BR112020001052A2 - métodos e composições para imunizações heterólogas com reprna - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para induzir uma resposta imunológica contra um imunógeno em humanos. A resposta imunológica induzida é obtida por administração de uma combinação heteróloga de dose inicial-reforço de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) e um vetor adenoviral. As composições e os métodos podem ser usados para proporcionar uma imunidade protetora contra uma doença, tal como uma infecção viral ou um câncer, em humanos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO-

DOS E COMPOSIÇÕES PARA IMUNIZAÇÕES HETERÓLOGAS COM REPRNA". Referência à Listagem de Sequências Apresentada em Formato Ele- trônico

[001] Este pedido contém uma listagem de sequências, que foi apresentada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de se- quências no formato ASCII com o nome de arquivo "sequence_listing", criado em 26 de julho de 2017, e tendo um tamanho de cerca de

23.045 bytes. A listagem de sequências apresentada simultaneamen- te via EFS-Web faz parte do relatório descritivo e está aqui incorpora- da em sua íntegra a título de referência. Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se a métodos e composições pa- ra induzir uma resposta imunológica em um indivíduo humano. Em particular, a resposta imunológica induzida é obtida pela administração de uma combinação de dose inicial-reforço heterólogos de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) e um vetor adenoviral. Os métodos e as composições proporcionam uma forte indução de respostas imunológicas humoral e celular contra um imunógeno em um indivíduo humano, que podem ser usados para oferecer um trata- mento e/ou uma proteção eficazes contra uma doença, tal como um tumor ou uma doença infecciosa no indivíduo humano. Antecedentes da Invenção

[003] Vacinas podem ser usadas para proporcionar proteção imu- nológica contra patógenos, tais como vírus, bactérias, fungos, ou pro- tozoários, assim como contra cânceres.

[004] As doenças infecciosas são a segunda principal causa de morte ao redor do mundo depois de doenças cardiovasculares, mas a principal causa de morte em bebês e crianças (Lee and Nguyen, 2015,

Immune Network, 15(2):51-7). A vacinação é a ferramenta mais efici- ente para prevenir uma variedade de doenças infecciosas. O objetivo da vacinação é gerar uma resposta imunológica específica para o pa- tógeno, proporcionando uma proteção duradoura contra infecções. Apesar do significativo sucesso das vacinas, o desenvolvimento de vacinas seguras e fortes continua sendo necessário devido ao surgi- mento de novos patógenos, o reaparecimento de patógenos antigos e a proteção subideal conferida pelas vacinas existentes. Doenças im- portantes que surgiram ou reapareceram recentemente incluem: sín- drome respiratória aguda severa (SARS) em 2003, a pandemia de in- fluenza H1N1 em 2009, e o vírus Ebola em 2014. Como consequência, faz-se necessário o desenvolvimento de vacinas novas e eficazes con- tra as doenças emergentes.

[005] Câncer é uma das doenças que mais matam no mundo oci- dental, com câncer de pulmão, de mama, de próstata, e colorretal sendo os mais comuns (Butterfield, 2015, BMJ, 350:h988). Encontram- se disponíveis diversas abordagens clínicas para o tratamento de cân- cer, que incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia, e tratamento com inibidores da via de sinalização de moléculas pequenas. Já foi demonstrado que cada uma destas abordagens tradicionais modulam a imunidade antitumoral aumentando a expressão de antígenos tumo- rais no tumor ou provocando a liberação de antígenos de células tumo- rais moribundas e promovendo imunidade antitumoral para benefício terapêutico. A imunoterapia é um campo promissor que oferece méto- dos alternativos para o tratamento de câncer. As vacinas contra câncer são desenhadas para promover respostas imunológicas específicas para o tumor, particularmente células T CD8+ citotóxicas que são es- pecíficas para antígenos tumorais. A eficácia clínica precisa ser melho- rada para que as vacinas contra câncer se tornem uma alternativa vá- lida ou um complemento para os tratamentos tradicionais contra cân-

cer. Já foram feitos até o momento esforços consideráveis para enten- der melhor os requisitos fundamentais de vacinas clinicamente efica- zes contra câncer. Dados recentes salientam que requisitos importan- tes, entre outros, são (1) o uso de imunógenos multiepítopos, possi- velmente derivados de diferentes antígenos tumorais; (2) a seeção de adjuvantes eficazes; (3) a associação de vacinas contra câncer com agentes capazes de neutralizar o meio regulador no microambiente do tumor; e (4) a necessidade de escolher a formulação definitiva e o es- quema de uma vacina depois de testes preliminares precisos compa- rando formulações de diferentes antígenos (Fenoglio et al., 2013, Hum Vaccin Immunother, (12):2543-7). É necessária uma nova geração de vacinas contra câncer, dotadas de eficácia imunológica e clínica, que atendam esses requisitos.

[006] O potencial de vacinas à base de ácidos nucleicos vem sen- do estudado há muitos anos (Vogel e Sarver N, 1995, Clin Microbiol Rev., 8(3):406-10). Atualmente estão sendo realizados testes clínicos que usam vacinas à base de DNA ou vacinas à base de RNA, incluin- do testes clínicos de vacinas à base de mRNA contra alvos virais, tal como o vírus da raiva (vide, por exemplo, world wide web em clinical- trials.gov; Alberer et al., The Lancet, publicado online em julho de 2017, world wide web em dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31665-3; DeFrancesco et al., Nature Biotechnology, 35: 193-197).

[007] Uma geração seguinte de vacinas à base de mRNA faz uso de RNA autorreplicante (repRNA), que se baseia no mecanismo de auto-replicação de vírus de RNA de sentido positivo tais como alfaví- rus (vide, por exemplo, Bogers et al., 2015, J Infect Dis., 211(6):947- 55). Tais repRNAs induzem a expressão transitória e de alto nível de antígenos em uma ampla gama de tecidos em um hospedeiro, e são capazes de agir tanto em células em divisão como em células não em divisão.

[008] Os alfavírus pertencem à família Togaviridae, e eles possuem genomas de RNA linear, de cordão simples e sentido positivo compre- endendo dois segmentos funcionais, cada um com seu próprio promo- tor. O primeiro segmento, localizado na extremidade 5’ do genoma, codifica proteínas não estruturais que compõem uma replicase de au- tomontagem que sintetiza o genoma do RNA de cordão negativo, o genoma do RNA de cordão positivo, e RNA subgenômico. O segundo segmento codifica as proteínas de envelope e capsídicas estruturais. RNAs autorreplicantes (repRNAs), também denominados réplicons de alfavírus, são ácidos nucleicos derivados do vírus de comprimento in- tegral no qual os genes codificando as proteínas estruturais foram re- movidos para que o réplicon seja capaz de replicar em uma células, mas incapas de se propagar como um vírus. No caso de sistemas de expressão de antígeno à base de repRNA, os genes codificando os antígenos podem ser inseridos a jusante do promotor subgenômico, no lugar dos genes codificando as proteínas estruturais. Os repRNAs po- dem ser distribuídos para uma célula como uma molécula de DNA, a partir da qual um repRNA é lançado, embalado em uma partícula de réplicon viral (VRP), ou como uma molécula de RNA nu modificado ou não modificado.

[009] A pesquisa sobre vacinas à base de repRNA ainda se en- contra em fases pré-clínicas, mas se espera que os testes clínicos comecem dentro de alguns anos. Estudos já mostraram que combinar repRNA lançado de DNA ou embalado em uma partícula de réplicon viral (VRP) com vetores adenovirais em vacinações heterólogas com dose inicial-reforço estimula respostas imunológicas (vide, por exem- plo, o documento WO2005046621; Zhao et al., 2009, Vet Immunol Immunopathol., 131:158-166; e Näslund et al., 2007, J Immunol, 178:6761-6769). Além disso, já foi demonstrado que respostas humo- rais induzidas por uma vacina à base de repRNA podem ser reforça-

das com uma vacina à base de proteínas (Bogers et al., Id.).

[0010] No entanto, a vacinação heteróloga usando um vetor ade- noviral em combinação com um plasmídio de DNA a partir do qual um repRNA é lançado apresenta vários desafios. Por exemplo, os plasmí- dios de DNA estão associados a problemas de segurança tais como contaminações resultantes da produção bacteriana, risco de integra- ção do DNA no genoma hospedeiro e uma falta de expressão autolimi- tantes dos antígenos. Por outro lado, uma vacinação heteróloga usan- do um vetor adenoviral em combinação com um repRNA lançado a partir de uma VRP requer uma linhagem celular de embalagem para produzir VRPs, que é um processo caro e demorado com desafios de produção complexos. O uso de uma vacina à base proteínas em com- binação com um repRNA apresenta a limitação de que vacinas à base de proteínas requerem uma produção baseada em células cara e de- morada da proteína com o risco de contaminação. Além disso, a maio- ria das vacinas à base de proteínas apresenta problemas de estabili- dade e requer uma cadeia fria, e, em geral, as vacinas à base de pro- teínas são limitadas à estimulação de respostas imunológicas humo- rais.

[0011] Por conseguinte, existe no estado da técnica uma necessi- dade de melhorar as vacinas baseadas na tecnologia de repRNA que podem ser usads para induzir imunidade humoral e celular protetora contra imunógenos, sobretudo quando é necessária uma resposta rá- pida em caso de um surto pandêmico. Tais vacinas seriam de custo reduzido e teriam efeitos adversos mínimos. Elas seriam ainda preferi- velmente eficazes contra uma ampla diversidade de antígenos. Breve Sumário da Invenção

[0012] A invenção satisfaz esta necessidade ao apesentar esque- mas de imunização heteróloga com dose inicial-reforço usando duas plataformas de vacina diferentes, (i) mRNA autorreplicante (repRNA)

transcrito in vitro (IVT), e (ii) uma vacina à base de vetor adenoviral.

[0013] Foi constatado que os problemas associados ao uso de vac- inas à base de DNA, vacinas embaladas em VRP, e vacinas à base proteínas, alguns deles estando discutidos acima, podem ser su- perados pelo uso da produção in vitro de repRNA, que é um produto livre de DNA que pode ser produzido por um processo de produção rápido, genérico e livre de células (Kallen and Thess, 2014, Ther Adv Vaccines, 2(1) 10-31). Os inventores descobriram de forma inesperada que combinar repRNA IVT com um vetor adenoviral em um esquema de imunização heteróloga com dose inicial-reforço resulta em respos- tas imunológicas humoral e celular induzidas que são mais fortes que aquelas resultantes de imunizações únicas ou homólogas com dose inicial-reforço com vetor adenoviral ou com repRNA IVT. A invenção pode, portanto, ser usada para gerar vacinas altamente potentes con- tra uma ampla gama de alvos.

[0014] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a um método de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo humano pela administração heteróloga com dose inicial-reforço compreendendo uma combinação de um repRNA IVT e um vetor adenoviral.

[0015] Em certas modalidades da invenção, as combinações hete- rólogas de dose inicial-reforço de um repRNA IVT e um vetor adenovi- ral geram uma resposta imunológica induzida a uma proteína antigêni- ca ou um polipeptídio imunogênico da mesma em um indivíduo huma- no. A proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma pode ser qualquer proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma. Por exemplo, a proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma pode ser derivada de um patógeno, por exemplo, um virus, uma bactéria, um fungo, um protozoário, ou um câncer, por exemplo, um tumor.

[0016] Por conseguinte, um aspecto geral da invenção refere-se a um método de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo humano com necessidade do mesmo, o método compreendendo: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) compreen- dendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, em que uma das composições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço, para assim obter uma resposta imunológica induzida no indivíduo hu- mano, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas comparti- lham pelo menos um determinante antigênico.

[0017] Um outro aspecto geral da invenção refere-se a uma com- binação para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo hu- mano, compreendendo: a. uma primeira composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. uma segunda composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína anti- gênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um car-

reador farmaceuticamente aceitável, em que uma das composições é administrada ao indivíduo humano para introduzir a resposta imunológica e a outra composição é admi- nistrada ao indivíduo humano para reforçar a resposta imunológica, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compartilham pelo menos um determinante antigênico.

[0018] Um outro aspecto geral da invenção refere-se ao uso de uma combinação de acordo com uma modalidade da invenção para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo humano.

[0019] Nas modalidades preferidas da invenção, a composição compreendendo o repRNA IVT é uma composição de dose inicial e a composição compreendendo o vetor adenoviral é uma composição de reforço.

[0020] Nas modalidades preferidas da invenção, a resposta imuno- lógica induzida compreende uma resposta imunológica humoral indu- zida, ou induzida por anticorpos, contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e segunda proteínas antigêni- cas no indivíduo humano. Tal resposta pode, por exemplo, ser caracte- rizada pela presença de uma proporção elevada de indivíduos respon- sivos, tal como mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% dos in- divíduos testados, segundo determinado por um ensaio imunoabsor- vente ligado a enzimas (ELISA).

[0021] Nas modalidades preferidas da invenção, a resposta imuno- lógica induzida compreende uma resposta imunológica induzida por células contra o pelo menos um determinante antigênico compartilha- do pelas primeira e segunda proteínas antigênicas no indivíduo huma- no.

[0022] Em uma modalidade da invenção, a resposta imunológica melhorada gerada pelo método compreende uma resposta de células T CD8+ melhorada contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e segunda proteínas antigênicas no indi- víduo humano. Tal resposta pode, por exemplo, ser caracterizada pela presença de uma proporção elevada de indivíduos responsivos CD8+, tal como mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% dos indivíduos testados, segundo determinado por um ensaio de imunocoloração li- gado a enzimas (ELISPOT) ou por um ensaio de coloração de citocina intracelular (ICS). Em uma outra modalidade da invenção, a resposta de células T CD8+ melhorada gerada pelo método compreende um aumento ou indução de células T CD8+ polifuncionais específicas para o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primei- ra e segunda proteínas antigênicas. Tais células T CD8+ polifuncionais expressam mais de uma citocina, tal como dois ou mais de IFN-gama, IL-2 e TNF-alfa.

[0023] Em uma modalidade da invenção, a resposta imunológica melhorada gerada pelo método compreende uma resposta de células T CD4+ melhorada contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e segunda proteínas antigênicas no indi- víduo humano. Tal resposta pode, por exemplo, ser caracterizada pela presença de uma proporção elevada de indivíduos responsivos CD4+, tal como mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% dos indivíduos testados, segundo determinado por um ensaio ELISPOT ou por um ensaio ICS. Em uma outra modalidade da invenção, a resposta de cé- lulas T CD4+ melhorada gerado pelo método compreende um aumen- to ou indução de células T CD4+ polifuncionais específicas para o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e se- gunda proteínas antigênicas. Tais células T CD4+ polifuncionais ex- pressam mais de uma citocina, tal como dois ou mais de IFN-gama, IL- 2 e TNF-alfa.

[0024] Nas modalidades preferidas da invenção, a resposta imuno- lógica induzida compreende uma resposta induzida por anticorpos,

uma resposta induzida por células T CD4+, e uma resposta induzida por células T CD8+, contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e segunda proteínas antigênicas no indi- víduo humano.

[0025] Nas modalidades preferidas, o repRNA IVT é um repRNA do vírus da encefalite equina venezuelana (VEE). Nas modalidades preferidas, o esqueleto de repRNA IVT é um daqueles descritos por Frolov et al. (1999, J Virol., 73(5):3854-65). Nas modalidades preferi- das, o esqueleto de repRNA IVT é a sequência de esqueleto de SEQ ID NO: 3 sem o inserto de proteína RSV pre-F.

[0026] Nas modalidades preferidas, o vetor adenoviral é um vetor de adenovírus humano recombinante sorotipo 26 (Ad26) ou um vetor de adenovírus humano recombinante sorotipo 35 (Ad35).

[0027] Nas modalidades da invenção, a composição de reforço é administrada 1-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 2-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 4-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 1 semana depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra mo- dalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 2 se- manas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de reforço é admi- nistrada 4 semanas depois de a composição de dose inicial ser admi- nistrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de re- forço é administrada 8 semanas depois de a composição de dose ini- cial ser administrada. Em outras modalidades da invenção, a compo- sição de reforço é administrada 6, 10, 12, 14, 16, 20, 24, ou mais se-

manas depois de a composição de dose inicial ser administrada.

[0028] Em uma modalidade da invenção, a primeira ou a segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma é deri- vada de um patógeno, tal como um vírus, uma bactéria, um fungo, ou um protozoário. Nas modalidades preferidas, a primeira ou a segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma é deri- vada de um vírus. Em uma outra modalidade da invenção, a proteína antigênica é derivada de um câncer. Nas modalidades preferidas, a primeira ou a segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imuno- gênico da mesma é derivada de um tumor.

[0029] Em uma modalidade da invenção, o primeiro polinucleotí- deo e o segundo polinucleotídeo codificam a mesma proteína antigêni- ca ou um polipeptídio imunogênico da mesma. Em uma outra modali- dade da invenção, o primeiro polinucleotídeo e o segundo polinucleotí- deo codificam polipeptídios ou epítopos imunogênicos diferentes da mesma proteína antigênica. Em ainda uma outra modalidade da in- venção, o primeiro polinucleotídeo e o segundo polinucleotídeo codifi- cam proteínas antigênicas diferentes, mas relacionadas, ou um poli- peptídio imunogênico da mesma. Por exemplo, as proteínas antigêni- cas relacionadas podem ser proteínas substancialmente similares de- rivadas da mesma proteína antigênica, ou proteínas antigênicas dife- rentes derivadas do mesmo patógeno ou tumor.

[0030] Nas modalidades preferidas, a primeira e a segunda proteí- nas antigênicas são idênticas ou substancialmente idênticas.

[0031] Em uma modalidade da invenção, um método da invenção proporciona uma imunidade protetora ao indivíduo humano contra uma doença associada à proteína antigênica, tal como um tumor ou uma doença infecciosa. Em uma modalidade preferida, a combinação dose inicial-reforço de repRNA IVT e vetor adenoviral induz uma resposta imunológica protetora contra um tumor em um indivíduo humano. Em uma outra modalidade preferida, a combinação de dose inicial-reforço de repRNA IVT e vetor adenoviral induz uma resposta imunológica contra um patógeno em um indivíduo humano.

[0032] Nas modalidades preferidas, a primeira ou a segunda prote- ína antigênica é derivada de uma proteína F pré-fusão do vírus sincici- al respiratório (RSV-preF), e a primeira e a segunda proteínas antigê- nicas são idênticas ou substancialmente idênticas.

[0033] Nas modalidades preferidas, a primeira e a segunda proteí- nas antigênicas compreendem independentemente uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, polipeptídios imunogênicos das mesmas, e combina- ções das mesmas.

[0034] Nas modalidades preferidas, o repRNA IVT compreende um ácido nucleico codificando uma proteína antigênica derivada de uma proteína RSV-preF. De preferência, o repRNA IVT um ácido nu- cleico codificando uma proteína antigênica tendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídio imuno- gênico ou determinante antigênico do mesmo. Mais preferivelmente, o repRNA IVT compreende a sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 3. Breve Descrição dos Desenhos

[0035] O resumo acima, assim como a descrição detalhada que se segue da invenção, serão mais bem entendidos quando lidos junto com os desenhos em anexo. Deve ficar entendido que a invenção não está limitada às modalidades exatas mostradas nos desenhos.

[0036] Nos desenhos:

[0037] A Figura 1 mostra uma representação esquemática de um repRNA do vírus VEE codificando uma proteína RSV-preF;

[0038] A Figura 2 mostra um desenho experimental de um estudo de imunização homóloga com repRNA IVT no qual a análise foi reali-

zada por ELISA;

[0039] A Figura 3 mostra as respostas imunológicas humorais es- pecíficas para a proteína RSV-preF de um estudo de imunização ho- móloga com repRNA IVT, segundo avaliado por ELISA;

[0040] A Figura 4 mostra um desenho experimental de um estudo de imunização homóloga com repRNA IVT no qual a análise foi reali- zada por ELISPOT;

[0041] A Figura 5 mostra as respostas de células T específicas para a proteína RSV-preF de um estudo de imunização homóloga com repRNA IVT, segundo avaliado por um ensaio IFN-γ ELISPOT usando PBMCs e o peptídio ativador de CTL KYKNAVTEL de RSV-F;

[0042] A Figura 6 mostra um desenho experimental de um estudo de imunização heteróloga com repRNA IVT e vetor adenoviral no qual a análise foi realizada por ELISA e ELISPOT;

[0043] A Figura 7 mostra as respostas imunológicas humorais es- pecíficas para a proteína RSV-preF de um estudo de imunização hete- rólga com repRNA IVT e vetor adenoviral, segundo avaliado por ELI- SA; e

[0044] A Figura 8 mostra as respostas imunológicas de células T específicas para a proteína RSV-preF de um estudo de imunização heterólga com repRNA IVT e vetor adenoviral, segundo avaliado por um ensaio IFN-γ ELISPOT usando esplenócitos. Descrição Detalhada da Invenção

[0045] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou des- critos na seção antecedentes e em todo o relatório descritivo; cada uma dessas referências está aqui incorporada em sua íntegra a título de referência. A discussão de documentos, leis, materiais, dispositivos, artigos, entre outros, que estão incluídos no presente relatório descriti- vo tem a finalidade de oferecer contexto para a invenção. Tal discus- são não representa o reconhecimento de toda ou qualquer dessas ma-

térias façam parte do estado da técnica no que diz respeito a qualquer das invenções descritas ou reivindicadas.

[0046] A menos que definido em contrário, todos os termos técni- cos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido pelo especialista na técnica à qual a in- venção pertence. Ao contrário, certos termos usados neste pedido têm o significado apresentado no relatório descritivo. Todas as patentes, pedidos de patente publicados e publicações citados neste pedido es- tão aqui incorporados a título de referência como se totalmente descri- tos. Deve-se observar que, conforme usado neste pedido e nas reivin- dicações anexas, as formas no singular "um", "uma", e "o/a" incluem os referentes no plural, a menos que nitidamente indicado em contrário pelo contexto.

[0047] A menos que indicado em contrário, fica entendido que o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos refere-se a qualquer elemento da série. Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando apenas experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descrita neste pedido. Tais equivalentes são considerados abrangidos pela invenção.

[0048] Em todo este relatório descritivo e nas reivindicações que se seguem, fica entendido que, a menos que o contexto exija o contrá- rio, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", subentendem a inclusão de um inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas mencionadas. Quando usado neste relató- rio, o termo "compreendendo" pode ser substituído pelo termo "con- tendo" ou "incluindo" ou às vezes, quando usado neste relatório, pelo termo "tendo". Quando usado neste relatório, "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado no elemen- to reivindicado. Quando usado neste relatório, "consistindo essencial-

mente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam material- mente as características básicas e novas da reivindicação. Em cada caso, neste pedido, qualquer um dos termos "compreendendo", "con- sistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituído por qualquer dos outros dois termos.

[0049] Conforme usado neste pedido, o termo conjunto "e/ou" en- tre vários elementos enumerados abrange tanto a opção individual quanto a combinada. Por exemplo, em que dois elementos são unidos por "e/ou", uma primeira opção refere-se à aplicação do primeiro ele- mento sem o segundo. Uma segunda opção refere-se à aplicação do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção refere-se à aplicação do primeiro e do segundo elementos juntos. Fica entendido que qualquer uma dessas opções se enquadra na definição, e, portan- to, satisfaz os requisitos do termo "e/ou" conforme usado neste pedido. Fica entendido que a aplicação simultânea de mais de uma opção também se esquadra na definição, e, portanto, satisfaz os requisitos do termo "e/ou".

[0050] Conforme usado neste pedido, "indivíduo" significa qual- quer animal, de preferência um mamífero, mais preferivelmente um ser humano, que será ou fora tratado por um método de acordo com uma modalidade da invenção. O termo "mamífero", conforme usado neste pedido, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, porém sem limitação, vacas, cavalos, carneiros, porcos, gatos, cachor- ros, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, macacos, se- res humanos, etc., mais preferivelmente um humano.

[0051] A imunidade protetora depende tanto da resposta imunoló- gica inata quando da adaptativa. Conforme usado neste pedido, o ter- mo "resposta imunológica" refere-se ao desenvolvimento em um indi- víduo de uma resposta imunológica humoral e/ou celular a um antíge- no que fora administrado ao indivíduo pelos métodos da invenção.

Respostas imunológicas "humorais" referem-se à produção de anticor- pos pelas células B, e uma resposta imunológica "celular" refere-se à atividade citotóxica de células T efetoras CD8+ e células T CD4+, também conhecidas como células T auxiliares. As células T CD4+ de- sempenham um papel essencial tanto na resposta imunológica humo- ral quanto na celular.

[0052] Conforme usado neste pedido, o termo "induzindo" ou "es- timulando" e seus correspondentes referem-se a qualquer aumento mensurável na atividade celular. Indução de uma resposta imunológica pode incluir, por exemplo, ativação, proliferação, ou maturação de uma população de células imunes, aumentando a produção de uma citoci- na, e/ou outro indicador de função imune aumentada. Em certas mo- dalidades, a indução de uma resposta imunológica pode incluir o au- mento da proliferaçã de células B, a produção de anticorpos antígeno- específicos, o aumento da proliferação de células T antígeno- específicas, a melhora a apresentação de antígenos a células dendríti- cas e/ou um aumento da expressão de certas citocinas, quimiocinas e marcadores coestimuladores.

[0053] Conforme usado neste pedido, o termo "resposta induzida por anticorpos" ou "resposta imunológica humoral induzida" refere-se a uma resposta a um anticorpo em um indivíduo humano que recebera uma combinação de dose inicial-reforço de repRNA e vetor adenoviri- ral de acordo com a invenção, que é aumentada por um fator de pelo menos 1,5, 2, 2,5, ou mais em relação à resposta imunológica corres- pondente observado no indivíduo humano que recebera uma imuniza- ção homóloga com dose inicial-reforço apenas de repRNA ou de vetor adenoviral em dosagens equiparáveis, usando o mesmo princípio de dose inicial-reforço.

[0054] Conforme usado neste pedido, o termo "resposta imunoló- gica celular induzida" refere-se a uma resposta imunológica celular em um indivíduo humano que recebera uma combinação de dose inicial- reforço de repRNA e de vetor adenoviriral de acordo com a invenção, que é aumentada por um fator de pelo menos 1,5, 2, 2,5, ou mais em relação à resposta imunológica correspondente observado no indiví- duo humano que recebera uma imunização homóloga com dose inici- al-reforço apenas de repRNA ou de vetor adenoviral em dosagens equiparáveis, usando o mesmo princípio de dose inicial-reforço.

[0055] Conforme usado neste pedido, o termo "imunidade proteto- ra" ou "resposta imunológica protetora" significa que o sujeito vacinado é capaz de controlar uma infecção ou uma doença relacionada com uma proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma contra a qual a vacinação foi feita. Usualmente, o sujeito que desen- volveu uma resposta imunológica protetora desenvolve sintomas clíni- cos apenas leves a moderados ou não desenvolve sintoma algum. Usualmente, um indivíduo que tem uma resposta imunológica proteto- ra ou imunidade protetora contra uma certa proteína antigênica não morrerá em decorrência de uma infecção ou doença relacionada com a proteína antigênica.

[0056] Conforme usado neste pedido, o termo "quantidade imuno- logicamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um princípio ou componente ativo que produz a resposta biológica ou médica desejada em um indivíduo. Uma quantidade imunologicamente eficaz pode ser determinada empiricamente e rotineiramente, em relação ao propósito estabelecido. Por exemplo, ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. A seleção de uma dose eficaz particular pode ser determinada (por exemplo, por meio de ensaios clínicos) pelos especialistas na técnica com base na consideração de diversos fatores, que incluem a doenç a ser tratada ou prevenida, os sintomas envolvidos, a massa corporal do paciente, a condição imunológica do paciente e outros fatores conhe-

cidos pelo especialista na técnica. A dose exata a ser usada na formu- lação também vai depender da via de administração, e da severidade da doença, e deve ser decidida a critério do profissional e das circuns- tâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de dose-resposta derivados de sistemas de teste in vitro ou com modelos animais.

[0057] Conforme usado neste pedido, o termo "transcrito in vitro" refere-se a um método no qual RNA é sintetizado enzimaticamente in vitro de uma forma livre de células, por exemplo, com o uso de extra- tos celulares ou enzimas isoladas.

[0058] Conforme usado neste pedido, o termo "RNA autorreplican- te", "replicante de RNA autorreplicante", ou "repRNA" ou "replicante de RNA" refere-se a uma molécula de RNA expressando genes de proteínas não estruturais de alfavírus de modo que ele pode diecionar sua própria amplificação de replicação em uma célula, sem produzir progênie do vírus. Por exemplo, um repRNA pode compreender se- quências de reconhecimento de replicação de alfavírus 5’ e 3’, se- quências codificadoras para proteínas não estruturais de alfavírus, um gene heterólogo codificando um antígeno e os meios para expressão do antígeno, e um trato de poliadenilação. Um repRNA da invenção pode conter uma ou mais mutações, tais como mutações atenuantes ou mutações que melhoram a funcionalidade. Um repRNA da invenção pode conter nucleobases modificadas, tais como aquelas descritas no documento US2011/0300205, cujo conteúdo relevante está aqui incor- porado a título de referência. Por exemplo, os repRNAs da invenção podem conter nucleosídeos modificados que incluem, porém sem limi- tação, m1G (1-metilguanosina), m2G (N2-metilguanosina), m7G (7- metilguanosina), Gm (2’-O-metilguanosina), m22G (N2,N2-dimetilgua- nosina), m2Gm (N2,2’-O-dimetilguanosina), e m22Gm (N2,N2,2’-O- trimetilguanosina.

[0059] Conforme usado neste pedido, o termo "proteína antigêni- ca" refere-se a uma proteína que é capaz de estimular uma resposta imunológica em verterbrado. Conforme usado neste pedido, o termo "polipeptídio imunogênico da mesma" ou "fragmento imunogênico da mesma" refere-se a um fragmento de uma proteína antigênica que conserva a capacidade de estimular uma resposta imunológica. Con- forme usado neste pedido, o termo "determinante antigênico" ou "epí- topo" refere-se à região de uma proteína antigênica que reage especi- ficamente com um anticorpo.

[0060] Conforme usado neste pedido, o termo "carreador" refere- se a qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, estabilizantes, solubilizante, óleo, lipídio, vesícula contendo lipídios, microesfera, en- capsulação lipossômica, ou outro material bastante conhecido no es- tado da técnica para uso em formulações farmacêuticas. Ficará enten- dido que as características do carreador, excipiente ou diluente vão depender da via de administração para uma aplicação particular. Con- forme usado neste pedido, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se um material não tóxico que não interfere na eficá- cia de uma composição de acordo com a invenção ou na atividade bio- lógica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com modalidades específicas, tendo em vista a presente descrição, qual- quer carreador farmaceuticamente aceitável adequado para uso em uma composição farmacêutica à base de repRNA IVT ou à base de um vetor adenoviral pode ser usado na invenção. Excipientes adequa- dos incluem, porém sem limitação, água estéril, solução salina, dextro- se, glicerol, etanol, entre outros, e combinações dos mesmos, assim como estabilizantes, por exemplo, albumina sérica humana (HSA) ou outras proteínas e açúcares redutores adequados.

[0061] Conforme usado neste pedido, o termo "composição de do- se inicial", "imunização com dose inicial" ou "imunização primária" refe-

re-se à estimulação antigênica primária por meio de uma primeira composição da invenção. Especificamente, o termo "introduzir" ou "po- tencializar" uma resposta imunológica, conforme usado neste pedido, refere-se a uma primeira imunização por meio de um antígeno que in- duz uma resposta imunológica ao antígeno desejado e revoca um ní- vel mais elevado de resposta imunológica ao antígeno desejado sub- sequente à reimunização com o mesmo antígeno. Conforme usado neste pedido, o termo "composição de reforço", "imunização de refor- ço" ou "imunização com dose de reforço" refere-se a uma imunização adicional administrada, ou eficaz, em um mamífero depois da imuniza- ção primária. Especificamente, o termo "reforço" de uma resposta imu- nológica, conforme usado neste pedido, refere-se à administração de uma composição que distribui o mesmo antígeno codificado na imuni- zação primária.

[0062] Conforme usado neste pedido, o termo "patógeno" refere- se a um agente infeccioso tal como um vírus, uma bactéria, um fungo, um paratita, ou um príon que causa doença em seu hospedeiro.

[0063] Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídi- cas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou possuem uma percentagem específica de resíduos aminoacídicos ou nucleotídeos que são os mesmos, quando compara- dos e alinhados para correspondência máxima, segundo medido com a ajuda de algoritmos de comparação de sequências que são tradicio- nais e conhecidos pelos especialistas na técnica.

[0064] Conforme usado neste pedido, o termo "substancialmente idêntico" em relação a uma sequência de polipeptídios de um antígeno refere-se a um polipeptídio do antígeno tendo pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequên-

cia com a sequência polipeptídica de referência. O termo "substanci- almente idêntico" em relação a uma sequência de ácidos nucleicos refere-se a uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com a sequência de ácidos nucleicos de referência.

[0065] Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídios são substancialmente idênticos é que o po- lipeptídio codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reativo cruzado com o polipeptídio codificado pelo segundo ácido nu- cleico. Dessa forma, um polipeptídio é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídio, por exemplo, em que os dois pep- tídios diferem apenas por substituições conservativas. Uma outra indi- cação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancial- mente idênticas é que as duas moléculas hibridizam uma para a outra em condições rigorosas.

[0066] Foi descoberto na invenção que combinações heterólogas de dose inicial-reforço, em particular, combinações de repRNA IVT e vetor adenoviriral, são surpreendentemente eficazes em gerar respos- tas imunológicas protetoras em indivíduos humanos. Proteínas antigênicas

[0067] Qualquer DNA de interesse pode ser inserido nos constru- tos de repRNA e nos vetores adenovirais descritos neste pedido para ser expresso heterologamente a partir dos repRNAs e vetres. Genes estranhos para inserção no genoma de um vírus de forma expressível podem ser obtidos por técnicas convencionais para isolar um gene de- sejado tendo em vista a presente invenção. Para organismos que con- têm um genoma de DNA, os genes codificando um antígeno de inte- resse podem ser isolados a partir do DNA genômico; para organismos com genomas de RNA, o gene desejado pode ser isolado a partir de cópias de cDNA do genoma. A proteína antigênica também pode ser codificada por um DNA recombinante que é modificado com base em uma sequência de ocorrência natural, por exemplo, para otimizar a resposta antigênica, a expressão gênica, etc.

[0068] Em certas modalidades da invenção, as combinações de dose inicial-reforço com repRNA e adenovírus geram uma resposta imunológica induzida a uma proteína antigênica ou a um polipeptídio imunogênico da mesma em um indivíduo humano. A proteína antigêni- ca pode ser qualquer proteína antigênica relacionada com uma infec- ção ou doença.

[0069] De acordo com as modalidades da invenção, a proteína an- tigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma pode ser isolada, ou derivada, de um patógeno, tal como um vírus (por exemplo, filoví- rus, adenovírus, arbovírus, astrovírus, coronavírus, vírus Coxsackie, citomegalovírus, vírus da dengue, vírus de Epstein-Barr, vírus da he- patite, vírus do herpes, vírus da imunodeficiência humana, vírus do papiloma humano, vírus do linfoma de células T humano, vírus influen- za, vírus JC, vírus da coriomeningite linfocítica, vírus do sarampo, ví- rus do molusco contagioso, vírus da caxumba, norovírus, parovírus, poliovírus, vírus da raiva, vírus sincicial respiratório, rinovírus, rotaví- rus, rotavírus, vírus da rubéola, vírus da varíola, vírus varicela-zoster, vírus do Nilo Ocidental, Zika vírus, etc.), uma bactéria (por exemplo, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Mycobacte- rium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Streptococcus, etc.), um fungo (por exemplo, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, espécie Candida, espécie Aspergillus, etc.), um protozoário (por exemplo, Plasmodium, Leishmania, Trypanosome, cryptosporidiums, isospora, Naegleria fowleri, Acanthamoeba, Bala- muthia mandrillaris, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, etc.), ou um câncer (por exemplo, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon e retal, câncer endometrial, câncer renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de tireoide, etc.).

[0070] De acordo com as modalidades da invenção, a proteína an- tigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma pode ser isolada, ou derivada, de um tumor, tal como um câncer.

[0071] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos expressam domínios antigênicos, e não a proteína antigênica inteira. Estes frag- mentos podem ser de qualquer comprimento suficiente para serem imunogênicos ou antigênicos. Os fragmentos podem ter pelo menos quatro aminoácidos de comprimento, de preferência 8-20 aminoácidos, mas podem ser mais compridos, tal como, por exemplo, 100, 200, 660, 800, 1000, 1200, 1600, 2000 aminoácidos de comprimento ou mais, ou qualquer comprimento entre estes.

[0072] Um especialista na técnica vai reconhecer que as molécu- las de ácido nucleico codificando a proteína antigênica podem ser mo- dificadas, por exemplo, as moléculas de ácido nucleico apresentadas neste pedido podem ser mutadas, contanto que a proteína expressa modificada produza uma resposta imunológica contra um patógeno ou uma doença. Assim sendo, conforme usado neste pedido, o termo "proteína antigênica" refere-se a uma proteína que compreende pelo menos um determinante antigênico de um patógeno ou de um tumor descrito acima. O termo proteínas antigênicas também abrange prote- ínas antigênicas que são substancialmente similares. repRNAs IVTs

[0073] RepRNAs úteis na invenção são derivados de alfavírus, que são vírus de RNA de cordão simples de sentido positivo. Em uma mo- dalidade, um RepRNA que pode ser usado na invenção contém um capuz de 7- metilguanosina, uma 5’ UTR, uma proteína P1234 de RNA polimerase RNA-dependente (RdRp) (isto é, proteínas não estruturais, nsPs), um elemento promotor subgenômico, uma região variável de interesse a partir da qual é expressa uma proteína antigênica, uma 3’ UTR, e uma cauda de poli(A).

[0074] RepRNAs úteis na invenção podem ser derivados de qual- quer vírus de RNA de cordão postivo autorreplicante, por exemplo, os RepRNAs podem ser derivadas das famílias de vírus de Togaviridae ou Arteriviridae, tal como Aura vírus, vírus Babanki, vírus da Floresta Barmah, vírus Bebaru, vírus Buggy Creek, vírus da Chikungunya, vírus da encefalite equina oriental, vírus Everglades, vírus Fort Morgan, ví- rus Getah, vírus Highlands J, vírus Kyzylagach, vírus Mayaro, vírus Middleburg, vírus Mucambo, vírus Ndumu, vírus O’nyong-nyong, vírus Pixuna, vírus Ross River, S.A. AR86, vírus Sagiyama, vírus da Flores- ta Semliki, vírus Sindbis, vírus Una, vírus da encefalite equina venezu- elana, vírus da encefalite equina ocidental, vírus Whataroa, arterivírus de rato africano ("African pouched rat arterivirus"), arterivírus do maca- co de DeBrazza, vírus da arterite equina, vírus do cólobo vermelho de Kibale, vírus do guenon de rabo vermelho de Kibale, vírus da lactato desidrogenase, vírus 1 do babuíno amarelo de Mikumi, vírus Pebjah, vírus da síndrome reprodutora e respiratória suína. Nas modalidades preferidas, os repRNAs da invenção são derivados do vírus da encefa- lite equina venezuelana (VEE). Exemplos de esqueletos de repRNA preferidos da invenção incluem aqueles descritos por Frolov et al., Id. e a sequência de esqueleto de SEQ ID NO: 3 em o inserto da proteína RSV pre-F.

[0075] A preparação de RNA transcrito in vitro (IVT) é bastante conhecida no estado da técnica, e procedimentos tradicionais de IVT e de purificação podem ser usados para preparar repRNAs IVT úteis na invenção tendo em vista a presente descrição.

[0076] A preparação de repRNA IVT está descrita, por exemplo,

nos documentos US2011/0300205 e US2013/0195968, cujo conteúdo relevante está aqui incorporado a título de referência. Por exemplo, moléculas de repRNA podem ser preparadas por IVT de um DNA que codifica a molécula de RNA autorreplicante por meio do uso de uma RNA polimerase DNA-dependente adequada, tal como RNA polimera- se de fago T7, RNA polimerase de fago SP6, RNA polimerase de fago T3, etc. IVT pode usar um modelo de cDNA criado e propagado em plasmídio de bactérias, ou criado sinteticamente, tal como por métodos de síntese de genes e/ou à base de PCR. Reações de adição de co- bertura apropriada podem ser usadas conforme necessário, e a poli-A pode ser codificada no modelo de DNA ou adicionada por uma reação de poli-A. Métodos de síntese adequados podem ser usados sozinhos, ou em combinação com um ou mais outros métodos (por exemplo, tecnologia de DNA ou RNA recombinante), para produzir uma molécu- la de repRNA IVT da invenção. Métodos adequados para a síntese de novo são bastante conhecidos no estado da técnica e podem ser adaptados para aplicações específicas.

[0077] Tipicamente, um repRNA IVT útil na invenção é produzido com uma molécula de DNA a partir da qual o repRNA pode ser trans- crito. Assim sendo, a invenção também apresenta moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os repRNAs da invenção. As molécu- las de ácido nucleico da invenção podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA obtido por clonagem ou produzido sinteticamente. O DNA pode ser de cordão duplo ou de cordão simples.

[0078] repRNAs IVTs úteis na invenção podem ser formuladas em sistemas de distribuição adequados para administração. Nas modali- dades preferidas, os repRNAs IVTs úteis na invenção são formulados como partículas não viróticas para administração. Partículas não viróti- cas adequadas estão descritas, por exemplo, nos documentos US2011/0300205 e US2013/0195968, cujo conteúdo relevante está aqui incorporado a título de referência. Por exemplo, sistemas de dis- tribuição úteis incluem lipossomas, partículas poliméricas, micropartí- culas não tóxicas e biodegradáveis, eletroporação, injeção de RNA nu, emulsões catiôinicas submicrônicas de óleo em água. Nas modalida- des preferidas, os repRNAs IVTs úteis na invenção são formulados como composições de nanopartículas lipídicas (LNP) (vide, por exem- plo, Semple et al., 2010, Nat Biotechnol. 28(2):172-176, cujo conteúdo relevante está aqui incorporado a título de referência).

[0079] Conforme usado neste pedido, o termo "nanopartícula lipí- dica" ou "LNP" refere-se a qualquer composição lipídica que possa ser usada para distribuir um produto terapêutico, incluindo, porém sem li- mitação, lipossomas ou vesículas, no qual um volume aquoso é en- capsulado por bicamadas de lipídios anfipáticos, ou no qual os lipídios cobrer um interior que compreende um produto terapêutico, ou agre- gados ou micelas de lipídios, nos quais o produto terapêutico encapsu- lado em lipídios está contido em uma mistura de lipídios relativamente desordenada.

[0080] Em modalidades particulares, os LNPs compreendem um lipídio catiônico para encapsular e/ou melhorar a distribuição do repR- NA IVT na célula alvo. O lipídio catiônico pode ser qualquer espécie de lipídio que carrega uma carga líquida positiva a um pH selecionado, tal como pH fisiológico. As nanopartículas lipídicas podem ser preparadas pela inclusão de misturas de lipídios multi-componentes de razões va- riáveis empregando um ou mais lipídios catiônicos, lipídios não catiô- nicos e lipídios modificados com PEG. Diversos lipídios catiônicos já foram descritos na literatura, muitos deles estando comercialmente disponíveis. Por exemplo, lipídios catiônicos adequados para uso nas composições e nos métodos da invenção incluem 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio-propano (DOTAP).

[0081] As formulações de LNP podem incluir lipídios aniônicos. Os lipídios aniônicos podem ser qualquer espécie de lipídio que carrega uma carga líquida negativa a um pH selecionado, tal como pH fisioló- gico. Os lipídios aniônicos, quando combinados com lipídios catiôni- cos, são usados para reduzir a carga superficial total de LNPs e intro- duzir o rompimento pH-dependente da estrutura bicamada de LNP, facilitando a liberação de nucleosídeos. Diversos lipídios aniônicos já foram descritos na literatura, muitos deles estando comercialmente disponíveis. Por exemplo, lipídios aniônicos adequados para uso nas composições e nos métodos da invenção incluem 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[0082] As LNPs podem ser preparadas por métodos bastante co- nhecidos no estado da técnica relativo à presente invenção. Por exemplo, as LNPs podem ser preparadas por meio de injeção de eta- nol ou diluição em etanol, hidratação de filme fino, congelamento- descongelamento, extrusão em prensa francesa ou membrana, diafil- tração, sonicação, diálise com detergente, infusão de éter, e evapora- ção em fase reversa. Nas modalidades preferidas, LNPs úteis na in- venção são preparadas por diluição em etanol. Adenovírus

[0083] Um adenovírus de acordo com a invenção pertence à famí- lia dos Adenoviridae e de preferência é um adenovírus que pertence ao gênero Mastadenovirus. Ele pode ser um adenovírus humano, mas também um adenovírus que infecta outras espécies, incluindo, porém sem limitação, um adenovírus bovino (por exemplo, adenovírus bovino 3, BAdV3), um adenovírus canino (por exemplo, CAdV2), um adenoví- rus suíno (por exemplo, PAdV3 ou 5), ou um adenovírus símio (que inclui um adenovírus de macaco e um adenovírus de símio, tal como um adenovírus de chimpanzé ou um adenovírus de gorila). De prefe- rência, o adenovírus é um adenovírus humano (HAdV, ou AdHu; na invenção, um adenovírus humano é indicado por Ad sem indicação da espécie, por exemplo, a curta designação "Ad5" significa o mesmo que HAdV5, que é adenovírus humano sorotipo 5), ou um adenovírus de símio tal como adenovírus de chimpanzé ou gorila (ChAd, AdCh, ou SAdV). Na invenção, um adenovírus humano é indicado por Ad sem indicação da espécie, por exemplo, a curta designação "Ad26" signifi- ca o mesmo que HadV26, que é adenovírus humano sorotipo 26. Também conforme usado neste pedido, a designação "rAd" significa adenovírus recombinante, por exemplo, "rAd26" refere-se ao adenoví- rus humano recombinante 26.

[0084] Já foram realizados estudos mais avançdos usando adeno- vírus humanos, e adenovírus humanos são preferidos de acordo com certos aspectos da invenção. Em certas modalidades preferidas, o adenovírus recombinante de acordo com a invenção baseia-se em um adenovírus humano. Nas modalidades preferidas, o adenovírus re- combinante baseia-se em um adenovírus humano sorotipo 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 ou 50. De acordo com uma modalidade particularmente preferida da invenção, um adenovírus é um adenovírus humano de um dos sorotipos 26 ou 35.

[0085] As vantagens desses sorotipos são uma soroprevalência baixa e/ou baixos títulos de anticorpos neutralizantes pré-existentes na população humana, e experimentos com o uso dos mesmos em indiví- duos humanos em ensaios clínicos.

[0086] Os adenovírus símios geralmente também apresentam uma soroprevalência baixa e/ou baixos títulos de anticorpos neutralizantes pré-existentes na população humana, e já foi apresentado um grande número de trabalhos usando vetores adenovirais em chimpanzés (por exemplo, US6083716; WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394- 401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17; vide também a revisão feita por Bangari e Mittal, 2006, Vaccine 24: 849- 62; e a revi- são feita por Lasaro e Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39). Logo, em ou- tras modalidades preferidas, o adenovírus recombinante de acordo com a invenção baseia-se em um adenovírus símio, por exemplo, um adenovírus de chimpanzé. Em certas modalidades, o adenovírus re- combinante baseia-se no adenovírus símio tipo 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1,

41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 ou SA7P. Vetores Adenovirais rAd26 e rAd35

[0087] Em uma modalidade preferida de acordo com a invenção os vetores adenovirais compreendem proteínas capsídicas de dois so- rotipos raros: Ad26 e Ad35. Na modalidade típica, o vetor é um vírus rAd26 ou um vírus rAd35.

[0088] Assim sendo, os vetores que podem ser usados na inven- ção compreender uma proteína capsídica Ad26 ou Ad35 (por exemplo, uma proteína fibra, penton ou hexon). Um especialista na técnica vai perceber que não é necessária que uma proteína capsídica Ad26 ou Ad35 inteira seja usada nos vetores da invenção. Dessa forma, proteí- nas capsídicas quiméricas que incluem pelo menos uma parte de uma proteína capsídica Ad26 ou Ad35 podem ser usadas nos vetores da invenção. Os vetores da invenção também podem compreender prote- ínas capsídicas nas quais as proteínas fibra, penton, e hexon são, ca- da uma delas, derivadas de um sorotipo diferente, contanto que pelo menos uma proteína capsídica seja derivada de Ad26 ou de Ad35. Nas modalidades preferidas, as proteínas fibra, penton, e hexon são, cada uma delas, derivadas de Ad26 ou cada uma delas, derivadas de Ad35.

[0089] Um especialista na técnica vai perceber que elementos de- rivados de múltiplos sorotipos podem ser combinados em um único vetor adenoviral recombinante. Portanto, é possível produzir um ade-

novírus quimérico que combina propriedades desejáveis de diferentes sorotipos. Portanto, em algumas modalidades, um adenovírus quiméri- co da invenção poderia combinar a ausência de imunidade pré- existente dos sorotipos Ad26 e Ad35 com características tais como estabilidade térmica, montagem, ancoragem, rendimento de produção, infecção redirecionada ou melhorada, estabilidade do DNA na célula alvo, entre outras.

[0090] Em certas modalidades o vetor adenoviral recombinante útil na invenção é derivado principalmente ou totalmente de Ad35 ou de Ad26 (isto é, o vetor é rAd35 ou rAd26). Em algumas modalidades, o adenovírus é deficiente em replicação, por exemplo, porque contém uma deleção na região E1 do genoma. Para os adenovírus da inven- ção, sendo derivados de Ad26 ou Ad35, é típico trocar a sequência codificadora de E4-orf6 do adenovírus pela sequência codificadora de E4-orf6 de um adenovírus do subgrupo humano C tal como Ad5. Isto permite a propagação de tais adenovírus em linhagens celulares com- plementares bastante conhecidas que expressam os genes E1 de Ad5, tal como, por exemplo, células 293, células PER.C6, entre outras (vide, por exemplo, Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467). Em certas modalidades, o adenovírus é um adenovírus humano de sorotipo 35, com uma deleção na região E1 na qual o áci- do nucleico codificando o antígeno foram clonado, e com uma região E4 orf6 de Ad5. Em certas modalidades, o adenovírus é um adenoví- rus humano de sorotipo 26, com uma deleção na região E1 na qual o ácido nucleico codificando o antígeno foram clonados, e com uma re- gião E4 orf6 de Ad5. Para o adenovírus Ad35, é típico reter a extremi- dade 3’ da fase de leitura aberta E1B 55K no adenovírus, por exemplo, os 166 bp diretamente a montante da fase de leitura aberta pIX ou um fragmento compreendendo o mesmo, tal como um fragmento de 243 bp a montante do códon de início pIX, marcado na extremidade 5’ por um sítio de restrição Bsu36I, uma vez que este aumenta a estabilidade do adenovírus porque o promotor do gene pIX é parcialmente residen- te nesta área (vide, por exemplo, Havenga et al, 2006, supra; WO 2004/001032).

[0091] A preparação de vetores adenovirais recombinantes é bas- tante conhecida no estado da técnica.

[0092] A preparação de vetores rAd26 está descrita, por exemplo, no documento WO 2007/104792 e em Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Sequências genômicas exemplificativas Ad26 são encontra- das no GenBank Acesso EF 153474 e na SEQ ID NO:1 do documento WO 2007/104792. A preparação de vetores de rAd35 está descrita, por exemplo, na Patente US N° 7,270,811 e em Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71. Uma sequência genômica exemplificativa de Ad35 é encontrada no GenBank Acesso AC_000019.

[0093] Em uma modalidade da invenção, os vetores úteis na in- venção incluem aqueles descritos no documento WO2012/082918, aqui incorporado em sua íntegra a título de referência.

[0094] Tipicamente, um vetor adenoviral útil na invenção é produ- zido usando um ácido nucleico compreendendo o genoma adenoviral recombinante inteiro (por exemplo, um vetor plasmídico, cosmídico, ou baculoviral). Por conseguinte, a invenção também apresenta molécu- las de ácido nucleico isolado que codificam os vetores adenovirais da invenção. As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser ob- tidas por clonagem ou podem ser produzidas sinteticamente. O DNA pode ser de cordão duplo ou de cordão simples.

[0095] Os vetores adenovirais úteis na invenção são tipicamente de replicação defeituosa. Nestas modalidades, o vírus é deixado defei- tuoso em termos de replicação por deleção ou inativação de regiões críticas para a replicação do vírus, tal como a região E1. As regiões podem ser substancialmente deletadas ou inativadas por, por exem-

plo, inserção do gene de interesse (usualmente ligado a um promotor). Em algumas modalidades, os vetores da invenção podem conter dele- ções em outras regiões, tais como as regiões E2, E3 ou E4 ou inser- ções de genes heterólogos ligados a um promotor. Para adenovírus com mutações em E2 e/ou em E4, geralmente são usadas linhagens celulares complementares de E2 e/ou de E4 para gerar adenovírus recombinantes. As mutações na região E3 do adenovírus não preci- sam ser complementadas pela linhagem celular, uma vez que E3 não é necessária para replicação.

[0096] Uma linhagem celular de embalagem é tipicamente usada para produzir quantidades suficientes dos vetores adenovirais da in- venção. Uma célula de embalagem é uma célula que compreende os genes que foram deletados ou inativados em um vetor de replicação defeituosa, permitindo assim que o vírus replique na célula. Linhagens celulares adequadas incluem, por exemplo, PER.C6, 911, 293, e E1 A549.

[0097] Em algumas modalidades, o vetor adenoviral pode expres- sar genes ou porções de genes que codificam peptídios antigênicos. Estes peptídios ou polipeptídios estranhos heterólogos ou exógenos podem incluir sequências que são imunogênicas, tais como, por exemplo, antígenos tumor-específicos (TSAs), antígenos bacterianos, virais, fúngicos, e protozoários.

[0098] O gene heterólogo codificando um peptídio antigênico pode estar sob o controle de (isto é, operacionalmente ligado a) um promo- tor derivado de adenovírus (por exemplo, o Promotor Tardio Maior) ou pode estar sob o controle de um promotor heterólogo. Exemplos de promotores heterólogos adequados incluem o promotor de CMV e o promotor de RSV. De preferência, o promotor fica localizado a montan- te do gene heterólogo de interesse em um cassete de expressão. Composições Imunogênicas

[0099] Composições imunogênicas são composições compreen- dendo uma quantidade imunologicamente eficaz de repRNA ou de ve- tores adenovirais para uso na invenção. As composições podem ser formuladas como vacinas (também denominadas "composições imu- nogênicas") de acordo com métodos bastante conhecidos na literatura. Tais composições podem incluir adjuvantes para aumentar as respos- tas imunológicas. As proporções ideais de cada componente na formu- lação podem ser determinadas por técnicas bastante conhecidas no campo da presente invenção.

[00100] A preparação e o uso de composições imunogênicas são bastante conhecidos na literatura. Composições farmacêuticas líquidas geralmente incluem um carreador líquido tal como água, petróleo, óleo animal ou vegetal, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisio- lógica, dextrose ou outra solução sacarídica ou glicóis tais como etile- no glicol, propileno glicol ou polietileno glicol podem ser incluídos.

[00101] As composições da invenção podem compreender repRNA ou vetores adenovirais expressando uma ou mais proteínas antigêni- cas ou polipeptídios imunogênicos das mesmas. Estes peptídios ou polipeptídios antigênicos podem incluir quaisquer sequências que se- jam imunogênicas, incluindo, porém sem limitação, antígenos tumor- específicos (TSAs), antígenos bacterianos, virais, fúngicos e protozoá- rios. Por exemplo, a proteína antigênica ou um polipeptídio imunogêni- co da mesma pode ser derivada de um patógeno, por exemplo, um vírus, uma bactéria, um fungo, um protozoário, ou ela também pode ser derivada de um tumor. Em um ou mais aspectos preferidos, as composições da invenção compreendem repRNA ou vetores adenovi- rais expressando uma ou mais proteínas antigênicas de um vírus, tal como um vírus sincicial respiratório (RSV, vírus influenza, HIV, vírus Ebola, HPV, HSV, CMV, RSV, vírus da hepatite, Zika vírus, vírus SARS, vírus da Chikungunya, vírus da dengue, ou vírus do Nilo Oci-

dental.

[00102] As proteínas antigênicas podem ser qualquer proteína de qualquer pneumovírus compreendendo um determinante antigênico. Em uma modalidade preferida as proteínas antigênicas são a proteína F pré-fusão do vírus sincicial respiratório (RSV-preF).

[00103] Em uma modalidade preferida, as proteínas antigênicas co- dificadas pelo repRNA IVT ou por vetores adenovirais têm as sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, polipeptídios imunogênicos das mesmas, e combinações das mesmas.

[00104] As composições imunogênicas úteis na invenção podem compreender adjuvantes.

[00105] Adjuvantes adequados para co-administração de acordo com a invenção devem ser aqueles que são potencialmente seguros, bem tolerados e eficazes em seres humanos, incluindo QS-21, Detox- PC, MPL- SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERa- mida, PSC97B, Adjumer, PG-026,GSK-I, GcMAF, B-aletina, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, Alum, e MF59.

[00106] Outros adjuvantes que podem ser administrados incluem lectinas, fatores de crescimento, citocinas e linfocinas tais como inter- feron alfa, interferon gama, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator estimulante de colônias de granulócitos (gCSF), fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (gMCSF), fator de necrose tumoral (TNF), fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-IO, e IL-12 ou ácidos nucleicos codificando os mesmos.

[00107] As composições da invenção podem compreender um ex- cipiente, carreador, tampão ou estabilizante farmaceuticamente acei- tável ou outros materiais conhecidos pelos especialistas na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do princípio ativo. A natureza exata do carreador ou de outro material pode depender da via de administração, por exemplo, via intramuscu- lar, subcutânea, oral, intravenosa, cutânea, intramucosa (por exemplo, intestino), intranasal ou intraperitoneal. Método para Melhorar a Resposta imunológica

[00108] A invenção apresenta um método aprimorado de introduzir e reforçar uma resposta imunológica a qualquer proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma em um indivíduo humano usando um repRNA IVT em combinação com um vetor adenoviral.

[00109] De acordo com um aspecto geral da invenção, um método de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo humano com necessidade do mesmo compreende: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) compreen- dendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, para assim obter uma resposta imunológica induzida no indivíduo hu- mano, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas comparti- lham pelo menos um determinante antigênico, e uma das composições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma com- posição de reforço.

[00110] De acordo com as modalidades da invenção, a resposta imunológica induzida compreende uma resposta induzida por anticor- po contra uma proteína antigênica no indivíduo humano.

[00111] De preferência, a resposta imunológica melhorada compre- ende ainda uma resposta de células T CD4+ melhorada ou uma res- posta de células T CD8+ melhorada contra uma proteína antigênica no indivíduo humano. A resposta de células T CD4+ melhorada gerada por um método de acordo com uma modalidade da invenção pode ser, por exemplo, um aumento ou indução de uma resposta de células T CD4+ dominantes contra a proteína antigênica, e/ou um aumento ou indução de células T CD4+ polifuncionais específicas para a proteína antigênica no indivíduo humano. As células T CD4+ polifuncionais ex- pressam mais de uma citocina, tal como dois ou mais de IFN-gama, IL- 2 e TNF-alfa. A resposta de células T CD8+ melhorada gerada por um método de acordo com uma modalidade da invenção pode ser, por exemplo, um aumento ou indução de uma resposta de células T CD8+ polifuncionais específicas para a proteína antigênica no indivíduo hu- mano.

[00112] Mais preferivelmente, a resposta imunológica melhorada resultante de um método de acordo com uma modalidade da invenção compreende uma resposta de células T CD4+ melhorada, uma respos- ta melhorada a anticorpos e uma resposta de células T CD8+ melho- rada, contra a proteína antigênica no indivíduo humano.

[00113] Ensaios que podem ser usados para detectar respostas imunológicas são bastante conhecidos na literatura. Alguns desses ensaios incluem, por exemplo, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas), ELISPOT (imunocoloração ligada a enzimas), e ICS (colo- ração com citocina intracelular). Os ensaios ELISA analisam, por exemplo, os níveis de anticorpos ou citocinas secretados. Quando en- saios ELISA são usados para determinar os níveis de anticorpos que se ligam a um antígeno particular, um indicador da resposta imunoló- gica humoral, eles também podem refletir a atividade das células T CD4+, uma vez que a produção de anticorpos de alta afinidade pelas células B depende da atividade das células T auxiliares CD4+. ELIS- POT e ICS são ensaios de célula única que analisam, por exemplo, as respostas de células T a um antígeno particular. Os ensaios ELISPOT medem a atividade secretora de células individuais, e os ensaios ICS analisam os níveis de citocina intracelular. As respostas de células T CD4+-específicas e CD8+-específicas podem ser determinadas por meio de ensaios ICS.

[00114] Em uma ou mais modalidades da invenção, um repRNA IVT é usado para introduzir a resposta imunológica, e um vetor Ad26 ou Ad35 é usado para reforçar a resposta imunológica de acordo com uma modalidade da invenção. Em outras modalidades da invenção, um vetor Ad26 ou Ad35 é usado para introduzir a resposta imunológi- ca, e um repRNA IVT é usado para reforçar a resposta imunológica de acordo com uma modalidade da invenção.

[00115] Os antígenos nas composições de dose inicial e dose de reforço não precisam ser idênticos, mas devem compartilhar determi- nantes antigênicos ou ser substancialmente similares entre si.

[00116] A administração das composições imunogênicas é tipica- mente intramuscular, subcutânea ou intradérmica. No entanto, outros modos de administração tal como intravenoso, cutâneo ou intranasal também podem ser usados. A administração intramuscular das com- posições imunogênicas pode ser feita por meio de uma agulha para injetar uma suspensão da composição. Uma alternativa é o uso de um dispositivo de injeção sem agulha para administrar a composição (usando, por exemplo, Biojector(TM)) ou um pó liofilizado contendo a composição.

[00117] Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou para injeção no sítio da aflição, a composição estará na forma de uma solu- ção aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirogênio e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os especialistas na técni-

ca estarão aptos a preparar soluções adequadas usando, por exem- plo, veículos isotônicos tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactada. Os repRNAs IVT da invenção podem ser formulados como nanopartículas lipídicas para administra- ção. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos nas composições, conforme necessário. Uma formulação de liberação lenta das composições também pode ser usada.

[00118] Tipicamente, a administração terá um objetivo profilático para gerar uma resposta imunológica contra um antígeno antes da in- fecção ou do desenvolvimento de sintomas. As doenças e distúrbios que podem ser tratados ou prevenidos de acordo com a invenção in- cluem aqueles nos quais uma resposta imunológica pode desempe- nhar um papel protetor ou terapêutico. Em outras modalidades, o re- pRNA IVT e o vetor adenoviral podem ser administrados para profila- xia após exposição.

[00119] As composições imunogênicas contendo o repRNA IVT e o vetor adenoviral são administradas a um indivíduo, dando origem a uma resposta imunológica no indivíduo. Uma quantidade de uma com- posição suficiente para induzir uma resposta imunológica detectável é definida como sendo uma "dose imunologicamente eficaz". Como mos- trado abaixo, as composições imunogênicas da invenção induzem uma resposta imunológica humoral bem como uma resposta imunoló- gica mediada por células. Em uma modalidade preferida a resposta imunológica é uma resposta imunológica protetora.

[00120] A quantidade efetiva das composições administradas, e a taxa e o tempo de administração, dependerão da natureza e da seve- ridade da doença, distúrbio ou condição sendo tratada. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., é de res- ponsabilidade dos profissionais da área e de outros médicos, e tipica-

mente leva em conta a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, a condição do paciente individual, o sítio de distribuição, o método de administração e outros fatores conhecidos pelos profissionais da área. Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser encontrados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980.

[00121] Subsequente à produção do repRNA IVT e dos vetores adenovirais e à formulação opcional de tais partículas como composi- ções, a composição pode ser administrada a um indivíduo, particular- mente um ser humano.

[00122] A quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com vários fatores, tais como o meio de administra- ção, o sítio alvo, o estado fisiológico do sujeito (incluindo, por exemplo, a idade, o peso corporal, a saúde), se o sujeito é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são titulados de forma ideal para otimizar a segurança e a eficácia.

[00123] Em um esquema exemplificativo, o repRNA IVT é adminis- trado (por, por via intramuscular) em um volume variando entre cerca de 100 µl e cerca de 10 ml contendo uma dose de ≤200 µg, ≤100 µg, ≤50 µg, ou ≤10 µg de repRNA IVT, mas a expressão pode ser vista em níveis muito mais baixos, por exemplo, ≤1 µg, ≤100 ng, ≤10 ng, ou ≤1 ng de repRNA IVT por dose. De preferência, o repRNA IVT é adminis- trado em um volume variando entre 0,25 ml e 1,0 ml. Mais preferivel- mente o repRNA IVT é administrado em um volume de 0,5 ml.

[00124] Tipicamente, o repRNA IVT é administrado em uma quanti- dade de cerca de 10-100 µg por dose. Em uma modalidade preferida, o repRNA IVT é administrado em uma quantidade de cerca de 10 µg por dose. Em uma outra modalidade preferida, o repRNA IVT é admi- nistrado em uma quantidade de cerca de 25 µg por dose. Em uma ou-

tra modalidade preferida, o repRNA IVT é administrado em uma quan- tidade de cerca de 50 µg por dose. Em uma outra modalidade preferi- da, o repRNA IVT é administrado em uma quantidade de cerca de 75 µg por dose. Em uma outra modalidade preferida, o repRNA IVT é administrado em uma quantidade de cerca de 100 µg por dose.

[00125] Em um esquema exemplificativo, o vetor adenoviral é ad- ministrado (por exemplo, por via intramuscular) em um volume varian- do entre cerca de 100 µl e cerca de 10 ml contendo concentrações de cerca de 104 a 1012 de partículas virais/ml. De preferência, o vetor adenoviral é administrado em um volume variando entre 0,25 ml e 1,0 ml. Mais preferivelmente, o vetor adenoviral é administrado em um vo- lume de 0,5 ml.

[00126] Tipicamente, o adenovírus é administrado em uma quanti- dade de cerca de 109 a cerca de 1012 partículas virais (vp) a um indiví- duo humano durante uma administração, mais tipicamente em uma quantidade de cerca de 1010 a cerca de 1012 vp. Em uma modalidade preferida, o vetor adenoviral é administrado em uma quantidade de cerca de 5x1010 vp. Em uma outra modalidade preferida, o vetor ade- noviral é administrado em uma quantidade de cerca de 0,8x1010 vp. Em uma outra modalidade preferida, o vetor adenoviral é administrado em uma quantidade de cerca de 2x1010 vp. Em uma outra modalidade preferida, o vetor adenoviral é administrado em uma quantidade de cerca de 4x1010 vp.

[00127] As composições da invenção podem ser administradas iso- ladas ou em combinação com outros tratamentos, seja simultanea- mente ou sequencialmente dependendo da condição a ser tratada.

[00128] As composições de reforço são administradas semanas ou meses depois da administração da composição de dose inicial, por exemplo, cerca de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 sema-

nas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 sema- nas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 sema- nas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 sema- nas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 sema- nas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 sema- nas, 36 semanas, 37 semanas, 38 semanas, 39 semanas, 40 sema- nas, 41 semanas, 42 semanas, 43 semanas, 44 semanas, 45 sema- nas, 46 semanas, 47 semanas, 48 semanas, 49 semanas, 50 sema- nas, 51 semanas, ou um a dois anos depois da administração da com- posição de dose inicial.

[00129] De preferência, a composição de reforço é administrada 1- 52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma modalidade preferida da invenção, a composição de reforço é administrada 2-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade preferida da invenção, a composição de reforço é administrada 4-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalida- de preferida da invenção, a composição de reforço é administrada 1 semana depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade preferida da invenção, a composição de reforço é administrada 2 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade preferida da invenção, a composição de reforço é administrada 4 semanas depois de a compo- sição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade pre- ferida da invenção, a composição de reforço é administrada 8 sema- nas depois de a composição de dose inicial ser administrada.

[00130] As composições de dose inicial e de reforço da invenção podem compreender, cada uma, uma, duas, três ou múltiplas doses.

[00131] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de indução de uma resposta imunológica contra um tumor em um indiví-

duo humano. O método compreende: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um primeiro polinucleotídeo codifi- cando uma proteína antigênica produzida por uma célula do tumor, uma proteína antigênica substancialmente similar, ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando a proteína antigênica, a proteína antigênica substancialmente similar, ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador far- maceuticamente aceitável, para assim obter uma resposta imunológica induzida contra o tumor no indivíduo humano, em que a primeira e a segunda proteí- nas antigênicas compartilham pelo menos um determinante antigênico, e uma das composições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço.

[00132] De preferência, a resposta imunológica induzida proporcio- na ao indivíduo humano uma imunidade protetora contra o tumor.

[00133] Em uma modalidade preferida, a composição compreen- dendo o repRNA IVT é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o vetor adenoviral é a composição de reforço.

[00134] De acordo com as modalidades da invenção, a composição de reforço é administrada 1-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. A composição de reforço também pode ser administrada mais de 52 semanas depois de a composição de do- se inicial ser administrada.

[00135] Em uma modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 2-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composi- ção de reforço é administrada 4-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade da inven- ção, a composição de reforço é administrada 1 semana depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalida- de da invenção, a composição de reforço é administrada 2 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma ou- tra modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 4 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de reforço é admi- nistrada 8 semanas depois de a composição de dose inicial ser admi- nistrada.

[00136] Em modalidades adicionais, a composição de reforço é administrada pelo menos 2 semanas ou pelo menos 4 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em ainda outras modalidades, a composição de reforço é administrada 4-12 semanas or 4-8 semanas depois de a composição de dose inicial ser adminis- trada.

[00137] Em uma modalidade preferida, o repRNA IVT é um repRNA do vírus VEE.

[00138] Em uma modalidade preferida, o vetor adenoviral é um ve- tor Ad26 ou um vetor Ad35.

[00139] A proteína antigênica produzida por uma célula do tumor pode ser qualquer antígeno tumoral. Em uma modalidade preferida, o antígeno tumoral é um antígeno tumor-específico que está presente somente em células tumorais. O antígeno tumoral também pode ser um antígeno associado ao tumor que está presente em algumas tumo- rais e também em algumas células normais.

[00140] De acordo com uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método de indução de uma resposta imunológica contra um vírus em um indivíduo humano. O método compreende: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um primeiro polinucleotídeo codifi- cando uma proteína antigênica do vírus, uma proteína antigênica subs- tancialmente similar, ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando a proteína antigênica, a proteína antigênica substancialmente similar, ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador far- maceuticamente aceitável, para assim obter uma resposta imunológica induzida contra o virus no indivíduo humano, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compartilham pelo menos um determinante antigênico, e uma das composições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço.

[00141] De preferência, a resposta imunológica melhorada propor- ciona ao indivíduo humano uma imunidade protetora contra o vírus.

[00142] Em uma modalidade preferida, a composição compreen- dendo o repRNA IVT é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o vetor adenoviral é a composição de reforço.

[00143] Em uma modalidade, a composição de reforço é adminis- trada 1-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser admi- nistrada. A composição de reforço também pode ser administrada mais de 52 semanas depois de a composição de dose inicial ser admi- nistrada.

[00144] Em uma outra modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 2-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 4-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalida- de da invenção, a composição de reforço é administrada 1 semana depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma ou- tra modalidade da invenção, a composição de reforço é administrada 2 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de reforço é admi- nistrada 4 semanas depois de a composição de dose inicial ser admi- nistrada. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de re- forço é administrada 8 semanas depois de a composição de dose ini- cial ser administrada.

[00145] Em modalidades adicionais, a composição de reforço é administrada pelo menos 2 semanas ou pelo menos 4 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada. Em ainda outras modalidades, a composição de reforço é administrada 4-12 semanas ou 4-8 semanas depois de a composição de dose inicial ser adminis- trada.

[00146] Em uma modalidade preferida, o repRNA IVT é um repRNA do vírus VEE.

[00147] Em uma modalidade preferida, o vetor adenoviral é um ve- tor Ad26 ou um vetor Ad35.

[00148] A proteína antigênica pode ser qualquer proteína antigênica de um vírus. Em uma modalidade preferida, a proteína antigênica é uma glicoproteína ou uma nucleoproteína de um vírus. Modalidades

[00149] A invenção também apresenta as seguintes modalidades não limitativas.

[00150] A modalidade 1 é um método de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo humano com necessidade do mesmo, o método compreendendo: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) compreen- dendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, para assim obter uma resposta imunológica induzida no in- divíduo humano, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compartilham pelo menos um determinante antigênico, e uma das composições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço.

[00151] A modalidade 2 é o método de acordo com a modalidade 1, em que a composição compreendendo o repRNA IVT é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o vetor adenoviral é a composição de reforço.

[00152] A modalidade 3 é o método de acordo com a modalidade 1, em que a composição compreendendo o vetor adenoviral é a compo- sição de dose inicial e a composição compreendendo o repRNA IVT é a composição de reforço.

[00153] A modalidade 4 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a resposta imunológica induzida com- preende uma resposta imunológica induzida por anticorpos contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e segunda proteínas antigênicas no indivíduo humano.

[00154] A modalidade 5 é o método de acordo com a modalidade 4, em que a resposta imunológica induzida por anticorpos é determinada por um ELISA.

[00155] A modalidade 6 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a resposta imunológica induzida com- preende uma resposta imunológica induzida por células contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e se- gunda proteínas antigênicas no indivíduo humano.

[00156] A modalidade 7 é o método de acordo com a modalidade 6, em que a resposta imunológica induzida por células é determinada por um ICS ou por um ensaio ELISPOT.

[00157] A modalidade 8 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a resposta imunológica induzida pro- porciona uma imunidade protetora ao indivíduo humano contra uma doença relacionada com pelo menos uma das primeira e segunda pro- teínas antigênicas.

[00158] A modalidade 9 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o repRNA IVT é um repRNA do vírus da encefalite equina venezuelana (VEE).

[00159] A modalidade 10 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o vetor adenoviral é um vetor recombi- nante do adenovírus humano sorotipo 26 (Ad26) ou um vetor recombi- nante do adenovírus humano sorotipo 35 (Ad35).

[00160] A modalidade 11 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que a composição de reforço é adminis- trada 1-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser admi- nistrada.

[00161] A modalidade 12 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que a composição de reforço é adminis-

trada pelo menos 1 semana depois de a composição de dose inicial ser administrada.

[00162] A modalidade 13 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que a primeira ou a segunda proteína an- tigênica é derivada de um patógeno ou de um tumor.

[00163] A modalidade 14 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que a primeira ou a segunda proteína an- tigênica é derivada de um vírus.

[00164] A modalidade 15 é o método de acordo com a modalidade 14, em que a primeira ou a segunda proteína antigênica é derivada de um pneumovírus, filovírus, HIV, vírus da dengue, Zika vírus, vírus in- fluenza ou vírus da hepatite B.

[00165] A modalidade 16 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, em que a primeira e a segunda proteínas an- tigênicas são idênticas ou substancialmente idênticas.

[00166] A modalidade 17 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 16, em que a primeira ou a segunda proteína an- tigênica é derivada de uma proteína F pré-fusão do vírus sincicial res- piratório (RSV-preF), e em que a primeira e a segunda proteínas anti- gênicas são idênticas ou substancialmente idênticas.

[00167] A modalidade 18 é o método de acordo com a modalidade 17, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compreen- dem independentemente uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, polipeptídios imunogênicos das mesmas, e combinações das mesmas.

[00168] A modalidade 19 é o método de acordo com a modalidade 18, em que o repRNA IVT compreende um polinucleotídeo codificando pelo menos uma proteína antigênica tendo uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e polipeptídios imunogênicos das mesmas.

[00169] A modalidade 20 é o método de acordo com a modalidade 21, em que o repRNA IVT compreende um polinucleotídeo tendo a se- quência de SEQ ID NO: 3.

[00170] A modalidade 21 é o método de acordo com a modalidade 20, em que o vetor adenoviral compreende um polinucleotídeo codifi- cando pelo menos uma proteína antigênica tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e polipeptídios imunogênicos das mesmas.

[00171] A modalidade 22 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 21, em que o repRNA IVT é administrado como uma composição de nanopartículas lipídicas em uma quantidade de 0,1-1000 µg IVT repRNA por dose.

[00172] A modalidade 23 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 22, em que o vetor adenoviral é administrado em uma quantidade de 109-1012 partículas virais por dose.

[00173] A modalidade 24 é um método de indução de uma resposta imunológica contra pelo menos um subtipo de pneumovírus em um indivíduo humano, compreendendo: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um primeiro polinucleotídeo codifi- cando uma primeira proteína antigênica do pelo menos um subtipo de pneumovírus, or um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína antigênica do pelo menos um subtipo de pneu- movírus, or um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um car- reador farmaceuticamente aceitável,

para assim obter uma resposta imunológica induzida contra o pelo menos um subtipo de pneumovírus no indivíduo humano, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compartilham pelo menos um determinante antigênico, e uma das composições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço.

[00174] A modalidade 25 é uma combinação para induzir uma res- posta imunológica em um indivíduo humano, compreendendo: a. uma primeira composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. uma segunda composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína anti- gênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um car- reador farmaceuticamente aceitável, em que uma das composições é administrada ao indivíduo humano para introduzir a resposta imunoló- gica e a outra composição é administrada ao indivíduo humano para reforçar a resposta imunológica, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas com- partilham pelo menos um determinante antigênico.

[00175] A modalidade 26 é um uso de uma combinação para a pre- paração de um medicamento para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo humano, compreendendo: a. uma primeira composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um pri- meiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador far-

maceuticamente aceitável, e b. uma segunda composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína anti- gênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um car- reador farmaceuticamente aceitável, em que uma das composições é administrada ao indivíduo humano para introduzir a resposta imunológica e a outra composição é administrada ao indivíduo humano para reforçar a resposta imunológi- ca, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas com- partilham pelo menos um determinante antigênico.

[00176] A modalidade 27 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que a composi- ção compreendendo o repRNA IVT é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o vetor adenoviral é a composição de reforço.

[00177] A modalidade 28 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que a composi- ção compreendendo o vetor adenoviral é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o repRNA IVT é a composição de re- forço.

[00178] A modalidade 29 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que a primeira ou a segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma é derivada de um patógeno ou de um tumor.

[00179] A modalidade 30 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que a primeira ou a segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma é derivada de um vírus.

[00180] A modalidade 31 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que a primeira ou a segunda proteína antigênica é derivada de uma proteína RSV- preF, e em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas são idên- ticas ou substancialmente idênticas.

[00181] A modalidade 32 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compreendem independentemente uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, polipeptídios imunogênicos das mes- mas, e combinações das mesmas.

[00182] A modalidade 33 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que o repRNA IVT compreende um polinucleotídeo codificando pelo menos uma pro- teína antigênica tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e polipeptídios imunogênicos das mesmas.

[00183] A modalidade 34 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que o vetor adenoviral compreende um polinucleotídeo codificando pelo menos uma proteína antigênica tendo uma sequência de aminoácidos seleci- onada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e poli- peptídios imunogênicos das mesmas.

[00184] A modalidade 35 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que o repRNA IVT é um repRNA do vírus da encefalite equina venezuelana (VEE).

[00185] A modalidade 36 é o método da modalidade 24, a combina- ção da modalidade 25 ou o uso da modalidade 26, em que o vetor adenoviral é um vetor de Ad26 ou um vetor de Ad35.

[00186] A modalidade 37 é um método de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo humano com necessidade do mesmo, o método compreendendo: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) compreen- dendo um polinucleotídeo codificando proteínas não estruturais do ví- rus da encefalite equina venezuelana (VEE), e um outro polinucleotí- deo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor de Ad26 ou de um vetor de Ad35 compreendendo um segundo polinu- cleotídeo codificando uma segunda proteína antigênica ou um polipep- tídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceutica- mente aceitável, para assim obter uma resposta imunológica induzida no in- divíduo humano, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compartilham pelo menos um determinante antigênico, e a primeira composição é uma composição de dose inicial e a segunda composi- ção é uma composição de reforço.

[00187] A modalidade 38 é uma combinação para induzir uma res- posta imunológica em um indivíduo humano, compreendendo: a. uma primeira composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) compreendendo um polinucleotídeo codificando proteínas não estruturais do vírus da encefalite equina venezuelana (VEE), e um outro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. uma segunda composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um vetor de Ad26 ou de um vetor de Ad35 compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mes- ma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas com- partilham pelo menos um determinante antigênico, e a primeira com- posição é uma composição de dose inicial e a segunda composição é uma composição de reforço.

[00188] A modalidade 39 é um uso da combinação da modalidade 38 para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo humano.

[00189] A modalidade 40 é o método da modalidade 37, a combina- ção da modalidade 38 ou o uso da modalidade 39, em que a primeira ou a segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma é derivada de um patógeno ou de um tumor.

[00190] A modalidade 41 é o método da modalidade 38, a combina- ção da modalidade 39 ou o uso da modalidade 40, em que a primeira ou a segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma é derivada de um vírus.

[00191] A modalidade 42 é o método da modalidade 37, a combina- ção da modalidade 38 ou o uso da modalidade 39, em que a primeira ou a segunda proteína antigênica é derivada de uma proteína RSV- preF, e em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas são idên- ticas ou substancialmente idênticas.

[00192] A modalidade 43 é o método da modalidade 37, a combina- ção da modalidade 38 ou o uso da modalidade 39, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compreendem independentemente uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, polipeptídios imunogênicos das mes-

mas, e combinações das mesmas.

[00193] A modalidade 44 é o método da modalidade 37, a combina- ção da modalidade 38 ou o uso da modalidade 39, em que a primeira composição compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT tendo a sequência de SEQ ID NO: 3, e a segunda composição compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor de Ad26 compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína antigênica tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00194] A modalidade 45 é o método de qualquer uma das modali- dades 37-44, a combinação de qualquer uma das modalidades 38-44 ou o uso de qualquer uma das modalidades 39-44, em que a segunda composição é administrada ao indivíduo humano 2 a 12 semanas, de preferência 4 a 8 semanas, depois da administração da primeira com- posição.

[00195] A modalidade 46 é o método de qualquer uma das modali- dades 38 ou 41-45, a combinação de qualquer uma das modalidades 39 ou 41-45 ou o uso de qualquer uma das modalidades 40-45, em que a primeira composição é formulada como uma formulação de lipo- nanopartículas.

EXEMPLOS

[00196] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, e não para limitar, a invenção reivindicada. Exemplo 1

[00197] Foi conduzido um estudo com animais com o objetivo de explorar o potencial de imunizações homólogas dose inicial-reforço com vacinas à base de repRNA codificando um antígeno modelo. O antígeno modelo que foi usado foi a proteína F pré-fusão do vírus sin- cicial respiratório (RSV-preF). O estudo testou uma gama de doses de vacinações homólogas com um intervalo de imunização de 4 sema-

nas. Manipulação dos Animais

[00198] Os estudos obedeceram todas as seções aplicáveis das Final Rules of the Animal Welfare Act regulations ("Normas Finais dos regulamentos da Lei de Bem-Estar Animal") (9 CFR Parts 1, 2, e 3) e do Guide for the Care e Use of Laboratory Animals ("Guia para o Cui- dado e Uso de Animais de Laboratório") – National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition (the Guide).

[00199] Um total de 30 camundongos Balb/c fêmeas (6 semanas de idade) foi adquirido no Jackson laboratories. Materiais da vacina

[00200] Uma representação esquemática do vetor vacinal de repR- NA IVT que foi usado está representado na Figura 1. O vetor de repR- NA IVT consistia em duas fases de leitura aberta (ORFs), a primeira codificando as proteínas não estruturais (NSPs) do vírus da encefalite equina venezuelana (VEE), e a segunda codificando a proteína RSV- preF. O vetor de repRNA IVT foi construído por meio de transcrição in vitro (IVT) e métodos de purificação. Resumidamente, DNA linear mo- delo para transcrição de T7 in vitro foi gerado por digestão de um plasmídeo de DNA contendo réplicons 5’ do promotor T7 e 3’ da cauda de poli-A. O produto digerido foi limpado com um kit Zymo DNA Clean & Concentrator™-25. repRNA IVT foi gerado com a ajuda do kit de transcrição de T7 Ambion MEGAscript® T7 (Thermo) seguido por uma etapa de limpeza por HPLC usando uma coluna GE CaptoCore 700 HiScreen para remover os componentes tamponantes, NTPs livres e proteínas. Depois da limpeza, o repRNA IVT foi coberto por uma rea- ção de cobertura enzimática pós-transcricional usando um kit de re- vestimento da Cellscript, e depois disto, o RNA foi concentrado em um concentrador giratório e o tampão foi trocado até uma concentração final de 1-5 μg/µl. A formulação de repRNA em nanopartículas lipídicas

(LNPs) foi realizado por um processo de diluição em etanol. Colesterol foi adquirido na Sigma-Aldrich, e 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1,2-dies- tearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metóxi(polietileno glicol)-2000] (DSPE-PEG) foram adquiridos na Avanti Polar Lipids. Os componen- tes lipídicos (em etanol) a uma percentagem molar de 48:40:10:2 de Colesterol:DOTAP:DSPC:DSPE-PEG foram misturados com repRNA em tampão citrato 10 mM usando uma razão molar de 8:1 de N:P (ni- trogênio sobre DOTAP para fosfato sobre RNA). Depois de 1 hora de emulsificação, as partículas foram dialisadas contra PBS. Antes das injeções in vivo, as partículas foram ainda diluídas até a concentração necessária de RNA em PBS.

[00201] O repRNA IVT expressou replicases virais de VEE e uma proteína RSV-preF antigênica tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. A sequência do DNA modelo usada para gerar o repR- NA IVT tinha a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3. Vacinação e Desenho Experimental

[00202] Camundongos Balb/c foram vacinados com um esquema de imunização homóloga com dose inicial-reforço usando repRNA (vi- de Tabela 1 e Figura 2 para agrupamento e desenho experimental). Antes da imunização, cada camundongo foi anestesiado com 1-4% isoflurano em oxigênio por meio de uma máquina para anestesia de roedores, e recebeu injeções intramusculares (IM) de repRNA formu- lado com nanopartículas lipídicas (LNP) (50 µL). As doses inicial e de reforço foram dadas com um intervalo de 4 semanas (Figura 2).

[00203] Sangue total sem anticoagulante foi processado para obter soro. Cada soro foi analisado em um ELISA específico para RSV preF.

Tabela 1: Agrupamento experimental dos animais em um estudo de imunização homóloga com repRNA para explorar respostas humorais Grupos de Animais Vacina Veículo Imunizações Dose Animais/ (Balb/c) (semanas) (µg) grupo 1-4 repRNA-RSV-preF LNP 0, 4 5, 1, 0,4, 0,02 6 5 Nenhuma LNP 0, 4 0 6 ELISA de IgG Anti-RSV-F

[00204] As respostas humorais específicas para RSV-F foram de- terminadas em 28 e 42 dias depois da imunização por um ensaio imu- noabsorvente ligado a enzimas (ELISA) modificado, como anterior- mente descrito em Krarup et al. (A highly stable prefusion RSV F vac- cine derived from structural analysis of the fusion mechanism. Nat. Commun. 6:8143).

[00205] Em resumo, placas de 96 poços de poliestireno MaxiSorp (NUNC) foram revestidas com anticorpo monoclonal humano anti-RSV F (Synagis) por uma noite a 4°C a uma concentração de 1 µg/ml em PBS. No dia seguinte, as placas foram lavadas com tampão de lava- gem PBST (PBS, 0,05% de Tween) e bloqueadas em PBS com 1% de albumina sérica bovina, seguido por incubação com uma proteína F pré-fusão estabilizada (0,25 μg/ml em PBST), que foi capturada pelos anticorpos anti-RSV F imobilizados.

[00206] Amostras de soro foram diluídas em PBST com 1% de al- bumina sérica bovina e incubadas com o conjugado IgG de cabra anti- camundongo-HRP da Bio-Rad (diluição 1/5000 em PBST), e as amos- tras foram então incubadas nos poços para possibilitar a detecção de IgG murina específica para RSV-F. O substrato OPD foi usado para detecção. Todas as incubações foram feitas à temperatura ambiente por 1 hora. Depois de cada etapa, as placas eram lavadas três vezes com PBST. Os resultados do ensaio ELISA estão mostrados na Figura

3. As imunizações primárias com doses de 0,4 µg ou mais altas resul- taram em respostas imunológicas humorais com títulos de IgG detec-

táveis, e o reforço homólogo resultou em um aumento apenas margi- nal nos títulos de IgG (dose cruzada). Exemplo 2

[00207] Para explorar as respostas celulares depois de um reforço homólogo com repRNA, foi conduzido um estudo com animais no qual os esplenócitos foram testados em um ELISPOT usando um peptídio específico para RSV-F. Manipulação dos Animais

[00208] Os estudos obedeceram todas as seções aplicáveis das Final Rules of the Animal Welfare Act regulations (9 CFR Parts 1, 2, e 3) e do Guide for the Care e Use of Laboratory Animals – National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition (the Guide).

[00209] Camundongos Balb/c fêmeas (6 semanas de idade) foram adquiridos no Jackson laboratories. Materiais da vacina

[00210] repRNA IVT foi gerado e formulado da maneira descrita no Exemplo 1. Vacinação e Desenho Experimental

[00211] Camundongos Balb/c foram vacinados com um esquema de imunização homóloga com dose inicial-reforço usando repRNA (vi- de Tabela 2 e Figura 4 para agrupamento e desenho experimental). Antes da imunização, cada camundongo foi anestesiado com 1-4% isoflurano em oxigênio por meio de uma máquina para anestesia de roedores, e recebeu injeções intramusculares (IM) de repRNA formu- lado com nanopartículas lipídicas (LNP) (50 µL). As doses inicial e de reforço foram dadas com um intervalo de 4 semanas (Figura 4).

[00212] Depois de 6 semanas, todos os camundongos foram sacri- ficados para obtenção dos esplenócitos para que fossem testados em um ensaio IFN-g ELISPOT usando o ensaio KYKNAVTEL de peptídios CTL específico para RSV-F.

Tabela 2: Agrupamento experimental dos animais em um estudo de imunização homóloga com repRNA (i.m.) para explorar respostas celu- lares Grupo Dose Reforço 1 Dose repRNA Camundongos/ Semanas de inicial (semana 4) (µg) grupo vacinação 1 PBS - 4 0,6† 2 repRNA - 1 10 0,6† 3 repRNA repRNA 1 10 0,4, 6† Ensaio ELISPOT de IFN-g

[00213] As respostas imunológicas celulares específicas para RSV - F usando esplenócitos foram determinadas no instante descrito na Fi- gura 4 pelo ensaio de imunocoloração ligado a enzimas e a interferon gama (ELISPOT) usando o kit IFNγ ELISPOT para células de camun- dongo da BD. Resumidamente, 500.000 esplenócitos por poço foram estimulados durante a noite com o peptídio RSV-F ativador de CTL (KYKNAVTEL) a uma concentração final de 1 µg/ml. Subsequente- mente, as colorações foram desenvolvidas de acordo com as instru- ções do fabricante do kit. Os resultados do ensaio ELISPOT estão mostrados na Figura 5 e indicam que as respostas celulares foram aumentadas apenas marginalmente (não estatisticamente significati- vas) depois de um reforço. Exemplo 3

[00214] Devido à ausência do potencial de reforço da vacina de re- pRNA IVT em um esquema homólogo dose inicial-reforço, foi conduzi- do um estudo com animais com o objetivo de explorar o potencial de imunizações heterólogas com dose inicial-reforço com vacinas à base de repRNA em combinação com vacinas à base de Adeno, ambas co- dificando um antígeno modelo. Em particular, o estudo testou duas va- cinações heterólogas, compreendendo repRNA e Ad26-RSV-F com um intervalo de 4 semanas entre as imunizações, para determinar se a vacinação com dose inicial-reforço heterólogo melhoraria a resposta humoral ou celular em comparação com a vacinação com repRNA homólogo dos Exemplos 1 e 2. Manipulação dos Animais

[00215] Estes estudos obedeceram todas as seções aplicáveis das Final Rules of the Animal Welfare Act regulations (9 CFR Parts 1, 2, e 3) e do Guide for the Care e Use of Laboratory Animals – National Academy Press, Washington D.C. Eight Edition (the Guide).

[00216] Um total de 36 camundongos Balb/c fêmeas (6 semanas de idade) foram adquiridos no Jackson laboratories Materiais da vacina

[00217] repRNA IVT foi gerado e formulado da maneira descrita no Exemplo 1.

[00218] O vetor adenoviral recombinante, que foi um vetor vacinal de adenovírus recombinante deficiente em replicação, de E1/E3 dele- tado, purificado, do tipo 26 (Ad26) contendo o gene de RSV-F inserido na posição E1, foi produzido pela Janssen R&D. O vetor foi resgatado em células PER.C6®, purificado em placas, ampliado e em seguida purificado por um procedimento em bandas de CsCl ("CsCl banding procedure") de duas etapas, e subsequentemente formulado em um tampão de formulação à base de TRIS e armazenado abaixo de -65°C.

[00219] O vetor adenoviral recombinante expressou RSV-F deriva- do da cepa RSV-A2. A proteína RSV-F expressa tinha a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

[00220] Os materiais da vacina foram armazenados a -80°C em um refrigerador de temperatura controlada. Vacinação e Desenho Experimental

[00221] Camundongos Balb/c foram vacinados com um esquema de dose inicial-reforço heterólogo usando o vetor de repRNA e Adeno (vide Tabela 3 e Figura 6 para agrupamento e desenho experimental). Antes da imunização, cada camundongo foi anestesiado e recebeu injeções intramusculares (IM) de vetor Adeno ou de repRNA formulado como nanopartículas lipídicas (LNP) (como descrito no Exemplo 1) na coxa traseira. As doses inicial e de reforço foram dadas com um inter- valo de 4 semanas (Figura 6).

[00222] O estudo com animais foi realizado para explorar se uma vacinação com dose inicial-reforço heterólogo usando repRNA e Ad26- RSV-F melhoraria a resposta humoral ou celular (vide Tabela 3 para agrupamento dos camundongos e Figura 6 para desenho experimen- tal) em contraste com a vacinação com repRNA homólogo, como de- monstrado pelos Exemplos 1 e 2. Todas as imunizações foram intra- musculares. Três grupos de controle de camundongos receberam so- mente as imunizações primárias (i.m.) com PBS, com repRNA formu- lado como LNP (1 µg), ou com Ad26-RSV-F (1x109 vp). O potencial das imunizações heterólogas com dose inicial-reforço foi testado em dois grupos adicionais de camundongos. Um grupo de 8 camundongos recebeu a dose inicial de repRNA formulado como LNP (1 ug) e 4 se- manas depois recebeu um reforço com Ad26-RSV-F (1x109 vp). O ou- tro grupo de 8 camundongos recebeu a dose inicial de Ad26-RSV-F (1x109 VPs) seguido por um reforço, depois de 4 semanas, com repR- NA formulado como LNP (1 µg). Tabela 3: Agrupamento experimental de animais em estudo de imuni- zação heteróloga Grupo Dose inicial Reforço 1 Dose Ade- Dose repRNA Camundon- Semanas de (semana 4) no (VPs) (µg) gos/ grupo vacinação 1 PBS PBS - - 4 0, 6+ 2 repRNA - - 1 8 0, 6+ 3 adenovírus - 109 - 8 0, 6+ 4 repRNA adenovírus 109 1 8 0, 4, 6+ 5 adenovírus repRNA 109 1 8 0, 4, 6+ ELISA de IgG Anti-RSV-F

[00223] As respostas humorais específicas para RSV-F foram de- terminadas 42 dias após a imunização por meio de análise ELISA de IgG anti-RSV-F, como descrito no Exemplo 1. Os resultados do ensaio ELISA estão mostrados na Figura 7. As imunizações heterólogas com dose inicial-reforço com repRNA e com o vetor adenoviral resultaram em respostas imunológicas humorais com título de IgG aumentados em comparação com as imunizações homólogas com repRNA ou com o vetor adenoviral. Ensaio ELISPOT de IFN-γ

[00224] As respostas imunológicas celulares (esplenócitos) especí- ficas para RSV-F foram determinadas 42 dias após a imunização por meio de análise ELISPOT com interferon gama como descrito no Exemplo 2. Os resultados do ensaio ELISPOT estão mostrados na Fi- gura 8. As imunizações heterólogas com dose inicial-reforço com re- pRNA e com o vetor adenoviral resultaram em respostas imunológicas celulares aumentadas em comparação com as imunizações apenas primárias com repRNA ou com o vetor adenoviral.

[00225] Em suma, o estudo demonstrou que respostas imunológi- cas humoral e celular aumentadas foram induzidas pela imunização com vacinas heterólogas de repRNA e vetores adenovirais em compa- ração com as imunizações homólogas apenas com repRNA ou com o vetor adenoviral.

[00226] Os especialistas na técnica vão perceber que é possível fazer alterações nas modalidades descritas acima sem se afastar do amplo conceito inventivo das mesmas. Fica, portanto, entendido que esta invenção não está limitada às modalidades particulares divulga- das, mas que pretende cobrir modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção definida pelas reivindicações em anexo.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo humano com necessidade do mesmo, caracterizado por compreender: a. administrar ao indivíduo humano uma primeira compo- sição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um RNA autorreplicante (repRNA) transcrito in vitro (IVT) compreen- dendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e b. administrar ao indivíduo uma segunda composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, para assim obter uma resposta imunológica induzida no in- divíduo humano, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas compartilham pelo menos um determinante antigênico, e uma das composições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o repRNA IVT é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o vetor adenoviral é a composição de reforço.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o vetor adenoviral é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o repRNA IVT é a composição de reforço.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a resposta imunológica induzida compreende uma resposta imunológica induzida por anticorpos contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primei- ra e segunda proteínas antigênicas no indivíduo humano.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a resposta imunológica induzida compreende uma resposta imunológica induzida por células contra o pelo menos um determinante antigênico compartilhado pelas primeira e segunda proteínas antigênicas no indivíduo humano.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a resposta imunológica induzida proporciona uma imunidade protetora ao indivíduo humano contra uma doença relacionada com pelo menos uma das primeira e segunda pro- teínas antigênicas.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o repRNA IVT é um repRNA do vírus da encefalite equina venezuelana (VEE).

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral é um vetor re- combinante do adenovírus humano sorotipo 26 (Ad26) ou um vetor recombinante do adenovírus humano sorotipo 35 (Ad35).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição de reforço é admi- nistrada 1-52 semanas depois de a composição de dose inicial ser administrada.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a composição de reforço é administrada pelo menos 1 semana depois de a composição de dose inicial ser administrada.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda proteínas antigênicas são derivadas de um patógeno ou de um tumor.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a primeira ou a segunda proteína antigênica é derivada de um vírus.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda proteínas antigênicas são idênticas ou substancialmente idênticas.

14. Combinação para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo humano, caracterizada por compreender: c. uma primeira composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e d. uma segunda composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína anti- gênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um car- reador farmaceuticamente aceitável, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas com- partilham pelo menos um determinante antigênico, e uma das compo- sições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço.

15. Uso de uma combinação para a preparação de um me- dicamento para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo humano, caracterizado por compreender: e. uma primeira composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um repRNA IVT compreendendo um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína antigênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável, e f. uma segunda composição compreendendo uma quanti- dade imunologicamente eficaz de um vetor adenoviral compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína anti- gênica ou um polipeptídio imunogênico da mesma, junto com um car- reador farmaceuticamente aceitável, em que a primeira e a segunda proteínas antigênicas com- partilham pelo menos um determinante antigênico, e uma das compo- sições é uma composição de dose inicial e a outra composição é uma composição de reforço.

16. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o repRNA IVT é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o vetor adenoviral é a compo- sição de reforço.

17. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o vetor adenoviral é a composição de dose inicial e a composição compreendendo o repRNA IVT é a com- posição de reforço.

18. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a primeira ou a segunda proteína antigênico ou um polipeptídio imuno- gênico da mesma é derivada de um patógeno ou de um tumor.

19. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a primeira ou a segunda proteína antigênico ou um polipeptídio imuno- gênico da mesma é derivada de um vírus.

20. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda proteínas antigênicas são idênticas ou substan- cialmente idênticas.

21. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o repRNA IVT é um repRNA do vírus VEE.

22. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral é um vetor de Ad26 ou um vetor de Ad35.