PL215165B1 - Rekombinowany wektor adenowirusowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego - Google Patents

Rekombinowany wektor adenowirusowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego

Info

Publication number
PL215165B1
PL215165B1 PL373304A PL37330403A PL215165B1 PL 215165 B1 PL215165 B1 PL 215165B1 PL 373304 A PL373304 A PL 373304A PL 37330403 A PL37330403 A PL 37330403A PL 215165 B1 PL215165 B1 PL 215165B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
serotype
adenovirus
cell
orf6
adenoviral vector
Prior art date
Application number
PL373304A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373304A1 (pl
Inventor
Ronald Vogels
Abraham Bout
Original Assignee
Crucell Holland Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Crucell Holland Bv filed Critical Crucell Holland Bv
Publication of PL373304A1 publication Critical patent/PL373304A1/pl
Publication of PL215165B1 publication Critical patent/PL215165B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C12N2810/6018—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest rekombinowany wektor adenowirusowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego.
Dziedzina wynalazku
Wynalazek dotyczy nośników do dostarczania kwasu nukleinowego i ich zastosowania, dokładniej wynalazek dotyczy rekombinowanych wektorów adenowirusowych i ich zastosowania.
Tło wynalazku
Do chwili obecnej zidentyfikowano 51 serotypów ludzkich adenowirusów, które podzielono na 6 podgrup (A, B, C, D, E i F) opierając się na ich zdolnościach hemaglutynacji i homologii sekwencji (Francki i wsp., 1991). Cykl infekcji adenowirusa dzieli się na fazę wczesną i późną. W fazie wczesnej, wirus zostaje pozbawiony kapsydu i genom jest transportowany do jądra, po czym aktywne transkrypcyjnie stają się wczesne regiony genu (E1, E2, E3 i E4). Region E1 zawiera dwa regiony transkrypcji: E1A i E1B. E1A koduje białka uczestniczące w modyfikacji cyklu komórki gospodarza i aktywowaniu innych regionów transkrypcyjnych wirusa (przegląd dokonany przez Russell, 2000). Region E1B koduje dwa główne białka: E1B-19K i E1B-55K, które zapobiegają indukcji apoptozy będącej wynikiem aktywności białek E1A (Rao i wsp., 1992; Yew i Berg, 1992; Shenk, 1996). Ponadto, białko E1B-55K jest wymagane w późnej fazie dla wybiórczego transportu wirusowego mRNA i hamowania ekspresji białka gospodarza (Pilder i wsp., 1986). E2 jest również podzielony na dwie poddomeny E2A i E2B, które razem kodują trzy białka (białko wiążące DNA, wirusową polimerazę i białko preterminalne), które uczestniczą w replikacji wirusowego genomu (Van der Vliet, 1995). E3 nie jest niezbędny dla replikacji in vitro lecz koduje szereg białek, które hamują mechanizm obronny gospodarza przeciw infekcji wirusowej (Horwitz, 2001). E4 niesie przynajmniej 6 otwartych ramek odczytu (orf) kodujących białka uczestniczące w szeregu różnych funkcji związanych ze składaniem i transportem wirusowego mRNA, transportem mRNA komórki gospodarza, wirusową i komórkową transkrypcją i transformacją (przeglądu dokonał Leppard, 1997). Późne białka niezbędne dla utworzenia wirusowych kapsydów i pakowania wirusowego genomu są wszystkie wytworzone w oparciu o główną, późną jednostkę transkrypcyjną (MLTU), która staje się w pełni aktywna po zajściu replikacji. Złożone procesy różnicowego składania i poliadenylacji dają więcej niż 15 rodzajów mRNA o wspólnej trzyczęściowej sekwencji lidera. Białka E1B-55K, E4-orf3 i E4-orf6 odgrywają kluczową rolę w regulacji obróbki i transportu z jądra komórkowego późnego, wirusowego mRNA. W tym celu E1B-55K oddziałuje z E4-orf6 tworząc funkcjonalny kompleks, który pobudza transport wirusowego mRNA do cytoplazmy, gdzie kompleks uczestniczy również w hamowaniu transportu komórkowego mRNA z jądra komórkowego do cytoplazmy (przeglądu dokonał Leppard, 1997 i 1998).
Wytwarzanie wektorów z delecją E1 opartych na podgrupie C serotypach Ad5 lub Ad2 jest osiągnięte w liniach komórkowych komplementujących E1 takich jak 293 (Graham i wsp., 1970), 911 (Fallaux i wsp., 1996) i PER.C6™ (Fallaux i wsp., 1998, Depozyt nr ECACC96022940). Jak ujawniono w WO/55132 i WO 01/05945 wektory i linie komórkowe mogą być tak dopasowane by zapobiec zachodzeniu replikacji kompetentnych adenowirusów przez rekombinację homologiczną pomiędzy sekwencjami adenowirusa w linii komórkowej i wektorem. Dla wydajnego wytwarzania replikacyjnie niekompetentnych adenowirusów pochodzących z grupy C, dogodnie stosuje się linię komórkową PER.C6™. Przy pomocy tej linii komórkowej dopasować można wektory adenowirusowe, a co za tym idzie, umożliwia to wytwarzanie wektorów adenowirusowych z grupy C przy braku replikacyjnie kompetentnych adenowirusów (Fallaux i wsp., 1998; patent US nr 6,033,908). Natomiast, wektory z grupy C mogą nie zawsze być idealnymi nośnikami dla bezpośrednich zastosowań in vivo, ponieważ wydajność infekcji jest poważnie ograniczona przez obecność wysokiego miana aktywności neutralizującej u większości ludzi i braku dostatecznej ilości receptora komórkowego (Coxsackie - receptor adenowirusa, CAR) na specyficznych pierwotnych komórkach docelowych (np. komórkach śródbłonka, komórkach mięśnia gładkiego, komórkach maziówkowych, monocytach i komórkach dendrytycznych). Podanie większych ilości wirusów w celu zwiększenia transdukcji może prowadzić do zwiększonej toksyczności i nie przewidywalnych objawów klinicznych związanych ze zmiennością mian neutralizujących u leczonych podmiotów. Ograniczeń tych można uniknąć przez użycie innych serotypów adenowirusów. Przykładowo, receptor wiążący część włókna wirusów z podgrupy B (w szczególności serotyp 16), gdy ulegał ekspresji z wektora opartego na Ad5, pośredniczył w znacząco zwiększonej infekcji ludzkich komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich (WO 00/31285) oraz ludzkich komórek maziówkowych (WO 00/52186). Włókno innego adenowirusa z podgrupy B, Ad35 jest najbardziej
PL 215 165 B1 skuteczne w wywoływaniu zakażenia ludzkich monocytów i komórek dendrytycznych (WO 00/03029). Ponadto, Ad35 został zidentyfikowany jako wirus, dla którego ogromna większość ludzkiej populacji nie posiada aktywności neutralizującej (WO 00/70071).
W dziedzinie istnieje ogólnie odczuwana potrzeba opracowania technologii wykorzystującej więcej serotypów. Szczególnym problemem jest brak użytecznych linii komórek pakujących dla tych innych serotypów. Linie komórek pakujących dla wektorów Ad5 typowo zawierają białka kodowane przez E1 pochodzące od adnowirusa o serotypie 5. Przykłady takich „typowych, pakujących linii komórkowych to 293, 911 i PER.C6™. Próby wytworzenia wektorów pochodzących od innych serotypów na tych standardowych liniach komórek pakujących okazały się mało pomyślne, jeśli nie nieudane. Wyjątkowo obserwuje się pewne wytwarzanie w zależności od szczególnego użytego serotypu. Natomiast wydajność rekombinowanych wektorów adenowirusowych pochodzących z innych podgrup adenowirusa niż podgrupa C wytwarzanych na transformowanych liniach komórkowych i unieśmiertelnionych przez E1 z Ad5, jest mała. W publikacji Abrahamsena i wsp. (1997) zaobserwowano poprawione oczyszczanie z łysinki wektorów adenowirusowych o serotypie 7 z delecją E1A (podgrupa B) w komórkach 293 zawierających E4-orf6 pochodzący z adenowirusa o serotypie 5, w porównaniu z komórkami 293 pozbawionymi sekwencji E4-orf6 z Ad5. Jednakże, pojawiły się problemy ze stabilnością wektora, bowiem zaobserwowano nieoczekiwane rekombinacje w roztworach wyjściowych oczyszczonych z łysinek. Dodatkowy problem był związany z zanieczyszczeniem wirusami - adenowirusami typu dzikiego, podczas produkcji. Ponadto, dla wielkoskalowej produkcji adenowirusów nie jest użyteczne współtransfekowanie E4-orf6 dla uzyskania mian, które są dostatecznie wysokie do zastosowania. Jedną opcją hodowania takich adenowirusów jest dostarczenie komórek z genem E4-orf6 stabilnie wbudowanym do genomu linii komórkowej komplementującej/pakującej. Takie komórki opisano w dziedzinie (np. WO 96/22378). Niekorzystną stroną tego systemu jest fakt, że powinny zostać wytworzone nowe, stabilne linie komórkowe i szereg rund selekcji powinno być przeprowadzonych zanim wytworzone zostaną stabilne i odpowiednie komórki. Proces ten jest pracochłonny i czasochłonny. Ogólnie, można stwierdzić, że wytwarzanie i namnażanie adenowirusów o serotypach innych niż serotyp 5 (podgrupa C), takich jak wirusy z podgrupy B, okazało się być trudne na liniach komórkowych komplementujących Ad5. Jak ujawnili zgłaszający w zgłoszeniu w WO 00/70071 rekombinowane wirusy oparte na wirusach podgrupy B Ad35 mogą być wytwarzane przez kotransfekcję konstruktu ekspresyjnego zawierającego sekwencje wczesnego regionu-1 Ad35 (Ad35-E1). Ponadto, wirusy oparte na Ad35, które mają usunięte jedynie sekwencje E1A, a nie E1B okazały się wydajnie replikować w komórkach PER.C6, co sugeruje że białka E1A z Ad5 są w stanie komplementować funkcje Ad35-E1A (jeszcze nie opublikowane Międzynarodowe Zgłoszenie PCT/NL01/00824, Zgłaszającego). Ponadto, doświadczenia pokazują, że brak Ad35-E1B prowadzi do słabego namnażania na komórkach komplementujących Ad5. WO 00/70071 ujawnia również linie komórkowe do wytwarzania wektorów adenowirusowych z grupy nie C z delecją E1 przez dalsze modyfikowanie linii komórkowych, które są zdolne do komplementowania adenowirusów o serotypie 5. WO 00/70071 sugeruje ponadto, że powinny zostać ustalone nowe linie komórkowe niosące sekwencje Ad35-E1 do komplementowania rekombinowanych wektorów adenowirusowych o serotypie 35 pozbawionych regionu E1 (patrz również międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/NL01/00824, Zgłaszającego). Natomiast, jak również dyskutowano powyżej, jeśli wskazane jest zastosowanie specyficznego serotypu dla specyficznej potrzeby, trzeba ustalić nową linię komórkową dla każdego specyficznego serotypu lub zmodyfikować dostępne linie komórkowe, które mogą komplementować adenowirusa o serotypie 5 dla komplementowania serotypu będącego przedmiotem zainteresowania. Oczywistym jest, że dogodne byłoby stosowanie ustalonych linii komórkowych, które są dostępne w dziedzinie i nie modyfikowanie ich oraz stosowanie ich do wytwarzania wszystkich innych serotypów nie Ad5, stosując ustalone i wydajne sposoby znane w dziedzinie. Podsumując, do niniejszego wynalazku nie były dostępne w dziedzinie plastyczne i odpowiednie „platformy produkcyjne umożliwiające wytwarzanie użytecznych ilości adenowirusów o serotypach innych niż serotypy z grupy C.
Krótki opis Figur.
Fig. 1 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu ρΔΜΤ.Orf6.Hygro (Depozyt nr ECACC P02041226). Dla jasności duże D oznacza delta (Δ).
Fig. 2 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu pAd35^MT.Orf6. Dla jasności duże D oznacza delta (Δ).
Fig. 3 jest schematycznym przedstawieniem pUC.35-5E4.
Fig. 4 przedstawia etapy klonowania dla uzyskania pUC.35-5E4.
PL 215 165 B1
Fig. 5 jest schematycznym przedstawieniem pBr.Ad35.PRn.
Fig. 6 jest schematycznym przedstawieniem pBr.Ad35.PRE4 (Depozyt nr ECACC P02041229).
Fig. 7 jest schematycznym przedstawieniem pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4.
Fig. 8 jest schematycznym przedstawieniem pCRscriptAmp.NFI.NcoIR.
Fig. 9 jest schematycznym przedstawieniem pCRscriptAmp.NcoIFNR2.
Fig. 10 jest schematycznym przedstawieniem pCRNF1-NR2.
Fig. 11 przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowej E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 5 (NR ID. SEKW.:21; górna sekwencja) z sekwencją aminokwasową białka E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 5 sklonowanego w szkielecie Ad35 (NR ID. SEKW.:21; środkowa sekwencja; NB. identyczna z E4-orf6 z Ad5, górna sekwencja) jakie otrzymano przez określenie kolejności nukleotydów i sekwencji aminokwasowej białka E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 35 (NR ID. SEKW.:22; dolna sekwencja) pokazujące, że cały fragment kodujący białko E4-orf6 w szkielecie Adenowirusa o serotypie 35 został zastąpiony przez fragment kodujący białko E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 5.
Fig. 12 przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowych białka E4-orf6/7 z Adenowirusa o serotypie 5 (NR ID. SEKW.:23; górna sekwencja) z sekwencją aminokwasową E4-orf6/7 białka fuzyjnego kodowanego częściowo przez adenowirusa o serotypie 5, fragment E4-orf6/7 zastępujący odpowiadającą mu część fragmentu E4-orf6/7 adenowirusa o serotypie 35 w szkielecie Adenowirusa o serotypie 35 (NR ID. SEKW.:24; środkowa sekwencja) i sekwencja aminokwasowa białka E4-orf6/7 z Adenowirusa o serotypie 35 (NR ID. SEKW.:25, dolna sekwencja); pokazuje, że sekwencja orf6/7 jest częściowo chimerowa z fuzją w przybliżeniu w reszcie lizyny (K) w pozycji 138. Dla jasności, oznaczenie orf6+7 powinno być czytane jako otwarta ramka odczytu orf6/7, która jest oddzielną ramką odczytu w regionie E4 adenowirusów pomiędzy orf6 i orf7, co jest oznaczeniem dobrze znanym specjalistom w dziedzinie.
Fig. 13 jest schematycznym przedstawieniem pBrAd35.PR.5Orf6 (Depozyt nr ECACC P02041227).
Fig. 14 jest schematycznym przedstawieniem pWE.Ad35.pIX-rITR.5Orf6.
Fig. 15 jest schematycznym przedstawieniem pBr.Ad35.PRnAE3. Dla jasności D oznacza delta (Δ).
Fig. 16 jest schematycznym przedstawieniem pBr.Ad35^E3.PR5E4. Dla jasności D oznacza delta (Δ).
Fig. 17 jest schematycznym przedstawieniem pBr.Ad35^E3.PR5Orf6. Dla jasności D oznacza delta (Δ).
Fig. 18 przedstawia system do wytwarzania rekombinowanych cząsteczek adenowirusa w komórkach takich jak PER.C6 przez podwójną rekombinację homologiczną.
Fig. 19 przedstawia pWE.Ad35.pIX-EcoRV.
Krótki opis wynalazku.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest rekombinowany wektor adenowirusowy, charakteryzujący się tym, że zawiera strukturalne i niestrukturalne elementy z adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany wektor zawiera ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 z adenowirusa o drugim serotypie innym niż wspomniany pierwszy serotyp.
W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp i wspomniany drugi serotyp korzystnie są z różnych podgrup adenowirusa.
W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp korzystnie jest z podgrupy innej niż podgrupa C a wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy C.
W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp korzystnie jest z podgrupy B a wspomniany drugi serotyp jest z podgrupy C.
Korzystnie wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi w wektorze według wynalazku z adenowirusa o serotypie 5.
W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp korzystnie jest wybrany z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50.
Korzystnie rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku zawiera ponadto sekwencję kodującą nie-adenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd.
Korzystnie wspomniane nie-adenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd w wektorze według wynalazku są wybrane z grupy składającej się z polipeptydu indukującego śmierć komórki, determ inanty antygenowej organizmu patogennego, antygenu specyficznego dla guza, białka wirusa, hormonu i cytokiny.
PL 215 165 B1
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego zawierającego strukturalne i nie-strukturalne elementy adenowirusa nie z podgrupy C o pierwszym serotypie, polegający na tym, że:
a. dostarcza się komórkę komplementującą niosącą sekwencję kodującą E1B-55K pochodzącą z adenowirusa o serotypie 5 (Ad5) w postaci ulegającej ekspresji, z niezbędnymi elementami adenowirusa pozwalającymi na składanie wspomnianego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej pewne elementy strukturalne i niestrukturalne z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie nie z podgrupy C i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 Ad5;
b. hoduje się wspomnianą komórkę komplementującą w pożywce w warunkach pozwalających na wytwarzanie i składanie wektora adenowirusowego; i
c. zbiera się tak wytworzony, rekombinowany wektor adenowirusowy z pożywki i/lub komórki komplementującej, gdzie sekwencja kodująca białko E4-orf6 Ad5 występuje w tak wytworzonym rekombinowanym wektorze adenowirusowym.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp jest serotypem adenowirusa z podgrupy B.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp wybiera się z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K jest wbudowana do genomu wspomnianej komórki komplementującej.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka pochodzi z pierwotnej, diploidalnej komórki człowieka lub jej komórki progenitorowej.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka komplementująca pochodzi z pierwotnej ludzkiej komórki blastycznej statkówki, pierwotnej ludzkiej komórki zarodkowej nerki, pierwotnej ludzkiej komórki nerwowej lub pierwotnego ludzkiego amniocytu.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka komplementująca posiada wbudowany do swojego genomu kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno białko E1A Ad5.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka komplementująca jest komórką PER.C6 lub jej pochodną.
Niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowanych wektorów adenowirusowych zawierających strukturalne i niestrukturalne elementy z adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany wektor zawiera ponadto sekwencję kodującą białko E4-orf6, która to wspomniana sekwencja jest wybrana z grupy składającej się z sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o drugim serotypie innym niż serotyp pierwszy. Opisano tu także sekwencję kodującą E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o pierwszym wspomnianym serotypie otrzymaną przez delecję, mutację, insercję i/lub substytucję w jednym lub większej liczbie kodonów oraz sekwencję kodującą E4-orf6 zawierającą fuzję pomiędzy częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z drugiego serotypu innego niż wspomniany pierwszy serotyp i częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z trzeciego serotypu, przy czym wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub różny od wspomnianego pierwszego serotypu.
Opisano tu ponadto sposoby wytwarzania takich rekombinowanych wektorów adenowirusowych zawierających elementy strukturalne i niestrukturalne adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany sposób obejmuje etapy: a) dostarczania komplementującej komórki niosącej sekwencję kodującą E1B-55K pochodzącą z adenowirusa o drugim serotypie w postaci umożliwiającej ekspresję, z niezbędnymi elementami adenowirusa takimi jak pozwalające na składanie wspomnianego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej niektóre elementy strukturalne i niestrukturalne z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie innym niż wspomniany drugi serotyp i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6, lub jego funkcjonalną część, jego pochodną i/lub analog, który jest zgodny ze wspomnianym białkiem mogącym ulegać ekspresji we wspomnianej, komplementującej komórce; b) hodowania wspomnianych komplementujących komórek w pożywce w warunkach pozwalających na wytworzenie i złożenie wektora adenowirusowego; i c) zbierania tak wytworzonego, rekombinowanego wektora adenowirusowego z pożywki i/lub komórki komplementującej, przy czym w tak wytworzonym, rekombinowanym wektorze adenowirusowym obecna jest sekwencja kodująca zgodna z białkiem E4-orf6.
PL 215 165 B1
Ponadto opisano tu kompozycje farmaceutyczne zawierające wektory adenowirusowe według wynalazku i leczenie osobników przy pomocy wektorów adenowirusowych dostarczonych przez niniejszy wynalazek. Opisano tu również zestaw części obejmujący linie komórkowe i wektory adenowirusowe dostarczone przez wynalazek do realizacji sposobu dostarczonego przez wynalazek.
Szczegółowy opis.
Niniejszy wynalazek ujawnia sposoby i środki, które rozwiązują pewne trudności związane ze zmniejszoną komplementacją wektorów adenowirusowych z nie-grupy C w komórkach pakujących/komplementujących Ad5. Choć w liniach komórkowych komplementujących Ad5 zachodzi funkcjonalna ekspresja E1B-55K z Ad5, stwierdzono, że wytwarzane mogą być jedynie bardzo niskie miana wektorów adenowirusowych, w przypadku gdy szkielet adenowirusowy pochodził z adenowirusa nie-grupy C; to stwierdzenie oznacza specyficzność serotypową w oddziaływaniu E1B-55K z innym (wirusowym) białkiem. Ujawniono tu, że ta zależność serotypowa może być przełamana przez dostarczenie białka E4-orf6 zgodnego z białkiem E1B-55K dostarczonym przez komplementującą linię komórkową. Jak tu ujawniono, E1B-55K i E4-orf6 tworzą kompleks uczestniczący w hamowaniu transportu komórkowego mRNA z jądra komórkowego do cytoplazmy, gdzie kompleks uczestniczy również w pobudzeniu transportu wirusowego mRNA z jądra do cytoplazmy. Twórcy niniejszego wynalazku zaobserwowali również, że odpowiednie komplementowanie wektorów wirusowych w komórkach pakujących wymaga obecności produktów genów E1B-55K i E4-orf6, które są zgodne. Komórki pakujące są również określone jako komórki komplementujące jeśli komórki zawierają określone sekwencje kodujące białka komplementujące funkcje nie dostarczane przez wektor, który powinien być zapakowany. „Zgodne w użytym tu znaczeniu oznaczają, że kompleks pomiędzy dostępnym produktem genu E1B-55K jest zdolny do tworzenia funkcjonalnego kompleksu z dostępnym produktem genu E4orf6 w tym sensie, że kompleks białka podtrzymuje replikację wirusa, namnażanie i/lub pakowanie do poziomu, który jest porównywalny do sytuacji wirusa typu dzikiego, lub który jest porównywalny do sytuacji stwierdzonej gdy wytworzony jest rekombinowany wektor adenowirusowy o serotypie 5 w linii komórkowej komplementującej Ad5 takiej jak 293 lub PER.C6. Replikacja wektora w komórkach pakujących jest wydajna, jeśli podczas etapu produkcji, gdy powstaje wirus, komórka zawiera przynajmniej zgodne białka E1B-55K i E4-orf6. Dogodnie sekwencje E1B-55K i E4-orf6 są z adenowirusa z tej samej podgrupy adenowirusa (takiej jak A, B, C, D, E lub F). Dogodniej sekwencje E1B-55 i E4-orf6 są z tego samego serotypu. Ponieważ w dziedzinie dostępne są ustalone linie komórkowe, które są zdolne wspierać wzrost adenowirusa z podgrupy C, takie jak serotyp 5, jest nawet bardziej zalecane by geny E1B-55K i E4-orf6 pochodziły z adenowirusa o serotypie 5. Dla specjalisty w dziedzinie będzie zrozumiałe, że zgodność może być określona w testach lub oznaczeniach komplementacji takich jak znane specjalistom w dziedzinie wytwarzania wektorów adenowirusowych. Specjaliści w dziedzinie zrozumieją również, że niniejszy wynalazek może również być stosowany do wytwarzania jakiegokolwiek serotypu adenowirusa w jakiejkolwiek komplementującej linii komórkowej pod warunkiem, że białka E1B-55K i E4-orf6 są zgodne.
Ponadto, zaobserwowano, że produkt genu E4-orf6 „pasujący do E1B w linii komórek komplementujących, może być dostarczany przez wektor adenowirusowy przez zastąpienie E4-orf6 w wybranym wektorze adenowirusowym, przez sekwencję kodującą E4-orf6, która jest zgodna z genem E1B obecnym w pakującej linii komórkowej. Co zaskakujące, stwierdzono, że modyfikacja ta nie ma szkodliwego wpływu na stabilność, replikację, pakowanie, składanie i wytwarzanie wektora.
W specyficznym aspekcie wynalazku można skutecznie wytwarzać adenowirusy o serotypach innych niż te z podgrupy C w liniach komórkowych normalnie stosowanych do wytwarzania adenowirusa o serotypie 5 lub innych serotypów z podgrupy C, takich jak serotyp 1, 2 i 6. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania adenowirusów nie-grupy C bez konieczności oddzielnego dostarczenia komórek komplementujących (pakujących) z E4-orf6, ponieważ sekwencja E4-orf6, która jest zgodna z komplementującą sekwencją E1B-55K, jest włączona w szkielet adenowirusowy.
Niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowany wektor adenowirusowy zawierający elementy strukturalne i niestrukturalne adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany wektor zawiera ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 o drugim serotypie innym niż wspomniany pierwszy serotyp. Wspomniana sekwencja może być wybrana z grupy składającej się z: a) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o drugim serotypie innym niż wspomniany pierwszy serotyp; lub b) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie zawierającym delecję, mutację, insercję i/lub substytucję w jednym lub większej liczbie kodonów; i c) sekwencję kodującą E4-orf6 zawierającej fuzję pomiędzy częścią sekwencji koPL 215 165 B1 dującej E4-orf6 pochodzącej z drugiego serotypu innego niż wspomniany pierwszy serotyp i część sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z trzeciego serotypu, który to wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub różny niż wspomniany pierwszy serotyp. W jednym z wykonań niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku, w którym wspomniany pierwszy serotyp i wspomniany drugi serotyp są z różnych podgrup adenowirusa. W korzystnym wykonaniu dostarczony jest rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku, w którym wspomniany pierwszy serotyp jest z podgrupy innej niż podgrupa C a wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy C. Korzystniejszy jest rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku, w którym to wspomniany pierwszy serotyp jest z podgrupy B a wspomniany drugi serotyp jest z podgrupy C. Jeszcze, gdy wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie 5.
Specjaliści w dziedzinie dostrzegli, że u ludzi krążą różne poziomy neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciw różnym serotypom. Stwierdzono, że określone serotypy adenowirusa natrafiają na wysokie miana takich przeciwciał neutralizujących i wiele osobników w różnych populacjach posiada przeciwciała neutralizujące takie serotypy. Stwierdzono również, że określone serotypy były tylko neutralizowane w mniejszości próbek (WO 00/70071). Najwyraźniej, określone serotypy z podgrupy B były neutralizowane jedynie w małej grupie próbek. Co za tym idzie, w korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, dostarczone są rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku, w których wspomniany pierwszy serotyp jest wybrany z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50. Wysoce zalecane są rekombinowane wektory adenowirusowe, w których wspomniany pierwszy serotyp jest serotypem 11 lub 35, podczas gdy te spotkane neutralizujące go przeciwciała występują jedynie w bardzo małym procencie badanych próbek.
Wektory według wynalazku mogą być stosowane w różnych sytuacjach takich jak terapia genowa, genomika funkcjonalna, szczepienie przeciwko guzowi i/lub szczepienie przeciwwirusowe. Dla tego celu niezbędne jest aby wektor adenowirusowy funkcjonował jako nośnik dostarczający gen, w którym gen nie-natywny jest włączany do genomu adenowirusa. Cząsteczka adenowirusa może następnie być specyficznie adresowana do komórek docelowych będących przedmiotem zainteresowania; adenowirus wiąże się ze specyficznymi komórkami albo przez wiązanie kapsyd-receptor albo innymi sposobami i dostarcza transgen. Adresowanie adenowirusów może być dokonane na wiele różnych sposobów. Specjaliści w dziedzinie adresowania wektora adenowirusowego będą znali wszystkie, różne możliwości, które stosuje się do dostarczania wektorów adenowirusowych do komórek będących przedmiotem zainteresowania. Takie możliwości obejmują, ale bez ograniczenia, zmianę kapsydu (modyfikacji włókna, heksonu i/lub pentonu, takich jak delecje, zamiany pomiędzy włóknami o różnych serotypach i insercje peptydów i/lub innych wiążących cząsteczek), przy czym wytwarzane są włókna chimerowe, które rozpoznają receptor na komórce będącej przedmiotem zainteresowania lub w których wykorzystane jest wiązanie oparte na pentonie. Innymi możliwościami jest związanie adresujących cząsteczek z białkami kapsydu, w których przykładowo wiążące peptydy, znane i silnie wiążące białka lub przeciwciała lub ich części, wiąże się z białkami kapsydu dla osiągnięcia specyficznego adresowania. Takie wektory mogą wszystkie być wyprodukowane przy pomocy sposobów dostarczonych przez niniejszy wynalazek i środków tu opisanych. Co za tym idzie, niniejszy wynalazek ujawnia również rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku, zawierające ponadto sekwencję kodującą nieadenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd. Takie sekwencje mogą występować w różnych miejscach w szkielecie adenowirusowym, lecz dogodnie są umiejscowione w regionie E1, którego brak w rekombinowanych wektorach adenowirusowych według wynalazku. Region E1 jest komplementowany przez elementy (komplementacyjne) obecne w komplementujących komorach. Orientacja promotora, transgenu i innych sekwencji regulatorowych może być skierowana ku lewemu, jak również ku prawemu odwróconemu, końcowemu powtórzeniu.
Niniejszy wynalazek może również być stosowany do wytwarzania wektorów wirusowych opartych na adenowirusie i/lub innych wirusach, takich jak wirus towarzyszący adenowirusowi (ang. Adeno-Associated Virus, AAV), w którym kombinacja taka jak wirus chimerowy Ad-AAV może wbudować się do genomu komórki gospodarza. W dziedzinie znanych jest wiele sposobów wytwarzania integrujących adenowirusów. Ogólnie, wynalazek jest również użyteczny do wytwarzania postaci adenowirusa, które (specyficznie lub niespecyficznie) mogą integrować.
Jak wspomniano, szereg nieadenowirusowych transgenów może być klonowanych do rekombinowanych wektorów adenowirusowych. Korzystnie w sposobie według wynalazku. Obejmują one nie tylko sekwencje regulatorowe kwasu nukleinowego, takie jak wzmacniacze, promotory (np. silne pro8
PL 215 165 B1 motory nieadenowirusowe takie jak promotor cytomegalowirusa, promotor SV40 i promotor RSV) i sygnały poliadenylacji, lecz również heterologiczne geny dla celów leczniczych. Dlatego, w jednym aspekcie wynalazku dostarczone są rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku, w których wspomniane nieadenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd są wybrane z grupy składającej się z: polipeptydu indukującego śmierć komórki, determinanty antygenowej z organizmu patogennego, antygenu specyficznego dla guza, białka wirusowego, hormonu i cytokiny. Przykładami patogennych organizmów są, ale bez ograniczenia, bakterie, wirusy i grzyby. Nieograniczającymi przykładami czynników nieadenowirusowych, białek, polipeptydów i peptydów są czynniki transkrypcyjne, białka sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, fosfatazy, kinazy, czynniki hamujące apoptozę, antagoniści receptora, rozpuszczalne postaci receptorów związanych z błoną, inhibitory RNA, antysensowne RNA, czynniki wabiące, rybozymy i dokładniej, kinaza tymidynowa, erytropoetyna, białka pobudzające nową erytropoezę (NESP), IL3, ceNOS, gamma-interferon i gp10. W rekombinowanych wektorach adenowirusowych dostarczonych przez sposoby i środki według wynalazku do szczepienia klonowane mogą być białka wirusowe niepochodzące z adenowirusa. Takie białka wirusowe obejmują, ale bez ograniczenia, gag, pol, env, nef, itd. dla szczepionek HIV, białka E6 i E7 dla szczepionek przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaka, białka circumsporozoitu pierwotniaka Plasmodium dla szczepionek przeciw malarii, składniki rotawirusa dla szczepionek przeciwko rotawirusowi, białka ebola dla szczepionek przeciwko ebola, produkty genu F i G z syncytialnego wirusa układu oddechowego (RSV) dla szczepionek przeciw RSV, HA i NA dla szczepionek przeciw grypie, itd.
Rekombinowane adenowirusy według wynalazku zawierają elementy strukturalne i niestrukturalne. Przykładami elementów strukturalnych są geny kodujące białka kapsydu takie jak włókno, hekson i penton, jak również same produkty genu. Przykładami elementów niestrukturalnych są wczesne geny, które ulegają ekspresji po zakażeniu komórki i wraz z postępem cyklu infekcji są tłumione. Innymi przykładami elementów niestrukturalnych są geny kodujące białka aktywne podczas replikacji takie jak pol i pTP. Powinno być zrozumiałe, że rekombinowane wektory adnowirusowe mogą zawierać elementy strukturalne i niestrukturalne pochodzące z różnych serotypów. Przykładami takich wektorów są np. cząsteczki adenowirusowe posiadające chimerowe włókna (patrz zgłoszenie patentowe zgłaszającego WO/03029). Techniki biologii molekularnej stworzyły możliwość konstrukcji nieskończonej liczby kombinacji sekwencji kwasu nukleinowego. Jest jasne, dla specjalisty w dziedzinie biologii molekularnej, że tworzenie kombinacji różnych sekwencji może być przeprowadzone przy użyciu różnych technik molekularnych takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), jak również bezpośredniego subklonowania. Wiele sekwencji użytych w niniejszym wynalazku, jak również sekwencje i konstrukty chimerowe znane w dziedzinie pochodzą z różnych serotypów adenowirusa. „Pochodzą w użytym tu znaczeniu oznacza, że takie kombinacje sekwencji mogą być otrzymane przez bezpośrednie klonowanie sekwencji typu dzikiego otrzymanych z wirusów typu dzikiego, natomiast mogą być one również przykładowo otrzymane przez PCR z użyciem jako matrycy różnych fragmentów DNA. Oznacza to również, że takie sekwencje mogą być w postaci typu dzikiego jak również w postaci zmienionej. Inną możliwością uzyskania takich samych wyników jest łączenie syntetycznego DNA. Powinno być zrozumiałe, że „pochodzący nie oznacza wyłącznie bezpośredniego klonowania DNA dzikiego typu. Specjalista w dziedzinie zna również możliwości biologii molekularnej do uzyskania form zmutowanych określonego kawałka kwasu nukleinowego. Mutacje te mogą wpływać na różne właściwości funkcjonalne, lecz również mogą być milczące w ten sposób, że określone mutacje nie zmieniają właściwości funkcjonalnych szczególnego fragmentu DNA i kodowanego przez niego białka. Co za tym idzie terminy „część funkcjonalna, pochodna i/lub jej analog powinny być rozumiane jako równoważniki kwasu nukleinowego, z którym są spokrewnione. Specjalista w dziedzinie doceni fakt, że określone delecje, zamiany, mutacje (punktowe) insercje, itd. mogą nadal dawać kwas nukleinowy posiadający podobną funkcję co oryginalny kwas nukleinowy. Co za tym idzie, powinno być zrozumiałe, że takie zmiany, które znacząco nie zmieniają funkcjonalności białek takich jak produkt genu E4-orf6 i E1B-55K są w zakresie niniejszego wynalazku.
Pewne zmiany w kwasie nukleinowym, takie jak delecja, mutacja insercja i/lub substytucja w jednym lub większej liczbie kodonów mogą znacząco zmienić strukturę i/lub funkcjonalność kodowanego przez gen produktu. Zatem, opisano tu również sekwencje kodujące E4-orf6 pochodzące z adenowirusa o tym samym serotypie co szkielet niosący geny, na przykład elementy strukturalne i niestrukturalne, lecz w których sekwencja kodująca E4-orf6 została zmutowana tak, że stała się zgodna z białkami E1 (takimi jak produkt genu E1B-55K) obecny w komórce komplementującej, w której wytworzony będzie wektor adenowirusowy. Kodon może być całkowicie zmieniony aby zaPL 215 165 B1 mienić kodowany aminokwas, lecz może być również zmutowany częściowo aby zmienić kodowany aminokwas. Delecje kwasu nukleinowego mogą doprowadzić do utraty jednego lub większej liczby kodowanych aminokwasów; lecz może to również doprowadzić do zmiany ramki odczytu. Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji E4-orf6 obecnej w kwasie nukleinowym adenowirusa, który zawiera różne części pochodzące z różnych serotypów, w których domena czyniąca białko funkcjonalnym w zgodnym układzie może być użyta z jednego serotypu, podczas gdy pozostała sekwencja E4-orf6 lub jej część pochodzi z innego (nie) spokrewnionego serotypu (przykładowo z tej samej podgrupy, z różnych podgrup lub z różnych gatunków lub ich kombinacji). Co za tym idzie, w niniejszym wynalazku możliwe jest zastosowanie fuzji białkowych E4-orf6, które są zgodne. Takie fuzje białkowe mogą być produktem szeregu fragmentów kwasu nukleinowego.
Specjaliście w dziedzinie będzie znany fakt, że poza wszystkimi ludzkimi adenowirusami nauka zidentyfikowała liczne adenowirusy niepochodzące od człowieka. Oczywiście również adenowirusy niepochodzące od człowieka mogą być zastosowane dla uzyskania takich samych wyników jak ujawnione w niniejszym wynalazku. Będzie jasne dla specjalisty w dziedzinie, że zgodność pomiędzy E1B-55K i E4-orf6 może nie być ograniczona do ludzkich adenowirusów, lecz zgodne mogą być również elementy z adenowirusów specyficznych dla innych gatunków. Tak więc, również kolejnym aspektem wynalazku jest, że niepochodzące od człowieka adenowirusy mogą być wytwarzane w wysokich mianach na znanych liniach komórki pakującej dostępnych nauce tak długo, jak długo zgodne są produkty genów E1B-55K i E4-orf6. Nieograniczającymi przykładami niepochodzących od człowieka adenowirusów, które mogą być wytworzone przy pomocy sposobów według wynalazku i środków tu opisanych są adenowirusy psie, bydlęce, owcze, żabie, świńskie, końskie, małpie i ptasie. Serotypy jakich tu użyto mieszczą się w obrębie ograniczonym gatunkowo. Jeśli przykładowo produkt genu E4-orf6 pochodzącego z małpiego adenowirusa jest zgodny z E1B-55K dostarczonym przez komórkę pakującą to kombinacja ta mieści się w zakresie niniejszego wynalazku. Również, gdy zastosowane są fuzje pomiędzy różnymi serotypami lub pomiędzy sekwencjami E4-orf6 pochodzącymi przykładowo z ludzkiego i ptasiego adenowirusa, który jest zgodny z genem E1B komórki pakującej, to taka szczególna kombinacja jest również w zakresie niniejszego wynalazku.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego zawierającego strukturalne i niestrukturalne elementy adenowirusa nie-podgrupy C o pierwszym serotypie, obejmującego etapy: a) dostarczenia komórki komplementującej niosącej sekwencję kodującą E1B-55K pochodzącą z adenowirusa o serotypie 5 (Ad5) w postaci umożliwiającej ekspresję, z niezbędnymi elementami adenowirusa tak, aby możliwe było składanie wspomnianego zrkombinowanego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej pewne elementy strukturalne i niestrukturalne z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie nie-podgrupy C i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 Ad5, b) hodowania wspomnianej komórki komplementującej w pożywce w warunkach, w których ma miejsce produkcja i składanie wektora adenowirusowego; i c) zbierania tak wytworzonego rekombinowanego wektora adenowirusowego z pożywki i/lub komórki komplementującej, w której sekwencja kodująca białko E4-orf6 Ad5 występuje w tak wytworzonym, rekombinowanym wektorze adenowirusowym.
Opisano tu również sposób, w którym wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 jest wybrana z grupy obejmującej: i) sekwencję kodującą E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o wspomnianym drugim serotypie; ii) sekwencję kodującę E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o trzecim serotypie innym niż wspomniany serotyp pierwszy i drugi; iii) sekwencję kodującą E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie zawierającą delecję, mutacje insercję i/lub substytucję w jednym lub większej liczbie kodonów; i iv) sekwencję kodującą E4-orf6 zawierającą fuzję pomiędzy sekwencją kodującą E4-orf6 pochodzącą z trzeciego serotypu i część sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym drugim serotypie, przy czym wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub inny niż wspomniany pierwszy serotyp. W opisanej tu realizacji wspomniany pierwszy i wspomniany drugi serotyp są z różnych podgrup. W bardziej zalecanej postaci wspomniany drugi serotyp jest adenowirusem o serotypie 5. W innym, szczególnym aspekcie wynalazku, wspomniany pierwszy serotyp jest serotypem adenowirusa z podgrupy B. Korzystnie, wspomniany pierwszy serotyp jest wybrany z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50.
W dziedzinie znanych jest szereg komórek pakujących, używanych do komplementowania rekombinowanych wektorów adenowirusowych i produkcji, składania i pakowania cząsteczek adnowirusa. Nieograniczającymi przykładami takich linii komórkowych są komórki HEK-293, 911 i PER.C6™.
PL 215 165 B1
Zalecane jest zastosowanie linii komórkowych, które już potwierdzono jako dające zawiesiny adenowirusa o wysokim mianie. Takie linie komórkowe wytwarzają w stabilny sposób białka E1, dlatego korzystnym aspektem wynalazku jest zastosowanie linii komórkowych i sposobów, w których wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K jest wbudowana do genomu wspomnianej komórki komplementującej. Korzystne są takie komórki komplementujące pochodzące z pierwotnej diploidalnej komórki człowieka lub jej komórki progenitorowej. Jeszcze korzystniej, wspomniana komórka komplementująca pochodzi z pierwotnej ludzkiej komórki blastycznej siatkówki, pierwotnej ludzkiej komórki zarodkowej nerki, pierwotnej ludzkiej komórki nerwowej lub pierwotnego ludzkiego amniocytu. Bardzo korzystne jest użycie komórki komplementującej w sposobie według wynalazku, w którym wspomniana komórka komplementująca jest komórką PER.C6 lub jej pochodną. Komórki PER.C6 są dobrze znane w dziedzinie, ponieważ nie dają zdolnych do replikacji adenowirusów, gdy użyty jest adenowirusowy DNA nieposiadający części wspólnej z kwasem nukleinowym dostarczonym przez komórkę. Wiele wektorów adenowirusowych używanych przez naukowców utraciło region E1, dlatego w jednym aspekcie wynalazku, wspomniana komórka komplementująca posiada wbudowany do jej genomu kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno białko E1A z Ad5 adenowirusa. Dogodnie, wspomniany kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno adenowirusowe białko E1A pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy innej niż podgrupa B. Dogodniej, wspomniany kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno białko E1A z adenowirusa pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy C. Zalecane są postaci, w których wspomniany kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno adenowirusowe białko E1A pochodzi z adenowirusa o serotypie 5. Opisano tu również sposób, w którym wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą z adenowirusów o różnych serotypach i w którym wspomniane różne serotypy adenowirusa są przedstawicielami tej samej podgrupy adenowirusa. Dogodnie, wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą od adenowirusów o różnych serotypach i przy czym wspomniane różne serotypy adenowirusów są przedstawicielami podgrupy C. Dogodniej wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą z tego samego serotypu adenowirusa. Zalecane są sposoby, w których wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą z adenowirusa o serotypie 5.
Opisano tu również kompozycję farmaceutyczną zawierającą rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku lub którą można otrzymać sposobem dostarczonym przez wynalazek. Kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto, nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, powszechnie stosowany przez specjalistów w dziedzinie przygotowywania farmaceutyków. Ponadto opisano tu również sposób leczenia ludzkiego ciała obejmujący podawanie do ciała człowieka rekombinowanego wektora adenowirusowego według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznej tu opisanej. Opisano tu również sposoby wytwarzania wektorów adenowirusowych przy pomocy odpowiednich komórek komplementujących/pakujących i wektora adenowirusowego będącego przedmiotem zainteresowania. Do wydajnego procesu produkcji użyteczne jest zastosowanie odpowiednich komórek z odpowiednim wektorem adenowirusowym. W związku z tym opisano tu również zestaw części obejmujący: komórkę komplementującą do wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego zawierającego strukturalne i niestrukturalne elementy adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniana komórka niesie sekwencję kodującą E1B-55K lub jej funkcjonalną część, pochodną i/lub analog, pochodzące z adenowirusa o drugim serotypie w postaci ulegającej ekspresji; i b) na jednym lub więcej ulegających replikacji wektorowych kwasach nukleinowych wszystkie niezbędne elementy adenowirusa tak, aby umożliwić składanie wspomnianego rekombinowanego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej pewne strukturalne i niestrukturalne elementy z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie innym niż wspomniany drugi serotyp i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 lub jego funkcjonalną część, pochodną i/lub analog, który jest zgodny ze wspomnianym ulegającym ekspresji białkiem E1B-55K we wspomnianej komplementującej komórce. Zalecane są zestawy części, w których wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 jest wybrana z grupy składającej się z: a) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym drugim serotypie; b) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adnowirusa o trzecim serotypie innym niż wspomniany pierwszy i drugi serotyp; c) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie zawierającej delecję, mutację, insercję i/lub substytucję jednego lub większej liczby kodonów i d) sekwencji kodującej E4-orf6 zawierającej fuzję pomiędzy częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z trzeciego serotypu i częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adnowirusa o wspomnianym drugim
PL 215 165 B1 serotypie, przy czym wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub inny niż wspomniany pierwszy serotyp.
Wynalazek jest szczególnie użyteczny do replikacji chimerowych adenowirusów z delecją E1, które niemal w całości pochodzą od serotypu innego niż adenowirus 5. Takim wektorom trzeba jedynie dostarczyć kwas nukleinowy kodujący E4-orf6 z adenowirusa 5. Po jego dostarczeniu wektor może wydajnie replikować się w normalnych liniach komórkowych komplementujących i pakujących adenowirusowych 5 E1. Stabilność wektorów jest poprawiona i wektory mogą być komplementowane zarówno dla delecji E1A, jak i E1B. Przez dostarczenie takim wektorom kwasu nukleinowego, kodującego adenowirusowe E4-orf6 jest możliwe poprawienie wydajności oczyszczania z łysinki i uzyskanie dobrej wydajności przy braku dodatkowych problemów z zanieczyszczeniami typem dzikim, gdy hodowla jest prowadzona na komórkach 293 lub 911. W PER.C6 oczywiście zanieczyszczeniu adenowirusem typu dzikiego można również zapobiec innymi sposobami.
Dodatkową zaletą rekombinowanego wektora według wynalazku jest to, że nie ma potrzeby wytwarzania specjalnych linii komórek adenowirusa E4-orf6 z kwasu nukleinowego wbudowanego do genomu. Choć takie linie komórkowe istnieją, nie są one łatwo utrzymywane w niezmienionej postaci. Jest to po części związane z faktem, że przy większej liczbie obcych genów wbudowanych do genomu linii komórkowej trudno jest utrzymać stabilność obcych sekwencji (lub ich ekspresję). W niniejszym wynalazku stwierdzono, że przynajmniej niektóre problemy związane z niską wydajnością wektorów opartych na nieadenowirusowym serotypie 5 i stabilnością wektorów adenowirusowych o serotypach z podgrupy B, takich jak serotyp adenowirusa 7, 11 i 35 w liniach komórkowych pakujących adenowirus o serotypie 5 można ominąć przy pomocy rekombinowanego wektora adenowirusowego według wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie wirusów Ad35 z delecją E1 wytwarzających E4-Orf6 z Ad5 w linii komórkowej komplementującej Ad5
Sekwencjonowanie genomu adenowirusa o serotypie 35 jak również konstruowanie systemu wektora opartego na plazmidzie i wytworzenie rekombinowanych wirusów opartych na Ad35 opisano szczegółowo w WO 00/70071.
Klonowanie sekwencji kodującej Ad5-E4-orf6 w pAdApt35IP1 (nr depozytu ECACC P02041228, dla szczegółów klonowania tego plazmidu patrz WO 00/70071) przeprowadzono jak następuje. Plazmid strawiono NheI i AvrII i zdefosforylowano fosfatazą z jelita cielęcia (New England Biolabs). Strawiony DNA wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu GeneClean. Plazmid ρΔΜΤ.Orf6.Hygro (Fig. 1, nr depozytu ECACC P02041226) strawiono NheI i następnie częściowo strawiono XbaI. Po rozdzieleniu uzyskanych pasm w żelu, fragment 1350 pz odpowiadający promotorowi ΔΜΤ połączonemu z sekwencją E4-orf6 oczyszczono z żelu. Następnie oba wyizolowane fragmenty połączono przy pomocy ligazy i wprowadzono przez transformację do elektrokompetentnych komórek DH10B (Invitrogen/Life Technologies), po czym wyselekcjonowano, w celu wytworzenia DNA na dużą skalę, kolonię ze wstawką w prawidłowej orientacji względem sygnału poliadenylacji SV40. Dało to konstrukt pAd35. ΔΜΤ.Ο1Ι6 (Fig. 2) zawierający sekwencję kodującą E4-orf6 z Ad5, połączoną funkcjonalnie ze zmutowanym promotorem metalotioneiny (ΔΜΤ). Promotor ΔΜΤ został opisany przez Hagmayer i wsp. (1996). Sekwencja E4.orf6 z Ad5 odpowiada nukleotydom 33193 do 34077 w sekwencji Ad5 (Genbank nr dostępu M73260). Dla sprawdzenia czy ekspresja białek E4-orf6 z Ad5 umożliwi wytwarzanie wektorów Ad35 z pełną delecją E1 w komórkach komplementujących Ad5, pAd35.ΔΜΤ.Orf6 kotransformowano ze szkieletowym konstruktem Ad35 pWE.Ad35.pIX-rITR do komórek PER.C6. W tym celu pAd35.ΔΜΤ.Orf6 strawiono PI-Psp-1, a pWE.Ad35.pIX-rITR strawiono NotI aby uwolnić wstawki adenowirusowe ze szkieletu. 2 μg strawionego pAd35AMT.Orf6 i 6 μg strawionego pWE.Ad35.pIX-rITR transfekowano przy pomocy LipofectAmine. Mieszaninę transfekcyjną dodano do komórek PER.C6, które wysiano dzień wcześniej przy gęstości 3,5x106 komórek na kolbę T25. Następnego dnia pożywkę zmieniono na pożywkę do hodowli PER.C6 (DMEM z 10% FBS i 10 mM MgCl2) i komórki dalej inkubowano w 37°C/10% CO2. Transfekcje kontrolne przeprowadzano przy pomocy pAdApt35.Luc kotransfekując z pWE.Ad35.pIX-rITR i samym pWE.Ad35.pIX-rITR. Dwa dni po transfekcji komórki przeszczepiano z kolb T25 do T80 i inkubowano jak opisano. Ponownie, 3 dni później hodowle stransfekowane pAd35AMT.Orf6 wraz ze szkieletem Ad35 ujawniły efekt cytopatogenny (CPE) wykazujący replikację wirusa i zebrano je (łącznie komórki i pożywkę) po dalszej, trwającej dwa dni inkubacji. Zawiesinę komórek poddano dwu rundom cykli zamrażanie/rozmrażanie i otrzymany materiał (nieoczyszczony lizat) trzymano w -20°C aż do dalszego użycia. Inne kolbynie wykazywały CPE i były
PL 215 165 B1 przeszczepione 1:3 do kolb T80 6 dni po przeniesieniu do T80. Ponownie 5 dni później kolby stransfekowane pAdApt35.Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR pokazały kilka przypadków typu CPE, lecz nie rozwijały się one dalej. 0,2 i 0,5 ml nie oczyszczonego lizatu otrzymanego z transfekcji pAd35^MT.Orf6 użyto do ponownej transfekcji komórek PER.C6 przy konfluencji około 85% w kolbach T80. Dała ona pełne CPE po dniu inkubacji wskazując, że zakaźny wirus występował w nieoczyszczonych lizatach. Hodowle te również zebrano przez cykle zamrożenia/rozmrożenia. Wykonano dodatkowe kontrole transfekcji samym konstruktem pAd35^MT.Orf6 do PER.C6 aby potwierdzić, że sama ekspresja orf6 nie powoduje toksyczności komórek i śmierci typu CPE. Podsumowując, jedynie transfekcja pAd35.ΔΜΤ.Orf6 wraz z pWE.Ad35.pIX-rITR dała CPE i replikację wirusa.
Analizę PCR przeprowadzono aby potwierdzić obecność genomu wirusa opartego na Ad35 z Ad5-E4-orf6 zastępującym wyjściowy region E1. W tym celu wyizolowano wirusowy DNA z próbek nieoczyszczonego lizatu, jak następuje. 275 μl nieoczyszczonego lizatu inkubowano z 10 μl DNazy I (10 mg/ml) w 37°C przez 30 min. Następnie, 6,0 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 7,5 μl 20% SDS i 1,5 μl proteinazy K 20 mg/ml dodano i zmieszano przez wytrząsanie. Mieszaninę inkubowano następnie w 50°C przez 1 godz. Ostatecznie, wirusowy DNA wyizolowano przy pomocy zestawu GeneClean Spin (Bio 101, Inc.). Następnie, 2 μl wyizolowanego DNA namnożono przez PCR przy pomocy starterów 35 psi-For i 35R4 (Tabela 1). Program ustawiono na 94°C przez 2 min., a następnie 30 cykli 94°C przez 30 sek., 58°C przez 30 sek. i 72°C przez 5 min. i kończono inkubacją w 72°C przez 10 min. Startery są specyficzne dla sekwencji Ad35 i wytwarzają fragment 2,9 kb obejmujący pakowaną sekwencję do nukleotydu 4669 (numeracja jak w przypadku sekwencji Ad35 typu dzikiego), tym samym obejmującego kasetkę transgenu Ad5 orf6. Elektroforeza uzyskanych fragmentów PCR pokazała, że fragmenty posiadały oczekiwaną długość zgodną z kontrolnymi fragmentami PCR wytworzonymi na plazmidzie adaptorowym pAd35^MT.Orf6. Co za tym idzie, wektory oparte na Ad35 z delecją całego E1 mogą być sporządzone w komórkach komplementujących Ad5 jeśli wirus wyraża również Ad5-E4orf6.
P r z y k ł a d 2. Konstrukcja pWE.Ad35.pIX-rITR5E4
Pierwszy fragment PCR namnożono przy pomocy starterów DF35-1 i 35FR (Tabela 1). Amplifikację wykonano z pWE.Ad35.pIX-rITR (patrz WO 00/70071) jako matrycą DNA przy pomocy polimerazy DNA Pwo (Roche) z dodatkiem DMSO (Sigma, końcowe stężenie 3%). Program był jak następuje: 94°C przez 2 min., a następnie 30 cykli (94°C przez 30 sek., 52°C przez 30 sek., 72°C przez 3 min.) i końcowy etap 72°C przez 8 min. dla upewnienia się, że otrzymane zostaną pełne fragmenty. Amplifikacja dała fragment 1,6 kb odpowiadający nukleotydom 30224 do 31805 z sekwencji Ad35. Miejsce BamHI wprowadzono na 3' końcu. Namnożony DNA oczyszczano z żelu przy pomocy zestawu GeneClean i przy pomocy ligazy połączono z pCRScript/Amp wektorem z zestawu do klonowania (Stratagene). Po transformacji do elektrokompetentnych komórek DH10B dla dalszej analizy wyselekcjonowano białe kolonie. Dało to konstrukt pCR-fiber35. Z uwagi na tępe końce fragment PCR może być wbudowany w 2 orientacjach. Klon, który posiadał wstawkę w miejscu BamHI polilinkera wektora pCRScript/Amp na 5' końcu został wyselekcjonowany. Trawienie BamHI dało fragment 1,6 kb. Sekwencjonowanie potwierdziło prawidłową amplifikację fragmentu PCR. Drugi fragment PCR namnożono przy pomocy starterów: 5E4F i 5E4R (Tabela 1). Amplifikację przeprowadzono na pWE.Ad5.AflII-rITRsp, który jest wektorem kosmidowym zawierającym dodatkowe miejsce PacI w pWE.Ad5.AflII-rITR (nr depozytu ECACC P97082116 opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/NL01/00824, Zgłaszającego). pWE.Ad5.AflII-rITRsp służył jako matryca dla polimerazy DNA Pwo jak opisano powyżej, choć pWE.Ad5.AflII-rlTR mógłby być użyty dla tych samych celów. Po oczyszczeniu z żelu DNA strawiono SstI i BamHI (oba miejsca wprowadzone podczas PCR) i fragment 3 kb oczyszczono z żelu agarozowego przy pomocy zestawu GeneClean. Region E4 z Ad5, który namnażano odpowiada nukleotydom 32794 pz do 35828 pz z sekwencji Ad5. Trzeci fragment PCR wytworzono na pWE.Ad35.pIX-rITR przy pomocy starterów: 355ITR i 353ITR (Tabela 1). Amplifikację PCR przeprowadzono jak opisano powyżej. Otrzymany fragment 160 pz jest otoczony przez miejsce SstI (5' koniec) i miejsce EcoRI (3' koniec). Po oczyszczeniu z żelu jak wyżej, DNA strawiono SstI i EcoRI. Fragment 160 pz odpowiadający prawemu ITR z Ad35 oddzielono następnie od strawionych końców w żelu agarozowym o niskiej temperaturze topienia i zebrano w żelu. Następnie pUC119 strawiono BamHI i fragment EcoRI 3,1 kb oczyszczono z żelu przy pomocy zestawu GeneClean. Potraktowany jak wyżej drugi i trzeci fragment PCR połączono przy pomocy ligazy ze strawionym BamHI/EcoRI pUC119 otrzymując pUC.Ad5E4-35ITR. Sklonowane wstawki pochodzące z PCR zsekwencjonowano aby potwierdzić prawidłową amplifikację. Następnie wstawkę 1,6 kb w pCR-fiber35 wycięto BamHI i fragment oczyszczono z żelu jak wyżej. pUC.Ad5E4-35ITR również strawiono BamHI i liniowy fragPL 215 165 B1 ment oczyszczono z żelu. Ligacja obu fragmentów i selekcja klonów posiadających prawidłową orientację względem każdego dała pUC.35-5E4 (Fig. 3). Etapy prowadzące do konstrukcji pUC.35-5E4 przedstawiono schematycznie na Fig. 4. Wstawkę adenowirusa w pUC.35-5E4 subklonowano do pBr.Ad35.PRn (Fig. 5; patrz WO 00/70071), konstrukt z 3' sekwencjami Ad35. W tym celu, konstrukt pUC.35-5E4 strawiono MluI i NotI i fragment 4,7 kb oczyszczono z żelu przy pomocy zestawu GeneClean. Fragment ten następnie połączono przy pomocy ligazy z fragmentem wektora otrzymanym przez trawienie MluI i NotI konstruktu pBr.Ad35.PRn. Ten fragment 16,3 kb oczyszczono z żelu przy pomocy enzymu agarazy (Roche). Ligacje następnie wprowadzano przez transformację do kompetentnych komórek DH10B. Otrzymany konstrukt nazwano pBr.Ad35.PR5E4 (Fig. 6, nr depozytu ECACC P02041229). Ostatni etap umożliwia sklonowanie modyfikowanego 3' końca sekwencji Ad35 do wirusowego klonu kosmidowego pWE.Ad35.pIX-rlTR. W tym celu, dwa fragmenty połączono w reakcji pakującej faga lambda (Stratagene) zgodnie z zaleceniami producentów. Pierwszy jest zmodyfikowana wstawka Ad35 16,8 kpz z pBr.Ad35.PR5E4 uzyskana przez trawienie PacI i SwaI a drugi jest fragmentem 22,8 kb otrzymanym przez trawienie pWE.Ad35.pIX-rITR przy pomocy PacI i SwaI. Prawidłowa kombinacja dwóch fragmentów daje pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4 (Fig. 7). Co za tym idzie, w konstrukcie tym region E4 w szkielecie Ad35 jest zastąpiony odpowiednim regionem pochodzącym z Ad5.
P r z y k ł a d 3. Konstrukcja pWE.Ad35.pIX-rITR5Orf6
Aby uzyskać szkieletowy konstrukt adenowirusowy zawierający sekwencje Ad35 z genu pIX (nukleotyd 3401 w sekwencji Ad35) do końca prawego ITR, lecz z sekwencjami E4-orf6 i -orf6/7 wymienionymi na odpowiadające im sekwencje Ad5, Ad35 i Ad5 sekwencje namnożono przez PCR i połączono jak opisano poniżej. Fragmenty PCR wytworzono przy pomocy polimeraz DNA Pwo z dodatkiem DMSO do 3%. Pierwszy PCR wykonano na matrycy pBr.Ad35.PRn (Fig. 5; patrz WO 00/70071) i przy pomocy starterów E4-F1 i E4-R2 (Tabela 1). Program ustawiono jak następuje: 94°C przez 2 min., 5 cykli (94°C przez 30 sek., 50°C przez 30 sek. i 72°C przez 1 min.), a następnie 30 cykli (94°C przez 30 sek., 60°C przez 30 sek. i 72°C przez 1 min.) i zakończono końcowym etapem 68°C przez 8 min. Otrzymany fragment 1,8 kpz oczyszczono przy pomocy zestawu GeneClean. Drugi PCR przeprowadzono z pWE.Ad5.AfIII-rlTRsp, który jest wektorem kosmidowym posiadającym miejsce PacI w pWE.Ad5.AfIII-rITR (nr depozytu ECACC P97082116, opisany w jeszcze nie opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/NL01/00824, Zgłaszającego) jako matryca i starterami E4-F3 i E4-R4 (Tabela 1). Program ustawiono jak następuje: 94°C przez 2 min. a następnie 30 cykli (94°C przez 30 sec., 62°C przez 3 sec. i 72°C przez 1 min.) i zakończono końcowym etapem 68°C przez 8 min. Fragment 1.1 kpz oczyszczono jak powyżej. Trzeci PCR wykonano z pBr.Ad35.PRn jako matrycą i starterami E4-E5 i E4-R6 (Tabela 1). Program ustawiono jak następuje: 94°C przez 2 min., 5 cykli (94°C przez 30 sek., 48°C przez 30 sek. i 72°C przez 45 sek.) i następnie 30 cykli (94°C przez 30 sek., 56°C przez 30 sek. i 72°C przez 45 sek.) i zakończono końcowym etapem 68°C przez 8 min. Otrzymany fragment 366 pz oczyszczono jak powyżej. Próbki oczyszczonych fragmentów naniesiono na żel, aby oszacować stężenie i następnie fragmenty zmieszano, aby zawierały 700 ng PCR-1, 650 ng PCR-2 i 430 ng PCR-3 w łącznie 30 μ|. Do mieszaniny tej dodano 3 μl buforu EcoPol (New England Biolabs), 3 μl roztworu 2 mM dNTP i 3 μl H2O miliQ. Otrzymaną mieszaninę inkubowano w 94°C przez min. i następnie schłodzono do 65°C w maszynie do PCR przy szybkości schładzania 0,5°C/sek. Po inkubacji w 65°C przez 10 min. mieszaninę dalej schłodzono do 20°C przy szybkości schładzania 0,05°C na sek. i inkubowano przez 10 min. w 20°C. Następnie dodano 1 μl (5 jednostek) enzymu Klenowa (New England Biolabs), a następnie inkubowano przez 60 min. w 37°C. 5 μl tej mieszaniny Klenowa użyto jako matrycy dla niezależnej amplifikacji dwóch fragmentów wykonanej jak następuje. Zestaw starterów 1: NF-1 i NcoI-R (Tabela 1) użyto w reakcji przy pomocy polimerazy DNA Pwo (Roche) z dodatkiem DMSO do końcowego stężenia 3% i stosując następujące ustawienia maszyny PCR: 94°C przez 2 min., i następnie 30 cykli (94°C przez 30 sek., 66°C przez 30 sek. i 72°C przez 3 min.) i następnie końcowa inkubacja w 68°C przez 8 min. Zestaw starterów 2: NcoI-F i NR-2 (Tabela 1) użyto w reakcji przy pomocy polimerazy DNA Pwo (Roche) z dodatkiem DMSO do końcowego stężenia 3% i stosując następujące ustawienia maszyny PCR: 94°C przez 2 min. i następnie 30 cykli (94°C przez 30 sek., 62°C przez 30 sek. i 72°C przez 90 sek.) i następnie końcowa inkubacja w 68°C przez 8 min. Otrzymane fragmenty 2,7 kpz (zestaw starterów 1) i 1,1 kpz (zestaw starterów 2) oczyszczono z żelu przy pomocy zestawu GeneClean i każdy łączono przy pomocy ligazy z wektorem pCRscriptAmp (Stratagene) i wprowadzano przez transformację do elektrokompetentnych komórek DH10B. Wynikiem tego jest konstrukt pCRsriptAmp.NFI-NcoIR (Fig. 8)
PL 215 165 B1 i konstrukt pCRscriptAmp.NcoIF-NR2 (Fig. 9). Ponieważ wstawki te zawierają tępe końce to w każdym klonowaniu uzyskano dwie orientacje. Przy pomocy trawienia KpnI wyselekcjonowano konstrukty o orientacji potrzebnej dla dalszego klonowania (patrz Fig. 8 i 9). Następnie wstawki zsekwencjonowano aby potwierdzić prawidłową amplifikację. Następnie część wstawki z pCRscriptAmp-NcolF-NR2 wycięto przy pomocy BamHI i NcoI, i oczyszczono z żelu jak wyżej. pCRsriptAmp-NFI-NcoIR strawiono tymi samymi enzymami i wektor zawierający fragment również oczyszczono z żelu. Ligacja tych fragmentów dała pCR.NF1-NR2 (Fig. 10). PCR-NF1-NR2 zawiera sekwencje Ad35 pomiędzy nukleotydami 30162 i 33234 z sekwencji Ad35 z sekwencjami E4-orf6 i E4-orf6/7 pomiędzy nukleotydami 31879 i 32974 zastąpionymi za sekwencje pochodzące z Ad5 umiejscowione pomiędzy 32968 i 34077 z opublikowanej sekwencji Ad5 w Genbank (nr dostępu M73260). Tak więc, jak można zobaczyć na przyrównaniu sekwencji aminokwasowych przedstawionych na Fig. 11 i 12, sekwencja aminokwasowa sklonowanego białka E4-orf6 jest identyczna z sekwencją E4-orf6 występującą w Ad5 i sekwencja aminokwasowa E4-orf6/7 jest w większej części identyczna z sekwencją E4-orf6/7 występującą w Ad5. Oczywiście, różne hybrydowe konstrukty Ad35-Ad5 E4 mogą być zaprojektowane przy pomocy ogólnych sposobów podanych powyżej bez wykraczania poza wynalazek. Ta chimerowa wstawka z pCR-NF1-NR2 została następnie sklonowana w pWE.Ad35.pIX-rITR: pCR.NF1-NR-2 strawiono MluI i NdeI, i otrzymany fragment 2,8 kpz oczyszczono z żelu przy pomocy zestawu GeneClean. Konstrukt pBr.Ad35.PRn również strawiono MluI i NdeI, i fragment wektora 18 kpz wyizolowano z żelu przy pomocy enzymu agarazy (Roche). Ligacja obu fragmentów dała konstrukt pBr.Ad35.PR.5Orf6 (Fig. 13, nr depozytu ECACC P02,041227). Sekwencje Ad35 pomiędzy PacI i SwaI zawierające region chimerowy E4 w tym konstrukcie następnie klonuje się do konstruktu pWE.Ad35. pIX-rITR przy pomocy pakowania faga lambda jak to opisano powyżej. Otrzymany pWE.Ad35pIX-rITR. 5Orf6 (Fig. 14) użyto następnie do wytwarzania rekombinowanych wirusów opartych na Ad35, przez kotransformację pakujących komórek PER.C6 plazmidem adaptorowym Ad35.
Przykład 4. Konstrukcja pWE.Ad35.pIX-rITRAE3, pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.5E4 i pWE.Ad35.pIX-rITRAE35Orf6
Szkielet Ad35 zmodyfikowano następnie przez delecję sekwencji E3. Białka E3 są znane jako modulujące odpowiedź immunologiczną gospodarza na zakażenie adenowirusem i co za tym idzie nie są niezbędne do namnażania i rekombinowania wirusów in vitro. Ponadto, delecja sekwencji E3 pozwala na wbudowanie dużych, heterologicznych sekwencji do wektorów bez zmniejszania wydajności pakowania. Również, dla zastosowania wektorów adenowirusowych jako nośników szczepionki nie jest zalecaną ekspresja genów modulujących odpowiedź immunologiczną zawartych w regionie E3. Sposoby usuwania sekwencji E3 z plazmidu pBr.Ad35.PRN (Fig. 5) opisano poniżej.
Najpierw wytworzono produkt PCR przy pomocy starterów 35E3for i 35E3rev (Tabela 1) stosując polimerazę DNA Pwo (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta i jako matrycowy DNA pBr.Ad35.PRn. Program ustawiono na 94°C przez 2 min., i 30 cykli 94°C przez 30 sek., 58°C przez 30 sek. i 72°C przez 1 min., a następnie 68°C przez 8 min. Namnożony fragment zawiera sekwencje Ad35 od nukleotydów 26814 do 27647 (patrz WO 00/70071) i jest otoczony na 3' końcu przez miejsce MluI. Otrzymany fragment 833 pz oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktów PCR Qiaquick (Qiagen) i strawiono MluI i Stul. Strawiony fragment PCR oczyszczono następnie z żelu agarozowego LMP przy pomocy zestawu do ekstrakcji z żelu Qiaquick (Qiagen). Konstrukt pBr.Ad35.PRn strawiono również MluI i Stul i fragment wektora 17,3 kpz wyizolowano z żelu agarozowego przy pomocy enzymu agarazy (Roche) przy pomocy sposobów znanych specjalistom w dziedzinie. Oba wyizolowane DNA połączono przy pomocy ligazy i wprowadzono przez transformację do kompetentnych bakterii DH5a Max-efficiency (Invitrogen/LTI) co dało pBr.Ad35.PRnAE3 (Fig. 15). Usunięte sekwencje obejmują nukleotydy 27648 do 30320 z sekwencji Ad35 co daje delecję 2673 pz. Delecja E3 została następnie wprowadzona do konstruktu pWE.Ad35.pIX-rITR przy pomocy ekstraktów pakujących faga lambda (Stratagene). W tym celu oba pWE.Ad35.pIX-rITR i pBr.Ad35.PRnAE3 strawiono PacI i SwaI, i wyizolowano fragmenty odpowiednio 22,8 kpz i 14 kpz z żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia przy pomocy enzymu agarazy (Roche). Po ligacji i zapakowaniu przy pomocy komórek STBL-2 (Invitrogen/LTI) otrzymano konstrukt pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.
Aby skonstruować opisaną wyżej wersję konstruktu o zmodyfikowanym szkielecie E4 z delecją E3, modyfikacje E4 wprowadzono do konstruktu pBr.Ad35.PRnAE3 jak następuje. Konstrukt pUC.35-5E4 (Fig. 3) strawiono MluI i NotI, i fragment 4,7 kpz wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu GeneClean II. Konstrukt pBr.Ad35.PRnAE3 strawiono również MluI i NotI, i fragment wektora 13,6 kpz wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu GeneClean spin. Ligacja tych fragmentów dała konstrukt
PL 215 165 B1 pBr.Ad35^E3.PR5E4 (Fig. 16). Konstrukt pCR-NF1-NR2 (Fig. 10) strawiono MluI, Ndel i Bgll (ostatni aby strawić fragment wektora na mniejsze fragmenty), i fragment 2,8 kpz wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu GeneClean spin. Konstrukt pBr.Ad35.PRnAE3 strawiono MluI i Ndel, zdefosforylowano przy pomocy enzymu CIP (New England Biolabs) i fragment wektora 15,2 kpz wyizolowano również przy pomocy zestawu GeneClean spin. Ligacja tych fragmentów dała konstrukt pBr.Ad35^E3.PR5Orf6 (Fig. 17). pBr.Ad35.AE3.PR5E4 i pBr.Ad35^E3.PR5Orf6 użyto następnie do zamiany 3' fragmentu PacI-SwaI w pWE.Ad35.pIX-rITR na odpowiadające mu regiony z pBr.Ad35^E3.PR5E4 i pBr.Ad35^E3.PR5Orf6 jak tu opisano. Prowadzi to do konstruktów pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.5E4 i pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.5Orf6. Alternatywnym sposobem wytwarzania tych dużych kosmidów jest użycie trzech fragmentów w reakcji ligacji do zapakowania fragmentu 14,7 kpz NotI-PacI z pWE.Ad35.pIX-rITR, wstawki PacI-NotI z pBr.Ad35.ΔΕ3.PR5E4 lub pBr.Ad35.ΔΕ3.PR5Orf6 i strawionego NotI fragmentu wektora kosmidowego pWE15 (Stratagene). Ten ostatni fragment może również być wyizolowany ze strawionego Notl/PacI pWE.Ad35.pIX-rITR.
P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie wektorów opartych na Ad35, z delecją E1- i E1/3 w komórkach PER.C6
Aby umożliwić wytworzenie rekombinowanych wirusów Ad35 w komplementującej linii komórkowej PER.C6 przy pomocy konstruktów opartych na pBr.Ad35.PRn, najpierw stworzono nowy konstrukt zawierający sekwencję z Ad35 od 3401 pz do 24650 pz z sekwencji Ad35 (WO 00/70071) i posiadającą część wspólną z obydwoma plazmidami adaptorowymi i konstruktami opartymi na pBr.Ad35.PRn. Transfekcja tych trzech plazmidów do komórek PER.C6 i podwójna rekombinacja homologiczna doprowadziły do pełnego genomu wirusa i replikacji rekombinowanych wirusów jak podano na Fig. 18. Wymagany plazmid sporządzono przez delecję dużej części sekwencji Ad35 w pWE.Ad35.pIX-rITR. W tym celu pWE.Ad35.pIX-rITR strawiono EcoRV i fragment 29 kpz zawierający wektor oczyszczono z żelu o niskiej temperaturze topnienia przy pomocy zestawu GeneClean spin. Oczyszczony DNA ligowano ze sobą i użyto do transformacji elektrokompetentnych (komórek) bakterii DH10B (Invitrogen/LTI) otrzymując pWE.Ad35.pIX-EcoRV (Fig. 19).
Wszystkie DNA użyte do transfekcji strawiono jak podano w Tabeli 2, inaktywowano termicznie w 65°C przez 15 min. i użyto bez dalszej obróbki do transfekcji. Komórki PER.C6 wysiano dzień przed transfekcją do kolb T25 przy gęstości 3x106 komórek na kolbę i stransfekowano jak podano w Tabeli 2 przy pomocy LipofectAmine (Invitrogen/LTI) zgodnie z zaleceniami producentów, z tym wyjątkiem, że mieszaninę transfekcyjną w pożywce DMEM bez surowicy (Gibco BRL) zastąpiono po 5 godzinach pożywką dla komórek PER.C6 (DMEM, 10% FBS i 10 mM MgCl2). Dzień później wydajność transfekcji oceniono na 50% z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej. Dwa dni później, komórki trawiono trypsyną i ponownie wyszczepiano do kolb T80 i dalej inkubowano w 37°C/10% CO2. Sześć dni po transfekcji wszystkie hodowle ujawniły pełen efekt cytopatyczny (CPE) (wskazujący na namnażanie się wirusa) z wyjątkiem hodowli PER.C6 stransfekowanej Ad35.AdApt.eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR. Dzień później komórki i pożywkę w kolbach z CPE zbierano i poddawano dwum cyklom zamrożenia/rozmrożenia, oczyszczano ze szczątków komórek przez wirowanie (10 min. przy 1500 obr/min) i 100 μl tak ich nieoczyszczonych lizatów użyto dla ponownego zakażenia świeżych komórek PER.C6 przy konfluencji 85% w kolbach T80. Transfekcja Ad35.AdApt.eGFP + pWEAd35.pIX-rITR, które nie pokazują CPE zebrano przez trawienie trypsyną i również traktowano jak powyżej. Dwa dni po zakażeniu świeżych komórek PER.C6 wszystkie kolby wykazały pełne CPE z wyjątkiem jednej, która nie wykazała śladów CPE w momencie pierwszego zbioru. Pokazuje to jasno, że wirusy oparte na Ad35 z pełną delecją E1 mogą być otrzymane w komórkach PER.C6 gdy produkt genu E4-orf6 z Ad5 ulega ekspresji ze szkieletu Ad35.
PL 215 165 B1
Tabela 1. Sekwencje starterów
35FR
35R4
35psi-For
DF35-1
5E4F
5E4R
355I7R
353ITR
E4-FI
E4-R2
E4-F3
E4-R4
E4-F5
E4-R6
NF-1
NR-2
Ncol-R
Ncol-F
35E3for
35E3rev
5' -CGGGATCCACTTTATTTTAGTTGTCGTCTTC - 3' (NRID.SEKW.: 1)
5' -CGGAATTCTTAATTAAGGGAAATGCAAATCTGTGAGG -3' (NRID. SEKW.:2) 5' -GTGGTATTTATGGCAGGGTG -3' (NRID. SEKW.: 3)
5’ -CACTCACCACCTCCAATTCC -3 ' (NRID. SEKW.: 4 )
5' -CGGGATCCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTG -3' (NRID. SEKW.:5)
5' -GCTGGCGAGCTCGGCGGAGTAACTTGTATGTG-3' (NRID.SEKW.:6)
51 -GATCCGGAGCTCACAACGTCATTTTCCCACG -3' (NRID. SEKW.:7)
5' -AGGAATTCGCGGCCGCATTTAAATC - 3' (NR ID. SEKW: 8)
5' -AGAGGAACACATTCCCCC-3' (NRID. SEKW.:9)
5' -GGGGAGAAAGGACTGTGTATTCTGTCAAATGG -3' (NRID. SEKW.: 10)
5'-TTTGACAGAATACACAGTCCTTTCTCCCCGGCTGG - 3' (NR ID. SEKW: 11 > 5' -ACAAAATACGAGAATGACTACGTCCGGCGTTCC - 3' (NRID.SEKW.:12)
5' -GGACGTAGTCATTCTCGTATTTTGTATAGC -3' (NRID. SEKW.:13)
5' -TCACCAACACAGTGGCGG-3' (NRID. SEKW.: 14 )
5' -CCACAACCCCCACTACTCCC -3' (NRID. SEKW.: 15)
5' -CGTCTCTTCCCTCTCCTCTCC-3' (NRID. sekw.:16)
5' -AGGATCATCCGCTGCTGCCC - 3' (NRID. SEKW.: 17)
5' -CATCAGGATAGGGCGGTGG -3' (NRID. SEKW: 18)
5' -AATGACTAATGCAGGTGCGC -3' (NRID. SEKW.: 19)
5' -CGACGCGTTGTAGTCGTTGAGCTTCTAG - 3' (NRID. SEKW.: 201
T a b e l a 2. Lista konstruktów użytych do wytworzenia wirusów opartych na Ad35 z delecją E1 w komórkach PER.C6 jak opisano w Przykładach. Konstrukty adaptorowe strawiono PacI, pWE.Ad35.pIX-EcoRV strawiono NotI i EcoRV, E4-zmodyfikowany konstrukt oparty na pBr strawiono PacI i NotI
nr konstrukt CPE
1 pAdApL35, eGFP pWE.Ad3S.pIX-EcoRV pBr-Ad35-PR5S4 tak
2 pAdApt3b . eGFP pWE .Ad3i-p!X-EcoRV par.Adlp.PR50rf6 tak
3 pAdAptBS.eGFP pWE.Ad35.prX-£coRV PBr.Ad35.óEJPR5C4 tak
4 pAdAptSS.eGFP p’flfE.Ad35.ptX-EcoRV par. Ad.35.AE3.PH5Grf6 tak
5 pAdApt.3S.eGFP pWE.Ad35.pIX-rITnxNotI nie
6 pA.IAptS. eGFP pWE.AdS.Atlll -ElTFxP.icI tak
Literatura
Abrahamsen K, Kong H-L, Mastrangeli A, Brough D, Lizonova A, Crystal R i Falck-Pedersen E. (1997) Construction of an adenovitus type 7a ElA- vector. J Virol 11:8946-8951.
Fallaux FJ, Kranenburg O, Cramer SJ Houweling A, Van Ormondt H, Hoeben RC i Van der Eb AJ. (1996) Characterization of 911: A new helper cell line for the titration and propagation of early region I-deleted adenovirol vectors Hum Gene Ther 7:215-222.
Fallaux FJ, Bout A, Van der Velde I, Van den Wollenberg DJ, Hehir KM. Keegan J, Auger C, Cramer SJ, Van Ormondt H, Van der Eb AJ, Valerio D i Hoeben RC. (1998) New helper cells and matched early region l-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication competent adenovirilses. Hum Gene Ther 9:1909-1917.
Francki RIB, Fauquet CM, Knudson L i Brown F. (1991) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the international committee on taxononay of viruses. Arch Virol Suppl 2:140-144.
PL 215 165 B1
Graham PO, Smiley J, Russell W i Nairn P. (1970) Characteristics of a human cell line transformed by DNA from lturitan adenovirus type 5. J Gen Virol 36:59-72.
Hagmeyer BM, Dundam MC, Angel P, Do Groot RP, Verlaan M, Elfferich P, Van der Eb AJ i Zantema A. (1996) Oncogene 12:1025-1032.
Horwitz MS. (2001) Adenovitus immunoregulatory genes and Their cellular targets. Virology 279:1-8.
Leppard KN (1997) E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J Gen Virol 78:2131-2138.
Leppard KN (199E} Regulated RNA processing and RNA transport during adenovrus infection. Seminars in virology 8:301-307.
Pilder S, Moore M, Logan J i Shenk T. (1986) The adenovirus E1B 55K transforming polypeptide modulates transport or cytoplasmic stabilisation of viral and host cell mRNAs. Mol Cell Biol 6:470-476.
Rao L, Debbas M, Sabbatini P, Hockenbery O, Korsmeyer S i White E. (1992) The adenovirus E1A proteins induce apoptosis, which is inhibited by the E1B 19 kDa and Bcl-2 proteins. Proc Natl Acad Sci USA 8 9:7742-7746.
Russell WC. (2000) Update on adenoviruses and its vectors. J Gen Virol 81:2573-2604.
Shenk T. (1996) Adenoviridae; The viruses and their replication. W Virology, wyd. Fields BN, Knipe DM i Howley PM. (Lippincott-Raven, Nowy Jork) 2:2111-2148.
Van der Vliet PC. (1995) Adenovirus DNA replication. W The molecular repertoire of adenoviruses II wyd., Doerfler W i Bohm P. (Springer-Verlag, Berlin) Current Topics in Microbiology and Immunology 199/11:1-30.
Yew PR i Berk AJ. (1992) inhibLLion of p53 translation required for transformation by adenovirus early region 1B protein. Nature 357:82-85.
PL 215 165 B1 <110> Gruca Ił. Holland B.V,
Voqelsf Ronald Bout, Abraham <120> Pokombinowany wektor adenowirnsowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirasowego <130> 005SWO00ORD <140>
<141> 2003-04-24 <tSQ> 25 <l'?0> Patentln wersja 3.1 <21Q> 1 <211> 31 <212> DHA <2I3> Sztuczna sekwencja <22tl>
<223> starter 35!
<4 00» 1 cgggatcrac tttafctttag ttgtęgtctt c 31 <210» 2 <211» 37 <212» CNA _ <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» starter 35R4 <400» 2.
cggaattrtt aattaaęgga aatgcaaafcc tgtgagg
<21 ó> 1
<21 L> 20
<212> IMA
<2Ł3> Sztuczna sekwencja
<220»
<223» starter 35psl-For
<403» 3
ęrggt atfcta tggcagggtg . η Λ Z U
<210» i
PL 215 165 B1 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter DF35-1 <4C0> 4 cactcaccac ctccaattcc 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter 5E4F <4OO> 5 cgggatccgt ttgtgttatg tttcaacgtg 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter 5E4R < 4 0 0 > 6 gctggcgagc tcggcggagt aacttgtatg tg 32
<210 T 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220
<22 3> starter 355ITR
<400 7
gatccggagc tcacaacgtc attttcccac g 31
<210 8
<211> 25
<212> DMA
<213» Sztuczna sekwencja
<2 20>
<223> starter 353ITR
<4 00 8
PL 215 165 B1 aggaattcgc ggccgcattt aaatc 25 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter E4-F1 <400> 9 agaggaacac attccccc 13 <210> 10 <21L> 32 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter E4-R2 <400» 10 _ ggggagaaag gactqtgtat tćtgtcaaat gg 32 <210 11 <211> 35 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter E4-F3 <400 11 tttgaeagaa tacacagtec tttctccccg gctgg 25
<210» 12
<211> 33
<212> CHA
C21?3> Sztuczna sekwencja
«220
<222> starter E4-R4
<400 12
aeaaaatacg agaatgaćta cgtccggcgt tcc 33
<210> 13
<21L> 30
<212> CNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220
PL 215 165 B1 <223> starter E4-F5 <400> 13 ggacgtagtc attctcgtat tttgtatagc 30 <210> 14 <211> 18 <212> DMA <2L3> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter E4-R6 <400> 14 tcaccaacac agtggggg 13 <210> 15 <211> 20 <212> DMA <213> Sztuczna sekwencja <22Q>
<223> starter NF-1 <40O> 15 ccacaacccc cactactccc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DMA
<213> Sztuczna sekwencja
<22O>
<223> starter WR-2
<4QO> 16
cgtctcttcc ctctcctctc c 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> starter Ncol-R
<400> 17
aggatcaccc gctgctgccc 20
<210> 18
<211> 19
<212> DMA
PL 215 165 B1 <213> Sztuczna sekwencja <2 2O>
<2 23> starter Ncol-F <400> 13 catcaggata gggcggtgg 19 <210> 13 <211> 23 <212> DMA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> starter 35E3for <4Q0> 1S aatgacta3t gcaggtgcgc 20
Met 1 Thr Thr Ser Gly 5 Val Pro Phe Gly Het 10 Thr Leu Arg Pro Thr L5 Arg
Ser Arg Leu Ser 20 Arg Arg Thr Pro Tyr 25 Ser Arg Asp Arg Leu 30 Pro Pro
Phe Glu The Ξ5 Glu Thr Arg Ala Thr 40 Ile Leu Glu Asp His 45 Pro Leu Leu
Pro Glu Gys Asn Thr Leu Thr Me t His Asn Val Ser Tyr Val Arg Gly
55 60
PL 215 165 B1
Leu 65 Pro Cys Ser Val Gly 70 Phe Thr Leu ile Gin Glu 75 Trp Val Val Pro 80
Trp A3p Met Val Leu Thr Arg Glu Glu Leu Vai Ile Leu Arg Lys Cys
85 90 55
Met His Val Cys Leu Cys Cys Ala Asn Ile Asp He Met Thr Ser Met
100 105 110
Met Ile His Gly Tyr Glu Ser Trp Ala Leu His Cys His Cys Ser Ser
115 120 125
Pro Gly Ser Leu Gin Cys Ile Ala Gly Gly Gin Val Leu Ala Sar Trp
130 135 140
Phe Arg Met Val Val Asp Gly Ala Met Phe Asn Gin Arg Phe Ile Trp
145 150 155 160
Tyr Arg Glu Val Val Asn Tyr Asn Me t Pro Lys Glu Val Met Phe Met
165 170 175
Ser Ser Val Phe Met Arg Gly Arg His Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Trp
ISO 195 190
Tyr Asp Gly His Val Gly Ser Val Val Pro Ala Met Ser Phe Gly Tyr
195 200 205
Ser Ala Leu His Cys Gly Ile Leu Asn Asn Ile Val Val Leu Cys Cys
210 215 220
Ser Tyr Cys Ala Asp Leu Ser Glu Ile Arg Val Arg Cys Cys Ala Arg
225 230 235 240
Arg Thr Arg Arg Leu Met Leu Arg Ala Val Arg Ile Ile Ala Glu Glu
245 250 255
Thr Thr Ala Me t Leu Tyr Ser Cys Arg Thr Glu Arg Arg Arg Gin Gin
260 265 270
Phe Ile Arg Ala Leu Leu Gin His His Arg Pro Ile Leu Met His Asp
275 280 285
Tyr Asp Ser Thr Pro Met
290
<210> 22
<211> 299
<212> PRT
<213 > Sztuczna sekwencj
<220
PL 215 165 B1 <223> Sekwencja aminokwasowa białka E4-orf6 z adenowirusa typu 35 <400> 22
Met Ser Gly Ser Asn Ser Ile Ket Thr Arg Leu Arg Ala Arg Ser Thr
1 5 10 15
Ser CV3 Ala Arg His His Pro Tyr Thr Arg Ala Gin Leu Pro Arg Cys
20 25 30 ’
Glu Glu Asn Glu Thr Arg Ala Ser Met Thr Glu Asp His Pro Leu Leu
3 5 40 45
Pro ASp Cys Asp Thr Met Thr ΝΊθ t His Ser Val Ser Cys Val Arg Gly
50 55 60
Leu Pro Cys Ser Ala Ser Phe Thr Val Leu Gin Glu Leu Pro Ile Pro
65 70 75 30
Trp Asp Met Phe Leu Asn Pro Glu GLu Leu Lys Ile Met Arg Arg Cys
85 50 55
Met His Leu Cys Leu Cys Cys Ala Thr Ile Asp Ile Phe His Ser Gin
100 105 110
Val Ile His Gly Arg Glu Asn Trp Val Leu His Cys His Cys Asn Gin
115 120 125
Gin Gly Ser Leu Gin Cys ile t Ala Gly Gly Ala Val Leu Ala V s1 Trp
130 135 140
Phe Arg Lys Val Ile Leu Gly Cys Met Ile Asn Gin Arg Cys Pro Trp
145 150 155 160
Tyr Arg Gin Ile Val Asn Me t His Met Pro Lys Glu Ile Met Tyr Val
165 170 ' 175
Gly Ser Val Phe Leu Arg Arg Arg His Leu Ile Tyr Ile Lys Leu Trp
130 195 ISO
Tyr Asp Gly His Ala Gly Ala Ile Ile Ser Asp Met Ser Phs Gly Trp
195 200 205
Ser Ala Phe Asn Tyr Gly Leu Leu Asn Asn Ile Val ile Met Cys Cys
210 215 220
Thr Tyr Cys Lys Asp Leu Sec Glu Ile Arg Met Arg Cvs Cys Ala His
225 230 235 ' 240
Arg Thr Arg Lys Leu Met Lsu Arg Ala Ile Lys Ile Met Leu Gin Glu
245 250 2 5. 5
PL 215 165 B1
Thr Val Aap Pro Asp Pro Ile Asn Ser Arg Thr Glu Arg Arg Arg
250 2S5 270
Gl n Arg Leu Leu Val Gly Lej Met Arg His Aj π Arg Pro Ile Pro Phe
275 230 285
Sec Asp Tyr Asp Ser His Arg Ολ w ** W fc· Ser Ser Arg
290 295 <2L0> 23 <211> 150 <212> PP.T <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> gekwencja aminokwasowa białka E4-orf6+7 z adenowicusa typu 5
<400 » 23
Met The Thr Sar Gly yal Pro Phe Gly Mat Thr leu Arg Pro Thr Arg
1 5 10 15
Ser Arg Leu Sar Arg Arg Thr Prc Tyr Sar Arg Asp .Arg Leu Pro Pro
20 z. 3 30
Phs Glu Thr Glu Thr Arg Ais Thr Ile Glu Asp His Pro Leu Lau
33 40 45
Pro Glu Cys Asn Thr Leu Thr Met His Asn Ala Trp Thr Ser Pro Ser
'50 55 80
Pro Pro Val Lys Gin Pro Gin Val Gly Gir, Gin Pro val AIS Gin Gin
65 70 7< 30
Leu Asp Sar A3p Me- Asn Leu Ser Glu Lau Pro Gly Glu Phe Ile Asn
35 90 95
Ile Thr Asp Glu Arg Leu Ala Arg Gin Glu Thr Val Trp Asn Ile Thr
100 1C5 11C
Pro Lys Asn Mst Ser Val Thr His Asp Mat Met Leu Phe lys Ala Ser
115 i 2 3 125
Arg Gly Glu Arg Thr yal Tyr Ssr val Cys Trp Glu Gly Gly Gly Arg
130 135 140
Le J Asn Thr Arg V.?. i leu
115 150 <2I0> 24
PL 215 165 B1
<211> L50
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
<220
<223> Sekwencja aminokwasowa białka fuzyjnego E4-orf6+7 z adenowirusa typu 5 i adenowirusa typu 35
<4 3 0> 24
Met Thr 1 Thr Ser Gly 5 Yal Pro Phs Gly Met 10 Thr Leu Arg Fro Thr 15 Arg
Sec Arg Leu Ser 20 Arg Arg Thr Pro Tyr 25 Ser Arg Asp Arg Leu 30 Pro Pro
Phe Glu Thr 35 Glu Thr Arg Ala Thr 40 Ile Leu Glu Asp His 45 Pro Leu Leu
Pro Gi.u 50 Cys Asn Thr Leu thr 55 Met His Asn Ala Trp 60 Thr Ser Pro Ser
Pro Pro 65 Val Lys Gin Pro 70 Gin Val Gly Gin Gin 75 Pro Val Ala Gin Gin 80
3U Asp Ser Asp Met S5 Asn Leu Ser Glu Leu 50 Pro Gly Glu Phe Ile 95 Asn
Ile The Asp Glu 100 Arg Leu Ala Arg Gin 105 Glu * Val Tro Aso 112 Ile Thr
Pro'Lys Asn 115 Met Sar Val Thr His 120 ASP Met Met Leu Phe 125 Lys Ala Ser
Arg GLy 130 Glu a ’.'<·* Thr Val T y £ 135 Ser Vai Lys Trp Glu 140 Gly Gly Gly Lys
Ile Thr Thr Arg 145
<2L0> 25
<211> 141
<2L2> PRT
<2L3> Sztuczna
<220>
<223> Sekwencja
<400> 25
Hat Ser Gly Ser sekwencja aEiiinokwasowa białka E4-orf€+7 z adsnowirusa typu 35
Asn Sec Ile Ket Thr Aro Lsu α-ί Λ a ir«r «.·»»· »}·«
PL 215 165 B1
1 5 13 15
Ser Cys Ala Arg His. His Pro Tyr Thr Arg Ala Gin Leu Pro Arg Cys
20 25 30
Glu Glu Asn Glu Thr Arg Ala Ser Met Thr C-lu Asp His Pro Leu Leu
35 40 45
Pro Asp Cys Asp Thr Met Thr Met His Ser Met Thr Val Ile Gin Thr
50 55 60
Pro Glu Ser His Pro Gin Gin Leu Asp Cys Glu Ser Al a Leu Lys Asp
65 70 75 80
Tyr Arg Asp Gly Phe Leu Ser Ile Thr Asp Pro Arg Leu Ala Arg Ser
35 90 95
Glu Thr Val Trp Asn Val Glu Ser Lys Thr Met Ser Ile Ser Asn Gly
100 105 110
Ile Gin E-let Phe Lys Ala Val Arg Gly Glu Arg Leu Val Tyr Ser Val
115 12;Q. 125
Lys Trp Glu Gly Gly Gly Lys Ile Thr Thr Arg He Leu
130 135 140
Zastrzeżenia patentowe

Claims (16)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Rekombinowany wektor adenowirusowy, znamienny tym, że zawiera strukturalne i niestrukturalne elementy z adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany wektor zawiera ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 z adenowirusa o drugim serotypie innym niż wspomniany pierwszy serotyp.
  2. 2. Rekombinowany wektor adenowirusowy według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany pierwszy serotyp i wspomniany drugi serotyp są z różnych podgrup adenowirusa.
  3. 3. Rekombinowany wektor adenowirusowy według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany pierwszy serotyp jest z podgrupy innej niż podgrupa C a wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy C.
  4. 4. Rekombinowany wektor adenowirusowy według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany pierwszy serotyp jest z podgrupy B a wspomniany drugi serotyp jest z podgrupy C.
  5. 5. Rekombinowany wektor adenowirusowy według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie 5.
  6. 6. Rekombinowany wektor adenowirusowy według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany pierwszy serotyp jest wybrany z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50.
  7. 7. Rekombinowany wektor adenowirusowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto sekwencję kodującą nie-adenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd.
  8. 8. Rekombinowany wektor adenowirusowy według zastrz. 7, znamienny tym, że wspomniane nie-adenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd są wybrane z grupy składającej się z polipeptydu indukującego śmierć komórki, determinanty antygenowej organizmu patogennego, antygenu specyficznego dla guza, białka wirusa, hormonu i cytokiny.
  9. 9. Sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego zawierającego strukturalne i niestrukturalne elementy adenowirusa nie z podgrupy C o pierwszym serotypie, znamienny tym, że:
    PL 215 165 B1
    a. dostarcza się komórkę komplementującą niosącą sekwencję kodującą E1B-55K pochodzącą z adenowirusa o serotypie 5 (Ad5) w postaci ulegającej ekspresji, z niezbędnymi elementami adenowirusa pozwalającymi na składanie wspomnianego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej pewne elementy strukturalne i niestrukturalne z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie nie z podgrupy C i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 Ad5;
    b. hoduje się wspomnianą komórkę komplementującą w pożywce w warunkach pozwalających na wytwarzanie i składanie wektora adenowirusowego; i
    c. zbiera się tak wytworzony, rekombinowany wektor adenowirusowy z pożywki i/lub komórki komplementującej, gdzie sekwencja kodująca białko E4-orf6 Ad5 występuje w tak wytworzonym rekombinowanym wektorze adenowirusowym.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniany pierwszy serotyp jest serotypem adenowirusa z podgrupy B.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że wspomniany pierwszy serotyp wybiera się z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50.
  12. 12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K jest wbudowana do genomu wspomnianej komórki komplementującej.
  13. 13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniana komórka pochodzi z pierwotnej, diploidalnej komórki człowieka lub jej komórki progenitorowej.
  14. 14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniana komórka komplementująca pochodzi z pierwotnej ludzkiej komórki blastycznej statkówki, pierwotnej ludzkiej komórki zarodkowej nerki, pierwotnej ludzkiej komórki nerwowej lub pierwotnego ludzkiego amniocytu.
  15. 15. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniana komórka komplementująca posiada wbudowany do swojego genomu kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno białko E1A Ad5.
  16. 16. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniana komórka komplementująca jest komórką PER.C6 lub jej pochodną.
PL373304A 2002-04-25 2003-04-24 Rekombinowany wektor adenowirusowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego PL215165B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL0200280 2002-04-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373304A1 PL373304A1 (pl) 2005-08-22
PL215165B1 true PL215165B1 (pl) 2013-10-31

Family

ID=29728828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL373304A PL215165B1 (pl) 2002-04-25 2003-04-24 Rekombinowany wektor adenowirusowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego

Country Status (23)

Country Link
US (2) US7468181B2 (pl)
EP (1) EP1497438B1 (pl)
JP (1) JP4495587B2 (pl)
KR (1) KR101021387B1 (pl)
CN (1) CN100497639C (pl)
AT (1) ATE447037T1 (pl)
AU (1) AU2003271737B2 (pl)
BR (1) BR0308783A (pl)
CA (1) CA2477954C (pl)
DE (1) DE60329835D1 (pl)
DK (1) DK1497438T3 (pl)
EA (1) EA010828B1 (pl)
ES (1) ES2335657T3 (pl)
HK (1) HK1068371A1 (pl)
IL (2) IL164803A0 (pl)
MX (1) MXPA04008891A (pl)
NO (1) NO332108B1 (pl)
NZ (1) NZ534866A (pl)
PL (1) PL215165B1 (pl)
PT (1) PT1497438E (pl)
SI (1) SI1497438T1 (pl)
WO (1) WO2003104467A1 (pl)
ZA (1) ZA200406942B (pl)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0833934T4 (da) 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
AU2003271738C1 (en) 2002-04-25 2008-04-17 Crucell Holland B.V. Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
EP1539937A4 (en) * 2002-08-22 2006-07-26 Merck & Co Inc METHODS OF PROPAGATION OF ADENOVIRUS AND VIRUS SO OBTAINED
US20070036721A1 (en) * 2003-09-23 2007-02-15 Uab Resarch Foundation Methods and compositions for in vivo inflammation monitoring
EP1718738A2 (en) 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
SG159555A1 (en) 2004-11-16 2010-03-30 Crucell Holland Bv Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
ATE412737T1 (de) 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
US20090110695A1 (en) * 2006-03-27 2009-04-30 Menzo Jans Emko Havenga Compositions Comprising a Recombinant Adenovirus and an Adjuvant
CA2742474C (en) 2008-11-03 2016-05-31 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors
AU2010305768B2 (en) 2009-10-15 2015-05-14 Crucell Holland B.V. Process for adenovirus purification from high cell density cultures
MX2012004222A (es) 2009-10-15 2012-06-08 Crucell Holland Bv Metodo para purificacion de particulas de adenovirus.
EP2498791B1 (en) * 2009-11-09 2014-12-24 GenVec, Inc. Methods of propagating monkey adenoviral vectors
AU2011214262B2 (en) 2010-02-15 2015-05-21 Crucell Holland B.V. Method for the production of Ad26 adenoviral vectors
AP3390A (en) 2010-09-20 2015-08-31 Crucell Holland Bv Therapeutic vaccination against active tuberculosis
BR112013004582A2 (pt) 2010-09-27 2016-09-06 Crucell Holland Bv método para induzir uma resposta imune em um sujeito contra um antígeno de um parasita que causa a malária
PL2655604T3 (pl) 2010-12-14 2019-02-28 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Szczepionki adenowirusowe serotyp 26 i serotyp 35 przeciwko filowirusom
WO2012145509A2 (en) 2011-04-19 2012-10-26 The Research Foundation Of State University Of New York Adeno-associated-virus rep sequences, vectors, and viruses
WO2013074501A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
MY170927A (en) 2011-11-28 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention Bv Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2013231423B2 (en) 2012-03-12 2018-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
AP2014007993A0 (en) 2012-03-22 2014-10-31 Crucell Holland Bv Vaccine against RSV
EP2855685B1 (en) 2012-05-24 2017-03-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenoviral vectors for transduction of vascular tissue
AU2014236207B2 (en) * 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
PL2988780T3 (pl) 2013-04-25 2019-06-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilizowane rozpuszczalne prefuzyjne polipeptydy F RSV
WO2014202570A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Crucell Holland B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
CA2923352C (en) 2013-09-19 2022-05-03 Crucell Holland B.V. Stable adenovirus formulations
EP3188754A1 (en) 2014-09-03 2017-07-12 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing immune responses
JP6462861B2 (ja) 2014-09-03 2019-01-30 バヴァリアン ノルディック エー／エス フィロウイルス感染に対する防御免疫の誘導を目的とする方法及び組成物
KR102159626B1 (ko) 2014-09-26 2020-09-25 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물
RS58080B1 (sr) 2014-11-04 2019-02-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Terapeutske vakcine protiv hpv16
CN107466324B (zh) 2015-04-14 2022-01-14 扬森疫苗与预防公司 具有双向启动子的表达两种转基因的重组腺病毒
CN104846013B (zh) * 2015-04-15 2018-11-09 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用
KR102638978B1 (ko) 2015-07-07 2024-02-22 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 백신
US10457708B2 (en) 2015-07-07 2019-10-29 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides
BR112018003019A2 (pt) 2015-08-20 2018-09-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv vacinas terapêuticas contra hpv18
CA3001050C (en) 2015-10-06 2023-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for preventing surface-induced degradation of viruses using cyclodextrins
JP7171433B2 (ja) * 2015-10-30 2022-11-15 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ｈｅｒ－２発現固形腫瘍の処置のための組成物および方法
DK3390430T3 (da) 2015-12-15 2019-11-18 Janssen Vaccines & Prevention Bv Human immundefektvirus-antigener, vektorer, sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3013639A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
CA3018139A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
KR102506895B1 (ko) 2016-04-05 2023-03-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 용해성 융합-전 rsv f 단백질
WO2017192418A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
US11473105B2 (en) 2016-05-12 2022-10-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
KR102421049B1 (ko) 2016-05-30 2022-07-15 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 융합-전 rsv f 단백질
AU2017286375B2 (en) 2016-06-16 2019-04-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV vaccine formulation
CN109312362B (zh) 2016-06-20 2022-06-28 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
US10744196B2 (en) 2016-07-14 2020-08-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HPV vaccines
WO2018011768A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Janssen Vaccines And Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
WO2018011198A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
AU2017318689A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
IL265186B (en) 2016-09-15 2022-09-01 Janssen Vaccines Prevention B V HIV envelope proteins with trimer-stabilizing mutations
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
US11034978B2 (en) 2017-02-09 2021-06-15 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
WO2018185732A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen
JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2020-06-25 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド アルファウイルス新生抗原ベクター
CA3061278A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
WO2018210871A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
JP7216668B2 (ja) 2017-05-26 2023-02-01 エピセントアールエックス，インコーポレイテッド 導入遺伝子を保持する組換えアデノウイルス
CN110958887B (zh) 2017-06-15 2023-10-31 扬森疫苗与预防公司 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法
CN110891601A (zh) 2017-07-19 2020-03-17 扬森疫苗与预防公司 三聚体稳定性hiv包膜蛋白突变
US20190022212A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human
IL272281B2 (en) 2017-07-28 2023-04-01 Janssen Vaccines Prevention B V Methods and preparations for heterologous reprna vaccines
KR20200053518A (ko) 2017-09-15 2020-05-18 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 면역의 안전한 유도를 위한 방법
US20190083620A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
EA202091074A1 (ru) 2017-10-31 2020-07-22 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Аденовирус и его применения
SG11202003398SA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus vectors and uses thereof
MA50502A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adénovirus et utilisations associées
KR20200083510A (ko) 2017-10-31 2020-07-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 및 이의 용도
US10864263B2 (en) 2017-11-20 2020-12-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen
KR20200100745A (ko) 2017-12-19 2020-08-26 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 B형 간염 바이러스(hbv)에 대한 면역 반응 유도를 위한 방법 및 조성물
IL315325A (en) 2018-01-04 2024-10-01 Iconic Therapeutics Inc Anti-tissue-mediated antibodies, antibody-drug conjugates, and related methods
BR112021000274A2 (pt) 2018-07-20 2021-04-06 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vetor adenoviral recombinante expressando antígeno de zika com produtividade melhorada
EP3856238A1 (en) 2018-09-25 2021-08-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method of inducing an immune response against human immunodeficiency virus by co-localized administration of vaccine components
MX2021013947A (es) 2019-05-15 2021-12-14 Janssen Vaccines & Prevention Bv Tratamiento profilactico de la infeccion por virus sincitial respiratorio con una vacuna basada en adenovirus.
EP3969044A1 (en) 2019-05-15 2022-03-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
WO2020237052A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
SG11202113187WA (en) 2019-05-30 2021-12-30 Gritstone Bio Inc Modified adenoviruses
CA3156471A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. ADENOVIRUS VECTORS AND THEIR USES
US20210315986A1 (en) 2020-04-13 2021-10-14 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
MX2022014162A (es) 2020-05-11 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteínas de fusión de la proteína de la espícula del coronavirus estabilizadas.
EP4149530A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Administration of homologous adenoviral vectors
BR112022026408A2 (pt) 2020-06-29 2023-01-17 Janssen Vaccines & Prevention Bv Combinação vacinal contra infecção pelo vírus sincicial respiratório
AU2021303722A1 (en) 2020-07-06 2022-12-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized Corona virus spike protein fusion proteins
JP2023533528A (ja) 2020-07-08 2023-08-03 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｈｂｖに対するｒｎａレプリコンワクチン
CA3189238A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Transgene Treatment of immune depression
WO2022032196A2 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
CA3195177A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy disorders including limb girdle 2i (lgmd2i)
US20220118081A1 (en) 2020-10-20 2022-04-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV vaccine regimens
CN116802280B (zh) * 2021-01-21 2024-09-17 希力德株式会社 不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体及其用途
CA3211034A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv fb antigens
WO2022175479A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections
KR20230165275A (ko) 2021-04-01 2023-12-05 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 융합 전 piv3 f 단백질
WO2023020939A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023026182A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023047348A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized corona virus spike protein fusion proteins
WO2023047349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins
WO2023111725A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023110618A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023217988A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
CN117264902A (zh) * 2022-06-15 2023-12-22 上海元宋生物技术有限公司 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用
EP4338727A1 (en) 2022-09-14 2024-03-20 Roquette Freres Adenovirus formulations
WO2024061757A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Pre-fusion human piv1 f proteins
WO2024061759A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized coronavirus s proteins
WO2024074584A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593002A (en) * 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
US4487829A (en) * 1982-03-23 1984-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies against adenoviruses
US4517686A (en) * 1982-08-04 1985-05-21 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide
US4578079A (en) * 1982-08-04 1986-03-25 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
US4792525A (en) * 1982-08-04 1988-12-20 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
US4589881A (en) * 1982-08-04 1986-05-20 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
FR2602790B1 (fr) 1986-08-13 1990-06-01 Transgene Sa Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante
US6007806A (en) * 1986-08-13 1999-12-28 Transgene S.A. Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US4956281A (en) * 1987-06-03 1990-09-11 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lymphocyte function associated antigen-3
US5024939A (en) * 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA2000048A1 (en) * 1988-10-03 1990-04-03 Edward F. Plow Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand bindin g
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) * 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5223394A (en) * 1989-04-10 1993-06-29 Biogen, Inc. Recombinant dna molecule comprising lymphocyte function-associated antigen 3 phosphatidylinositol linkage signal sequence
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5332567A (en) * 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
US5436146A (en) * 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
EP0595798B1 (en) 1989-10-20 1999-03-03 Medarex, Inc. Bispecific heteroantibodies with dual effector functions
EP0496818B1 (en) 1989-10-20 1999-06-23 Trustees Of Dartmouth College MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR IgA RECEPTOR
WO1991018088A1 (en) * 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US5246921A (en) * 1990-06-26 1993-09-21 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Method for treating leukemias
GB2246779B (en) 1990-08-03 1994-08-17 Delta Biotechnology Ltd Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells
GB9101550D0 (en) 1991-01-24 1991-03-06 Mastico Robert A Antigen-presenting chimaeric protein
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
FR2681786A1 (fr) 1991-09-27 1993-04-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires.
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
IL103059A0 (en) 1991-09-30 1993-02-21 Boehringer Ingelheim Int Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
WO1994008026A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
DE69331526T2 (de) 1992-11-18 2002-10-24 Arch Development Corp., Chicago Adenovirus gelenkter gen-transfer zum herz- und glatten vaskularen muskel
GB9300686D0 (en) 1993-01-15 1993-03-03 Imp Cancer Res Tech Compounds for targeting
AU6133394A (en) 1993-02-09 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
ATE221575T1 (de) 1993-05-10 2002-08-15 Univ Michigan Gentransfer zu den pankreatischen epithelzellen
US5543328A (en) * 1993-08-13 1996-08-06 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having modified fiber proteins
WO1995006745A1 (de) 1993-09-03 1995-03-09 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vektor für leber-gentherapie
US5552311A (en) * 1993-09-14 1996-09-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy
US5534423A (en) * 1993-10-08 1996-07-09 Regents Of The University Of Michigan Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
IT1271461B (it) 1993-12-01 1997-05-28 Menarini Ricerche Sud Spa Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso.
US5443953A (en) * 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US6057299A (en) * 1994-01-13 2000-05-02 Calydon, Inc. Tissue-specific enhancer active in prostate
US5698443A (en) * 1995-06-27 1997-12-16 Calydon, Inc. Tissue specific viral vectors
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US6312699B1 (en) 1994-03-28 2001-11-06 Uab Research Foundation Ligands added to adenovirus fiber
US7252989B1 (en) 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
AU2589695A (en) 1994-05-13 1995-12-05 Chiron Corporation Compositions and methods for targeting gene delivery vehicles
US5571531A (en) 1994-05-18 1996-11-05 Mcmaster University Microparticle delivery system with a functionalized silicone bonded to the matrix
US5570975A (en) 1994-06-27 1996-11-05 Reinert, Sr.; Gary L. Metal foundation push-it and installation apparatus and method
FR2721943B1 (fr) * 1994-06-29 1996-08-02 Rhone Poulenc Rorer Sa Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutase
US5846782A (en) * 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
JPH10508743A (ja) 1994-09-09 1998-09-02 ニューロクライン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド インターロイキン−１ タイプ３レセプター
FR2724846B1 (fr) 1994-09-27 1996-12-20 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras
FR2725726B1 (fr) * 1994-10-17 1997-01-03 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
US5856152A (en) * 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
FR2727867B1 (fr) * 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
DK0833934T4 (da) * 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US6676935B2 (en) * 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
US7001764B2 (en) * 1995-06-27 2006-02-21 Cell Genesys, Inc. Compositions comprising tissue specific adenoviral vectors
US5622699A (en) * 1995-09-11 1997-04-22 La Jolla Cancer Research Foundation Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US5837511A (en) * 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
JP2001520511A (ja) * 1995-12-08 2001-10-30 ザ ユーナヴァーサティ オブ アラバマ アト バーミングハム リサーチ ファンデーション 向標的性アデノウイルス・ベクター
CA2259152C (en) * 1996-07-05 2002-02-12 Philip E. Branton Adenovirus e4 proteins for inducing cell death
US5877011A (en) * 1996-11-20 1999-03-02 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors
US5922315A (en) * 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
AU6691098A (en) * 1997-03-07 1998-09-22 Wistar Institute Of Anatomy & Biology, The Method and compositions for healing tissue defects and inducing hypervascularityin mammalian tissue
US5981275A (en) * 1997-04-14 1999-11-09 Genzyme Corporation Transgene expression system for increased persistence
US6100086A (en) * 1997-04-14 2000-08-08 Genzyme Corporation Transgene expression systems
IL132673A0 (en) 1997-05-08 2001-03-19 Genetic Therapy Inc Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins
US5849561A (en) * 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
US6287857B1 (en) * 1998-02-09 2001-09-11 Genzyme Corporation Nucleic acid delivery vehicles
US6417168B1 (en) * 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
WO1999047180A1 (en) 1998-03-20 1999-09-23 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors for targeted gene delivery
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
GB9811171D0 (en) * 1998-05-22 1998-07-22 Royal Free Hosp School Med Viral vector
US20030017138A1 (en) 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US6383794B1 (en) 1998-08-24 2002-05-07 Uab Research Foundation Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus
WO2000029573A2 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Canji, Inc. Adenoviral vectors
EP1020529B1 (en) 1998-11-20 2005-06-01 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
EP1016726A1 (en) 1998-12-30 2000-07-05 Introgene B.V. Gene therapy to promote angiogenesis
DE60045138D1 (de) * 1999-05-17 2010-12-02 Crucell Holland Bv Rekombinantes Adenovirus des Ad26-Serotyps
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) * 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
EP1067188A1 (en) 1999-07-08 2001-01-10 Introgene B.V. Infection with chimaeric adenoviruses of cells negative for the adenovirus serotype 5 Coxsacki adenovirus receptor (CAR)
US7125705B2 (en) * 2000-04-28 2006-10-24 Genzyme Corporation Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
EP1157999A1 (en) 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
US20020152553A1 (en) * 2001-03-22 2002-10-24 Wynveen Pamela Sue Travel pillow securing to bucket seats
US6844192B2 (en) * 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US20030026783A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-06 Amine Abina Method of modulating neutralizing antibodies formation in mammals, and uses thereof in gene therapy, animal transgenesis and in functional inactivation of an endogenous proteins
AU2003220237A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-29 Merck & Co., Inc. Method of inducing an enhanced immune response against hiv
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
AU2003271738C1 (en) * 2002-04-25 2008-04-17 Crucell Holland B.V. Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
EP1553983A2 (en) 2002-10-23 2005-07-20 Crucell Holland B.V. New settings for recombinant adenoviral-based vaccines
NZ539813A (en) * 2002-12-17 2008-04-30 Crucell Holland Bv A replication defective recombinant adenovirus comprising a antigenic determinant of Plasmodium falciparum wherein the antigenic determinant is SEQ ID 6
US20070010016A1 (en) * 2005-03-11 2007-01-11 Mccelland Alan Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN100497639C (zh) 2009-06-10
CA2477954C (en) 2012-07-10
EP1497438B1 (en) 2009-10-28
NO20045130L (no) 2005-01-18
EA010828B1 (ru) 2008-12-30
KR101021387B1 (ko) 2011-03-14
US7468181B2 (en) 2008-12-23
EP1497438A1 (en) 2005-01-19
US20080199917A1 (en) 2008-08-21
US7820440B2 (en) 2010-10-26
NO332108B1 (no) 2012-06-25
ES2335657T3 (es) 2010-03-31
NZ534866A (en) 2007-04-27
DE60329835D1 (de) 2009-12-10
CA2477954A1 (en) 2003-12-18
CN1650020A (zh) 2005-08-03
EA200401424A1 (ru) 2005-04-28
ATE447037T1 (de) 2009-11-15
BR0308783A (pt) 2005-01-04
PL373304A1 (pl) 2005-08-22
IL164803A0 (en) 2005-12-18
WO2003104467A1 (en) 2003-12-18
DK1497438T3 (da) 2010-01-04
HK1068371A1 (en) 2005-04-29
PT1497438E (pt) 2010-02-04
AU2003271737B2 (en) 2007-04-19
KR20040106363A (ko) 2004-12-17
JP2005523729A (ja) 2005-08-11
JP4495587B2 (ja) 2010-07-07
US20050158278A1 (en) 2005-07-21
AU2003271737A1 (en) 2003-12-22
ZA200406942B (en) 2005-11-30
SI1497438T1 (sl) 2010-03-31
MXPA04008891A (es) 2004-11-26
IL164803A (en) 2011-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1497438B1 (en) Means and methods for the production of adenovirus vectors
CA2478508C (en) Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
EP0833934B1 (en) Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
CA2428739C (en) Complementing cell lines
ES2246533T3 (es) Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas.
AU3445899A (en) Generation of packaging system for human recombinant adenoviral vectors
CA2378061A1 (en) Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
Rivera et al. Mode of transgene expression after fusion to early or late viral genes of a conditionally replicating adenovirus via an optimized internal ribosome entry site in vitro and in vivo
CN113774031B (zh) 一种复制型人腺病毒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification