CN109922829A - 治疗性hpv疫苗组合 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用作针对HPV18和/或HPV16的治疗剂的载体、疫苗、疫苗组合物和疫苗组合。

Description

治疗性HPV疫苗组合
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)本申请有权享有于2015年8月24日提交的美国临时专利申请号62/209,091和于2015年8月27日提交的美国临时专利申请号62/210,655的优先权，其披露内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及医学领域并且更具体地涉及可以被用作针对人类乳头瘤病毒18型和/或16型的治疗剂的核酸构建体、多肽、载体、疫苗、疫苗组合。
对以电子方式提交的序列表的引用
本申请含有一个序列表，该序列表经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，其文件名为“0269_US_P00_PRO_ST25”，创建日期为2016年4月25日，且大小约为64,700字节。经由EFS-Web提交的序列表是该说明书的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)家族由大于100种类型(也称为亚型)组成，这些类型能够感染皮肤或黏膜的角质细胞。超过40种类型的HPV典型地通过性接触进行传播，并且肛殖区的HPV感染在无论男女中都非常常见。一些性传播的HPV类型可以引起生殖器疣。持续感染“高危”HPV类型(例如16、18、31、45型)——不同于引起皮肤疣的那些——可以发展成癌前病变和浸润性癌症，例如宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌和肛门癌。在感染后的一至两年内，大部分的HPV感染将自发清除。在健康个体中，当抗原激发时，特异性针对HPV-16的病毒早期蛋白E2、E6和E7的循环的Th1-型和Th2-型CD4+T-细胞连同E6-特异性的CD8+T细胞迁移到皮肤中，表明针对HPV-16感染的成功防御通常与这些病毒早期抗原的系统效应T-细胞应答有关。在小部分(约1％)的感染个体中，HPV感染持续，最终导致生殖器肿瘤病变。在高危HPV中，HPV16和HPV18是宫颈癌的主要原因，一起引起了约70％的病例，并且这两种类型还在其他HPV诱导的癌症例如肛门癌和口咽癌中起到了主要作用。在世界范围内，HPV是引起癌症的最重要的传染性病原体之一。
针对HPV的疫苗接种被视为减少HPV感染发病率或影响的一种可行策略(van derBurg和Melief，2011，Curr Opinion Immunol[免疫学当今观点]23:252-257)。
基于由HPV16和18型的蛋白L1(包膜蛋白)所形成的病毒样颗粒(VLP)的预防性HPV疫苗在预防HPV16和HPV18的持续感染和相关疾病的方面中非常有效。这些疫苗被认为是通过诱导针对该L1蛋白的中和抗体提供了无菌免疫。添加来自另外的高危HPV类型的基于L1的VLP可以进一步增加此类疫苗赋予的保护宽度。
然而，当此类疫苗可以预防初始感染(即，它们引起了预防)时，不存在对由HPV16和HPV18引起的已形成的生殖器病变的有益作用的证明，因此它们不被认为是针对HPV的治疗性疫苗(Hildesheim等人，2007，JAMA[美国医学会杂志]298:743-53)。
尽管引入了这些预防性疫苗，但是大量人群已经获得或仍处于获得持久性高危HPV感染的风险，并且因此处于患上癌症的风险。用于根除已形成的HPV感染和相关疾病的治疗性疫苗是一项紧急未满足的医疗需要。
已经描述了一些解决这项需要的尝试。例如，已经用各种不同的疫苗接种策略进行临床试验，例如，由来自牛型结核菌(Mycobacterium bovis)和HPV-16E7的热休克蛋白(Hsp)或来自HPV-16和HPV-18的E6、E7和L2的融合蛋白组成的融合蛋白、嵌合的L1-E7VLP、表达HPV-16和HPV-18的E6和E7或牛乳头瘤病毒E2的重组牛痘病毒、表达HPV-16和HPV-18的E6和E7的CTL表位的DNA疫苗、分泌HPV-16E7抗原的减活单核细胞增生李斯特菌(Lm)、以及包含HPV-16E6和E7肽的合成长肽(SLP)。虽然这些方法中的一些显示出了一些但有限的临床疗效，但大多数失败了，证实了需要改善当前的策略。
编码早期HPV蛋白E6和E7的基因的整合是从感染到癌症的过程中一项必要的步骤，并且针对保持宫颈癌细胞的肿瘤表型，需要E6和E7的连续表达。因此，E6和E7被认为是针对治疗性疫苗接种的良好的靶标。如提到的一些研究已经显示了感染了高危HPV的女性的治疗性疫苗接种可以诱导现有病变的消退。Kenter等人显示了使用衍生自HPV16E6和E7蛋白的SLP以及佐剂作为一种治疗性疫苗的在患有外阴上皮内瘤样病变(VIN)的47％患者中的持久并完全消退(Kenter等人，2009，N Engl J Med[新英格兰医学杂志]361:1838-47)。类似地，一项研究，其中在VIN 2/3患者中将基于蛋白的疫苗(TA-CIN，由HPV16E6、E7和L2的融合蛋白组成)与局部免疫调控结合，显示出了在63％患者中的完全消退(Daayana等人，2010，Br J Cancer[英国癌症杂志]102:1129-36)。作为疫苗的合成长肽的可能缺陷包括大规模的生产及其相关成本、对潜在反应佐剂的需要以及与免疫接种有关的有关不良作用(尤其是疼痛和肿胀)。由于高度不适，当自发清除率仍然很高的时候，SLP将不可能被用于早期阶段疾病。类似地，由于在TA-CIN治疗的情况下针对局部咪喹莫特治疗的需要，耐受性是一个重要问题，因为大部分女性经历了持续咪喹莫特治疗期间的局部或全身性副作用，这可能影响日常活动。
一种可能的替代方案是使用基于核酸疫苗接种例如编码用于疫苗接种的HPV E6和/或E7蛋白的DNA疫苗或病毒载体疫苗。
然而，HPV E6和E7蛋白具有致癌的潜力，并且因此由于抗原的拖延表达的可能性，用包括编码这些蛋白的核酸的疫苗接种造成了诱导细胞转化的风险。
因此，在基因疫苗接种的情况下，可以使用无毒的/脱毒版本的E6和/或E7，以便排除因为疫苗接种的任何细胞转化风险。通常通过针对这些蛋白功能已知重要的残基的缺失和/或取代来获得野生型E6和E7的致癌潜能丧失(例如，Smahel等人，2001，Virology[病毒学]281:231-38；Yan等人，2009，Vaccine[疫苗]27:431-40；Wieking等人，2012，CancerGene Ther[癌症基因治疗]19:667-74)。然而，这些方法的缺点是它们会带来从蛋白去除重要T-细胞表位和/或将新的不希望的T-细胞表位导入蛋白中的风险，并且因此可能不会引起所希望的免疫应答。
在去除HPV16E6和E7的致癌潜能的可替代策略中，已经构建了E6和E7蛋白的改组版本(即，多肽，其中重新排序野生型蛋白的片段)(例如，等人，2006，Vaccine[疫苗]24:2880-93；Oosterhuis等人，2011，Int J Cancer[国际癌症杂志]129:397-406；Oosterhuis等人，2012，Hum Gen Ther[人类基因治疗]23:1301-12)。然而，这些方法将仍需要生产、配制并且给予多种分子以确保包括E6和E7蛋白的所有可能性表位，这导致了次优的逻辑和相对的高成本，并且此外所描述的策略引入了不存在于E6和E7中的潜在强大的非天然表位，并且由于免疫应答可以源自与此类非天然表位相关的E6/E7表位，因此所述构建体可以不具有最优的免疫学特性。表达一种细胞内靶向融合蛋白(该融合蛋白具有HPV16和HPV18两者的E6和E7的内置遗传佐剂和改组片段)的治疗性DNA疫苗也已经被描述，并且其电穿孔增强免疫接种随其在CIN3患者中引起显著的E6/E7特异性T细胞应答(Kim等人，2014)。
本领域仍需要针对HPV的治疗性疫苗，优选具有较少上述方法缺点的那些。
发明内容
本发明提供了一种或多种载体、疫苗、和疫苗组合，其可用于产生针对HPV感染的免疫应答。在各种实施例中，本发明包含编码多肽或融合蛋白的核酸分子，该多肽或融合蛋白基本上包含HPV16或HPV18癌蛋白E6和E7的所有可能的T-细胞表位，然而该核酸分子，通过包括已经重新排序的E6和E7蛋白的片段，同时还含有最小化数量的不希望的强的新表位，具有大幅降低的(与wt E6和E7相比)直至不能检测到的转化活性。这与之前由其他人所报告的分子相反。本发明提供了能在针对HPV16或HPV18的治疗性疫苗中使用的分子。
在各种另外的实施例中，这些载体、疫苗和疫苗组合包含编码多肽或融合蛋白的核酸分子，该多肽或融合蛋白基本上包含HPV16或HPV18癌蛋白E6和E7的所有可能的T细胞表位，但是具有大幅降低的(与wt E6和E7相比)，直至不能检测到的转化活性。至少在一个方面，这一点实现了，因为载这些体、疫苗、和疫苗组合包含已经重新排序的E6和E7蛋白的片段，但同时含有最小数量的不希望的强的新表位。这与之前由其他人所报告的分子相反。在优选的实施例中，由这些载体、疫苗或疫苗组合编码的多肽或融合蛋白进一步包含HPV16或HPV18的E2蛋白或其片段。本发明提供了能在针对HPV16或HPV18的治疗性疫苗中使用的分子。这些分子还可以与针对HPV16和HPV18两者的治疗性疫苗组合。
在某些实施例中，本发明针对HPV16提供了载体、疫苗、和疫苗组合，其包含编码多肽的核酸分子，该多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，或其组合。在某些优选的实施例中，本发明针对HPV16提供了载体、疫苗、和疫苗组合，其包含编码多肽的核酸分子，该多肽包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在其他实施例中，本发明针对HPV18提供了载体、疫苗、和疫苗组合，其包含编码多肽的核酸分子，该多肽包含如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，或其组合。在某些优选的实施例中，本发明针对HPV18提供了载体、疫苗、和疫苗组合，其包含编码多肽的核酸分子，该多肽包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在一些方面，本发明的编码的多肽可以进一步包含前导序列。
在某些实施例中，该编码的多肽包含HPV16E2蛋白或HPV18E2蛋白的至少一个表位。该E2蛋白可以例如在其转录激活和/或DNA结合结构域中被灭活，例如通过缺失、突变或通过蛋白质的不同部分的结构重排。在针对HPV16的某些实施例中，所编码的多肽包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。在针对HPV18的某些实施例中，所编码的多肽包含如SEQID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，针对HPV16，该核酸序列包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示的多核苷酸序列，或其组合。在某些优选的实施例中，针对HPV16，该核酸序列包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ IDNO:24所示的多核苷酸序列。
在某些其他的实施例中，针对HPV18，该核酸序列包含如SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33所示的多核苷酸序列，或其组合。在某些优选的实施例中，针对HPV18，该核酸序列包含如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、或SEQ IDNO:25所示的多核苷酸序列。
本发明还提供了疫苗和疫苗组合物，其包含根据本发明的重组病毒载体和药学上可接受的赋形剂。该重组病毒载体包含一种或多种根据本发明的核酸分子，其中编码该多肽的序列与启动子可操作地连接。
在某些实施例中，该载体是病毒栽体，例如，重组痘病毒载体或重组腺病毒载体。在某些优选的实施例中，该载体是重组腺病毒或重组MVA病毒。在另外的优选的实施例中，该MVA病毒载体是MVA-BN或其衍生物。在仍另外的优选的实施例中，该腺病毒载体选自rAd26和rAd35，且最优选地是rAd26。
在某些优选的实施例中，有一种疫苗组合，其包含：
a)第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的一种或多种重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体同时包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，连同药学上可接受的载体；和
b)第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
其中该MVA载体包含MVA-BN或其衍生物。
根据本发明的实施例，该第一多肽和第三多肽可以相同或不同。例如，该第一和第三多肽之一可含有在另一多肽不存在情况下的另外的氨基酸序列，或者该第一和第三多肽可含有彼此不同的另外的氨基酸序列。类似地，该第二和第四多肽可以相同或不同。该第一核酸和第三核酸可以相同或不同。例如，该第一和第三核酸可以不同，因为他们编码不同的第一和第三多肽，和/或对相同的氨基酸使用不同的密码子。类似地，该第二和第四核酸可以相同或不同。
在某些另外的优选实施例中，a)和b)二者的第一疫苗和第二疫苗各自进一步包含编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第五多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的第六多肽的核酸。该第五和第六多肽各自可以独立地表达或优选地作为含有本发明的E6和E7多肽的融合蛋白的一部分表达。
在其他另外的优选的实施例中，编码包含该第一疫苗和第二疫苗中每一种的SEQID NO:1的氨基酸序列的多肽的核酸进一步编码该第五多肽。优选地，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽和该第五多肽一起在融合蛋白中表达，例如包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的氨基酸序列的多肽。编码包含该第一和第二疫苗中每一种的SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽的核酸优选地进一步编码该第六多肽。优选地，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽和该第六多肽一起在融合蛋白中表达，例如包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽。
在仍其他优选的实施例中，编码包含该第一疫苗和第二疫苗中的一种或两种的SEQ ID NO:1的多肽的核酸是编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸的一部分。在仍另外的优选的实施例中，编码包含该第一疫苗和第二疫苗中的一种或两种的SEQ ID NO:20的多肽的核酸是编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸的一部分。
在各种实施例中，编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的核酸与SEQ IDNO:2的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽的核酸与SEQ ID NO:21的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。在其他的实施例中，编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的核酸与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽的核酸与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
本发明还提供了在对其有需要的受试者中诱导针对HPV，特别是HPV16或HPV18，或者HPV16和HPV18的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予根据本发明的载体、疫苗、或疫苗组合。本发明还提供了根据本发明的载体、疫苗、或疫苗组合，用于在对其有需要的受试者中诱导针对HPV，特别是HPV16或HPV18，或者HPV16和HPV18二者的免疫应答。
在某些实施例中，将本发明的载体或疫苗向该受试者给予不止一次。
在某些实施例中，将根据本发明的载体、疫苗、或疫苗组合物向对其有需要的受试者给予，优选地人类受试者，作为引发-加强方案。在优选的实施例中，该引发-加强方案包含引发疫苗，该引发疫苗包含免疫有效量的(i)包含编码根据本发明的多肽的核酸的重组腺病毒载体，连同药学上可接受的载体；或(ii)包含编码根据本发明的多肽的核酸的第一重组腺病毒载体，和包含编码根据本发明的不同多肽的核酸的第二重组腺病毒载体，连同药学上可接受的载体。还有一种包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体的加强疫苗，该MVA载体包含编码根据本发明的多肽(优选地编码根据本发明的两种不同多肽)的核酸，连同药学上可接受的载体。
在其他各种实施例中，该引发-加强方案包含引发疫苗，该引发疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码根据本发明的多肽的核酸，连同药学上可接受的载体。还有一种加强疫苗，该加强疫苗包含免疫有效量的(i)包含编码根据本发明的多肽的核酸的重组腺病毒载体，连同药学上可接受的载体；或(ii)包含编码根据本发明的多肽的核酸的第一重组腺病毒载体，和包含编码根据本发明的不同多肽的核酸的第二重组腺病毒载体，连同药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种用于治疗对其有需要的受试者中以下任一项的方法：持续性HPV感染(特别是持续性HPV16或HPV18感染)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌，该方法包括向该受试者给予根据本发明的载体、疫苗、或疫苗组合。本发明还提供了根据本发明的载体、疫苗、或疫苗组合，用于治疗对其有需要的受试者中的以下任一项：持续性HPV感染(具体是持续性HPV16或HPV18感染)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌。
附图说明
当连同附图一起阅读时，会更好地理解先前概述以及以下本发明的详述。应理解的是本发明不限于附图中示出的准确实施例。
图1.HPV16E6和E7的融合蛋白的表达。将HEK-293T细胞用DNA载体进行瞬时转染，该DNA载体表达图之上所指示的转基因。在转染后24hr，收获细胞并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法用HPV16E7的抗体(上图)分析细胞抽提物。显示了NF-κB的加载对照(下图)确认了所有泳道中细胞裂解物的类似的加载。分子量标记在左侧表明。融合蛋白的预期大小：E6E7SH，约38kDa；E2E6E7SH和E6E7E2SH，约75kDa；LSE2E6E7SH，约78kDa。
图2.软琼脂中的菌落形成。A)软琼脂测定设置的示意图。B)在接种后六周的琼脂中以细胞40x放大率的代表性显微图像。白色箭头强调在E7wt转染细胞中所观察到的菌落。C)接种后六周，在琼脂中使用GelcountTM和相关的软件的菌落量化。*：p<0.05(泊松回归模型)；**：非劣效性(具有非劣效性界限为5％的广义线性模型)。
图3.HPV16E6E7SH已经失去了E6和E7活性。A)代表性蛋白质印迹证实了缺乏E6E7SH对p53的降解。将人类p53失效NCI-H1299细胞用表达p53的质粒连同表达HPV16E6野生型、HPV16E6E7SH的质粒或空载体进行共转染。非-TF表示非转染细胞。在转染后24小时，制备细胞裂解物，并且将30μg的总蛋白加载到凝胶上。上图-p53染色，中图-E6染色，下图-NF-κB染色(加载对照)。(B)在四种独立的测定中p53水平的量化。将该p53信号标准化至NF-κB信号。C)蛋白质印迹证实了E6E7SH对pRb的降解的缺乏，将pRb失效Saos-2细胞用表达pRb的质粒连同表达HPV16E7野生型、HPV16E6E7SH的质粒或空载体进行转染。非-TF表示非转染细胞。在转染后24小时，制备细胞裂解物，并且将10μg的总蛋白加载到凝胶上。上图-pRb染色，中图-E7染色，下图-NF-κB染色(加载对照)。D)在四种独立的测定中pRb水平的量化。将该pRb信号标准化至NF-κB信号。*：p<0.05(ANOVA模型)；**：非劣效性(试验是基于源自ANOVA模型的95％CI’s。非劣效性界限被设为75％)。
图4.HPV16E6E7SH不使原代人类表皮角质形成细胞永生化。将原代人类表皮角质形成细胞用编码HPV16(E6E7wt)的野生型E6-和E7-编码开放阅读框、HPV16E6E7SH序列或eGFP的慢病毒进行转导。非转导供体细胞被用作对照。如通过约200天的延长寿命和的hTERT激活(未显示)所示的，仅有E6E7wt的表达诱导原代角质形成细胞的永生化。十字架标志表示细胞在衰老过程中死亡并且不能进一步培养。关于详情，参见实例2。在两个另外的供体中获得相似的结果(未显示)。
图5.在DNA免疫之后由HPV16E6E7SH诱导的免疫应答-IFNγELISPOT分析。A.免疫接种方案。将CB6F1小鼠用表达HPV16E6E7SH的DNA质粒或不表达转基因的质粒(对照)进行免疫。免疫接种后两周，处死该小鼠并且用对应于E7的15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。B.以点形成单位(SFU)/106脾细胞给出如通过IFNγELISPOT测定所测量的个体小鼠中HPV16E7-特异性免疫应答。
图6.HPV16E6E7SH的免疫原性-IFNγELISPOT分析。(A).免疫接种方案。将小鼠用具有如所示的插入片段的腺病毒载体进行免疫。通过IFNγELISPOT分析处于两周(B)和处于八周(C)的E7-特异性应答(表示为点形成单位(SFU)/106脾细胞)。闭环代表用1*1010vp的剂量进行免疫的小鼠，并且开环代表用5*109vp进行免疫的小鼠。黑条代表应答的几何均数。点状线表示在ELISPOT测定中的检测下限。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在对数转换数据上进行的。*：p<0.05。关于详情，参见实例3。
图7.HPV16E2E6E7SH的免疫原性-E7-四聚体染色。(A).免疫接种方案。将CB6F1小鼠用1*1010vp的表达如所表示的转基因的腺病毒载体进行免疫。免疫接种后两周，处死该小鼠并且针对能够与E749-57-H2-Db四聚体(B)相互作用的CD8+细胞的存在分析分离的脾细胞。E7-四聚体阳性的CD8+T-细胞的百分比表示在y轴上。ANOVA事后邦弗朗尼分析是在对数转换数据上进行的，在不同的E6E7SH变体之间的差异无统计学意义。
图8.HPV16E2E6E7SH的免疫原性-IFNγELISPOT分析。(A).免疫接种方案。将CB6F1小鼠用表达图B和C下方所表示的转基因的腺病毒载体进行免疫。免疫接种后两周，处死该小鼠并且用对应于E2(B)、E6(未显示)或E7(C)的15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。以SFU/106脾细胞给出应答。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在对数转换数据上进行的。由仅编码E2的腺病毒载体所诱导的E2应答高于包括E6和E7片段的本发明多肽所诱导的应答。差异对E2与E2E6E7SH和E2与E6E7E2SH是显著的(*：p<0.05)。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在对数转换数据上进行的。
图9.在免疫的小鼠中的持续HPV16免疫应答。具体地，(A)免疫接种方案。将CB6F1小鼠用1*1010vp的表达变体HPV16LSE2E6E7SH、HPV16E2E6E7SH、HPV16E6E7SH的Ad35载体、或用不表达转基因的腺病毒载体(空白)进行免疫。每两周取血液样品以利用四聚体染色确定E7-特异性的CD8+T-细胞的百分比。(B)免疫接种后两周的免疫应答。包括前导序列的载体诱导了比没有前导序列的载体更高的应答；LSE2E6E7SH与E2E6E7SH(*：p<0.05)。(C)应答的动力学。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在第2周数据集的对数转换数据上进行的。尽管这些结果无统计学意义，但相比于没有E2的分子，由包括E2的分子诱导的E7应答倾向于更高。
图10.使用不同的腺病毒载体加强免疫应答。(A).免疫接种方案。将CB6F1小鼠用表达HPV16E2E6E7SH(HPV16-Tx)的Ad26载体或用不表达转基因的Ad26载体(空白)进行免疫。两周后，用如图的下方所表示的基于Ad35的载体重复该免疫接种。在第二次免疫接种后四周，处死小鼠并且用血液样品利用四聚体染色(B)来确定E7-特异性CD8+T-细胞的百分比。*表示Ad26.HPV16-Tx/Ad35.HPV16-Tx与Ad26.HPV16-Tx/Ad35.空白的比较，p<0.05(在对数转换数据上的学生t-检验，针对多重比较，α＝0.01)。
图11.在猕猴中的HPV16E2E6E7SH的细胞免疫原性。(A)免疫接种方案。在第0天将猕猴进行免疫。通过肌肉注射免疫接种(i.m)八只动物获得了Ad26.HPV16-E2E6E7SH并且两只对照动物获得了Ad26.空白。在8周时，给予加强免疫接种(Ad26.HPV16-E2E6E7SH或Ad26.空白)。在16周时，动物接受了具有表达相同HPV16E2E6E7SH的Ad35载体的第二次加强免疫接种，同时对照动物接受了Ad35.空白。腺病毒载体的剂量为1*1011vp/免疫接种。在若干时间点进行抽血。(B)通过IFNγELISPOT测量PBMC中的细胞免疫应答。用对应于HPV16E2、E6或E7的肽池刺激PBMC，并且描绘在1*106PBMC中点形成单位(SFU)的数量。空白对照动物(n＝2)显示了没有可检测到的应答。关于详情，参见实例4。
图12.表达HPV16-E2E6E7SH的腺病毒载体的治疗效果。(A)TC-1注射和免疫接种方案。在第0天用1*105TC-1细胞经皮下注射CB6F1小鼠。在六天后，当肿瘤可感知时，以在200μl 0.9％盐水(该盐水补充以5nmol ODN1826-CpG(B)或Ad26.HPV16-E2E6E7SH(C))的最终体积中的150μg，将小鼠用覆盖HPV16E6和E7免疫显性表位(即，HPV16E6，aa41-65(KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN；SEQ ID NO:18)和HPV16E7aa 43-77(GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR；SEQ ID NO:19))的两个SLP进行免疫。对照小鼠接收单独的CpG(D)或Ad26.空白(E)。在第20天，所有的小鼠接收了加强免疫接种。将在引发免疫接种中接收Ad26载体的小鼠随后用对应的Ad35载体进行免疫接种。如在引发免疫接种中一样，其他小鼠接收以单独的CpG或CpG为佐剂的SLP。(B-E)在注射了TC-1的小鼠中的肿瘤测量。肿瘤体积计算为(宽度2*长度)/2。当肿瘤体积超过1000mm3时，处死小鼠。由于大于20％的重量损失，必须处死小鼠(用星号表示)。(F-G)针对头35天的图B和C的一个特写。(H)在TC-1注射后的存活。相比于用SLP和CpG进行免疫的小鼠，用Ad.HPV16-E2E6E7SH治疗的小鼠的存活显著增加(对数秩检验p<0.05)。在试验结束时(在第92天)，三只用Ad.HPV16-E2E6E7SH进行免疫的小鼠是无肿瘤的。
图13.携带编码HPVAg或LSE2E6E7SH的转基因的腺病毒载体显示了关于在能够阻遏转基因表达的细胞的增加的病毒产量。A)针对Ad35载体的病毒产量测定。用携带编码GFP-Luc或HPVAg的转基因的Ad35载体感染PER.C6、PER.C6/CymR、和PER.C6/TetR细胞。用包含CuO或TetO的CMV启动子驱动这些转基因。在感染后四天通过基于Ad35六邻体特异性qPCR的方法确定病毒产量。B)针对Ad26载体的病毒产量测定。用携带编码GFP-Luc、HPVAg或LSE2E6E7SH的转基因的Ad26载体感染PER.C6和PER.C6/TetR细胞，所有这些转基因都通过包含TetO的CMV启动子进行驱动。在感染后三天通过基于Ad26六邻体特异性qPCR的方法确定病毒产量。关于详情，参见实例6。
图14.在载体生产过程中，使用阻遏转基因表达的阻遏物系统防止携带编码HPVAg的转基因的腺病毒载体中转基因盒的不稳定。通过对PER.C6或PER.C6/CymR细胞系的DNA转染，拯救在CMVCuO的控制下的表达HPVAg的Ad35载体。挑选所得的病毒噬斑-每细胞系五个-并且用于对各细胞系的连续感染循环。A)在10次病毒传代后通过PCR分析载体转基因盒区域的整合。将从PER.C6和PER.C6/CymR传代的病毒分离株获得的PCR产物分别示于中图和右图中。通过桑格DNA测序分析针对PER.C6传代的病毒分离株1、2、4和5所获得的看似全长的PCR产物，以及针对PER.C6/CymR传代的分离株1至5所见到的那些。色谱图迹线(未显示)的分析揭示了在PER.C6上生长的所有的分离株，而不是在PER.C6/CymR上生长的那些，包含在HPVAg的编码序列内的移码小缺失或过早终止突变。B)在七次病毒传代后分析载体表达HPVAg的能力。用生长在PER.C6和PER.C6/CymR上的病毒分离株转导A549细胞，并且通过蛋白质印迹法使用HPV16E7-特异性抗体分析HPVAg表达。针对HPVAg的预测大小为83kDa。关于详情，参见实例6。
图15.HPV18E6和E7的融合蛋白的表达。将HEK-293T细胞用DNA载体进行瞬时转染，该DNA载体表达图之上所指示的转基因。在转染后24hr后，收获细胞并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法用HPV18E6的抗体(上图)分析细胞抽提物。显示了NF-κB的加载对照(下图)确认了这两条泳道中细胞裂解物的类似的加载。分子量标记显示在左侧并且箭头指示融合蛋白。预期大小：E6E7SH，约38kDa；E2E6E7SH，约75kDa。
图16.通过HPV18E6E7SH设计构建体，在软琼脂上没有菌落形成。A)在接种后六周的琼脂中以细胞40x放大率的代表性显微图像。在E7wt转染细胞中观察到大的菌落形成。B)接种后六周，在琼脂中使用GelcountTM和相关的软件的菌落量化。*：p<0.05(泊松回归模型)；**：非劣效性(具有非劣效性界限为5％的广义线性模型)。
图17.HPV18E6E7SH已经缺失了降解p53和pRb的能力。(A)代表性蛋白质印迹证实了缺乏HPV18E6E7SH对p53的降解。将人类p53失效NCI-H1299细胞用表达p53的质粒连同表达HPV18E6野生型、E6E7SH的质粒或空载体进行共转染。非-TF表示非转染细胞。在转染后24小时，制备细胞裂解物，并且将30μg的总蛋白加载到凝胶上。上图-p53染色，中图-E6染色，下图-NF-κB染色(加载对照)。(B)在四种独立的测定中p53水平的量化。将该p53信号标准化至NF-κB信号。C)蛋白质印迹证实了HPV18E6E7SH对pRb的降解的缺乏，将pRb失效Saos-2细胞用表达pRb的质粒连同表达HPV18E7野生型、E6E7SH的质粒或空载体进行转染。非-TF表示非转染细胞。在转染后24小时，制备细胞裂解物，并且将10μg的总蛋白加载到凝胶上。上图-pRb染色，中图-E7染色，下图-NF-κB染色(加载对照)。D)在四种独立的测定中pRb水平的量化。将该pRb信号标准化至NF-κB信号。*：p<0.05(ANOVA模型)；**：非劣效性(试验是基于源自ANOVA模型的95％CI’s。非劣效性界限被设为75％)。
图18.HPV18E6E7SH不使原代人类生殖角质形成细胞永生化。将原代人类生殖角质形成细胞用编码HPV18(E6E7wt)的野生型E6-和E7-编码开放阅读框、E6E7SH序列或eGFP的慢病毒进行转导。非转导供体细胞被用作对照。如通过约200天的延长寿命和hTERT激活(数据未显示)所示的，仅有HPV18E6E7wt的表达诱导原代角质形成细胞的永生化。十字架标志表示细胞在衰老过程中死亡并且不能进一步培养。关于详情，参见实例8。在两个另外的供体中获得相似的结果(数据未显示)。
图19.HPV18E6E7SH变体的免疫原性-细胞内细胞因子染色。将CB6F1小鼠用表达下图所表示的转基因的腺病毒载体进行免疫。免疫接种后两周，处死该小鼠并且用对应于HPV18E6的15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。以IFNγ-阳性CD8+T细胞的百分数给出应答。
图20.合并的HPV16和HPV18载体的免疫原性-IFNγELISPOT分析。用表达来自HPV16(编码SEQ ID NO:3)和HPV18(编码SEQ ID NO:22)的E2E6E7SH转基因的腺病毒载体(类型26)使CB6F1小鼠免疫。引发免疫接种四周后，使小鼠接受用相同E2E6E7SH转基因的35型腺病毒载体进行的异源加强免疫接种。加强免疫接种两周后，处死该小鼠并且用对应于HPV16E7(A)或HPV18E6(B)的15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。以SFU/106脾细胞给出应答。
图21.合并的HPV16和HPV18疫苗在猕猴中的细胞免疫原性。根据如图11中呈现的方案，用HPV16和HPV18设计构建体的组合使猕猴免疫。在第0天：通过肌肉内免疫接种(i.m)使八只猕猴接受Ad26.HPV16-E2E6E7SH和Ad26.HPV18-E2E6E7SH的混合物。在第8周时，给予相同载体的加强免疫接种。在16周时，动物接受了具有表达相同HPV16和HPV18E2E6E7SH融合蛋白的两种Ad35载体的混合物的第二次加强免疫接种。腺病毒载体的剂量为1*1011vp/载体/免疫接种。在若干时间点进行抽血。通过IFNγELISPOT测量PBMC中的细胞免疫应答。用对应于HPV16和HPV18的E2、E6或E7的肽池刺激PBMC，并且测定在1*106PBMC中点形成单位(SFU)的数量。该图显示了在每次免疫接种后2周时所有六个测试肽池的累积应答。关于详情，参见实例11。
图22.表达HPV16和HPV18E2E6E7SH的合并的腺病毒载体的治疗效果。在第0天用5*104TC-1细胞经皮下注射C57BL/6小鼠。六天后，当癌症是可感知时，用Ad26.HPV16-E2E6E7SH或Ad26.HPV16-E2E6E7SH和Ad26.HPV18-E2E6E7SH的混合物使小鼠免疫。对照小鼠接受了Ad26.空白。用相应的Ad35载体使所有小鼠在第20天接受加强免疫接种。肿瘤体积计算为(宽度2*长度)/2。当肿瘤体积超过1000mm3时，处死小鼠。这些图表显示TC-1注射后的存活。在试验结束时，三只用合并的HPV16+HPV18疫苗进行免疫的小鼠是无肿瘤的。用Ad.HPV16-E2E6E7SH处理的小鼠的中值存活时间与用Ad.HPV16/18-E2E6E7SH进行免疫的小鼠相比没有显著不同。
图23.使用修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体来加强免疫应答。(A).免疫接种方案。将CB6F1小鼠用表达HPV16E2E6E7SH(HPV16)的Ad26载体和表达HPV18E2E6E7SH的Ad26载体的混合物或者用不表达转基因的Ad26载体(空白)进行免疫。八周后，用MVA-BN或用表达与Ad26载体相同的抗原的Ad35载体重复免疫接种。用不表达转基因的MVA-BN载体(对照)对对照动物进行加强免疫。第二次免疫接种后两周，处死这些小鼠并且用对应于HPV16的E2、E6或E7和HPV18E6的15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。(B)显示每组的总IFNγ应答为每106个脾细胞的SFU。(在对数转换数据上的学生t-检验，其中α＝0.05，排除阴性对照)。
图24.猕猴中Ad26引发和MVA加强诱导的细胞免疫原性。根据如图24A中呈现的方案，用HPV16和HPV18设计构建体的组合使猕猴免疫。在第0天：通过肌肉内免疫接种(i.m)使若干动物接受Ad26.HPV16-E2E6E7SH和Ad26.HPV18-E2E6E7SH的混合物。在8周时，给予编码HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH载体的加强免疫接种MVA-BN。腺病毒载体的剂量为1*1011vp/载体。MVA的剂量是1.8x108TCID50。在若干时间点进行抽血。通过IFNγELISPOT测量PBMC中的细胞免疫应答。用对应于HPV16E2(B)、HPV16E6(C)、HPV16E7(D)、HPV18E2(E)、HPV18E6(F)、HPV18E7(G)的肽池刺激PBMC，并且测定在1*106PBMC中点形成单位(SFU)的数量，并分别示出于图24B-24G中。图24H示出了每个时间点每个动物的抗原数量。截止设定为每1*106个PBMC 50个SFU。图24I示出了在不同时间点对所有六个测试肽池的累积应答。图B-H的统计分析：Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxon Signed Rank test)将第13周与第2周进行比较，以及将第24周与第13周进行比较。应用针对2次比较的邦弗朗尼校正(Bonferronicorrection)(调整的p值)。
图25.用表达HPV16和HPV18E2E6E7SH的Ad35或MVA载体引发和加强的Ad26的治疗效果。在第0天用5*104TC-1细胞经皮下注射C57BL/6小鼠。六天后，当肿瘤是可感知时，用Ad26.HPV16-E2E6E7SH和Ad26.HPV18-E2E6E7SH的混合物使小鼠免疫。对照小鼠接受了Ad26.空白。小鼠在第20天接受了使用编码HPV16/18E2E6E7SH的Ad35载体或MVA的加强免疫。用不编码转基因的MVA免疫对照动物。肿瘤体积计算为(宽度2*长度)/2。当肿瘤体积超过1000mm3时，处死小鼠。这些图表显示TC-1注射后的存活。在实验结束时，用Ad35.HPV16E2E6E7SH和Ad35.HPV18E2E6E7SH加强免疫的一只小鼠和用MVA-BN HPV16/18E2E6E7SH加强免疫的一只小鼠是无肿瘤的。与用MVA-BN HPV16/18-E2E6E7SH加强免疫的小鼠相比，用Ad35.HPV16/18-E2E6E7SH加强的小鼠的中值存活时间没有显著差异。
具体实施方式
在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一篇均通过引用以其全文并入本文。包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、物品或类似物的讨论用于提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
除非另外定义，本文所使用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文使用的某些术语具有如说明书中示出的含义。本文引用的所有专利、公开专利申请和出版物如同完全列出一样通过引用并入本文。必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。
除非另有说明，任何数值，如此处所述的浓度或浓度范围，应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值典型包括列举值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所使用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括值的这些范围内的整数和分数，除非上下文另有明确指示。
本发明提供一种或多种载体、疫苗、和疫苗组合，其可用于产生针对HPV感染以及与其有关疾病的免疫应答。
本发明实施例的载体、疫苗和疫苗组合包含编码一种或多种多肽的核酸分子，该多肽是精心设计的分子，其实际上含有呈重新排序并且部分重叠的片段形式的HPV16的完整的E6和E7氨基酸序列，并且在一些实施例中也含有E2，这样使得(实质上)存在HPV16E6和E7蛋白的所有T细胞表位。本发明实施例的载体、疫苗和疫苗组合另外地包含编码一种或多种多肽的核酸分子，该多肽是精心设计的分子，其实际上含有呈重新排序并且部分重叠的片段形式的HPV18的完整的E6和E7氨基酸序列，并且在一些实施例中也含有E2，这样使得(实质上)存在HPV18E6和E7蛋白的所有T细胞表位。已经由其他人描述了具有一些作为HPV疫苗的潜能的早期分子(例如，Kenter等人2009，N Engl J Med[新英格兰医学杂志]361:1838-47；Daayana等人，2010，Br J Cancer[英国癌症杂志]102:1129-36；Smahel等人，2001，Virology[病毒学]281:231-38；Yan等人，2009，Vaccine[疫苗]27:431-40；等人，2006，Vaccine[疫苗]24:2880-93；Oosterhuis等人，2011，Int J Cancer[国际癌症杂志]129:397-406；EP 1183368，WO 2013/083287)，但是这些分子中的每个具有一个或多个缺点。相对于早期描述的方法，本发明的载体、疫苗、和疫苗组合在至少一个且典型地几个方面是有利的。具体地，本发明的优点包括但不限于：(i)它们具有所希望的安全性特征，因为这些核酸分子具有大幅降低的(与天然E6和E7蛋白相比)，低到不能检测到的转化活性；(ii)它们是单一核酸分子，这些核酸分子易于以工业规模以经济上可行的方式进行生产，并且不像多分子方法，不会造成逻辑上的挑战；(iii)这些疫苗和疫苗组合的编码多肽基本上包括天然HPV16和HPV 18E6和E7蛋白的所有T-细胞表位；(iv)编码多肽的设计已经最小化所不希望的潜在强大的新表位(即，不存在于天然E6和E7蛋白中的表位)的引入；(v)在某些实施例中，它们不依赖于高度反应性的佐剂以提升所希望的免疫应答；以及(vi)在某些实施例中，如本文所示，与单独给予疫苗相比，腺病毒疫苗和MVA疫苗的组合给予(例如，在引发-加强方案中)提供增强的免疫应答。
因此，通过将各种有利特点结合在单一设计中，本发明实施例的载体、疫苗、和疫苗组合代表了一大步迈进，并且是主要对针对HPV16和HPV18的治疗性疫苗的优秀的候选物。这些载体、疫苗、和疫苗组合也可用作针对HPV16和HPV18的预防性疫苗，这意味着它们可能防止接种疫苗的受试者持续感染HPV16、HPV18、或HPV16和HPV18二者。
在发展本发明的某些实施例中，我们使用IEDB-AR以确定非天然的强表位的可能的形成，这些非天然的强表位可以在不同的E6和E7片段之间的新产生的连接处引入。在针对HPV16设计分子的某些实施例中，通过精心设计，将针对重新排序的HPV16E6和E7序列中的20种最常见的HLA-A等位基因、20种最常见的HLA-B等位基因和20种最常见的HLA-C等位基因具有<50nM的预计结合亲和力的具有九个氨基酸长度的新表位的数量最小化至仅一个。这是超越其他人所描述的构建体的一个显著改进，该改进针对单次改组的HPV16E6蛋白已经含有了超过30个此类新表位，并且改进的构建体将高度可能在序列中包含甚至若干更多的新表位，这些序列附加至这些构建体以防止表位的丧失(等人，2006，Vaccine[疫苗]24:2880-93)。因此，相比于其他人描述的方法，由于相比于天然E6和E7，改变的免疫应答的偶然性已经在本发明的分子中最小化，因此本发明的构建体具有显著改进的免疫学谱。
本领域技术人员可以使用常规的技术进行核苷酸取代，这些取代不影响多核苷酸编码的多肽序列，这些多核苷酸被描述以反映有待表达这些多肽的任何具体的宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
在优选的实施例中，编码根据本发明的多肽或HPV融合蛋白的核酸分子已针对在本发明的一种或多种载体中的最佳表达和功效进行配置。例如，在某些实施例中编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HPV16多肽的核酸分子包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列、在某些实施例中编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HPV16多肽的核酸分子包含SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列、且在某些实施例中编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HPV16多肽的核酸分子包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列。另外，在某些实施例中编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HPV18多肽的核酸分子包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列，且在某些实施例中编码包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HPV18多肽的核酸分子包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的多核苷酸序列。
在某些实施例中，根据本发明的核酸涵盖同源或变体序列。这些序列定义为与本发明的核酸具有一定百分比的序列同一性。
优选地，此类同源物或变体与参考的核酸序列具有至少约50％，至少约60％或65％，至少约70％或75％，至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％，更典型地，至少约90％、91％、92％、93％、或94％，并且甚至更典型地至少约95％、96％、97％、98％或99％，最典型地，至少约99％的序列同一性。术语同源物或变体还涵盖截短的、缺失的或以其他方式被修饰的核苷酸序列。
用于确定核酸之间的序列同一性的技术是本领域已知的。可以通过确定它们的“同一性百分比”来比较两个或更多个序列。两个序列的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数量除以较短序列的长度并乘以100。
相对于核苷酸序列或核酸，“序列同一性百分比(％)”定义为与参考序列中的核苷酸残基(即，其来源的核酸序列)相同的候选序列中的核苷酸残基的百分比，如果需要，在比对序列和引入缺口之后，以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为该序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实现与所比较的序列的全长的最大比对所需的任何算法。
例如，通过Smith和Waterman，(1981)，Advances in Applied Mathematics[应用数学进展]2:482-489的局部同源性算法提供核酸序列的适当比对。该算法可以通过使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure[蛋白质序列和结构图谱]，M.O.Dayhoff编辑，5增刊3:353-358，National Biomedical Research Foundation[国家生物医学研究基金会]，华盛顿特区，美国开发的评分矩阵应用于氨基酸序列并由Gribskov(1986)，Nucl.Acids Res.[核酸研究]14(6):6745-6763进行标准化。用于确定序列同一性百分比的该算法的示例性实施由遗传学计算机公司(Genetics Computer Group)(麦迪逊，威斯康星州)在“BestFit”实用应用程序中提供。该方法的默认参数描述于威斯康星序列分析包程序手册(Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual)，第8版(1995)(可获自遗传学计算机公司(Genetics Computer Group)，麦迪逊，威斯康星州)。在本发明的上下文中建立同一性百分比的优选方法是使用爱丁堡大学版权所有的由JohnF.Collins和Shane S.Sturrok开发并由IntelliGenetics有限公司(山景城，加利福尼亚州)分销的MPSRCH程序包。根据这套软件包，可以采用Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，并且空位为6)。根据产生的数据，该“匹配”值反映了“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性百分比或类似性的其他合适程序通常是本领域已知的，例如，另一个比对程序是BLAST，与默认参数一起使用。例如，BLASTN和BLASTP可以利用以下默认参数使用：遗传密码＝标准、过滤器＝无、链＝两条、截止＝60、期望＝10、矩阵＝BLOSUM62、描述＝50个序列、排序依据＝HIGH SCORE、数据库＝非冗余、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详情，可在以下网址找到：http://http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/。
核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(GeneArt)、基斯奎思公司(GenScripts)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。
本领域技术人员将理解，可以改变蛋白质，例如，通过氨基酸取代、缺失、添加等等，例如使用常规的分子生物学程序。一般来说，可以在多肽的功能性或免疫原性没有损耗地应用保守性氨基酸取代。这可以根据本领域技术人员所熟知常规程序进行检测。
在某些实施例中，根据本发明的至少一个方面的编码的多肽进一步包含前导序列(又称为信号序列或信号肽)。它是存在于大部分注定去往分泌通路的新合成的蛋白质的N-末端的短(典型地5个-30个氨基酸长)肽。此种序列的存在可以导致表达和免疫原性的增加。可以使用的非限制性实例是IgE前导肽(参见，例如，US 6,733,994；例如具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO:7))或HAVT20前导肽(例如，具有序列MACPGFLWALVISTCLEFSMA(SEQ ID NO:9))。可以将这些中的一个任选地添加至本发明多肽的N-端。在其他实施例中，根据本发明的多肽不包括前导序列。
存在不同类型的HPV(已经识别了超过120种类型并且以编号进行指代)，并且尽管针对某些抗原可能存在一些交叉反应性，但是一般针对每种需要被疫苗覆盖的类型，类型特异性抗原可能需要被掺入疫苗中。16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、和82型是致癌“高危”的性传播HPV，并且可以导致发展为宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、阴茎上皮内瘤病变(PIN)和/或肛门上皮内瘤样病变(AIN)。根据本发明的HPV(即，编码的多肽中的E6和E7片段所源自的HPV)是HPV16(针对SEQ ID NO:1-6)或HPV18(针对SEQ ID NO:20-23)。它可以被用于分别感染有HPV16或HPV18的受试者。在某些实施例中，它还可以合适与针对其他HPV类型的疫苗结合。在某些实施例中，该结合是与如上鉴定的抗高危类型的HPV的疫苗结合，例如抗HPV16的疫苗与抗HPV18的疫苗结合。在其他实施例中，本发明的疫苗与针对HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73或HPV-82中的一种或多种的疫苗结合。例如，如果还不确定HPV感染的具体类型，或如果希望具有预防作用的免疫应答针对不止一种HPV类型，那么可以使用此类结合。还设想了将本发明的疫苗与针对引起生殖器疣的HPV类型的疫苗的组合，例如HPV6和/或HPV11。这些HPV类型的序列和由其编码的蛋白(例如E6、E7、E2)可在公用数据库中提供给技术人员，例如，由国家技术信息中心(National Center for of technology Information)(NCBI)所提供的GenBank序列数据库。
根据本发明的一个方面针对HPV16的多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且在一个实施例中，根据本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列。根据本发明针对HPV18的多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且在一个实施例中，根据本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列。
本文提供了从5’至3’方向的或从N-端至C-端的序列，如本领域中所习惯的。
根据本发明的编码的多肽包含HPV16E6和E7蛋白的表位，或可替代地HPV18E6和E7蛋白的表位。在某些实施例中，根据本发明的多肽进一步包括(因此该编码多肽的核酸进一步编码)至少一种另外的抗原或此类另外的抗原的一个或多个表位。此类另外的抗原优选地是HPV抗原，优选地是属于在多肽中与E6和E7蛋白相同的HVP类型，即分别是HPV16或HPV18。因此，此种另外的抗原可以是HPV蛋白或其免疫原片段，并且在某些实施例中，包括E2蛋白或其包括HPV(优选地来自HPV16或HPV18)的E2的至少一个表位的片段。此类另外的根据本发明的E6和E7多肽的抗原或表位可以独立地表达。此类另外的抗原或表位也可以表达为融合蛋白的一部分，例如，置于包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽中的E6和/或E7的两个片段之间，但优选地与在包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽中的E6/E7N-末端或C-末端融合。可替代地或此外，可以存在刺激免疫应答的氨基酸序列。因此，在某些实施例中，本发明提供了根据本发明的核酸分子，该核酸分子编码包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽，并且其中该多肽进一步包含至少一种其他抗原，例如，HPV E2蛋白或其至少一个表位，但是优选地是更多个表位。针对本发明，添加E2蛋白的一个优点是已知在感染期间/在E6和E7表达仍非常低的低度病变中E2是早期表达的。
在向宫颈癌发展期间，失去了E2表达并且其结果是E6和E7水平的提高(Yugawa和Kiyono，2009，Rev Med Virol[医学病毒学评论]19:97-113)。将来自E2、E6和E7中的表位结合于一个疫苗中允许在一个广泛标靶群体的患者中治疗，该患者范围为患有持续感染至患有浸润性宫颈癌(或其他HPV16引起的癌症)。在某些实施例中，该E2蛋白是野生型E2蛋白。在某些其他实施例中，该E2蛋白在其DNA结合域中具有已缺失或一个或多个突变(相比于野生型E2蛋白)。HPV16和HPV18E2蛋白的序列可以发现于NCBI蛋白数据库中(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)的分别在编号NP_041328.1和AAP20597.1下。已知该蛋白的C-末端部分中的HPV16E2中若干单个氨基酸变化例如G293V、K299M或C300R废止了DNA结合。针对HPV18E2，对应的氨基酸改变是G294V、K300M、C301R。
使用缺少DNA结合能力的E2的变体或片段的优点是它能够在其表达的细胞中通过直接结合至宿主细胞DNA防止不可预测的转录变化。除了或作为替代的以上所描述的DNA结合结构域中的突变，防止E2活性的另外的方法是引入突变，这些突变废止位于E2反式激活域的多个N-末端的活性，和/或被报告以影响E2多肽的结构。针对HPV16E2，在之前所述的(例如Brokawet等人，1996；Sakai等人，1996)的位置处的氨基酸改变的非限制性实例是R37A、I73A、W92A、E39A、W33A、P106A以及G156A，并且根据本发明的HPV16E2可以任选地包含反式激活域中的这些突变中的一个或多个。在一个优选的实施例中，该HPV16E2片段包含编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的多肽的核酸。在更具体的实施例中，编码SEQ ID NO:28的核酸序列包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的多核苷酸序列。针对HPV18E2，对应的氨基酸改变是R41A、I77A、W96A、E43A、W37A、P110A以及G161A，并且根据本发明的HPV18E2可以任选地包含反式激活域中的这些突变中的一个或多个。在一个优选的实施例中，HPV18E2片段包含编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的多肽的核酸。在更具体的实施例中，编码SEQID NO:31的核酸序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的多核苷酸序列。
在某些实施例中，E2具有反式激活域中的突变，在其他实施例中E2具有DNA结合域中的突变，并且在另外的实施例中E2具有反式激活域中的突变和DNA结合域中的突变两者。在又一另一可替代的实施例中，根据本发明的E2多肽被分裂成片段，这些片段被重新排序(改组)以废止E2活性同时保留E2表位用于免疫原性。此类实施例可以任选地与以上所述的突变(例如在DNA结合域和/或在反式激活域中的突变)中的一个或多个结合。除了野生型HPV E2多肽，所有这样的E2突变体可以根据本发明被用作E2蛋白或其部分或变体。
可以内部添加该E2蛋白或其部分或变体，例如，但不限于本文描述的那些，但是优选地是融合至具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的本发明的多肽的N-端或C-端。在针对HPV16的一个实施例中，本发明的核酸分子编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。在其一个实施例中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。在针对HPV16的另一个实施例中，本发明的核酸分子编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。在其一个实施例中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列。在针对HPV18的一个实施例中，本发明的核酸分子编码包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽。在其一个实施例中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的多核苷酸序列。
还可以进一步使本发明由设计师专门设计的多肽与另外的蛋白融合，例如，所谓的载体蛋白，例如钙网蛋白、结核分枝杆菌热休克蛋白-70、IP10或破伤风毒素片段C(参见Oosterhuis等人，Human Gene Ther[人类基因治疗]，2012，见上文，如需更多实例)，这些另外的蛋白可以进一步提高对HPV E6和E7(和任选地E2)表位的免疫应答。因此本发明还提供了此类另外的融合蛋白，以及对其进行编码的核酸。
在某些实施例中，将根据本发明的核酸分子中的一个或多个掺入载体中。如本文使用的“载体”典型地是人工运载外源遗传物质到另一个细胞中的运载体，其中可以对它进行复制和/或表达，并且根据本发明它可以是任何包括根据本发明核酸分子的核酸分子。这些可以通过常规分子生物学技术例如克隆进行制备。典型地，此类载体可以在至少一种类型的适合宿主中进行繁殖，例如细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、以及类似物。载体的四种主要类型是质粒、病毒载体、粘粒(cosmid)和人工染色体。载体本身一般是由插入片段(转基因；在本发明中编码本发明融合多肽的核酸)和序列(该序列作为载体的“骨架”)组成的DNA序列。转移遗传信息至另一个细胞的载体的目的典型地是为了分离、扩增或表达靶细胞中的插入片段。
优选的是，编码多肽的序列可操作地连接至载体中的启动子。术语“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以一种方式连接至启动子，该方式允许该核苷酸序列(例如，当该载体导入宿主细胞时，在宿主细胞中)表达。表达调节序列可以可操作地连接至转基因上。在某些实施例中，设计载体用来在靶细胞中表达转基因，并且该载体一般具有驱动该转基因表达的启动子序列。在某些实施例中，可以存在常规使用的载体元件(例如转录终止子序列、聚腺苷尾序列、Kozak序列、UTR、复制原点、多克隆位点、遗传标记、抗生素抗性以及另外的序列)中的一种或多种，并且本领域技术人员可以设计载体，这样使得载体具有所希望的性质，例如用于在某些细胞中复制以繁殖并扩增载体，并且在引入该载体的靶细胞中用于载体中的转基因的表达。包含编码根据本发明的多肽的核酸的载体，优选地是被设计用于在哺乳动物细胞中表达的载体，合适作为根据本发明的疫苗。在某些实施例中，根据本发明的载体是质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体、病毒载体、或诸如此类。本领域的普通技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中基因的表达。在真核细胞中用于表达的一些熟知的并且常用的启动子包括源自病毒的启动子，如腺病毒，例如E1A启动子；源自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如CMV立即早期(IE)启动子(本文称为CMV启动子)(例如可从pcDNA获得，英杰公司(Invitrogen))，源自猿猴病毒40(SV40)的启动子(例如可从pIRES获得，目录号631605，BD科学公司(BD Sciences))；以及类似物。合适的启动子还可以来源于真核细胞，例如金属硫蛋白(MT)启动子、延长因子1α(EF-1α)启动子、泛素C或UB6启动子、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子、以及诸如此类(参见例如WO2006/048459)。用于获得在真核细胞中的表达的合适的启动子的非限制性实例是CMV-启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95，例如如本文所提供的具有如SEQ ID NO:13所示的序列的CMV启动子。聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素polyA信号(US5,122,458)可以存在于该(这些)转基因后面。在另一个非限制性实例中，该启动子可以是PrMVA13.5long启动子(WO 2014/063832)或PrHyb启动子(美国专利8,394,385、8,613,936)，其分别包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的多核苷酸序列，且可特别用于驱动转基因在MVA载体中的表达。
还可以添加其他调节序列。术语“调节序列”与“调节元件”在本文中可互换地使用，并且是指核酸片段，典型地但不限于DNA，该核酸片段调节与其有效地连接的核酸序列的转录，并且因此作为转录调节子。调节序列通常包含作为转录结合结构域的核酸序列，该转录结合结构域被转录蛋白和/或转录因子、增强子或阻遏物等的核酸结合结构域识别。例如，可能使阻遏物序列与启动子可操作地偶联，该阻遏物序列可以被阻遏蛋白限制，该阻遏蛋白可以降低或阻止表达该阻遏蛋白的生产细胞系中的转基因的表达。当传代时和/或当其在生产细胞系中大量生产时，这可以改进核酸分子的遗传稳定性和/或表达水平。本领域已经描述了此类系统。例如，调节序列可以包括一种或多种四环素操纵基因操纵基因序列(tetO)，这样使得在四环素操纵基因阻遏蛋白(tetR)存在下抑制表达。在不存在四环素下，该tetR蛋白能够结合至tetO位点并且阻遏可操作地连接至tetO位点的基因的转录。然而，在四环素的存在下，tetR蛋白质中构象变化阻止其结合至操纵基因序列，允许发生可操作连接的基因的转录。在某些实施例中，本发明的核酸分子，例如当存在于重组腺病毒载体中，可以任选地包括可操作地连接至启动子的tetO，这样使得在重组腺病毒中抑制了一种或多种转基因的表达，这些重组腺病毒产生在表达tetR蛋白的生产细胞系中。随后，如果将重组腺病毒引入受试者或不表达tetR蛋白的细胞中，那么将不能抑制表达(例如，国际专利申请WO 07/073513)。在某些其他实施例中，本发明的核酸分子，例如当存在于重组腺病毒中时，可以任选地包括cumate基因开关系统，其中调节表达是通过将阻遏物(CymR)结合至操纵基因位点(CuO)，置于启动子下游进行介导(例如，Mullick等人，BMC Biotechnol.[BMC生物技术]2006 6:43)。如本文所使用的，术语“阻遏物”是指具有抑制、干扰、延迟和/或阻遏重组表达载体的异源蛋白产物的产生的能力的实体(例如，蛋白或其他分子)。例如，通过干扰表达载体中(如在表达盒中)处于适当位置的结合位点。阻遏物的实例包括tetR、CymR、乳糖阻遏物、trp阻遏物、半乳糖阻遏物、λ阻遏物以及其他本领域中已知的适当的阻遏物。本文提供了使用tetO/tetR操纵基因/阻遏物系统和使用CuO/CymR操纵基因/阻遏物系统的实例。阻遏在载体繁殖期间载体转基因表达可以防止转基因的不稳定性，并且可以在生产期间增加具有本发明转基因的载体的产量。因此，在一些实施例中，本发明载体具有如下启动子，该启动子可以通过阻遏蛋白的结合被阻遏，例如通过具有可操作地偶联到阻遏物操纵基因序列上的启动子(例如，在非限制性实施例中，包含TetO的序列，例如SEQ ID NO:11的多核苷酸序列中所示的序列，或者含有CuO的序列，例如SEQ ID NO:12的多核苷酸序列中所示的序列)，阻遏蛋白(例如，TetR蛋白，例如具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或者CymR蛋白，例如具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列)可以结合至该阻遏物操纵基因序列。
在优选的实施例中，该载体是重组病毒载体，该重组病毒载体可以是可复制型的或者复制缺陷型或缺损型的。在某些实施例中，病毒载体包含重组DNA基因组。在某些实施例中，根据本发明的载体是例如重组腺病毒；重组痘病毒，例如正痘病毒(例如牛痘病毒，修饰的安卡拉痘苗(MVA))。
在一个或多个优选的实施例中，根据本发明的载体是重组痘病毒，例如但不限于正痘病毒。该重组正痘病毒可以是牛痘病毒(VV)、Wyeth菌株、ACAM1000、ACAM 2000、MVA或MVA-BN。
在更优选的实施例中，该重组痘病毒是MVA。在某些优选的实施例中，该MVA是MVA-BN。MVA-BN是无复制能力的，这是一个比其他类型的MVA更重要的优点。MVA-BN于2000年8月30日在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)在编号V00083008下保存，并描述于国际PCT出版物WO 2002042480中(也参见例如欧洲专利号1335987、美国专利号6,761,893、6,913,752、7,335,364、7,459,270、7,939,086、和8,268,325)。如那些专利出版物中所述，MVA-BN不在细胞系293、143B、HeLa和HaCat中生殖性复制。
在某些实施例中，重组MVA是MVA-BN的衍生物。此类“衍生物”包括展现出与保存的菌株(ECACC No.V00083008)基本相同的复制特征的病毒，但在其基因组的一个或多个部分中展现出差异。如本文所用，MVA-BN衍生物的特征在于：i)能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)和幼仓鼠肾细胞系BHK中生殖性复制，但不能在人类细胞系HaCat、HeLa、和143B中生殖性复制、和ii)无法在小鼠菌株中复制，该小鼠菌株不能产生成熟B和T细胞，并因此免疫严重受损且对复制型病毒高度敏感。这些特征和测试在本领域中已得到很好的定义(例如WO2002042480，美国专利号6,761,893和6,913,752)。
在某些实施例中，将本文所述的核酸分子掺入MVA基因组或MVA-BN基因组中的各种插入位点或基因间区。如本文所述，这些核酸分子可以作为单独的转录单元或融合基因插入重组MVA或MVA-BN中。在某些实施例中，将这些核酸分子插入MVA或MVA-BN的一个或多个基因间区(IGR)中。IGR可选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137、和IGR 148/149，优选地来自IGR64/65、IGR88/89、和/或IGR 148/149。这些IGR在WO03/097845中进一步表征(也参见例如欧洲专利号1407033和美国专利号7,550,147、7,964,374、8,034,354、和8,741,308)。另外地或可替代地，可以将这些核酸分子插入MVA或MVA-BN的天然存在的缺失位点I、II、III、IV、V或VI中的一个或多个中。在某些实施例中，少于5、4、3、或2个整合位点包含本披露的核酸分子。
包含这些核酸分子的MVA或MVA-BN的插入位点的数量可以是1、2、3、4、5、6、7个、或更多个。重组MVA或MVA-BN可包含插入4、3、2、或1个插入位点的核酸分子。
在某些优选的实施例中，将本披露的核酸分子插入单个插入位点。在优选的实施例中，插入单个插入位点的核酸分子是编码如下多肽的核酸分子，该多肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、及其组合。在其他优选的实施例中，插入单个插入位点的核酸分子编码SEQID NO:3和SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在仍其他优选的实施例中，插入单个插入位点的核酸分子是一个或多个如下核酸分子，该(这些)核酸分子与选自下组的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25，优选地，该(这些)核酸分子包含选自下组的多核苷酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25。在仍更优选的实施例中，将两个或更多个核酸分子插入单个插入位点，这些核酸分子分别与SEQ ID NO:24和ID NO:25的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，优选地，分别包含SEQ ID NO:24和ID NO:25的多核苷酸序列。在另一个优选的实施例中，该单个插入位点是IGR88/89。
鉴于本披露，本文提供的重组MVA病毒可以通过本领域已知的常规方法产生。获得重组痘病毒或将异源核苷酸序列插入痘病毒基因组中的方法是本领域技术人员熟知的。例如，Molecular Cloning,A laboratory Manual[分子克隆，实验室手册](第2版)[J.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](1989)]中描述了标准分子生物学技术的方法，例如DNA克隆、DNA和RNA分离、蛋白质印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术，以及Virology Methods Manual[病毒学方法手册][B.W.J.Mahy等人(编辑)，Academic Press[学术出版社](1996)]中描述了处理和操纵病毒的技术。类似地，针对MVA的处理、操作和基因工程的技术和诀窍描述于Molecular Virology:APractical Approach[分子病毒学：一种实用的方法][A.J.Davison&R.M.Elliott(编辑)，The Practical Approach Series[实用方法系列]，牛津大学出版社的IRL出版社[IRLPress at Oxford University Press]，牛津，英国(1993)(参见例如Chapter 9:Expression of genes by Vaccinia virus vectors[第9章：牛痘病毒载体对基因的表达])]和Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方法][约翰威利父子公司(1998)(参见例如，Chapter 16,Section IV:Expression of proteins inmammalian cells using vaccinia viral vector[第16章，第IV节：使用牛痘病毒载体在哺乳动物细胞中表达蛋白质])]中。
为了产生本文披露的各种重组MVA，可以应用不同的方法。可以将待插入病毒中的核苷酸序列置于大肠杆菌质粒构建体中，向该构建体中插入了与MVA的DNA的一部分同源的DNA。另外，待插入的DNA序列可以与启动子连接。启动子-基因连接可定位在该质粒构建体中，使得该启动子-基因连接的两端侧翼为与含有非必需基因座的MVA DNA区域侧翼的DNA序列同源的DNA。得到的质粒构建体可以通过在大肠杆菌细菌内繁殖而扩增并分离。在用MVA感染培养物的同时可以将含有待插入的DNA基因序列的分离的质粒转染到(例如鸡胚成纤维细胞(CEF))的细胞培养物中。分别在质粒和病毒基因组中的同源MVA DNA之间的重组可以产生通过外源DNA序列的存在而修饰的MVA。
根据优选的实施例，可以用痘病毒感染合适的细胞培养物的细胞，例如CEF细胞。随后，可以用包含一个或多个外源基因的第一质粒载体转染感染的细胞，优选地在痘病毒表达控制元件的转录控制下。如上所解释，该质粒载体还包含能够定向外源序列插入该痘病毒基因组的选定部分中的序列。任选地，该质粒载体还含有包含与痘病毒启动子可操作连接的标记和/或选择基因的盒。合适的标记或选择基因是例如编码绿色或红色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素-磷酸核糖基转移酶、ecogpt或其他标记的基因。选择或标记盒的使用简化了所产生的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，也可以通过PCR技术鉴定重组痘病毒。随后，可以用如上所述获得的重组痘病毒感染另外的细胞，并用包含一个或多个第二外源基因的第二载体转染。在该情况下，可以将该基因引入该痘病毒基因组的不同插入位点，该第二载体在痘病毒同源序列(其定向该(这些)一个或多个第二外源基因整合到该痘病毒的基因组中)方面也不同。在发生同源重组后，可以分离包含两个或更多个外源基因的重组病毒。为了将另外的外源基因引入重组病毒中，可以通过使用在之前步骤中用于感染而分离的重组病毒并使用包含用于转染的另外的一个或多个外源基因的另外的载体来重复感染和转染步骤。
可替代地，如上所述的感染和转染步骤是可互换的，即，首先可以通过包含外源基因的质粒载体转染合适的细胞，以及然后用痘病毒感染。作为另外的选择方案，还可以将每种外源基因引入不同的病毒中，用所有获得的重组病毒共感染细胞并筛选包括所有外源基因的重组体。第三种选择方案是体外连接DNA基因组和外源序列，并使用辅助病毒重建重组牛痘病毒DNA基因组。第四种选择方案是大肠杆菌或克隆为细菌人工染色体(BAC)的牛痘病毒基因组和线性外源序列之间的另一种细菌物种中的同源重组，该线性外源序列侧翼有与该牛痘病毒基因组中所希望的整合位点侧翼的序列同源的DNA序列。
在其他的优选的实施例中，根据本发明的载体是重组腺病毒。腺病毒用作疫苗的优点包括操作简单、优良的大规模可制造性、以及良好的安全记录，该良好的安全记录基于使用已经报道过的多种腺病毒载体在研究、开发、生产和临床试验中的多年经验。被用作疫苗的腺病毒载体通常提供了对转基因所编码的蛋白的良好的免疫应答，该免疫应答包括细胞免疫应答。根据本发明的腺病毒载体可以基于任何类型的腺病毒，并且在某些实施例中，是可以为任何血清型的人类腺病毒。在其他实施例中，它是一种猿猴腺病毒，例如可以为任何血清型的黑猩猩或大猩猩腺病毒。在某些实施例中，根据本发明的载体是人类腺病毒血清型26或35的。重组腺病毒载体的制备在本领域中是熟知的。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在腺病毒基因组的E1区域(例如，E1a区域和/或E1b区域)的至少一个必需基因功能中是有缺陷的，E1区域属于对病毒复制的必需腺病毒基因组。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必须E3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，该载体在E1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必须E3区域的至少部分中是有缺陷的。
腺病毒载体、其构建方法和其繁殖方法是本领域所熟知的，并且被描述于，例如，美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913，和Thomas Shenk，“Adenoviridae andtheir Replication[腺病毒及其复制]”，M.S.Horwitz，“Adenoviruses[腺病毒]”，分别第67和68章，在Virology[病毒学]中，B.N.Fields等人，编辑，第3版，纽约雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)，(1996)，以及本文提及的其他参考资料。典型地，腺病毒载体的构建涉及使用标准分子生物技术，例如在以下描述的那些，例如，Sambrook等人，MolecularCloninga,Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册]，第2版，冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press)，冷泉港，纽约，(1989)，Watson等人，Recombinant DNA[重组DNA]，第2版，Scientific American Books[科学美国人书刊](1992)，和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，威利国际科学出版社(WileyInterscience Publishers)，纽约(1995)，和本文提及的其他参考资料。
针对重组腺病毒的具体优选的血清型是人类血清型35或人类血清型26，最优选地是人类血清型26(rAd26)。例如在WO 2007/104792中和在Abbink等人，2007Virology[病毒学]81:4654-63中描述了rAd26载体的制备。Ad26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。例如，在美国专利号7,270,811中、在WO 00/70071中以及在Vogels等人，2003，J Virol[病毒学杂志]77:8263-71中，描述了rAd35载体的制备。Ad35的示例性基因组序列发现于GenBank登录号AC_000019中和WO00/70071的图6中。
在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它在基因组的E1区域中含有缺失。正如本领域技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必须区域的情况下，由这些区域编码的功能必须由菌株反式提供，优选的是由生产细胞提供，即，当E1、E2和/或E4区域的部分或全部从腺病毒中删除时，这些必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在E3区域中的缺失，该缺失针对复制是非必要的，并且因此不必补充此种缺失。
可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文还称为‘包装细胞’或‘补充细胞’)可以是任何生产细胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，该生产细胞补充了腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选地在其基因组中至少具有腺病毒E1序列，并且从而能够补充在E1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充E1的生产细胞，如由E1永生化的人类网膜细胞，例如911或PER.C6细胞(参见美国专利5,994,128)、E1转化的羊水细胞(参见欧洲专利1230354)、E1转化的A549细胞(参见例如WO 98/39411，美国专利5,891,690)、GH329：海拉细胞(Gao等人，2000，Hum Gene Ther[人类基因治疗]11:213-19)、293、以及类似物。在某些实施例中，这些生产细胞是，例如，HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞等。在(Kovesdi等人，2010，Viruses[病毒]2:1681-703)中评论了生产细胞中腺病毒载体的生产。
在某些实施例中，E1缺陷的腺病毒包括亚组C的腺病毒(例如Ad5)的E4-orf6编码序列。这允许在表达Ad5的E1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，例如293细胞或PER.C6细胞(参见，例如Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-43；WO 03/104467，将其通过引用以其全文并入本文)。
在本发明的载体中“异源核酸”(在本文还称为‘转基因’)是非天然存在于载体中的核酸，并且根据本发明，编码本发明融合多肽的核酸当存在于载体中时被认为是异源核酸。例如，通过标准分子生物学技术将其引入载体中。例如，可以将其克隆至腺病毒载体的缺失的E1或E3区域，或在E4区域和rITR之间的区域中。通常，转基因可操作地连接到表达控制序列。在优选的实施例中，将转基因克隆至腺病毒载体的E1区域中。
可以鉴于本披露根据本领域技术人员熟知的各种方法进行载体的生产，例如MVA载体、或重组腺病毒载体。通常，生产需要在培养细胞中繁殖来产生大量的载体材料，随后从细胞培养物中获得载体，并且典型的是随后进一步纯化载体以去除其他物质并且获得纯化的载体，可以将该载体配制到药物组合物中(例如，Hoganson等人，2002，BioProcessingJ[生物工艺杂志]1:43-8；Evans等人，2004，J Pharm Sci[药物科学杂志]93:2458-75)。例如，用于从生产细胞的培养物中获得腺病毒的方法已经例如广泛描述于WO 2005/080556中。例如WO2010/060719和WO 2011/098592，二者通过引用并入本文，描述了用于获得并纯化大量重组腺病毒的合适的方法。
在另外的方面,本发明进一步提供了包含根据本发明的核酸分子、载体或重组病毒的疫苗和疫苗组合，其中针对这些方面中的每个的实施例可以包括如本文所述的那些。在某些实施例中，根据本发明的疫苗包含本文所述的核酸分子。在优选的实施例中，该疫苗包含根据本发明的载体，优选地重组痘病毒载体，例如MVA载体，优选地MVA-BN载体或其衍生物，和/或重组腺病毒载体，例如rAd26载体。
在某些实施例中，根据本发明的编码HPV16设计多肽的疫苗进一步包含活性成分，例如，编码不同于HPV16的至少一种HPV类型的E6和/或E7蛋白的至少一个表位的核酸，例如高危HPV类型，如HPV18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68、-73、或-82。在某些实施例中，根据本发明的编码HPV18设计多肽的疫苗进一步包含活性成分，例如，编码不同于HPV18的至少一种HPV类型的E6和/或E7蛋白的至少一个表位的核酸，例如高危HPV类型例如HPV16、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68、-73、或-82。
特别优选地是包含编码本发明的HPV16和HPV18设计多肽两者的核酸的载体、疫苗、或疫苗组合，例如，编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽以及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽；例如，编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽以及包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的多肽。在此类载体、疫苗、疫苗组合物、或疫苗组合中，HPV16和HPV18组分可以在与单独的分子相同的组合物中，或者他们可以在相同的分子中，例如在相同的载体上编码。此类组合的一个优点是，这样的疫苗可以在感染了HPV16或HPV18(两个最普遍的高危HPV类型，它们一起导致大多数HPV诱发的癌症)的受试者中治疗地工作，因此这样的疫苗具有超过单型疫苗(具有HPV16或HPV18设计分子)的增加的适用性。
在其他实施例中，HPV16和HPV18组分可以作为试剂盒或具有单独的HPV16组分和单独的HPV18组分的部分的组合物提供，用于在疫苗接种中结合使用，例如用于在给予前重构，或用于单独但基本上同时的给予。此类组合的一个优点是此类疫苗可以在用HPV16或HPV18感染的受试者中治疗性地起作用。术语“疫苗”是指试剂或组合物，该试剂或组合物含有在受试者中有效诱导预防程度和/或治疗程度的免疫性针对某种病原体或疾病的活性组分，在此是治疗性地针对HPV。该疫苗典型地包括根据本发明的核酸分子、或载体、或重组病毒，以及药学上可接受的赋形剂。当向受试者给予的时候，由根据本发明的核酸分子所编码的多肽将在该受试者中表达，该表达将导致对存在于该编码的多肽中的抗原片段的免疫应答。本发明的疫苗的优点在于HPV16(例如，SEQ ID NO:1-6和24)或HPV18(例如，SEQ ID NO:20-23，和25)的E6和E7的基本上所有T细胞表位、和存在HPV16或HPV18的E2的任选地表位是存在的，以及因此，对野生型E6、或E7、或任选地E2中存在的任何表位的T细胞应答可以配备到疫苗中。此外，针对根据本发明的核酸分子该疫苗具有如上所述的安全性和有效性的优点。
针对向人类给予，本发明可以采用包含载体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载体或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明登氏制药科学]，第18版，A.R.Gennaro编辑，Mack Publishing Company[马克出版社][1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins[肽和蛋白质的医药配制品发展]，S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑，泰勒弗朗西斯集团(Taylor&Francis)[2000]；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients[医药赋形剂手册]，第3版，A.Kibbe编辑，Pharmaceutical Press[医药出版社][2000])。赋形剂通常是用药物的活性成分配制的药学上无活性的物质。赋形剂通常被用来增大包含有效活性成分(因此通常称为“膨胀剂”、“填料”、“稀释剂”)的配制品，以允许当生产剂型时方便并准确的分配药品。他们还可以服务各种增强治疗的目的，例如促进药物吸收或溶解或其他药物动力学考虑。赋形剂还可以在制造过程中使用，除帮助体外稳定性如在预期的保质期中防止变性以外，还来帮助处理所关心的活性物质如通过促进粉末流动性或不黏性。适当的赋形剂的选择还取决于给予途径和剂型，连同活性成分及其他因素。
尽管还可以运用冻干制品，但该纯化的核酸分子、载体或多肽优选地是作为无菌溶液进行配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0到9.5，例如pH5.0到7.5范围内。该核酸分子或载体或多肽典型地是在具有合适缓冲液的溶液中，并且该载体的溶液还可以含有盐。任选地稳定剂可以存在，如白蛋白。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，疫苗可以被配制为可注射制品。这些配制品包含有效量的核酸分子、载体或多肽(这些有效量的核酸分子、载体或多肽是无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干的版本)，并且可任选地包含稳定剂或赋形剂。
例如，重组腺病毒载体可以储存于缓冲液中，该缓冲液还可以用于腺病毒世界标准(Adenovirus World Standard)(Hoganson等人，2002，Bioprocessing J[生物工艺杂志]1:43-8)：20mM Tris pH 8，25mM NaCl，2.5％甘油)。适用于向人类给予的另一种有用的配制品缓冲液是20mM Tris、2mM MgCl2、25mM NaCl、蔗糖10％w/v、聚山梨酯-80 0.02％w/v。适用于重组腺病毒的另一种配制品缓冲液包括10mM-25mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.9-6.2，4％-6％(w/w)羟丙基-β-环糊精(HBCD)、70mM-100mM NaCl、0.018％-0.035％(w/w)聚山梨酯-80以及任选地包括0.3％-0.45％(w/w)乙醇。适用于MVA载体的示例性配制品缓冲液可以是10mM Tris、140mM NaCl、pH 7.7(或7.4)。显而易见地，可以使用许多其他缓冲液，并且已知针对存储和针对纯化载体的药用给予的合适的配制品的若干实例。
在某些实施例中，包括载体的组合物进一步包括一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知来进一步提高对所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，佐剂用来增强对由本发明载体中核酸分子编码的多肽的免疫应答。适合佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝和/或磷酸铝钾；油-乳液组合物(或水包油型组合物)，包括角鯊烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰基脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、包含CpG-基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，如大肠杆菌热不稳定的肠毒素LT、霍乱毒素CT等等。还可以使用载体编码的佐剂，例如，通过使用编码感兴趣的抗原与C4-结合蛋白(C4bp)的低聚反应域的融合物的异源核酸(例如，Solabomi等人，2008，InfectImmun[感染与免疫]76:3817-23)，或通过使用编码感兴趣的转基因和TLR-3激动剂如异源性dsRNA(例如WO 2007/100908)的载体，或诸如此类。
在其他实施例中，本发明的组合物不包括佐剂。
可以将药物组合物给予受试者，例如人类受试者。在一次给予期间向受试者提供的疫苗活性组分的总剂量可以按照技术从业人员已知的进行改变，并且针对腺病毒通常是从1x 107病毒颗粒(vp)至1x 1012vp，优选地是从1x 108vp至1x 1011vp，例如从3x 108至5x1010vp，例如从109至3x 1010vp；针对MVA病毒，疫苗总剂量通常是从1x 105TCID50(组织培养感染剂量)至1x 1010TCID50，优选地从1x 107TCID50至1x 1010，并且更优选地从1x 108TCID50至1x 109TCID50。
药物组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实施例包括不经肠给予，比如通过注射，例如皮内、肌肉内等、或者皮下或经皮、或粘膜给予，例如鼻内、经口、阴道内、直肠等等。在一个实施例中，通过肌内注射给予组合物，例如向手臂的三角肌、或大腿的股外侧肌。在某些实施例中，该疫苗是DNA疫苗，并且这可以例如经皮内给予，例如通过DNA纹身法(DNA tattooing)(参见，例如，Oosterhuis等人，2012，Curr Top Microbiol Immunol[微生物学和免疫学的当前主题]351:221-50)。该途径对于腺病毒载体和痘病毒载体也是可行的。在某些实施例中，根据本发明的组合物包含腺病毒载体或痘病毒载体，或腺病毒载体和痘病毒载体二者，并通过肌内注射给予。本领域的技术人员已知给予组合物(例如疫苗)的各种可能性，以诱发对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答。
如本文所使用的受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠或非人类灵长类动物或人类。优选地，该受试者为人类受试者。
可以将本发明的疫苗用来治疗患有由HPV引起的疾病的各种阶段之一的患者(具体是针对包含或编码SEQ ID NO:1-6、24、和28中的任何一个的疫苗的16型，或针对包含或编码SEQ ID NO:20-23、25、和31中的任何一个的疫苗的18型，或针对包含或编码本文所描述的HPV16和HPV18设计分子两者的疫苗的这两种类型)，从这样的事件和持续性HPV感染(例如，如通过HPV DNA测试所检测的)，因此在形成(预)癌病变之前，连同宫颈上皮内瘤样病变(CIN；又称宫颈非典型增生和宫颈间质瘤，该CIN是在宫颈表面上鳞状细胞的可能癌变前转换和异常生长(发育异常))至多且包括子宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))。此外，可以靶向其他HPV诱导的瘤形成，例如外阴上皮内瘤样病变(VIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、阴茎上皮内瘤病变(PIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)，连同口咽癌(又称头颈癌)、阴茎癌、阴道肿瘤、外阴癌以及肛门癌的晚期。因此，本发明的疫苗可以靶向广泛的HPV诱导的病变，并且可能对HPV诱导的疾病的癌前阶段最有效，例如在(持续)感染和/或瘤形成阶段，其中E2、E6和/或E7的表达最高。还可以将使用本发明的疫苗来的治疗与在晚期癌细胞中可以抵消或克服免疫逃逸机制的化合物(例如，抗PD1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体如伊匹木单抗、抗LAG-3抗体、抗CD25抗体、IDO抑制剂、CD40激动性抗体、CD137激动性抗体等等)结合(参见例如Hamid和Carvajal，2013，Expert Opinion Biol Ther[生物治疗专家意见]13:847-861；Mellman等人，2011，Nature Rev[自然综述]480:480-89)。
如本文使用的，‘治疗’意指给予疫苗来诱导患者中针对表达(HPV16E6和/或E7的表位)HPV16或HPV18E6和/或E7，和/或任选地E2的细胞的治疗性免疫应答，该免疫应答导致HPV16或HPV18感染的水平的至少降低并且优选地是完全去除HPV16或HPV18感染，这导致了至少减缓并优选地是停止HPV16或HPV18引起的疾病(例如瘤形成和/或其症状)的进展。优选地，用疫苗治疗也导致了HPV诱导的癌症的更晚期阶段的缓和。优选的是向患有已经分型的已形成的HPV感染的患者给予疫苗，这样使得可以给予编码对应的HPV类型的多肽的疫苗。在筛选不存在下，该疫苗还可以在部分可能被HPV感染的人群中给予，即性行为活跃的人。还可能向没有被HPV16或HPV18感染的受试者给予本发明的疫苗，例如用于预防性使用，可以与针对患者已经感染的另一种HPV类型的疫苗结合，或可替代地在非感染的受试者中。本发明的疫苗还可以向通过其他方法经受过另外的治疗的受试者给予，例如外科手术(去除了由HPV16或HPV18感染引起的病变部位)、或用咪喹莫特治疗(包括TLR-7/8激动剂，参见例如Dayaana等人，2010，Br J Cancer[英国癌症杂志]102:1129-36)。可以通过细胞学或通过HPV测试测量治疗的效果。
在某些实施例中，本文所述的疫苗接种和方法包括将本发明的疫苗给予受试者或患者至少一次。还可以提供一种或多种另外疫苗的一次或多次的加强给予。如果执行加强疫苗接种，那么典型地，此类加强疫苗接种将在具有相同抗原的免疫原性组合物第一次给予受试者(在这些情况下这被称为‘引发接种’)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的某一时刻给予相同的受试者。在可替代的加强方案中，还可以向受试者给予不同的载体，例如一种或多种不同血清型的腺病毒、或其他载体如MVA、或DNA、或蛋白，作为引发和增强疫苗接种。在某些实施例中，在引发-加强方案中向同一位患者给予至少两次本发明相同形式的疫苗，例如，用根据本发明的相同的重组腺病毒(如Ad26)。
在某些优选的实施例中，本发明的疫苗在引发-加强方案中至少给予两次，但该疫苗的载体是不同的，例如，使用两种不同的病毒载体，例如，用重组Ad26引发并用重组痘病毒加强，反之亦然。非限制性示例性实施例包括：a)用重组Ad26载体引发并用重组MVA载体加强；b)用重组Ad26载体和重组Ad35载体引发并用重组MVA载体加强；c)用重组痘病毒载体(例如，MVA)引发并用重组Ad26载体加强；d)用重组痘病毒载体(例如，MVA)引发并用重组Ad26载体和重组Ad35载体加强；其中，在每种情况下，引发和加强载体各自包含至少一种编码本发明的设计多肽的核酸。在某些优选的实施例中，该引发和加强载体各自编码本发明的相同的设计多肽。每次引发和/或加强给予可任选地对同一受试者给予不止一次。
在某些实施例中，根据本发明的疫苗或重组病毒在引发-加强-加强方案中给予至少三次，例如，第一次在引发给予中，并且第二次和第三次在两次后续加强给予中。在另外的实施例中，可以将另外的加强给予添加至该方案中。还可以同时或基本上同时(例如，不超过10分钟间隔)给予腺病毒载体和MVA载体(其可以是在同一组合物中或不同的组合物中)，以诱导免疫应答(参见例如WO 2010/073043)。
本发明的一个方面还在受试者中诱导了针对HPV16或HPV18的CTL应答，该方面包含向该受试者给予根据本发明的载体、疫苗、或疫苗组合。技术人员将理解的是，包括HPV16序列(例如编码或包含SEQ ID NO:1-6、24、和28中的任何一个)的疫苗在针对和旨在用于针对HPV16感染方面效果最好，而包括HPV18序列(例如编码或包含SEQ ID NO:20-23、25、和31中的任何一个)的疫苗在针对和旨在用于针对HPV18感染方面效果最好。
1.本发明还提供了以下非限制性实施例：
1)一种疫苗组合，其包含：
a)第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的一种或多种重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体同时包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，连同药学上可接受的载体；和
b)第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
2.其中该MVA载体包含MVA-BN或其衍生物。
2)根据实施例1的疫苗组合，其中该第一疫苗和第二疫苗各自进一步包含编码包含SEQID NO:28的氨基酸序列的第五多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的第六多肽的核酸。
3)根据实施例1-2中任一项的疫苗组合，其中该第一和第三多肽各自进一步包含SEQID NO:28，并且其中该第二和第四多肽各自进一步包含SEQ ID NO:31。
4)根据实施例1的疫苗组合，其中该第一核酸和第三核酸各自编码包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，并且其中该第二核酸和第四核酸各自编码包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的多肽。
5)根据实施例1-4中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸与SEQ ID NO:21的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
6)根据实施例1-5中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸与SEQ ID NO:2具有至少95％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸与SEQID NO:21具有至少95％的序列同一性。
7)根据实施例1-6中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸包含SEQ ID NO:2，并且编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸包含SEQ ID NO:21。
8)根据实施例4的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
9)根据实施例4和8中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24具有至少95％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25具有至少95％的序列同一性。
10)根据实施例4、8-9中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸包含SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:25。
11)根据实施例4和8-10中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸与SEQ ID NO:4具有至少90％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸与SEQ ID NO:23具有至少90％的序列同一性。
12)根据实施例4和8-11中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸与SEQ ID NO:4具有至少95％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸与SEQ ID NO:23具有至少95％的序列同一性。
13)根据实施例4和8-12中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸包含SEQ ID NO:4，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸包含SEQ ID NO:23。
14)根据实施例4和8-10中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸与SEQ ID NO:24具有至少90％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸与SEQ ID NO:25具有至少90％的序列同一性。
15)根据实施例4、8-10和14中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸与SEQ ID NO:24具有至少95％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸与SEQ ID NO:25具有至少95％的序列同一性。
16)根据实施例4、8-10、和14-15中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸包含SEQ ID NO:24，并且编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸包含SEQ ID NO:25。
17)根据实施例2-3中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
18)根据实施例2、3和17中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少95％的序列同一性，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33具有至少95％的序列同一性。
19)根据实施例2、3、和17-18中任一项的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸包含SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:33。
20)根据实施例2-3和17-19的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸与SEQ ID NO:29具有至少90％的序列同一性，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸与SEQ IDNO:32具有至少90％的序列同一性。
21)根据实施例2-3和17-20的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸与SEQ ID NO:29具有至少95％的序列同一性，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸与SEQ IDNO:32具有至少95％的序列同一性。
22)根据实施例2-3和17-21的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸包含SEQ ID NO:29，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸包含SEQ ID NO:32。
23)根据实施例2-3和17-19的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸与SEQ ID NO:30具有至少90％的序列同一性，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸与SEQ IDNO:33具有至少90％的序列同一性。
24)根据实施例2-3、17-19和23的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸与SEQ ID NO:30具有至少95％的序列同一性，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸与SEQ IDNO:33具有至少95％的序列同一性。
25)根据实施例2-3、17-19、和23-24的疫苗组合，其中编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸包含SEQ ID NO:29，并且其中编码SEQ ID NO:31的核酸包含SEQ ID NO:32。
26)根据实施例1-25中任一项的疫苗组合，其中MVA-BN的衍生物的特征在于：i)能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)和幼仓鼠肾细胞系BHK中生殖性复制，但不能在人类细胞系HaCat、HeLa、和143B中生殖性复制、和ii)无法在小鼠菌株中复制，该小鼠菌株不能产生成熟B和T细胞，并因此免疫严重受损且对复制型病毒高度敏感。
27)根据实施例1-26中任一项的疫苗组合，其中该重组腺病毒载体选自由rAd26和rAd35组成的组。
28)根据实施例1-27中任一项的疫苗组合，其中该重组腺病毒载体是rAd26。
29)根据实施例1-27中任一项的疫苗组合，其中该重组腺病毒载体是rAd35。
30)根据实施例1-29中任一项的疫苗组合，其中该第一疫苗包含第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20的第二多肽的第二核酸。
31)一种重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，其包含：(a)编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽中的至少一种的核酸，和(b)编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽中的至少一种的另一种核酸；
其中该MVA载体是MVA-BN或其衍生物。
32)根据实施例31的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，其中该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸。
33)根据实施例31和32中任一项的重组MVA载体，其中该MVA载体进一步包含编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的多肽的核酸中的至少一种。
34)根据实施例31-33中任一项的重组MVA载体，其中包含SEQ ID NO:1的多肽进一步包含SEQ ID NO:28，并且其中包含SEQ ID NO:20的多肽进一步包含SEQ ID NO:31。
35)根据实施例31的重组MVA载体，其中该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸。
36)根据实施例31的重组MVA载体，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸是编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸的一部分，并且其中编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸是编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸的一部分。
37)根据实施例31-36中任一项的重组MVA载体，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸与SEQ ID NO:21的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
38)根据实施例31-37中任一项的重组MVA载体，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸与SEQ ID NO:2具有至少95％的序列同一性，并且编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸与SEQ ID NO:21具有至少95％的序列同一性。
39)根据实施例31-38中任一项的重组MVA载体，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸包含SEQ ID NO:2，并且编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸包含SEQ ID NO:21。
40)根据实施例31和35中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸与SEQID NO:4或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且编码SEQ IDNO:22的核酸与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
41)根据实施例31、35和40中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24具有至少95％的序列同一性，并且编码SEQ ID NO:22的核酸与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25具有至少95％的序列同一性。
42)根据实施例31、35、和40-41中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24，并且编码SEQ ID NO:22的核酸包含SEQ ID NO:23或SEQID NO:25。
43)根据实施例31、35和40-42中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸与SEQ ID NO:4具有至少90％的序列同一性，并且编码SEQ ID NO:22的核酸与SEQ ID NO:23具有至少90％的序列同一性。
44)根据实施例31、35和40-43中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸与SEQ ID NO:4具有至少95％的序列同一性，并且编码SEQ ID NO:22的核酸与SEQ ID NO:23具有至少95％的序列同一性。
45)根据实施例31、35和40-44中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸包含SEQ ID NO:4，并且编码SEQ ID NO:22的核酸包含SEQ ID NO:23。
46)根据实施例31、35和40-42中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸与SEQ ID NO:24具有至少90％的序列同一性，并且编码SEQ ID NO:22的核酸与SEQ ID NO:25具有至少90％的序列同一性。
47)根据实施例31、35、40-42和46中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸与SEQ ID NO:24具有至少95％的序列同一性，并且编码SEQ ID NO:22的核酸与SEQ IDNO:25具有至少95％的序列同一性。
48)根据实施例31、35、40-42、和46-47中任一项的重组MVA载体，其中编码SEQ ID NO:3的核酸包含SEQ ID NO:24，并且编码SEQ ID NO:22的核酸包含SEQ ID NO:25。
49)一种重组MVA载体，其包含至少一种编码包含选自下组的序列的多肽的核酸，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:20、和SEQ ID NO:22，其中该至少一种核酸与启动子可操作地连接，该启动子包含与SEQ ID NO:26的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸和与SEQ ID NO:27的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸中的至少一种。
50)根据实施例49的重组MVA载体，其中该启动子包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的至少一种。
51)根据实施例49-50中任一项的重组MVA载体，其中该启动子是SEQ ID NO:26。
52)根据实施例49-50中任一项的重组MVA载体，其中该启动子是SEQ ID NO:27。
53)根据实施例49-51中任一项的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3与SEQID NO:26可操作地连接。
54)根据实施例53的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:26可操作地连接。
55)根据实施例49、50或52中任一项的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:27可操作地连接。
56)根据实施例55的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:27可操作地连接。
57)根据实施例49和53中任一项的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:1由根据实施例5-7和36-39中任一项的核酸编码。
58)根据实施例49、和53-54中任一项的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:3由根据实施例4、8-16、35、36、和40-48中任一项的核酸编码。
59)根据实施例49和55中任一项的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:20由根据实施例3-7、32、34和36-39中任一项的核酸编码。
60)根据实施例49和55-56中任一项的重组MVA载体，其中SEQ ID NO:22由根据实施例4、8-16、35、36、和40-48中任一项的核酸编码。
61)一种疫苗，其包含根据实施例31-60中任一项的重组MVA载体和药学上可接受的载体。
62)一种用于治疗受试者中持续性HPV感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌的方法，该方法包括向该受试者给予根据实施例1-61中任一项的载体、疫苗、或疫苗组合。
63)一种用于在受试者中诱导针对人类乳头瘤病毒(HPV)的免疫应答的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的
1.(i)重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，或者
2.(ii)第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，
连同药学上可接受的载体；
和
(b)向该受试者给予第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
其中将该第一疫苗作为引发疫苗向该受试者给予，并且将该第二疫苗作为加强疫苗向该受试者给予。
64)一种用于在受试者中诱导针对人类乳头瘤病毒(HPV)的免疫应答的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的
3.(i)重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，或者
(ii)第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，
连同药学上可接受的载体；
和
(b)向该受试者给予第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
其中将该第一疫苗或第二疫苗作为引发疫苗向该受试者给予，并且将该另一种疫苗作为加强疫苗向该受试者给予。
65)根据实施例63-64中任一项的方法，其中该第一疫苗和第二疫苗各自进一步包含编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第五多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的第六多肽的核酸。
66)根据实施例63-65中任一项的方法，其中该第一和第三多肽各自进一步包含SEQ IDNO:28，并且其中该第二和第三多肽各自进一步包含SEQ ID NO:31。
67)根据实施例63-66中任一项的方法，其中该第一疫苗包含第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的第二多肽的第二核酸。
68)根据实施例63-67中任一项的方法，其中SEQ ID NO:1由根据实施例5-7和36-39中任一项的核酸编码。
69)根据实施例63-67中任一项的方法，其中SEQ ID NO:3由根据实施例4、8-16、35、36和40-48中任一项的核酸编码。
70)根据实施例63-67中任一项的方法，其中SEQ ID NO:20由根据实施例3-7、32、34和36-39中任一项的核酸编码。
71)根据实施例63-67中任一项的方法，其中SEQ ID NO:22由根据实施例4、8-16、35、36、和40-48中任一项的核酸编码。
72)根据实施例65-66中任一项的方法，其中SEQ ID NO:28由根据实施例17-24中任一项的核酸编码。
73)根据实施例65-66中任一项的方法，其中SEQ ID NO:31由根据实施例17-24中任一项的核酸编码。
74)一种核酸分子，其包含选自下组的多核苷酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、和SEQ ID NO:33。
75)一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:24。
76)一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:25。
77)一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:30。
78)一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:33。
79)一种核酸分子，其与实施例74-78中任一项的核酸分子具有至少90％或95％的序列同一性。
80)一种分离的核酸分子，其包含实施例74-79中任一项的核酸分子。
81)一种载体，其包含实施例74-79中任一项的核酸分子。
82)根据实施例81的载体，其中该载体选自痘病毒和腺病毒。
83)根据实施例81-82中任一项的载体，其中该载体是痘病毒。
84)根据实施例83的载体，其中该痘病毒是正痘病毒或禽痘病毒。
85)根据实施例84的载体，其中该痘病毒是正痘病毒。
86)根据实施例85的载体，其中该正痘病毒是牛痘病毒。
87)根据实施例86的载体，其中该牛痘病毒是MVA病毒。
88)根据实施例87的载体，其中该MVA病毒是MVA-BN或其衍生物。
89)根据实施例81-82中任一项的载体，其中该载体是腺病毒。
90)根据实施例89的载体，其中该腺病毒选自rAd26和rAd35。
91)一种疫苗组合，其包含：
a)第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的
(i)重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，和编码包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，或者
(ii)第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，
连同药学上可接受的载体；
和
(b)第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
其中将该第一疫苗或第二疫苗作为引发疫苗向该受试者给予，并且将该另一种疫苗作为加强疫苗向该受试者给予；并且
其中该MVA载体包含MVA-BN或其衍生物。
92)根据实施例91的疫苗组合，其中包含SEQ ID NO:3的多肽由根据实施例4、8-16、35、36和40-48中任一项的核酸编码。
93)根据实施例91的疫苗组合，其中包含SEQ ID NO:22的多肽由根据实施例4、8-16、35、36和40-48中任一项的核酸编码。
94)根据实施例1-61和74-93中任一项的核酸、多肽、载体、疫苗、或疫苗组合中的任何一种的用途，用于治疗对其有需要的受试者中的持续性HPV感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌。
95)根据实施例1-61和74-93中任一项的核酸、多肽、载体、疫苗或疫苗组合中的任何一种在用于在对其有需要的受试者中诱导针对人类乳头瘤病毒(HPV)的免疫应答的药物组合物或药剂的制备中的用途。
96)一种试剂盒，其包含根据实施例1-61和74-93中任一项的核酸、多肽、载体、疫苗、或疫苗组合中的任何一种。
97)根据实施例30的疫苗组合，其中该第一重组腺病毒载体是rAd26，并且该第二重组腺病毒载体是rAd26。
98)根据实施例97的疫苗组合，其中该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:3的第一多肽的第一核酸，并且该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:22的第二多肽的第二核酸。
99)根据实施例91的疫苗组合，其中该第一疫苗包含免疫有效量的重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:3的第一多肽的第一核酸和编码包含SEQ ID NO:22的第二多肽的第二核酸，连同药学上可接受的载体。
100)根据实施例99的疫苗组合，其中该重组腺病毒载体是rAd26。
101)根据实施例91的疫苗组合，其中该第一疫苗包含免疫有效量的第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:3的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:22的第二多肽的第二核酸，连同药学上可接受的载体。
102)根据实施例101的疫苗组合，其中该第一重组腺病毒载体是rAd26，并且该第二重组腺病毒载体是rAd26。
103)根据实施例91和99-102中任一项的疫苗组合，其中该第一疫苗是引发疫苗，并且该第二疫苗是加强疫苗。
104)一种用于治疗对其有需要的受试者中的持续性HPV感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的
4.(i)重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，或者
5.(ii)第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，
连同药学上可接受的载体；
和
(b)向该受试者给予第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
其中将该第一疫苗作为引发疫苗向该受试者给予，并且将该第二疫苗作为加强疫苗向该受试者给予。
105)根据实施例63、64或104中任一项的方法，其中该第一疫苗包含免疫有效量的第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20的第二多肽的第二核酸，连同药学上可接受的载体。
106)根据实施例105的方法，其中该第一重组腺病毒载体是rAd26，并且该第二重组腺病毒载体是rAd26。
107)根据实施例63、64或104中任一项的方法，其中该第一疫苗包含免疫有效量的重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的第一多肽的第一核酸和编码包含SEQ ID NO:20的第二多肽的第二核酸，连同药学上可接受的载体。
108)根据实施例107的方法，其中该重组腺病毒载体是rAd26。
109)根据实施例104-108中任一项的方法，其中编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸是编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸的一部分，并且其中编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸是编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸的一部分。
110)一种重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，其包含：(a)编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽中的至少一种的核酸，和(b)编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽中的至少一种的核酸；
6.其中将来自(a)和(b)的核酸中的至少一种插入MVA基因间区(IGR)88/89。
111)根据实施例110的重组MVA载体，其中将来自(a)和(b)二者的核酸插入MVA基因间区(IGR)88/89。
112)根据实施例110-111中任一项的重组MVA载体，其中该MVA是MVA-BN或其衍生物。
113)根据实施例110-112中任一项的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，其中该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:20的多肽的核酸。
114)根据实施例110-113中任一项的重组MVA载体，其中该MVA载体进一步包含编码包含SEQ ID NO:28的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:31的多肽的核酸中的至少一种。
115)根据实施例110-114中任一项的重组MVA载体，其中包含SEQ ID NO:1的多肽进一步包含SEQ ID NO:28，并且其中包含SEQ ID NO:20的多肽进一步包含SEQ ID NO:31。
116)根据实施例110的重组MVA载体，其中该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:3的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:22的多肽的核酸。
除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验手册]，第2版，1989；CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，Ausubel FM等人编辑，1987；Methods in Enzymology[酶学方法]系列(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；PCR2:A Practical Approach[PCR2：一种实用的方法]，MacPherson MJ、Hams BD、TaylorGR编辑，1995；Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验手册]，Harlow和Lane编辑，1988。
在以下实例中将进一步解释本发明。这些实例不以任何方式限制本发明。它们仅仅用以阐明本发明。
实例
实例1：设计多肽的构建，该设计多肽基本上包含所有的HPV16E6和E7CTL表位
我们设计了一种新颖的、非致瘤的多肽(和编码这种多肽的核酸)，该多肽基本上含有所有的HPV16E6和E7蛋白的所有的CTL表位，并且具有最小数量的预计的/预测的强大的新表位(新表位意指不存在于野生型HPV16E6和E7蛋白中的表位)。针对HPV16的本发明的多肽(有时在本文还称为‘E6E7SH’)包含如在SEQ ID NO:1中所提供的序列。以SEQ ID NO:2提供编码该多肽的密码子优化的核酸。
本发明的分子是单分子，该单分子提供了超过了使用多分子的策略的生产优点。此外，本发明的多肽包含存在于HPV16的野生型E6和E7中的基本上所有假定的CTL表位，并且同时具有最小数量的预期的/预测的强大的新表位，这些新表位可以潜在地可能是免疫显性的并且因此可以从相关的野生型CTL表位转移免疫应答。因此本发明的构建体是比其他人所描述的分子(缺少可能的CTL表位和/或包含更多或更强的新表位)在免疫学上更有利。
例如，SEQ ID NO:1的构建体针对如下含有具有预测结合亲和力<50nM的九个氨基酸长度的仅一个新表位：20种最常见的HLA-A、20种最常见的HLA-B和20种最常见的HLA-C等位基因(HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:03、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*23:01、HLA-A*24:02、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:01、HLA-A*33:03、HLA-A*34:01、HLA-A*68:01、HLA-A*68:02、HLA-B*07:02、HLA-B*07:04、HLA-B*08:01、HLA-B*13:01、HLA-B*15:01、HLA-B*18:01、HLA-B*35:01、HLA-B*37:01、HLA-B*39:01、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*40:06、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HL-B*46:01、HLA-B*48:01、HLA-B*51:01、HLA-B*52:01、HLA-B*53:01、HLA-B*58:01、HLA-C*07:02、HLA-C*04:01、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:03、HLA-C*08:01、HLA-C*15:02、HLA-C*12:02、HLA-C*02:02、HLA-C*05:01、HLA-C*14:02、HLA-C*03:02、HLA-C*16:01、HLA-C*08:02、HLA-C*12:03、HLA-C*04:03、HLA-C*17:01、HLA-C*14:03)，如在IEDB网站(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_binding.html，2009-09-01B版)针对HLA-A和HLA-B使用ANN(Lundegaard等人，2008，Nucl Acids Res[核酸研究]36:W509-12)SMM方法(Peters等人，2003，Bioinformatics[生物信息学]19:1765-72)以及针对用于肽结合至MHC类别I分子的预测工具的HLA-C的NetMHCpan方法(Hoof等人，2009，Immunogenetics[免疫遗传学]61:1-13)。
作为一种非限制性实例，使用在IEDB网站的SMM预测工具，该改组的E6和E7序列如由Oosterhuis等人，2011，Int J Cancer[国际癌症杂志]129:397-406和等人，2006，Vaccine[疫苗]24:2880-93所描述的在核心部分针对20种最常见的HLA-A和-B含有每一个九氨基酸的潜在的强大的独特的新表位(ANN或SMM IC50<50nM)。这甚至不包括用于那种途径的附加物(其中附加物将进一步有助于另外的新表位，并且可能由于限制长度的‘重叠’错过了更多的天然MHC II表位)。事实上，据报道，改进的分子(包含具有改组的E6和E7蛋白(被描述于WO 2013/083287中)的变体)包含针对20种最常见的HLA-A、20种最常见的HLA-B和20种最常见的HLA-C等位基因具有预测的IC50<50nM的九个氨基酸长度的22个独特的新表位(ANN、SMM或NetMHCPan)。
因此，本发明的设计的分子相比于改组的E6和E7以去除功能性的其他已公布的方法，显然有利于具有更低数量的预测的新表位。
合成编码我们由此设计的HPV16E6E7SH分子(即，具有如在SEQ ID NO:1中所提供的氨基酸序列的多肽)的核酸，该核酸序列包含SEQ ID NO:2，并且侧翼为在5'端的HindIII位点和Kozak序列以及在3'位点的XbaI位点(在英杰生命技术公司(Invitrogen Lifetechnologies)的委托合成以及标准分子克隆，德国)。
使用HindIII和XbaI将该合成的片段克隆到标准表达载体，pCDNA2004.Neo中，该载体具有细菌抗药性标志物(氨比西林)和哺乳类动物抗药性标志物(新霉素)，以获得编码本发明分子的质粒载体，例如用于基于(瞬时)转染的试验。
可以按照这样使用这些分子，但是还可以用作为包含附加特征的另外的分子的基础。作为非限制性实例，如下描述制备一些另外的变体。
可以将HPV16E6E7SH融合蛋白质序列与其他HPV16早期蛋白的序列结合，以靶向患有持续感染的个体，并且以扩展免疫个体中的免疫系统全部。已经提出，针对E2的免疫应答在清除HPV16感染中起到了重要作用(de Jong等人，2002，Cancer Res[癌症研究]62:472-479)。E2与E6E7SH的融合将给出疫苗组分，该疫苗组分具有针对从持续感染到浸润性癌或在Leep手术后的复发/难治性疾病的HPV相关癌症的各阶段的抗原。因此，作为此类实施例的非限制性实例，我们制备了编码E6E7SH与E2在它的N-端的融合蛋白的序列。在E2序列中，可以使修饰废止DNA结合活性，该DNA结合活性可能在表达融合蛋白的细胞中影响基因表达。我们使wt HPV16E2蛋白的位置293的甘氨酸、位置299的赖氨酸和位置300的半胱氨酸分别突变成缬氨酸、甲硫氨酸和精氨酸。这些突变中的每个在于其自身已经完全废止了E2与具有E2的结合域的DNA序列的结合(Prakash等人，1992，Genes Dev[基因与发育]6:105-16)。
所产生的多肽称为HPV16E2E6E7SH并且包括SEQ ID NO:3。制备编码该多肽的密码子优化序列并且在SEQ ID NO:4中提供。
我们还构建了变体，其中将相同的E2突变蛋白融合至HPV16E6E7SH融合多肽的C-端，产生了称为HPV16E6E7E2SH的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:5。将编码该构建体的序列提供为SEQ ID NO:6。
出于对照的目的，我们还构建了编码多肽的序列，该序列含有针对作为融合蛋白的全长HPV16E6和E7的野生型序列(将从aa 1至158的E6直接融合到从aa 1至98的E7，本文命名为E6E7wt)。
我们还测试了向该多肽添加前导序列的影响。作为非限制性实例，在这些构建体中的一些的N-末端处融合编码IgE前导序列的序列(参见例如US6,733,994)[前导肽的序列提供于SEQ ID NO:7]，例如在E6E7wt构建体中，该E6E7wt构建体导致了LSE6E7wt，并且在E2E6E7SH构建体中，该E2E6E7SH构建体导致了LSE2E6E7SH。在免疫小鼠中如通过E7四聚体分析所测的，相比于不具有LS序列的相同抗原，其作用显著(p<0.05)提高了免疫原性(例如，如在图9中所见)。
在具有或不具有E2的情况下，编码本发明E6E7SH多肽的序列可以，例如由DNA构建体、由RNA或由病毒载体进行表达。图1证实了当如上所述用表达转基因的DNA载体瞬时转染后在HEK-293T细胞中的表达。在转染之后，收获细胞并且用针对HPV16E7的抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析细胞提取物。该试验证实了当表达载体转染后，适当大小的预期融合蛋白的表达。
在具有或不具有E2的情况下，并且在具有或不具有增强所编码的融合蛋白的免疫原性的附加序列的情况下，可以使用腺病毒载体来表达E6E7。
在基因艺术公司(Geneart)，将编码HPV16E6E7wt对照的基因或上述的HPV16设计序列针对人类表达进行基因优化并且合成。Kozak序列(5’GCCACC 3’)直接包含于ATG起始密码子的前面，并且将两个终止密码子(5’TGA TAA 3’)添加至各自的编码序列的末端。将这些基因通过HindIII和XbaI位点插入pAdApt35BSU质粒和pAdApt26质粒中(Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87,2135-43)。
通过单同源重组，所有的腺病毒产生于PER.C6细胞中，并且如之前所述进行生产(针对rAd35：Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-43；针对rAd26：Abbink等人，2007，J Virol[病毒学杂志]81:4654-63)。将PER.C6细胞(Fallaux等人，1998，Hum Gene Ther[人类基因治疗]9:1909-17)保持在具有10％胎牛血清(FBS)、补充以10mMMgCl2的杜氏改良培养基(DMEM)中。
简言之，根据制造商(美国生命技术公司(Life Technologies))提供的说明书使用脂质体转染，用Ad载体质粒转染PER.C6细胞。在到达完全的细胞病变效应(CPE)后一天收获细胞，冻融，在3,000rpm下离心5min，并且在-20℃存储。将病毒进行噬斑纯化并且在培养于多孔24组织培养板的单孔中的PER.C6细胞中进行扩增。进一步扩增在培养于T25组织培养烧瓶并随后养于T175组织培养烧瓶中的PER.C6细胞中进行。将从在T175烧瓶后所获得的细胞制备的粗裂解物的3ml到5ml用来接种包含PER.C6细胞的70％融合层的24×T1000五层组织培养烧瓶。使用两步CsCl净化法纯化该病毒。最终，将该病毒以等分在-85℃储存。
Ad35.HPV16-E6E7wt和Ad35.HPV16-E6E7SH是重组腺病毒血清型35(Ad35)载体，这些载体包含密码子优化的核苷酸序列，分别用于表达野生型HPV16E6和E7蛋白(E6E7wt)的融合蛋白、以及如上所述的设计的融合蛋白变体(E6E7SH，具有提供于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列)。该组合的E6和E7序列置于E1、E3缺失的腺病毒基因组的E1区域中的CMV启动子控制下。Ad26.HPV16-E6E7wt和Ad26.HPV16-E6E7SH是基于重组腺病毒血清型26的等效载体。
类似地，产生基于Ad26和Ad35的重组腺病毒载体，这些载体编码HPV16E2E6E7SH(SEQ ID NO:3)变体。类似地，产生编码HPV16E6E7E2SH(SEQ ID NO:5)变体的Ad26和Ad35。此外，产生编码在N-端具有IgE前导序列的E2E6E7SH融合蛋白的Ad35载体，该载体命名为Ad35.HPV16-LSE2E6E7SH。还生产具有在N-端融合至IgE前导序列的E6E7wt的对照腺病毒。
用PER.C6细胞产生重组腺病毒，并且在氯化铯梯度上通过离心进行纯化。
在以下实例中提供了偶联至阻遏物系统的构建体的另外的实例。
实例2.HPV16设计构建体的转化活性的缺失
野生型HPV16E6和E7蛋白具有致瘤潜能，该致瘤潜能在某些测定中表现为转化活性，例如在软琼脂测定中的菌落形成(Massimi和Banks，2005，Methods Mol Med[分子医学方法]119:381-395)。如在实例1中所描述的E6E7SH多肽包括以重新排序方式的E6和E7蛋白的片段。与在此类测定中wt E6和E7蛋白之一相比，预测这可以去除致瘤潜能(例如通过显著降低的转化活性测量的)。
其他文献报道了HPV16E6和E7的基因改组变体确实已经失去了他们的致癌潜能(等人，2006，Vaccine[疫苗]24:2880-93；Henken等人，2012，Vaccine[疫苗]30:4259-66)，证实了基因改组破坏了E6和E7蛋白的野生型功能。
为了评估致瘤性的丧失，我们评估了我们的E6E7SH构建体赋予NIH3T3细胞在软琼脂中生长能力的能力(由例如Massimi和Banks，2005，Methods Mol Med[分子医学方法]119:381-395所描述的)。具有表达野生型HPV16E7的质粒的NIH3T3细胞的转染一致地导致菌落形成。在这些测定中，仅野生型HPV16E6的表达不引起在背景上的菌落形成。这与所公布的观察一致，在该测定中E7wt比E6wt更有效(Sedman等人，1991，J Virol[病毒学杂志]65:4860-66)。在四个独立的试验中用我们的E6E7SH构建体进行的转染并不会导致在软琼脂(图2)中细胞的菌落的生长，证实了编码本发明多肽的核酸E6E7SH已经失去了与E7相关的转化能力。
E6和E7的致瘤潜能分别是与他们降低细胞蛋白p53和pRb水平的能力有关。进行p53和pRb降解测定来证实编码本发明多肽的核酸E6E7SH构建体不具有与野生型E6和E7有关的、处于分子水平的生物活性。简言之，HPV16E6wt和我们的E6E7SH构建体表达于NCI-H1299细胞中，这些NCI-H1299细胞针对于p53降解测定缺少内源p53。针对pRb降解测定，HPV16E7wt和E6E7SH构建体表达于pRb失效Saos-2细胞中。正如在图3中可见的，p53与E6wt但不是与E6E7SH的共同表达，导致了p53水平的降低(图A和B)。类似地，图3C和3D显示出了pRb与E7wt但不是与E6E7SH的共同表达，导致了pRB水平的降低。这些数据证实了编码本发明多肽的核酸没有能力在软琼脂中形成菌落并且不包含野生型E6和E7多肽的主要生物活性，即p53和pRb的分别失活。
为了进一步证实编码本发明多肽的核酸构建体的安全性，我们使用了原代人类包皮角质形成细胞,该原代人类包皮角质形成细胞是HPV介导的转化的天然靶细胞。原代人类角质形成细胞的永生化需要E6和E7二者野生型的作用(Munger等人，1989，J Virol[病毒学杂志]63:4417-21)。这种测定可能是生理学上最相关的体外测定，来证实我们构建体的安全性(Massimi和Banks，2005，Methods Mol Med[分子医学方法]119:381-395)。与非转导的对照细胞(图4)和激活hTERT、端粒酶催化亚单位(数据未示出)相比，用表达来自HPV16(E6E7wt)的野生型E6和E7的慢病毒所转导的细胞诱导了原代角质形成细胞的永生化，如通过他们寿命的延长所表明的。与GFP转导的或非转导的角质形成细胞相比，本发明多肽(E6E7SH)的表达不能延长寿命。在两个另外独立的供体中获得相似的结果(数据未显示)。总之，这些数据证实了我们的构建体已经失去了诱导原代人类角质形成细胞永生化的能力，这些原代人类角质形成细胞被认为是高度具有生理意义的模型。
HPV16E6和E7的可比的片段以不同顺序重组的另一种构建体也不能够使原代人类包皮角质形成细胞永生化。然而，针对那种构建体观察到了长达约120-150天的延长的寿命。这表明了这一领域的一些不可预测性，并且证实了在安全性相关的方面中根据本发明的选择的设计分子的优越性。
该实例中的所有实验一起提供了编码根据本发明的HPV16设计多肽的核酸缺少转化活性的强有力的证据，并且因此比HPV16E6和E7wt构建体大大提高了安全性。
实例3.对HPV16E6E7SH设计构建体的免疫应答
如在实例1中所述，我们已经制备了DNA载体和腺病毒载体。
基于小鼠用编码野生型E2、或者E6或E7的DNA质粒免疫的初始试验，我们使用CB6F1小鼠菌株用于测量免疫应答，并且用HPV16E2、E6和E7抗原进行免疫接种在CB6F1中比在C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠中诱导出更广泛的细胞免疫应答。在一个单独的实验中，将小鼠用编码本发明分子的DNA载体进行免疫，并且测量细胞免疫应答。可以在用表达E6E7SH的DNA质粒免疫的小鼠中测量HPV16E7特异性免疫应答(图5)。
示于该实例中的以下数据来自用腺病毒载体进行的小鼠实验。
为了评估疫苗诱导的免疫原性，用表达HPV16E6E7wt、LSE6E7wt、E6E7SH的腺病毒载体(Ad35)或不编码转基因的腺病毒载体(空白)对CB6F1小鼠进行免疫。测试向小鼠给予的两种剂量：5*109病毒颗粒(vp)和1*1010vp。免疫接种后两周和八周，处死这些小鼠并且用HPV16E7 15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。通过IFNγELISPOT分析两周和八周的E7特异性应答。数据呈现于图6中。
这显示了用Ad35.HPV16-E6E7SH对小鼠进行免疫接种诱导了如通过ELISPOT分析所测量的E7特异性免疫应答。此外，图6中的结果证实了通过向转基因添加N-端前导序列提高针对腺病毒表达的转基因的免疫应答的可能性。
其次，对于免疫原性，测试向HPV16E6E7SH多肽添加HPV16E2的作用。Ad35载体编码具有融合至N-端(E2E6E7SH)或融合至C-端(E6E7E2SH)的E2的多肽。将CB6F1小鼠用1x1010vp的剂量进行免疫。图7(E7四聚体染色)和图8(图C，IFNγELISPOT)显示了针对E7的免疫应答，尽管差异并不是统计学上有义意的，但是相比于不具有E2的构建体，包括E2的设计的构建体的免疫应答往往更高。相比于具有融合至E6E7SH设计多肽的E2的腺病毒载体的应答，针对只编码E2的腺病毒载体具有更高的对E2的应答(图8B)，其中E2与E2E6E7SH和E2与E6E7E2SH的差异是显著的(p值：<0.05)。
可以推断进一步包括E2的设计的构建体仍可以提供针对E7的免疫应答，并且此外还提供了对E2的免疫应答，因此比不包括E2的构建体增大了免疫应答的宽度。
当融合至野生型E6和E7的融合蛋白的N-端的时候，显示出了前导序列的添加导致更高的E7特异性应答(图6C)。类似地，确定前导序列对E2E6E7SH融合蛋白的免疫原性的作用。因此，在具有或不具有N-末端E2的情况下，将编码HPV16设计多肽的Ad35载体和编码LSE2E6E7SH的Ad35载体用来对小鼠进行免疫接种，并且每隔两周取血液样品来测量E7特异性的免疫应答(图9)。如图7和8所示，存在N-或C-端融合至E6E7SH的E2往往增加了免疫应答。IgE前导序列的添加进一步增加了E7特异性应答(图9B)。随着时间，针对所有三种编码根据本发明的设计的分子的腺病毒载体，观察到了持续免疫应答，并且在免疫接种之后的最高应答与在试验期间的最高应答一致。
推断出可以通过添加特异性序列可以增加设计的构建体(该构建体进一步包括N-末端E2)所诱导的应答，例如，IgE前导序列，该IgE前导序列是将所编码的蛋白靶向特异性细胞区室。
可以用不同类型的腺病毒载体诱导针对本发明肽的细胞免疫应答。在先前的实验中，我们使用了Ad35载体，然而在图10的试验中，用表达HPV16E2E6E7SH的Ad26腺病毒载体对小鼠进行免疫。数据显示了用基于Ad26的疫苗进行免疫接种也诱导了E7特异性T细胞。此外，这些结果证实了用表达HPV16E2E6E7SH的Ad35腺病毒载体的第二次免疫接种进一步增强了细胞免疫应答(图10)。
实例4.猕猴中HPV16设计构建体的免疫原性
为了评估表达本发明的设计序列的腺病毒载体诱导非人类灵长动物中免疫应答的能力，以1*1011vp的剂量，用表达HPV16E2E6E7SH的腺病毒载体(Ad26)或不编码转基因的腺病毒载体(空白)通过肌肉内注射对猕猴进行免疫。在免疫接种后八周，用表达相同抗原的Ad26载体通过免疫接种加强该免疫应答。在第16周时，该动物接受了又一次的表达相同抗原的Ad35的注射。在若干时间点取血液样品并且用对应于HPV16E2、E6或E7的肽池刺激分离的白细胞过夜。通过IFNγELISPOT测量特异性应答。数据呈现于图11中。此外，在引发免疫接种后的第10周和第18周，评估对本发明中的跨新颖连接的肽具有特异性的细胞免疫应答。在所有的动物中IFNγ应答的诱导是在<50SFU/1*106PBMC的检测限之下进行的(数据未示出)。
数据显示了用Ad26.HPV16-E2E6E7SH的非人类灵长动物的免疫接种导致了针对出现于编码转基因中的所有三种HPV16蛋白的细胞免疫应答，但是不是针对新颖的连接。可以用Ad26.HPV16-E2E6E7SH通过另外的免疫接种加强应答，并且在第16周用对应Ad35载体的另外加强进一步增加了HPV16E2、E6和E7特异性免疫应答。
在一个单独的实验中(未示出)，用两种腺病毒载体(一种表达HPV16E6E7SH并且另一种表达HPV16L1蛋白)的组合通过阴道给予对猕猴进行免疫。在外周血单核细胞中测量到针对E6和E7的低的但是可测量的细胞应答。在这些试验中，检测到了针对L1的强大的细胞免疫应答。
实例5.在小鼠肿瘤模型中的治疗功效。
针对HPV16(包含SEQ ID NO:1)的本发明的多肽能够诱导动物中的HPV16特异性细胞免疫应答，该细胞免疫应答可以对表达HPV16E6和/或E7的细胞施加治疗效果。治疗性免疫接种，即在肿瘤已经开始生长后的免疫接种，可以被用来证实治疗性HPV疫苗候选物的功效。在用TC-1细胞(表达HPV16E6和E7的小鼠细胞)注射的小鼠中测试Ad26和Ad35载体的治疗效果(Lin等人，1996，Cancer Res[癌症研究]56:21-6)。在小鼠中经皮下注射后的几天至几周内TC-1细胞将形成实体瘤。在没有疫苗的情况下，肿瘤快速生长并且在30天内达到1000mm3的预定大小(图D和E)。当达到这种大小时，出于伦理原因处死小鼠。
在具有SLP(被用作阳性对照；Kenter等人，2009，N Engl J Med[新英格兰医学杂志]361:1838-47；Zwaveling等人，2002，J Immunol[免疫学杂志]169:350-8)或表达HPV16-E2E6E7SH的腺病毒载体的引发-加强免疫接种时间表下，观察到了TC-1诱导的肿瘤生长的明显降低(图12、图B和C)。在引发免疫接种后的第一个30天的仔细检查(图F和G)显示出了用表达E2E6E7SH的腺病毒载体的免疫接种比用SLP的免疫接种对肿瘤生长具有本质上更大的影响。初始生长速率更低并且在大多数情况下这些肿瘤缩小了。在用腺病毒载体免疫的小鼠中的11只中的3只中，完全消除了肿瘤，这体现在存活图中(图H)。
总之，在良好建立的激发模型中，针对HPV16诱导的癌症，用表达本发明的HPV16设计多肽的腺病毒载体进行免疫接种显著降低了肿瘤生长或完全消除了已形成的肿瘤。
实例6：使用阻遏物系统来改进表达HPV衍生抗原的腺病毒载体的生产率和遗传稳定性
之前已经报道了在强大组成型活性启动子的控制下，插入的腺病毒载体的转基因取决于转基因产物的性质，可以负面影响载体生产(Yoshida和Yamada，1997，BiochemBiophys Res Commun[生物化学与生物物理学集刊]230:426-30；Rubinchik等人，2000，Gene Ther[基因治疗]7:875-85；Matthews等人，1999，J Gen Virol[普通病毒学杂志]80:345-53；Edholm等人，2001，J Virol[病毒学杂志]75:9579-84；Gall等人，2007，MolBiotechnol[分子生物技术]35:263-73)。转基因依赖型载体生产率问题的实例包括低效载体挽救和生长，低最终载体产量，和，在严重的情况下，具有缺陷转基因盒的病毒突变体的快速过度生长。为了解决这些问题，多项研究探索了在生产细胞中，在载体复制期间，沉默载体转基因表达的可能性(Matthews等人，1999，J Gen Virol[普通病毒学杂志]80:345-53；Edholm等人，2001，J Virol[病毒学杂志]75:9579-84；Gall等人，2007，Mol Biotechnol[分子生物技术]35:263-73；Cottingham等人，2012，Biotechnol Bioeng[生物技术与生物工程]109:719-28；Gilbert等人，2014，J Virol Methods[病毒学方法杂志]208:177-88)。在此方面，在Ad载体的背景下，之前已经执行了不同的阻遏系统，并且事实上已经示出了改进了编码不同类型的(抑制性)转基因的载体生产率和遗传稳定性。
已经观察到本文描述的腺病毒载体中的一些，连同一些编码某些HPV抗原变体的其他腺病毒载体显示出了本文所述的转基因依赖型载体生产率问题中的一些，并且因此可能在这一方面进一步改善。因此，我们力图调研使用系统来阻遏载体转基因表达是否可以如本文所述的那些改进表达HPV衍生抗原的Ad载体的生产特性。为此目的，我们实施了两种存在的阻遏物操纵基因系统，即TetR/TetO(Yao和Eriksson，1999，Hum Gene Ther[人类基因治疗]10:419-22，EP 0990041B1)和CymR/CuO(Mullick等人，2006，BMC Biotechnol[BMC生物技术]6:43)，进入我们的腺病毒载体平台。之前已经有其他人使用TetR/TetO和CymR/CuO系统在载体复制期间通过载体转基因沉默来改善腺病毒载体生产率(Gall等人，2007，Mol Biotechnol[分子生物技术]35:263-73；Cottingham等人，2012，Biotechnol Bioeng[生物技术与生物工程]109:719-28；Gilbert等人，2014，J Virol Methods[病毒学方法杂志]208:177-88)。这两种系统的实施涉及了在包含TetO或CuO序列的CMV启动子的控制下产生表达感兴趣基因的腺病毒载体。此外，该实施需要产生稳定表达各自同源阻遏蛋白(即，TetR或CymR)的细胞系。
产生若干E1缺失、基于Ad26-和Ad35-的载体，其中编码异源多肽的序列可操作地连接至包含TetO或CuO操纵基因序列的CMV启动子。首先，将某些含有TetO-或CuO-的序列(分别是SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)插入pAdapt26和pAdapt35.Bsu质粒的CMV启动子(SEQ ID NO:13)的转录起始位点(TSS)附近(Abbink等人，2007，J Virol[病毒学杂志]81:4654-63；Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-43)。针对两种系统，将含有操纵基因的序列插入之前所述的CMV启动子的完全相同的位置(Yao&Eriksson，1999，Human Gene Ther[人类基因治疗]10:419-22；EP 0990041B1；Mullick等人，2006，BMCBiotechnol[BMC生物技术]6:43；EP 1385946B1)。确切地，相对于TSS(按原设计；Stenberg等人，1984，J.Virol.[病毒学杂志]49:190-9)，分别将含有TetO-和CuO-的序列直接插入位置-20和+7的下游。在SEQ ID NO:13中，这两个位置分别对应于位置716和742。分别将得到的包含操纵基因的CMV启动子称为CMVTetO和CMVCuO。其次，使用HindIII和XbaI限制性位点，将不同的转基因插入得到的构建体的(修改的)CMV启动子的下游。这些转基因包括编码绿色荧光蛋白和萤虫素酶(GFP-Luc)、如以上在实例1中所描述的HPV16LSE2E6E7SH、和另一种与HPV16LSE2E6E7SH具有一些类似性的多肽(在该实例中称为‘HPVAg’的构建体)的融合蛋白的基因。HPVAg包含呈现于LSE2E6E7SH中的相同的前导序列，连同HPV16的E2、E6和E7序列。使用本文所述的方法，在CMVTetO或CMVCuO启动子的控制下，将得到的修饰的pAdapt26和pAdapt35.Bsu质粒用于产生表达上述报告基因和HPV转基因的腺病毒载体。
通过细胞的稳定转染，分别使用质粒pcDNATM6/TR(生命技术公司(LifeTechnologies)，V1025-20)和pcDNATM6/TR的衍生物产生表达TetR或CymR的细胞系，在pcDNATM6/TR的衍生物中TetR编码序列(SEQ ID NO:14，编码多肽SEQ ID NO:15)被密码子优化的CymR编码序列(SEQ ID NO:16，编码多肽SEQ ID NO:17)替代。如通过pcDNATM6/TR的供应商所述的，使用基于瞬间转染的测定大规模产生稳定的细胞系，来筛选能够阻遏CMVTetO-或CMVCuO-驱动的基因的表达的细胞克隆。在这些细胞中，在载体复制期间，针对其阻遏转基因表达的能力，分析得到的PER.C6/TetR和PER.C6/CymR细胞系。在包含操纵基因的CMV启动子的控制下，在表达对应于各自操纵基因序列的阻遏物的细胞系中，用表达GFP-Luc的载体进行的实验显示了整个完整的病毒复制周期中荧光素酶基因表达减少至少10倍(数据未显示)。这证实了在复制腺病毒载体的背景下PER.C6/TetR和PER.C6/CymR细胞系能够阻遏载体转基因表达。
针对表达HPVAg的基于Ad35的载体，调研腺病毒载体转基因表达的TetR-和CymR-介导的阻遏对载体产量的影响(图13A)。为此，通过从CMVTetO或CMVCuO启动子表达HPVAg的载体，以1000病毒颗粒/细胞并且持续三小时的持续时间，使于在24孔板中以3*105细胞/孔接种的PER.C6、PER.C6/TetR和PER.C6/CymR细胞系经受一式四份感染。作为对照，用表达GFP-Luc而不是HPVAg的对应载体进行平行感染。在感染后四天，通过使孔的内容物(即，受感染细胞和介质)经受两次冻融循环来制备粗病毒裂解物。随后通过基于Ad35六邻体序列特异性定量PCR方案确定腺病毒载体效价，该方案用已知的病毒颗粒效价作为标准使用纯化的Ad35载体。结果显示出包含TetO-和CuO-的编码HPVAg的Ad35载体，相比于表达GFP-Luc的对照载体，显示出了在正常PER.C6细胞上降低的载体产量。相比之下，当在表达它们同源阻遏物的细胞上生产时(即分别是TetR和CymR)，这些相同的载体给出了与用对照载体所获得的那些一样高的产量。这些数据表明，在载体生产期间，在生产细胞中，转基因表达的阻遏针对携带作为转基因的HPVAg的Ad35载体的生产是有益的。
针对源自腺病毒血清型26(Ad26)的载体，还调研了阻遏腺病毒载体转基因表达可能对载体产量具有的影响(图13B)。在基本上如针对以上Ad35载体所述进行的测定中，将携带CMVTetO启动子控制的转基因(该转基因编码GFP-Luc、HPVAg、或LSE2E6E7SH)的Ad26载体以1500病毒颗粒/细胞用来感染PER.C6和PER.C6/TetR细胞。三天后获得感染，并且通过基于Ad26六邻体序列特异性定量PCR方法确定病毒颗粒效价。这些结果显示出了对于PER.C6细胞，编码HPVAg和LSE2E6E7SH的载体的产量比用编码GFP-Luc的对照载体所获得的更低。相比之下，对于PER.C6/TetR细胞，这两种载体显示出了与对照载体所获得的一样高的效价。与以上结果一起(针对Ad35载体)，这些数据表明在腺病毒载体生产期间遏制转基因表达增加了表达HPVAg和LSE2E6E7SH的载体的产量。
我们已经观察到了关于腺病毒载体的遗传稳定性的主要问题，该腺病毒载体携带了针对HPVAg的CMV启动子驱动的转基因。例如，已经观察到在PER.C6上该载体的若干传代后，大部分的载体群由突变载体组成，该突变载体携带在HPVAg编码序列中的一个大的缺失(数据未显示)。
我们推断使用转基因表达阻遏系统，例如上述两种之一，可以防止与转基因有关的遗传稳定性问题，例如抑制载体生长的HPVAg。为了测试这一项，当在PER.C6或PER.C6/CymR细胞上的载体生长后，针对转基因盒稳定性评估具有CMVCuO启动子驱动的HPVAg表达的基于Ad35的载体(图14)。简言之，将载体DNA转染到两种不同的细胞系中，并且允许得到的病毒噬斑生长在琼脂糖层下。从两种转染中的每个，分离五个病毒噬斑，并且分别在相同细胞系(即，用于转染)上进一步传代，持续连续10次病毒传代。在病毒传代数10(VPN10)时，通过转基因盒的PCR扩增评估转基因完整性，并且产生的PCR产物的进一步分析是通过凝胶电泳和桑格测序进行。此外，在VPN7时，针对它们表达HPVAg的能力评估传代的病毒克隆。这通过使用传代的病毒分离株来进行，以1000病毒颗粒/细胞来感染A549细胞，在感染后的48小时裂解这些细胞，并且随后使用针对HPV16E7(圣克鲁斯生物技术(Santa-CruzBiotechnology))的单克隆抗体通过蛋白质印迹法分析HPVAg的表达。凝胶电泳和序列分析的结果显示了已经在PER.C6上传代的所有五种病毒分离株每种在转基因盒内携带了小移码缺失或过早终止突变。相比之下，此类缺失或突变不能在任何已经在表达CymR(PER.C6/CymR)的细胞系上传代的载体分离株中检测到。与这些数据相同，所有的PER.C6/CymR繁殖的载体分离株能够表达HPVAg，然而所有的PER.C6生长的载体完全丢失了这项能力，暗示这些载体的缺陷转基因盒。总之，我们的数据证实了使用阻遏物系统，举例来说CymR/CuO系统，在载体增殖期间来阻遏载体转基因表达是一种有效的手段来防止严重的转基因盒不稳定性，例如针对携带表达HPVAg的转基因的载体所见到的那种。
实例7：设计多肽的构建，该设计多肽基本上包含所有的HPV18E6和E7CTL表位
与我们的针对HPV16E6和E7的设计相似，我们设计了一种新颖的、非致瘤的多肽(和编码这种多肽的核酸)，该多肽基本上包含所有的HPV18E6和E7蛋白的所有的表位，并且具有最小数量的预计的/预测的强大的新表位(新表位意指不存在于野生型HPV18E6和E7蛋白中的表位)。针对HPV18的本发明的多肽(有时在本文还称为HPV18‘E6E7SH’)包括如在SEQID NO:20中所提供的氨基酸序列。以SEQ ID NO:21提供编码该多肽的密码子优化的核酸。
针对HPV18的本发明的分子具有如在实例1下针对HPV16所描述的相同的优点。它们是单分子，这些单分子提供了超过了使用多分子的策略的生产优点。此外，本发明的多肽包含存在于HPV18的野生型E6和E7中的基本上所有假定的CTL表位，并且同时具有最小数量的预期的/预测的强大的新表位，这些新表位可以潜在地可能是免疫显性的并且因此可以从相关的野生型CTL表位转移免疫应答。因此本发明的构建体是比其他人所描述的分子(缺少可能的CTL表位和/或包含更多或更强的新表位)在免疫学上更有利。
例如，SEQ ID NO:20的HPV18设计构建体针对如下包含具有预测结合亲和力<50nM的、具有九个氨基酸长度的仅一个新表位：20种最常见的HLA-A、20种最常见的HLA-B和20种最常见的HLA-C等位基因，例如在实例1中针对HPV16设计构建体所描述的(具有SEQ ID NO:1)。
合成编码我们由此设计的HPV18E6E7SH分子(即，具有如在SEQ ID NO:20中所提供的氨基酸序列的多肽)的核酸，该核酸序列包括SEQ ID NO:21，并且侧翼为在5’端的HindIII位点和Kozak序列和在3’位点的XbaI位点(在英杰生命技术公司(Invitrogen Lifetechnologies)的委托合成以及标准分子克隆，德国)。
使用HindIII和XbaI将该合成的片段克隆到标准表达载体，pCDNA2004.Neo中，该载体具有细菌抗药性标志物(氨比西林)和哺乳类动物抗药性标志物(新霉素)，以获得编码本发明的HPV18设计分子的质粒载体，例如用于基于(瞬时)转染的试验。
可以按照这样使用这些分子，但是还可以用作为包含附加特征的另外的分子的基础。作为非限制性实例，如下描述制备一些另外的变体。
可以将HPV18E6E7SH融合蛋白质序列与其他HPV18早期蛋白的序列结合，以靶向患有持续感染的个体，并且以扩展免疫个体中的免疫系统全部。作为此类实施例的非限制性实例，我们制备了编码E6E7SH与E2在它的N-端的融合蛋白的序列。我们使wt HPV18E2蛋白(Genbank:AAP20597.1)的位置294处的甘氨酸、位置300处的赖氨酸和位置301处的半胱氨酸分别突变成缬氨酸、甲硫氨酸和精氨酸以废止DNA结合活性。这些突变中的每个在于其自身已经完全废止了E2与具有E2的结合域的DNA序列的结合(Prakash等人，1992，Genes Dev[基因与发育]6:105-16)。
所产生的多肽称为HPV18E2E6E7SH并且包括SEQ ID NO:22。制备编码该多肽的密码子优化序列并且在SEQ ID NO:23中提供。
在具有或不具有E2的情况下，编码本发明HPV18E6E7SH多肽的序列可以，例如从DNA构建体、从RNA或从病毒载体进行表达。图15证实了当如上所述用表达转基因的DNA载体瞬时转染后在HEK-293T细胞中的表达。在转染之后，收获细胞并且用识别HPV18的E6的抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析细胞提取物。该试验证实了当表达载体转染后，适当大小的预期融合蛋白的表达。
在具有或不具有E2的情况下，并且在具有或不具有增强所编码的融合蛋白的免疫原性的附加序列的情况下，可以使用腺病毒载体来表达E6E7。
在基因艺术公司(Geneart)，将上述的编码HPV18设计序列针对人类表达进行基因优化并且合成。Kozak序列(5’GCCACC 3’)直接包含于ATG起始密码子的前面，并且将两个终止密码子(5’TGA TAA 3’)添加至各自的编码序列的末端。将这些基因通过HindIII和XbaI位点插入pAdApt35BSU质粒和pAdApt26质粒中(Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87,2135-43)。
Ad35.HPV18-E6E7SH是重组腺病毒血清型35(Ad35)载体，该载体包括密码子优化的核苷酸序列，用于表达如以上所述的HPV18设计融合蛋白变体(HPV18E6E7SH，具有在SEQID NO:20中所提供的氨基酸序列)。该组合的E6和E7序列置于E1、E3缺失的腺病毒基因组的E1区域中的CMV启动子控制下。Ad26.HPV18-E6E7SH是基于重组腺病毒血清型26的等效载体。
类似地，产生基于Ad26和Ad35的重组腺病毒载体，这些载体编码HPV18E2E6E7SH(SEQ ID NO:22)变体。
将所有腺病毒如在以上实例1中所描述的进行生成、制备、纯化以及存储。
实例8.HPV18设计构建体的转化活性的缺失
HPV18的E6和E7蛋白具有致瘤潜能，该致瘤潜能在某些测定中表现为转化活性，例如在软琼脂测定中的菌落形成(Massimi和Banks，2005，Methods Mol Med[分子医学方法]119:381-395)。如在实例7中所描述的E6E7SH多肽包括以重新排序方式的E6和E7蛋白的片段。与在此类测定中wt E6和E7蛋白之一相比，预测这可以去除致瘤潜能(如可以例如通过转化活性的缺失进行测量)。
其他文献报道了HPV16E6和E7的基因改组变体确实已经失去了他们的致癌潜能(等人，2006，Vaccine[疫苗]24:2880-93；Henken等人，2012，Vaccine[疫苗]30:4259-66)，证实了基因改组破坏了HPV16E6和E7蛋白的野生型功能。在实例2中，我们已经示出了我们的针对HPV16的设计构建体已经失去E6和E7活性。
为了评估致瘤性的丧失，我们评估了我们的HPV18E6E7SH构建体赋予NIH 3T3细胞在软琼脂中生长能力的能力(由例如Massimi和Banks，2005，Methods Mol Med[分子医学方法]119:381-395所描述的)。具有表达野生型HPV18E7的质粒的NIH3T3细胞的转染一致地导致菌落形成。与用HPV16E6获得的结果相似，仅野生型HPV18E6的表达不引起在背景上的菌落形成。在四个独立的试验中用我们的HPV18E6E7SH构建体进行的转染并不会导致在软琼脂(图16)中细胞的菌落的生长，证实了编码本发明的多肽的核酸HPV18E6E7SH已经失去了与E7相关的转化能力。
E6和E7的致瘤潜能分别是与他们降低细胞蛋白p53和pRb水平的能力有关。进行p53和pRb降解测定来证实编码本发明的多肽的核酸HPV18E6E7SH不具有与野生型E6和E7有关的、处于分子水平的生物活性。简言之，HPV18E6wt和我们的HPV18E6E7SH构建体表达于NCI-H1299细胞中，这些NCI-H1299细胞针对于p53降解测定缺少内源p53。针对pRb降解测定，HPV18E7wt和HPV18E6E7SH构建体表达于pRb失效Saos-2细胞中。正如在图17中可见的，p53与HPV18E6wt但不与HPV18E6E7SH的共同表达，导致了p53水平的降低(图A和B)。类似地，图17C、17D显示出了pRb与HPV18E7wt但不与HPV18E6E7SH的共同表达，导致了pRB水平的降低。这些数据证实了编码本发明的HPV18设计多肽的核酸没有能力在软琼脂中形成菌落并且不包含野生型HPV18E6和E7多肽的主要生物活性，即p53和pRb的分别失活。
为了进一步证实编码本发明多肽的核酸构建体的安全性，我们使用了衍生自新生儿包皮的原代人类生殖角质形成细胞(HEKn细胞)，该原代人类生殖角质形成细胞是HPV介导的转化的天然靶细胞。原代人类角质形成细胞的永生化需要E6和E7二者野生型的作用(Munger等人，1989，J Virol[病毒学杂志]63:4417-21)。这种测定可能是生理学上最相关的体外测定，来证实我们构建体的安全性(Massimi和Banks，2005，Methods Mol Med[分子医学方法]119:381-395)。与非转导的对照细胞(图18)和活化hTERT、端粒酶催化亚单位(数据未示出)相比，用表达来自HPV18(E6E7wt)的野生型E6和E7的慢病毒所转导的细胞诱导了原代角质形成细胞的永生化，如通过它们寿命的延长所表明的。与GFP转导的或非转导的角质形成细胞相比，本发明的HPV18设计多肽(HPV18E6E7SH)的表达不能延长寿命。在两个另外独立的供体中获得相似的结果(数据未显示)。总之，这些数据证实了我们的构建体已经失去了诱导原代人类角质形成细胞永生化的能力，这些原代人类角质形成细胞被认为是高度具有生理意义的模型。
HPV18E6和E7的可比的片段以不同顺序重组的另一种构建体也不能够使原代人类包皮角质形成细胞永生化。然而，与HPV16的可替代的E6E7序列的结果类似(参见实例2)，观察到该可替代的HPV18构建体的延长的寿命。这表明了这一领域的一些不可预测性，并且证实了在安全性相关的方面中根据本发明的选择的设计分子的优越性。
该实例中的所有实验一起提供了编码根据本发明多肽的核酸缺少转化活性的强有力的证据，并且因此比HPV18E6和E7wt构建体大大提高了安全性。
实例9.对HPV18E6E7SH设计构建体的免疫应答
如在实例7中所述，我们已经制备了DNA载体和腺病毒载体。为了评估疫苗诱导的免疫原性，用表达HPV18E6E7SH或E2E6E7SH的腺病毒载体(Ad35)或不编码转基因的腺病毒载体(空白)作为对照对CB6F1小鼠进行免疫。引发免疫接种后两周，处死这些小鼠并且用HPV18E6 15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。通过细胞内细胞因子染色来分析E6-特异性免疫应答。在单独的实验中，用表达HPV18E2E6E7SH的腺病毒载体(Ad35或Ad26)或不编码转基因的腺病毒载体(空白)作为对照对CB6F1小鼠进行免疫。
图19A示出了用Ad35.HPV18-E6E7SH对小鼠进行免疫接种诱导了如通过ICS分析所测量的E6特异性免疫应答。此外，图19A中的结果展示出E2与设计者构建体的N-末端的融合不降低免疫原性，尽管在转染后观察到这个E2E6E7变体的低表达(图15)。图19B示出了具有Ad35.HPV18-E6E7SH或Ad26.HPV18-E2E6E7SH的小鼠的免疫诱导了产IFNγ的HPV18-E6特异性CD8T细胞的可比的百分数。
可以用不同类型的腺病毒载体诱导针对本发明肽的细胞免疫应答。在实验中呈现于图19B中，将小鼠用体表达HPV18E2E6E7SH的Ad26或Ad35腺病毒载进行免疫。数据显示这些腺病毒载体诱导HPV18E6-特异性T细胞至以类似的水平。
实例10.将表达HPV16和HPV18设计构建体的腺病毒载体进行组合。
将针对不同HPV类型的设计构建体进行组合，为制造针对不同HPV类型的治疗疫苗提供了可能性。为了评估表达不同设计序列的腺病毒载体诱导免疫应答的能力，以针对每个载体1*1010vp的剂量，用表达HPV16E2E6E7SH(编码包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的蛋白质)的腺病毒载体(Ad26)和表达HPV18E2E6E7SH(编码包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的蛋白质)的Ad26或不编码转基因的腺病毒载体(空白)通过肌肉内注射对小鼠进行免疫。在免疫接种后四周，用表达相同抗原的Ad35载体通过免疫接种加强该免疫应答。在加强免疫接种后两周测量免疫应答。用对应于HPV18的E6或HPV16的E7的肽池刺激细胞过夜并通过IFNγELISPOT测量应答。数据呈现于图20中。
数据显示，用表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的Ad26/35载体对小鼠进行免疫接种导致了针对这两个(即HPV16和HPV18)设计蛋白的细胞免疫应答。
在具有类似免疫接种程序的独立实验(Ad26引发和Ad35加强)中，我们比较了通过表达HPV16E2E6E7SH的Ad和表达HPV18E2E6E7SH的Ad一起诱导的免疫应答与用表达HPV16E2E6E7SH的Ad单独地或用表达HPV18E2E6E7SH的Ad单独地进行免疫接种的小鼠的免疫应答。加强免疫接种后两周测量免疫应答，并用对应于HPV16和HPV18的E2、E6或E7的肽池刺激细胞过夜，并通过IFNγELISPOT连同细胞内细胞因子染色测量这些应答。虽然与仅用个体疫苗组分免疫的动物相比，以表达HPV16E2E6E7SH的Ad和表达HPV18E2E6E7SH的Ad的单一组合物进行共同给予确实导致CD4和CD8应答的整体较低的幅度，但该共同给予诱导免疫应答的类似宽度(数据未显示)。
因此根据本发明的、表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的构建体的共同给予可能诱导对HPV16和HPV18两者的细胞免疫应答。
实例11.猕猴中组合的设计构建体的免疫原性。
为了评估表达本发明设计序列的腺病毒载体诱导非人类灵长动物中免疫应答的能力，以针对每个载体1*1011vp的剂量，用如在先前实例中的两个单独的腺病毒载体(即一起表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的Ad26载体)或不编码转基因的腺病毒载体(空白)通过肌肉内注射对猕猴进行免疫。在免疫接种后八周，用表达相同抗原的Ad26载体使动物接受加强免疫接种。在第16周时，用表达相同抗原的Ad35载体使这些动物接受再一次注射。在若干时间点取血液样品并且用对应于HPV16和HPV18两者的E2、E6或E7的肽池刺激分离的白细胞过夜。通过IFNγELISPOT测量特异性应答。数据呈现于图21中。此外，在引发免疫后的第10周和第18周，评估对本发明的HPV18设计分子中的跨新颖连接的肽具有特异性的细胞免疫应答。在所有的动物中针对这些连接肽的IFNγ应答的诱导是在<50SFU/1*106PBMC的检测限之下进行的(数据未示出)。
数据显示，用一起表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的Ad26载体的组合进行非人类灵长动物的免疫接种导致了针对呈现于编码的转基因中的几种HPV蛋白的细胞免疫应答。通过用Ad26载体进行的再次免疫接种可导致应答增强。在第16周时用对应的Ad35载体进行再次增强免疫接种，进一步提高免疫应答。
实例12.在小鼠肿瘤模型中的组合的构建体的治疗功效。
对应于HPV16E6和E7的本发明的多肽能够在小鼠中诱导细胞免疫应答，这将导致在TC-1模型中的治疗效果(如实例5中示出的)。在该同一模型中测试一起表达HPV16和HPV18设计蛋白两者的腺病毒载体的组合的治疗效果。在没有疫苗的情况下，肿瘤快速生长并且在30天内达到1000mm3的预定大小，在该点因为伦理原因处死小鼠。
在本实验中，在第0天用5*104TC-1细胞经皮下注射C57BL/6小鼠。六天后，当癌症是可感知时，用Ad26.HPV16-E2E6E7SH或Ad26.HPV16-E2E6E7SH和Ad26.HPV18-E2E6E7SH的混合物使小鼠免疫。还用相应的Ad35载体使所有小鼠在第20天接受加强免疫接种。观察到用表达HPV16E2E6E7SH的腺病毒载体进行的引发免疫接种-加强免疫接种显著地延长了小鼠的存活期(图22)。使用一起表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH两者的腺病毒载体的组合，观察到相似的平均存活时间。在接受该组合疫苗的小鼠的组中，三只动物在90天的监测期结束时也没有患上肿瘤。
其他实验的结果显示，当更早给予引发免疫时，例如，用TC-1细胞在小鼠皮下注射后4天，用同时表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的腺病毒载体的引发-加强免疫也显著地延长了小鼠的存活期(数据未示出)。
结论，在针对HPV16诱导的癌症而良好建立的激发模型中，用一起表达本发明的HPV16-和HPV18-特异性设计多肽的腺病毒载体的组合进行的免疫接种显著降低了肿瘤生长或完全消除了已形成的肿瘤。
实例13：对HPV16E2E6E7和HPV18E2E6E7(MVA-BN mBN411)MVA载体的构建
在本实例中，我们已经产生了包括HPV16E2E6E7和HPV18E2E6E7的MVA-BN载体。应理解在具有或不具有E2的情况下，并且在具有或不具有增强所编码的多肽的免疫原性的附加序列的情况下，可以使用MVA-BN载体来表达E6E7。
我们设计了编码多肽HPV16E2E6E7(SEQ ID NO:3)的新颖核酸(SEQ ID NO:24)和编码多肽HPV18E2E6E7(SEQ ID NO:22)的新颖核酸(SEQ ID NO:25)。针对彼此之间的人类表达和最小同源性设计新颖核酸。核酸序列在基因艺术公司(GeneArt)合成。
PrMVA13.5long启动子(SEQ ID NO:26)包括在HPV16E2E6E7的ATG起始密码子前面，并且在该编码序列的末端添加两个终止密码子(5'TGA TGA 3')。PrHyb启动子(SEQ IDNO:27)包括在HPV18E2E6E7的ATG起始密码子前面，并且在该编码序列的末端添加两个终止密码子(5'TGA TGA 3')。将提前终止信号(5'TTTTTAT 3')插在两个核酸序列的各自的终止密码子后面。
经由SacII和NheI将基因插入到pBNX202中，pBNX202是编码IGR88/89MVA-BN同源区的转移载体，且因此允许经由同源重组插入MVA-BN的IGR88/89的插入位点。此外，pBNX202编码mRFP1和ecogpt用于阳性选择以及IGR88/89MVA-BN同源区Flank 2的重复序列，用于随后在缺乏选择压力的情况下经由同源重组切除选择盒。
基于MVA的载体在原代鸡成纤维细胞(CEF)中产生并如本文所述生产。
每周从鸡胚中分离CEF细胞并保持在没有FBS的VP-SFM培养基中。
简言之，根据制造商(普洛麦格公司(Promega))提供的说明书，使用Fugene，用MVA载体质粒转染CEF细胞，并进行与MVA-BN的共感染。两天后收获细胞，超声处理并进一步噬斑纯化。将病毒噬斑纯化并分别在于多孔24-组织培养板的单孔或多孔96-组织培养板的单孔中培养的CEF细胞中扩增。在多孔6-组织板的单孔中并随后在T175组织培养瓶中培养的CEF细胞中进行进一步扩增。
为了产生病毒mBN 411A，产生十一次传代，其中三次传代是在含有麦考酚酸/黄嘌呤和次黄嘌呤的VP-SFM培养基中的噬斑纯化。为了产生mBN411B，产生了十七次传代，其中六次传代是在没有选择压力的VP-SFM培养基中的噬斑纯化，以允许经由同源重组切除选择盒。
因此，MVA mBN 411病毒是MVA-BN，该MVA-BN在其IGR88/89区中包含在PrMVA13.5long启动子(SEQ ID NO:26)控制下编码设计多肽HPV16E2E6E7SH(SEQ ID NO:3)的核酸，和在PrHyb启动子(SEQ ID NO:27)控制下编码设计多肽HPV18E2E6E7SH(SEQ IDNO:22)的核酸。将MVA mBN411病毒用于具有编码设计多肽的腺病毒载体的引发-加强方案的后续实验中。
实例14.HPV16和HPV18设计构建体在小鼠中的Ad26引发和MVA加强免疫中的免疫原性。
评估了通过使用腺病毒载体(Ad26)的引发免疫和使用修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒的加强免疫诱导的HPV16和HPV18特异性免疫应答。作为引发免疫，通过肌内注射表达HPV16E2E6E7SH(编码包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的蛋白质)的腺病毒载体(Ad26)和表达HPV18E2E6E7SH(编码包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的蛋白质)的Ad26接种小鼠，对于每种载体使用1*1010vp的剂量，或作为使用不编码转基因的腺病毒载体的对照(空白)。引发免疫后八周，用表达与引发免疫期间相同抗原的MVA(MVA BN mBN411A，剂量为8.9x107TCID50/小鼠)对动物进行加强免疫，而另一组小鼠用与引发免疫期间表达相同抗原的Ad35载体进行加强免疫。用不编码转基因的MVA载体(对照)对对照动物进行加强免疫。
在加强免疫接种后两周测量免疫应答。用对应于HPV16或HPV18的E2、E6或E7的肽池刺激细胞过夜并通过IFNγELISPOT测量应答。数据呈现于图23中。
数据显示，用表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的Ad26/Ad35或Ad26/MVA载体对小鼠进行免疫导致了针对这两个(即HPV16和HPV18)设计蛋白的细胞免疫应答。在用表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的MVA加强免疫的动物中，整体应答最高。
实例15.HPV16和HPV18设计构建体在猕猴Ad26引发和MVA加强免疫中的免疫原性。
我们评估了表达本发明的设计序列的腺病毒载体和MVA载体在非人类灵长类动物中诱导免疫应答的能力。将猕猴(非人类灵长类动物，NHP)通过用如实例11中两种单独的腺病毒载体(即表达HPV16E2E6E7SH的Ad26和表达HPV18E2E6E7SH的Ad26，每种腺病毒载体剂量为1*1011vp)的混合物肌内注射进行引发免疫。引发免疫后八周，用MVA-BN(mBN 411A，表达这些相同抗原的载体，以约1.80x108TCID50/NHP的剂量)加强动物。
在若干时间点取血液样品并且用对应于HPV16和HPV18两者的E2、E6或E7的肽池刺激分离的白细胞过夜。通过IFNγELISPOT测量特异性应答。数据呈现于图24中。
数据显示用表达HPV16E2E6E7SH和HPV18E2E6E7SH的Ad/MVA免疫猕猴导致针对设计的抗原的细胞免疫应答。此外，诱导的细胞应答似乎通过MVA加强而扩展，这些应答针对由疫苗载体表达的6种不同HPV16和HPV18抗原中的3-5种。
实例16.HPV16和HPV18设计构建体在小鼠Ad26引发和MVA加强免疫中的治疗功效。
在与实例12下所述相同的TC-1模型中测试用腺病毒载体和表达HPV16和HPV18设计蛋白的MVA的引发加强免疫的治疗功效。随着时间肿瘤生长，一旦肿瘤体积达到>1000mm3，就出于伦理原因处死动物。
实验设计如下：
处理组。在引发当天，在最少50％的动物中可感知肿瘤。(HPV16-Tx和HPV18-Tx指示编码分别具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:20的多肽的本发明构建体)。
在TC-1肿瘤细胞接种之前、在第19天(即加强给予前一天)和在第34天(即加强给予后两周)抽取血液，并且在一些小鼠中，在TC-1肿瘤细胞接种后第90天也抽取血液。
在本实验中，在第0天用5*104TC-1细胞经皮下注射C57BL/6小鼠。六天后，当肿瘤是可感知时，用Ad26.HPV16-E2E6E7SH和Ad26.HPV18-E2E6E7SH的混合物使小鼠免疫。在第20天小鼠接受Ad26.HPV16-E2E6E7SH和Ad26.HPV18-E2E6E7SH或MVA-BN-HPV16/18-Tx的加强免疫。将对照小鼠用不编码转基因的Ad26引发，并用不编码转基因的MVA加强。用编码E2E6E7SH的Ad26/Ad35或编码HPV16/18E2E6E7SH的MVA-BN免疫的动物导致了可比的延长的存活期和中值存活时间；在两组中，一只小鼠在90天的监测期结束时存活并且没有肿瘤。数据表示于图25中。
说明书中的实例被视为仅是示例性的，本发明的真正范围和精神由以下权利要求指示。
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序列表
<110> 扬森疫苗与预防公司
巴法里安诺迪克有限公司
<120> 治疗性HPV疫苗组合
<130> 0269 US P00 PRO
<160> 33
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16-E6E7SH设计多肽
<400> 1
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
115 120 125
Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
130 135 140
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
145 150 155 160
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His
165 170 175
Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
180 185 190
Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu
195 200 205
Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala
210 215 220
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
225 230 235 240
Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln
245 250 255
Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile
260 265 270
Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys
275 280 285
Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr
290 295 300
Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu
305 310 315 320
Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys
325
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16-E6E7SH设计多肽的nt序列
<400> 2
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gacccccagg aacggcccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tggaagatga gatcgacggc cctgctggcc aggccgaacc cgacagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgcggct gtgcgtgcag 240
agcacccacg tggacatccg gaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccccatct gcagccagaa gcccggcacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 360
tgcgacctgc tgatccggtg catcaactgc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 420
cggcacctgg acaagaagca gcggttccac aacatccggg gcagatggac aggcagatgc 480
atgagctgct gcagaagcag ccggaccaga cgggaaaccc agatgcacgg cgacaccccc 540
accctgcacg agtacatgct ggacctgcag cccgagacaa ccgacctgta ctgctacgag 600
cagctgaacg acagcagcga ggaagaggac gagattgacg gacccgctgg acaggccgag 660
cctgaccggg ctcactataa catcgtgaca ttttgctgtc agctctgtac tgaactccag 720
acaacaattc acgatattat tctcgaatgt gtgtattgta aacagcagct cctgcggaga 780
gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctc tgcatcgtgt atcgggacgg caacccctac 840
gccgtgtgcg acaagtgcct gaagttctac agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc 900
tacagcctgt acggaacaac actcgaacag cagtataaca aaccactctg tgatctgctg 960
attcgctgta tcaattgtca gaagtgataa 990
<210> 3
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E2E6E7SH设计多肽
<400> 3
Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu
1 5 10 15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
50 55 60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
100 105 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
115 120 125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
130 135 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
145 150 155 160
His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
165 170 175
Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
180 185 190
Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
210 215 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
225 230 235 240
Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
245 250 255
Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn
260 265 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
275 280 285
Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg
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Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
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340 345 350
Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile Met His Gln
355 360 365
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Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu
385 390 395 400
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Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
420 425 430
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
435 440 445
Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile
450 455 460
Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln
465 470 475 480
Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln
485 490 495
Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln
500 505 510
Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys
515 520 525
Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His Gly Asp Thr
530 535 540
Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp
545 550 555 560
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
565 570 575
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
580 585 590
Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile
595 600 605
His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg
610 615 620
Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg
625 630 635 640
Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser
645 650 655
Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr
660 665 670
Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys
675 680 685
Ile Asn Cys Gln Lys
690
<210> 4
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16 E2E6E7SH设计多肽的nt序列
<400> 4
atggaaaccc tgtgccagcg gctgaacgtg tgccaggaca agatcctgac ccactacgag 60
aacgacagca ccgacctgcg ggaccacatc gactactgga agcacatgcg gctggaatgc 120
gccatctact acaaggccag agagatgggc ttcaagcaca tcaaccacca ggtggtgccc 180
accctggccg tgtccaagaa caaggccctg caggccatcg agctgcagct gaccctggaa 240
accatctaca acagccagta cagcaacgag aagtggaccc tgcaggacgt gtccctggaa 300
gtgtacctga ccgctcccac cggctgcatc aagaaacacg gctacaccgt ggaagtgcag 360
ttcgacggcg acatctgcaa caccatgcac tacaccaact ggacccacat ctacatctgc 420
gaagaggcca gcgtgaccgt ggtggaaggc caggtggact actacggcct gtactacgtg 480
cacgagggca tccggaccta cttcgtgcag ttcaaggacg acgccgagaa gtacagcaag 540
aacaaagtgt gggaggtgca cgctggcggc caggtcatcc tgtgccccac cagcgtgttc 600
agcagcaacg aggtgtccag ccccgagatc atccggcagc acctggccaa tcaccctgcc 660
gccacccaca caaaggccgt ggccctgggc accgaggaaa cccagaccac catccagcgg 720
cccagaagcg agcccgacac cggcaatccc tgccacacca ccaagctgct gcaccgggac 780
agcgtggaca gcgcccctat cctgaccgcc ttcaacagca gccacaaggg ccggatcaac 840
tgcaacagca acaccacccc catcgtgcac ctgaaggtgg acgccaacac cctgatgcgg 900
ctgcggtaca gattcaagaa gcactgcacc ctgtacaccg ccgtgtcctc cacctggcac 960
tggaccggcc acaacgtgaa gcacaagagc gccatcgtga ccctgaccta cgacagcgag 1020
tggcagcggg accagttcct gagccaggtc aaaatcccca agaccatcac cgtgtccacc 1080
ggcttcatga gcatcatgca ccagaaacgg accgccatgt tccaggaccc ccaggaacgg 1140
cccagaaagc tgccccagct gtgcaccgag ctgcagacca ccatccacga catcatcctg 1200
gaatgcgtgt actgcaagca gcagctggaa gatgagatcg acggccctgc tggccaggcc 1260
gaacccgaca gagcccacta caatatcgtg accttctgct gcaagtgcga cagcaccctg 1320
cggctgtgcg tgcagagcac ccacgtggac atccggaccc tggaagatct gctgatgggc 1380
accctgggca tcgtgtgccc catctgcagc cagaagcccg gcaccaccct ggaacagcag 1440
tacaacaagc ccctgtgcga cctgctgatc cggtgcatca actgccagaa acccctgtgc 1500
cccgaggaaa agcagcggca cctggacaag aagcagcggt tccacaacat ccggggcaga 1560
tggacaggca gatgcatgag ctgctgcaga agcagccgga ccagacggga aacccagatg 1620
cacggcgaca cccccaccct gcacgagtac atgctggacc tgcagcccga gacaaccgac 1680
ctgtactgct acgagcagct gaacgacagc agcgaggaag aggacgagat tgacggaccc 1740
gctggacagg ccgagcctga ccgggctcac tataacatcg tgacattttg ctgtcagctc 1800
tgtactgaac tccagacaac aattcacgat attattctcg aatgtgtgta ttgtaaacag 1860
cagctcctgc ggagagaggt gtacgacttc gccttccggg acctctgcat cgtgtatcgg 1920
gacggcaacc cctacgccgt gtgcgacaag tgcctgaagt tctacagcaa gatcagcgag 1980
taccggcact actgctacag cctgtacgga acaacactcg aacagcagta taacaaacca 2040
ctctgtgatc tgctgattcg ctgtatcaat tgtcagaagt gataa 2085
<210> 5
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6E7E2SH设计多肽
<400> 5
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
115 120 125
Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
130 135 140
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
145 150 155 160
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His
165 170 175
Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
180 185 190
Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu
195 200 205
Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala
210 215 220
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
225 230 235 240
Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln
245 250 255
Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile
260 265 270
Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys
275 280 285
Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr
290 295 300
Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu
305 310 315 320
Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu
325 330 335
Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr
340 345 350
Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys
355 360 365
Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu Met Gly Phe Lys His Ile Asn His
370 375 380
Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala
385 390 395 400
Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser
405 410 415
Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr
420 425 430
Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln
435 440 445
Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His
450 455 460
Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val
465 470 475 480
Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe
485 490 495
Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp
500 505 510
Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe
515 520 525
Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala
530 535 540
Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu
545 550 555 560
Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly
565 570 575
Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser
580 585 590
Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn
595 600 605
Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn
610 615 620
Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr
625 630 635 640
Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His
645 650 655
Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp
660 665 670
Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr
675 680 685
Gly Phe Met Ser Ile
690
<210> 6
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16 E6E7E2SH设计多肽的nt序列
<400> 6
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gacccccagg aacggcccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tggaagatga gatcgacggc cctgctggcc aggccgaacc cgacagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgcggct gtgcgtgcag 240
agcacccacg tggacatccg gaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccccatct gcagccagaa gcccggcacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 360
tgcgacctgc tgatccggtg catcaactgc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 420
cggcacctgg acaagaagca gcggttccac aacatccggg gcagatggac aggcagatgc 480
atgagctgct gcagaagcag ccggaccaga cgggaaaccc agatgcacgg cgacaccccc 540
accctgcacg agtacatgct ggacctgcag cccgagacaa ccgacctgta ctgctacgag 600
cagctgaacg acagcagcga ggaagaggac gagattgacg gacccgctgg acaggccgag 660
cctgaccggg ctcactataa catcgtgaca ttttgctgtc agctctgtac tgaactccag 720
acaacaattc acgatattat tctcgaatgt gtgtattgta aacagcagct cctgcggaga 780
gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctc tgcatcgtgt atcgggacgg caacccctac 840
gccgtgtgcg acaagtgcct gaagttctac agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc 900
tacagcctgt acggaacaac actcgaacag cagtataaca aaccactctg tgatctgctg 960
attcgctgta tcaattgtca gaagatggaa accctgtgcc agcggctgaa cgtgtgccag 1020
gacaagatcc tgacccacta cgagaacgac agcaccgacc tgcgggacca catcgactac 1080
tggaagcaca tgcggctgga atgcgccatc tactacaagg ccagagagat gggcttcaag 1140
cacatcaacc accaggtggt gcccaccctg gccgtgtcca agaacaaggc cctgcaggcc 1200
atcgagctgc agctgaccct ggaaaccatc tacaacagcc agtacagcaa cgagaagtgg 1260
accctgcagg acgtgtccct ggaagtgtac ctgaccgctc ccaccggctg catcaagaaa 1320
cacggctaca ccgtggaagt gcagttcgac ggcgacatct gcaacaccat gcactacacc 1380
aactggaccc acatctacat ctgcgaagag gccagcgtga ccgtggtgga aggccaggtg 1440
gactactacg gcctgtacta cgtgcacgag ggcatccgga cctacttcgt gcagttcaag 1500
gacgacgccg agaagtacag caagaacaaa gtgtgggagg tgcacgctgg cggccaggtc 1560
atcctgtgcc ccaccagcgt gttcagcagc aacgaggtgt ccagccccga gatcatccgg 1620
cagcacctgg ccaatcaccc tgccgccacc cacacaaagg ccgtggccct gggcaccgag 1680
gaaacccaga ccaccatcca gcggcccaga agcgagcccg acaccggcaa tccctgccac 1740
accaccaagc tgctgcaccg ggacagcgtg gacagcgccc ctatcctgac cgccttcaac 1800
agcagccaca agggccggat caactgcaac agcaacacca cccccatcgt gcacctgaag 1860
gtggacgcca acaccctgat gcggctgcgg tacagattca agaagcactg caccctgtac 1920
accgccgtgt cctccacctg gcactggacc ggccacaacg tgaagcacaa gagcgccatc 1980
gtgaccctga cctacgacag cgagtggcag cgggaccagt tcctgagcca ggtcaaaatc 2040
cccaagacca tcaccgtgtc caccggcttc atgagcatct gataa 2085
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgE前导肽
<400> 7
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码IgE前导肽的nt序列
<400> 8
atggactgga cctggatcct gttcctggtg gctgccgcaa cccgggtgca cagc 54
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HAVT20前导肽
<400> 9
Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu
1 5 10 15
Glu Phe Ser Met Ala
20
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HAVT20前导肽的nt序列
<400> 10
atggcctgcc ccggctttct gtgggccctg gtcatcagca cctgtctgga attcagcatg 60
gcc 63
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有2xTetO的序列
<400> 11
gagctctccc tatcagtgat agagatctcc ctatcagtga tagagatcgt cgac 54
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有2xCuO的序列
<400> 12
aacaaacaga caatctggtc tgtttgta 28
<210> 13
<211> 829
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV启动子
<400> 13
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780
aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattgga 829
<210> 14
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TetR多肽的nt序列
<400> 14
atgtctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc cgcgtacagc ggatcccggg aattcagatc ttattaa 657
<210> 15
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TetR多肽
<400> 15
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala
195 200 205
Tyr Ser Gly Ser Arg Glu Phe Arg Ser Tyr
210 215
<210> 16
<211> 612
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CymR多肽的nt序列
<400> 16
atgtctccca aacgacggac tcaagcggaa agggcaatgg aaactcaggg taagctgatt 60
gccgcggctc tgggagtgct gcgagagaaa gggtatgccg ggtttcgcat agccgacgtt 120
cctggagctg caggcgtaag cagaggagcc caatctcatc actttccgac caagctggag 180
cttttgctgg ctaccttcga atggctgtac gagcagatca cggaaaggag tcgtgctagg 240
ctggccaagc tgaaacccga ggatgatgtc attcagcaga tgctggacga tgcagccgag 300
ttcttcctgg acgacgactt cagcatcagt ctcgacctca tcgtagccgc agatcgcgat 360
ccagctttgc gcgagggcat acagagaaca gtcgagcgga atcggtttgt ggtggaggac 420
atgtggcttg gtgttctggt gagcagaggc ctctcacggg atgatgccga ggacatcctg 480
tggctgatct ttaactccgt cagagggttg gcagtgaggt ccctttggca gaaggacaaa 540
gaacggtttg aacgtgtgcg aaactcaaca ctcgagattg ctagggaacg ctacgccaag 600
ttcaagagat ga 612
<210> 17
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CymR多肽
<400> 17
Met Ser Pro Lys Arg Arg Thr Gln Ala Glu Arg Ala Met Glu Thr Gln
1 5 10 15
Gly Lys Leu Ile Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu Lys Gly Tyr
20 25 30
Ala Gly Phe Arg Ile Ala Asp Val Pro Gly Ala Ala Gly Val Ser Arg
35 40 45
Gly Ala Gln Ser His His Phe Pro Thr Lys Leu Glu Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Thr Phe Glu Trp Leu Tyr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Ser Arg Ala Arg
65 70 75 80
Leu Ala Lys Leu Lys Pro Glu Asp Asp Val Ile Gln Gln Met Leu Asp
85 90 95
Asp Ala Ala Glu Phe Phe Leu Asp Asp Asp Phe Ser Ile Ser Leu Asp
100 105 110
Leu Ile Val Ala Ala Asp Arg Asp Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Arg Thr Val Glu Arg Asn Arg Phe Val Val Glu Asp Met Trp Leu Gly
130 135 140
Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Ser Arg Asp Asp Ala Glu Asp Ile Leu
145 150 155 160
Trp Leu Ile Phe Asn Ser Val Arg Gly Leu Ala Val Arg Ser Leu Trp
165 170 175
Gln Lys Asp Lys Glu Arg Phe Glu Arg Val Arg Asn Ser Thr Leu Glu
180 185 190
Ile Ala Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Phe Lys Arg
195 200
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6 aa41-65
<400> 18
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 19
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E7 aa43-77
<400> 19
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 20
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV18-E6E7SH设计多肽
<400> 20
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
50 55 60
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
65 70 75 80
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
85 90 95
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
100 105 110
Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly
115 120 125
Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile
130 135 140
Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg
145 150 155 160
His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg
165 170 175
Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln
180 185 190
Arg Arg Arg Glu Thr Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile
195 200 205
Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys
210 215 220
His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly
225 230 235 240
Val Asn Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile
245 250 255
Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val
260 265 270
Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile
275 280 285
Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg
290 295 300
Glu Leu Arg His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys
305 310 315 320
Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile
325 330
<210> 21
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV18-E6E7SH设计序列的nt序列
<400> 21
atggccagat tcgaggaccc caccagacgg ccctacaagc tgcccgacct gtgcaccgag 60
ctgaacacat ctctgcagga catcgagatc acatgcgtgt actgcaagac cgtgctggac 120
ctgctgtgcc acgagcagct gtccgactcc gaggaagaaa acgacgagat cgacggcgtg 180
aaccatcagc atctgcccgc cagacgggcc gagccccaga gacacaccat gctgtgcatg 240
tgctgcaagt gcgaggcccg gattgagctg gtggtggaaa gcagcgccga cgacctgcgg 300
gccttccagc agctctttct gaataccctg agcttcgtgt gcccttggtg cgccagccag 360
cactacagcg actccgtgta cggcgatacc ctggaaaagc tgaccaatac cggcctgtat 420
aacctgctga tccggtgcct gcggtgccag aagcccctga atcccgccga gaaactgaga 480
cacctgaacg agaagcggcg gttccacaat atcgccggcc actacagagg ccagtgccac 540
agctgctgca accgggccag acaggaacgg ctgcagcgga ggcgggaaac catgcacgga 600
cccaaggcca ccctccagga cattgtcctg cacctggaac cccagaacga gatccccgtc 660
gatctgctgt gtcatgaaca gctcagcgac agcgaagagg aaaatgacga aattgacggg 720
gtcaaccctg acctctgtac cgaactcaat accagtctcc aggatatcga aattacctgt 780
gtctactgta aaaccgtcct cgagctgacc gaggtgttcg agttcgcctt caaggacctg 840
tttgtggtgt acagagacag catcccccac gccgcctgcc acaagtgcat cgacttctac 900
agccggatca gagagctgcg gcactactcc gattctgtgt atggcgacac actcgagaag 960
ctcacaaaca caggactgta caatctgctc atctgataa 999
<210> 22
<211> 696
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV18-E2E6E7SH设计序列
<400> 22
Met Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu Arg Leu Ser Ala Leu Gln
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp Ser Lys Asp Ile Asp Ser
20 25 30
Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp Glu Asn Ala Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu Asn His Gln Val Val Pro
50 55 60
Ala Tyr Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His Lys Ala Ile Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ser Ala Tyr Lys Thr Glu Asp Trp
85 90 95
Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp Asn Thr Glu Pro Thr His
100 105 110
Cys Phe Lys Lys Gly Gly Gln Thr Val Gln Val Tyr Phe Asp Gly Asn
115 120 125
Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp Asp Ser Val Tyr Tyr Met
130 135 140
Thr Asp Ala Gly Thr Trp Asp Lys Thr Ala Thr Cys Val Ser His Arg
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Glu Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ile Glu Phe
165 170 175
Lys Ser Glu Cys Glu Lys Tyr Gly Asn Thr Gly Thr Trp Glu Val His
180 185 190
Phe Gly Asn Asn Val Ile Asp Cys Asn Asp Ser Met Cys Ser Thr Ser
195 200 205
Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val Lys Gln Leu Gln His Thr
210 215 220
Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val Gly Thr Ala Lys Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Gln Thr Ser Ala Ala Thr Arg Pro Gly His Cys Gly Leu Ala Glu
245 250 255
Lys Gln His Cys Gly Pro Val Asn Pro Leu Leu Gly Ala Ala Thr Pro
260 265 270
Thr Gly Asn Asn Lys Arg Arg Lys Leu Cys Ser Gly Asn Thr Thr Pro
275 280 285
Ile Ile His Leu Lys Val Asp Arg Asn Ser Leu Met Arg Leu Arg Tyr
290 295 300
Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser Thr Trp
305 310 315 320
His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr
325 330 335
Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile
340 345 350
Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr Met Thr Met Met Ala Arg
355 360 365
Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr
370 375 380
Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys
385 390 395 400
Lys Thr Val Leu Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu
405 410 415
Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala
420 425 430
Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys
435 440 445
Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu
450 455 460
Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro
465 470 475 480
Trp Cys Ala Ser Gln His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu
485 490 495
Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu
500 505 510
Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn
515 520 525
Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys
530 535 540
His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg
545 550 555 560
Glu Thr Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His
565 570 575
Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln
580 585 590
Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn Pro
595 600 605
Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr
610 615 620
Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe
625 630 635 640
Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala
645 650 655
Ala Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg
660 665 670
His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn
675 680 685
Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile
690 695
<210> 23
<211> 2094
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV18-E2E6E7SH设计序列的nt序列
<400> 23
atgcagaccc ccaaagagac actgagcgag cggctgagcg ccctgcagga caagatcatc 60
gaccactacg agaacgacag caaggacatc gacagccaga tccagtactg gcagctgatc 120
agatgggaga acgccatctt cttcgccgcc agagagcacg gcatccagac cctgaaccac 180
caggtggtgc ccgcctacaa catcagcaag agcaaggccc acaaggctat cgagctgcag 240
atggccctgc agggactggc ccagagcgcc tacaagaccg aggactggac cctgcaggat 300
acctgcgagg aactgtggaa caccgagccc acccactgct tcaagaaagg cggccagacc 360
gtgcaggtgt acttcgacgg caacaaggac aactgcatga cctacgtggc ctgggacagc 420
gtgtactaca tgaccgacgc cggcacctgg gacaagaccg ccacctgtgt gtcccaccgg 480
ggcctgtact acgtgaaaga gggctacaac accttctaca tcgagttcaa gagcgagtgc 540
gagaagtacg gcaacaccgg cacatgggag gtgcacttcg gcaacaacgt gatcgactgc 600
aacgacagca tgtgcagcac cagcgacgac accgtgtccg ccacccagct ggtgaaacag 660
ctgcagcaca cccccagccc ctacagcagc accgtgtctg tgggcaccgc caagacctac 720
ggccagacca gcgccgccac cagacctgga cactgtggcc tggccgagaa gcagcactgc 780
ggccctgtga accctctgct gggagccgcc acccccaccg gcaacaacaa gcggagaaag 840
ctgtgcagcg gcaacaccac ccccatcatc cacctgaagg tggaccggaa cagcctgatg 900
cggctgcggt acagactgcg gaagcacagc gaccactacc gggacatcag cagcacctgg 960
cactggaccg gcgctggcaa cgagaaaacc ggcatcctga ccgtgaccta ccacagcgaa 1020
acccagcgga ccaagttcct gaacaccgtg gccatccccg acagcgtgca gatcctggtg 1080
ggatatatga ccatgatggc cagattcgag gaccccacca gacggcccta caagctgccc 1140
gacctgtgca ccgagctgaa cacatctctg caggacatcg agatcacatg cgtgtactgc 1200
aagaccgtgc tggacctgct gtgccacgag cagctgtccg actccgagga agaaaacgac 1260
gagatcgacg gcgtgaacca tcagcatctg cccgccagac gggccgagcc ccagagacac 1320
accatgctgt gcatgtgctg caagtgcgag gcccggattg agctggtggt ggaaagcagc 1380
gccgacgacc tgcgggcctt ccagcagctc tttctgaata ccctgagctt cgtgtgccct 1440
tggtgcgcca gccagcacta cagcgactcc gtgtacggcg ataccctgga aaagctgacc 1500
aataccggcc tgtataacct gctgatccgg tgcctgcggt gccagaagcc cctgaatccc 1560
gccgagaaac tgagacacct gaacgagaag cggcggttcc acaatatcgc cggccactac 1620
agaggccagt gccacagctg ctgcaaccgg gccagacagg aacggctgca gcggaggcgg 1680
gaaaccatgc acggacccaa ggccaccctc caggacattg tcctgcacct ggaaccccag 1740
aacgagatcc ccgtcgatct gctgtgtcat gaacagctca gcgacagcga agaggaaaat 1800
gacgaaattg acggggtcaa ccctgacctc tgtaccgaac tcaataccag tctccaggat 1860
atcgaaatta cctgtgtcta ctgtaaaacc gtcctcgagc tgaccgaggt gttcgagttc 1920
gccttcaagg acctgtttgt ggtgtacaga gacagcatcc cccacgccgc ctgccacaag 1980
tgcatcgact tctacagccg gatcagagag ctgcggcact actccgattc tgtgtatggc 2040
gacacactcg agaagctcac aaacacagga ctgtacaatc tgctcatctg ataa 2094
<210> 24
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16 E2E6E7SH设计多肽的nt序列
<400> 24
atggaaacgc tctgccagag actcaatgtc tgccaggata agattctcac gcattatgag 60
aacgattcca cggacctgcg cgatcacatt gattattgga aacacatgcg ccttgagtgt 120
gctatctatt ataaggctcg cgaaatgggt ttcaaacata tcaatcatca ggtcgtccct 180
accctcgccg tcagcaaaaa caaagctctg caggctattg aactccagct caccctcgag 240
acaatctaca attcccagta ctccaatgag aaatggacgc tccaggatgt gtctctcgag 300
gtctacctga cagctcctac aggatgtatt aagaaacacg ggtacacggt ggaagtccag 360
tttgatggcg atatatgtaa taccatgcat tatacgaatt ggacgcatat ctatatttgt 420
gaagaggcct ctgtgacagt ggtcgaggga caggtcgact attatgggct gtattatgtg 480
cacgaaggga tcagaacata ctttgtccag tttaaggatg atgctgagaa gtattctaag 540
aacaaagttt gggaagtcca tgccggtgga caagtgattc tgtgtcctac ctccgtgttc 600
agctctaatg aggtgtcctc tccagagatc attagacagc atctggccaa ccatcctgct 660
gctacacata ccaaggctgt ggctctggga acagaagaga cacagacaac aatccagagg 720
cctcggagcg agcctgatac aggcaaccct tgtcacacaa caaaactgct gcacagagac 780
tccgtggact ccgctcctat tctgacagcc tttaactcct cccacaaagg gagaatcaat 840
tgcaattcca ataccacgcc gatcgtccac ctcaaagtgg atgctaatac tctcatgcgg 900
ctccgctacc gcttcaagaa acactgtaca ctgtatacag ctgtgtccag cacatggcat 960
tggacgggac acaatgtgaa acataagtcc gccatcgtca cgctcacata cgattccgag 1020
tggcagagag atcagtttct gtcccaagtc aagattccga aaacgatcac cgtcagcacc 1080
ggctttatgt ctattatgca ccagaaacgc acggctatgt ttcaagatcc acaagagcga 1140
cccagaaaac tgcctcagct gtgtacagaa ctgcaaacaa ccatccatga catcattctt 1200
gagtgtgttt attgcaagca acagctcgag gacgaaatcg atggacctgc tggacaggcc 1260
gaacccgata gggctcacta caacatcgtc acgttttgtt gcaagtgtga ctccaccctg 1320
agactgtgtg tgcagtctac ccatgtggat atcagaaccc tcgaggacct gctcatggga 1380
acactcggta ttgtgtgtcc tatctgctcc cagaagcctg gaacaactct cgagcaacag 1440
tacaacaagc cgctctgtga tctcctgatc agatgcatta actgtcagaa gcctctctgc 1500
cctgaagaga agcagagaca cctcgataag aaacagcgct ttcacaatat cagaggccgg 1560
tggaccggca gatgcatgtc ctgctgtcgg agcagcagaa ccagacgcga gacacagatg 1620
catggcgata cacctacact ccatgagtat atgctcgatc tccagcctga aaccaccgat 1680
ctctactgtt atgagcagct caatgacagc agcgaagagg aagatgagat tgacggacca 1740
gctgggcaag ccgagccaga tcgcgcacat tacaatatcg ttaccttttg ttgtcagctc 1800
tgcacagagt tgcaaacgac gattcacgac attatattgg agtgcgtgta ctgtaaacaa 1860
cagctgctgc ggagagaagt ctacgatttc gcctttagag atctctgcat cgtctacaga 1920
gatgggaatc cctatgccgt ctgtgataag tgtctcaagt tttactccaa gatctccgag 1980
tatcgccatt actgttactc cctgtacggg acaaccttgg agcagcagta taacaagcca 2040
ttgtgtgatc tgctcattcg gtgtattaac tgccaaaagt gatga 2085
<210> 25
<211> 2094
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16 E2E6E7SH设计多肽的核苷酸序列
<400> 25
atgcagacgc cgaaagaaac cctgtccgag agactgagcg ctctccaaga taagattatt 60
gatcactatg agaatgactc caaggacatt gattcccaga ttcagtattg gcaacttatt 120
cgctgggaaa atgccatctt ctttgccgct cgggaacacg ggattcagac actgaatcat 180
caagtggtcc cagcctacaa tatctccaag tccaaagccc acaaagctat cgaactccaa 240
atggctctcc agggactggc tcagtccgct tataagacag aagattggac actccaggac 300
acgtgtgaag aactctggaa taccgaaccg acgcactgtt ttaagaaggg tggacagaca 360
gttcaagtct actttgatgg gaacaaagat aattgcatga catatgtcgc ttgggattcc 420
gtctactata tgacagatgc tgggacgtgg gataagacag ccacatgcgt cagccacaga 480
gggctgtact atgtcaaaga agggtataat acgttctata tcgagtttaa gtctgaatgc 540
gagaaatatg ggaatacggg aacctgggaa gtgcattttg ggaacaatgt catcgattgc 600
aatgactcca tgtgctccac ctccgatgac acagtcagcg ccacacagct cgtgaaacag 660
ctccagcata caccatctcc ctactcctcc actgtgtccg tgggaacagc caaaacatat 720
ggacagacct ccgctgccac acggcctggc cattgcggac tggccgagaa acagcattgt 780
ggaccagtca accctctgct gggagctgct actccaacag ggaacaacaa gaggcggaaa 840
ctgtgttccg gcaatacgac acctatcatt cacctcaagg tcgacagaaa ctccctgatg 900
agactgagat accggctgag aaagcactcc gatcactaca gagatatcag ctctacttgg 960
cattggacag gtgctggaaa cgaaaagaca gggatcctga cagtgacgta tcactccgag 1020
actcagcgca ccaaatttct caatactgtg gccattcccg attccgtgca gattcttgtc 1080
ggatatatga cgatgatggc tcgctttgag gatcctacaa gaaggcctta taagctccct 1140
gatctctgca ctgagcttaa caccagcctg caagacattg aaatcacttg tgtctattgc 1200
aaaacggtcc tggacctcct ctgtcacgaa caactgtctg atagtgaaga ggagaatgat 1260
gagatcgatg gtgtcaacca ccagcacctc cctgctcgga gagccgagcc tcagcggcat 1320
acaatgctct gtatgtgttg taaatgcgag gccagaatcg aactcgtggt cgagtcctcc 1380
gccgacgatc tgagagcttt tcagcaactg tttctcaaca ccctgtcctt tgtctgtcct 1440
tggtgtgcct cccagcatta ctccgattct gtgtatggcg acactctcga gaagctcact 1500
aacacgggac tgtataatct gctcatccgc tgtctgagat gccagaaacc tctgaatcct 1560
gccgagaaac tgcgccacct caatgagaag agaagattcc acaacattgc cggacattat 1620
cgaggccagt gtcactcctg ctgtaacaga gctcggcaag agagactgca gagaaggcgc 1680
gagacaatgc acggacctaa agccaccctc caggacattg tgctgcatct cgagcctcag 1740
aatgagattc ctgtcgactt gctctgccat gagcaactgt ccgattctga ggaagaaaat 1800
gacgaaatag atggcgtgaa ccctgacttg tgcactgaac tcaatacttc cctgcaagat 1860
atagagataa cgtgcgttta ctgtaagacg gtcctcgaac tcaccgaagt ctttgagttt 1920
gcctttaagg atctctttgt cgtctaccgc gactccatcc ctcacgctgc ttgtcacaaa 1980
tgtatcgatt tttactctcg catcagagaa ctgcggcact actctgactc agtgtatggc 2040
gatactttgg agaagcttac caatacgggc ctctataact tgctgatctg atga 2094
<210> 26
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PrMVA启动子
<400> 26
taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag 60
agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt 120
agta 124
<210> 27
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PrHyb启动子
<400> 27
gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120
gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227
<210> 28
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV 16 E2片段
<400> 28
Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu
1 5 10 15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
50 55 60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
100 105 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
115 120 125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
130 135 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
145 150 155 160
His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
165 170 175
Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
180 185 190
Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
210 215 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
225 230 235 240
Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
245 250 255
Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn
260 265 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
275 280 285
Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg
290 295 300
Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
305 310 315 320
Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr
325 330 335
Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile
340 345 350
Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile
355 360 365
<210> 29
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV 16 E2片段的nt序列
<400> 29
atggaaaccc tgtgccagcg gctgaacgtg tgccaggaca agatcctgac ccactacgag 60
aacgacagca ccgacctgcg ggaccacatc gactactgga agcacatgcg gctggaatgc 120
gccatctact acaaggccag agagatgggc ttcaagcaca tcaaccacca ggtggtgccc 180
accctggccg tgtccaagaa caaggccctg caggccatcg agctgcagct gaccctggaa 240
accatctaca acagccagta cagcaacgag aagtggaccc tgcaggacgt gtccctggaa 300
gtgtacctga ccgctcccac cggctgcatc aagaaacacg gctacaccgt ggaagtgcag 360
ttcgacggcg acatctgcaa caccatgcac tacaccaact ggacccacat ctacatctgc 420
gaagaggcca gcgtgaccgt ggtggaaggc caggtggact actacggcct gtactacgtg 480
cacgagggca tccggaccta cttcgtgcag ttcaaggacg acgccgagaa gtacagcaag 540
aacaaagtgt gggaggtgca cgctggcggc caggtcatcc tgtgccccac cagcgtgttc 600
agcagcaacg aggtgtccag ccccgagatc atccggcagc acctggccaa tcaccctgcc 660
gccacccaca caaaggccgt ggccctgggc accgaggaaa cccagaccac catccagcgg 720
cccagaagcg agcccgacac cggcaatccc tgccacacca ccaagctgct gcaccgggac 780
agcgtggaca gcgcccctat cctgaccgcc ttcaacagca gccacaaggg ccggatcaac 840
tgcaacagca acaccacccc catcgtgcac ctgaaggtgg acgccaacac cctgatgcgg 900
ctgcggtaca gattcaagaa gcactgcacc ctgtacaccg ccgtgtcctc cacctggcac 960
tggaccggcc acaacgtgaa gcacaagagc gccatcgtga ccctgaccta cgacagcgag 1020
tggcagcggg accagttcct gagccaggtc aaaatcccca agaccatcac cgtgtccacc 1080
ggcttcatga gcatc 1095
<210> 30
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV 16 E2片段的核苷酸序列
<400> 30
atggaaacgc tctgccagag actcaatgtc tgccaggata agattctcac gcattatgag 60
aacgattcca cggacctgcg cgatcacatt gattattgga aacacatgcg ccttgagtgt 120
gctatctatt ataaggctcg cgaaatgggt ttcaaacata tcaatcatca ggtcgtccct 180
accctcgccg tcagcaaaaa caaagctctg caggctattg aactccagct caccctcgag 240
acaatctaca attcccagta ctccaatgag aaatggacgc tccaggatgt gtctctcgag 300
gtctacctga cagctcctac aggatgtatt aagaaacacg ggtacacggt ggaagtccag 360
tttgatggcg atatatgtaa taccatgcat tatacgaatt ggacgcatat ctatatttgt 420
gaagaggcct ctgtgacagt ggtcgaggga caggtcgact attatgggct gtattatgtg 480
cacgaaggga tcagaacata ctttgtccag tttaaggatg atgctgagaa gtattctaag 540
aacaaagttt gggaagtcca tgccggtgga caagtgattc tgtgtcctac ctccgtgttc 600
agctctaatg aggtgtcctc tccagagatc attagacagc atctggccaa ccatcctgct 660
gctacacata ccaaggctgt ggctctggga acagaagaga cacagacaac aatccagagg 720
cctcggagcg agcctgatac aggcaaccct tgtcacacaa caaaactgct gcacagagac 780
tccgtggact ccgctcctat tctgacagcc tttaactcct cccacaaagg gagaatcaat 840
tgcaattcca ataccacgcc gatcgtccac ctcaaagtgg atgctaatac tctcatgcgg 900
ctccgctacc gcttcaagaa acactgtaca ctgtatacag ctgtgtccag cacatggcat 960
tggacgggac acaatgtgaa acataagtcc gccatcgtca cgctcacata cgattccgag 1020
tggcagagag atcagtttct gtcccaagtc aagattccga aaacgatcac cgtcagcacc 1080
ggctttatgt ctatt 1095
<210> 31
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV 18 E2片段
<400> 31
Met Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu Arg Leu Ser Ala Leu Gln
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp Ser Lys Asp Ile Asp Ser
20 25 30
Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp Glu Asn Ala Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu Asn His Gln Val Val Pro
50 55 60
Ala Tyr Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His Lys Ala Ile Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ser Ala Tyr Lys Thr Glu Asp Trp
85 90 95
Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp Asn Thr Glu Pro Thr His
100 105 110
Cys Phe Lys Lys Gly Gly Gln Thr Val Gln Val Tyr Phe Asp Gly Asn
115 120 125
Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp Asp Ser Val Tyr Tyr Met
130 135 140
Thr Asp Ala Gly Thr Trp Asp Lys Thr Ala Thr Cys Val Ser His Arg
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Glu Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ile Glu Phe
165 170 175
Lys Ser Glu Cys Glu Lys Tyr Gly Asn Thr Gly Thr Trp Glu Val His
180 185 190
Phe Gly Asn Asn Val Ile Asp Cys Asn Asp Ser Met Cys Ser Thr Ser
195 200 205
Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val Lys Gln Leu Gln His Thr
210 215 220
Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val Gly Thr Ala Lys Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Gln Thr Ser Ala Ala Thr Arg Pro Gly His Cys Gly Leu Ala Glu
245 250 255
Lys Gln His Cys Gly Pro Val Asn Pro Leu Leu Gly Ala Ala Thr Pro
260 265 270
Thr Gly Asn Asn Lys Arg Arg Lys Leu Cys Ser Gly Asn Thr Thr Pro
275 280 285
Ile Ile His Leu Lys Val Asp Arg Asn Ser Leu Met Arg Leu Arg Tyr
290 295 300
Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser Thr Trp
305 310 315 320
His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr
325 330 335
Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile
340 345 350
Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr Met Thr Met
355 360 365
<210> 32
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV 18 E2片段的核苷酸序列
<400> 32
atgcagaccc ccaaagagac actgagcgag cggctgagcg ccctgcagga caagatcatc 60
gaccactacg agaacgacag caaggacatc gacagccaga tccagtactg gcagctgatc 120
agatgggaga acgccatctt cttcgccgcc agagagcacg gcatccagac cctgaaccac 180
caggtggtgc ccgcctacaa catcagcaag agcaaggccc acaaggctat cgagctgcag 240
atggccctgc agggactggc ccagagcgcc tacaagaccg aggactggac cctgcaggat 300
acctgcgagg aactgtggaa caccgagccc acccactgct tcaagaaagg cggccagacc 360
gtgcaggtgt acttcgacgg caacaaggac aactgcatga cctacgtggc ctgggacagc 420
gtgtactaca tgaccgacgc cggcacctgg gacaagaccg ccacctgtgt gtcccaccgg 480
ggcctgtact acgtgaaaga gggctacaac accttctaca tcgagttcaa gagcgagtgc 540
gagaagtacg gcaacaccgg cacatgggag gtgcacttcg gcaacaacgt gatcgactgc 600
aacgacagca tgtgcagcac cagcgacgac accgtgtccg ccacccagct ggtgaaacag 660
ctgcagcaca cccccagccc ctacagcagc accgtgtctg tgggcaccgc caagacctac 720
ggccagacca gcgccgccac cagacctgga cactgtggcc tggccgagaa gcagcactgc 780
ggccctgtga accctctgct gggagccgcc acccccaccg gcaacaacaa gcggagaaag 840
ctgtgcagcg gcaacaccac ccccatcatc cacctgaagg tggaccggaa cagcctgatg 900
cggctgcggt acagactgcg gaagcacagc gaccactacc gggacatcag cagcacctgg 960
cactggaccg gcgctggcaa cgagaaaacc ggcatcctga ccgtgaccta ccacagcgaa 1020
acccagcgga ccaagttcct gaacaccgtg gccatccccg acagcgtgca gatcctggtg 1080
ggatatatga ccatg 1095
<210> 33
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV 18 E2片段的核苷酸序列
<400> 33
atgcagacgc cgaaagaaac cctgtccgag agactgagcg ctctccaaga taagattatt 60
gatcactatg agaatgactc caaggacatt gattcccaga ttcagtattg gcaacttatt 120
cgctgggaaa atgccatctt ctttgccgct cgggaacacg ggattcagac actgaatcat 180
caagtggtcc cagcctacaa tatctccaag tccaaagccc acaaagctat cgaactccaa 240
atggctctcc agggactggc tcagtccgct tataagacag aagattggac actccaggac 300
acgtgtgaag aactctggaa taccgaaccg acgcactgtt ttaagaaggg tggacagaca 360
gttcaagtct actttgatgg gaacaaagat aattgcatga catatgtcgc ttgggattcc 420
gtctactata tgacagatgc tgggacgtgg gataagacag ccacatgcgt cagccacaga 480
gggctgtact atgtcaaaga agggtataat acgttctata tcgagtttaa gtctgaatgc 540
gagaaatatg ggaatacggg aacctgggaa gtgcattttg ggaacaatgt catcgattgc 600
aatgactcca tgtgctccac ctccgatgac acagtcagcg ccacacagct cgtgaaacag 660
ctccagcata caccatctcc ctactcctcc actgtgtccg tgggaacagc caaaacatat 720
ggacagacct ccgctgccac acggcctggc cattgcggac tggccgagaa acagcattgt 780
ggaccagtca accctctgct gggagctgct actccaacag ggaacaacaa gaggcggaaa 840
ctgtgttccg gcaatacgac acctatcatt cacctcaagg tcgacagaaa ctccctgatg 900
agactgagat accggctgag aaagcactcc gatcactaca gagatatcag ctctacttgg 960
cattggacag gtgctggaaa cgaaaagaca gggatcctga cagtgacgta tcactccgag 1020
actcagcgca ccaaatttct caatactgtg gccattcccg attccgtgca gattcttgtc 1080
ggatatatga cgatg 1095

Claims (19)

1.一种疫苗组合，其包含：
a)第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的一种或多种重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体同时包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，连同药学上可接受的载体；和
b)第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ IDNO:20的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
其中该MVA载体包含MVA-BN或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中该第一疫苗和该第二疫苗各自进一步包含编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第五多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的第六多肽的核酸。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的疫苗组合，其中该第一多肽和该第三多肽各自进一步包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并且其中该第二多肽和该第四多肽各自进一步包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中该第一核酸和该第三核酸各自编码包含SEQID NO:3的氨基酸序列的多肽，并且其中该第二核酸和该第四核酸各自编码包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的多肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的疫苗组合，其中该第一核酸和该第三核酸各自与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且该第二核酸和该第四核酸各自与SEQ ID NO:21的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合，其中该第一核酸和该第三核酸各自与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且该第二核酸和该第四核酸各自与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的疫苗组合，其中该重组腺病毒载体是rAd26。
8.根据权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合，其中该第一疫苗包含第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒，该第一重组腺病毒载体包含该第一核酸，该第二重组腺病毒包含该第二核酸。
9.一种重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，其包含：(a)编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽中的至少一种的第一核酸，和(b)编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽中的至少一种的第二核酸；
其中该MVA载体是MVA-BN或其衍生物。
10.根据权利要求9所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，其中该第一核酸编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，并且该第二核酸编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽。
11.根据权利要求9所述的重组MVA载体，其中该第一核酸编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽，并且该第二核酸编码包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽。
12.根据权利要求10所述的重组MVA载体，其中该第一核酸与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且该第二核酸与SEQ ID NO:21的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
13.根据权利要求11所述的重组MVA载体，其中该第一核酸与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:24的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，并且该第二核酸与SEQ ID NO:23或SEQID NO:25的多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。
14.一种重组MVA载体，其包含至少一种编码至少一种选自下组的多肽的核酸，该组由以下组成：包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:20、和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽，其中该至少一种核酸与包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的多核苷酸序列中的至少一种的启动子可操作地连接。
15.一种疫苗，其包含根据权利要求9-14中任一项所述的重组MVA载体和药学上可接受的载体。
16.一种用于治疗对其有需要的受试者中持续性人类乳头瘤病毒(HPV)感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌的方法，该方法包括向该受试者给予根据权利要求1-15中任一项所述的载体、疫苗、或疫苗组合。
17.一种用于在对其有需要的受试者中诱导针对人类乳头瘤病毒(HPV)的免疫应答的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予第一疫苗，该第一疫苗包含免疫有效量的
(i)重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，和编码包含SEQ ID NO:20的第二多肽的第二核酸，或者
(ii)第一重组腺病毒载体和第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二多肽的第二核酸，
连同药学上可接受的载体；和
(b)向该受试者给予第二疫苗，该第二疫苗包含免疫有效量的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体，该MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第三多肽的第三核酸和编码包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第四多肽的第四核酸，连同药学上可接受的载体；
其中将该第一疫苗作为引发疫苗向该受试者给予，并且将该第二疫苗作为加强疫苗向该受试者给予。
18.根据权利要求17所述的方法，其中该第一多肽和该第三多肽各自进一步包含SEQID NO:28的氨基酸序列，并且其中该第二多肽和该第四多肽各自进一步包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的方法，其中该第一疫苗包含该第一重组腺病毒载体和该第二重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的氨基酸序列的该第一多肽的该第一核酸，该第二重组腺病毒载体包含编码包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的该第二多肽的该第二核酸。
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