶性ポリペプチドであっても膜アンカー型ポリペプチドであってもよく、第２のポリペプチド抗原は可溶性ポリペプチドであってよい。第１のポリペプチド抗原は融合ポリペプチドであってよい。第２のポリペプチド抗原は融合ポリペプチドであってよい。自己複製ＲＮＡはアルファウイルス由来のＲＮＡレプリコンであってよい。

自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、本発明のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体、例えば、本発明の三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体または五量体複合体などをコードする。一部の実施形態では、第２のポリペプチド抗原は、本発明の精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体、例えば、本発明の精製された三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体または精製された五量体複合体などである。

一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ビロソーム、免疫刺激性複合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルション、油中水エマルション、エマルソーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）、ポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルションまたはそれらの組合せに封入されているか、それに結合しているか、またはそれに吸着している。

一部の実施形態では、キットまたは免疫原性組成物の初回刺激用組成物は、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ビロソーム、免疫刺激性複合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルション、油中水エマルション、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルションをさらに含む。

本発明の抗体
本発明は、本発明の単離および／または精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を認識するが、単離されたｇＨポリペプチド、ｇＬポリペプチド、ｇＯポリペプチド、ｐＵＬ１２８ポリペプチド、ｐＵＬ１３０ポリペプチドまたはｐＵＬ１３１Ａポリペプチドのいずれにも結合せず、かつ／または単離されたｇＨ−ｇＬヘテロ二量体に結合しない抗体を提供する。

下記の通り、本発明の抗体は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であってよく、かつ／または、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体であってよい。

本発明の抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。多くの状況にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が好ましい。本来抗体に関連して使用される「モノクローナル」という用語は、全てが同じ標的タンパク質を認識するが、異なるＢ細胞によって産生され、そのタンパク質の異なるエピトープを対象とする「ポリクローナル」抗体とは対照的に、免疫細胞の単一のクローン株によって産生される抗体を指す。本明細書で使用される場合、「モノクローナル」という単語は、いかなる特定の細胞起源も意味しないが、同じ標的タンパク質内の特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す任意の抗体の集団を指す。この使用は当該分野では標準的なものである。

したがって、ｍＡｂは、免疫細胞、非免疫細胞、無細胞系などを含めた任意の適切なタンパク質合成系を使用して作製することができる。したがって、ｍＡｂは、従来のモノクローナル抗体方法論（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準の体細胞ハイブリダイゼーション技法）を含めたさまざまな技法によって、Ｂリンパ球のウイルス形質転換または発がん性形質転換によって、コンビナトリアル合成によって、ファージディスプレイによってなどで作製することができる。したがって、本発明の抗体は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を抗原として使用して、または本発明の精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を抗原として使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで生じさせることができる。抗体を生じさせる動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどであってよい。代替の手法として、抗体のファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択方法を使用して抗体を同定することができる。

本発明の抗体は、種々の形態をとってよい。例えば、本発明の抗体は、哺乳動物において天然に見いだされるネイティブな抗体であってよい。ネイティブな抗体は重鎖および軽鎖で構成される。重鎖および軽鎖はどちらも、可変ドメインと定常ドメインに分けられる。異なる抗体の異なる抗原を認識する能力は、それらの軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインが異なることから生じる。脊椎動物種におけるネイティブな抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれかである。ネイティブな抗体の重鎖の定常ドメインはα、δ、ε、γまたはμであり、それぞれＩｇＡクラス、ＩｇＤクラス、ＩｇＥクラス、ＩｇＧクラス、またはＩｇＭクラスの抗体を生じさせる。クラスは、さらに、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２などに分けることができる。抗体は、アロタイプによって分類することもでき、例えば、γ重鎖はＧ１ｍアロタイプａ、ｆ、ｘもしくはｚ、Ｇ２ｍアロタイプｎ、またはＧ３ｍアロタイプｂ０、ｂ１、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｃ３、ｃ５、ｇ１、ｇ５、ｓ、ｔ、ｕ、もしくはｖを有し得、κ軽鎖はＫｍ（１）アロタイプ、Ｋｍ（２）アロタイプまたはＫｍ（３）アロタイプを有し得る。ネイティブなＩｇＧ抗体は２つの同一の軽鎖（１つの定常ドメインＣＬおよび１つの可変ドメインＶＬ）ならびに２つの同一の重鎖（３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ならびに１つの可変ドメインＶＨ）を有し、これらはジスルフィド架橋によって結びついている。種々のクラスのネイティブな抗体のドメインおよび三次元構造が周知である。

本発明の抗体が定常ドメインを伴う軽鎖を有する場合、その軽鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖であってよい。本発明の抗体が定常ドメインを伴う重鎖を有する場合、その重鎖は、α重鎖、δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖またはμ重鎖であってよい。γクラス（すなわち、ＩｇＧ抗体）の重鎖が好ましい。

本発明の抗体は、抗原結合活性を保持するネイティブな抗体の断片であってよい。例えば、ネイティブな抗体をパパイン消化することにより、「Ｆａｂ」断片と称される、それぞれが単一の抗原結合性部位を有する２つの同一の抗原結合性断片、および残りの抗原結合活性を有さない「Ｆｃ」断片が生じる。ペプシン処理により、２つの抗原結合性部位を有する「Ｆ（ａｂ’）２」断片がもたらされる。「Ｆｖ」は、完全な抗原結合性部位を含有するネイティブな抗体の最小の断片であり、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。したがって、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、またはネイティブな抗体の任意の他の種類の断片であってよい。

本発明の抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖として含む「単鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」または「ｓＦｖ」）であってよい。一般には、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ｓｃＦｖが抗原と結合するための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインの間の短いポリペプチドリンカー（例えば、＞１２アミノ酸）によってつながっている。少なくとも最初の選択のためにｓｃＦｖタンパク質を発現させる典型的なやり方は、ファージディスプレイライブラリーまたは他のコンビナトリアルライブラリーに関連する。複数のｓｃＦｖが単一のポリペプチド鎖に連結していてよい。

本発明の抗体は、複数の連結したＦｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む「ダイアボディ」または「トリアボディ」などであってよい。ＶＨドメインとＶＬドメインの間の、互いと対をなすことが可能になるには短い（例えば、＜１２アミノ酸）リンカーを使用することによって、それらは、その代わりに、別のＦｖ断片の相補的なドメインと対をなさざるを得ず、したがって、２種の抗原結合性部位が創出される。これらの抗体は、ＣＨドメインおよび／またはＣＬドメインを含んでよい。

本発明の抗体は、単一の可変ドメインまたはＶＨＨ抗体であってよい。ラクダ科の動物（例えば、ラクダおよびラマ）およびサメにおいて天然に見いだされる抗体は、重鎖を含有するが軽鎖は含有しない。したがって、哺乳動物のネイティブな抗体とは異なり、抗原認識は単一の可変ドメインによって決定される。そのような抗体の定常ドメインは省略することができるが、抗原結合活性は保持される。少なくとも最初の選択のために単一の可変ドメイン抗体を発現させる１つのやり方は、ファージディスプレイライブラリーまたは他のコンビナトリアルライブラリーに関連する。

本発明の抗体は、「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）であってよい。そのようなｄＡｂは、ヒト抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインに基づき、分子量がおよそ１３ｋＤａ（完全な抗体のサイズの１０分の１未満）である。異なる標的を認識する重鎖ｄＡｂおよび軽鎖ｄＡｂの対を形成することにより、二重特異性を有する抗体を作出することができる。ｄＡｂは直ちに体内から取り除かれ、したがって、持続放出系が有効であるが、血液タンパク質（例えば、血清アルブミン）に結合する第２のｄＡｂに融合させることによって、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）とのコンジュゲーションによって、または他の技法によって、循環中にさらに持続させることができる。

抗体は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づく足場、例えば、アドネクチンまたはトリネクチンを有してよい。フィブロネクチンに基づく足場は免疫グロブリンではないが、全体的なフォールディングは、最小の機能性抗体断片のものと密接に関連する。この構造に起因して、非免疫グロブリン抗体は、性質および親和性が天然の抗体と同様である抗原結合特性を模倣する。ＦｎＩＩＩドメインは、２つのベータシート間に分布し、それら自体が互いに詰まってタンパク質のコアを形成する７つまたは８つのベータストランドを有し、そしてベータストランドを互いに接続し、溶媒露出（ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｐｏｓｅｄ）しているループ（抗体ＣＤＲと類似している）をさらに含有する。そのようなループがベータシートサンドイッチの各縁端部に少なくとも３つ存在し、縁端部はベータストランドの方向に対して垂直のタンパク質の境界である。ＦｎＩＩＩループは標準のクローニング技法を使用して免疫グロブリンＣＤＲと置き換えることができ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の親和性成熟化のプロセスと同様であるｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるループランダム化およびシャッフリング戦略において使用することができる。ＦｎＩＩＩ足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型の第１０のモジュール（すなわち、^１０Ｆｎ３）に基づいてよい。

したがって、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、多様な構造的特徴を有する種々のタンパク質を包含するが、通常は、２つのβ−シート内に配置された逆平行βストランドの２層サンドイッチを伴う全βタンパク質フォールディングを有する少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。

本発明で使用する抗体は、単一の抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖなどの場合）または複数の抗原結合部位（例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片またはダイアボディまたはネイティブな抗体などの場合）を含んでよい。抗体が２つ以上の抗原結合部位を有する場合、抗原の架橋が有利にもたらされ得る。

抗体が２つ以上の抗原結合性部位を有する場合、抗体は、単一特異性（すなわち、全ての抗原結合性部位が同じ抗原を認識する）であってもよく、多重特異性（すなわち、抗原結合性部位が２つ以上の抗原を認識する）であってもよい。

本発明の抗体は、非タンパク質物質を、例えば、共有結合性コンジュゲーションを介して含んでよい。例えば、抗体は放射性同位元素を含んでよく、例えば、ＺＥＶＡＬＩＮ（商標）およびＢＥＸＸＡＲ（商標）製品はそれぞれ^９０Ｙ同位元素および^１３１Ｉ同位元素を含む。さらなる例として、抗体は細胞傷害性分子を含んでよく、例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）は細菌毒素であるＮ−アセチル−γカリチアマイシンに連結している。さらなる例として、抗体は共有結合したポリマーを含んでよく、例えば、ポリオキシエチル化ポリオールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合することにより、抗体の循環半減期が増大することが報告されている。

一部の実施形態では、抗体は、１つまたは複数の定常ドメイン（例えば、ＣＨドメインまたはＣＬドメインを含む）を含んでよい。上記の通り、定常ドメインはκ軽鎖もしくはλ軽鎖またはα重鎖、δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖もしくはμ重鎖を形成し得る。抗体が定常ドメインを含む場合、その定常ドメインは、ネイティブな定常ドメインであっても修飾された定常ドメインであってもよい。重鎖は、３つの定常ドメイン（αクラス、γクラス、δクラスなどの場合）または４つの定常ドメイン（μクラス、εクラスなどの場合）のいずれかを含んでよい。定常ドメインは、抗体と抗原の間の結合性相互作用に直接関与しないが、これだけに限定されないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与；Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；食作用；および細胞表面受容体の下方制御を含めた種々のエフェクター機能をもたらし得る。

定常ドメインは、ネイティブな抗体の重鎖のＣ末端領域である「Ｆｃ領域」を形成することができる。本発明の抗体がＦｃ領域を含む場合、そのＦｃ領域は、ネイティブなＦｃ領域であっても修飾されたＦｃ領域であってもよい。Ｆｃ領域はいくつかの抗体の機能のために重要であり、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）の活性はＦｃ依存性である。ネイティブな抗体のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から重鎖のＣ末端までにわたると定義される。Ｆｃ領域は、一般には、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（例えば、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＣ）、ＦｃγＲＩＩＩ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＦｃＲｎ、ＦｃαＲ（ＣＤ８９）、ＦｃδＲ、ＦｃμＲ、ＦｃεＲＩ（例えば、ＦｃεＲＩαβγ２またはＦｃεＲＩαγ２）、ＦｃεＲＩＩ（例えば、ＦｃεＲＩＩＡまたはＦｃεＲＩＩＢ）などの１つまたは複数のＦｃ受容体に結合することができる。Ｆｃ領域は、同様にまたはその代わりに、Ｃ１ｑなどの補体タンパク質に結合することができ得る。抗体のＦｃ領域に対する修飾を使用して、そのエフェクター機能（複数可）を変化させること、例えば、受容体への結合親和性を上昇または低下させることができる。

抗体は、一般には、グリコシル化されている。重鎖のＣＨ２ドメインに結合したＮ結合グリカンは、例えば、Ｃ１ｑおよびＦｃＲへの結合に影響を及ぼし得、グリコシル化されていない（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体は、これらの受容体に対する親和性がより低い。グリカン構造は、活性にも影響を及ぼす可能性があり、例えば、グリカンの二分枝鎖の末端にあるガラクトース糖の数（０個、１個または２個）に応じて補体媒介性細胞死の差異が見られ得る。抗体のグリカンによって投与後にヒト免疫原性応答が生じないことが好ましい。

抗体は、天然では付随すると思われる産物から遊離した形態で調製することができる。抗体の天然の環境の混入成分としては、酵素、ホルモン、または他の宿主細胞タンパク質などの物質が挙げられる。

有用な抗体は、それらの標的抗原に対して、ナノモルまたはピコモル単位（例えば、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍ、１０^−１３Ｍの、またはそれよりも密接な）親和定数を有する。そのような親和性は、従来の分析的な技法を使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）計装に具体化された表面プラズモン共鳴技法を使用し、製造者の説明書に従って操作して決定することができる。

本発明で使用するモノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または（例えば、獣医科用に）非ヒト抗体であってよい。

一部の実施形態では、抗体はヒトｍＡｂである。これらは、種々の手段によって調製することができる。例えば、目的の抗原を産生するヒトＢ細胞を、例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を必要に応じてポリクローナルＢ細胞活性化因子の存在下で感染させることによって不死化することができる。ヒトモノクローナル抗体は、非ヒト宿主において、例えば、ＳｃｉｄマウスまたはＴｒｉｍｅｒａマウス中に、宿主自身の免疫系を機能性ヒト免疫系と置き換えることによって、産生させることもできる。本明細書では集合的に「ヒトＩｇマウス」と称される、Ｍｅｄａｒｅｘからの「ｈｕｍａｂ ｍｏｕｓｅ」およびＡｂｇｅｎｉｘからの「ｘｅｎｏ−ｍｏｕｓｅ」を含めたトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミック（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ）マウスがヒトモノクローナル抗体を生成するために首尾よく使用されてきた。ファージディスプレイもこの目的に関して成功している。非ヒト抗体とは異なり、ヒト抗体では、ヒトに投与した際にそれらの定常ドメインを対象とする免疫応答が惹起されない。さらに、これらのヒト抗体の可変ドメインは完全ヒトであり（具体的には、相補性決定領域［ＣＤＲ］に加えて、可変ドメインのフレームワーク領域が完全ヒトである）、したがって、ヒトに投与した際に、可変ドメインフレームワーク領域を対象とする免疫応答は惹起されない（潜在的に、任意の抗イディオタイプ応答以外）。ヒト抗体は、ヒト起源ではない配列はいかなるものも含まない。

一部の実施形態では、抗体はヒト化ｍＡｂ、ＣＤＲグラフト化ｍＡｂまたはキメラｍＡｂである。これらは、種々の手段によって調製することができる。例えば、これらは、非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。非ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを得、標準の分子生物学技法を使用して、ヒト免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するために、当該分野で公知の方法を使用してマウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる。ＣＤＲグラフト化抗体を創出するために、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる。ヒト化抗体を創出するために、１つまたは複数の非ＣＤＲ可変フレームワーク残基を変更することもできる。Ｈ１ ＣＤＲ、Ｈ２ ＣＤＲおよびＨ３ ＣＤＲを一緒にアクセプターＶＨドメインに移入することができるが、それらのうちの１つまたは２つのみを移入することも適切であり得る。同様に、Ｌ１ ＣＤＲ、Ｌ２ ＣＤＲおよびＬ３ ＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つ全てをアクセプターＶＬドメインに移入することができる。好ましい抗体は、ドナーＣＤＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全てを有する。１つのＣＤＲのみを移入する場合、一般には、そのＣＤＲは、通常６つのうちで最も短いＬ２ ＣＤＲではない。一般には、ドナーＣＤＲは全て同じヒト抗体由来であるが、これらを混合すること、例えば、第１の抗体由来の軽鎖ＣＤＲと第２の抗体由来の重鎖ＣＤＲを移入することも可能である。

一部の実施形態では、抗体は非ヒトｍＡｂである。これらは、種々の手段、例えば、マウスｍＡｂを調製するための最初のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ技法によって調製することができる。

本発明の抗体を生じさせるための方法
本発明は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体または本発明の精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を使用して抗体を生じさせるための方法も提供する。これらの抗体はヒト抗体であってもヒト化抗体であってもよい。これらの抗体は、本発明の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体に特異的であり、単離されたｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０またはｐＵＬ１３１Ａには結合しないことが好ましい。そのような抗体は、診断アッセイのために使用することができ、そして直接的にまたは間接的に標識されていてよい。広範囲の抗体標識が当該分野で公知である。本発明の他の実施形態では、本発明の抗体は、治療のために、例えば、ＨＣＭＶ感染症の処置において使用することができ、抗原の生物活性を阻害または中和することができる中和抗体の形態であってよい。

定義
「組換え」とは、本明細書においてポリヌクレオチドを説明するために使用される場合、その起源または操作によって、（１）天然で付随するポリヌクレオチドの全部または一部が付随せず、かつ／または（２）天然で連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結しているゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源、または合成起源であるポリヌクレオチドを意味する。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドを発現させることによって作製されるポリペプチドを意味する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなってもよく、追加的な何かを含み、例えば、Ｘ＋Ｙであってもよい。

「実質的に」という単語により、「完全に」は排除されず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要であれば、「実質的に」という単語は本発明の定義から省くことができる。

数値ｘと関連した「約」という用語は、任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

特に明記されていない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスでは、混合にいかなる特定の順序も必要ない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。例えば、３つの成分が存在する場合、２つの成分を互いと組み合わせることができ、次いでその組合せを第３の成分と組み合わせることができる。

動物（特にウシ）材料を細胞の培養に使用する場合、その材料は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を伴わない、特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を伴わない供給源から入手すべきである。全体的に、動物由来の材料が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。

化合物を組成物の一部として体内に投与する場合、その化合物を、その代わりに適切なプロドラッグと置き換えることができる。

ポリペプチド配列間の配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年）を使用し、初期状態のパラメータ（例えば、ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．５を用い、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する）を使用してペアワイズアラインメントアルゴリズムによって決定することが好ましい。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ内のニードルツールで都合よく実行される（Ｒｉｃｅ、ＬｏｎｇｄｅｎおよびＢｌｅａｓｂｙ、２０００年）。配列同一性は本発明のポリペプチド配列の長さ全体にわたって算出されるべきである。

本発明の特定の実施形態
本発明の特定の実施形態としては、以下が挙げられる：

１．ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を作製するためのプロセスであって、前記ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質の組換え発現を含むプロセス。

２．ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体の精製を含む、項目１に記載のプロセス。

３．ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を、
−ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする１つまたは複数の組換え核酸分子を発現系に導入すること、
−前記１つまたは複数の核酸を前記発現系において発現させること、ならびに
−前記膜タンパク質複合体を精製すること
によって発現させるためのプロセス。

４．細胞に、膜貫通ドメインを欠くｇＨの断片をコードする第１の核酸構築物、ｇＬタンパク質をコードする第２の核酸構築物、および少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする第３の核酸構築物をトランスフェクトするステップを含む、項目３に記載のプロセス。

５．前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を哺乳動物細胞で発現させる、項目３または項目４に記載のプロセス。

６．ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を作製するためのプロセスであって、前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を項目３に記載のプロセスに従って発現させるステップと、単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を精製するステップとを含むプロセス。

７．ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体がｇＨ、ｇＬおよびｇＯからなる、前記項目のいずれかに記載のプロセス。

８．ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体がｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａからなる、前記項目のいずれかに記載のプロセス。

前記ｇＨが配列番号１、２、３、４、６、２９または３０に記載されている配列のいずれか１つを含み、またはそれからなり、かつ／または、前記ｇＬが配列番号７、８、９または３１に記載されている配列のいずれか１つを含む、またはそれからなる、前記項目のいずれかに記載のプロセス。

９．前記ｇＯが配列番号１０、１１、１２または３２に記載されている配列のいずれか１つを含む、またはそれからなる、項目７に記載のプロセス。

１０．−前記ｐＵＬ１２８が配列番号１３、１４、１５または３３に記載されている配列のいずれか１つを含み、またはそれからなり、
−前記ｐＵＬ１３０が配列番号１６、１７または３４に記載されている配列のいずれか１つを含み、またはそれからなり、かつ／または、
−前記ｐＵＬ１３１Ａが配列番号１８、１９、２０または３５に記載されている配列のいずれか１つを含む、またはそれからなる、
項目８または項目９に記載のプロセス。

１１．−前記ｇＨが配列番号１、２、３、４、６、２９または３０に記載されている配列のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含み、またはそれからなり、かつ／または、
−前記ｇＬが配列番号７、８、９または３１に記載されている配列のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含む、またはそれからなる、
前記項目のいずれかに記載のプロセス。

１２．前記ｇＯが配列番号１０、１１、１２または３２に記載されている配列のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含む、またはそれからなる、項目１１に記載のプロセス。

１３．−前記ｐＵＬ１２８が、配列番号１３、１４、１５または３３に記載されている配列のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含み、またはそれからなり、
−前記ｐＵＬ１３０が配列番号１６、１７または３４に記載されている配列のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含み、またはそれからなり、かつ／または、
−前記ｐＵＬ１３１Ａが配列番号１８、１９、２０または３５に記載されている配列のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含む、またはそれからなる、
項目１２に記載のプロセス。

１４．前記項目のいずれか１つに規定されるＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を精製するためのプロセスであって、前記生成は、１つまたは複数のクロマトグラフィーのステップを含む、プロセス。

１５．前記クロマトグラフィーのステップが、アフィニティークロマトグラフィー、好ましくは、Ｎｉ^２＋アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目１４に記載のプロセス。

１６．ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体の純度が、＞８５質量％、＞８６質量％、＞８７質量％、＞８８質量％、＞８９質量％、＞９０質量％、＞９１質量％、＞９２質量％、＞９３質量％、＞９４質量％または＞９５質量％である、前記項目のいずれかに記載のプロセス。

１７．前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体内のｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａのうちの１つまたは複数が、
−哺乳動物のグリコシル化パターンを有し、かつ／または、
−昆虫細胞のグリコシル化パターンを含有しない、
前記項目のいずれかに記載のプロセス。

１８．ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体。

１９．前記項目のいずれかに記載のプロセスによって作製される、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体。

２０．項目１８または項目１９に記載の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を含む組成物。

２１．ポリアクリルアミドを含有しない、項目２０に記載の組成物。

２２．ＨＣＭＶのテグメントタンパク質またはカプシドタンパク質を含有しない、項目２０または項目２１に記載の組成物。

２３．液体である、項目２０から２２までのいずれか１つに記載の組成物。

２４．免疫原性組成物である、項目２０から２３までのいずれか１つに記載の組成物。

２５．ｇＢを含む、項目２４に記載の免疫原性組成物。

２６．前記ｇＢが配列番号２１、２２、２３または３６に記載されている配列のいずれか１つを含む、またはそれからなる、項目２５に記載の免疫原性組成物。

２７．前記ｇＢが配列番号２１、２２、２３または３６に記載されている配列のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含む、またはそれからなる、項目２６に記載の免疫原性組成物。

２８．前記ｇＢが、
−哺乳動物のグリコシル化パターンを有し、かつ／または、
−昆虫細胞のグリコシル化パターンを含有しない、
項目２５から２７までのいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

２９．ワクチンである、項目２４から２８までのいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

３０．アジュバントを含む、項目２４から２９までのいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

３１．前記アジュバントが水中油エマルションまたはアルミニウム塩である、項目３０に記載の免疫原性組成物。

３２．−ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体をコードする自己複製ＲＮＡ分子と、
−項目１８または項目１９に記載のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体と
を含む免疫原性組成物。

３３．−ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激用組成物と、
−項目１８または項目１９に記載のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を含む追加刺激用組成物と
を含むキット。

３４．ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨ、および少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする組換え核酸分子であって、
（ａ）自己複製ＲＮＡ分子ではなく、
（ｂ）アルファウイルスレプリコンではなく、
（ｃ）ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４などのアルファウイルス非構造タンパク質のいずれもコードせず、
（ｄ）ＥＭＣＶまたはＥＶ７１などの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有せず、かつ／または、
（ｅ）ＦＭＤＶなどのウイルスの２Ａ部位を含有しない
組換え核酸分子。

３５．−ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａ、または、
−ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨおよびｇＯ
をコードする、項目３４に記載の組換え核酸分子。

３６．ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨ、および少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする複数の組換え核酸であって、前記複数の組換え核酸のうちの１つまたは複数または全てが、
（ａ）自己複製ＲＮＡ分子ではなく、
（ｂ）アルファウイルスレプリコンではなく、
（ｃ）ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４などのアルファウイルス非構造タンパク質のいずれもコードせず、
（ｄ）ＥＭＣＶまたはＥＶ７１などの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有せず、かつ／または、
（ｅ）ＦＭＤＶなどのウイルスの２Ａ部位を含有しない
複数の組換え核酸。

３７．−膜貫通ドメインを欠くｇＨ、およびｇＬをコードする第１の構築物と、
−１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする第２の構築物と
を含む、項目３６に記載の複数の組換え核酸。

３８．前記第２の構築物が、
−ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａ、または、
−ｇＯ
をコードする、項目３７に記載の複数の組換え核酸。

３９．−ｇＬをコードする第１の組換え核酸分子と、
−膜貫通ドメインを欠くｇＨの断片をコードする第２の組換え核酸分子と、
−１つまたは複数の追加的なＨＣＭＶタンパク質をコードする１つまたは複数の第３の組換え核酸分子と
を含む、項目３６に記載の複数の組換え核酸。

４０．（ａ）ｇＨをコードする前記核酸分子が配列番号２４に記載されている配列と８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、
（ｂ）ｇＬをコードする前記核酸分子が配列番号２５に記載されている配列と８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、
（ｃ）ｐＵＬ１２８をコードする前記核酸分子が配列番号２６に記載されている配列と７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、
（ｄ）ｐＵＬ１３０をコードする前記核酸分子が配列番号２７に記載されている配列と７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、かつ／または、
（ｅ）ｐＵＬ１３１Ａをコードする前記核酸分子が配列番号２８に記載されている配列と７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、
項目３４または項目３５に記載の組換え核酸分子、または項目３６から３９までのいずれか１つに記載の複数の組換え核酸分子。

４１．完全なＨＣＭＶゲノムを含まない、項目３４から４０までのいずれか１つに記載の組換え核酸または複数の組換え核酸を発現する細胞。

４２．前記組換え核酸または複数の組換え核酸を用いて安定に形質転換される、項目４１に記載の細胞。

４３．哺乳動物細胞である、項目４１または項目４２に記載の細胞。

４４．ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む細胞であって、
（ａ）ＨＣＭＶゲノムを含有せず、
（ｂ）ＨＣＭＶビリオンを産生せず、
（ｃ）前記ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有せず、かつ／または、
（ｄ）アルファウイルスレプリコンを含有しない
細胞。

４５．ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む単離または精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を作製するためのプロセスであって、項目４１から４４までのいずれか１つに記載の細胞を増殖培地中で増殖させることを伴うプロセス。

４６．前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体が前記増殖培地中に分泌される、項目４５に記載のプロセス。

４７．前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を増殖培地１リットル当たり複合体＞０．８ｍｇ、＞０．８５ｍｇ、＞０．８８ｍｇ、＞０．９ｍｇ、＞０．９５ｍｇ、＞１ｍｇ、＞１．５ｍｇ、＞２ｍｇ、＞２．５ｍｇ、＞３ｍｇ、＞３．５ｍｇ、＞４ｍｇ、＞４．５ｍｇ、＞５ｍｇの濃度まで蓄積させる、項目４６に記載のプロセス。

４８．前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を前記増殖培地から精製するステップを含む、項目４５から４７までのいずれか１つに記載のプロセス。

４９．項目１８または項目１９に記載のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を使用して抗体を生じさせるための方法。

５０．前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、項目４９に記載の方法。

５１．前記抗体が中和抗体である、項目４９または５０に記載の方法。

５２．項目４９から５１までのいずれか１つに記載の方法によって作製される抗体。

５３．項目４９から５２までのいずれか１つに記載の方法によって作製される抗体であって、前記項目のいずれかに記載の単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体には結合するが、単離されたｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０またはｐＵＬ１３１Ａには結合しない抗体。

５４．診断アッセイにおいて使用するための、項目５２または項目５３に記載の抗体。

５５．直接的にまたは間接的に標識されている、項目５２から５４までのいずれか１つに記載の抗体。

５６．治療において使用するための、項目５２から５３までのいずれか１つに記載の抗体。

５８．−ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体のタンパク質成分の１つまたは複数をコードするＲＮＡを用いて１回または複数回の初回刺激免疫を実施することと、
−ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を用いて１回または複数回の追加刺激免疫を後に実施することと
を含む、ＲＮＡ初回刺激−タンパク質追加刺激レジメン。

（実施例１）
五量体複合体を発現しているレプリコンの免疫原性
ＷＯ２０１２／０５１２１１では、単一の構築物由来の五量体複合体の５種のタンパク質全て（ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａ）を発現しているアルファウイルスレプリコンベクターを作製した。このベクターによって発現されるＲＮＡは、ＶＲＰ中にパッケージングするか、または、レプリコンをＣＮＥとの複合体にすることによって、もしくはレプリコンをＬＮＰに封入することによってのいずれかでＲＮＡワクチン接種用に製剤化するかした。ＶＲＰおよび製剤化されたＲＮＡを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスを３週間の間隔で免疫した。免疫したマウス由来の血清をマイクロ中和アッセイで使用して、上皮細胞へのＨＣＭＶ ＴＢ４０の感染を遮断した（補体の不在下で）。ＨＣＭＶ ＴＢ４０株は臨床株と類似しており、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＣＭＶの天然の標的細胞である内皮細胞および上皮細胞に感染する（１７）。マイクロ中和アッセイのデータにより、五量体複合体を発現しているレプリコンにより、ｇＨ／ｇＬを発現しているレプリコンよりも強力な中和抗体が惹起されたことが実証された。マイクロ中和試験のデータにより、五量体複合体を発現しているＲＮＡによって惹起される抗体は、上皮細胞におけるＨＣＭＶ感染を中和することができるが（当該抗体は五量体複合体を標的とするので）、線維芽細胞におけるＨＣＭＶ感染を中和することはできない（感染に五量体複合体が必要とされない）ことも示され、したがって、五量体複合体を発現しているＲＮＡにより、ｇＨ／ｇＬ二量体ではなくインタクトな五量体複合体を特異的に標的とする抗体が惹起されることが実証された。この研究により、五量体複合体に対して抗体を生じさせることができ、これらの抗体は、ＨＣＭＶ感染を中和することができることが実証される。

（実施例２）
哺乳動物細胞において五量体複合体を安定発現させるための構築物
哺乳動物細胞における五量体複合体の発現および精製を可能にするために、５種の核酸構築物を作製した。五量体複合体を精製するための以前の試みは、構築物が全長のｇＨタンパク質をコードする遺伝子を含む場合に失敗した。この問題を克服するための試みにおいて、本発明者らは、全長の配列ではなく、Ｃ末端ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６タグを伴うｇＨの外部ドメイン（ｇＨｅｃｔｏ）（配列番号６）のみをコードする構築物を作製した。以下の５種の構築物を使用して五量体複合体を作製した：配列番号６をコードする構築物（図１および配列番号２３）、全長のｇＬをコードする構築物（図２および配列番号２４）、全長のｐＵＬ１２８をコードする構築物（図３および配列番号２５）、全長のｐＵＬ１３０をコードする構築物（図４および配列番号２６）および全長のｐＵＬ１３１Ａをコードする構築物（図５および配列番号２７）。

（実施例３）
２９３−６Ｅ細胞においてタンパク質複合体をトランスフェクトし、発現させるためのプロトコール
材料：
哺乳動物２９３−６Ｅ細胞（Ｇｉｂｃｏ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｏｐｔｉ−ＭＥＭおよびＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｌｉｎｅａｒ（ＰＥＩ）、ＭＷ２５，０００。

細胞の調製
２９３−６Ｅ細胞を無血清２９３発現培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）中で維持した。細胞が２４時間ごとに倍加し、生存率が９０％超になったら、細胞を培地１ｍＬ当たり１×１０^６個の密度まで希釈した。

トランスフェクション
各構築物に対応するＤＮＡを、トランスフェクトする細胞培養物の体積の２．５％の体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭを使用してＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。ＤＮＡ構築物を、総ＤＮＡが培養物の体積１ｍＬ当たり１μｇに等しくなるように適した比率で混合した。例えば、細胞培養物１Ｌを使用して五量体複合体を安定発現させるためには、２５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに配列番号２３〜２７のそれぞれを２００μｇ添加した。

ＰＥＩを、トランスフェクトする細胞培養物の体積の２．５％の体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭを使用して、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。希釈したＰＥＩを室温で５分、時々旋回させながらインキュベートして混合した。培養物１ｍＬ当たり３μｇのＰＥＩを使用した（例えば、細胞培養物１Ｌに対して３ｍｇのＰＥＩを２５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した）。

ＤＮＡ混合物をＰＥＩ混合物に加え（その結果、培養物１ｍＬ当たり１μｇの総ＤＮＡ＋３μｇのＰＥＩを使用した）、旋回させ、室温で３０分インキュベートした。ＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を、混合物を徐々に添加することによって細胞に加え、混合物が培養物に一様に添加されるように細胞を時々旋回させた。次いで、細胞をすぐに元の増殖条件に戻した。

発現および収集
トランスフェクトした３日後に、細胞を２，０００ｒｐｍで遠心沈殿することによって培地を収集した。次いで、培地をおよそ１０×に濃縮し、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中にダイアフィルトレーションした。最後に、透析した培地を−８０℃で凍結させた。新鮮な培地を培養物に加え、さらに３日後に培地を収集し、上記の通り濃縮／ダイアフィルトレーションした。

（実施例４）
ＨＣＭＶ複合体を精製するためのプロトコール
材料：
ＧＥ ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ；Ｑｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、５ｍｌ；９６ Ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍ ２ ｍＬ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｂｌｏｃｋ；緩衝液Ａ（＝結合緩衝液）５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール；緩衝液Ｂ（＝溶出緩衝液）５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、１Ｍのイミダゾール；ＳＥＣ緩衝液（＝緩衝液の交換およびサイズ排除クロマトグラフィー用）；システムの洗浄用に０．５ＭのＮａＯＨ溶液２×５００ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ １．０ｍｍ、１２ウェル；ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４×）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（１０×）。
手順

内毒素を含まないストック溶液および濾過したＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて緩衝液を調製した。

精製する培地を温かいウォーターバス中で解凍した。その間に、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓを０．５ＭのＮａＯＨで洗浄して可能性のある内毒素コンタミネーションならびに残留するタンパク質／培地を除去し、次いで、濾過した内毒素を含まないＭｉｌｌｉ−Ｑ水ですすいだ。

Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｃａｒｔｒｉｄｇｅをＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍに接続し、水および緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂを定位置にセットした。次いで、「Ｎｉ−ＮＴＡ ｐｒｅｐ」プログラムを開始させて、システムに緩衝液を流し、カラム中のエタノールを洗い流し、緩衝液Ａをカラムに流してカラムを平衡化した。

画分採取用９６ウェルを、各ウェル中に５００ｍＭのＥＤＴＡ溶液３．５μｌを入れることによって準備した。ローディング試料もローディングの直前に調製した。培地が解凍されたら、１／５００体積の２．５Ｍイミダゾールストックを添加し、穏やかに混合した。次いで、ローディング試料を定位置にセットした。

次いで、精製プログラムを開始した。このプログラムは、以下のステップで実施された：試料をカラムにローディングするステップ；ベースラインが定まるまで結合していない化合物を緩衝液Ａで洗い流すステップ；非特異的に結合した化合物を１５カラム体積の２．５％緩衝液Ｂ（＝３０ｍＭのイミダゾール）で洗い流すステップ；１０カラム体積の２５％緩衝液Ｂ（＝２５４ｍＭのイミダゾール）を用いてＨＣＭＶタンパク質複合体を溶出させるステップ；および５カラム体積の１００％緩衝液Ｂ（＝１Ｍのイミダゾール）を用いてカラムを最終的に洗浄するステップ。試料のローディング速度は毎分２．５ｍｌであり、他方洗浄および溶出速度は毎分５ｍＬであった。フロースルー全部ならびに洗浄および溶出からの画分それぞれ１．７５ｍｌを採取した）。

２５０ｍＭのイミダゾールによる溶出ピークから６つまたは７つの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析するために選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに従ってタンパク質の量が最も多かった４つまたは５つの画分を一緒にプールし、ＳＥＣ緩衝液２Ｌに対して室温で１時間の透析を２回行った。透析液を回収し、ＢＣＡ法を使用して濃度を測定した。精製されたタンパク質プール中に複合体の全ての成分が存在することをウエスタンブロットによって検証した。

いくつかの試料の純度を上昇させるために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５１７５−０１）において、２カラム体積より多くのＳＥＣ緩衝液を用いて平衡化した。１カラム体積の緩衝液をローディングした透析済みプールをカラムに流し、１ｍＬの画分を採取した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、どの画分をプールし、維持するかを決定した。

（実施例５）
三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体の発現、精製および特徴付け
以下の３種の構築物を作製した：Ｃ末端ＡＰＰタグを伴うｇＨの外部ドメイン、全長のｇＬおよびＣ末端（Ｈｉｓ）６タグを伴う全長のｇＯ。これらの３種の構築物を、実施例３に記載されている方法に従ってＨＥＫ２９３細胞で同時発現させた。Ｎｉ^２＋アフィニティークロマトグラフィーを伴う実施例４の精製方法を実施した。

次いで、精製された試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後、抗ＡＰＰタグ（ｇＨ）抗体、抗ｇＬ抗体および抗６Ｈｉｓ（ｇＯ）抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した。これらの３種の抗体は、還元性条件下で（＋熱、＋ＤＴＴ）異なるタンパク質に結合したが、非還元条件（−熱、−ＤＴＴ）では全てが単一の複合体に結合した。これらの結果により、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯの三量体複合体としての精製が成功したことが実証される。培地１Ｌ当たりおよそ０．５ｍｇの複合体がＨＥＫ２９３細胞から精製された。ＳＥＣにより、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体の純度が上昇した。

（実施例６）
五量体複合体の発現および精製
実施例３に記載されている方法に従って、ＨＥＫ２９３細胞に実施例２に記載されている５種の構築物を同時トランスフェクトし、トランスフェクトした３日後および６日後に培地を収集し、発現されたタンパク質を、実施例４に記載されている方法に従ってＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー法によって精製した。

精製された五量体複合体についてのサイズ排除クロマトグラムにおける単一のピーク（図７）により、インタクトな単量体複合体が首尾よく精製されたことが示された。五量体複合体の５つのメンバー：ｇＨｅｃｔｏ−Ｈｉｓ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａの全てが精製された複合体内に存在するかどうかを評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を実施した。

（実施例７）
ＨＣＭＶ五量体複合体のウエスタンブロット法
材料：
ＢｉｏＲａｄ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、０．２μｍ孔；ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ（２０×）；メタノール；Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ；ＤＰＢＳ；１０×ＰＢＳ；一次抗体：マウス抗Ｈｉｓタグ、ウサギ抗ｇＬ ２７−４６、マウス抗ｐＵＬ１２８ ４Ｂ１０、マウス抗ＵＬ１３０ ３Ｅ３、およびウサギ抗ＵＬ１３１Ａ ９０−１３６；二次抗体：ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）。

手順
抗体のセットを３つ使用し、１つはｇＨｅｃｔｏ−Ｈｉｓ／ｇＬの検出用であり、１つはｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３１Ａの検出用であり、１つはｐＵＬ１３０の検出用であった。

タンパク質９μｌをＬＤＳ試料緩衝液／還元剤混合物（９：１）３μｌと混合し、１００℃で３分煮沸した。煮沸した試料をウェルにローディングし、２００Ｖで３５分流した。次いで、タンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌを使用して０．２μｍのニトロセルロース膜に２０Ｖで３５分かけて移した。ブロッキング緩衝液を用いて膜を室温で３０分ブロッキングした。膜を一次抗体溶液と一緒に室温で１時間インキュベートした。一次抗体溶液は、全てブロッキング緩衝液とＤＰＢＳの１：１混合物中に希釈した、（Ａ）抗Ｈｉｓタグの１：１００００希釈物および抗ｇＬの１：５０００希釈物、（Ｂ）抗ｐＵＬ１２８の１：５００希釈物および抗ＵＬ１３１Ａの１：１０００希釈物、ならびに（Ｃ）抗ＵＬ１３０の１：５００希釈物からなった。膜を、室温でＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎを用いて３回すすぎ、次いで、二次抗体溶液と一緒に室温で１時間インキュベートした。膜（Ａ）および（Ｂ）については、抗マウス抗体および抗ウサギ抗体のそれぞれの、ブロッキング緩衝液とＤＰＢＳの１：１混合物中１：２５０００希釈物を使用した。膜（Ｃ）については、抗マウス抗体の１：２５０００希釈物のみを使用した。膜を、室温でＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎを用いて３回すすぎ、次いで、室温でＤＰＢＳを用いて１回すすいだ。Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ ９２０１）を用いて膜をスキャンし、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ２．１．１２を使用して解析した。

五量体複合体の５つのメンバー：ｇＨｅｃｔｏ−Ｈｉｓ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａの全てが精製された複合体内に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって同定され（図８）、したがって、五量体複合体の精製が成功したことが確認された。

ｇＨｅｃｔｏ−Ｈｉｓ、ｇＬおよびｐＵＬ１２８は、熱もＤＴＴも伴わないＳＤＳビス−トリスゲルにおいて一緒に移動したが、ｐＵＬ１２８とｇＨ／ｇＬの結びつきはＤＴＴの存在下で完全に消失し（データは示していない）、したがって、ｐＵＬ１２８とｇＨ／ｇＬがジスルフィド結合によって結びつくことが実証された。ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１ＡはｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８と一緒には移動せず、これにより、ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａが非共有結合によって五量体複合体に組み込まれることが示された。

ゲル上で最も優勢であったバンドは非還元、非煮沸条件でｇＨ／ｇＬ複合体の位置の近くにあり、したがって、ＨＣＭＶ五量体複合体に対応すると考えられた。純度は９０質量％であると推定された。ＳＥＣ精製を用いて、純度はほぼ１００％に上昇した。Ｎｉ−ＮＴＡ精製により、培地１リットル当たり五量体複合体およそ０．６ｍｇを精製することができた。

（実施例８）
組換え五量体複合体はコンフォメーション依存性中和抗体に結合する
ヒト中和抗体（ＨｕｍＡｂ）のパネルを血清反応陽性の個体の記憶Ｂ細胞から単離した。五量体複合体タンパク質をプレート上に固定化し、中和抗体を１０倍連続希釈で添加した直接ＥＬＩＳＡを実施した。このＥＬＩＳＡの結果が表１に示されている。ＨｕｍＡｂはいくつかのＵＬタンパク質およびｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０に結合し、これにより、正しいコンフォメーションの五量体複合体が形成されたことが確認された。ｇＨに対するＨｕｍＡｂの結合により、これらのエピトープが組換え複合体上に露出していることが示唆される。

（実施例９）
五量体複合体により、ｇＨ／ｇＬよりも高い中和力価が惹起される

０．１／１μｇの精製されたｇＨ／ｇＬおよび０．１６μｇ／１．６μｇの五量体複合体タンパク質を、ＭＦ５９を用いて、または用いずに製剤化し、マウスを免疫するために使用した。３ｗｐ３の中和力価は、五量体複合体に関してｇＨ／ｇＬ（同じくｇＢと比較して高い中和力価が惹起される）と比較しておよそ４倍の上昇が示された（図９）。ＭＦ５９を用いて製剤化した、精製された五量体複合体により、製剤化していないタンパク質よりも高い中和力価が惹起された（図９）。ＴＬＲ７アゴニストを吸着させた水酸化アルミニウムを用いた五量体複合体の製剤により、オキシ水酸化アルミニウムおよび／またはＭＦ５９を用いた製剤よりもさらに高い中和力価が惹起された（図１０）。

（実施例１０）
精製されたｇＨ／ｇＬ／ｇＯを抗原として使用したモノクローナル抗体の作製
精製されたｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体を１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ中に０．４ｍｇ／ｍＬまで希釈し、凍結させる。ワクチン接種日にｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体を解凍し、解凍したｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体にアジュバント４３８μｌを添加し、チューブを少なくとも１０回反転させることによって十分に混合する。生じた組成物を混合してから１時間以内に使用する。

６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹の２つの群を、５０μｇの精製されたｇＨ／ｇＬ／ｇＯ、およびＭＦ５９アジュバントを含む組成物を用いて免疫する。各マウスを、各四頭筋に１２５μＬを用いて免疫し（すなわち、各マウスは２５０μＬを受ける）、眼窩静脈叢から採血する。

マウス３匹の各群について、免疫スケジュールが以下の表２に要約されている。

ｇＨ／ｇＬ／ｇＯに対するモノクローナル抗体を精製するために、一次ＥＬＩＳＡスクリーニングにｇＨ／ｇＬ／ｇＯ抗原を使用し、次いで、一次スクリーニングからの陽性クローンを、ｇＨ／ｇＬ抗原を使用してその後さらにスクリーニングする。

同様の方法を使用して、精製された五量体複合体を抗原として使用してモノクローナル抗体を作製することができる。

（実施例１１）
ＨＣＭＶの五量体抗原を使用した、ＳＡＭ（商標）ワクチン初回刺激、タンパク質追加刺激およびＲＮＡおよびサブユニットの同時投与
マウスを、３週間の間隔を空けて、ＨＣＭＶ五量体複合体をコードする本明細書に記載の自己複製ＲＮＡであるＳＡＭワクチン、ＭＦ５９を用いてアジュバント化した精製された五量体のサブユニット、ＳＡＭワクチンの種々の配列とその後のＭＦ５９中サブユニット、またはその２つの組合せ（表３）を用いて３回免疫した。ＳＡＭワクチンは、ウイルスによらずに送達するために合成ＬＮＰに封入した。対照マウス群はいかなるワクチンも受けなかった。

各免疫の３週間後に血清を収集し、ＥＬＩＳＡに使用して結合抗体価を決定し、このアッセイにはサブユニットワクチンの場合と同じ精製された抗原を使用した。血清をＡＲＰＥ−１９上皮細胞へのＴＢ４０感染またはＶＲ１８１４感染を使用したＨＣＭＶマイクロ中和アッセイのためにも使用した。３回目の免疫の３週間または４週間後に、屠殺したマウスから脾臓を摘出した。脾臓細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで精製タンパク質またはｇＨタンパク質のｃ末端側の半分に対応する１５−ｍｅｒのペプチド（１１アミノ酸が重複している）のプールを用いて刺激し、サイトカイン発現に対して染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。

ＳＡＭワクチンおよびサブユニット／ＭＦ５９単独により、３回の投与後に強力な中和抗体応答が惹起された（図１１）。ＭＦ５９中の五量体サブユニットではワクチンの１回目および２回目の投与に対して五量体ＳＡＭワクチンほどの応答はなかったが、３回目の投与後、サブユニット／ＭＦ５９によって惹起される力価はＳＡＭワクチンによって惹起される力価に勝った。ＳＡＭワクチン初回刺激を１回、その後サブユニット／ＭＦ５９の単回投与を行うことにより、サブユニット／ＭＦ５９の２回投与よりも強力な中和応答が惹起されたが、これはＳＡＭ単独と同等であった。２回目のサブユニット／ＭＦ５９追加刺激をこれらの動物に行うことにより、サブユニット／ＭＦ５９またはＳＡＭワクチン３回を投与した後に見られるものを超えるレベルの中和応答が生じた。ＳＡＭワクチンを２回投与し、その後、サブユニット／ＭＦ５９を単回投与することは、サブユニット／ＭＦまたはＳＡＭワクチン単独のいずれと比較しても中和応答の利益にならないと思われた。ＭＦ５９を用いずにＳＡＭワクチンとサブユニットを混合することにより、１回目の投与後にＲＮＡ単独と同様の強力な応答が惹起され、２回目および３回目の投与後に強力な中和力価が惹起された。

精製したｇＨ／ｇＬおよび五量体サブユニットを使用したワクチン接種に応答するＣＤ４＋Ｔ細胞を分析した。ＳＡＭワクチン初回刺激タンパク質追加刺激およびＳＡＭワクチン＋サブユニットの混合により、ｇＨ／ｇＬによる再刺激に対して応答するＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＳＡＭワクチンまたはサブユニット／ＭＦ５９単独よりも多く惹起された（図１２）。ＲＮＡ単独に対するＣＤ４＋応答は些細なものであったが、サブユニット／ＭＦ５９単独に対する応答はＴｈ２／Ｔｈ０表現型であった。ＳＡＭワクチンとサブユニットの組合せで免疫したマウス由来の応答細胞の表現型は主にＴｈ１／Ｔｈ０であった。細胞を精製された五量体複合体で再刺激した際に同様の傾向が見られたが、応答は概してより強力であった（図１３）。

精製された五量体のサブユニットまたはｇＨに対するペプチドのプールを使用したワクチン接種に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答も分析した。ＳＡＭワクチンを２回投与し、その後、サブユニット／ＭＦ５９を１回投与することで免疫したマウスにおいてのみ、五量体のサブユニットで再刺激した際に有意なＣＤ８応答が見られた（図１４）。これらの動物由来の細胞では、ｇＨペプチドを用いて再刺激した際にも最も強力な応答が示された（図１５）。ＳＡＭワクチン＋サブユニットを用い、ＳＡＭワクチンを１回投与し、その後、サブユニット／ＭＦ５９、またはＳＡＭワクチン単独を２回投与することで免疫したマウスにおいても再刺激に対する有意な応答が示された（図１５）。

結論：ＳＡＭワクチンを１回投与し、その後、サブユニット／ＭＦ５９を２回接種すること、ならびにＳＡＭワクチン＋サブユニットにより、サブユニット／ＭＦ５９単独よりも高い中和力価が惹起された。ＳＡＭワクチン＋サブユニットに対する応答にはＭＦ５９アジュバントの添加は必要なかった。ＳＡＭワクチン初回刺激サブユニット／ＭＦ５９追加刺激の最も大きな影響は、細胞性免疫応答に対するものであった。ＳＡＭワクチンを含む組合せのいずれによっても主にＴｈ１／Ｔｈ０ ＣＤ４＋応答が生じた。さらに、ＳＡＭワクチンを用いて２回免疫し、その後、サブユニット／ＭＦ５９を用いて１回免疫することにより、最も強力なＣＤ８＋応答が生じた。この試験により、ＳＡＭワクチン初回刺激タンパク質追加刺激のレジメンを最適化して、所望の免疫応答、すなわち、細胞性免疫応答または体液性免疫応答を生じさせることができることが示された。

Claims (27)

1. ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む単離されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を作製するためのプロセスであって、該ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質の組換え発現を含む、プロセス。
2. ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を、
   −ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする１つまたは複数の組換え核酸分子を発現系に導入すること、
   −該１つまたは複数の核酸を該発現系において発現させること、ならびに
   −該膜タンパク質複合体を精製すること
   によって発現させるためのプロセス。
3. 哺乳動物細胞に、膜貫通ドメインを欠くｇＨの断片をコードする第１の核酸構築物、ｇＬタンパク質をコードする第２の核酸構築物、および少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする第３の核酸構築物をトランスフェクトするステップを含む、請求項２に記載のプロセス。
4. 前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体がｇＨ、ｇＬおよびｇＯからなる、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
5. 前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体がｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａからなる、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
6. −前記ｐＵＬ１２８が配列番号１３、１４、１５または３３に記載されている配列のいずれか１つを含み、またはそれからなり、
   −前記ｐＵＬ１３０が配列番号１６、１７または３４に記載されている配列のいずれか１つを含み、またはそれからなり、かつ／または、
   −前記ｐＵＬ１３１Ａが配列番号１８、１９、２０または３５に記載されている配列のいずれか１つを含む、またはそれからなる、
   請求項５に記載のプロセス。
7. 前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体の純度が＞８５質量％、＞８６質量％、＞８７質量％、＞８８質量％、＞８９質量％、＞９０質量％、＞９１質量％、＞９２質量％、＞９３質量％、＞９４質量％または＞９５質量％である、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
8. 前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体内のｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａのうちの１つまたは複数が、
   −哺乳動物のグリコシル化パターンを有し、かつ／または、
   −昆虫細胞のグリコシル化パターンを含有しない、
   前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
9. ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体。
10. 前記請求項のいずれかに記載のプロセスによって作製される、ｇＨ、ｇＬおよび少なくとももう１つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体。
11. 請求項９または請求項１０に記載の単離されたＨＣＭＶ膜複合体を含む免疫原性組成物。
12. ワクチンである、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
13. アジュバントを含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
14. 前記アジュバントが水中油エマルションまたはアルミニウム塩である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
15. −ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体をコードする自己複製ＲＮＡ分子と、
    −請求項９または請求項１０に記載のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体と
    を含む免疫原性組成物。
16. −ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激用組成物と、
    −請求項９または請求項１０に記載のＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を含む追加刺激用組成物と
    を含むキット。
17. ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨ、および少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする組換え核酸分子であって、
    （ａ）自己複製ＲＮＡ分子ではなく、
    （ｂ）アルファウイルスレプリコンではなく、
    （ｃ）ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４などのアルファウイルス非構造タンパク質のいずれもコードせず、
    （ｄ）ＥＭＣＶまたはＥＶ７１などの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有せず、かつ／または、
    （ｅ）ＦＭＤＶなどのウイルスの２Ａ部位を含有しない
    組換え核酸分子。
18. −ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａ、または、
    −ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨおよびｇＯ
    をコードする、請求項１７に記載の組換え核酸分子。
19. ｇＬ、膜貫通ドメインを欠くｇＨ、および少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする複数の組換え核酸であって、前記複数の組換え核酸のうちの１つまたは複数または全てが、
    （ａ）自己複製ＲＮＡ分子ではなく、
    （ｂ）アルファウイルスレプリコンではなく、
    （ｃ）ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４などのアルファウイルス非構造タンパク質のいずれもコードせず、
    （ｄ）ＥＭＣＶまたはＥＶ７１などの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有せず、かつ／または、
    （ｅ）ＦＭＤＶなどのウイルスの２Ａ部位を含有しない
    複数の組換え核酸。
20. −膜貫通ドメインを欠くｇＨ、およびｇＬをコードする第１の構築物と、
    −１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする第２の構築物と
    を含む、請求項１９に記載の複数の組換え核酸。
21. 前記第２の構築物が、
    −ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１Ａ、または、
    −ｇＯ
    をコードする、請求項２０に記載の複数の組換え核酸。
22. −ｇＬをコードする第１の組換え核酸分子と、
    −膜貫通ドメインを欠くｇＨの断片をコードする第２の組換え核酸分子と、
    −１つまたは複数の追加的なＨＣＭＶタンパク質をコードする１つまたは複数の第３の組換え核酸分子と
    を含む、請求項２１に記載の複数の組換え核酸。
23. ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む細胞であって、
    （ａ）ＨＣＭＶゲノムを含有せず、
    （ｂ）ＨＣＭＶビリオンを産生せず、
    （ｃ）前記ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有せず、かつ／または、
    （ｄ）アルファウイルスレプリコンを含有しない
    細胞。
24. ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む単離または精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を作製するためのプロセスであって、請求項２３に記載の細胞を増殖培地中で増殖させることを伴う、プロセス。
25. 前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体が前記増殖培地中に分泌される、請求項２４に記載のプロセス。
26. 前記ＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を増殖培地１リットル当たり複合体＞０．８ｍｇ、＞０．８５ｍｇ、＞０．８８ｍｇ、＞０．９ｍｇ、＞０．９５ｍｇ、＞１ｍｇ、＞１．５ｍｇ、＞２ｍｇ、＞２．５ｍｇ、＞３ｍｇ、＞３．５ｍｇ、＞４ｍｇ、＞４．５ｍｇ、＞５ｍｇの濃度まで蓄積させる、請求項２５に記載のプロセス。
27. −ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含むＨＣＭＶ膜タンパク質複合体のタンパク質成分の１つまたは複数をコードするＲＮＡを用いて１回または複数回の初回刺激免疫を実施することと、
    −ｇＨ、ｇＬおよび少なくとも１つの追加的なＨＣＭＶ糖タンパク質を含む精製されたＨＣＭＶ膜タンパク質複合体を用いて１回または複数回の追加刺激免疫を後に実施することと
    を含む、ＲＮＡ初回刺激−タンパク質追加刺激レジメン。