EA010828B1 - Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его получения и применения - Google Patents

Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA010828B1
EA010828B1 EA200401424A EA200401424A EA010828B1 EA 010828 B1 EA010828 B1 EA 010828B1 EA 200401424 A EA200401424 A EA 200401424A EA 200401424 A EA200401424 A EA 200401424A EA 010828 B1 EA010828 B1 EA 010828B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
serotype
adenovirus
sequence encoding
ogg6
protein
Prior art date
Application number
EA200401424A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401424A1 (ru
Inventor
Роналд Вогелс
Абрахам Баут
Original Assignee
Круселл Холланд Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Круселл Холланд Б.В. filed Critical Круселл Холланд Б.В.
Publication of EA200401424A1 publication Critical patent/EA200401424A1/ru
Publication of EA010828B1 publication Critical patent/EA010828B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C12N2810/6018—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантному аденовирусному вектору и способам его применения и получения на комплементирующих линиях клеток, причем нуклеиновая кислота, кодирующая открытую рамку считывания 6 ранней области 4 (Е4-orf6), присутствует в аденовирусном векторе и продукт гена Е4-orf6 совместим с одним или несколькими продуктами из продуктов гена E1, предоставляемых комплементирующей клеткой, так что аденовирусный вектор может эффективно продуцироваться комплементирующей клеткой.

Description

Область изобретения
Изобретение относится к носителям для доставки нуклеиновых кислот и их применению, более конкретно изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам и их применению.
Предпосылки изобретения
До настоящего времени идентифицирован 51 серотип аденовирусов человека, которые подразделяют на 6 подгрупп (А, В, С, И, Е и Е) на основании свойств гемагглютинации и гомологии последовательностей (Егаиск! е! а1. 1991).
Инфекционный цикл аденовирусов делится на раннюю и позднюю фазы. В ранней фазе вирус теряет оболочку и геном транспортируется в ядро, после этого области ранних генов (Е1, Е2, Е3и Е4) становятся транскрипционно активными. Область Е1 содержит две области транскрипции: Е1А и Е1В. Е1А кодирует белки, которые принимают участие в модификации клеточного цикла хозяина и активации других областей транскрипции вируса (обзор Ки88е11 2000). Область Е1В кодирует два основных белка: Е1В19К и Е1В-55К, которые предотвращают индукцию апоптоза из-за активности белков Е1А (Као е! а1. 1992; Уе\т апб Вегк 1992; 8йеик 1996). Кроме того, белок Е1В-55К необходим в поздней фазе для избирательного транспорта вирусной мРНК и ингибирования экспрессии белков хозяина (Рббет е! а1. 1986). Е2 также делится на два субдомена: Е2А и Е2В, которые вместе кодируют три белка (ДНК-связывающий белок, вирусную полимеразу и претерминальный белок), которые все вовлечены в репликацию вирусного генома (Уап бег Убе! 1995) . Е3 не требуется для репликации ίη νί!το, но кодирует несколько белков, которые разрушают механизм защиты хозяина от вирусной инфекции (ΗοπνίΙζ 2001). Е4 содержит по меньшей мере 6 открытых рамок считывания (от!), которые кодируют белки, вовлеченные в несколько отдельных функций, связанных со сплайсингом и транспортом вирусной мРНК, транспортом мРНК клетки-хозяина, вирусной и клеточной транскрипцией и трансформацией (обзор Ьеррагб 1997).
Все поздние белки, необходимые для образования вирусных капсидов и упаковки вирусных геномов, образуются с главной поздней транскрипционной единицей (МЬТИ), которая становится полностью активной после начала репликации. Сложный процесс дифференциального сплайсинга и полиаденилирования приводит к образованию более 15 видов мРНК, которые имеют общую, состоящую из трех частей лидерную последовательность. Белки Е1В-55К, Е4-от13 и Е4-огГ6 играют центральную роль в регуляции процессинга и транспорта из ядра поздней вирусной мРНК. В случае указанного процесса Е1В-55К взаимодействует с Е4-огГ6 с образованием функционального комплекса, который стимулирует транспорт вирусных мРНК в цитоплазму, наряду с тем, что комплекс также вовлечен в ингибирование транспорта клеточных мРНК из ядра в цитоплазму (обзор в Ьеррагб 1997 и 1998).
Получение Е1-делетированных векторов, основанных на серотипах подгруппы С, Аб5 или Аб2, осуществляют в линиях клеток, комплементирующих Е1, таких как 293 (Сгайаш е! а1. 1970), 911 (Еа11аих е! а1. 1996) и РЕК.С6™ (Еа11аих е! а1. 1998; ЕСАСС № депозита 96022940). Как заявлено в АО 99/55132 и АО 01/05945, векторы и линия клеток могут быть подобраны так, чтобы избежать образования компетентных по репликации аденовирусов в результате гомологичной рекомбинации между аденовирусными последовательностями в линии клеток и векторе. Для эффективной продукции некомпетентных по репликации аденовирусов, полученных их группы С, предпочтительно используют линию клеток РЕК.С6™. Используя данную линию клеток, можно подобрать аденовирусные векторы, тем самым обеспечив продуцирование аденовирусных векторов группы С в отсутствии компетентного по репликации аденовируса (Еа11аих е! а1. 1998; патент США № 6033908). Однако векторы группы С не всегда могут быть идеальными носителями для прямых применений ίη νί\Ό. так как эффективность инфекции значительно ослаблена из-за присутствия высоких титров нейтрализующей активности у большинства людей и отсутствия достаточных количеств клеточных рецепторов (рецептор аденовируса коксаки, САК) на специфичных первичных клетках-мишенях (например, эндотелиальных клетках, гладко-мышечных клетках, синовиоцитах, моноцитах и дендритных клетках). Введение высоких количеств вирусов для того, чтобы увеличить трансдукцию, может привести к повышенной токсичности и непредсказуемому клиническому исходу вследствие изменения в нейтрализующих титрах у субъектов, подвергаемых лечению. Указанные ограничения могут быть преодолены в результате использования других серотипов аденовирусов. Например, связывающая рецептор часть фибриллы вирусов подгруппы В частности, серотипа 16), при экспрессии в векторе, основанном на Аб5, опосредовала в значительной степени повышенную инфекцию эндотелиальных клеток и гладко-мышечных клеток человека (АО 00/31285) и синовиоцитов человека (АО 00/52186). Фибрилла другого аденовируса подгруппы В, Аб35, наиболее эффективна в опосредовании инфекции моноцитов и дендритных клеток человека (АО 00/03029). Кроме того, Аб35 идентифицирован как вирус, к которому у огромного большинства людей в популяции отсутствует нейтрализующая активность (АО 00/70071).
В данной области, в общем, существует ощутимая необходимость в разработке методики, которая применима в случае более широкого спектра серотипов. Особой проблемой является отсутствие подходящих линий пакующих клеток для указанных других серотипов. Линии пакующих клеток для векторов Аб5 обычно содержат кодируемые Е1 белки, полученные из аденовируса серотипа 5. Примерами таких стандартных линий пакующих клеток являются 293, 911 и РЕК.С6™. Попытки продуцировать векторы, имеющие происхождение из других серотипов, на указанных стандартных линиях пакующих клеток ока
- 1 010828 зались трудными, если не безуспешными. Иногда наблюдается некоторая продукция в зависимости от конкретного используемого серотипа. Однако выходы рекомбинантных аденовирусных векторов, полученных из подгрупп аденовирусов, отличных от подгруппы С, продуцируемых в линиях клеток, трансформированных и иммортализованных с помощью Е1из А65, являются низкими. В публикации АЬгаЬашкеп с1 а1. (1997), повышенная очистка из бляшек Е1А-делетированного аденовирусного вектора серотипа 7 (подгруппа В) наблюдалась на клетках 293, содержащих Е4-огГ6, полученный из аденовируса серотипа 5, по сравнению с клетками 293, не содержащими последовательности Е4-огГ6 из А65. Однако при этом столкнулись с проблемой стабильности вектора, так как наблюдались неожиданные рекомбинации в очищенных из бляшек культурах. Встретилась дополнительная проблема, связанная с вирусным загрязнением аденовирусом дикого типа во время продуцирования. Более того, в случае крупномасштабного получения аденовирусов бесполезно котрансфицировать Е4-огГ6, чтобы получить титры, которые достаточны высоки для применения. Одним вариантом выращивания таких аденовирусов является снабжение клеток геном Е4-огГ6, стабильно интегрированным в геном линии комплементирующих/пакующих клеток. Такие клетки описаны в данной области (например, \¥О 96/22378). Недостатком данной системы является тот факт, что необходимо создавать новые стабильные линии клеток и необходимо осуществлять многочисленные раунды селекции перед тем, как будут созданы стабильные и соответствующие клетки. Указанный процесс является сложным и трудоемким. В общем можно констатировать, что показано, что образование и размножение аденовирусов других серотипов, отличных от серотипа 5 (подгруппа С), таких как вирусы подгруппы В, трудно осуществить на клетках, комплементирующих А65. Как описано заявителями в \УО 00/70071, рекомбинантные вирусы, основанные на вирусе А635 подгруппы В, можно получить с помощью контрансфекции экспрессирующей конструкции, содержащей последовательности ранней области-1 А635 (А635-Е1). Кроме того, показано, что основанные на А635 вирусы, которые делетированы только по последовательностям Е1А, но не по Е1В, эффективно реплицируются в клетках РЕК.С6, свидетельствуя о том, что белки Е1А А65 способны комплементировать функции А635Е1А (международная заявка на выдачу патента авторов данного изобретения РСТ/ИЕ01/00824, еще не опубликована). Кроме того, эксперименты показывают, что отсутствие А635-Е1В приводит к низким выходам на клетках, комплементирующих А65. В \УО 00/70071 также заявлены линии клеток для продуцирования Е1-делетированных аденовирусных векторов, не относящихся к группе С, с помощью дополнительной модификации клеточных линий, которые способны комплементировать аденовирус серотипа 5. В \УО 00/70071 кроме того высказано предложение о том, что следует разработать новые линии клеток, несущие последовательности А635-Е1, для комплементации рекомбинантных аденовирусных векторов серотипа 35, не: содержащих области Е1 (см. также международную заявку на выдачу патента авторов данного изобретения РСТ/ИЪ01/00824). Однако как обсуждалось выше, если требуется применить конкретный серотип для конкретных нужд, то пришлось бы создавать новую линию клеток для каждого конкретного серотипа, или пришлось бы модифицировать имеющиеся линии клеток, которые могут комплементировать аденовирус серотипа 5, для комплементации представляющего интерес серотипа. Очевидно, было бы выгодно применять созданные линии клеток, доступные в данной области, и не модифицировать указанные линии, а использовать их для продуцирования всех других серотипов, не являющихся серотипом А65, применяя разработанные и эффективные способы, известные в данной области. Сделано заключение, что до настоящего изобретения в данной области не имелось гибкой и надлежащей платформы для получения, которая позволяет получать значительные выходы аденовирусных серотипов, которые отличаются от серотипов подгруппы С.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 является схематичным изображением плазмиды рАМТ.ОгГ6.Нудго (ЕСАСС № депозита Р02041226). Для ясности, прописная буква Ό означает дельта (Δ).
Фиг. 2 является схематичным изображением плазмиды рАб35АМТ.ОгГ6. Для ясности, прописная буква Ό означает дельта (Δ).
Фиг. 3 является схематичным изображением рИС.35-5Е9.
Фиг. 4 является изображением стадий клонирования, приводящих к рИС.35-5Е4.
Фиг. 5 является схематичным изображением рВг.Аб35.РКп.
Фиг. 6 является схематичным изображением рВг.Аб35.РК5Е4 (ЕСАСС № депозита Р02041229).
Фиг. 7 является схематичным изображением р^Е.Аб35.р1Х-г1ТК.5Е4.
Фиг. 8 является схематичным изображением рСК.8Спр1Атр.ИР1-Исо1К..
Фиг. 9 является схематичным изображением рСК.8Спр1Атр.Исо1Е-ИК2 .
Фиг. 10 является схематичным изображением рСК.ИЕ1-ИК2.
На фиг. 11 показано выравнивание между аминокислотной последовательностью Е4-огГ6 аденовируса серотипа 5 (8ЕО ΙΌ ИО: 21; верхняя последовательность), аминокислотной последовательностью белка Е4-огГ6 из аденовируса серотипа 5, клонированного в остове А635 (8ЕО ΙΌ ИО: 21; средняя последовательность; ИВ. идентичная Е4-огГ6 А65, верхней последовательности), которая получена в результате определения порядка нуклеотидов, и аминокислотной последовательностью белка Е4-огГ6 аденовируса серотипа 35 (8ЕО Ш ИО: 22; нижняя последовательность), свидетельствующее о том, что полный
- 2 010828 фрагмент, кодирующий белок Е4-огГ6 в остове аденовируса серотипа 35, был заменен фрагментом, кодирующим белок Е4-огГ6 аденовируса серотипа 5.
На фиг. 12 показано выравнивание между аминокислотной последовательностью белка Е4-огГ6/7 аденовируса серотипа 5 (ЪЕЦ Ш N0: 23; верхняя последовательность), аминокислотной последовательностью слитого белка Е4-огГ6/7, частично кодируемого фрагментом Е4-огГ6/7 аденовируса серотипа 5, заменяющим соответствующую часть фрагмента Е4-огГ6/7 аденовируса серотипа 35 в остове аденовируса серотипа 35 (8ЕС Ш N0: 24; средняя последовательность) и аминокислотной последовательностью белка Е4-огГ6/7 аденовируса серотипа 35 (ЗЕЦ Ш N0: 25; нижняя последовательность), свидетельствующее, что последовательность огГ6/7 является частично химерной, при этом слияние осуществлено примерно у остатка лизина (К) в положении 138. Для ясности, обозначение огГ6+7 следует читать как открытая рамка считывания огГ6/7, которая является отдельной открытой рамкой считывания в области Е4 аденовируса помимо огГ6 и огГ7, причем обозначение является хорошо известным специалистам в данной области.
Фиг. 13 является схематичным изображением рВг.Аб35.РК.50гГ6 (ЕСАСС № депозита Р02041227).
Фиг. 14 является схематичным изображением рАЕ.Аб35.р1Х-г1ТК50гГ6.
Фиг. 15 является схематичным изображением рВг.Аб35.РКпАЕ3. Для ясности, прописная буква Ό означает дельта (Δ).
Фиг. 16 является схематичным изображением рВг.ЛФ35АЕ3.РЯ5Е4. Для ясности, прописная буква Ό означает дельта (Δ).
Фиг. 17 является схематичным изображением рВг.А035АЕ3.РР50гГ6. Для ясности, прописная буква Ό означает дельта (Δ).
На фиг. 18 показана система для продуцирования рекомбинантных аденовирусных частиц в таких клетках, как РЕКС6, посредством события двойной гомологичной рекомбинации.
Фиг. 19 является схематичным изображением рАЕ.А035.р1Х-ЕсоРУ.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам, содержащим структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный вектор кроме того содержит последовательность, кодирующую белок Е4-огГ6, где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из: а) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа; Ь) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа путем делеции, мутации, добавления и/или замены в одном или нескольких кодонах; и с) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа, и частью последовательности, кодирующей Е4огГ6, полученной из аденовируса третьего серотипа, при этом указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него.
Изобретение кроме того относится к способам получения таких рекомбинантных аденовирусных векторов, содержащих структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный способ включает в себя стадии: а) обеспечения комплементирующей клетки, несущей последовательность, кодирующую Е1В-55К, полученную из аденовируса второго серотипа в экспрессируемой форме, необходимыми элементами аденовируса, такими как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора указанной комплементирующей клеткой, при этом указанные элементы содержат по меньшей мере некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательностью, кодирующей функциональный белок Е4-огГ6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, который совместим с указанным экспрессируемым белком Е1В-55К в указанной комплементирующей клетке; Ь) культивирования указанной комплементирующей клетки в среде в условиях, позволяющих происходить продуцированию и сборке аденовирусного вектора; и с) сбора рекомбинантного аденовирусного вектора, полученного таким образом, из среды и/или комплементирующей клетки, при этом последовательность, кодирующая совместимый белок Е4-огГ6, присутствует в полученном таким образом рекомбинантном аденовирусном векторе.
Изобретение кроме того относится к фармацевтическим композициям, содержащим аденовирусные векторы согласно изобретению, и лечению индивидуумов с использованием аденовирусных векторов, предлагаемых в данном изобретении. Изобретение также относится к наборам частей, содержащим клеточные линии и аденовирусные векторы, предлагаемые в изобретении, для осуществления способов, предлагаемых в изобретении.
Подробное описание
В данном изобретении предлагаются способы и средства для решения некоторых трудностей, связанных с ослабленной комплементацией аденовирусных векторов, не относящихся к группе С, в А65пакующих/комплементирующих клетках. Хотя в линиях клеток, комплементирующих А65, присутствует экспрессия функционального А65Е1В-55К, было обнаружено, что могут быть получены только очень
- 3 010828 низкие титры аденовирусных векторов в том случае, когда остов аденовируса имеет происхождение из аденовируса, не относящегося к группе С; полученные данные свидетельствуют о связанной с серотипом специфичности взаимодействия Е1В-55К с другим (вирусным) белком. В данном описании заявлено, что указанную зависимость от серотипа можно обойти, предоставляя белком Е4-огГб, совместимый с белком Е1В-55К, предоставляемым линий комплементирующих клеток. Как обсуждается в данном описании, Е1В-55К и Е4-огГб образуют комплекс, который участвует в ингибировании транспорта клеточных мРНК из ядра в цитоплазму, при этом комплекс также вовлечен в стимулирование транспорта вирусных мРНК из ядра в цитоплазму. Авторами данного изобретения обнаружено, что для правильной комплементации вирусных векторов в пакующих клетках требуется присутствие продуктов генов Е1В-55К Е4-огГб, которые являются совместимыми. Пакующие клетки также называют комплементирующими клетками, если клетки содержат определенные последовательности, кодирующие белки, которые комплементируют функции, не предоставляемые вектором, который должен быть упакован. Следовательно, совместимые в используемом в данном описании смысле означает, что в случае комплекса с имеющимися генным продуктом Е1В-55К возможно образование функционального комплекса с имеющимся генным продуктом Е4-огГб в том смысле, что данный белковый комплекс поддерживает репликацию, размножение и/или упаковку вируса на уровне, который сравним с ситуацией в случае дикого типа или который сравним с ситуацией, обнаруженной в том случае, когда рекомбинантный аденовирусный вектор серотипа 5 получают в такой линии клеток, комплементирующих Л65. как 293 или РЕВ.Сб. Репликация вектора в пакующих клетках эффективна, если в течение периода продуцирования, в ходе которого образуется вектор, клетка содержит по меньшей мере белок Е1В-55К и белок Е4-огГб, которые совместимы. Предпочтительно последовательности Е1В-55К и Е4-огГб являются последовательностями из аденовирусов, относящихся к одной и той же подгруппе аденовирусов (такой как А, В, С, Ό, Е или Р) . Более предпочтительно последовательности Е1В-55К и Е4-огГб происходят из одного и того же серотипа. Так как в данной области имеются созданные линии клеток, которые способны поддерживать рост аденовирусов подгруппы С, таких как аденовирусов серотипа 5, еще более предпочтительно, чтобы гены Е1В-55К и Е4-огГб были получены из аденовируса серотипа 5. Как будет понятно специалисту, совместимость можно определить в тестах или анализах комплементации, по существу известных специалистам в области получения аденовирусных векторов. Специалисту в данной области также будет понятно, что данное изобретение также можно применять для получения любого аденовирусного серотипа в любой комплементирующей линии клеток, при условии, что белки Е1В-55К и Е4-огГб являются совместимыми.
Кроме того, было обнаружено, что продукт гена Е4-огГб сочетающийся с Е1В в комплементирующей линии клеток, может быть предоставлен аденовирусным вектором при замене Е4-огГб в выбранном аденовирусном векторе последовательностью, кодирующей Е4-огГб, которая совместима с геном Е1В, присутствующем в пакующей линии клеток. Неожиданно обнаружено, что данная модификация не оказывает сильного влияния на стабильность, репликацию, упаковку, сборку и продуцирование вектора.
Особым аспектом изобретения является то, что теперь можно эффективно продуцировать аденовирусы других серотипов, отличных от серотипов подгруппы С, на линиях клеток, обычно применяемых для получения аденовируса серотипа 5 или другого серотипа из подгруппы С, такого как серотип 1, 2 и б. В данном изобретении предлагаются способы получения аденовирусов, не относящихся к группе С, без необходимости отдельно обеспечивать комплементирующую (пакующую) клетку Е4-огГб, так как последовательность Е4-огГб, которая совместима с комплементирующей последовательностью Е1В-55К, включают в остов аденовируса.
В данном изобретении предлагается рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный вектор кроме того содержит последовательность, кодирующую функциональный белок Е4-огГб или его функциональную часть, производное и/или аналог, где указанная последовательность выбрана из группы состоящей из: а) последовательности, кодирующей Е4-огГб, полученной из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа; Ь) последовательности, кодирующей Е4-огГб, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и с) последовательности, кодирующей Е4-огГб, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей Е4-огГб, полученной из второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа, и частью последовательности, кодирующей Е4-огГб, полученной из третьего серотипа, при этом, указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него. В одном варианте данное изобретение относится к рекомбинантному аденовирусному вектору согласно изобретению, причем указанный первый серотип и указанный второй серотип относятся к разным подгруппам аденовирусов. В предпочтительном варианте предлагается рекомбинантный аденовирусный вектор согласно изобретению, причем указанный первый серотип относится к другой подгруппе, отличной от подгруппы С, и указанная последовательность, кодирующая Е4-огГб, получена из аденовируса серотипа подгруппы С. Более предпочтительным является рекомбинантный аденовирус согласно изобретению, где указанный первый серотип относится к подгруппе В, а указанный второй серотип относится к подгруппе С. Еще более предпочтительно - указанная последовательность, кодирующая Е4-огГб, получена из аденовируса серотипа 5.
- 4 010828
Специалистам в данной области известно, что у людей циркулируют различные уровни нейтрализующих антител, которые направлены против различных серотипов. Обнаружено, что некоторые серотипы аденовирусов сталкиваются с высокими титрами таких нейтрализующих антител и что многие люди в разных популяциях несут нейтрализующие антитела против таких серотипов. Также обнаружено, что некоторые серотипы нейтрализовались только в малой части образцов (XVО 00/70071). По-видимому, некоторые серотипы из подгруппы В нейтрализовались только в небольшой группе образцов. Таким образом, в предпочтительном варианте данного изобретения предлагаются рекомбинантные аденовирусные векторы согласно изобретению, где указанный первый серотип выбран из группы, состоящей из серотипов аденовирусов 11, 14, 16, 21, 34, 35 и 50. В высокой степени предпочтительны рекомбинантные аденовирусные векторы в случае, когда указанный первый серотип является серотипом 11 или 35, при этом они встречаются с нейтрализующими антителами только в небольшом проценте тестируемых образцов.
Векторы согласно данному изобретению можно применять в различных направлениях, таких как генная терапия, функциональная геномика, противоопухолевая вакцинация и/или противовирусная вакцинация. Для этого необходимо, чтобы аденовирусный вектор функционировал как носитель для доставки генов, в котором ненативный ген включен в аденовирусный геном. Затем аденовирусная частица может быть специфично направлена к представляющим интерес клеткам-мишеням; аденовирус связывается с такой специфичной клеткой либо посредством связывания капсид-рецептор, либо другими способами и доставляет трансген. Направление аденовируса к мишени можно осуществить многими различными способами. Специалистам в области направления к мишени аденовирусных векторов будут известны все различные возможности, которые используются для доставки аденовирусных векторов к представляющим интерес клеткам. Такие возможности включают, но не ограничены указанным, изменения капсида (модификации фибриллы, гексона и/или пентона, такие как делеции, перестановки между фибриллами различных серотипов и присоединения пептидов и/или других связывающих остатков), при этом получают химерные фибриллы, которые узнают рецептор, присутствующий на представляющей интерес клетке, или используют связывание пентонного основания. Другими возможностями являются связывание направляющих к мишени остатков с белками капсида, при этом, например, связывающие пептиды, известные и сильно связывающие белки или антитела или их части связывают с белками капсида, чтобы осуществить специфичное направление к мишени. Все указанные векторы можно получить, используя способы и средства, предлагаемые в данном изобретении. Таким образом, в данном изобретении также заявлены рекомбинантные аденовирусные векторы согласно изобретению, кроме того содержащие последовательность, кодирующую неаденовирусный белок, полипептид или пептид. Такие последовательности могут присутствовать в различных положениях в остове аденовируса, но предпочтительно расположены в области Е1, которая отсутствует в рекомбинантных аденовирусных векторах согласно изобретению. Область Е1 комплементируется элементами (комплементации), присутствующими в комплементирующих клетках. Направление промотора, трансгена и других регуляторных последовательностей может быть ориентировано к левому, а также к правому инвертированному концевому повтору.
Данное изобретение также можно использовать для получения вирусных векторов, основанных на аденовирусе и/или на других вирусах, таких как аденоассоциированный вирус (ААУ), при чем такая комбинация, как химерный вирус А6-ААУ, может быть интегрирована в геном клетки-хозяина. В данной области известно несколько способов создания интегрирующихся аденовирусов. В общем, изобретение также применимо для получения форм аденовирусов, которые могут (специфично или неспецифично) интегрироваться.
Как указано, несколько неаденовирусных трансгенов можно клонировать в рекомбинантных аденовирусных векторах согласно данному изобретению. Указанные трансгены включают не только регуляторные последовательности нуклеиновых кислот, такие как энхансеры, промоторы (например, сильные неаденовирусные промоторы, такие как промотор цитомегаловируса, промотор 8У40 и промотор Я8У) и сигналы полиаденилирования, но также гетерологичные гены для терапевтических целей. Таким образом, в одном аспекте изобретения предлагаются рекомбинантные аденовирусные векторы согласно изобретению, где указанный неаденовирусный белок, полипептид или пептид выбран из группы, состоящей из полипептида, индуцирующего гибель клетки, антигенной детерминанты патогенного организма, антигена, специфичного для опухоли, вирусного белка, гормона и цитокина. Примерами патогенных организмов являются, но не ограничены указанным, бактерии, вирусы и грибы. Неограничивающими примерами неаденовирусных факторов, белков, полипептидов и пептидов являются транскрипционные факторы, внутриклеточные сигнальные белки, фосфатазы, киназы, факторы, ингибирующие апоптоз, антагонисты рецепторов, растворимые формы связанных с мембранами рецепторов, ингибиторы РНК, антисмысловые РНК, факторы-приманки, рибозимы и более конкретно, тимидинкиназа, эритропоэтин, новый стимулирующий эритропоэз белок (ΝΕ8Ρ), 1Ь3, сеЫО8, гамма-интерферон и др100. Неаденовирусные вирусные белки можно клонировать в рекомбинантных аденовирусных векторах, приготовленных с помощью способов и средств согласно данному изобретению в целях вакцинации. Такие вирусные белки включают, но не ограничены указанным, дад, ро1, еиу, пеГ и т.д. для Н1У-вакцин, белки Е6 и Е7 для вакцин против вируса папилломы человека, белки циркумспорозоита из простейших Р1а8шобшт для вакцин против малярии, компоненты ротавируса для ротавирусных вакцин, белки эбола для вакцин против эбо
- 5 010828 ла, продукты генов Р и С из респираторно-синцитиального вируса (К.8У) для КБУ-вакцин. НА и ΝΑ для вакцин против гриппа и т.д.
Рекомбинантные аденовирусы согласно данному изобретению содержат структурные и неструктурные элементы. Примерами структурных элементов являются гены, кодирующие белки капсида, такие как гены фибриллы, гексона и пентона, а также продукты данных генов. Примерами неструктурных элементов являются ранние гены, которые экспрессируются во время инфицирования клетки и которые подвергаются понижающей регуляции, когда продолжается инфекционный цикл. Другими примерами неструктурных элементов являются гены, кодирующие белки, активные во время репликации, такие как ро1 и рТР. Следует понимать, что рекомбинантные аденовирусные векторы могут содержать структурные и неструктурные элементы, полученные из различных серотипов. Примерами таких векторов, например, являются аденовирусные частицы, несущие химерные фибриллы (см. заявку на выдачу патента авторов данного изобретения XVО 00/03029). Методы молекулярной биологии сделали возможным конструирование бесконечного числа комбинаций последовательностей нуклеиновых кислот. Специалисту в области молекулярной биологии понятно, что комбинирование различных последовательностей можно осуществить с использованием различных методов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), а также прямое субклонирование. Многие последовательности, используемые в данном изобретении, а также последовательности и химерные конструкции, известные в данной области, получены из аденовирусов разных серотипов. Следовательно получены в используемом в данном описании смысле означает, что такие комбинации последовательностей могут быть получены с помощью прямого клонирования из последовательностей дикого типа, полученных из вирусов дикого типа, наряду с тем, например, что они также могут быть получены с помощью ПЦР с использованием различных частей ДНК в качестве матрицы. Это означает также, что такие последовательности могут быть в форме дикого типа, а также в измененной форме. Другой вариант достижения такого же результата осуществляют посредством комбинирования синтетической ДНК. Следует понимать, что получены не означает только прямое клонирование ДНК дикого типа. Специалисту в данной области также будут известны возможности молекулярной биологии для получения мутантных форм определенного участка нуклеиновой кислоты. Указанные мутации могут придавать различную функциональность, но они также могут быть молчащими в том отношении, что некоторые мутации не изменяют функциональность данного конкретного участка ДНК и кодируемого им белка. Следовательно термины ее функциональная часть, производное и/или аналог следует понимать как эквиваленты нуклеиновой кислоты, с которой они являются родственными Специалисту в данной области будет понятен тот факт, что некоторые делеции, замены, (точечные) мутации, присоединения и т.д. кроме того могут приводить к нуклеиновой кислоте, которая имеет сходную функцию, что и исходная нуклеиновая кислота. Таким образом, следует понимать, что такие изменения, которые существенно не изменяют функциональность белков, таких как продукты генов Е4-огГ6 и Е1В-55К, входят в объем данного изобретения.
Некоторые изменения нуклеиновой кислоты, такие как делеция, мутация, добавление и/или замена в одном или нескольких кодонах также могут существенно изменять структуру и/или функциональность кодируемого генного продукта. Таким образом, данное изобретение также относится к последовательностям, кодирующим Е4-огГ6, которые получены из аденовируса того же серотипа, что и остов, несущим гены, например, структурные и неструктурные элементы, но при этом последовательность, кодирующая Е4-огГ6, мутирована так, что она стала совместимой с белками Е1 (такими как продукт гена Е1В-55К), присутствующими в комплементирующей клетке, в которой необходимо продуцировать аденовирусный вектор. Кодон может быть изменен полностью, чтобы изменить кодируемую аминокислоту, а также он может быть мутирован частично, чтобы изменить кодируемую аминокислоту. Делеции нуклеиновых кислот могут приводить к утрате одной или нескольких кодируемых аминокислот; наряду с этим они могут также приводить к сдвигам рамки считывания. Данное изобретение также относится к последовательностям Е4-огГ6, присутствующим в аденовирусной нуклеиновой кислоте, которые содержат различные части, полученные из разных серотипов, в которых домены, которые делают белок функциональным при совместимости, можно использовать из одного серотипа, тогда как остаток последовательности Е4огГ6 или его часть получают из другого (не)родственного серотипа (например, из той же подгруппы, из других подгрупп или из других видов, или их комбинации). Следовательно, в объем данного изобретения также входит применение слитых белков Е4-огГ6, которые являются совместимыми. Такой слитый белок может быть продуктом нескольких частей нуклеиновой кислоты.
Специалисту в данной области будет известен тот факт, что в данной области кроме всех аденовирусов человека идентифицировано множество аденовирусов других организмов, отличных от человека. Очевидно аденовирусы, не являющиеся аденовирусами человека, также можно применять для достижения такого же результата, который заявлен в данном изобретении. Специалисту будет понятно, что совместимость между Е1В-55К и Е4-огГ6 не может быть ограничена аденовирусами человека и что элементы аденовирусов, специфичных для других видов, также могут быть совместимыми. Таким образом, другой аспект изобретения также состоит в том, что аденовирусы других организмов, отличных от человека, можно получать с высокими титрами на известных линиях пакующих клеток, доступных в данной области, при условии, что продукты генов Е1В-55К и Е4-огГ6 являются совместимыми. Неограничивающими
- 6 010828 примерами аденовирусов других организмов, отличных от человека, которые можно получать с использованием способов и средств согласно данному изобретению, являются аденовирусы собаки, быка, овцы, лягушки, свиньи, лошади, обезьяны и птиц. Следовательно, серотипы в используемом в данном описании смысле выходят за пределы ограниченных видом серотипов. Если, например, продукт гена Е4-огГ6 аденовируса обезьян совместим с Е1В-55К, предоставляемым пакующей клеткой, то данная комбинация входит в объем данного изобретения. Также в том случае, когда применяют слияния между разными серотипами или между последовательностями Е4-огГ6. полученными, например, из аденовируса человека и птицы, которые являются совместимыми с геном Е1В пакующей клетки, то данная конкретная комбинация также входит в объем данного изобретения.
Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный способ включает в себя стадии: а) обеспечения комплементирующей клетки, несущей последовательность, кодирующую Е1В-55К, или ее функциональную часть, производное и/или аналог, полученные из аденовируса второго серотипа в экспрессируемой форме, необходимыми элементами аденовируса, такими как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора указанной комплементирующей клеткой, при этом указанные элементы содержат по меньшей мере некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательностью, кодирующей функциональный белок Е4-огГ6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, который совместим с указанным экспрессируемым белком Е1В-55К в указанной комплементирующей клетке; Ь) культивирования указанной комплементирующей клетки в среде в условиях, позволяющих происходить продуцированию и сборке аденовирусного вектора; и с) сбора рекомбинантного аденовирусного вектора, полученного таким образом, из среды и/или комплементирующей клетки, при этом последовательность, кодирующая совместимый белок Е4огГ6, присутствует в полученном таким образом рекомбинантном аденовирусном векторе.
В одном аспекте изобретения предлагается способ согласно изобретению, при котором указанная последовательность, кодирующая Е4-огГ6, выбрана из группы, состоящей из: ί) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа; ίί) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса третьего серотипа, отличного от указанного первого и второго серотипа; ίίί) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и ίν) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из третьего серотипа, и частью последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа, при этом указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или быть отличным от него. В предпочтительном варианте указанные первый и указанный второй серотипы относятся к разным подгруппам. В более предпочтительном варианте указанный второй серотип является серотипом аденовируса подгруппы С. В еще более предпочтительном варианте указанный второй серотип является серотипом аденовируса 5. В другом конкретном аспекте изобретения указанный первый серотип является серотипом аденовируса подгруппы В. Предпочтительно указанный первый серотип выбран из группы, состоящей из серотипов аденовирусов 11, 14, 16, 21, 34, 35 и 50.
Существует несколько пакующих клеток, известных в данной области, которые используют для комплементации рекомбинантных аденовирусных векторов и продуцирования, сборки и упаковки аденовирусных частиц. Неограничивающими примерами таких линий клеток являются клетки НЕК-293, 911 и РЕК..С6™. Предпочтительно использование линий клеток, которые уже были испытаны в отношении доставки высоких титров аденовирусных культур. Такие линии клеток стабильным образом экспрессируют белки Е1, следовательно предпочтительным аспектом изобретения является применение линий клеток и способов в том случае, когда указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, интегрирована в геном указанной комплементирующей клетки. Более предпочтительными являются комплементирующие клетки, которые получены из первичной диплоидной клетки человека или ее клеткипредшественника. Еще более предпочтительно указанную комплементирующую клетку получают из первичной клетки ретинобласта человека, первичной клетки эмбриональной почки человека, первичной нейронной клетки человека или первичного амниоцита человека. В высокой степени предпочтительным является применение комплементирующей клетки в способах, предлагаемых в данном изобретении, когда указанная комплементирующая клетка является клеткой РЕР.С6 или ее производной. Клетки РЕР.С6 хорошо известны в данной области, как клетки, которые не приводят к появлению компетентного по репликации аденовируса, когда используют аденовирусную ДНК, которая не имеет перекрывания с нуклеиновой кислотой, предоставляемой клетками. Во многих аденовирусных векторах, используемых в данном области, отсутствует область Е1, следовательно в одном аспекте изобретения указанная комплементирующая клетка содержит интегрированную в ее геном нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере аденовирусный белок Е1А. Предпочтительно указанная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере один аденовирусный белок Е1А, получена из аденовирусного серотипа, относящегося к подгруппе, отличной от подгруппы В. Более предпочтительно указанная нуклеиновая кислота,
- 7 010828 кодирующая по меньшей мере один аденовирусный белок Е1А, получена из аденовируса серотипа подгруппы С. Высоко предпочтительными являются варианты, в которых указанная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере один аденовирусный белок Е1А, получена из аденовируса серотипа 5. В другом варианте изобретения изобретение относится к способу, при котором указанная последовательность, кодирующая Е4-ог£6, и указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, получены из аденовирусов разных серотипов и при котором указанные разные серотипы аденовирусов являются членами одной и той же подгруппы аденовирусов. Предпочтительно указанная последовательность, кодирующая Е4-огГ6. и указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, получены из аденовирусов разных серотипов, и при этом указанные разные серотипы аденовирусов оба являются членами подгруппы С. Более предпочтительно указанная последовательность, кодирующая Е4-огГ6, и указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, получены из одного и того же серотипа аденовирусов. Высоко предпочтительными являются способы, при которых указанная последовательность, кодирующая Е4-огГ6, и указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, получены из аденовируса серотипа 5.
Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный аденовирусный вектср согласно изобретению или получаемой способом, предлагаемом в данном изобретении. Фармацевтическая композиция кроме того содержит приемлемый фармацевтический носитель, обычно применяемый специалистами в области приготовления фармацевтических препаратов. Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения организма человека, включающему в себя введение в организм человека рекомбинантного аденовирусного вектора согласно изобретению или фармацевтической композиции, предлагаемой в данном изобретении. Изобретение также относится к способам, которыми можно получить аденовирусные векторы, используя надлежащие комплементирующие/пакующие клетки и представляющий интерес аденовирусный вектор. Для эффективного процесса продуцирования полезно использовать правильно выбранные клетки и соответствующий аденовирусный вектор. Следовательно, изобретение также относится к набору частей, содержащему: а) комплементирующую клетку для продуцирования рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанная клетка несет последовательность, кодирующую Е1В-55К, или ее функциональную часть, производное и/или аналог, полученную из аденовируса второго серотипа, в экспрессируемой форме; и Ь) одну или несколько реплицируемых векторных нуклеиновых кислот, для всех из которых требуются аденовирусные элементы, такие как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора указанной комплементирующей клеткой, при этом указанные элементы содержат по меньшей мере некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного указанного второго серотипа, и последовательность, кодирующую функциональный белок Е4-огГ6 или его функциональную часть, производное или аналог, который совместима с указанным экспрессируемым белком Е1В-55К в указанной комплементирующей клетке. Предпочтительно используют набор частей, где указанная последовательность, кодирующая Е4-огГ6, выбрана из группы, состоящей из: а) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа; Ь) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса третьего серотипа, отличного от указанного первого и второго серотипа, с) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и б) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из третьего серотипа, и частью последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа, при этом указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него.
Изобретение особенно применимо для репликации Е1-делетированных химерных аденовирусов, которые получены почти полностью из серотипа, отличного от аденовируса 5. Такие векторы нуждаются только в том, чтобы они были снабжены нуклеиновой кислотой, кодирующей Е4-огГ6 аденовируса 5, или его функциональную часть, производное и/или аналог. После обеспечения указанного вектор может эффективно реплицироваться на стандартных комплементирующих Е1 аденовируса 5 пакующих линиях клеток. Стабильность векторов повышена, и векторы могут быть комплементированы в отношении делеций как в Е1А, так и Е1В. Обеспечивая такие векторы нуклеиновой кислотой, кодирующей Е4-ог£6 аденовируса, можно обеспечить возможность эффективной очистки из бляшек и хорошие выходы в отсутствии дополнительной проблемы, связанной с загрязнением диким типом, при выращивании на клетках 293 или 911. Конечно в РЕК.С6 загрязнение аденовирусом дикого типа, также может быть предотвращено другими способами.
Дополнительное преимущество рекомбинантного вектора согласно изобретению состоит в том, что нет необходимости в создании специальных линий клеток, экспрессирующих Е4-ог£6 аденовируса с нуклеиновой кислоты, интегрированной в геном. Хотя такие линии клеток существуют, их трудно поддерживать в хорошем состоянии. По меньшей мере частично это является следствием того факта, что со все большим числом чужеродных генов, встроенных в геном линии клеток, трудно сохранять стабильность всех чужеродных последовательностей (или их экспрессию). В данном изобретении обнаружено, что по меньшей мере некоторые из проблем, связанные с низкими выходами векторов, основанных на аденови
- 8 010828 русах, не относящихся к серотипу 5, и стабильностью аденовирусных векторов серотипов из подгруппы В, таких как аденовирусов серотипов 7, 11 и 35 на линиях клеток, пакующих аденовирусы серотипа 5, можно преодолеть с помощью рекомбинантного аденовирусного вектора согласно изобретению.
Примеры
Пример 1. Образование Е1-делетированных Аб35-вирусов, экспрессирующих Е4-ОгГ6 Лб5. на линии клеток, комплементирующих Л65.
Секвенирование генома аденовируса серотипа 35, а также конструирование основанной на плазмиде векторной системы и создание рекомбинантных основанных на Л635 вирусов подробно описаны в АО 00/70071.
Клонирование последовательности, кодирующей Аб5-Е4-отГ6, в ρΆάΆρΐ35ΙΡ1 (ЕСАСС № депозита Р02041228, подробности клонирования данной плазмиды см. в АО 00/70071) осуществляли следующим образом. Плазмиду расщепляли ΝΙκΙ и ΑντΙΙ и дефосфорилировали фосфатазой кишечника теленка (Νο\ν Епд1апс. Вю1аЬ§). Расщепленную ДНК выделяли из геля, используя набор ОепеС1еап. Плазмиду рАМТ.ОтГ6.Нудто (фиг. 1, ЕСАСС № депозита Р02041226) расщепляли ΝΙκΙ и затем частично расщепляли ХЬа1. После разделения полученных в результате полос в геле из геля очищали фрагмент длиной 1350 п.о., соответствующий промотору ΔΜΤ, связанному с последовательностью Е4-огГ6. Затем оба выделенных фрагмента лигировали и ими трансформировали электрокомпетентные клетки ΌΗ10Β (ΙπνίίΓΟдеп/ЕИеТесйпо1од1е8), после этого отбирали колонию со вставкой в правильной ориентации по отношению к поли (А)-сигналу 8У40 для крупномасштабного получения ДНК. В результате получена конструкция рАД35АМТ.ОгГ6 (фиг. 2), которая содержит последовательность, кодирующую Е4-огГ6 А65, функционально связанную с мутантным промотором металлотионеина (ΔΜΤ). Промотор ΔΜΤ описан Надтеуег е! а1. (1996). Последовательность Е4-огГ6 А65 соответствует нуклеотидам с 33193 по 34077 в последовательности А65 (ОепЬапк, номер доступа М73260). Чтобы проверить может ли экспрессия белков Е4-огГ6 А65 сделать возможной продуцирование полностью Е1-делетированных Аб35-векторов на клетках, комплементирующих А65, рАД35АМТ.ОгГ6 трансфицировали совместно с конструкцией на основе Аб35-остова рАЕ.Аб35.р1Х-т1ТВ в клетки РЕК..С6. Для этого рАб35. ΔМТ. ОгГ6 расщепляли ΡΙ-Ρκρ-1 и рАЕ.Аб35.р1Х-т1ТК. расщепляли ИоИ, чтобы высвободить аденовирусные вставки из остова. 2 мкг расщепленного рАД35АМТ.ОгГ6 и 6 мкг расщепленного рАЕ.Аб35.р1Х-г1ТВ трансфицировали, используя Ыро1ес1Ат1пе. Смесь для трансфекции добавляли к клеткам РЕК..С6, которые высевали за день до этого при плотности 3,5хх106 клеток на флакон Т25. На следующий день среду заменяли на среду для культивирования РЕК..С6 (ЭМЕМ с 10% РВ8 и 10 мМ МдС12) и клетки продолжали инкубировать при 37°С/10% СО2. Контрольные трансфекции осуществляли с использованием рАйАр135.Ьис, трансфицированным совместно с рАЕ.Ай35.р1Х-г1ТВ, и отдельно рАЕ.Аб35.р1Х-т1ТВ. Через два дня после трансфекции клетки пересевали из флаконов Т25 в Т80 и инкубировали как описано. Спустя еще три дня в культуре, трансфицированной рАб35.АМТ.ОтГ6 вместе с остовом А635, наблюдали цитопатогенное действие (СРЕ), являющееся показателем репликации вируса, и культуру собирали (включая клетки и среду) после инкубации еще в течение 2 дней. Суспензию клеток подвергали 2 раундам циклов замораживания/оттаивания и полученный в результате материал (неочищенный лизат) хранили при -20°С вплоть до дальнейшего использования. В других флаконах не наблюдалось СРЕ, и клетки пересевали 1:3 во флаконы Т80 через 6 дней после переноса в Т80. Еще спустя 5 дней во флаконах, где проводили трансфекцию рАбАр135.Еис+рАЕ.Аб35.р1Х-г1ТВ, наблюдали несколько СРЕ-подобных событий, но дальнейшего прогрессирования не было. 0,2 и 0,5 мл неочищенного лизата, полученного после трансфекции рАб35АМТ.ОтГ6, использовали для повторной инфекции клеток РЕК..С6 при слиянии примерно на 85% во флаконах Т80. Это приводило к полному СРЕ после одного дня инкубации, свидетельствуя о том, что в неочищенных лизатах присутствовал инфекционный вирус. Полученные культуры также собирали, используя два цикла замораживания/оттаивания. Проводили дополнительные контрольные трансфекции отдельной конструкции рАД35АМТ.ОгГ6 в РЕК..С6, чтобы подтвердить, что экспрессия огГ6 сама по себе не приводит к клеточной токсичности и СРЕ-подобной гибели клеток. В заключение, только трансфекции рАб35.АМТ.ОтГ6 вместе с рАЕ.Аб35.р1Х-т1ТВ не приводили к СРЕ и репликации вируса.
Проводили ПЦР-анализ, чтобы подтвердить наличие основанных на А635 вирусных геномов с А65Е4-огГ6, заменяющей прежнюю Е1-область. Для этого вирусную ДНК выделяли из образцов неочищенного лизата следующим образом. 275 мкл материала неочищенного лизата инкубировали с 10 мкл ДНКазы I (10 мг/мл) при 37°С в течение 30 мин. Затем добавляли 6,0 мкл 0,5 М ЕЭТА (рН 8,0), 7,5 мкл 20% 8Ό8 и 1,5 мкл 20 мг/мл протеиназы К и смешивали встряхиванием. Затем смесь инкубировали при 50°С в течение 1 ч. Наконец выделяли вирусную ДНК, используя набор для выделения центрифугированием ОепеС1еап (Вю 101, 1пс.). Затем 2 мкл выделенной ДНК амплифицировали в ПЦР, используя праймеры 35р81-Рог и 35Κ4 (таблица 1). Программа была установлена при 94°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 с, 58°С в течение 30 с и 72°С в течение 5 мин, и заканчивалась инкубацией при 72°С в течение 10 мин. Праймеры специфичны в отношении последовательностей А635 и создают фрагмент длиной 2,9 т.о., имеющий пределы от пакующей последовательности до нуклеотида 4669 (нумерация как в последовательности А635 дикого типа), таким образом включающий в себя кассету транс
- 9 010828 гена ОгГ6 Л65. Электрофорез полученных ПЦР-фрагментов показал, что фрагменты имели ожидаемую длину, совпадающую с контрольными ПЦР-фрагментами, создаваемыми на адаптерной плазмиде рАЕ35.АМТ.ОгГ6. Таким образом, можно создавать полностью Е1-делетированные основанные на Л635 векторы на клетках, комплементирующих Л65, если вирус также экспрессирует Аб5-Е4огГ6.
Пример 2. Конструирование р^Е.АЕ35.р1Х-г1ТК5Е4.
Первый ПЦР-фрагмент амплифицировали, используя праймеры ΌΕ35-1 и 35ЕК (таблица 1). Амплификацию осуществляли с р^Е.АЕ35.р1Х-г1ТК (см. XVО 00/70071) в качестве ДНК-матрицы, используя ДНК-полимеразу Ρ\\ό (Косйе) с добавлением ДМСО (81дта, конечная концентрация 3%). Программа представляла собой следующее: 94°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами (94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с, 72°С в течение 3 мин) и конечная стадия при 72°С в течение 8 мин, чтобы обеспечить, образование полных фрагментов. Результатом амплификации был фрагмент длиной 1,6 т.о., соответствующий нуклеотидам 30224-31805 последовательности А635. В 3'-конец был введен сайт ВатН1. Амплифицированную ДНК очищали из геля, используя набор СепеС1еап. и лигировали в клонирующий вектор рСК8спр!/Атр из набора (81га1адепе). После трансформации элетрокомпетентных клеток ЭН10В отбирали белые колонии для дальнейшего анализа. В результате получали конструкцию рСК-ДЬег35. В результате клонирования с использованием тупых концов фрагмент ПЦР можно было встроить в 2 ориентациях. Отбирали клон, который имел инсерцию с сайтом ВатН1 в полилинкере вектора рСК8спр1/Атр на 5'-конце. Соответственно расщепление ВатН1 приводило к образованию фрагмента длиной 1,6 т.о. Секвенирование подтвердило правильную амплификацию ПЦР-фрагмента. Второй ПЦРфрагмент амплифицировали, используя праймеры: 5Е4Е и 5Е4К (таблица 1). Амплификацию осуществляли, используя рVЕ.Аά5.АГ1II-^IТК.κр, который является космидным вектором, содержащим дополнительный сайт Рас1 в р\VЕ.Аά5.АΠII-^IТК (ЕСАСС № депозита Р97082116, описан авторами данного изобретения в международной заявке на выдачу патента РСТ/ЫЕ01/00824). р\VЕ.Аά5.АΠII-^IТК5р служил в качестве матрицы при использовании ДНК-полимеразы Ρ\\ό ЭХА, как описано выше, хотя для такой же цели можно было использовать р\VЕ.Аά5.АΠII-^IТК. После очистки из геля ДНК расщепляли δκΐΐ и ВатН1 (оба сайта введены во время ПЦР) и фрагмент длиной 3 т.о. очищали из агарозного геля, используя набор СепеС1еап. Область Е4 А65, которую амплифицировали, соответствует 32794-35828 п.о. последовательности А65. Третий ПЦР-фрагмент создавали на р\VЕ.Аά35.рIX-^IТК. используя праймеры: 3551ТК и 3531ТК (таблица 1). ПЦР-амплификацию осуществляли как описано выше. Полученный в результате фрагмент длиной 160 п. о. фланкирован сайтом δκΐΐ (5'-конец) и сайтом ЕсоК1 (3'-конец). После очистки из геля, как описано выше, ДНК расщепляли δκΐΐ и ЕсоК1. Затем фрагмент длиной 160 п.о., соответствующий правому 1ТК А635 отделяли от отщепленных концов на низкоплавком агарозном геле и собирали в геле. Затем рИС119 расщепляли ВатН1 и ЕсоК1 и фрагмент длиной 3,1 т.о. очищали из геля, используя набор СепеС1еап. Затем обработанные, как указано выше, второй и третий ПЦР-фрагменты лигировали с ВатН1/ЕсоК1-расщепленной рИС119, получая рИС.Аб5Е4-351ТК. Клонированные полученные в ПЦР вставки секвенировали, чтобы подтвердить правильную амплификацию. Затем вставку длиной 1,6 т.о. в рСК-ДЬег35 вырезали ВатН1 и фрагмент очищали из геля, как описано выше. риС.Аб5Е4-351ТК также расщепляли ВатН1 и линейный фрагмент очищали из геля. Лигирование обоих фрагментов и отбор клонов, которые имели правильную ориентацию относительно друг друга, давали рИС.35-5Е4 (фиг. 3). Стадии, приводящие к конструированию рИС.35-5Е4 схематично изображены на фиг. 4. Аденовирусную вставку в рИС.35-5Е4 субклонировали в рВг.АЕ35.РКп (фиг. 5; см. νθ 00/70071), конструкции с 3'-последовательностями А635. Для этого конструкцию рИС.35-5Е4 расщепляли М1и1 и ХоЕ и фрагмент длиной 4,7 т.о. очищали из геля, используя набор СепеС1еап. Затем данный фрагмент лигировали с фрагментом вектора, полученным в результате расщепления М1и1 и ЫоП конструкции рВг.Аб35.РКщ Полученный фрагмент длиной 16,3 т.о. очищали из геля, используя фермент агаразу (Коске). Затем продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки ЭН10В. Полученная в результате конструкция названа рВг.АЕ35.РК5Е4 (фиг. 6, ЕСАСС № депозита Р02041229). Последняя стадия приводит к клонированию модифицированного 3'-конца последовательности А635 в вирусном космидном клоне р\VЕ.Аά35.рIX-^IТК. Для этого два фрагмента объединяли в реакции упаковки фага лямбда (81га1адепе) согласно инструкциям производителя. Первый представляет собой модифицированную вставку А635 длиной 16,8 т.о. из рВг. А635. РК5Е4, полученную расщеплением Рас1 и 8\гаЕ а второй представляет собой фрагмент длиной 22,8 т.о., полученный расщеплением р\VЕ.Аά35.рIX-^IТК ферментами Рас1 и 8\гаЕ Правильная комбинация двух фрагментов дает р\VЕ.Аά35.рIX-^IТК.5Е4 (фиг. 7). Таким образом, в данной конструкции область Е4 в остове А635 заменена соответствующей областью, полученной из А65.
Пример 3. Конструирование рVЕ.Аά35 .р1Х-г1ТК50гГ6.
Чтобы получить конструкцию остова аденовируса, которая содержит последовательности А635 от гена р1Х (нуклеотид 3401 в последовательности А635) до конца правого 1ТК, но с последовательностями Е4-огГ6 и -огГ6/7, замененными на соответствующие последовательности А65, последовательности А635 и А65 амплифицировали в ПЦР и объединяли, как описано ниже. ПЦР-фрагменты создавали, используя ДНК-полимеразу Ρ\\ό с добавлением ДМСО до 3%. Первую ПЦР осуществляли, используя рВг.Аб35.РКп (фиг. 5; см. νθ 00/70071) в качестве матрицы и праймеры Е4-Е1 и Е4-К2 (таблица 1). Программу уста
- 10 010828 навливали следующим образом: 94°С в течение 2 мин, 5 циклов (94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин) с последующими 30 циклами (99°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин) и заканчивали конечной стадией при 68°С в течение 8 мин. Полученный в результате фрагмент длиной 1,8 т.о. очищали, используя набор ОепеС1еап. Вторую ПЦР осуществляли, используя р\ХЕ. АЙ5. ΑΠΙΙ-ΓίΤΡδρ. который является космидным вектором, содержащим сайт Рас1 в р\УЕ.Ай5.АП11г1ТВ (ЕСАСС № депозита Р97082116, описан авторами данного изобретения в международной заявке на выдачу патента РСТ/ПЪ01/00824, еще не опубликованной), в качестве матрицы и праймеры Е4-Е3 и Е4Κ4 (табл. 1). Программу устанавливали следующим образом: 94°С в течение 2 мин, затем 30 циклов (94°С в течение 30 с, 62°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин) и заканчивали конечной стадией при 68°С в течение 8 мин. Фрагмент длиной 1,1 т.о. очищали как описано выше. Третью ПЦР выполняли, используя в качестве матрицы рВт.Ай35.РВп и праймеры Е4-Е5 и Е4-В6 (табл. 1). Программу устанавливали следующим образом 94°С в течение 2 мин, 5 циклов (94°С в течение 30 с, 48°С в течение 30 с и 72°С в течение 45 с), затем 30 циклов (94°С в течение 30 с, 56°С в течение 30 с и 72°С в течение 45 с) и заканчивали конечной стадией при 68°С в течение 8 мин. Фрагмент длиной 366 п. о. очищали, как описано выше. Образцы очищенных фрагментов наносили на гель, чтобы оценить концентрацию, и затем фрагменты смешивали вместе так, чтобы в общем объеме 30 мкл содержалось 700 нг ПЦР-1, 650 нг ПЦР2 и 430 нг ПЦР-3. К полученной смеси добавляли 3 мкл буфера ЕсоРо1 (Иете Еид1аий Вю1аЬ§), 3 мкл 2 мМ раствора ЙЫТР и 3 мкл Н2О ιηί11ίθ. Полученную в результате смесь инкубировали при 94°С в течение 3 мин и затем охлаждали до 65°С в устройстве для ПЦР со скоростью 0,5°С/с. После инкубации при 65°С в течение 10 мин смесь охлаждали далее до 20°С со скоростью 0,05°С в сек и инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Затем добавляли 1 мкл (5 единиц) фермента Кленова (Лете Еид1аий Вю1аЬ§) с последующей инкубацией в течение 60 мин при 37°С. 5 мкл полученной смеси Кленова использовали в качестве матрицы, чтобы отдельно амплифицировать два фрагмента следующим образом. Набор праймеров 1: ΝΤ-1 и Ысо1-К (таблица 1) использовали в реакции с применением ДНК-полимеразы Ртео (Коске) с добавлением ДМСО до конечной концентрации 3% и используя следующие установки устройства для ПЦР: 94°С в течение 2 мин, затем 30 циклов (94°С в течение 30 с, 66°С в течение 30 с и 72°С в течение 3 мин) с последующей конечной инкубацией при 68°С в течение 8 мин. Набор праймеров 2: Лсо1-Е и ΝΚ-2 (таблица 1) использовали в реакции с применением ДНК-полимеразы Ртео (Воске) с добавлением ДМСО до конечной концентрации 3% и используя следующие установки устройства для ПЦР: 94°С в течение 2 мин, затем 30 циклов (94°С в течение 30 с, 62°С в течение 30 с и 72°С в течение 90 с) с последующей конечной инкубацией при 68°С в течение 8 мин. Полученные в результате фрагменты длиной 2,7 т.о. (набор праймеров 1) и 1,1 т.о. (набор праймеров 2) очищали из геля, используя набор ОепеС1еаи, и каждый лигировали с вектором рСВ§спр1Атр (81та1адепе) и ими трансформировали электрокомпетентные клетки ΌΗ1ΟΒ. В результате получали конструкцию рСР5спр1Атр.ЛЕ1-Лсо1Р (фиг. 8) и конструкцию рСВ5спр1Атр.Лсо1Е-ЛР2 (фиг. 9). Так как вставки содержали тупые концы, в каждом клонировании получали две ориентации. Используя расщепления ΚρηΙ, отбирали конструкции с ориентацией, необходимой для дальнейшего клонирования (см. фиг. 8 и 9). Затем вставки секвенировали, чтобы подтвердить правильную амплификацию. Затем часть вставки из рСВ5спр1Атр-Лсо1Е-ЛР2 вырезали, используя ВатН1 и Лсо1, и очищали из геля, как описано выше. рСР5спр1Атр-ЛЕ1-Лсо1Р расщепляли такими же ферментами и содержащий вектор фрагмент также очищали из геля. Лигирование полученных фрагментов приводило к созданию рСР.ЛЕ1-ЛР2 (фиг. 10). ρΟΚ..ΝΤ1-ΝΚ2 содержит последовательности АЙ35 между нуклеотидами 30162 и 33234 последовательности АЙ35, при этом последовательности Е4огГ6 и Е4-огГ6/7 между нуклеотидами 31879 и32974 заменены последовательностями, полученными из Ай5, расположенными между 32 968 и 34077 в опубликованной последовательности АЙ5 в ОепЬапк (номер доступа М73260). Таким образом, как можно видеть на выравниваниях аминокислот, изображенных на фигуре 11 и 12, аминокислотная последовательность клонированного белка Е4-огГ6 идентична последовательности Е4-огГ6, обнаруженной в Ай5, и аминокислотная последовательность Е4-огГ6/7 в большей части идентична последовательности Е4-огГ6/7, присутствующей в АЙ5. Очевидно, различные гибридные конструкции АЙ35-АЙ5 Е4 могут быть сконструированы с использованием общего способа, описанного выше, не выходя за рамки объема изобретения. Затем указанную химерную вставку из ρΟΚ..ΝΤ1-ΝΚ2 клонировали в р\УЕ.Ай35.р1Х-г1ТР: ρ№.ΝΤ1-ΝΚ.-2 расщепляли М1и1 и Ше1 и полученный в результате фрагмент длиной 2,8 т.о. очищали из геля, используя набор ОепеС1еап. Конструкцию рВт.Ай35.РВп также расщепляли М1и1 и Ыйе1 и фрагмент вектора длиной 18 т.о. выделяли из геля, используя фермент агаразу (Воске). Результатом лигирования обоих фрагментов была конструкция рВг.Ай35.РР.5ОгГ6 (фиг. 13, ЕСАСС № депозита Р02041227). Затем последовательности АЙ35 между Рас1 и 8теа1, содержащие химерную область Е4, в данной конструкции клонировали в конструкции р^Е.Ай35.р1Х-г1ТВ, используя упаковку фага лямбда, как описано выше. Затем полученный в результате р\ХЕ.Ай35р1Х-г1ТК50гГ6 (фиг. 14) использовали для создания рекомбинантных вирусов, основанных на АЙ35, с помощью котрансфекции пакующих клеток РЕВ.С6 с адаптерной плазмидой АЙ35.
Пример 4. Конструирование р\ХЕ.Ай.35 .р1Х-г1ТВАЕ3, р\ХЕ.Ай35.р1Х-г1ТРАЕ3.5Е4 и р\ХЕ. АЙ35 .р1Х-г1ТВАЕ350гГ 6.
- 11 010828
Остов Л635 дополнительно модифицировали с помощью делеции последовательностей Е3. Известно, что белки Е3 модулируют иммунный ответ хозяина по отношению к аденовирусной инфекции и поэтому не обязательны для размножения рекомбинантных вирусов ίη νίίτο. Кроме того, делеция последовательностей Е3 позволяет осуществлять инсерцию более крупных гетерологичных последовательностей в векторы без риска для эффективности упаковки. Также в случае применения аденовирусных векторов в качестве носителей для вакцинации экспрессия иммуномодулирующих генов, кодируемых областью ЕЗ, не является предпочтительной. Способы делетирования последовательностей Е3 в плазмиде рВт.Лб35.РЕп (фиг. 5) описаны ниже.
Сначала создавали продукт ПЦР с помощью праймеров 35Ε3ίοτ и 35Ε3τδν (таблица 1), используя ДНК-полимеразу Ρ\νο (Воске) согласно инструкциям производителей и рВт.Аб35.РЕп в качестве ДНКматрицы. Программу устанавливали при 94°С в течение 2 мин и 30 циклов 94°С в течение 30 с, 58°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин, затем 68°С в течение 8 мин. Амплифицированный фрагмент содержит последовательности А635 от нуклеотида 26814 до 27647 (см. XVО 00/70071) и фланкирован на 3'конце сайтом М1и1. Полученный в результате фрагмент длиной 833 п.о. очищали, используя набор для очистки продуктов ПЦР О1ас.|шск (01адеп) и расщепляли М1и1 и 8Ы. Затем расщепленный ПЦРфрагмент очищали из низкоплавкого агарозного геля, используя набор для экстракции из геля О1ас.|шск (О|адеп). Конструкцию рВт.Аб35.РВп также расщепляли, используя М1и1 и Зшк и содержащий вектор фрагмент длиной 17,3 т.о. выделяли из агарозного геля, используя фермент агаразу (Воске), используя способы, известные специалистам в данной области. Обе выделенные ДНК лигировали и ими трансформировали максимально эффективные компетентные бактерии ΌΗ5α (Ιηνίίτο^η/ΕΤΙ), получая рВг. А635. ΡΒηΔΕ3 (фиг. 15). Делегированные последовательности охватывают нуклеотиды от 27648 до 30320 последовательности А635, приводя к делеции 2673 п.о. Затем вводили делецию Е3 в конструкцию рVΕ.Аά35.рIX-^IΤВ, используя экстракты для упаковки фага лямбда (31гакщепе). Для этого оба вектора рVΕ.Аά35.рIX-^IΤВ и рВг. А635. ΡΒηΔΕ3 расщепляли Рас1 и 3\ναΙ и соответствующие фрагменты длиной 22,8 т.о. и 14 т.о. выделяли из низкоплавких агарозных гелей, используя фермент агаразу (Воске). После лигирования и упаковки с использованием клеток 8ТВЬ-2 (Ιηνίίτο^η/ΕΤΙ) получали конструкцию рХХ'Н.АсЕ'5 .рк\-г1Т'В:\к3.
Чтобы сконструировать Е3-делетированные варианты конструкций Е4-модифицированного остова, описанных выше, вводили модификации Е4 в конструкцию рВ^.Аά35.ΡВηΔΕ3 следующим образом. Конструкцию рυС.35-5Ε4 (фиг. 3) расщепляли, используя М1и1 и ΝοίΙ, и фрагмент длиной 4,7 т.о. выделяли из геля, используя набор 6еηеС1еаη II. Конструкцию рВт.А635.РВпАВ3 также расщепляли М1и1 и ΝοίΙ и фрагмент вектора длиной 13,6 т.о. выделяли из геля, используя набор для выделения центрифугированием Се^СВал Лигирование указанных фрагментов приводило к образованию конструкции рВ^.Аά35.ΔЕ3.ΡΒ5Ε4 (фиг. 16). Конструкцию рСВ.NΕ1-NВ2 (фиг. 10) расщепляли, используя МЫ, NάеI и ВдП (последний фермент для расщепления фрагмента вектора на более мелкие фрагменты), и фрагмент длиной 2,8 т.о. выделяли из геля, используя набор для выделения центрифугированием Се^Ска^ Конструкцию рВт.А635.РВпАВ3 расщепляли, используя МЫ и Шек дефосфорилировали, используя фермент СГР (№\ν Εη§1αηά Вю1аЬ§), и фрагмент вектора длиной 15,2 т.о. также выделяли, используя набор для выделения центрифугированием Се^СВаю Лигирование указанных фрагментов давало конструкцию рВг.Аб35АЕ3.РВ5ОгГ6 (фиг. 17). Затем рВ^.Аά35.ΔΕ3.ΡВ5Ε4 и рВг.Аб35АЕ3.РВ5ОгГ6 использовали, чтобы заменить 3'-ΡасI-8νаI-фрагмент в рVΕ.Аά35.рI\-^IΤВ на соответствующие области из рВ^.Аά35.ΔЕ3.ΡΒ5Ε4 и рВ^.Аά35.ΔЕ3.ΡΒ5О^Γ6. как описано ниже. Это дает конструкции рVΕ.Аά35.рI\ΓΙΤΒΔΕ3.5Ε4 и рVΕ.Аά35.рI\-^IΤВΔΕ3.5О1ί6.
Альтернативный способ создания указанных крупных космид заключается в применении трех фрагментов в реакции лигирования для упаковки: ШЧ-РасЕфрагмент длиной 14,7 т.о. из рVΕ.Аά35.рI\τΙΤΒ, РасЕШП-инсерцию из рВ^.Аά35.ΔЕ3.ΡΒ5Ε4 или рВт.А635.АЕ3.РВ5ОтЕ6 и фрагмент ΝοίΙрасщепленного космидного вектора р^В15 (δΙηΕ^ικ). Указанный последний фрагмент также можно выделить из продуктов ΝοΐΙ/РасЕрасщепления рVΕ.Аά35.рI\-^IΤВ.
Пример 5. Образование Ε1- и Е1/Е3-делетированных векторов на основе А635 на клетках ΡΕВ.С6.
Чтобы сделать возможным образование рекомбинантных вирусов А63 5 на комплементирующей линии клеток ΡΕВ.С6 с использованием конструкций, основанных на рВг.А635.РВп, авторы сначала создали новую конструкцию, содержащую последовательности А635 от 3401 до 24650 п.о. последовательности А635 (XVО 00/70071) и следовательно перекрывающуюся как с адаптерными плазмидами, так и с конструкциями на основе рВг.Аб35.РВп. Трансфекция указанных трех плазмид в клетки ΡΕВ.С6 и событие двойной гомологичной, рекомбинации приводит к образованию полного вирусного генома и репликации рекомбинантных вирусов, как изображено на фиг. 18. Требуемую плазмиду получали с помощью делеции большой части последовательностей А635 в рVΕ.Аά35.рI\-^IΤВ. Для этого рVΕ.Аά35.рI\-^IΤВ расщепляли Ε^Βν и содержащий вектор фрагмент длиной 29 т.о. очищали из низкоплавкого геля, используя набор для выделения центрифугированием Се^с^ал Очищенную ДНК подвергали самолигированию и использовали для трансформации электрокомпетентных бактерий ИН10В (Iην^ίτοдеη/^ΤI) с получением в результате рXVΕ.Аά35.рI\-ΕсοΒV (фиг. 19).
- 12 010828
Все ДНК, используемые для трансфекции, расщепляли, как указано в табл. 2, инактивировали нагреванием при 65°С в течение 15 мин и использовали без дальнейшей обработки для трансфекции. Клетки РЕК.С6 высевали за день до трансфекции во флаконы Т25 при плотности 3 χ 106 клеток/флакон и трансфицировали, как указано в таблице 2, используя ПроГес^Аште (1пу11годеп/ЬТ1) согласно инструкциям производителей, за исключением того, что смесь для трансфекции в бессывороточной среде ЭМЕМ (ОШсо/ВКК) заменяли на среду для культивирования РЕК.С6 (ΌΜΕΜ, 10% ЕБ8 и 10 мМ МдС12) через 5 час. Спустя день эффективность трансфекции оценили с помощью флуоресцентной микроскопии на уровне 50%. Через два дня клетки обрабатывали трипсином и пересевали во флаконы Т80 и дополнительно инкубировали при 37°С/10% СО2. Через шесть дней после трансфекции во всех культурах наблюдали цитопатогенное действие (СРЕ, показатель размножения вируса), за исключением культуры РЕК.С6, трансфицированной Άά35.ΆάΆρΐ. еОРР+р^Е. Ай35.р1Х-г1ТК. Спустя один день клетки и среду во флаконах с СРЕ собирали и подвергали двум циклам замораживания/оттаивания, очищали от обломков клеток центрифугированием (10 мин при 1500 об/мин) и 100 мкл полученных неочищенных лизатов использовали для повторной инфекции свежих клеток РЕК.С6 при слиянии на 85% во флаконах Т80. Клетки, трансфицированные Ай35.АйАр1.еОРР+р^Е.Ай35.р1Х-г1ТК, которые не проявляли признаков СРЕ, собирали трипсинизацией и также обрабатывали, как описано выше. Через два дня после инфекции свежих клеток РЕК.С6 во всех флаконах наблюдали полное СРЕ, за исключением одного, в котором не наблюдалось признаков СРЕ во время первоначального сбора. Это ясно свидетельствует о том, что полностью Е1-делетированные вирусы, основанные на АЙ35, можно получить на клетках РЕК.С6 в том случае, когда продукт гена Е4-огГ6 Ай5 экспрессируется с остова АЙ35.
Таблица 1
Последовательности праймеров
35ГВ 5'-СЕ6САТССАСТТТАТТТТАСТТСТССТСТТС-3' (ЗЕО ΙΟΝΟ:1)
35Н4 5'-ССЕААТТСТТААТТААСССАААТССАААТСТЕТСАСЕ-3' (ЗЕО Ю N0:2)
35рз1-Еог 5'-СТССТАТТТАТСССАСС6ТС-3' (5Е0 Ю N0:3)
ϋΓ35-1 5'-САСТСАССАССТССААТТСС-3' (ЗЕО Ю N0:4)
5Е4Е 5'-СС6САТСССТТТСТСТТАТСТТТСААС6ТС-3' (ЗЕО ΙϋΝΟ:5)
5Е4Р 5'-ССТССССАССТС0ССССАСТААСТТСТАТСТ6-3' (ЗЕО Ю N0:6)
355ΙΤΚ 5'-ЕАТССбСАССТСАСААСЕТСАТТТТСССАСС-3' (ЗЕО Ю N0:7)
353ΙΤΚ 5' -АЕЕААТТСбСЕЕССЕСАТТТАААТС - 3' (5Е0Ю N0:8)
Е4-Е1 5'-АСАССААСАСАТТССССС-3' (ЗЕО Ю N0:9)
Е4-Н2 5' -СЕ6СА0ААА6САСТСТЕТАТТСТ6ТСАААТС6-3' (ЗЕО Ю N0:10)
Е4-РЗ 5'-ТТТСАСАСААТАСАСАСТССТТТСТСССССССТСС - 3' (8Е0 10 N0:11)
Е4-Н4 5'-АСААААТАССАСААТСАСТАССТССССССТТСС - 3' (ЗЕО Ю N0:12)
Е4-Е5 5'-ССАССТАСТСАТТСТССТАТТТТСТАТАСС-3' (ЗЕО ΙΟΝΟ:13)
Е4-Н6 5'-ТСАССААСАСАСТССССС-3' (ЗЕО Ю N0:14)
ΝΓ-1 5'-ССАСААСССССАСТАСТССС-3' (ЗЕО Ю N0:15)
ΝΗ-2 5'-СвТСТСТТСССТСТССТСТСС-3' (ЗЕО Ю N0:16)
ΝοοΙ-Κ 5'-АССАТСАТССССТССТСССС-3' (ЗЕО Ю N0:17)
ΝσοΙ-Γ 5'-САГСАССАТАСССССЕТбС-3' (ЗЕО Ю N0:18)
ЗЬЕЗГог 5'-ААТСАСТААТССАССТСССС-3' (ЗЕО Ю N0:19)
35ЕЗгеу 5'-ССАССССТТЕТАЕТСЕТТСАССТТСТАС-3' (ЗЕО 10 N0:20)
Таблица 2
- 13 010828
Список конструкций, используемых для образования Е1-делетированных вирусов, основанных на Асб35, на клетках РЕК.С6, как описано в примерах. Адаптерные конструкции расщепляли Рас1, рИЕ.Αά35.ρΙΧ-ЕсоВУ расщепляли ΝοΕΙ и ЕсоКУ, Е4-модифицированные основанные на рВг конструкции расщепляли Рас! и ΝοΈΙ.
№ Конструкции СРЕ
1 рА<ЗАр£35. еСЕР рМЕ.АЙЗ 5.р1Х -ЕсоНУ рВг. АЙ35. РК5Е4 Да
2 рАсйрЪЗЬ.еСЕР рИЕ.Αά35. р1Х-ЕсоНУ рВг.Ай35.РЯ50г£б Да
3 рАс1Арк35. еЗЕР рИЕ .Αά35 .р1Х-ЕсоНУ рВг.А635.ДЕЗРВ5Е4 Да
4 рАсЗАрЬЗЭ. еСЕР рНЕ .А635.р!Х-ЕсоНУ рВг.АЙ35.ДЕЗ.РЯ5ОГ£6 Да
5 ρλάΑρΐ35.еСЕР рИЕ.Ас135 .р1Х-г1ТНхЫоЫ Нет
б рАс!Арс5.ебГР рИЕ.АбЭ.ΑίΙΙΙ-г1ТНхРас! Да
Ссылки
АЬгабатзеп К, Копд Н-Б, Маз£гапде11 А, ВгоидР Б, Ы/опоуа А, Сгуз£а1 К апб Еа1ск-Ребегзеп Е. (1997) Сопзб’исбоп оР ап абепоу1гиз £уре 7а Е1А уее£ог. I У1го1 11:8946-8951.
Ра11аих ЕЕ КгапепЬигд 0, Сгатег 81, Ноитеебпд А, Уап Огшопб£ Н, НоеЬеп КС апб Уап бег ЕЬ АЕ (1996) СРагас£еп/а£юп о£ 911: А пете Ре1рег се11 1те Рог £Ре б£габоп апб ргорадабоп о£ еаг1у гедюп 1-бе1е£еб абепоу1га1 уес£огз. Нит Оепе ТРег 7:215-222.
Еа11аих ЕЕ Бои£ А, Уап бег Уе1бе I, Уап беп \¥о11епЬегд БЕ НеЫг КМ, Кеедап I, Аидег С, Сгатег 81, Уап Огтопб£ Н, Уап бег ЕЬ АЦ уа1епо Б апб НоеЬеп КС. (1998) №те Ре1рег се11з апб та£сРеб саг1у гедюп 1-бе1е£еб абепоу1гиз уес£огз ргеуеп£ депегабоп о£ герНсабоп сотре£еп£ абепоу1гизез. Нит Оепе Тбег 9:19091917.
Егапск1 К1В, Еаидие! СМ, Кпибзоп Б апб Вготеп Е. (1991) С1азз1йсабоп апб потепс1а£иге о£ У1гизез. Е1йР герой о£ £бе т£етабопа1 соттШее оп £ахопоту о£ У1гизез. Агсб У1го1 8ирр1 2:140-144.
Огабат ЕО, 8тбеу I, Киззе11 апб \а1т К. (1970) СРагас£епзбсз о£ а Ритап се11 1те £гапзРогтеб Ьу БКА Ргот Ритап абепоу1гиз £уре 5. I Оеп У1го1 36:59-72.
Надтеуег ВМ, Биупбат МС, Апде1 Р, Бе Огоо£ КР, Уег1аап М, Е1РРепсР Р, Уап бег ЕЬ А1 апб 7ап£ета А. (1996) Опсодепе 12:1025-1032.
Ногтей^ М8. (2001) Абепоу1гиз 1ттипогеди1а£огу депез апб £Ре1г се11и1аг £агде£з. У1го1оду 279;1-8.
беррагб КК (1997) Е4 депе Рипсбоп т абепоу1гиз, абепоу1гиз уес£ог апб абепо-аззос1а£еб У1гиз тРесбопз. I Оеп У1го1 78:2131-2138.
беррагб КК (1998) Кеди1а£еб ККА ргосеззтд апб КЫА £гапзрог! биппд абепоу1гиз тРесбоп. 8еттагз т У1го1оду 8:301-307.
Рббег 8, Мооге Ν, Бодан I апб 8Репк Т. (1986) ТРе абепоу1гиз Е1В 55К £гапзРогттд ро1урерббе тоби1а£ез £гапзрог! ог су£ор1азт1с з£аЬШ/а£юп оР У1га1 апб Роз£ се11 тККАз. Мо1 Се11 Вю1 6:470-476.
Као Б, БеЬЬаз М, 8аЬЬабт Р, НоскепЬегу Б, Когзтеуег 8 апб \¥11йе Е. (1992) ТРе абепоу1гиз Е1А рго£етз тбисе арор£оз1з, теР1сР 1з тР1Ьйеб Ьу £Ре Е1В 19-кБа апб Вс1-2 рго£етз. Ргос N£1 Асаб 8с1 И8А 89:7742-7746.
Киззе11 ^С. (2000) Ирба£е оп абепоу1гизез апб Йз уес£огз. I Оеп У1го1 81:2573-2604.
8Репк Т. (1996) Абепоутбае; ТРе У1гизез апб 1Ре1г герНсабоп. 1п У1го1оду, ебз. Е1е1бз ВК Кшре БМ апб Ноте1еу РМ. (Е1рртсо£1-Кауеп, Кете Уогк) 2:2111-2148.
Уап бег УНе£ РС. (1995) Абепоу1гиз БКА герНсабоп. 1п ТРе то1еси1аг геребопе оР абепоу1гизез II, ебз. БоегЙег апб ВоРт Р. (8рппдег-Уег1ад, ВегНп) . Сиггеп£ Тор1сз т МюгоЬю1оду апб 1ттипо1оду 199/11:130.
Уете РК апб Вегк А1. (1992) 1пР1Ьйюп оР р53 £гапзас£1уа£1оп гес|ипеб Рог б’апзРогтабоп Ьу абепоу1гиз еаг1у гедюп 1В рго£ет. №б1ге 357:82-85.
- 14 010828
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Сгисе11 НоПапс1 Β.ν.
Уоде15, иопа!б
ВоиХ, АЬгапат <120> Средства и способы получения аденовирусных векторов <130> 00751Λ/Ο00ΟΚΟ <140>
<141> 2003-04-24 <160> 25 <170> Патент, версия 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 35РВ <400>1 сдддагссас тгьагтггад ттдтсдтстт с <210> 2 <211>37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность31 <220>
<223> праймер 35К4 <400>2 сддааттстт ааТГааддда аагдсааатс гдтдадд37 <210>3 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 35рзт-Рог <400>3 дгддгаттга гддсадддЬд20 <210>4 <211> 20
- 15 010828 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер ОЕ35-1 <400>4 сасТсассас сиссаагтсс20 <210>5 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 5Е4Е <400>5 сдддатссдт «дгдтгагд ТТТсаасдТд30 <210> 6 <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> праймер 5Е4К <400> б дсгддсдадс гсддсддадг аасгтдгагд Тд32 <210>7 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 355ΙΤΚ <400>7 дагссддадс гсасаасдсс аггггсссас д31 <210> 8 <211>25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 353ΙΤΚ <400> 8 аддааТСсдс ддссдсаТТТ ааагс 25
- 16 010828 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <22О>
<223>
праймер Е4-Е1 <400>
<400> 9 ададдаасас аггссссс <210> 10 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер Е4-К2 <400>10 ддддадааад дасгдгдгаг гсгдхсааа! дд32 <210> 11 <211>35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер Е4-ЕЗ <400>11
ТТТдасадаа гасасадгсс хггсиссссд дсгдд35 <210> 12 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер Е4-К4 <400>12 асааааБасд адаа1дас1а сд1ссддсд! гсс33 <210>13 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
- 17 010828 <223> праймер Е4-Е5 <400>13 ддасдгадгс атгсгсдгат ТТТдТаТадс30 <210>14 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер Е4-К6 <400>14 тсассаасас адгддддд18 <210>15 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер ΝΕ-1 <400> 15 ссасаасссс састастссс 20 <210> 16 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер N8-2 <400>16
СдГС1СТ1СС СТСТССТСГС С21 <210>17 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер Ысо1-К <400>17 аддагсагсс дс1дс1дссс20 <210> 18 <211>19
- 18 010828 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер ΝσοΙ-Ρ <400>18 сатсаддаГа дддсддТдд19 <210>19 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 35Ε3ίοτ <400> 19 ааЬдасЬааЬ дсаддЬдсдс 20 <210> 20 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> праймер 35ЕЗгеу <400>20 сдасдсдтьд тадгсдггда дсггсгад28 <210> 21 <211>294 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Аминокислотная последовательность белка Ε4-οιί6 аденовируса типа 5 <400> 21
мег 1 ТЬг ТЬг 5ег 61 у 5 Уа1 РГО РНе 61 у Μθΐ 10 ТЬг Ьеи Агд РГО ТНг 15 Агд
5ег Агд Ьеи 5ег 20 Агд Агд тЬг РГО туг 25 5ег Агд Азр Агд ьеи 30 РГО Рго
РЬе 61 и ТЬг б! и ТЬг Агд А1а ТЬг Не Ьеи 61 и А5р Нтз РГО ьеи Ьеи
35 40 45
Рго 61 и Суз Азп ТЬг ьеи тНг меь НТ 3 Азп Уа! 5ег туг уа! Агд 61у
50 55 60
- 19 010828
Ьеи Рго 65 Суз 5ег Уа! 61 у 70 РНе тНг 1_еи Не 61 η 61 и 75 Тгр Уа1 Уа.1 РГО 80
тгр А5р МеТ Уа1 1_еи тНг Агд 61 и 61 и ьеи Уа1 11е ьеи Агд туз суз
85 90 95
мет ΗΊ 5 Уа1 Суз |_еи Суз Суз А1а Азп Не Азр 11е мет ТНг Бег мет
100 105 110
Мет 11е НТ 5 61 у Туг 61 и Бег Тгр А1а Теи Нт 5 Суз НТ 3 Суз Бег Бег
115 120 125
Рго 61у 5ег 1_еи 61п Суз 11е А1а 61у 61у 61 η уа! ьеи А1а Бег Тгр
130 135 140
РЬе Агд мет Уа1 Уа! АЗр 61у А1а Мет РНе АЗП 6ΐη Агд РНе 11е тгр
145 150 155 160
Туг Агд С1и Уа1 Уа1 АЗП Туг Азп МеТ РГО ьуз 61 и Уа1 мет РНе мет
165 170 175
5ег 5ег Уа! РНе мет Агд 61 у Агд НТ 5 Ьеи Не Туг ьеи Агд ьеи Тгр
180 185 190
туг Азр С1у НТ 5 уа! б1у Бег Уа1 Уа1 Рго А1а МеТ Бег РНе 61 у Туг
195 200 205
5ег А1а Ьеи НТ 5 Суз 61у Не ьеи АЗП АЗП Не Уа1 Уа1 Ьеи Суз СУ'
210 215 220
Бег Туг Суз А1а Азр ьеи Бег 61 и Не Агд Уа! Агд Суз Суз А1а Аге
225 230 235 24С
Агд ТНг Агд Агд 1_еи Мет ьеи Агд А1а Уа1 Агд Не 11 е А1а 61 и 61т
245 250 255
ТНг тНг А1а МеТ Ьеи туг Бег Суз Агд ТНг 61 и Агд Агд Агд 61 п 61 г
260 265 270
РНе Не Агд А1а ьеи 1_еи 61 η НТ 5 НТ 5 Агд РГО Не Ьеи мет НТ 5 Азр
275 280 285
туг Азр Бег тЬг Рго мет
290 <210> 22 <211> 299 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Аминокислотная последовательность белка Е4-огГ6 аденовируса типа 35 <400> 22
- 20 010828
мег 5ег 61 у зег А5П зег 11 е мес ТНг Агд Сеи Агд А1а Агд зег тНг
1 5 10 15
5ег Суз А1а Агд НТЗ НТВ Рго Туг ТНг Агд А1а 61 п сеи Рго Агд Суз
20 25 30
61 и 61 и А5П 61 и ТНг Агд А1а Зег мес тНг 61 и Авр НТ 8 рго сеи сеи
35 40 45
Рго АЗр 50 Суз Азр тНг мес ТНг 55 мес НТЗ 5ег Уа1 Зег 60 СУЗ Уа1 Агд 61 у
ьей Рго Су5 Зег А1а Зег РНе ТНг Уа! сеи 61 п 61 и ьей РГО Не РГО
65 70 75 80
Тгр А5р мес РНе сеи АЗП Рго 61и 61 и сеи Суз Не мес Агд Агд суз
85 90 95
мее НТ 5 сеи Суз Сеи Суз Суз А1а ТНг 11 е Азр 11е РНе НТЗ Зег 61 п
100 105 110
Уа1 11 е НТЗ 61 у Агд 61 и А5П тгр Уа1 Сеи НТ 5 Суз НТЗ СУ5 АЗП 61 π
115 120 125
61 η 61 у Зег Ьей 61 η Суз мес А1а 61 у 61 у А1а Уа1 сеи А1а Уа1 тгр
130 135 140
РНе 145 Агд 1_У5 Уа! Не Ьей 150 61у Суз Мес 11 е Азп 155 61 п Агд Суз Рго Тгр 160
Туг Агд б!п И е Уа1 АЗП мес НТЗ мес РГО Суз 61 и Не мес туг Уа!
165 170 175
61 у Зег Уа! РНе 180 Ьей Агд Агд Агд НТЗ 185 Сеи Не Туг Не суз 190 сеи тгр
Туг АЗр 61 у 195 ΗΊ5 А1а 61 у А1а Не 200 Не Зег Азр мес Зег 205 РНе С1У тгр
Зег А1а РНе АЗП Туг 61 у Теи Сеи АЗП Азп Не Уа1 Не мес суз Су5
210 215 220
ТНг туг Суз ЬУ5 Азр Сеи Зег С1и 11е Агд Мес Агд Суз суз А1а нтз
225 230 235 240
Агд тНг Агд |_уз сеи Мес ьей Агд А1а 11 е Су5 11 е мес сеи 61 п 61 и
245 250 255
тНг Уа! А8р Рго 260 Азр Рго Не Азп Зег 265 Зег Агд ТНг 61и Агд 270 Агд Агд
61 η Агд Ьей ьей Уа1 61 у сеи мес Агд НТЗ АЗП Агд РГО Не РГО РНе
275 280 285
Зег Α5Ρ Туг Азр Зег НТЗ Агд Зег Зег Зег Агд
290 295
- 21 010828 <210> 23 <211> 150 <212> белок <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Аминокислотная последовательность белка Е4-огГ6+7 аденовируса типа 5 <400> 23
мег 1 ТЬг ТЬг Зег 01у Уа! 5 Рго РЬе 61 у Мег тЬг 10 Геи Агд Рго ТЬг 15 Агд
5ег Агд Геи 5ег 20 Агд Агд ТЬг Рго туг 25 5ег Агд Азр Агд геи 30 РГО РГО
РЬе С1и ТЬг 61 и ТЬг Агд А1а ТЬг 11е геи 61 и Азр ΗΊ 5 РГО Геи Гее
35 40 45
Рго 61 и Су5 Азп тЬг Геи ТЬг мег ΗΊ 8 АЗП А1а Тгр ТЬг Зег РГО Зег
сл эи С с э νν
Рго РГО Уа1 Ьуз 61 п РГО 61п Уа1 61 у 61 п 61 п РГО Уа1 А1а 61 п 61 г
65 70 75 80
Ьеи А5р 5ег Азр мег АЗП Геи Зег 61 и геи РГО 61 у 61 и РЬе 11е АЗП
85 90 95
11е ТЬг Азр 01 и 100 Агд Геи А1а Агд 61 п 105 61 и ТЬг Уа1 Тгр Азп 110 11 е ТЬг
РГО ЕуЗ А5П мег Зег Уа1 Тпг ΗΊ 5 АЗр МеГ Мег Геи Рпе гуз А1а Зег
115 120 125
Агд 61у 01 и Агд тЬг Уа! & Зег Уа1 СУЗ тгр 01 и 01 у 61 у 01 у Агд
130 140
Ьеи А5П тЬг Агд Уа1 Геи
145 150
<21О> 24 <211> 150 <212> белок <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Аминокислотная последовательность слитого белка Е4-огГ6+7 из аденовируса типа 5 и аденовируса типа 35 <400> 24
Ме1 тЬг ТЬг Зег О1у Уа! Рго РЬе 61у Мег ТЬг ьеи Агд Рго ТЬг Агд
10 15
- 22 010828
5ег Агд геи 5ег 20 Агд Агд ТЬг РГО туг 25 Бег Агд Азр Агд геи 30 РГО РГО
РЬе 01 и ТЬг С1и ТЬг Агд А1а ТЬг Не геи 61и Азр НТЗ РГО геи геи
35 40 45
РГО 61 и Суз Азп ТЬг геи ТЬг мег НТ5 Азп А1а Тгр ТЬг 5ег Рго 5ег
50 55 60
РГО РГО Уа! гуз 61 п Рго 61 п уа! 61 у 61 п 61 п РГО Уа1 А1а 61 п 61п
70 75 80 ьеи Азр 5ег А5р Мег Азп геи Бег 61 и геи Рго 61у б!и РЬе 11е Азп
Не тНг Авр 61 и дгд геи А1а дгд 61η б1и ТЬг Уа1 тгр азп 11е тНг 100 105110 рго ьуз азп мег 5ег Уа1 тЬг нт 5 Азр мег Мег геи РНе гуз А1а Бег 115 120125
Агд 61^ б1и Агд тЬг Уа1 т^г Бег Уа1 гуз тгр е!и б1у С1у 61у гуз
11е тНг тНг Агд 11е геи
145150 <210>25 <211>141 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Аминокислотная последовательность белка Е4-ог(6+7 аденовируса типа 35 <400> 25
мег 1 5ег 61 у Бег Азп 5 Бег 11 е Мег ТНг Агд 10 геи Агд А1а Агд Бег 15 ТНг
5ег Суз А1а Агд Нт $ нтз Рго туг ТНг Агд А1а 61 п геи РГО Агд Суэ
20 25 30
61и 61 и АЗП 61 и тЬг Агд А1а Бег мег ТНг 61 и Азр НТ 5 РГО геи геи
35 40 45
Рго Азр Су 5 Азр ТЬг мег ТНг мег Н15 Бег Мег тЬг Уа1 Не 61 п тНг
50 55 60
РГО 61 и Бег НТ 5 РГО 61 п 61 п геи Азр Суз 61 и Бег А1а геи гуз Азр
65 70 75 80
Туг Агд Азр 61 у РЬе геи Бег Не ТНг Азр РГО Агд геи А1а Агд Бег
85 90 95
61 и ТНг Уа1 тгр А5П Уа1 61 и Бег гуз тНг мег Бег Не Бег АЗП 61 у
100 105 110
Не 61 п мег РНе гуз А1а Уа1 Агд 61 у 61 и Агд геи Уа! Туг Бег Уа1
115 120 125
гуз 1зг8 61 и 61 у 61у 61у гуз 135 Не тЬг ТЬг Агд Не 140 геи
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (27)

1) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса второго серотипа, отлич ного от указанного первого серотипа;
1. Рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, причем указанный вектор дополнительно содержит последовательность, кодирующую функциональный белок Е4-огГ6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, совместимые с белком Е1В-55К, экспрессируемым в линии комплементирующих клеток, в которой получают указанный рекомбинантный аденовирусный вектор, где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
2. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.1, где указанный первый серотип и указанный второй серотип являются серотипами из разных подгрупп аденовирусов.
2) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и
3. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.1, где указанный первый серотип является серотипом подгруппы, отличной от подгруппы С, и где указанная последовательность, кодирующая Е4-огГ6, получена из аденовируса серотипа подгруппы С.
3) последовательности, кодирующей Е4-огГ6, в которой часть последовательности, кодирующей Е4огГ6, полученная из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа, слита с
4. Рекомбинантный аденовирус по п.1, где указанный первый серотип является серотипом подгруппы В и указанный второй серотип является серотипом подгруппы С.
5. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.1, в котором последовательность, кодирующая Е4огГ6, получена из аденовируса серотипа 5.
6. Рекомбинантный аденовирусный вектор по любому из пп.1-5, где указанный первый серотип аденовируса является серотипом 11, 14, 16, 21, 34, 35 или 50.
7. Рекомбинантный аденовирусный вектор по любому из пп.1-6, дополнительно содержащий последовательность, кодирующую неаденовирусный белок, полипептид или пептид.
8. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.7, где указанный неаденовирусный белок, полипептид или пептид выбран из группы, состоящей из полипептида, индуцирующего гибель клеток, антигенной детерминанты патогенного организма, антигена, специфичного для опухоли, вирусного белка, гормона и цитокина.
9. Способ получения рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, по п.1, включающий следующие стадии:
a) получение линии комплементирующих клеток, экспрессирующих белок Е1В-55К или его функциональную часть, производное и/или аналог аденовируса второго серотипа с необходимыми элементами аденовируса, такими как элементы, обеспечивающие сборку указанного вектора в указанных комплементирующих клетках, причем указанные элементы содержат, по меньшей мере, некоторые структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательность, кодирующую функциональный белок Е4-огГ6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, где белок Е4-огГ6 совместим с указанным белком Е1В-55К, экспрессируемым в указанных комплементирующих клетках;
b) культивирование указанных комплементирующих клеток в среде в условиях, обеспечивающих продуцирование и сборку аденовирусного вектора; и
c) сбор полученного рекомбинантного аденовирусного вектора из среды и/или комплементирующих клеток, причем последовательность, кодирующая совместимый белок Е4-огГ6, присутствует в полученном таким образом рекомбинантном аденовирусном векторе.
10. Способ по п.9, где указанный первый и указанный второй серотип являются серотипами аденовирусов разных подгрупп.
11. Способ по п.9 или 10, где указанный первый серотип является серотипом аденовируса подгруппы В и указанный второй серотип является серотипом аденовируса подгруппы С.
12. Способ по п.11, где указанный второй серотип является серотипом аденовируса 5.
13. Способ по любому из пп.9-12, где указанный первый серотип аденовируса является серотипом 11, 14, 16, 21, 34, 35 или 50.
14. Способ по любому из пп.9-13, где последовательность, кодирующая Е1В-55К, интегрирована в геном указанных комплементирующих клеток.
15. Способ по любому из пп.9-14, где указанные комплементирующие клетки получены из первичной диплоидной клетки человека или ее клетки-предшественника.
16. Способ по п.15, где указанная первичная диплоидная клетка представляет собой клетку ретинобласта человека, клетку эмбриональной почки человека, нейронную клетку человека или амниоцит человека.
17. Способ по любому из пп.9-16, где нуклеиновая кислота, кодирующая аденовирусные белки Е1А, интегрирована в геном указанных комплементирующих клеток.
18. Способ по п.17, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая указанные белки Е1А, получена из серотипа аденовируса подгруппы, отличной от подгруппы В.
19. Способ по п.18, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая указанные белки Е1А, получена из серотипа аденовируса подгруппы С.
20. Способ по п.18, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая указанные белки Е1А, получена из серотипа аденовируса 5.
21. Способ по любому из пп.9-20, где указанная последовательность, кодирующая Е4-огГ6, и указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, получены из аденовирусов разных серотипов и где указанные разные серотипы аденовирусов являются членами одной и той же подгруппы аденовирусов.
22. Способ по п.21, где указанные разные серотипы аденовирусов являются членами подгруппы С.
аденовирусные аденовирусные аденовирусные
23. Способ по любому из пп.9-20, где указанная последовательность, кодирующая Е4-огГб, и указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, получены из аденовируса одного и того же серотипа.
- 23 010828 частью последовательности, кодирующей Е4-огГ6, полученной из аденовируса третьего серотипа, причем указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него.
24. Способ по п.23, где указанная последовательность, кодирующая Е4-огГб, и указанная последовательность, кодирующая Е1В-55К, получены из аденовируса серотипа 5.
- 24 010828
25. Способ по п.9, где указанные комплементирующие клетки являются клетками РЕК.Сб или производными клеток РЕК.Сб.
26. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения инфекционного заболевания, содержащая рекомбинантный аденовирусный вектор по любому из пп.1-8.
27. Набор для получения рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, по п.1, содержащий:
a) комплементирующие клетки для получения указанного вектора, экспрессирующие белки Е1, включая белок Е1В-55К или его функциональную часть, производное и/или аналог, полученные из аденовируса второго серотипа; и
b) один или несколько векторов реплицируемых нуклеиновых кислот, кодирующих все остальные необходимые аденовирусные элементы, такие как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора в указанных комплементирующих клетках, причем указанные элементы содержат, по меньшей мере, некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательность, кодирующую функциональный белок Е4-огГб или его функциональную часть, производное или аналог, который совместим с указанным белком Е1В-55К, экспрессируемым в указанных комплементирующих клетках.
EA200401424A 2002-04-25 2003-04-24 Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его получения и применения EA010828B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL0200280 2002-04-25
PCT/EP2003/050125 WO2003104467A1 (en) 2002-04-25 2003-04-24 Means and methods for the production of adenovirus vectors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401424A1 EA200401424A1 (ru) 2005-04-28
EA010828B1 true EA010828B1 (ru) 2008-12-30

Family

ID=29728828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401424A EA010828B1 (ru) 2002-04-25 2003-04-24 Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его получения и применения

Country Status (23)

Country Link
US (2) US7468181B2 (ru)
EP (1) EP1497438B1 (ru)
JP (1) JP4495587B2 (ru)
KR (1) KR101021387B1 (ru)
CN (1) CN100497639C (ru)
AT (1) ATE447037T1 (ru)
AU (1) AU2003271737B2 (ru)
BR (1) BR0308783A (ru)
CA (1) CA2477954C (ru)
DE (1) DE60329835D1 (ru)
DK (1) DK1497438T3 (ru)
EA (1) EA010828B1 (ru)
ES (1) ES2335657T3 (ru)
HK (1) HK1068371A1 (ru)
IL (2) IL164803A0 (ru)
MX (1) MXPA04008891A (ru)
NO (1) NO332108B1 (ru)
NZ (1) NZ534866A (ru)
PL (1) PL215165B1 (ru)
PT (1) PT1497438E (ru)
SI (1) SI1497438T1 (ru)
WO (1) WO2003104467A1 (ru)
ZA (1) ZA200406942B (ru)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL122614A0 (en) 1995-06-15 1998-08-16 Introgene Bv Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
ES2335657T3 (es) * 2002-04-25 2010-03-31 Crucell Holland B.V. Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus.
ATE405663T1 (de) 2002-04-25 2008-09-15 Crucell Holland Bv Stabile adenovirale vektoren und methoden für deren vermehrung
AU2003268145A1 (en) * 2002-08-22 2004-03-11 Merck And Co., Inc. Methods for propagating adenovirus and virus produced thereby
WO2005030927A2 (en) * 2003-09-23 2005-04-07 Uab Research Foundation Methods and compositions for in vivo inflammation monitoring
ES2329607T3 (es) 2004-02-23 2009-11-27 Crucell Holland B.V. Metodos de purificacion de virus.
KR101255870B1 (ko) 2004-11-16 2013-04-17 아에라스 글로벌 티비 백신 파운데이션 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 다가 백신
ATE412737T1 (de) 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
WO2007110409A1 (en) * 2006-03-27 2007-10-04 Crucell Holland B.V. Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant
PL2350268T3 (pl) 2008-11-03 2015-05-29 Crucell Holland Bv Sposób wytwarzania wektorów adenowirusowych
WO2011045378A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
ES2445713T3 (es) 2009-10-15 2014-03-04 Crucell Holland B.V. Proceso para la purificación de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular
WO2011057248A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Genvec, Inc. Simian adenovirus and methods of use
NZ601424A (en) 2010-02-15 2014-07-25 Crucell Holland Bv Method for the production of ad26 adenoviral vectors
CA2808556A1 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Crucell Holland B.V. Therapeutic vaccination against active tuberculosis
MX354752B (es) 2010-09-27 2018-03-20 Janssen Vaccines & Prevention Bv Regimen de vacunacion de sensibilizacion y refuerzo heterologo contra malaria.
CN103370411B (zh) 2010-12-14 2016-05-04 美国卫生和人类服务部 腺病毒血清型26和血清型35线状病毒疫苗
US20140155469A1 (en) 2011-04-19 2014-06-05 The Research Foundation Of State University Of New York Adeno-associated-virus rep sequences, vectors and viruses
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
SG11201402633UA (en) 2011-11-28 2014-09-26 Crucell Holland Bv Influenza virus vaccines and uses thereof
SG11201405228VA (en) 2012-03-12 2014-11-27 Crucell Holland Bv Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9125870B2 (en) 2012-03-22 2015-09-08 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
EP2827895B1 (en) 2012-03-22 2017-08-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
JP6162224B2 (ja) 2012-05-24 2017-07-12 クルセル ホランド ベー ヴェー 血管組織の形質導入のためのアデノウイルスベクター
WO2014153204A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
AP2015008815A0 (en) 2013-04-25 2015-10-31 Crucell Holland Bv Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides
MY171210A (en) 2013-06-17 2019-10-02 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
ES2711115T3 (es) 2013-09-19 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Formulaciones de adenovirus mejoradas
BR112017003891A2 (pt) 2014-09-03 2017-12-26 Bavarian Nordic As métodos e composições para induzir imunidade protetora contra infecção por filovírus
BR112017004202A2 (pt) 2014-09-03 2019-09-03 Bavarian Nordic As composições para intensificar respostas imunes e seus usos
EA037583B1 (ru) 2014-09-26 2021-04-16 Бет Изрейэл Диконисс Медикал Сентер, Инк. Способы и композиции для индукции защитного иммунитета против инфекции вирусом иммунодефицита человека
MY181175A (en) 2014-11-04 2020-12-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv16 vaccines
SI3283634T1 (sl) 2015-04-14 2019-08-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Rekombinantni adenovirus, ki izraža dva transgena z dvosmernim promotorjem
CN104846013B (zh) * 2015-04-15 2018-11-09 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用
EP3319634B1 (en) 2015-07-07 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
JP7189014B2 (ja) 2015-07-07 2022-12-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｒｓｖに対するワクチン
EA037295B1 (ru) 2015-08-20 2021-03-05 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Терапевтические вакцины против hpv18
JP6487604B2 (ja) 2015-10-06 2019-03-20 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 生物学的製剤のプラスチック誘起分解を防止する方法
JP7171433B2 (ja) * 2015-10-30 2022-11-15 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ｈｅｒ－２発現固形腫瘍の処置のための組成物および方法
PT3390430T (pt) 2015-12-15 2019-11-20 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antígenos, vetores, composições para o vírus da imunodeficiência humana e métodos da sua utilização
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
KR20180112024A (ko) 2016-02-23 2018-10-11 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 바이러스 동역학에 미치는 영향 최소화를 위한 치료용 아데노바이러스의 외인성 유전자 발현
DK3439672T3 (da) 2016-04-05 2021-02-15 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabiliserede opløselige præfusions-rsv-f-proteiner
JP7233928B2 (ja) 2016-04-05 2023-03-07 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｒｓｖに対するワクチン
CN109922829A (zh) 2016-05-02 2019-06-21 扬森疫苗与预防公司 治疗性hpv疫苗组合
KR102573534B1 (ko) 2016-05-12 2023-08-31 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터
ES2836598T3 (es) 2016-05-30 2021-06-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteínas F de RSV prefusión estabilizadas
KR102389489B1 (ko) 2016-06-16 2022-04-22 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Hiv 백신 제형
CN109312362B (zh) 2016-06-20 2022-06-28 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
JP7229151B2 (ja) 2016-07-14 2023-02-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｈｐｖワクチン
US10925956B2 (en) 2016-07-15 2021-02-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
EP3484505A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
US10307477B2 (en) 2016-09-02 2019-06-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
BR112019004593A2 (pt) 2016-09-15 2019-07-02 Janssen Vaccines & Prevention Bv mutações da proteína do envelope do hiv estabilizando o trímero
CN110062630A (zh) 2016-12-12 2019-07-26 萨克生物研究学院 肿瘤靶向合成腺病毒及其用途
AU2018217935B2 (en) 2017-02-09 2020-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
WO2018185732A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen
CA3062591A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Gritstone Oncology, Inc. Alphavirus neoantigen vectors
WO2018210871A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
JP2020519663A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． Ｒｓｖ感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物
WO2018218240A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Epicentrx, Inc. Recombinant adenoviruses carrying transgenes
EP3638302B1 (en) 2017-06-15 2024-03-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Poxvirus vectors encoding hiv antigens, and methods of use thereof
WO2019016062A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV ENVELOPE PROTEIN MUTATIONS STABILIZING TRIMERIC FORM
US20190022212A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human
CN111163799A (zh) 2017-07-28 2020-05-15 扬森疫苗与预防公司 用于异源repRNA免疫接种的方法和组合物
SG11202001458SA (en) 2017-09-15 2020-03-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Method for the safe induction of immunity against rsv
US20190083620A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
WO2019086461A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
MX2020004487A (es) 2017-10-31 2020-08-13 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus y usos de estos.
JP7438943B2 (ja) 2017-10-31 2024-02-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー アデノウイルス及びその用途
AU2018357912B2 (en) 2017-10-31 2023-11-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
US10864263B2 (en) 2017-11-20 2020-12-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen
MX2020006471A (es) 2017-12-19 2020-09-22 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Metodos y composiciones para inducir una respuesta inmune contra el virus de hepatitis b (hbv).
EP3735271A4 (en) 2018-01-04 2022-06-15 Iconic Therapeutics, Inc. ANTI-TISSUE FACTOR ANTIBODIES, ANTIBODY DRUG CONJUGATES AND RELATED METHODS
US11713469B2 (en) 2018-07-20 2023-08-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenoviral vector expressing Zika antigen with improved productivity
US11517618B2 (en) 2018-09-25 2022-12-06 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method of inducing an immune response against human immunodeficiency virus by co-localized administration of vaccine components
CN113950333A (zh) 2019-05-15 2022-01-18 扬森疫苗与预防公司 使用基于腺病毒的疫苗预防性治疗呼吸道合胞病毒感染
AU2020275455A1 (en) 2019-05-15 2021-12-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
TW202110476A (zh) 2019-05-22 2021-03-16 荷蘭商傑森疫苗防護公司 於接受抗反轉錄病毒治療之個體中誘發抗人類免疫缺乏病毒感染之免疫反應的方法
JP7457733B2 (ja) 2019-05-30 2024-03-28 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 改変アデノウイルス
US20220372515A1 (en) 2019-10-03 2022-11-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
WO2021209897A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
MX2022014162A (es) 2020-05-11 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteínas de fusión de la proteína de la espícula del coronavirus estabilizadas.
EP4149530A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Administration of homologous adenoviral vectors
IL299515A (en) 2020-06-29 2023-02-01 Janssen Vaccines & Prevention Bv Immune combination against respiratory syncytial virus infection
IL299459A (en) 2020-07-06 2023-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteins fused to stabilized coronavirus spike proteins
BR112022027038A2 (pt) 2020-07-08 2023-01-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Vacinas de replicon de rna contra hbv
CA3189238A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Transgene Treatment of immune depression
WO2022032196A2 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
US20230374542A1 (en) 2020-10-07 2023-11-23 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21 (lgmd21)
WO2022084333A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Hiv vaccine regimens
EP4242318A4 (en) * 2021-01-21 2024-02-14 Cellid Co., Ltd NEW ADENOVIRAL VECTOR NOT INCLUDING REPLICATION COMPETENT ADENOVIRUS AND ASSOCIATED USE
WO2022175479A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections
US20240228548A9 (en) 2021-02-19 2024-07-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv fb antigens
AU2022249741A1 (en) 2021-04-01 2023-09-21 Msd International Business Gmbh Stabilized pre-fusion piv3 f proteins
WO2023020939A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023026182A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023047348A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized corona virus spike protein fusion proteins
WO2023047349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins
WO2023111725A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023110618A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023217988A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
CN117264902A (zh) * 2022-06-15 2023-12-22 上海元宋生物技术有限公司 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用
EP4338727A1 (en) 2022-09-14 2024-03-20 Roquette Freres Adenovirus formulations
WO2024061759A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized coronavirus s proteins
WO2024061757A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Pre-fusion human piv1 f proteins
WO2024074584A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698443A (en) * 1995-06-27 1997-12-16 Calydon, Inc. Tissue specific viral vectors
WO1998001563A2 (en) * 1996-07-05 1998-01-15 Branton Philip E Adenovirus e4 proteins for inducing cell death
WO1998046779A1 (en) * 1997-04-14 1998-10-22 Genzyme Corporation Adenoviral vectors comprising a modified e4 region but retaining e4orf3
WO1998046781A2 (en) * 1997-04-14 1998-10-22 Genzyme Corporation Novel transgene expression system for increased persistence
US5849561A (en) * 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
WO1999061640A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University College London Aav derived vector
WO2000029573A2 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Canji, Inc. Adenoviral vectors
WO2000070071A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Crucell Holland B.V. Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35
WO2001083797A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593002A (en) 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
US4487829A (en) 1982-03-23 1984-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies against adenoviruses
US4792525A (en) 1982-08-04 1988-12-20 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
US4589881A (en) 1982-08-04 1986-05-20 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide
US4517686A (en) 1982-08-04 1985-05-21 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide
US4578079A (en) 1982-08-04 1986-03-25 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US6007806A (en) 1986-08-13 1999-12-28 Transgene S.A. Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor
FR2602790B1 (fr) 1986-08-13 1990-06-01 Transgene Sa Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante
US5166320A (en) 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US4956281A (en) 1987-06-03 1990-09-11 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lymphocyte function associated antigen-3
US5024939A (en) 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA2000048A1 (en) 1988-10-03 1990-04-03 Edward F. Plow Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand bindin g
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5223394A (en) 1989-04-10 1993-06-29 Biogen, Inc. Recombinant dna molecule comprising lymphocyte function-associated antigen 3 phosphatidylinositol linkage signal sequence
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5240846A (en) 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5332567A (en) 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
EP0496818B1 (en) 1989-10-20 1999-06-23 Trustees Of Dartmouth College MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR IgA RECEPTOR
EP0595798B1 (en) 1989-10-20 1999-03-03 Medarex, Inc. Bispecific heteroantibodies with dual effector functions
AU7906691A (en) 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US5246921A (en) 1990-06-26 1993-09-21 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Method for treating leukemias
GB2246779B (en) 1990-08-03 1994-08-17 Delta Biotechnology Ltd Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells
GB9101550D0 (en) 1991-01-24 1991-03-06 Mastico Robert A Antigen-presenting chimaeric protein
ATE237694T1 (de) 1991-08-20 2003-05-15 Us Gov Health & Human Serv Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
FR2681786A1 (fr) 1991-09-27 1993-04-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires.
IL103059A0 (en) 1991-09-30 1993-02-21 Boehringer Ingelheim Int Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
AU692423B2 (en) 1992-09-25 1998-06-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
ATE307212T1 (de) 1992-11-18 2005-11-15 Arch Dev Corp Adenovirus-gelenkter gen-transfer zum herz-und glatten vaskulären muskel
GB9300686D0 (en) 1993-01-15 1993-03-03 Imp Cancer Res Tech Compounds for targeting
AU6133394A (en) 1993-02-09 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
WO1994026915A1 (en) 1993-05-10 1994-11-24 The Regents Of The University Of Michigan Gene transfer into pancreatic and biliary epithelial cells
US5543328A (en) 1993-08-13 1996-08-06 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having modified fiber proteins
EP0716711A1 (de) 1993-09-03 1996-06-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vektor für leber-gentherapie
US5552311A (en) 1993-09-14 1996-09-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy
US5534423A (en) 1993-10-08 1996-07-09 Regents Of The University Of Michigan Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
IT1271461B (it) 1993-12-01 1997-05-28 Menarini Ricerche Sud Spa Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso.
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US6057299A (en) 1994-01-13 2000-05-02 Calydon, Inc. Tissue-specific enhancer active in prostate
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US6312699B1 (en) 1994-03-28 2001-11-06 Uab Research Foundation Ligands added to adenovirus fiber
US7252989B1 (en) 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
DE69520496T2 (de) 1994-05-13 2001-07-12 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Verfahren und zusammensetzungen als vehikel zur zielgerichtete einbringen von genen
US5571531A (en) 1994-05-18 1996-11-05 Mcmaster University Microparticle delivery system with a functionalized silicone bonded to the matrix
US5570975A (en) 1994-06-27 1996-11-05 Reinert, Sr.; Gary L. Metal foundation push-it and installation apparatus and method
FR2721943B1 (fr) * 1994-06-29 1996-08-02 Rhone Poulenc Rorer Sa Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutase
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
AU705595B2 (en) 1994-09-09 1999-05-27 Neurocrine Biosciences, Incorporated Interleukin-1 type 3 receptors
FR2724846B1 (fr) 1994-09-27 1996-12-20 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras
FR2725726B1 (fr) 1994-10-17 1997-01-03 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
FR2727867B1 (fr) * 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
US6127525A (en) 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
IL122614A0 (en) 1995-06-15 1998-08-16 Introgene Bv Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6676935B2 (en) 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
US7001764B2 (en) 1995-06-27 2006-02-21 Cell Genesys, Inc. Compositions comprising tissue specific adenoviral vectors
US5622699A (en) 1995-09-11 1997-04-22 La Jolla Cancer Research Foundation Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
JP2001520511A (ja) 1995-12-08 2001-10-30 ザ ユーナヴァーサティ オブ アラバマ アト バーミングハム リサーチ ファンデーション 向標的性アデノウイルス・ベクター
US5877011A (en) 1996-11-20 1999-03-02 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors
US5922315A (en) 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
US6486133B1 (en) 1997-03-07 2002-11-26 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods for inducing localized vascular development and enhancing the repair of a wound in the mammamian dermis
IL132673A0 (en) 1997-05-08 2001-03-19 Genetic Therapy Inc Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins
US6287857B1 (en) 1998-02-09 2001-09-11 Genzyme Corporation Nucleic acid delivery vehicles
US6417168B1 (en) * 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
WO1999047180A1 (en) 1998-03-20 1999-09-23 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors for targeted gene delivery
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
US20030017138A1 (en) 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
AU5689699A (en) 1998-08-24 2000-03-14 Uab Research Foundation Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus
EP1020529B1 (en) 1998-11-20 2005-06-01 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
EP1016726A1 (en) 1998-12-30 2000-07-05 Introgene B.V. Gene therapy to promote angiogenesis
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
EP1067188A1 (en) 1999-07-08 2001-01-10 Introgene B.V. Infection with chimaeric adenoviruses of cells negative for the adenovirus serotype 5 Coxsacki adenovirus receptor (CAR)
EP1157999A1 (en) 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
US20020152553A1 (en) * 2001-03-22 2002-10-24 Wynveen Pamela Sue Travel pillow securing to bucket seats
US6844192B2 (en) * 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US20030026783A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-06 Amine Abina Method of modulating neutralizing antibodies formation in mammals, and uses thereof in gene therapy, animal transgenesis and in functional inactivation of an endogenous proteins
CA2478651A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-25 Merck & Co., Inc. Method of inducing an enhanced immune response against hiv
ATE405663T1 (de) * 2002-04-25 2008-09-15 Crucell Holland Bv Stabile adenovirale vektoren und methoden für deren vermehrung
ES2335657T3 (es) * 2002-04-25 2010-03-31 Crucell Holland B.V. Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus.
EP1553983A2 (en) 2002-10-23 2005-07-20 Crucell Holland B.V. New settings for recombinant adenoviral-based vaccines
WO2004055187A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Crucell Holland B.V. Recombinant viral-based malaria vaccines
US20070010016A1 (en) * 2005-03-11 2007-01-11 Mccelland Alan Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698443A (en) * 1995-06-27 1997-12-16 Calydon, Inc. Tissue specific viral vectors
WO1998001563A2 (en) * 1996-07-05 1998-01-15 Branton Philip E Adenovirus e4 proteins for inducing cell death
WO1998046779A1 (en) * 1997-04-14 1998-10-22 Genzyme Corporation Adenoviral vectors comprising a modified e4 region but retaining e4orf3
WO1998046781A2 (en) * 1997-04-14 1998-10-22 Genzyme Corporation Novel transgene expression system for increased persistence
US5849561A (en) * 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
WO1999061640A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University College London Aav derived vector
WO2000029573A2 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Canji, Inc. Adenoviral vectors
WO2000070071A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Crucell Holland B.V. Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35
WO2001083797A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production

Also Published As

Publication number Publication date
CA2477954A1 (en) 2003-12-18
SI1497438T1 (sl) 2010-03-31
US20050158278A1 (en) 2005-07-21
PL373304A1 (en) 2005-08-22
HK1068371A1 (en) 2005-04-29
PT1497438E (pt) 2010-02-04
US7820440B2 (en) 2010-10-26
JP4495587B2 (ja) 2010-07-07
EP1497438A1 (en) 2005-01-19
JP2005523729A (ja) 2005-08-11
BR0308783A (pt) 2005-01-04
PL215165B1 (pl) 2013-10-31
CN100497639C (zh) 2009-06-10
ES2335657T3 (es) 2010-03-31
US7468181B2 (en) 2008-12-23
DE60329835D1 (de) 2009-12-10
MXPA04008891A (es) 2004-11-26
EP1497438B1 (en) 2009-10-28
ATE447037T1 (de) 2009-11-15
ZA200406942B (en) 2005-11-30
CN1650020A (zh) 2005-08-03
KR20040106363A (ko) 2004-12-17
AU2003271737A1 (en) 2003-12-22
NZ534866A (en) 2007-04-27
IL164803A (en) 2011-07-31
IL164803A0 (en) 2005-12-18
AU2003271737B2 (en) 2007-04-19
NO332108B1 (no) 2012-06-25
KR101021387B1 (ko) 2011-03-14
US20080199917A1 (en) 2008-08-21
NO20045130L (no) 2005-01-18
CA2477954C (en) 2012-07-10
EA200401424A1 (ru) 2005-04-28
WO2003104467A1 (en) 2003-12-18
DK1497438T3 (da) 2010-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010828B1 (ru) Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его получения и применения
KR100403708B1 (ko) 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도
CN100374574C (zh) 稳定的腺病毒载体及其增殖方法
KR100379569B1 (ko) 개기원의아데노바이러스벡터및유전자치료에서이의사용방법
US20040161848A1 (en) Adenoviral vector and related system and methods of making and use
US9133248B2 (en) Methods of propagating monkey adenoviral vectors
AU2001245944B2 (en) Human urothelial cell specific uroplakin transcriptional regulatory sequences, vectors comprising the same, and methods of use thereof
AU2001245944A1 (en) Human urothelial cell specific uroplakin transcriptional regulatory sequences, vectors comprising the same, and methods of use thereof
KR100484441B1 (ko) IVa2유전자가불활성화된결손재조합아데노바이러스
WO2001002540A2 (en) Adenoviral vectors for treating disease
EP4222272A1 (en) Rescue of recombinant adenoviruses by crispr/cas-mediated in vivo terminal resolution
JP5260815B2 (ja) 組換えアデノウイルスおよびアデノウイルスライブラリーの調製
CN113774031B (zh) 一种复制型人腺病毒及其应用
AU2002327630A1 (en) Adenoviral vector and related system and methods of making and use

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM