MXPA04008891A - Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus. - Google Patents
Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus.Info
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Abstract
La invencion se refiere a metodos y medios para la produccion de vectores adenovirales sobre lineas de celulas de complementacion, en donde el acido nucleico que codifica para el marco de lectura abierto 6 de la region temprana 4 (E4-orf6) esta presente en el vector adenoviral, y en donde el producto genico E4-orf6 es compatible con uno o mas productos de los productos genicos El provistos por la celula de complementacion, de tal forma que el vector adenoviral puede ser producido eficientemente por la celula de complementacion.
Description
MEDIOS Y METODOS PARA LA PRODUCCION DE VECTORES DE ADENOVIRUS
Campo de la invención La invención se refiere a vehículos de suministro de ácido nucleico y al uso de los mismos, más en particular la invención se refiere a vectores adenovirales recombinantes y al uso de los mismos. Antecedentes de la invención Hasta la fecha se han identificado 51 serotipos de adenovirus humanos que se subdividen en seis grupos (A, B, C, D, E y F) con base en las propiedades de hemaglutinación y homología de secuencia (Francki et al., 1991) . El ciclo infeccioso de los adenovirus se divide en una fase temprana y una tardía. En la fase temprana, el virus está no recubierto y el genoma es transportado al núcleo después de lo cual las reacciones génicas tempranas (El, E2 , E3 y E4) se vuelven transcripcionalmente activas. La región El contiene dos regiones de transcripción: E1A y E1B. E1A codifica para proteínas que están implicadas en la modificación del ciclo de células huésped y la activación de las demás regiones de transcripción virales (revisado por Rusell. 2000) . La región E1B codifica para dos proteínas principales: E1B-19K y E1B-55K, que evitan la inducción de apoptosis que resulta de la actividad de las proteínas E1A (Rao et al., 1992; Yew y Berk 1992; Shenk 1996) . Además, la proteína E1B-55K es requerida REP. : 158093 en la fase tardía para el transporte de AR m viral selectivo y la inhibición de la expresión de proteínas huésped (Pilder et al., 1986) . E2 se divide también en dos subdominios : E2A y E2B, que juntos codifican para tres proteínas (una proteína de unión a ADN, una polimerasa viral y una proteína pre-terminal) , que están todos implicados en la replicación del genoma viral (Van der Vliet 1995) . E3 no es necesario para la replicación in vi tro pero que codifica para varias proteínas que se voltean al mecanismo de defensa huésped del hacia la infección viral (Horwitz 2001) . E4 porta al menos seis marcos de lectura abiertos (orf's) que codifican para proteínas implicadas en varias funciones distintas relacionadas con el empalme y transporte de ARNm viral, transporte de ARNm de células huésped, transcripción y transformación viral y celular (revisado por Leppard 1997) . Las proteínas tardías, necesarias para la formación de las cápsides virales y el empaque de los genomas virales, se generan todas a partir de la unidad de transcripción tardía principal (MLTU) que se vuelve completamente activa después del inicio de la replicación. Un proceso completo de empalme diferencial y poliadenilación da origen a más de 15 especies de ARNm que comparten una secuencia líder tripartita. Las proteínas E1B-55K, E4-crf3 y E4-orf6 juegan un papel pivotal en la regulación del procesamiento y transporte de ARNm viral tardío desde el núcleo. Para este proceso E1B-55K interactúa con E4-orf6 para formar un complejo funcional que estimula el transporte de moléculas de ARNm virales al citoplasma, mientras que el complejo está también implicado en la inhibición del transporte de moléculas de ARNm celulares del núcleo al citoplasma (revisado por Leppard 1997 y 1998) . La producción de vectores suprimidos en El a base de serotipos del subgrupo C Ad5 o Ad2 se logra en líneas celulares de complementación El tales como 293 (Graham et al., 1970), 911 (Fallaux et al., 1996) y PER. C6™ (Fallaux et al., 1998; ECACC No. de depósito 96022940). Como se describió en O 99/55132 y WO 01/05945, los vectores y líneas de células pueden ser apareados para evitar la generación de adenovirus competentes en replicación a través de recombinación homologa entre secuencias de adenovirus en la línea de células y el vector. Para una producción eficiente de adenovirus incompetentes en replicación derivados del grupo C, se usa de preferencia la línea de células PER.C6™. Usando esta línea de células pueden aparearse los vectores de adenovirus, de esta manera permitiendo la producción de vectores adenovirales de grupo C en ausencia de adenovirus competentes en replicación (Fallaux et al., 1998; patente de E.U.A. No. 6,033,908). Sin embargo, los vectores del grupo C podrían no siempre ser los vehículos ideales para aplicaciones in vivo directas toda vez que la eficiencia de infección es seriamente obstaculizada por la presencia de altas concentraciones de actividad neutralizante en la mayoría de los humanos y la ausencia de cantidades suficientes del receptor celular (receptor de adenovirus de Coxsackie, CAR) en células objetivo primarias (por ejemplo células endoteliales, células de músculo liso, sinoviocitos , monocitos y células dendríticas) . La administración de cantidades más altas de virus para incrementar la transducción puede llevar a toxicidad incrementada y a un resultado clínico impredecible debido a la variación en las concentraciones neutralizantes de los sujetos que son tratados. Estas limitaciones pueden ser superadas por el uso de otros serotipos de adenovirus. Por ejemplo, la parte de unión a receptor de una fibra de virus de subgrupo B (en particular del serotipo 16) cuando es expresada en un vector a base de Ad5, media una infección significativamente incrementada de células endoteliales y células de músculo liso humanas (WO 00/31285) y de sinoviocitos humanos ( O 00/52186) . La fibra de otro adenovirus de subgrupo B, Ad35, es más eficiente para mediar la infección de monocitos humanos y células dendríticas (WO 00/03029) . Más aún, Ad35 ha sido identificado como un virus para el cual la vasta mayoría de la población humana no tiene actividad neutralizante (WO 00/70071) . Existe una necesidad generalmente sentida en la técnica por desarrollar tecnología que tenga una utilidad de serotipo más amplia. Un problema particular es la falta de líneas de células de empaque adecuadas para estos otros serotipos. Las líneas de células de empaque para vectores Ad5 comprenden típicamente proteínas codificadas El derivadas del serotipo 5 de adenovirus. Ejemplos de estas líneas de células de empaque "estándares" son 293, 911 y P3R. C6™. Los intentos por producir vectores derivados de otros serotipos en estas líneas de células de empaque estándares han probado ser difíciles si no es que inexitosos . Ocasionalmente se observa cierta producción, dependiendo del serotipo particular usado. Sin embargo, los rendimientos de vectores de adenovirus recombinante derivados de subgrupos de adenovirus que no son de subgrupo C, producidos en líneas de células transformadas e inmortalizadas por El de Ad5, es deficiente. En un documento por Abrahamsen et al., (1997), una purificación de placa mejorada de un vector de serotipo 7 de adenovirus suprimido en E1A (subgrupo B) se observó en células 293 que comprendían E4-orf6 derivado del serotipo 5 de adenovirus, en comparación con células 293 que carecían de la secuencia E4-orf6 de Ad5. Sin embargo, se encontró un problema con la estabilidad del vector ya que se observaron recombinaciones inesperadas en grupos purificados en placa. Un problema adicional se encontró con la contaminación de virus de adenovirus tipo silvestre durante la producción. Más aún, para la producción a gran escala de adenovirus no es útil cotransfectar E4-orf6 para obtener concentraciones que sean lo suficientemente altas como para su aplicación. Una opción para cultivar estos adenovirus es proporcionar células con el gen E4-orf6 integrado establemente en el genoma de la línea de células de complementación/empaque . Estas células se han descrito en la técnica (por ejemplo, WO 96/22378) . Una desventaja de ese sistema es el hecho de que nuevas líneas de células estables tienen que ser generadas, y numerosas rondas de selección tienen que llevarse a cabo antes de que células estables y adecuadas hayan sido generadas. Este proceso es laborioso y consumidor de tiempo. En general, se puede decir que la generación y propagación de adenovirus de serotipos que no sean el serotipo 5 (subgrupo C) , tales como virus del subgrupo B, ha probado ser difícil en células de complementación Ad5. Se han descrito por los solicitantes en WO 00/70071, que virus recombinantes a base del Ad35 de virus del subgrupo B pueden hacerse mediante la cotransfección de una construcción de expresión que contiene las secuencias de la región 1 temprana de Ad35 (Ad35-El) . Además, los virus a base de Ad35 que están suprimidos solamente para las secuencias E1A y no para E1B mostraron replicarse eficientemente en células PER.C6, sugiriendo que las proteínas E1A de Ad5 son capaces de complementar las funciones de Ad35-E1A (solicitud internacional del solicitante PCT/NL01/00824 , aún no publicada) . Además, los experimentos muestran que la falta de Ad35-E1B da como resultado rendimientos deficientes en células de complementación de Ad5. WO 00/70071 describe también líneas de células para la producción de vectores adenovirales que no son de grupo C y suprimidos en El al modificar además líneas de células que son capaces de complementar serotipo 5 de adenovirus. El documento WO 00/70071 sugiere además que se deben establecer líneas de células nuevas que porten secuencias Ad35-El para la complementación de vectores de serotipo 35 de adenovirus recombinantes que carezcan de la región El (véase también la solicitud internacional del solicitante PCT/NL01/00824) . Sin embargo, como también se describió arriba, si se desea aplicar un serotipo específico para una necesidad específica, se tendría que establecer una nueva línea de células para cada serotipo específico, o se tendrían que modificar las líneas de células disponibles que pudieran complementar el serotipo 5 de adenovirus para la complementación del serotipo de interés. Sería claramente adecuado usar las líneas de células establecidas que están disponibles en la técnica, y no modificar éstas y usarlas para la producción de todos los demás serotipos que no sean de Ad5, aplicando los métodos establecidos y eficientes conocidos en la técnica. Se concluye que hasta la presente invención, ninguna "plataforma de producción" flexible y adecuada estaba disponible en la técnica que hiciera posible producir rendimientos útiles de serotipos de adenovirus que fueran diferentes de los serotipos del subgrupo C. Breve descripción de las figuras La figura 1 es una representación esquemática del plásmido ???? . Orf6. Hygro (ECACC No. de depósito P02041226) . Por motivos de claridad, la D mayúscula indica delta (?) . La figura 2 es una representación esquemática del plásmido pAd35. ??? . Orf6. Por motivos de claridad, la D mayúscula indica delta (?) . La figura 3 es una representación esquemática de pUC.35-5E4. La figura 4 es una representación de las etapas de clonación que llevan a pUC.35-5E4. La figura 5 es una representación esquemática de pBr.Ad35.PRn. La figura 6 es una representación esquemática de pBr .Ad35. PR5E4 (ECACC No. de depósito P02041229) . La figura 7 es una representación esquemática de pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4. La figura 8 es una representación esquemática de pCRscriptAmp . FI -NcoIR . La figura 9 es una representación esquemática de pCRscriptAmp. NcoIF-NR2. La figura 10 es una representación esquemática de pCR . NFI -NR2.
La figura 11 muestra la alineación entre la secuencia de aminoácidos de E4-orf6 del serotipo 5 de Adenovirus (SEQ ID N0:21; secuencia superior) con la secuencia de aminoácidos de la proteína E4-orf6 del serotipo 5 de Adenovirus clonada en la estructura de base de Ad35 (SEQ ID N0:21); secuencia intermedia; NB . idéntica a E4-orf6 de Ad5 , secuencia superior) como la obtenida mediante la determinación del orden de nucleótidos, y la secuencia de aminoácidos de la proteína E4-orf6 del serotipo 35 de adenovirus (SEQ ID NO: 22; secuencia inferior) , que muestra que el fragmento completo que codifica para la proteína E4-orf6 en la estructura de base del serotipo 35 de adenovirus ha sido reemplazada por el fragmento que codifica para la proteína E4-orf6 del serotipo 5 de adenovirus . La figura 12 muestra la alineación entre la secuencia de aminoácidos de la proteína E4-orf6/7 del serotipo 5 de adenovirus (SEQ ID NO: 23; secuencia superior) con la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión E4-crf6/7 codificada parcialmente por el fragmento E4-orf6/7 del serotipo 5 de adenovirus que reemplaza la parte correspondiente del fragmento E4-orf6/7 del serotipo 35 de adenovirus en la estructura de base del serotipo 35 de adenovirus (SEQ ID NO: 24; secuencia intermedia) y la secuencia de aminoácidos de la proteína E4-orf6/7 del serotipo 35 de adenovirus (SEQ ID NO: 25; secuencia inferior) , que muestra que la secuencia orf6/7 es parcialmente quimérica, con la fusión aproximadamente en el residuo de lisina (K) en la posición 138. Por motivos de claridad, la anotación orf6+7 debe leerse como el marco de lectura abierto orf6/7, el cual es un marco de lectura abierto separado dentro de la región E4 de adenovirus aparte de orf6 y orf7, que es una anotación bien conocida por las personas expertas en la técnica. La figura 13 es una representación esquemática de pBr .Ad35. PR.50rf6 (ECACC No. de depósito P02041227) . La figura 14 es una representación esquemática de pWE .Ad35.pIX-rITR.50rf6. La figura 15 es una representación esquemática de pBr .Ad35. PRnAE3. Por motivos de claridad, la D mayúscula indica delta (?) . La figura 16 es una representación esquemática de pBr .Ad35. ??3. PR5E4. Por motivos de claridad, la D mayúscula indica delta (?) . La figura 17 es una representación esquemática de pBr.Ad35.AE3.PR550rf6. Por motivos de claridad, la D mayúscula indica delta (?) . La figura 18 muestra el sistema para producir partículas adenovirales recombinantes en células tales como PER.C6 a través de un evento de recombinación homologa doble.
La figura 19 es una representación esquemática de pWE.Ad35.pIX-EcoRV. Sumario de la invención La presente invención proporciona vectores de adenovirus recombinantes que comprenden elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, en donde el vector comprende además una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6, en donde la secuencia se selecciona del grupo que consiste en: a) una secuencia que codifica para E4-orf6 derivada de un adenovirus de un segundo serotipo diferente al primer serotipo; b) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del primer serotipo mediante una supresión, mutación, adición y/o sustitución en uno o más codones y c) una secuencia de codificación de E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un segundo serotipo diferente al primer serotipo y una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un tercer serotipo, en donde el tercer serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo. La invención proporciona además métodos para la producción de estos vectores de adenovirus recombinantes que comprenden elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, el método comprende las etapas de: a) proporcionar una célula de complementacion que porte una secuencia de codificación de E1B-55K, derivada de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable, con los elementos necesarios de un adenovirus tales como para permitir el ensamble del vector de adenovirus recombinante por la célula de complementación, en donde los elementos comprenden al menos algunos elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus del primer serotipo diferente del segundo serotipo y una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, que sea compatible con la proteína E1B-55K expresable en la célula de complementación; b) cultivar la célula de complementación en un medio bajo condiciones que permitan que tenga lugar la producción y ensamble del vector de adenovirus y c) cosechar el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera del medio y/o la célula de complementación, en donde la secuencia que codifica para la proteína E4-orf6 compatible está presente en el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera . La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden vectores adenovirales de acuerdo con la invención y al tratamiento de individuos usando los vectores adenovirales provistos por la presente invención. La invención se refiere también a un equipo de partes que comprenden líneas de células y vectores adenovirales provistos por la invención para ejecutar los métodos provistos por la invención. Descripción detallada de la invención La presente invención describe métodos y medios que resuelven ciertas dificultades relacionadas con una complementacion disminuida de vectores adenovirales que no son del grupo C en células de empaque/complementación de Ad5. Aunque en las líneas de células de complementacion de Ad5 la expresión de E1B-55K de Ad5 funcional está presente, se encontró que sólo muy bajas concentraciones de vectores adenovirales podían producirse cuando la estructura de base adenoviral era de un origen adenoviral que no era de grupo C; este descubrimiento implica una especificidad de serotipo en la interacción de E1B-55K con otra proteína (viral) . Se describe aquí que esta dependencia de serotipo puede ser superada al proporcionar una proteína E4-orf6 compatible con la proteína E1B-55K provista por la línea de células de complementacion. Como se describe en la presente, E1B-55K y E4-orf6 forman un complejo que está implicado en inhibir el transporte de moléculas de AR m celulares del núcleo al citoplasma, mientras que el complejo también está implicado en la estimulación del transporte de moléculas de ARNm virales del núcleo al citoplasma. Se ha observado por los presentes inventores que la complementacion adecuada de vectores virales en células de empaque requiere la presencia de productos génicos E1B-55K y E4-orf6 que sean compatibles. Las células de empaque también son referidas como células de complementación, si las células comprenden ciertas secuencias que codifiquen para proteínas que complementen funciones no provistas por el vector que deba ser empacado. "Compatible" según se usa en la presente significa por lo tanto que un complejo entre el producto génico E1B-55K disponible es capaz de formar un complejo funcional con el producto génico E4-orf6 disponible en un sentido de que este complejo de proteínas soporte la replicación, propagación y/o empaque viral hasta un nivel que sea comparable con el de la situación tipo silvestre o que sea comparable con la situación encontrada cuando un vector de serotipo 5 de adenovirus recombinante se produzca en una línea de células de complementación Ad5 tal como 293 o PER.C6. La replicación de vectores en células de empaque es eficiente si, durante el periodo de producción en el cual el virus se forma, la célula comprende al menos proteína E1B-55K y proteína E4-orf6 que sean compatibles. De preferencia, las secuencias de E1B-55K y E4-orf6 son de adenovirus con y dentro del mismo subgrupo de adenovirus (tal como A, B, C, D, E o F) . En forma muy preferible, las secuencias de E1B-55 y E4-orf6 son del mismo serotipo. Ya que están disponibles en la técnica líneas de células establecidas que son capaces de soportar el crecimiento de adenovirus del subgrupo C, tales como el serotipo 5, se prefiere aún más que los genes E1B-55K y E4-orf6 se deriven del serotipo 5 de adenovirus . Como se entenderá por la persona capacitada en la técnica, la compatibilidad puede determinarse en pruebas o ensayos de complementación como aquellos en el reino de los expertos en la técnica de la producción de vectores adenovirales . La persona capacitada en la técnica también entenderá que la presente invención se puede usar también para la producción de un serotipo de adenovirus o cualquier línea de células de complementación, siempre y cuando las proteínas E1B-55 y E4-orf6 sean compatibles. Se ha observado además que el producto génico E4-orf6 que, "coincide" con el E1B en la línea de células de complementación, pueden ser provisto por el vector adenoviral, al reemplazar el E4-orf6 en el vector adenoviral de elección con una secuencia de codificación de E4-orf6 que sea compatible con el gen E1B presente dentro de la línea de células de empaque. Se encontró sorprendentemente que esta modificación tenía un efecto severo en estabilidad, replicación, empaque, ensamble y producción del vector. Un aspecto específico de la invención es que ahora es posible producir eficientemente serotipos de adenovirus diferentes de aquellos del subrupo C en líneas aplicadas normalmente a la producción de serotipo 5 de adenovirus u otro serotipo del subgrupo C, tal como serotipo 1, 2 y 6. La presente invención proporciona métodos para la producción de adenovirus que no son del grupo C sin la necesidad de proporcionar por separado la célula (de empaque) de complementación con E4-orf6 debido a que la secuencia de E4-orf6, que es compatible con la secuencia de E1B-55K de complementación, se incorpora en la estructura de base adenoviral . La presente invención proporciona un vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, en donde el vector comprende además una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, en donde la secuencia se selecciona del grupo que consiste en: a) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus de un segundo serotipo diferente del primer serotipo; b) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del primer serotipo que comprende una supresión, mutación, adición y/o sustitución en uno o más codones y c) una secuencia de codificación de E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un segundo serotipo diferente del primer serotipo y una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un tercer serotipo, en donde el tercer serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un vector de adenovirus recombinante de acuerdo con la invención, en donde el primer serotipo y el segundo serotipo son de diferentes subgrupos de adenovirus. En una modalidad preferida, se proporciona un vector de adenovirus recombinante de acuerdo con la invención, en el que el primer serotipo es de un primer subgrupo que no es el subgrupo C y en el que la secuencia de codificación de E4-orf6 se deriva de un serotipo de adenovirus del subgrupo C. Se prefiere más un adenovirus recombinante de acuerdo con la invención, en el que el primer serotipo es del subgrupo B y el segundo serotipo es del subgrupo C. Aún más preferible, la secuencia de codificación de E4-orf6 se deriva del serotipo 5 de adenovirus . Se ha reconocido por los expertos en la técnica que niveles diferentes de anticuerpos de neutralización circulan en humanos, los cuales están dirigidos contra diferentes serotipos. Se ha encontrado que ciertos serotipos adenovirales encontraron altas titulaciones de estos anticuerpos neutralizadores y que muchos individuos en poblaciones diferentes portaban anticuerpos neutralizadores contra estos serotipos. Se encontró también que ciertos serotipos sólo eran neutralizados en una minoría de las muestras ( O 00/70071). Aparentemente, ciertos serotipos del subgrupo B sólo eran neutralizados en un pequeño grupo de muestras. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la presente invención, se proporcionan vectores de adenovirus recombinantes de acuerdo con la invención, en donde el primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en serotipos de adenovirus 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50. Se prefieren altamente los vectores adenovirales recombinantes , en donde el primer serotipo es el serotipo 11 ó 35, mientras que éstos encontraron anticuerpos neutralizadores sólo en un porcentaje muy pequeño de las muestras probadas. Los vectores de la presente invención se pueden usar en diferentes escenarios tales como terapia génica, genómica funcional, vacunación tumoral y/o vacunación antiviral. Para esto, es necesario que el vector adenoviral funcione como un vehículo de suministro génico, en donde un gen no nativo se incorpora en el genoma adenoviral. La partícula adenoviral puede dirigirse posteriormente específicamente a células objetivo de interés; el adenovirus se une a esa célula específica ya sea a través de la unión cápside-receptor o a través de otros medios, y suministra el transgen. La dirección de adenovirus puede llevarse a cabo de muchas formas diferentes. Las personas capacitadas en la técnica de dirección de vectores adenovirales estarán conscientes de todas las posibilidades diferentes que se aplican para suministrar los vectores adenovirales a las células de interés. Estas posibilidades incluyen pero no están limitadas a alteraciones de cápside (modificaciones de fibras, hexones y/o pentones, tales como supresiones, cambios entre fibras de diferentes serotipos y adiciones de péptidos y/u otras porciones de unión) , en donde se producen fibras quiméricas que reconocen un receptor presente sobre la célula de interés, o en donde se utiliza la unión de la base de pentones. Otras posibilidades son el enlace de porciones de dirección a las proteínas de cápside, en donde por ejemplo péptidos de unión, proteínas de unión conocidas y fuertes, o anticuerpos o partes de los mismos se enlazan a las proteínas de cápside para lograr una dirección específica. Estos vectores se pueden producir todos usando los métodos y medios provistos por la presente invención. Por lo tanto, la presente invención describe también vectores de adenovirus recombinantes de acuerdo con la invención, que comprenden además una secuencia que codifica para una proteína, polipéptido o péptido no adenoviral . Estas secuencias pueden estar presentes en diferentes lugares dentro de la estructura de base adenoviral, pero de preferencia se localizan en la región El, la cual carece en los vectores adenovirales recombinantes de la invención. La región El es complementada por elementos (la complementación) presentes en las células de complementación. La dirección del promotor, transgen y otras secuencias reguladoras se puede dirigir hacia la repetición terminal invertida a la izquierda; así como la invertida a la derecha. La presente invención también se puede usar para la producción de vectores virales a base de adenovirus y/o de otros virus tales como el Virus Adeno-Asociado (AAV) , en donde la combinación, tal como un virus quimérico Ad-AAV, se puede integrar en el genoma de la célula huésped. Se conocen en la técnica varios métodos para generar adenovirus de integración. Generalmente, la invención también es útil para la producción de formas de adenovirus que (específica o no específicamente) pueden integrarse. Como se mencionó, varios transgenes no adenovirales pueden clonarse en los vectores adenovirales recombinantes de la presente invención. Éstos no sólo incluyen secuencias de ácido nucleico reguladoras tales como potenciadores , promotores (por ejemplo, promotores no adenovirales fuertes tales como el promotor de citomegalovirus , el promotor SV40 y el promotor RSV) y señales de poliadenilación, sino también genes heterólogos para propósitos terapéuticos. Por lo tanto, en un aspecto de la invención se proporcionan vectores de adenovirus recombinantes de acuerdo con la invención, en donde la proteína, polipéptido o péptido no adenoviral se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido inductor de muerte celular, un determinante antigénico de un organismo patógeno, un antígeno específico de tumor, una proteína viral, una hormona y una citocina. Ejemplos de organismos patógenos son, pero no están limitados a, bacterias, virus y hongos. Ejemplos no limitativos de factores, proteínas, polipéptidos y péptidos no adenovirales son factores de transcripción, proteínas de señalización intracelular, fosfatasas, cinasas, factores de inhibición de apoptosis, antagonistas de receptores, formas solubles de receptores unidos a membrana, inhibidores de ARN, moléculas de ARN de antisentido, factores de señuelo, ribozimas y más específicamente, timidina cinasa, eritropoyetina, proteína estimuladora de eritopoyesis nueva (NESP) , IL3, ceNOS, gama interferón y gplOO . Las proteínas virales no adenovirales pueden ser clonadas en los vectores adenovirales recombinantes provistos por los métodos y medios de la presente invención para propósitos de vacunación. Estas proteínas virales incluyen, pero no están limitadas a, gag, pol, env, nef, etc., para vacunas contra VH, proteínas E6 y E7 para vacunas contra Virus de Papiloma Humano, proteínas de circumsporozoita de protozoarios de Plas odiu para vacunas contra malaria, componentes de rotavirus para vacunas contra rotavirus, proteínas de ébola para vacunas contra el ébola, los productos el gen F y G de virus sincitial respiratorio (RSV) para vacunas contra RSV, HA y NA para vacunas de influenza, etc. Los adenovirus recombinantes de la presente invención comprenden elementos estructurales y no estructurales .
Ejemplos de elementos estructurales son los genes que codifican para las proteínas de cápside, tales como proteínas de fibra, hexón y pentón, así como los propios productos génicos. Ejemplos de elementos no estructurales son los genes tempranos que son expresados después de la infección en una célula y que son subregulados cuando el ciclo de infección procede. Otros ejemplos de elementos no estructurales son los genes que codifican para las proteínas activas durante la replicación, tales como pol y pTP . Se debe entender que los vectores adenovirales recombinantes pueden comprender elementos estructurales y no estructurales derivados de diferentes serotipos. Ejemplos de estos vectores son por ejemplo las partículas adenovirales que portan fibras quiméricas (véase la solicitud de patente del solicitante WO 00/03029). Las técnicas de biología molecular han hecho posible construir combinaciones infinitas de secuencias de ácido nucleico. Es claro para la persona capacitada en la técnica de la biología molecular que combinar secuencias diferentes puede llevarse a cabo usando diferentes técnicas moleculares, tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) así como subclonación directa. Muchas de las secuencias usadas en la presente invención, así como las secuencias y construcciones quiméricas conocidas en la técnica, se derivan de serotipos de adenovirus diferentes. "Derivar", según se usa en la presente, significa por lo tanto que estas combinaciones de secuencias pueden obtenerse a través de la clonación directa de secuencias tipo silvestre obtenidas de virus tipo silvestre, aunque pueden obtenerse por ejemplo también a través de PCR usando diferentes piezas de ADN como una plantilla. Esto significa también que estas secuencias pueden estar en la forma tipo silvestre así como en forma alterada. Otra opción para alcanzar el mismo resultado es a través de combinar ADN sintético. Se debe entender que "derivar" no significa exclusivamente una clonación directa del ADN tipo silvestre. Una persona capacitada en la técnica también estará consciente de las posibilidades de la biología molecular para obtener formas mutantes de cierta pieza de ácido nucleico. Estas mutaciones pueden hacer una funcionalidad diferente, pero también pueden ser silenciosas de tal manera que ciertas mutaciones no alteren la funcionalidad de esa pieza de ADN particular y su proteína codificada. Por lo tanto, los términos "parte funcional, derivado y/o análogo de la misma" deben entenderse como equivalentes del ácido nucleico con el que estén relacionados. Una persona capacitada en la técnica apreciará el hecho de que ciertas supresiones, cambios, mutaciones (por puntos), adiciones, etc., podrían aún dar como resultado un ácido nucleico que tuviera una función similar a la del ácido nucleico original. Se debe entender por lo tanto que estas alteraciones no alteran significativamente la funcionalidad de las proteínas tales como el producto génico E4-orf6 y E1B-55K y están dentro del alcance de la presente invención. Algunas alteraciones en el ácido nucleico, tales como una supresión, una mutación, adición y/o sustitución en uno o más codones también pueden cambiar en forma significativa la estructura y/o funcionalidad del producto génico codificado. La presente invención se refiere también por lo tanto a secuencias codificadas de E4-orf6 que se derivan del mismo serotipo de adenovirus que el de la estructura de base que porta los genes, por ejemplo, los elementos estructurales y no estructurales, pero en donde la secuencia de codificación de E4-orf6 ha sido mutada de tal manera que se vuelva compatible con las proteínas El (tal como el producto génico E1B-55K) presentes en la célula de complementación en la cual se va a producir el vector adenoviral . El codón se puede alterar completamente para cambiar el aminoácido codificado, pero también puede ser mutado parcialmente para cambiar el aminoácido codificado. Las supresiones de ácidos nucleicos pueden dar como resultado la pérdida de uno o más aminoácidos codificados; mientras que esto también puede dar como resultado desplazamientos de cuadro. La presente invención se refiere también a secuencias de E4-orf6 presentes en el ácido nucleico adenoviral, que comprenden partes diferentes derivadas de diferentes serotipos, en donde los dominios que hacen a la proteína funcional en compatibilidad pueden usarse de un serotipo, mientras que el resto de la secuencia de E4-orf6 o una parte de la misma se derive de otro serotipo no relacionado (por ejemplo del mismo subgrupo, de diferentes subgrupos o de diferentes especies, o combinaciones de los mismos) . Por lo tanto, también está dentro del alcance de la presente invención aplicar proteínas de fusión E4-orf6 que sean compatibles. Esta proteína de fusión puede ser el producto de varias piezas de ácido nucleico. Una persona capacitada en la técnica estará consciente del hecho de que aparte de todos los adenovirus humanos, numerosos adenovirus no humanos han sido identificados en la técnica. Obviamente, también adenovirus no humanos pueden aplicarse para alcanzar los mismos resultados que los descritos por la presente invención. Será claro para la persona experta en la técnica que la compatibilidad entre E1B-55K y E4-orf6 podría no estar limitada a adenovirus humanos sino que también elementos de adenovirus específicos para diferentes especies pueden ser compatibles. Así, es también otro aspecto de la invención que adenovirus no humanos pueden producirse hasta altas titulaciones en líneas de células de empaque conocidas disponibles en la técnica, siempre y cuando los productos génicos E1B-55K y E4-orf6 sean compatibles. Ejemplos no limitativos de adenovirus no humanos que pueden producirse usando los métodos y medios de la presente invención son adenovirus de caninos, bovinos, ovinos, de rana, porcinos, equinos, de simios y aviarios. Los serotipos usados en la presente por lo tanto van más allá de serotipos restringidos en especie. Por ejemplo, si un producto génico E4-orf6 de adenovirus de mono es compatible con la E1B-55K provista por la célula de empaque, entonces esta combinación está dentro del alcance de la presente invención. Igualmente, cuando se aplican fusiones entre diferentes serotipos, o entre secuencias E4-orf6 derivadas de por ejemplo un adenovirus humano y aviario que es compatible con el gen E1B de la célula de empaque, entonces esa combinación particular también está dentro del alcance de la presente invención. La presente invención proporciona un método para producir un vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, el método comprende las etapas de: a) proporcionar una célula de complementación que porte una secuencia de codificación de E4-orf6, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, derivada de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable, con los elementos necesarios de un adenovirus tales como para permitir el ensamble del vector de adenovirus recombinante por la célula de complementación, en donde los elementos comprenden al menos un elemento estructural y no estructural de un adenovirus del primer serotipo diferente al segundo serotipo y una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, que sea compatible con la proteína E1B-55K expresable en la célula de complementacion; b) cultivar la célula de complementacion en un medio bajo condiciones que permitan que tenga lugar la producción y ensamble del vector de adenovirus y c) cosechar el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera del medio y/o la célula de complementacion, en donde la secuencia que codifica para la proteína E4-orf6 compatible está presente en el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera. En un aspecto de la invención, se proporciona un método de acuerdo con la invención, en el que la secuencia de codificación de E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en: i) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo; ii) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus de un tercer serotipo diferente al primero y segundo serotipos; iii) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del primer serotipo que comprende una supresión, mutación, adición y/o sustitución en uno o más codones y iv) una secuencia de codificación de E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un tercer serotipo y una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo, en donde el tercer serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo. En una modalidad preferida, el primero y segundo serotipos son de diferentes subgrupos . En una modalidad más preferida, el segundo serotipo es un serotipo de adenovirus del subgrupo C. En una modalidad todavía más preferida, el segundo serotipo es serotipo 5 de adenovirus. En otro aspecto particular de la invención, el primer serotipo es un serotipo de adenovirus del subgrupo B. De preferencia, el primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en serotipos -de adenovirus 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50. Existen varias células de empaque conocidas en la técnica que se usan para complementar vectores adenovirales recombinantes y para producir, ensamblar y empacar las partículas adenovirales. Ejemplos no limitativos de estas líneas de células son células HEK-293, 911 y PER.C6™. Se prefiere usar líneas de células que ya hayan probado suministrar altas concentraciones de grupos adenovirales. Estas líneas de células expresan proteínas El de una manera estable, y es por lo tanto un aspecto preferido de la invención usar líneas de células y métodos, en donde la secuencia de codificación E1B-55K está integrada en el genoma de la célula de complementacion. Se prefieren más las células de complementacion que se derivan de una célula humana diploide y primaria, o una de célula progenitora de la misma.
De una manera todavía más preferida, la célula de complementación se deriva de una célula de retinoblasto humano primaria, una célula de riñón embrionario humana primaria, una célula neuronal humana primaria y un amniocito humano primario. Se prefiere altamente el uso de una célula de complementación en los métodos provistos por la presente invención, en donde la célula de complementación es una célula PER.C6 o un derivado de la misma. Las células PER.C6 se conocen bien en la técnica porque no dan origen a adenovirus competentes en replicación cuando se usa ADN adenoviral que no tiene traslape con el ácido nucleico provisto por las células. Muchos de los vectores adenovirales usados en la técnica carecen de la región El, y por lo tanto en un aspecto de la invención, la célula de complementación comprende, integrado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus. De preferencia, el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus se deriva de un serotipo de adenovirus de un subgrupo diferente que el subgrupo B. En forma muy preferible, el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus se deriva de un serotipo de adenovirus del subgrupo C. Se prefieren altamente las modalidades en las que el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus se deriva de un serotipo 5 de adenovirus. En otra modalidad de la invención, la invención proporciona un método, en donde la secuencia de codificación de E4-orf6 y la secuencia de codificación de E1B-55K se derivan de serotipos de adenovirus diferentes y en donde los serotipos de adenovirus diferentes son miembros del mismo subgrupo de adenovirus. De preferencia, la secuencia de codificación de E4-orf6 y la secuencia de codificación de E1B-55K se derivan de diferentes serotipos de adenovirus y en donde los diferentes serotipos de adenovirus son ambos miembros del subgrupo C. En forma muy preferible, la secuencia de codificación de E4-orf6 y la secuencia decodificación de E1B-55K se derivan del mismo serotipo de adenovirus. Se prefieren altamente los métodos en los que la secuencia de codificación de E1B-55K y la secuencia de codificación de E4-orf6 se derivan del serotipo 5 de adenovirus . La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un vector adenoviral recombinante de acuerdo con la invención, o que puede obtenerse mediante un método provisto por la invención. La composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéutico aceptable, aplicado generalmente por las personas capacitadas en la técnica de la preparación de farmacéuticos. Más aún, la presente invención se refiere a un método para tratar un cuerpo humano que comprende administrar a un cuerpo humano un vector adenoviral recombinante de acuerdo con la invención, o una composición farmacéutica provista por la invención. La invención se refiere también a métodos en los cuales pueden producirse vectores adenovirales usando las células de complementación/empaque adecuadas y el vector adenoviral de interés. Para un proceso de producción eficiente es útil aplicar las células correctas con el vector adenoviral adecuado. Por lo tanto, la invención se refiere también a un equipo de partes que comprende: a) una célula de complementación para producir un vector de adenovirus recombinante que comprenda elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, la célula porta una secuencia de codificación de E1B-55K, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, derivada de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable; y b) en uno o más vectores de ácido nucleico replicables todos los elementos adenovirales necesarios para permitir de esta manera el ensamble del vector de adenovirus recombinante por la célula de complementación, en donde los elementos comprenden al menos algunos elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus del primer serotipo diferentes del segundo serotipo y una secuencia que codifica para una proteína . E4-orf6 funcional, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, que es compatible con la proteína E1B-55K expresable en la célula de complementación. De preferencia, se usa un equipo de partes, en donde la secuencia de codificación de E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en: a) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo; b) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus de un tercer serotipo diferente al primero y segundo serotipos; c) una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del primer serotipo que comprende una supresión, mutación, adición y/o sustitución de uno o más codones y d) una secuencia de codificación de E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un tercer serotipo y una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo, en donde el tercer serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo . La invención es particularmente útil para la replicacion de adenovirus quiméricos suprimidos en El que se derivan casi completamente de un serotipo que no es el adenovirus 5. Esos vectores sólo tienen que ser provistos con un ácido nucleico que codifique para E4orf6 de adenovirus 5 o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo. Una vez que está provisto con el mismo, el vector puede ser replicado eficientemente en líneas de células de empaque de complementación de adenovirus 5 normales. La estabilidad de los vectores es mejorada, y los vectores pueden ser complementados para supresiones tanto en E1A como en E1B. Al proporcionar a estos vectores un ácido nucleico que codifica para E4orf6 de adenovirus, es posible lograr una purificación en placa eficiente y adecuados rendimientos en ausencia de un problema de contaminación tipo silvestre adicional, cuando se cultivan sobre células 293 ó 911. En PER.C6, por supuesto, la contaminación de adenovirus tipo silvestre también puede evitarse de otras maneras. Una ventaja adicional de un vector recombinante de la invención es que no existe la necesidad de generar E4-orf6 de adenovirus de líneas de células especiales a partir de un ácido nucleico integrado en el genoma. Aunque estas líneas de células existen, no se mantienen fácilmente en un orden adecuado. Esto es al menos en parte debido al hecho de que con más y más genes extraños insertados en el genoma de la línea de células es difícil mantener la estabilidad de todas las secuencias extrañas (o la expresión de las mismas) . En la presente invención se encontró que al menos algunos de los problemas asociados con bajos rendimientos de vectores a base de serotipo 5 que no es de adenovirus y la estabilidad de los vectores del serotipo de adenovirus del subgrupo B, tales como serotipo 7, 11 y 35 de adenovirus en líneas de células de empaque del serotipo 5 de adenovirus pueden ser superados con un vector de adenovirus recombinante de la invención.
Ejemplo 1 Generación de virus Ad35 suprimido en El que expresa E4-orf6 de Ad5 en una línea de células de complementación de Ad5 La secuenciación del genoma del serotipo 35 de adenovirus así como la construcción de un sistema de vectores a base de plásmidos y la generación de virus a base de Ad35 recombinante se han descrito en detalle en WO 00/70071. La clonación de la secuencia de codificación Ad5-E4-orf6 en pAdApt35IPl (ECACC No. de depósito P02041228, para detalles de clonificación de ese plásmido véase WO 00/70071) se llevó a cabo como sigue. El plásmido fue digerido con Nhel y Avrll y desfosforilado con Fosfatasa de Intestino de Ternera (New England Biolabs) . El ADN digerido se aisló de gel usando el equipo GeneClean. El plásmido ???? . Orf6. Hygro (figura 1, ECACC No. de depósito P02041226) se digirió con Nhel y posteriormente se digirió parcialmente con Xbal . Luego de la separación de las bandas resultantes en gel, el fragmento de 1350 pb que correspondía al promotor ??? enlazado a la secuencia E4-orf6 se purificó del gel. Después, ambos fragmentos aislados se ligaron y se transformaron en células DH10B electrocompetentes (Invitrogen/LifeTechnologies) después de lo cual una colonia con el inserto en la orientación correcta con respecto a la señal SV40 poly(A) se seleccionó para la preparación de ADN a gran escala. Esto dio como resultado la construcción pAd35. ??? . Orf6 (figura 2), la cual contiene la secuencia de codificación E4-orf6 de Ad5 enlazada funcionalmente a un promotor de metalotioneína mutado (???) . El promotor ??? ha sido descrito por Hagmeyer et al., (1996) . La secuencia E4-orf6 de Ad5 corresponde al nucleótido 33193 al nucleótido 34077 en la secuencia de Ad5 (Genbank, número de registro M73260) . Para probar si la expresión de las proteínas E4-orf6 de Ad5 podría hacer posible la producción de vectores Ad35 completamente suprimidos en El en células de complementación de Ad5, pAd35.AMT.Orf6 fue co-transíectado con la construcción de estructura de base de Ad35 p E .Ad35. pIX-rlTR sobre células PER.C6. Después, pAd35. ??? . Orf6 fue digerido con PI-Psp-1 y pWE.Ad35.pIX-rITR fue digerido con Notl para liberar los insertos adenovirales de la estructura de base. Dos g de pAd35.AMT.Orf6 digerido y 6 µg de pWE .Ad35.pIX-rITR se transíectaron usando LipofectAmine . La mezcla de transíección se añadió a células PER.C6 que fueron sembradas el día anterior a una densidad de 3.5 x 106 células por matraz T25. Al día siguiente el medio fue cambiado por medio de cultivo de PER.C6 (DMEM con 10% de FBS y 10 mM de MgCl2) y las células fueron incubadas más a 37°C/10% de C02. Se llevaron a cabo transíecciones de control con pAdApt35.Luc co-transfectado con pWE .Ad35.pIX-rITR y pWE.Ad35.pIX-rITR solo. Dos días después de la transíección, las células fueron pasadas de matraces T25 a T80 y se incubaron como se describe. Nuevamente tres días después el cultivo transfectado con pAd35.???-Orf6 junto con la estructura de base de Ad35 mostró un efecto citopatogénico (CPE) indicador de la replicación de virus, y fue cosechado (incluyendo células y medio) luego de una incubación adicional de dos días. La suspensión de células se sometió a dos rondas de ciclos de congelación/descongelación y el material resultante (lisado crudo) se mantuvo a -20°C hasta su uso adicional. Los otros matraces no mostraron CPE y fueron pasados 1:3 en matraces T80 seis días después de la transferencia a T80. Nuevamente cinco días después el matraz transfectado con pAdApt35.Luc + pWE.Ad35. pIX-rITR mostró pocos eventos tipo CPE pocos pero esto no progresó más. Se usaron 0.2 y 0.5 mi del lisado crudo que resultó de la transfección con pAd35. ??? . Orf6 para reinfectar células PER.C6 a aproximadamente 85% de confluencia en matraces T80. Esto dio como resultado un CPE completo después de un día de incubación indicando que el virus infeccioso estaba presente en los lisados crudos. Estos cultivos también fueron cosechados por dos ciclos de congelación/descongelación. Transíecciones de control adicionales con la construcción pAd35. AMT.Orf6 sola sobre PER.C6 fueron llevadas a cabo para confirmar que la expresión de orf6 por sí misma no dio como resultado la toxicidad celular y muerte celular tipo CPE. En conclusión, sólo las transfecciones con pAd35.AMT.Orf6 junto con pWE.Ad35. pIX-rITR dieron como resultado la replicación de CPE y virus.
El análisis de PCR se llevó a cabo para confirmar la presencia de genomas virales a base de Ad35 con Ad5-E4-orf6 reemplazando la región El anterior. Más tarde, se aisló ADN viral de las muestras de lisado crudo como sigue. Doscientos setenta y cinco microlitros de material lisado crudo se incubaron con 10 µ de DNasel (10 mg/ml) a 37°C durante 30 minutos . Posteriormente se añadieron 6.0 µ? de EDTA 0.5 M (pH 8.0), 7.5 µ? de SDS al 20% y 1.5 µ de 20 mg/ml de Proteinasa K y se mezclaron mediante vortexeo. La mezcla se incubó después a 50°C durante una hora. Finalmente, el ADN viral se aisló usando el equipo GeneClean Spin (Bio 101, Inc.). Después se amplificaron 2 µ? del ADN aislado mediante PCR usando los cebadores 35psi-For y 35R4 (tabla 1) . El programa se ajustó a 94°C durante dos minutos seguido por 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 seg. y 72°C durante 5 min. , y concluyó por una incubación a 72°C durante 10 minutos. Los cebadores son específicos para secuencias Ad35 y generan un fragmento de 2.9 kb que varía de la secuencia de empaque al nucleótido 4669 (numeración como en la secuencia de Ad35 wt) incluyendo de esta manera el cásete de transgen orf6 de Ad5. La electroforesis de los fragmentos de PCR obtenidos mostró que los fragmentos tuvieron la longitud esperada que coincidía con la de los fragmentos de PCR de control generados en el plásmido adaptador pAd35.AMT.Orf6. De esta manera, vectores a base de Ad35 complemente suprimidos en El pueden hacerse sobre células de complementacion de Ad5 si el virus expresa también Ad5-E4orf6. Ejemplo 2 Construcción de pWE .Ad35.pIX-rITR5E4 Un primer fragmento de PCR se amplificó usando los cebadores DF35-1 y 35FR (tabla 1) . La amplificación se hizo con pWE.Ad35.pIX-rITR (véase WO 00/70071) como ADN de plantilla usando Pwo ADN polimerasa (Roche) con DMSO adicional (Sigma, concentración final 3%). El programa fue el siguiente: 94°C durante 2 min. , seguido por 30 ciclos de (94°C durante 30 seg., 52°C durante 30 seg., 72°C durante 3 min.) y una etapa final de 72°C durante 8 min. para asegurar fragmentos completos. La amplificación dio como resultado un fragmento de 1.6 kb que correspondía al nucleótido 30224 a 31805 de la secuencia de Ad35. Un sitio BamHI se introdujo en el extremo 3'. El ADN amplificado se purificó de gel usando el equipo Geneclean y se ligó al equipo de vector de clonación pCRScript/Amp (Stratagene) . Después de la transformación en células DH10B electrocompetentes se seleccionaron con líneas blancas para análisis adicional. Esto dio como resultado la construcción pCR-fiber35. Debido a la clonación de extremos parejos el fragmento de PCR puede ser insertado en dos orientaciones. Se seleccionó un clon que tenía el inserto con el sitio BamHI en el polienlazador del vector pCRScript/Amp del extremo 5' . La digestión con BamHI da como resultado entonces un fragmento de 1.6 kb. La secuenciación confirmó una amplificación correcta del fragmento de PCR. Un segundo fragmento de PCR fue amplificado usando los cebadores: 5E4F y 5E4R (tabla 1). La amplificación se hizo con pWE .Ad5.AfIII -rITRsp, el cual es un vector cósmido que contiene un sitio Pací adicional en pWE .Ad5.AfIII -rITR (ECACC No. de depósito P97082116 descrito en la solicitud de patente internacional del solicitante PCT/NL01/00824 ) . pWE.Ad5.Af111-rITRsp sirvió como una plantilla usando P o ADN polimerasa como la descrita arriba, aunque p E.Ad5.AflII-rITR también podría ser usado para el mismo propósito. Luego de la purificación de gel, el ADN fue digerido con SstI y BamHI (ambos sitios introducidos durante la PCR) y el fragmento de 3 kb fue purificado a partir de gel de agarosa usando el equipo GeneClean. La región E4 de Ad5 que es amplificada corresponde al pb 32794 a pb 35828 de la secuencia de Ad5. Un tercer fragmento de PCR se generó en pWE.Ad35.pIX-rITR usando los cebadores: 355ITR y 353ITR (tabla 1) . La amplificación por PCR se llevó a cabo como se describió arriba. El fragmento de 160 pb resultante es flanqueado por un sitio SstI (extremo 5') y un sitio EcoRI (extremo 3') . Después de la purificación de gel como arriba, el ADN fue digerido con SstI y EcoRI . El fragmento de 160 pb que correspondía al ITR derecho de Ad35 se separó después de extremos digeridos sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión y se recogió en gel. Después, pUC119 fue digerido con BamHI y EcoRI y el fragmento de 3.1 kb fue purificado de gel usando el equipo GeneClean. Los segundo y tercero fragmentos de PCR tratados arriba fueron ligados después con pUC119 digerido con BamHI/EcoRI dando como resultado pUC .Ad5E4 -35ITR. Los insertos derivados de PCR clonados fueron secuenciados para verificar una amplificación correcta. Después, el inserto de 1.6 kb en pCR-fiber35 fue cortado con BamHI y el fragmento se purificó de gel como arriba. pUC .Ad5E4-35ITR fue digerido también con BamHI y el fragmento lineal se purificó de gel. La ligación de ambos fragmentos y la selección de los clones que tuvieron la orientación correcta unos en relación con otros dio como resultado pü*C.35-5E4 (figura 3). Las etapas que llevan a la construcción de pUC.35-5E4 se representan esquemáticamente en la figura 4. El inserto de adenovirus en pUC.35-5E4 fue subclonado en pBr.Ad35.PRn (figura 5; véase WO 00/70071), una construcción con secuencias 3' de Ad35. Después, la construcción pUC.35-5E4 es digerida con MluI y Notl y el fragmento de 4.7 kb es purificado de gel usando el equipo GeneClean. Este fragmento se liga después con el fragmento de vector que resulta de la digestión con MluI y Notl de la construcción pBr .Ad35. PRn. Este fragmento de 16.3 kb se purificó de gel usando enzima agarosa (Roche) . Las ligaciones se transformaron después en células DH10B competentes. La construcción resultante fue nombrada pBr.Ad35. PR5E4 (figura 6, ECACC No. de depósito P02041229) . La última etapa implica clonar el extremo 3' modificado de la secuencia de Ad35 en el clon cósmido viral pWE.Ad35.pIX-rITR. Posteriormente, dos fragmentos se combinan en una reacción de empaque de fagos lambda (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El primero es el inserto Ad35 modificado de 16.8 kb de pBr .Ad35. PR5E4 obtenido mediante digestión con Pací y Swal y el segundo es un fragmento de 22.8 kb obtenido mediante digestión de pWE .Ad35.pIX-rITR con Pací y Swal. La combinación correcta de los dos fragmentos produce pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4 (figura 7) . De esta manera, en esta construcción la región E4 en la estructura de base de Ad35 es reemplazada con la región correspondiente derivada de Ad5. Ejemplo 3 Construcción de pWE .Ad35.pIX-rITR50rf6 Para obtener una construcción de estructura de base adenoviral que contiene las secuencias Ad35 del gen pIX (nucleótido 3401 en la secuencia Ad35) hasta el extremo del ITR derecho pero con las secuencias para E4-orf6 y -orf6/7 intercambiadas por las secuencias correspondientes de Ad5, secuencias Ad35 y Ad5 fueron amplificadas por PCR y combinadas como se describe abajo. Los fragmentos de PCR se generaron con Pwo ADN polimerasa con la adición de DMSO hasta 3%. La primera PCR se hizo con pBr.Ad35.PRn (figura 5; véase WO 00/70071) como plantilla y los cebadores E4-F1 y E4-R2 (tabla 1) . El programa se ajustó como sigue: 94°C durante 2 min., 6 ciclos de (94°C durante 30 seg. , 50°C durante 30 seg. y 72°C durante
1 min.) seguido por 30 ciclos de (94°C durante 30 seg., 60°C durante 30 seg. y 72°C durante 1 min.) y concluyó con una etapa final a 68°C durante 8 min. El fragmento de 1.8 kb resultante se purificó usando el equipo GeneClean. La segunda PCR se hizo con pWE.Ad5.Af111-rITRsp, el cual es un vector cósmido que contiene un sitio Pací en pWE .Ad5.AfIII -rITR (ECACC No. de depósito P97082116, descrito en la solicitud de patente internacional del solicitante PCT/NL01/00824 , aún no publicada) , como plantilla, y los cebadores E4-F3 y E4-R4 (tabla 1). El programa se estableció como sigue: 94°C durante
2 min. seguido por 30 ciclos de (94°C durante 30 seg., 62°C durante 30 seg. y 72°C durante 1 min.) y concluyó con una etapa final a 68 °C durante 8 min. El fragmento de 1.1 kb se purificó como arriba. La tercera PCR se hizo con pBr.Ad35.PRn como plantilla y los cebadores E4-F5 y E4-R6 (tabla 1) . El programa se ajustó como sigue: 94°C durante 2 min., 5 ciclos de (94°C durante 30 seg., 48°C durante 30 seg. y 72°C durante 45 seg.) seguido por 30 ciclos de (94°C durante 30 seg., 56°C durante 30 seg. y 72°C durante 45 seg.) y concluyó con una etapa final a 68°C durante 8 min. El fragmento de 366 pb se purificó como arriba. Muestras de los fragmentos purificados se cargaron sobre un gel para calcular la concentración y luego los fragmentos se mezclaron juntos para contener 700 ng de PCR-1, 650 ng de PCR-2 y 430 ng de PCR-3 en un total de 30 µ?. A esta mezcla se le añadieron 3 µ? de regulador de pH EcoPol (New England Biolabs) , 3 µ? de solución de dNTP 2 mM y 3 µ? de milliQ H20. La mezcla resultante se incubó a 94°C durante 3 min. y luego se enfrió hasta 65°C en una máquina de PCR a una velocidad de 0.5°C/seg. Después de la incubación a 65°C durante 10 min., la mezcla se enfrió más hasta 20°C a una velocidad de 0.05°C por segundo y se incubó durante 10 min. a 20°C. Después se añadieron 1 µ? (5 unidades) de enzima Klenow (New England Biolabs) seguida por una incubación a 60 min. a 37°C. Se usaron 5 µ? de esta mezcla de Klenow como una plantilla para amplificar por separado dos fragmentos como sigue. El conjunto de cebadores 1: NR-1 y Ncol-R (tabla 1) se usó en una reacción usando Pwo ADN polimerasa (Roche) con la adición de DMSO hasta una concentración final de 3% y usando los siguientes ajustes de la máquina de PCR: 94 °C durante 2 min. seguido por 30 ciclos de (94°C durante 30 seg., 66°C durante 30 seg. y 72°C durante 3 min.) seguido por una incubación final a 68°C durante 8 min. El conjunto de cebadores 2: Ncol-F y NR-2 (tabla 1) se usó en una reacción usando Pwo ADN polimerasa (Roche) con adición de DMSO hasta una concentración final de 3% y usando los siguientes ajustes de la máquina de PCR: 94°C durante 2 min. seguido por 30 ciclos de (94°C durante 30 seg., 62°C durante 30 seg. y 72°C durante 90 seg.) seguido por una incubación final a 68°C durante 8 min. Los fragmentos resultantes de 2.7 kb (conjunto de cebadores 1) y 1.1 kb (conjunto de cebadores 2) se purificaron de gel usando el equipo GeneClean y cada uno se ligó al vector pCRscriptArap (Stratagene) y se transformaron en células electrocompetentes DH10B . Esto dio como resultado la construcción pCRscriptAmp.NFI-NcoIR (figura 8) y la construcción pCRscriptAmp .NcoIF-NR2 (figura 9) . Ya que los insertos contenían extremos parejos se obtuvieron dos orientaciones de cada clonación. Usando digestiones con Kpnl se seleccionaron las construcciones con orientación requerida para una clonación adicional (véase figuras 8 y 9) . Los insertos fueron después secuenciados para verificar una amplificación correcta. Después, parte del inserto de pCRscriptAmp-NcoIF-NR2 se cortó usando BamHI y Ncol y se purificó de gel como arriba. pCRscriptAmp-NFI -NcoIR fue digerido con las mismas enzimas y el fragmento que contenía vectores también se purificó de gel. La ligación de estos fragmentos dio como resultado pCR.NFl-NR2 (figura 10) . pCR.NFl-NR2 contiene secuencias Ad35 entre nt 30162 y 33234 de la secuencia Ad35 con secuencias E4-orf6 y E4-orf6/7 entre nt 31879 y 32974 reemplazadas por secuencias derivadas de Ad5 localizadas entre 32968 y 34077 de la secuencia Ad5 publicada en Genbank (Número de registro M73260) . De esta manera, como se puede observar en las alineaciones de aminoácidos presentadas en las figuras 11 y 12, la secuencia de aminoácidos de la proteína E4-orf6 clonada es idéntica a la secuencia E4-orf6 encontrada en Ad5 y la secuencia de aminoácidos E4-orf6/7 es en gran parte idéntica a la secuencia E4-orf6/7 presente en Ad5. Obviamente, diferentes construcciones Ad35-Ad5 E4 híbridas pueden diseñarse usando el método general descrito arriba sin alejarse de la invención. Este inserto quimérico de pCR.NFl- R2 se clonó después en pWE .Ad35.pIX-rITR: pCR.NFl- R-2 fue digerido con MluI y Ndel y el fragmento de 2.8 kb resultante se purificó de gel usando el equipo GeneClean. La construcción pBr.Ad35.PRn se digirió también con MluI y Ndel y el fragmento de vectores de 18 kb se aisló de gel usando enzima agarasa (Roche) . La ligación de ambos fragmentos dio como resultado la construcción pBr.Ad35.PR.50rf6 (figura 13, ECACC No. de depósito P02041227) . Las secuencias Ad35 entre Pací y SwaI que contenían la región E4 quimérica en esta construcción se clonan después en la construcción pWE .Ad35.pIX-rITR usando empaque de fagos lambda como el descrito arriba. El pWE .Ad35pIX-rITR.50rf6 resultante (figura 14) se usa después para generar virus a base de Ad35 recombinante mediante co-transfección en células de empaque PER.C6 con un plásmido adaptador Ad35. Ejemplo 4 Construcción de pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 , pWE .Ad35.pIX- rITRAE3.5E4 y pWE .Ad35.pIX-rITRAE35Qrf6 La estructura de base de Ad35 se modifica más mediante una supresión de las secuencias E3. Se sabe que las proteínas E3 modulan la respuesta inmune del huésped a infección por adenovirus y por lo tanto no son necesarias para la propagación in vitro de virus recombinantes . Más aún, la supresión de las secuencias E3 permite la inserción de secuencias heterólogas más grandes en los vectores sin comprometer la eficiencia de empaque. Asimismo, para la aplicación de vectores adenovirales como vehículos de vacunación, la expresión de genes inmunomoduladores codificados por la región E3 no se prefiere. Los métodos para suprimir las secuencias E3 en el plásmido pBr.Ad35.PRn (figura 5) se describen abajo. Primero, se generó un producto de PCR con los cebadores 35E3for y 35E3rev (tabla 1) usando Pwo ADN polimerasa (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y pBr.Ad35.PRn como ADN de plantilla. El programa se ajustó a 94°C durante 2 min. y 30 ciclos de 94°C durante 30 seg., 58°C durante 30 seg. y 72°C durante 1 min., seguidos por 68°C durante 8 min. El fragmento amplificado contiene secuencias Ad35 de nt 26814 a 27647 (véase O 00/70071) y es flanqueado en el extremo 3' por un sitio MluI . El fragmento de 833 pb resultante se purificó usando el equipo de purificación Qiaquick PCR (Qiagen) y se digirió con MluI y Stul . El fragmento de PCR digerido se purificó después de un gel de agarosa LMP usando el equipo de extracción en gel Qiaquick (Qiagen) . La construcción pBr.Ad35.PRn se digirió también con MluI y Stul y el fragmento que contenía un vector de 17.3 kb se aisló de gel de agarosa usando enzima agarasa (Roche) mediante el uso de métodos conocidos por las personas expertas en la técnica. Ambas moléculas de ADN aisladas se ligaron y transformaron en bacterias competentes DH5<x de máxima eficiencia (Invitrogen/LTI) para dar pBr.Ad35. PRnAE3 (figura 15). Las secuencias suprimidas abarcan los nucleotidos 27648 a 30320 de la secuencia Ad35 dando como resultado una supresión de 2673 pb. La supresión en E3 se introdujo después en la construcción pWE .Ad35.pIX-rITR usando extractos de empaque de fagos lambda (Stratagene) . Después, ambos pWE .Ad35.pIX-rITR y pBr .Ad35. RnAE fueron digeridos con Pací y SwaI y los fragmentos de 22.8 kb y 14 kb respectivos se aislaron de geles de agarosa de bajo punto de fusión usando enzima agarasa (Roche) . Después de la ligación y empaque usando células STBL-2 (Invitrogen/LTI), se obtuvo la construcción pWE.Ad35.pIX-rITRAE3. Para construir las versiones suprimidas en E3 de las construcciones de estructura de base modificadas en E4 descritas arriba, las modificaciones en E4 fueron introducidas en la construcción pBr.Ad35. PRnAE3 como sigue. La construcción pUC.35-5E4 (figura 3) fue digerida con MluI y Notl y el fragmento de 4.7 kb fue aislado de gel usando el equipo GeneClean II. La construcción pBr .Ad35. PRnAE3 fue digerida también con MluI y Notl y el fragmento de vector de 13.6 kb se aisló de gel usando el equipo centrífugo GeneClean. La ligación de estos fragmentos dio como resultado la construcción pBr .Ad35. ??3. PR5E4 (figura 16). La construcción pCR.NFl-NR2 (figura 10) fue digerida con MluI, Ndel y Bgll (esto último para digerir el fragmento de vector en fragmentos más pequeños), y el fragmento de 2.8 kb fue aislado de gel usando el equipo centrífugo GeneClean. La construcción pBr .Ad35. PRnAE3 fue digerida con MluI y Ndel, desfosforilada usando enzima CIP (New England Biolabs) y el fragmento de vector de 15.2 kb también fue aislado usando el equipo centrífugo GeneClean. La ligación de estos fragmentos dio la construcción pBr.Ad35.??3. PR50rf6 (figura 17). Después se usan pBr .Ad35. ??3. PR5E4 y pBr .Ad35. ??3. PR50rf6 para cambiar el fragmento 3' PacI-SwaI en pWE .Ad35.pIX-rITR por las regiones correspondientes de pBr .Ad35.??3. PR5E4 y pBr .Ad35. ??3. PR50rf6 como se describió antes. Esto lleva a las construcciones pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.5E4 y pwE .Ad35.pIX-rITRAE3.50rf6. Un método alternativo para generar estos cósmidos grandes es el de usar tres fragmentos en la reacción de ligación para el empaque: un fragmento Notl-PacI de 14.7 kb de pWE .Ad35.pIX-rITR, el inserto Pací -Notl de pBr.Ad35. ??3. PR5E4 o pBr.Ad35.
AE3.PR50rf6 y el fragmento de vector cósmido pWE15 digerido con Notl (Stratagene) . Este último fragmento también puede ser aislado de la digestión con Notl/PacI de pWE .Ad35. IX-rITR. Ejemplo 5 Generación de vectores a base de Ad35 suprimidos en El y E1/E3 sobre células PER.C6 Para hacer posible la generación de virus Ad35 recombinantes en la línea de células de complementación PER.C6 usando las construcciones a base de pBr .Ad35. PRn, los inventores hicieron primero una construcción nueva que contenía secuencias Ad35 de pb 3401 a pb 24650 de la secuencia Ad35 ( O 00/70071) y de esta manera traslapes tanto con los plásmidos adaptadores como con las construcciones a base de pBr .Ad35. PRn. La transfección de estos tres plásmidos en células PER.C6 y un evento de recombinación homologa doble lleva a un genoma viral completo y a la replicación de virus recombinantes como se describe en la figura 18. El plásmido requerido se hizo mediante la supresión de una gran parte de las secuencias Ad35 en p E.Ad35.pIX-rITR. Luego, pWE .Ad35.pIX-rITR fue digerido con EcoRV y el fragmento que contenía vectores de 29 kb se purificó de un gel de bajo punto de fusión usando el equipo centrífugo GeneClean. El ADN purificado fue auto-ligado y se usó para transformar bacterias electrocompetentes DH10B (Invitrogen/LTI) dando como resultado pWE .Ad35. pIX-EcoRV (figura 19). Todas las moléculas de ADN usadas para la transfección se digirieron como se indica en la tabla 2, se inactivaron con calor a 65°C durante 15 minutos y se usaron sin tratamiento adicional en la transfección. Las células PER.C6 fueron sembradas el día anterior a la transfección en matraces T25 a una densidad de 3xl06 células/matraz y se transíectaron como se indica en la tabla 2 usando LipofectAmine ( Invitrogen/LTl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que la mezcla de transfección en medio DMEM libre de suero (Gibco/BRL) fue reemplazada por medio de cultivo de PER.C6 (DMEM, 10% de FBS y 10 mM de MgCl2) luego de cinco horas. Al día siguiente, la eficiencia de transfección se estimó a 50% por microscopía de fluorescencia. Dos días después, las células fueron tripsinizadas y se volvieron a sembrar en matraces T80 y se incubaron más a 37°C/10% de C02. Seis días después de la transfección todos los cultivos mostraron un efecto citopatogénico completo (CPE, indicador de la propagación de virus) excepto por el cultivo de PER.C6 transfectado con Ad35. dApt . eGFP + pWE .Ad35.pIX-rITR. Un día después, células y medio en los matraces con CPE fueron cosechadas y sometidas a dos ciclos de congelación/descongelación, clarificadas de restos celulares por centrifugación (10 min. a 1,500 rpm) y 100 µ? de estos lisados crudos fueron usados para reinfectar células PER.C6 frescas a 85% de confluencia en matraces T80. La transfección de Ad35.AdApt . eGFP + pWE .Ad35.pIX-rITR que no mostró señales de CPE se cosechó mediante tripsinización y también se trató como arriba. Dos días después de la infección de células PER.C6 frescas todos los matraces mostraron CPE completo excepto por el que no mostró señales de CPE en el momento de la cosecha inicial. Esto muestra claramente que virus a base de Ad35 completamente suprimidos en El pueden hacerse sobre células PER.C6 cuando el producto génico E4-Orf6 de Ad5 es expresado de la estructura de base de Ad35. Tabla 1 Secuencias cebadoras
35FR 5' -CGGGATCCACTTTATTTTAGTTGTCGTCTTC-3' (SEQ ID NO : 1 )
35R4 5' -CGGAATTCTTAATTAAGGGAAATGAAATCTGTGAGG-3' (SEQ ID NO: 2)
35psi-For 5' -GTGGTATTTATGGCAGGGTG-3' (SEQ ID NO: 3) DF35-1 5' -CACTCACCACCTCCAATTCC-3' (SEQ ID NO : 4 ) 5E4F 5' -CGGGATCCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTG-3' (SEQ ID NO: 5)
5E4R 5' -GCTGGCGAGCTCGGCGGAGTAACTTGTATGTG-3 ' (SEQ ID NO: 6)
355ITR 5' -GATCCGGAGCTCACAACGTCATTTTCCCACG-3 ' (SEQ ID NO: 7)
353ITR 5' -AGGAATTCGCGGCCGCATTTAAATC-3' (SEQ ID NO: 8) E4-F1 5' -AGAGGAACACATTCCCCC-3' (SEQ ID NO: 9) E4-R2 5' -GGGGAGAAAGGACTGTGTATTCTGTCAAATGG-3' (SEQ ID NO: 10)
E4-F3 5' -TTTGACAGAATACACAGTCCTTTCTCCCCGGCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 11)
E4-R4 5' -ACAAAATACGAGAATGACTACGTCCGGCGTTCC-3' (SEQ ID NO: 12)
E4-F5 5' -GGACGTAGTCATTCTCGTATTTTGTATAGC-3' (SEQ ID NO: 13)
E4-R6 5' -TCACCAACACAGTGGGGG-3' (SEQ ID NO: 14) NF-1 5' -CCACAACCCCCACTACTCCC-3' (SEQ ID NO: 15) NR-2 5' -CGTCTCTTCCCTCTCCTCTCC-3' (SEQ ID NO: 16) Ncol-R 5' -AGGATCATCCGCTGCTGCCC-3' (SEQ ID NO: 17) Ncol-F 5' -CATCAGGATAGGGCGGTGG-3' (SEQ ID NO: 18) 35E3for 5' -AATGACTAATGCAGGTGCGC-3' (SEQ ID NO: 19) 35E3rev 5' -CGACGCGTTGTAGTCGTTGAGCTTCTAG-3' (SEQ ID NO: 20) Tabla 2 Lista de construcciones usadas para la generación de virus a base de Ad35 suprimidos en El sobre células PER.C6 como los descritos en los ejemplos. Las construcciones adaptadoras fueron digeridas con Pací, pWE .Ad35.pIX-EcoRV fue digerido con Notl y EcoRV, las construcciones a base de pBr modificado con E4 fueron digeridas con Pací y Notl .
REFERENCIAS Abrahamsen K, Kong H-L, Mastrangeli A, Brough D, Lizonova A, Crystal R y Falck-Pedersen E. (1997) Construction of an adenovirus type 7a ElA" vector. J. Virol 11:8946-8951. Fallaux FJ, Kranenburg O, Cramer SJ, Houweling A, Van Ormondt H, Hoeben RC y Van der Eb AJ. (1996) Characterization of 911: A new helper cell line for the trtration and propagation of early región 1-deleted adenoviral vectors. Hum Gene Ther 7:215-222. Fallaux FJ, Bout A, Van der Velde I, Van den ollenberg DJ, Hehir KM, Keegan J, Auger C, Cramer SJ, Van Ormondt H, Van der Eb AJ, Valerio D y Hoeben C. (1998) New helper cells and matched early región 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication competent adenoviruses . Hum Gene Ther 9:1909-1917. Francki RIB, Fauquet CM, Knudson L y Brown F. (1991)
Classification and nomenclature of viruses . Fifth report of the international committee on taxonomy of viruses. Arch Virol Suppl 2:140-144. Graham FO, Smiley J, Russell W y Nairn R. (1970) Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 36:59-72. Hagmeyer BM, Duyndam MC, Angel P, De Groot RP, Verlaan M, Elfferich P, Van der Eb AJ y Zantema A. (1996) Oncogene 12 : 1025-1032. Horwitz MS . (2001) Adenovirus immunoregulatory genes and their cellular targets. Virology 279:1-8. Leppard KN. (1997) E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J
Gen Virol 78:2131-2138. Leppard KN. (1998) Regulated RNA processing and RNA transport during adenovirus infection. Seminars in Virology
8 : 301-307. Pilder S, Moore M, Logan J y Shenk T. (1986) The adenovirus E1B 55K transforming polypeptide modulates transport or cytoplasmic stabilization of viral and host cell mRNAs. Mol Cell Biol 6:470-476. Rao L, Debbas M, Sabbatini P, Hockenbery D, Korsmeyer S y White E. (1992) The adenovirus E1A proteins induce apoptosis, which is inhibited by the E1B 19-kDa and Bcl-2 proteins. Proc Nati Acad Sci USA 89:7742-7746. Russell WC. (2000) Update on adenoviruses and its vectors. J Gen Virol 81:2573-2604. Shenk T. (1996) Adenoviridae : The viruses and their replication. En Virology, eds . Fields BN, Knipe Dm y Howley PM. (Lippincott-Raven, Nueva York) 2:2111-2148. Van der Vliet PC. (1995) Adenovirus DNA replication. En The molecular repertoire of adenoviruses II, eds. Doerfler W y Bohm P. (Springer-Verlag, Berlin) . Current Topics in Microbiology and Immunology 199/11:1-30. Yew PR y Berk AJ. (1992) Inhibition of p53 transactivation required for transíormation by adenovirus early región IB protein. Nature 357:82-85. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un vector de adenovirus recombinante caracterizado porque comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, en donde el vector comprende además una secuencia que codifica para una proteina E4-orf6 funcional, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, en donde la secuencia se selecciona del grupo que consiste en: i. una secuencia que codifica para E4-orf6 derivada de un adenovirus de un segundo serotipo diferente al primer serotipo; ii. una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del primer serotipo que comprende una supresión, mutación, adición y/o sustitución en uno o más codones y iii . una secuencia de codificación de E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un segundo serotipo diferente al primer serotipo y una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un tercer serotipo, en donde el tercer serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo.. 2. El vector de adenovirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer serotipo y el segundo serotipo son de diferentes subgrupos de adenovirus. 3. El vector de adenovirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer serotipo es de un subgrupo que no es el subgrupo C, y en donde la secuencia de codificación de E4-orf6 se deriva de un serotipo de adenovirus del subgrupo C. 4. El vector de adenovirus recombinante de con ormidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer serotipo es del subgrupo B y el segundo serotipo es del subgrupo C . 5. El vector de adenovirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de codificación de E4-orf6 se deriva del serotipo 5 de adenovirus. 6. El vector de adenovirus recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50 de adenovirus . 7. El vector de adenovirus recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 6, caracterizado porque comprende además una secuencia que codifica para una proteína, polipéptido o péptido no adenoviral . 8. El vector de adenovirus recombinante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína, polipéptido o péptido no adenoviral se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido inductor de muerte celular, un determinante antigénico de un organismo patógeno, un antígeno específico de tumor, una proteína viral, una hormona y una citocina. 9. Un método para la producción de un vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: a. proporcionar una célula de complementación que porta una secuencia de codificación de E1B-55K, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, derivada de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable, con los elementos necesarios de un adenovirus tales como para permitir el ensamble del vector de adenovirus recombinante por la célula de complementación, en donde los elementos comprenden al menos algunos elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus del primer serotipo diferente del segundo serotipo y una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, que sea compatible con la proteína E1B-55K expresable en la célula de complementacion; b. cultivar la célula de complementacion en un medio bajo condiciones que permitan que tenga lugar la producción y ensamble del vector de adenovirus y c. cosechar el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera del medio y/o la célula de complementacion, en donde la secuencia que codifica para la proteína E4-orf6 compatible está presente en el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia de codificación de E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en: i. una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo; 11. una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus de un tercer serotipo diferente del primero y segundo serotipos; iii. una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del primer serotipo que comprende una supresión, mutación, adición y/o sustitución en uno o más codones y iv. una secuencia de codificación de E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un tercer serotipo y una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo, en donde el tercer serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque el primero y segundo serotipos son de diferentes subgrupos . 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el segundo serotipo es un serotipo de adenovirus del subgrupo C. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el segundo serotipo es serotipo 5 de adenovirus . 1 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque el que el primer serotipo es un serotipo de adenovirus del subgrupo B. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en serotipos de adenovirus 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizado porque la secuencia de codificación E1B-55K está integrada en el genoma de la célula de complementación . 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizado porque la célula de complementación se deriva de una célula humana diploide y primaria, o una célula progenitora de la misma. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizado porque la célula de complementación se deriva de una célula de retinoblasto humano primaria, una célula de riñon embrionario humana primaria, una célula neuronal humana primaria y un amniocito humano primario . 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, caracterizado porque la célula de complementación comprende, integrado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus . 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus se deriva de un serotipo de adenovirus de un subgrupo diferente que el subgrupo B. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus se deriva de un serotipo de adenovirus del subgrupo C. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína ElA de adenovirus se deriva de un serotipo 5 de adenovirus . 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, caracterizado porque la secuencia de codificación de E4-orf6 y la secuencia de codificación de E1B-55K se derivan de serotipos de adenovirus diferentes y en donde los serotipos de adenovirus diferentes son miembros del mismo subgrupo de adenovirus. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, caracterizado porque la secuencia de codificación de E4-orf6 y la secuencia de codificación de E1B-55K se derivan de diferentes serotipos de adenovirus, y en donde los diferentes serotipos de adenovirus son ambos miembros del subgrupo C. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, caracterizado porque la secuencia de codificación de E4-orf6 y la secuencia de codificación de E1B-55K se derivan del mismo serotipo de adenovirus. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de codificación de E4-orf6 y la secuencia de codificación de E1B-55K se derivan del serotipo 5 de adenovirus. 27. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula de complementación es una célula PER.C6 o un derivado de la misma. 28. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el vector adenoviral recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, u obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 27. 29. Un método para tratar un cuerpo humano caracterizado porque comprende administrar a un cuerpo humano el vector adenoviral recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28. 30. Un equipo de partes caracterizado porque comprende: a) una célula de complementación para producir un vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, la célula porta una secuencia de codificación de E1B-55K, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, derivada de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable y b) en uno o más vectores de ácido nucleico replicables todos los elementos adenovirales necesarios para permitir de esta manera el ensamble del vector de adenovirus recombinante por la célula de complementación, en donde los elementos comprenden al menos algunos elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus del primer serotipo diferentes del segundo serotipo y una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, que es compatible con la proteína E1B-55K expresable en la célula de complementacion. 31. El equipo de partes de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la secuencia de codificación de E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en : i. una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo; ii. una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus de un tercer serotipo diferente al primero y segundo serotipos; iii. una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del primer serotipo que comprende una supresión, mutación, adición y/o sustitución de uno o más codones y iv. una secuencia de codificación de E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un tercer serotipo y una parte de una secuencia de codificación de E4-orf6 derivada de un adenovirus del segundo serotipo, en donde el tercer serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo.
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Families Citing this family (115)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI0833934T2 (sl) | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji |
| US6929946B1 (en) * | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| US6913922B1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US20050232900A1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-10-20 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| CA2477954C (en) * | 2002-04-25 | 2012-07-10 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for the production of adenovirus vectors |
| CA2478508C (en) | 2002-04-25 | 2013-07-02 | Crucell Holland B.V. | Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof |
| EP1539937A4 (en) * | 2002-08-22 | 2006-07-26 | Merck & Co Inc | METHODS OF PROPAGATION OF ADENOVIRUS AND VIRUS SO OBTAINED |
| US20070036721A1 (en) * | 2003-09-23 | 2007-02-15 | Uab Resarch Foundation | Methods and compositions for in vivo inflammation monitoring |
| DK1780269T3 (da) | 2004-02-23 | 2009-10-12 | Crucell Holland Bv | Virusrensningsmetoder |
| SG159554A1 (en) | 2004-11-16 | 2010-03-30 | Crucell Holland Bv | Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors |
| DE602006003420D1 (de) | 2005-04-11 | 2008-12-11 | Crucell Holland Bv | Virusreinigung mit ultrafiltration |
| EP1998804B1 (en) * | 2006-03-27 | 2014-04-16 | Crucell Holland B.V. | Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant |
| KR101504392B1 (ko) * | 2008-11-03 | 2015-03-19 | 크루셀 홀란드 비.브이. | 아데노바이러스 벡터의 제조방법 |
| CN102791852B (zh) | 2009-10-15 | 2014-05-07 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 纯化腺病毒颗粒的方法 |
| EP2488635B1 (en) | 2009-10-15 | 2013-11-20 | Crucell Holland B.V. | Process for adenovirus purification from high cell density cultures |
| WO2011057248A2 (en) * | 2009-11-09 | 2011-05-12 | Genvec, Inc. | Simian adenovirus and methods of use |
| AU2011214262B2 (en) | 2010-02-15 | 2015-05-21 | Crucell Holland B.V. | Method for the production of Ad26 adenoviral vectors |
| WO2012038367A1 (en) | 2010-09-20 | 2012-03-29 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic vaccination against active tuberculosis |
| BR112013004582A2 (pt) | 2010-09-27 | 2016-09-06 | Crucell Holland Bv | método para induzir uma resposta imune em um sujeito contra um antígeno de um parasita que causa a malária |
| US9701718B2 (en) | 2010-12-14 | 2017-07-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus serotype 26 and serotype 35 filovirus vaccines |
| US20140155469A1 (en) | 2011-04-19 | 2014-06-05 | The Research Foundation Of State University Of New York | Adeno-associated-virus rep sequences, vectors and viruses |
| US20130122038A1 (en) | 2011-11-14 | 2013-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department | Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines |
| IN2014CN04742A (es) | 2011-11-28 | 2015-09-18 | Crucell Holland Bv | |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| DK2825640T3 (en) | 2012-03-12 | 2016-08-01 | Crucell Holland Bv | BATCHES OF RECOMBINANT ADENOVIRUS WITH CHANGED TERMINAL END |
| US9125870B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-08 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
| AP2014007993A0 (en) | 2012-03-22 | 2014-10-31 | Crucell Holland Bv | Vaccine against RSV |
| EP2855685B1 (en) | 2012-05-24 | 2017-03-08 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenoviral vectors for transduction of vascular tissue |
| KR102089121B1 (ko) * | 2013-03-14 | 2020-03-13 | 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 | 종양살상형 아데노바이러스 조성물 |
| CN105188745B (zh) | 2013-04-25 | 2019-10-18 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| EP3010931B1 (en) | 2013-06-17 | 2018-06-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
| US9974737B2 (en) | 2013-09-19 | 2018-05-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus formulations |
| KR101963985B1 (ko) | 2014-09-03 | 2019-07-31 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 필로바이러스 감염에 대한 보호 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물 |
| SG11201701745TA (en) | 2014-09-03 | 2017-04-27 | Bavarian Nordic As | Methods and compositions for enhancing immune responses |
| RS61902B1 (sr) | 2014-09-26 | 2021-06-30 | Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc | Metodi i kompozicije za indukovanje zaštitnog imuniteta protiv infekcije virusom humane imunodeficijencije |
| CA2965562C (en) | 2014-11-04 | 2023-11-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic hpv16 vaccines |
| AU2016249798B2 (en) | 2015-04-14 | 2022-05-26 | Janssen Vaccines And Prevention B.V. | Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter |
| CN104846013B (zh) * | 2015-04-15 | 2018-11-09 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用 |
| US10457708B2 (en) | 2015-07-07 | 2019-10-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |
| PL3319633T3 (pl) | 2015-07-07 | 2021-04-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Szczepionka przeciwko rsv |
| BR112018003019A2 (pt) | 2015-08-20 | 2018-09-25 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | vacinas terapêuticas contra hpv18 |
| EA036412B1 (ru) | 2015-10-06 | 2020-11-09 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Способ обеспечения защиты аденовируса от разрушения, вызванного взаимодействием с пластиком, и применение 2-гидроксипропил--циклодекстрина для защиты аденовируса |
| JP7171433B2 (ja) * | 2015-10-30 | 2022-11-15 | ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | Ｈｅｒ－２発現固形腫瘍の処置のための組成物および方法 |
| AU2016369326B2 (en) | 2015-12-15 | 2019-02-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof |
| CN108699566B (zh) | 2016-02-23 | 2023-06-30 | 萨克生物研究学院 | 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达 |
| CA3013637A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Salk Institute For Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
| WO2017174564A1 (en) | 2016-04-05 | 2017-10-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv |
| AU2017248021B2 (en) | 2016-04-05 | 2021-08-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F proteins |
| EP3452087A1 (en) | 2016-05-02 | 2019-03-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic hpv vaccine combinations |
| AU2017264562B2 (en) | 2016-05-12 | 2023-03-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| JP2019523644A (ja) | 2016-05-30 | 2019-08-29 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 安定化された融合前ｒｓｖ ｆタンパク質 |
| US10273268B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-04-30 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV vaccine formulation |
| EP3472327B1 (en) | 2016-06-20 | 2020-08-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| JP7229151B2 (ja) | 2016-07-14 | 2023-02-27 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Ｈｐｖワクチン |
| WO2018011198A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection |
| EP3484507A1 (en) | 2016-07-15 | 2019-05-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection |
| AU2017318689A1 (en) | 2016-09-02 | 2019-04-11 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| HUE052008T2 (hu) | 2016-09-15 | 2021-04-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Trimert stabilizáló HIV-burokfehérje-mutációk |
| CA3045892A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Salk Institute For Biological Studies | Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof |
| JP6721797B2 (ja) | 2017-02-09 | 2020-07-15 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 異種遺伝子発現のための強力で短いプロモーター |
| EP3606553A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-02-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen |
| WO2018208856A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Gritstone Oncology, Inc. | Alphavirus neoantigen vectors |
| WO2018210871A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
| CA3061278A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
| WO2018218240A1 (en) | 2017-05-26 | 2018-11-29 | Epicentrx, Inc. | Recombinant adenoviruses carrying transgenes |
| MA49397A (fr) | 2017-06-15 | 2020-04-22 | Bavarian Nordic As | Vecteurs à poxvirus codant pour des antigènes du vih, et leurs procédés d'utilisation |
| BR112020000867A2 (pt) | 2017-07-19 | 2020-07-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | mutações da proteína do envelope do hiv estabilizando o trímero |
| US20190022212A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human |
| MA49693A (fr) | 2017-07-28 | 2020-06-03 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Méthodes et compositions pour assurer l'immunisation contre l'arnrep hétérologue |
| WO2019053109A1 (en) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | METHOD FOR SAFE INDUCTION OF IMMUNITY AGAINST RSV |
| WO2019055888A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | METHODS OF INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN SUBJECTS UNDER ANTIRETROVIRAL TREATMENT |
| KR20200074988A (ko) | 2017-10-31 | 2020-06-25 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 벡터 및 이의 용도 |
| BR112020007698A2 (pt) | 2017-10-31 | 2020-10-06 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Sequência de ácido nucleico isolada, vetor, seu método de produção, célularecombinante, composição imunogênica, método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, vacina e seu método de produção |
| BR112020007695A2 (pt) | 2017-10-31 | 2020-10-20 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | adenovírus e seus usos |
| KR20200074987A (ko) | 2017-10-31 | 2020-06-25 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 및 이의 용도 |
| WO2019099970A1 (en) | 2017-11-20 | 2019-05-23 | Janssen Pharmaceuticals Inc. | Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen |
| BR112020012273A2 (pt) | 2017-12-19 | 2020-11-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | métodos e composições para induzir uma resposta imune contra o vírus da hepatite b (hbv) |
| KR20200118029A (ko) | 2018-01-04 | 2020-10-14 | 아이코닉 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 항-조직 인자 항체, 항체-약물 결합체, 및 관련 방법 |
| CN112437684A (zh) | 2018-07-20 | 2021-03-02 | 扬森疫苗与预防公司 | 以提高的生产率表达寨卡抗原的重组腺病毒载体 |
| WO2020064621A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-02 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Method of inducing an immune response against human immunodeficiency virus by co-localized administration of vaccine components |
| WO2020229577A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
| AU2020275910A1 (en) | 2019-05-15 | 2021-11-04 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine |
| TW202110476A (zh) | 2019-05-22 | 2021-03-16 | 荷蘭商傑森疫苗防護公司 | 於接受抗反轉錄病毒治療之個體中誘發抗人類免疫缺乏病毒感染之免疫反應的方法 |
| TW202110870A (zh) | 2019-05-30 | 2021-03-16 | 美商葛利史東腫瘤科技公司 | 經修飾之腺病毒 |
| IL291852A (en) | 2019-10-03 | 2022-06-01 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Adenovirus vectors and their use |
| WO2021209897A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Janssen Biotech, Inc. | Psma and steap1 vaccines and their uses |
| KR20230009445A (ko) | 2020-05-11 | 2023-01-17 | 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 | 안정화된 코로나바이러스 스파이크 단백질 융합 단백질 |
| EP4149530A1 (en) | 2020-05-12 | 2023-03-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Administration of homologous adenoviral vectors |
| IL299515A (en) | 2020-06-29 | 2023-02-01 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Immune combination against respiratory syncytial virus infection |
| JP2023532369A (ja) | 2020-07-06 | 2023-07-27 | ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 安定化されたコロナウイルススパイクタンパク質融合タンパク質 |
| KR20230050328A (ko) | 2020-07-08 | 2023-04-14 | 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 | Hbv에 대한 rna 레플리콘 백신 |
| KR20230038496A (ko) | 2020-07-13 | 2023-03-20 | 트랜스진 | 면역 억제의 치료 |
| CN116438308A (zh) | 2020-08-06 | 2023-07-14 | 磨石生物公司 | 多表位疫苗盒 |
| GB202013940D0 (en) | 2020-09-04 | 2020-10-21 | Synpromics Ltd | Regulatory nucleic acid sequences |
| US20230374542A1 (en) | 2020-10-07 | 2023-11-23 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21 (lgmd21) |
| US20220118081A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV vaccine regimens |
| JP2023551743A (ja) * | 2021-01-21 | 2023-12-12 | 株式会社 セリッド | 複製能のあるアデノウイルスを包含しない新規アデノウイルスベクター、およびこれの使用 |
| WO2022175477A1 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion rsv fb antigens |
| WO2022175479A1 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections |
| KR20230165275A (ko) | 2021-04-01 | 2023-12-05 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 융합 전 piv3 f 단백질 |
| WO2023020939A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-02-23 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
| WO2023026182A1 (en) | 2021-08-24 | 2023-03-02 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
| WO2023047348A1 (en) | 2021-09-24 | 2023-03-30 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized corona virus spike protein fusion proteins |
| WO2023047349A1 (en) | 2021-09-24 | 2023-03-30 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins |
| WO2023111725A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
| WO2023110618A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins |
| WO2023198815A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Sequential administration of adenoviruses |
| WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
| WO2023217988A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins |
| CN117264902A (zh) * | 2022-06-15 | 2023-12-22 | 上海元宋生物技术有限公司 | 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用 |
| EP4338727A1 (en) | 2022-09-14 | 2024-03-20 | Roquette Freres | Adenovirus formulations |
| WO2024061759A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized coronavirus s proteins |
| WO2024061757A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Pre-fusion human piv1 f proteins |
| WO2024074584A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion piv3 f proteins |
Family Cites Families (104)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4593002A (en) | 1982-01-11 | 1986-06-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Viruses with recombinant surface proteins |
| US4487829A (en) | 1982-03-23 | 1984-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Production and use of monoclonal antibodies against adenoviruses |
| US4792525A (en) | 1982-08-04 | 1988-12-20 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
| US4517686A (en) | 1982-08-04 | 1985-05-21 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
| US4578079A (en) | 1982-08-04 | 1986-03-25 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
| US4589881A (en) | 1982-08-04 | 1986-05-20 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
| US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US6007806A (en) | 1986-08-13 | 1999-12-28 | Transgene S.A. | Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor |
| FR2602790B1 (fr) | 1986-08-13 | 1990-06-01 | Transgene Sa | Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante |
| US5166320A (en) | 1987-04-22 | 1992-11-24 | University Of Connecticut | Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells |
| US4956281A (en) | 1987-06-03 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lymphocyte function associated antigen-3 |
| US5024939A (en) | 1987-07-09 | 1991-06-18 | Genentech, Inc. | Transient expression system for producing recombinant protein |
| US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| US5204445A (en) | 1988-10-03 | 1993-04-20 | The Scripps Research Institute | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding |
| US5198346A (en) | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
| US5096815A (en) | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
| US5223394A (en) | 1989-04-10 | 1993-06-29 | Biogen, Inc. | Recombinant dna molecule comprising lymphocyte function-associated antigen 3 phosphatidylinositol linkage signal sequence |
| WO1991000360A1 (en) | 1989-06-29 | 1991-01-10 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
| US5240846A (en) | 1989-08-22 | 1993-08-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Gene therapy vector for cystic fibrosis |
| US5332567A (en) | 1989-08-24 | 1994-07-26 | Immunomedics | Detection and treatment of infections with immunoconjugates |
| US5436146A (en) | 1989-09-07 | 1995-07-25 | The Trustees Of Princeton University | Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors |
| JP3360108B2 (ja) | 1989-10-20 | 2002-12-24 | メダレックス インク． | 二つのエフェクター機能を有する二元特異性異種抗体 |
| JPH05504677A (ja) | 1989-10-20 | 1993-07-22 | トラスティーズ オブ ダートマス カレッジ | ＩｇＡレセプターに特異的なモノクロナール抗体 |
| WO1991018088A1 (en) | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5349053A (en) | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
| US5246921A (en) | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
| GB2246779B (en) | 1990-08-03 | 1994-08-17 | Delta Biotechnology Ltd | Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells |
| GB9101550D0 (en) | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
| WO1993003769A1 (en) | 1991-08-20 | 1993-03-04 | THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract |
| FR2681786A1 (fr) | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
| IL103059A0 (en) | 1991-09-30 | 1993-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
| NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
| US5521291A (en) | 1991-09-30 | 1996-05-28 | Boehringer Ingelheim International, Gmbh | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
| DE69334238D1 (de) | 1992-09-25 | 2008-09-25 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus vektoren für die übertragung fremder gene in zellen des zentralen nervensystems, insbesondere im gehirn |
| GB9223084D0 (en) | 1992-11-04 | 1992-12-16 | Imp Cancer Res Tech | Compounds to target cells |
| ATE307212T1 (de) | 1992-11-18 | 2005-11-15 | Arch Dev Corp | Adenovirus-gelenkter gen-transfer zum herz-und glatten vaskulären muskel |
| GB9300686D0 (en) | 1993-01-15 | 1993-03-03 | Imp Cancer Res Tech | Compounds for targeting |
| WO1994017832A1 (en) | 1993-02-09 | 1994-08-18 | The Scripps Research Institute | Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton |
| DE4311651A1 (de) | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Ingelheim Int | Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen |
| EP0698109B1 (en) | 1993-05-10 | 2002-07-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Gene transfer into pancreatic epithelial cells |
| US5543328A (en) | 1993-08-13 | 1996-08-06 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having modified fiber proteins |
| EP0716711A1 (de) | 1993-09-03 | 1996-06-19 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Vektor für leber-gentherapie |
| US5552311A (en) | 1993-09-14 | 1996-09-03 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy |
| US5534423A (en) | 1993-10-08 | 1996-07-09 | Regents Of The University Of Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
| FR2712812B1 (fr) | 1993-11-23 | 1996-02-09 | Centre Nat Rech Scient | Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo. |
| IT1271461B (it) | 1993-12-01 | 1997-05-28 | Menarini Ricerche Sud Spa | Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso. |
| US5443953A (en) | 1993-12-08 | 1995-08-22 | Immunomedics, Inc. | Preparation and use of immunoconjugates |
| US5698443A (en) | 1995-06-27 | 1997-12-16 | Calydon, Inc. | Tissue specific viral vectors |
| US6057299A (en) | 1994-01-13 | 2000-05-02 | Calydon, Inc. | Tissue-specific enhancer active in prostate |
| US5928944A (en) | 1994-02-04 | 1999-07-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of adenoviral-medicated cell transfection |
| US6312699B1 (en) | 1994-03-28 | 2001-11-06 | Uab Research Foundation | Ligands added to adenovirus fiber |
| US7252989B1 (en) | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
| CA2158926A1 (en) | 1994-05-13 | 1995-11-14 | Douglas J. Jolly | Compositions and methods for targeting gene delivery vehicles |
| US5571531A (en) | 1994-05-18 | 1996-11-05 | Mcmaster University | Microparticle delivery system with a functionalized silicone bonded to the matrix |
| US5570975A (en) | 1994-06-27 | 1996-11-05 | Reinert, Sr.; Gary L. | Metal foundation push-it and installation apparatus and method |
| FR2721943B1 (fr) | 1994-06-29 | 1996-08-02 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutase |
| US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| CA2199609A1 (en) | 1994-09-09 | 1996-03-14 | Errol B. Desouza | Interleukin-1 type 3 receptors |
| FR2724846B1 (fr) | 1994-09-27 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras |
| FR2725726B1 (fr) | 1994-10-17 | 1997-01-03 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
| US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
| FR2727867B1 (fr) | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| US6127525A (en) | 1995-02-21 | 2000-10-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| US5770442A (en) | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| SI0833934T2 (sl) | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji |
| US6676935B2 (en) | 1995-06-27 | 2004-01-13 | Cell Genesys, Inc. | Tissue specific adenoviral vectors |
| US7001764B2 (en) | 1995-06-27 | 2006-02-21 | Cell Genesys, Inc. | Compositions comprising tissue specific adenoviral vectors |
| US5622699A (en) | 1995-09-11 | 1997-04-22 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo |
| US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
| WO1997020575A1 (en) | 1995-12-08 | 1997-06-12 | The University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Targeted adenovirus vectors |
| JP2000515504A (ja) * | 1996-07-05 | 2000-11-21 | フィリップ イー． ブラントン | 細胞死を誘導するアデノウイルスｅ４蛋白質 |
| US5877011A (en) | 1996-11-20 | 1999-03-02 | Genzyme Corporation | Chimeric adenoviral vectors |
| US5922315A (en) | 1997-01-24 | 1999-07-13 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having altered hexon proteins |
| AU6691098A (en) | 1997-03-07 | 1998-09-22 | Wistar Institute Of Anatomy & Biology, The | Method and compositions for healing tissue defects and inducing hypervascularityin mammalian tissue |
| US5981275A (en) * | 1997-04-14 | 1999-11-09 | Genzyme Corporation | Transgene expression system for increased persistence |
| US6100086A (en) | 1997-04-14 | 2000-08-08 | Genzyme Corporation | Transgene expression systems |
| AU743051B2 (en) | 1997-05-08 | 2002-01-17 | Genetic Therapy, Inc. | Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins |
| US5849561A (en) * | 1997-05-22 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for the production of non-group C adenoviral vectors |
| US6287857B1 (en) | 1998-02-09 | 2001-09-11 | Genzyme Corporation | Nucleic acid delivery vehicles |
| US6417168B1 (en) * | 1998-03-04 | 2002-07-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods of treating tumors |
| WO1999047180A1 (en) | 1998-03-20 | 1999-09-23 | Genzyme Corporation | Chimeric adenoviral vectors for targeted gene delivery |
| US6436392B1 (en) | 1998-05-20 | 2002-08-20 | University Of Iowa Research Foundation | Adeno-associated virus vectors |
| GB9811171D0 (en) * | 1998-05-22 | 1998-07-22 | Royal Free Hosp School Med | Viral vector |
| US20030017138A1 (en) | 1998-07-08 | 2003-01-23 | Menzo Havenga | Chimeric adenoviruses |
| WO2000011149A1 (en) | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Uab Research Foundation | Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus |
| AU2145300A (en) * | 1998-11-18 | 2000-06-05 | Canji, Inc. | Adenoviral vectors |
| EP1020529B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-06-01 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| EP1016726A1 (en) | 1998-12-30 | 2000-07-05 | Introgene B.V. | Gene therapy to promote angiogenesis |
| ATE519854T1 (de) | 1999-05-17 | 2011-08-15 | Crucell Holland Bv | Rekombinantes adenovirus auf basis von serotyp 48 (ad48). |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| EP1067188A1 (en) | 1999-07-08 | 2001-01-10 | Introgene B.V. | Infection with chimaeric adenoviruses of cells negative for the adenovirus serotype 5 Coxsacki adenovirus receptor (CAR) |
| WO2001083797A2 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-08 | Avigen, Inc. | Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production |
| EP1157999A1 (en) | 2000-05-24 | 2001-11-28 | Introgene B.V. | Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof |
| US20020152553A1 (en) * | 2001-03-22 | 2002-10-24 | Wynveen Pamela Sue | Travel pillow securing to bucket seats |
| US6844192B2 (en) * | 2001-06-29 | 2005-01-18 | Wake Forest University | Adenovirus E4 protein variants for virus production |
| US20030026783A1 (en) | 2001-08-03 | 2003-02-06 | Amine Abina | Method of modulating neutralizing antibodies formation in mammals, and uses thereof in gene therapy, animal transgenesis and in functional inactivation of an endogenous proteins |
| AU2003220237A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-29 | Merck & Co., Inc. | Method of inducing an enhanced immune response against hiv |
| CA2477954C (en) * | 2002-04-25 | 2012-07-10 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for the production of adenovirus vectors |
| CA2478508C (en) * | 2002-04-25 | 2013-07-02 | Crucell Holland B.V. | Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof |
| EP1553983A2 (en) | 2002-10-23 | 2005-07-20 | Crucell Holland B.V. | New settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
| EP1573012B1 (en) | 2002-12-17 | 2011-11-30 | Crucell Holland B.V. | Recombinant viral-based malaria vaccines |
| US20070010016A1 (en) | 2005-03-11 | 2007-01-11 | Mccelland Alan | Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins |
-
2003
- 2003-04-24 CA CA2477954A patent/CA2477954C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-24 DE DE60329835T patent/DE60329835D1/de not_active Expired - Lifetime
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2004
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2005
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-
2007
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