JP4051416B2 - 遺伝子治療に使用されるヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えDNA技術の分野に関し、より具体的には遺伝子治療の分野に関する。具体的に述べると、本発明は、アデノウイルス（具体的にはヒト組換えアデノウイルス）由来の材料を用いる遺伝子治療に関する。特に本発明は、新規ウイルス由来ベクターとアデノウイルスにもとづくベクター用の新規パッケージング細胞系に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は最近開発された概念であり、この技術には広い応用範囲を想定することができ、また実際既に広範囲にわたる応用が考えられている。
【０００３】
遺伝子治療では、遺伝情報を持つ分子を宿主の細胞の一部又は全部に導入することにより、その遺伝情報を機能的な形式でその宿主に加える。
【０００４】
加えられる遺伝情報は、タンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子の誘導体（cDNAなど）でありうる。この場合、機能的な形式とは、そのタンパク質がその宿主細胞の機構によって発現しうることを意味する。
【０００５】
遺伝情報は、宿主細胞内に存在するヌクレオチド（DNA又はRNA）の配列に相補的なヌクレオチドの配列であってもよい。この場合の機能的な形式とは、加えられたDNA（核酸）分子又は系内（in situ）で作製されたそのコピーが宿主細胞内に存在するその相補配列と塩基対を形成できることをいう。
【０００６】
その応用には、例えば、遺伝的疾患のために宿主内に存在しないか若しくは不十分な量でしか存在しないタンパク質やその他の物質を補足することによる該遺伝的疾患の処置、腫瘍及び（その他の）後天的疾患（（自己）免疫疾患や感染症など）の処置が含まれる。
【０００７】
先の記述からわかるように、遺伝子治療には基本的に3種類のアプローチがある。その1つは（哺乳類）宿主内に存在する欠損症を補うことに向けられ、第2のアプローチは望ましくない物質（生物又は細胞）を除去又は排除することに向けられ、第3のアプローチは組換えワクチン（腫瘍又は外来微生物）の適用に向けられる。
【０００８】
遺伝子治療には、欠失を持つアデノウイルスが好適な運搬体として提案されている。アデノウイルスは非包膜DNAウイルスである。アデノウイルス由来の遺伝子導入ベクター（いわゆるアデノウイルスベクター）はいくつかの特徴を持ち、それらがこのベクターを上述の目的を持つ遺伝子導入にとってとりわけ有用なものにしている。例えば、アデノウイルスの生物学は詳細に特徴づけられている。アデノウイルスは重篤なヒト病理に関係せず、このウイルスは宿主細胞に極めて効率よくそのDNAを導入する。このウイルスは極めて多様な細胞に感染することができ、広い宿主域を持つ。このウイルスは比較的容易に大量生産できる。このウイルスはそのウイルスゲノムの初期領域1（E1）内の欠失によって複製欠損性にすることができる。
【０００９】
アデノウイルスゲノムは、各鎖の5′末端に共有結合した55kDaの末端タンパク質を持つ約36000塩基対の直線状（linear）の二本鎖DNA分子である。このAd DNAは、約100塩基対からなる同一の逆方向末端反復配列（ITR）を含有し、その正確な長さは血清型に依存する。ウイルス複製起点はまさにゲノム末端にあるそのITR内に位置する。DNA合成は二段階で起こる。まず、鎖置換によって複製が進行し、娘二本鎖分子と置換された親鎖が生成する。置換された鎖は一本鎖であり、いわゆる「パンハンドル」中間体を形成することができ、それが複製の開始と娘二本鎖分子の生成を可能にする。また、複製がゲノムの両端から同時に進行して、パンハンドル構造を形成する必要を回避する場合もある。この複製を図14（Lechner及びKelly,1977から翻案）に要約する。
【００１０】
生産的感染周期では、ウイルス遺伝子が2つの相（すなわち、ウイルスDNA複製までの期間である初期相と、ウイルスDNA複製の開始と同時に起こる後期相）で発現する。初期相では、E1、E2、E3及びE4領域によってコードされる初期遺伝子産物のみが発現し、それらは細胞にウイルス構造タンパク質の合成準備をさせるいくつかの機能を果たす（Berk,1986）。後期相では、初期遺伝子産物に加えて後期ウイルス遺伝子産物が発現し、宿主細胞のDNA及びタンパク質合成が遮断される。その結果、その細胞はウイルスDNAとウイルス構造タンパク質の生産に供されるようになる（Tooze,1981）。
【００１１】
アデノウイルスのE1領域は標的細胞の感染後に発現する最初のアデノウイルス領域である。この領域は2つの転写単位（E1A遺伝子とE1B遺伝子）からなり、これらは共に初代（胚）齧歯類培養の発癌性形質転換には必須である。E1A遺伝子産物の主な機能は、i）休止細胞を細胞周期に入らせ、細胞DNA合成を再開させることと、ii）E1B遺伝子および他の初期領域（E2、E3、E4）を転写的に活性化することである。E1A遺伝子のみによる初代細胞のトランスフェクションは、無制限の増殖（不死化）を誘導しうるが、完全な形質転換には至らない。しかし、E1Aの発現はほとんどの場合、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導をもたらし、不死化は時折しか起こらない（Jochemsenら,1987）。アポトーシスの誘導を防止し、完全な形態学的形質転換を起こすには、E1B遺伝子の同時発現が必要である。樹立不死細胞系では、E1Aの高レベル発現によって、E1Bの不在下でも完全な形質転換が起こりうる（Robertsら,1985）。
【００１２】
E1Bがコードするタンパク質は、細胞機能を切り替えてウイルス複製を可能にする際にE1Aを補助する。E1Bの55kDタンパク質とE4の33kDタンパク質（これらは本質的に核内に局在化する複合体を形成する）は、宿主タンパク質の合成を阻害し、ウイルス遺伝子の発現を促進する機能を果たす。これらの主な作用は、感染の後期相の開始と同時に、ウイルスmRNAの核から細胞質への選択的な輸送を確立することである。E1Bの21kDタンパク質は、生産的感染周期を時間的に正しく制御することによって、ウイルスの生活環が完了する前に宿主が時期尚早に死滅するのを予防する上で重要である。E1Bの21kD遺伝子産物を発現することのできない突然変異ウイルスは、短縮された感染周期を示し、その感染周期には宿主細胞染色体DNAの過剰な分解（deg-表現型）と細胞変性作用の増大（cyt-表現型）を伴う（Tellingら,1994）。このdeg及びcyt表現型はE1A遺伝子が同時に突然変異すると抑制される。このことは、これらの表現型がE1Aの機能であることを示している（Whiteら,1988）。またE1Bの21kDaタンパク質は、E1Aが他のウイルス遺伝子を活性化（switch on）する速度を低下させる。E1Bの21kDがこれらのE1A依存性機能を失わせる機構はまだわかっていない。
【００１３】
少なくともE1領域が削除されていてその領域が目的の遺伝子で置換されているヒトアデノウイルス由来のベクターは、前臨床相及び臨床相の遺伝子治療実験に広く使用されてきた。
【００１４】
上述のように、現在遺伝子治療に使用されているアデノウイルスベクターはすべてE1領域に欠失をもち、その部分に新規遺伝情報を導入することができる。このE1欠失はその組換えウイルスを複製欠損性にする（Stratford-Perricaudet及びPerricaudet,1991）。本発明者らは、組換えアデノウイルスがラットの肝臓とアカゲザルの気道上皮に組換え遺伝子を効率よく導入させうることを立証した（Boutら,1994b；Boutら,1994a）。また、本発明者ら（Vincentら,1996a；Vincentら,1996b）と他の研究者（例えばHaddadaら,1993）は、試験管内（in vitro）では種々の腫瘍細胞に対する、また生体内（in vivo）では動物モデル中の固形腫瘍（肺腫瘍、神経膠腫）及び免疫不全マウス中のヒト異種移植片（肺）に対する、極めて効率のよい生体内アデノウイルス媒介性遺伝子導入を観察している（Blaeseら,1995に概説されている）。
【００１５】
例えばレトロウイルスなどとは対照的に、アデノウイルスは、a）宿主細胞ゲノムに統合せず、b）非分裂細胞に感染することができ、c）生体内で組換え遺伝子を効率よく導入することができる（Brody及びCrystal,1994）。これらの特徴は、アデノウイルスを、例えば腫瘍細胞内への自殺遺伝子やサイトカイン遺伝子の生体内遺伝子導入用の魅力的な候補にしている。
【発明の開示】
【００１６】
しかし、現行の組換えアデノウイルス技術に伴う問題は、組換えアデノウイルスの製造中に望ましくない複製コンピテントアデノウイルス（RCA）が生成する可能性である（Lochmullerら,1994；Imlerら,1996）。これは、組換えベクターと相補細胞系（complementing cell line；例えば293細胞）中に存在するアデノウイルス構築物の重複する配列間で起こる相同組換え（homologous recombination）によって引き起こされる（Grahamら,1977）。臨床試験に使用されるバッチ内のRCAは、i）RCAが制御されない形式で複製すること、ii）RCAが複製欠損性組換えアデノウイルスを補完して、組換えアデノウイルスの制御されない増殖を引き起こしうること、及びiii）RCAを含有するバッチは有意な組識損傷を誘発し、それゆえに強い病的副作用を誘発することから、望ましくない（Lochmullerら,1994）。したがって臨床試験に使用されるバッチは、RCAが含まれないことを証明すべきである（Ostrove,1994）。本発明の一側面として、本発明者らは、新しい基本ベクターと重複する配列を持たず、それゆえに組換えアデノウイルスの安全な大規模生産に適したパッケージング細胞を開発したので、ウイルス生産に関するこの問題は解決される。組換えアデノウイルスベクターの使用に伴うその他の問題点の一つは、アデノウイルスによる処置に対する宿主防御反応である。
【００１７】
簡単に述べると、組換えアデノウイルスはE1領域が削除されている（上記参照）。アデノウイルスE1産物は他の初期遺伝子（E2、E3、E4）の転写を誘発し、その結果として、後期ウイルス遺伝子の発現を活性化する。したがって、E1欠失ベクターは他のアデノウイルス遺伝子のいずれをも発現させないであろうと一般に考えられていた。しかし、最近になって、いくつかの細胞タイプがE1配列の不在下でもアデノウイルス遺伝子を発現させうることが立証された。このことは、いくつかの細胞タイプがアデノウイルス遺伝子の転写を駆動する機構を保持していることを示している。具体的に述べると、これらの細胞がE2Aタンパク質と後期アデノウイルスタンパク質を合成することが明らかにされた。
【００１８】
遺伝子治療の場合、これは、体細胞に対する治療用組換え遺伝子の導入がその治療用タンパク質の発現をもたらすばかりでなく、ウイルスタンパク質の合成をも引き起こしうることを意味する。アデノウイルスタンパク質を発現させる細胞は細胞障害性Tリンパ球によって認識され殺されるので、細胞障害性Tリンパ球が、a）形質導入された細胞を根絶し、b）炎症を引き起こすことになる（Boutら,1994a；Englehardtら,1993；Simonら,1993）。この不都合な反応は遺伝子治療の障害となっているので、例えばa）処置後に免疫抑制剤を使用すること、b）組換えベクター中にアデノウイルスE3領域を維持すること（特許出願EP95202213を参照のこと）、及びc）E2領域中に点突然変異を持つヒトアデノウイルスのts突然変異体を使用すること（特許WO/28938）などといった、この問題の対する解決策がいくつか提案されている。
【００１９】
しかし、免疫反応を回避するためのこれらの戦略には、それぞれ限界がある。
【００２０】
ts突然変異組換えアデノウイルスの使用は、免疫反応をある程度減少させるが、肺における異常反応の予防についてはあまり有効でなかった（Engelhardtら,1994a）。
【００２１】
E2Aタンパク質は単独で免疫反応を誘発することができ、後期アデノウイルスタンパク質合成への切替えに中枢的な役割を果たす。したがって、特許出願WO28938の請求の範囲に述べられているように、E2領域が突然変異した組換えアデノウイルスを作製して、それを温度感受性（ts）にすることは魅力的な手法である。
【００２２】
このシステムの主な欠点は、非許容温度ではE2タンパク質が不安定であるものの、それでもなお、この免疫原性タンパク質が合成されているという事実である。また、この不安定なタンパク質は、後期遺伝子発現を（低い程度にとはいえ）活性化すると予想すべきである。ts125突然変異組換えアデノウイルスが試験され、長期間持続する組換え遺伝子発現が報告された（Yangら,1994b；Engelhardtら,1994a；Engelhardtら,1994b；Yangら,1995）。しかし、コトンラットの肺内の病状は依然として高く（Engelhardtら,1994a）、ts突然変異体の使用が組換えアデノウイルス技術に部分的な改良しかもたらさないことを示した。ts125組換えアデノウイルスを用いた他の研究者ら（Fangら,1996）は、マウスとイヌで、長期間持続する遺伝子発現を観察していない。ts125突然変異アデノウイルスの使用に伴うもう1つの問題は、高頻度の復帰突然変異がみられることである。これらの復帰突然変異体は、真の復帰突然変異体であるか、もしくは第2の部位突然変異の結果である（Kruijerら,1983；Nicolasら,1981）。どちらのタイプの復帰突然変異体も常温で機能するE2Aタンパク質を持ち、それゆえに野生型ウイルスと同様の毒性を持つ。
【００２３】
そこで、本発明のもう1つの側面として、本発明者らはE2Aコード配列を組換えアデノウイルスゲノムから削除し、E1配列を含有する（パッケージング）細胞系にこれらのE2A配列をトランスフェクションすることにより、組換えアデノウイルスベクターを補完することにした。
【００２４】
このアプローチにおける主な障害は、a）E2Aを極めて高レベルに発現させるべきであることと、b）E2Aタンパク質が細胞にとって極めて有毒なことである。
【００２５】
そこで本発明は、そのさらなる側面として、非許容温度ではDNA配列と結合できないタンパク質を生産するts125突然変異E2A遺伝子の使用を開示する。高レベルのこのタンパク質は、許容温度への切替えが行われるまで細胞内に維持することができる（なぜならこのタンパク質は非許容温度で毒性を持たないからである）。これは、突然変異E2A遺伝子を誘導性プロモーター（inducible promoter）（例えばtet、メタロチオネイン、ステロイド誘導性プロモーター、レチノイン酸β-レセプターその他の誘導システムなど）の管理下に置くことと組み合わせることができる。しかし、本発明のさらなる側面として、有毒な野生型E2Aの生産時機を制御するために誘導性プロモーターを使用することを開示する。
【００２６】
E2A欠失組換えアデノウイルスのさらに2つの顕著な利点は、異種配列を保持する能力が増大していることと、突然変異E2Aを発現させる細胞の永続的な選択である。この第2の利点は、ts125突然変異の高頻度の復帰変異に関係する。ts125 E2Aを保持する細胞系内で復帰突然変異が起こると、それはその細胞にとって致命的になるであろう。したがって、ts125突然変異E2Aタンパク質を発現させる細胞が常に選択されることになる。また、本発明者らは本発明の一側面としてE2A欠失組換えアデノウイルスを作製するので、本発明者らのアデノウイルスには復帰突然変異の問題が生じないことになる。
【００２７】
本発明のもう１つの側面では、さらなる改良として、パッケージング細胞系としての非ヒト細胞系の使用を開示する。
【００２８】
組換えウイルスの臨床用バッチのGMP生産には、他の生物工学製品の生産に広く使用されている細胞系を使用することが望ましい。ワクチンなどの生産に使用されている最近の細胞系は、ほとんどがサル由来である。ヒトアデノウイルスはサル由来の細胞内では複製できないか、もしくは低レベルにしか複製できないので、これらの細胞を組換えヒトアデノウイルスの生産に直接使用することはできない。アデノウイルス細胞溶解サイクルの初期相から後期相への切替えの遮断が、不完全複製の根本にある。しかし、ヒトウイルスのサル細胞内での複製を可能にするヒトアデノウイルスゲノム中の宿主域突然変異が記述されている（hr400-404）。これらの突然変異はE2Aタンパク質をコードする遺伝子内にある（Klessig及びGrodzicker,1979；Klessigら,1984；Rice及びKlessig,1985）（Klessigら,1984）。さらに、hrと温度感受性ts125表現型の両方を持つ突然変異ウイルスも記述されている（Broughら,1985；Rice及びKlessig,1985）。
【００２９】
そこで本発明者らは、次に挙げる要素を保持するサル由来のパッケージング細胞系を作製する：
a. E1/E2欠損アデノウイルスの複製を可能にするためのE1配列、及び、
b. E2A過剰発現による細胞死を防止するための、hr突然変異とts125突然変異を含有するE2A配列（ts400と呼ばれる）（Broughら,1985；Rice及びKlessig,1985）、及び/又は、
c. 誘導性プロモーターの制御下にhr突然変異のみを含有するE2A配列、及び/又は、
d. 誘導性プロモーターの制御下にhr突然変異とts125突然変異を含有するE2A配列（ts400）。
【００３０】
さらに本発明者らは、（新規及び改良型）パッケージング細胞系と（新規及び改良型）組換えアデノウイルスベクターの新規及び改良型組み合わせを開示する。本発明者らは、次に挙げるものを提供する：
1. アデノウイルス5型ゲノムのnt.80-5788を保持する二倍体ヒト胚網膜芽細胞（HER）由来の新規パッケージング細胞系。ECACCに番号95062101として寄託されているこの細胞系（911と呼ばれる）は、この細胞系を一般的に使用される293細胞より優れたものにする多くの特徴を持つ（Fallauxら,1996）。
【００３１】
2. E1A遺伝子のみを発現させ、E1B遺伝子を発現させない新規パッケージング細胞系。樹立細胞系（及び293細胞と911細胞の起源である非ヒト二倍体細胞）は、E1Bの不在下にE1Aを発現させるヒト二倍体細胞で起こるようなアポトーシス性細胞死を受けることなく、E1Aを高レベルに発現させることができる。このような細胞系はE1B欠損組換えアデノウイルスをトランス補完（trans-complement）することができる。なぜならE1Bの21kDタンパク質が突然変異したウイルスは、野生型アデノウイルスよりもさらに速くウイルス複製を完了することができるからである（Tellingら,1994）。これらの構築物については下に詳述すると共に、図1〜5に図示する。これらの構築物を種々の樹立細胞系にトランスフェクションし、E1A発現量の高いものを選択する。これは、選択可能なマーカー遺伝子（例えばNEO遺伝子）をE1Bプロモーターに直接機能的に連結することによって行われる。E1BプロモーターはE1A遺伝子産物によって転写的に活性化されるので、選択剤（例えばNEOを選択マーカーとして使用する場合はG418）に対する耐性により、望ましいE1A遺伝子発現の直接的な選択が起こる。
【００３２】
3. E1B 21kDが突然変異又は欠失しており、同55kDタンパク質のみを発現させるパッケージング構築物。
【００３３】
4. マーカー遺伝子による選択の必要がない二倍体細胞（ヒト起源のものに限らない）由来の相補パッケージング細胞の作製に使用されるパッケージング構築物。これらの細胞はE1Aの発現によって不死化される。しかしこの場合、E1Aタンパク質によって誘導されるアポトーシスを防止するにはE1Bの発現が必須である。E1発現細胞の選択は、293細胞（Grahamら,1977）と911細胞（Fallauxら,1996）（これらはそれぞれE1で形質転換されたヒト胚腎（HEK）細胞とヒト胚網膜芽細胞（HER）である）について記述されているように、フォーカス形成（不死化）に関する選択によって達成される。
【００３４】
5. 構築物pIG.E1B（図4）によるHER細胞のトランスフェクション後に、7つの独立した細胞系を樹立することができる。これらの細胞系をPER.C1、PER.C3、PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8及びPER.C9と名づけた。PERとは、PGK-E1-網膜芽細胞を意味する。これらの細胞系はE1Aタンパク質とE1Bタンパク質を発現し、安定であり（例えばPER.C6は57継代以上安定）、E1欠損アデノウイルスベクターを補完する。PER細胞で得られる組換えアデノウイルスの収量は、293細胞で得られる収量よりも少し高い。これらの細胞系の一つ（PER.C6）は、ECACCに番号96022940として寄託されている。
【００３５】
6. 延長されたE1欠失（nt.459-3510欠失）を持つ新規アデノウイルスベクター。これらのウイルスベクターは、上記パッケージング細胞系中のE1配列に相同な配列を持たない。これらのアデノウイルスベクターはpIXプロモーター配列とpIX遺伝子を含有し、pIX（その天然プロモーター配列から）はこのベクターからのみ発現し、パッケージング細胞によっては発現されない（Matsuiら,1986,Hoeben及びFallaux,私信；Imlerら,1996）。
【００３６】
7. 好ましくはE1A発現性樹立細胞系又はE1A-E1B発現性二倍体細胞（2〜4を参照のこと）に基づくE2A発現性パッケージング細胞系。E2A発現は誘導性プロモーターの制御下に置かれるか、もしくはE2A ts125突然変異体が誘導性プロモーター又は構成プロモーターによって駆動される。
【００３７】
8. 上述（6を参照のこと）と同様のベクターであるが、さらにE2A配列の欠失をも持つ組換えアデノウイルスベクター。
【００３８】
9. E1欠損組換えアデノウイルスをトランス補完することができるサル由来のアデノウイルスパッケージング細胞系。これらは、pIG.E1AE1BとpIG.NEOでコトランスフェクションされ、NEO耐性について選択されることが好ましい。E1AとE1Bを発現させるこのような細胞はE1欠損組換えヒトアデノウイルスをトランス補完することができるが、サル由来の細胞内では後期アデノウイルスタンパク質の合成が遮断されるので（Klessig及びGrodzicker,1979）、その効率は良くないであろう。この問題を克服するため、本発明者らは、E2A遺伝子中に宿主域突然変異を持つ組換えアデノウイルスを作製することにより、サル細胞におけるヒトアデノウイルスの複製を可能にする。このようなウイルスは、hr突然変異体のDNAを相同組換えに使用することを除いて、図12に記述するように作製される。
【００３９】
10. 9に記述したものと同様であるが、hr突然変異を持つE2A配列でもコトランスフェクションされる点が異なる、サル由来のアデノウイルスパッケージング細胞。これは、E1とE2Aを欠くヒトアデノウイルス（8を参照のこと）の複製を可能にする。これらの細胞系中のE2Aは誘導性プロモーターの制御下にあるか、もしくはtsE2A突然変異体が使用される。後者の場合、E2A遺伝子はts突然変異とhr突然変異の両方（ts400由来）を保持することになる。両突然変異を保持する複製コンピテントヒトアデノウイルスは既に記述されている（Broughら,1985；Rice及びKlessig,1985）。
【００４０】
本発明のさらなる側面は、別の方法で改良されたアデノウイルスベクターと、上記ベクターの作製及び応用に関する新しい戦略、及び哺乳類細胞における直線状DNA断片の細胞内増幅方法を提供する。
【００４１】
本発明のいわゆる「最小」アデノウイルスベクターは、少なくとも、ウイルス粒子へのゲノムの包膜に必要なウイルスゲノムの一部（包膜シグナル）と、直線状アデノウイルスゲノムの末端由来のDNA配列である逆方向末端反復配列（ITR）の少なくとも機能的な部分又は誘導体の少なくとも1コピーとを保有する。本発明のベクターは、導入遺伝子（transgene）の発現を管理するためのプロモーター配列に連結した導入遺伝子をも含有するであろう。いわゆる最小アデノウイルスベクターのパッケージングは、ヘルパーウイルス又は後述のパッケージング欠損性複製ヘルパーシステムとの同時感染によって達成することができる。
【００４２】
適当な細胞系内で複製することができ、パッケージング欠損性複製ヘルパーシステムとして機能することができるアデノウイルス由来のDNA断片は、以下のように作製される。これらのDNA断片は、アデノウイルスゲノムの「後期」転写単位の被転写領域の少なくとも一部を保持し、E1領域の少なくとも一部と包膜シグナルの少なくとも一部に欠失を持つ。さらにこれらのDNA断片は、逆方向末端反復配列（ITR）のコピーを少なくとも1つは含有する。トランスフェクションされるDNA分子の一端には、ITRが置かれる。もう1つの末端はITRを含有してもよいし、そのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的なDNA配列を含有してもよい。後者の場合、それら2つの相補配列がアニールすると、そのヘアピン構造の3′末端ヌクレオチドの遊離の3′-ヒドロキシル基は、細胞DNAポリメラーゼ及び/又はアデノウイルスがコードするDNAポリメラーゼによるDNA合成のプライマーとして機能することができ、そのDNA分子の少なくとも一部が二本鎖型に変換されることになる。ITRで始まるさらなる複製は、トランスフェクションされた元のDNA分子より大きく、2つのITRが隣接した、直線状二本鎖DNA分子をもたらすであろう（図13を参照のこと）。この分子は、そのDNA分子によってコードされるアデノウイルスタンパク質と宿主細胞ゲノム内の遺伝子によってコードされるアデノウイルスタンパク質及び細胞タンパク質の効力により、トランスフェクションされた細胞内でそれ自身複製することができる。このDNA分子は、その大きなサイズ（39000塩基対以上）ゆえに、もしくは機能的な包膜シグナルが存在しないために、包膜されえない。このDNA分子は、適当な細胞系における欠損アデノウイルスベクターの生産にヘルパーとして役立つ予定である。
【００４３】
本発明は、適当な哺乳類細胞内で様々なサイズの直線状DNA断片を増幅する方法をも包含する。これらのDNA断片は、その断片の一端にITRのコピーを少なくとも1つは含有する。もう1つの末端はITRを含有してもよいし、もしくはそのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的なDNA配列を含有してもよい。後者の場合、その2つの相補配列がアニールすると、そのヘアピン構造の3′末端ヌクレオチドの3′-ヒドロキシル基は、細胞DNAポリメラーゼ及び/又はアデノウイルスがコードするDNAポリメラーゼによるDNA合成のプライマーとして機能することができ、そのDNA分子の少なくとも一部が二本鎖型に変換されることになる。ITRで始まるさらなる複製は、トランスフェクションされた元のDNA分子より大きく、2つのITRが隣接した、直線状二本鎖DNA分子をもたらすであろう。両端にITR配列を含有するDNA分子は、少なくともアデノウイルスE2タンパク質（すなわちDNA結合タンパク質（DBP）、アデノウイルスDNAポリメラーゼ（Ad-pol）及びプレ末端タンパク質（pTP））が存在するため、トランスフェクションされた細胞内でそれ自身複製することができる。必要なタンパク質は、そのDNA分子自体のアデノウイルス遺伝子、宿主細胞ゲノムに組込まれたアデノウイルスE2遺伝子、又は上述の複製ヘルパー断片から発現することができる。
【００４４】
複製に必要なアデノウイルスタンパク質がヘルパーウイルスの感染などによってトランスに供給されるのであれば、複製できるアデノウイルスミニ染色体の生成には、DNA分子の末端にITR配列が存在すれば足りることを、いくつかのグループが示している（Huら,1992；Wang及びPearson,1985；Hayら,1984）。Huら（1992）は、ITRを一つだけ含有するプラスミドのトランスフェクション後に、対称なアデノウイルスミニ染色体二量体の存在と複製を観察した。この著者らは、これらの二量体ミニ染色体が単一ITR DNA分子の尾-尾連結後に生じることを立証することができた。欠損アデノウイルス2型粒子から抽出したDNAには、電子顕微鏡で様々なサイズの二量体分子も観察されている（Daniell,1976）。これは、不完全なゲノムが異なる分子間の非正統的組換えによって生成したことと、異常塩基対形成を起こした配列の位置の変動がその不完全ゲノムの不均一性の原因であることを示唆するものであった。この機構によれば、理論的には、正常ゲノムの2倍までの全長を持つ欠損分子が生成しうると考えられた。そのような分子は、そのゲノムのいずれかの末端から複写（duplicate）された配列を含有するであろう。しかし、完全長ウイルスより長いDNA分子は欠損粒子中にパッケージングされないことがわかった（Daniell,1976）。これは、パッケージングに適用されるサイズ制限によって説明することができる。また、複写された左末端を持つウイルス粒子DNA分子は、右端末端を含有するものより優勢であることがみとめられた（Daniell,1976）。これは、包膜シグナルがそのゲノムの左末端近くに存在することから完全に説明される（Grable及びHearing,1990；Grable及びHearing,1992；Hearingら,1987）。
【００４５】
現行のアデノウイルス由来ベクターに伴う主な問題は、
A）そのウイルス粒子の強い免疫原性、
B）アデノウイルスベクターに内在するアデノウイルス遺伝子の発現（これは形質導入された細胞に対する細胞障害性T細胞反応をもたらす）、および
C）現行のベクターに適応させることができる異種配列の量が少ないこと（最大約8000bpまでの異種DNA）
である。
【００４６】
補足A）アデノウイルス粒子の強い免疫原性は、アデノウイルスベクターを1回投与しただけでも、宿主の免疫学的反応をもたらす。中和抗体が発生するため、当該ウイルスのそれ以降の投与は有効性が低下するか、もしくは完全に無効となる。しかし、導入された遺伝子の長期間にわたる又は永続的な発現により、必要な投与回数が減少し、この問題を回避することができる。
【００４７】
補足B）Wilsonとその共同研究者らが行なった実験は、アデノウイルスによる免疫適格動物（immunocompetent animal）への遺伝子導入後に導入遺伝子の発現が徐々に減少し、感染後約2〜4週間で消滅することを立証している（Yangら,1994a；Yangら,1994b）。これは、形質導入された細胞に対する細胞障害性T細胞（CTL）の発生によって起こる。これらのCTLは、ウイルスベクターによって発現されたアデノウイルスタンパク質に対して向けられた。形質導入された細胞では、アデノウイルスDNA結合タンパク質（E2A遺伝子産物）、ペントン及び繊維タンパク質（後期遺伝子産物）の合成を確認することができた。ウイルスベクターによってコードされるこれらのアデノウイルスタンパク質は、E1領域の欠失にもかかわらず発現した。このことは、E1領域の欠失が、ウイルス遺伝子の発現を完全に防止するには十分でないことを立証している（Engelhardt,1994a）。
【００４８】
補足C）Grahamとその共同研究者らの研究は、アデノウイルスが正常なゲノムサイズの105%までのDNAを包膜しうることを立証している（Bettら,1993）。より大きなゲノムは不安定な傾向があり、ウイルスの増殖中にDNA配列の喪失をもたらす。ウイルスゲノムのE1領域とE3領域の欠失を組み合わせると、包膜され得る外来DNAの最大サイズが約8.3kbに増大する。また、E4領域のいくつかの配列はウイルス増殖にはなくてもよいようである（これにより最大包膜収容力がさらに1.8kb増大する）。E2A遺伝子産物が包膜細胞系内でトランスに供給される場合は、E2A領域もベクターから削除することができ、さらに1.6kbが加わる。ただし、外来DNAの最大収容力は12kbを大きく超えることはできないと思われる。
【００４９】
本発明者らは、38kbまでの外来DNAを適応させることができる組換えアデノウイルスのヘルパー非含有ストックを作製及び生産するための新しい戦略を開発した。このベクターゲノムの一部でなければならない要素は、2つの機能的ITR配列と、包膜シグナルとして機能できる配列だけである。そのようなベクターを最小アデノベクターという。最小アデノベクターに対するヘルパー機能は、宿主細胞ゲノム中に存在する遺伝子又はベクターゲノムに内在する遺伝子以外の必要な遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子をすべて含有する包膜欠損性複製コンピテントDNA分子によってトランスに供給される。
【００５０】
以下、開示した発明の応用を概説し、実験項に例示する。当業者には理解されるであろうが、これらは単なる例示を目的とするものであって、これを本発明の範囲の減縮に利用してはならない。
【００５１】
IGパッケージング構築物二倍体細胞の使用
上記構築物（具体的にはpIG.E1A.E1B）は、ヒト胚網膜芽細胞（HER）、ヒト胚腎細胞（HEK）及びヒト胚肺細胞（HEL）などの二倍体ヒト細胞のトランスフェクションに使用されるであろう。トランスフェクションされた細胞は、形質転換した表現型（フォーカス形成）に関して選択され、E1欠失組換えアデノウイルス（例えばIG.Ad.MLPI.TKなど）の増殖を支持するその能力について試験されるであろう。これらの細胞系は、E1欠失組換えアデノウイルスの作製と（大規模）生産に使用されるであろう。組換えアデノウイルスに感染したこれらの細胞は、例えば固形腫瘍治療用などの組換えアデノウイルスの局所生産細胞として、生体内でも使用される予定である。
【００５２】
911細胞は組換えアデノウイルスベクターの力価測定、作製及び生産に使用される（Fallauxら,1996）。
【００５３】
pIG.E1A.E1BでトランスフェクションされたHER細胞は、7つの独立したクローンをもたらした（これらをPER細胞という）。これらのクローンはE1欠失（非重複アデノウイルスベクターを含む）又はE1欠損組換えベクターの生産に使用され、E2A又はE4などに突然変異を持つアデノウイルスベクターの増殖を可能にするE2B又はE2A構築物（例えばts125E2A；下記参照）、E4などの導入の基礎となる。
【００５４】
また、ヒトアデノウイルスを許容する他の種の二倍体細胞、例えばコトンラット（Sigmodon hispidus）（Paciniら,1984）、シリアハムスター（Morinら,1987）又はチンパンジー（Levreroら,1991）などは、これらの構築物によって不死化されるであろう。組換えアデノウイルスに感染したこれらの細胞は、例えば固形腫瘍治療用などの組換えアデノウイルスの局所生産細胞として、生体内でも使用される予定である。
【００５５】
樹立細胞
上記構築物（具体的にはpIG.E1A.NEO）は、例えばA549（ヒト気管支癌腫）、KB（口頭癌腫）、MRC-5（ヒト二倍体肺細胞）又はGLC細胞系（小細胞肺癌）（de Leijら,1985；Postmusら,1988）などの樹立細胞のトランスフェクションに使用し、NEO耐性について選択することができる。耐性細胞の個々のコロニーを単離し、E1欠失組換えアデノウイルス（IG.Ad.MLPI.TKなど）の増殖を支持するそれらの能力について試験する。E1A含有細胞におけるE1欠失ウイルスの増殖が可能である場合は、それらの細胞をE1欠失組換えアデノウイルスの作製と生産に使用することができる。またこれらはE1A欠失／E1B保有組換えアデノウイルスの増殖にも使用される。
【００５６】
樹立細胞は、pIG.E1A.E1BとpIG.NEO（又はその他のNEO含有発現ベクター）でコトランスフェクションすることもできる。G418に耐性なクローンは、E1欠失組換えアデノウイルス（IG.Ad.MLPI.TKなど）の増殖を支持するそれらの能力について試験され、E1欠失組換えアデノウイルスの作製と生産に使用され、また、二倍体細胞（上記参照）について記述したように、組換えウイルスの局所生産のために生体内で利用されるであろう。
【００５７】
形質転換二倍体細胞系又はNEO耐性樹立系を含む全ての細胞系は、他の遺伝子（例えばE2A及びE4）にも欠失を持つE1欠損組換えアデノウイルスの増殖を支持する「次世代」パッケージング細胞系を作製する際の基礎として使用することができる。さらに、これらは本明細書に開示する最小アデノウイルスベクターを作製するための基礎にもなる。
【００５８】
E2発現細胞系
E2A配列を発現させるパッケージング細胞はE2A欠失組換えアデノウイルスの作製と（大規模）生産に使用されており、また使用されるであろう。
【００５９】
新たに作製されたヒトアデノウイルスパッケージング細胞系、又はヒトアデノウイルス（E2A又はts125E2A；E1A+E2A；E1A+E1B+E2A；E1A+E2A/ts125；E1A+E1B+E2A/ts125）を許容する種に由来する細胞系、又はサル細胞などの非許容細胞系（hrE2A又はhr+ts125E2A；E1A+hrE2A；E1A+E1B+hrE2A；E1A+hrE2A/ts125；E1A+E1B+hrE2A/125）は、E2A欠失組換えアデノウイルスベクターの作製及び（大規模）生産に使用されており、また使用されるであろう。さらにこれらは、二倍体細胞（上記参照）について記述したように、組換えウイルスの局所生産のために生体内でも利用されるであろう。
【００６０】
新規アデノウイルスベクター
nt.459-3510のE1欠失を保持する新たに開発されたアデノウイルスベクターは、遺伝子導入に使用されるであろう。これらのベクターは、例えばE2A、E2B又はE4などが突然変異したさらなる欠失アデノウイルスを開発する際の基礎でもある。これらのベクターは、例えば上述の新たに開発されたパッケージング細胞系（1〜3を参照のこと）で作製されるであろう。
【００６１】
最小アデノウイルスパッケージングシステム
本発明者らは、（最小アデノウイルスベクターのパッケージングに使用される）アデノウイルスパッケージング構築物を開示する。このパッケージング構築物は次に挙げる特徴を持ちうる：
a. 本パッケージング構築物は複製する；
b. 本パッケージング構築物はパッケージングシグナルが削除されているのでパッケージングされ得ない；
c. 本パッケージング構築物は内部ヘアピン形成配列を含有する（「実験項；ヘアピンの示唆」及び図15を参照のこと）；
d. 内部ヘアピン構造ゆえに、本パッケージング構築物は複写（duplicate）される。すなわち、本パッケージング構築物のDNAは、パッケージング細胞にトランスフェクションされる前の2倍の長さになる（本発明者らの試料では、35kbから70kbになる）。この複写もパッケージングを防止する。この複写されたDNA分子がITRを両端に持つことに注意すること（例えば図13参照）；
e. この複写されたパッケージング分子は「正常アデノウイルス」DNA分子と同様に複製できる；
f. ゲノムの複写は、最小アデノウイルスベクターのパッケージングに要求される充分なレベルのアデノウイルスタンパク質の生産にとって必要条件である；
g. 本パッケージング構築物は、相同組換えによるRCAの生成につながりうる最小ベクター又は細胞配列との重複配列を持たない。
【００６２】
このパッケージングシステムは、最小アデノウイルスベクターを生産するために使用されるであろう。例えば予防接種目的の遺伝子治療などに関する最小アデノウイルスベクターの利点は、よく知られている（38kbまでに適応；潜在的に有毒、免疫原性のアデノウイルス遺伝子はすべて除去されている）。
【００６３】
必須遺伝子に突然変異を含有するアデノウイルスベクター（最小アデノウイルスベクターを含む）はこのシステムを用いて増殖させることもできる。
【００６４】
細胞内E2発現ベクターの使用
最小アデノウイルスベクターは、パッケージング欠損性複製ヘルパー分子によってトランスに供給されるヘルパー機能を用いて作製される。アデノウイルス由来のITR配列は、少なくともE2遺伝子産物の存在下にDNA複製起点として機能する。E2遺伝子産物がベクターゲノム中の遺伝子から発現する場合（注：その遺伝子はE1に依存しないプロモーターによって駆動されなければならない）は、ベクターゲノムは標的細胞内で複製できる。これによって、標的細胞内の鋳型分子の数が有意に増大し、その結果、そのベクターによってコードされる目的遺伝子の発現量が増大する。このことは、癌の遺伝子治療では特に重要である。
【００６５】
直線状DNA断片の細胞内増幅の応用
直線状DNA断片の増幅を望む場合にも、同様のアプローチをとることができるであろう。既知又は未知配列のDNA断片は、その末端又は末端付近に少なくとも1つのITR配列があるならば、E2遺伝子産物を含有する細胞内で増幅することができるであろう。断片のサイズに明白な制約はない。アデノウイルスゲノム（36kb）よりはるかに長い断片でも、この手法で増幅されるはずである。したがって、哺乳類細胞中の大きな断片を、その断片を細菌（例えば大腸菌）に移したり、ポリメラーゼ連鎖反応（P.C.R.）を使用することなくクローン化することができる。生産的アデノウイルス感染の最終段階では、一つの細胞が100,000コピーを超えるウイルスゲノムを含有することができる。最適な状況では、直線状DNA断片を同様のレベルにまで増幅することができる。したがって、細胞1000万個あたり5μg以上のDNAを抽出できるはずである（35kbp断片の場合）。このシステムを使用すれば、研究又は治療目的で、シミアンウイルス40に基づくCOS細胞系と等価な異種タンパク質を発現させることができる。またこのシステムは、大きいDNA断片中の遺伝子を同定するためにも使用できる。ランダムなDNA断片を（ITRの付加後に）増幅し、細胞内増幅中に発現させることができる。目的の表現型を持つ細胞を選定又は選択することにより、目的の断片を濃縮し、その遺伝子を単離することができる。
【００６６】
実験項
E1欠損性組換えアデノウイルスベクターをトランス補完することができる細胞系の作製
1. 911細胞系
本発明者らは、アデノウイルス5型のE1配列を保持し、E1欠失組換えアデノウイルスをトランス補完することができる細胞系を作製した（Fallauxら,1996）。
【００６７】
この細胞系は、ヒト二倍体ヒト胚網膜芽細胞（HER）を、Ad5のnt.80-5788を含むpAd5XhoICでトランスフェクションすることによって得られた。得られた形質転換体の一つを911と名づけた。この細胞系は、E1欠損組換えアデノウイルスの増殖に極めて有用であることが示されている。これは293細胞より優れていることがわかった。293細胞とは異なり、911細胞は完全に形質転換した表現型を欠き、それがアデノウイルスパッケージングシステムとして優れた性能を示す理由だと思われる：
プラークアッセイをより迅速に行なうことができる（293の8〜14日に対して4〜5日）；
911細胞の単層はプラークアッセイに必要な寒天上層の下でよりよく生き残る；
E1欠失ベクターの増幅率が高い。
【００６８】
また、せん断したアデノウイルスDNAでトランスフェクションされた293細胞とは異なり、911細胞は明確な構築物を用いてトランスフェクションされた。911細胞のトランスフェクション効率は293のそれと同等である。
【００６９】
新規パッケージング構築物
アデノウイルス配列の供給源
アデノウイルス配列は、ヒトアデノウイルス5型のnt.80-9460を含有するpAd5.SalB（Bernardsら,1983）又は野生型Ad5 DNAから得られる。
【００７０】
pAd5.SalBをSalIとXhoIで消化し、その大断片を再連結し、その新しいクローンをpAd5.X/Sと名づけた。
【００７１】
pTN構築物（R.Vogels博士（IntroGene,オランダ）が構築したもの）をヒトPGKプロモーターとNEO遺伝子の供給源として使用した。
【００７２】
ヒトPGKプロモーター及びNEOR遺伝子
この新規パッケージング構築物中のE1A配列の転写は、pUC119（Vieira及びMessing,1987）を骨格とするプラスミドpTN（R.Vogel氏から贈与）から得たヒトPGKプロモーター（Michelsonら、1983、Singer-Samら、1984）によって駆動される。このプラスミドは、B型肝炎ウイルス（HBV）ポリアデニル化シグナルに融合したNEO遺伝子の供給源としても使用した。
【００７３】
E1遺伝子に対するPGKプロモーターの融合（図1）
Ad5のE1配列（ITR、複製起点及びパッケージングシグナル）を異種配列で置換するために、本発明者らは、プライマーEa1とEa2（表I参照）を用いるPCRによってAd5のE1配列（nt.459からnt.960まで）を増幅した。得られたPCR産物をClaIで消化し、ClaIとEcoRVで予め消化しておいたBluescript（Stratagene）に連結して、構築物pBS.PCRIを得た。
【００７４】
ベクターpTNを制限酵素EcoRI（部分消化）とScaIで消化し、PGKプロモーター配列を含有するDNA断片を、ScaIとEcoRIで消化したPBS.PCRI中に連結した。得られた構築物PBS.PGK.PCRIは、nt.459からnt.916までのAd5 E1配列に機能的に連結したヒトPGKプロモーターを含有する。
【００７５】
pIG.E1A.E1B.Xの構築（図2）
pAT-X/SのScaI-BspE1断片をPBS.PGK.PCRIの対応する断片（E1A配列に連結したPGKプロモーターを含有する）で置換することにより、pIG.E1A.E1B.Xを作製した。
【００７６】
pIG.E1A.E1B.Xは、PGKプロモーターの管理下にあるE1A及びE1Bコード配列を含有する。
【００７７】
この構築物にはnt.459からnt.5788までのAd5配列が存在するので、アデノウイルスのpIXタンパク質もこのプラスミドによってコードされている。
【００７８】
pIG.E1A.NEOの構築（図3）
完全なE1Bプロモーターを導入し、このプロモーターをE1B 21kDのAUGコドンがNEORのAUGコドンとして正確に機能するように融合させるため、本発明者らは、プライマーEa3とEp2を用いて、E1Bプロモーターを増幅した。ここに、プライマーEp2はPCR断片にNcoI部位を導入する。得られたPCR断片（PCRIIと呼ぶ）をHpaIとNcoIで消化し、予めHpaIとNcoIで消化しておいたpAT-X/S中に連結した。得られたプラスミドをpAT-X/S-PCR2と名づけた。NEO遺伝子とB型肝炎ウイルス（HBV）ポリアデニル化シグナルの一部を含有するpTNのNcoI-StuI断片をpAT-X/S-PCR2（NcoIとNruIで消化したもの）中にクローニングした。得られた構築物：pAT-PCR2-NEO。pAT-PCR2-NEOのScaI-SalI断片をpTNの対応する断片で置換する（pAT.PCR2.NEO.p（A）を得る）ことにより、ポリアデニル化シグナルを完成させた。pAT.PCR2.NEO.p（A）のScaI-XbaIを、E1A遺伝子に連結したPGKプロモーターを含有するpIG.E1A.E1B-Xの対応する断片で置換した。
【００７９】
得られた構築物をpIG.E1A.NEOと名づけた。これはヒトPGKプロモーターの制御下にAd5 E1配列（nt.459からnt.1713まで）を含有する。
【００８０】
pIG.EIA.E1Bの構築（図4）
プライマーEb1とEb2（これはXhoI部位を導入する）を用いてE1B 55kdのN-末端アミノ酸をコードする配列を増幅することにより、pIG.E1A.E1Bを作製した。得られたPCR断片をBglIIで消化し、pAT-X/SのBglII/NruI中にクローニングすることにより、pAT-PCR3を得た。
【００８１】
pIg.E1A.NEOのXbaI-SalI断片とpAT.PCR3のXbaI-XhoI断片の交換によって、pIG.E1A.NEOのHBVポリ（A）配列をpAT-PCR3のE1B配列の下流に導入することにより、pIG.E1B.E1Bを構築した。
【００８２】
pIG.E1A.E1Bは、E1Aタンパク質とE1Bタンパク質をコードするAd5のnt.459からnt.3510までを含有する。そのE1B配列はnt.3511にあるスプライス受容部位で終わっている。この構築物にはpIX配列は存在しない。
【００８３】
pIG.NEOの構築（図5）
Ad.5 E1Bプロモーターの制御下にあるNEO遺伝子を含有するpIG.E1A.NEOのHpaI-ScaI断片を、EcoRVとScaIで消化したpBSにクローニングすることにより、pIG.NEOを作製した。
【００８４】
この構築物は、樹立細胞をE1A.E1B構築物でトランスフェクションし、NEO選択が必要な場合に役立つ。NEO発現はE1Bプロモーターによって管理されるので、NEO耐性細胞はE1Aを同時発現させると予想され、これはその細胞の長期培養中にE1Aの高レベル発現を維持するためにも好都合である。
【００８５】
構築物の試験
構築物pIG.E1A.NEO、pIG.E1A.E1B.X及びpIG.E1A.E1Bの完全性を制限酵素マッピングによって評価した。さらに、PCR分析によって得たこれら構築物の一部を配列分析によって確認した。ヌクレオチド配列の変化は見つからなかった。
【００８６】
これらの構築物を初代BRK（仔ラット腎）細胞にトランスフェクションし、これらの細胞を不死化する能力（pIG.E1A.NEO）又はこれらの細胞を完全に形質転換する能力（pAd5.XhoIC、pIG.E1A.E1B.X及びpIG.E1A.E1B）について調べた。
【００８７】
6日齢WAG-Rijラットの腎臓を単離し、ホモジナイズし、トリプシン処理した。BRK細胞培養のサブコンフルエント（subconfluent）培養プレート（直径5cm）を1又は5μgのpIG.NEO、pIG.E1A.NEO、pIG.E1A.E1B、pIG.E1A.E1B.X、pAd5XhoIC、又はpIG.E1A.NEOとSV40初期プロモーターの制御下にあるAd5.E1B遺伝子を保持するPDC26（Vander Elsenら,1983）でトランスフェクションした。トランスフェクションの3週間後、フォーカスが視認できた時に、それらの培養プレートを固定し、ギエムザ染色し、フォーカスを数えた。
【００８８】
生成したアデノウイルスパッケージング構築物の概略と、BRKを形質転換するそれらの能力を図6に示す。これらの結果は、構築物pIG.E1A.E1BとpIG.E1A.E1B.XがBRK細胞を用量依存的に形質転換しうることを示している。形質転換の効率はどちらの構築物についても同等であり、911細胞を作製する際に使用した構築物（すなわちpAd5.XhoIC）で認められたものに匹敵する。
【００８９】
予想通り、pIG.E1A.NEOはほとんどBRKを不死化することができなかった。しかし、E1B発現構築物（PDC26）の同時感染により、形質転換体数の有意な増大が起こった（18対1）。このことは、pIG.E1A.NEOによってコードされるE1Aが機能的であることを示す。
【００９０】
したがって、本発明者らは、新たに作製したパッケージング構築物が新しいアデノウイルスパッケージングシステムの作製に適していると結論する。
【００９１】
新規パッケージング構築物を持つ細胞系の作製
細胞系及び細胞培養
ヒトA549気管支癌腫細胞（Shapiroら,1978）、ヒト胚網膜芽細胞（HER）、Ad5-E1-形質転換ヒト胚腎（HEK）細胞（293；Grahamら,1977）、及びAd5形質転換HER細胞（911；Fallauxら,1996）とPER細胞を、10%ウシ胎児血清（FCS）と抗生物質を補足したダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中、5%CO2雰囲気下37℃で生育した。細胞培養培地、試薬類及び血清はGibco Laboratories（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。培養プラスチック製品はGreiner（ドイツ国ニュルチンゲン）とCorning（ニューヨーク州コーニング）から購入した。
【００９２】
ウイルス及びウイルス技術
アデノウイルスベクターIG.Ad.MLP.nls.lacZ、IG.Ad.MLP.luc、IG.Ad.MLP.TK及びIG.Ad.CMV.TKの構築は、特許出願EP95202213に詳述されている。
【００９３】
組換えアデノウイルスベクターIG.Ad.MLP.nls.lacZは、β-ガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺伝子をAd2主要後期プロモーター（MLP）の制御下に含有する。IG.Ad.MLP.lucは、Ad2 MLPによって駆動されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する。アデノウイルスベクターIG.Ad.MLP.TKとIG.Ad.CMV.TKは、それぞれAd2 MLPとサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー/プロモーターの制御下にある単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子を含有する。
【００９４】
トランスフェクション
トランスフェクションはすべて、GIBCOリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（GIBCO BRL Life Technology Inc.,米国ガイサースブルグ）を用い、その製造者のプロトコルに従って、リン酸カルシウム沈澱DNA（Graham及びVan der Eb,1973）によって行なった。
【００９５】
ウェスタンブロッティング
指数的に増殖している293、911及びAd5-E1形質転換A549及びPER細胞のサブコンフルエント培養物をPBSで洗浄し、Fos-RIPA緩衝液（10mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、1% NP40、01%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1% NA-DOC、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、0.5mMトリプシンインヒビター、50mM NaF及び1mMバナジウム酸ナトリウム）中でこすり落とした。室温で10分後、溶解液を遠心分離によって浄化した。タンパク質濃度をBioradプロテインアッセイキットで測定し、25μgの全細胞タンパク質を12.5% SDS-PAAゲルにのせた。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに転写した（300mAで1時間）。染色済標品（Sigma,米国）を並行して処理した。それらのフィルターをTBST（10mMトリス（pH8）、15mM NaCl及び0.05%トゥイーン-20）中の1%ウシ血清アルブミン（BSA）で1時間ブロックした。第1抗体はマウスモノクローナル抗Ad5-E1B-55-kDA抗体A1C6（Zantemaら,未公表）、ラットモノクローナル抗Ad5-E1B-221-kDa抗体C1G11（Zantemaら,1985）とした。第2抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（Promega）とした。シグナルは、増幅化学発光（enhanced chemoluminescence；Amersham Crop,英国）によって可視化した。
【００９６】
サザンブロット分析
高分子量DNAを単離し、10μgを完全に消化し、0.7%アガロースゲルで分画した。Hybond N+（Amersham,英国）へのサザンブロット転写は、0.4M NAOH,0.6M NaCl転写溶液（Church及びGilbert,1984）を用いて行なった。ハイブリダイゼーションはpAd5.SalB（Bernardsら,1983）の2463-nt SspI-HindIII断片を用いて行なった。この断片はAd5のbp.342-2805からなる。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーとクレノウDNAポリメラーゼを用いて、この断片をα-32P-dCTPで放射線標識した。そのサザンブロットを−80℃でKodak XAR-5フィルムとPhosop-Imagerスクリーンに暴露し、それをB&L systems Molecular Dynamicソフトウェアによって分析した。
【００９７】
A549
Ad5−E1形質転換A549気管支癌腫細胞系は、pIG.E1A.NEOによるトランスフェクションとG418耐性に関する選択によって作製した。31個のG418耐性クローンを樹立した。pIG.E1A.E1BとpIG.NEOのコトランスフェクションにより、7個のG418耐性細胞系を得た。
【００９８】
PER
初代HER細胞をプラスミドpIG.E1A.E1Bでトランスフェクションすることにより、Ad5-E1形質転換ヒト胚網膜（HER）細胞を作製した。十分に分離したフォーカスから形質転換細胞系を樹立した。8つのクローン細胞系を樹立することができた。本発明者らはこれらをPER.C1、PER.C3、PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8及びPER.C9と名づけた。
【００９９】
これらPERクローンのうちの1つ（すなわちPER.C6）はECACCに番号96022940として寄託されている。
【０１００】
形質転換したA549及びPER細胞におけるAd5 E1A及びE1B遺伝子の発現
ウェスタンブロット法とモノクローナル抗体（mAb）を利用して、樹立A549及びPER細胞におけるAd5 E1AとE1Bの55kDa及び21kDaタンパク質の発現を調べた。Mab M73はE1A産物を認識し、Mab AIC6とC1G11はそれぞれ55kDa及び21kDa E1Bタンパク質を指向する。
【０１０１】
これらの抗体は親A549細胞又は初代HER細胞から得た抽出物中のタンパク質を認識しなかった（データの記載なし）。pIG.NEOとpIG.E1A.E1Bのコトランスフェクションによって作製したA549クローンはいずれも、検出できるレベルのE1A又はE1Bタンパク質を発現させなかった（記載なし）。pIG.E1A.NEOを用いるトランスフェクションで作製したA549クローンのいくつかは、Ad5 E1Aタンパク質を発現させたが（図7）、そのレベルは293細胞のタンパク質溶解物中に検出されるものよりはるかに低かった。PER細胞から得たタンパク質抽出物中に検出された定常状態E1Aレベルは、A549由来の細胞から得た抽出物中に検出されるものよりはるかに高かった。PER細胞系はすべて、同様のレベルのE1Aタンパク質を発現させた（図7）。E1Bタンパク質の発現の方が、（E1B 55kDaの場合は特に）変化しやすかった。911及び293と比較すると、大半のPERクローンは高レベルのE1B 55kDa及び21kDaを発現させる。E1B 21kDaの定常状態レベルは、PER.C3で最も高かった。いずれのPERクローンも、その細胞を連続継代培養した時に、Ad5 E1遺伝子の発現を失わなかった（記載なし）。本発明者らは、PER細胞におけるE1発現のレベルが、少なくとも100集団倍加の間、安定なままであることを発見した。本発明者らは、これらのPERクローンをより詳細に特徴づけることにした。
【０１０２】
PERクローンのサザン分析
PERクローンにおけるAd5-E1コード配列の配置を調べるために、本発明者らはサザン分析を行なった。細胞DNAを全てのPERクローンと293及び911細胞から抽出した。そのDNAを、Ad5 E1領域内を1度だけ切断するHindIIIで消化した。放射線標識したAd5-E1特異プローブを用いてHindIII消化DNAに対するサザンハイブリダイゼーションを行なったところ、PERクローンのゲノム内に組込まれたpIG.E1A.E1Bのコピーがいくつか存在することが明らかになった。図8は、種々のPER細胞系の高分子量DNA中のE1配列の分布パターンを示す。これらのコピーは単一のバンドに濃縮されており、このことはそれらが縦列反復として組込まれることを示唆している。PER.C3、C5、C6及びC9の場合は、pIG.E1A.E1Bの先端削除型コピーの存在を示す低分子量ハイブリッド形成バンドも見つかった。Phospho-Imagerを用いてコピー数を決定した。本発明者らは、PER.C1、C3、C4、C5、C6、C8及びC9が、Ad5 E1コード領域のコピーをそれぞれ2、88、5、4、5、5及び3個含有し、911細胞と293細胞がAd5 E1配列をそれぞれ1個と4個含有すると見積もった。
【０１０３】
トランスフェクション効率
組換えアデノベクターはアダプタープラスミドとAd5の大ClaI断片を293細胞にコトランスフェクションすることによって作製される（特許出願EP95202213を参照のこと）。組換えウイルスDNAは、プラスミド中に存在する相同なウイルス配列とアデノウイルスDNAの間の相同組換えによって生成する。この方法と代替法の効率は、ヘルパー細胞のトランスフェクション性に著しく依存する。そこで本発明者らは、大腸菌β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子をリポーターとして、PERクローンのいくつかと911細胞のトランスフェクション効率を比較した（図9）。
【０１０４】
組換えアデノウイルスの生産
293、911、PER.C3、PER.C5及びPER.C6に種々のアデノウイルスベクターを接種した後に得られる組換えアデノウイルスの収量を表IIに記載する。
【０１０５】
これらの結果は、PER細胞で得られる収量が、現存する細胞系で得られる収量と少なくとも同程度に高いことを示している。
【０１０６】
また、新規アデノウイルスベクターIG.Ad.MLPI.TKの収量は、試験した全ての細胞系で、他のウイルスベクターに関して得られる収量と同等か、それ以上である。
【０１０７】
新規アデノウイルスベクターの作製（図10）
使用した組換えアデノウイルスベクター（特許出願EP95202213を参照のこと）は、459からnt.3328までのE1配列が欠失している。
【０１０８】
構築物pE1A.E1Bは459からnt.3510までのAd5配列を含有するので、パッケージング構築物pIG.E1A.E1Bと例えばIG.Ad.MLP.TKなどの組換えアデノウイルスベクターのE1B配列の間には183nt.の配列重複がある。この重複配列を、新規アデノウイルスベクターから削除した。また、元の構築物中に存在するlacZ由来の非コード配列も同様に削除した。これは、プライマーSV40-1（これはBamHI部位を導入する）とSV40-2（これはBglII部位を導入する）を用いて、pMLP.TKのSV40ポリ（A）配列をPCR増幅することによって達成された（図10参照）。また、この構築物中に存在するAd5配列をnt.2496（Ad5,BglII部位を導入する）からnt.2779（Ad5-2）まで増幅した。両PCR断片をBglIIで消化し、ライゲートした。その連結産物を、プライマーSV40-1とAd5-2を用いてPCR増幅した。得られたPCR産物をBamHIとAflIIで切断し、同じ酵素で予め切断しておいたpMLP.TK中に連結した。得られた構築物（pMLPI.TKと命名）は、アデノウイルスE1配列中にnt.459からnt.3510までの欠失を含有する。
【０１０９】
パッケージングシステム
配列重複を一切持たない新規パッケージング構築物pIG.E1A.E1Bと組換えアデノウイルスpMLPI.TKの組み合わせを図11に示す。この図には元の状態も記載してあり、そこには配列重複が示されている。
【０１１０】
pIG.E1A.E1BとpMLPI.TK（図11a）の間には重複する配列が存在しないので、パッケージング構築物と組換えウイルスの間で相同組換えが起こる可能性がなくなり、したがって、元の状態と比較すると組換えアデノウイルスの生産が有意に改善される。
【０１１１】
図11bに、pIG.E1A.NEOとIG.Ad.MLPI.TKに関する状況を示す。樹立細胞にトランスフェクションされた場合、pIG.E1A.NEOはE1欠失組換えアデノウイルスの増殖を支持するに足りると予想される。この組合わせは配列重複を一切持たないので、相同組換えによるRCAの生成が防止される。また、この便利なパッケージングシステムは、E1A配列のみが削除されE1B配列は削除されていない組換えアデノウイルスの増殖を可能にする。E1Bタンパク質（特にE1B 19kDa）は、感染ヒト細胞が腫瘍壊死因子（TNF）によって溶解されるのを防止することができるので（Goodingら,1991）、E1Aの不在下にE1Bを発現させる組換えアデノウイルスは魅力的である。
【０１１２】
pMLPI.TK由来の組換えアデノウイルスの作製
SalI直線化（linealized）pMLPI.TK DNAとClaI直線化Ad5 wt DNAで293細胞をコトランスフェクションすることにより、組換えアデノウイルスを作製した。その操作を図12に図示する。
【０１１３】
最小アデノウイルスベクター用パッケージングシステムを作製するための戦略の概略
使用したプラスミドの名称の取り決め：
p プラスミド
I ITR（アデノウイルス逆方向末端反復配列）
C サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー/プロモーター複合体
L ホタルルシフェラーゼコード配列
hac,haw 制限エンドヌクレアーゼAsp718による消化後に生成しうる潜在的ヘアピンであって、それぞれ正しい配向及び逆の配向にあるもの（図15）。
【０１１４】
例：pICLhawは、アデノウイルスITRとそれに続くCMV駆動性ルシフェラーゼ遺伝子及び逆（非機能的）配向にあるAsp718ヘアピンを含有するプラスミドである。
【０１１５】
1.1 アデノウイルス遺伝子を含有し発現させる細胞内で、ヘアピン構造を形成することにより、二本鎖DNA分子を生成する逆鎖合成のプライマーとして機能できるという合成DNA配列の能力の証明
一般的な技術を用いて、プラスミドpICLhac、pICLhaw、pICLI及びpICLを作製した。これらのプラスミドの概略を図16〜19に示す。
【０１１６】
プラスミドpICLは次に挙げるプラスミドに由来する：
nt.1-457 pMLP10（Levreroら,1991）
nt.458-1218 pCMVβ（Clontech,EMBLバンク番号U02451）
nt.1219-3016 pMLP.luc（IntroGene,未公表）
nt.3017-5620 pBLCAT5（Stein及びWhelan,1989）。
【０１１７】
このプラスミドは以下のように構築した。
【０１１８】
プラスミドpML10のtet遺伝子を、BamHI-SalI断片の削除によって不活化することによりpMLP10ΔSBを得た。プライマー対PCR/MLP1とPCR/MLP3を用い、pMLP10 DNAを鋳型として、合成SalI制限部位が隣接したAd5-ITRを含有する210bp断片を増幅した。そのPCR産物を酵素EcoRIとSgrAIで消化することにより196bp断片を得た。プラスミドpMLP10ΔSBをEcoRIとSgrAIで消化することによりITRを除去した。この断片をEcoRI-SgrAI処理したPCR断片で置換することによりpMLP/SALを得た。プラスミドpCMV-LucをPvuIIで完全に消化し、再環化することにより、SV40由来のポリアデニル化シグナルとAd5左末端以外のAd5配列とを除去した。得られたプラスミドpCMV-lucΔAdのAd5 ITRを、XmnI-SacII断片の交換により、プラスミドpMLP/SAL由来のSal部位隣接ITRで置換した。得られたプラスミドpCMV-lucΔAd/SALのAd5左末端とCMV駆動性ルシフェラーゼ遺伝子をSalI-SamI断片として単離し、それをSalIとHpaIで消化したプラスミドpBLCATSに挿入することにより、プラスミドpICLを得た。プラスミドpICLを図19に示す。またその配列を図20に示す。
【０１１９】
プラスミドpICLは次に挙げる特徴を持つ：
nt.1-457 Ad5左末端（ヒトアデノウイルス5型の配列1〜457）
nt.458-969 ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー及び即時初期プロモーター（Bosthartら,1985）（プラスミドpCMVβ（Clontech,米国パロアルト）由来）
nt.970-1204 SV40 19Sエクソンと先端が欠失した16/19Sイントロン（プラスミドpCMVβ由来）
nt.1218-2987 ホタルルシフェラーゼ遺伝子（pMLP.luc由来）
nt.3018-3131 プラスミドpBLCAT5から得られる後期転写物由来のSV40縦列ポリアデニル化シグナル
nt.3132-5620 pUC12骨格（プラスミドpBLCAT5由来） nt.4337-5191 β-ラクタマーゼ遺伝子（Amp耐性遺伝子、逆配向）
【０１２０】
プラスミドpICLhacとpICLhaw
プラスミドpICLを制限酵素Asp718で消化することにより、pICLからプラスミドpIChacとpICLhawを得た。直線化したプラスミドをウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理することにより51リン酸基を除去した。一部相補的な合成一本鎖オリゴヌクレオチドHp/asp1とHp/Asp2をアニールし、その5′末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。
【０１２１】
リン酸化した二本鎖オリゴマーを脱リン酸化pICL断片と混合し、連結した。プラスミド中に挿入された合成オリゴヌクレオチドを1コピーだけ含有するクローンを単離し、制限酵素消化を用いて特徴づけた。Asp718部位にオリゴヌクレオチドを挿入すると、一方の接合部にAsp718認識部位が再生し、他方の接合部では認識部位が破壊されることになる。選択したクローンで、挿入されたオリゴヌクレオチドの配向と完全性を、配列分析によって確かめた。正しい配向（Asp718部位が3205 EcoRI部位に近い）のオリゴヌクレオチドを含有するクローンをpICLhacと命名した。逆配向（Asp718部位がSV40由来のポリシグナルに近い）のオリゴヌクレオチドを持つクローンをpICLhawと命名した。プラスミドpICLhacとpICLhawを図16及び17に示す。
【０１２２】
Ad5-ITRを含有するプラスミドpICLのSalI-SgrAI断片をpICLのAsp718部位に挿入することによって、pICLからプラスミドpICLIを作製した。194bpのSalI-SgrAI断片をpICLから単離し、その付着末端を大腸菌DNAポリメラーゼI（クレノウ断片）とdNTPを用いて平滑末端に変換した。Asp718付着末端は、ヤエナリ（mungbean）ヌクレアーゼによる処理で平滑末端に変換した。連結によって、プラスミドpICLのAsp718部位にITRを含有するクローンを得た。正しい向きにITR断片を含有するクローンをpICLIと名づけた（図18）。
【０１２３】
アデノウイルスAdCMV-hcTKの作製。特許出願95202213に記載の方法に従って、組換えアデノウイルスを構築した。組換えアデノウイルスを作製するには2つの成分が必要である。まず、ITRとパッケージングシグナルを含むアデノウイルスゲノムの左末端、目的遺伝子を含む発現カセット、及び相同組換えに利用できるアデノウイルスゲノムの一部を含有するアダプタープラスミド。また、アデノウイルスDNAも上述のアダプタープラスミドとの組換えに必要である。Ad-CMV-hcTKの場合、プラスミドPCMV.TKを基礎として用いた。このプラスミドはアデノウイルス5型ゲノムのnt.1-455、pCMVβ（Clontech、CMVエンハンサー・プロモーターとシミアンウイルス40の16S/19Sイントロンを含むPstI-StuI断片）から得たnt.456-1204、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（特許出願95202213に記載）、SV40由来のポリアデニル化部位（SV40配列のnt.2533-2668）と、それに続くAd5のBglII-SacI断片（Ad5配列のnt.3328-6092）を含有する。これらの断片はpMLP10由来（Levreroら,1991）の骨格中に存在する。プラスミドpAD-CMVhc-TKを作製するために、プラスミドpCMV.TKをClaI（唯一のClaI部位はTK読み取り枠のすぐ上流にある）で消化し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化した。ヘアピン構造を作製するために、合成オリゴヌクレオチドHP/cla2とHP/cla2をアニールし、その5′-OH基をT4ポリヌクレオチドキナーゼとATPでリン酸化した。その二本鎖オリゴヌクレオチドを直線化したベクター断片と連結し、大腸菌株「Sure」の形質転換に使用した。このオリゴヌクレオチドをClaI部位に挿入すると、ClaI認識部位が破壊されることになる。このオリゴヌクレオチドはその一末端付近に新しいClaI部位を含有する。選択したクローンで、挿入されたオリゴヌクレオチドの配向と完全性を配列分析によって確かめた。オリゴヌクレオチドを正しい向き（ClaI部位がITR側にある）に含有するクローンをpAd-CMV-hcTKと名づけた。このプラスミドを、911細胞に、ClaI消化した野生型アデノウイルス5型DNAとコトランスフェクションした。E1配列がCMV-hcTK発現カセットに置き換わった組換えアデノウイルスを単離し、一般的な手法を用いて増殖した。
【０１２４】
ITRで複製が始まった後に、置換鎖上での逆鎖合成のプライマーとしてヘアピンが使用され得るかどうかを調べるために、プラスミドpICLhacを911細胞（アデノウイルスE1領域で形質転換されたヒト胚網膜芽細胞）に導入した。オリゴヌクレオチド対HP/asp1及び2を逆向きに含有する点以外はプラスミドpICLhacと完全に同一であるプラスミドpICLhawを対照とする。これらの研究には、プラスミドpICLIとpICLも含める。プラスミドpICLIでは、ヘアピンがアデノウイルスITRに置き換わっている。プラスミドpICLはヘアピンもITR配列も含有しない。これらのプラスミドは末端ヘアピン構造による複製効率を決定するための対照として役立つ。DNA複製に必要なE1タンパク質以外のウイルス産物（これらは911細胞によって生産される）を提供するため、トランスフェクション後に、培養物をウイルスIG.Ad.MLPI.TKに感染させる。トランスフェクションされたDNA分子の適正な複製を立証するために、いくつかのパラメーターを調べる。まず、上述のプラスミドでトランスフェクションし、かつ、IG.Ad.MLPI.TKウイルスに感染した細胞培養から抽出したDNAを、サザンブロット法によって、予想される複製中間体の存在及び複写したゲノムの存在について分析する。さらに、トランスフェクションされIG.Ad.MLPI.TKに感染した細胞集団から、ルシフェラーゼ陰性細胞にルシフェラーゼマーカー遺伝子を導入しそれを発現させることのできるウイルスを単離する。
【０１２５】
プラスミドpICLhac、pICLhaw、pICLI及びpICLのプラスミドDNAを制限エンドヌクレアーゼSalIで消化し、ヤエナリヌクレアーゼで処理することにより、得られたDNA断片の4ヌクレオチド一本鎖伸長部を除去した。この方法で、DNA断片に天然アデノウイルス5′LTR末端が生成する。次に、pICLhacプラスミドとpICLhawプラスミドの両方を制限エンドヌクエラーゼAsp718で消化することにより、ヘアピン構造を形成することができる末端を生成させた。各プラスミドにつき4つの培養プレートで、その消化したプラスミドを一般的なリン酸カルシウム共沈法で911細胞に導入する。トランスフェクション中に、1細胞あたり5個の感染性IG.Ad.MLPI.TK粒子を用いて、各プラスミドにつき2つの培養物をIG.Ad.MLPI.TKウイルスに感染させる。トランスフェクションの20時間後とトランスフェクションの40（fort）時間後に、Ad.tkウイルス感染培養1つと非感染培養1つを用いて、Hirtらが考案した手法で小分子量DNAを単離する。単離したDNAの一部をサザン分析に使用する。試料を制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化した後、ルシフェラーゼ遺伝子をプローブとして使用すると、約2.6kbのハイブリッド形成断片が、プラスミドpICLhacでトランスフェクションされたアデノウイルス感染細胞から得た試料中にのみ検出される。この断片のサイズは、ルシフェラーゼマーカー遺伝子の予想される複写と合致する。このことは、挿入されたヘアピンが逆鎖合成のプライマーとして機能しうるという結論を裏付ける。IG.Ad.MLPI.TKウイルスを省略した場合、又はヘアピンオリゴヌクレオチドが逆向きに挿入されている場合は、ハイブリッド形成断片が存在しない。
【０１２６】
制限エンドヌクレアーゼDpnIはテトラヌクレオチド配列5′-GATC-3′を認識するが、メチル化されたDNAのみを切断する（すなわち、大腸菌内で増殖した大腸菌由来の（プラスミド）DNAのみが切断され、哺乳類細胞中で複製したDNAは切断されない）。制限エンドヌクレアーゼMboIは同じ配列を認識するが、非メチル化DNA（すなわち、哺乳類細胞中で増殖したDNA）のみを切断する。トランスフェクションされた細胞から単離したDNA試料をMboI及びDpnIと共にインキュベートし、サザンブロットで分析した。これらの結果は、pICLhacプラスミドとpICLIプラスミドでトランスフェクションされた細胞にのみ大きいDpnI耐性断片が存在し、MboIで処理した試料には存在しないことを立証する。これらのデータは、プラスミドpICLIとpICLhacのトランスフェクション後にのみ、断片の複製と複写が起こることを証明している。
【０１２７】
これらのデータは、アデノウイルス由来の逆方向末端反復配列（ITR）を一端に持ち、かつ、他端に一本鎖型で存在する時に同じ鎖上の配列にアニールしてヘアピン構造を生成することができるヌクレオチド配列を持つ直線状DNA断片が、アデノウイルス感染細胞中で、逆方向末端配列を両端に持つ構造に変換されることを立証している。得られたDNA分子は野生型アデノウイルスゲノムと同じ機構で複製されるであろう。
【０１２８】
1.2 ウイルス粒子に包膜されうるDNA分子の生成には、ルシフェラーゼマーカー遺伝子、1コピーのITR、包膜シグナル、及びヘアピン構造を形成することのできる合成DNA配列を含有するDNA分子で充分であることの証明
2コピーのCMV-lucマーカー遺伝子を含有する上記DNA分子がウイルス粒子に包膜されうることを立証するために、残り2つの培養物から3サイクルの凍結−融解破砕操作によってウイルスを収集し、それらをネズミ線維芽細胞の感染に使用する。感染の48時間に、感染細胞をルシフェラーゼ活性について検定する。ルシフェラーゼ活性がウイルス粒子によってではなく遊離DNAの導入によって誘導された可能性を排除するために、ウイルスストックをDNaseIで処理することにより、DNA汚染物質を除去する。さらに、もう1つの対照として、ウイルスストックの一部を56℃で60分間インキュベートする。この熱処理は混入しているDNAには影響を与えないであろうが、ウイルスを不活化するであろう。有意なルシフェラーゼ活性は、pICLhcとpICLIプラスミドでトランスフェクションしたIG.Ad.MLPI.TK感染細胞から得たウイルスストックに感染した後の細胞にのみ認められる。非感染細胞と、pICLhw及びpICLでトランスフェクションした感染細胞には、有意なルシフェラーゼ活性を認めることができない。熱不活化はルシフェラーゼ発現を完全に排除するが、DNaseI処理はルシフェラーゼ発現を排除せず、このことは、遊離（汚染）DNA断片ではなくアデノウイルス粒子がルシフェラーゼリポーター遺伝子の導入の原因であることを示している。
【０１２９】
これらの結果は、これらの小ウイルスゲノムがアデノウイルス粒子に包膜されうることを立証しており、直線状DNA断片のアデノウイルス粒子への包膜には、ITRと包膜シグナルがあれば足りることを示唆している。これらのアデノウイルス粒子は効率のよい遺伝子導入に利用できる。アデノウイルス遺伝子の少なくとも一部（すなわちE1、E2、E4、及びL、及びVA）を含有しそれらを発現させる細胞に導入すると、少なくとも1つのLTR、包膜シグナルの少なくとも一部、及びヘアピン構造を形成することができる合成DNA配列からなる組換えDNA分子は、ウイルス粒子に包膜されうる組換えゲノムを自律的に生成する固有の能力を持つ。そのようなゲノムとベクター系は遺伝子導入に利用することができる。
【０１３０】
1.3 アデノウイルス5型ゲノムのヌクレオチド3510-35953（すなわち9.7-100マップ単位）（したがってE1タンパク質コード領域、右側ITR及び包膜配列を欠く）と、一本鎖型として存在する時にそのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的であるため、ヘアピン構造を形成することができる末端DNA配列とを含有するDNA分子が911細胞内で複製できることの証明
上記ICLhacベクターゲノム及び類似の最小アデノベクターがヘルパー細胞によってアデノウイルス粒子に包膜されることを可能にするのに必要なアデノウイルス産物を提供することができる複製性DNA分子を開発するために、Ad-CMV-hcTKアデノウイルスベクターを開発した。CMVエンハンサー/プロモーター領域とチミジンキナーゼ遺伝子の間に、アニールしたオリゴヌクレオチド対HP/cla1及び2を挿入する。ベクターAd-CMV-hcTKは、一般的な手法を用いて、911細胞内で増殖させ生産することができる。このベクターはもっぱらトランスフェクションに使用するDNAの供給源として生育され、増殖される。アデノウイルスAd-CMV-hcTKのDNAを、CsCl密度勾配遠心分離を用いて精製したウイルス粒子から一般的な方法で単離する。そのウイルスDNAを制限エンドヌクレアーゼClaIで消化した。消化したDNAを0.7%アガロースゲルでサイズ分画し、その大断片を単離し、さらなる実験に使用する。911細胞の培養物を、標準的なリン酸カルシウム共沈法を用いて、Ad-CMV-hcTK DNAの大ClaI断片でトランスフェクションする。プラスミドpICLhacを用いる先の実験とほとんど同様に、AD-CMV-hcは右側ITRから複製を開始するであろう。1-鎖が置換されると、その断片の左側末端にヘアピン構造が生成しうる。これはDNAポリメラーゼによる鎖の右方向への伸長を促進する。この過程は置換鎖が完全にその二本鎖型に変換されるまで進行するであろう。最後に、右側LTRが再生され、その位置で、正常なアデノウイルス複製の開始と伸長が起こるであろう。ポリメラーゼがヘアピンをリードスルーするため、分子が複写されることに注目のこと。アデノウイルスITR配列を一端に持ち、反対側にヘアピン構造を形成することができるDNA配列を持つ33250bpの投入DNA分子が、両側にITR配列を含有するように複写された。得られるDNA分子は、約66500bpのパリンドローム構造からなるであろう。
【０１３１】
この構造は、トランスフェクションされた細胞から抽出した低分子量DNA中に、サザン分析によって検出することができる。DNA断片のパリンドローム性は、適当な制限エンドヌクレアーゼによるその低分子量DNAの消化と、HSV-TK遺伝子をプローブとするサザンブロット法によって証明することができる。この分子は、トランスフェクションされた細胞中で、その細胞内に存在するアデノウイルス遺伝子産物の効力により、それ自身複製することができる。アデノウイルス遺伝子は、一部、標的細胞ゲノムに組込まれた鋳型から発現され（すなわちE1遺伝子産物）、その他の遺伝子は複製性DNA断片自体に内在する。しかし、この直線状DNA断片はウイルス粒子中に包膜され得ないことに注意すること。それは包膜に必要なDNA配列をすべて欠くばかりでなく、そのサイズも包膜されるには大きすぎるのである。
【０１３２】
1.4 アデノウイルス5型ゲノムのヌクレオチド3503-35953（すなわち9.7-100マップ単位）（したがってE1タンパク質コード領域、右側ITR及び包膜配列を欠く）と、そのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的であるためヘアピン構造を形成することができる末端DNA配列とを含有するDNA分子が、911細胞中を複製することができ、かつ、pICLI及びpICLhac由来のDNA断片の包膜に必要なヘルパー機能を提供できることの証明
次の一連の実験は、1.1及び1.2節に記述した最小アデノベクターの包膜に、1.3節に記述したDNA分子を使用できることを立証しようとするものである。
【０１３３】
これらの実験では、Ad-CMV-hcTK DNAのエンドヌクレアーゼClaI消化後に単離した大断片を、エンドヌクレアーゼSalI、ヤエナリヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼAsp718で処理したプラスミドpICLhac又は対照として同様に処理したプラスミドpICLhawと共に、911細胞に導入する（1.3節に記載の実験と同様）。48時間後、トランスフェクションされた細胞集団の凍結−融解破砕によってウイルスを単離する。そのウイルス調製物をDNaseIで処理することにより、混入している遊離のDNAを除去する。次に、そのウイルスを用いてRat2線維芽細胞を感染させる。感染の48時間後に、細胞をルシフェラーゼ活性について検定する。pICLhacプラスミドでトランスフェクションされた細胞から単離したウイルスに感染した細胞でのみ、有意なルシフェラーゼ活性が認められ、pICLhawプラスミドでトランスフェクションされた細胞から単離したウイルスに感染した細胞には、有意なルシフェラーゼ活性が認められなかった。感染前にウイルスを熱不活化するとルシフェラーゼ活性が完全になくなり、ルシフェラーゼ遺伝子がウイルス粒子によって導入されることが示される。ウイルスストックによる911細胞の感染は、何の細胞病理学的効果ももたらさなかった。このことは、pICLhacが911細胞で増殖しうる感染性ヘルパーウイルスを伴わずに生産されることを立証している。これらの結果は、ここに提案する方法を使用することにより、アデノウイルス形質転換ヒト細胞又は非アデノウイルス形質転換ヒト細胞で自律的に複製しうる感染性ヘルパーウイルスを完全に欠く最小アデノウイルスベクターのストックを生産できることを証明している。
【０１３４】
本願に記述するシステムの他に、もう1つの最小アデノウイルスベクター作製法がWO94/12649に開示されている。WO94/12649に記載の方法では、最小アデノウイルスベクター（WO94/12649の用語では偽アデノウイルスベクター（Pseudo Adenoviral Vectors；PAV））のパッケージングに、タンパク質IXの機能を利用する。PAVは、左側アデノウイルスITR（包膜に必要な配列を含む）と右側アデノウイルスITRの間に目的の遺伝子を持つ発現プラスミドをクローニングすることにより生産される。PAVは、ヘルパーウイルスの存在下に増殖される。ヘルパーウイルスは（パッケージングシグナル中の突然変異により、又はそのサイズ（37.5kb以上のウイルスゲノムは効率よくパッケージングされない）ゆえに）部分的にパッケージング欠損性であるから、PAVの包膜は、ヘルパーウイルスより優先される。またこの著者らは、タンパク質IX遺伝子の不在下では、PAVが選択的にパッケージングされるであろうと述べている。しかし、これらの機構はいずれも、PAV/最小ベクターのみのパッケージングが可能なほど制限的ではないようである。提案されているパッケージングシグナル中の突然変異はパッケージングを減少させるが、完全に遮断するわけではない。そのパッケージング活性はヘルパーウイルスの増殖に必要とされるからである。ヘルパーウイルスのサイズの増大とタンパク質IX遺伝子の突然変異はいずれも、確実にPAVだけをパッケージングさせることにはならないであろう。したがって、WO94/12649に記載の方法は、最小アデノウイルスベクター/PAVのヘルパー非含有ストックの生産には有効ではないと思われる。
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
合成ヘアピンの作成に使用した合成オリゴヌクレオチド対；これをAsp718部位に挿入するとその一端にAsp718部位が再生される：
合成ヘアピンの作成に使用した合成オリゴヌクレオチド対；これはヘアピン形成に使用されるClaI認識部位を含有する：
【０１３８】
【０００１】
本発明は組換えDNA技術の分野に関し、より具体的には遺伝子治療の分野に関する。具体的に述べると、本発明は、アデノウイルス（具体的にはヒト組換えアデノウイルス）由来の材料を用いる遺伝子治療に関する。特に本発明は、新規ウイルス由来ベクターとアデノウイルスにもとづくベクター用の新規パッケージング細胞系に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は最近開発された概念であり、この技術には広い応用範囲を想定することができ、また実際既に広範囲にわたる応用が考えられている。
【０００３】
遺伝子治療では、遺伝情報を持つ分子を宿主の細胞の一部又は全部に導入することにより、その遺伝情報を機能的な形式でその宿主に加える。
【０００４】
加えられる遺伝情報は、タンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子の誘導体（cDNAなど）でありうる。この場合、機能的な形式とは、そのタンパク質がその宿主細胞の機構によって発現しうることを意味する。
【０００５】
遺伝情報は、宿主細胞内に存在するヌクレオチド（DNA又はRNA）の配列に相補的なヌクレオチドの配列であってもよい。この場合の機能的な形式とは、加えられたDNA（核酸）分子又は系内（in situ）で作製されたそのコピーが宿主細胞内に存在するその相補配列と塩基対を形成できることをいう。
【０００６】
その応用には、例えば、遺伝的疾患のために宿主内に存在しないか若しくは不十分な量でしか存在しないタンパク質やその他の物質を補足することによる該遺伝的疾患の処置、腫瘍及び（その他の）後天的疾患（（自己）免疫疾患や感染症など）の処置が含まれる。
【０００７】
先の記述からわかるように、遺伝子治療には基本的に3種類のアプローチがある。その1つは（哺乳類）宿主内に存在する欠損症を補うことに向けられ、第2のアプローチは望ましくない物質（生物又は細胞）を除去又は排除することに向けられ、第3のアプローチは組換えワクチン（腫瘍又は外来微生物）の適用に向けられる。
【０００８】
遺伝子治療には、欠失を持つアデノウイルスが好適な運搬体として提案されている。アデノウイルスは非包膜DNAウイルスである。アデノウイルス由来の遺伝子導入ベクター（いわゆるアデノウイルスベクター）はいくつかの特徴を持ち、それらがこのベクターを上述の目的を持つ遺伝子導入にとってとりわけ有用なものにしている。例えば、アデノウイルスの生物学は詳細に特徴づけられている。アデノウイルスは重篤なヒト病理に関係せず、このウイルスは宿主細胞に極めて効率よくそのDNAを導入する。このウイルスは極めて多様な細胞に感染することができ、広い宿主域を持つ。このウイルスは比較的容易に大量生産できる。このウイルスはそのウイルスゲノムの初期領域1（E1）内の欠失によって複製欠損性にすることができる。
【０００９】
アデノウイルスゲノムは、各鎖の5′末端に共有結合した55kDaの末端タンパク質を持つ約36000塩基対の直線状（linear）の二本鎖DNA分子である。このAd DNAは、約100塩基対からなる同一の逆方向末端反復配列（ITR）を含有し、その正確な長さは血清型に依存する。ウイルス複製起点はまさにゲノム末端にあるそのITR内に位置する。DNA合成は二段階で起こる。まず、鎖置換によって複製が進行し、娘二本鎖分子と置換された親鎖が生成する。置換された鎖は一本鎖であり、いわゆる「パンハンドル」中間体を形成することができ、それが複製の開始と娘二本鎖分子の生成を可能にする。また、複製がゲノムの両端から同時に進行して、パンハンドル構造を形成する必要を回避する場合もある。この複製を図14（Lechner及びKelly,1977から翻案）に要約する。
【００１０】
生産的感染周期では、ウイルス遺伝子が2つの相（すなわち、ウイルスDNA複製までの期間である初期相と、ウイルスDNA複製の開始と同時に起こる後期相）で発現する。初期相では、E1、E2、E3及びE4領域によってコードされる初期遺伝子産物のみが発現し、それらは細胞にウイルス構造タンパク質の合成準備をさせるいくつかの機能を果たす（Berk,1986）。後期相では、初期遺伝子産物に加えて後期ウイルス遺伝子産物が発現し、宿主細胞のDNA及びタンパク質合成が遮断される。その結果、その細胞はウイルスDNAとウイルス構造タンパク質の生産に供されるようになる（Tooze,1981）。
【００１１】
アデノウイルスのE1領域は標的細胞の感染後に発現する最初のアデノウイルス領域である。この領域は2つの転写単位（E1A遺伝子とE1B遺伝子）からなり、これらは共に初代（胚）齧歯類培養の発癌性形質転換には必須である。E1A遺伝子産物の主な機能は、i）休止細胞を細胞周期に入らせ、細胞DNA合成を再開させることと、ii）E1B遺伝子および他の初期領域（E2、E3、E4）を転写的に活性化することである。E1A遺伝子のみによる初代細胞のトランスフェクションは、無制限の増殖（不死化）を誘導しうるが、完全な形質転換には至らない。しかし、E1Aの発現はほとんどの場合、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導をもたらし、不死化は時折しか起こらない（Jochemsenら,1987）。アポトーシスの誘導を防止し、完全な形態学的形質転換を起こすには、E1B遺伝子の同時発現が必要である。樹立不死細胞系では、E1Aの高レベル発現によって、E1Bの不在下でも完全な形質転換が起こりうる（Robertsら,1985）。
【００１２】
E1Bがコードするタンパク質は、細胞機能を切り替えてウイルス複製を可能にする際にE1Aを補助する。E1Bの55kDタンパク質とE4の33kDタンパク質（これらは本質的に核内に局在化する複合体を形成する）は、宿主タンパク質の合成を阻害し、ウイルス遺伝子の発現を促進する機能を果たす。これらの主な作用は、感染の後期相の開始と同時に、ウイルスmRNAの核から細胞質への選択的な輸送を確立することである。E1Bの21kDタンパク質は、生産的感染周期を時間的に正しく制御することによって、ウイルスの生活環が完了する前に宿主が時期尚早に死滅するのを予防する上で重要である。E1Bの21kD遺伝子産物を発現することのできない突然変異ウイルスは、短縮された感染周期を示し、その感染周期には宿主細胞染色体DNAの過剰な分解（deg-表現型）と細胞変性作用の増大（cyt-表現型）を伴う（Tellingら,1994）。このdeg及びcyt表現型はE1A遺伝子が同時に突然変異すると抑制される。このことは、これらの表現型がE1Aの機能であることを示している（Whiteら,1988）。またE1Bの21kDaタンパク質は、E1Aが他のウイルス遺伝子を活性化（switch on）する速度を低下させる。E1Bの21kDがこれらのE1A依存性機能を失わせる機構はまだわかっていない。
【００１３】
少なくともE1領域が削除されていてその領域が目的の遺伝子で置換されているヒトアデノウイルス由来のベクターは、前臨床相及び臨床相の遺伝子治療実験に広く使用されてきた。
【００１４】
上述のように、現在遺伝子治療に使用されているアデノウイルスベクターはすべてE1領域に欠失をもち、その部分に新規遺伝情報を導入することができる。このE1欠失はその組換えウイルスを複製欠損性にする（Stratford-Perricaudet及びPerricaudet,1991）。本発明者らは、組換えアデノウイルスがラットの肝臓とアカゲザルの気道上皮に組換え遺伝子を効率よく導入させうることを立証した（Boutら,1994b；Boutら,1994a）。また、本発明者ら（Vincentら,1996a；Vincentら,1996b）と他の研究者（例えばHaddadaら,1993）は、試験管内（in vitro）では種々の腫瘍細胞に対する、また生体内（in vivo）では動物モデル中の固形腫瘍（肺腫瘍、神経膠腫）及び免疫不全マウス中のヒト異種移植片（肺）に対する、極めて効率のよい生体内アデノウイルス媒介性遺伝子導入を観察している（Blaeseら,1995に概説されている）。
【００１５】
例えばレトロウイルスなどとは対照的に、アデノウイルスは、a）宿主細胞ゲノムに統合せず、b）非分裂細胞に感染することができ、c）生体内で組換え遺伝子を効率よく導入することができる（Brody及びCrystal,1994）。これらの特徴は、アデノウイルスを、例えば腫瘍細胞内への自殺遺伝子やサイトカイン遺伝子の生体内遺伝子導入用の魅力的な候補にしている。
【発明の開示】
【００１６】
しかし、現行の組換えアデノウイルス技術に伴う問題は、組換えアデノウイルスの製造中に望ましくない複製コンピテントアデノウイルス（RCA）が生成する可能性である（Lochmullerら,1994；Imlerら,1996）。これは、組換えベクターと相補細胞系（complementing cell line；例えば293細胞）中に存在するアデノウイルス構築物の重複する配列間で起こる相同組換え（homologous recombination）によって引き起こされる（Grahamら,1977）。臨床試験に使用されるバッチ内のRCAは、i）RCAが制御されない形式で複製すること、ii）RCAが複製欠損性組換えアデノウイルスを補完して、組換えアデノウイルスの制御されない増殖を引き起こしうること、及びiii）RCAを含有するバッチは有意な組識損傷を誘発し、それゆえに強い病的副作用を誘発することから、望ましくない（Lochmullerら,1994）。したがって臨床試験に使用されるバッチは、RCAが含まれないことを証明すべきである（Ostrove,1994）。本発明の一側面として、本発明者らは、新しい基本ベクターと重複する配列を持たず、それゆえに組換えアデノウイルスの安全な大規模生産に適したパッケージング細胞を開発したので、ウイルス生産に関するこの問題は解決される。組換えアデノウイルスベクターの使用に伴うその他の問題点の一つは、アデノウイルスによる処置に対する宿主防御反応である。
【００１７】
簡単に述べると、組換えアデノウイルスはE1領域が削除されている（上記参照）。アデノウイルスE1産物は他の初期遺伝子（E2、E3、E4）の転写を誘発し、その結果として、後期ウイルス遺伝子の発現を活性化する。したがって、E1欠失ベクターは他のアデノウイルス遺伝子のいずれをも発現させないであろうと一般に考えられていた。しかし、最近になって、いくつかの細胞タイプがE1配列の不在下でもアデノウイルス遺伝子を発現させうることが立証された。このことは、いくつかの細胞タイプがアデノウイルス遺伝子の転写を駆動する機構を保持していることを示している。具体的に述べると、これらの細胞がE2Aタンパク質と後期アデノウイルスタンパク質を合成することが明らかにされた。
【００１８】
遺伝子治療の場合、これは、体細胞に対する治療用組換え遺伝子の導入がその治療用タンパク質の発現をもたらすばかりでなく、ウイルスタンパク質の合成をも引き起こしうることを意味する。アデノウイルスタンパク質を発現させる細胞は細胞障害性Tリンパ球によって認識され殺されるので、細胞障害性Tリンパ球が、a）形質導入された細胞を根絶し、b）炎症を引き起こすことになる（Boutら,1994a；Englehardtら,1993；Simonら,1993）。この不都合な反応は遺伝子治療の障害となっているので、例えばa）処置後に免疫抑制剤を使用すること、b）組換えベクター中にアデノウイルスE3領域を維持すること（特許出願EP95202213を参照のこと）、及びc）E2領域中に点突然変異を持つヒトアデノウイルスのts突然変異体を使用すること（特許WO/28938）などといった、この問題の対する解決策がいくつか提案されている。
【００１９】
しかし、免疫反応を回避するためのこれらの戦略には、それぞれ限界がある。
【００２０】
ts突然変異組換えアデノウイルスの使用は、免疫反応をある程度減少させるが、肺における異常反応の予防についてはあまり有効でなかった（Engelhardtら,1994a）。
【００２１】
E2Aタンパク質は単独で免疫反応を誘発することができ、後期アデノウイルスタンパク質合成への切替えに中枢的な役割を果たす。したがって、特許出願WO28938の請求の範囲に述べられているように、E2領域が突然変異した組換えアデノウイルスを作製して、それを温度感受性（ts）にすることは魅力的な手法である。
【００２２】
このシステムの主な欠点は、非許容温度ではE2タンパク質が不安定であるものの、それでもなお、この免疫原性タンパク質が合成されているという事実である。また、この不安定なタンパク質は、後期遺伝子発現を（低い程度にとはいえ）活性化すると予想すべきである。ts125突然変異組換えアデノウイルスが試験され、長期間持続する組換え遺伝子発現が報告された（Yangら,1994b；Engelhardtら,1994a；Engelhardtら,1994b；Yangら,1995）。しかし、コトンラットの肺内の病状は依然として高く（Engelhardtら,1994a）、ts突然変異体の使用が組換えアデノウイルス技術に部分的な改良しかもたらさないことを示した。ts125組換えアデノウイルスを用いた他の研究者ら（Fangら,1996）は、マウスとイヌで、長期間持続する遺伝子発現を観察していない。ts125突然変異アデノウイルスの使用に伴うもう1つの問題は、高頻度の復帰突然変異がみられることである。これらの復帰突然変異体は、真の復帰突然変異体であるか、もしくは第2の部位突然変異の結果である（Kruijerら,1983；Nicolasら,1981）。どちらのタイプの復帰突然変異体も常温で機能するE2Aタンパク質を持ち、それゆえに野生型ウイルスと同様の毒性を持つ。
【００２３】
そこで、本発明のもう1つの側面として、本発明者らはE2Aコード配列を組換えアデノウイルスゲノムから削除し、E1配列を含有する（パッケージング）細胞系にこれらのE2A配列をトランスフェクションすることにより、組換えアデノウイルスベクターを補完することにした。
【００２４】
このアプローチにおける主な障害は、a）E2Aを極めて高レベルに発現させるべきであることと、b）E2Aタンパク質が細胞にとって極めて有毒なことである。
【００２５】
そこで本発明は、そのさらなる側面として、非許容温度ではDNA配列と結合できないタンパク質を生産するts125突然変異E2A遺伝子の使用を開示する。高レベルのこのタンパク質は、許容温度への切替えが行われるまで細胞内に維持することができる（なぜならこのタンパク質は非許容温度で毒性を持たないからである）。これは、突然変異E2A遺伝子を誘導性プロモーター（inducible promoter）（例えばtet、メタロチオネイン、ステロイド誘導性プロモーター、レチノイン酸β-レセプターその他の誘導システムなど）の管理下に置くことと組み合わせることができる。しかし、本発明のさらなる側面として、有毒な野生型E2Aの生産時機を制御するために誘導性プロモーターを使用することを開示する。
【００２６】
E2A欠失組換えアデノウイルスのさらに2つの顕著な利点は、異種配列を保持する能力が増大していることと、突然変異E2Aを発現させる細胞の永続的な選択である。この第2の利点は、ts125突然変異の高頻度の復帰変異に関係する。ts125 E2Aを保持する細胞系内で復帰突然変異が起こると、それはその細胞にとって致命的になるであろう。したがって、ts125突然変異E2Aタンパク質を発現させる細胞が常に選択されることになる。また、本発明者らは本発明の一側面としてE2A欠失組換えアデノウイルスを作製するので、本発明者らのアデノウイルスには復帰突然変異の問題が生じないことになる。
【００２７】
本発明のもう１つの側面では、さらなる改良として、パッケージング細胞系としての非ヒト細胞系の使用を開示する。
【００２８】
組換えウイルスの臨床用バッチのGMP生産には、他の生物工学製品の生産に広く使用されている細胞系を使用することが望ましい。ワクチンなどの生産に使用されている最近の細胞系は、ほとんどがサル由来である。ヒトアデノウイルスはサル由来の細胞内では複製できないか、もしくは低レベルにしか複製できないので、これらの細胞を組換えヒトアデノウイルスの生産に直接使用することはできない。アデノウイルス細胞溶解サイクルの初期相から後期相への切替えの遮断が、不完全複製の根本にある。しかし、ヒトウイルスのサル細胞内での複製を可能にするヒトアデノウイルスゲノム中の宿主域突然変異が記述されている（hr400-404）。これらの突然変異はE2Aタンパク質をコードする遺伝子内にある（Klessig及びGrodzicker,1979；Klessigら,1984；Rice及びKlessig,1985）（Klessigら,1984）。さらに、hrと温度感受性ts125表現型の両方を持つ突然変異ウイルスも記述されている（Broughら,1985；Rice及びKlessig,1985）。
【００２９】
そこで本発明者らは、次に挙げる要素を保持するサル由来のパッケージング細胞系を作製する：
a. E1/E2欠損アデノウイルスの複製を可能にするためのE1配列、及び、
b. E2A過剰発現による細胞死を防止するための、hr突然変異とts125突然変異を含有するE2A配列（ts400と呼ばれる）（Broughら,1985；Rice及びKlessig,1985）、及び/又は、
c. 誘導性プロモーターの制御下にhr突然変異のみを含有するE2A配列、及び/又は、
d. 誘導性プロモーターの制御下にhr突然変異とts125突然変異を含有するE2A配列（ts400）。
【００３０】
さらに本発明者らは、（新規及び改良型）パッケージング細胞系と（新規及び改良型）組換えアデノウイルスベクターの新規及び改良型組み合わせを開示する。本発明者らは、次に挙げるものを提供する：
1. アデノウイルス5型ゲノムのnt.80-5788を保持する二倍体ヒト胚網膜芽細胞（HER）由来の新規パッケージング細胞系。ECACCに番号95062101として寄託されているこの細胞系（911と呼ばれる）は、この細胞系を一般的に使用される293細胞より優れたものにする多くの特徴を持つ（Fallauxら,1996）。
【００３１】
2. E1A遺伝子のみを発現させ、E1B遺伝子を発現させない新規パッケージング細胞系。樹立細胞系（及び293細胞と911細胞の起源である非ヒト二倍体細胞）は、E1Bの不在下にE1Aを発現させるヒト二倍体細胞で起こるようなアポトーシス性細胞死を受けることなく、E1Aを高レベルに発現させることができる。このような細胞系はE1B欠損組換えアデノウイルスをトランス補完（trans-complement）することができる。なぜならE1Bの21kDタンパク質が突然変異したウイルスは、野生型アデノウイルスよりもさらに速くウイルス複製を完了することができるからである（Tellingら,1994）。これらの構築物については下に詳述すると共に、図1〜5に図示する。これらの構築物を種々の樹立細胞系にトランスフェクションし、E1A発現量の高いものを選択する。これは、選択可能なマーカー遺伝子（例えばNEO遺伝子）をE1Bプロモーターに直接機能的に連結することによって行われる。E1BプロモーターはE1A遺伝子産物によって転写的に活性化されるので、選択剤（例えばNEOを選択マーカーとして使用する場合はG418）に対する耐性により、望ましいE1A遺伝子発現の直接的な選択が起こる。
【００３２】
3. E1B 21kDが突然変異又は欠失しており、同55kDタンパク質のみを発現させるパッケージング構築物。
【００３３】
4. マーカー遺伝子による選択の必要がない二倍体細胞（ヒト起源のものに限らない）由来の相補パッケージング細胞の作製に使用されるパッケージング構築物。これらの細胞はE1Aの発現によって不死化される。しかしこの場合、E1Aタンパク質によって誘導されるアポトーシスを防止するにはE1Bの発現が必須である。E1発現細胞の選択は、293細胞（Grahamら,1977）と911細胞（Fallauxら,1996）（これらはそれぞれE1で形質転換されたヒト胚腎（HEK）細胞とヒト胚網膜芽細胞（HER）である）について記述されているように、フォーカス形成（不死化）に関する選択によって達成される。
【００３４】
5. 構築物pIG.E1B（図4）によるHER細胞のトランスフェクション後に、7つの独立した細胞系を樹立することができる。これらの細胞系をPER.C1、PER.C3、PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8及びPER.C9と名づけた。PERとは、PGK-E1-網膜芽細胞を意味する。これらの細胞系はE1Aタンパク質とE1Bタンパク質を発現し、安定であり（例えばPER.C6は57継代以上安定）、E1欠損アデノウイルスベクターを補完する。PER細胞で得られる組換えアデノウイルスの収量は、293細胞で得られる収量よりも少し高い。これらの細胞系の一つ（PER.C6）は、ECACCに番号96022940として寄託されている。
【００３５】
6. 延長されたE1欠失（nt.459-3510欠失）を持つ新規アデノウイルスベクター。これらのウイルスベクターは、上記パッケージング細胞系中のE1配列に相同な配列を持たない。これらのアデノウイルスベクターはpIXプロモーター配列とpIX遺伝子を含有し、pIX（その天然プロモーター配列から）はこのベクターからのみ発現し、パッケージング細胞によっては発現されない（Matsuiら,1986,Hoeben及びFallaux,私信；Imlerら,1996）。
【００３６】
7. 好ましくはE1A発現性樹立細胞系又はE1A-E1B発現性二倍体細胞（2〜4を参照のこと）に基づくE2A発現性パッケージング細胞系。E2A発現は誘導性プロモーターの制御下に置かれるか、もしくはE2A ts125突然変異体が誘導性プロモーター又は構成プロモーターによって駆動される。
【００３７】
8. 上述（6を参照のこと）と同様のベクターであるが、さらにE2A配列の欠失をも持つ組換えアデノウイルスベクター。
【００３８】
9. E1欠損組換えアデノウイルスをトランス補完することができるサル由来のアデノウイルスパッケージング細胞系。これらは、pIG.E1AE1BとpIG.NEOでコトランスフェクションされ、NEO耐性について選択されることが好ましい。E1AとE1Bを発現させるこのような細胞はE1欠損組換えヒトアデノウイルスをトランス補完することができるが、サル由来の細胞内では後期アデノウイルスタンパク質の合成が遮断されるので（Klessig及びGrodzicker,1979）、その効率は良くないであろう。この問題を克服するため、本発明者らは、E2A遺伝子中に宿主域突然変異を持つ組換えアデノウイルスを作製することにより、サル細胞におけるヒトアデノウイルスの複製を可能にする。このようなウイルスは、hr突然変異体のDNAを相同組換えに使用することを除いて、図12に記述するように作製される。
【００３９】
10. 9に記述したものと同様であるが、hr突然変異を持つE2A配列でもコトランスフェクションされる点が異なる、サル由来のアデノウイルスパッケージング細胞。これは、E1とE2Aを欠くヒトアデノウイルス（8を参照のこと）の複製を可能にする。これらの細胞系中のE2Aは誘導性プロモーターの制御下にあるか、もしくはtsE2A突然変異体が使用される。後者の場合、E2A遺伝子はts突然変異とhr突然変異の両方（ts400由来）を保持することになる。両突然変異を保持する複製コンピテントヒトアデノウイルスは既に記述されている（Broughら,1985；Rice及びKlessig,1985）。
【００４０】
本発明のさらなる側面は、別の方法で改良されたアデノウイルスベクターと、上記ベクターの作製及び応用に関する新しい戦略、及び哺乳類細胞における直線状DNA断片の細胞内増幅方法を提供する。
【００４１】
本発明のいわゆる「最小」アデノウイルスベクターは、少なくとも、ウイルス粒子へのゲノムの包膜に必要なウイルスゲノムの一部（包膜シグナル）と、直線状アデノウイルスゲノムの末端由来のDNA配列である逆方向末端反復配列（ITR）の少なくとも機能的な部分又は誘導体の少なくとも1コピーとを保有する。本発明のベクターは、導入遺伝子（transgene）の発現を管理するためのプロモーター配列に連結した導入遺伝子をも含有するであろう。いわゆる最小アデノウイルスベクターのパッケージングは、ヘルパーウイルス又は後述のパッケージング欠損性複製ヘルパーシステムとの同時感染によって達成することができる。
【００４２】
適当な細胞系内で複製することができ、パッケージング欠損性複製ヘルパーシステムとして機能することができるアデノウイルス由来のDNA断片は、以下のように作製される。これらのDNA断片は、アデノウイルスゲノムの「後期」転写単位の被転写領域の少なくとも一部を保持し、E1領域の少なくとも一部と包膜シグナルの少なくとも一部に欠失を持つ。さらにこれらのDNA断片は、逆方向末端反復配列（ITR）のコピーを少なくとも1つは含有する。トランスフェクションされるDNA分子の一端には、ITRが置かれる。もう1つの末端はITRを含有してもよいし、そのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的なDNA配列を含有してもよい。後者の場合、それら2つの相補配列がアニールすると、そのヘアピン構造の3′末端ヌクレオチドの遊離の3′-ヒドロキシル基は、細胞DNAポリメラーゼ及び/又はアデノウイルスがコードするDNAポリメラーゼによるDNA合成のプライマーとして機能することができ、そのDNA分子の少なくとも一部が二本鎖型に変換されることになる。ITRで始まるさらなる複製は、トランスフェクションされた元のDNA分子より大きく、2つのITRが隣接した、直線状二本鎖DNA分子をもたらすであろう（図13を参照のこと）。この分子は、そのDNA分子によってコードされるアデノウイルスタンパク質と宿主細胞ゲノム内の遺伝子によってコードされるアデノウイルスタンパク質及び細胞タンパク質の効力により、トランスフェクションされた細胞内でそれ自身複製することができる。このDNA分子は、その大きなサイズ（39000塩基対以上）ゆえに、もしくは機能的な包膜シグナルが存在しないために、包膜されえない。このDNA分子は、適当な細胞系における欠損アデノウイルスベクターの生産にヘルパーとして役立つ予定である。
【００４３】
本発明は、適当な哺乳類細胞内で様々なサイズの直線状DNA断片を増幅する方法をも包含する。これらのDNA断片は、その断片の一端にITRのコピーを少なくとも1つは含有する。もう1つの末端はITRを含有してもよいし、もしくはそのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的なDNA配列を含有してもよい。後者の場合、その2つの相補配列がアニールすると、そのヘアピン構造の3′末端ヌクレオチドの3′-ヒドロキシル基は、細胞DNAポリメラーゼ及び/又はアデノウイルスがコードするDNAポリメラーゼによるDNA合成のプライマーとして機能することができ、そのDNA分子の少なくとも一部が二本鎖型に変換されることになる。ITRで始まるさらなる複製は、トランスフェクションされた元のDNA分子より大きく、2つのITRが隣接した、直線状二本鎖DNA分子をもたらすであろう。両端にITR配列を含有するDNA分子は、少なくともアデノウイルスE2タンパク質（すなわちDNA結合タンパク質（DBP）、アデノウイルスDNAポリメラーゼ（Ad-pol）及びプレ末端タンパク質（pTP））が存在するため、トランスフェクションされた細胞内でそれ自身複製することができる。必要なタンパク質は、そのDNA分子自体のアデノウイルス遺伝子、宿主細胞ゲノムに組込まれたアデノウイルスE2遺伝子、又は上述の複製ヘルパー断片から発現することができる。
【００４４】
複製に必要なアデノウイルスタンパク質がヘルパーウイルスの感染などによってトランスに供給されるのであれば、複製できるアデノウイルスミニ染色体の生成には、DNA分子の末端にITR配列が存在すれば足りることを、いくつかのグループが示している（Huら,1992；Wang及びPearson,1985；Hayら,1984）。Huら（1992）は、ITRを一つだけ含有するプラスミドのトランスフェクション後に、対称なアデノウイルスミニ染色体二量体の存在と複製を観察した。この著者らは、これらの二量体ミニ染色体が単一ITR DNA分子の尾-尾連結後に生じることを立証することができた。欠損アデノウイルス2型粒子から抽出したDNAには、電子顕微鏡で様々なサイズの二量体分子も観察されている（Daniell,1976）。これは、不完全なゲノムが異なる分子間の非正統的組換えによって生成したことと、異常塩基対形成を起こした配列の位置の変動がその不完全ゲノムの不均一性の原因であることを示唆するものであった。この機構によれば、理論的には、正常ゲノムの2倍までの全長を持つ欠損分子が生成しうると考えられた。そのような分子は、そのゲノムのいずれかの末端から複写（duplicate）された配列を含有するであろう。しかし、完全長ウイルスより長いDNA分子は欠損粒子中にパッケージングされないことがわかった（Daniell,1976）。これは、パッケージングに適用されるサイズ制限によって説明することができる。また、複写された左末端を持つウイルス粒子DNA分子は、右端末端を含有するものより優勢であることがみとめられた（Daniell,1976）。これは、包膜シグナルがそのゲノムの左末端近くに存在することから完全に説明される（Grable及びHearing,1990；Grable及びHearing,1992；Hearingら,1987）。
【００４５】
現行のアデノウイルス由来ベクターに伴う主な問題は、
A）そのウイルス粒子の強い免疫原性、
B）アデノウイルスベクターに内在するアデノウイルス遺伝子の発現（これは形質導入された細胞に対する細胞障害性T細胞反応をもたらす）、および
C）現行のベクターに適応させることができる異種配列の量が少ないこと（最大約8000bpまでの異種DNA）
である。
【００４６】
補足A）アデノウイルス粒子の強い免疫原性は、アデノウイルスベクターを1回投与しただけでも、宿主の免疫学的反応をもたらす。中和抗体が発生するため、当該ウイルスのそれ以降の投与は有効性が低下するか、もしくは完全に無効となる。しかし、導入された遺伝子の長期間にわたる又は永続的な発現により、必要な投与回数が減少し、この問題を回避することができる。
【００４７】
補足B）Wilsonとその共同研究者らが行なった実験は、アデノウイルスによる免疫適格動物（immunocompetent animal）への遺伝子導入後に導入遺伝子の発現が徐々に減少し、感染後約2〜4週間で消滅することを立証している（Yangら,1994a；Yangら,1994b）。これは、形質導入された細胞に対する細胞障害性T細胞（CTL）の発生によって起こる。これらのCTLは、ウイルスベクターによって発現されたアデノウイルスタンパク質に対して向けられた。形質導入された細胞では、アデノウイルスDNA結合タンパク質（E2A遺伝子産物）、ペントン及び繊維タンパク質（後期遺伝子産物）の合成を確認することができた。ウイルスベクターによってコードされるこれらのアデノウイルスタンパク質は、E1領域の欠失にもかかわらず発現した。このことは、E1領域の欠失が、ウイルス遺伝子の発現を完全に防止するには十分でないことを立証している（Engelhardt,1994a）。
【００４８】
補足C）Grahamとその共同研究者らの研究は、アデノウイルスが正常なゲノムサイズの105%までのDNAを包膜しうることを立証している（Bettら,1993）。より大きなゲノムは不安定な傾向があり、ウイルスの増殖中にDNA配列の喪失をもたらす。ウイルスゲノムのE1領域とE3領域の欠失を組み合わせると、包膜され得る外来DNAの最大サイズが約8.3kbに増大する。また、E4領域のいくつかの配列はウイルス増殖にはなくてもよいようである（これにより最大包膜収容力がさらに1.8kb増大する）。E2A遺伝子産物が包膜細胞系内でトランスに供給される場合は、E2A領域もベクターから削除することができ、さらに1.6kbが加わる。ただし、外来DNAの最大収容力は12kbを大きく超えることはできないと思われる。
【００４９】
本発明者らは、38kbまでの外来DNAを適応させることができる組換えアデノウイルスのヘルパー非含有ストックを作製及び生産するための新しい戦略を開発した。このベクターゲノムの一部でなければならない要素は、2つの機能的ITR配列と、包膜シグナルとして機能できる配列だけである。そのようなベクターを最小アデノベクターという。最小アデノベクターに対するヘルパー機能は、宿主細胞ゲノム中に存在する遺伝子又はベクターゲノムに内在する遺伝子以外の必要な遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子をすべて含有する包膜欠損性複製コンピテントDNA分子によってトランスに供給される。
【００５０】
以下、開示した発明の応用を概説し、実験項に例示する。当業者には理解されるであろうが、これらは単なる例示を目的とするものであって、これを本発明の範囲の減縮に利用してはならない。
【００５１】
IGパッケージング構築物二倍体細胞の使用
上記構築物（具体的にはpIG.E1A.E1B）は、ヒト胚網膜芽細胞（HER）、ヒト胚腎細胞（HEK）及びヒト胚肺細胞（HEL）などの二倍体ヒト細胞のトランスフェクションに使用されるであろう。トランスフェクションされた細胞は、形質転換した表現型（フォーカス形成）に関して選択され、E1欠失組換えアデノウイルス（例えばIG.Ad.MLPI.TKなど）の増殖を支持するその能力について試験されるであろう。これらの細胞系は、E1欠失組換えアデノウイルスの作製と（大規模）生産に使用されるであろう。組換えアデノウイルスに感染したこれらの細胞は、例えば固形腫瘍治療用などの組換えアデノウイルスの局所生産細胞として、生体内でも使用される予定である。
【００５２】
911細胞は組換えアデノウイルスベクターの力価測定、作製及び生産に使用される（Fallauxら,1996）。
【００５３】
pIG.E1A.E1BでトランスフェクションされたHER細胞は、7つの独立したクローンをもたらした（これらをPER細胞という）。これらのクローンはE1欠失（非重複アデノウイルスベクターを含む）又はE1欠損組換えベクターの生産に使用され、E2A又はE4などに突然変異を持つアデノウイルスベクターの増殖を可能にするE2B又はE2A構築物（例えばts125E2A；下記参照）、E4などの導入の基礎となる。
【００５４】
また、ヒトアデノウイルスを許容する他の種の二倍体細胞、例えばコトンラット（Sigmodon hispidus）（Paciniら,1984）、シリアハムスター（Morinら,1987）又はチンパンジー（Levreroら,1991）などは、これらの構築物によって不死化されるであろう。組換えアデノウイルスに感染したこれらの細胞は、例えば固形腫瘍治療用などの組換えアデノウイルスの局所生産細胞として、生体内でも使用される予定である。
【００５５】
樹立細胞
上記構築物（具体的にはpIG.E1A.NEO）は、例えばA549（ヒト気管支癌腫）、KB（口頭癌腫）、MRC-5（ヒト二倍体肺細胞）又はGLC細胞系（小細胞肺癌）（de Leijら,1985；Postmusら,1988）などの樹立細胞のトランスフェクションに使用し、NEO耐性について選択することができる。耐性細胞の個々のコロニーを単離し、E1欠失組換えアデノウイルス（IG.Ad.MLPI.TKなど）の増殖を支持するそれらの能力について試験する。E1A含有細胞におけるE1欠失ウイルスの増殖が可能である場合は、それらの細胞をE1欠失組換えアデノウイルスの作製と生産に使用することができる。またこれらはE1A欠失／E1B保有組換えアデノウイルスの増殖にも使用される。
【００５６】
樹立細胞は、pIG.E1A.E1BとpIG.NEO（又はその他のNEO含有発現ベクター）でコトランスフェクションすることもできる。G418に耐性なクローンは、E1欠失組換えアデノウイルス（IG.Ad.MLPI.TKなど）の増殖を支持するそれらの能力について試験され、E1欠失組換えアデノウイルスの作製と生産に使用され、また、二倍体細胞（上記参照）について記述したように、組換えウイルスの局所生産のために生体内で利用されるであろう。
【００５７】
形質転換二倍体細胞系又はNEO耐性樹立系を含む全ての細胞系は、他の遺伝子（例えばE2A及びE4）にも欠失を持つE1欠損組換えアデノウイルスの増殖を支持する「次世代」パッケージング細胞系を作製する際の基礎として使用することができる。さらに、これらは本明細書に開示する最小アデノウイルスベクターを作製するための基礎にもなる。
【００５８】
E2発現細胞系
E2A配列を発現させるパッケージング細胞はE2A欠失組換えアデノウイルスの作製と（大規模）生産に使用されており、また使用されるであろう。
【００５９】
新たに作製されたヒトアデノウイルスパッケージング細胞系、又はヒトアデノウイルス（E2A又はts125E2A；E1A+E2A；E1A+E1B+E2A；E1A+E2A/ts125；E1A+E1B+E2A/ts125）を許容する種に由来する細胞系、又はサル細胞などの非許容細胞系（hrE2A又はhr+ts125E2A；E1A+hrE2A；E1A+E1B+hrE2A；E1A+hrE2A/ts125；E1A+E1B+hrE2A/125）は、E2A欠失組換えアデノウイルスベクターの作製及び（大規模）生産に使用されており、また使用されるであろう。さらにこれらは、二倍体細胞（上記参照）について記述したように、組換えウイルスの局所生産のために生体内でも利用されるであろう。
【００６０】
新規アデノウイルスベクター
nt.459-3510のE1欠失を保持する新たに開発されたアデノウイルスベクターは、遺伝子導入に使用されるであろう。これらのベクターは、例えばE2A、E2B又はE4などが突然変異したさらなる欠失アデノウイルスを開発する際の基礎でもある。これらのベクターは、例えば上述の新たに開発されたパッケージング細胞系（1〜3を参照のこと）で作製されるであろう。
【００６１】
最小アデノウイルスパッケージングシステム
本発明者らは、（最小アデノウイルスベクターのパッケージングに使用される）アデノウイルスパッケージング構築物を開示する。このパッケージング構築物は次に挙げる特徴を持ちうる：
a. 本パッケージング構築物は複製する；
b. 本パッケージング構築物はパッケージングシグナルが削除されているのでパッケージングされ得ない；
c. 本パッケージング構築物は内部ヘアピン形成配列を含有する（「実験項；ヘアピンの示唆」及び図15を参照のこと）；
d. 内部ヘアピン構造ゆえに、本パッケージング構築物は複写（duplicate）される。すなわち、本パッケージング構築物のDNAは、パッケージング細胞にトランスフェクションされる前の2倍の長さになる（本発明者らの試料では、35kbから70kbになる）。この複写もパッケージングを防止する。この複写されたDNA分子がITRを両端に持つことに注意すること（例えば図13参照）；
e. この複写されたパッケージング分子は「正常アデノウイルス」DNA分子と同様に複製できる；
f. ゲノムの複写は、最小アデノウイルスベクターのパッケージングに要求される充分なレベルのアデノウイルスタンパク質の生産にとって必要条件である；
g. 本パッケージング構築物は、相同組換えによるRCAの生成につながりうる最小ベクター又は細胞配列との重複配列を持たない。
【００６２】
このパッケージングシステムは、最小アデノウイルスベクターを生産するために使用されるであろう。例えば予防接種目的の遺伝子治療などに関する最小アデノウイルスベクターの利点は、よく知られている（38kbまでに適応；潜在的に有毒、免疫原性のアデノウイルス遺伝子はすべて除去されている）。
【００６３】
必須遺伝子に突然変異を含有するアデノウイルスベクター（最小アデノウイルスベクターを含む）はこのシステムを用いて増殖させることもできる。
【００６４】
細胞内E2発現ベクターの使用
最小アデノウイルスベクターは、パッケージング欠損性複製ヘルパー分子によってトランスに供給されるヘルパー機能を用いて作製される。アデノウイルス由来のITR配列は、少なくともE2遺伝子産物の存在下にDNA複製起点として機能する。E2遺伝子産物がベクターゲノム中の遺伝子から発現する場合（注：その遺伝子はE1に依存しないプロモーターによって駆動されなければならない）は、ベクターゲノムは標的細胞内で複製できる。これによって、標的細胞内の鋳型分子の数が有意に増大し、その結果、そのベクターによってコードされる目的遺伝子の発現量が増大する。このことは、癌の遺伝子治療では特に重要である。
【００６５】
直線状DNA断片の細胞内増幅の応用
直線状DNA断片の増幅を望む場合にも、同様のアプローチをとることができるであろう。既知又は未知配列のDNA断片は、その末端又は末端付近に少なくとも1つのITR配列があるならば、E2遺伝子産物を含有する細胞内で増幅することができるであろう。断片のサイズに明白な制約はない。アデノウイルスゲノム（36kb）よりはるかに長い断片でも、この手法で増幅されるはずである。したがって、哺乳類細胞中の大きな断片を、その断片を細菌（例えば大腸菌）に移したり、ポリメラーゼ連鎖反応（P.C.R.）を使用することなくクローン化することができる。生産的アデノウイルス感染の最終段階では、一つの細胞が100,000コピーを超えるウイルスゲノムを含有することができる。最適な状況では、直線状DNA断片を同様のレベルにまで増幅することができる。したがって、細胞1000万個あたり5μg以上のDNAを抽出できるはずである（35kbp断片の場合）。このシステムを使用すれば、研究又は治療目的で、シミアンウイルス40に基づくCOS細胞系と等価な異種タンパク質を発現させることができる。またこのシステムは、大きいDNA断片中の遺伝子を同定するためにも使用できる。ランダムなDNA断片を（ITRの付加後に）増幅し、細胞内増幅中に発現させることができる。目的の表現型を持つ細胞を選定又は選択することにより、目的の断片を濃縮し、その遺伝子を単離することができる。
【００６６】
実験項
E1欠損性組換えアデノウイルスベクターをトランス補完することができる細胞系の作製
1. 911細胞系
本発明者らは、アデノウイルス5型のE1配列を保持し、E1欠失組換えアデノウイルスをトランス補完することができる細胞系を作製した（Fallauxら,1996）。
【００６７】
この細胞系は、ヒト二倍体ヒト胚網膜芽細胞（HER）を、Ad5のnt.80-5788を含むpAd5XhoICでトランスフェクションすることによって得られた。得られた形質転換体の一つを911と名づけた。この細胞系は、E1欠損組換えアデノウイルスの増殖に極めて有用であることが示されている。これは293細胞より優れていることがわかった。293細胞とは異なり、911細胞は完全に形質転換した表現型を欠き、それがアデノウイルスパッケージングシステムとして優れた性能を示す理由だと思われる：
プラークアッセイをより迅速に行なうことができる（293の8〜14日に対して4〜5日）；
911細胞の単層はプラークアッセイに必要な寒天上層の下でよりよく生き残る；
E1欠失ベクターの増幅率が高い。
【００６８】
また、せん断したアデノウイルスDNAでトランスフェクションされた293細胞とは異なり、911細胞は明確な構築物を用いてトランスフェクションされた。911細胞のトランスフェクション効率は293のそれと同等である。
【００６９】
新規パッケージング構築物
アデノウイルス配列の供給源
アデノウイルス配列は、ヒトアデノウイルス5型のnt.80-9460を含有するpAd5.SalB（Bernardsら,1983）又は野生型Ad5 DNAから得られる。
【００７０】
pAd5.SalBをSalIとXhoIで消化し、その大断片を再連結し、その新しいクローンをpAd5.X/Sと名づけた。
【００７１】
pTN構築物（R.Vogels博士（IntroGene,オランダ）が構築したもの）をヒトPGKプロモーターとNEO遺伝子の供給源として使用した。
【００７２】
ヒトPGKプロモーター及びNEOR遺伝子
この新規パッケージング構築物中のE1A配列の転写は、pUC119（Vieira及びMessing,1987）を骨格とするプラスミドpTN（R.Vogel氏から贈与）から得たヒトPGKプロモーター（Michelsonら、1983、Singer-Samら、1984）によって駆動される。このプラスミドは、B型肝炎ウイルス（HBV）ポリアデニル化シグナルに融合したNEO遺伝子の供給源としても使用した。
【００７３】
E1遺伝子に対するPGKプロモーターの融合（図1）
Ad5のE1配列（ITR、複製起点及びパッケージングシグナル）を異種配列で置換するために、本発明者らは、プライマーEa1とEa2（表I参照）を用いるPCRによってAd5のE1配列（nt.459からnt.960まで）を増幅した。得られたPCR産物をClaIで消化し、ClaIとEcoRVで予め消化しておいたBluescript（Stratagene）に連結して、構築物pBS.PCRIを得た。
【００７４】
ベクターpTNを制限酵素EcoRI（部分消化）とScaIで消化し、PGKプロモーター配列を含有するDNA断片を、ScaIとEcoRIで消化したPBS.PCRI中に連結した。得られた構築物PBS.PGK.PCRIは、nt.459からnt.916までのAd5 E1配列に機能的に連結したヒトPGKプロモーターを含有する。
【００７５】
pIG.E1A.E1B.Xの構築（図2）
pAT-X/SのScaI-BspE1断片をPBS.PGK.PCRIの対応する断片（E1A配列に連結したPGKプロモーターを含有する）で置換することにより、pIG.E1A.E1B.Xを作製した。
【００７６】
pIG.E1A.E1B.Xは、PGKプロモーターの管理下にあるE1A及びE1Bコード配列を含有する。
【００７７】
この構築物にはnt.459からnt.5788までのAd5配列が存在するので、アデノウイルスのpIXタンパク質もこのプラスミドによってコードされている。
【００７８】
pIG.E1A.NEOの構築（図3）
完全なE1Bプロモーターを導入し、このプロモーターをE1B 21kDのAUGコドンがNEORのAUGコドンとして正確に機能するように融合させるため、本発明者らは、プライマーEa3とEp2を用いて、E1Bプロモーターを増幅した。ここに、プライマーEp2はPCR断片にNcoI部位を導入する。得られたPCR断片（PCRIIと呼ぶ）をHpaIとNcoIで消化し、予めHpaIとNcoIで消化しておいたpAT-X/S中に連結した。得られたプラスミドをpAT-X/S-PCR2と名づけた。NEO遺伝子とB型肝炎ウイルス（HBV）ポリアデニル化シグナルの一部を含有するpTNのNcoI-StuI断片をpAT-X/S-PCR2（NcoIとNruIで消化したもの）中にクローニングした。得られた構築物：pAT-PCR2-NEO。pAT-PCR2-NEOのScaI-SalI断片をpTNの対応する断片で置換する（pAT.PCR2.NEO.p（A）を得る）ことにより、ポリアデニル化シグナルを完成させた。pAT.PCR2.NEO.p（A）のScaI-XbaIを、E1A遺伝子に連結したPGKプロモーターを含有するpIG.E1A.E1B-Xの対応する断片で置換した。
【００７９】
得られた構築物をpIG.E1A.NEOと名づけた。これはヒトPGKプロモーターの制御下にAd5 E1配列（nt.459からnt.1713まで）を含有する。
【００８０】
pIG.EIA.E1Bの構築（図4）
プライマーEb1とEb2（これはXhoI部位を導入する）を用いてE1B 55kdのN-末端アミノ酸をコードする配列を増幅することにより、pIG.E1A.E1Bを作製した。得られたPCR断片をBglIIで消化し、pAT-X/SのBglII/NruI中にクローニングすることにより、pAT-PCR3を得た。
【００８１】
pIg.E1A.NEOのXbaI-SalI断片とpAT.PCR3のXbaI-XhoI断片の交換によって、pIG.E1A.NEOのHBVポリ（A）配列をpAT-PCR3のE1B配列の下流に導入することにより、pIG.E1B.E1Bを構築した。
【００８２】
pIG.E1A.E1Bは、E1Aタンパク質とE1Bタンパク質をコードするAd5のnt.459からnt.3510までを含有する。そのE1B配列はnt.3511にあるスプライス受容部位で終わっている。この構築物にはpIX配列は存在しない。
【００８３】
pIG.NEOの構築（図5）
Ad.5 E1Bプロモーターの制御下にあるNEO遺伝子を含有するpIG.E1A.NEOのHpaI-ScaI断片を、EcoRVとScaIで消化したpBSにクローニングすることにより、pIG.NEOを作製した。
【００８４】
この構築物は、樹立細胞をE1A.E1B構築物でトランスフェクションし、NEO選択が必要な場合に役立つ。NEO発現はE1Bプロモーターによって管理されるので、NEO耐性細胞はE1Aを同時発現させると予想され、これはその細胞の長期培養中にE1Aの高レベル発現を維持するためにも好都合である。
【００８５】
構築物の試験
構築物pIG.E1A.NEO、pIG.E1A.E1B.X及びpIG.E1A.E1Bの完全性を制限酵素マッピングによって評価した。さらに、PCR分析によって得たこれら構築物の一部を配列分析によって確認した。ヌクレオチド配列の変化は見つからなかった。
【００８６】
これらの構築物を初代BRK（仔ラット腎）細胞にトランスフェクションし、これらの細胞を不死化する能力（pIG.E1A.NEO）又はこれらの細胞を完全に形質転換する能力（pAd5.XhoIC、pIG.E1A.E1B.X及びpIG.E1A.E1B）について調べた。
【００８７】
6日齢WAG-Rijラットの腎臓を単離し、ホモジナイズし、トリプシン処理した。BRK細胞培養のサブコンフルエント（subconfluent）培養プレート（直径5cm）を1又は5μgのpIG.NEO、pIG.E1A.NEO、pIG.E1A.E1B、pIG.E1A.E1B.X、pAd5XhoIC、又はpIG.E1A.NEOとSV40初期プロモーターの制御下にあるAd5.E1B遺伝子を保持するPDC26（Vander Elsenら,1983）でトランスフェクションした。トランスフェクションの3週間後、フォーカスが視認できた時に、それらの培養プレートを固定し、ギエムザ染色し、フォーカスを数えた。
【００８８】
生成したアデノウイルスパッケージング構築物の概略と、BRKを形質転換するそれらの能力を図6に示す。これらの結果は、構築物pIG.E1A.E1BとpIG.E1A.E1B.XがBRK細胞を用量依存的に形質転換しうることを示している。形質転換の効率はどちらの構築物についても同等であり、911細胞を作製する際に使用した構築物（すなわちpAd5.XhoIC）で認められたものに匹敵する。
【００８９】
予想通り、pIG.E1A.NEOはほとんどBRKを不死化することができなかった。しかし、E1B発現構築物（PDC26）の同時感染により、形質転換体数の有意な増大が起こった（18対1）。このことは、pIG.E1A.NEOによってコードされるE1Aが機能的であることを示す。
【００９０】
したがって、本発明者らは、新たに作製したパッケージング構築物が新しいアデノウイルスパッケージングシステムの作製に適していると結論する。
【００９１】
新規パッケージング構築物を持つ細胞系の作製
細胞系及び細胞培養
ヒトA549気管支癌腫細胞（Shapiroら,1978）、ヒト胚網膜芽細胞（HER）、Ad5-E1-形質転換ヒト胚腎（HEK）細胞（293；Grahamら,1977）、及びAd5形質転換HER細胞（911；Fallauxら,1996）とPER細胞を、10%ウシ胎児血清（FCS）と抗生物質を補足したダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中、5%CO2雰囲気下37℃で生育した。細胞培養培地、試薬類及び血清はGibco Laboratories（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。培養プラスチック製品はGreiner（ドイツ国ニュルチンゲン）とCorning（ニューヨーク州コーニング）から購入した。
【００９２】
ウイルス及びウイルス技術
アデノウイルスベクターIG.Ad.MLP.nls.lacZ、IG.Ad.MLP.luc、IG.Ad.MLP.TK及びIG.Ad.CMV.TKの構築は、特許出願EP95202213に詳述されている。
【００９３】
組換えアデノウイルスベクターIG.Ad.MLP.nls.lacZは、β-ガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺伝子をAd2主要後期プロモーター（MLP）の制御下に含有する。IG.Ad.MLP.lucは、Ad2 MLPによって駆動されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する。アデノウイルスベクターIG.Ad.MLP.TKとIG.Ad.CMV.TKは、それぞれAd2 MLPとサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー/プロモーターの制御下にある単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子を含有する。
【００９４】
トランスフェクション
トランスフェクションはすべて、GIBCOリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（GIBCO BRL Life Technology Inc.,米国ガイサースブルグ）を用い、その製造者のプロトコルに従って、リン酸カルシウム沈澱DNA（Graham及びVan der Eb,1973）によって行なった。
【００９５】
ウェスタンブロッティング
指数的に増殖している293、911及びAd5-E1形質転換A549及びPER細胞のサブコンフルエント培養物をPBSで洗浄し、Fos-RIPA緩衝液（10mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、1% NP40、01%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1% NA-DOC、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、0.5mMトリプシンインヒビター、50mM NaF及び1mMバナジウム酸ナトリウム）中でこすり落とした。室温で10分後、溶解液を遠心分離によって浄化した。タンパク質濃度をBioradプロテインアッセイキットで測定し、25μgの全細胞タンパク質を12.5% SDS-PAAゲルにのせた。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに転写した（300mAで1時間）。染色済標品（Sigma,米国）を並行して処理した。それらのフィルターをTBST（10mMトリス（pH8）、15mM NaCl及び0.05%トゥイーン-20）中の1%ウシ血清アルブミン（BSA）で1時間ブロックした。第1抗体はマウスモノクローナル抗Ad5-E1B-55-kDA抗体A1C6（Zantemaら,未公表）、ラットモノクローナル抗Ad5-E1B-221-kDa抗体C1G11（Zantemaら,1985）とした。第2抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（Promega）とした。シグナルは、増幅化学発光（enhanced chemoluminescence；Amersham Crop,英国）によって可視化した。
【００９６】
サザンブロット分析
高分子量DNAを単離し、10μgを完全に消化し、0.7%アガロースゲルで分画した。Hybond N+（Amersham,英国）へのサザンブロット転写は、0.4M NAOH,0.6M NaCl転写溶液（Church及びGilbert,1984）を用いて行なった。ハイブリダイゼーションはpAd5.SalB（Bernardsら,1983）の2463-nt SspI-HindIII断片を用いて行なった。この断片はAd5のbp.342-2805からなる。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーとクレノウDNAポリメラーゼを用いて、この断片をα-32P-dCTPで放射線標識した。そのサザンブロットを−80℃でKodak XAR-5フィルムとPhosop-Imagerスクリーンに暴露し、それをB&L systems Molecular Dynamicソフトウェアによって分析した。
【００９７】
A549
Ad5−E1形質転換A549気管支癌腫細胞系は、pIG.E1A.NEOによるトランスフェクションとG418耐性に関する選択によって作製した。31個のG418耐性クローンを樹立した。pIG.E1A.E1BとpIG.NEOのコトランスフェクションにより、7個のG418耐性細胞系を得た。
【００９８】
PER
初代HER細胞をプラスミドpIG.E1A.E1Bでトランスフェクションすることにより、Ad5-E1形質転換ヒト胚網膜（HER）細胞を作製した。十分に分離したフォーカスから形質転換細胞系を樹立した。8つのクローン細胞系を樹立することができた。本発明者らはこれらをPER.C1、PER.C3、PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8及びPER.C9と名づけた。
【００９９】
これらPERクローンのうちの1つ（すなわちPER.C6）はECACCに番号96022940として寄託されている。
【０１００】
形質転換したA549及びPER細胞におけるAd5 E1A及びE1B遺伝子の発現
ウェスタンブロット法とモノクローナル抗体（mAb）を利用して、樹立A549及びPER細胞におけるAd5 E1AとE1Bの55kDa及び21kDaタンパク質の発現を調べた。Mab M73はE1A産物を認識し、Mab AIC6とC1G11はそれぞれ55kDa及び21kDa E1Bタンパク質を指向する。
【０１０１】
これらの抗体は親A549細胞又は初代HER細胞から得た抽出物中のタンパク質を認識しなかった（データの記載なし）。pIG.NEOとpIG.E1A.E1Bのコトランスフェクションによって作製したA549クローンはいずれも、検出できるレベルのE1A又はE1Bタンパク質を発現させなかった（記載なし）。pIG.E1A.NEOを用いるトランスフェクションで作製したA549クローンのいくつかは、Ad5 E1Aタンパク質を発現させたが（図7）、そのレベルは293細胞のタンパク質溶解物中に検出されるものよりはるかに低かった。PER細胞から得たタンパク質抽出物中に検出された定常状態E1Aレベルは、A549由来の細胞から得た抽出物中に検出されるものよりはるかに高かった。PER細胞系はすべて、同様のレベルのE1Aタンパク質を発現させた（図7）。E1Bタンパク質の発現の方が、（E1B 55kDaの場合は特に）変化しやすかった。911及び293と比較すると、大半のPERクローンは高レベルのE1B 55kDa及び21kDaを発現させる。E1B 21kDaの定常状態レベルは、PER.C3で最も高かった。いずれのPERクローンも、その細胞を連続継代培養した時に、Ad5 E1遺伝子の発現を失わなかった（記載なし）。本発明者らは、PER細胞におけるE1発現のレベルが、少なくとも100集団倍加の間、安定なままであることを発見した。本発明者らは、これらのPERクローンをより詳細に特徴づけることにした。
【０１０２】
PERクローンのサザン分析
PERクローンにおけるAd5-E1コード配列の配置を調べるために、本発明者らはサザン分析を行なった。細胞DNAを全てのPERクローンと293及び911細胞から抽出した。そのDNAを、Ad5 E1領域内を1度だけ切断するHindIIIで消化した。放射線標識したAd5-E1特異プローブを用いてHindIII消化DNAに対するサザンハイブリダイゼーションを行なったところ、PERクローンのゲノム内に組込まれたpIG.E1A.E1Bのコピーがいくつか存在することが明らかになった。図8は、種々のPER細胞系の高分子量DNA中のE1配列の分布パターンを示す。これらのコピーは単一のバンドに濃縮されており、このことはそれらが縦列反復として組込まれることを示唆している。PER.C3、C5、C6及びC9の場合は、pIG.E1A.E1Bの先端削除型コピーの存在を示す低分子量ハイブリッド形成バンドも見つかった。Phospho-Imagerを用いてコピー数を決定した。本発明者らは、PER.C1、C3、C4、C5、C6、C8及びC9が、Ad5 E1コード領域のコピーをそれぞれ2、88、5、4、5、5及び3個含有し、911細胞と293細胞がAd5 E1配列をそれぞれ1個と4個含有すると見積もった。
【０１０３】
トランスフェクション効率
組換えアデノベクターはアダプタープラスミドとAd5の大ClaI断片を293細胞にコトランスフェクションすることによって作製される（特許出願EP95202213を参照のこと）。組換えウイルスDNAは、プラスミド中に存在する相同なウイルス配列とアデノウイルスDNAの間の相同組換えによって生成する。この方法と代替法の効率は、ヘルパー細胞のトランスフェクション性に著しく依存する。そこで本発明者らは、大腸菌β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子をリポーターとして、PERクローンのいくつかと911細胞のトランスフェクション効率を比較した（図9）。
【０１０４】
組換えアデノウイルスの生産
293、911、PER.C3、PER.C5及びPER.C6に種々のアデノウイルスベクターを接種した後に得られる組換えアデノウイルスの収量を表IIに記載する。
【０１０５】
これらの結果は、PER細胞で得られる収量が、現存する細胞系で得られる収量と少なくとも同程度に高いことを示している。
【０１０６】
また、新規アデノウイルスベクターIG.Ad.MLPI.TKの収量は、試験した全ての細胞系で、他のウイルスベクターに関して得られる収量と同等か、それ以上である。
【０１０７】
新規アデノウイルスベクターの作製（図10）
使用した組換えアデノウイルスベクター（特許出願EP95202213を参照のこと）は、459からnt.3328までのE1配列が欠失している。
【０１０８】
構築物pE1A.E1Bは459からnt.3510までのAd5配列を含有するので、パッケージング構築物pIG.E1A.E1Bと例えばIG.Ad.MLP.TKなどの組換えアデノウイルスベクターのE1B配列の間には183nt.の配列重複がある。この重複配列を、新規アデノウイルスベクターから削除した。また、元の構築物中に存在するlacZ由来の非コード配列も同様に削除した。これは、プライマーSV40-1（これはBamHI部位を導入する）とSV40-2（これはBglII部位を導入する）を用いて、pMLP.TKのSV40ポリ（A）配列をPCR増幅することによって達成された（図10参照）。また、この構築物中に存在するAd5配列をnt.2496（Ad5,BglII部位を導入する）からnt.2779（Ad5-2）まで増幅した。両PCR断片をBglIIで消化し、ライゲートした。その連結産物を、プライマーSV40-1とAd5-2を用いてPCR増幅した。得られたPCR産物をBamHIとAflIIで切断し、同じ酵素で予め切断しておいたpMLP.TK中に連結した。得られた構築物（pMLPI.TKと命名）は、アデノウイルスE1配列中にnt.459からnt.3510までの欠失を含有する。
【０１０９】
パッケージングシステム
配列重複を一切持たない新規パッケージング構築物pIG.E1A.E1Bと組換えアデノウイルスpMLPI.TKの組み合わせを図11に示す。この図には元の状態も記載してあり、そこには配列重複が示されている。
【０１１０】
pIG.E1A.E1BとpMLPI.TK（図11a）の間には重複する配列が存在しないので、パッケージング構築物と組換えウイルスの間で相同組換えが起こる可能性がなくなり、したがって、元の状態と比較すると組換えアデノウイルスの生産が有意に改善される。
【０１１１】
図11bに、pIG.E1A.NEOとIG.Ad.MLPI.TKに関する状況を示す。樹立細胞にトランスフェクションされた場合、pIG.E1A.NEOはE1欠失組換えアデノウイルスの増殖を支持するに足りると予想される。この組合わせは配列重複を一切持たないので、相同組換えによるRCAの生成が防止される。また、この便利なパッケージングシステムは、E1A配列のみが削除されE1B配列は削除されていない組換えアデノウイルスの増殖を可能にする。E1Bタンパク質（特にE1B 19kDa）は、感染ヒト細胞が腫瘍壊死因子（TNF）によって溶解されるのを防止することができるので（Goodingら,1991）、E1Aの不在下にE1Bを発現させる組換えアデノウイルスは魅力的である。
【０１１２】
pMLPI.TK由来の組換えアデノウイルスの作製
SalI直線化（linealized）pMLPI.TK DNAとClaI直線化Ad5 wt DNAで293細胞をコトランスフェクションすることにより、組換えアデノウイルスを作製した。その操作を図12に図示する。
【０１１３】
最小アデノウイルスベクター用パッケージングシステムを作製するための戦略の概略
使用したプラスミドの名称の取り決め：
p プラスミド
I ITR（アデノウイルス逆方向末端反復配列）
C サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー/プロモーター複合体
L ホタルルシフェラーゼコード配列
hac,haw 制限エンドヌクレアーゼAsp718による消化後に生成しうる潜在的ヘアピンであって、それぞれ正しい配向及び逆の配向にあるもの（図15）。
【０１１４】
例：pICLhawは、アデノウイルスITRとそれに続くCMV駆動性ルシフェラーゼ遺伝子及び逆（非機能的）配向にあるAsp718ヘアピンを含有するプラスミドである。
【０１１５】
1.1 アデノウイルス遺伝子を含有し発現させる細胞内で、ヘアピン構造を形成することにより、二本鎖DNA分子を生成する逆鎖合成のプライマーとして機能できるという合成DNA配列の能力の証明
一般的な技術を用いて、プラスミドpICLhac、pICLhaw、pICLI及びpICLを作製した。これらのプラスミドの概略を図16〜19に示す。
【０１１６】
プラスミドpICLは次に挙げるプラスミドに由来する：
nt.1-457 pMLP10（Levreroら,1991）
nt.458-1218 pCMVβ（Clontech,EMBLバンク番号U02451）
nt.1219-3016 pMLP.luc（IntroGene,未公表）
nt.3017-5620 pBLCAT5（Stein及びWhelan,1989）。
【０１１７】
このプラスミドは以下のように構築した。
【０１１８】
プラスミドpML10のtet遺伝子を、BamHI-SalI断片の削除によって不活化することによりpMLP10ΔSBを得た。プライマー対PCR/MLP1とPCR/MLP3を用い、pMLP10 DNAを鋳型として、合成SalI制限部位が隣接したAd5-ITRを含有する210bp断片を増幅した。そのPCR産物を酵素EcoRIとSgrAIで消化することにより196bp断片を得た。プラスミドpMLP10ΔSBをEcoRIとSgrAIで消化することによりITRを除去した。この断片をEcoRI-SgrAI処理したPCR断片で置換することによりpMLP/SALを得た。プラスミドpCMV-LucをPvuIIで完全に消化し、再環化することにより、SV40由来のポリアデニル化シグナルとAd5左末端以外のAd5配列とを除去した。得られたプラスミドpCMV-lucΔAdのAd5 ITRを、XmnI-SacII断片の交換により、プラスミドpMLP/SAL由来のSal部位隣接ITRで置換した。得られたプラスミドpCMV-lucΔAd/SALのAd5左末端とCMV駆動性ルシフェラーゼ遺伝子をSalI-SamI断片として単離し、それをSalIとHpaIで消化したプラスミドpBLCATSに挿入することにより、プラスミドpICLを得た。プラスミドpICLを図19に示す。またその配列を図20に示す。
【０１１９】
プラスミドpICLは次に挙げる特徴を持つ：
nt.1-457 Ad5左末端（ヒトアデノウイルス5型の配列1〜457）
nt.458-969 ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー及び即時初期プロモーター（Bosthartら,1985）（プラスミドpCMVβ（Clontech,米国パロアルト）由来）
nt.970-1204 SV40 19Sエクソンと先端が欠失した16/19Sイントロン（プラスミドpCMVβ由来）
nt.1218-2987 ホタルルシフェラーゼ遺伝子（pMLP.luc由来）
nt.3018-3131 プラスミドpBLCAT5から得られる後期転写物由来のSV40縦列ポリアデニル化シグナル
nt.3132-5620 pUC12骨格（プラスミドpBLCAT5由来） nt.4337-5191 β-ラクタマーゼ遺伝子（Amp耐性遺伝子、逆配向）
【０１２０】
プラスミドpICLhacとpICLhaw
プラスミドpICLを制限酵素Asp718で消化することにより、pICLからプラスミドpIChacとpICLhawを得た。直線化したプラスミドをウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理することにより51リン酸基を除去した。一部相補的な合成一本鎖オリゴヌクレオチドHp/asp1とHp/Asp2をアニールし、その5′末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。
【０１２１】
リン酸化した二本鎖オリゴマーを脱リン酸化pICL断片と混合し、連結した。プラスミド中に挿入された合成オリゴヌクレオチドを1コピーだけ含有するクローンを単離し、制限酵素消化を用いて特徴づけた。Asp718部位にオリゴヌクレオチドを挿入すると、一方の接合部にAsp718認識部位が再生し、他方の接合部では認識部位が破壊されることになる。選択したクローンで、挿入されたオリゴヌクレオチドの配向と完全性を、配列分析によって確かめた。正しい配向（Asp718部位が3205 EcoRI部位に近い）のオリゴヌクレオチドを含有するクローンをpICLhacと命名した。逆配向（Asp718部位がSV40由来のポリシグナルに近い）のオリゴヌクレオチドを持つクローンをpICLhawと命名した。プラスミドpICLhacとpICLhawを図16及び17に示す。
【０１２２】
Ad5-ITRを含有するプラスミドpICLのSalI-SgrAI断片をpICLのAsp718部位に挿入することによって、pICLからプラスミドpICLIを作製した。194bpのSalI-SgrAI断片をpICLから単離し、その付着末端を大腸菌DNAポリメラーゼI（クレノウ断片）とdNTPを用いて平滑末端に変換した。Asp718付着末端は、ヤエナリ（mungbean）ヌクレアーゼによる処理で平滑末端に変換した。連結によって、プラスミドpICLのAsp718部位にITRを含有するクローンを得た。正しい向きにITR断片を含有するクローンをpICLIと名づけた（図18）。
【０１２３】
アデノウイルスAdCMV-hcTKの作製。特許出願95202213に記載の方法に従って、組換えアデノウイルスを構築した。組換えアデノウイルスを作製するには2つの成分が必要である。まず、ITRとパッケージングシグナルを含むアデノウイルスゲノムの左末端、目的遺伝子を含む発現カセット、及び相同組換えに利用できるアデノウイルスゲノムの一部を含有するアダプタープラスミド。また、アデノウイルスDNAも上述のアダプタープラスミドとの組換えに必要である。Ad-CMV-hcTKの場合、プラスミドPCMV.TKを基礎として用いた。このプラスミドはアデノウイルス5型ゲノムのnt.1-455、pCMVβ（Clontech、CMVエンハンサー・プロモーターとシミアンウイルス40の16S/19Sイントロンを含むPstI-StuI断片）から得たnt.456-1204、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（特許出願95202213に記載）、SV40由来のポリアデニル化部位（SV40配列のnt.2533-2668）と、それに続くAd5のBglII-SacI断片（Ad5配列のnt.3328-6092）を含有する。これらの断片はpMLP10由来（Levreroら,1991）の骨格中に存在する。プラスミドpAD-CMVhc-TKを作製するために、プラスミドpCMV.TKをClaI（唯一のClaI部位はTK読み取り枠のすぐ上流にある）で消化し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化した。ヘアピン構造を作製するために、合成オリゴヌクレオチドHP/cla2とHP/cla2をアニールし、その5′-OH基をT4ポリヌクレオチドキナーゼとATPでリン酸化した。その二本鎖オリゴヌクレオチドを直線化したベクター断片と連結し、大腸菌株「Sure」の形質転換に使用した。このオリゴヌクレオチドをClaI部位に挿入すると、ClaI認識部位が破壊されることになる。このオリゴヌクレオチドはその一末端付近に新しいClaI部位を含有する。選択したクローンで、挿入されたオリゴヌクレオチドの配向と完全性を配列分析によって確かめた。オリゴヌクレオチドを正しい向き（ClaI部位がITR側にある）に含有するクローンをpAd-CMV-hcTKと名づけた。このプラスミドを、911細胞に、ClaI消化した野生型アデノウイルス5型DNAとコトランスフェクションした。E1配列がCMV-hcTK発現カセットに置き換わった組換えアデノウイルスを単離し、一般的な手法を用いて増殖した。
【０１２４】
ITRで複製が始まった後に、置換鎖上での逆鎖合成のプライマーとしてヘアピンが使用され得るかどうかを調べるために、プラスミドpICLhacを911細胞（アデノウイルスE1領域で形質転換されたヒト胚網膜芽細胞）に導入した。オリゴヌクレオチド対HP/asp1及び2を逆向きに含有する点以外はプラスミドpICLhacと完全に同一であるプラスミドpICLhawを対照とする。これらの研究には、プラスミドpICLIとpICLも含める。プラスミドpICLIでは、ヘアピンがアデノウイルスITRに置き換わっている。プラスミドpICLはヘアピンもITR配列も含有しない。これらのプラスミドは末端ヘアピン構造による複製効率を決定するための対照として役立つ。DNA複製に必要なE1タンパク質以外のウイルス産物（これらは911細胞によって生産される）を提供するため、トランスフェクション後に、培養物をウイルスIG.Ad.MLPI.TKに感染させる。トランスフェクションされたDNA分子の適正な複製を立証するために、いくつかのパラメーターを調べる。まず、上述のプラスミドでトランスフェクションし、かつ、IG.Ad.MLPI.TKウイルスに感染した細胞培養から抽出したDNAを、サザンブロット法によって、予想される複製中間体の存在及び複写したゲノムの存在について分析する。さらに、トランスフェクションされIG.Ad.MLPI.TKに感染した細胞集団から、ルシフェラーゼ陰性細胞にルシフェラーゼマーカー遺伝子を導入しそれを発現させることのできるウイルスを単離する。
【０１２５】
プラスミドpICLhac、pICLhaw、pICLI及びpICLのプラスミドDNAを制限エンドヌクレアーゼSalIで消化し、ヤエナリヌクレアーゼで処理することにより、得られたDNA断片の4ヌクレオチド一本鎖伸長部を除去した。この方法で、DNA断片に天然アデノウイルス5′LTR末端が生成する。次に、pICLhacプラスミドとpICLhawプラスミドの両方を制限エンドヌクエラーゼAsp718で消化することにより、ヘアピン構造を形成することができる末端を生成させた。各プラスミドにつき4つの培養プレートで、その消化したプラスミドを一般的なリン酸カルシウム共沈法で911細胞に導入する。トランスフェクション中に、1細胞あたり5個の感染性IG.Ad.MLPI.TK粒子を用いて、各プラスミドにつき2つの培養物をIG.Ad.MLPI.TKウイルスに感染させる。トランスフェクションの20時間後とトランスフェクションの40（fort）時間後に、Ad.tkウイルス感染培養1つと非感染培養1つを用いて、Hirtらが考案した手法で小分子量DNAを単離する。単離したDNAの一部をサザン分析に使用する。試料を制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化した後、ルシフェラーゼ遺伝子をプローブとして使用すると、約2.6kbのハイブリッド形成断片が、プラスミドpICLhacでトランスフェクションされたアデノウイルス感染細胞から得た試料中にのみ検出される。この断片のサイズは、ルシフェラーゼマーカー遺伝子の予想される複写と合致する。このことは、挿入されたヘアピンが逆鎖合成のプライマーとして機能しうるという結論を裏付ける。IG.Ad.MLPI.TKウイルスを省略した場合、又はヘアピンオリゴヌクレオチドが逆向きに挿入されている場合は、ハイブリッド形成断片が存在しない。
【０１２６】
制限エンドヌクレアーゼDpnIはテトラヌクレオチド配列5′-GATC-3′を認識するが、メチル化されたDNAのみを切断する（すなわち、大腸菌内で増殖した大腸菌由来の（プラスミド）DNAのみが切断され、哺乳類細胞中で複製したDNAは切断されない）。制限エンドヌクレアーゼMboIは同じ配列を認識するが、非メチル化DNA（すなわち、哺乳類細胞中で増殖したDNA）のみを切断する。トランスフェクションされた細胞から単離したDNA試料をMboI及びDpnIと共にインキュベートし、サザンブロットで分析した。これらの結果は、pICLhacプラスミドとpICLIプラスミドでトランスフェクションされた細胞にのみ大きいDpnI耐性断片が存在し、MboIで処理した試料には存在しないことを立証する。これらのデータは、プラスミドpICLIとpICLhacのトランスフェクション後にのみ、断片の複製と複写が起こることを証明している。
【０１２７】
これらのデータは、アデノウイルス由来の逆方向末端反復配列（ITR）を一端に持ち、かつ、他端に一本鎖型で存在する時に同じ鎖上の配列にアニールしてヘアピン構造を生成することができるヌクレオチド配列を持つ直線状DNA断片が、アデノウイルス感染細胞中で、逆方向末端配列を両端に持つ構造に変換されることを立証している。得られたDNA分子は野生型アデノウイルスゲノムと同じ機構で複製されるであろう。
【０１２８】
1.2 ウイルス粒子に包膜されうるDNA分子の生成には、ルシフェラーゼマーカー遺伝子、1コピーのITR、包膜シグナル、及びヘアピン構造を形成することのできる合成DNA配列を含有するDNA分子で充分であることの証明
2コピーのCMV-lucマーカー遺伝子を含有する上記DNA分子がウイルス粒子に包膜されうることを立証するために、残り2つの培養物から3サイクルの凍結−融解破砕操作によってウイルスを収集し、それらをネズミ線維芽細胞の感染に使用する。感染の48時間に、感染細胞をルシフェラーゼ活性について検定する。ルシフェラーゼ活性がウイルス粒子によってではなく遊離DNAの導入によって誘導された可能性を排除するために、ウイルスストックをDNaseIで処理することにより、DNA汚染物質を除去する。さらに、もう1つの対照として、ウイルスストックの一部を56℃で60分間インキュベートする。この熱処理は混入しているDNAには影響を与えないであろうが、ウイルスを不活化するであろう。有意なルシフェラーゼ活性は、pICLhcとpICLIプラスミドでトランスフェクションしたIG.Ad.MLPI.TK感染細胞から得たウイルスストックに感染した後の細胞にのみ認められる。非感染細胞と、pICLhw及びpICLでトランスフェクションした感染細胞には、有意なルシフェラーゼ活性を認めることができない。熱不活化はルシフェラーゼ発現を完全に排除するが、DNaseI処理はルシフェラーゼ発現を排除せず、このことは、遊離（汚染）DNA断片ではなくアデノウイルス粒子がルシフェラーゼリポーター遺伝子の導入の原因であることを示している。
【０１２９】
これらの結果は、これらの小ウイルスゲノムがアデノウイルス粒子に包膜されうることを立証しており、直線状DNA断片のアデノウイルス粒子への包膜には、ITRと包膜シグナルがあれば足りることを示唆している。これらのアデノウイルス粒子は効率のよい遺伝子導入に利用できる。アデノウイルス遺伝子の少なくとも一部（すなわちE1、E2、E4、及びL、及びVA）を含有しそれらを発現させる細胞に導入すると、少なくとも1つのLTR、包膜シグナルの少なくとも一部、及びヘアピン構造を形成することができる合成DNA配列からなる組換えDNA分子は、ウイルス粒子に包膜されうる組換えゲノムを自律的に生成する固有の能力を持つ。そのようなゲノムとベクター系は遺伝子導入に利用することができる。
【０１３０】
1.3 アデノウイルス5型ゲノムのヌクレオチド3510-35953（すなわち9.7-100マップ単位）（したがってE1タンパク質コード領域、右側ITR及び包膜配列を欠く）と、一本鎖型として存在する時にそのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的であるため、ヘアピン構造を形成することができる末端DNA配列とを含有するDNA分子が911細胞内で複製できることの証明
上記ICLhacベクターゲノム及び類似の最小アデノベクターがヘルパー細胞によってアデノウイルス粒子に包膜されることを可能にするのに必要なアデノウイルス産物を提供することができる複製性DNA分子を開発するために、Ad-CMV-hcTKアデノウイルスベクターを開発した。CMVエンハンサー/プロモーター領域とチミジンキナーゼ遺伝子の間に、アニールしたオリゴヌクレオチド対HP/cla1及び2を挿入する。ベクターAd-CMV-hcTKは、一般的な手法を用いて、911細胞内で増殖させ生産することができる。このベクターはもっぱらトランスフェクションに使用するDNAの供給源として生育され、増殖される。アデノウイルスAd-CMV-hcTKのDNAを、CsCl密度勾配遠心分離を用いて精製したウイルス粒子から一般的な方法で単離する。そのウイルスDNAを制限エンドヌクレアーゼClaIで消化した。消化したDNAを0.7%アガロースゲルでサイズ分画し、その大断片を単離し、さらなる実験に使用する。911細胞の培養物を、標準的なリン酸カルシウム共沈法を用いて、Ad-CMV-hcTK DNAの大ClaI断片でトランスフェクションする。プラスミドpICLhacを用いる先の実験とほとんど同様に、AD-CMV-hcは右側ITRから複製を開始するであろう。1-鎖が置換されると、その断片の左側末端にヘアピン構造が生成しうる。これはDNAポリメラーゼによる鎖の右方向への伸長を促進する。この過程は置換鎖が完全にその二本鎖型に変換されるまで進行するであろう。最後に、右側LTRが再生され、その位置で、正常なアデノウイルス複製の開始と伸長が起こるであろう。ポリメラーゼがヘアピンをリードスルーするため、分子が複写されることに注目のこと。アデノウイルスITR配列を一端に持ち、反対側にヘアピン構造を形成することができるDNA配列を持つ33250bpの投入DNA分子が、両側にITR配列を含有するように複写された。得られるDNA分子は、約66500bpのパリンドローム構造からなるであろう。
【０１３１】
この構造は、トランスフェクションされた細胞から抽出した低分子量DNA中に、サザン分析によって検出することができる。DNA断片のパリンドローム性は、適当な制限エンドヌクレアーゼによるその低分子量DNAの消化と、HSV-TK遺伝子をプローブとするサザンブロット法によって証明することができる。この分子は、トランスフェクションされた細胞中で、その細胞内に存在するアデノウイルス遺伝子産物の効力により、それ自身複製することができる。アデノウイルス遺伝子は、一部、標的細胞ゲノムに組込まれた鋳型から発現され（すなわちE1遺伝子産物）、その他の遺伝子は複製性DNA断片自体に内在する。しかし、この直線状DNA断片はウイルス粒子中に包膜され得ないことに注意すること。それは包膜に必要なDNA配列をすべて欠くばかりでなく、そのサイズも包膜されるには大きすぎるのである。
【０１３２】
1.4 アデノウイルス5型ゲノムのヌクレオチド3503-35953（すなわち9.7-100マップ単位）（したがってE1タンパク質コード領域、右側ITR及び包膜配列を欠く）と、そのDNA分子の同じ鎖のITR以外の部分に相補的であるためヘアピン構造を形成することができる末端DNA配列とを含有するDNA分子が、911細胞中を複製することができ、かつ、pICLI及びpICLhac由来のDNA断片の包膜に必要なヘルパー機能を提供できることの証明
次の一連の実験は、1.1及び1.2節に記述した最小アデノベクターの包膜に、1.3節に記述したDNA分子を使用できることを立証しようとするものである。
【０１３３】
これらの実験では、Ad-CMV-hcTK DNAのエンドヌクレアーゼClaI消化後に単離した大断片を、エンドヌクレアーゼSalI、ヤエナリヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼAsp718で処理したプラスミドpICLhac又は対照として同様に処理したプラスミドpICLhawと共に、911細胞に導入する（1.3節に記載の実験と同様）。48時間後、トランスフェクションされた細胞集団の凍結−融解破砕によってウイルスを単離する。そのウイルス調製物をDNaseIで処理することにより、混入している遊離のDNAを除去する。次に、そのウイルスを用いてRat2線維芽細胞を感染させる。感染の48時間後に、細胞をルシフェラーゼ活性について検定する。pICLhacプラスミドでトランスフェクションされた細胞から単離したウイルスに感染した細胞でのみ、有意なルシフェラーゼ活性が認められ、pICLhawプラスミドでトランスフェクションされた細胞から単離したウイルスに感染した細胞には、有意なルシフェラーゼ活性が認められなかった。感染前にウイルスを熱不活化するとルシフェラーゼ活性が完全になくなり、ルシフェラーゼ遺伝子がウイルス粒子によって導入されることが示される。ウイルスストックによる911細胞の感染は、何の細胞病理学的効果ももたらさなかった。このことは、pICLhacが911細胞で増殖しうる感染性ヘルパーウイルスを伴わずに生産されることを立証している。これらの結果は、ここに提案する方法を使用することにより、アデノウイルス形質転換ヒト細胞又は非アデノウイルス形質転換ヒト細胞で自律的に複製しうる感染性ヘルパーウイルスを完全に欠く最小アデノウイルスベクターのストックを生産できることを証明している。
【０１３４】
本願に記述するシステムの他に、もう1つの最小アデノウイルスベクター作製法がWO94/12649に開示されている。WO94/12649に記載の方法では、最小アデノウイルスベクター（WO94/12649の用語では偽アデノウイルスベクター（Pseudo Adenoviral Vectors；PAV））のパッケージングに、タンパク質IXの機能を利用する。PAVは、左側アデノウイルスITR（包膜に必要な配列を含む）と右側アデノウイルスITRの間に目的の遺伝子を持つ発現プラスミドをクローニングすることにより生産される。PAVは、ヘルパーウイルスの存在下に増殖される。ヘルパーウイルスは（パッケージングシグナル中の突然変異により、又はそのサイズ（37.5kb以上のウイルスゲノムは効率よくパッケージングされない）ゆえに）部分的にパッケージング欠損性であるから、PAVの包膜は、ヘルパーウイルスより優先される。またこの著者らは、タンパク質IX遺伝子の不在下では、PAVが選択的にパッケージングされるであろうと述べている。しかし、これらの機構はいずれも、PAV/最小ベクターのみのパッケージングが可能なほど制限的ではないようである。提案されているパッケージングシグナル中の突然変異はパッケージングを減少させるが、完全に遮断するわけではない。そのパッケージング活性はヘルパーウイルスの増殖に必要とされるからである。ヘルパーウイルスのサイズの増大とタンパク質IX遺伝子の突然変異はいずれも、確実にPAVだけをパッケージングさせることにはならないであろう。したがって、WO94/12649に記載の方法は、最小アデノウイルスベクター/PAVのヘルパー非含有ストックの生産には有効ではないと思われる。
【０１３５】
合成ヘアピンの作成に使用した合成オリゴヌクレオチド対；これをAsp718部位に挿入するとその一端にAsp718部位が再生される：
Claims (6)
- ＥＣＡＣＣに９６０２２９４０で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６細胞である、アデノウイルスのＥ１ＡならびにＥ１Ｂ２１ｋＤａおよびＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子産物をコードし、ｐＩＸ配列を含まない核酸をそのゲノムに含有する細胞。
- さらにアデノウイルスＥ２Ａ遺伝子産物をコードする核酸を含有する請求項１記載の細胞。
- アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子産物が温度感受性１２５突然変異を有する請求項２記載の細胞。
- 目的の遺伝子を含有する組換えアデノウイルスの産生のための請求項１〜３のいずれかに記載の細胞の使用方法。
- ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の細胞、および
ｂ）複製コンピテントアデノウイルスの形成をもたらす相同組換えを可能にする該細胞の核酸との重複配列をもたないＥ１欠損組換えアデノウイルスベクター
を含有するアデノウイルスパッケージングシステム。 - 組換えアデノウイルスの製造方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の細胞に、複製コンピテントアデノウイルスの形成をもたらす相同組換えを可能にする該細胞の核酸との重複配列をもたないＥ１欠損組換えアデノウイルスベクターを与え、
ｂ）該細胞を培養し、および
ｃ）該細胞から生産された組換えアデノウイルスを得る
ことを含む方法。
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