ES2231813T5 - Sistemas de empaquetamiento para adenovirus recombinante humano utilizado en terapia génica - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA METODOS MEJORADOS Y PRODUCTOS BASADOS EN MATERIALES DE ADENOVIRUS QUE PUEDEN UTILIZARSE VENTAJOSAMENTE POR EJEMPLO EN TERAPIA GENICA. EN OTRO PUNTO SE PROPORCIONA UN VECTOR DE ADENOVIRUS QUE NO TIENE SOLAPAMIENTO CON UNA LINEA DE EMPAQUETAMIENTO DE CELULAS ADECUADAS QUE ES OTRO ASPECTO DE LA INVENCION. ESTA COMBINACION EXCLUYE LA POSIBILIDAD DE RECOMBINACION HOMOLOGA, CON LO QUE SE EXCLUYE LA POSIBILIDAD DE FORMACION DE ADENOVIRUS COMPETENTES PARA LA REPLICACION. EN OTRO PUNTO SE PRESENTA UNA CONSTRUCCION COLABORADORA BASADA EN EL ADENOVIRUS QUE POR SUS DIMENSIONES ES IMPOSIBLE DE ENCAPSIDAR. ESTE VIRUS COLABORADOR PUEDE TRANSFERIRSE A OTRA CELULA HUESPED ADECUADA CONVIRTIENDOLA EN UNA CELULA DE EMPAQUETAMIENTO. ADEMAS, SE PRESENTA UNA SERIE DE MUTACIONES UTILES A MATERIALES BASADOS EN ADENOVIRUS Y COMBINACIONES DE DICHAS MUTACIONES, QUE TIENEN TODAS EN COMUN LA SEGURIDAD DE LOS METODOS Y LOS PRODUCTOS, EN PARTICULAR QUE EVITAN LA PRODUCCION DE ADENOVIRUS COMPETENTES PARA LA REPLICACION Y/O LA INTERFERENCIA CON EL SISTEMA INMUNITARIO. ADEMAS, SE PRESENTA UN METODO DE AMPLIFICACION INTRACELULAR.

Description

Sistemas de empaquetamiento para adenovirus recombinante humano utilizado en terapia genica.

5 La invencion se refiere al campo de la tecnologia del ADN recombinante, mas concretamente al campo de la terapia genica. En particular la invencion se refiere a la terapia genica en la que se utilizan materiales derivados de adenovirus, en particular adenovirus recombinante humano. Especialmente se refiere a vectores derivados de virus novedosos y lineas celulares de empaquetamiento novedosas para vectores basados en adenovirus. La terapia genica es un concepto desarrollado recientemente para el cual se pueden y se han ideado una amplia gama de aplicaciones.

15 En la terapia genica se introduce una molecula que porta informacion genetica en algunas o todas las celulas de un huesped, como resultado de lo cual se anade informacion genetica al huesped en un formato funcional. La informacion genetica anadida puede ser un gen o un derivado de un gen, tal como un ADNc, que codifica una proteina. En este caso el formato funcional significa que la proteina puede ser expresada por la maquinaria de la celula huesped. La informacion genetica tambien puede ser una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos (ya sea ADN o ARN) presente en la celula huesped. El formato funcional en este caso consiste en que la molecula de ADN (acido nucleico) anadida o las copias realizadas de la misma in situ sean capaces de emparejar

25 las bases con la secuencia complementaria presente en la celula huesped. Entre las aplicaciones se incluyen el tratamiento de las alteraciones geneticas suplementando una proteina u otra sustancia que, debido a dicha alteracion genetica, no se encuentra presente o al menos esta presente en cantidades insuficientes en el huesped, el tratamiento de tumores y (otras) enfermedades adquiridas tales como las enfermedades (auto)inmunes o infecciones, etc. Como puede resultar evidente a partir de lo anterior, existen basicamente tres enfoques diferentes en terapia genica, uno dirigido a compensar una deficiencia presente en un huesped (mamifero); el segundo dirigido a la separacion o eliminacion de sustancias no deseadas (organismos o celulas) y el tercero a l a aplicacion de una va cuna

35 recombinante (tumores o microorganismos foraneos). Para el proposito de l a terapia genica, se han propuesto como vehiculos adecuados adenovirus que portan deleciones. Los adenovirus son virus con ADN sin envuelta. Los vectores de transferencia genica derivados de adenovirus (denominados vectores virales) tienen numerosos rasgos que los hacen particularmente utiles para la transferencia genica con tales fines. Por ejemplo, la biologia de los adenovirus esta caracterizada con detalle, el adenovirus no esta asociado a patologias humanas graves, el virus es extremadamente eficaz al introducir su ADN en la celula huesped, el virus puede infectar una amplia variedad de celulas y tiene una amplia gama de huespedes, el virus puede ser producido en grandes cantidades con relativa facilidad, y el virus se puede volver de replicacion deficiente mediante deleciones en la region temprana 1 (E1) de genoma viral.

45 El genoma de los adenovirus es una molecula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases con la proteina terminal de 55 kDa unida covalentemente al extremo 5' de cada hebra. El ADN de Ad contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) identicas de aproximadamente 100 pares de bases dependiendo de la longitud exacta del serotipo. Los origenes de replicacion virales estan localizados en las ITR exactamente en los extremos del genoma. La sintesis de ADN se produce en dos fases. Primero, la replicacion se desarrolla mediante desplazamiento de la hebra, generando una molecula duplex hija y una hebra desplazada parental. La hebra desplazada es de hebra sencilla y puede formar un intermedio denominado "panhandle", que permite el inicio de la replicacion y la generacion de una molecula duplex hija. Alternativamente, la replicacion puede desarrollarse desde ambos extremos del genoma simultaneamente, obviando el requerimiento de formar la estructura "panhandle". La

55 replicacion se resume en la Figura 14 adaptada de (Lechner and Kelly, 1977).

Durante el ciclo de infeccion productivo, los genes virales son expresados en dos fases: la fase temprana, que es el periodo hasta la replicacion del ADN viral, y la fase tardia, que coincide con el inicio de la replicacion del ADN viral. Durante la fase temprana solo se expresan los productos genicos tempranos, codificados por las regiones E1, E2, E3 y E4, que portan numerosas funciones que preparan la celula para la sintesis de las proteinas estructurales virales (Berk, 1986). Durante la fase tardia se expresan los productos genicos virales tardios ademas de los productos genicos tempranos y se disparan la sintesis de A DN y de proteinas de la celula huesped. Por consiguiente, la celula se dedica a la produccion de ADN viral y de proteinas estructurales virales (Tooze, 1981).

La region E1 del adenovirus es laprimera region del adenovirus expresada despues de la infeccion de la celula diana. Esta region consta de dos unidades transcripcionales, los genes E1A y E1B, ambos requeridos para la transformacion onco genica de cu ltivos de r oedor pr imarios (embrionarios). Las principales funciones de l os productos genicos E1A son: i) inducir a las celulas quiescentes a entrar en el ciclo celular y reanudar la sintesis de ADN celular, y

ii) activar transcripcionalmente el gen E1B y las otras regiones tempranas (E2, E3, E4). La transfeccion de las celulas primarias con el gen E1A solo puede inducir una proliferacion ilimitada (inmortalizacion), pero no da como resultado una transformacion completa. Sin embargo, la expresion de E1A en la mayoria de los casos da como resultado la induccion d e l a m uerte ce lular programada ( apoptosis), y s olo oc asionalmente s e o btiene l a inmortalizacion (Jochemsen y col., 1987). La co-expresion del gen E1B es requerida para evitar la induccion de la apoptosis y para hacer que se produzca la transformacion morfologica completa. En lineas celulares inmortales establecidas, un elevado nivel de expresion de E1A puede causar la transformacion completa en ausencia de E1B (Roberts y col., 1985).

Las proteinas codificadas por E1B ayudan a E1A a redirigir las funciones celulares para permitir la replicacion viral.

Las proteinas E1B de 55 kD y E4 de 33 kD, que forman un complejo que se localiza esencialmente en el nucleo, funcionan inhibiendo la sintesis de las proteinas del huesped y facilitando la expresion de los genes virales. Su principal i nfluencia consiste en est ablecer un t ransporte se lectivo de ARNm vi rales desd e el nucleo hasta e l citoplasma, simultaneamente al comienzo de la fase tardia de la infeccion. La proteina E1B de 21 kD es importante para corregir el control temporal del ciclo de infeccion productivo, evitando de ese modo la muerte prematura de la celula huesped antes de que el ciclo vital del virus se haya completado. Los virus mutantes incapaces de expresar el producto genico E1B de 21 kD manifiesta un ciclo de infeccion acortado que esta acompanado de una degradacion excesiva del ADN cromosomico de la celula huesped (fenotipo deg) y un efecto citopatico intensificado (fenotipo cyt) (Telling y col., 1994). Los fenotipos deg y cyt son suprimidos cuando ademas el gen E1A es mutado, indicando que estos fenotipos son una funcion de E1A (White y col., 1988). Ademas, la proteina E1B de 21 kDa disminuye la velocidad mediante la cual E1A pone en marcha los otros genes virales. No se sabe todavia a t raves de que mecanismo E1B de 21 kD sofoca estas funciones dependientes de E1A.

Los vectores derivados de adenovirus humanos, en los que al menos la region E1 ha sido suprimida y remplazada por un gen de interes, han sido extensamente utilizados para experimentos de terapia genica en fase pre-clinica y clinica.

Como se ha establecido antes, todos los vectores de adenovirus utilizados en la actualidad en terapia genica tienen una delecion en la region E1, donde se puede introducir informacion genetica novedosa. La delecion de E1 vuelve al virus re combinante de r eplicacion def iciente ( Stratford-Perricaudet a nd P erricaudet, 1991) . Los autores de l a presente invencion han demostrado que los adenovirus recombinantes son capaces transferir eficazmente genes recombinantes al higado de rata y al epitelio de las vias respiratorias de monos rhesus (Bout y col., 1994b; Bout y col., 1994a). Ademas, los autores de la presente invencion (Vincent y col., 1996a; Vincent y col., 1996b) y otros (ver, v.g., Haddada y col., 1993) han observado una transferencia genica mediada por adenovirus in vivo muy eficaz a una variedad de celulas tumorales in vitro y a tumores solidos en modelos animales (tumores de pulmon, glioma) y xenoinjertos humanos en ratones inmunodeficientes (pulmon) in vivo (revisado por Blaese y col., 1995).

En contraste por ejemplo con los retrovirus, los adenovirus a) no se integran en el genoma de la celula huesped; b) son ca paces de i nfectar ce lulas que n o estan e n di vision y c) so n capaces de t ransferir ef icazmente ge nes recombinantes in vivo (Brody and Crystal, 1994). Esos rasgos hacen de los adenovirus atractivos candidatos para la transferencia genica in vivo, por ejemplo, de genes suicidas o citoquinas a celulas tumorales.

No obst ante, un pr oblema asociado c on la t ecnologia de ad enovirus r ecombinante actual es la posibilidad de generacion no dese ada de adenovirus de r eplicacion c ompetente ( ARC) dur ante la pr oduccion de a denovirus recombinante (Lochmuller y col., 1994; Imler y col., 1996). Esta esta causada por la recombinacion homologa entre secuencias solapantes del vector recombinante y los constructos del vector presentes en la linea celular complementadora, tales como las celulas 293 (Graham ycol., 1977). El ARC en los lotes que se van a utilizar en pruebas clinicas no es deseable debido a qu e e l A RC i ) r eplicara de una m anera d escontrolada; i i) p uede complementar los adenovirus recombinantes de replicacion defiente, causando una multiplicacion descontrolada de los adenovirus recombinantes y iii) los lotes que contienen ARC inducen una lesion tisular significativa y por tanto fuertes efectos secundarios patologicos (Lochmuller y col., 1994). Por lo tanto, se debe probar primero que los lotes que van a ser utilizados en pruebas clinicas estan libres de ARC (Ostrove, 1994). En un aspecto de la invencion se resuelve este problema de la produccion de virus ya que los autores de la presenteinvencion han desarrollado celulas de empaquetamiento que no tienen secuencias solapantes con un nuevo vector basico y por tanto son adecuadas para la produccion segura a gran escala de adenovirus recombinantes. Uno de los problemas adicionales asociados con el uso de vectores de adenovirus recombinantes es la reaccion de defensa del huesped frente al tratamiento con adenovirus.

En resumen, los adenovirus recombinantes son sometidos a la delecion de la region E1 (ver arriba). Los productos de E 1 d e a denovirus desencadenan la t ranscripcion d e l os ot ros g enes t empranos (E2, E 3, E4), qu e p or consiguiente activan la expresion de los genes tardios del virus. Por lo tanto, generalmente se pensaba que los vectores con E1 su primida no expresarian ni ngun otro ge n d el adenovirus. N o o bstante, r ecientemente se ha demostrado q ue al gunos tipos de ce lulas so n ca paces de e xpresar gen es de a denovirus en au sencia de l as secuencias de E1. Esto indica, que algunos tipos de celulas poseen la maquinaria para conducir la transcripcion de los genes de adenovirus. En particular, se demostro que tales celulas sintetizan E2A y las proteinas tardias del adenovirus.

En el marco de la terapia genica, esto significa que la transferencia del gen recombinante terapeutico a celulas somaticas no solo produce la expresion de la proteina terapeutica sino que tambien produce la sintesis de proteinas virales. Las celulasque expresanlas proteinas adenovirales son reconocidas y eliminadas por los Linfocitos T Citotoxicos, que de est e modo, a) erradican las celulas transducidas y b) ocasionan inflamaciones (Bout y col., 1994a; Engelhardt y col., 1993; Simon y col. 1993). Como esta reaccion adversa esta impidiendo la terapia genica, se han sugerido numerosas soluciones a este problema, tales como a) utilizacion de agentes inmunosupresores despues del tratamiento; b) conservacion de la region E3 del adenovirus en el vector recombinante (ver la solicitud de patente EP 0.707.071) y c) utilizacion de mutantes ts de adenovirus humanos, que tienen un punto de mutacion en la region E2A (patente WO 94/28938).

No obstante, estas estrategias para salvar la respuesta inmune tienen sus limitaciones.

El uso de los adenovirus recombinantes mutantes ts disminuye la respuesta inmune en cierto grado, pero era menos eficaz al prevenir las respuestas patologicas en los pulmones (Engelhardt y col., 1994a).

La proteina E2A puede inducir una respuesta inmune por si misma y juega un papel fundamental en la puesta en marcha de l a si ntesis de proteinas de adenovirus tardias. P or l o tanto, es atractivo el aborar ade novirus recombinantes que tienen mutaciones en la region E2, haciendolos sensibles ala temperatura (ts), como se ha reivindicado en la solicitud de patente WO 94/28938.

La principal desventaja de este sistema es el hecho de que, aunque la proteina E2 es inestable a la temperatura no permisiva, l a proteina inmunogenica t odavia est a si endo si ntetizada. A demas, es de esp erar que l a pr oteina inestable active la expresion del gen tardio, aunque en un grado bajo. Los adenovirus recombinantes mutantes ts125 han sido sometidos a ensayo, y se ha informado de una expresion genica recombinante prolongada (Yang y col., 1994b; Engelhardt ycol., 1994a; Engelhardt y col., 1994b; Yang ycol., 1995). Sin embargo, la patologia en los pulmones de ratas Cotton todavia era elevada (Engelhardt y col., 1994a), indicando que el uso de los mutantes ts solo produce una mejora parcial de la tecnologia de los adenovirus recombinantes.Otros (Fang y col., 1996) no observaron una expresion genica prolongada en ratones ni en perros utilizando adenovirus recombinantes ts125. Una dificultad adicional asociada con el uso de adenovirus mutantes es que se observa una elevada frecuencia de reversion. Estos revertientes son o bien revertientes reales o bien el resultado de segundas mutaciones en el sitio (Kruijer ycol., 1983; Nicolas y col., 1981). Ambos tipos de revertientes tienen una proteina E2A que funciona a la temperatura normal y por lo tanto tienen una toxicidad similar a la del virus de tipo salvaje.

En otro aspecto de la presente invencion los autores de la presente invencion suprimen por lo tanto las secuencias codificadoras de E2A del genoma del adenovirus recombinante y transfectan estas secuencias E2A a las lineas celulares (de empaquetamiento) que contienen las secuencias E1 para complementar los vectores de adenovirus recombinantes.

Los principales obstaculos de este enfoque son a) que E2A debe ser expresada a niveles muy elevados y b) que la proteina E2A es muy toxica para las celulas.

La presente invencion describe por lo tanto en otro aspecto el uso del gen E2A mutante ts125, que produce una proteina que no es susceptible de unirse a secuencias de ADN a la temperatura no permisible. Se pueden mantener elevados niveles de esta proteina en las celulas (debido a que no es toxica a esta temperatura) hasta que se realiza la puesta en marcha a la temperatura permisiva. Esto se puede combinar colocando el gen E2A mutante bajo la direccion de un pr omotor inducible, t al c omo p or e jemplo el promotor i nducible p or est eroides tet, el de l a metalotioneina, el del receptor 1 de acido retinoico u otros sistemas inducibles. Sin embargo en otro aspecto mas de la invencion, se describe el uso de un promotor inducible para controlar el momento de produccion de E2A salvaje toxica.

Dos notables ventajas adicionales del adenovirus recombinante con E2A suprimido son el incremento de la capacidad para albergar secuencias heterologas y la seleccion permanente de celulas que expresan la E2A mutante. Esta segunda ventaja se refiere a la elevada frecuencia de reversion de la mutacion ts125: cuando se produce la reversion en una linea celular que alberga E2A ts125, esta sera letal para la celula. Por lo tanto, existe una seleccion permanente para aquellas celulas que expresan la proteina E2A mutante ts125. Ademas, como los autores de la presente invencion en un aspecto de la presente invencion generan adenovirus recombinantes con

E2A suprimido, no tendran el problema de la reversion en sus adenovirus.

Ademas los autores de la presente invencion describen la construccion de combinaciones novedosas y mejoradas de lineas ce lulares de empaquetamiento ( novedosas y m ejoradas) y v ectores de ad enovirus r ecombinantes (novedosos y mejorados). Los autores de la presente invencion proporcionan:

1.-Los constructos de empaquetamiento que se van a utilizar para la generacion de lineas celulares de empaquetamiento complementadoras de celulas HER, HEK y HEL sin necesidad de seleccion con genes marcadores. Estas celulas son inmortalizadas mediante la expresion de E1A. Sin embargo, en este caso concreto es esencial la expresion de E1B para evitar la apoptosis inducida por las proteinas E1A. La seleccion de las celulas que expresan E1 se logra mediante la seleccion en cuanto a la formacion de focos (inmortalizacion), como se describe para las celulas293 (Grahamy col., 1977) y las celulas 911 (Fallaux y co l., 1996) , qu e celulas de r inon em brionico humano ( HEK) y r etinoblastos embrionicos humanos (HER) transformados con E1, respectivamente. 2.-Tras la transfeccion de las celulas HER con el constructo pIG.E1A.E1B (Fig. 4), se pudieron establecer siete lineas celulares independientes. Estas lineas celulares fueron denominadas PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 y PER.C9. PER indica PGK-E1-Retinoblastos. Estas lineas celulares expresan las proteinas E1A y E1B, son estables (v.g. PER.C6 durante mas de 57 pases) y complementan los vectores de adenovirus carentes de E1. Los rendimientos de adenovirus recombinante obtenidos en las celulas PER son algo superiores a los obtenidos en las celulas 293. Una de estas lineas celulares (PER.C6) ha sido depositada en la ECACC con el numero 96022940. 3.-Nuevos vectores de adenovirus con deleciones de E1 ampliadas (delecion nt. 459 - 3.510). Esos vectores virales carecen de secuencias homologas a las secuencias de E1 en dichas lineas celulares de empaquetamiento. Estos vectores adenovirales contienen secuencias promotoras pIX y el gen pIX, ya que pIX (de sus secuencias promotoras naturales) solo puede ser expresado a partir del vector y no por las celulas de empaquetamiento (Matsui y col., 1986, Hoeben and Fallaux, pers. Comm: Imler y col., 1996). 4.-Las lineas celulares d e empaquetamiento q ue e xpresan E2A basadas pr eferiblemente e n l ineas celulares establecidas que expresan E1A o celulas diploidesque expresan E1A + E1B (ver en 1). La expresion de E2A o bien esta bajo el control de un promotor inducible o bien el mutante ts125 E2A es dirigido por un promotor inducible o constitutivo. 5.-Vectores de adenovirus recombinantes como se ha descrito antes (ver 3) pero que portan una delecion adicional de las secuencias E2A.

Los vectores utilizados tambien contendran un transgen conectado a una secuencia promotora para dirigir la expresion del transgen.

Los principales problemas asociados con los vectores derivados de adenovirus actuales son:

A) La fuerte inmunogenicidad de la particula de virus. B) La expresion de los genes del adenovirus que reside en los vectores adenovirales, dando como resultado una respuesta de las celulas T citotoxicas frente a las celulas transducidas. C) La baja cantidad de secuencias heterologas que pueden ser acomodadas en los vectores actuales (Hasta aproximadamente un maximo de 8.000 pb de ADN heterologo).

Informacion so bre A ). La f uerte i nmunogenicidad d e l as particulas de ade novirus produce una r espuesta inmunologica del huesped, incluso despues de la administracion del vector adenoviral. Como resultado del desarrollo de los anticuerpos neutralizantes, una posterior administracion del virus sera menos eficaz o incluso completamente ineficaz. Sin embargo, una expresion prolongada o persistente de los genes transferidos reducira el numerode administraciones requeridas y puede evitar el problema.

Informacion sobre B). Los experimentos realizados por Wilson y colaboradores han demostrado que despues de la transferencia genica mediada por adenovirus a animales inmunocompetentes, la expresion del transgen disminuye gradualmente y desaparece aproximadamente 2 - 4 semanas despues de la infeccion (Yang y col., 1994a; Yang y col., 1994b). Esto esta causado por el desarrollo de una respuesta de las Celulas T Citotoxicas (CTL) frente a las celulas transducidas. Las CTL fueron dirigidas contra proteinas de adenovirus expresadas por los vectores virales. En la sintesis por las celulas transducidas de la proteina de union al ADN de adenovirus (el producto del gen E2A), se pudieron establecer proteinas pentonicas y de la fibra (productos genicos tardios). Estas proteinas de adenovirus, codificadas por el vector viral, fueron expresadas a pesar de la delecion de la region E1. Esto demuestra que la delecion de la region E1 no es suficiente para evitar completamente la expresion de los genes virales (Engelhardt y col., 1994a).

Informacion sobre C). Los estudios de Graham y colaboradores han demostrado que los adenovirus son capaces de encapsidar ADN de un tamano de hasta un 105% el del genoma normal (Bett y col., 1993). Los genomas mas grandes tienden a ser inestables dando como resultado la perdida de secuencias de ADN durante la propagacion del virus. Combinando deleciones en las regiones E1 y E3 del genoma viral aumenta el tamano maximo del foraneo que puede ser encapsidado hasta aproximadamente 8,3 kb. Ademas, algunas secuencias de la region E4 parecen ser

innecesarias para el crecimiento del virus (anadiendo o tras 1,8 kb a l a capacidad m axima de en capsidacion). Asimismo la region E2A puede ser suprimida del vector, cuando el producto del gen E2A es proporcionado en trans en la linea celular de encapsidacion, anadiendo otras 1,6 kb. No obstante, es improbable que la capacidad maxima del ADN foraneo puede ser incrementada significativamente mas alla de 12 kb.

Las aplicaciones de las invenciones descritas son esbozadas mas abajo y se ilustraran en la parte experimental, que solo est a destinada a est e fin, y no s e d ebe ut ilizar para r educir el alcance d e l a pr esente i nvencion co mo comprendera una persona experta en la tecnica.

Uso de constructos de empaquetamiento de IG para Celulas diploides

Los constructos, en particular pI G.E1A.E1B, se ut ilizaran par a t ransfectar R etinoblastos Embrionicos Humanos (HER), celulas de Rinon Embrionico Humano (HEK), y celulas de Pulmon Embrionico Humano (HEL). Las celulas transfectadas seran seleccionadas por el fenotipo transformado (formacion de foco) y sometidas a ensayo en cuanto a su ca pacidad par a so portar l a pr opagacion d e ad enovirus recombinantes con E 1 su primida, t al co mo IG.Ad.MLPI.TK. Tales lineas celulares se utilizaran para la generacion y produccion (a gran escala) de adenovirus recombinantes con E1 suprimida. Tales celulas, infectadas con adenovirus recombinante tambien estan destinadas a ser utilizadas in vivo en forma de un productor local de adenovirusrecombinante, v.g. para el tratamiento de tumores solidos.

Las celulas HER transfectadas con pIG.E1A.E1B han dado como resultado 7 clones independientes (celulas denominadas PER). E stos clones se ut ilizan p ara l a pr oduccion de v ectores de ad enovirus con E1 su primida (incluyendo vectores de adenovirus no solapantes) o con E1 defectuosa y proporcionan la base para la introduccion

v.g. de constructos E2B o E2A (v.g. ts125E2A, ver mas abajo), E4, etc., que permitiran la propagacion de vectores de adenovirus que tengan mutaciones v.g. E2A o E4.

Las lineas celulares diploides transformadas, pueden ser utilizadas como base parala generacion de lineas de empaquetamiento de " la si guiente ge neracion", q ue so porten l a pr opagacion de l os aden ovirus recombinantes carentes de E1, que tambien portan deleciones en otros genes, tales como E2A y E4.

Lineas celulares que expresan E2

Se utilizan y se utilizaran celulas de empaquetamiento que expresen secuencias E2A para la generacion y produccion (a gran escala) de adenovirus recombinante con E2A suprimida.

Las lineas celulares de empaquetamiento de adenovirus humano recien generadas o las lineas celulares derivadas de especies permisivas para adenovirus humano (E2A o ts125E2A; E1A + E2A; E1A + E1B + E2A; E1A + E2A/TS125; E1A + E1B + E2A/TS125) son y seran utilizadas para la generacion y produccion (a gran escala) de vectores adenovirus recombinante con E2A suprimida. Ademas, seran aplicadas in vivo para la produccion local del virus recombinante, como se describe para las celulas diploides (ver arriba).

Vectores de adenovirus novedosos

Los vectores de adenovirus recien desarrollados que albergan una delecion de E1 de los nt. 459-3.510 seran utilizados para el proposito de la transferencia genica. Estos vectores tambien son la base para el desarrollo de vectores de adenovirus sometidos a delecion adicionalmente que son mutados v.g. para E2A, E2B o E4.

SECC/ON EXPER/MENTAL

Generaci6n de lineas celulares capaces de complementar en trans los vectores de adenovirus recombinante carentes de E1

1. Linea celular 911

Los autores de la presente invencion generaron una linea celular que alberga las secuencias E1 del adenovirus de tipo 5, susceptible de complementar en trans un adenovirus recombinante con E1 suprimida (Fallaux y col., 1996). Esta linea celular fue obtenida mediantetransfeccion de retinoblastos embrionicos humanos diploides (HER) con pAd5XhoIC, que contiene los nt. 80 -5.788 de Ad5; uno de los transformantes resultantes fue denominado 911. Se ha demostrado que esta linea celular es muy util en la propagacion de adenovirus recombinantes carentes de E1. Se encontro que era superior a las celulas 293. A diferencia de las celulas 293, las celulas 911 carecen de un fenotipo totalmente transformado, que muy probablemente es la causa del mejor funcionamiento como linea de empaquetamiento de adenovirus:

se pueden realizar mas rapido los analisis en placa (4 -5 dias en lugar de 8 - 14 dias en 293),las monocapas de celulas 911 sobreviven mejor bajo una cubierta de agar de lo requerido para los analisis en placa, superior amplificacion de los vectores con E1 suprimida.

Ademas, a diferencia de las celulas 293 que fueron transfectadas con ADN adenoviral sometido a cizalla, las celulas 911 fueron transfectadas utilizando un constructo definido. Las eficacias de transfeccion de las celulas 911 son comparables a las de 293.

Nuevos constructos de empaquetamiento.

Fuente de secuencias de adenovirus.

Las secuencias de adenovirus derivan o bien de pAd5.SalB, conteniendo los nt. 80 -9.460 del adenovirus de tipo 5 humano (Bernards y col., 1983) o bien de ADN de Ad5 de tipo salvaje. PAd5.SalB fue digerido con SalI y XhoI y el fragmento grande fue religado y este nuevo clon fue denominado pAd5.X/S. El constructo pTN (construido por el Dr. R. Vogels, IntroGene, Holanda) fue utilizado como fuente de promotor PGK humano y de gen NEO.

Promotor PGK Humano y gen NEOR.

La t ranscripcion de las secuencias de E 1A en l os nuevos constructos de em paquetamiento es dirigida p or e l promotor PGK humano (Michelson y col., 1983; Singer-Sam y col., 1984), derivado del plasmido pTN (donacion de

R. Vogels), que utiliza pUC119 (Vieira y Messing, 1987) como esqueleto. Este plasmido tambien fue utilizado como una fuente de gen NEO fusionado a la senal de poli-adenilacion del Virus de la Hepatitis B (HBV).

Fusi6n del promotor PGK a los genes E1 (Fig. 1)

Con el fin de remplazar las secuencias de E1 de Ad5 (ITR, origen de replicacion y senal de empaquetamiento) por secuencias heterologas los autores de la presente invencion amplificaron las secuencias E1 (nt. 459 a nt. 960) de Ad5 mediante PCR, utilizando los cebadores Ea1 y Ea2 (ver la Tabla I). El producto de la PCR resultante fue digerido con ClaI y ligado en Bluescript (Stratagene), predigerido con ClaI y EcoRV, dando como resultado el constructo pBS.PCRI. El vector pTN fue digerido con las enzimas de restriccion EcoRI (parcialmente) y ScaI, y el fragmento de ADN que contenia las secuencias promotoras de PGK fue ligado en PBS.PCRI digerido con ScaI y EcoRI. El constructo resultante PBS.PGK.PCRI contiene el promotor PGK humano conectado operativamente a las secuencias E1 de Ad5 desde el nt. 459 al nt. 916.

Construcci6n de pIG.E1A.E1B.X (Fig. 2)

pIG.E1A.E1B.X fue elaborado remplazando el fragmento ScaI-BspEI de pAT-X/S por el correspondiente fragmento de PBS.PGK.PCRI (conteniendo el promotor PGK conectado a las secuencias de E1A). pIG.E1A.E1B.X contiene las secuencias codificadoras de E1A y E1B bajo la direccion del promotor PGK. Como las secuencias Ad5 desde el nt. 459 al nt. 5.788 de Ad5 estan presentes en este constructo, tambien la proteina pIX del adenovirus esta codificada por este plasmido.

Construcci6n de pIG.E1A.NEO (Fig. 3)

Con el fin de introducir el promotor de E1B completo y fusionar este promotor de tal manera que el codon AUG de E1B de 21 kd funcione exactamente como el codon AUG de NEOR, los autores de la presente invencion amplificaron el promotor E1B utilizando los cebadores Ea3 y Ep2, donde el cebador Ep2 introduce un sitio NcoI enel fragmento de la PCR. El fragmento de la PCR resultante, denominado PCRII, fue digerido con HpaI y NcoI y ligado en pAT-X/S, que habia sido predigerido con HpaI y con NcoI. El plasmido resultante fue denominado pAT-X/S-PCR2. El fragmento NcoI-StuI de pTN, que contenia el gen NEO y parte de la senal de poli-adenilacion del Virus de la Hepatitis B (HBV), fue clonado en pAT-X/S-PCR2 (digerido con NcoI y NruI). El constructo resultante: pAT-PCR2-NEO. La s enal de poliadenilacion fue completada remplazando el fragmento ScaI-SalI de pAT-PCR2-NEO por el correspondiente fragmento de pTN (dando como resultado pAT.PCR2-NEO.p(A)). El ScaI-XbaI de pAT.PCR2.NEO.p (A) fue remplazado por el correspondiente fragmento de pIG.E1A.E1B-X, conteniendo el promotor PGK conectado a los genes E1A. El constructo resultante fue denominado pIG.E1A.NEO, y contiene por lo tanto las secuencias E1 de Ad5 (nt. 459 a nt. 1.713) bajo el control del promotor PGK humano.

Construcci6n de pIG.E1A.E1B (Fig. 4)

PIG.E1A.E1B fue elaborado amplificando las secuencias que codificaban los aminoacidos N-terminales de E1B de 55 kd utilizando los cebadores Eb1 y Eb2 (introduce un sitio XhoI). El fragmento de la PCR resultante fue digerido con BglII y clonado en BglII/NruI de pAT-X/S, obteniendose de ese modo pAT-PCR3. PIG.E1A.E1B fue construido introduciendo las secuencias poli(A) de HBV de pIG.E1A.NEO aguas abajo de las secuencias de E1B de pAT-PCR3 mediante intercambio del fragmento XbaI -SalI de pIG.E1A.NEO y el fragmento XbaI XhoI de pAT.PCR3. PIG.E1A.E1B contiene los nt. 459 a nt. 3.510 de Ad5, que codifican las proteinas E1A y E1B. Las secuencias de E1B est an t erminadas en e l ace ptor de empalme en el nt . 3. 511. N o se enc uentran se cuencias pIX en est e constructo.

Construcci6n de pIG.NEO (Fig. 5)

PIG.NEO fue generado clonando el fragmento HpaI -ScaI de pIG.E1A.NEO, conteniendo el gen NEO bajo el control del promotor E1B de Ad5, en pBS digerido con EcoRV y ScaI. Este constructo se utiliza cuando se transfectan celulas establecidas con constructos E1A.E1B y se requiere seleccion NEO. Debido a que la expresion de NEO esta dirigida por el promotor E1B, se espera que las celulas resistentes a NEO expresen simultaneamente E1A, lo que tambien es ventajoso para mantener elevados niveles de expresion de E1A durante el cultivo a largo plazo de las celulas.

Analisis de los constructos.

La integridad de los constructos pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B.X y pIG.E1A.E1B fue evaluada mediante mapeo con enzimas de restriccion; ademas, partes de los constructos que habian sido obtenidos mediante analisis PCR fueron confirmados mediante analisis de la secuencia. No se encontraron cambios en la secuencia de nucleotidos. Los constructos fueron transfectados en celulas BRK (Baby Rat Kidney) primarias y sometidos a ensayo en cuanto a su ca pacidad par a i nmortalizar ( pIG.E1A.NEO) o t ransformar co mpletamente ( pAd5.XhoIC, pI G.E1A.E1B.X y pIG.E1A.E1B) estas celulas. Los rinones de ratas WAG-Rij de 6 di as de edad fueron aislados, homogeneizados ytratados con tripsina. Se transfectaron placas subconfluentes (5 cm de diametro) de los cultivos de celulas BRK con 1 o 5 !g de pIG.NEO, pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B, pIG.E1A.E1B.X, pAd5XhoIC, o con pIG.E1A.NEO junto con PDC26 (Van der Elsen y col., 1983), que portaban el gen Ad5.E1B bajo el control del promotor temprano de SV40. Tres semanas despues de la transfeccion, cuando los focos eran visibles, las placas fueron fijadas, tenidas con Giemsa y sometidas a recuento de los focos. Una vision de conjunto de los constructos de empaquetamiento de adenovirus generados, y de su capacidad para tranformar BRK, se presenta en la Fig. 6. Los resultados indican que los constructos pIG.E1A.E1B y pIG.E1A.E1B.X son capaces de transformar celulas BRK de una manera dependiente de la dosis. La eficacia de la transformacion es similar para ambos constructos y es comparable a la encontrada con el constructo que se utilizaba para elaborar las celulas 911, esto es pAd5.XhoIC. Como se esperaba, pIG.E1A.NEO apenas era capaz de inmortalizar BRK. No obstante, la co-transfeccion de un constructo de expresion de E1B (PDC26) daba como resultado un incremento significativo del numero de transformantes (18 versus 1), indicando que la E1A codificada por pIG.E1A.NEO es funcional. Los autores de l a pr esente i nvencion co ncluyen por l o tanto, que l os co nstructos de em paquetamiento r ecien generados son adecuados para la generacion de nuevas lineas de empaquetamiento de adenovirus.

Generaci6n de lineas celulares con nuevos constructos de empaquetamiento. Lineas celulares y cultivo celular

Se hicieron crecer celulas de carcinoma bronquial A549 humano (Shapiro y col., 1978), retinoblastos embrionicos humanos (HER), celulas de rinon embrionico humano (HEK) transformadas con Ad5-E1 (293; Graham y col., 1977) y celulas HER transformadas con Ad5 (911, Fallaux y col, 1996)) y celulas PER en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con Suero de Ternera Fetal al 10% (FCS) yantibioticos en una atmosfera con el 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo, los reactivos y los sueros fueron adquiridos de Gibco Laboratories (Grand Island, NY). Los plasticos para el cultivo fueron adquiridos de Greiner (Nurtingen, Alemania) y Corning (Corning, NY).

Virus y tecnicas virales

La construccion de los vectores adenovirales IG.Ad.MLP.nls.lacZ, IG.Ad.MLP.luc, IG.Ad.MLP.TK e IG.Ad.CMV.TK se describe con detalle en la solicitud de patente EP 0707071. El vector adenoviralIG.Ad.MLP.nls.lacZ contiene el gen lacZ de E. Coli, que codifica la 1-galactosidasa, bajo el control del promotor tardio principal (MLP) de Ad2. IG.Ad.MLP.luc contiene el gen de la luciferasa de luciernaga dirigido por el MLP de Ad2. Los vectores adenovirales IG.Ad.MLP.TK e IG.Ad.CMV.TK contienen el gen de la timidina quinasa (TK) del Virus Herpes Simplex bajo el control del MLP de A d2 y elintensificador/promotor de Citomegalovirus (CMV), respectivamente.

Transfecciones

Todas las transfecciones se realizaron mediante ADN precipitado con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973) con el GIBCO Calcium Phosphate Transfection System (GIBCO BRL Life Technologies Inc.,Gaithersburg, USA), segun el protocolo de los fabricantes.

Transferencia Western

Se lavaron con PBS cultivos subconfluentes de celulas 293, 911 yA549y PER transformadas con Ad5-E1 que crecian exponencialmente y se rasparon en tampon Fos-RIPA (Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, NP40 al 1%, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1%, NA-DOC al 1%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,5 M, inhibidor de tripsina 0,5 mM, NaF 50 mM y vanadato de sodio 1 mM). Al cabo de 10 minutos a la temperatura ambiente, los

productos lisados fueron aclarados por centrifugacion. Las concentraciones de proteina fueron medidas con el estuche de analisis de proteinas de Biorad, y se cargaron 25 !g de proteina celular total sobre un gel de SDS-PAA al 12,5%. Tras la electroforesis, las proteinas fueron transferidas a nitrocelulosa (1h a 300 mA). Los patrones tenidos previamente (Sigma, USA) se desarrollaron en paralelo. Los filtros fueron bloqueados con seralbumina bovina (BSA) al 1% en TBST (Tris 10 mM, pH 8, NaCl 15 mM, y Tween-20 al 0,05%) durante una hora. Los primeros anticuerpos fueron el anticuerpo A1C6 anti-Ad5-E1B de 55 kDA monoclonal de raton (Zantema y col., no publicado), el anticuerpo C1G11 anti-Ad5-E1B de 221 kDA monoclonal de rata (Zantema y col., 1985). El segundo anticuerpo era un anticuerpo ant i-raton de ca bra m arcado c on per oxidasa d e r abano picante ( Promega). L as senales fueron visualizadas mediante aumento de la quimioluminiscencia (Amersham Corp. UK).

Analisis por transferencia Southern

Se aislo ADN de elevado peso molecular y se digirieron 10 !g por completo y se fraccionaron sobre un gel de agarosa a l 0, 7%. S e r ealizo l a t ransferencia S outhern a H ybond N + ( Amersham, U K) co n u na so lucion d e transferencia de NaOH 0,4 M, NaCl 0,6 M (Church and Gilbert, 1984). La hibridacion se realizo con un fragmento SspI-HindIII de 2.463 nt. De pAd5.SalB (Bernards y col., 1983). Este fragmento consta de los pb. 342-2.805 de pAd5. El fragmento fue radiomarcado con dCTP a-P32con el uso de cebadores hexanucleotidicos al azar y ADN polimerasa de Klenow. Las transferencias Southern fueron expuestas a una pelicula Kodak XAR-5 a -80°C y a una pantalla Phospho-Imager que fue analizada mediante el soporte logico B & L Systems Molecular Dynamics.

A549

Se g eneraron l ineas celulares de ca rcinoma bronquial hum ano A 549 t ransformadas con A d5-E1 m ediante transfeccion con pIG.E1A.NEO y seleccion en cuanto a la resistencia a G418. Se establecieron treinta y un clones resistentes a G418. La co-transfeccion de pIG.E1A.E1B con pIG.NEO rindio siete lineas celulares resistentes a G418.

PER

Se generaron celulas de retina embrionica humana (HER) transformadas con Ad5-E1 mediante transfeccion de celulas HER primarias con el plasmido pIG.E1A.E1B. Las lineas celulares transformadas fueron establecidas a partir de focos bien separados. Los autores de la presente invencion fueron capaces de establecer siete lineas celulares clonales, que denominaron PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 y PER.C9. Uno de los clones PER, a saber PER.C6, ha sido consignado en la ECACC con el numero 96022940.

Expresi6n de los genes E1A y E1B de Ad5 en celulas A459 y PER transformadas

La expresion de las proteinas E1A y E1B de 55 kDa y 21 kDa de Ad5 en las celulas A549 y PER establecidas fue estudiada por medio de transferencia Western, utilizando anticuerpos monoclonales (mAb). El mAb M73 reconoce los productos de E1A, mientras los mAb AIC6 y ClGll estan dirigidos contra las proteinas E1B de 55 kDa yde 21 kDa, respectivamente. Los anticuerpos no reconocian las proteinas en los extractos de las celulas A549 parentales o de las celulas HER primarias (datos no mostrados). Ninguno de los clones de A549 que se generaban por co-transfeccion de pIG.NEO y pIG.E1A.E1B expresaba niveles detectables de las proteinas E1A o E1B (no mostrados). Algunos de los clones de A549 que se generaban por transfeccion con pIG.E1A.NEO expresaban las proteinas E1A de Ad5 (Fig. 7), pero los niveles eran muy inferiores a los detectados en los productos lisados de proteina de las celulas 293. Los niveles de E1A en estado estacionario detectados en los extractos de proteina de las celulas PER eran muy superiores a los detectados enlos extractos de celulas derivadas de A549. Todas las lineas celulares PER expresaban niveles similares de proteinas E1A (Fig. 7). La expresion de las proteinas E1B, concretamente en el caso de E1B de 55 kDa, era mas variable. En comparacion con 911 y 293, la mayoria de los clones de PER expresan elevados niveles de E1B de 55 kDa y de 21 kDa. El nivel en estado estacionario de E1B de 55 kDa en PER-C3 era el mas alto. Ninguno de los clones de PER perdia expresion de los genes E1 de Ad5 tras el paso seriado de las celulas (no mostrado). Los autores de la presente invencion encontraron que el nivel de expresion de E1 en las celulas PER permanecia estable durante al menos 100 duplicaciones de lapoblacion. Los autores de la presenteinvencion decidieron caracterizar los clones de PER con mas detalle.

Analisis Southern de clones de PER

Para estudiar la disposicion de las secuencias que codifican E1 de Ad5 en los clones de PER se realizaron analisis Southern. El ADN celular fue extraido de todos los clones de PER, y de las celulas 293 y 911. El ADN fue digerido con HindIII, que corta una vez en la region E1 de Ad5. La hibridacion de Southern del ADN digerido con HindIII, utilizando una sonda especifica para E1 de Ad5 radiomarcada revelo la presencia de numerosas copias integradas de pI G.E1A.E1B en el g enoma d e l os clones de P ER. La F igura 8 muestra e l pa tron de distribucion de las secuencias de E1 en el ADN de elevado peso molecular de las diferentes lineas celulares PER. Las copias se concentran en una unica banda, lo que sugiere que estan integradas como repeticiones en tandem. En el caso de PER.C3, C5, C6 y C9 los autores de la presente invencion encontraron bandas de hibridacion adicionales de bajo peso molecular que indican la presencia de copias truncadas de pIG.E1A.E1B. El numero de copias fue determinado

utilizando un Phospho-Imager. Los autores de la presente invencion estimaron que PER.C1, C3, C4, C5, C6, C8 y C9 contienen 2, 88, 5,4, 5, 5 y 3 copias de la region codificadora de E1 de Ad5, respectivamente, y que las celulas 911 y 293 contienen 1 y 4 copias de las secuencias E1 de Ad5, respectivamente.

Eficacia de transfecci6n

Se generan adenovectores recombinantes mediante co-transfeccion de plasmidos adaptadores y del fragmento ClaI grande de Ad5 en celulas 293 (ver la solicitud de patente 0707071). El ADN del virus recombinante se forma mediante recombinacion homologa entre las secuencias virales homologas que estan presentes en el plasmido y el ADN de adenovirus. La eficacia de este metodo, asi como la de las estrategias alternativas, depende enormemente de la transfectabilidad de las celulas coadyuvantes. Por lo tanto, los autores de la presente invencion compararon las eficacias de transfeccion de algunos de los clones de PER con celulas 911, utilizando el gen lacZ que codifica a 1galactosidasa de E. Coli como informador (Fig. 9).

Producci6n de adenovirus recombinante

Los rendimientos de adenovirus recombinantes obtenidos tras la inoculacion de 293, 911, PER.C3, PER.C5 y PER.C6 con diferentes vectores de adenovirus se presentan en la Tabla II. Los resultados indican que los rendimientos obtenidos en las celulas PER son al menos tan elevados como los obtenidos en lineas celulares existentes. Ademas, los rendimientos del vector de adenovirus novedoso IG.Ad.MLPI.TK son similares o superiores a los rendimientos obtenidos para otros vectores virales en todas las lineas celulares sometidas a ensayo.

Generaci6n de nuevos vectores de adenovirus (Fig. 10)

Los vectores de adenovirusrecombinantes utilizados (ver la solicitud de patente 0707071) tienen suprimidas las secuencias E1 de 459 al nt. 3.328. Como el constructo pIG.E1A.E1B contiene las secuencia de los nt. 459 a 3.510 de Ad5 existe un solapamiento de la secuencia de 183 nt. Entre las secuencias E1B del constructo de empaquetamiento pIG.E1A.E1B y los adenovirus recombinantes, tales como v.g. IG.Ad.MLP.TK. Las secuencias solapantes son suprimidas de los nuevos vectores de adenovirus. Ademas, las secuencias no codificadoras derivadas de lacZ, que estan presentes en los constructos originales, tambien fueron suprimidas. Esto se logro (ver la Fig. 19) mediante amplificacion por PCR de las secuencias poli(A) de S V40 de pMLP.TK utilizando los cebadores SV40-1 (introduce un si tio BamHI) ySV40-2 (introduce un sitio BglII). Ademas, las secuencias de Ad5 presentes en este constructo fueron amplificadas desde el nt. 2.496 (Ad4, introduce un sitio BglII) a nt. 2.779 (Ad5-2). Ambos fragmentos de PCR fueron digeridos con BglII y ligados. E l p roducto de ligadura f ue amplificado m ediante P CR ut ilizando l os cebadores SV40-1 y A d5-2. E l producto de la PCR obtenido fue cortado con BamHI y AflII y fue ligado en pMLP.TK digerido previamente con las mismas enzimas. El constructo resultante, denominado pMLPI.TK, contiene una delecion en las secuencias E1 del adenovirus desde el nt. 459 al nt. 3.510.

Sistema de empaquetamiento

La combinacion del nuevo constructo de empaquetamiento pIG.E1A.E1B y el adenovirus recombinante pMLPI.TK, que no tienen ningun solapamiento de secuencia, se presenta en la Figura 11. En esta figura, tambien se presenta la situacion original, donde se indica el solapamiento de la secuencia. La ausencia de s ecuencias so lapantes entre pI G.E1A.E1B y pMLPI.TK ( Fig. 11a) e xcluye la p osibilidad d e recombinacion homologa entre el constructo de empaquetamiento y el virus recombinante, y por lo tanto es una mejora significativa para la produccion de adenovirus recombinante en comparacion con la situacion original. En la Fig. 11b se representa la situacion para pIG.E1A.NEO e IG.Ad.MLPI.TK. Se espera que cuando pIG.E1A.NEO es transfectado a celulas establecidas, sea suficiente para soportar la propagacion del adenovirus recombinante con E1 su primida. E sta co mbinacion no t iene ni ngun so lapamiento d e se cuencia, evi tando la generacion de A RC mediante recombinacion homologa. Ademas, este sistema de empaquetamiento conveniente permite la propagacion de a denovirus r ecombinantes que t ienen suprimidas solo l as secuencias E1A y no l as secuencias E1B. Los adenovirus recombinantes que expresan E1B en ausencia de E1A son atractivos,ya que la proteina E1B, en particular E1B de 19 kD, es capaz de evitar la lisis de las celulas humanas infectadas mediante el Factor de Necrosis Tumoral (TNF) (Gooding y col., 1991).

Generaci6n del adenovirus recombinante derivado de pMLPI.TK.

Se genero un adenovirus recombinante mediante co-transfeccion de celulas 293 con ADN de pMLPI.TK linealizado con SalI y ADN wt de Ad5 linealizado con ClaI. El procedimiento se representa esquematicamente en la Fig. 12.

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Tabla I

5 Cebadores utilizados para la amplificacion mediante PCR de fragmentos de ADN utilizados para la generacion de constructos descritos en esta solicitud de patente.

Ea-1 CGTGTAGTGTATTTATACCCG Amplificacion mediante PCR de nt459 de Ad5 -�

10 Ea-2 TCGTCACTGGGTGGAAAGCCA Amplificacion mediante PCR de nt960 �- Ea-3 TACCCGCCGTCCTAAAATGGC nt1284-1304 del genoma de Ad5 Ea-5 TGGACTTGAGCTGTAAACGC nt1514-1533 del genoma de Ad5

Ep-2 GCCTCCATGGAGGTCAGATGT nt1721-1702 de Ad5; Introduccion del sitio NcoI

15 Eb-1 GCTTGAGCCCGAGACATGCT nt3269-3289 del genoma de Ad5 Eb-2 CCCCTCGAGCTCAATCTGTATCTT nt3508-3496 del genoma de Ad5; introduccion del sitio XhoI

SV40-1 GGGGGATCCGAACTTGTTTATTGCAGC Introduccion del sitio BamHI (nt2182-2199 de pMLP.TK) 20 adaptacion de adenovirus recombinantes SV40-2 GGGAGATCTAGACATGATAAGATAC Introduccion del sitio BglII (nt2312-2297 de pMLP.TK)

Ad5-1 GGGAGATCTGTACTGAAATGTGTGGGC Introduccion del sitio BglII (nt2496-2514 de pMLP.TK) Ad5-2 GGAGGCTGCAGTCTCCAACGGCGT nt2779-2756 de PMLP.TK

25 ITR1 GGGGGATCCTCAAATCGTCACTTCCGT nt35737-35757 de Ad5 (introduccion del sitio BamHI) ITR2 GGGGTCTAGACATCATCAATAATATAC nt35935-35919 de Ad5 (introduccion del sitio XbaI)

TABLA II

Celula

Numero de Pases IG.Ad.CMV.lac Z IG.Ad.CMV.T K IG.Ad.MLPI.T K d1313 Media de Produccion

293

6,0 5,8 24 34 17,5

911

8 14 34 180 59,5

PER.C3

17 8 11 44 40 25,8

PER.C5

15 6 17 36 200 64,7

PER.C6

36 10 22 58 320 102

Rendimientos x 10-8 pfu/matraz T175. Tabla II. Rendimientos de diferentes adenovirus recombinantes obtenidos tras la inoculacion de lineas celulares de empaquetamiento de E1 de adenovirus 293, 911, PER.C3, PER.C5 y PER.C6. Los rendimientos son la media de dos experimentos diferentes. IG.Ad.CMV.lacZ e IG.Ad.CMV.TK se describen en la solicitud de patente EP0707071. La construccion de IG.Ad.MLPI.TK se describe en esta solicitud de patente. Los rendimientos de virus por matraz T80 fueron determinados mediante analisis de placas en celulas 911, como se describe (Fallaux y col, 1996).

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una combinacion que consiste en:

   una molecula de acido nucleico recombinante basada en o derivada de adenovirus, teniendo dichamolecula de acido nucleico una senal de encapsidacion funcional y al menos una Repeticion Terminal Invertida funcional o un fragmento funcional o un derivado del mismo, y una celula de empaquetamiento, comprendiendo dicho acido nucleico recombinante y dicha celula de empaquetamiento juntos todos los elementos que son necesarios para generar una particula adenoviral recombinante que comprende dicha molecula de acido nucleico recombinante, caracterizado porque dicha molecula de acido nucleico recombinante no tiene secuencias solapantes quepermitan la recombinacion homologa que conduce a un virus de replicacion competente en dicha celula de empaquetamiento ydonde el genoma de dicha celula de empaquetamiento comprende una secuencia adenoviral consistente en nucleotidos 459-3510 de Ad5, y donde dicha celula es Retinoblasto Embrionico Humano(HER), una celula de Rinon Embrionico Humano (HEK), o una celula de Pulmon Embrionico Humano (HEL).

2. 2.

   Una combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha molecula de acido nucleico es una forma lineal y comprende una Repeticion Terminal Invertida en ambos extremos o cerca de ellos.

3. 3.

   Una combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha molecula de acido nucleico es una forma lineal y de hebra esencialmente sencilla y comprende en el extremo 3' una secuencia complementaria a una porcion corriente arriba de la misma hebra de dicha molecula de acido nucleico, siendo capaz dicha secuencia de emparejar las bases con dicha porcion de manera que sea capaz de funcionar como un sitio de partida para una polimerasa de acido nucleico.

4. 4.

   Una combinacion que comprende una molecula de acido nucleico recombinante resultante de la accion de una polimerasa de acido nucleico sobre una molecula de acido nucleico comprendido por una combinacion segun la reivindicacion 3.

5. 5.

   Una combinacion segun la reivindicacion 4, caracterizado porque dicha molecula de acido nucleico tiene una Repeticion Terminal Invertida en ambos extremos.

6. 6.

   Una combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha celula de empaquetamiento comprende una molecula de acido nucleico con una mutacion de la gama de huesped.

7. 7.

   Una combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha celula de empaquetamiento comprende una molecula de acido nucleico que comprende una region E2 bajo el control de un promotor inducible.

8. 8.

   Una combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha celula de empaquetamiento ha sido proporcionada con una o mas moleculas de acido nucleico de empaquetamiento, que proporcionan a dicha celula la capacidad de expresar productos genicos adenovirales derivados al menos de la region E2A.

9. 9.

   Una combinacion segun la reivindicacion 8, caracterizado porque la molecula de acido nucleico recombinante que codifica la region E2A esta bajo el control de un promotor inducible.

10. 10.

    Una celula de empaquetamiento que alberga un fragmento de ADN de un adenovirus, consistiendo ese fragmento de los nucleotidos 459-3.510 del genoma del Adenovirus 5 humano, donde dicha celula es Retinoblasto EmbrionicoHumano(HER), una celula de Rinon Embrionico Humano (HEK), o una celula de Pulmon Embrionico Humano (HEL).

11. 11.

    Una combinacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde dicha celula de empaquetamiento es una celula diploide.

12. 12.

    Una combinacion segun una c ualquiera de las reivindicaciones 1-9 u 11, donde dicha molecula de acido nucleico recombinante es una molecula de ADN.

13. 13.

    Una combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha molecula de acido nucleico recombinante tiene al menos una delecion de los nucleotidos 459-3510 de la region E1.

14. 14.Uso de una combinacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 u 11-13 para producir un lote de particulas de adenovirus recombinante cuyo lote esta libre de particulas de replicacion competente.

15. 15.

    Una combinacion segun una cualquiera de las reivindicacion 1-3, caracterizado porque dicha molecula de acido nucleico comprende los genesE2A yE2B funcionales o fragmentos funcionaleso derivados de los mismos bajoel control de un promotor independiente de E1A.

16. 16.

    Una celula segun la reivindicacion 10 depositada con el num. 96022940 en la ECACC.

17. 17.

    Una celula de empaquetamiento para empaquetar adenovirus derivados de moleculas de acido nucleico, a cuya celula de empaquetamiento se han proporcionado una o mas moleculas de acido nucleico de empaquetamiento,

    5 dicha una o mas moleculas de acido nucleico de empaquetamiento proporcionando a dicha celula la capacidad de expresar productos genicos adenovirales derivados al menos tanto de la region de E1A como de la de E2A, donde la molecula de acido nucleico de empaquetamiento que codifica la region E2A es mutada de manera que al menos uno de sus productos es sensible a la temperatura, y donde dicha celula es Retinoblasto Embrionico Humano(HER), una celula de Rinon Embrionico Humano (HEK), o una celula de Pulmon Embrionico Humano (HEL).
18. 18. Una combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizada porque dicha celula de empaquetamiento es una celula PER.C6 depositada con el num. 96022940 en la ECACC.

    15 19. Una celula de empaquetamiento caracterizada porque comprende en su genoma una secuencia adenoviral que consiste en nucleotidos 459-3510 del genoma del Adenovirus 5 humano, y donde dicha celula es Retinoblasto EmbrionicoHumano(HER), una celula de Rinon Embrionico Humano (HEK), o una celula de Pulmon Embrionico Humano (HEL).

    15 16 17 18 19 20 21

    Figura �

    Analisis mediante transferencia Western de los clones de A549 transfectados con pIG.E1A.NEO y de los clones de

    Figura �

    Analisis mediante transferencia Southern de las lineas celulares 293, 911 y PER

    Figura 9

    Eficacia de la transfeccion de las celulas PER.C3, PER.C5, PER.C6 y 911. Las celulas fueron cultivadas en placas de 6 pocillos y transfectadas (n�2) con 5 !g de pRSV.lacZ mediante coprecipitacion con fosfato de calcio. Al cabo de 48 horas las celulas se tineron con X-GAL. Se muestra el porcentaje medio de celulas azules.

    Figura 10

    Construccion de pMLPI. TK a partir de pMLP.TK

    25 26 27 28 29 30