JP6731933B2 - Ｐｃｓｋ９抗体、及び医薬組成物とその使用 - Google Patents

Ｐｃｓｋ９抗体、及び医薬組成物とその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP6731933B2
JP6731933B2 JP2017542863A JP2017542863A JP6731933B2 JP 6731933 B2 JP6731933 B2 JP 6731933B2 JP 2017542863 A JP2017542863 A JP 2017542863A JP 2017542863 A JP2017542863 A JP 2017542863A JP 6731933 B2 JP6731933 B2 JP 6731933B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
seq
pcsk9
acid sequence
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017542863A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018509894A (ja
Inventor
バイヨン リ
バイヨン リ
チョンミン ワン
チョンミン ワン
ユー シア
ユー シア
ペン チャン
ペン チャン
ウーシャン レン
ウーシャン レン
チナン ジャオ
チナン ジャオ
ユアンユアン シュー
ユアンユアン シュー
ドンシェン ダイ
ドンシェン ダイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ad Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Ad Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ad Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Ad Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JP2018509894A publication Critical patent/JP2018509894A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6731933B2 publication Critical patent/JP6731933B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/321—Arterial hypertension

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、免疫学及び分子生物学の分野に属し、抗ＰＣＳＫ９抗体、医薬組成物及び使用方法に関する。具体的には、本発明は、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体に関する。
プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、タンパク質前駆体転換酵素活性を有するサブチリシンプロテアーゼの一種である。ＰＣＳＫ９は、主に肝臓、小腸、及び腎臓で発現するが、皮膚及び神経系においてはほとんど発現しない。肝臓から血液循環系へ分泌されるＰＣＳＫ９は、細胞表面上の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体（ＬＤＬＲ）への結合及びエンドサイトーシスを介して、その受容体の数を低下させることができる。ＬＤＬＲは血漿中のＬＤＬを効果的に除去可能であることから、ＬＤＬＲが少ないほどＬＤＬの蓄積は促進される。したがって、ＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲの低下により、結果としてＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ‐Ｃ）が増加する。ＰＣＳＫ９は、アポリポタンパク質Ｂの脂質代謝にも関与する。ＰＣＳＫ９の分泌は、腸内のトリグリセリド（ＴＧ）レベルを上昇させ、高コレステロール血症を引き起こす可能性がある（Ｒａｓｈｉｄ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ‐ｒｉｃｈ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｏｔｈ ｌｏｗ‐ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ‐ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４ Ｊｕｌ ２９；１３０（５）：４３１‐４１）。
高コレステロール血症患者の約２９％がスタチンを服用している。しかしながら、高コレステロール血症患者の８．２％がスタチンに対して不耐性であるか、またはスタチンを用いても所望のコレステロール濃度を達成できなかった。合計３億９０００万人の高コレステロール血症患者が、中国を除く上位７大医薬品市場に居住していると推定された。２００４年１０月１２日に保健省が発表した報告書「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｒｅｓｉｄｅｎｔｓ」によると、中国の成人の１８．８％が高血圧を有し、これは全国で合計１億６０００万人にあたり、１９９１年から７０００万人増加している。脂質異常症患者の数も、同様に１億６０００万人に達している。
現在、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合をブロックし、次いで細胞表面上のＬＤＬＲ発現をアップレギュレートし、ＬＤＬ及びコレステロールの代謝を促進し、及び高コレステロール血症によって引き起こされる心臓血管疾患を予防及び治療することができる新規免疫治療抗体を開発する必要がある。さらに、ＴＧの代謝を高めるか、またはＴＧのレベルを低下させるとともに、それを長期間有効とする、高い効果を有するＰＳＣＫ９抗体を開発する必要がある。
本発明者らは、深い研究と創造的努力を通じて、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を取得した。驚くべきことに、本発明者らは、本発明のモノクローナル抗体が、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合を効果的にブロックし、細胞膜上に発現するＬＤＬＲの量をアップレギュレートし、ＬＤＬコレステロールの代謝を促進し、ＴＧのレベルを低下させるとともに、特に長い半減期を有することを見出した。したがって、本抗体を用いて、高コレステロール血症によって引き起こされる心臓血管疾患を予防及び／または治療することができる。
以下は、本発明の要約である：
本発明は、その重鎖ＣＤＲ領域が配列番号５〜７のアミノ酸配列から選択され；
及び／または
その軽鎖ＣＤＲ領域が、配列番号８〜１０のアミノ酸配列から選択されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
抗体治療剤、特にモノクローナル抗体（ＭＡＢ）は、多くの疾患の治療において良好な有効性を示した。慣習的に、これらの治療用抗体は、標的抗原で免疫した動物から得るか、または結合活性の低い抗体の親和性成熟によって得られる。しかしながら、これらの方法は、多くの時間と努力を要し、特定の抗原エピトープを標的とすることができない場合が非常に多い。
抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域は、結合活性を左右する。各鎖は３つの超可変領域を有する。すなわち、Ｋａｂａｔらの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），ｖｏｌｕｍｅ １‐３，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１‐３２４２， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）による相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、重鎖（Ｈ鎖）ではＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、ならびに軽鎖（Ｌ鎖）ではＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３である。
本発明者らは、結合活性を増強するための特異的修飾を有する６つのＣＤＲ領域を創造的に設計した。ＣＤＲ領域の変化に適応させるために、フレームワーク中のアミノ酸も変化させて、結合活性を維持するとともに、配列の最大限のヒト性を保証するようにした。
重鎖可変領域における３つのＣＤＲのアミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＳ （配列番号５）
ＨＣＤＲ２：ＩＳＳＳＳＳＹＩ （配列番号６）
ＨＣＤＲ３：ＥＹＤＦＷＳＡＹＹＤＡＦＤＶ（配列番号７）
軽鎖可変領域における３つのＣＤＲのアミノ酸配列
ＬＣＤＲ１：ＳＲＮＩＧＧＧＮＤ （配列番号８）
ＬＣＤＲ２：ＧＶＩ （配列番号９）
ＬＣＤＲ３：ＱＳＦＤＧＳＬＳＧＳＶ （配列番号１０）
特定の実施形態では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２のアミノ酸配列から選択される重鎖可変領域を含み、
及び／または
配列番号４のアミノ酸配列から選択される軽鎖可変領域を含む。
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトのツールのような当該分野の公知の技術を用いて、前記モノクローナル抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲを、配列番号５〜７及び配列番号８〜１０であると決定した。本発明においては、このモノクローナル抗体をＭＡＢ１と命名する。
特定の実施形態では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、ＣＤＲ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、または二重特異性抗体から選択される配列または配列部分を含む。
特定の実施形態では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＰＣＳＫ９タンパク質に結合し、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡによって検出するそのＥＣ５０が、およそ１００ｎＭ未満、特に１０ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、またはそれ未満である。
特定の実施形態では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、約１０−５Ｍ未満、特におよそ１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれ未満のＫＤでＰＣＳＫ９タンパク質に結合する。
特定の実施形態では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、マウス以外の種由来の非ＣＤＲ領域、例えばヒト由来の非ＣＤＲ領域を有する。
本発明は、配列番号５〜７のアミノ酸配列のＣＤＲを有する重鎖可変領域；好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；より好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列を有する重鎖可変領域をコードする配列を含む単離ヌクレオチドに関する。
本発明は、配列番号８〜１０のアミノ酸配列のＣＤＲを有する軽鎖可変領域；好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；より好ましくは、配列番号３のヌクレオチド配列を有する軽鎖可変領域をコードする配列を含む単離ヌクレオチドに関する。
本発明は、任意の単離ヌクレオチドを有するベクターに関する。
本発明は、任意の単離ヌクレオチドまたはベクターを保有する宿主細胞に関する。
本発明は、適切な条件下で宿主細胞株を増殖させ、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を細胞培養物から回収することによって前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を生成する方法に関する。
本発明は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、検出可能なマーカーとしての結合パートナーとを備えた複合体に関する。好ましくは、結合パートナーは、放射性同位体、フルオレセイン、発光物質、発色物質、または酵素である。
本発明は、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明で請求する複合体からなる試薬キットに関する。
好ましくは、試薬キットは、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体を含んでもよく；必要に応じて、そのような二次抗体は、放射性同位体、フルオレセイン、発光物質、発色物質、または酵素のような検出可能なマーカーを含んでもよい。
本発明は、試料中のＰＣＳＫ９の存在またはレベルの検出に使用する、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明で請求する複合体からなる試薬キットの調製に関する。
本発明は、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明で請求する複合体を含有する医薬組成物に関する。必要に応じて、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含んでもよい。
本発明は、高血圧、高コレステロール、高コレステロール血症またはこれらの病態によって引き起こされる心血管疾患の予防及び／または治療において、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または本発明で請求する複合体を含有する薬物の製造方法に関する。
本発明は、以下を目的とする前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明で請求する複合体を含有する薬物の製造方法に関する：
ａ）ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、
ｂ）ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合をブロックし、
ｃ）細胞表面上のＬＤＬＲの量もしくは血漿中のＬＤＬＲのレベルをアップレギュレートし、
ｄ）血漿中のＬＤＬもしくはＬＤＬ‐Ｃのレベルを低下させ、
ｅ）血漿中のＬＤＬの蓄積を制限し、
ｆ）ＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲの分解を阻害するか、または
ｇ）ＬＤＬコレステロール及び／またはトリグリセリドの代謝を高める。
本発明者らは、本発明の抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体が、マウス及びサルにおいて血漿ＬＤＬ及び／またはＬＤＬ‐Ｃのレベルを効果的に低下させることができ、それはエボロクマブの効果よりも長期間にわたる（マウスにおける血漿ＬＤＬ‐Ｃの低下を最長で３２日間維持する）ことを実証した。予期しないことに、本発明の抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体は、注射後最長で１３日間、サルの血清ＴＧレベルを低下させることが可能だが、このことは良好な治療可能性を意味している。現時点で、このような転帰を示す抗ＰＣＳＫ９抗体は他に存在しない。
本発明は、以下を目的として、本発明で請求する有効量の前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または複合体を投与するｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する：
ａ）ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、
ｂ）ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合をブロックし、
ｃ）細胞表面上のＬＤＬＲの量もしくは血漿中のＬＤＬＲのレベルをアップレギュレートし、
ｄ）血漿中のＬＤＬもしくはＬＤＬ‐Ｃのレベルを低下させ、
ｅ）血漿中のＬＤＬの蓄積を制限し、
ｆ）ＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲの分解を阻害するか、または
ｇ）ＬＤＬコレステロール及び／またはトリグリセリドの代謝を高める。
本発明は、高血圧、高コレステロール、高コレステロール血症及びこれらの病態によって引き起こされる心血管疾患の予防及び／または治療において、本発明で請求する有効量の前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、または複合体を投与する方法に関する。
特定の実施形態では、本発明は、高血圧、高コレステロール、高コレステロール血症及びこれらの病態によって引き起こされる心血管疾患の予防及び／または治療に関しての、本発明で請求する前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、または複合体に関する。
特定の実施形態では、本発明は、以下を目的とする本発明で請求する前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、または複合体の投与に関する：
ａ）ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、
ｂ）ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合をブロックし、
ｃ）細胞表面上のＬＤＬＲの量もしくは血漿中のＬＤＬＲのレベルをアップレギュレートし、
ｄ）血漿中のＬＤＬもしくはＬＤＬ‐Ｃのレベルを低下させ、
ｅ）血漿中のＬＤＬの蓄積を制限し、
ｆ）ＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲの分解を阻害するか、または
ｇ）ＬＤＬコレステロール及び／またはトリグリセリドの代謝を高める。
定義
本明細書中で他に特段の定義のない限り、本発明に関連して使用する科学用語及び技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子遺伝学、オリゴまたはポリヌクレオチド化学、ならびに免疫学の実験技術は、当該技術分野において周知であって、一般的に使用される技術である。一方、本発明をより良く理解するために、以下の用語は、他に特段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解すべきである：
本発明で用いる「ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型）のアミノ酸配列」とは、全長のＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、ヒトＮＰ＿７７７５９６．２１、マウスＮＰ＿７０５７９３．１ またはサルＮＰ＿００１１０６１３０．１）だけでなく、それらの融合断片、特にマウスまたはヒトＩｇＧのＦｃ（ｍＦｃまたはｈＦｃ）との融合断片も指すものとする。さらに、当業者であれば理解するように、ＰＣＳＫ９タンパク質のアミノ酸配列は、その生物学的機能に影響を与えない天然または人工の突然変異（置換、欠失及び／または付加を含むが、必ずしもこれらに限定されない）を有し得る。
本発明で使用する用語「ＥＣ５０」とは、最大効果の５０％にあたる濃度を指す。
本発明において使用する用語「抗体」とは、一般的には二対のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリンタンパク質を指す（各対は「軽」（Ｌ）鎖及び「重」（Ｈ）鎖を有する）。軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとしてアイソタイプ抗体を定義する。軽鎖及び重鎖では、可変領域と定常領域は、約１２残基またはそれ以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって連結する。重鎖はまた、約３残基以上のアミノ酸を有する「Ｄ」領域を有する。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）及び３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる定常領域（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）及び１つのドメインＣＬからなる定常領域（ＣＬ）を含む。定常領域は、免疫系における様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。 ＶＨ及びＶＬはまた、高い可変性を有する領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）と、それらを分断するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存的な領域とに細分することもできる。アミノ末端からカルボキシル末端の方向へ、各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順で、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗体結合部位を形成する。領域またはドメインへのアミノ酸の分布は、ＫａｂａｔによるＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７ ａｎｄ １９９１））、もしくはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１‐９１７；またはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ， ３４２：８７８‐８８３の定義に従う。用語「抗体」は、それらを産生する特定の方法によって制限されない。例えば、抗体は、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体を包含する。抗体は、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプなど）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であることが可能である。
本発明において使用する場合、用語「抗原結合断片」とは、完全長抗体の断片を含有するポリペプチドであって、完全長抗体と同一抗原に特異的に結合し、及び／または抗原に対して完全長抗体と競合する能力を維持しているポリペプチドを指し、「抗原結合部分」とも呼ばれる。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．２，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたく、あらゆる目的のために、その論文全体及び参考文献を本発明に援用する。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはタンパク質分解酵素もしくは化学物質でインタクトな抗体を切断することによって生成することができる。いくつかの場合には、抗原結合部分として、特異的抗原結合能力を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を有するＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及びＣＤＲ断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ならびに二重特異性抗体が挙げられる。
本発明で使用する用語「Ｆｄフラグメント」とは、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指し；用語「Ｆｖフラグメント」とは、ＶＬ及びＶＨドメインからなる抗体断片を指し；用語「ｄＡｂフラグメント」とは、ＶＨドメインからなる抗体断片を指し（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４‐５４６（１９８９））；用語「Ｆａｂフラグメント」とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指し； 用語「Ｆ（ａｂ′）２フラグメント」とは、ヒンジ領域のジスルフィド架橋を介して連結する２つのＦａｂフラグメントからなる抗体断片を指す。
いくつかの場合、抗原結合断片は一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、これは互いに連結するＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる単一のポリペプチド鎖である（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３‐４２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９‐５８８３（１９８８）参照）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２‐ＶＬ‐リンカー‐ＶＨ‐ＣＯＯＨまたはＮＨ２‐ＶＨ‐リンカー‐ＶＬ‐ＣＯＯＨを有してもよい。適切なリンカーは、ＧＧＧＧＳリピートまたはその変異体であり得る。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４またはその変異体を用いることができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４‐６４４８）。他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５‐７３１，Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４‐１０６，Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５‐３０６１，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１‐５６及びＲｏｏｖｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌに記載されている。
いくつかの場合では、抗原結合断片は二重特異性抗体、すなわち二量体抗体断片であり、そのＶＨ及びＶＬドメインは単一のポリペプチド鎖上に発現する。しかしながら、非常に短いリンカーは、同じ鎖の２つのドメイン間の対形成を可能にせず、ドメインを別の鎖上の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４‐６４４８（１９９３）、及びＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１‐１１２３ （１９９４）参照）。
当業者に周知の従来技術（組換えＤＮＡ技術または酵素／化学的切断など）を用いて、抗原結合断片（例えば、上記抗体断片）を所与の抗体から取得し、完全抗体と同じ様式で特異性についてスクリーニングしてもよい。
本発明において、特に明記しない限り、用語「抗体」とは、インタクトな抗体だけでなく抗体の抗原結合断片も指す。
本発明で使用する用語「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」とは、高度に相同的な抗体の群、すなわち自発的に生じる可能性のある突然変異を除いては同一である抗体分子の群に由来する抗体または抗体の断片を指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体とは異なり、通常、抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，（１９７５））によって最初に報告されたハイブリドーマ技術、ならびに組換えＤＮＡ技術（米国特許第４，８１６，５６７号参照）を用いて取得することができる。
本発明で使用する用語「ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）に由来する抗体またはその断片であって、そのＣＤＲまたはＣＤＲの一部が非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域によって置換されているものを指し、ここで、ドナー抗体は、予想される特異性、結合親和性、または反応性を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）であってもよい。さらに、レセプター抗体フレームワーク領域（ＦＲ）のいくつかのアミノ酸残基を、非ヒト供給源の対応するアミノ酸残基によって置換するか、または他の抗体のアミノ酸残基によって置換し、抗体の性能をさらに向上または最適化することができる。ヒト化抗体のより詳細については、例えばＪｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２‐５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３‐３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３‐５９６（１９９２）；及びＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１：３９７‐４０２（２０００）参照。
本発明において使用する場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合することができる抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、この分野の「抗原決定基」としても知られている。エピトープまたは抗原決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の３次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは、通常、「直鎖状」または「立体構造的」であってもよい少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５残基の連続または非連続アミノ酸を含む独特の空間的コンフォメーションである。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）参照。直鎖状エピトープでは、タンパク質とその相互作用分子（例えば、抗体）との間の相互作用点は、タンパク質のアミノ酸一次構造に沿って直線的に存在し、ここで、立体配座エピトープにおいて、相互作用点とは、タンパク質のアミノ酸一次構造に沿って互いを分離するアミノ酸残基である。
本発明において使用する場合、用語「単離する」または「単離された」とは、自然状態で人工的手段によって得られることを意味する。自然界にある種の「単離された」物質や成分がある場合、それはその自然環境の変化によるものか、もしくは自然環境から隔離されることによるか、またはその両方である場合がある。例えば、生きている動物の中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、同じ自然状態において高純度で分離されている場合、「単離された」と呼ばれる。用語「単離する」または「単離された」は、活性に影響を及ぼさない人工または合成物質、または他の不純物の存在を排除するものではない。
本発明において使用する場合、用語「Ｅ．ｃｏｌｉ発現系」とは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（株）及びベクターからなる発現系を指し、ここでＥ．ｃｏｌｉ（株）は市販の株であって：例えば、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
本発明において使用する場合、用語「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達媒体を指す。ポリヌクレオチドを挿入した場合にタンパク質を発現し得るベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入、または形質移入によって宿主細胞に挿入することができ、移送した遺伝子物質を宿主細胞内で発現させることができる。ベクターは、当業者には公知であり、限定するものではないが、プラスミド；ファスミド（ｐｈａｓｍｉｄ）；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；λファージまたはＭ１３ファージなどのファージ及び動物ウイルスなどが挙げられる。動物ウイルスとして、逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、水痘ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス（ＳＶ４０など）を挙げてもよいが、必ずしもこれらに限定するものではない。ベクターは、発現を制御する複数の成分を有し、プロモーター、転写開始因子、エンハンサー、選択エレメント、及びレポーター遺伝子が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。さらに、ベクターは複製開始部位を有する場合もある。
本発明において使用する場合、用語「宿主細胞」とは、ベクターを導入できる細胞を指し、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの原核細胞、酵母及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの真菌細胞、Ｓ２ ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞及びＳｆ９などの昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはヒト細胞などの動物細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
本発明において使用する場合、用語「特異的結合」とは、抗体とその標的抗原との間の相互作用のような、２つの分子間の非ランダム結合を指す。いくつかの実施形態では、抗原に対する抗体の特異的結合とは、例えば約１０−５Ｍ未満、特に１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、またはそれ未満のアフィニティー（ＫＤ）を意味する。
本発明において使用する場合、用語「ＫＤ」とは、抗体と抗原との間の結合親和性を記載するための特異的抗体抗原相互作用の解離平衡定数を指す。解離平衡定数が小さいほど、抗体はより強く結合し、抗体と抗原との間の親和性は高くなる。一般的には、抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による測定において、約１０−５Ｍ未満、特に１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍまたはそれ未満の解離平衡定数で、抗原に結合する。
本発明において使用する場合、用語「モノクローナル抗体」及び「ｍＡｂ」は同じ意味を有し、同じ意味でこれらを用い；用語「ポリクローナル抗体」及び「ＰｃＡｂ」は同じ意味を有し、同じ意味でこれらを用い；用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は同じ意味を有し、同じ意味でこれらを用いる。また、本発明では、アミノ酸を、通常、本分野で周知の一文字または三文字の略語によって表す。例えば、アラニンはＡまたはＡｌａとして表すことができる。
本発明において使用する場合、用語「有効量」とは、患者の疾患または障害を部分的にまたは完全に予防するか、または阻止するのに十分な治療剤の量として定義される。例えば、予防有効量とは、疾患を予防、停止、または遅延させる量であり；治療有効量とは、病気の患者における疾患及びその合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に停止させる量である。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内にある。例えば、治療有効量は、疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的状態、年齢、体重及び性別などの患者の一般的背景、薬物の投与、ならびに同時に実施する他の治療に応じて異なる。
発明の効果
本発明のモノクローナル抗体（例えば、ＭＡＢ１）は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合を効果的に遮断し、細胞表面に発現するＬＤＬＲの量をアップレギュレートし、ＬＤＬ及びコレステロールの代謝を促進し、ＴＧのレベルを低下させ、及び高コレステロール血症によって引き起こされる心臓血管疾患を、拡張されたｉｎ ｖｉｖｏ有効性で、予防及び／または治療することができる。
抗ＰＣＳＫ９抗体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ結果である。左から右へ：１μｇＢＳＡ；マーカー１０μＬ；還元ローディングバッファー中の１μｇの試料；非還元ローディングバッファー中の１μｇの抗ＰＣＳＫ９抗体である。 ＭＡＢ１の結合速度。 ヒト、マウス、及びサルＰＣＳＫ９に結合するＭＡＢ１のＥＬＩＳＡの結果。 ヒトＰＣＳＫ９に結合するＭＡＢ１の、ＬＤＬＲに対する競合ＥＬＩＳＡの結果。 ＭＡＢ１の存在下での２４時間インキュベート後の、ヒトＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬＲのＦＡＣＳ検出。 ＭＡＢ１の存在下での４８時間インキュベート後の、ヒトＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬＲのＦＡＣＳ検出。 ＭＡＢ１の存在下での２４時間インキュベート後の、ヒトＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬＲのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ結果。 マウス血清中ＬＤＬ‐Ｃの濃度に対する抗ＰＣＳＫ９抗体ＭＡＢ１及びエボロクマブの効果。 サル血清中ＬＤＬ‐Ｃの濃度に対する抗ＰＣＳＫ９抗体ＭＡＢ１の効果。 マウス血清中ＨＤＬ‐Ｃの濃度に対する抗ＰＣＳＫ９抗体ＭＡＢ１及びエボロクマブの効果。 サル血清中ＨＤＬ‐Ｃの濃度に対する抗ＰＣＳＫ９抗体ＭＡＢ１の効果。 マウス血清中ＴＧの濃度に対する抗ＰＣＳＫ９抗体ＭＡＢ１及びエボロクマブの効果。 サル血清中ＴＧの濃度に対する抗ＰＣＳＫ９抗体ＭＡＢ１の効果。
発明の詳細な説明
本発明について、以下に詳細に説明する。当業者であれば理解するように、以下の実施例は本発明の説明のためにのみ使用し、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。技術または条件の具体的な記載がないものに関しては、当該分野の文献（例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｗｒｉｔｔｅｎ ｂｙ Ｊ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｅｉｔａｎｇ Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ，ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ）に従って、または製品の取扱説明書に従って実施した。具体的な製造元に関する記載のない試薬または機器は、いずれも商業的に入手可能な従来製品であった。
本発明の実施例において、マウスは広東医学実験動物センターから購入した。
本発明の陽性対照抗体は、Ａｍｇｅｎ社のエボロクマブである（Ｊｏｙｃｅ Ｃ．Ｙ． Ａ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｅｒｕｍ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００９，１０６（２４）：９８２０‐５）。
実施例１：ヒト、マウス、及びサルＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６融合タンパク質の調製
１．ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６の遺伝子合成
ヒト（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿７７７５９６．２１）、マウス（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿７０５７９３．１）及びサル（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１０６１３０．１）ＰＳＣＫ９のアミノ酸配列をＴＥＶ‐ｈｉｓ６のアミノ酸配列と組み合わせた。
ヒト、マウス、及びサルの融合タンパク質の対応するヌクレオチド配列を最適化し、それぞれＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社において合成した。
２．プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ‐ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６
合成したＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６遺伝子をｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社提供）にクローニングし、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ‐ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６プラスミドを取得した。
組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３‐ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６の構築：プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ‐ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ゲル電気泳動から回収したＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６の遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にライゲーションし、ｐｃＤＮＡ３．１‐ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６プラスミドを取得し、プレーティングのために取扱説明書に従ってコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞ＤＨ５α（ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入）に形質移入した。陽性クローンを選択し、大量のｐｃＤＮＡ３．１‐ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６ ＤＮＡを精製するために、試薬キットを用いて製造元の指定に従ってスケールアップした。
３．ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６の発現、精製及びＰＣＳＫ９抗原の調製
ヒト、マウス及びサルｐｃＤＮＡ３．１‐ＰＣＳＫ９‐ＴＥＶ‐ｈｉｓ６の組換えプラスミドを２９３Ｆ細胞に形質移入してから７日後に、培養液を高速遠心分離及び微多孔膜を用いた濾過により処理し、その後、製造元が提供する取扱説明書に従ってＨｉｓＴｒａｐカラム（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１０、ＧＥ）によって精製し、ヒト、マウス及びサルの融合タンパク質を取得した。ＴＥＶプロテイナーゼを用いて融合タンパク質を消化し、さらにＮｉ‐ＮＴＡカラムで精製してＰＣＳＫ９抗原を取得した。
実施例２：ＬＤＬＲタンパク質の発現及び精製
１．ｈＬＤＬＲ‐Ｈｉｓプラスミドの構築
ｈＬＤＬＲ‐Ｈｉｓ遺伝子断片を、鋳型としてＬＤＬＲヒトｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入）を用いたＰＣＲにより増幅し、一般的なＤＮＡ精製キット及びゲル電気泳動で精製した。回収した遺伝子断片ｈＬＤＬＲ‐ＨｉｓをＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ‐ＨＦで消化し、Ｔ４リガーゼによりｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入）にクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１‐ｈＬＤＬＲ‐ｈｉｓ６を取得し、Ａｍｐ＋アガー（ａｇａｒ）プレート上に播種するためにコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞ＤＨ５α（ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入）に形質移入した。陽性クローンをＰＣＲによって同定し、ＬＢ液体培地で培養した。その培地を配列決定のためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに提出し、正しいインサートを含んでいることをＢＬＡＳＴによって確認した。
２．ＬＤＬＲタンパク質の発現及び精製
組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１‐ｈＬＤＬＲ‐ｈｉｓ６を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）形質移入キットを用いて２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質移入した。形質移入の７日後、培地を高速遠心分離、濃縮、及びＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ａにバッファー交換し、ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１０、ＧＥ）にアプライした。タンパク質をＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａの直線勾配で溶出した。精製したタンパク質を、Ｈｉｔｒａｐ脱塩カラムを用いてＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂにバッファー交換し、Ｈｉｔｒａｐ Ｑカラムにロードした。標的タンパク質を、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂの直線勾配で溶出し、ＰＢＳにバッファー交換した。最終タンパク質を、還元ローディングバッファー中に溶解し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより検査した。
実施例３：ＭＡＢ１の設計、発現、及び精製
１．抗体設計
モノクローナル抗体ＭＡＢ１を調製するために、本発明者らは、ＰＣＳＫ９タンパク質のアミノ酸配列及び３次元結晶構造に従って一連の抗体配列を創造的に設計した。数多くのスクリーニングと検査を通して、ＰＳＣＫ９に特異的に結合するＭＡＢ１が最終的に得られた。ＭＡＢ１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号１〜４に定義した。
ＭＡＢ１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（３６９ｂｐ）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＡＣＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＡＡＧＣ（配列番号１）
ＭＡＢ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（１２３ａａ）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＳＳＳＳＹＩＳＹＡＤＳＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＧＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＦＣＡＲＥＹＤＦＷＳＡＹＹＤＡＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ （配列番号２）
ＭＡＢ１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（３３３ｂｐ）：
ＣＡＧＡＧＣＧＡＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＧＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＴＣＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＴＡＴＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＣＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＧ（配列番号３）
ＭＡＢ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（１１１ａａ）：
ＱＳＥＬＴＱＰＲＳＶＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＲＮＩＧＧＧＮＤＶＨＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＧＶＩＥＲＳＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＤＧＳＬＳＧＳＶＦＧＴＧＴＤＶＴＶＬ（配列番号４）
２．発現及び精製
ＭＡＢ１の重鎖（Ｉｇγ１鎖Ｃ領域の定常領域を有する配列番号１、登録番号Ｐ０１８５７）及び軽鎖（Ｉｇλ２鎖Ｃ領域の定常領域を有する配列番号３；登録番号Ｐ０ＣＧ０５．１）のｃＤＮＡ配列を、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクターにクローニングし、それぞれプラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ‐ＭＡＢ１Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ‐ＭＡＢ１Ｌを取得した。
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ‐ＭＡＢ１Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ‐ＭＡＢ１Ｌを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いて個別に消化し、ゲル電気泳動から回収した重鎖及び軽鎖の遺伝子断片をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。この２つの組換えプラスミドを２９３Ｆ細胞に同時に形質移入した。形質移入の７日後、培地を高速遠心分離及び濃縮によって処理し、Ｈｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムにアプライした。Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを用いてＭＡＢ１を溶出し、ＰＢＳにバッファー交換した。
精製したＭＡＢ１を、還元または非還元ローディングバッファーで煮沸した後、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで検査した。図１に示すように、還元ＭＡＢ１は４５ｋＤ（重鎖）及び３０ｋＤ（軽鎖）に現れ、一方、非還元ＭＡＢ１（抗体全体）は１５０ｋＤに現れた。
本実施例で取得したＭＡＢ１を、以下の実施例４〜９において用いた。
実施例４：ＭＡＢ１と抗原ＰＣＳＫ９‐ｈｉｓとの間の結合速度
ＭＡＢ１と抗原ＰＣＳＫ９‐ｈｉｓとの間の結合速度を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍによって測定した。
ＭＡＢ１（実施例３で調製）を、標準的なアミンカップリング法によってＡＲ２Ｇバイオセンサーに固定化した。過剰のアミノ基をエタノールアミンでブロッキングし、ＰＢＳＴ中で平衡化させた後、抗原ＰＣＳＫ９‐ｈｉｓに対するＭＡＢ１の結合親和性を測定した。ＰＢＳＴ中のＰＣＳＫ９の濃度は、４１１、２０５．５、１０２．８、５１．４、２５．７、１２．８、及び０ｎＭであった。抗原及び抗体の解離もまたＰＢＳＴ中で行った。
ＭＡＢ１と抗原ＰＣＳＫ９‐ｈｉｓとの間の結合速度を表２及び図２に示す。

明らかに、抗体ＭＡＢ１は、ＰＣＳＫ９との良好な結合親和性を有する。
実施例５：ＰＣＳＫ９へのＭＡＢ１結合活性
１．マウス、サル、及びヒトＰＣＳＫ９（実施例１で調製）に対するＭＡＢ１の結合活性をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する
マウス抗ｈｉｓモノクローナル抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ａ００１８６）でコーティングしたマイクロプレートをＢＳＡで２時間ブロックした後、マウス、サル、及びヒト抗原ＰＣＳＫ９を別々に加え、３０分間インキュベートし、次いでＭＡＢ１を加え、３０分間インキュベートした。ＨＲＰ標識二次抗体（ヤギ抗ｈＩｇＧ抗体）（Ｊａｃｋｓｏｎ，１０９‐０３５‐０８８）を各ウェルにＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）と共に添加し、５分間発色させ、吸光度値を波長４５０ｎｍで読み取った（図３に示す）。
明らかに、ＭＡＢ１は、ＰＣＳＫ９に用量依存的に効果的に結合することができる。
マウス、サル、及びヒト抗原ＰＣＳＫ９に結合する異なる希釈濃度でのＭＡＢ１についての吸光度値を表３〜５に示す。


次いで、吸光度値の定量分析を用いて、曲線シミュレーション（表６）によりＥＣ５０を取得した。
明らかに、ＭＡＢ１は、ヒト、マウス、及びサルＰＣＳＫ９に効果的に結合することができる。
２．ＬＤＬＲに対するヒトＰＣＳＫ９とのＭＡＢ１の結合活性を競合ＥＬＩＳＡで測定する
ＬＤＬＲ‐Ｈｉｓ（実施例２で調製）を４℃で一晩マイクロタイタープレートに結合させた。プレートを１％ＢＳＡで３７℃、２時間ブロックした後、ヒトＰＣＳＫ９とＭＡＢ１の混合物（表７に示す濃度）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いでペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を３７℃で添加し、６０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加した。反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を４５０ｎＭで測定した（表７）。
ＬＤＬＲ（実施例２で調製）に対するＰＣＳＫ９へのＭＡＢ１の結合活性を図４に示し、これは、ＭＡＢ１がＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合を用量依存的に効果的にブロックできることを示した。
異なる用量の吸光度値を表７に示すが、これは、ＭＡＢ１がＰＣＳＫ９への結合を介して細胞膜上のＬＤＬＲの減少を阻害できることを示し（すなわち、ＭＡＢ１はＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合及び内在化ならびにＬＤＬＲの分解をブロックすることができる）；この阻害は用量依存的である。
ＥＣ５０は、吸光度値の定量分析を用いて曲線シミュレーションにより２．３３９ｎＭと計算された。明らかに、ＭＡＢ１は、ＬＤＬＲに対してＰＣＳＫ９に競合的に結合し、ＰＣＳＫ９誘導性の細胞表面上のＬＤＬＲの減少を阻害し（以下の実施例６に詳説）、及びｉｎ ｖｉｖｏでのＬＤＬコレステロールの代謝を調節する（すなわち、以下の実施例７に示すように、ＭＡＢ１は血清中のＬＤＬコレステロールのレベルをダウンレギュレートする）。
実施例６：ＭＡＢ１の細胞活性
フローサイトメトリー及びウエスタンブロットを使用して、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２表面上のＬＤＬＲのレベルに対するＭＡＢ１の効果を測定した。
１．ＭＡＢ１により制御されるＨｅｐＧ２表面上のＬＤＬＲレベルのＦＡＣＳ測定
細胞培地を除去した後、健康なＨｅｐＧ２細胞を、表８に記載の濃度のＰＣＳＫ９及び抗体の存在下で、２４時間及び４８時間、別々にインキュベートした。
２４時間または４８時間のインキュベーション後、各チューブ内の２×１０５個の細胞に対する通常の酵素消化によって細胞を回収した。ＰＥ標識ウサギ抗ｈＬＤＬＲ（１％ＰＢＳＡで２００倍に希釈）を各チューブに加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３００μＬのＰＢＳに再懸濁した。ＰＥ蛍光シグナルをフローサイトメーターで測定した。
２４時間後及び４８時間後の結果をそれぞれ図５及び図６に示した。明らかに、ＭＡＢ１は、細胞表面上のＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲの減少を用量依存的にブロックし、ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲの負の調節を効果的に予防した。
２．ＭＡＢ１によって制御されるＨｅｐＧ２表面上のＬＤＬＲレベルのＷＢ測定
細胞培地を除去した後、ＨｅｐＧ２細胞をＰＣＳＫ９及び抗体とともに、表８に記載の濃度で２４時間インキュベートした。細胞を回収し、溶解し、上清をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで検査した。図７に示すように、標的タンパク質は約１４０ｋＤに現れるはずである。データは、ＭＡＢ１が用量依存的にＬＤＬＲのレベルをアップレギュレートし、ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲの負の調節を効果的に予防できることを示した。
実施例７：ｉｎ ｖｉｖｏでの低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ‐Ｃ）に対するＭＡＢ１の効果
１．マウスにおける血清ＬＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の効果
血清ＬＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の影響を調べるために、マウスを皮下注射用に４群にランダムに割り当てた：
・対照群（生理食塩水、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝８）
・ＭＡＢ１ ６０ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ６０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝６）
・ＭＡＢ１ ９０ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ９０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝６）
・エボロクマブ６０ｍｇ／ｋｇ群（エボロクマブ６０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝４）。
投与前、投与後３日、７日、１０日、１８日、２４日、及び３２日目に、各マウスの血液試料（１５０μｌ）を内眼角静脈から採取し、採取後４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を分離した。その後、血清中のＬＤＬ‐Ｃレベルを、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｍｉｎｄｒａｙ Ｂｉｏ‐Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社から購入したＬＤＬ‐Ｃアッセイキットを用いて、Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ‐１８０自動生化学分析装置で測定した。
図８に示すように、ＭＡＢ１は、マウスにおいて３日目に血清ＬＤＬ‐Ｃレベルを低下させ始めたが、これはエボロクマブと同等の有効性を示しており、また、ＭＡＢ１は、エボロクマブ（１８日間）よりも長い有効期間（３２日間）を示した。
２．サルにおける血清ＬＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の効果
血清ＬＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の効果を調べるために、４匹のカニクイザルを、皮下注射のための２つの群に無作為に割り当てた：
・ＭＡＢ１ ３ ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ３ ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）
・ＭＡＢ１ １８ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ １８ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）。
投与前の血清ＬＤＬ‐Ｃレベルを対照として使用した。各サルの血液試料を、投与前、投与後３０分、５時間、１日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日、及び２１日目に採取し、採取後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を分離した。その後、血清中のＬＤＬ‐Ｃレベルを、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｍｉｎｄｒａｙ Ｂｉｏ‐Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社から購入したＬＤＬ‐Ｃアッセイキットを用いて、Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ‐１８０自動生化学分析装置で測定した。
図９に示すように、３ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇの投与量のＭＡＢ１は、サルの血清ＬＤＬ‐Ｃレベルを低下させ、１８ｍｇ／ｋｇの投与量のＭＡＢ１は、カニクイザルにおいて長い有効期間（１７日間）を示した。
実施例８：ｉｎ ｖｉｖｏでの高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ‐Ｃ）に対するＭＡＢ１の効果
１．マウスにおける血清ＨＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の効果
血清ＨＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の効果を調べるために、マウスを、皮下注射のための５つの群に無作為に割り当てた：
・対照群（生理食塩水、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝８）
・ＭＡＢ１ ６０ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ６０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝６）
・ＭＡＢ１ ９０ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ９０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝６）
・ＭＡＢ１ １２０ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ １２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝３）
・エボロクマブ６０ｍｇ／ｇ群（エボロクマブ６０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝４）。
投与前、投与後３日、７日、１０日、１８日、２４日、及び３２日目に、各マウスの血液試料（１５０μｌ）を内眼角静脈から採取し、採取後、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を単離した。その後、血清中のＨＤＬ‐Ｃレベルを、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｍｉｎｄｒａｙ Ｂｉｏ‐Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社から購入したＨＤＬ‐Ｃアッセイキットを用いて、Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ‐１８０自動生化学分析装置で測定した。
図１０に示すように、ＭＡＢ１は、エボロクマブと同様に、マウスにおいて３日目に血清ＨＤＬ‐Ｃレベルを低下させた。１０日後、血清ＨＤＬ‐Ｃレベルは対照群のものと同じレベルに回復した。
２．サルにおける血清ＨＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の効果
血清ＨＤＬ‐Ｃに対するＭＡＢ１の効果を調べるために、４匹のカニクイザルを、皮下注射のための２つの群に無作為に割り当てた：
・ＭＡＢ１ ３ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）
・ＭＡＢ１ １８ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ １８ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）。
投与前の血清ＨＤＬ‐Ｃレベルを対照として使用した。各サルの血液試料を、投与前、投与後３０分、５時間、１日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日目に採取した。採取後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を単離した。その後、血清中のＨＤＬ‐Ｃレベルを、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｍｉｎｄｒａｙ Ｂｉｏ‐Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社から購入したＨＤＬ‐Ｃアッセイキットを用いて、Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ‐１８０自動生化学分析装置で測定した。
図１１に示すように、３ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇの投与量でのＭＡＢ１は、カニクイザルの血清ＨＤＬ‐Ｃに影響を示さなかった。
実施例９． ｉｎ ｖｉｖｏでのトリグリセリド（ＴＧ）に対するＭＡＢ１の効果
１．マウスにおける血清トリグリセリド（ＴＧ）に対するＭＡＢ１の効果
血清トリグリセリドに対するＭＡＢ１の効果を調べるために、マウスを、皮下注射のための４つの群に無作為に割り当てた：
・対照群（生理食塩水、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝８）
・ＭＡＢ１ ６０ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ６０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝６）
・ＭＡＢ１ ９０ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ９０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝６）
・エボロクマブ６０ｍｇ／ｋｇ群（エボロクマブ６０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇとして投与、ｎ＝４）。
投与前、投与後３日、７日、１０日、１８日、２４日、及び３２日目に、各マウスの血液試料（１５０μｌ）を内眼角静脈から採取し、採取後４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を単離した。その後、血清中のトリグリセリドレベルを、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｍｉｎｄｒａｙ Ｂｉｏ‐Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社から購入したトリグリセリドアッセイキットを用いて、Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ‐１８０自動生化学分析装置で測定した。
図１２に示すように、ＭＡＢ１は、マウスにおいて、高用量（９０ｍｇ／ｋｇ）では３日後に、低用量（６０ｍｇ／ｋｇ）では３２日後に、血清トリグリセリドレベルを上昇させ、他の時点においては対照群に比べて差がなかった。
２．サルにおける血清トリグリセリド（ＴＧ）に対するＭＡＢ１の効果
血清トリグリセリドに対するＭＡＢ１の効果を調べるために、４匹のカニクイザルを、皮下注射のための２つの群に無作為に割り当てた：
・ＭＡＢ１ ３ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ ３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）
・ＭＡＢ１ １８ｍｇ／ｋｇ群（ＭＡＢ１ １８ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）。
投与前の血清トリグリセリドレベルを対照として使用した。各サルの血液試料を、投与前、投与後３０分、５時間、１日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日、及び２１日目に採取した。採取後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を単離した。その後、血清中のトリグリセリドレベルを、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｍｉｎｄｒａｙ Ｂｉｏ‐Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社から購入したトリグリセリドアッセイキットを用いて、Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ‐１８０自動生化学分析装置で測定した。
図１３に示すように、１８ｍｇ／ｋｇの投与量でのＭＡＢ１は、投与後１３日間にわたって、カニクイザルにおける血清トリグリセリドを低下させた。
当業者であれば理解するように、本発明の特定の実施形態を詳細に記載してきたが、これらの詳細は、本発明者らが開示するすべての情報に従って様々な改変及び置換を受ける可能性がある。これらの変更はすべて本発明の範囲に含まれる。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及び任意の均等物によって与えられる。

Claims (16)

  1. ａ．配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（Ｈ）相補決定領域（ＣＤＲ）１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；及び、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに
    ｂ．配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（Ｌ）ＣＤＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；及び、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
    を含む抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体。
  2. ａ．配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び
    ｂ．配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ
    を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  4. ＰＣＳＫ９に対する抗体の結合親和性（ＫＤ）が１０−５Ｍ未満である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  5. マウス以外の種に由来する非ＣＤＲ領域を含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  6. （１）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（Ｈ）相補決定領域（ＨＣＤＲ）１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；及び、配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに
    （２）配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（Ｌ）ＣＤＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；及び、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
    を含む抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体をコードする配列を含む、単離ヌクレオチド。
  7. （１）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ；及び（２）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ；をコードする配列を含む、請求項６に記載の単離ヌクレオチド。
  8. 請求項６または７に記載の単離ヌクレオチドを含む、発現用構築物。
  9. 請求項６もしくは７に記載の単離ヌクレオチド、または請求項８に記載の発現用構築物を含む、発現用細胞株。
  10. 細胞培養物を産生するための適切な条件下で請求項９に記載の細胞株を増殖させること、及び前記細胞培養物からモノクローナル抗体を回収することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体の産生方法。
  11. 請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び検出可能なマーカーとしての結合パートナーを含む複合体。
  12. 請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体、または請求項１１に記載の複合体を含むキット。
  13. 請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体、または請求項１１に記載の複合体と、任意で薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含有する薬学的組合せ。
  14. 高血圧、高コレステロール血症、または高血圧もしくは高コレステロール血症によって引き起こされる心血管疾患の予防及び／または治療のための薬剤の調製において使用する、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体、または請求項１１に記載の複合体。
  15. ａ．ＰＣＳＫ９に結合する、
    ｂ．ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合をブロックする、
    ｃ．細胞表面上のＬＤＬＲの量または血漿中のＬＤＬＲのレベルをアップレギュレートする、
    ｄ．血漿中のＬＤＬもしくはＬＤＬ‐Ｃレベルを低下させる、
    ｅ．血漿中のＬＤＬの蓄積を制限する、
    ｆ．ＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲの分解を阻害する、または
    ｇ．ＬＤＬ及び／またはトリグリセリドの代謝を高める
    ことにおいて使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体または請求項１１に記載の複合体。
  16. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、
    ａ．ＰＣＳＫ９に結合する、
    ｂ．ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの会合をブロックする、
    ｃ．細胞表面上のＬＤＬＲの量または血漿中のＬＤＬＲのレベルをアップレギュレートする、
    ｄ．血漿中のＬＤＬもしくはＬＤＬ‐Ｃレベルを低下させる、
    ｅ．血漿中のＬＤＬの蓄積を制限する、
    ｆ．ＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲの分解を阻害する、または
    ｇ．ＬＤＬ及び／またはトリグリセリドの代謝を高める
    ために、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体または請求項１１に記載の複合体を利用することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
JP2017542863A 2015-02-11 2016-02-04 Ｐｃｓｋ９抗体、及び医薬組成物とその使用 Active JP6731933B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510075778.3A CN105461809B (zh) 2015-02-11 2015-02-11 Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途
CN201510075778.3 2015-02-11
PCT/CN2016/073492 WO2016127912A1 (zh) 2015-02-11 2016-02-04 Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018509894A JP2018509894A (ja) 2018-04-12
JP6731933B2 true JP6731933B2 (ja) 2020-07-29

Family

ID=55600009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017542863A Active JP6731933B2 (ja) 2015-02-11 2016-02-04 Ｐｃｓｋ９抗体、及び医薬組成物とその使用

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10670604B2 (ja)
JP (1) JP6731933B2 (ja)
KR (1) KR102531577B1 (ja)
CN (1) CN105461809B (ja)
WO (1) WO2016127912A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105461809B (zh) 2015-02-11 2018-10-12 康融东方（广东）医药有限公司 Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途
CN107474140B (zh) 2016-06-08 2022-06-03 常州博嘉生物医药科技有限公司 Pcsk9特异性的结合蛋白mv072及其应用
KR20190049866A (ko) 2016-09-20 2019-05-09 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 신규한 항-ｐｃｓｋ９ 항체
CN108802378A (zh) * 2018-05-31 2018-11-13 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一种试纸条的质控线包被溶液以及用此溶液制备的试纸条
US20230312750A1 (en) * 2019-11-18 2023-10-05 Ad Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-pcsk9 antibody and use thereof
CN112710837B (zh) * 2020-11-03 2022-05-17 浙江大学 一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法
WO2024002357A1 (zh) * 2022-06-30 2024-01-04 康融东方（广东）医药有限公司 抗pcsk9抗体的制剂及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JP5588175B2 (ja) * 2006-11-07 2014-09-10 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｐｃｓｋ９のアンタゴニスト
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
TWI516501B (zh) * 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
JO3672B1 (ar) * 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
KR20130118925A (ko) * 2010-12-22 2013-10-30 제넨테크, 인크. 항-pcsk9 항체 및 사용 방법
MX2014014830A (es) * 2012-06-15 2015-05-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso.
CN105461809B (zh) 2015-02-11 2018-10-12 康融东方（广东）医药有限公司 Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018509894A (ja) 2018-04-12
US20180024131A1 (en) 2018-01-25
US10670604B2 (en) 2020-06-02
US11402383B2 (en) 2022-08-02
CN105461809B (zh) 2018-10-12
US20200319185A1 (en) 2020-10-08
KR20170110681A (ko) 2017-10-11
WO2016127912A1 (zh) 2016-08-18
CN105461809A (zh) 2016-04-06
KR102531577B1 (ko) 2023-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230064544A1 (en) Anti-ctla4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses
JP6731933B2 (ja) Ｐｃｓｋ９抗体、及び医薬組成物とその使用
KR102503084B1 (ko) 항-ctla4 및 항-pd-1 이작용성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도
TWI845767B (zh) 抗人Claudin18.2抗體及其應用
WO2019062832A1 (zh) Tigit抗体、其抗原结合片段及医药用途
JP2021526022A (ja) 抗インターロイキン１７ａ抗体、医薬組成物、およびその使用
WO2019091449A1 (zh) Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途
KR20210093255A (ko) 항-cd73 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 적용
EP3922647A1 (en) Anti-pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
JP2023126929A (ja) ヒトｉｌ４ｒａに対する抗体及びその使用
CN115697491A (zh) Sars-cov-2抗体及其选择和使用方法
JP2023134497A (ja) Ｍｕｃ１７及びｃｄ３に向けられる二重特異性抗体コンストラクト
WO2014194274A2 (en) Oncostatin m receptor antigen binding proteins
CN114478769B (zh) 抗tigit抗体、其药物组合物及用途
CN111196849B (zh) 抗硬骨素抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP2023510787A (ja) 抗ａｎｇｐｔｌ３抗体及びその応用
JP2024514246A (ja) Ｃｌｄｎ１８．２抗原結合タンパク質およびその使用
KR20200116967A (ko) IL-4Rα 항체 및 그 용도
KR20210046024A (ko) 항-IL-1β 항체, 이의 약학적 조성물 및 용도
JP2019509254A (ja) Ｐｃｓｋ９抗体、その抗原結合フラグメント及び医薬用途
KR20220061998A (ko) Tfpi를 표적화하는 단일클론 항체
RU2807484C2 (ru) Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и его фармацевтическое применение
RU2819228C2 (ru) Антитело против фактора роста соединительной ткани и его применение
RU2819228C9 (ru) Антитело против фактора роста соединительной ткани и его применение
WO2024022478A1 (zh) 结合大麻素受体cb1的抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171017

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20181220

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20191205

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200227

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20200615

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200707

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6731933

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250