KR102585324B1 - 항-fam19a5 항체의 아데노-연관 바이러스(aav) 전달 - Google Patents

항-fam19a5 항체의 아데노-연관 바이러스(aav) 전달 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 이들의 용도를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5) 단백질에 대한 길항제, 예를 들어 항-FAM19A5 항체, 예를 들어 항-FAM19A5 scFv를 코딩하는 핵산을 포함한다.

Description

항-FAM19A5 항체의 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달
전자 제출된 서열목록에 대한 참조 사항
본 출원과 함께 ASCII 텍스트 파일(이름: 3763_010PC01_SeqListing_ST25.txt; 크기: 261,643 바이트; 및 생성일: 2019년 5월8일)로 전자 제출된 서열목록의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 개시 내용은 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5) 단백질에 대한 길항제를 코딩하는 핵산을 포함하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 특정 측면에 있어서, 상기 FAM19A5 길항제는 FAM19A5 단백질을 표적으로 하는 단일쇄 가변 단편이다.
FAM19A5는 5개의 상동성이 높은 작은 단백질로 구성되어 있는 단백질의 TAFA 서브패밀리에 속하는 일종이다. Tang T.Y. et al., Genomics 83(4): 727-34(2004). 이들 단백질은 소정 위치에 보존된 시스테인 잔기를 함유하고 CC-케모카인 패밀리에 속하는 일종인 대식세포 염증 단백질 1-알파(MIP-1-알파)와 멀지만 관련이 있다. 다른 TAFA 단백질들의 대부분과 마찬가지로 FAM19A5는 뇌와 척수의 특정 영역에서 주로 발현된다. FAM19A5는 완전한 중추 신경계의 발생, 분화 및 형성뿐만 아니라 중추 신경계와 관련된 많은 질환의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서 항-FAM19A5 항체의 생체내 투여는 중추 신경계 손상 또는 질환과 관련된 증상을 개선하는 것으로 나타났다. 미국특허번호 9,579,398를 참조할 것.
치료 항체는 다양한 질환을 치료하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. Ecker D.M., et al., MAbs 7: 9-14(2015). 그러나 이들의 효능에도 불구하고 항체에 대해 제한적으로 알려져 있어 이들의 광범위한 치료 용도를 제한하고 있다. 예를 들어 다수의 항체는 불충분한 약동학과 조직 접근성뿐만 아니라 면역계와 손상된 상호 작용을 갖는 것으로 기재되어 왔다. Chames P., et al., Br J Pharmacol 157(2): 220-223(2009)를 참조할 것. 나아가 항체는 대개 임상 효능을 달성하기 위해 다량으로 투여되어야 하므로 결과적으로는 제조비용이 커진다.
따라서 질환 치료를 위해 대상에 치료용 항체, 예를 들어 항-FAM19A5 항체를 전달하기 위한 효과적이면서 경제적인 대체 방법이 요구되고 있다.
본 개시 내용은 서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5) 단백질에 대한 길항제를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 인트론, 신호 펩티드 및/또는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 역전된 말단 반복(ITR)을 더 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 FAM19A5 길항제는 항-FAM19A5 항체이다. 따라서 몇몇 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 항-FAM19A5 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 scFv이다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 코돈 최적화된 핵산을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 204, 서열번호 205, 서열번호 206 또는 서열번호 301에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 201, 서열번호 202, 서열번호 203 또는 서열번호 256에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는: (a) 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정했을 때 KD가 10 nM 이하인 가용성 인간 FAM19A5에 결합하는 특성; (b) ELISA에 의해 측정했을 때 KD가 10 nM 이하인 막 결합 인간 FAM19A5에 결합하는 특성; 또는 (c) (a)와 (b) 모두로부터 선택된 특성을 나타낸다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 인간 FAM19A5 에피토프에 결합하기 위해 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 기준 항체(reference antibody)와 교차 경쟁하되, (i) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나; (iii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 222의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 225의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 224의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 기준 항체와 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합하되, (i) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나; (iii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 아미노산 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나; (iv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 222의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 225의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 224의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 6 또는 서열번호 9인 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 6 또는 서열번호 9인 FAM19A5 에피토프에만 결합한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 추가 FAM19A5 에피토프에 추가로 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 추가 FAM19A5 에피토프는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하되, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 19, 서열번호 16 또는 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체의 중쇄 CDR1은 서열번호 17, 서열번호 14, 서열번호 11 또는 서열번호 212에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체의 중쇄 CDR2는 서열번호 18, 서열번호 15, 서열번호 12 또는 서열번호 213에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체의 경쇄 CDR1은 서열번호 29, 서열번호 26, 서열번호 23 또는 서열번호 222에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체의 경쇄 CDR2는 서열번호 30, 서열번호 27, 서열번호 24 또는 서열번호 225에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체의 경쇄 CDR3은 서열번호 31, 서열번호 28, 서열번호 25 또는 서열번호 224에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하되, (i) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 17, 18과 19를 포함하고, 상기 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 29, 30과 31을 포함하거나; (ii) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 14, 15와 16을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 26, 27과 28을 포함하거나; (iii) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 11, 12와 13을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 23, 24와 25를 포함하거나; 또는 (iv) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 212, 213과 16을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 222, 225와 224를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 37, 서열번호 36, 서열번호 35 또는 서열번호 236을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 41, 서열번호 40, 서열번호 39 또는 서열번호 245를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 37을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 36을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 35를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 236를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 245를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 37, 36, 35 또는 236에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 41, 40, 39 또는 245에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 37, 36, 35 또는 236에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 41, 40, 39 또는 245에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 인간 FAM19A5에 대한 기준 항체의 결합을 결합 저해 분석법에 의해 측정했을 때 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 저해한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 성상 세포주(예를 들어 C8-D1A)를 포함하는 배양 배지 내 FAM19A5 단백질의 농도를 ELISA에 의해 측정했을 때 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시킨다.
본 명세서는 또한 (a) 본 명세서에 개시된 AAV 벡터를 사용하여 형질 주입시킨 숙주 세포를 배양하여 세포 배양물을 제공하는 단계 및 (b) 상기 세포 배양물의 상청액으로부터 재조합 AAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자를 제조하는 방법을 개시한다.
본 개시 내용은 또한 FAM19A5 단백질에 대한 길항제를 필요로 하는 대상에 생체내 전달하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 기재된 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 또한 필요로 하는 대상에서 질환 또는 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서는 또한 필요로 하는 대상에서 신경병증성 통증을 치료하는 방법으로서, 상기 대상에 본 개시 내용의 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 개시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 말초 신경병증성 통증이다.
본 개시 내용은 필요로 하는 대상에서 외부 자극에 대한 역치 또는 지연 시간(latency)을 증가시키는 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 외부 자극은 기계적 자극이다. 다른 구현예에 있어서, 상기 외부 자극은 열 자극이다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV 벡터는 정맥내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 근육내, 피하, 복강내, 유리체강내, 경막외, 망막하 또는 심실내 투여된다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 대상은 인간이다.
도 1은 실시예에 기재되어 있는 항-FAM19A5 scFv AAV 구조체(construct)를 생성하기 위해 사용한 pscAAV 구조체의 맵을 제공하고 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 pscAAV 구조체는 다음과 같은 핵심 요소들을 포함한다: (i) CMV 프로모터 아래의 인간 베타 글로빈; (ii) 3-2, 1-65 또는 2-13 scFv를 코딩하는 전이 유전자(transgene) 및 (iii) 좌우 역전된 말단 반복(ITR).
도 2A, 2B 및 2C는 다음과 같은 AAV 구조체들 중 하나로 HEK293 세포를 형질 도입시킨 후 항-FAM19A5 scFv의 발현 수준을 보여주고 있다: (i) scAAV8-CMV-3-2-ScFv; (ii) scAAV9-CMV-3-2-ScFv; (iii) scAAV9-CMV-1-65-ScFv; 또는 (iv) scAAV9-2-13-ScFv. 도 2A에서, HEK293 세포를 2개의 서로 다른 MOI: 5×104(흰색 막대) 또는 1×105(검정 막대)의 scAAV8-CMV-3-2-ScFv로 형질 도입시켰다. 항체 농도는 형질 도입 후 1, 4 및 8일에 측정하였다. 도 2B에서, HEK293 세포를 scAAV9-CMV-3-2-ScFv(흰색 막대: MOI = 1×105; 검정 막대 = 2×105)로 형질 도입시켰다. 항체 농도는 단일 시점, 즉 형질 도입 후 8일째에 측정하였다. 도 2C에서, HEK293 세포를 scAAV9-CMV-1-65-ScFv(흰색 막대: MOI = 1×105; 검정 막대 = 2×105) 또는 scAAV9-2-13-ScFv(점이 있는 흰색 막대: MOI = 1×105; 점이 있는 검정 막대 = 2×105)로 형질 도입시켰다.
도 3A, 3B 및 3C는 서로 다른 항-FAM19A5 AAV 구조체로 형질 도입시킨 세포의 상청액이 있거나 또는 없는 상태에서 U87MG 세포에 대한 인간 FAM19A5-Fc 결합의 평균 형광 세기(MFI)를 보여주고 있다. 도 3A는 scAAV9-CMV-1-65-ScFv에 대한 데이터를 보여주고 있다. 숫자 "1"은 대조군(GFP)을 가리키고 숫자 "2"는 1-65 scFv를 가리킨다. 도 3B는 scAAV9-2-13-ScFv에 대한 데이터를 보여주고 있다. 숫자 "1"은 대조군(GFP)을 가리키고 숫자 "2"는 2-13 scFv를 가리킨다. 도 3C는 scAAV8-CMV-3-2-ScFv에 대한 데이터를 보여주고 있다. 숫자 "1"은 대조군(PBS)을 가리키고 숫자 "2"는 3-2 scFv를 가리킨다.
도 4A 및 4B는 서로 다른 항-FAM19A5 AAV 구조체로 형질 도입시킨 세포의 상청액으로 처리한 후 C8-D1A 세포 배양물 내 인간 FAM19A5 단백질의 농도를 보여주고 있다. 도 4A는 C8-D1A 세포를 scAAV8-CMV-3-2-ScFv로 형질 도입시킨 세포의 상청액 또는 PBS 단독과 함께 배양시 FAM19A5 단백질 농도들을 비교한 것을 보여주고 있다. 도 4B는 C8-D1A 세포를 scAAV9-2-13-ScFv, scAAV9-CMV-1-65-ScFv 또는 대조군 구조체(scAAV9-CMV-GFP)와 함께 배양시 FAM19A5 농도들을 비교한 것을 보여주고 있다. 도 4A 및 4B에서, "미투여(naive)"는 활성화되지 않아 최소 FAM19A5 단백질을 배양물로 생산하는 C8-D1A 세포를 가리킨다.
도 5는 scAAV8-CMV-3-2-ScFv를 C57BL/6 마우스에 척수강내 투여한지 1주(상단행) 및 2주(하단행) 후에 뇌내 항-FAM19A5(3-2) scFv의 발현을 보여주고 있다. 좌측 사진들은 미투여 동물의 사진이다(비투여). 우측 사진들은 AAV 구조체를 투여 받은 마우스의 사진이다. 상단 우측 사진에서 화살표는 양성 염색을 의미한다.
도 6A 및 6B는 말초 신경 손상 후 기계적 이질통(도 6A)과 열적 통각과민(도 6B)에 대한 scAAV8-CMV-3-2-ScFv의 투여 효과를 보여주고 있다. 도 6A에서, 기계적 이질통에 대한 효과는 동물이 Von Frey 마이크로필라멘트를 이용한 자극에 대해 통증으로 반응한 횟수로서 표시되어 있다. 도 6B에서, 열적 통각과민에 대한 효과는 발 움츠림 잠복기(paw withdrawal latency, 동물이 열원으로부터 떨어질 때까지 걸린 시간)로서 표시되어 있다. "*"는 대조군 대비 p < 0.05의 통계적 유의성을 의미한다.
도 7A 및 7B는 말초 신경 손상 후 기계적 이질통(도 7A)과 열적 통각과민(도 7B)에 대한 scAAV9-CMV-3-2-ScFv의 투여 효과를 보여주고 있다. 도 7A에서, 기계적 이질통에 대한 효과는 동물이 Von Frey 마이크로필라멘트를 이용한 자극에 대해 통증으로 반응한 횟수로서 표시되어 있다. 도 7B에서, 열적 통각과민에 대한 효과는 발 움츠림 잠복기(동물이 열원으로부터 떨어질 때까지 걸린 시간)로서 표시되어 있다. "*"는 대조군 대비 p < 0.05의 통계적 유의성을 의미한다.
도 8A 및 8B는 각각 기계적 이질통과 열적 통각과민에 대한 scAAV1-CMV-3-2-ScFv의 투여 효과를 보여주고 있다. 도 8A에서, 기계적 이질통에 대한 효과는 동물이 (10번의 자극 중) Von Frey 마이크로필라멘트를 이용한 자극에 대해 통증으로 반응한 횟수로서 표시되어 있다. 도 8B에서, 열적 통각과민에 대한 효과는 발 움츠림 잠복기(동물이 열원으로부터 떨어질 때까지 걸린 시간)로 표시되어 있다. "*"는 대조군 대비 p < 0.05의 통계적 유의성을 의미한다.
도 9A 및 9B는 각각 기계적 이질통과 열적 통각과민에 대한 scAAV9-CMV-2-13-ScFv의 투여 효과를 보여주고 있다. 도 9A에서, 기계적 이질통에 대한 효과는 동물이 (10번의 자극 중) Von Frey 마이크로필라멘트를 이용한 자극에 대해 통증으로 반응한 횟수로서 표시되어 있다. 도 9B에서, 열적 통각과민에 대한 효과는 발 움츠림 잠복기(동물이 열원으로부터 떨어질 때까지 걸린 시간)로 표시되어 있다. "*"는 대조군 대비 p < 0.05의 통계적 유의성을 의미한다.
도 10A 및 10B는 각각 기계적 이질통과 열적 통각과민에 대한 scAAV9-CMV-1-30-ScFv의 투여 효과를 보여주고 있다. 도 10A에서, 기계적 이질통에 대한 효과는 동물이 (10개의 자극 중) Von Frey 마이크로필라멘트를 이용한 자극에 대해 통증으로 반응한 횟수로서 표시되어 있다. 도 10B에서, 열적 통각과민에 대한 효과는 발 움츠림 잠복기(동물이 열원으로부터 떨어질 때까지 걸린 시간)로 표시되어 있다. "*"는 대조군 대비 p < 0.05의 통계적 유의성을 의미한다.
도 11A, 11B 및 11C는 서로 다른 항-FAM19A5 scFv AAV 구조체 단독 또는 또 다른 치료제와 조합한 효과를 비교하여 제공하고 있다. 도 11A에서, 동물들은 다음 중 하나를 투여받았다: (i) scAAV1-CMV-GFP(빈 원); (ii) scAAV1-CMV-3-2-ScFv(채워진 원); (iii) scAAV9-CMV-mIL-10(빈 사각형); (iv) scAAV1-CMV-3-2-ScFv + scAAV9-CMV-mIL-10(채워진 사각형). 도 11B에서, 동물들은 다음 중 하나를 투여받았다: (i) scAAV9-CMV-GFP(빈 원); (ii) scAAV9-CMV-2-13-ScFv(채워진 원); (iii) scAAV9-CMV-mIL-10(빈 사각형); (iv) scAAV9-CMV-2-13-ScFv + scAAV9-CMV-mIL-10(채워진 사각형). 도 11C에서, 동물들은 다음 중 하나를 투여받았다: (i) scAAV9-CMV-GFP(빈 원); (ii) scAAV9-CMV-1-30-ScFv(채워진 원); (iii) scAAV9-CMV-mIL-10(빈 사각형); (iv) scAAV9-CMV-1-30-ScFv + scAAV9-CMV-mIL-10(채워진 사각형). "*"는 대조군 대비 p < 0.05의 통계적 유의성을 의미한다.
본 명세서는 서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5) 단백질에 대한 길항제를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물, 예를 들어 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 개시한다. 본 명세서는 또한 질환 또는 장애, 예를 들어 신경병성통증을 치료하기 위한 유전자 치료법으로서 이러한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 제공된 개시 내용의 이해를 용이하게 하기 위해서 다수의 용어 및 문구를 정의하기로 한다. 추가 정의들은 상세한 설명 전반에 걸쳐 주어져 있다.
I. 정의
본 개시 내용 전반에 걸쳐, 용어 "한" 또는 "어떤" 실체는 그 실체의 하나 이상을 말하는 것으로; 예를 들어, "한 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한"(또는 "어떤"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본 명세서에서 혼용될 수 있다.
또한 본 명세서에서 사용하는 "및/또는"은 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각을 나머지 다른 특징 또는 구성요소와 함께 또는 단독으로 구체적인 개시로서 간주되어야 한다. 따라서 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 양태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본 명세서에서 양태들을 용어 "포함하는"으로 기재하면 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는"의 관점으로 기재된 다른 유사한 양태 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시 내용과 관련된 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed, 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 당업자에게 본 개시 내용에서 사용되고 있는 용어 중 다수를 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 이들의 Systeme International de Unites(SI)에서 인정한 형태로 표시된다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 쓰여진다. 본 명세서에서 제공된 표제는 개시 내용의 다양한 양태들의 제한이 아니며 이들은 전체적으로 명세서를 참조한 것일 수 있다. 따라서 바로 아래에 정의된 용어들은 명세서를 전체적으로 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
본 명세서에서 용어 "약"은 거의, 대략, 가량 또는 그의 영역 내를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우에 기재되어 있는 수치의 위와 아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 명시된 값의 위와 아래의 수치를 예를 들어 위 또는 아래(더 높거나 더 낮은) 10%의 변화량만큼 변경할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 유전자 치료법에서 사용하는 모든 아데노-연관 바이러스를 이들의 유도체, 바이러스 아형 및 자연 발생 및 재조합 형태를 포함하여 지칭한다. AAV의 다양한 혈청형은 다수의 서로 다른 세포 유형을 형질 도입하기 위한 재조합 유전자 전달 바이러스로서 사용될 수 있다. AAV 혈청형의 비제한적인 예는 AAV 1형(AAV-1), AAV 2형(AAV-2), AAV 3형(AAV-3), AAV 4형(AAV-4), AAV 5형(AAV- 5), AAV 6형(AAV-6), AAV 7형(AAV-7), AAV 8형(AAV-8), AAV 9형(AAV-9), 조류의 AAV, 소의 AAV, 개의 AAV, 말의 AAV, 영장류의 AAV, 비-영장류의 AAV 및 양의 AAV를 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 AAV는 AAV 8형(AAV-8) 또는 AAV 9형(AAV-9)이다.
알려진 모든 AAV 혈청형의 게놈 조직은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000개 미만의 뉴클레오티드(nt)인 선형 단일 가닥 DNA 분자이다. 상기 게놈은 3개의 유전자 rep(복제), cap(캡시드) 및 aap(어셈블리)를 포함한다. 이들 3개의 유전자는 3개의 프로모터, 대안 번역 시작 부위 및 차등 스플라이싱(differential splicing)의 사용을 통해 적어도 9개의 유전자 산물을 생성한다. 본 개시 내용의 AAV 벡터는 시스 또는 트랜스로 작용하는 추가 요소를 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 벡터 게놈을 포함하는 AAV 벡터는 또한 도너 서열의 5' 또는 3' 말단에 인접해 있는 하나 이상의 역전된 말단 반복(ITR) 서열; 구성적 또는 조절 가능한 조절 요소, 조직 특이적 발현 조절 요소, 인트론 서열, 스터퍼 또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열과 같이 도너 서열을 전사시키는 발현 조절 요소(예를 들어 프로모터 또는 인핸서); 및/또는 도너 서열의 3'에 위치해 있는 폴리-아데닌 서열을 갖는다.
AAV는 세포에 외래 DNA를 전달하기 위한 벡터로서 매력적이게 하는 독특한 특징을 가지고 있다. 배양물에서 세포의 AAV 감염은 일반적으로 비세포변성이었고, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 무증후성이면서 무증상이다. 나아가 AAV는 서로 다른 유형의 많은 포유류 세포를 감염시켜 생체내 서로 다른 많은 조직들을 표적으로 할 가능성이 있다. AAV는 또한 다른 형태의 유전자 전달에 비해 약한 면역 반응을 촉진하고 분열 및 정지 세포 모두에서 비통합 벡터(non-integrating vector)로서 지속 발현하는 것을 포함하여 유전자 전달을 위한 특히 매력적인 바이러스 시스템이게 하는 추가 장점을 갖고 있다. 또한 AAV는 아데노바이러스를 비활성화하는 데 사용되는 조건(수 시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 견디므로 rAAV 기반 백신의 저온 보존은 그다지 중요하지 않게 된다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV는 이들 특징 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에 사용되고 있는 용어 "AAV 벡터"는 아데노-연관 바이러스(AAV)의 성분을 포함하거나 이들 성분으로부터 유래하고 뇌, 심장, 폐, 골격근, 간, 신장, 비장 또는 췌장과 같은 임의의 많은 조직 유형의 인간 세포를 포함한 포유류 세포를 시험관내 또는 생체내 관계없이 감염시키기 적합한 임의의 벡터를 지칭한다. 용어 "AAV 벡터"는 관심 단백질을 코딩하는 적어도 핵산 분자를 포함하는 AAV형 바이러스 입자(또는 비리온)를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열(즉, AAV와 이종인 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 항-FAM19A5 항체), 전형적으로 세포의 유전자 변형을 위한 관심 서열을 포함하는 AAV 벡터를 의미하는 "재조합 AAV 벡터"이다. 일반적으로, 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 옆에 적어도 하나, 일반적으로는 2개의 AAV 역전된 말단 반복 서열(ITR)이 있다. 용어 AAV 벡터는 AAV 벡터 입자와 AAV 벡터 플라스미드를 모두 포함한다.
본 명세서에 사용되고 있는 용어 "ITR"은 역전된 말단 반복을 지칭한다. 전형적으로, ITR은 원핵 플라스미드로부터 파르보바이러스(예를 들어 AAV) DNA 복제 및 구출(rescue) 또는 절제에 관여한다(Daya, S., et al, Clin Microbiol Rev 21(4): 583-593(2008)). ITR은 일반적으로 AAV 프로바이러스 통합 및 AAV DNA를 비리온으로 패키징하는데 요구되는 최소 서열인 것으로 생각된다. 따라서 이들 요소는 파르보바이러스 게놈의 효율적인 증식에 필수적이다.
본 명세서에 사용되고 있는 용어 "혈청형"은 혈청학적 또는 DNA 서열분석 방법에 의해 동정될 수 있고 그의 항원 특성에 의해 구별될 수 있는 AAV의 세분된 한 부분을 의미한다. 또한 용어 "분리"를 AAV와 관련하여 사용할 때에는 소정의 공급원으로부터 얻은 특정 AAV 혈청형을 의미한다. 당업자라면 상기 용어가 사용되는 문맥에 따라 AAV 샘플의 상대적 순도를 의미하는 "분리된 AAV"와 특정 AAV 혈청형의 클론 유래 제제를 의미하는 "AAV 분리물" 간의 차이를 쉽게 인식할 것이다.
용어 "무-캡시드" 또는 "캡시드가 없는"(또는 이의 변형들) 벡터 또는 핵산 분자는 캡시드가 없는 벡터 구조체를 지칭한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 캡시드가 없는 벡터 또는 핵산 분자는 예를 들어 AAV Rep 단백질을 코딩하는 서열을 포함하지 않는다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 AAV는 헬퍼 바이러스를 사용하여 복제한다. 본 명세서에서 사용하는 AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"란 AAV(예를 들어 야생형 AAV)가 포유류 세포에 의해 복제 및 패키징되도록 하는 바이러스를 지칭한다. 당업계에는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 백시니아(vaccina)와 같은 폭스바이러스를 포함하는 AAV에 대한 다양한 이러한 헬퍼 바이러스가 공지되어 있다. 서브패밀리 C의 아데노바이러스 5형이 가장 보편적으로 사용되고 있지만 상기 아데노바이러스는 다수의 서로 다른 하위군을 포함한다. 인간, 비-인간 포유류 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스가 알려져 있고 ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수가 가능하다. 헤르페스과 바이러스의 예로는 ATCC와 같은 기탁기관으로부터도 구할 수 있는 거대세포 바이러스(CMV) 및 가성광견병 바이러스(PRV) 뿐 아니라 단순 헤르페스바이러스(HSV) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV)를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV는 명확한 조직 표적화 능력(예를 들어 조직 향성(tissue tropisms)을 갖고 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 AAV는 하나 이상의 인간 줄기 세포 유형에서 비-변이체 모 캡시드(non-variant parent capsid) 폴리펩티드에 비해 증가된 형질 도입 또는 향성을 추가로 나타낸다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 인간 줄기 세포 유형은 배아 줄기 세포, 성체 조직 줄기 세포(즉, 체세포 줄기 세포), 골수, 전구 세포, 유도 다능성 줄기 세포 및 역분화 줄기 세포(reprogrammed stem cell)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구현예에 있어서, 성체 줄기 세포는 오르가노이드 줄기 세포(즉, 신체 내 임의의 관심 기관 또는 기관계로부터 유래된 줄기 세포)를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, AAV의 표적 조직은 생식선, 횡격막, 심장, 위, 간, 비장, 췌장 또는 신장이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 AAV의 표적 신체 기관은 피부, 모발, 손톱, 감각 수용체, 한선(sweat gland), 지선(oil gland), 골, 근육, 뇌, 척수, 신경, 뇌하수체, 송과선, 시상하부, 갑상선, 부갑상선, 흉선, 부신, 췌장(섬 조직), 심장, 혈관, 림프절, 림프관, 흉선, 비장, 편도선, 코, 인두, 후두, 기도, 기관지, 폐, 입, 인두, 식도, 위, 소장, 대장, 직장, 항문관, 치아, 타액선, 혀, 간, 담낭, 췌장, 충수, 신장, 요관, 방광, 요도, 고환, 정관(수정관), 요도, 전립선, 음경, 음낭, 난소, 자궁, 난관(나팔관), 질, 외음부 및 유선(유방)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 신체의 기관계로는 외피계, 골격계, 근육계, 신경계, 내분비계, 심혈관계, 림프계, 호흡계, 소화계, 비뇨기계 및 생식계를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구현예에 있어서, 형질 도입 및/또는 향성이 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100%만큼 증가한다. 몇몇 구현예에 있어서, 형질 도입 및/또는 향성이 약 5% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60% 또는 약 30% 내지 약 60%만큼 증가한다.
문구 "향성" 및 "형질도입"은 상호 관련되어 있지만 차이점이 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "향성"은 하나 이상의 특정 세포 유형을 감염시키는 AAV 벡터 또는 비리온의 능력을 의미하지만, 벡터가 하나 이상의 특정 세포 유형에 세포를 형질 도입하도록 기능하는지를 포함할 수도 있는바; 즉 향성은 특정 세포 또는 조직 유형(들)으로 AAV 벡터 또는 비리온의 우선적인 도입 및/또는 특정 세포 또는 조직 유형으로 진입을 용이하게 하는 세포 표면과의 우선적인 상호작용 후, 경우에 따라 그리고 바람직하게는 세포에서 AAV 벡터 또는 비리온에 의해 운반되는 서열의 발현(예를 들어 전사 및 경우에 따라 번역), 예를 들어 재조합 바이러스의 경우에는 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "형질 도입"은 하나 이상의 특정 세포 유형을 감염시키는 AAV 벡터 또는 비리온의 능력을 의미하는바; 즉 형질 도입은 AAV 벡터 또는 비리온을 세포 내 도입하고 AAV 벡터 또는 비리온 내 함유된 유전 물질을 세포로 전달하여 벡터 게놈으로부터 발현을 얻는 것을 의미한다. 모든 경우는 아니지만 일부의 경우에는 형질 도입과 향성은 상관관계가 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "감염 다중도" 또는 "MOI"는 숙주 세포의 형질 주입 또는 형질 도입 중 사용되는 통합 벡터 대 숙주 세포의 비를 의미한다. 예를 들어 100,000개의 숙주 세포를 형질 도입하기 위해 1,000,000개의 벡터를 사용하는 경우에는 감염 다중도가 10이다. 이 용어의 사용은 형질 도입을 수반한 경우에 국한되지 않고 대신에 리포펙션, 미세주입, 인산칼슘침전 및 전기천공과 같은 방법에 의해 숙주로 벡터를 도입하는 것을 포함한다.
용어 "신경병증성 통증"은 중추 신경계(CNS) 및/또는 말초 신경계의 임의의 수준에 영향을 미치는 상해, 손상 및/또는 부적절한 기능으로 인한 통증을 의미한다. 용어 "신경병성 통증"은 신경병증성 통증의 원인과 일부 및 모든 증상에 관계없이 일부 및 모든 유형의 신경병성 통증을 포함한다.
신경병성 통증은 중추 신경병성 통증 및 말초 신경병성 통증을 포함한다. 본원에서 사용하고 있는 용어 "중추 신경병성 통증"은 장애, 선천적 결함 또는 중추 신경계(즉, 뇌 또는 척수) 손상에 기인한 통증을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "말초 신경병성 통증"은 말초 감각 신경의 손상 또는 감염에 기인한 통증을 지칭한다.
신경병성 통증의 증상은 지속성/만성 통증, 자발성 통증 뿐 아니라 이질통(예를 들어 평상시에는 통증이 없는 자극에 대한 통증 반응), 통각과민(예를 들어 일반적으로 핀으로 찌르는 것과 같은 단지 경증의 불편을 야기하는 통증성 자극에 대한 두드러진 반응), 감각과민(예를 들어 자극, 특히 피부의 자극에 대한 과도한 신체적 과민성) 또는 통각과민(예를 들어 짧은 불편함이 장기간 중증의 통증으로 되는 경우)을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 증상은 오래 지속될 수 있고 1차 원인이 존재한 경우에 이를 해결한 후 지속될 수 있다. Merck Manual, Neuropathic Pain, merckmanuals.com/professional/neurologic-disorders/pain/neuropathic-pain에서 이용 가능함; Campbell J.N. and Meyer R.A. Neuron 52(1): 77-92(2006).
몇몇 구현예에 있어서, 신경병성 통증의 유형은 (1) 신경통, (2) 구심로 차단 통증 증후군(deafferentation pain syndrome), (3) 복합 부위 통증 증후군(CRPS) 및 (4) 신경병증(중추 또는 말초)을 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 일반적으로 신경 구조의 어떠한 명백한 병리학적 변화 없이 하나 이상의 특정 신경(예를 들어 뇌신경)의 경로를 따라 퍼지는 통증을 지칭하는 신경통이다. 신경통에는 삼차 신경통(TN), 비정형 삼차 신경통(ATN), 후두 신경통, 설인 신경통, 포진 후 신경통(대상포진 또는 헤르페스에 의해 유발됨), 말초 신경 손상 통증, 좌골 신경통, 요통 및 비정형 안면통을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 화학적 자극, 만성 신장 질환, 당뇨병, 염증, 외상(수술 포함), 인근 구조(예를 들어 종양)에 의한 신경 압박, 특정 약물(예를 들어 시스플라틴, 파클리탁셀 또는 빈크리스틴), 포르피린증(혈액 장애), 및 감염(예를 들어 헤르페스 포진(대상포진), HIV/AIDS, 라임병 또는 매독)은 모두 신경통으로 이어질 수 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 신체 일부로부터 감각 입력(sensory input)의 상실(예를 들어 말초 감각 섬유 또는 중추 신경계의 신경 차단에 의해 야기됨)에 기인할 수 있는 구심로 차단 통증 증후군이다. 구심로 차단 통증 증후군은 뇌 또는 척수 손상, 뇌졸중 후 통증, 환지통(phantom pain), 하지마비, 완신경총 박리성 손상 및 요추부 신경근 병변을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 팔 또는 다리에 가장 보편적으로 영향을 미치는 만성 통증 증상인 "복합 부위 통증 증후군"(CRPS)이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 CRPS는 상해, 수술, 뇌졸중 또는 심장마비 후에 발병한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 CRPS는 I형 CRPS(CRPS-I)(반사 교감신경 이상증 증후군이라고도 알려짐)이다. 신경 손상이 확진되지 않은 개인은 종종 CRPS-1을 가진 것으로 분류된다. 다른 구현예에 있어서, 상기 CRPS는 확진된 신경 손상과 연관이 있는 II형 CRPS(CRPS-II)(인과통이라고도 알려짐)이다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 신경의 기능적 또는 병리학 적 변화(예를 들어 질환 또는 손상)에 기인한 통증을 의미하는 신경병증이다. 신경병증은 대개 임상적으로 감각 또는 운동 신경세포 이상을 특징으로 할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 신경병증은 중추 신경병증(예를 들어 중추 신경계의 기능적 또는 병리학적 변화)이다. 다른 구현예에 있어서, 상기 신경병증은 말초 신경병증(예를 들어 운동 신경, 감각 신경, 자율 신경 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 말초 신경의 기능적 또는 병리학적 변화)이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 말초 신경병증은 단일 신경 또는 신경군에 대한 기능적 또는 병리학적 변화를 수반한다(즉, 단일 신경병증). 몇몇 구현예에 있어서, 상기 말초 신경병증은 여러 신경(국소적 또는 전신적으로)에 영향을 미치는 기능적 또는 병리학적 변화를 수반한다(즉, 다발 신경병증). 몇몇 구현예에 있어서, 상기 말초 신경병증은 신체의 양쪽에 거의 동일하게 영향을 미친다(즉, 대칭성 다발 신경병증). 몇몇 구현예에 있어서, 상기 말초 신경병증은 신체의 서로 전혀 다른 영역에 영향을 미친다(예를 들어 다발성 단일 신경염, 다초점 단일 신경병증 또는 다발성 단일 신경병증).
본 명세서에서 사용하는 "단일 신경병증"은 단일 말초 신경 또는 신경군의 손상 또는 파괴에 의해 야기된 영역에 대한 운동 또는 감각의 상실을 수반하는 말초 신경병증이다. 단일 신경병증은 국소 부위의 손상 또는 외상으로 인해 가장 자주 발생하며, 이는 예를 들어 단일 신경에 장기간의 압력/압박을 초래한다. 그러나 특정 전신 장애(예를 들어 다발성 단일 신경염) 또한 단일 신경병증을 일으킬 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 국소 부위에 대한 손상 또는 외상은 신경의 수초(외피) 또는 신경 세포(축삭)의 일부 파괴를 야기하여 신경을 통한 자극의 전도를 지연시키거나 막을 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 단일 신경병증은 신체의 어느 부분에도 영향을 미칠 수 있다. 단일 신경병성 통증의 예는 좌골 신경 기능 장애, 일반적인 비골 신경 기능 장애, 요골 신경 기능 장애, 척골 신경 기능 장애, 두개골 단일 신경병증 VI, 두개골 단일 신경병증 VII, 두개골 단일 신경병증 III(압박형), 두개골 단일 신경병증 III(당뇨병형), 액와 신경 기능 장애, 손목 터널 증후군, 대퇴 신경 기능 장애, 경골 신경 기능 장애, 안면 신경마비(Bell's palsy), 흉부 출구 증후군, 손목 터널 증후군 및 6번(외전) 신경마비를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. Finnerup N B et al., Pain 157(8): 1599-1606 (2016); ninds.nih.gov/disorders/peripheralneuropathy/detailj3 eripheralneuropathy.htm에서 이용 가능한 National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Peripheral Neuropathy Fact Sheet. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 단일 신경병증성 통증은 좌골 신경통이다.
본 명세서에서 사용하는 "다발 신경병증"은 다수의 말초 신경의 손상 또는 파괴에 의해 야기된 영역에 대한 운동 또는 감각의 상실을 수반하는 말초 신경병증이다. 다발 신경병성 통증은 소아마비후 증후군, 유방 절제후 증후군, 당뇨병성 신경병증, 알코올 신경병증, 아밀로이드, 독소, AIDS, 갑상선 기능 저하증, 요독증, 비타민 결핍증, 화학 요법 유발 통증, 2',3'-디데속시시티딘(ddC) 치료, 길랑-바레 증후군 또는 파브리병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. Finnerup N. B. et al., Pain 157(8): 1599-1606 (2016); National Institute of Neurological Disorders and Stroke, ninds.nih.gov/disorders/peripheralneuropathy/detail3 eripheralneuropathy.htm에서 이용 가능한 Peripheral Neuropathy Fact Sheet. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 다발 신경병증은 당뇨병성 말초 신경병증이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 당뇨병성 말초 신경병증은 당뇨병 피험자의 혈액 내 높은 혈중 글루코오스 농도(혈당) 및/또는 높은 농도의 지방(예를 들어 트리글리세리드)에 의해 야기되며, 이는 환자의 말초 신경을 손상시킨다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 말초 신경병증은 손상 또는 영향을 받는 신경 세포의 부분(예를 들어 축삭, 수초 또는 세포체)을 토대로 분류될 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 말초 신경병증은 축삭의 대사 또는 독성 이상에 기인한 원위 축삭병증이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 대사 이상은 당뇨병, 신부전증, 영양실조와 같은 결핍 증후군 및 알코올 중독을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 대사 이상은 당뇨병이고 상기 원위 축삭병증은 당뇨병성 신경병증이다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 말초 신경병증은 자극 전도의 급성 부전을 일으키는 수초 또는 수초화 슈반 세포에 대한 주요 공격으로 인한 수초병증이다. 가장 흔한 원인은 급성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(AIDP, 길랑-바레 증후군이라고도 알려짐)이지만, 다른 원인으로는 만성 염증성 탈수초성 증후군(CIDP), 유전적 대사 장애(예를 들어 대뇌백질위축증(leukodystrophy)) 또는 독소를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 말초 신경병증은 말초 신경계(PNS) 신경세포의 파괴로 인한 신경병증이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증은 운동 신경세포 질환, 감각 신경병증(예를 들어 헤르페스 대상포진), 독소 또는 자율 신경 기능 장애에 의해 유발된다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증은 화학치료제 빈크리스틴과 같은 신경독에 의해 유발된다.
신경병성 통증은 다양한 원인(예를 들어 신체적 상해(예를 들어 외상 또는 반복적인 스트레스), 질환 또는 장애, 유독 물질에 대한 노출 또는 이들의 조합)으로 인해 발생하거나 이와 연관이 있을 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 예를 들어 신경 압박 손상(예를 들어 신경 압착, 신경 신장, 신경 포착 또는 불완전한 신경 절개); 척수 손상(예를 들어 척수의 반절단); 말초 신경(예를 들어 운동 신경, 감각 신경 또는 자율 신경, 또는 이들의 조합)의 상해 또는 손상, 사지절단; 타박상; 염증(예를 들어 척수 염증); 또는 외과적 처치와 같은 외상성 상해 또는 손상으로 인해 발생하거나 이와 연관이 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 예를 들어 장기간 특정 군의 관절의 운동을 필요로 하는 반복적이고, 불편하고/또는 강제적인 활동을 포함하는 반복적인 스트레스에 기인하거나 이와 연관이 있다. 그로 인해 생기는 자극은 어느 하나의 이론에 구속되지는 않지만 인대, 힘줄과 근육에 염증을 일으키고 부어오르게 하여 신경이 지나가는 좁은 통로를 수축시킬 수 있다(예를 들어 팔꿈치 또는 손목에서 갇히거나 압박을 받은 신경의 신경병증인 척골 신경병증 및 손목 터널 증후군). 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 예를 들어 허혈 사례(예를 들어 뇌졸중 또는 심장 마비), 다발성 경화증, 대사 및/또는 내분비 질환 또는 장애(예를 들어 당뇨병, 대사성 질환 및 성장 호르몬의 과다 생산으로 인해 유발되고 신경 포착 및 통증을 일으키는 관절을 포함한 골격의 일부가 비정상적으로 커지는 것을 특징으로 하는 증상인 말단 비대증), 신경 조직 손상(예를 들어 혈관염, 즉 혈관 염증), 자가 면역 질환(예를 들어 쇼그렌 증후군, 루푸스, 류마티스 관절염 및 길랑-바레 증후군으로도 알려진 급성 염증성 탈수초성 신경병증)으로 이어지는 말초 신경으로 공급되는 산소의 감소를 야기하는 소혈관 질환), 신장 장애, 암 또는 종양(예를 들어 혈관신생 종양, 신경종, 부수 종양성 증후군(paraneoplastic syndrome), 암 치료시 화학치료제와 방사선의 독성), 감염(예를 들어 헤르페스 수두포진(대상포진), 엡스타인-바 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 거대 세포 바이러스 및 단순 헤르페스바이러스, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)과 같은 바이러스 또는 라임병, 디프테리아 및 나병과 같은 박테리아에 의한 감염), 염증성 장애, 말초 신경 장애(예를 들어 신경종), 선천적이거나 새로(de novo) 발생하는 유전적 장애(예를 들어 샤리코-마리-듀스(Charcot-Marie-Tooth) 장애는 하퇴와 발 근육의 극심한 약화 및 손실, 보행 이상, 힘줄 반사의 상실, 하지 마비 포함), 단일 신경병증 또는 다발 신경병증을 포함하는 질환 또는 장애에 기인하거나 이와 연관이 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 감염원(예를 들어 진드기 매개 감염, 헤르페스 수두포진, 엡스타인-바 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 거대 세포 바이러스, 단순 포진 바이러스, AIDS)에 기인하거나 이와 연관이 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 예를 들어 약물, 알코올, 중금속(예를 들어 납, 비소, 수은), 산업용 물질(예를 들어 접착제로부터 나오는 용매, 연기) 또는 아산화질소를 포함하는 유독 물질에 노출에 기인하거나 이와 연관이 있다.
용어 질환 또는 장애와 "연관이 있는 신경병증성 통증"은 질환 또는 장애(예를 들어 본 명세서에 개시된 것들)를 수반하거나 질환 또는 장애(예를 들어 본 명세서에 개시된 것들)에 의해 야기되거나 이에 기인하는 신경병성 통증을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환 관련 증후군, 합병증, 증상 또는 생화학적 징후의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 반전, 완화, 개선, 저해 또는 지연 또는 예방하고자 하는 목적으로 대상에 대해 수행된 임의 유형의 개입 또는 과정 또는 대상에게 활성제를 투여하는 것을 말한다. 치료는 질환이 있는 대상 또는 질환이 없는 대상(예를 들어 예방용)에 대해 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 "투여"는 당업자에게 공지된 다양한 방법과 전달계 중 임의의 것을 사용하여 대상에 치료제 또는 치료제를 포함하는 조성물을 물리적으로 도입하는 것을 말한다. 본 명세서에 기재된 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추, 유리체내, 또는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 문구 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 이에 제한되지는 않지만 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 표피하, 유리체내, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입 뿐 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 이와 달리, 본 명세서에 기재된 항체는 비경구 경로, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 경구, 질내, 직장, 설하 또는 국소 투여될 수 있다. 투여는 또한 예를 들어 1회, 복수 회 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료 유효량"은 대상의 질환 또는 장애를 "치료"하거나 질환 또는 장애(예를 들어 신경병성 통증)의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키는 데 효과적인 약물 단독 또는 또 다른 치료제와 조합한 약물의 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 질환 또는 장애(예를 들어 본 명세서에 개시된 신경병성 통증)를 갖거나 가질 위험이 있는 대상에 일부 개선 또는 실익을 제공하는 약물 또는 치료제의 양을 포함한다. 이에 따라 "치료 유효양"은 질환 또는 장애의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키거나 또는 일부 완화, 경감을 제공하고/또는 적어도 하나의 지표(예를 들어 신경병성 통증)를 감소시키고/또는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 임상 증상을 감소시키는 양이다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 비-포유류를 포함한다.
용어 "서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5" 또는 "FAM19A5"는 5개의 상동성이 높은 단백질의 TAFA 패밀리(FAM19 패밀리라고도 알려짐)에 속하고 주로 뇌와 척수에서 발현되는 단백질을 지칭한다. FAM19A5는 TAFA5 또는 케모카인 유사 단백질 TAFA-5로도 알려져 있다.
인간에서 FAM19A5를 코딩하는 유전자는 염색체 22에 위치해 있다. 선택적 스플라이싱에 의해 생산되는 것으로 믿어지는 다음과 같은 다수의 인간 FAM19A5(UniProt: Q7Z5A7) 이소형(isoform)들이 있다: 132개의 아미노산으로 이루어진 이소형 1(UniProt: Q7Z5A7-1), 125개의 아미노산으로 이루어진 이소형 2(UniProt: Q7Z5A7-2) 및 53개의 아미노산으로 이루어진 이소형 3(UniProt: Q7Z5A7-3). 인간 FAM19A5 단백질은 막 결합 및 가용성(분비) 형태로 존재하는 것으로 믿어진다. 이소형 1은 하나의 막 관통 영역을 가진 막인 것으로 믿어진다. Tang T. Y. et al., Genomics 83(4): 727-34(2004)에 분비된 단백질(가용성)로서 보고된 이소형 2는 아미노산 위치 1-25번에 신호 펩티드를 함유하고 있다. 이소형 1은 막 단백질인 것으로 믿어진다. 아래는 3개의 공지된 인간 FAM19A5 이소형들의 아미노산 서열이다.
(I) 이소형 1(UniProt: Q7Z5A7-1, 막 관통 단백질): 이 이소형을 표준 서열로 선정하였다.
MAPSPRTGSR QDATALPSMS STFWAFMILA SLLIAYCSQL AAGTCEIVTL DRDSSQPRRT IARQTARCAC RKGQIAGTTR ARPACVDARI IKTKQWCDML PCLEGEGCDL LINRSGWTCT QPGGRIKTTT VS(서열번호 1)
(II) 이소형 2(UniProt: Q7Z5A7-2, 가용성 단백질):
MQLLKALWAL AGAALCCFLV LVIHAQFLKE GQLAAGTCEI VTLDRDSSQP RRTIARQTAR CACRKGQIAG TTRARPACVD ARIIKTKQWC DMLPCLEGEG CDLLINRSGW TCTQPGGRIK TTTVS(서열번호 2)
(III) 이소형 3(UniProt: Q7Z5A7-3):
MYHHREWPAR IIKTKQWCDM LPCLEGEGCD LLINRSGWTC TQPGGRIKTT TVS(서열번호 3)
용어 "FAM19A5"는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 FAM19A5의 임의의 변이체 또는 이소형들을 포함한다. 따라서 본 명세서에 기재된 항체는 동일 종 내 서로 다른 이소형(예를 들어 인간 FAM19A5의 서로 다른 이소형)과 교차 반응하거나 인간 이외의 종의 FAM19A5(예를 들어 마우스 FAM19A5)와 교차 반응할 수 있다. 이와 다르게, 상기 항체는 인간 FAM19A5에 특이적일 수 있고 다른 종들과는 어떠한 교차 반응성도 나타내지 못할 수 있다. FAM19A5 또는 이의 임의의 변이체 및 이소형들은 이들을 자연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 분리되거나 재조합에 의해 생산될 수 있다. 인간 FAM19A5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GenBank 수탁번호 BC039396 및 다음과 같은 서열을 갖는다:
표 1A 인간 FAM19A5의 폴리뉴클레오티드 서열
용어 "FAM19A5 단백질에 대한 길항제"는 FAM19A5 단백질의 발현을 억제하는 모든 길항제를 지칭한다. 이러한 길항제는 펩티드, 핵산 또는 화합물일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 길항제는 FAM19A5를 표적으로 하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA, 압타머, PNA(펩티드 핵산) 또는 이를 포함하는 벡터일 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 길항제는 FAM19A5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합부분일 수 있다.
용어 "항체" 및 "항체들"은 당업계의 용어이고 본 명세서에서 호환적으로 사용될 수 있으며 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 가진 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 용어는 전체 항체 및 이들의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합부분") 또는 단일쇄를 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질 또는 이의 항원-결합부분을 지칭한다. 다른 구현예에 있어서, "항체"는 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 도메인을 포함하는 단일쇄 항체를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 특정 자연 발생 항체에서 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어져 있다. 특정 자연 발생 항체에서 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어져 있다.
상기 VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존된 영역들이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 초가변성 영역으로 더욱 세분화될 수 있다. VH 및 VL 각각은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 다음과 같은 순서로 배치되어 있는 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분(Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 면역 글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다.
용어 "Kabat 번호 표기(Kabat numbering)" 및 유사한 용어들은 당업계에서 인정되어 있고 항체 또는 이의 항원-결합부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 아미노산 잔기의 번호를 표기하는 체계를 말한다. 특정 측면에 있어서, 항체의 CDR은 Kabat 번호 표기 체계에 따라 결정될 수 있다(예를 들어 Kabat EA & Wu TT(1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조). Kabat 번호 표기 체계를 이용하면 항체 중쇄 분자 내 CDR들은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35번(CDR1) (경우에 따라 35번 이후에 하나 또는 2개의 추가 아미노산을 포함할 수 있음(Kabat 번호 표기 방식에서는 35A 및 35B로 지칭됨), 아미노산 위치 50 내지 65번(CDR2) 및 아미노산 위치 95 내지 102번(CDR3)에 존재한다. Kabat 번호 표기 체계를 이용하면 항체 경쇄 분자 내 CDR들은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34번(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56번(CDR2) 및 아미노산 위치 89 내지 97번(CDR3)에 존재한다. 특정 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체의 CDR들은 Kabat 번호 표기 방식에 따라 결정하였다.
문구 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 번호 표기", "Kabat 위치" 및 이들의 문법적 변형은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)에서 항체 컴필레이션의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용되는 번호 표기 체계를 지칭한다. 이 번호 표기 체계를 이용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FW 또는 CDR의 단축 또는 이에 삽입하는 것에 해당하는 더 적거나 추가 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52번 이후 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따르면 잔기 52a번) 및 중쇄 FW 잔기 82번 이후 삽입된 잔기(예를 들어 Kabat에 따르면 잔기 82a번, 82b번 및 82c번 등)를 을 포함할 수 있다. 표 1B를 참조할 것.
표 1B
소정의 항체에 대한 잔기의 Kabat 번호 표기는 "표준" Kabat 번호 표기된 서열과 상기 항체의 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 결정될 수 있다. 대신에 Chothia는 구조 루프의 위치를 지칭한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kabat 번호 표기 관례를 이용하여 번호 표기하였을 때 Chothia CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32 내지 H34 사이에서 변한다(이는 Kabat 번호 표기 방식이 H35A와 H35B에서 끼워 넣기(insertions)를 두기 때문이다; 35A도 35B도 없다면, 루프는 32에서 끝난다; 35A만 있다면 루프는 33에서 끝난다; 35A와 35B가 2개 모두 있다면 루프는 34에서 끝난다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 대변하는 것으로, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
IMGT(ImMunoGeneTics)도 CDR을 포함한 면역 글로불린 가변 영역에 대한 번호 표기 체계를 제공한다. 예를 들어 본 명세서에 참고로서 포함되는 Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003)를 참조할 것. IMGT 번호 표기 체계는 5,000개를 넘는 서열의 정렬, 구조 데이터 및 초가변 루프의 특성 분석에 기반한 것으로, 모든 종에 대해 가변 및 CDR 영역의 비교를 용이하게 한다. IMGT 번호 표기 스키마에 따르면, VH-CDR1은 26번 내지 35번 위치에 있고, VH-CDR2는 위치 51번 내지 57번 위치에 있고, VH-CDR3은 93번 내지 102번 위치에 있고, VL-CDR1은 27번 내지 32번 위치에 있고, VL-CDR2는 50번 내지 52번 위치에 있고, VL-CDR3은 89번 내지 97번 위치에 있다.
본 개시 내용에서 논의되는 모든 중쇄 불변 영역 아미노산 위치에 대해서 번호 표기는 서열화된 최초의 인간 IgG1인 골수종 단백질 EU의 아미노산 서열을 기재한 Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85)에 최초로 기재된 EU 인덱스에 따른다. Edelman et al.의 EU 인덱스는 또한 Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda에 제시되어 있다. 이에 따라 문구 "Kabat에 제시된 EU 인덱스" 또는 "Kabat의 EU 인덱스" 및 "Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 위치 ...." 및 이들의 문법적 변형들은 Kabat 1991에 제시된 Edelman et al.의 인간 IgG1 EU 항체를 기반으로 하는 잔기 번호 표기 체계를 지칭한다.
가변 도메인(중쇄와 경쇄 모두) 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열에 사용된 번호 표기 체계는 Kabat 1991에 제시된 것이다.
항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 유형(예를 들어 IgD, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 아형(예를 들어 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3)를 가질 수 있다. 면역 글로불린, 예를 들어 IgG1은 많아야 몇 개의 아미노산에서 서로 다른 여러 동종이인자형(allotype)으로 존재한다. 본 명세서에 개시된 항체는 통상적으로 알려진 이소형, 유형, 아형 또는 동종이인자형 중 임의의 것으로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형 또는 이들의 임의의 혼성형이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG1 아형 또는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 아형을 갖는다.
"항체"는 예로서 자연 발생 및 비-자연 발생 항체; 단클론성 및 다클론성 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비-인간 항체, 전합성 항체; 단일쇄 항체; 단일 특이적 항체; 다중 특이적 항체(2중 특이적 항체 포함); 2개의 중쇄와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 테트라머 항체; 항체 경쇄 모노머; 항체 중쇄 모노머; 항체 경쇄 다이머; 항체 중쇄 다이머; 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍; 세포내 항체(intrabody); 헤테로콘쥬게이트(heteroconjugate) 항체; 1가 항체; 단일쇄 항체; 카멜화(camelized) 항체; 아피바디(affybody); 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어 항-항-Id 항체 포함), 및 완전히 항원 결합할 수 있는 단일 모노머 가변 항체 도메인(예를 들어 VH 도메인 또는 VL 도메인)으로 이루어진 결합 분자를 포함하는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함한다(Harmen M. M. and Haard H. J. Appl Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007)).
본 명세서에서 사용하는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 및 "항원-결합 단편"은 호환적이며 항원(예를 들어 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 이러한 "단편"은 예를 들어 약 8 내지 약 1500개의 아미노산 길이이고, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들어 약 8 내지 약 200개 아미노산 또는 약 10개 내지 약 50개 또는 100개 아미노산 길이이다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 항체, 예를 들어 본 명세서에 개시된 항-FAM19A5 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예들은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 연결부에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인 및 이황화-연결된 Fvs(sdFv)로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 경우에 따라 합성 링커에 의해 접합될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한 Fv 단편의 2개의 도메인인 VL과 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 이들을 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일쇄 Fv(scFv)로서 알려짐)로서 만들 수 있는 합성 링커에 의해 접합될 수 있다; 예를 들어 Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조. 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래 기술을 이용하여 얻어지며, 상기 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 면역 글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가변 영역"과 "가변 도메인"은 호환되며 당업계에서 보편적이다. 상기 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부를 지칭하는 것으로, 전형적으로 상기 성숙한 중쇄 내에는 약 아미노-말단 110 내지 120개의 아미노산이 있고 상기 성숙한 경쇄 내에는 약 90 내지 115개의 아미노산이 있고, 이들은 항체들 사이에서 서열이 광범위하게 상이하고 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합과 특이성에서 사용된다. 상기 서열 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 영역에 집중되는 반면에, 상기 가변 도메인에서 더 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불린다.
특정 기전 또는 이론에 국한되기를 바라는 것은 아니지만, 상기 경쇄 및 중쇄의 CDR은 항원과 항체의 상호작용 및 특이성을 주로 담당하는 것으로 믿어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 가변 영역은 설치류 또는 쥐과의 CDR과 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 가변 영역은 영장류(예를 들어 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 가변 영역은 설치류 또는 쥐과의 CDR과 영장류(예를 들어 비-인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "중쇄(HC)"는 항체와 관련하여 사용하였을 때 불변 도메인의 아미노산 서열을 토대로 IgG의 아형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여 각각 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 유형을 발생시키는 임의의 별개의 타입, 예를 들어 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "경쇄(LC)"는 항체와 관련하여 사용하였을 때 불변 도메인의 아미노산 서열을 토대로 임의의 별개의 타입, 예를 들어 카파(κ) 및 람다(λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 경쇄는 인간 경쇄이다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 항체의 경쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 항체의 중쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 호환적이고 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다. 상기 불변 도메인은 항체 부분, 예를 들어 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 효과기 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카복시 말단 부분이다. 면역 글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역 글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖고 있다.
"Fc 영역"(단편 결정화 가능한 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 면역계의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 상에 위치한 Fc 수용체 또는 고전적 보체계의 제1 성분(C1q)에 대한 결합을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 면역 글로불린이 결합하는 것을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 이에 따라, Fc 영역은 제1 불변 영역 면역 글로불린 도메인(예를 들어 CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2(CH2) 및 제3(CH3) 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편을 포함하고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 사슬에 있는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH 도메인 2-4)을 포함한다. IgG의 경우에 Fc 영역은 면역 글로불린 도메인 Cγ2과 Cγ3 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 면역 글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 C226번 또는 P230번 위치에 있는 아미노산 잔기(또는 이들 2개의 아미노산 사이의 아미노산)로부터 중쇄의 카르복시-말단까지 신장되는 것으로 한정되는데, 번호 표기는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 약 아미노산 231번으로부터 약 아미노산 340번으로 연장되어 있고, CH3 도메인은 Fc 영역에서 Cm 도메인의 C-말단 측에 위치해 있는바, 즉 IgG의 약 아미노산 341번으로부터 약 아미노산 447번으로 연장되어 있다. 본 명세서에서 사용하는 Fc 영역은 임의의 동종이인자형 변이체를 포함하는 천연 서열 Fc, 또는 변이체 Fc(예를 들어 비-자연 발생 Fc)일 수 있다. Fc는 또한 이 영역이 분리 상태에 있거나 또는 "Fc 융합 단백질"(예를 들어 항체 또는 면역유착(immunoadhesion))이라고도 하는 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"과 같은 Fc-포함 단백질 폴리펩티드와 관련하여 의미하는 것일 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "천연 서열 Fc"는 자연에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이들의 자연 발생 변이체를 포함한다. 천연 서열 Fc는 Fc들의 다양한 동종이인자형을 포함한다(예를 들어 Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1; Vidarsson G. et al. Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개) 참조).
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역 글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 Fcγ 패밀리의 수용체와 이들 수용체의 대립 유전자 변이체 및 다른 방식으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. 상기 Fcγ 패밀리는 3개의 활성화 수용체(마우스의 FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV; 인간의 FcγRIA, FcγRIIA 및 FcγRIIIA)와 하나의 저해 수용체(FcγRIIB)로 이루어져 있다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체와 결합하며 가장 강한 Fc 효과기 기능을 끌어낸다. 인간 IgG1은 그가 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형과 관련하여 쥐의 IgG2a와 동등한 것으로 볼 수 있다. 역으로, 인간 IgG4는 최소의 Fc 효과기 기능을 끌어낸다(Vidarsson G. et al. Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개) 참조).
상기 불변 영역은 하나 이상의 효과기 기능을 제거하기 위해서 예를 들어 재조합 기술에 의해 조작될 수 있다. "효과기 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용 또는 그로부터 생기는 생화학적 반응을 지칭한다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, ADCC 및 항체 의존성 세포-매개 식작용(ADCP)과 같은 FcγR-매개 효과기 기능 및 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 한다. 따라서 용어 "Fc 기능이 없는 불변 영역"은 Fc 영역에 의해 매개된 하나 이상의 효과기 기능이 감소되거나 또는 없는 불변 영역을 포함한다.
항체의 효과기 기능은 서로 다른 접근법에 의해 감소 또는 회피될 수 있다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역이 결여된 항체 단편(예를 들어 Fab, F(ab')2, 단일쇄 Fv(scFv) 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 sdAb와 같은)을 사용함으로써 감소 또는 회피될 수 있다. 이와 달리, Fc 영역의 다른 가치 있는 특성(예를 들어 긴 반감기 및 헤테로다이머화)은 보유하면서 Fc 영역에서 특정 잔기에 연결되어 있는 당을 제거하여 항체의 효과기 기능을 감소시킴으로써 소위 무당화(aglycosylated) 항체가 생성될 수 있다. 무당화 항체는 예를 들어 당이 부착되어 있는 잔기를 결실 또는 변경함으로써, 당을 효소적으로 제거함으로써, 글리코실화 저해제의 존재하에 배양된 세포에 항체를 생산함으로써 또는 단백질을 글리코실화할 수 없는 세포(예를 들어 박테리아 숙주 세포)에서 항체를 발현함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어 미국특허공개번호 20120100140 참조할 것. 또 다른 접근법은 효과기 기능이 감소된 IgG 아형의 Fc 영역을 이용하는 것으로, 예를 들어 IgG2 및 IgG4 항체는 IgG1 및 IgG3보다 더 낮은 수준의 Fc 효과기 기능을 갖는 것을 특징으로 한다. Fc 부분의 CH2 도메인에서 힌지 영역에 가장 가까이 있는 잔기가 항체의 효과기 기능을 담당하는데, 선천 면역계의 효과기 세포 상에서 C1q(보체) 및 IgG-Fc 수용체(FcγR)에 대해 크게 중첩된 결합 부위를 함유하고 있기 때문이다(Vidarsson G. et al. Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개)). 따라서 Fc 효과기 기능이 감소되거나 없는 항체는 예를 들어 IgG4 이소형의 IgG 항체의 CH2 도메인과 IgG1 이소형의 IgG 항체의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역 또는 IgG2의 힌지 영역과 IgG4의 CH2 영역을 포함하는 키메라 Fc 영역(예를 들어 Lau C. et al. J. Immunol. 191:4769-4777 (2013) 참조) 또는 Fc 효과기 기능을 변경, 예를 들어 Fc 기능을 감소시키거나 없게 하는 돌연변이를 가진 Fc 영역을 생성시킴으로써 제조될 수 있다. 돌연변이가 있는 이러한 Fc 영역은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 개시 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허공개번호 20120100140와 그 안에 인용된 미국출원과 PCT 출원들 및 An et al., mAbs 1:6, 572-579 (2009)를 참조할 것.
"힌지", "힌지 도메인" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인과 접합시키고 힌지의 상, 중 및 하부를 포함하는 중쇄 불변 영역의 도메인을 지칭한다(Roux et al., J. Immunol. 1998 161:4083). 상기 힌지는 항체의 결합 및 효과기 영역 간 가요성의 수준 변화를 제공하고 또한 2개의 중쇄 불변 영역 사이의 분자간 이황화 결합을 위한 부위를 제공한다. 본 명세서에 개시되어 있는 바와 같이, 힌지는 모든 IgG 이소형에 대해 Glu216에서 시작하여 Gly237에서 끝난다(Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083). 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지의 서열이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어 Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개)를 참조할 것.
용어 "CH1 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 힌지에 가변 도메인을 연결하는 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 CH1 도메인은 A118에서 시작하여 V215에서 끝난다. 용어 "CH1 도메인"은 야생형 CH1 도메인 뿐만 아니라 이의 자연에 존재하는 변이체(예를 들어 동종이인자형)를 포함한다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4(야생형 및 동종이인자형 포함)의 CH1 도메인 서열은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 위의 Kabat EA et al., (1991) 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개 참조). 예시적인 CH1 도메인은 예를 들어 미국특허공개 20120100140 및 그 안에 인용된 미국특허와 공개공보 및 PCT 공보에 기재되어 있는 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기를 변경하는 돌연변이를 가진 CH1 도메인을 포함한다.
용어 "CH2 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 CH3 도메인에 힌지를 연결하는 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 CH2 도메인은 P238에서 시작하여 K340에서 끝난다. 용어 "CH2 도메인"은 야생형 CH2 도메인 뿐만 아니라 이의 자연에 존재하는 변이체(예를 들어 동종이인자형)를 포함한다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4(야생형 및 동종이인자형 포함)의 CH2 도메인 서열은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 위의 Kabat EA et al., (1991) 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개 참조). 예시적인 CH2 도메인은 예를 들어 미국특허공개 20120100140 및 그 안에 인용된 미국특허와 공개공보 및 PCT 공보에 기재되어 있는 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기 및/또는 감소된 Fc 효과기 기능을 변경하는 돌연변이를 가진 CH2 도메인을 포함한다.
용어 "CH3 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 CH2 도메인에 대해 C-말단인 중쇄 불변 영역을 말한다. 본 명세서에서 사용하는 CH3 도메인은 G341에서 시작하여 K447에서 끝난다. 용어 "CH3 도메인"은 야생형 CH3 도메인 뿐만 아니라 이의 자연에 존재하는 변이체(예를 들어 동종이인자형)를 포함한다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4(야생형 및 동종이인자형 포함)의 CH3 도메인 서열은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 위의 Kabat EA et al., (1991) 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개 참조). 예시적인 CH3 도메인은 예를 들어 미국특허공개 20120100140 및 그 안에 인용된 미국특허와 공개공보 및 PCT 공보에 기재되어 있는 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기를 변경하는 돌연변이를 가진 CH3 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 유형(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)을 지칭한다.
"동종이인자형"은 몇 개의 아미노산에서 차이가 있는 특정 이소형 그룹 내 자연 발생 변이체를 지칭한다(예를 들어 Jefferis et al., (2009) mAbs 1:1 참조). 본 명세서에 기재되어 있는 항체는 임의의 동종이인자형을 가질 수 있다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 동종이인자형은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 위의 Kabat EA et al., (1991); Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년10월20일 온라인 공개); 및 Lefranc MP, mAbs 1:4, 1-7(2009)을 참조할 것.
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본 명세서에서 호환하여 사용된다.
본 명세서에서 사용하는 "분리된 항체"는 서로 다른 항원 특이성을 가진 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 의미한다(예를 들어 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 FAM19A5 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나 FAM19A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 서로 다른 종의 다른 FAM19A5 단백질에 교차 반응성을 가질 수 있다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어 항원) 간의 비공유 상호작용의 전체 합의 강도를 의미한다. 달리 제시하지 않는 한, 본 명세서에서 사용하는 "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버(예를 들어 항체와 항원) 간 1:1 상호작용을 반영한 고유 결합 친화성을 의미한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 평형 해리 상수(KD)와 평형 결합 상수(KA)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 다수의 방법으로 측정 및/또는 표시될 수 있다. 상기 KD는 koff/kon의 몫으로부터 계산되고 몰 농도(M)로 표시되고, KA는 kon/koff의 몫으로부터 계산된다. kon은 예를 들어 항원에 대한 항체의 결합 속도 상수를 의미하고, koff는 예를 들어 항원에 대한 항체의 해리를 의미한다. kon 및 koff는 면역분석(예를 들어 효소결합 면역흡착 분석(ELISA)), BIAcore® 또는 역학적 배제 분석(KinExA®)과 같이 당업자에게 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "특이적으로 결합", "특이적으로 인식", "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합"은 항체와 관련하여 유사한 용어들이고, 항원(예를 들어 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합하는 분자(예를 들어 항체)를 지칭하는 것으로 이러한 결합은 당업자에 의해 이해되는 것이다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 예를 들어 면역분석, BIAcore®, KinExA® 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, ID) 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 분석법들에 의해 결정하였을 때 일반적으로 더 낮은 친화도를 가진 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 이 분자가 또 다른 항원에 결합할 때 KA보다 적어도 2 logs, 2.5 logs, 3 logs, 4 logs 이상 더 큰 KA으로 상기 항원에 결합한다.
항체는 전형적으로 10-5 내지 10-11 M 이하의 해리 상수(KD)에 의해 반영되는 높은 친화도로 이들의 동족 항원(cognate antigen)에 특이적으로 결합한다. 약 10-4 M를 넘는 임의의 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 의미하는 것으로 간주된다. 본 명세서에서 사용하는 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 높은 친화도로 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로, 이는 예를 들어 상기 소정의 항원을 사용하는 BIACORE™ 2000 기기에서 면역분석(예를 들어 ELISA) 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정하였을 때 10-7 M 이하, 바람직하게 10-8 M 이하, 훨씬 더 바람직하게 10-9 M 이하, 가장 바람직하게 10-8 M 내지 10-10 M 이하의 KD를 갖는 것을 의미하지만, 이 항체는 관련 없는 항원에는 높은 친화도로 결합하지 않는다.
본 명세서에서 사용하는 "항원"은 단백질, 펩티드 또는 합텐(hapten)과 같은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질을 지칭한다. 항원은 FAM19A5 또는 이의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 "에피토프"는 당업계의 용어로서 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국재화된 영역을 지칭한다. 에피토프는 예를 들어 폴리펩티드의 인접 아미노산들(선형 또는 인접 에피토프)일 수 있거나 또는 에피토프는 예를 들어 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 2개 이상의 인접하지 않은 영역들이 합쳐진 것(입체형태, 비선형, 불연속 또는 비-인접 에피토프)일 수 있다. 인접 아미노산들로부터 형성된 에피토프는 항상 그렇지는 않지만 전형적으로 변성(denaturing) 용매에 노출시 유지되는 반면에, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간적 입체형태 내 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20개의 아미노산을 포함한다. 소정의 항체에 의해 어떤 에피토프가 결합되는 가를 결정하기 위한 방법(즉, 에피토프 매핑)은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 (예를 들어 FMAM19A5의) 중첩 또는 인접 펩티드를 소정의 항체(예를 들어 항-FAM19A5 항체)와의 반응성에 대해 시험하는 면역블롯팅과 면역침전 분석을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당업계의 기술 및 본 명세서에 기재된 기술, 예를 들어 x선 결정학, 2차원 핵자기공명 및 HDX-MS를 포함한다(예를 들어 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) 참조).
특정 구현예에 있어서, 상기 항체가 결합하는 에피토프는 예를 들어 NMR 분광법, X-선 회절 결정학 연구, ELISA 분석, 질량분광분석과 결합한 수소/중수소 교환(예를 들어 액체 크로마토그래피 전자분무 질량분광분석), 어레이-기반 올리고-펩티드 스캐닝 분석 및/또는 돌연변이유발 매핑(예를 들어 부위-지향 돌연변이 유발 매핑)에 의해 결정될 수 있다. 엑스선 결정학의 경우에 결정화는 당업계에 공지된 방법 중 임의의 방법을 이용하여 달성될 수 있다(예를 들어 Giege R et al, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303 참조). 항체:항원 결정은 잘 공지된 X-선 회절 기술을 이용하여 연구될 수 있고 X-PLOR(Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포; 예를 들어 Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff H.W. et al.,; U.S. 2004/0014194 참고) 및 BUSTER(Bricogne G. (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt1):37-60; Bricogne G. (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P. et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 정제(refine)될 수 있다. 돌연변이 유발 매핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 알라닌 스캐닌 돌연변이 유발 기술을 포함한 돌연변이 유발 기술들의 기재에 대해서는 예를 들어 Champe M. et al., (1995) J Biol Chem 270:1388-1394 및 Cunningham B.C. & Wells J.A. (1989) Science 244: 1081-1085를 참고할 것.
용어 "에피토프 매핑"은 항체-항원 인식에 대한 분자 결정 요인의 동정 과정을 지칭한다.
2개 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일 에피토프에 결합"은 소정의 방법에 의해 결정할 때 항체들이 아미노산 잔기의 동일 세그먼트에 결합한다는 것을 의미한다. 항체들이 본 명세서에 기재된 항체와 "FAM19A5 상의 동일 에피토프"에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 기술은 에피토프 매핑 방법, 예를 들어 에피토프의 원자 분해능을 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 x-선 분석 및 수소/중수소 교환 질량분광분석(HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 여기서 상기 항원 서열 내 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합 손실은 대개 에피토프 성분의 표시로서 간주된다. 또한 에피토프 매핑을 위한 전산 조합법도 이용할 수 있다. 이들 방법은 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특정한 짧은 펩티드를 친화성 분리하는 관심 항체의 능력에 의존한다. 동일한 VH 및 VL 또는 동일한 CDR1, 2 및 3 서열을 가진 항체는 동일한 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.
"표적과의 결합에 대해 또 다른 항체와 경쟁"하는 항체는 상기 다른 항체의 표적 결합을 (부분적으로 또는 완전히) 저해하는 항체를 지칭한다. 2개의 항체가 표적과의 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부, 즉 하나의 항체가 다른 하나의 항체의 표적 결합을 저해하는지 여부와 저해하는 정도는 공지된 경쟁 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 어느 한 항체는 또 다른 항체의 표적 결합에서 경쟁하며 이 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%까지 저해한다. 저해 또는 경쟁 수준은 항체가 "차단 항체"(즉, 표적과 먼저 배양되는 저온 항체)인지에 따라 다를 수 있다. 경쟁 분석은 예를 들어 E.d. Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 또는 E.d. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999에 의한 "Using Antibodies"의 제11장에 기재된 대로 실시할 수 있다. 경쟁 항체는 동일 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프(예를 들어 입체장애에 입증됨)에 결합한다.
다른 경쟁 결합 분석으로는 고상 직접 또는 간접 방사성 면역분석(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983) 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986) 참조); 고상 직접 표지화 분석, 고상 직접 표지화 샌드위치 분석(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조); 1-125 표지를 사용하는 고상 직접 표지 RIA(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546 (1990) 참조); 및 직접 표지화 RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990) 참조)를 포함한다.
용어 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 전통적인 2쇄 항체의 중쇄와 단쇄의 가변 도메인이 접합하여 하나의 사슬을 형성하는 단일쇄 Fv("가변 단편") 항체를 지칭한다.
"2중 특이적" 또는 "2중 기능성 항체"는 2개의 서로 다른 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 서로 다른 결합 부위를 가진 인공 혼성 항체이다. 2중 특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어 Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)를 참조할 것.
본 명세서에서 사용하는 "단클론성 항체"는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성과 친화성을 보이는 항체이거나 또는 모든 항체가 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성과 친화성을 보이는 항체 조성을 지칭한다. 따라서 용어 "인간 단클론성 항체"는 단일 결합 특이성을 보이고 인간 생식계(germline) 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 선택적 불변 영역을 가진 항체 또는 항체 조성을 지칭한다. 몇몇 구현예에 있어서, 인간 단클론성 항체는 예를 들어 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 전이 유전자와 경쇄 전이 유전자를 포함하는 게놈을 가진 유전자 도입(transgenic) 비-인간 동물, 예를 들어 유전자 도입 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 면역 글로불린 유전자에 대해 유전자 도입 또는 염색체 도입(transchromosomal) 동물(예를 들어 마우스)로부터 분리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마, (b) 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 인간 면역 글로불린 유전자 서열을 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 생식계 유전자에 의해 코딩되는 특정한 인간 생식계 면역 글로불린 서열을 이용하지만 예를 들어 항체 성숙화 중에 일어나는 후속 재배열과 돌연변이를 포함하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이(예를 들어 Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125 참조), 상기 가변 영역은 외래 항원에 대해 특이적인 항체를 형성하도록 재배열되는 다양한 유전자에 의해 코딩되는 항원 결합 도메인을 함유한다. 재배열 외에도, 상기 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 다수의 단일 아미노산 변화(체세포 돌연변이 또는 초돌연변이라고 함)에 의해 더욱 변형될 수 있다. 상기 불변 영역은 항원에 대한 추가 반응으로 변할 것이다(즉, 이소형 변화). 따라서 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 면역 글로불린 폴리펩티드를 코딩하는 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 본래의 핵산 분자와 서열 동일성을 가질 수 없지만, 대신에 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다(즉, 적어도 80% 동일성을 가짐).
"인간 항체(HuMAb)"는 프레임워크와 CDR 영역이 2개 모두 인간 생식계 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체를 지칭한다. 또한 상기 항체가 불변 영역을 함유하면 상기 불변 영역 또한 인간 생식계 면역 글로불린 서열로부터 유래된다. 본 명세서에 기재된 항체는 인간 생식계 면역 글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나 본 명세서에서 사용하는 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식계로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하지 않는다. 용어 "인간" 항체와 "완전한 인간" 항체는 동의어로 사용된다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체의 CDR 도메인 외부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역 글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 치환된 항체를 지칭한다. 항체의 인간화된 형태의 몇몇 구현예에 있어서, CDR 도메인 외부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역 글로불린의 아미노산으로 치환되었고 하나 이상의 CDR 영역 내부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 변하지 않고 남아 있다. 아미노산의 작은 첨가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 이들이 특정 항원에 결합하는 항체의 능력을 없애지 않는 한 허용 가능하다. "인간화" 항체는 원 항체의 항원 특이성과 유사한 항원 특이성을 유지한다.
"키메라 항체"는 마우스 항체로부터 가변 영역이 유래되고 인간 항체로부터 불변 영역이 유래된 항체와 같이 하나의 종으로부터 가변 영역이 유래되고 또 다른 종으로부터 불변 영역이 유래된 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "교차 반응"은 상이한 종의 FAM19A5에 결합하는 본 명세서에 개시된 항체의 능력을 지칭한다. 예를 들어 인간 FAM19A5에 결합하는 본 명세서에 개시된 항체는 또한 또 다른 종의 FAM19A5(예를 들어 마우스 FAM19A5)에도 결합할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 교차 반응성은 결합 분석(예를 들어 SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출함으로써 또는 FAM19A5를 생리학적으로 발현하는 세포에 결합하거나 또는 그렇지 않으면 상기 세포와 기능적으로 상호작용함으로써 측정될 수 있다. 교차 반응성을 결정하기 위한 방법은 본 명세서에 기재되어 있는 표준 결합 분석, 예를 들어 BIACORETM 2000 SPR 기기(Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)를 사용한 BIACORETM 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석, 또는 유세포 계수 기술을 포함한다.
본 명세서에 개시된 용어 "자연 발생"을 대상체에 적용시 대상체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어 자연의 소스로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함) 내 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연 발생이다.
"폴리펩티드"는 적어도 2개의 연속 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 사슬을 지칭하는 것으로, 상기 사슬의 길이에 상한은 없다. 단백질 내 하나 이상의 아미노산 잔기는 글리코실화, 포스포릴화 또는 이황화 결합 형성과 같은 변형을 함유할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, cDNA일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 세포 내 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 지칭하는 것으로, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어들은 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이나 환경적인 영향으로 인해 다음 세대들에게서는 특정한 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일할 수 없지만 여전히 본 명세서에서 사용하는 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
본 발명에서 사용하는 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 상기 연결은 공유 연결 또는 비공유 연결일 수 있다. 상기 연결은 또한 유전자 연결(즉 재조합에 의한 융합)일 수 있다. 이러한 연결은 화학적 콘쥬게이션 및 재조합 단백질 생산과 같은 당업계에서 인정하는 다양한 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
II. 아데노-연관 바이러스(AAV) 및 이로부터 유래된 벡터
본 명세서에 개시된 AAV 벡터는 관심 단백질, 예를 들어 FAM19A5 길항제, 예를 들어 항-FAM19A5 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 핵산은 또한 발현 및 몇몇 구현예에서는 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 단백질 형질 도입 도메인(PTD)을 코딩하는 서열 등과 같은 관심 단백질의 분비를 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있다. 이에 따라 몇몇 구현예에 있어서, 상기 핵산은 감염된 세포에서 관심 단백질의 발현을 유발 또는 개선하기 위해 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 이러한 프로모터는 예를 들어 감염된 조직에서 단백질의 효율적이고 안정적인 생산을 가능하게 하는 편재성(ubiquitous)이고 세포- 또는 조직-특이적이며, 강하고, 약하게 조절되는 키메라성 등일 수 있다. 일반적으로 상기 개시된 방법에서 사용하는 프로모터는 인간 세포에서 기능적이지만, 상기 프로모터는 코딩된 단백질에 상동성이거나 비상동성일 수 있다. 조절된 프로모터의 예는 Tet 온/오프 요소-함유 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, 타목시펜-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용 가능한 다른 프로모터로는 신장, 비장, 췌장, 뇌 또는 척수와 같은 조직에 대해 조직 특이적인 프로모터를 포함한다. 유비쿼터스 프로모터의 예에는 특히 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터 등의 바이러스 프로모터 및 PGK(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터와 β-액틴 프로모터와 같은 세포 프로모터가 포함된다.
본 명세서에 개시된 AAV 벡터의 몇몇 구현예에 있어서, 하나 이상의 피드백 요소를 사용하여 관심 단백질의 과발현을 약화시킬 수 있다. 예를 들어 상기 AAV 벡터의 몇몇 구현예는 외인성 전사체를 표적으로 할 하나 이상의 siRNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 저해 전사 인자에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 추가 프로모터를 포함한다. 다양한 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 AAV 벡터는 관심 단백질의 발현 수준을 생리학적 수준에서 유지할 수 있는 항상성(homoeostatic) 피드백 루프를 생성할 수 있는 구조체를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 AAV 벡터는 코딩된 단백질의 분비를 가능하게 하는 리더 서열(또는 신호 펩티드)을 포함하는 핵산을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 관심 전이 유전자를 분비 신호 펩티드(통상적으로 분비된 폴리펩티드의 N-말단에 위치함)를 코딩하는 서열과 융합하면 형질 도입된 세포로부터 분비될 수 있는 형태의 치료 단백질의 생산을 가능하게 할 수 있다. 이러한 신호 펩티드의 비제한적인 예는 인간 베타-글로빈, 알부민, β-글루쿠로니다아제, 알칼리 프로테아제 또는 피브로넥틴 분비 신호 펩티드를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV 벡터로부터 발현된 mRNA는 비 -CNS 조직에서 우선적으로 발현되는 miRNA의 miRNA 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 miRNA 결합 부위는 miR-122에 대한 결합 부위이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 miRNA 결합 부위는 miR-1에 대한 결합 부위이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 CNS-연관 유전자로부터 발현된 mRNA는 CNS 조직에서 우선적으로 발현되는 miRNA의 miRNA 결합 부위를 포함하지 않는다.
파르보비리다에 과에 속하는 AAV는 4.7 킬로 염기(kb) 내지 6 kb의 단일 가닥 선형 DNA 게놈을 가진 작은 외피가 없는 정20면체 바이러스이다. Gonqalves, M., Virol J 2:43(2005)를 참조할 것. 이 과는 2개의 아과: 척추동물을 감염시키는 파르보비리나에 아과와 곤충을 감염시키는 덴소비리나에 아과로 나눌 수 있다. 파르보보비리나에 아과에 속하는 바이러스들은 본 명세서에서 파르보바이러스라고 하며 덴소바이러스 속을 포함한다. 이들 속의 명칭으로부터 추론할 수 있듯이 데펜도바이러스에 속하는 바이러스들은 이들이 일반적으로 세포 배양에서 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와 공-감염을 필요로 한다는 점에서 독특하다. 데펜도바이러스 속은 통상적으로 인간(예를 들어 혈청형 1, 2, 3 A, 3B, 4, 5 및 6) 또는 영장류(예를 들어 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 AAV 및 다른 온혈 동물을 감염시키는 관련 바이러스(예를 들어 소, 개, 말 및 양의 아데노-연관 바이러스)를 포함한다. 파르보바이러스 및 파르보비리다에에 속하는 다른 바이러스들에 대한 추가 정보는 Kenneth I. Bems, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)에 기재되어 있다.
복제, 캡시드 및 어셈블리 AAV 유전자
AAV의 단일 가닥 게놈은 3개의 유전자 rep(복제), cap(캡시드) 및 aap(어셈블리)를 포함한다. 이들 3개의 유전자는 3개의 프로모터, 대체 번역 개시 부위 및 차등 스플라이싱의 사용을 통해 적어도 9개의 유전자 산물을 생성한다.
상기 rep 유전자는 바이러스 게놈 복제 및 패키징에 필요한 4개의 단백질(Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 코딩한다. 상기 cap 유전자 발현은 바이러스 게놈을 보호할 뿐 아니라 세포 결합과 내재화에 적극 관여하는 외부 캡시드 쉘을 형성하는 바이러스 캡시드 단백질(VP1; VP2; VP3)을 생성한다. 상기 바이러스 외피는 정20면체 구조로 배치되어 있는 60개의 단백질로 이루어져 있는 것으로 추정된다. 상기 aap 유전자는 cap 유전자와 중첩되는 대체 판독 프레임에서 어셈블리 활성화 단백질(AAP)을 코딩한다. 이러한 핵 단백질은 캡시드 어셈블리를 위한 지지(scaffolding) 기능을 제공하는 것으로 생각되며 몇몇 AAV 혈청형에서 VP 단백질의 핵 국재화에서 역할을 한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 AAV 벡터는 재조합 AAV이고 상기 rep 유전자, cap 유전자 및 aap 유전자 중 하나 이상이 결여되어 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 rAAV는 상기 rep 유전자, cap 유전자 및 aap 유전자 중 하나 이상이 돌연변이되도록 변형되어 AAV 유전자 중 하나 이상의 발현이 변형된다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 rep, cap, 또는 aap 유전자 중 하나 이상은 자연 발생이고, 예를 들어 상기 rep, cap 또는 app 유전자는 파르보바이러스 rep, cap 또는 aap 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 rep, cap 또는 aap 유전자 중 하나 이상은 합성 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 AAV 게놈은 서로 다른 AAV 게놈(예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11의 게놈)을 가질 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 이에 따라 본 명세서는 rep, cap 또는 aap의 임의의 가능한 변형(permutation)을 포함하는 AAV 벡터를 개시한다
역전된 말단 반복
본 개시 내용의 특정 측면은 제1 ITR, 예를 들어 5' ITR, 및 제2 ITR, 예를 들어 3' ITR을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 ITR은 자연 발생이고, 예를 들어 상기 ITR은 파르보바이러스 ITR의 전부 또는 일부를 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 ITR은 합성 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 ITR은 AAV 게놈의 ITR을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 AAV 게놈의 ITR이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 ITR은 AAV8 또는 AAV9 게놈의 ITR이다. 다른 구현예에 있어서, 상기 ITR은 AAV 게놈 중 하나 이상으로부터 유래된 ITR을 5' 및 3' 말단에 포함하도록 유전자 조작된 합성 서열이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 ITR은 동일한 게놈으로부터, 예를 들어 동일한 바이러스의 게놈으로부터 또는 서로 다른 게놈으로부터, 예를 들어 2개 이상의 서로 다른 AAV 게놈의 게놈으로부터 유래된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 ITR은 동일한 AAV 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 핵산 분자에 존재하는 2개의 ITR은 동일하고, 특히 AAV2 ITR일 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 제1 ITR과 제2 ITR은 동일하다.
몇몇 구현예에 있어서, ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않은 ITR을 5' 및 3' 말단에 포함하도록 유전자 조작된 합성 서열이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 ITR 서열은 하나 이상의 회문 서열(palindromic sequence)을 포함한다. 본 명세서에 개시된 ITR의 회문 서열은 천연 회문 서열(즉, 자연에서 발견되는 서열), 유사 회문 서열과 같은 합성 서열(즉, 자연에서 발견되지 않는 서열) 및 이들의 조합 또는 변형 형태를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. "유사 회문 서열"은 2차 구조를 형성하는 천연 AAV 회문 서열 내 서열에 대해 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만을 포함한 80% 미만의 동일성을 공유하거나 핵산 서열 동일성이 없는 불완전 회문 서열을 포함한 회문 DNA 서열이다. 상기 천연 회문 서열은 본 명세서에 개시된 임의의 게놈으로부터 수득 또는 유래될 수 있다. 상기 합성 회문 서열은 본 명세서에 개시된 임의의 게놈을 기반으로 할 수 있다. 상기 회문 서열은 연속 또는 불연속적(interrupted)일 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 회문 서열은 제2 서열의 삽입을 포함하여 불연속적이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 제2 서열은 프로모터, 인핸서, 인테그라아제에 대한 통합 부위(예를 들어 Cre 또는 Flp 재조합효소에 대한 부위), 유전자 산물에 대한 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 ITR은 헤어핀 루프 구조를 형성한다. 일 구현예에 있어서, 상기 제1 ITR은 헤어핀 구조를 형성한다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성한다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 헤어핀 구조를 형성한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 핵산 분자의 ITR은 전사 활성화된 ITR일 수 있다. 전사 활성화된 ITR은 적어도 하나의 전사 활성화된 요소를 포함함으로써 전사 활성화된 야생형 ITR의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이와 관련하여 다양한 유형의 전사 활성 요소가 사용하기에 적합하다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 전사 활성 요소는 구성적 전사 활성 요소이다. 구성적 전사 활성 요소는 지속 가능한 수준의 유전자 전사를 제공하고 전이 유전자가 지속적으로 발현될 필요가 있을 때 바람직하다. 다른 구현예에 있어서, 상기 전사 활성 요소는 유도성 전사 활성 요소이다. 유도성 전사 활성 요소는 일반적으로 유도인자(또는 유도 조건)가 없는 상태에서는 낮은 활성을 나타내고 유도인자가 존재하는 상태(또는 유도 조건으로 전환)에서는 상향 조절된다. 유도성 전사 활성 요소는 특정 시간 또는 특정 위치에서만 발현이 필요할 때 또는 유도제를 사용하여 발현 수준을 적정할 필요가 있을 때 바람직할 수 있다. 전사 활성 요소는 또한 조직 특이적일 수 있는바, 즉 특정 조직 또는 세포 유형에서만 활성을 나타낸다.
전사 활성 요소는 ITR에 다양한 방법으로 혼입될 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 전사 활성 요소는 ITR의 임의의 부분에 5' 혼입되거나 ITR의 임의의 부분에 3' 혼입된다. 다른 구현예에 있어서, 전사 활성화된 ITR의 전사 활성 요소는 2개의 ITR 서열 사이에 위치한다. 상기 전사 활성 요소가 떨어져 있어야 하는 2개 이상의 요소를 포함하는 경우에 이들 요소는 ITR의 일부들과 교호적일 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, ITR의 헤어핀 구조는 결실되고 전사 요소의 역전된 반복으로 대체된다. 이러한 후자의 배열은 구조에 있어 결실된 부분을 모방한 헤어핀을 생성할 것이다. 전사 활성화된 ITR에는 다수의 직렬 전사 활성 요소가 존재할 수도 있으며, 이들은 인접하거나 떨어져 있을 수 있다. 또한 단백질 결합 부위(예를 들어 Rep 결합 부위)는 전사 활성화된 ITR의 전사 활성 요소에 도입될 수 있다. 전사 활성 요소는 RNA를 형성하는 RNA 폴리머라아제에 의한 DNA의 제어된 전사를 가능하게 하는 임의의 서열을 포함할 수 있고 예를 들어 아래에 정의되어 있는 전사 활성 요소를 포함할 수 있다.
전사 활성화된 ITR은 핵산 분자로부터 운반 및 발현될 수 있는 전이 유전자의 길이를 효과적으로 극대화하는 비교적 제한된 뉴클레오티드 서열 길이로 핵산 분자에 전사 활성화 및 ITR 기능을 모두 제공한다. 전사 활성 요소를 ITR에 혼입하는 것은 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. ITR 서열 및 전사 활성 요소의 서열 요건을 비교하면 ITR 내 요소를 코딩하는 방법에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 예를 들어 전사 활성 요소의 기능적 요소를 복제하는 ITR 서열 내 특정 변화의 도입을 통해 전사 활성을 ITR에 부가할 수 있다. 당업계에는 특정 부위에서 특정 뉴클레오티드 서열을 효율적으로 부가, 결실 및/또는 변경하기 위한 많은 기술들이 존재한다(예를 들어 Deng and Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200: 81-88 참조). 전사 활성화된 ITR을 생성하는 또 다른 방법은 ITR 내 원하는 위치에 제한 부위를 도입하는 것을 포함한다. 또한 다수의 전사 활성 요소를 당업계에 공지된 방법을 이용하여 전사 활성화된 ITR에 혼입할 수 있다.
예시로서, 전사 활성화된 ITR은 TATA 박스, GC 박스, CCAAT 박스, Spl 부위, Inr 영역, CRE(cAMP 조절 요소) 부위, ATF-1/CRE 부위, ARBb 박스, APBa 박스, CArG 박스, CCAC 박스 또는 당업계에 공지된 전사에 관여하는 임의의 다른 요소와 같은 하나 이상의 전사 활성 요소를 포함함으로써 생성될 수 있다.
FAM19A5 길항제
본 개시 내용의 AAV 벡터는 FAM19A5 단백질의 하나 이상의 길항제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 FAM19A5 길항제는 FAM19A5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv(scFv)를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 scFv이다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV 벡터에 의해 발현된 항-FAM19A5 항체(예를 들어 항-FAM19A5 scFv)는 특정 기능적 특징 또는 특성을 특징으로 한다. 예를 들어 상기 항체는 가용성 FAM19A5 및 막 결합 FAM19A5를 포함한 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합한다. 가용성 및/또는 막 결합 인간 FAM19A5에 특이적 결합 외에도, 본 명세서에 기재된 항체는 다음과 같은 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 섬유증 감소, 반전 및/또는 예방;
(b) 과도한 세포외 기질(ECM)의 형성 감소;
(c) 종양 성장 또는 진행의 지연;
(d) 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정했을 때 KD가 10 nM 이하인 가용성 인간 FAM19A5에 결합;
(e) ELISA에 의해 측정했을 때 KD가 10 nM 이하인 막 결합 인간 FAM19A5에 결합;
(f) 반응성 신경아교증(gliosis) 발병의 감소, 반전, 지연 및/또는 예방;
(g) 반응성 성상 세포의 과다 증식 억제;
(h) 뉴로칸 및 신경-아교 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현 감소;
(i) 신경세포의 핵 내 c-fos 및 pERK의 발현 증가;
(j) 신경세포의 생존 촉진;
(k) 신경세포 내 GAP43의 발현 증가; 및
(l) 축삭의 재성장 촉진.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 높은 친화도, 예를 들어 KD가 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M(0.1 nM) 이하, 10-11 M 이하 또는 10-12 M 이하, 예를 들어 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M 또는 10-9 M 내지 10-7 M, 예를 들어 10-12 M, 5 × 10-12 M, 10-11 M, 5 × 10-11 M, 10-10 M, 5 × 10-10 M, 10-9 M, 5 × 10-9 M, 10-8 M, 5 × 10-8 M, 10-7 M 또는 5 × 10-7 M인 가용성 인간 FAM19A5 또는 막 결합 인간에 특이적으로 결합한다. 다양한 종의 인간 FAM19A5에 대한 항체의 결합능을 평가하기 위한 표준 분석법은 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함하여 당업계에 공지되어 있다. 상기 항체의 결합 동역학(예를 들어 결합 친화도)은 ELISA, BIACORE™ 분석 또는 KINEXA®와 같은 당업계에 알려진 표준 분석법에 의해 평가될 수도 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 예를 들어 ELISA에 의해 결정했을 때 KD가 10-7 M 이하, 10-8 M(10 nM) 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M, 또는 10-8 M 내지 10-7 M인 가용성 인간 FAM19A5에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 KD가 10 nM 이하, 예를 들어 0.1 내지 10 nM, 0.1 내지 5 nM, 0.1 내지 1 nM, 0.5 내지 10 nM, 0.5 내지 5 nM, 0.5 내지 1 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 5 nM 또는 5 내지 10 nM인 가용성 FAM19A5에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 ELISA에 의해 결정했을 때 KD가 약 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM 또는 900 pM, 또는 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM 또는 9 nM, 또는 약 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM , 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM 또는 90 nM인 가용성 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 KD가 예를 들어 ELISA에 의해 결정했을 때 10-7 M 이하, 10-8 M(10 nM) 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M 또는 10-8 M 내지 10-7 M인 막 결합 인간 FAM19A5에 결합한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 ELISA에 의해 결정했을 때 KD가 10 nM 이하, 예를 들어 0.1 내지 10 nM, 0.1 내지 5 nM, 0.1 내지 1 nM, 0.5 내지 10 nM, 0.5 내지 5 nM, 0.5 내지 1 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 5 nM 또는 5 내지 10 nM인 막 결합 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 ELISA에 의해 결정했을 때 KD가 약 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM 또는 900 pM, 또는 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM 또는 9 nM, 또는 약 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM 또는 90 nM인 막 결합 인간 FAM19A5에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에 적합한 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 인간 FAM19A5 에피토프에 결합하기 위해(또는 결합을 저해하기 위해) 본 명세서에 개시된 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항-FAM19A5 항체와 교차 경쟁한다.
몇몇 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 기준 항체의 결합을 저해하되, (i) 상기 기준 항체의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 기준 항체의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나; (iii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나; (iv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나; (v) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하거나; (vi) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하거나; (vii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하거나; (viii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하거나; (ix) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하거나; (x) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하거나; (xi) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하거나; (xii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하거나; (xiii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하거나; (xiv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (xv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 기준 항체의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 표 2에 나타낸 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하고, 상기 기준 항체의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 표 3에 나타낸 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 기준 항체는 (a) 각각 서열번호 35 및 39를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (b) 각각 서열번호 36 및 40을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (c) 각각 서열번호 37 및 41을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (d) 각각 서열번호 38 및 42를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (e) 각각 서열번호 155 및 166을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (f) 각각 서열번호 156 및 167을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (g) 각각 서열번호 157 및 168을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (h) 각각 서열번호 158 및 169를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (i) 각각 서열번호 159 및 170을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (j) 각각 서열번호 160 및 171을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (k) 각각 서열번호 161 및 172를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (1) 각각 서열번호 162 및 173을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (m) 각각 서열번호 163 및 174를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (n) 각각 서열번호 164 및 175를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (o) 각각 서열번호 165 및 176을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 기준 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되 상기 VH는 표 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고 상기 VL은 표 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 인간 FAM19A5에 대한 이러한 기준 항체의 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 저해한다. 경쟁 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프에 결합한다(예를 들어 입체장애에 의해 입증됨). 표적에 결합하기 위해 2개의 항체가 서로 경쟁하는지 여부는 RIA 및 EIA와 같은 당업계에 공지된 경쟁 실험을 이용하여 결정할 수 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 본 명세서에 개시된 기준 항체와 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합하되, (i) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나; (iii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나; (iv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나; (v) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하거나; (vi) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하거나; (vii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하거나; (viii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하거나; (ix) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하거나; (x) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하거나; (xi) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하거나; (xii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하거나; (xiii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하거나; (xiv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (xv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 기준 항체의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 표 2에 나타낸 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하고, 상기 기준 항체의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 표 3에 나타낸 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 기준 항체는 (a) 각각 서열번호 35 및 39를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (b) 각각 서열번호 36 및 40을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (c) 각각 서열번호 37 및 41을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (d) 각각 서열번호 38 및 42를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (e) 각각 서열번호 155 및 166을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (f) 각각 서열번호 156 및 167을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (g) 각각 서열번호 157 및 168을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (h) 각각 서열번호 158 및 169를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (i) 각각 서열번호 159 및 170을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (j) 각각 서열번호 160 및 171을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (k) 각각 서열번호 161 및 172를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (l) 각각 서열번호 162 및 173을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (m) 각각 서열번호 163 및 174를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; (n) 각각 서열번호 164 및 175를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (o) 각각 서열번호 165 및 176을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 기준 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 상기 VH는 표 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고 상기 VL은 표 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
2개의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 기술은 예를 들어 에피토프의 원자 분해능을 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 x-선 분석 및 수소/중수소 교환 질량분광분석(HDX-MS)과 같은 에피토프 매핑 방법, 항원 서열 내 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합 손실을 대개 에피토프 성분의 표시로서 간주하는 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 방법, 에피토프 매핑을 위한 전산 조합 방법을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법에 유용할 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 예를 들어 인간 FAM19A5의 단편에 대한 항체의 결합에 의해 결정된 바와 같이 성숙한 인간 FAM19A5의 적어도 하나의 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 TLDRDSSQPRRTIARQTARC(서열번호 6 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 42 내지 61)의 아미노산 서열 내 위치한 단편, 예를 들어 서열번호 6의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 가진 에피토프에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체는 아미노산 잔기 46 내지 51(즉, DSSQPR), 예를 들어 아미노산 잔기 46, 50 및 52(즉, D---P-R), 예를 들어 서열번호 2의 아미노산 잔기 46, 47, 48 및 50(즉, DSS-P)에 해당하는 하나 이상의 아미노산에서 서열번호 6에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체는 CDMLPCLEGEGCDLLINRSG의 아미노산 서열 내에 위치한 단편(서열번호 9 또는 서열번호 2의 아미노산 90 내지 109), 예를 들어 서열번호 9의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산을 가진 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기 99 내지 107(즉, EGCDLLINR), 예를 들어 아미노산 잔기 102, 103, 105 및 107(즉, DL-I-R), 예를 들어 아미노산 잔기 99, 100, 102, 103, 105 및 107(즉, EG-DL-I-R), 예를 들어 서열번호 4의 아미노산 잔기 99, 100 및 107(즉, EG------R)에서 서열번호 9에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 적어도 하나의 에피토프는 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 적어도 하나의 에피토프는 서열번호 9와 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인 인간 FAM19A5 에피토프 또는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 서열 내 위치한 단편, 예를 들어 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 가진 에피토프에만 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 항-FAM19A5 항체는 서열번호 6 또는 천연 입체형태(즉, 미변성)의 이의 단편에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호 9 또는 천연 입체형태(즉, 미변성)의 이의 단편에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 글리코실화 및 글리코실화되지 않은 인간 FAM19A5 모두에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 추가로 하나 이상의 추가 FAM19A5 에피토프에 결합한다. 따라서 특정 항-FAM19A5 항체는 (i) 서열번호 6의 에피토프 및 추가 에피토프 또는 (ii) 서열번호 9의 에피토프 및 추가 에피토프에 결합한다. 다른 항-FAM19A5 항체들은 서열번호 5, 서열번호 9의 에피토프 및 추가 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체는 서열번호 6의 에피토프, 서열번호 10의 에피토프 및 추가 에피토프에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 FAM19A5 에피토프는 QLAAGTCEIVTLDR(서열번호 5, 에피토프 F1), TLDRDSSQPRRTIARQTARC(서열번호 6, 에피토프 F2), TARCACRKGQIAGTTRARPA(서열번호 7, 에피토프 F3), ARPACVDARIIKTKQWCDML(서열번호 8, 에피토프 F4), CDMLPCLEGEGCDLLINRSG(서열번호 9, 에피토프 F5) 또는 NRSGWTCTQPGGRIKTTTVS(서열번호 10, 에피토프 F6) 또는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열 내 위치한 단편 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열 내 위치한 단편은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 가진 단편을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 FAM19A5 에피토프는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 또는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 서열 내 위치한 단편, 예를 들어 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 가진 단편, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 항-FAM19A5 항체는 천연 입체형태(즉, 미변성)의 상기 하나 이상의 추가 에피토프 중 임의의 에피토프에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 글리코실화 및 글리코실화되지 않은 하나 이상의 FAM19A5 에피토프 모두에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 EP2, EP4 및/또는 EP8로서 동정된 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하되, EP2는 아미노산 DSSQP(서열번호 66)를 포함하거나 상기 아미노산들로 본질적으로 이루어지거나 또는 상기 아미노산들로 이루어지고, EP4는 아미노산 ARCACRK(서열번호 68)를 포함하거나 상기 아미노산들로 본질적으로 이루어지거나 또는 상기 아미노산들로 이루어지고, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(서열번호 72)을 포함하거나 상기 아미노산들로 본질적으로 이루어지거나 또는 상기 아미노산들로 이루어진다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 적어도 하나의 에피토프는 EP2, EP4 또는 EP8과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체만이 EP2에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체는 EP4 및 EP8에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 EP6, EP7 또는 EP8로서 동정된 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하되, EP6은 아미노산 KTKQWCDML(서열번호 70)을 포함하고, EP7은 아미노산 GCDLLINR(서열번호 71)을 포함하고, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(서열번호 72)을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 적어도 하나의 에피토프는 EP6, EP7 또는 EP8과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 EP6, EP7 또는 EP8에만 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 EP6, EP7 및 EP8에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAMT9A5 항체는 EP7 및 EP8에 결합한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 EP7에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 항-FAM19A5 항체는 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 FAM19A5 에피토프에 결합한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서는 예를 들어 면역 분석(예를 들어 ELISA), 표면 플라스마 공명 또는 역학적 배제 분석에 의해 측정했을 때 FAM19A 패밀리 내 다른 단백질들에 비해 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 더 높은 친화도로 FAM19A5(예를 들어 인간 FAM19A5)에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 본 명세서는 예를 들어 면역 분석에 의해 측정했을 때 FAM19A 패밀리 내 또 다른 단백질과의 교차 반응성 없이 FAM19A5(예를 들어 인간 FAM19A5)에 결합하는 항체를 제공한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 천연 항체가 아니거나 자연 발생 항체가 아니다. 예를 들어 상기 항-FAM19A5 항체는 예를 들어 더 많거나 더 적거나 또는 상이한 유형의 번역후 변형을 가짐으로써 자연 발생 항체와 다른 번역후 변형을 갖는다.
예시적인 항-FAM19A5 항체
본 명세서에 개시된 AAV 벡터에 의해 발현될 수 있는 특정 항체는 항-FAM19A5 항체 1-65, 3-2 및 2-13의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 가진 항체, 예를 들어 scFv, 뿐만 아니라 이들의 가변 영역 또는 CDR 서열에 적어도 80% 동일성(예를 들어 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 99% 이상의 동일성)을 가진 항체이다. 미국특허번호 9,579,398; 국제출원번호 PCT/IB2017/001490을 참조할 것. 표 2 및 3은 각각 예시적인 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 제공한다. 다음과 같은 항체에 대한 CDR은 Kabat 번호 표기 체계(위 참조)를 이용하여 동정하였다: 1-65, 3-2, 2-13, 1-28, P2-C12, 13B4, 13F7, 15A9, Pl-A03, P1-A08, P1-F02, P2-A01, P2-A03, P2-F07, P2-F11, SS01-13, SS0l-13-s5 및 S5-2.GKNG. 다음과 같은 항체에 대한 CDR은 IMGT 번호 표기 체계(위 참조)를 이용하여 동정하였다: 1-7A-IT, Low-PI, 1-30, 1-17, 1-32, 4-11, 6-10, 2-13D, 2-13D-37, 2-13D-37-1.5W-41 및 2-13D-37-3W-16. 본 개시 내용의 서로 다른 항-FAM19A5 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열들이 각각 표 4 및 5에 제공되어 있다.
표 2 가변 중쇄 CDR 아미노산 서열
표 3 가변 경쇄 CDR 아미노산 서열
표 4 가변 중쇄 아미노산 서열
표 5 가변 경쇄 아미노산 서열
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호: 35-38, 155-165 또는 232-240의 아미노산 서열을 포함한다(표 4 참조). 다른 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호: 35-38, 155-165 또는 232-240으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다(표 4 참조).
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 39-42, 166-176 또는 241-250의 아미노산 서열을 포함한다(표 5 참조). 다른 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 서열번호: 39-42, 166-176 또는 241-250으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다(표 5 참조).
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAMT9A5 항체는 서열번호: 35-38, 155-165 또는 232-240으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역의 CDR(표 4 참조) 및 서열번호 39-42, 166-176 또는 241-250으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다(표 5 참조).
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, (i) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하고; (iii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하고; (iv) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; (v) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하고; (vi) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하고; (vii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하고; (viii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 158의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하고; (ix) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함하고; (x) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하고; (xi) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하고; (xii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하고; (xiii) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하고; (xiv) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하고; (xv) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 상기 VH는 표 4에 나타낸 VH 서열을 포함하고 상기 VL은 표 5에 나타낸 VL 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 35-38, 155-165 또는 232-240에 나타낸 아미노산 서열(표 4 참조)과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 39-42, 166-176 또는 241-250에 나타낸 아미노산 서열(표 5 참조)과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 35-38, 155-165 또는 232-240에 나타낸 아미노산 서열(표 4 참조)과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 39-42, 166-176 또는 241-250에 나타낸 아미노산 서열(표 5 참조)과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 각각 서열번호 35 및 39를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(b) 각각 서열번호 36 및 40을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(c) 각각 서열번호 37 및 41을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(d) 각각 서열번호 38 및 42를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(e) 각각 서열번호 155 및 166을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(f) 각각 서열번호 156 및 167을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(g) 각각 서열번호 157 및 168을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(h) 각각 서열번호 158 및 169를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(i) 각각 서열번호 159 및 170을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(j) 각각 서열번호 160 및 171을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(k) 각각 서열번호 161 및 172를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(l) 각각 서열번호 162 및 173을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(m) 각각 서열번호 163 및 174를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(n) 각각 서열번호 164 및 175를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(o) 각각 서열번호 165 및 176을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(p) 각각 서열번호 232 및 241을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(q) 각각 서열번호 233 및 242를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(r) 각각 서열번호 234 및 242를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(s) 각각 서열번호 235 및 243을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(t) 각각 서열번호 236 및 244를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(u) 각각 서열번호 236 및 245를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(v) 각각 서열번호 236 및 246을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(w) 각각 서열번호 236 및 247을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(x) 각각 서열번호 236 및 248을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(y) 각각 서열번호 236 및 249를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(z) 각각 서열번호 237 및 250을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(aa) 각각 서열번호 238 및 250을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(bb) 각각 서열번호 239 및 250을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(cc) 각각 서열번호 240 및 250을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 (i) 1-65의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 1-65의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합; (ii) 3-2의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 3-2의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (iii) 2-13의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 2-13의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (iv) 1-28의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 1-28의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (v) P2-C12의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 P2-C12의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (vi) 13B4의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 13B4의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (vii) 13F7의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 13F7의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (viii) 15A9의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 15A9의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (ix) P1-A03의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 P1-A03의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (x) P1-A08의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 P1-A08의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xi) P1-F02의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 P1-F02의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xii) P2-A01의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 P2-A01의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xiii) P2-A03의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 P2-A03의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xiv) P2-F07의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 P2-F07의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xv) P2-F11의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 F2-F11의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xvi) SS01-13의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 SS01-13의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xvii) SS01-13-s5의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 SS01-l3-s5의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xviii) S5-2.GKNG의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 S5-2.GKNG의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xix) 1-7A-IT의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 1-7A-IT의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xx) Low-PI의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 Low-PI의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxi) 1-30의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 1-30의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxii) 1-17의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 1-17의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxiii) 1-32의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 1-32의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxiv) 4-11의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 4-11의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxv) 6-10의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 6-10의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxvi) 2-13D의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 2-13D의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxvii) 2-13D-37의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 2-13D-37의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 임의의 조합; (xxviii) 2-13D-37-1.5W-41의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 2-13D-37-1.5W-41의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3- 41 또는 이들의 임의의 조합; 또는 (xxiv) 2-13D-37-3W-16의 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합 및/또는 2-13D-3W-16의 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 개시된 서로 다른 항-FAM19A5 항체에 대한 VH CDR1, CDR2와 CDR3의 아미노산 서열은 표 2에 제공되어 있다. 본 명세서에 개시된 서로 다른 항-FAM19A5 항체에 대한 VL CDR1, CDR2와 CDR3의 아미노산 서열은 표 3에 제공되어 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는:
(a) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 상기 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 항-FAM19A5 항체(예를 들어 scFv)는 표 2 또는 표 3에 제공된 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 VH 도메인 및 VL 도메인은 가요성(flexible) 링커에 의해 연결되어 단일쇄 Fv 항체를 생산할 수 있다. 따라서 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체 또는 이의 항원-결합부분은 표 4로부터 선택된 VH 도메인 및 표 5로부터 선택된 VL 도메인을 포함하되, 상기 VH 도메인 및 VL 도메인은 가요성 링커에 의해 접합되어 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 SGGGGSSGGGGS(서열번호 207)를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 GQSSRSSGGGGSSGGGGS(서열번호 300)를 포함한다. 예시적인 항-FAM19A5 scFv의 아미노산 서열은 아래 표 6에 제공되어 있다(VH 도메인은 밑줄, VL 도메인은 굵게, 링커는 이탤릭체로 표시되어 있다).
표 6 가변 중쇄 아미노산 서열
본 명세서에 기재된 VH 도메인 또는 이의 하나 이상의 CDR은 또한 중쇄, 예를 들어 전장(full length) 중쇄를 형성하기 위한 불변 도메인에 연결될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 VL 도메인 또는 이의 하나 이상의 CDR은 경쇄, 예를 들어 전장 경쇄를 형성하기 위한 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장 중쇄 및 전장 경쇄는 조합하여 전장 항체를 생성한다.
따라서 특정 구현예에 있어서, 항체 경쇄 및 중쇄, 예를 들어 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 별개의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 상기 경쇄와 관련하여, 특정 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체의 경쇄는 카파(kappa) 경쇄이다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체의 경쇄는 람다(lambda) 경쇄이다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체의 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄이다. 특정 구현예에 있어서, FAM19A5 폴리펩티드(예를 들어 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 항체는 본 명세서에 기재된 임의의 VL 또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하되, 상기 경쇄의 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, FAM19A5 폴리펩티드(예를 들어 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 항체는 본 명세서에 기재된 VL 또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하되, 상기 경쇄의 불변 영역은 인간 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어 미국특허번호 5,693,780 및 위의 Kabat EA et al, (1991)를 참조할 것.
상기 중쇄와 관련하여 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄는 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄일 수 있다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 기재된 항체의 중쇄는 인간 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, FAM19A5(예를 들어 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 항체는 본 명세서에 기재된 VH 또는 VH CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하되, 상기 중쇄의 불변 영역은 중쇄는 인간 감마(γ) 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, FAM19A5(예를 들어 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 기재된 항체는 본 명세서에 기재된 VH 또는 VH CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하되, 상기 중쇄의 불변 영역은 본 명세서에 기재되어 있거나 당업계에 공지되어 있는 인간 중쇄의 아미노산을 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어 미국특허번호 5,693,780 및 위의 Kabat EA et al., (1991)를 참조할 것.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 항체는 본 명세서에 기재된 VH 또는 VH CDR 및 VL과 VL CDR을 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하되, 상기 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역 글로불린 분자 또는 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역 글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, FAM19A5(예를 들어 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 기재된 항체는 본 명세서에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하되, 상기 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역 글로불린 분자 및 임의의 아형의 면역 글로불린 분자(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2)의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 불변 영역은 아형(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 및 동종이인자형(예를 들어 Glm, G2m, G3m 및 nG4m) 및 이들의 변종을 포함하는 천연 인간 IgG의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어 Vidarsson G. et al. Front Immunol. 5: 520(2014년10월20일 온라인 공개) 및 Jefferis R. and Lefranc MP, mAbs 1: 4, 1-7(2009)를 참조할 것. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이들의 변종의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 항-FAM19A5 항체는 Fc 효과기 기능, 예를 들어 보체-의존성 세포 독성(CDC) 및/또는 항체-의존성 세포성 식균 작용(ADCP)을 갖지 않는다. 효과기 기능은 Fc 영역에 의해 매개되며, 상기 Fc 영역의 CH2 도메인에서 힌지 영역에 가장 근접한 잔기는 선천성 면역계의 효과기 세포 상에서 Clq(보체) 및 IgG-Fc 수용체(FcγR)에 대해 크게 중첩되는 결합 부위를 포함하기 때문에 항체의 효과기 기능을 담당한다. 또한 IgG2 및 IgG4 항체는 IgG1 및 IgG3 항체보다 낮은 수준의 Fc 효과기 기능을 갖고 있다. 항체의 효과기 기능은 (1) Fc 영역이 결여된 항체 단편(예를 들어 Fab, F(ab')2, 단일쇄 Fv(scFv) 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 sdAb와 같은)을 사용하고; (2) 예를 들어 당이 부착되어 있는 잔기를 결실 또는 변경함으로써, 당을 효소적으로 제거함으로써, 글리코실화 저해제의 존재하에 배양된 세포에서 항체를 생성함으로써, 또는 단백질을 글리코실화할 수 없는 세포(예를 들어 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 미국특허공개 20120100140 참조)에서 항체를 발현함으로써 무당화 항체를 생성하고; (3) 효과기 기능이 감소된 IgG 아형의 Fc 영역을 사용하고(예를 들어 IgG2 및 IgG4 항체의 영역 또는 IgG2 및 IgG4 항체의 CH2 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역, 예를 들어 미국특허공개 20120100140 및 Lau C. et al. J. Immunol. 191:4769-4777 (2013) 참조); 및 (4) Fc 기능을 감소시키거나 없게 하는 돌연변이를 가진 Fc 영역을 생성시키는 것을 포함한 당업계에 공지된 서로 다른 접근법에 의해 감소 또는 회피될 수 있다. 예를 들어 미국특허공개 20120100140 및 그 안에 인용된 미국 및 PCT 출원 및 An et al, mAbs 1:6, 572-579(2009)를 참조할 것.
이에 따라 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 항-FAM19A5 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv(scFv) 또는 단량체 VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 sdAb이다. 이러한 항체 단편은 당업계에 잘 알려져 있고 위에 기재되어 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 항-FAM19A5 항체는 Fc 효과기 기능이 감소되거나 없는 Fc 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 불변 영역은 인간 IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 IgG2/IgG4 이소형을 갖는다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 IgG4 이소형의 IgG 항체의 CH2 도메인 및 IgG1 이소형의 IgG 항체의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 IgG2의 힌지 영역과 IgG4의 CH2 영역을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 Fc 효과기 기능이 감소되거나 없는 돌연변이를 가진 Fc 영역을 포함한다. Fc 효과기 기능이 감소되거나 없는 Fc 영역은 당업계에 공지된 것들을 포함한다. 예를 들어 Lau C. et al, J. Immunol. 191: 4769-4777(2013); An et al, mAbs 1:6, 572-579(2009); 및 미국특허공개번호 20120100140 및 그 안에 인용된 미국특허 및 공개공보 및 PCT 공개공보를 참조할 것. 또한 Fc 효과기 기능이 감소되거나 없는 Fc 영역은 당업자라면 용이하게 만들 수 있다.
핵산 분자
본 명세서에 기재된 또 다른 측면은 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합부분 중 어느 하나를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 본 개시 내용의 AAV 벡터에서 발현될 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염 물질, 예를 들어 다른 세포 핵산(예를 들어 다른 염색체 DNA, 예를 들어 자연에서 분리된 DNA에 연결된 염색체 DNA) 또는 단백질로부터 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 칼럼 크로마토그래피, 제한 효소, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 그 외의 기술을 포함한 표준 기술에 의해 정제될 때 "분리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다". F. Ausubel, el al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York을 참조할 것. 본 명세서에 기재된 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론 서열을 함유하거나 함유할 수 없다. 특정 구현예에 있어서, 상기 핵산은 cDNA 분자이다.
본 명세서에 기재된 특정 핵산 분자는 본 개시 내용의 항-FAM19A5 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 것들이다. 이러한 항체의 VH 서열을 코딩하는 예시적인 DNA 서열들은 서열번호 43-46, 177 및 265-278에 나타나 있다(표 7). 이러한 항체의 VL 서열을 코딩하는 예시적인 DNA 서열들은 서열번호 47-50, 178 및 279-292에 나타나 있다(표 8). 1-65, 3-2 및 2-13 scFv 항체를 코딩하는 예시적인 DNA 서열들은 표 9에 제공되어 있다.
표 7 가변 중쇄 폴리뉴클레오티드 서열
표 8 가변 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열
표 9 가변 scFv 폴리뉴클레오티드 서열
본 명세서에 개시된 항-FAM19A5 scFv 항체를 생성하기 위해서 상기 VH- 및 VL-코딩 DNA 단편은 가요성 링커, 예를 들어 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결되어 상기 VH 및 VL 서열은 VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 접합된 인접 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들어 Bird et al, (1988) Science 242: 423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554 참조). 다음, 이러한 핵산 서열은 본 명세서에 개시된 AAV 벡터에 삽입될 수 있으며, 이는 이후 예를 들어 실시예에서 입증된 바와 같이 scFv 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
이와 달리, 상기 항-FAM19A5 항체(신호 펩티드가 있거나 또는 없는)의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 각각 서열번호 43 및 47, 서열번호 44 및 48, 서열번호 45 및 49, 서열번호 46 및 50, 서열번호 177 및 178은 본 개시 내용의 하나 이상의 AAV 벡터에 삽입될 수 있다. 다음, 이러한 AAV 벡터를 사용하여 전장 항체를 생산할 수 있다. 본 개시 내용의 AAV 벡터를 사용하여 형질 도입된 숙주 세포가 본 명세서에 포함된다.
예를 들어 패키징 세포, 보조 바이러스 또는 플라스미드 및/또는 베큘로바이러스 시스템을 사용하는 방법을 포함하여 본 명세서에 개시된 AAV 벡터를 생산하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 Samulski el al., J. Virology 63, 3822 (1989); Xiao el al., J. Virology 72, 2224(1998); Inoue et al., J Virol. 72, 7024 (1998); WO 1998/022607; 및 WO2005/072364 참조).
또한 위형(pseudotyped) AAV 벡터를 생산하는 방법(예를 들어 WO00/28004) 뿐만 아니라 생체내 투여시 AAV 벡터의 면역원성을 감소시키기 위해 AAV 벡터의 다양한 변형 또는 제형화가 알려져 있다(예를 들어 WO01/23001; WO00/73316; WO04/112727; WO05/005610; 및 WO99/06562 참조). 몇몇 구현예에 있어서, AAV 벡터는 함께 혼합되거나 다른 유형의 바이러스와 혼합되어 키메라(예를 들어 위형) AAV 바이러스를 생산할 수 있는 다양한 혈청형의 AAV로부터 제조 또는 유래될 수 있다.
III. 약제학적 조성물
본 명세서는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA)에서 원하는 정도의 순도를 가진 본 개시 내용의 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 그 외 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸과 같은); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물들; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염형성 대이온; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
몇몇 구현예에 있어서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 본 명세서에 기재된 AAV 벡터 및 경우에 따라 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 유효량 및 경우에 따라 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 항체는 상기 약제학적 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 FAM19A5 활성을 감소시키고 중추 신경계 손상, 질환 또는 장애, 예를 들어 신경병성 통증과 같은 증상을 치료하는데 유용할 수 있다.
비경구 제제에서 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 항산화제, 국소 마취제, 현탁 및 분산제, 유화제, 금속이온 봉쇄제 또는 킬레이트화제 및 그 외 다른 약제학적으로 허용되는 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예들은 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장 덱스트로오스 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로오스 및 락테이트 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유 및 땅콩유를 포함한다. 정균 또는 정진균 농도의 항미생물제가 페놀 또는 크레졸, 수은함유물질, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 다용량 용기에 패키지된 비경구 제제에 첨가될 수 있다. 등장화제는 염화나트륨 및 덱스트로오스를 포함한다. 완충제는 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 황산수소나트륨을 포함한다. 국소 마취제는 프로카인 염산염을 포함한다. 현탁 및 분산제는 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 Polysorbate 80(TWEEN® 80)을 포함한다. 금속이온의 봉쇄제 또는 킬레이트화제는 EDTA를 포함한다. 약제학적 담체는 또한 수혼화성 비히클용 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 대상에 대한 임의의 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 투여 경로의 구체적인 예들은 비내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 피하 또는 심실내 경로를 포함한다. 본 명세서에서는 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하는 비경구 투여 또한 고려된다. 주사제는 종래의 형태로, 액체 용액이나 현탁액, 주사 전에 액체 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조되거나 또는 유화액으로서 제조될 수 있다. 주사제, 용액 및 유화액은 또한 하나 이상의 부형제를 함유한다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 또한 필요한 경우, 투여할 약제학적 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 증진제와 같은 비독성 보조 물질 및 예를 들어 아세트산 나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 사이클로덱스트린과 같은 제제를 함유할 수 있다.
항체의 비경구 투여용 제제는 주사용 즉석 멸균액, 피하주사용 정제를 포함하여 사용 직전에 용매와 바로 즉석 조합할 수 있는 동결건조 분말과 같은 멸균 건조 가용성 제품, 주사용 즉석 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 즉석 조합할 수 있는 멸균 건조 불용성 제품 및 멸균 유화액을 포함한다. 상기 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
정맥내 투여의 경우에 적합한 담체는 생리식염수 또는 인산 완충 식염수(PBS) 및 글루코오스, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물과 같은 증점제와 가용화제를 함유한 용액을 포함한다.
항체를 포함하는 국소용 혼합물은 국소 및 전신 투여에 대해 기재된 대로 제조된다. 그 결과 얻은 혼합물은 용액, 현탁액, 유화액 등일 수 있으며, 크림, 겔, 연고, 유화액, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크, 페이스트, 폼, 에어로졸, 관주액(irrigation), 스프레이, 좌약, 붕대, 피부 패치 또는 국소 투여에 적합한 임의의 다른 제형으로서 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 AAV 벡터는 예를 들어 흡입에 의한 국소용 에어로졸로서 제형화될 수 있다(예를 들어 염증성 질환, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드 전달용 에어로졸을 기재하고 있는 미국특허번호 4,044,126, 4,414,209 및 4,364,923 참조). 기도 투여용 이들 제형은 분무기용 에어로졸 또는 용액 형태이거나 흡입제용 미세 분말로서 단독 또는 락토오스와 같은 비활성 담체와 조합할 수 있다. 이러한 경우, 제형의 입자는 몇몇 구현예에서 50 마이크론 미만의 직경, 몇몇 구현예에서는 10 마이크론 미만의 직경을 갖는다.
본 명세서에 기재된 AAV 벡터는 눈 안에 있는 것과 같은 피부와 점막에 국소 도포와 같이 국소용 또는 국부용으로 겔, 크림 및 로션 형태로 및 눈에 적용 또는 수조내(intracisternal) 또는 척수내 적용을 위해 제제화될 수 있다. 국소 투여는 경피 전달용으로 그리고 눈이나 점막 투여용 또는 흡입 요법용으로도 고려된다. 상기 항체의 점비액(nasal solution)은 단독으로 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 투여될 수 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 용액, 유화액 및 그외 다른 혼합물로서 투여용으로 재구성할 수 있는 동결건조 분말이다. 상기 동결건조 분말은 또한 고체 또는 겔로서 재구성 및 제형화될 수 있다. 상기 동결건조 분말은 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 유도체를 적합한 용매에 용해시켜 제조된다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 동결건조 분말은 멸균성이다. 상기 용매는 상기 분말 또는 상기 분말로부터 제조된 재구성 용액의 안정성 또는 그 외 다른 약리학적 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 사용 가능한 부형제는 덱스트로오스, 소르비톨, 프룩토오스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코오스, 수크로오스 또는 그 외 다른 적합한 제제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용매는 또한 시트레이트, 인산 나트륨 또는 인산 칼륨과 같은 완충제 또는 몇몇 구현예에 있어서 약 중성 pH의 다른 이러한 완충제를 함유할 수 있다. 이어서 상기 용액을 멸균 여과한 후 당업자에게 공지된 표준 조건에서 동결건조하여 원하는 제형을 제공한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 얻어진 용액은 동결건조용 바이알에 배분될 수 있다. 각각의 바이알은 상기 화합물의 단일 투여량 또는 다수의 투여량을 함유할 수 있다. 상기 동결건조된 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건에서 보관될 수 있다.
이러한 동결건조된 분말을 주사용수에 의해 재구성하여 비경구 투여용으로 사용하기 위한 제형을 제공한다. 재구성을 위해서 상기 동결건조된 분말을 멸균수 또는 다른 적합한 담체에 첨가한다. 그 정확한 양은 선택한 화합물에 따라 다르다. 이러한 양은 경험적으로 결정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 VVA 항체와 본 명세서에 제공된 다른 조성물들은 또한 치료할 대상의 특정 조직, 수용체 또는 다른 신체 영역을 표적으로 하도록 제형화될 수 있다. 이러한 표적화 방법이 다수 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 이러한 표적화 방법은 모두 본 조성물에 사용하는 것이 고려된다. 표적화 방법의 비제한적 예에 대해서는 예를 들어 미국특허번호 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 제6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 및 5,709,874를 참조할 것. 특정 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 AAV 벡터는 질환 또는 장애, 예를 들어 중추 신경계 손상, 퇴행성 뇌 질환 또는 신경병성 통증을 치료하기 위해 표적화된다.
생체내 투여에 사용되는 조성물은 멸균성일 수 있다. 이는 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 이루어진다.
IV. 키트
본 명세서는 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 AAV 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서는 본 명세서에 제공된 하나 이상의 AAV 벡터와 같은 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 성분들 중 하나 이상이 채워진 하나 이상의 용기 및 경우에 따라 사용 설명서를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 키트는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 및 본 명세서에 기재된 것들과 같은 임의의 예방제 또는 치료제를 함유한다.
V. 치료 용도 및 방법
특정 측면에 있어서, 본 명세서는 대상에서 CNS에 대한 상해 또는 손상을 경감시키기 위한 방법으로서 상기 대상에 본 개시 내용의 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다.
다른 측면에서, 본 명세서는 대상에서 신경교증의 시작 또는 개시 및 이와 연관된 CNS의 해로운 영향을 저해, 지연, 억제, 제한, 감소, 반전 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서는 대상에서 반응성 성상 세포의 과도하거나 비정상적인 증식 및 이와 연관된 CNS의 해로운 영향을 저해, 지연, 억제, 제한, 감소, 반전 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 개시 내용의 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서는 대상에서 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(뉴로칸, NG2 또는 2개 모두의 수준 포함)의 발현을 감소, 저해 또는 줄이거나 또는 뉴로칸, NG2 또는 2개 모두의 활성을 감소시키거나 불활성화하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 기재된 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서는 대상에서 바람직하게는 상해 또는 손상 후에 신경세포의 성장을 자극, 촉진, 증가 또는 활성화하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 기재된 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 다른 구현예에 있어서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 c-fos mRNA, c-fos 단백질 또는 c-fos 단백질 활성의 수준을 증가시키고, 바람직하게는 신경세포의 핵 내 ERK mRNA, ERK 단백질 또는 pERK 활성의 수준을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 개시 내용의 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 특정 구현예에 있어서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 GAP43 mRNA, GAP43 단백질의 수준을 증대 또는 증가시키거나 바람직하게는 신경세포에서 GAP43 단백질의 활성을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 개시 내용의 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 특정 구현예에 있어서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 신경세포의 생존을 증진 또는 촉진하고/또는 축삭의 재성장을 촉진시키기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 대상은 인간, 바람직하게는 예를 들어 CNS 손상, 외상, 상해, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역 반응 및/또는 신경퇴행성 질환으로부터 신경세포가 상해 또는 손상된 인간이다.
몇몇 측면에 있어서, 본 명세서는 또한 필요로 하는 대상에서 중추 신경계 손상, 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애, 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애 또는 신경병성 통증을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 개시 내용의 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 중추 신경계 손상은 외상성 뇌 상해, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 뇌종양 또는 이들의 조합이다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 퇴행성 뇌 장애는 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(ALS) 또는 이들의 조합이다. 이에 따라, 특정 구현예에 있어서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 외상성 뇌 손상, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 뇌종양 또는 이들의 조합을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 AAV 벡터 또는 이의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 개시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, ALS를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 AAV 벡터 또는 이의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 개시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 대상은 인간이다.
특정 구현예에 있어서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 섬유증을 치료, 감소, 반전, 예방, 완화, 개선 또는 저해하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 AAV 벡터 또는 이의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제시한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 섬유증은 양성(즉, 증상을 유발하지 않는)이다. 다른 구현예에 있어서, 상기 섬유증은 가역적이거나 가역적일 수 없는 병리학적 상태와 관련이 있다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 골수 섬유증, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 동맥 섬유증, 관절 섬유증, 유방 섬유증, 근육 섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프절 섬유증, 방광 섬유증 및 흉막 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에 있어서, 상기 섬유증은 간 섬유증 또는 폐 섬유증이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 섬유증은 간암, 폐암, 신장암, 유방암 및/또는 췌장암과 같은 암으로부터 유래된 종양과 관련이 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 섬유증, 상기 섬유증 관련 증상, 상기 섬유증의 근본 원인 또는 이들의 조합을 감소, 반전, 완화, 개선, 저해 또는 지연 또는 예방한다.
다른 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 AAV 벡터는 필요로 하는 대상에서 섬유증 관련 질환 또는 장애를 치료, 감소, 반전, 예방, 개선, 제어 또는 저해할 수 있다. 용어 "질환 또는 장애 관련 섬유증"은 질환 또는 장애를 동반하거나 질환 또는 장애에 의해 야기 또는 이에 기인한 섬유증을 지칭한다. 상기 용어는 위에서 개시된 질환 또는 장애에 기인하거나 이에 의해 야기되는 섬유증 또는 질환 또는 장애를 동반하는 섬유증을 포함한다.
다른 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV 벡터는 필요로 하는 대상에서 간암, 폐암, 신장암, 유방암 및/또는 췌장암을 치료, 감소, 반전, 예방, 지연, 개선, 제어 또는 저해할 수 있고, 상기 방법은 상기 대상에 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 간암, 폐암, 신장암, 유방암 및/또는 췌장암은 섬유증과 관련되거나 또는 이에 의해 야기된다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV 벡터 또는 이의 조성물의 치료 유효량을 투여한다. 대상(예를 들어 인간) 치료시 본 명세서에 개시된 AAV 벡터의 치료 유효량은 연령, 성별, 질환의 중증도와 같은 인자에 따라 달라진다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 개시 내용의 AAV 벡터 또는 이의 조성물은 정맥내, 경구, 비경구, 경척수강, 척수강내, 뇌실내, 근육내, 폐, 복강내, 유리체내, 피하, 경막외, 망막하 또는 심실내 투여된다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 개시된 AAV 벡터 또는 이의 조성물은 섬유증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가 제제(예를 들어 특발성 폐 섬유증의 경우에 피르페니돈(ESBRIET®) 또는 닌테다닙(OFEV®))와 조합하여 투여될 수 있다. 상기 하나 이상의 추가 치료 약물의 투여량 및 투여는 예를 들어 각각의 약물의 제품 라벨에 지시되어 있는 바와 같이 당업계에 알려져 있다.
몇몇 구현예에 있어서, 본 명세서에 기재된 AAV 벡터 또는 이의 조성물은 중추 신경계 손상(예를 들어 외상성 뇌 손상, 뇌척수 손상, 뇌졸중 또는 뇌종양), 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애(예를 들어 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, ALS), 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애 또는 신경병성 통증)을 치료하기 위한 하나 이상의 추가 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어 헌팅턴병을 치료하기 위한 비제한적인 예시적인 제제는 테트라베나진(XENAZINE®), 예를 들어 할로페리돌(HALDOL®), 클로르프로마진, 리스페리돈(RISPERDAL®) 및 쿠에티아핀(SEROQLIEL®)과 같은 항정신병 약물을 포함한다.
파킨슨병 치료용 제제의 비제한적인 예는 레보도파(카르비도파가 있거나 없는), 프라미펙솔(MIRAPEX®)과 같은 도파민 작용제, 로피니롤(REQETIP®) 및 로티고틴(NEEIPRO®) 및 아포모르핀(APOKYN®), 셀레길린(ELDEPRYL® 및 ZELAPAR®), 라사길린(AZILECT®), 엔타카폰(COMTAN®), 벤즈트로핀(COGENTIN®), 트리헥시페니딜 및 아만타딘을 포함한다.
알츠하이머병 치료용 제제의 비제한적인 예는 도네페질(ARICEPT®), 갈란타민(RAZADYNE®) 및 리바스티그민(EXELON®)을 포함한다.
다발성 경화증 치료용 제제의 비제한적인 예는 글라티라머 아세테이트(COPAXONE®), 디메틸 푸마레이트(TECFIDERA®), 핀골리모드(GILENYA®), 테리플루노미드(AEIBAGIO®), 나탈리주맙(TYSABRI®), 알렘투주맙(LEMTRADA®) 및 미톡산트론을 포함한다.
ALS 치료용 제제의 비제한적인 예는 릴루졸(RILETTEK®)을 포함한다.
상기 하나 이상의 추가 치료 약물의 투여량 및 투여는 예를 들어 각각의 약물의 제품 라벨에 지시되어 있는 바와 같이 당업계에 알려져 있다.
후술하는 실시예는 한정되지 않는 예시로서 제공된다.
실시예 1: 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 제작
항-FAM19A5 항체 클론 1-65, 2-13 또는 3-2의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 코딩하는 AAV 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 간단히, 3-2 scFv를 코딩하는 AAV 벡터를 제작하기 위해서 pscAAV-MCS 발현 벡터(Cell biolabs, cat. #VPK-430)를 EcoRI 및 NotI를 사용하여 잘라냈다. 다음, 도 1에 나타낸 바와 같이 CMV 프로모터 아래 인간 베타 글로빈 인트론과 3-2 scFv를 코딩하는 이식 유전자를 pscAAV-MCS 벡터에 삽입하였다. 유전자 발현의 극대화를 위하여 인간 베타 글로빈 인트론을 삽입하였다. 1-65 또는 2-13 scFv를 코딩하는 AAV 벡터를 생성하기 위해서 위의 AAV 벡터를 EcoRV 및 Notl를 사용하여 3-2 scFv 이식 유전자를 제거하였다. 그 다음, 1-65 또는 2-13 ScFv를 코딩하는 이식 유전자를 AAV 벡터에 삽입하였다. 3-2, 1-65 또는 2-13 ScFv를 코딩하는 이식 유전자들을 마우스에서 최적 발현을 위해 코돈-최적화하였다. 모든 AAV 벡터는 이식 유전자 앞에 마우스 IgG 카파 사슬 신호 펩티드를 포함하여 세포로부터 분비를 촉진시켰다. 상기 AAV 벡터는 또한 scFv 이식 유전자의 뒤에 FLAG-태그를 포함하여 유전자 발현 검출을 도왔다. 일단 제작되었다면, 상기 AAV 벡터를 대장균에 형질 전환하고, 배양하고, maxiprep을 사용하여 다량의 AAV 벡터를 얻었다. Signagen Laboratories(록빌, 메릴랜드)가 1-30 scFv 또는 마우스 IL-10 또는 GFP를 코딩하는 AAV 벡터를 생성하여 제공하였다.
다음과 같은 재조합 AAV를 후술하는 실시예에서 사용하였다: (i) scAAV8-CMV-3-2-ScFv(Sirion, 독일), (ii) scAAV9-CMV-3-2-ScFv(Signagen Laboratories, 미국), (iii) scAAV9-CMV-1-65-ScFv(Signagen Laboratories, 미국), scAAV9-CMV-2-13-ScFv(Signagen Laboratories, 미국); (iv) scAAV1-CMV-3-2-ScFv(Signagen Laboratories, 미국); (v) scAAV9-CMV-1-30-ScFv(Signagen Laboratories, 미국); (vi) scAAV9-CMV-mIL-10(Signagen Laboratories, 미국); (vii) scAAV9-CMV-GFP(Signagen Laboratories, 미국); (viii) scAAV1-CMV-GFP(Signagen Laboratories, 미국).
실시예 2: 항-FAM19A5 ScFv 유전자 발현 분석
위에서 제작한 AAV 벡터(scAAV8-CMV-3-2-ScFv, scAAV9-CMV-3-2-ScFv, scAAV9-CMV-1-65-ScFv 및 scAAV9-CMV-2-13-ScFv)를 사용하여 항-FAM19A5 ScFv의 발현을 시험하였다. 간단히, HEK293 세포(1.2 × 106) 세포를 60 mm2 디쉬에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 배지를 opti-MEM 배지(저혈청)로 교체해 주고 HEK293 세포를 서로 다른 AAV 벡터(다중 감염 다중도(MOI) 사용)를 사용하여 형질 도입하였다. 형질 도입 후 1, 4 및 8일째에 상청액을 회수하였다. 유전자 발현을 확인하기 위해서 ABSbio™ DYKDDDK 태그 ELISA 키트(Advanced Bioreagent, cat. # SE002-flag)를 사용하여 scFv 유전자 뒤에 포함된 FLAG 태그를 검출하였다(도 1 및 실시예 1 참조). 수거한 상청액을 1 내지 10배 희석한 다음, 희석된 상청액 100 μL을 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 350 rpm으로 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 플레이트를 세척하고 검출 항체 100 μL을 각각의 웰에 첨가하고 350 rpm으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음, 상기 플레이트를 다시 세척하고, 각 웰에 100 μL의 TMB 용액을 첨가하고 10-30분 동안 방치하였다. 다음, 웰에 100 μL의 정지 용액을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량선을 통해 FLAG의 양을 측정하였고 표준물질의 분자량 대비 FLAG 발현비를 곱하여 scFv의 양을 계산하였다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, scAAV8-CMV-3-2-scFv 벡터의 경우에 항-FAM19A5 scFv는 형질 도입 후 빠르면 1일째부터 상청액에서 검출할 수 있었다(1 × 105 MOI). 형질 도입 후 8일까지 대략 100 ng/mL의 3-2 scFv가 상청액에서 검출되었다(1 × 105 MOI에서). scAAV9-CMV-3-2-scFv 벡터에 의해 형질 도입 후 8일까지 대략 70 ng/mL의 3-2 scFv가 상청액에서 검출되었다(2 × 105 MOI). scAAV9-CMV-1-65-ScFv 및 scAAV9-CMV-2-13-ScFv에 의해서도 유사한 결과가 관찰되었다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, 형질 도입 후 4일째에 상청액에서 각각 대략 120 ng/mL 및 115 ng/mL의 1-65 scFv 및 2-13 scFv가 검출되었다.
상기 데이터는 실시예 1에서 모든 AAV 벡터가 적절하게 제작되었으며 이들은 세포에 형질 도입시 항-FAM19A5 scFv 발현을 유도할 수 있음을 입증하고 있다.
실시예 3: U87MG 세포에서 FAM19A5 결합 억제
상기 AAV 구조체에 의해 생산된 항-FAM19A5 scFv의 결합능을 평가하기 위해서 U87MG 세포(인간 원발성 교모세포종 세포주로서 인간 FAM19A5-Fc 단백질에 결합 가능함)를 사용하여 결합 저해 분석을 수행하였다. 간단히, U87MG 세포를 scAAV8-CMV-2-3-ScFv(MOI 1×105), scAAV9-CMV-1-65-ScFv(MOI 2×105) 또는 scAAV9-CMV-2-13-ScFv(MOI 2×105)를 사용하여 형질 도입하였다. 다음, 형질 도입 후 4일째에 인간 FAM19A5-Fc 단백질 0.1 μg를 상청액 200 μL과 혼합하고 이 혼합물을 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 음성 대조군은 PBS 또는 scAAV9-CMV-GFP 벡터를 이용하여 형질 도입한 HEK293 세포의 상청액을 사용하였다. 30분 배양 후, 상기 혼합물(인간 FAM19A5-Fc + 항-FAM19A5 scFv AAV 구조체를 사용하여 형질 도입한 세포의 상청액) 100 μL를 U87MG 세포(2×105)에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음, 상기 세포를 PBS로 세척하고, 100 μL의 염소 항-인간 IgG 488 항체(Invitrogen, cat. # A11013)(1:50 희석)로 처리하고, 4℃에서 추가 30분 동안 배양시켰다. 다음, 상기 세포를 다시 세척하고 U87MG 세포에 대한 인간 FAM19A5-Fc의 결합을 유세포 계수법을 이용하여 분석하였다.
도 3A, 3B 및 3C에 나타낸 바와 같이, 상기 U87MG 세포를 혼합물(인간 FAM19A5-Fc + 항-FAM19A5 scFv AAV 구조체를 사용하여 형질 주입된 세포의 상청액)로 처리했을 때 상기 세포에 대한 인간 FAM19A5-Fc의 결합이 상기 세포를 대조군 혼합물(인간 FAM19A5-Fc + scAAV9-CMV-GFP 구조체를 사용하여 형질 주입된 세포의 상청액)로 처리할 때에 비해 감소하였다. 이는 시험한 모든 항-FAM19A5 scFv AAV 구조체에 대해 해당되었다. scAAV9-CMV-1-65-ScFv, scAAV9-CMV-2-13-ScFv, scAAV8-CMV-3-2-ScFv를 사용하여 형질 도입된 세포의 상청액은 해당 대조군(AAV-GFP 벡터를 사용하여 형질 주입되거나 또는 PBS 처리한 세포의 상청액)에 비해 U87MG 세포에 대한 인간 FAM19A5-Fc의 결합의 평균 형광 세기(MFI)를 각각 19%(도 3A), 68%(도 3B) 및 42%(도 3C) 감소시켰다.
이들 결과는 실시예 1에 기재되어 있는 AAV 구조체에 의해 생산된 항-FAM19A5 scFv가 높은 친화도로 인간 FAM19A5에 효과적으로 결합할 수 있음을 입증한다.
실시예 4: C8-D1A 세포에서 FAM19A5 결합의 저해
실시예 3에서 관찰된 결합 저해를 확인하기 위해서 C8-D1A 세포를 결합 저해 분석에 사용하였다. C8-D1A 세포는 성상 세포주이며 배양시 FAM19A5를 주변 배지로 분비할 수 있다. 상기 AAV 구조체에 의해 생산된 항-FAM19A5 scFv가 인간 FAM19A5에 효과적으로 결합할 수 있는 경우에는 상기 항-FAM19A5 scFv AAV를 사용하여 형질 도입된 세포의 상청액으로 C8-D1A 세포 배양 배지를 처리하면 배양 배지 내 FAM19A5 단백질 농도 감소가 나타나야 한다.
간단히, C8-D1A 세포를 6-웰 플레이트(2×105 세포/웰)에 도말하고 대략 24 시간 동안 배양하였다. 항-FAM19A5 scFv 함유 상청액은 HEK293 세포를 (i) scAAV8-CMV-3-2-ScFv(MOI 1×105); (ii) scAAV9-CMV-1-65-ScFv(MOI = 2×105); 또는 (iii) scAAV9-CMV-2-13-ScFv(MOI = 2×105) 중 하나를 사용하여 형질 주입시켜 생산한 다음, 형질 도입 후 8일째에 상청액을 수거하였다. 상기 C8-D1A 세포를 활성화하기 위해서 TGF-β(20 ng/mL)를 항-FAM19A5 scFv를 함유하는 상청액과 함께 세포에 첨가하였다. PBS 또는 scAAV-9-CMV-GFP를 사용하여 형질 도입된 세포의 상청액을 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 24시간 동안 배양하도록 한 다음, ELISA 분석을 이용하여 배양물 중 FAM19A5 단백질 농도를 측정하였다(ELISA 분석에 사용된 방법에 대해서 실시예 1을 참조할 것).
도 4A에 나타낸 바와 같이. C8-D1A 세포를 scAAV8-CMV-3-2-ScFv를 사용하여 형질 도입된 세포의 상청액이 존재하는 상태에서 활성화하였을 때 해당 대조군(PBS)에 비해 배양 배지에서 검출된 FAM19A5 단백질의 농도가 약 38% 감소하였다. scAAV9-CMV-2-13-ScFv와 scAAV9-CMV-1-65-ScFv를 사용하여 형질 도입된 세포의 상청액은 해당 대조군(GFP AAV 벡터를 사용하여 형질 주입된 세포의 상청액)에 비해 배양 배지 내 FAM19A5 단백질의 농도가 각각 약 63% 및 14% 감소하였다. 도 4B를 참조할 것.
위의 데이터는 상기 AAV 벡터에 의해 생산된 항-FAM19A5 scFv가 인간 FAM19A5에 효과적으로 결합할 수 있음을 추가로 입증한다.
실시예 5: 생체내 발현 분석
생체내 항-FAM19A5 scFv 발현을 확인하기 위해서 scAAV8-CMV-3-2-ScFv 구조체를 C57BL/6 마우스에 척수강내 투여하였다(1×1011 바이러스 게놈 (vg)/마우스). 다음, 상기 마우스를 투여 후 1주 및 2주에 희생시키고 척수 조직(요추 척수)을 분석하였다. 유전자 발현을 검출하기 위해서 항-FLAG 항체와 형광 현미경을 사용하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 미투여(naive) 동물(즉, AAV 벡터의 미투여)에게서는 투여 후 1주(상단 좌측 사진) 및 2주(하단 좌측 사진) 모두 양성 항체 발현이 없었다. 이에 반해, scAAV8-CMV-3-2-ScFv 처리 동물에서는 투여 후 1주째에 배쪽 뿔(ventral horn) 신경세포에서 항-FLAG(즉, 항-FAM19A5 scFv) 발현이 관찰되었다(상단 우측 사진). 2주까지는 등쪽 뿔(dorsal horn) 영역을 포함하여 훨씬 더 높은 발현이 있었다.
이 데이터는 앞선 시험관내 발현 데이터(실시예 2 참조)를 확인해 주는 것으로, 항-FAM19A5 AAV 벡터의 척수강내 투여시 주변 세포를 형질 도입하여 항-FAM19A5 scFv를 생산할 수 있음을 의미하였다.
실시예 6: scAAV8-CMV-3-2-ScFv를 사용한 만성 신경병성 통증 모델(CCI)에서 통증 완화 평가
상기 항-FAM19A5 scFv AAV 구조체 투여의 생체내 효과를 평가하기 위해서 만성 수축성 손상(CCI)의 마우스 모델을 사용하였다. 간단히, PBS(대조군) 또는 scAAV8-CMV-3-2-ScFv를 C57BL/6 마우스에 척수강내(척추에) 투여하였다. 다음, 투여 후 약 1주째에 상기 동물에게서 말초 신경 손상이 좌골 신경 결찰을 통해 유도되었다. 손상 후 다양한 시점에서 상기 동물의 기계적 이질통(물리적 외부 자극에 대한 반응) 및 열적 통각과민(고온에 대한 반응) 모두를 평가하였다. 기계적 이질통은 Von Frey 모노필라멘트(0.16 g)를 상처 입은 발에 여러 번 가하고 동물이 통증으로 반응하는 횟수를 관찰하여 평가하였다. 열적 통각과민은 방사 열 자극(세기: 30)을 상처 입은 발에 가하고 발 움츠림 지연성을 확인하는 Hargreaves 시험법을 이용하여 평가하였다.
도 6B에 나타낸 바와 같이, scAAV8-CMV-3-2를 투여 받은 동물은 대조군 동물(PBS만)에 비해 Von Frey 모노필라멘트에 덜 빈번하게 반응하였다. 열적 통각과민에 대해서는 유사한 결과가 관찰되었다. 도 6B를 참조할 것. 이들 결과는 항-FAM19A5 AAV 구조체의 생체내 투여가 말초 신경 손상 후 신경병성 통증을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 7: scAAV9-CMV-3-2-ScFv를 사용한 만성 신경병성 통증 모델(CCI)에서 통증 완화 평가
실시예 6에 기재된 만성 수축성 손상(CCI)의 마우스 모델을 사용하여 scAAV9-CMV-3-2-ScFv의 생체내 효과를 또한 시험하였다. 간단히, scAAV9-CMV-3-2-ScFv 구조체를 C57BL6 마우스에 척수강내 투여하였다. 대조군 동물은 scAAV9-CMV-GFP 구조체를 투여 받았다. 다음, 투여한 지 약 1주 후에 말초 신경 손상이 유도되었다. 다음, 실시예 6에 기재되어 있는 바와 같이 다양한 시점에서 상기 동물의 기계적 이질통 및 열적 통각과민 모두를 평가하였다.
도 7A와 7B에 나타낸 바와 같이, scAAV9-CMV-3-2-ScFv를 투여 받은 동물은 말초 신경 손상 후 더 많은 통증 내성이 있는 것으로 보였다. 예를 들어 대조군 동물에 비해 scAAV9-CMV-3-2-ScFv를 투여 받은 마우스는 Von Frey 모노필라멘트에 덜 빈번하게 반응하였고(도 7A) 고온에 대해 더 높은 지연시간을 가졌다(도 7B).
종합적으로, 이들 결과는 항-FAM19A5 scFv가 AAV 벡터를 사용하여 효과적으로 생체내 전달될 수 있고 AAV 벡터에 의해 생산된 항-FAM19A5 scFv가 완전히 기능적임(예를 들어 인간 FAM19A5에 결합하고 신경병성 통증을 감소시킴)을 입증한다.
실시예 8: scAAV1-CMV-3-2-ScFv를 사용하여 만성 신경병성 통증 모델(CCI)에서 통증 완화 평가
상기 효과가 사용된 AAV의 유형에 의존하는지 여부를 추가로 평가하기 위해서 scAAV1-CMV-3-2-ScFv의 생체내 효과를 시험하였다. 간단히, C57BL/6 마우스에 척수강내 투여를 통해 2주 간격으로 scAAV1-CMV-3-2-ScFv의 2회 용량(각 용량 = 1 x 1011 vg/마우스)을 투여하였다. 마지막 투여 1주 후, 말초 신경 손상을 유도하였고 실시예 6에 기재되어 있는 대로 기계적 이질통 및 열성 통각과민 모두를 평가하였다.
실시예 6과 7에서 관찰된 바와 같이, scAAV1-CMV-3-2-ScFv로 처리한 동물은 대조군에 비해 손상 유도 후 약 4일(즉, 수술 후 수일) 부터 기계적 이질통의 개선을 보였다(즉, Von Frey 모노필라멘트 자극에 덜 빈번하게 반응함). 도 8A를 참조할 것. 이러한 개선은 손상 유도 후 24일에 실험 종료시까지 유지되었다. 열적 통각과민의 경우, 손상 유도 후 약 5일 부터 scAAV1-CMV-3-2-ScFv로 처리한 동물에서 개선이 관찰되었고(즉, 열 자극에 대한 반응으로 더 긴 지연시간) 적어도 손상 유도 후 12일까지 지속되었다. 도 8B를 참조할 것.
이들 결과는 신경병성 통증 치료에서 3-2 항-FAM19A5 scFv의 효능을 추가로 확인해 주는 것으로, 사용한 AAV 벡터의 유형에 치료 실익이 의존하지 않음을 입증한다.
실시예 9: scAAV9-CMV-2-13-ScFv 또는 scAAV9-CMV-1-30-ScFv를 사용하여 만성 신경병성 통증 모델(CCI)에서 통증 완화 평가
상기 항-FAM19A5 항체의 다른 클론들 또한 신경병성 통증을 치료할 수 있는지 여부를 평가하기 위해서 실시예 6에 기재되어 있는 만성 수축성 손상(CCI)의 마우스 모델을 다시 사용하였다. 간단히, scAAV9-CMV-2-13-ScFv(2주 간격으로 2회 용량, 각각의 용량 = 1 × 1011 vg/마우스) 또는 scAAV9-CMV-1-30-ScFv(단일 용량, 1 × 1011 vg/마우스)를 C57BL/6 마우스에 척수강내 투여를 통해 투여하였다. 대조군 동물은 scAAV9-CMV-GFP를 투여받았다. 마지막 투여한 지 대략 1주일 후에 말초 신경 손상을 유도하였고 손상 유도 후 다양한 시점에서 기계적 이질통과 열적 통각과민 모두를 평가하였다(실시예 6 참조).
도 9A, 9B, 10A 및 10B에 나타낸 바와 같이, scAAV9-CMV-2-13-ScFv 또는 scAAV9-CMV-1-30-ScFv로 처리한 동물은 기계적 이질통 및 열적 통각과민 모두에 대해 개선을 보였다. 이들 결과는 항-FAM19A5 항체의 서로 다른 클론들이 신경병성 통증을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 10: 항-FAM19A5 ScFv을 IL-10과 조합 사용하여 만성 신경병성 통증 모델(CCI)에서 통증 완화의 평가
다른 치료제들(즉, IL-10)과 조합한 항-FAM19A5 ScFv의 효능을 결정하기 위해서 다음 처방(regimen) 중 하나를 척수강내 투여를 통해 C57BL/6 마우스에 투여하였다: (i) scAAV1-CMV-GFP; (ii) scAAV1-CMV-3-2-ScFv; (iii) scAAV1-CMV-3-2-ScFv + scAAV9-CMV-mIL-10; 및 (iv) scAAV9-CMV-mIL-10. 상기 서로 다른 치료 처방을 마우스에 1 × 1011 ㎍/마우스의 투여량으로 2회(2주 간격) 투여하였다. 마지막 투여한 지 1주일 후 말초 신경 손상을 유도하였고 다양한 시점에서 기계적 이질통을 평가하였다(실시예 6 참조).
앞선 실시예들에서 관찰된 바와 같이, scAAV1-CMV-3-2-ScFv를 단독으로 처리한 동물은 대조군(즉, scAAV1-CMV-GFP)에 비해 물리적 자극에 더 내성이 있었다(즉, Von Frey 모노필라멘트의 인가에 덜 빈번하게 반응함). 유사한 반응이 scAAV9-CMV-mIL-10으로 단독 처리한 동물에게서 관찰되었다(도 11A). 동물을 scAAV1-CMV-3-2-ScFv 및 scAAV9-CMV-mIL-10의 조합으로 처리했을 때, 단일 치료 처방으로 처리한 동물에 비해 훨씬 더 개선된 반응을 나타내었다. scAAV9-CMV-2-13-ScFv(도 11B) 및 scAAV9-CMV-1-30-ScFv(도 11C)에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다.
이들 결과는 신경병성 통증 치료에서 AAV 벡터를 통해 전달되는 항-FAM19A5 scFv의 효능을 추가 입증한다. 상기 결과들은 또한 이 효능이 IL-10과 같은 다른 치료제와 조합하였을 때 더욱 증진될 수 있음을 입증한다.
본 PCT 출원은 2018년5월8일에 제출된 미국 가출원 번호 62/668,634의 우선권의 이익을 주장하며 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NEURACLE SCIENCE CO., LTD. <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) DELIVERY OF ANTI-FAM19A5 ANTIBODIES <130> 3763.010PC01/C-K/DKC <150> US 62/668,634 <151> 2018-05-08 <160> 301 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Ala Pro Ser Pro Arg Thr Gly Ser Arg Gln Asp Ala Thr Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ser Met Ser Ser Thr Phe Trp Ala Phe Met Ile Leu Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Ile Ala Tyr Cys Ser Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val 35 40 45 Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln 50 55 60 Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg 65 70 75 80 Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp 85 90 95 Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile 100 105 110 Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr 115 120 125 Thr Thr Val Ser 130 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Gln Leu Leu Lys Ala Leu Trp Ala Leu Ala Gly Ala 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ttgcttttat 960 tttcttatac tttcagtata ctccatagac caaagagcaa aatctatctg aacctggacg 1020 caccctcact gtcagggtcc ctggggtcgc ttgtgcgggc gggagggcaa tggtggcaga 1080 gacatgctgg tggccccggc ggagcggaga gggcggccgt ggtggaggcc tccaccccag 1140 gagcaccccg cacaccctcg gaggacgggc ttcggctgcg cggaggccgt ggcacacctg 1200 cgggaggcag cgacggcccc cacgcagacg ccgggaacgc aggccgcttt attcctctgt 1260 acttagatca acttgaccgt actaaaatcc ctttctgttt taaccagtta aacatgcctc 1320 ttctacagct ccatttttga tagttggata atccagtatc tgccaagagc atgttgggtc 1380 tcccgtgact gctgcctcat cgatacccca tttagctcca gaaagcaaag aaaactcgag 1440 taacacttgt ttgaaagaga tcattaaatg tattttgcaa agcccaaaaa aaaaaaaaaa 1500 a 1501 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope F1 <400> 5 Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val Thr Leu Asp Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope F2 <400> 6 Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Cys 20 <210> 7 <211> 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ggctgaggac accggcacct acttctgcgc cagatctact 300 tatgaatgtc ctggtggttt tagttgttgg ggtgatactg gtcaaataga cgcatggggc 360 cacgggaccg aagtcatcgt ctcctcca 388 <210> 44 <211> 394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-2 Antibody VH <400> 44 gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60 gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agcttcaaca tgttctgggt gcgacaggcg 120 cccggcaagg ggctggaata cgtcgctcaa attagcagca gtggtagtag cacaaactac 180 gcacccgcgg tgaggggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240 ctgcagctga acaaccccgg ggctgaagac accggcacct actactgcgc caaaagtagt 300 tatgactgtc cttacggtca ttgtagtagt ggtgttgata gtgctggtga gatcgacgca 360 tggggccacg ggaccgaagt catcgtctcc tcca 394 <210> 45 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-65 Antibody VH <400> 45 gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60 gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agctatcaga tgggctgggt gcgacaggcg 120 cccggcaagg ggctggaatg ggtcggtgtt attaacaaga gtggtagtga cacatcatac 180 gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240 ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct acttctgcgc caaaggttct 300 gctagttata taactgctgc taccatcgac gcatggggcc acgggaccga agtcatcgtc 360 tcctcc 366 <210> 46 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-28 Antibody VH <400> 46 gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60 gtctgcaagg cctccgggtt cgacttcagc gattatggca tgggttgggt gcgacaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggttgctgct attagaagtg atggtagtaa cccatcatac 180 gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgaaggaca acgggcgaag cacagtgagg 240 ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accgccacct actactgcgc caaggatggt 300 aatggttact gtgctctcga tgcttatcgt agtggtggtt atagttgtgg tgtttatcct 360 ggtagcatcg acgcatgggg ccacgggacc gaagtcatcg tctcctcc 408 <210> 47 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-13 Antibody VL <400> 47 ggccctgact cagccgtcct cggtgtcagc aaacccagga gaaaccgtca agataacctg 60 ctccgggggt agctatagct atggctggtt ccagcagaag tctcctggca gtgcccttgt 120 cactgtgatc tactgggatg atgagagacc ctcggacatc ccttcacgat tctccggtgc 180 cctatccggc tccacaaaca cattaaccat cactggggtc caagccgacg acgaggctgt 240 ctatttctgt gggactgaag acatcagcgg cactgctggt gtatttgggg ccgggacaac 300 cctgaccgtc ctggg 315 <210> 48 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-2 Antibody VL <400> 48 ggccctgact cagccgtcct cggtgtcagc aaacccagga gaaaccgtca agatcacctg 60 ctccgggggt ggcagctatg ctggaagtta ctattatggc tggtaccagc agaaggcacc 120 tggcagtgcc cctgtcactc tgatctatga aagcaacaag agaccctcgg acatcccttc 180 acgattctcc ggttccacat ctggctccac agccacacta accatcactg gggtccaagc 240 cgatgacgag gctatctatt actgtgggag ctgggacagt agcaatggtg gtatatttgg 300 ggccgggaca accctgaccg tcctagg 327 <210> 49 <211> 331 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-65 Antibody VL <400> 49 ggccctgact cagccgtcct cggtgtcagc aaaccctggg gaaactgtca agatcacctg 60 ctccgggggt ggtagcagtg gctatggtta tggctggtat cagcagaagt cacctagcag 120 tgcccctctc actgtgatct actggaacga caagagaccc tcggacatcc cttcacgatt 180 ctccggttcc aaatccggct ccacacacac attaaccatc actggggtcc aagccgagga 240 cgaggctgta tatttctgtg ggaatgatga ctacagcagt gatagtggat atgtcggtgt 300 atttggggcc gggacaaccc tgaccgtcct a 331 <210> 50 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-28 Antibody VL <400> 50 gccctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aacctggaag gaaccgtcga gatcacctgc 60 tccgggagtg gctatggtta tggctggtat cagcagaagt ctcctggcag tgcccctgtc 120 actgtgatct atcagaacga caagagaccc tcggacatcc cttcacgatt ctccggttcc 180 aaatccggct ccacgggcac attaaccatc actggggtcc aagtcgagga cgaggctgtc 240 tattactgtg ggagtgaaga cagcagcact cttgctggta tatttggggc cgggacaacc 300 ctgaccgtcc ta 312 <210> 51 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M3 mutant <400> 51 Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val 1 5 10 15 Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Ile Glu Glu Arg Ser Gln 20 25 30 Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg 35 40 45 Ala Arg 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<400> 294 gccctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aaccctgggg aaactgcgcg tatcacctgc 60 tccggtggtg ctagcagtgg ctatggttat ggctggtatc agcagaagcc tagcagtgcc 120 cctctcactg tgatctacaa agactctgaa agaccctcgg acatcccttc acgattctcc 180 ggttcctctt ccggctccac acacacatta accatcagcg gggtccaagc cgaggacgag 240 gctgtatatt tctgtgggaa tgatgactac agcagtgata gtggatatgt cggtgtattt 300 ggggccggga caaccctgac cgtcctaggt cagtcctcta gatcttccgg cggtggtgga 360 tcctctggtg gtggtggttc cgccgtgacg ttggacgagt ccgggggcgg cctccagacg 420 cccggaggag cgctccgcct ctcttgcaag gcctccgggt tcaccttcag cagctatcag 480 atgggctggg tgcgacaggc gcccggcaag gggctggaat gggtcagcgc gattaataag 540 agcggtagtg acacatcata cgggtcggcg gtgaagggcc gtgccaccat ctcgagggac 600 aacgggcaga gcacactgta cctgcagatg aacagcctca gggctgagga caccgctgtt 660 tacttctgcg ccaaaggttc tgctagttac ataactgctg ctaccatcga cgcatggggc 720 cacgggaccg aagtcatcgt ctcctcc 747 <210> 295 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> S5-2.GKNG scFv <400> 295 gccctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aaccctgggg aaactgcgcg tatcacctgc 60 tccggtggtg ctagcagtgg ctatggttat ggctggtatc agcagaagcc tagcagtgcc 120 cctctcactg tgatctacaa agactctgaa agaccctcgg acatcccttc acgattctcc 180 ggttcctctt ccggctccac acacacatta accatcagcg gggtccaagc cgaggacgag 240 gctgtatatt tctgtgggaa tgatgactac agcagtgata gtggatatgt cggtgtattt 300 ggggccggga caaccctgac cgtcctaggt cagtcctcta gatcttccgg cggtggtgga 360 tcctctggtg gtggtggttc cgccgtgacg ttggacgagt ccgggggcgg cctccagacg 420 cccggaggag cgctccgcct ctcttgcaag gcctccgggt tcaccttcag cagctatcag 480 atgggctggg tgcgacaggc gcccggcaag gggctggaat gggtcagcgc gattaataag 540 ggcggtagtg acacatcata cgggtcggcg gtgaagggcc gtgccaccat ctcgagggac 600 aacgggcaga gcacactgta cctgcagatg aacagcctca gggctgagga caccgctgtt 660 tacttctgcg ccaaaggttc tgctagttac ataactgctg ctaccatcga cgcatggggc 720 cacgggaccg aagtcatcgt ctcctcc 747 <210> 296 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 2-13D scFv <400> 296 ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccaggagaaa ccgcgaagat aacctgctcc 60 gggggtgtgt atagctatgg ctggttccag cagaagcctg gcagtgccct tgtcactgtg 120 atctactggg atgatgagag accctcggac atcccttcac gattctccgg tgccctatcc 180 ggctccacaa acacattaac catcactggg gtccaagccg aagacgaggc tgattattat 240 tgtgggactg aagacatcag cggcactgct ggtgtatttg gggccgggac aaccctgacc 300 gtcctgggtc agtcctctag atcttccggc ggtggtggat cctctggtgg tggtggttcc 360 gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctccgcctt 420 agctgcagcg cctccgggtt caccttcagc agccatggca tgttctgggt gcgacaggcg 480 cccggcaagg ggttggaata tgtctcggag attaccaatg atggtagtgg cacaaactac 540 gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacactgtat 600 ctgcagatga acagcctcag ggctgaggac accggcacct acttctgcgc cagatctact 660 tatgaatgtc ctggtggttt tagttgttgg ggtgatactg gtcaaataga cgcatggggc 720 cacgggaccg aagtcatcgt ctcctcc 747 <210> 297 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 2-13D-37 scFv <400> 297 ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccaggagaaa ccgcgaagat aacctgctcc 60 gggggtgtgt atagctatgg ctggttccag cagaagcctg gcagtgccct tgtcactgtg 120 atctactggg atgatgagag accctcggac atcccttcac gattctccgg tgccctatcc 180 ggctccacaa acacattaac catcactggg gtccaagccg aagacgaggc tgattattat 240 tgtgggactg aagacatcag cggcactgct ggtgtatttg gggccgggac aaccctgacc 300 gtcctgggtc agtcctctag atcttccggc ggtggtggat cctctggtgg tggtggttcc 360 gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctccgcctt 420 agctgcagcg cctccgggtt cgatttcagc agccatggca tgttctgggt gcgacaggcg 480 cccggcaagg ggttggaata tgtctcggag attaccaatg atggtagtgg cacaaactac 540 gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacactgtat 600 ctgcagatga acagcctcag ggctgaggac accggcacct acttctgcgc cagatctact 660 tatgaatgtc ctggtggttt tagttgttgg ggtgatactg gtcaaataga cgcatggggc 720 cacgggaccg aagtcatcgt ctcctcc 747 <210> 298 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 2-13D-37-1.5W-41 scFv <400> 298 gccctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aacccaggag aaaccgcgaa gataacctgc 60 tccgggggtg tgtatagcta tggctggttc cagcagaagc ctggcagtgc ccttgtcact 120 gtgatctact gggatgatga gagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggtgcccta 180 tccggctcca caaacacatt aaccatcact ggggtccaag ccgaagacga ggctgattat 240 tattgtggga ctgaagacat cagcggcact gctggtgtat ttggggccgg gacaaccctg 300 accgtcctgg gtcagtcctc tagatcttcc ggcggtggtg gatcctctgg tggtggtggt 360 tccgccgtga cgttggacga gtccgggggc ggcctccaga cgcccggagg agcgctccgc 420 cttagctgca gcgcctccgg gttcgatttc agcagccatg gcatgttctg ggtgcgacag 480 gcgcccggca aggggttgga atatgtctcg gagattacca atgatggtag tggcacaaac 540 tacgggtcgg cggtgaaggg ccgtgccacc atctcgaggg acaacgggca gagcacactg 600 tatctgcaga tgaacagcct cagggctgag gacaccggca cctacttctg cgccagatct 660 tcttatgttt gtcctggtgg ttttagttgt tggggtgata ctggtcaaat agacgcatgg 720 ggccacggga ccgaagtcat cgtctcctcc 750 <210> 299 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 2-13D-37-3W-16 scFv <400> 299 gccctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aacccaggag aaaccgcgaa gataacctgc 60 tccgggggtg tgtatagcta tggctggttc cagcagaagc ctggcagtgc ccttgtcact 120 gtgatctact gggatgatga gagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggtgcccta 180 tccggctcca caaacacatt aaccatcact ggggtccaag ccgaagacga ggctgattat 240 tattgtggga ctgaagacat cagcggcact gctggtgtat ttggggccgg gacaaccctg 300 accgtcctgg gtcagtcctc tagatcttcc ggcggtggtg gatcctctgg tggtggtggt 360 tccgccgtga cgttggacga gtccgggggc ggcctccaga cgcccggagg agcgctccgc 420 cttagctgca gcgcctccgg gttcgatttc agcagccatg gcatgttctg ggtgcgacag 480 gcgcccggca aggggttgga atatgtctcg gagattacca atgatggtag tggcacaaac 540 tacgggtcgg cggtgaaggg ccgtgccacc atctcgaggg acaacgggca gagcacactg 600 tatctgcaga tgaacagcct cagggctgag gacaccggca cctacttctg cgccagatct 660 aattatgctt gtcctggtgg ttttagttgt tggggtgata ctggtcaaat agacgcatgg 720 ggccacggga ccgaagtcat cgtctcctcc 750 <210> 300 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 300 Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 301 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-30 scFv <400> 301 gctctcacac aaccttcctc tgtctctgct aatcctggcg agactgttaa aatcacctgc 60 tccggggggg gtagtgagga agaacagtat tactatggat ggtaccaaca aaagcctggg 120 tctgcacccg taacccttat ataccaagat gaggagcgcc catccgatat accctcacgc 180 ttctcaggca gtacatctgg gtcaactgca accctcacca ttacaggagt gcaagcaggt 240 gatgaggcag attattattg tgggtcatgg gactccgagg acgaggatca ttttggagct 300 ggcactacat tgacagtact gggccagtca tcaagaagtt caggtggcgg cggaagctcc 360 gggggcggtg gatcagcagt aactctcgac gaatctggag gcggtcttca aacccctggg 420 ggggctctga gactctcatg taaagccagc ggattcgatt tcgagtcatt taacatgttt 480 tgggtccgcc aggcccccgg taaaggcctg gagtatgtgt cccaaatatc aagttcagag 540 gaggacgaga actatgcccc agccgtgaaa ggtcgagcta caatttcccg agacaacggc 600 cagtcaacac tctacttgca gatgaacagc ctgagagccg aagacactgg tacatactat 660 tgtgctaaat ccagctacga ctgtccatac ggccattgtt catcaggagt agactccgca 720 ggtgagatag acgcatgggg tcatggcact gaggtcattg tgtcctct 768

Claims (42)

  1. 서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5) 단백질에 대한 길항제를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경병증성 통증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 FAM19A5 단백질에 대한 길항제는 FAM19A5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합부분(항-FAM19A5 항체)인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 인트론, 신호 펩티드 또는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 역전된 말단 반복(ITR)을 더 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv(scFv)를 포함하는 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 scFv인 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 코돈 최적화된 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 204, 서열번호 205, 서열번호 206 또는 서열번호 301에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 scFv가 서열번호 201, 서열번호 202, 서열번호 203 또는 서열번호 256에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가:
    (a) 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정했을 때 KD가 10 nM 이하인 가용성 인간 FAM19A5에 결합하는 특성;
    (b) ELISA에 의해 측정했을 때 KD가 10 nM 이하인 막 결합 인간 FAM19A5에 결합하는 특성; 또는
    (c) (a)와(b) 모두로부터 선택된 특성을 나타내는 약제학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 기준 항체와 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합하되,
    (i) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iii) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 아미노산 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iv) 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 222의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 225의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 CDR3은 서열번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 서열번호 6 또는 서열번호 9인 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하는 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 서열번호 6 또는 서열번호 9인 FAM19A5 에피토프에만 결합하는 약제학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 FAM19A5 에피토프에 추가로 결합하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추가 FAM19A5 에피토프가 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하되,
    (i) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 17, 18과 19를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 29, 30과 31을 포함하거나;
    (ii) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 14, 15와 16을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 26, 27과 28을 포함하거나;
    (iii) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 11, 12와 13을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 23, 24와 25를 포함하거나; 또는
    (iv) 상기 중쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 212, 213과 16을 포함하고, 상기 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3은 각각 서열번호 222, 225와 224를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 삭제
  24. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 서열번호 37을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 서열번호 36을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 서열번호 35를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 서열번호 236을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 245를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제1항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체가 인간 FAM19A5에 대한 기준 항체의 결합을 결합 저해 분석법에 의해 측정했을 때 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 저해하는 약제학적 조성물.
  32. 삭제
  33. (a) 시험관내에서 제1항의 AAV 벡터를 사용하여 형질 주입시킨 숙주 세포를 배양하여 세포 배양물을 제공하는 단계 및 (b) 상기 세포 배양물의 상청액으로부터 재조합 AAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는, 신경병증성 통증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 제1항에 있어서, 상기 신경병증성 통증이 말초 신경병증성 통증인 약제학적 조성물.
  38. 제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 필요로 하는 대상에서 외부 자극에 대한 역치 또는 지연 시간을 증가시키기 위한 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 외부 자극이 기계적 자극인 약제학적 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 외부 자극이 열 자극인 약제학적 조성물.
  41. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 정맥내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 근육내, 피하, 복강내, 유리체강내, 경막외, 망막하 또는 심실내 투여되는 약제학적 조성물.
  42. 제38항에 있어서, 상기 대상이 인간인 약제학적 조성물.
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