NO332108B1 - Innretning og fremgangsmate til fremstilling av adenovirusvektorer - Google Patents

Innretning og fremgangsmate til fremstilling av adenovirusvektorer Download PDF

Info

Publication number
NO332108B1
NO332108B1 NO20045130A NO20045130A NO332108B1 NO 332108 B1 NO332108 B1 NO 332108B1 NO 20045130 A NO20045130 A NO 20045130A NO 20045130 A NO20045130 A NO 20045130A NO 332108 B1 NO332108 B1 NO 332108B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
serotype
adenovirus
orf6
coding sequence
different
Prior art date
Application number
NO20045130A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20045130L (no
Inventor
Ronald Vogels
Abraham Bout
Original Assignee
Crucell Holland Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Crucell Holland Bv filed Critical Crucell Holland Bv
Publication of NO20045130L publication Critical patent/NO20045130L/no
Publication of NO332108B1 publication Critical patent/NO332108B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C12N2810/6018—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Det er beskrevet fremgangsmåter og midler for fremstillingen av adenovirale vektorer på komplementerende cellelinjer hvor den tidlige region 4 åpne leseramme 6(E4orf6)-kodende nukleinsyre er til stede i den adenovirale vektor og hvor E4-orf6-genproduktet er kompatibelt med et eller flere produkter av El-genproduktene fremskaffet av den komplementerende celle slik at den adenovirale vektor kan bli effektivt fremstilt av den komplementerende celle.

Description

Område for oppfinnelsen
Oppfinnelsen angår nukleinsyreavleveringsvehikler samt anvendelse derav, mer spesielt angår oppfinnelsen rekombinante adenovirale vektorer samt anvendelsen derav. Nærmere bestemt vises det til kravene.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Til i dag har 51 humane adenovirus serotyper blitt identifisert som blir oppdelt i 6 undergrupper (A, B, C, D, E og F) basert på hemagglutineringsegenskaper og sekvenshomologi (Francki et al. 1991). Den infeksjonsdyktige adenovirus syklus er oppdelt i en tidlig og en sen fase. I den tidlige fase har viruset ingen kappa og genomet blir transportert til kjernen hvorpå de tidlige genområder (El, E2, E3 og E4) blir transkripsjonelt aktive. El-regionen inneholder to transkripsjonsregioner: EIA og E1B. EIA koder for proteiner som er involvert i modifisering av vertscellesyklus og aktivering av de andre virale transkripsjonsområder (oversikt av Russell. 2000). ElB-regionen koder for to hoved-proteiner: E1B-19K og E1B-55K, som forhindrer induksjonen av apoptose som resulterer fra aktiviteten av ElA-proteinene (Rao et al. 1992; Yew og Berk 1992; Shenk 1996). I tillegg er ElB-55K-proteinet nødvendig i den sene fase for selektiv viral mRNA-transport og inhibering av vertspro-teinekspresjon (Pilder et al. 1986). E2 er også oppdelt i to subdomener: E2A og E2B, som sammen koder for tre proteiner (et DNA-bindende protein, en viral polymerase og et pre-terminalt protein) som alle er involvert i replikasjon av det virale genom (Van der Vliet 1995). E3 er ikke nød-vendig for replikasjon in vitro, men koder for flere proteiner som ødelegger vertsforsvarsmekanismen overfor viralinfeksjon (Horwitz 2001). E4 inneholder minst 6 åpne leserammer (orfs) som koder for proteiner involvert i flere distinkte funksjoner relatert til viral mRNA-spleising og transport, vertscelle mRNA-transport, viral og cellulær transkripsjon og transformasjon (oversikt av Leppard 1997). De sene proteiner, som er nødvendige for dannelsen av de virale kapsider og pakking av virale genomer, blir alle generert fra sen hovedtranskripsjons-enhet (MLTU) som blir fult aktivt etter igangsetningen av replikasjon. En kompleksprosess av differensiell spleising og poly-adenylering gir opphav til mer enn 15 mRNA-typer som deler en tredel ledesekvens. E1B-55K-, E4-orf3- og E4-orf6-proteinene spiller en avgjørende rolle i reguleringen av sen viral mRNA-prosessering og transport fra kjernen. For denne prosess samvirker E1B-55K med E4-orf6 for å danne et funksjonelt kompleks som stimulerer transport av viral mRNA til cytoplasma, mens komplekset også er involvert i inhibering av transporten av cellulære mRNA fra kjernen til cytoplasma (oversikt i Leppard 1997 og 1998) .
Produksjon av El-deleterte vektorer basert på undergruppe C serotyper Ad5 eller Ad2 blir dannet i El komplementerende cellelinjer så som 293 (Graham et al. 1970), 911 (Fallaux et al. 1996) og PER.C6™ (Fallaux et al. 1998; ECACC deponeringsnummer 96022940). Som beskrevet i WO 99/55132 og WO 01/05945, kan vektorer og cellelinje bli samstilt for å unngå dannelse av replikasjonskompetente adenovirus via homolog rekombinasjon mellom adenovirussekvenser i cellelinjen og vektoren. For effektiv produksjon av replika-sjonsinkompetente adenovirus avledet fra gruppe C, blir cellelinjen PER.C6™ fortrinnsvis brukt. Ved å bruke denne cellelinje kan adenovirusvektorer bli samstilt, for derved å tillate fremstillingen av gruppe C adenovirale vektorer ved fravær av replikasjonskompetente adenovirus (Fallaux et al. 1998; US patent nr. 6,033,908). Imidlertid kan gruppe C vektorer ikke alltid være de ideelle vehikler for direkte in vivo-applikasjoner siden infeksjonseffektiviteten er alvorlig dempet ved tilstedeværelsen av høye titrer av nøytraliserende aktivitet i de fleste mennesker og fravær av tilstrekkelige mengder av den cellulære reseptor (Coxsackie-adenovirusreseptor, CAR) på spesifikke primære målceller (for eksempel endotelialceller, glatte muskelceller, synoviocytter, monocytter og dentritiske celler). Administrasjon av høye mengder virus for å øke transduksjon kan føre til øket toksisitet og ikke forutsibart klinisk resultat grunnet variasjonen i nøytraliserende titrer hos individer som blir behandlet. Disse begrensninger kan bli overvunnet ved bruken av andre serotyper av adenovirus. For eksempel ga den reseptorbindende del av en fiber av undergruppe B virus (spesielt av serotype 16) når uttrykt på en Ad5-basert vektor, vesentlig øket infeksjon hos humane endotelialceller og glatte muskelceller (WO 00/31285) og av humane synoviocytter (WO 00/52186). Fiberen av en annen undergruppe B adenovirus, Ad35, er mest effektiv til å fremme infeksjon av humane monocytter og dendritiske celler (WO 00/03029). Videre har Ad35 blitt identifisert som et virus overfor hvilken største del av den humane populasjon ikke har noe nøytraliserende aktivitet (WO 00/70071). Videre er det fra US 5849561 kjent en metode for å produsere en replikasjonsdefekt adenovirus av en subgruppe som har en defekt i El regionen til adenoviruset, som kan komplimenteres av en adenovirus av en annen subgruppe.
Det er et generelt feltbehov innen faget til å utvikle tek-nologi som har bredere serotype anvendelighet. Et spesielt problem er mangelen på egnede pakkecellelinjer for disse andre serotyper. Pakkecellelinjer for Ad5-vektorer omfatter typisk El kodede proteiner avledet fra adenovirus serotype 5. Eksempler på slike "standard" pakkecellelinjer er 293, 911 og PER.C6™. Forsøk på å danne vektorer avledet fra andre serotyper på disse standardpakkecellelinjer har vist seg for å være vanskelig, om ikke umulig. Til tider blir noe produksjon observert, avhengig av den spesielt anvendte serotype. Imidlertid er utbyttene av rekombinante adenovirusvektorer avledet fra adenovirus undergrupper andre enn undergruppe C, fremstilt på cellelinjer transformert og im-mortalisert med El fra Ad5 dårlig. I en artikkel av Abrahamsen et al. (1997), ble forbedret plakkopprensning av en ElA-deletert adenovirus serotype 7 vektor (undergruppe B) observert på 293 celler omfattende E4-orf6 avledet fra adenovirus serotype 5, i forhold til 293 celler som mangler E4-orf6-sekvensen fra Ad5. Imidlertid ble det påtruffet et problem med stabiliteten av vektoren ettersom uventede rekombinasjoner ble observert i plakkrenset stammaterialer. Et ytterligere problem ble påtruffet med villtype adenovirus virusforurensning under fremstilling. Videre er det for storskala fremstilling av adenovirus ikke nyttig å kotransfektere E4-orf6 for å oppnå titrer som er høye nok for anvendelse. En mulighet for å dyrke slike adenovirus er å fremskaffe celler med E4-orf6-genet stabilt integrert i genomet av den komplementerende/pakkende cellelinje. Slike celler har blitt beskrevet i faget (for eksempel WO 96/22378). En ulempe med dette system er det faktum at nye stabile cellelinjer må bli dannet, og flere utvelgelses-runder må bli utført før stabile og riktige celler har blitt dannet. Denne prosess er arbeidskrevende og tids-krevende. Generelt kan det bli angitt at dannelse og formering av adenovirus fra serotyper andre enn serotype 5 (undergruppe C), så som undergruppe B-virus, har vist seg å være vanskelig på Ad5 komplementerende celler. Slik det har blitt beskrevet av søkerne i WO 00/70071 kan rekombinante virus basert på undergruppe B virus Ad35 bli dannet ved ko-transfeksjon av en ekspresjonskonstruksjon inneholdende Ad35 tidlig område-l-sekvenser (Ad35-El). Videre ble Ad35-baserte virus som er deletert kun for ElA-sekvenser og ikke for E1B vist å replikere effektivt på PER.C6-celler, noe som antyder at ElA-proteinene av Ad5 er i stand til å komplementere Ad35-ElA-funksjonene (søkers internasjonale søknad PCT/NL01/00824, enda ikke publisert). Videre viser forsøkene at mangel på Ad35-E1B resulterer i dårlig utbytte på Ad5 komplementerende celler. WO 00/70071 beskriver også cellelinjer for fremstillingen av El-deleterte ikke-gruppe C adenovirale vektorer ved ytterligere å modifisere cellelinjer som er i stand til å komplementere adenovirus serotype 5. WO 00/70071 antyder videre at man bør etablere nye cellelinjer som inneholder Ad35-El-sekvenser for komplementeringen av rekombinante adenovirus serotype 35 vektorer som mangler El-området (se også søkers inter nasjonale søknad PCT/NL01/00824). Imidlertid som også diskutert ovenfor, dersom man ønsker å anvende en spesifikk serotype for et spesielt behov, ville det være nødvendig å etablere en ny cellelinje for hver spesifikk serotype, eller det ville være nødvendig å modifisere de tilgjengelige cellelinjer som kan komplementere adenovirus serotype 5 for komplementering av serotype av interesse. Det ville klart være fordelaktig å benytte de etablerte cellelinjer som er tilgjengelige innen faget, og ikke å modifisere disse og bruke dem for produksjonen av alle andre, ikke-Ad5 serotyper, ved å anvende de etablerte og effektive metoder som er kjent innen faget. Det vil konkluderes at inntil foreliggende oppfinnelse, er ingen fleksibel og riktig "produksjonsplattform" tilgjengelig innen faget som tillater produksjon av anvendelige utbytter av adenovirus serotyper som er forskjellige fra serotypene av undergruppe C.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 er en skjematisk representasjon av plasmid pAMT.Orf6.Hygro (ECACC deponeringsnummer P02041226). For klarhets skyld står storbokstav D for delta (A). Figur 2 er en skjematisk representasjon av plasmid pAd35.AMT.Orf6. For klarhets skyld står storbokstav D for delta (A). Figur 3 er en skjematisk representasjon av pUC.35-5E4. Figur 4 er en representasjon av kloningstrinnene som fører til pUC.35-5E4. Figur 5 er en skjematisk representasjon av pBr.Ad35.PRn. Figur 6 er en skjematisk representasjon av pBR.Ad35.PR5E4 (ECACC deponeringsnummer P02041229). Figur 7 er en skjematisk representasjon av pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4. Figur 8 er en skjematisk representasjon av
pCRscriptAmp.NFI-NcoIR.
Figur 9 er en skjematisk representasjon av
pCRscriptAmp.NFI-NR2.
Figur 10 er en skjematisk representasjon av pCR.NFl-NR2. Figur 11 viser samstillingen mellom aminosyresekvensene for E4-orf6 av adenovirus serotype 5 (SEKV. ID NR:21; øvre sekvens) med aminosyresekvensen av E4-orf6-proteinet fra adenovirus serotype 5 klonet i Ad35-stammen (SEKV. ID NR:21; midtre sekvens; NB. identisk med E4-orf6 av Ad5, øvre sekvens) som oppnådd ved bestemmelse av nukleotid-rekkefølgen, og aminosyresekvensen av E4-orf6-proteinet av adenovirus serotype 35 (SEKV. ID NR:22; nedre sekvens), som viser at hele fragmentet som koder for E4-orf6-proteinet i adenovirus serotype 35-stammen har blitt erstattet med fragmentet som koder for E4-orf6-proteinet av adenovirus serotype 5. Figur 12 viser samstillingen mellom aminosyresekvensen til E4-orf6/7-proteinet av adenovirus serotype 5 (SEKV. ID NR:23; øvre sekvens) med aminosyresekvensen av E4-orf6/7-fusjonsproteinet kodet delvis av adenovirus serotype 5 E4-orf6/7-fragmentet som erstatter den tilsvarende del av adenovirus serotype 35 E4-orf6/7-fragmentet i adenovirus serotype 35-stammen (SEKV. ID NR:24; midtre sekvens) og aminosyresekvensen av E4-orf6/7-proteinet av adenovirus serotype 35 (SEKV. ID NR:25; nedre sekvens), som viser at orf6/7-sekvensen er delvis kimerisk, med fusjonen omtrent ved lysin (K) residuet ved posisjon 138. For klarhets skyld bør noteringen orf6+7 bli lest som den åpne leseramme orf6/7, som er en separat åpen leseramme innen E4-området av adenovirus ved siden av orf6 og orf7, som er en notasjon som er velkjent for fagpersonen. Figur 13 er en skjematisk representasjon av pBr.Ad35.PR.50rf6 (ECACC deponeringsnummer P02041227). Figur 14 er en skjematisk representasjon av pWE.Ad35.pIX-rITR.50rf6. Figur 15 er en skjematisk representasjon av pBr.Ad35.PRnAE3. For klarhets skyld står storbokstav D for delta (A). Figur 16 er en skjematisk representasjon av pBr.Ad35.AE3.PR5E4. For klarhets skyld står storbokstav D for delta (A). Figur 17 er en skjematisk representasjon av pBr.Ad35.AE3.PR50rf6. For klarhets skyld står storbokstav D for delta (A). Figur 18 viser systemet for å fremstille rekombinante adenovirale partikler i celler så som PER.C6 via en dobbelt homolog rekombinasjonshendelse. Figur 19 er en skjematisk representasjon av pWE.Ad35.PIX-EcoRV.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer rekombinante adenovirusvektorer omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte vektor ytterligere omfatter en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein hvor nevnte sekvens er valgt fra gruppen bestående av a) en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype som er forskjellig fra nevnte første serotype og b) en E4-orf6-kodende sekvens omfattende en fusjon mellom en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en andre serotype som er forskjellig fra nevnte første serotype og en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en tredje serotype, hvor nevnte tredje serotype kan være identisk med eller forskjellig fra nevnte første serotype.
Oppfinnelsen fremskaffer videre fremgangsmåte for fremstilling av slike rekombinante adenovirusvektorer omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) å fremskaffe en komplementerende celle som inneholder en ElB-55K-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype i uttrykkbar form med de nødvendige elementer av et adenovirus for å tillate sammensetning av nevnte rekombinante adenovirusvektor av nevnte komplementerende celle, hvor nevnte elementer omfatter minst enkelte strukturelle og ikke-strukturelle elementer fra et adenovirus av nevnte første serotype som er forskjellig fra nevnte andre serotype, og en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein, og som er kompatibel med nevnte uttrykkbare ElB-55K-protein i nevnte komplementerende celle; b) å dyrke nevnte komplementerende celle i et medium under forhold som tillater dannelse og sammensetning av adenovirusvektoren å finnes sted; og c) å innhøste den rekombinante adenovirusvektor således fremstilt fra mediet og/eller den komplementerende celle, hvor sekvensen som koder for det kompatible E4-orf6 proteinet er tilstede i den rekombinante adenovirusvektoren sådan fremstilt.
Oppfinnelsen angår videre farmasøytiske sammensetninger omfattende rekombinante adenovirale vektorer i henhold til oppfinnelsen. Oppfinnelsen angår også et sett av deler omfattende cellelinjer og adenovirale vektorer fremskaffet med oppfinnelsen for å utføre fremgangsmåtene fremskaffet med oppfinnelsen.
Detaljert beskrivelse
Foreliggende oppfinnelse beskriver fremgangsmåter og anordninger som løser visse vanskeligheter relatert til minsket komplementering av ikke-gruppe C adenovirale vektorer i Ad5-pakkende/komplementerende celler. Selv om i de Ad5 komplementerende cellelinjer funksjonell Ad5 E1B-55K-ekspresjon er til stede, ble det funnet at kun meget lave titrer av adenovirale vektorer kunne bli fremstilt når den adenovirale stamme var av en ikke-gruppe C adenoviral opprinnelse; idet dette funn implikerer en serotype-spesifisitet i interaksjonen av E1B-55K med et annet (viralt) protein. Det er her beskrevet at denne serotype-avhengighet kan bli omgått ved å fremskaffe E4-orf6-protein som er kompatibel med ElB-55K-proteinet fremskaffet av den komplementerende cellelinje. E1B-55K og E4-orf6 danner et kompleks som er involvert i inhibering av transport av cellulære mRNA fra kjernen til cytoplasma, mens komplekset også er involvert i stimulering av transport av viralt mRNA fra kjernen til cytoplasma.
Det har blitt observert av foreliggende oppfinnere at riktig komplementering av virale vektorer i pakkeceller krever tilstedeværelsen av E1B-55K og E4-orf6-genprodukter som er kompatible. Pakkende celler blir også referert til som komplementerende celler, dersom cellene omfatter visse sekvenser som koder for proteiner som komplementerer funksjoner ikke fremskaffet av vektoren som skal bli pakket. "Kompatible" som benyttet heri betyr følgelig at et kompleks mellom det tilgjengelige ElB-55K-genprodukt er i stand til å danne et funksjonelt kompleks med det tilgjengelige E4-orf6-genprodukt i den forstand at dette proteinkompleks støtter viral replikasjon, formering og/eller pakking til et nivå som er kompatibel med villtype situasjon eller som er kompatibel med situasjonen funnet når en rekombinant adenovirus serotype 5 vektor blir dannet på en Ad5 komplementerende cellelinje så som 293 eller PER.C6. Vektorreplikasjon i pakkende celler er effektiv dersom, under produksjonsperioden hvor viruset blir dannet, cellen omfatter minst ElB-55K-protein og E4-orf6-protein som er kompatible. Fortrinnsvis er E1B-55K og E4-orf6-sekvensene fra adenovirus innen den samme adenovirus-undergruppe (så som A, B, C, D, E eller F). Mer foretrukket er E1B-55K- og E4-orf6-sekvensene fra samme serotype. Siden etablerte cellelinjer er tilgjengelige innen faget som er i stand til å støtte veksten av adenovirus av undergruppe C, så som serotype 5, er det enda mer foretrukket at E1B-55K-og E4-orf6-genene er avledet fra adenovirus serotype 5. Slik det vil bli forstått av fagpersonen kan kompatibilitet bli bestemt i komplementeringstester eller assays som sådan i området for fagpersonen som kjenner adenoviral vektor-produksjon. Fagpersonen vil også forstå at foreliggende oppfinnelse også kan bli brukt for fremstillingen av enhver adenovirus serotype eller enhver komplementerende cellelinje så lenge E1B-55K- og E4-orf6-proteinene er kompatible.
Det har videre blitt observert at E4-orf6-genprodukter, som "passer overens" med E1B på den komplementerende cellelinje, kan bli fremskaffet med den adenovirale vektor, ved å erstatte E4-orf6 i den aktuelle adenovirale vektor med en E4-orf6-kodende sekvens som er kompatibel med ElB-genet som er tilstede i den pakkende cellelinje. Denne modifikasjon ble overraskende funnet ikke å ha en alvorlig effekt på stabiliteten, replikasjonen, pakkingen, sammensetningen og produksjonen av vektoren.
Det er et spesielt aspekt av oppfinnelsen at man nå er i stand til effektivt å fremstille adenovirus serotyper som er forskjellige fra dem av undergruppe C på cellelinjer som normalt anvendes for fremstillingen av adenovirus serotype 5 eller annen serotype fra undergruppe C, så som serotype 1, 2 og 6. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer fremgangsmåter for fremstillingen av ikke-gruppe C adenoviruser uten at det er nødvendig separat å fremskaffe den komplementerende (pakkende) cellelinje med E4-orf6 fordi E4-orf6- sekvensen, som er kompatibel med den komplementerende E1B-55K-sekvens, er inkorporert i den adenovirale stamme.
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en rekombinant adenovirusvektor omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte vektor ytterligere omfatter en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein hvor nevnte sekvens er valgt fra gruppen bestående av: en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype som er forskjellig fra nevnte første serotype; og en E4-orf6-kodende sekvens omfattende en fusjon mellom en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en andre serotype som er forskjellig fra nevnte første serotype og en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en tredje serotype, hvor nevnte tredje serotype kan være identisk med eller forskjellig fra nevnte første serotype.
I en utførelsesform fremskaffer foreliggende oppfinnelse en rekombinant adenovirusvektor i henhold til oppfinnelsen hvor nevnte første serotype og nevnte andre serotype er fra forskjellige adenovirus undergrupper. I en foretrukket utførelsesform er en rekombinant adenovirusvektor i henhold til oppfinnelsen fremskaffet hvor nevnte første serotype er fra en undergruppe som er forskjellig fra undergruppe C og hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens er fra en adenovirus serotype av undergruppe C. Mer foretrukket er et rekombinant adenovirus i henhold til oppfinnelsen hvor nevnte første serotype er fra undergruppe B og nevnte andre serotype er fra undergruppe C. Mer foretrukket er nevnte E4-orf6-kodende sekvens fra adenovirus serotype 5.
Det har blitt erkjent av fagpersonen at forskjellige nivåer av nøytraliserende antistoff sirkulerer i mennesker som er rettet mot forskjellige serotyper. Det har blitt funnet at visse adenovirale serotyper møtet høye titrer av slike nøytraliserende antistoff og at mange individer i forskjellige folkegrupper bar nøytraliserende antistoff mot slike serotyper. Det ble også funnet at visse serotyper kun ble nøytralisert i en mindre del av prøvene (WO 00/70071) .
Åpenbart ble visse serotyper fra undergruppe B kun nøytralisert i en liten gruppe prøver. Følgelig blir i en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse rekombinante adenovirusvektorer i henhold til oppfinnelsen fremskaffet, hvor nevnte første serotype er valgt fra gruppen bestående av adenovirus serotyper 11, 14, 16, 21, 34, 35 og 50. Høyt foretrukket er rekombinante adenovirale vektorer, hvor nevnte første serotype er serotype 11 eller 35, mens disse traff nøytraliserende antistoff kun i en meget liten prosentdel av de undersøkte prøver.
Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt i forskjellige områder så som genterapi, funksjonell genom-lærer, tumorvaksinering og/eller anti-viralvaksinering. For dette er det nødvendig at den adenovirale vektor virker som en genavleveringsvehikkel, hvor et ikke-nativt gen er inkorporert i det adenovirale genom. Den adenovirale partikkel kan etterfølgende bli målrettet spesifikt mot målceller av interesse; idet adenoviruset binder til denne spesifikke celle, enten via kapsidreseptorbinding eller på annen måte, og avleverer transgenet. Målretting av adenovirus kan bli utført på mange forskjellige måter. Fagpersonen innen adenoviral vektormålretting vil være klar over alle de forskjellige muligheter som blir presentert til å avlevere de adenovirale vektorer til cellene av interesse. Slike muligheter innbefatter, men er ikke begrenset til, kapsidendringer (fiber, hekson og/eller pentonmodifika-sjoner, så som delesjoner, utbyttinger mellom fibrer av forskjellige serotyper, og addisjoner av peptider og/eller andre bindingsenheter), hvor kimeriske fibrer blir fremstilt som gjenkjenner en reseptor som er til stede på celleinteresse, eller hvor bindingen av penton-basen blir utnyttet. Andre muligheter er tilknytning av målrettende enheter til kapsidproteinene, hvor for eksempel bindende peptider, kjente og sterke bindende proteiner, eller antistoff eller deler derav blir bundet til kapsidproteinene for å oppnå spesifikk målretting. Slike vektorer kan alle bli fremstilt ved å bruke metoder og midler som er frem skaffet ved foreliggende oppfinnelse. Følgelig beskriver foreliggende oppfinnelse også rekombinante adenovirusvektorer i henhold til oppfinnelsen, ytterligere omfattende en sekvens som koder for et ikke-adenoviralt protein, polypeptid eller peptid. Slike sekvenser kan være til stede på forskjellige steder i den adenovirale stamme, men den ligger fortrinnsvis i El-regionen, som mangler i de rekombinante adenovirale vektorer ifølge oppfinnelsen. El-regionen er komplementert av (komplementerings) elementer som er til stede i komplementerende celler. Retningen av promoteren, transgene og andre regulatoriske sekvenser kan bli rettet mot den venstre, så vel som mot den høyre inverterte termi-nale repetisjon.
Foreliggende oppfinnelse kan også bli benyttet for fremstillingen av virale vektorer basert på adenovirus og/eller på andre virus så som det adeno-assosierte virus (AAV), hvor kombinasjonen, så som et Ad-AAV kimerisk virus, kan integrere i vertscellegenomer. Flere metoder er kjent innen faget for å danne integrerende adenovirus. Generelt er oppfinnelsen også anvendelig for fremstillingen av adenovirus-former som (spesifikt, eller ikke-spesifikt) kan integrere.
Som nevnt kan flere ikke-adenovirale transgener bli klonet i de rekombinante adenovirale vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse innbefatter ikke bare regulatoriske nukleinsyresekvenser så som forsterkere, promoterer (for eksempel sterke ikke-adenovirale promoterer så som cytome-galoviruspromoteren, SV4 0-promoteren og RSV-promoteren) og polyadenyleringssignaler, men også heterologe gener for terapeutiske formål. Følgelig er i ett aspekt av oppfinnelsen rekombinante adenovirusvektorer i henhold til oppfinnelsen fremskaffet, hvor nevnte ikke-adenvoriale protein, polypeptid eller peptid er valgt fra gruppen bestående av: et celledøds induserende polypeptid, en antigen determinant av en patogen organisme, et tumorspesifikt antigen, et viralt protein, et hormon og et cytokin. Eksempler på patogene organismer er, men er ikke begrenset til bakterier, virus og sopp. Ikke-begrensende eksempler på ikke-adenovirale faktorer, proteiner, polypeptider og peptider er transkripsjonsfaktorer, intracellulære sig-naliserende proteiner, fosfataser, kinaser, apoptose inhiberende faktorer, reseptorantagonister, oppløselige former av membranbundne reseptorer, RNA-inhibitorer, antisens RNA, narrefaktorer, ribozymer, og mer spesielt, tymidinkinase, erytropoietin, nye erytropoiesisk stimu-lerende protein (NESP), IL3, ceNOS, gamma-interferon og gplOO. Ikke-adenovirale virale proteiner kan bli klonet i de rekombinante adenovirale vektorer fremskaffet ved fremgangsmåtene og anordninger ifølge foreliggende oppfinnelse for vaksinasjonsformål. Slike virale proteiner innbefatter, men er ikke begrenset til, gag, pol, env, nef, etc. for HIV-vaksiner, E6- og E7-proteiner for humane papilloma virusvaksiner, sirkumsporozoit proteiner fra Plasmodium protozoa for malaria vaksiner, rotaviruskomponenter for rotavirusvaksiner, ebolaproteiner for ebolavaksiner, F- og G-genproduktene fra respiratorisk syncytial virus (RSV) for RSV-vaksiner, HA og NA for influensavaksiner, etc.
De rekombinante adenovirusene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter strukturelle og ikke-strukturelle elementer. Eksempler på strukturelle elementer er genene som koder for kapsidproteiner, så som fiber, hekson og pentonproteiner, så vel som genproduktene i seg selv. Eksempler på ikke-strukturelle elementer er de tidlige gener som blir uttrykt ved infeksjon i en celle og som blir nedregulert når infeksjonsyklusen skrider frem. Andre eksempler på ikke-strukturelle elementer er genene som koder for proteinene som er aktive under replikasjon, så som pol og pTP. Det skal bli forstått at de rekombinante adenovirale vektorer kan omfatte strukturelle og ikke-strukturelle elementer avledet fra forskjellige serotyper. Eksempler på slike vektorer er for eksempel de adenovirale partikler som bærer kimeriske fibrer (se søkers patentsøknad WO 00/03029). Molekylær biologiteknikker har gjort det mulig å konstruere endeløse kombinasjoner av nukleinsyresekvenser. Det er klart for fagpersonen innen molekylær biologi at det å kombinere forskjellige sekvenser kan bli utført ved å bruke forskjellige molekylære teknikker, så som polymerasekjedereaksjon (PCR) så vel som direkte subkloning. Mange av sekvensene benyttet i foreliggende oppfinnelse så vel som sekvenser og kimeriske konstruksjoner som er kjent innen faget er avledet fra forskjellige adenvirus serotyper. "Avledet" som benyttet heri betyr følgelig at slike sekvenskombinasjoner kan bli oppnådd via direkte kloning fra villtype sekvenser oppnådd fra villtype virus, mens de for eksempel også kan bli oppnådd via PCR ved å bruke forskjellige deler av DNA som et templat. Dette betyr også at slike sekvenser kan foreligge i villtype form, så vel som i endret form. En annen mulighet for å oppnå samme resultat er via kombi-nering av syntetisk DNA. Det skal bli forstått at "avledet" ikke utelukker betyr en direkte kloning av villtype DNA-materialet. Fagpersonen vil også være klar over mulighetene innen molekylær biologi for å oppnå mutante former av en viss del nukleinsyre. Disse mutasjoner kan gi en forskjellig funksjonalitet, men de kan også være stumme på den måte at visse mutasjoner ikke endrer funksjonaliteten av denne spesielle del av DNA og dets kodede protein. Følgelig er uttrykket "funksjonell del, derivat og/eller analog derav" blir forstått som ekvivalenter av nukleinsyren de er relatert til. Fagpersonen vil forstå at visse delesjoner, ombyttinger, (punkt)mutasjoner, addisjoner, etc. fremdeles kan resultere i en nukleinsyre som har en lignende funksjon som den opprinnelige nukleinsyre. Det skal følgelig bli forstått at slike endringer som ikke signifikant endrer funksjonaliteten av proteinene som så E4-orf6- og E1B-55K-genproduktet ligger innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse .
Enkelte endringer i nukleinsyren, så som en delesjon, en mutasjon, addisjon og/eller substitusjon i ett eller flere kodoner kan også signifikant endre strukturen og/eller funksjonaliteten av det kodede genprodukt.
Kodonet kan bli endret fullstendig for å endre den kodede aminosyre, men det kan også være mutert delvis for å endre den kodede aminosyre. Delesjoner av nukleinsyrer kan resultere i tap av en eller flere aminosyrer; mens de også kan resultere i rammeskift. Foreliggende oppfinnelse angår også E4-orf6-sekvenser som er til stede i den adenovirale nukleinsyre som omfatter forskjellige deler avledet fra forskjellige serotyper, hvor domenene som gjør proteinet funksjonelt i kompatibilitet kan bli brukt fra en serotype, mens den gjenværende av E4-orf6-sekvensen eller en del derav er avledet fra en annen (u)relatert serotype (for eksempel fra den samme undergruppe, fra forskjellige undergrupper eller fra forskjellige arter, eller kombinasjoner derav). Det ligger følgelig også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse å anvende E4-orf6-fusjonsproteiner som er kompatible. Slike fusjonsproteiner kan være produktet av flere deler av nukleinsyre.
Fagpersonen vil være klar over det faktum at ved siden av alle humane adenovirus har mange ikke-humane adenovirus blitt identifisert innen faget. Innlysende kan også ikke-humane adenovirus bli anvendt til å nå de samme resultater som beskrevet av foreliggende oppfinnelse. Det vil være klart for fagpersonen at kompatibilitet mellom E1B-55K og E4-orf6 ikke behøver å være begrenset til humane adenovirus, men at også elementer fra adenovirus som er spesifikke for forskjellige arter kan være kompatible. Således er det også et annet aspekt av oppfinnelsen at ikke-humane adenovirus kan bli fremstilt til høye titrer på kjente pakkecellelinjer som er tilgjengelige innen faget så lenge E1B-55K- og E4-orf6-genproduktene er kompatible. Ikke-begrensende eksempler på ikke-humane adenovirus som kan bli fremstilt ved å bruke fremgangsmåtene og metodene ifølge foreliggende oppfinnelse er hund-, bovin-, ovin-, frosk-, porsin-, ekviun-, ape- og fugle-adenovirus. Serotyper som benyttet heri går følgelig utover artsbegrensede serotyper. Dersom for eksempel et apeadenovirus E4-orf6-genprodukt er kompatibelt med E1B-55K, gitt av pakkecellen, så ligger denne kombinasjon innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. I tillegg når fusjoner blir utført mellom forskjellige serotyper, eller mellom E4-orf6-sekvenser avledet fra for eksempel et menneske og et fugleadenovirus som er kompatibelt med ElB-genet av pakkecellen, så ligger denne spesielle kombinasjon også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en fremgangsmåte for å fremstille en rekombinant adenovirusvektor omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene å: a) fremskaffe en komplementerende celle som inneholder en ElB-55K-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype i uttrykkbar form med de nødvendige elementer av et adenovirus for å tillate sammensetning av nevnte rekombinante adenovirusvektor av nevnte komplementerende celle, hvor nevnte elementer omfatter minst enkelte strukturelle og ikke-strukturelle elementer fra et adenovirus av nevnte første serotype som er forskjellige fra nevnte andre serotype, og en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein, og som er kompatibel med nevnte uttrykkbare ElB-55K-protein i nevnte komplementerende celle; b) dyrke nevnte komplementerende celle i et medium under forhold som tillater dannelse og sammensetning av adenovirusvektoren å finne sted; og c) innhøste den rekombinante adenovirusvektoren således fremstilt fra mediet og/eller den komplementerende celle.
I ett aspekt av oppfinnelsen er det fremskaffet en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens er valgt fra gruppen bestående av: en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype; en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av en tredje serotype som er forskjellig fra nevnte første og andre serotype; og en E4-orf6-kodende sekvens omfattende en fusjon mellom en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en tredje serotype og en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype, hvor nevnte tredje serotype kan være identisk med eller forskjellig fra nevnte første serotype. I en foretrukket utførelsesform er nevnte første og nevnte andre serotyper fra forskjellige undergrupper. I en mer foretrukket utførelsesform er nevnte andre serotype en adenovirus serotype av undergruppe C. I en enda mer foretrukket utførelselsform er nevnte andre serotype adenovirus serotype 5. I et annet spesielt aspekt av oppfinnelsen er nevnte første serotype en adenovirus serotype av undergruppe B. Fortrinnsvis er nevnte første serotype valgt fra gruppen bestående av adenovirus serotyper 11, 14, 16, 21, 34, 35 og 50.
Det finnes flere pakkeceller som er kjent innen faget som blir brukt for komplementerende rekombinante adenovirale vektorer og for å fremstille, sette sammen og pakke de adenovirale partikler. Ikke-begrensende eksempler på slike cellelinjer er HEK-293, 911 og PER.C6™-celler. Det er foretrukket å bruke cellelinjer som allerede har vist seg å avlevere høye titrer av adenoviralt stammateriale. Slike cellelinjer uttrykker El-proteiner på en stabil måte, og det er følgelig et foretrukket aspekt av oppfinnelse å anvende cellelinjer og fremgangsmåter, hvor nevnte E1B-55K-kodende sekvens er integrert i genomet av nevnte komplementerende celle. Mer foretrukket er nevnte komplementerende celle avledet fra en primær, diploid human celle eller en forløpercelle derav. Enda mer foretrukket er nevnte komplementerende celle avledet fra en primær human retinoblast-celle, en primær human embryonisk nyrecelle, en primær human nevronal celle eller en primær human aminocytt. Svært foretrukket er anvendelsen av en komplementerende celle i fremgangsmåtene fremskaffet av foreliggende oppfinnelse, hvor nevnte komplementerende celle er en PER.C6-celle eller et derivat derav. PER.C6-celler er velkjent innen faget for ikke å gi opphav til replikasjons kompetente adenovirus når adenoviralt DNA blir brukt som ikke har noen overlapp med nukleinsyren fremskaffet av cellene. Mange av adenovirale vektorer benyttet innen faget mangler El-området, og følgelig omfatter i ett aspekt av oppfinnelsen nevnte komplementerende celle, integrert i sitt genom, en nukleinsyre som koder for minst et adenovirus ElA-protein. Fortrinnsvis er nevnte nukleinsyre som koder for minst et adenovirus ElA-protein fra en adenovirus serotype av en undergruppe som er forskjellig fra undergruppe B. Mer foretrukket er nevnte nukleinsyre som koder for minst et adenovirus ElA-protein fra en adenovirus serotype av undergruppe C. Svært foretrukket er utførelses-former hvor nevnte nukleinsyre som koder for minst et adenovirus ElA-protein fra en adenovirus serotype 5. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen fremskaffer oppfinnelsen en fremgangsmåte hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens og nevnte E1B-55K-kodende sekvens er fra forskjellige adenovirus serotyper, og hvor nevnte forskjellige adenovirus serotyper tilhører samme adenovirus undergruppe. Fortrinnsvis er nevnte E4-orf6-kodende sekvens og nevnte E1B-55K-kodende sekvens fra forskjellige adenovirus serotyper og hvor nevnte forskjellige adenovirus serotyper begge tilhører undergruppe C. Mer foretrukket er nevnte E4-orf6-kodende sekvens og nevnte ElB-55K-kodende sekvens fra samme adenovirus serotype. Svært foretrukket er fremgangsmåter hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens og nevnte E1B-55K-kodende sekvens er fra adenovirus serotype 5.
Foreliggende oppfinnelse angår også en farmasøytisk sammensetning omfattende en rekombinant adenoviral vektor i henhold til oppfinnelsen eller som kan fremstilles ved en fremgangsmåte fremskaffet av oppfinnelsen. Den farmasøy-tiske sammensetning omfatter ytterligere et akseptabelt farmasøytisk bæremateriale, generelt tilført av fagpersonen som kjenner fremstilling av farmasøytika. For en effektiv produksjonsprosess er det nyttig å anvende de korrekte celler med den passende adenovirale vektor. Følgelig angår oppfinnelsen også et sett eller deler omfattende: en komplementerende celle for fremstilling av en rekombinant adenovirusvektor omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte celle inneholder en ElB-55K-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype i uttrykkbar form; og en eller flere replikerbare nukleinsyrevektorer omfattende alle nødvendige adenovirale elementer for å tillate sammensetning av nevnte rekombinante adenovirusvektor av nevnte komplementerende celle, hvor nevnte elementer omfatter minst enkelte strukturelle eller ikke-strukturelle elementer fra et adenovirus av nevnte første serotype som er forskjellige fra nevnte andre serotype, og en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein som er kompatibel med nevnte uttrykkbare ElB-55K-protein i nevnte komplementerende celle. Foretrukket blir et sett med deler brukt hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens er valgt fra gruppen bestående av: en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype; en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av en tredje serotype som er forskjellig fra nevnte først og andre serotype; og en E4-orf6-kodende sekvens omfattende en fusjon mellom en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en tredje serotype og en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype, hvor nevnte tredje serotype kan være identisk med eller forskjellig fra nevnte først serotype.
Oppfinnelsen er spesielt anvendelig for replikasjonen av El avledede kimeriske adenovirus som er avledet nesten fullstendig fra en serotype forskjellig fra adenovirus 5. Slike vektorer behøver kun å bli utstyrt med en nukleinsyre som koder for adenovirus 5 E4orf6.
Når utstyrt med dette kan vektoren bli effektivt replikert på normale adenovirus 5 El-komplementerende pakkende cellelinjer. Stabilitet av vektorene er forbedret, og vektorene kan komplementert for delesjoner i både EIA og E1B. Ved å utstyre slike vektorer med en nukleinsyre som koder for adenovirus E4orf6, er det mulig å tillate effektivt plakkopprensning og godt utbytter ved fravær av et ytterligere villtype forurensningsproblem, når dyrket på 293 eller 911 celler. I PER.C6 kan villtype adenovirusforurensning også bli forhindret på andre måter.
En ytterligere fordel med en rekombinant vektor ifølge oppfinnelsen er at det ikke er noe behov for å danne spesialcellelinjeadenovirus E4-orf6 fra en nukleinsyre integrert i genomet. Selv om slike cellelinjer eksisterer, blir de ikke lett opprettholdt i god stand. Dette er i det minste delvis grunnet det faktum at med mer og mer fremmede gener satt inn i genomet av cellen er det vanskelig å opprettholde stabilitet av alle fremmede sekvenser (eller ekspresjonen derav). I foreliggende oppfinnelse ble det funnet at minst enkelte av problemene assosiert med lave utbytter av ikke-adenovirus serotype 5 baserte vektorer og stabilitet av adenovirus serotype vektorer fra undergruppe B, så som adenovirus serotype 7, 11 og 35 på adenovirus serotype 5 pakkecellelinjer kan bli overvunnet med en rekombinant adenovirusvektor ifølge oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1. Dannelse av El-deleterte Ad35-virus som uttrykker Ad5 E4-orf6 på en Ad5-komplementerende cellelinje
Sekvenseringen av adenovirus serotype 35-genomet så vel som konstruksjonen av et plasmidbasert vektorsystem og dannelsen av rekombinante Ad35-baserte virus har blitt beskrevet i detalj i WO 00/70071.
Kloningen av den Ad5-E4-orf6-kodende sekvens i pAdApt35IPl (ECACC deponeringsnr. P02041228, for kloningsdetaljer av dette plasmid se WO 00/70071) ble utført som følger. Plas-midet ble spaltet med Nhel og Avrll og defosforylert med kalvetarmfosfatase (New England Biolabs). Spaltet DNA ble isolert fra gel ved å bruke GeneClean-settet. Plasmid pAMT.Orf6.Hygro (figur 1, ECACC deponeringsnr. P02041226) ble spaltet med Nhel og derpå delvis spaltet med Xbal. Etter separasjon av de resulterende bånd på gel ble 1350 bp-fragmentet som tilsvarer AMT-promoteren bundet til E4-orf6-sekvensen renset fra gel. Dernest ble begge isolerte fragmenter ligert og transformert i elektrokompetente DHlOB-celler (Invitrogen/LifeTechnologies) hvorpå en koloni med innskuddet i den korrekte orientering med hensyn til SV40 poly(A)-signalet ble valgt ut for storskala DNA-fremstilling. Dette resulterte i konstrukt pAd35.AMT.Orf6 (figur 2) som inneholder den Ad5 E4-orf6-kodende sekvens funksjonelt bundet til en mutert metallo tioneinpromoter (AMT). AMT-promoteren har blitt beskrevet av Hagmeyer et al. (1996). Ad5 E4-orf6-sekvensen tilsvarer nukleotid 33193 til nukleotid 34077 i Ad5-sekvensen (Genbank tilgangsnummer M73260). For å undersøke hvorvidt ekspresjonen av Ad5 E4-orf6-proteiner ville gjøre produksjon av fullstendig El-deleterte Ad35-vektorer mulig på Ad5-komplementerende celler, ble pAd35.AMT.Orf6 ko-transfektert med Ad35 stammekon-struksjonen pWE.Ad35.pIX-rlTR i PER.C6-celler. Til dette ble pAd35.AMT.Orf6 spaltet med PI-Psp-1 og pWE.Ad35.pIX-rlTR ble spaltet med Noti for å frigjøre de adenovirale innskudd fra stammen. 2 ug av det spaltede pAd35.AMT.Orf6 og 6 ug av det spaltede pWE.Ad35.pIX-rlTR ble transfektert ved å bruke LipofectAmine. Transfeksjonsblandingen ble tilsatt til PER.C6-celler som var sådd ut dagen før ved en tetthet på 3,5xl0<6>celler pr. T25-flaske. Den neste dag ble mediet skiftet med PER.C6 dyrkningsmedium (DMEM med 10 % FBS og 10 mM MgCl2) og celler ble videre inkubert ved 37 °C/10 % C02. Kontrolltransfeksjoner ble utført med pAdApt35.Lue ko-transfektert med pWE.Ad35.pIX-rlTR og pWE.Ad35.pIX-rlTR alene. To dager etter transfeksjon ble celler passert fra T25- til T80-flasker og inkubert som beskrevet. Igjen viste tre dager senere kulturen transfektert med pAd35.AmT.Orf6 sammen med Ad35-stammen cytopatogen effekt (CPE), noe som indikerer virusreplikasjon og ble innhøstet (innbefattende celler og medium) etter en ytterligere inkubering på 2 dager. Cellesuspen-sjonen ble utsatt for 2 runder fryse-/tinesykluser og det resulterende materialet (grovlysat) ble holdt ved -20 °C inntil videre bruk. De andre flasker viste ikke CPE og ble passert 1:3 i T80-flasker 6 dager etter overføring til T80. Igjen, 5 dager senere, viste de pAdApt35.Lue + pWE.Ad35.pIX-rlTR-transfekterte flasker enkelte CPE-lignende hendelser, men dette utviklet seg ikke videre. 0,2 og 0,5 ml av grovlysatet som stammet fra pAd35.AMT.Orf6-transfeksjonen ble brukt til å reinfisere PER.C6-celler ved omtrent 85 % konfluens i T80-flasker. Dette resulterte i full CPE etter en dag inkubering, noe som indikerer at infeksjonsdyktige virus var til stede i grovlysatene. Disse kulturer ble også innhøstet med to fryse-/tinesykluser. Ytterligere kontrolltransfeksjoner med konstrukt pAd35.AMT.Orf6 alene på PER.C6 ble utført for å bekrefte at Orf6-ekspresjon i seg selv ikke resulterte i celletoksi-sitet og CPE-lignende celledød. Til slutt resulterte kun transfeksjonene med pAd35.AMT.Orf6 sammen med pWE.Ad35.pIX-rlTR i CPE og virusreplikasjon.
PCR-analyse ble utført for å bekrefte tilstedeværelsen av
Ad35-baserte, virale genomer med Ad5-E4-orf6 til å erstatte den tidligere El-regionen. Til dette ble viralt DNA isolert fra grovlysatprøvene som følger. 275 yl av grovlysatmateri-alet ble inkubert med 10 yl DNasel (10 mg/ml) ved 37 °C i
30 minutter. Derpå ble 6,0 yl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 7,5 yl 20 % SDS og 1,5 yl 20 mg/ml Proteinase K tilsatt og blandet med oppvirvling. Blandingen ble så inkubert ved 50 °C i 1 time. Til slutt ble viralt DNA isolert ved å bruke GeneClean spinsettet (Bio 101, Inc.). 2 yl av det isolerte DNA ble så PCR-amplifikert ved å bruke primere 35psi-For og 35R4 (tabell 1). Programmene ble satt til 94 °C i 2 minutter fulgt av 30 sykler på 94 °C i 30 sekunder, 58 °C i 30 sekunder og 72 °C i 5 minutter og avsluttet med inkubering ved 72 °C i 10 minutter. Primerne er spesifikke for Ad35-sekvenser og danner et fragment på 2,9 kb i området fra pakkesekvensen til nt 4669 (nummerering som i wt Ad35-sekvens) for således å inkludere Ad5 orf6 transgenkas-setten. Elektroforese av de oppnådde PCR-fragmenter viste at fragmentene hadde den forventede lengde som tilsvarte kontroll PCR-fragmentene dannet på adapterplasmidet pAd35.AMT.Orf6. Således kan fullstendig El-deleterte Ad35-baserte vektorer bli dannet på Ad5-komplementerende celler dersom viruset også uttrykker Ad5-E4orf6.
Eksempel 2. Konstruksjon av pWE.Ad35.pIX-rITR5E4
Et første PCR-fragment ble amplifikert ved å bruke primere DF35-1 og 35FR (tabell 1). Amplifikering ble foretatt med pWE.Ad35.pIX-rlTR (se WO 00/70071) som templat-DNA ved å bruke Pwo DNA polymerase (Roche) med ytterligere DMSO (Sigma, sluttkonsentrasjon 3 %). Programmet var som følger: 94 °C i 2 minutter fulgt av 30 sykler med (94 °C i 30 sekunder, 52 °C i 30 sekunder, 72 °C i 3 minutter) og et sluttrinn med 72 °C i 8 minutter for å sikre fullstendige fragmenter. Amplifikering resulterte i et 1,6 kb-fragment som tilsvarer nt 30224 til 31805 av Ad35-sekvensen. Et BamHI-sete ble innført ved 3' ende. Det amplifikerte DNA ble renset fra gel ved å bruke GeneClean-settet og ligert til pCRScript/Amp kloningsvektorsettet (Stratagene). Etter transformasjon i elektrokompetente DHlOB-celler ble hvite kolonier valgt ut for ytterligere analyse. Dette resulterte i konstrukt pCR-fiber35. Grunnet buttkloningen kunne PCR-fragmentet bli satt inn i 2 orienteringer. En klon som hadde innskuddet med BamHI-sete i polylinkeren av pCRScript/Amp-vektoren ved 5' ende ble valgt ut. Spaltning med BamHI resulterer således i et 1,6 kb-fragment. Sekven-sering bekreftet korrekt amplifikering av PCR-fragmentet. Et andre PCR-fragment ble amplifikert ved å bruke primere. 5E4F og 5E4R (tabell 1). Amplifikering ble foretatt med pWE.Ad5.Af111-rITRsp som er en kosmidvektor inneholdende et ekstra Pacl-sete i pWE.Ad5.Af111-rITR (ECACC deponeringsnr. P97082116 beskrevet i søkers internasjonale patentsøknad PCT/NL01/00824). pWE.Ad5.Af111-rITRsp virket som et templat ved å bruke Pwo DNA-polymerase som beskrevet ovenfor selv om pWE.Ad5.Af111-rITR også kunne bli brukt for samme formål. Etter opprensking fra gel ble DNA-materialet spaltet med Sstl og BamHI (begge seter innført under PCR) og 3 kb-fragmentet ble renset fra agarosegel ved å bruke GeneClean- settet. Ad5 E4-området som er amplifikert tilsvarer bp 32794 til bp 35828 av Ad5-sekvensen. Et tredje PCR-fragment ble dannet på pWE.Ad35.pIX-rlTR ved å bruke primere: 355ITR og 353ITR (tabell 1). PCR-amplifikering ble foretatt som beskrevet ovenfor. Det resulterende 160 bp-fragment er flankert av et Sstl-sete (5' ende) og et EcoRI-sete (3' ende). Etter opprenskning fra gel som ovenfor, ble DNA-materialet spaltet med Sstl og EcoRI. 160 bp-fragmentet tilsvarende høyre ITR av Ad35 ble så atskilt fra spaltede ender på en lavsmeltepunkts agarosegel og samlet opp i gel. Dernest ble pUC119 spaltet med BamHI og EcoRI og 3,1 kb-fragmentet ble renset fra gel ved å bruke GeneClean-settet. De ovenfor behandlede andre og tredje PCR-fragmenter ble så ligert med BamHI/EcoRI spaltet pUC119, noe som resulterer i pUC.Ad5E4-35ITR. De klonede, PCR-avledede innskudd ble sekvensert for å verifisere korrekt amplifikasjon. Dernest ble 1,6 kb-innskuddet i pCR-fiber35 skåret ut med BamHI og fragmentet ble renset fra gel som ovenfor. pUC.Ad5E4-35ITR ble også spaltet med BamHI og det lineære fragment ble renset fra gel. Ligering av begge fragmenter og utvelgelse av klonene som hadde den korrekte orientering i forhold til hverandre, resulterte i pUC.35-5E4 (figur 3). Trinnene som fører til konstruksjonen av pUC.35-5E4 er skjematisk vist i figur 4. Adenovirusinnskuddet i pUC.35-5E4 ble subklonet i pBr.Ad35.PRn (figur 5, se WO 00/70071) som et konstrukt med Ad35 3' sekvenser. Til dette blir konstrukt pUC.35-5E4 spaltet med Mlul og Noti og 4,7 kb-fragmentet renses fra gel ved å bruke GeneClean-settet. Dette fragment blir så ligert med vektorfragmentet som stammer fra Mlul og Notl-spalting av konstrukt pBr.Ad35.PRn. Dette 16,3 kb fragment ble renset fra gel ved å bruke agaraseenzym (Roche). Ligeringer ble så transformert til kompetente DHlOB-celler. Det resulterende konstrukt ble betegnet pBr.Ad35.PR5E4 (figur 6, ECACC deponeringsnr. P02041229). Det siste trinn angår kloning av den modifiserte 3' ende av Ad35-sekvensen i den virale kosmidklon pWE.Ad35.pIX-rlTR. Til dette blir to fragmenter kombinert i en lambdafag pakkereaksjon (Stratagene) i henhold til forhandlers instruksjoner. Det første er det 16,8 kb store modifiserte Ad35-innskudd fra pBr.Ad35.PR5E4 oppnådd ved spalting med PacI og Swal og det andre er et 22,8 kb fragment oppnådd ved spalting av pWE.Ad35.pIX-rlTR med PacI og Swal. Den korrekte kombinasjonen av de to fragmenter gir pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4 (figur 7). Således er i dette konstrukt E4-området i Ad35-stammen erstattet med den tilsvarende region avledet fra Ad5.
Eksempel 3. Konstruksjon av pWE.Ad35.pIX-rITR50rf6
For å oppnå et adenoviralt stammekonstrukt som inneholder Ad35-sekvensen fra pIX-genet (nt 3401 i Ad35-sekvensen) til enden av høyre ITR, men med sekvensene for E4-orf6 og
-orf6/7 byttet ut med de tilsvarende sekvenser av Ad5, Ad35 og Ad5-sekvenser ble PCR-amplifikert og kombinert som beskrevet nedenfor. PCR-fragmenter ble dannet med Pwo DNA polymerase med tilsetting av DMSO opp til 3 %. Den første PCR ble foretatt med pBr.Ad35.PRn (figur 5, se WO 00/70071) som templat og primerne E4-F1 og E4-R2 (tabell 1). Programmet ble satt som følger: 94 °C i 2 minutter, 5 sykler av (94 °C i 30 sekunder, 50 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt) fulgt av 30 sykler med (94 °C i 30 sekunder, 60 °C
i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt) og avsluttet med et sluttrinn ved 68 °C i 8 minutter. Det resulterende 1,8 kb fragment ble renset ved å bruke GeneClean-settet. Den andre PCR ble foretatt med pWE.Ad5.Af111-rITRsp som er en kosmidvektor inneholdende et Pacl-sete i pWE.Ad5.Af111-rITR (ECACC deponeringsnr. P97082116, beskrevet i søkers internasjonale patentsøknad PCT/NL01/00824, enda ikke publisert) som templat og primerne E4-F3 og E4-R4 (tabell 1). Programmet ble satt som følger: 94 °C i 2 minutter fulgt av 30 sykler av (94 °C i 30 sekunder, 62 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt) og avsluttet med et sluttrinn ved 68 °C i 8 minutter. 1,1 kb fragmentet ble renset som ovenfor. Den tredje PCR ble foretatt med pBr.Ad35.PRn som templat og primerne E4-F5 og E4-R6 (tabell 1). Programmet ble satt som følger: 94 °C i 2 minutter, 5 sykler av (94 °C i 30 sekunder, 48 °C i 30 sekunder og 72 °C i 45 sekunder) fulgt
av 30 sykler av (94 °C i 30 sekunder, 56 °C i 30 sekunder og 72 °C i 45 sekunder) og avsluttet med et sluttrinn ved 68 °C i 8 minutter. 366 bp fragmentet ble renset som ovenfor. Prøver av de rensede fragmenter ble satt på en gel for å beregne konsentrasjonen og så ble fragmentene blandet sammen til å inneholde 700 ng PCR-1, 650 ng PCR-2 og 430 ng PCR-3 i et totale på 30 ul. Til denne blanding ble 3 yl EcoPol-buffer (New England Biolabs), 3 yl 2 mM dNTP oppløsning og 3 yl milliQ H20 tilsatt. Den resulterende blanding ble inkubert ved 94 °C i 3 minutter og så avkjølt ned til 65 °C i en PCR-maskin ved en hastighet på 0,5 °C/sekund. Etter inkubering ved 65 °C i 10 minutter ble blandingen ytterligere kjølt ned til 20 °C ved en hastighet på 0,05 °C pr. sekund og inkubert i 10 minutter ved 20 °C. Derpå ble 1 yl (5 enheter) Klenow-enzym (New England Biolabs) tilsatt fulgt av en inkubering i 60 minutter ved 37 °C. 5 yl av denne Klenow-blanding ble brukt som et templat til separat å amplikere to fragmenter som følger. Primersett 1: NF-1 og Ncol-R (tabell 1) ble brukt i en reaksjon ved å bruke Pwo DNA polymerase (Roche) med tilsetning av DMSO til en sluttkonsentrasjon på 3 % og ved å bruke de følgende verdier på PCR-maskinen: 94 °C i 2 minutter fulgt av 30 sykler av (94 °C i 30 sekunder, 66 °C
i 30 sekunder og 72 °C i 3 minutter) fulgt av en sluttinkubering ved 68 °C i 8 minutter. Primersett 2: Ncol-F og NR-2 (tabell 1) ble brukt i en reaksjon ved å bruke Pwo DNA polymerase (Roche) med tilsetning av DMSO til en sluttkon-sentras jon på 3 % og bruke de følgende innstillinger på PCR-maskinen: 94 °C i 2 minutter fulgt av 30 sykler av (94 °C i 30 sekunder, 62 °C i 30 sekunder og 72 °C i 90 sekunder) fulgt av en sluttinkubering ved 68 °C i 8 minutter. De resulterende fragmenter på 2,7 kg (primersett 1) og 1,1 kb (primersett 2) ble renset fra gel ved å bruke GeneCleane-settet og hvert ble ligert til pCRscriptAmp-vektoren (Stratagene) og transformert i DH10B elektrokompetente celler. Dette resulterte i konstrukt pCRscriptAmp.NFI-NcoIR (figur 8) og konstrukt pCRscriptAmp.NcoIF-NR2 (figur 9). Siden innskuddene inneholdt butte ender, ble to orien-
teringer oppnådd ved hver kloning. Ved å bruke Kpnl-spaltninger ble konstruktene med orienteringen som er nødvendig for videre kloning valgt ut (se figur 8 og 9). Innskuddene ble så sekvensert for å verifisere korrekt amplifikering. Dernest ble deler av innskuddet fra pCRscriptAmp-NcoIF-NR2 spaltet ut ved å bruke BamHI og Ncol og renset fra gel som ovenfor. pCRscriptAmp-NFI-NcoIR ble spaltet med de samme enzymer og det vektorinneholdende fragment ble også renset fra gel. Ligering av disse fragmenter resulterte i pCR.NFl-NR2 (figur 10). pCR.NFl-NR2 inneholder Ad35-sekvenser mellom nt 30162 og 33234 av Ad35-sekvensen av E4-orf6- og E4-orf6/7-sekvenser mellom nt 31879 og 32974 erstattet for ad5-avledede sekvenser belig-gende mellom 32968 og 34077 fra den publiserte Ad5-sekvens i Genbank (tilgangsnummer M73260). Således, som kan bli observert i aminosyresammenstillingene presentert i figur 11 og 12, er aminosyresekvensen av det klonede E4-orf6-protein identisk med E4-orf6-sekvensen funnet i Ad5 og E4-orf6/7 aminosyresekvensen er for størstedelen identisk med E4-orf6/7-sekvensen som er til stede i Ad5. Innlysende kan forskjellige hybride Ad35-Ad5 E4-konstruksjoner bli ut-formet ved å bruke den generelle metode skissert ovenfor uten å fravike fra oppfinnelsen. Dette kimeriske innskudd fra pCR.NFl-NR2 ble så klonet i pWE.Ad35.pIX-rlTR: pCR.NFl-NR-2 ble spaltet med Mlul og Ndel og det resulterende 2,8 kb fragment ble renset fra gel ved å bruke GeneClean-settet. Konstrukt pBr.Ad35.PRn ble også spaltet med Mlul og Ndel og 18 kb vektorfragmentet ble isolert fra gel ved å bruke agaraseenzym (Roche). Ligering av begge fragmenter resulterte i konstrukt pBr.Ad35.PR.50rf6 (figur 13, ECACC deponeringsnr. P02041227). Ad35-sekvensene mellom PacI og Swal inneholdende det kimeriske E4-området i dette konstrukt blir så klonet i konstrukt pWE.Ad35.pIX-rlTR ved å bruke lambda-fag pakking som beskrevet ovenfor. Det resulterende pWE.Ad35pIX-rITR.50rf6 (figur 14) blir så brukt til å danne rekombinante Ad35-baserte viruser med ko-transfeksjon på PER.C6 pakkende celler med et Ad35 adapterplas-mid.
Eksempel 4. Konstruksjon av pWE.Ad35.pIX-rITRAE3, pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.5E4 og pWE.Ad35.pIX-rITRAE350rf6
Ad35-stammen ble videre modifisert med en delesjon av E3-sekvenser. E3-proteiner er kjent for å modulere verts-immunresponsen mot adenovirusinfeksjon og er følgelig ikke nødvendige for in vitro formering av rekombinante virus. Videre tillater delesjonen av E3-sekvenser innsetting av større heterologe sekvenser i vektorene uten å sette pakkeeffektiviteten i fare. I tillegg, for anvendelsen av adenovirale vektorer som vaksinasjonsvehikler, er ekspre-sjon av immunomodulatoriske gener kodet av E3-området ikke foretrukket. Metoder for å fjerne E3-sekvenser i pBr.Ad35.PRn-plasmidet (figur 5) er beskrevet nedenfor.
Først ble et PCR-produkt dannet med primere 35E3for og 35E3rev (tabell 1) ved å bruke Pwo DNA polymerase (Roche) i henhold til forhandlers instruksjoner og pBr.Ad35.PRn som templat-DNA. Programmet ble satt til 94 °C i 2 minutter og 30 sykler av 94 °C i 30 sekunder, 58 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt fulgt av 68 °C i 8 minutter. Det amplifikerte fragment inneholder Ad35-sekvenser fra nt 26814 til 27647 (se WO 00/70071) og er flankert ved 3' ende av et Mlul-sete. Det resulterende 833 bp fragment ble renset ved å bruke Qiaquick PCR opprenskningssett (Qiagen) og spaltet med Mlul og Stul. Det spaltede PCR-fragment ble så renset fra en LMP agarosegel ved å bruke Qiaquick gel ekstrak-sjonssettet (Qiagen). Konstrukt pBr.Ad35.PRn ble også spaltet med Mlul og Stul og det 17,3 kb vektorinneholdende fragment ble isolert fra agarosegel ved å bruke agaraseenzym (Roche) under anvendelse av metoder som er kjent for fagpersonen. Begge isolerte DNA-materialer ble ligert og transformert i maksimum effektive DH5a-kompetente bakterier (Invitrogen/LTI) for å gi pBr.Ad35.PRnAE3 (figur 15). De fjernede sekvenser omfatter nt 27648 til 30320 av Ad35-sekvensen, noe som resulterer i en 2673 bp-delesjon. E3-delesjonen ble så innført i konstrukt pWE.Ad35.pIX-rlTR ved å bruke lambda-fag-pakkende ekstrakter (Stratagene). Til dette ble både pWE.Ad35.pIX-rlTR og pBr.Ad35.PRnAE3 spaltet med PacI og Swal og de respektive 22,8 kb og 14 kg fragmenter ble isolert fra lavt smeltepunkt agarosegeler ved å bruke agaraseenzym (Roche). Etter ligering og pakking ved å bruke STBL-2-celler (Invitrogen/LTI) ble konstrukt pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 oppnådd.
For å konstruere de E3-deleterte versjoner av de E4-modifiserte stammekonstrukter beskrevet ovenfor, ble E4-modifi-kasjonene introdusert i pBr.Ad35.PRnAE3 konstruktet som følger. Konstrukt pUC.35-5E4 (figur 3) ble spaltet med Mlul og Noti og 4,7 kb fragmentet ble isolert fra gel ved å bruke GeneClean II-settet. Konstrukt pBr.Ad35.PRnAE3 ble også spaltet med Mlul og Noti og 13,6 kb vektorfragmentet ble isolert fra gel ved å bruke GeneClean spinsettet. Ligering av disse fragmenter resulterte i konstrukt pBr.Ad35.AE3.PR5E4 (figur 16). Konstrukt pCR.NFl-NR2 (figur 10) ble spaltet med Mlul, Ndel og Bgll (sistnevnte for å spalte vektorfragmentet i mindre fragmenter) og 2,8 kb fragmentet ble isolert fra gel ved å bruke GeneClean spinsettet. Konstrukt pBr.Ad35.PRnAE3 ble spaltet med Mlul og Ndel, defosforylert ved å bruke CIP-enzym (New England Biolabs) og 15,2 kb vektorfragmentet ble også isolert ved å bruke GeneClean spinsettet. Ligering av disse fragmenter ga konstrukt pBr.Ad35.AE3.PR50rf6 (figur 17). pBr.Ad35.AE3.PR5E4 og pBr.Ad35.AE3.PR50rf6 blir så brukt til å bytte 3' PacI-Swal-fragmentet i pWE.Ad35.pIX-rlTR med de tilsvarende områder fra pBr.Ad35.AE3.PR5E4 og pBr.Ad35.AE3.PR50rf6 som beskrevet nedenfor. Dette fører til konstrukter pWE.Ad35.pIX.rITRAE3.5E4 og pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.50rf6. En alternativ metode til å danne disse store kosmider er å bruke tre fragmenter i ligeringsreaksjonen for pakking: et 14,7 kb Notl-PacI-fragment fra pWE.Ad35.pIX-rlTR, PacI-Notl-innskuddet fra pBr.Ad35.AE3.PR5E4 eller pBr.Ad35.AE3.PR50rf6 og det Notl-spaltede pWE15 kosmid vektorfragment (Stratagene). Dette sistnevnte fragment kan også bli isolert fra Notl/Pacl-spaltingen av pWE.Ad35.pIX-rlTR.
Eksempel 5. Dannelse av El— og El/E3-deleterte Ad35-baserte vektorer på PER.C6-celler
For å tillate dannelse av rekombinante Ad35-virus på den komplementerende cellelinje PER.C6 ved å bruke pBr.Ad35.PRn-baserte konstrukter dannet søker først et nytt konstrukt inneholdende Ad35-sekvenser fra bp 3401 til bp 24650 av Ad35-sekvensen (WO 00/70071) og overlapper således med begge adapterplasmidene og de pBr.Ad35.PRn-baserte konstrukter. Transfeksjon av disse tre plasmider i PER.C6-celler og en dobbel homolog rekombinasjon fører til et fullstendig viralt genom og replikasjon av rekombinante virus som skissert i figur 18. Det ønskede plasmid ble dannet ved delesjon av en stor del av Ad35-sekvensene i pWE.Ad35.pIX-rlTR. I tillegg ble pWE.Ad35.pIX-rlTR spaltet med EcoRV og det 2 9 kb vektorinneholdende fragment ble renset fra en lavsmeltepunktsgel ved å bruke Geneclean spinsettet. Det opprensede DNA ble selvligert og brukt til å transformere DH10B elektrokompetente bakterier (Invitrogen/LTI), noe som resulterer i pWE.Ad35.pIX-EcoRV (figur 19).
Alle DNA brukt for transfeksjon ble spaltet som indikert i tabell 2, varmeinaktivert ved 65 °C i 15 minutter og benyttet uten ytterligere behandling i transfeksjonen. PER.C6-celler ble sådd ut dagen før transfeksjon i T25 flasker ved en tetthet på 3xl0<6>celler/flaske og transfektert som indikert i tabell 2 ved å bruke LipofectAmine (Invitrogen/LTI) i henhold til forhandlers instruksjoner, bortsett fra at transfeksjonsblandingen i serumfritt DMEM medium (Gibco/BRL) ble erstattet med PER.C6 dyrkningsmedium (DMEM, 10 % FBS og 10 rtiM MgCl2) etter 5 timer. Dagen etter ble transfeksjonseffektivitet beregnet ved 50 % med fluore-scensmikroskopi. To dager senere ble celler trypsinisert og sådd ut på nytt i T80 flasker og ytterligere inkubert ved 37 °C/10 % C02. Seks dager etter transfeksjon viste alle kulturer full cytopatogen effekt (CPE, som er indikatorisk for virusformering) bortsett fra for PER.C6-kulturen transfektert med Ad35.AdApt.eGFP + pWE.Ad35.pIX-rlTR. En dag senere ble celler og medium i flaskene med CPE innhøstet og utsatt for to fryse-/tinesykler, klargjort for celleavfall med sentrifugering (10 minutter ved 1500 rpm) og 100 yl av disse grovlysater ble brukt for å reinfisere ferske PER.C6-celler ved 85 % konfluens i T80 flasker. Transfeksjonen av Ad35.AdApt.eGFP + pWE.Ad35.pIX-rlTR som ikke viste tegn på CPE ble høstet inn med trypsinisering og også behandlet som ovenfor. To dager etter infeksjon av ferske PER.C6-celler viste alle flasker full CPE, bortsett fra den ene som ikke viste noen tegn på CPE ved tiden for initial innhøsting. Dette viste klart at fullstendig El-deleterte Ad35-baserte virus kan bli dannet på PER.C6-celler når Ad5 E4-orf6-genproduktet blir uttrykt fra Ad35-stammen.
Tabell 2. Liste av konstrukter benyttet for å danne El-deleterte Ad35-baserte virus på PER.C6-celler som beskrevet i eksemplene. Adapterkonstrukter ble spaltet med PacI, pWE.Ad35.pIX-EcoRV ble spaltet med Noti og EcoRV, E4-modifiserte pBr-baserte konstrukter ble spaltet med PacI og Noti.
REFERANSER
Abrahamsen K, Kong H-L, Mastrangeli A, Brough D, Lizonova A, Crystal R og Falck-Pedersen E. (1997) Construction of an adenovirus type 7a EIA vector. J Virol 11:8946-8951.
Fallaux FJ, Kranenburg 0, Cramer SJ, Houweling A, Van Ormondt H, Hoeben RC og Van der Eb AJ. (1996) Characterization of 911: A new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenovirul vectors. Hum Gene Ther 7:215-222.
Fallaux FJ, Bout A, Van der Velde I, Van den Wollenberg DJ, Hehir KM, Keegan J, Auger C, Cramer SJ, Van Ormondt H, Van der Eb AJ, Valerio D og Hoeben RC. (1998) New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication competent adenoviruses. Hum Gene Ther 9:1909-1917.
Francki RIB, Fauquet CM, Knudson L og Brown F. (1991) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the international committee on taxonomy of viruses. Arch Virol Suppl 2:140-144.
Graham FO, Smiley J, Russell W og Nairn R. (1970) Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type."5. J Gen Virol 36:59-72.
Hagmeyer BM, Duyndam MC, Angel P, De Groot RP, Verlaan M, Elfferich P, Van der Eb AJ og Zantema A. (1996) Oncogene 12:1025-1032.
Horwitz MS. (2001) Adenovirus immunoregulatory genes and their cellular targets. Virology 279:1-8.
Leppard KN. (1997) E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J Gen Virol 78:2131-2138.
Leppard KN. (1998) Regulated RNA processing and RNA transport during adenovirus infection. Seminars in Virology 8:301-307.
Pilder S, Moore M, Logan J og Shenk T. (1986) The adenovirus E1B 55K transforming polypeptide modulates transport or cytoplasmic stabilization of viral and host cell mRNAs. Mol. Cell Biol 6:470-476.
Rao L, Debbas M, Sabbatini P, Hockenbery D, Korsmeyer S og White E. (1992) The adenovirus EIA proteins induce apoptosis, which is inhibited by the E1B 19-kDa and Bcl-2 proteins. Proe Nati Acad Sei USA 89:7742-7746.
Russell WC. (2000) Update on adenoviruses and its vectors. Gen Virol 81:2573-2604.
Shenk T. (1996) Adenoviridae: The viruses and their replication. In Virology, eds. Fields BN, Knipe DM and Howley PM.(Lippincott-Raven, New York) 2:2111-2148.
Van der Vliet PC. (1995) Adenovirus DNA replication. In The molecular repertoire of adenoviruses II, eds. Doerfler W and Bohm P. (Springer-Verlag, Berlin). Current Topics in Microbiology and immunology 199/11:1-30.
Yew PR and Berk AJ. (1992) Inhibition of p53 transactivation required for transformation by adenovirus early region IB protein. Nature 357:82-85.

Claims (30)

1. Rekombinant adenovirusvektor omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte vektor ytterligere omfatter en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein hvor nevnte sekvens er valgt fra gruppen bestående av a) en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype som er forskjellig fra nevnte første serotype; og b) en E4-orf6-kodende sekvens omfattende en fusjon mellom en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en andre serotype som er forskjellig fra nevnte første serotype og en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en tredje serotype, hvor nevnte tredje serotype kan være identisk med eller forskjellig fra nevnte første serotype.
2. Rekombinant adenovirusvektor ifølge krav 1, hvor nevnte første serotype av nevnte andre serotype er fra forskjellige adenovirus undergrupper.
3. Rekombinant adenovirusvektor ifølge krav 1, hvor nevnte første serotype er fra en undergruppe som er forskjellig fra undergruppe C og hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens er fra en adenovirus serotype av undergruppe C.
4. Rekombinant adenovirusvektor ifølge krav 1, hvor nevnte første serotype er fra undergruppe B og nevnte andre serotype er fra undergruppe C.
5. Rekombinant adenovirusvektor ifølge krav 1, hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens er fra adenovirus serotype 5.
6. Rekombinant adenovirusvektor ifølge ethvert av kravene 1 til 5, hvor nevnte første serotype er valgt fra gruppen bestående av adenovirus serotyper 11, 14, 16, 21, 34 og 50.
7. Rekombinant adenovirusvektor ifølge ethvert av kravene 1 til 6, ytterligere omfattende en sekvens som koder for et ikke-adenovirus-protein, polypeptid eller peptid.
8. Rekombinant adenovirusvektor ifølge krav 7, hvor nevnte ikke-adenovirale protein, polypeptid eller peptid er valgt fra gruppen bestående av: et celledøds-induserende polypeptid, en antigen determinant av en patogen organisme, et tumor-spesifikt antigen, et viralt protein, et hormon og et cytokin.
9. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant adenovirusvektor omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) fremskaffe en komplementerende celle som inneholder en ElB-55K-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype i uttrykkbar form med de nødvendige elementer av et adenovirus for å tillate sammensetning av nevnte rekombinante adenovirusvektor av nevnte komplementerende celle, hvor nevnte elementer omfatter minst enkelte strukturelle og ikke-strukturelle elementer fra et adenovirus av nevnte første serotype som er forskjellig fra nevnte andre serotype, og en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein, og som er kompatibel med nevnte uttrykkbare E1B-55K-protein i nevnte komplementerende celle; b) dyrke nevnte komplementerende celle i et medium under forhold som tillater dannelse og sammensetning av adenovirusvektoren å finne sted; og c) innhøste den rekombinante adenovirusvektoren således fremstilt fra mediet og/eller den komplementerende celle, hvor sekvensen som koder for det kompatible E4-orf6 proteinet er til stede i den rekombinante adenovirusvektoren sådan fremstilt.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens er valgt fra gruppen bestående av: a) en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype; b) en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av en tredje serotype som er forskjellig fra nevnte første og andre serotype; og c) en E4-orf6-kodende sekvens omfattende en fusjon mellom en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en tredje serotype og en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype, hvor nevnte tredje serotype kan være identisk med eller forskjellig fra nevnte første serotype.
11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 eller 10, hvor nevnte første og nevnte andre serotype er fra forskjellige undergrupper.
12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 11, hvor nevnte andre serotype er en adenovirus serotype av undergruppe C.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor nevnte andre serotype er adenovirus serotype 5.
14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 13, hvor nevnte første serotype er en adenovirus serotype av undergruppe B.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvor nevnte første serotype er valgt fra gruppen bestående av adenovirus serotyper 11, 14, 16, 21, 34, 35 og 50.
16. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 15, hvor nevnte EIB-55K-kodende sekvens er integrert i genomet av nevnte komplementerende celle.
17. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 16, hvor nevnte komplementerende celle er avledet fra en primær, diploid human celle eller en forløpercelle derav.
18. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 17, hvor nevnte komplementerende celle er avledet fra en primær human retinoblast-celle, en primær human embryonisk nyrecelle, en primær human nevronal celle eller en primær human aminocytt.
19. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 18, hvor nevnte komplementerende celle omfatter, integrert i sitt genom, en nukleinsyre som koder for minst et adenovirus ElA-protein.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, hvor nevnte nukleinsyre som koder for minst et adenovirus ElA-protein er fra en adenovirus serotype av en undergruppe som er forskjellig fra undergruppe B.
21. Fremgangsmåte ifølge krav 19, hvor nevnte nukleinsyre som koder for minst et adenovirus ElA-protein er fra en adenovirus serotype av en undergruppe som er forskjellig fra undergruppe C.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 20, hvor nevnte nukleinsyre som koder for minst et adenovirus El A-protein er fra et adenovirus serotype 5.
23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 22, hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens og nevnte ElB-55K-kodende sekvens er fra forskjellige adenovirus serotyper, og hvor nevnte forskjellige adenovirus serotyper tilhører samme adenovirus undergruppe.
24. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 22, hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens og nevnte ElB-55K-kodende sekvens er fra forskjellige adenovirus serotyper og hvor nevnte forskjellige adenovirus serotyper begge tilhører undergruppe C.
25. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 22, hvor nevnte 4-orf6-kodende sekvens og nevnte ElB-55K-kodende sekvens er fra samme adenovirus serotype.
26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, hvor nevnte E4-orf6-kodende sekvens og nevnte El-55K-kodende sekvenser er fra adenovirus serotype 5.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor nevnte komplementerende celle er en PER.C6-celle eller et derivat derav.
28. Farmasøytisk sammensetning omfattende en rekombinant adenoviral vektor ifølge ethvert av kravene 1 til 8 eller som kan fremstilles ved en fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9 til 27.
29. Sett av deler omfattende: a) en komplementerende celle for fremstilling av en rekombinant adenovirus virusvektor omfattende strukturelle og ikke-strukturelle elementer av et adenovirus av en første serotype, hvor nevnte celle inneholder en ElB-55K-kodende sekvens fra et adenovirus av en andre serotype i uttrykkbar form; og b) en eller flere replikerbare nukleinsyrevektorer omfattende alle nødvendige adenovirale elementer for å tillate sammensetning av nevnte rekombinante adenovirusvektor av nevnte komplementerende celle, hvor nevnte elementer omfatter minst enkelte strukturelle eller ikke-strukturelle elementer fra et adenovirus av nevnte første serotype som er forskjellige fra nevnte andre serotypeo og en sekvens som koder for et funksjonelt E4-orf6-protein som er kompatibelt med nevnte uttrykkbare ElB-55K-protein i nevnte komplementerende celle.
30. Sett av deler ifølge krav 29, hvor nevnte E4-orf-6-kodende sekvens er valgt fra gruppen bestående av a) en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype; b) en E4-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av en tredje serotype som er forskjellig fra nevnte første og andre serotype; og c) en E4-orf6-kodende sekvens omfattende en fusjon mellom en del av en E4-orf6-kodende sekvens fra en tredje serotype og en del av en EA-orf6-kodende sekvens fra et adenovirus av nevnte andre serotype, hvor nevnte tredje serotype kan være identisk med eller forskjellige fra nevnte første serotype.
NO20045130A 2002-04-25 2004-11-24 Innretning og fremgangsmate til fremstilling av adenovirusvektorer NO332108B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL0200280 2002-04-25
PCT/EP2003/050125 WO2003104467A1 (en) 2002-04-25 2003-04-24 Means and methods for the production of adenovirus vectors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20045130L NO20045130L (no) 2005-01-18
NO332108B1 true NO332108B1 (no) 2012-06-25

Family

ID=29728828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20045130A NO332108B1 (no) 2002-04-25 2004-11-24 Innretning og fremgangsmate til fremstilling av adenovirusvektorer

Country Status (23)

Country Link
US (2) US7468181B2 (no)
EP (1) EP1497438B1 (no)
JP (1) JP4495587B2 (no)
KR (1) KR101021387B1 (no)
CN (1) CN100497639C (no)
AT (1) ATE447037T1 (no)
AU (1) AU2003271737B2 (no)
BR (1) BR0308783A (no)
CA (1) CA2477954C (no)
DE (1) DE60329835D1 (no)
DK (1) DK1497438T3 (no)
EA (1) EA010828B1 (no)
ES (1) ES2335657T3 (no)
HK (1) HK1068371A1 (no)
IL (2) IL164803A0 (no)
MX (1) MXPA04008891A (no)
NO (1) NO332108B1 (no)
NZ (1) NZ534866A (no)
PL (1) PL215165B1 (no)
PT (1) PT1497438E (no)
SI (1) SI1497438T1 (no)
WO (1) WO2003104467A1 (no)
ZA (1) ZA200406942B (no)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0833934T4 (da) 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
AU2003271738C1 (en) 2002-04-25 2008-04-17 Crucell Holland B.V. Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
EP1539937A4 (en) * 2002-08-22 2006-07-26 Merck & Co Inc METHODS OF PROPAGATION OF ADENOVIRUS AND VIRUS SO OBTAINED
US20070036721A1 (en) * 2003-09-23 2007-02-15 Uab Resarch Foundation Methods and compositions for in vivo inflammation monitoring
EP1718738A2 (en) 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
SG159555A1 (en) 2004-11-16 2010-03-30 Crucell Holland Bv Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
ATE412737T1 (de) 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
US20090110695A1 (en) * 2006-03-27 2009-04-30 Menzo Jans Emko Havenga Compositions Comprising a Recombinant Adenovirus and an Adjuvant
CA2742474C (en) 2008-11-03 2016-05-31 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors
AU2010305768B2 (en) 2009-10-15 2015-05-14 Crucell Holland B.V. Process for adenovirus purification from high cell density cultures
MX2012004222A (es) 2009-10-15 2012-06-08 Crucell Holland Bv Metodo para purificacion de particulas de adenovirus.
EP2498791B1 (en) * 2009-11-09 2014-12-24 GenVec, Inc. Methods of propagating monkey adenoviral vectors
AU2011214262B2 (en) 2010-02-15 2015-05-21 Crucell Holland B.V. Method for the production of Ad26 adenoviral vectors
AP3390A (en) 2010-09-20 2015-08-31 Crucell Holland Bv Therapeutic vaccination against active tuberculosis
BR112013004582A2 (pt) 2010-09-27 2016-09-06 Crucell Holland Bv método para induzir uma resposta imune em um sujeito contra um antígeno de um parasita que causa a malária
PL2655604T3 (pl) 2010-12-14 2019-02-28 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Szczepionki adenowirusowe serotyp 26 i serotyp 35 przeciwko filowirusom
WO2012145509A2 (en) 2011-04-19 2012-10-26 The Research Foundation Of State University Of New York Adeno-associated-virus rep sequences, vectors, and viruses
WO2013074501A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
MY170927A (en) 2011-11-28 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention Bv Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2013231423B2 (en) 2012-03-12 2018-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
AP2014007993A0 (en) 2012-03-22 2014-10-31 Crucell Holland Bv Vaccine against RSV
EP2855685B1 (en) 2012-05-24 2017-03-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenoviral vectors for transduction of vascular tissue
AU2014236207B2 (en) * 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
PL2988780T3 (pl) 2013-04-25 2019-06-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilizowane rozpuszczalne prefuzyjne polipeptydy F RSV
WO2014202570A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Crucell Holland B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
CA2923352C (en) 2013-09-19 2022-05-03 Crucell Holland B.V. Stable adenovirus formulations
EP3188754A1 (en) 2014-09-03 2017-07-12 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing immune responses
JP6462861B2 (ja) 2014-09-03 2019-01-30 バヴァリアン ノルディック エー／エス フィロウイルス感染に対する防御免疫の誘導を目的とする方法及び組成物
KR102159626B1 (ko) 2014-09-26 2020-09-25 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물
RS58080B1 (sr) 2014-11-04 2019-02-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Terapeutske vakcine protiv hpv16
CN107466324B (zh) 2015-04-14 2022-01-14 扬森疫苗与预防公司 具有双向启动子的表达两种转基因的重组腺病毒
CN104846013B (zh) * 2015-04-15 2018-11-09 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用
KR102638978B1 (ko) 2015-07-07 2024-02-22 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 백신
US10457708B2 (en) 2015-07-07 2019-10-29 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides
BR112018003019A2 (pt) 2015-08-20 2018-09-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv vacinas terapêuticas contra hpv18
CA3001050C (en) 2015-10-06 2023-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for preventing surface-induced degradation of viruses using cyclodextrins
JP7171433B2 (ja) * 2015-10-30 2022-11-15 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ｈｅｒ－２発現固形腫瘍の処置のための組成物および方法
DK3390430T3 (da) 2015-12-15 2019-11-18 Janssen Vaccines & Prevention Bv Human immundefektvirus-antigener, vektorer, sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3013639A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
CA3018139A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
KR102506895B1 (ko) 2016-04-05 2023-03-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 용해성 융합-전 rsv f 단백질
WO2017192418A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
US11473105B2 (en) 2016-05-12 2022-10-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
KR102421049B1 (ko) 2016-05-30 2022-07-15 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 융합-전 rsv f 단백질
AU2017286375B2 (en) 2016-06-16 2019-04-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV vaccine formulation
CN109312362B (zh) 2016-06-20 2022-06-28 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
US10744196B2 (en) 2016-07-14 2020-08-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HPV vaccines
WO2018011768A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Janssen Vaccines And Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
WO2018011198A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
AU2017318689A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
IL265186B (en) 2016-09-15 2022-09-01 Janssen Vaccines Prevention B V HIV envelope proteins with trimer-stabilizing mutations
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
US11034978B2 (en) 2017-02-09 2021-06-15 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
WO2018185732A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen
JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2020-06-25 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド アルファウイルス新生抗原ベクター
CA3061278A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
WO2018210871A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
JP7216668B2 (ja) 2017-05-26 2023-02-01 エピセントアールエックス，インコーポレイテッド 導入遺伝子を保持する組換えアデノウイルス
CN110958887B (zh) 2017-06-15 2023-10-31 扬森疫苗与预防公司 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法
CN110891601A (zh) 2017-07-19 2020-03-17 扬森疫苗与预防公司 三聚体稳定性hiv包膜蛋白突变
US20190022212A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human
IL272281B2 (en) 2017-07-28 2023-04-01 Janssen Vaccines Prevention B V Methods and preparations for heterologous reprna vaccines
KR20200053518A (ko) 2017-09-15 2020-05-18 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 면역의 안전한 유도를 위한 방법
US20190083620A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
EA202091074A1 (ru) 2017-10-31 2020-07-22 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Аденовирус и его применения
SG11202003398SA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus vectors and uses thereof
MA50502A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adénovirus et utilisations associées
KR20200083510A (ko) 2017-10-31 2020-07-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 및 이의 용도
US10864263B2 (en) 2017-11-20 2020-12-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen
KR20200100745A (ko) 2017-12-19 2020-08-26 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 B형 간염 바이러스(hbv)에 대한 면역 반응 유도를 위한 방법 및 조성물
IL315325A (en) 2018-01-04 2024-10-01 Iconic Therapeutics Inc Anti-tissue-mediated antibodies, antibody-drug conjugates, and related methods
BR112021000274A2 (pt) 2018-07-20 2021-04-06 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vetor adenoviral recombinante expressando antígeno de zika com produtividade melhorada
EP3856238A1 (en) 2018-09-25 2021-08-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method of inducing an immune response against human immunodeficiency virus by co-localized administration of vaccine components
MX2021013947A (es) 2019-05-15 2021-12-14 Janssen Vaccines & Prevention Bv Tratamiento profilactico de la infeccion por virus sincitial respiratorio con una vacuna basada en adenovirus.
EP3969044A1 (en) 2019-05-15 2022-03-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
WO2020237052A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
SG11202113187WA (en) 2019-05-30 2021-12-30 Gritstone Bio Inc Modified adenoviruses
CA3156471A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. ADENOVIRUS VECTORS AND THEIR USES
US20210315986A1 (en) 2020-04-13 2021-10-14 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
MX2022014162A (es) 2020-05-11 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteínas de fusión de la proteína de la espícula del coronavirus estabilizadas.
EP4149530A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Administration of homologous adenoviral vectors
BR112022026408A2 (pt) 2020-06-29 2023-01-17 Janssen Vaccines & Prevention Bv Combinação vacinal contra infecção pelo vírus sincicial respiratório
AU2021303722A1 (en) 2020-07-06 2022-12-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized Corona virus spike protein fusion proteins
JP2023533528A (ja) 2020-07-08 2023-08-03 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｈｂｖに対するｒｎａレプリコンワクチン
CA3189238A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Transgene Treatment of immune depression
WO2022032196A2 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
CA3195177A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy disorders including limb girdle 2i (lgmd2i)
US20220118081A1 (en) 2020-10-20 2022-04-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV vaccine regimens
CN116802280B (zh) * 2021-01-21 2024-09-17 希力德株式会社 不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体及其用途
CA3211034A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv fb antigens
WO2022175479A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections
KR20230165275A (ko) 2021-04-01 2023-12-05 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 융합 전 piv3 f 단백질
WO2023020939A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023026182A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023047348A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized corona virus spike protein fusion proteins
WO2023047349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins
WO2023111725A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023110618A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023217988A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
CN117264902A (zh) * 2022-06-15 2023-12-22 上海元宋生物技术有限公司 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用
EP4338727A1 (en) 2022-09-14 2024-03-20 Roquette Freres Adenovirus formulations
WO2024061757A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Pre-fusion human piv1 f proteins
WO2024061759A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized coronavirus s proteins
WO2024074584A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593002A (en) * 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
US4487829A (en) * 1982-03-23 1984-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies against adenoviruses
US4517686A (en) * 1982-08-04 1985-05-21 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide
US4578079A (en) * 1982-08-04 1986-03-25 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
US4792525A (en) * 1982-08-04 1988-12-20 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
US4589881A (en) * 1982-08-04 1986-05-20 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
FR2602790B1 (fr) 1986-08-13 1990-06-01 Transgene Sa Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante
US6007806A (en) * 1986-08-13 1999-12-28 Transgene S.A. Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US4956281A (en) * 1987-06-03 1990-09-11 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lymphocyte function associated antigen-3
US5024939A (en) * 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA2000048A1 (en) * 1988-10-03 1990-04-03 Edward F. Plow Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand bindin g
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) * 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5223394A (en) * 1989-04-10 1993-06-29 Biogen, Inc. Recombinant dna molecule comprising lymphocyte function-associated antigen 3 phosphatidylinositol linkage signal sequence
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5332567A (en) * 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
US5436146A (en) * 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
EP0595798B1 (en) 1989-10-20 1999-03-03 Medarex, Inc. Bispecific heteroantibodies with dual effector functions
EP0496818B1 (en) 1989-10-20 1999-06-23 Trustees Of Dartmouth College MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR IgA RECEPTOR
WO1991018088A1 (en) * 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US5246921A (en) * 1990-06-26 1993-09-21 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Method for treating leukemias
GB2246779B (en) 1990-08-03 1994-08-17 Delta Biotechnology Ltd Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells
GB9101550D0 (en) 1991-01-24 1991-03-06 Mastico Robert A Antigen-presenting chimaeric protein
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
FR2681786A1 (fr) 1991-09-27 1993-04-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires.
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
IL103059A0 (en) 1991-09-30 1993-02-21 Boehringer Ingelheim Int Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
WO1994008026A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
DE69331526T2 (de) 1992-11-18 2002-10-24 Arch Development Corp., Chicago Adenovirus gelenkter gen-transfer zum herz- und glatten vaskularen muskel
GB9300686D0 (en) 1993-01-15 1993-03-03 Imp Cancer Res Tech Compounds for targeting
AU6133394A (en) 1993-02-09 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
ATE221575T1 (de) 1993-05-10 2002-08-15 Univ Michigan Gentransfer zu den pankreatischen epithelzellen
US5543328A (en) * 1993-08-13 1996-08-06 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having modified fiber proteins
WO1995006745A1 (de) 1993-09-03 1995-03-09 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vektor für leber-gentherapie
US5552311A (en) * 1993-09-14 1996-09-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy
US5534423A (en) * 1993-10-08 1996-07-09 Regents Of The University Of Michigan Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
IT1271461B (it) 1993-12-01 1997-05-28 Menarini Ricerche Sud Spa Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso.
US5443953A (en) * 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US6057299A (en) * 1994-01-13 2000-05-02 Calydon, Inc. Tissue-specific enhancer active in prostate
US5698443A (en) * 1995-06-27 1997-12-16 Calydon, Inc. Tissue specific viral vectors
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US6312699B1 (en) 1994-03-28 2001-11-06 Uab Research Foundation Ligands added to adenovirus fiber
US7252989B1 (en) 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
AU2589695A (en) 1994-05-13 1995-12-05 Chiron Corporation Compositions and methods for targeting gene delivery vehicles
US5571531A (en) 1994-05-18 1996-11-05 Mcmaster University Microparticle delivery system with a functionalized silicone bonded to the matrix
US5570975A (en) 1994-06-27 1996-11-05 Reinert, Sr.; Gary L. Metal foundation push-it and installation apparatus and method
FR2721943B1 (fr) * 1994-06-29 1996-08-02 Rhone Poulenc Rorer Sa Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutase
US5846782A (en) * 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
JPH10508743A (ja) 1994-09-09 1998-09-02 ニューロクライン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド インターロイキン−１ タイプ３レセプター
FR2724846B1 (fr) 1994-09-27 1996-12-20 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras
FR2725726B1 (fr) * 1994-10-17 1997-01-03 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
US5856152A (en) * 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
FR2727867B1 (fr) * 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
DK0833934T4 (da) * 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US6676935B2 (en) * 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
US7001764B2 (en) * 1995-06-27 2006-02-21 Cell Genesys, Inc. Compositions comprising tissue specific adenoviral vectors
US5622699A (en) * 1995-09-11 1997-04-22 La Jolla Cancer Research Foundation Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US5837511A (en) * 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
JP2001520511A (ja) * 1995-12-08 2001-10-30 ザ ユーナヴァーサティ オブ アラバマ アト バーミングハム リサーチ ファンデーション 向標的性アデノウイルス・ベクター
CA2259152C (en) * 1996-07-05 2002-02-12 Philip E. Branton Adenovirus e4 proteins for inducing cell death
US5877011A (en) * 1996-11-20 1999-03-02 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors
US5922315A (en) * 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
AU6691098A (en) * 1997-03-07 1998-09-22 Wistar Institute Of Anatomy & Biology, The Method and compositions for healing tissue defects and inducing hypervascularityin mammalian tissue
US5981275A (en) * 1997-04-14 1999-11-09 Genzyme Corporation Transgene expression system for increased persistence
US6100086A (en) * 1997-04-14 2000-08-08 Genzyme Corporation Transgene expression systems
IL132673A0 (en) 1997-05-08 2001-03-19 Genetic Therapy Inc Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins
US5849561A (en) * 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
US6287857B1 (en) * 1998-02-09 2001-09-11 Genzyme Corporation Nucleic acid delivery vehicles
US6417168B1 (en) * 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
WO1999047180A1 (en) 1998-03-20 1999-09-23 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors for targeted gene delivery
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
GB9811171D0 (en) * 1998-05-22 1998-07-22 Royal Free Hosp School Med Viral vector
US20030017138A1 (en) 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US6383794B1 (en) 1998-08-24 2002-05-07 Uab Research Foundation Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus
WO2000029573A2 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Canji, Inc. Adenoviral vectors
EP1020529B1 (en) 1998-11-20 2005-06-01 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
EP1016726A1 (en) 1998-12-30 2000-07-05 Introgene B.V. Gene therapy to promote angiogenesis
DE60045138D1 (de) * 1999-05-17 2010-12-02 Crucell Holland Bv Rekombinantes Adenovirus des Ad26-Serotyps
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) * 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
EP1067188A1 (en) 1999-07-08 2001-01-10 Introgene B.V. Infection with chimaeric adenoviruses of cells negative for the adenovirus serotype 5 Coxsacki adenovirus receptor (CAR)
US7125705B2 (en) * 2000-04-28 2006-10-24 Genzyme Corporation Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
EP1157999A1 (en) 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
US20020152553A1 (en) * 2001-03-22 2002-10-24 Wynveen Pamela Sue Travel pillow securing to bucket seats
US6844192B2 (en) * 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US20030026783A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-06 Amine Abina Method of modulating neutralizing antibodies formation in mammals, and uses thereof in gene therapy, animal transgenesis and in functional inactivation of an endogenous proteins
AU2003220237A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-29 Merck & Co., Inc. Method of inducing an enhanced immune response against hiv
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
AU2003271738C1 (en) * 2002-04-25 2008-04-17 Crucell Holland B.V. Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
EP1553983A2 (en) 2002-10-23 2005-07-20 Crucell Holland B.V. New settings for recombinant adenoviral-based vaccines
NZ539813A (en) * 2002-12-17 2008-04-30 Crucell Holland Bv A replication defective recombinant adenovirus comprising a antigenic determinant of Plasmodium falciparum wherein the antigenic determinant is SEQ ID 6
US20070010016A1 (en) * 2005-03-11 2007-01-11 Mccelland Alan Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN100497639C (zh) 2009-06-10
CA2477954C (en) 2012-07-10
EP1497438B1 (en) 2009-10-28
NO20045130L (no) 2005-01-18
EA010828B1 (ru) 2008-12-30
KR101021387B1 (ko) 2011-03-14
US7468181B2 (en) 2008-12-23
EP1497438A1 (en) 2005-01-19
US20080199917A1 (en) 2008-08-21
US7820440B2 (en) 2010-10-26
PL215165B1 (pl) 2013-10-31
ES2335657T3 (es) 2010-03-31
NZ534866A (en) 2007-04-27
DE60329835D1 (de) 2009-12-10
CA2477954A1 (en) 2003-12-18
CN1650020A (zh) 2005-08-03
EA200401424A1 (ru) 2005-04-28
ATE447037T1 (de) 2009-11-15
BR0308783A (pt) 2005-01-04
PL373304A1 (en) 2005-08-22
IL164803A0 (en) 2005-12-18
WO2003104467A1 (en) 2003-12-18
DK1497438T3 (da) 2010-01-04
HK1068371A1 (en) 2005-04-29
PT1497438E (pt) 2010-02-04
AU2003271737B2 (en) 2007-04-19
KR20040106363A (ko) 2004-12-17
JP2005523729A (ja) 2005-08-11
JP4495587B2 (ja) 2010-07-07
US20050158278A1 (en) 2005-07-21
AU2003271737A1 (en) 2003-12-22
ZA200406942B (en) 2005-11-30
SI1497438T1 (sl) 2010-03-31
MXPA04008891A (es) 2004-11-26
IL164803A (en) 2011-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2477954C (en) Means and methods for the production of adenovirus vectors
US8052967B2 (en) Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
AU2002218569B2 (en) Complementing cell lines
JP2019521679A (ja) 強力でバランスのとれた双方向性プロモーター
US20080124360A1 (en) Adenovirus particles with enhanced infectivity of dendritic cells and particles with decreased infectivity of hepatocytes
CN113774031B (zh) 一种复制型人腺病毒及其应用
Class et al. Patent application title: COMPLEMENTING CELL LINES Inventors: Ronald Vogels (Linschoten, NL) Menzo Jans Emco Havenga (Alphen A/d Rijn, NL) Majid Mehtall (Plobsheim, FR)
Cots i Rabella Development and optimization of the attB system to produce Helper-dependent Adenovirus vectors of different species

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired