KR101711672B1 - 프리즐드 결합 작용제 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

인간 프리즐드 수용체에 결합하는, 항체를 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 신규한 항암제가 제공된다. 또한 항암제의 표적으로서 적합한 인간 프리즐드 수용체 내의 신규한 에피토프가 확인된다. 작용제 또는 항체의 사용 방법, 예컨대 Wnt 신호전달을 억제하고/하거나 종양 성장을 억제하기 위해 작용제 또는 항체를 사용하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

프리즐드 결합 작용제 및 그의 용도 {FRIZZLED―BINDING AGENTS AND USES THEREOF}
본 발명의 분야는 일반적으로 인간 프리즐드 수용체(들)에 결합하는 항체 및 기타 작용제, 뿐만 아니라 질환, 예컨대 암을 치료하기 위한 항체 또는 기타 작용제의 사용 방법에 관한 것이다.
암은 선진국에서의 주요 사망 원인 중 하나로, 미국에서만 년간 1백만 명을 초과하는 사람이 암 진단을 받고 500,000 명이 사망한다. 전체적으로 3 명 중 1 명을 초과하는 사람에게서 일생동안 어떤 형태의 암이 발생할 것으로 예상된다. 200 종을 초과하는 상이한 유형의 암이 존재하지만, 이 중 4 종 - 유방암, 폐암, 결장직장암 및 전립선암 - 이 모든 신규 사례의 절반이 넘는다 (문헌 [Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26]).
Wnt 신호전달 경로는 암 요법의 잠재적 표적으로 확인되었다. Wnt 신호전달 경로는 배아 패턴 형성, 후-배아 조직 유지 및 줄기 세포 생물학의 여러 중요 조절자들 중 하나이다. 보다 구체적으로, Wnt 신호전달은 줄기 세포 집단에 의한 자기 재생을 비롯하여, 세포 극성 및 세포 운명 결정을 생성하는데 중요한 역할을 한다. Wnt 경로의 조절되지 않은 활성화는 수많은 인간 암과 관련이 있으며, 그러한 활성화는 종양 세포의 발생 운명을 변화시켜 이들을 미분화 및 증식 상태로 유지시킬 수 있다. 따라서, 발암은 줄기 세포에 의한 정상적인 발생 및 조직 회복을 조절하는 항상성 메카니즘의 와해에 의해 진행될 수 있다 (문헌 [Reya & Clevers, 2005, Nature 434:843]; [Beachy et al., 2004, Nature 432:324]에서 고찰됨).
Wnt 신호전달 경로는 드로소필라(Drosophila) 발생 돌연변이체 무시 (wg) 및 뮤린 원암유전자 int-1, (현재 Wnt1)에서 처음 밝혀졌다 (문헌 [Nusse & Varmus, 1982, Cell 31:99-109]; [Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell 39:233-40]; [Cabrera et al., 1987, Cell 50:659-63]; [Rijsewijk et al., 1987, Cell 50:649-57]). Wnt 유전자는 분비된 지질-변형된 당단백질을 코딩하며, 19 종이 포유동물에서 확인되었다. 이들 분비된 리간드는 프리즐드 (Fzd) 수용체 패밀리 구성원 및 저밀도 지단백질 (LDL) 수용체 관련 단백질 5 또는 6 (LPR5/6)으로 이루어진 수용체 복합체를 활성화한다. Fzd 수용체는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 7개의 막횡단 도메인 단백질이며, 시스테인 풍부 도메인 (CRD) 또는 Fri 도메인으로 알려진 10개의 보존적 시스테인을 갖는 대형 세포외 N-말단 리간드 결합 도메인을 함유한다. 10 종의 인간 FZD 수용체: FZD1-10이 존재한다. 상이한 Fzd CRD는 특정 Wnt에 대해 상이한 결합 친화도를 가지고 (문헌 [Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem. 277:41762-9]), Fzd 수용체는 이하에서 기재하는 고전적 β-카테닌 경로를 활성화하는 것과 비고전적 경로를 활성화하는 것으로 분류된다 (문헌 [Miller et al., 1999, Oncogene 18:7860-72]). FZD 리간드에 결합하는 수용체 복합체를 형성하기 위해, FZD 수용체는 6개의 YWTD 아미노산 반복부에 의해 분리된 4개의 세포외 EGF-유사 도메인을 갖는 단일 통과 막횡단 단백질인 LRP5/6와 상호작용한다 (문헌 [Johnson et al., 2004, J. Bone Mineral Res. 19:1749]).
수용체 결합시에 활성화되는 고전적 Wnt 신호전달 경로는 Fzd 수용체와 직접 상호작용하는 세포질 단백질 디쉐벨레드(Dishevelled) (Dsh)에 의해 매개되고, β-카테닌의 세포질 안정화 및 축적을 야기한다. Wnt 신호의 부재시에, β-카테닌은 종양 억제 단백질 선종성 폴립증 콜라이 (APC) 및 액신을 포함하는 세포질 파괴 복합체에 국소화된다. 이들 단백질은 글리코겐 신타제 키나제 (GSK)-3β가 β-카테닌에 결합하고 인산화하는 것을 가능하게 하여, 이것을 유비퀴틴/프로테아좀 경로를 통해 분해되도록 표시하는 중요한 스캐폴드로서 기능한다. Dsh의 활성화는 GSK3β의 인산화 및 파괴 복합체의 분해를 야기한다. 이에 따라 축적된 세포질 β-카테닌은 핵으로 이동되어, Tcf/Lef 패밀리의 DNA 결합 단백질과 상호작용하여 전사를 활성화한다.
고전적 신호전달 경로에 더하여, Wnt 리간드는 또한 β-카테닌 비의존적 경로를 활성화한다 (문헌 [Veeman et al., 2003, Dev. Cell 5:367-77]). 비고전적 Wnt 신호전달은 많은 프로세스와 관련이 있지만, 드로소필라 평면 세포 극성 (PCP) 경로와 유사한 메카니즘을 통한 장배 형성 운동에서 가장 유효하게 관련된다. 비고전적 Wnt 신호전달의 다른 잠재적 메카니즘에는 칼슘 유입, JNK, 및 둘 모두의 소형 및 이종삼량체 G-단백질이 포함된다. 길항작용은 종종 고전적 및 비고전적 경로 사이에서 관찰되고, 몇몇 증거는 비고전적 신호전달이 암 형성을 억제할 수 있음을 보여준다 (문헌 [Olson & Gibo, 1998, Exp. Cell Res. 241 :134]; [Topol et al., 2003, J. Cell Biol. 162:899-908]). 이에 따라, 특정 문맥에서, Fzd 수용체는 고전적 Wnt 신호전달 경로의 음성 조절자로서 작용한다. 예를 들어, FZD6은 TAK1-NLK 경로를 통해 FZD1과 공동 발현될 경우 Wnt-3a 유도된 고전적 신호전달을 억제한다 (문헌 [Golan et al., 2004, JBC 279:14879-88]). 유사하게, Fzd2는 Wnt-5a의 존재시에 TAK1-NLK MAPK 캐스케이드를 통해 고전적 Wnt 신호전달에 대해 길항작용을 한다 (문헌 [Ishitani et al., 2003, Mol. Cell. Biol. 23:131-9]).
또한 고전적 Wnt 신호전달 경로는 소장 및 결장에서 줄기 세포 집단을 유지하는데 중추적 역할을 하며, 이 경로의 부적절한 활성화는 결장직장암에서 중요한 역할을 한다 (문헌 [Reya & Clevers, 2005, Nature 434:843]). 장의 흡수 상피는 융모 및 장샘에 배열된다. 줄기 세포는 장샘에 위치하고, 천천히 분열되어 장샘의 외부로 배출되는 모든 분화된 세포 집단을 야기하는 증식성 세포를 급속하게 생성하여 장 융모를 뒤덮는다. Wnt 신호전달 캐스케이드는 장샘 융모 축과 함께 세포 운명을 조절하는데 우세한 역할을 하며, 줄기 세포 집단을 유지하는데 본질적이다. 상동성 재조합에 의한 Tcf7/2의 유전적 손실로 인한 (문헌 [Korinek et al., 1998, Nat. Genet. 19:379]) 또는 강력한 분비된 Wnt 길항제인 Dickkopf-1 (Dkk1)의 과다발현에 의한 (문헌 [Pinto et al., 2003, Genes Dev. 17:1709-13]; [Kuhnert et al., 2004, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 101:266-71]) Wnt 신호전달의 파괴는 장내 줄기 세포 집단을 감소시킨다.
결장직장암은 가장 흔하게 Wnt 신호전달 캐스케이드에서 돌연변이의 활성화에 의해 개시된다. 모든 결장직장암의 대략 5-10％는 가족성 선종성 폴립증 (FAP)인 주요 형태 중 하나로부터 유전되며, 이러한 상염색체 우성 질환에서 감염된 개체의 약 80％가 선종성 폴립증 콜라이 (APC) 유전자 내에 배선 돌연변이를 함유한다. 또한 액신 및 β-카테닌을 비롯한 다른 Wnt 경로 성분에서도 돌연변이가 확인되었다. 개개의 선종은 제2 불활성화된 대립유전자를 함유하는 상피 세포의 클론성 생장이며, 다수의 FAP 선종은 종양유전자 및/또는 종양 억제 유전자에서 추가의 돌연변이를 통해 필연적으로 선암종을 발생시킨다. 또한 APC 및 β-카테닌에서의 기능획득 돌연변이를 비롯한 Wnt 신호전달 경로의 활성화는 마우스 모델에서 과형성성 발생 및 종양 성장을 유도할 수 있다 (문헌 [Oshima et al., 1997, Cancer Res. 57:1644-9]; [Harada et al., 1999, EMBO J. 18:5931-42]).
암에서 Wnt 신호전달의 역할은 뮤린 바이러스의 이웃 삽입에 의해 형질전환된 유방 종양에서 종양유전자로서 Wnt1 (본래 int1)을 확인한 것에 의해 최초로 밝혀졌다 (문헌 [Nusse & Varmus, 1982, Cell 31 :99-109]). 이후 유방암에서 Wnt 신호전달의 역할에 대한 추가의 증거가 축적되었다. 예를 들어, 유선에서의 트랜스제닉 β-카테닌의 과다발현은 증식증 및 선암종을 야기하였고 (문헌 [Imbert et al., 2001, J. Cell Biol. 153:555-68]; [Michaelson & Leder, 2001, Oncogene 20:5093-9]), Wnt 신호전달의 손실은 정상적인 유선 발생을 파괴하였다 (문헌 [Tepera et al., 2003, J. Cell Sci. 116:1137-49]; [Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 8:145-58]). 가장 최근에는 유방 줄기 세포가 Wnt 신호전달에 의해 활성화되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Liu et al., 2004, Proc. Nat'l Acad. Sci. 101:4158]). 인간 유방암에서, β-카테닌 축적은 50％를 초과하는 암종에서 활성화된 Wnt 신호전달과 관련성이 있었고, 특이적 돌연변이가 확인된 바는 없지만, 프리즐드 수용체 발현의 상향조절이 관찰되었다 (문헌 [Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Neoplasia 9:119-31]; [Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol. 25:1337-42]).
FZD10, FZD8, FZD7, FZD4, 및 FZD5는 확인된 10 종의 인간 Wnt 수용체 중 5 종이다. FZD10은 폐에서 Wnt7b와 공동발현되며, 세포 형질감염 연구에 의해 FZD10/LRP5 공동수용체가 Wnt7b에 반응하여 고전적 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 것이 밝혀졌다 (문헌 [Wang et al., 2005, Mol. Cell Biol. 25:5022-30]). FZD10 mRNA는 자궁경부, 위, 및 교모세포종 세포주를 비롯한 많은 암 세포주 및 대략 40％의 원발성 위암, 결장암 및 윤활막 육종을 비롯한 원발성 암에서 상향조절된다 (문헌 [Saitoh et al., 2002, Int. J. Oncol. 20:117-20]; [Terasaki et al., 2002, Int. J. Mol. Med. 9:107-12]; [Nagayama et al., 2005, Oncogene 1-12]). FZD8은 수 종의 인간 암 세포주, 원발성 위암, 및 신장 암종에서 상향조절된다 (문헌 [Saitoh et al., 2001, Int. J. Oncol. 18:991-96]; [Kirikoshi et al., 2001, Int. J. Oncol. 19:111-5]; [Janssens et al., 2004, Tumor Biol. 25:161-71]). FZD7은 위장관을 통해 발현되고, 인간 원발성 위암 6 사례 중 하나에서 상향 조절된다 (문헌 [Kirikoshi et al., 2001, Int. J. Oncol. 19:111-5]). 결장암 세포주에 의한 FZD7 엑토도메인의 발현은 형태상 변화를 유도하고, 이종이식 모델에서 종양 성장을 감소시킨다 (문헌 [Vincan et al., 2005, Differentiation 73:142-53]). FZD5는 난황낭 및 태반 혈관신생에서 본질적인 역학을 하며 (문헌 [Ishikawa et al., 2001, Dev. 128:25-33]), Wnt/β-카테닌 신호전달의 활성화와 관련하여 신장 암종에서 상향조절된다 (문헌 [Janssens et al., 2004, Tumor Biology 25:161-71]). FZD4는 장샘 상피 세포에서 고도로 발현되며, 정상 조직 대 신생물성 조직에서 차등 발현을 나타내는 여러 인자 중 하나이다 (문헌 [Gregorieff et al., 2005, Gastroenterology 129:626-38]). 암 줄기 세포의 마커로서 FZD 수용체의 확인은 이러한 단백질들을 암 치료를 위한 이상적 표적으로 만든다.
본 발명은 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 결합하는 항체 또는 기타 작용제를 비롯한 (그러나 이들로 한정되는 것은 아님), 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체 (FZD)에 결합하는 신규한 작용제 및 그러한 작용제의 사용 방법을 제공한다. 추가로 본 발명은 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 결합하는 항체, 그러한 항체의 단편과 같은 신규한 폴리펩티드 및 그러한 항체와 관련이 있는 기타 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제, 항체, 기타 폴리펩티드, 또는 FZD에 결합하는 작용제는 본 발명자들이 Wnt 신호전달 및/또는 종양 성장 억제를 위한 표적으로서 최초로 확인한, 본원에서 생물학적 결합 부위 (BBS)라 칭하는 FZD 영역에 결합한다. 또한 1종을 초과하는 FZD에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체 및 기타 폴리펩티드를 제공한다. 또한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 추가로 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 또한 신규한 FZD 결합 작용제 또는 항체를 포함하는 조성물 (예를 들어 제약 조성물)을 제공한다. 또한 종양 성장을 억제하고/거나 암을 치료하기 위해 신규한 FZD 결합 작용제 또는 항체를 사용하는 방법과 같은, 신규한 FZD 결합 작용제 또는 항체의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 작용제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 프리즐드 수용체의 생물학적 결합 부위 (BBS)에 리간드 (예를 들어 Wnt)가 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 프리즐드 수용체 내의 생물학적 결합 부위 (BBS)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, BBS에의 작용제의 결합은 Wnt 신호전달 및/또는 종양 성장을 억제한다. 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체는 FZD8이고, 작용제는 (a) 아미노산 72(F), 74-75(PL), 78(I), 92(Y), 121-122(LM), 및 129-132(WPDR (서열 70))에 의해 형성된 FZD8의 입체형 에피토프; (b) 서열 QDEAGLEVHQFWPL (서열 67)로 이루어진 FZD8 영역; 및/또는 (c) 서열 QYGFA (서열 66)로 이루어진 FZD8 영역의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 또는 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택되고, 작용제는 인간 프리즐드 수용체 내의 서열 Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL (서열 24)의 적어도 일부에 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체는 FZD8이고, 작용제는 FZD8 내의 서열 QDEAGLEVHQFWPL (서열 67)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 서열 GLEVHQ (서열 25)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD9, 또는 FZD10이고, 작용제는 QDEAGLEVHQFWPL (서열 67)로 이루어진 FZD8 영역에 상응하는 인간 프리즐드 수용체 영역의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8 내의 서열 (K/Q)(F/Y)GF(Q/A) (서열 69)의 적어도 일부에 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체는 FZD8이고, 작용제는 FZD8 내의 서열 QYGFA (서열 66)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 대안적 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD9, 또는 FZD10이고, 작용제는 QYGFA (서열 66)로 이루어진 FZD8 영역에 상응하는 인간 프리즐드 수용체 영역의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 FZD5 및 FZD8을 포함하는 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (예를 들어, 시험관내 경쟁 결합 검정에서) 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 것에 대해 항체와 경쟁하는 작용제를 제공하며, 상기 항체는 서열 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 12 또는 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 것에 대해 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 것에 대해 경쟁한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 FZD5 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 것에 대해 서열 85를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 작용제를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 작용제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 프리즐드 수용체는: (a) FZD1, 및 FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 프리즐드 수용체; (b) FZD2, 및 FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 프리즐드 수용체; (c) FZD5 및 FZD7; 또는 (d) FZD7 및 FZD8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 3종 이상의 (즉, 3, 4, 또는 5종의) 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하고, 여기서 3종 이상의 인간 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 3종 이상의 인간 수용체는 FZD5 및 FZD8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 3종 이상의 인간 프리즐드 수용체는 추가로 FZD3, FZD4, FZD6, FZD9, 및/또는 FZD10을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및/또는 (c) NFIKYVFAN (서열 3), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 FZD5 및 FZD8을 비롯한 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 (a) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열 4 또는 서열 7의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; (b) EKDNRPSG (서열 5), DKSNRPSG (서열 8), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 5 또는 서열 8의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는 (c) SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 6 또는 서열 9의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 FZD5 및 FZD8을 비롯한 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 2종 이상 (예를 들어 적어도 FZD5 및 FZD8), 3종 이상, 또는 4종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및 NFIKYVFAN (서열 3), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDKLGKKYAS (서열 4), SGDNIGSFYVH (서열 7), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 4 또는 서열 7의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; EKDNRPSG (서열 5), DKSNRPSG (서열 8), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 5 또는 서열 8의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 SSFAGNSLE (서열 6), QSYANTLSL (서열 9), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 6 또는 서열 9의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QSYANTLSL (서열 9)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 10과 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 12 또는 서열 14와 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 10과 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 14와 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체(들)은 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 FZD5 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 작용제, 예컨대 항체를 제공하며, 여기서 항체는 (a) GFTFSSYYIT (서열 77), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; TISYSSSNTYYADSVKG (서열 78), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및 SIVFDY (서열 79), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDALGNRYVY (서열 80), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; SG (서열 81), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 GSWDTRPYPKY (서열 82), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) GFTFSSYYIT (서열 77)를 포함하는 중쇄 CDR1, TISYSSSNTYYADSVKG (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIVFDY (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDALGNRYVY (서열 80)를 포함하는 경쇄 CDR1, SG (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 GSWDTRPYPKY (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 FZD5 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열 85와 약 80％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 86과 약 80％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 인간 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 것에 대해 다음 중 임의의 하나의 IgG 항체: 18R8, 18R5, 18R4605, 및 18R4805와 경쟁하는 작용제를 제공한다.
또 다른 추가의 측면에서, 본 발명은 인간 FZD5 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 것에 대해 항-FZD IgG 항체 44R24와 경쟁하는 작용제를 제공한다.
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드는 항체이다. 특정 대안적 실시양태에서, 작용제는 항체가 아니다.
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 인간 프리즐드 수용체 또는 그것이 결합하는 수용체의 세포외 도메인 (ECD)에 특이적으로 결합한다. 상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 인간 프리즐드 수용체 또는 그것이 결합하는 수용체의 Fri 도메인 (Fri)에 특이적으로 결합한다.
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, 항체 또는 다른 폴리펩티드의 개개의 항원 결합 부위는 1종을 초과하는 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다 (또는 결합할 수 있다).
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 인간 프리즐드 수용체(들)에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 Wnt이다.
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, FZD(들)에 결합하는 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 FZD(들)의 길항제이다.
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 Wnt 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 억제되는 Wnt 신호전달은 고전적 Wnt 신호전달이다. 일부 실시양태에서, FZD 결합 작용제에 의해 억제되는 Wnt 신호전달은 비고전적 Wnt 신호전달이다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달은 비고전적 Wnt 신호전달이다.
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 종양 성장을 억제한다.
추가로 본 발명은 항체 18R8, 18R5, 18R4605, 44R24, 및 18R4805 뿐만 아니라 그의 단편을 제공한다.
추가로 본 발명은 FZD 결합 작용제 또는 항체를 포함하는 조성물, 예컨대 제약 조성물을 제공한다.
FZD 결합 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Wnt 신호전달 (예를 들어 고전적 Wnt 신호전달)을 억제하고/거나 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양을 포함하는 환자에게 FZD 결합 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체의 치료 유료량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 항체를 투여하는 것에 의해 감소된다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제를 투여하는 것은 종양 내 종양형성 세포가 비종양형성 상태로 분화되도록 한다.
또한 대상체의 종양 내 세포가 분화되도록 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에게 FZD 결합 작용제, 폴리펩티드, 또는 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
추가로 대상체에게 FZD 결합 작용제, 폴리펩티드, 또는 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 충실성 종양의 기질을 FZD 결합 작용제, 폴리펩티드, 또는 항체의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 충실성 종양의 기질 내 근섬유모세포 활성화를 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제, 폴리펩티드, 또는 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법은 대상체에게 제2 항암제 (예를 들어 화학요법제)를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 작용제는 겜시타빈, 이리노테칸 또는 파클리탁셀이다. 특정 실시양태에서, 제2 작용제는 혈관신생 억제제 및/또는 노치 신호전달의 억제제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 10-15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한 서열 85-86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 17-22로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 추가로 서열 87-90, 92, 및 94-95로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 추가의 측면에서, 본 발명은 서열 17, 19, 21, 87-90, 92, 및 94-95로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 10, 12, 14, 및 85-86으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 고 엄격성 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 17, 19, 또는 21로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 10, 12, 또는 14를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 고 엄격성 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
상기 언급한 각각의 측면 및 또한 본원에서 기재하는 그밖의 측면의 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체 또는 폴리뉴클레오티드는 단리된 것이다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체 또는 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
추가로 본 발명은 FZD 결합 작용제 (예를 들어 인간 프리즐드 수용체 길항제 및/또는 Wnt 신호전달 억제제) 또는 기타 Wnt 신호전달 억제제에 의한 치료에 반응할 것으로 예상되는 종양 및/또는 환자를 확인하는데 유용한 Wnt 유전자 표지를 제공한다. 또한 Wnt 유전자 표지를 이용하여 FZD 결합 작용제 또는 기타 Wnt 신호전달 억제제로 치료하기 위한 환자를 선택하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 Wnt 유전자 표지에서 1종 이상의 유전자 수준을 평가하는 것을 포함한다. 또한 Wnt 유전자 표지에 의해 확인된 종양에 대한 약물 후보를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한 상기 방법에 유용한 어레이, 키트, 및 기타 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 잠재적인 약물 후보 또는 기타 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 작용제에 노출시킨 제1 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준을 작용제에 노출시키지 않은 제2 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 것을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 제1 충실성 종양을 작용제에 노출시키고 제2 충실성 종양은 작용제에 노출시키지 않는 단계; (b) 제1 및 제2 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준을 평가하는 단계; 및 (c) 제1 및 제2 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준을 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명의 측면 또는 실시양태를 마쿠쉬 그룹 또는 다른 대안적 그룹화의 방법으로 기술한 경우, 본 발명은 전체로서 열거한 전체 그룹 뿐만 아니라, 그룹의 각 구성원을 개별적으로, 그리고 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹 및 또한 하나 이상의 그룹 구성원이 빠진 주요 그룹을 포괄한다. 본 발명은 또한 본 발명의 특허청구범위에서 하나 이상의 임의의 그룹 구성원이 명시적으로 배제된 것도 고려한다.
도 1. 18R8는 다중 인간 프리즐드 수용체에 결합한다. FACS 분석에 의해 18R8이 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포 상의 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8 서열에 결합하는 것으로 밝혀졌다. FACS 플롯은 18R8이 표시한 FZD를 코딩하는 발현 벡터 및 GFP에 대한 발현 벡터로 형질감염된 HEK293 세포에 결합함을 보여준다. 18R8 결합은 공동형질감염된 (GFP 양성) 세포 집단 내에서의 상승된 염색에 의해 나타났다. FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및 FZD8에 대한 FACS 플롯은 18R8에 대한 결합을 나타낸 FZD를 강조하기 위해 굵은 선으로 박스로 표시하였다.
도 2. 항-FZD 항체 18R5는 세포 상의 다중 인간 프리즐드 수용체에 결합한다. FACS 분석에 의해 18R5는 18R8과 유사하게 세포 상의 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8 서열에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 항체 18R8 및 18R5를 표시한 FZD를 과다발현하는 다양한 농도의 HEK293 세포와 인큐베이션하고, 유동세포계수 분석에 의해 항체 결합을 평가하였다. 18R8 및 18R5는 둘 모두 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및 FZD8에 결합하고, 18R5가 더 큰 친화도로 결합하였다.
도 3. 루시페라제에 연결된 8xTCF 프로모터 성분을 안정하게 발현하는 STF293 세포에서 루시페라제 리포터 검정을 수행하였다. 세포를 Wnt3A 뿐만 아니라 다양한 농도의 18R8 및 18R5를 함유하는 조건화 배지로 처리한 다음, 18 시간 후에 이중 글로(Dual-Glo) 루시페라제 검정 리포터 시스템 (프로메가(Promega))을 이용하여 검정하였다. 그 결과 18R8 및 18R5이 둘 모두 Wnt 신호전달을 억제하고, 18R5가 18R8 보다 더 큰 친화도로 결합하는 것이 밝혀졌다.
도 4. 18R8은 다중 Wnt에 의한 TCF 신호전달을 차단한다. 루시페라제에 연결된 8xTCF 프로모터 성분을 안정하게 발현하는 STF293 세포에서 루시페라제 리포터 검정을 수행하였다. HEK293 세포 (ATCC)를 퓨진 6(Fugene 6) (로슈(Roche))을 이용하여 표시한 Wnt 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켜 다양한 Wnt-과다발현 세포를 생성하였다. STF293 세포를 18R8로 처리하고, Wnt 과다발현 HEK293 세포를 첨가하고, 18 시간 후에 이중 글로 루시페라제 검정 리포터 시스템을 이용하여 검정하였다.
도 5. 18R8은 FZD에 대한 Wnt 결합을 직접적으로 차단한다. 8xTCF 프로모터 성분을 안정하게 발현하는 STF293 세포에서 루시페라제 리포터 검정을 수행하였다. Wnt3A 조건화 배지, 정제된 FZD8-Fc, 및/또는 18R8을 함유하는 혼합물을 나타낸 바와 같이 4℃에서 2 시간 동안 단백질 A 세파로스 비드의 존재/부재하에서 공동인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후에, 단백질 A 세파로스 비드를 제거하고, STF293 세포에 첨가하였다. 처리된 STF293 세포를 18 시간 후에 이중 글로 루시페라제 검정 리포터 시스템을 이용하여 검정하였다. 이러한 실험은 18R8의 부재하에서 Fzd8-Fc가 Wnt3A의 신호전달 자극 능력을 억제할 수 있지만, 18R8은 FZD8이 Wnt3A에 결합하는 능력을 차단할 수 있음을 보여주며, 이는 세파로스 A 비드를 사용하여 공동인큐베이션으로부터 FZD8-Fc (및 18R8)를 제거한 경우 신호전달이 복구되는 것에 의해 증명된다.
도 6. 야생형 FZD8과 비교하여 돌연변이체 FZD8에 대한 18R8 결합의 FACS 분석. FZD 상의 18R8의 에피토프를 평가하기 위해, 에피토프 맵핑 연구를 수행하였다. N-말단 플래그 태그를 갖는 인간 FZD8의 Fri 도메인, 및 C-말단 CD4 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 발현할 수 있는 발현 구축물을 GFP를 코딩하는 발현 벡터와 함께 일시적 형질감염 연구에 이용하였다. 또한 다른 특정 FZD의 Fri 도메인 내의 상응하는 위치에 아미노산을 코딩하기 위해 FZD8 서열 내에 선택된 아미노산 치환을 함유하지만 18R8에 의해 결합되지 않는 상기 발현 벡터의 변이체를 준비하였다. 이어서, 18R8이 이러한 변이체 FZD8 서열에 결합하는 능력을 유동세포계수 분석에 의해 평가하였다. FZD8의 아미노산 66-71 및 126-127을 비롯한 특정 위치가 18R8 결합을 위해 요구되는 것으로 확인되었다 (공동형질감염된 (GFP 양성) 세포 집단 내의 염색 감소로 표시됨). 공동형질감염된 세포 집단에 대한 18R8의 결합을 보여주는 FACS 플롯 영역을 박스로 강조표시하고, 두드러지게 감소된 18R8 결합을 보여주는 아미노산 치환에 대해서는 박스에서 굵은 선으로 표시하였다.
도 7. 18R5 및 18R8은 인간 FZD8 상에 유사한 결합 에피토프를 갖는 것으로 밝혀졌다. 18R8의 결합을 방해하기 위해 상기에 나타낸 일련의 아미노산 변이체를 이용하여 유동세포계수 분석에 의해 18R5의 18R8과 유사한 에피토프에 결합하는 능력을 평가하였다. FZD8의 아미노산 66-71 및 126-127을 비롯한 위치는 18R8 및 18R5 둘 모두의 결합을 위해 요구되는 것으로 확인되었다 (공동형질감염된 (GFP 양성) 세포 집단 내의 염색 감소로 표시됨). 공동형질감염된 세포 집단에 대한 18R8의 결합을 보여주는 FACS 플롯 영역을 박스로 강조표시하고, 두드러지게 감소된 18R8 및 18R5 결합을 보여주는 아미노산 치환에 대해서는 박스에서 굵은 선으로 표시하였다.
도 8. 인간 프리즐드 수용체의 Fri 도메인 서열 부분의 아미노산 서열 비교. 보존적 잔기를 갖는 부위를 흑색으로 음영처리하고; 유사한 아미노산 잔기를 갖는 부위를 회색으로 음영처리하였다. 18R8 및 18R5의 FZD 에피토프는 "상부 가장자리" 및 "하부 가장자리"로 밑줄치고 표시하여 나타낸 영역을 함유한다. 용어 "상부 가장자리" 및 "하부 가장자리"는 Fri 도메인 결정 구조의 조사에 기초한 인식을 반영한 것으로, 이들 영역은 FZD 단백질의 표면 상의 틈과 접한다. 이러한 틈은 다중의 매우 보존적 잔기를 함유한다. 이러한 틈을 포함하는 아미노산을 얼라인먼트 내의 각각의 상응하는 위치 위에 역삼각형 기호로 강조표시하였다. 이러한 영역은 종전에는 특정 기능에 기여하는 것으로 생각되지 않았다. 이러한 영역에 결합하는 항체의 발견 및 이들 항체가 Wnt 결합 및 Wnt 신호전달을 억제한다는 발견, 뿐만 아니라 본 발명자들의 이러한 틈의 보존적 속성의 인식은 본 발명자들로 하여금 이러한 영역이 FZD 단백질의 핵심 기능적 측면임을 확인할 수 있게 하였다.
도 9. FZD의 생물학적 결합 부위 (BBS). Fzd fri 도메인의 구조 영상을 나타낸다. 영상은 종전에 보고된 마우스 FZD8의 결정 구조의 분석에 기초한 것으로 (문헌 [Dann CE et al., Nature 412 (6842) 86-90, 2001]), 소프트웨어 프로그램 피몰(Pymol)을 이용하여 분석하였다. 상부 좌측의 영상은 본 발명자들이 발견한 생물학적 결합 부위 (BBS) (백색 타원형으로 동그라미표시함)을 포함하는 Fzd 단백질 영역을 갖는 FZD Fri 도메인의 표면도이다. 이것은 항체 18R8 및 18R5에 의해 결합되는 영역이다. 이 영역은 본 발명자들이 "상부 가장자리", "하부 가장자리" 및 "틈"이라고 명명한 구조 요소를 함유한다. 이들 각각을 패널 하부에 개별 영상으로 보다 짙은 표면색으로 강조표시하였다. 상부 우측 영상은 10 개의 인간 Fzd 패밀리 구성원의 9 개 또는 10 개의 보존된 잔기를 보다 짙은색의 표면으로 강조표시한 것으로, 이러한 구분되는 잔기 그룹은 Fzd 기능을 억제하는 항체가 결합하는 에피토프와 접하는 "틈" 영역의 중심 내에 존재한다는 인식을 강조하였다.
도 10. 항-FZD mAb에 의한 Wnt 의존적 종양 성장의 방지. NOD/SCID 마우스에 50,000개의 MMTV WNT1 종양 유래 세포를 주사하고, 성장이 검출될 때까지 매주 종양 성장을 모니터링하여, 주 2회 종양 성장을 측정하였다. 확립된 종양을 갖는 10 마리의 마우스에 18R8 또는 대조군으로서 대조군 항체를 처리하였다. 18R8로 처리한 동물에서의 종양 성장은 대조군 항체로 처리한 동물에서 관찰되는 것과 비교하여 사실상 제거되었다.
도 11. 18R5 및 이리노테칸의 조합물 처리에 의한 OMP-C28 이종이식 종양 성장의 감소. NOD/SCID 마우스에 10,000개의 OMP-C28 결장 종양 세포를 주사하고, 24 일째에 평균 종양 부피가 129 mm3인 마우스를 무작위화하고, 나타낸 처리를 개시하였다. 종양 성장을 매주 모니터링하였다. 18R5로 처리한 동물에서 종양 성장이 현저하게 감소되었다. 또한 18R5 및 이리노테칸의 조합물은 어느 하나의 작용제를 단독 처리한 것에 비해 현저하게 감소시켰다.
도 12. 18R5 및 겜시타빈의 조합물 처리에 의한 OMP-PN4 이종이식 종양 성장의 감소. NOD/SCID 마우스에 50,000개의 OMP-PN4 췌장 종양 세포를 주사하고, 38 일째에 평균 종양 부피가 약 120 mm3인 마우스를 무작위화하고, 이틀 후 나타낸 처리를 개시하였다. 18R5 및 겜시타빈의 조합물로 처리한 동물에서 종양 성장이 겜시타빈을 단독 처리한 것에 비해 현저하게 감소되었다.
도 13. VH 및 VL 서열을 포함하는 18R8 및 18R5에 대한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열.
도 14. 18R8 및 18R5의 중쇄 및 VH 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 15. 18R8 및 18R5의 경쇄 및 VL 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 16. FZD7 ECD Fc 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 17. 인간 FZD1 (서열 26), FZD1의 세포외 도메인 (ECD) (서열 27, 서열 26의 밑줄친 아미노산 1-321을 나타냄), 및 FZD1의 Fri 도메인 (서열 28)의 아미노산 서열.
도 18. 인간 FZD2 (서열 30), FZD2의 세포외 도메인 (ECD) (서열 31, 서열 30의 밑줄친 아미노산 1-250을 나타냄), 및 FZD2의 Fri 도메인 (서열 32)의 아미노산 서열.
도 19. 인간 FZD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 20. 인간 FZD2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 21. 인간 FZD3 (서열 34), FZD3의 세포외 도메인 (ECD) (서열 35, 서열 34의 밑줄친 아미노산 1-204를 나타냄), 및 FZD3의 Fri 도메인 (서열 36)의 아미노산 서열.
도 22. 인간 FZD4 (서열 38), FZD4의 세포외 도메인 (ECD) (서열 39, 서열 38의 밑줄친 아미노산 1-224를 나타냄), 및 FZD4의 Fri 도메인 (서열 40)의 아미노산 서열.
도 23. 인간 FZD3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 24. 인간 FZD4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 25. 인간 FZD5 (서열 42), FZD5의 세포외 도메인 (ECD) (서열 43, 서열 42의 밑줄친 아미노산 1-233을 나타냄), 및 FZD5의 Fri 도메인 (서열 44)의 아미노산 서열.
도 26. 인간 FZD6 (서열 46), FZD6의 세포외 도메인 (ECD) (서열 47, 서열 46의 밑줄친 아미노산 1-207을 나타냄), 및 FZD6의 Fri 도메인 (서열 48)의 아미노산 서열.
도 27. 인간 FZD5를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 28. 인간 FZD6을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 29. 인간 FZD7 (서열 50), FZD7의 세포외 도메인 (ECD) (서열 51, 서열 50의 밑줄친 아미노산 1-255를 나타냄), 및 FZD7의 Fri 도메인 (서열 52)의 아미노산 서열.
도 30. 인간 FZD8 (서열 54), FZD8의 세포외 도메인 (ECD) (서열 55, 서열 54의 밑줄친 아미노산 1-277을 나타냄), 및 FZD8의 Fri 도메인 (서열 56)의 아미노산 서열.
도 31. 인간 FZD7을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 32. 인간 FZD8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 33. 인간 FZD9 (서열 58), FZD9의 세포외 도메인 (ECD) (서열 59, 서열 58의 밑줄친 아미노산 1-230을 나타냄), 및 FZD9의 Fri 도메인(서열 60)의 아미노산 서열.
도 34. 인간 FZD10 (서열 62), FZD10의 세포외 도메인 (ECD) (서열 63, 서열 62의 밑줄친 아미노산 1-227을 나타냄), 및 FZD10의 Fri 도메인 (서열 64)의 아미노산 서열.
도 35. 인간 FZD9를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 36. 인간 FZD10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 37. 18R5 항체 및 파클리탁셀의 조합물 처리에 의한 PE-13 유방 종양 성장의 감소. NOD/SCID 마우스에 10,000개의 PE-13 유방 종양 세포를 주사하고, 22 일째에 평균 종양 부피가 약 120 mm3인 마우스를 무작위화하였다. 이어서, 마우스를 대조군 항체 ("대조군 Ab"), 18R5 항체 ("항-FZD"), 파클리탁셀 ("탁솔"), 또는 18R5 항체 플러스 파클리탁셀의 조합물 ("항-FZD+탁솔")로 처리하였다. 18R5 항체를 파클리탁셀과 함께 처리하는 것에 의해 항종양 활성이 야기되었다.
도 38. 18R5 항체 플러스 파클리탁셀의 조합물로 처리한 개개의 동물에서의 유방 종양 성장. 18R5 항체를 파클리탁셀과 함께 처리하는 것에 의해 확립된 유방 종양이 퇴보되었다.
도 39. 대조군 항체, 18R5 항체, 이리노테칸, 또는 18R5 항체 및 이리노테칸 둘 모두로 처리한 이후의 결장직장 종양 세포의 유동세포계수법.
도 40. 41 일 동안 대조군 항체 ("대조군"), 18R5 항체 ("항-FZD"), 겜시타빈 ("겜시타빈"), 또는 18R5 플러스 겜시타빈의 조합물 ("조합물")로 처리한 마우스로부터 수득한 30, 90, 270, 또는 810 개의 종양 세포를 이식한 이후의 마우스에서의 종양 성장.
도 41. 대조군 항체 ("대조군 Ab"), 18R5 항체 단독 ("항-FZD"), 겜시타빈 단독 ("겜시타빈"), 또는 18R5 항체 및 겜시타빈의 조합물 ("조합물")로 처리한 이후의 제한 희석 분석에 의해 판단된 PN-4 췌장 종양에서의 종양 줄기 세포 (CSC) 빈도.
도 42. 대조군 항체 ("LZ-1"), 18R5 항체 단독 ("18R5"), 겜시타빈 단독 ("Gem"), 또는 겜시타빈 및 18R5의 조합물 ("콤보")로 처리한 췌장 종양 세포에서의 크로마토그램 유전자 발현.
도 43. 항-FZD 항체 18R5에 의한 처리는 종양 세포를 비증식성 점액 세포로 분화되도록 촉진한다. NOD/SCID 마우스에 50,000개의 OMP-PN13 췌장 종양 세포를 주사하고, 23 일째에 평균 종양 부피가 약 107 mm3인 마우스를 무작위화하고, 4 일 후에 대조군 항체 또는 18R5에 의한 처리를 개시하였다. 20 일 후, 종양을 수집하고 절편화하였다. 18R5 처리된 마우스 또는 대조군 항체로 처리된 마우스로부터의 종양 절편을 알시안 블루 염색으로 염색하여 점액 세포임을 확인하고, ki67에 대한 항체에 의한 면역조직화학에 의해 증식성 세포임을 확인하였다. 예시적인 점액 세포 및 증식성 세포를 화살표로 강조표시하였다.
도 44. 항-FZD 항체 18R5, 그의 단독 및 탁솔® (파클리탁셀)과의 조합물은 둘 모두 OMP-LU24 이종이식 종양 성장을 억제하였다. OMP-LU24 인간 폐 종양을 보유하는 마우스를 대조군 항체 ("대조군 Ab"), 항-FZD 18R5 ("18R5"), 탁솔® ("탁솔") 또는 18R5 플러스 탁솔®의 조합물 ("18R5+탁솔")로 처리하였다.
도 45. 항-FZD 항체 18R5, 그의 단독 및 아바스틴® (베바시주맙)과의 조합물은 OMP-LU33 이종이식 종양 성장을 억제하였다. OMP-LU33 인간 폐 종양을 보유하는 마우스를 대조군 항체 (사각형), 아바스틴® (삼각형), 항-FZD 18R5 (역삼각형), 또는 18R5 플러스 아바스틴®의 조합물 (원형)로 처리하였다.
도 46. 항-FZD 항체 18R5와 헤르셉틴® (트라스투주맙)의 조합물은 T3 이종이식 종양 성장의 성장을 억제하였다. T3 인간 유방 종양을 보유하는 마우스를 대조군 항체 (사각형), 항-FZD 18R5 (삼각형), 헤르셉틴® (흑색 원형), 또는 18R5 플러스 헤르셉틴®의 조합물 (개방형 원형)로 처리하였다.
도 47. 18R5 및 44R24 Fzd 결합 프로파일. FZD1, 2, 5, 7 및 8에 대한 각각의 mAb의 결합을 나타내는 용량 반응 곡선.
도 48. 18R5 및 44R24에 의한 STF 세포에서의 Wnt3a 유도된 리포터 활성의 억제 (용량 반응 곡선).
도 49. 18R5 및 44R24에 의한 액신2 유전자 발현의 기저 수준의 억제.
도 50. 18R5 및 44R24 처리된 OMP-PN13 종양에서의 Muc16의 IHC 검출.
도 51. 18R5 처리된 췌장 종양에서의 평활근 액틴의 억제. a. 마이크로어레이에 의해 검출된 ACTA2 유전자 발현 수준. b. 대조군 mAb (상부 패널) 및 18R5 (하부 패널) 처리된 OMP-PN4 종양 상에서의 SMA 검출.
도 52. 18R5 유도된 Muc16+ OMP-PN13 세포의 종양형성성 시험. a. Muc16에 대해 염색된 린(lin)-고갈된 OMP-PN13 종양 세포의 FACS 플롯. 2 가지로 구분되는 집단을 원으로 표시하였다. b. Muc16- (상부 패널) 및 Muc16+ (하부 패널) 세포 주사 결과의 종양의 대표도. c. 종양 성장 곡선.
도 53. PE13 유방 종양 이종이식에서의 항-FZD mAb 18R5에 의한 종양 재발의 억제.
도 54. 항-FZD mAb18R5에 의한 유방암 줄기 세포 빈도의 감소.
도 55. PN4 췌장 종양 이종이식에서의 항-FZD mAb 18R5에 의한 종양 재발의 억제.
도 56. PN4 췌장 종양 이종이식에서의 항-FZD mAb 44R24 및 겜시타빈의 조합물에 의한 종양 성장의 억제.
도 57. 야생형 FZD8과 비교하여 돌연변이체 FZD8에 대한 항-FZD mAb 44R24 결합의 FACS 분석. 공동형질감염된 세포 집단에 대한 44R24의 결합을 나타낸 FACS 플롯 영역을 박스로 강조표시하였다. 두드러지게 감소된 44R24 결합을 나타내는 아미노산 치환에 대한 박스를 화살표로 표시하였다.
도 58. C28 결장 종양 이종이식에서의 항-FZD 항체 44R24 및 18R5의 항종양 활성.
도 59. 항-FZD 항체 44R24 또는 18R5로 처리된 C28 결장 종양 이종이식에서의 사이토케라틴 7 발현의 유도.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체(FZD)에 결합하는 폴리펩티드, 예컨대 항체 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아님)를 비롯한 신규한 작용제를 제공한다. 관련 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, FZD 결합 작용제를 포함하는 조성물, 및 FZD 결합 작용제를 제조하는 방법을 또한 제공한다. 신규한 FZD 결합 작용제를 사용하는 방법, 예컨대 종양 성장을 억제하는 방법 및/또는 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 부분적으로 FZD-결합, 항암제에 대한 적합한 표적인 인간 프리즐드 수용체 내의 영역의 확인을 기초로 한다. 2 종의 항-FZD 항체, 18R8 및 18R5가 FZD7에 특이적으로 결합하지만, 또한 FZD1, FZD2, FZD5, 및 FZD8과도 상호작용하는 것이 확인되었다 (하기 실시예 1 및 2). 18R8 항체를 이용한 시험관내 실험에 의해 항체가 Wnt 신호전달을 억제할 수 있고 (하기 실시예 3), FZD8에 대한 Wnt 리간드의 결합을 억제할 수 있는 것 (하기 실시예 4)으로 나타났다. 또한 세포-기반 검정에서 18R5 항체는 Wnt 신호전달을 억제할 수 있는 것 (하기 실시예 3 및 20)으로 밝혀졌다. 18R5 항체를 이용한 생체내 실험에 의해 항체가 종양 성장 또는 재발을 억제할 수 있는 것 (하기 실시예 7, 17, 및 23)으로 밝혀졌다. 또한 본 발명자들은 항-FZD 항체 18R5가 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킬 수 있으며 (하기 실시예 8 및 23), 암 세포의 분화를 유도하고/하거나 암 세포의 종양형성성을 감소시킬 수 있음 (하기 실시예 16, 21, 22, 및 25)을 밝혀내었다. 이들 활성 18R8 및 18R5 항체를 이용한 에피토프 맵핑 실험에서 상기 항체는 둘 모두 FZD8 내의 서열 GLEVHQ (서열 25)의 적어도 일부 및 서열 YGFA (서열 74)의 적어도 일부에 결합하는 것으로 나타났다 (하기 실시예 5). 이러한 2종의 항체의 밝혀진 생물학적 활성에 비추어 마우스 프리즐드 8 (문헌 [Dann et al., Nature, 412: 86-90 (2001)])의 결정 구조를 분석하였고, 종전에는 임의의 특정 기능이 있는 것으로 생각되지 않았던 이들 서열을 포함하는 프리즐드 단백질의 세포외 영역이 FZD 생물학 및 Wnt 신호전달에서 중요한 기능적 역할을 한다는 것을 최초로 확인하였다 (실시예 6). 생물학적 결합 부위 (BBS)로 지정된 이러한 인간 프리즐드 수용체 영역은 항암 요법을 위한 표적으로 적합하다.
또한 제3 항체, 44R24가 인간 FZD5 및 FZD8에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다 (하기 실시예 19). 또한 이 항체는 세포 기반 검정에서 Wnt 신호전달을 억제할 수 있고 (하기 실시예 20), 생체내에서 항종양 효능이 있는 것 (하기 실시예 23 및 25)으로 밝혀졌다. 항-FZD 항체 18R8 및 18R5에 의한 치료와 유사하게, 44R24에 의한 종양의 치료는 종양에서 분화 마커 수준을 증가시켰다 (하기 실시예 25). 또한 에피토프 맵핑은 항-FZD 항체 44R24의 에피토프가 항-FZD 항체 18R8 및 18R5의 에피토프와 중첩되는 것을 보여주었다. 보다 구체적으로, 44R24는 BBS 내의 YGFA (서열 74) 영역의 적어도 일부에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (하기 실시예 24).
I. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 수많은 용어 및 어구를 하기에서 정의한다.
용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내의 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 조합을 인식하고 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체 (2 이상의 무손상 항체로부터 생성됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여 이뮤노글로불린의 5 가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 하위클래스 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 다른 클래스의 이뮤노글로불린은 서로 상이하며, 서브유닛 구조 및 3차원 배열이 널리 공지되어 있다. 항체는 네이키드(naked) 상태이거나 또는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성동위원소 등에 접합될 수 있다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 다중특이적 항체 (항체 단편으로부터 형성됨)가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
"모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도의 특이적인 인식 및 결합과 관련이 있는 동종 항체 집단을 나타낸다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 둘 모두 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 또한 "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 임의의 수의 방식으로 제조된 그러한 항체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 특정 이뮤노글로불린 사슬, 키메라 이뮤노글로불린, 또는 최소한의 비인간 (예를 들어 뮤린) 서열을 함유하는 그의 단편인 비인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린이다 (문헌 [Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525]; [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327]; [Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536]). 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종으로부터의 항체의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체를 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비인간 잔기 내에서 추가의 잔기 치환에 의해 추가로 변형시켜, 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선 및 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 이뮤노글로불린에 상응하는 CDR 영역을 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 하나 이상, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이나, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 그것이다. 인간화 항체는 또한 적어도 일부의 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호에 기재되어 있다.
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 제조된 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 무손상 또는 전장 항체, 그의 단편 및/또는 1개 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들어 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 서열이 2 이상의 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 한 종의 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 한편, 불변 영역은 또 다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이어서 그 종에서 면역 반응을 일으키는 것을 방지한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 근접 아미노산 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬 배치된 비근접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 근접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시에 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시에 손실된다. 에피토프는 전형적으로 3개 이상, 보다 일반적으로 적어도 5 또는 8-10개의 아미노산을 독특한 공간적 배열로 포함한다.
에피토프 또는 단백질에 "특이적으로 결합하는" 항체는 항체가 관련되지 않은 단백질을 비롯한 다른 물질에 비해 에피토프 또는 단백질과 보다 빈번하게, 보다 빠르게, 보다 오래, 보다 높은 친화도로, 또는 상기한 것의 일부의 조합으로 반응하거나 회합되는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합하는" 이란, 예를 들어 항체가 단백질에 약 0.1 mM 이하, 보다 통상적으로 약 1 μM 이하의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합하는" 이란, 항체가 단백질에 때로는 적어도 약 0.1 μM 이하, 다른 때에는 적어도 약 0.01 μM 이하의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종에서 상동 단백질 사이의 서열 동일성으로 인해, 특이적 결합은 하나를 초과하는 종에서 프리즐드 수용체와 같은 특정 단백질을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 이와 마찬가지로, 수용체의 폴리펩티드 서열의 특정 영역에서 상이한 FZD 수용체 (예를 들어, FZD5 및 FZD8) 사이의 상동성으로 인해, 특이적 결합은 하나를 초과하는 프리즐드 수용체를 인식하는 항체 (또는 다른 폴리펩티드 또는 작용제)를 포함할 수 있다. 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 모이어티는 제2 표적에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이에 따라, "특이적 결합"은 독점적인 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있으나) 반드시 필요로 하지는 않는다. 따라서, 항체는 특정 실시양태에서 하나를 초과하는 표적 (예를 들어, 인간 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 다중 표적이 항체 상의 동일한 항원 결합 부위에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 특정한 경우에 2개의 동일한 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 이들은 각각 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체 (예를 들어, 인간 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8)에 특이적으로 결합한다. 특정 대안적 실시양태에서, 항체는 이중특이적일 수 있고, 특이성이 상이한 2 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 비제한적인 예로, 이중특이적 항체는 하나의 프리즐드 수용체, 예컨대 인간 FZD5 상의 에피토프를 인식하는 하나의 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 또한 추가로 제2 프리즐드 수용체, 예컨대 인간 FZD8 상의 상이한 에피토프를 인식하는 제2의 상이한 항원 결합 부위를 포함한다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이 "단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연계에서 발견되지 않는 형태이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 더이상 자연계에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한"은 물질이 50％ 이상 순수한 (즉, 오염물이 없는), 보다 바람직하게는 90％ 이상 순수한, 보다 바람직하게는 95％ 이상 순수한, 보다 바람직하게는 98％ 이상 순수한, 보다 바람직하게는 99％ 이상 순수한 것을 지칭한다.
용어 "암" 및 "암성"은 세포의 집단이 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 등이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 특정한 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 여러 유형의 두경부암이 포함된다.
"종양" 및 "신생물"은 양성 (비암성) 또는 악성 (암성) (전암성 병소를 포함)의 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인해 초래된 임의의 조직 덩어리를 나타낸다.
용어 "암 줄기 세포", "종양 줄기 세포" 또는 "충실성 종양 줄기 세포"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, (1) 대규모의 증식 능력을 갖고; (2) 비대칭적 세포 분열을 하여 증식 또는 발생 잠재력이 감소된 하나 이상의 분화된 자손 유형을 생성할 수 있고; (3) 자기 재생 또는 자기 유지를 위한 대칭적 세포 분열을 할 수 있는 충실성 종양으로부터의 세포의 집단을 지칭한다. "암 줄기 세포", "종양 줄기 세포" 또는 "충실성 종양 줄기 세포"의 이러한 특성은 상기 암 줄기 세포에, 종양 형성에 실패한 대부분의 종양 세포에 비해 면역손상된 마우스로의 일련의 이식시에 감지할 수 있는 종양을 형성하는 능력을 부여한다. 암 줄기 세포는 카오틱 방식으로 자기 재생 대 분화를 거쳐 돌연변이가 발생하는 시간에 따라 변화할 수 있는 비정상적인 세포 유형을 갖는 종양을 형성한다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문리상 등가물은 대규모의 종양 세포 집단을 포함하는 비종양형성 세포 및 종양형성 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 모두를 비롯하여, 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 총 세포의 집단을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 세포"는 종양 세포를 암 줄기 세포와 구분되게 하는 재생 및 분화능이 결여된 종양 세포만을 지칭하는 경우 "비종양형성"이라는 용어로 변형될 것이다.
용어 "종양형성"은 자기 재생 특성 (추가의 종양형성 암 줄기 세포를 발생시킴) 및 충실성 종양 줄기 세포가 종양을 형성하도록 모든 다른 종양 세포를 생성하는 증식 특성 (분화되어 비종양형성 종양 세포를 생성함)을 비롯한, 충실성 종양 줄기 세포의 기능적 특성을 지칭한다. 자기 재생 특성 및 모든 다른 종양 세포를 생성하는 증식 특성은 암 줄기 세포에 일련의 이식시에 종양을 형성할 수 없는 비종양형성 종양 세포에 비해 면역손상된 마우스에 일련의 이식시에 감지가능한 종양을 형성할 수 있는 능력을 부여한다. 비종양형성 종양 세포는 충실성 종양으로부터 종양 세포를 수득한 후 면역손상된 마우스에의 원발성 이식시에 종양을 형성할 수 있지만, 비종양형성 종양 세포는 일련의 이식시에 종양을 발생시키지 않음이 관찰되었다.
용어 "대상체"는 인간, 비인간 영장류, 설치류 등을 비롯한 (그러나 이들로 한정되는 것은 아닌) 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭하고, 이들은 특정 치료의 수용자가 된다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 인간 대상체에 대해 교환가능하게 사용된다.
"제약상 허용되는 염"은 제약상 허용되고, 모 화합물의 목적하는 약리 활성을 갖는 화합물의 염을 지칭한다.
"제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 아주반트"는 하나 이상의 본 개시물의 항체와 함께 대상체에게 투여될 수 있고, 그의 약리 활성을 파괴하지 않으며, 치료량의 화합물을 전달하기에 충분한 용량으로 투여되는 경우 비독성인 부형제, 담체 또는 아주반트를 지칭한다.
"제약상 허용되는 비히클"은 본 개시물의 하나 이상의 항체와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
용어 "치료 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 소분자, 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있거나; 주변 기관으로의 암 세포 침윤, 예를 들어 연조직 및 골 내로의 암의 확산을 억제 또는 중지시킬 수 있거나; 종양 전이를 억제 및 중지시킬 수 있거나; 종양 성장을 억제 및 중지시킬 수 있거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있거나; 이환률(morbidity) 및 사망률(mortality)을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선시킬 수 있거나; 종양의 종양형성성, 종양형성 빈도 또는 종양형성 능력을 감소시킬 수 있거나; 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킬 수 있거나; 종양형성 세포를 비종양형성 세포로 분화시킬 수 있거나; 또는 이들의 조합 효과를 나타낼 수 있다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지하고/거나 기존의 암 세포를 사멸시키는 범위까지, 이를 세포증식 억제성 및/또는 세포독성이라 칭할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한"과 같은 용어는 1) 진단된 병적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 지연시키고/거나, 증상을 경감시키고/거나 진행을 중단시키는 치료적 수단 및 2) 표적화된 병적 상태 또는 장애의 발생을 방지하고/하거나 지연시키는 예방 또는 방지적 수단을 둘 모두 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 대상에는 이미 장애를 앓고 있는 대상; 장애를 갖기 쉬운 대상; 및 장애를 예방해야 하는 대상이 포함된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 환자가 다음 중 하나 이상을 보일 경우 본 발명의 방법에 따라 암이 성공적으로 "치료"된다: 암 세포의 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 주변 기관으로의 암 세포 침윤, 예를 들어 연조직 및 골 내로의 암의 확산의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 완화; 감소된 이환률 및 사망률; 삶의 질 개선; 종양의 종양형성성, 종양형성 빈도 또는 종양형성 능력의 감소; 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소; 종양형성 세포의 비종양형성 세포로의 분화; 또는 이들 효과들의 몇몇 조합.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 실시될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지 성분과의 접합에 의해서와 같이 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 또 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡(cap)", 1개 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 결합이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한 당에 본래 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 치환되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 형성하기 위해 활성화되거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 포스포릴화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수도 있다. 또한 다른 히드록실도 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, .알파.-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비시클릭 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 비롯한, 당업계에 일반적으로 알려져 있는 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 대체 연결기에 의해 치환될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기에는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 실시양태가 포함되지만 이것으로 한정되는 것은 아니며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르(-O-) 연결을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
항체의 "가변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄 가변 영역 또는 항체 중쇄 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 또한 초가변 영역으로 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR에 의해 함께 매우 가까이 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 적어도 2가지의 CDR 결정 기술이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (문헌 [Al-lazikani et al., (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948])). 또한 이들 두 접근법이 함께 당업계에서 CDR 결정에 사용되기도 한다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 응축제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 프로듀서 세포가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개입될 수 있다. 또한 이 용어는 천연적으로, 또는 개재, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 이러한 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함) 뿐만 아니라, 당업계에 알려져 있는 기타 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기초로 하기 때문에, 특정 실시양태에서 폴리펩티드가 단일 쇄 또는 회합 쇄로 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 백분률 "동일성"은, 최대한의 상응을 위해 (필요하다면 갭을 도입하여) 비교하고 정렬한 경우에 동일하거나 명시적인 백분률의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다 (서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환은 고려하지 않음). 백분률 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여 또는 육안 검사에 의해 측정할 수 있다. 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당업계에 공지되어 있고, 이들은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하는데 사용될 수 있다. 서열 정렬 알고리즘의 한가지 그러한 비제한적 예가 문헌 [Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268]에 기재되어 있는 알고리즘, 문헌 [Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877]에서 변형된 것이고, NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (문헌 [Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402])이 포함된다. 특정 실시양태에서, 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재되어 있는 갭드(Gapped) BLAST를 사용할 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2 (문헌 [Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480]), ALIGN, ALIGN-2 (제넨테크(Genentech), 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재) 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR)은 서열을 정렬하는데 사용할 수 있는 추가의 공중이 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 특정 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 백분률 동일성은 GCG 소프트웨어의 GAP 프로그램을 이용하여 판단한다 (예를 들어, NWSgapdna.CMP 행렬 및 갭 중량 40, 50, 60, 70, 또는 90 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용함). 특정 대안적 실시양태에서, 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch)의 알고리즘 (문헌 [J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)])을 포함하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 2종의 아미노산 서열 간의 백분률 동일성을 판단할 수 있다 (예를 들어 블로숨(Blossum) 62 행렬 또는 PAM250 행렬, 및 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5를 이용함). 별법적으로, 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 백분률 동일성은 마이어스(Myers) 및 밀러(Miller)의 알고리즘 (문헌 [CABIOS, 4:11-17 (1989)])을 이용하여 판단한다. 예를 들어, 백분률 동일성은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)을 이용하고, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4의 잔기 테이블을 갖는 PAM120을 이용하여 판단할 수 있다. 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대의 정렬을 위한 적절한 파라미터는 당업자가 판단할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다. 특정 실시양태에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 백분률 동일성 "X"는 100 x (Y/Z)로 계산되며, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬 (육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 개수이고, Z는 제2 서열에서의 잔기의 총 개수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 길다면, 제2 서열에 대한 제1 서열의 백분률 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 백분률 동일성보다 길 것이다.
비제한적인 예로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드가 참조 서열에 대해 특정 백분률 서열 동일성 (예를 들어 적어도 80％ 동일성, 적어도 85％ 동일성, 적어도 90％ 동일성, 및 일부 실시양태에서, 적어도 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성)을 갖는지 여부는, 특정 실시양태에서 베스트핏(Bestfit) 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스(Unix)용 버젼 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크 소재)을 사용하여 판단할 수 있다. 베스트핏은 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여 두 서열 간의 최고의 상동성 세그먼트를 찾는다. 특정 서열이 예를 들어 본 발명에 따른 참조 서열과 95％ 동일한지 여부를 결정하기 위해서 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라미터는, 동일성 백분률이 참조 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 참조 서열 내 뉴클레오티드의 총 수의 5％ 이하의 상동성 차이가 허용되도록 설정된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 2종의 핵산 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일하며, 이는 이들이 최대한의 상응을 위해 비교하고 정렬하여 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 또는 육안 검사에 의해 측정하였을때 적어도 70％, 적어도 75％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 85％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 및 일부 실시양태에서는 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가짐을 의미한다. 바람직하게는, 동일성은 적어도 약 10, 바람직하게는 약 20, 보다 바람직하게는 약 40-60 잔기 길이 또는 그 사이의 임의의 정수값의 서열 영역에 걸쳐, 바람직하게는 60-80 잔기 보다 긴 영역에 걸쳐, 보다 바람직하게는 적어도 약 90-100 잔기에서 존재하며, 가장 바람직하게는 서열은 에를 들어 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 같은 비교하는 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 규정되어 있고, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 포함된다. 예를 들어, 티로신에 대한 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체 서열에서 보존적 치환은 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체가, 항원(들), 즉 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않는다. 항원 결합능이 소실되지 않은 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993)]; [Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)]; 및 [Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)] 참조).
본 개시물 및 청구항에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
실시양태가 본원에서 용어 "포함하는"으로 기재되는 어떠한 경우에든, 다르게는 "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"의 용어가 기재된 유사한 실시양태가 또한 제공된다는 점을 이해한다.
"A 및/또는 B"과 같이 본원의 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A," 및 "B"를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같이 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 각각의 실시양태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
"고 엄격성 조건"은 다음에 의해 확인될 수 있다: (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 고온, 예를 들어 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 50℃에서 이용하는 것; (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 함유하는 50％ (v/v) 포름아미드를 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨과 함께 42℃에서 이용하는 것; 또는 (3) 50％ 포름아미드, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 42℃에서 이용하고, 42℃에서 0.2xSSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에서, 55℃에서 50％ 포름아미드 중에서 세척한 다음, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어진 고 엄격성 세척을 이용하는 것.
II. FZD 결합 작용제
본 발명은 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체 (FZD)에 특이적으로 결합하는 작용제를 제공한다. 이러한 작용제를 본원에서는 "FZD 결합 작용제"라 지칭한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종의 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 작용제에 의해 결합되는 인간 프리즐드 수용체 또는 수용체는 FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, 및 FZD10으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체는 FZD7을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체는 FZD5 및/또는 FZD8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8에 특이적으로 결합한다. FZD1-10에 대한 전장 아미노산 (aa) 및 뉴클레오티드 (nt) 서열은 당업계에 공지되어 있고, 또한 본원에서 서열 26 (FZD1 aa), 서열 30 (FZD2 aa), 서열 34 (FZD3 aa), 서열 38 (FZD4 aa), 서열 42 (FZD5 aa), 서열 46 (FZD6 aa), 서열 50 (FZD7 aa), 서열 54 (FZD8 aa), 서열 58 (FZD9 aa), 서열 62 (FZD10 aa), 서열 29 (FZD1 nt), 서열 33 (FZD2 nt), 서열 37 (FZD3 nt), 서열 41 (FZD4 nt), 서열 45 (FZD5 nt), 서열 49 (FZD6 nt), 서열 53 (FZD7 nt), 서열 57 (FZD8 nt), 서열 61 (FZD9 nt), 및 서열 65 (FZD10 nt)으로 제공한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 기재하는 항체 또는 기타 폴리펩티드 또는 작용제는 FZD7에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 그러한 항체, 폴리펩티드, 또는 작용제는 추가로 1종 이상의 부가적인 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 그와 교차반응할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 기재하는 항체 또는 기타 폴리펩티드 또는 작용제는 FZD5에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 그러한 항체, 폴리펩티드, 또는 작용제는 추가로 1종 이상의 부가적인 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 그와 교차반응할 수 있다.
특정 실시양태에서, 작용제는 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체는 FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 프리즐드 수용체는 FZD1을 포함하고, 제2 프리즐드 수용체는 FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 프리즐드 수용체는 FZD2를 포함하고, 제2 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 프리즐드 수용체는 FZD5를 포함하고, 제2 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 프리즐드 수용체는 FZD5 및 FZD8을 둘 모두 포함한다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 프리즐드 수용체는 FZD7을 포함하고, 제2 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD5, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 작용제는 3종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 3종 이상의 인간 프리즐드 수용체는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 프리즐드 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 추가로 1종 이상의 부가적인 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 그것이 결합하는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체 내의 세포외 도메인 (ECD)에 특이적으로 결합한다. 각각의 인간 프리즐드 수용체의 세포외 도메인의 서열은 당업계에 공지되어 있고, 또한 서열 27 (FZD1 ECD), 서열 31 (FZD2 ECD), 서열 35 (FZD3 ECD), 서열 39 (FZD4 ECD), 서열 43 (FZD5 ECD), 서열 47 (FZD6 ECD), 서열 51 (FZD7 ECD), 서열 55 (FZD8 ECD), 서열 59 (FZD9 ECD), 및 서열 63 (FZD10 ECD)으로 제공한다.
특정 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 그것이 결합하는 인간 프리즐드 수용체(들) 내의 Fri 도메인 (FRI) (또한 시스테인 풍부 도메인(CRD)로도 공지됨)에 특이적으로 결합한다. 각각의 인간 프리즐드 수용체의 Fri 도메인의 서열은 당업계에 공지되어 있고, 또한 서열 28 (FZD1 FRI), 서열 32 (FZD2 FRI), 서열 36 (FZD3 FRI), 서열 40 (FZD4 FRI), 서열 44 (FZD5 FRI), 서열 48 (FZD6 FRI), 서열 52 (FZD7 FRI), 서열 56 (FZD8 FRI), 서열 60 (FZD9 FRI), 및 서열 64 (FZD10 FRI)로 제공한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 기재하는 FZD-결합 항체 또는 폴리펩티드의 개개의 항원 결합 부위는 1, 2, 3, 4, 또는 5종 (또는 그 이상)의 인간 프리즐드 수용체에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, FZD 결합 항체 또는 폴리펩티드의 개개의 항원 결합 부위는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5종의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드의 개개의 결합 부위는 적어도 FZD5 및 FZD8에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 1종 이상 (예를 들어 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종 이상)의 인간 프리즐드 수용체에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에서 기재하는 1종을 초과하는 FZD에 결합하는 FZD 결합 작용제 또는 항체는 그러한 FZD에 약 100 nM 이하, 약 20 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 각각 1종 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5종)의 다음과 같은 FZD에 약 40 nM 이하의 해리 상수로 결합한다: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 각각 1종 이상의 다음과 같은 FZD에 약 10 nM 이하의 해리 상수로 결합한다: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 각각 다음과 같은 FZD에 약 10 nM 이하의 해리 상수로 결합한다: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8. 특정 실시양태에서, 특정 FZD에 대한 작용제 또는 항체의 해리 상수는 비아코어(Biacore) 칩에 고정된 FZD 세포외 도메인 또는 Fri 도메인을 포함하는 FZD-Fc 융합 단백질을 이용하여 판단한 해리 상수이다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 1종 이상 (예를 들어, 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종 이상)의 인간 프리즐드 수용체에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 1 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에서 기재하는 1종을 초과하는 FZD에 결합하는 FZD 결합 작용제 또는 항체는 이들 FZD에 대하여 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하의 EC50을 갖는다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 1종 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5종)의 다음과 같은 FZD에 대해 약 20 nM 이하의 EC50을 갖는다: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 1종 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5종)의 다음과 같은 FZD에 대해 약 10 nM 이하의 EC50을 갖는다: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 FZD5 및/또는 FZD8의 결합에 대해 약 40 nM 이하 또는 20 nM 이하의 EC50을 갖는다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 (예를 들어 항체)는 서열 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 12 또는 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (예를 들어 18R5 또는 18R8 IgG 항체)의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 그와 중첩되는 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 서열 11의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 13 또는 서열 15의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 그와 중첩되는 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 서열 85를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (예를 들어 44R24 IgG 항체)의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 그와 중첩되는 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 경쟁 결합 검정에서 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 것에 대해 항체와 경쟁하며, 여기서 항체는 서열 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 12 또는 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 것에 대해 서열 11의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 13 또는 서열 15의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 것에 대해 작용제와 경쟁하는 항체는 18R5 IgG 항체이다. 특정 대안적 실시양태에서, 항체는 18R8 IgG 항체이다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 경쟁 결합 검정에서 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 것에 대해 항체와 경쟁하며, 여기서 항체는 서열 85를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체는 본 발명자들에 의해 생물학적 결합 부위 (BBS)로 지정된 인간 프리즐드 수용체의 영역의 적어도 일부에 결합한다 (도 9, 실시예 6). 인간 FZD8 (서열 54)에서, BBS는 다음으로 이루어진다: (a) 아미노산 72(F), 74-75(PL), 78(I), 92(Y), 121-122(LM), 및 129-132(WPDR (서열 70))으로 이루어진 입체형 에피토프 (도 8 및 9에 나타낸 BBS의 "틈"); (b) 서열 GLEVHQ (서열 25)로 이루어진 FZD8 영역 (도 8 및 9에 나타낸 BBS의 "상부 가장자리"); 및 (c) 서열 YGFA (서열 74)로 이루어진 FZD8 영역 (도 8 및 9에 나타낸 BBS의 "하부 가장자리"). FZD1-7, FZD9, 및 FZD10에서 상응하는 BBS 잔기는 하기 표 1 및 도 8에서 확인된다. 특정 실시양태에서, 리간드 (예를 들어 Wnt)가 FZD에 결합하는 것을 차단하는 작용제는 리간드가 BBS에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, BBS의 적어도 일부에 결합하는 작용제는 또한 인간 프리즐드 수용체 상의 하나를 초과하는 다른 (즉 BBS 이외의) 영역에도 결합할 수 있음을 이해한다. 다시 말하면, 특정 실시양태에서 FZD 결합 작용제 또는 항체가 결합하는 에피토프는 BBS와 중첩되는 FZD 수용체의 세포외 도메인 내의 영역이지만, 그것이 전적으로 BBS 내에만 함유되어 있는 것은 아니다. 특정 대안적 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체가 결합하는 에피토프는 전적으로 BBS 내에 함유된다 (즉 BBS는 FZD 결합 항체 또는 다른 작용제가 결합하는 전체 에피토프를 포함한다).
Figure 112011030538926-pct00001
이론에 얽매이지 않고, BBS는 Wnt에 대한 결합 부위와 같은 가능한 리간드 결합 부위를 포함하는 것으로 여겨진다. FZD8 상에서, 이러한 가능한 리간드 결합 부위는 아미노산 72(F), 74-75(PL), 78(I), 92(Y), 121-122(LM), 및 129-132(WPDR (서열 70)) (도 8 및 9에 나타낸 BBS의 "틈")에 의해 형성된 입체형 에피토프를 포함한다. FZD1-7, FZD9, 및 FZD10 상의 가능한 리간드 결합 부위의 상응하는 잔기를 도 8의 정렬된 서열에 나타낸다. 특정 실시양태에서, 리간드 (예를 들어 Wnt)가 BBS에 결합하는 것을 차단하는 작용제는 리간드가 이러한 입체형 에피토프에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, 이러한 리간드 결합 부위의 적어도 일부에 결합하는 작용제는 또한 인간 프리즐드 수용체 상의 다른 (예를 들어 BBS 이외의) 영역에도 결합할 수 있음을 이해한다. 특정 대안적 실시양태에서, 작용제는 입체형 에피토프 이외의 임의의 FZD 부분에는 결합하지 않는다.
특정 실시양태에서, 작용제는 인간 프리즐드 수용체가 FZD8인 경우 인간 프리즐드 수용체 내의 서열 QDEAGLEVHQFWPL (서열 67)의 적어도 일부에 결합하고, 또는 인간 프리즐드 수용체가 FZD1-7, FZD9, 또는 FZD10인 경우 상응하는 서열에 결합한다. FZD 상의 이러한 영역은 도 8 및 9에서 확인되는 BBS의 "상부 가장자리"를 포함한다. 다양한 프리즐드 수용체에서 FZD8의 에피토프 QDEAGLEVHQFWPL (서열 67)에 상응하는 서열이 하기 표 2에서 확인되고, 또한 도 8에 정렬한 것으로부터 분명하다. 특정 실시양태에서, 작용제는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하고, 작용제는 인간 프리즐드 수용체 내의 서열 Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL (서열 24)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 프리즐드 수용체(들) FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8 내의 서열 AGLEVHQF (서열 68)의 적어도 일부에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 FZD8 내의 서열 AGLEVHQF (서열 68)에 상응하는 FZD3, FZD4, FZD6, FZD9, 및/또는 FZD10 내의 서열의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 프리즐드 수용체(들) FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8 내의 서열 GLEVHQ (서열 25)의 적어도 일부에 특이적으로 결합한다. 이러한 서열은 도 9에 나타낸 BBS의 "상부 가장자리"이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 FZD8 내의 서열 GLEVHQ (서열 25)에 상응하는 FZD3, FZD4, FZD6, FZD9, 및/또는 FZD10 내의 서열의 적어도 일부에 결합한다. FZD8의 서열 GLEVHQ (서열 25)에 상응하는 서열을 하기 표 2의 제2 및 제3 행에 밑줄로 표시하였고, 이는 도 8에서의 서열 정렬로부터 분명하다. 특정 실시양태에서, FZD8 내의 서열 67 또는 68의 적어도 일부 또는 다른 FZD 내의 상응하는 에피토프에 결합하는 작용제는 리간드 (예를 들어 Wnt)가 FZD (예를 들어 FZD의 BBS)에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, 상기에 나타낸 영역에 결합하는 작용제는 또한 인간 프리즐드 수용체 상의 다른 부가적인 영역 (즉 상기 명시된 영역 이외)에 결합할 수 있다.
Figure 112011030538926-pct00002
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 인간 프리즐드 수용체가 FZD8인 경우 서열 QYGFA (서열 66)로 이루어진 영역 (이는 BBS의 "하부 가장자리"를 포함함)의 적어도 일부에 결합하거나, 또는 인간 프리즐드 수용체가 FZD1-7, FZD9, 또는 FZD10인 경우 상응하는 서열에 결합한다. 다양한 프리즐드 수용체 내의 영역 QYGFA (서열 66)에 상응하는 서열은 도 8 및 상기 표 2에서 확인된다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 인간 프리즐드 수용체가 FZD8인 경우 서열 YGFA (서열 74)로 이루어진 영역, BBS의 "하부 가장자리"의 적어도 일부에 결합하거나, 또는 인간 프리즐드 수용체가 FZD1-7, FZD9, 또는 FZD10인 경우 상응하는 서열에 결합한다. 다양한 프리즐드 수용체 내의 영역 YGFA (서열 74)에 상응하는 서열은 도 8에서 확인되고, 상기 표 2의 제4 행에 밑줄로 표시하였다. 특정 실시양태에서, FZD8 내의 서열 66 또는 서열 74의 적어도 일부, 또는 다른 FZD 내의 상응하는 서열에 결합하는 작용제는 리간드 (예를 들어 Wnt)가 FZD (예를 들어 FZD의 BBS)에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, 이러한 영역에 결합하는 작용제는 또한 인간 프리즐드 수용체 상의 다른 (즉 이러한 영역 이외의) 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 BBS의 "상부 가장자리"를 형성하는 영역의 적어도 일부 뿐만 아니라 BBS의 "하부 가장자리"를 형성하는 영역의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8 내의 Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL (서열 24), FZD8 내의 QDEAGLEVHQFWPL (서열 67), FZD8 내의 AGLEVHQF (서열 68), 및/또는 FZD8 내의 GLEVHQ (서열 25), 및/또는 다른 인간 프리즐드 수용체에서 임의의 이러한 서열에 상응하는 서열 (상기 표 2에서 규정된 것)의 적어도 일부에 결합하는 FZD 결합 작용제는 추가로 FZD8 내의 QYGFA (서열 66) 또는 FZD8 내의 YGFA (서열 74), 및/또는 FZD1-7, FZD9, 또는 FZD10 내의 이들 서열 중 하나에 상응하는 서열 (상기 표 2에서 규정된 것)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 FZD8 내의 서열 GLEVHQ (서열 25)의 적어도 일부 뿐만 아니라, FZD8 내의 서열 YGFA (서열 74)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 FZD8 내의 서열 GLEVHQ (서열 25)에 상응하는 FZD1-7, FZD9, 또는 FZD10의 영역의 적어도 일부 뿐만 아니라, FZD8 내의 서열 YGFA (서열 74)에 상응하는 FZD1-7, FZD9, 또는 FZD10의 영역의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 나타낸 서열에 결합하는 FZD 결합 작용제는 또한 그것이 결합하는 인간 프리즐드 수용체(들) 내의 다른 하나 이상의 서열에 결합한다. 다시 말하면, 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 항체가 결합하는 에피토프는 상기 나타낸 서열과 단지 부분적으로 중첩되는 FZD 세포외 도메인 내의 영역이다. 특정 대안적 실시양태에서, FZD 결합 작용제가 결합하는 전체 에피토프는 상기 나타낸 서열 내에 전부 함유된다.
특정 실시양태에서, 작용제는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체 또는 IgG2 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다.
본 발명의 항체 또는 기타 작용제는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 특이적 결합에 대해 검정될 수 있다. 이용될 수 있는 면역검정으로는, 이들로 한정되지는 않지만, 비아코어 분석, FACS 분석, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블롯, 방사선면역검정, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침전 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체 고정 검정, 면역방사능 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용한 경쟁적 및 비경쟁적 검정 시스템을 들 수 있다. 이러한 검정은 통상적이며, 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York] (그의 전문은 본원에 참조로 포함됨) 참조).
예를 들어, 인간 프리즐드 수용체에의 항체의 특이적 결합은 ELISA를 이용하여 판단할 수 있다. ELISA 검정은 항원을 제조하고, 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하고, 검출가능한 화합물, 예컨대 효소 기질 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)에 접합시킨 FZD 결합 항체 또는 기타 FZD 결합 작용제를 웰에 첨가하고, 소정의 시간 동안 인큐베이션하고, 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, FZD 결합 항체 또는 작용제는 검출가능한 화합물에 접합시키지 않고, 대신 FZD 결합 항체 또는 작용제를 인식하는 제2 접합 항체를 웰에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 웰을 항원으로 코팅하는 대신, FZD 결합 항체 또는 작용제를 웰에 코팅할 수 있고, 코팅된 웰에 항원을 첨가한 후 검출가능한 화합물에 접합시킨 2차 항체를 첨가할 수 있다. 검출된 신호를 증가시키기 위해 어떠한 파라미터를 변형시킬 수 있는지 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 ELISA의 기타 변수는 당업자에게 공지되어 있을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York at 11.2.1] 참조).
인간 프리즐드 수용체에 대한 항체 또는 기타 작용제의 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 오프-레이트(off-rate)를 경쟁적 결합 검정에 의해 판단할 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예로는, 표지된 항원 (예를 들어, 3H 또는 125I), 또는 그의 단편 또는 변이체를 표지되지 않은 항원의 증가량의 존재하에 관심 항체와 함께 인큐베이션한 후, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사선면역검정이다. 프리즐드 수용체에 대한 항체의 친화도 및 결합 오프-레이트를 스캐차드 플롯(scatchard plot) 분석에 의한 데이터로부터 판단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비아코어 역학 분석을 이용하여 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 결합하는 항체 또는 작용제의 결합 온 및 오프 레이트를 판단한다. 비아코어 역학 분석은 그의 표면 상에 고정된 FZD 항원을 갖는 칩으로부터 항체의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 작용제 (예를 들어 항체)는 작용제에 의해 결합된 적어도 1종의 인간 프리즐드 수용체 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종의 FZD)의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 결합된 인간 프리즐드 수용체의 하나 이상의 활성을 적어도 약 10％, 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 50％, 적어도 약 75％, 적어도 약 90％, 또는 약 100％ 억제한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 리간드가 적어도 하나의 인간 프리즐드 수용체에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 리간드가 인간 프리즐드 수용체의 생물학적 결합 부위 (BBS)에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 인간 Wnt 단백질이다. 19 종의 인간 Wnt 단백질이 확인되었다: WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A (종전 WNT14), WNT9B (종전 WNT15), WNT10A, WNT10B, WNT11, 및 WNT16. 특정 실시양태에서, 작용제는 WNT3A가 FZD8에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제에 의해 제공되는 특정 리간드가 특정 인간 프리즐드 단백질에 결합하는 것의 억제 정도는 적어도 약 10％, 적어도 약 25％, 적어도 약 50％, 적어도 약 75％, 적어도 약 90％, 또는 적어도 약 95％이다. 특정 실시양태에서, Wnt와 같은 리간드가 FZD에 결합하는 것을 억제하는 작용제는 추가로 Wnt 신호전달을 억제한다 (예를 들어 고전적 Wnt 신호전달을 억제함).
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 Wnt 신호전달을 억제한다. Wnt 신호전달을 억제하는 FZD 결합 작용제는, 특정 실시양태에서 하나 이상의 Wnt에 의한 신호전달을 억제할 수 있지만, 반드시 모든 Wnt에 의한 신호전달을 억제할 수 있는 것은 아님을 이해한다. 특정 대안적 실시양태에서, 모든 인간 Wnt에 의한 신호전달이 억제될 수 있다. 특정 실시양태에서, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A (종전 WNT14), WNT9B (종전 WNT15), WNT10A, WNT10B, WNT11, 및 WNT16으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 Wnt에 의한 신호전달이 억제된다. 특정 실시양태에서, 억제되는 Wnt 신호전달은 WNT1, WNT2, WNT3, WNT3A, WNT7a, WNT7b, 및/또는 WNT10B에 의한 신호전달이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 (적어도) WNT1, WNT3A, WNT7b, 및 WNT10B에 의한 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 (적어도) WNT3A에 의한 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제에 의해 제공되는 Wnt에 의한 신호전달의 억제는 Wnt에 의한 신호전달 수준에서의 적어도 약 10％, 적어도 약 25％, 적어도 약 50％, 적어도 약 75％, 적어도 약 90％, 또는 적어도 약 95％의 감소이다. 특정 실시양태에서, 억제되는 Wnt 신호전달은 고전적 Wnt 신호전달이다.
FZD 결합 작용제 (또는 후보 FZD 결합 작용제)가 Wnt 신호전달을 억제하는지 여부를 판단하기 위한 생체내 및 시험관내 검정이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 TCF-결합 도메인 상류의 다중 카피를 함유하는 TCF/Luc 리포터 벡터를 이용한 세포-기반의 루시페라제 리포터 검정을 사용하여 시험관내 고전적 Wnt 신호전달 수준을 측정할 수 있다 (문헌 [Gazit et al., 1999, Oncogene 18; 5959-66]). 하나 이상의 Wnt (예를 들어 형질감염된 세포에 의해 발현되거나 Wnt-조건화 배지에 의해 제공된 Wnt(들))의 존재하에서 FZD 결합 작용제가 존재할 경우의 Wnt 신호전달의 수준을 FZD 결합 작용제가 존재하지 않을 경우의 신호 전달의 수준과 비교한다. 고전적 Wnt 신호전달의 억제를 평가하기 위해 그러한 루시페라제 리포터 검정을 이용하는 비제한적이고 구체적인 예를 하기 실시예 3 및 11에 제공한다. TCF/luc 리포터 검정에 더하여, 베타-카테닌 조절 유전자, 예컨대 c-myc (문헌 [He et al., Science, 281:1509-12 (1998)]), 시클린 D1 (문헌 [Tetsu et al., Nature, 398:422-6 (1999)]) 및/또는 피브로넥틴 (문헌 [Gradl et al., Mol. Cell Biol., 19:5576-87 (1999)])의 발현 수준에 대한 작용제의 효과를 측정하는 것에 의해 고전적 Wnt 신호전달에 대한 FZD 결합 작용제 (또는 후보 작용제)의 효과를 시험관내 또는 생체내에서 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달에 대한 작용제의 효과는 또한 디쉐벨레드-1, 디쉐벨레드-2, 디쉐벨레드-3, LRP5, LRP6, 및/또는 베타-카테닌의 인산화 상태에 대한 작용제의 효과를 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다. 또 다른 추가의 실시양태에서, Wnt 신호전달에 대한 FZD 결합 작용제의 효과는 Wnt 표지에서 1종 이상의 유전자의 발현 수준에 대한 FZD 결합 작용제의 영향을 평가하는 것에 의해 판단한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 다음과 같은 하나 이상의 효과를 갖는다: 종양 세포의 증식을 억제하거나, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도를 감소시켜 종양의 종양형성성을 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 생존을 증가시키거나, 종양 세포의 세포 사멸을 촉발하거나, 종양형성 세포를 비종양형성 상태로 분화시키거나, 또는 종양 세포의 전이를 방지함.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기타 작용제는 접합된 독소, 화학요법제, 방사성동위원소, 또는 다른 그와 같은 작용제를 통해 세포 사멸을 촉발한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 항체에 대한 항체는 단백질 내재화에 의해 FZD를 발현하는 종양 세포에서 활성화되는 독소에 접합된다. 특정 대안적 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 독소, 화학요법제 또는 방사성동위원소에 접합되지 않는다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 생체내에서 (예를 들어, 이종이식 마우스 모델에서 및/또는 암을 가진 인간에서) 종양 성장을 억제할 수 있다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 종양의 종양형성성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 이 결합제 또는 항체는 동물 모델, 예컨대 마우스 이종이식 모델에서 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도는 적어도 약 2배, 약 3배, 약 5배, 약 10배, 약 50배, 약 100배, 또는 약 1000배 감소된다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소는 동물 모델을 이용한 한계 희석 검정으로 측정한다. 항-FZD 항체의 효능을 시험하기 위해 사용되는 한계 희석 검정의 예를 하기 실시예 8에 제공한다. 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소를 판단하기 위해 한계 희석 검정을 사용하는 것에 대한 추가적인 예 및 지침은, 예를 들어 국제 공개공보 제WO 2008/042236호, 미국 특허 출원 공개공보 제2008/0064049호, 및 동 제2008/0178305호에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체에 대한 항체는 항체 의존적 세포독성 (ADCC)을 통해 FZD 단백질을 발현하는 세포의 세포 사멸을 매개한다. ADCC는 항체의 Fc 부분을 인식하는 이펙터 세포에 의한 세포 용해를 수반하였다. 예를 들어, 많은 림프구, 단핵구, 조직 대식세포, 과립구 및 호산구는 Fc 수용체를 갖고 있어, 세포용해를 매개할 수 있다 (문헌 [Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497]).
특정 실시양태에서, 1종 이상의 FZD에 대한 항체는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 활성화함으로써 FZD 단백질(들)을 발현하는 세포의 세포 사멸을 촉발한다. CDC는 항체의 Fc 부분에 대한 혈청 보체의 결합 및 이후의 보체 단백질 캐스케이드의 활성화에 관여하여 세포막 손상 및 최후의 세포 사멸을 초래한다. 항체의 생물학적 활성은 항체 분자의 불변 도메인 또는 Fc 영역에 의해 대부분 결정되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams ＆ Wilkins, p. 218 (1984)]). 상이한 클래스 및 하위클래스의 항체는 이러한 점에서 상이하며, 상이한 종으로부터의 동일한 서브클래스의 항체도 마찬가지이다. 인간 항체 중에서, IgM은 보체에 결합하는 항체의 가장 효율적인 부류이며, 이어서 IgG1, IgG3, 및 IgG2이고, IgG4는 보체 캐스케이드를 활성화하는데 있어서 다소 부족한 것으로 보인다 (문헌 [Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497]; [Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76]). 본 발명에 따르면, 목적하는 생물학적 활성을 갖는 항체 부류가 제조된다.
1종 이상의 FZD에 대한 임의의 특정 항체에 있어서 보체 활성화 및/또는 ADCC에 의해 표적 세포의 용해를 매개하는 능력을 검정할 수 있다. 관심 세포를 성장시키고, 시험관내에서 표지하고; 항체를 항원 항체 복합체에 의해 활성화될 수 있는 혈청 보체 또는 면역 세포와 조합하여 세포 배양물에 첨가한다. 표적 세포의 세포용해는, 예를 들어 용해된 세포로부터의 표지 방출에 의해 검출한다. 실제로는, 환자 자신의 혈청을 보체 및/또는 면역 세포의 공급원으로 사용하여 항체를 스크리닝할 수 있다. 그런 다음, 시험관내 시험에서 보체를 활성화하거나 또는 ADCC를 매개할 수 있는 항체를 상기 특정 환자에서 치료적으로 사용할 수 있다.
본 발명은 18R5 및/또는 18R8의 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 CDR을 포함하고, CDR 당 4개 이하 (즉 0, 1, 2, 3, 또는 4개)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 (하기 실시예 1의 표 4 참조), 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 폴리펩티드를 제공한다. 즉, 본 발명은 18R5 및/또는 18R8의 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 CDR을 포함하는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 18R8의 중쇄 CDR3 및/또는 18R5 또는 18R8의 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 CDR(들)은 중쇄 가변 영역 내에 함유되어 있고/거나 경쇄 CDR(들)은 경쇄 가변 영역 내에 함유되어 있다.
예를 들어, 본 발명은 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 (예를 들어 항체)를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및/또는 (c) NFIKYVFAN (서열 3), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 추가로 (a) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열 4 또는 서열 7의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; (b) EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 5 또는 서열 8의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는 (c) SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 6 또는 서열 9의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
즉, 본 발명은 GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 CDR(들)은 항체 중쇄의 가변 영역 내에 함유되어 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, CDR(들)은 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된다. 특정 실시양태에서, 각각의 중쇄 CDR(들)은 1-2를 넘지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된다.
본 발명은 또한 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 항체는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및 (c) NFIKYVFAN (서열 3), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 추가로 (a) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열 4 또는 서열 7의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; (b) EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 5 또는 서열 8의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (c) SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 6 또는 서열 9의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 대안적 실시양태에서, 항체는 대신 추가로 (a) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1; (b) EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (c) SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 FZD5 및 FZD8을 비롯한 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
본 발명은 추가로 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 (예를 들어 항체)를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 (a) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열 4 또는 서열 7의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; (b) EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 5 또는 서열 8의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는 (c) SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 6 또는 서열 9의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
또한 (a) 서열 SGD(K/N)(L/I)G(K/S)(K/F)Y(A/V)(S/H) (서열 71) 또는 4개 이하 (즉, 0, 1, 2, 3, 또는 4개)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 71의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (b) 서열 (E/D)K(D/S)NRPSG (서열 72) 또는 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 72의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 (c) 서열 (S/Q)S(F/Y)A(G/N)(N/T)(no aa/L)SL(E/no aa) (여기서 "no aa/L"은 L 또는 아미노산 부재를 나타내고, "E/no aa"는 E 또는 아미노산 부재를 나타냄; 서열 73) 또는 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 73의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QSYANTLSL (서열 9)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 대안적 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 SGDKLGKKYAS (서열 4)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SSFAGNSLE (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 CDR(들)은 항체 경쇄의 가변 영역 내에 함유되어 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, CDR(들)은 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 변형에 의해 변형된다. 특정 실시양태에서, 각각의 경쇄 CDR(들)은 1-2를 넘지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된다.
특정 실시양태에서, 항체는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDKLGKKYAS (서열 4) 또는 SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5) 또는 DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SSFAGNSLE (서열 6) 또는 QSYANTLSL (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및 (b) SGDKLGKKYAS (서열 4)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SSFAGNSLE (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3 및 (b) SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QSYANTLSL (서열 9)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, CDR(들)은 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된다. 특정 실시양태에서, 각각의 CDR(들)은 1-2를 넘지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된다.
본 발명은 추가로 항-FZD 항체 44R24의 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 CDR을 포함하고, CDR 당 4개 이하 (즉, 0, 1, 2, 3, 또는 4개)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 (하기 실시예 18의 표 7 참조), 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 폴리펩티드를 제공한다. 즉, 본 발명은 44R24의 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 CDR을 포함하는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 44R24의 중쇄 CDR3 및/또는 44R24의 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 CDR(들)은 중쇄 가변 영역내에 함유되어 있고/거나 경쇄 CDR(들)은 경쇄 가변 영역 내에 함유되어 있다.
본 발명은 또한 인간 FZD5 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 (예를 들어 항체)를 제공하며, 여기서 항체는 (a) GFTFSSYYIT (서열 77), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; TISYSSSNTYYADSVKG (서열 78), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및 SIVFDY (서열 79), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDALGNRYVY (서열 80), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; SG (서열 81), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 GSWDTRPYPKY (서열 82), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 (또는 기타 FZD 결합 폴리펩티드)는 (a) GFTFSSYYIT (서열 77)를 포함하는 중쇄 CDR1, TISYSSSNTYYADSVKG (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIVFDY (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) SGDALGNRYVY (서열 80)를 포함하는 경쇄 CDR1, SG (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 GSWDTRPYPKY (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
본원에서 기재하는 개개의 경쇄 또는 중쇄 중 하나를 포함하는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 경쇄 및 중쇄를 둘 다 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어 항체)를 또한 제공한다.
또한 (a) 서열 10에 대해 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 12 또는 서열 14에 대해 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 10, 12, 또는 14에 대해 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 97％, 또는 적어도 약 99％의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 즉, 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열 10에 대해 적어도 약 95％의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및/또는 (b) 서열 12 또는 14에 대해 적어도 약 95％의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 12 또는 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 13 또는 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이고/거나 폴리펩티드는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체 (예를 들어 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및/또는 FZD8)에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 본 발명은 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및 (b) 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서 서열 10을 포함하는 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역이다. 특정 실시양태에서, 서열 12 또는 14를 포함하는 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역이다. 특정 실시양태에서, 서열 10, 12, 또는 14에 대해 특정 백분률의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드는 단지 보존적 아미노산 치환 만에 의해 서열 10, 12, 또는 14와 상이하다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 (a) 서열 10 및 서열 12; (b) 서열 10 및 서열 14; (c) 서열 11 및 서열 13; 또는 (d) 서열 11 및 서열 15를 포함한다.
본 발명은 추가로 FZD5 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하고 (a) 서열 85에 대해 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 97％, 또는 적어도 약 99％의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 86에 대해 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 97％, 또는 적어도 약 99％의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 기타 폴리펩티드를 제공한다. 특정 대안적 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열 85 및/또는 서열 86을 포함한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 18R8, 18R5, 18R4605, 18R4805, 및 44R24 IgG 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-FZD 항체를 포함하거나, 그러한 항체로 본질적으로 이루어지거나 이루어진다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 18R8 IgG2 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열을 함유하거나 함유하지 않음). 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 18R8 IgG2 항체이다. 18R8 IgG2 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 2008년 9월 29일 부다페스트 조약의 조건하에 미국 버지니아주 머내서스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)에 기탁되었고, ATCC 기탁 지정 번호 PTA-9540가 할당되었다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 18R5 IgG2 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열은 함유하거나 함유하지 않음). 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 18R5 IgG2 항체이다. 18R5 IgG2 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 2008년 9월 29일 부다페스트 조약의 조건하에 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁 지정 번호 PTA-9541이 할당되었다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 2009년 8월 26일자로 ATCC에 기탁되어 기탁 지정 번호 PTA-10307, PTA-10309, 또는 PTA-10311이 할당된 플라스미드에 의해 코딩된 IgG 항체이다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 (예를 들어 경쟁 결합 검정에서) FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 것에 대해 ATCC 기탁 지정 번호 PTA-9540, PTA-9541, PTA-10307, 또는 PTA-10309를 갖는 플라스미드에 의해 코딩된 항체와 경쟁하는 작용제이다. 특정 대안적 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 FZD5 및/또는 FZD8에 특이적으로 결합하는 것에 대해 ATCC 기탁 지정 번호 PTA-10311를 갖는 플라스미드에 의해 코딩된 항체와 경쟁하는 작용제이다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 마우스, 시노몰구스 원숭이, 또는 인간에서 적어도 약 10 시간, 적어도 약 24 시간, 적어도 약 3 일, 적어도 약 1 주, 또는 적어도 약 2 주의 순환 반감기를 갖는다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 마우스, 시노몰구스 원숭이, 또는 인간에서 적어도 약 10 시간, 적어도 약 24 시간, 적어도 약 3 일, 적어도 약 1 주, 또는 적어도 약 2 주의 순환 반감기를 갖는 IgG (예를 들어 IgG1 또는 IgG2) 항체이다. 폴리펩티드 및 항체와 같은 작용제의 반감기를 증가시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 항체의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법으로는 pH 6.0에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 항체의 pH 의존적 결합을 증가시키는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하는 것이 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 제2005/0276799호, 동 제2007/0148164호, 및 동 제2007/0122403호 참조). Fc 영역이 결여된 항체 단편의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법으로는 페길화와 같은 기술이 있다.
폴리클로날 항체는 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 임의로는 멸균 염수 중에 희석하고 아주반트 (예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 아주반트)와 조합시켜 안정한 에멀젼을 형성하게 한 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) (KLH), 혈청 알부민 등에 접합시킨 관련 항원 (정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질 등)을 피하 또는 복강내로 다수회 주사하여 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 당나귀 등)을 면역화하여 폴리클로날 항체를 생성한다. 그런 다음, 그렇게 면역화된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 상기 폴리클로날 항체를 회수한다. 수집된 혈액을 응고시키고, 혈청을 따라버린 후, 원심분리로 맑게 하고, 항체 역가에 대해 분석한다. 상기 폴리클로날 항체는, 친화도 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등을 비롯한 당업계의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법을 이용하여, 마우스, 햄스터, 또는 여타의 적절한 숙주 동물을 상기 기재한 바와 같이 면역화하여, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생성을 이끌어낸다. 또한 림프구를 시험관내에서 면역화할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여, 적합한 골수종 세포주 및 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시키고, 그런 다음 이 세포를 비-융합 림프구 및 골수종 세포로부터 선별할 수 있다. 이어서, 면역침전, 면역블로팅에 의해, 또는 시험관내 결합 검정 (예를 들어 방사선면역검정 (RIA); 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA))에 의해 판단된 바와 같이, 선택된 항원에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 표준 방법 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986])을 이용한 시험관내 배양으로 또는 동물의 복수 종양으로서 생체내에서 증식시킬 수 있다. 그런 다음, 상기에서 폴리클로날 항체에 대해 기재한 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제할 수 있다.
별법적으로, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 모노클로날 항체를 또한 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 예컨대 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해, 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리시키고, 통상적인 절차를 사용하여 그의 서열을 결정한다. 이어서, 상기 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이를, 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시키면, 숙주 세포에 의해 모노클로날 항체가 생성된다. 또한 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]; [Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628]; 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 바와 같이 목적하는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 목적하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 단리할 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 재조합 DNA 기술을 이용하여 수많은 상이한 방식으로 추가로 변형시켜, 대안적인 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을 1) 예를 들어 인간 항체의 그러한 영역으로 대체시켜 키메라 항체를 생성하거나 또는 2) 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드로 대체시켜 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역을 절단 또는 제거하여 목적하는 모노클로날 항체의 항체 단편을 생성한다. 가변 영역의 부위 지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 이용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체(들)에 대한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 그러한 항체를 치료적으로 사용하여 인간 대상체에게 투여하는 경우 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시킬 수 있다. 인간화 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 특정 대안적 실시양태에서, 인간 프리즐드 수용체(들)에 대한 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 직접적으로 제조할 수 있다. 시험관내 면역화되거나 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 면역화 개체로부터 단리된 불멸화 인간 B 림프구를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조). 또한 인간 항체는 예를 들어 문헌 [Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314], [Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162], [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381], 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]에 기재되어 있는 바와 같이, 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선별할 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 이용 기술은 또한 미국 특허 제5,969,108호, 동 제6,172,197호, 동 제5,885,793호, 동 제6,521,404호; 동 제6,544,731호; 동 제6,555,313호; 동 제6,582,915호; 동 제6,593,081호; 동 제6,300,064호; 동 제6,653,068호; 동 제6,706,484호; 및 동 제7,264,963호; 및 문헌 [Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018] (이들 각각은 그의 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 친화도 성숙 전략 및 사슬 셔플링 전략 (문헌 [Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783] (그의 전문이 참조로 포함됨))이 당업계에 공지되어 있고, 이를 이용하여 고 친화도 인간 항체를 생성할 수 있다.
인간화 항체는 또한 면역화 시, 내인성 이뮤노글로불린은 생성하지 않고 인간 항체는 충분한 레퍼토리로 생성할 수 있는 인간 이뮤노글로불린 좌위를 함유하는 형질전환 마우스에서 제조할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 인간 프리즐드 수용체를 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 2 이상의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식과 결합할 수 있는 항체이다. 상이한 에피토프는 동일한 분자 (예를 들어 동일한 인간 프리즐드 수용체) 내에 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 항체가 인간 프리즐드 수용체 뿐만 아니라, 예를 들어 1) 백혈구 상의 이펙터 분자, 예컨대 T-세포 수용체 (예를 들어 CD3) 또는 Fc 수용체 (예를 들어 CD64, CD32, 또는 CD16) 또는 2) 하기에서 상세하게 기재하는 세포독성제를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있도록 상이한 분자 상에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 적어도 1종의 인간 프리즐드 수용체, 뿐만 아니라 VEGF, 노치 리간드, 예컨대 델타-유사 리간드 (예를 들어 DLL4) 또는 재기드, 또는 노치 1, 노치 2, 노치 3, 및 노치 4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 노치 수용체에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이들 중 적어도 하나는 본 발명의 폴리펩티드에서 유래한다. 별법적으로, 이뮤노글로불린 분자의 항-항원 아암을 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체와 결합하는 아암과 조합하여 세포 방어 메카니즘을 특정 항원을 발현하는 세포에 집중시킬 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 특정 항원을 발현하는 세포로 지시하는 데 사용될 수 있다. 상기 항체는 항원 결합 아암, 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA에 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 당업계에서 보편적이다 (문헌 [Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539]; [Brennan et al., 1985, Science 229:81]; [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol. 121:120]; [Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659]; [Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]; [Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368]; 및 미국 특허 제5,731,168호). 또한 2 초과의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]). 따라서, 특정 실시양태에서 인간 프리즐드 수용체(들)에 대한 항체는 다중특이적이다.
별법적으로, 특정 대안적 실시양태에서, 본 발명의 FZD 결합 작용제는 이중특이적 항체가 아니다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 (또는 기타 폴리펩티드)는 단일특이적일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체가 함유하는 하나 이상의 항원 결합 부위는 각각 동일한 1종 이상의 인간 FZD 수용체 (예를 들어, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 또는 FZD8 또는 FZD의 일부 조합 상의 상동 에피토프)에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 단일특이적 항체의 항원 결합 부위는 1, 2, 3, 4, 또는 5종 (또는 그 이상)의 인간 프리즐드 수용체에 결합할 수 있다 (또는 결합한다).
특정 실시양태에서는, 예를 들어 종양 침투를 증가시키는 항체 단편을 제공한다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질가수분해 소화를 통해 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117]; [Brennan et al., 1985, Science, 229:81]). 특정 실시양태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되어 이들로부터 분비될 수 있고, 이에 따라 이들 단편의 대량 생산이 가능하다. 그러한 항체 단편을 또한 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 항체 단편은 또한 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 선형 항체일 수 있고, 예를 들어 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명에 따르면, 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적인 단일-쇄 항체의 생성을 위해 기술들을 적합하게 개조할 수 있다 (미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한 FZD 수용체 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 확인할 수 있게 하는 Fab 발현 라이브러리의 구축을 위해 방법들을 개조할 수 있다 (문헌 [Huse, et al., Science, 246:1275-1281 (1989)]). 당업계의 기술을 이용하여, (a) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 제조된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시켜 생성한 Fab 단편, (c) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성한 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편을 비롯한 (이들로 한정되는 것은 아님) 항체 단편을 제조할 수 있다.
특히 항체 단편의 경우, 항체를 변형시켜 그의 혈청 반감기를 증가시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 항체 단편 내 적절한 영역의 돌연변이에 의한 재이용 수용체 결합 에피토프의 항체 단편으로의 혼입, 또는 상기 에피토프의 펩티드 태그로의 혼입, 및 이어서 말단 또는 중간에서의 항체 단편과의 융합 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의함)에 의해 이루어질 수 있다
이종접합 항체도 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이종접합 항체는 2개의 공유 결합된 항체로 구성된다. 상기 항체는, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 표적 면역 세포로 제안된 바 있다 (미국 특허 제4,676,980호). 항체는, 가교제를 포함하는 방법을 비롯하여 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용해 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 들 수 있다.
본 발명의 목적상, 변형된 항체는 항체가 인간 FZD 수용체의 폴리펩티드에 회합하는데 필요한 임의의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있음이 인식될 것이다. 이와 관련하여, 가변 영역은, 체액 반응 개시 및 목적하는 종양-연관 항원에 대한 이뮤노글로불린 생성을 유도할 수 있는 임의 유형의 포유동물을 포함하거나 이로부터 유래할 수 있다. 따라서, 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어 인간, 뮤린, 비인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카쿠(macaque) 등) 또는 늑대 기원의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 이뮤노글로불린의 가변 및 불변 영역은 둘 다 인간이다. 다른 실시양태에서, 적합한 항체 (통상 비인간 공급원으로부터 유래됨)의 가변 영역은 결합 특성을 개선시키거나 분자의 면역원성을 감소시키기 위해 조작되거나 또는 특이적으로 맞추어질 수 있다. 이런 점에서, 본 발명에 유용한 가변 영역은 인간화될 수 있거나, 또는 다르게는 개입된 아미노산 서열의 포함을 통해 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해서, 및 필요한 경우, 일부 프레임워크 영역 대체 및 서열 변형에 의해서 변경된다. CDR이 프레임워크 영역을 유도하는 항체로서 동일한 클래스 또는 심지어는 하위클래스의 항체로부터 유도될 수 있지만, CDR은 다양한 클래스의 항체로부터, 및 바람직하게는 다양한 종의 항체로부터 유도될 것으로 예상된다. 모든 CDR을 공여자 가변 영역으로부터의 완전 CDR로 대체하여 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 가변 도메인으로 이동시키는 것이 필요하지 않을 수 있다. 오히려, 항원 결합 부위의 활성을 유지하기 위해 필요한 이들 잔기를 이동시키는 것만이 필요할 수 있다. 미국 특허 제5,585,089호; 동 제5,693,761호; 및 동 제5,693,762호에 제시된 설명을 고려하여, 면역원성이 감소된 기능성 항체를 수득하는 것은 통상적인 실험 수행 또는 시행 착오 시험에 의해 당업자의 실력 범위 내에서 정통할 것이다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 변형된 항체가 불변 영역 도메인의 적어도 하나 이상의 부분이 결실되거나 또는 다르게는 변경되어 목적하는 생화학적 특성, 예컨대 천연의 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 항체에 비해 증가된 종양 편재화 또는 감소된 혈청 반감기를 제공하는 항체 (예를 들어, 전장 항체 또는 그의 면역반응성 단편)를 포함할 것임을 알 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 상용가능한 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항체는 3종의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 도메인이 일부 또는 전부 결실된 변형된 불변 영역이 고려된다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체 (ΔCH2 구축물)를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재하는 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개의 잔기)에 의해 대체될 것이다.
이들의 배열 외에도, 불변 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민반응에 관여할 수 있다. 추가로, 항체는, 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)와 결합하는 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위를 이용하여, Fc 영역을 통해 세포와 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 비롯한 다양한 클래스의 항체에 대해 특이적인 Fc 수용체가 다수 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포 (항체 의존적 세포-매개된 세포독성, 또는 ADCC라 칭함)에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해, 염증 매개자의 방출, 태반 통과, 및 이뮤노글로불린 생산의 제어를 비롯한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공하여, 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미친다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 다른 방법을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양 편재화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시켜 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또 다른 변형을 이용하여, 항원 특이성 또는 항체 가요성 증가로 인한 편재성 증진을 가능하게 하는 디술피드 연결 또는 올리고당 잔기를 제거할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따른 불변 영역에 대한 변형은 당업자 범위 안에서 널리 공지된 생화학 또는 분자 공학 기술을 이용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체인 FZD 결합 작용제는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이 항체는 항체 의존적 세포독성 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성을 갖고 있지 않다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 이펙터 기능을 갖고 있지 않다.
특정 실시양태에서 변형된 항체를 조작하여 CH3 도메인을 각각의 변형된 항체의 힌지 영역에 직접 융합시킬 수 있다는 것을 주목할 것이다. 다른 구축물에서, 힌지 영역 및 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고, 남은 CH3 도메인 (변형되거나 변형되지 않음)이 5-20개의 아미노산 스페이서를 이용하여 힌지 영역에 결합한 적합한 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 첨가하여, 예를 들어 불변 도메인의 조절 요소를 자유롭고 접근가능하게 하거나, 또는 힌지 영역을 가요성이게 할 수 있다. 그러나, 아미노산 스페이서는 일부 경우에 면역원성으로 판명되며, 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있음을 알아야 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 구축물에 첨가되는 임의의 스페이서는 비교적 비-면역원성이거나, 또는 심지어 변형된 항체의 목적하는 생화학적 양이 유지될 수 있는 경우에는 완전히 생략될 것이다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 이외에, 본 발명의 항체는 소수의 또는 심지어는 단일 아미노산의 부분 결실 또는 치환에 의해 제공될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 실질적으로 Fc 결합을 감소시키기에 충분할 수 있고, 이에 따라 종양 편재화가 증가한다. 유사하게, 조절되어야 할 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 CLQ 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 대상 불변 영역 도메인 무손상과 연관된 다른 바람직한 기능을 남기면서 항체의 선택된 특성 (혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 게다가, 상술한 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역을 생성된 구축물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 배열 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위 (예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공되는 활성을 파괴하는 것이 가능할 수 있다. 특정 실시양태는 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가하여 바람직한 특성, 예컨대 이펙터 기능을 감소 또는 증가시키거나, 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 이들의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 공통 부류 내의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예를 들어 하나의 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 또 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환이 의미하는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또한 세포독성제에 접합시킨 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 세포독성제로는 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체) 등을 들 수 있다. 상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제로는, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제를 들 수 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 들 수 있다. 다양한 방사성핵종은 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 비롯한 방사성접합된 항체를 생산하는데 이용 가능하다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 사용될 수 있다.
접합 항체는 2개의 공유 결합된 항체로 이루어진다. 상기 항체는, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 표적 면역 세포로 제안된 바 있다 (미국 특허 제4,676,980호). 항체는, 가교제를 포함하는 방법을 비롯하여 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용해 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 들 수 있다.
얼마나 유용한 양이 얻어지는 지에 상관없이, 본 발명의 항체는 다수의 접합된 (즉, 면역접합) 또는 접합되지 않은 형태 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 항체는 비접합된 형태 또는 "네이키드" 형태로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체를 비접합된 형태로 사용하여 보체 의존적 세포독성 (CDC) 및 항체 의존적 세포 독성 (ADCC)을 비롯한 대상체의 자연 방어 메카니즘을 이용하여 악성 세포를 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 널리 공지된 킬레이터 또는 직접 표지 중 어느 하나를 이용하여 상기 항체를 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re와 같은 방사성동위원소에 접합시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시된 조성물은 약물, 전구약물 또는 생물학적 반응 개질제, 예컨대 메토트렉세이트, 아드리아미신, 및 림포카인, 예컨대 인터페론에 커플링된 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 특정 생물독소, 예컨대 리신 또는 디프테리아 독소에 접합시킨 항체의 사용을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 항체는 다른 면역학적 활성 리간드 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편)과 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 생성된 분자는 신생물 세포 및 이펙터 세포 (예컨대, T 세포) 둘 모두와 결합한다. 사용시 접합되거나 접합되지 않은 변형된 항체의 선별은 암의 유형 및 단계, 보조 요법의 사용 (예를 들어, 화학요법 또는 외부 방사선), 및 환자 상태에 따라 달라질 것이다. 본원에 교시된 바를 고려하여 당업자는 이러한 선별이 용이하게 이루어질 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 인간 FZD 수용체에 대한 항체 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열이 해당 단백질의 구조 또는 기능에 대해 유의한 영향을 주지 않고 달라질 수 있음은 당업계에 인식되어 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적인 활성을 나타내거나 인간 FZD 수용체 단백질에 대한 항체 또는 그의 단편의 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이체를 추가로 포함한다. 그러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복, 및 유형 치환을 포함한다.
이들 폴리펩티드 및 유사체는 정상적으로는 해당 단백질의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이들 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수를 향상시킬 수 있다. 이들 모이어티는 또한 단백질의 임의의 바람직하지 않은 부수 효과 등을 감소 또는 제거할 수 있다. 이들 모이어티에 대한 고찰은 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 단리된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 제조가능하다. 이러한 방법에는 직접적인 단백질 합성 방법에서부터 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 이들 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 방법까지 다양하다. 일부 실시양태에서, 재조합 기술을 이용하여 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 합성하여 DNA 서열을 구축한다. 임의로는, 이 서열에 대해 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이를 일으켜, 그의 기능적 유사체를 생성할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)] 및 미국 특허 제4,588,585호를 참조한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 이용한 화학적 합성에 의해 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 구축할 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드의 설계는, 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하고 관심 재조합 폴리펩티드를 생성하도록 할 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 할 수 있다. 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해서 표준 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 나아가, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 여러 개의 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 후 이들을 라이게이션할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 돌출부를 함유한다.
일단 (합성, 부위 지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의해) 조립되면, 관심있는 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 삽입하고, 목적하는 숙주에서의 단백질의 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결할 것이다. 조립의 적절성에 대해서는 뉴클레오티드 서열분석, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인가능하다. 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자를 높은 수준으로 발현하기 위해서는, 이 유전자를 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시켜야 한다.
특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터를 사용하여 인간 프리즐드 수용체에 대한 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시킬 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 항-FZD 항체 또는 그의 단편의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구축물이다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들어 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열 (이하에서 상세히 기재됨)의 조립물을 포함한다. 상기와 같은 조절 요소에는 전사를 제어하는 오퍼레이터 서열이 포함될 수 있다. 보통 복제 원점에 의해 수여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 유전자의 선택을 추가로 혼입할 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로에 대해 기능적으로 관련될 때 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로 발현될 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터는 코딩 서열의 전사를 제어할 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 이루어지도록 위치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 효모 발현 시스템에서 사용하도록 의도된 구조 요소에는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열이 포함된다. 별법적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로는 그 후에 발현된 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 생성물을 생성할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터에 대한 선택은 숙주에 대한 선택에 좌우될 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합물이 이용될 수 있다. 진핵 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는, 예를 들어 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터가 있다. 박테리아 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는, 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 비롯한 에쉬케리키아 콜라이로부터의 플라스미드, 및 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 섬유상 단일-가닥 DNA 파지가 있다.
FZD 결합 폴리펩티드 또는 항체 (또는 항원으로서 사용하기 위한 FZD 단백질)의 발현을 위해 적합한 숙주 세포에는 적절한 프로모터의 제거하의 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포가 포함된다. 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 이.콜라이 또는 바실러스가 포함된다. 고등 진핵 세포에는 하기 기재하는 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 또한 무세포 번역 시스템을 사용할 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위해 적절한 클로닝 및 발현 벡터가 문헌 [Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y., 1985]에 기재되어 있고, 그의 관련 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 항체 생산을 비롯한 단백질 생산 방법과 관련된 부가적인 정보는 예를 들어 미국 특허 공개공보 제2008/0187954호, 미국 특허 제6,413,746호 및 동 제6,660,501호, 및 국제 특허 공개공보 제WO 04009823호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
또한 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질의 발현에 유리하게 이용된다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는데, 그 이유는, 그러한 단백질이 일반적으로 올바르게 폴딩되고, 적절히 변형되고, 완전히 기능적이기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 글루즈만(Gluzman) (문헌 [Cell 23:175, 1981])에 기재된 COS-7 계통의 원숭이 신장 세포주, 및 예를 들어 L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 비롯한 적절한 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 발현시킬 유전자에 연결된 비-전사 요소, 예컨대 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 여타의 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이싱 제공 및 수용 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종성 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 문헌 [Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에서 검토된 바 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질을 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 그러한 표준 방법에는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징(sizing) 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제에 대한 여타 임의의 표준 기술이 있다. 친화도 태그, 예컨대 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착하여, 적절한 친화도 칼럼을 통과시킴으로써 정제를 용이하게 할 수도 있다. 단리된 단백질에 대해서는 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징분석할 수도 있다.
예를 들어, 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore) 펠리콘(Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여, 배양 배지 내로 재조합 단백질을 분비하는 시스템으로부터의 상청액을 먼저 농축할 수 있다. 이 농축 단계 후, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 별법적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기판을 이용할 수 있다. 이 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 통상 이용되는 여타의 유형일 수 있다. 별법적으로, 양이온 교환 단계를 이용할 수 있다. 적합한 양이온 교환체로는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 있다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어 메틸 또는 여타의 지방족기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 이용하여 FZD 결합 작용제를 추가로 정제할 수 있다. 또한 균질한 재조합 단백질의 생성을 위해 상기한 정제 단계의 일부 또는 전부의 다양한 조합을 이용할 수도 있다.
박테리아 배양물에서 생성된 재조합 단백질은, 예를 들어 세포 펠렛으로부터의 최초 추출에 이어서 하나 이상의 농도, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 최종 정제 단계에 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 이용되는 미생물 세포는, 동결-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용해제 이용을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 파쇄할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 항체 및 기타 단백질을 정제하는 방법에는 또한 예를 들어 미국 특허 공고공보 제2008/0312425호, 동 제2008/0177048호, 및 동 제2009/0187005호에 기재되어 있는 것이 포함되며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 항체가 아닌 폴리펩티드이다. 단백질 표적에 높은 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩티드를 확인 및 생산하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007)], [Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006)], [Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006)], [Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008)], 및 [Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008)] (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 특정 실시양태에서, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 FZD 결합 폴리펩티드를 확인/생산한 바 있다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 단백질 A, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 컨센서스 반복 도메인 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 비-단백질 분자이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 소분자이다. 비-단백질 FZD 결합 작용제의 확인에 유용한 조합 화학 라이브러리 및 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Kennedy et al., J. Comb. Chem., 10:345-354 (2008)], [Dolle et al., J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007)], 및 [Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001)]을 참조하며, 이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가의 특정 실시양태에서, 작용제는 탄수화물, 글리코아미노글리칸, 당단백질 또는 프로테오글리칸이다.
특정 실시양태에서, 작용제는 핵산 압타머이다. 압타머는 또 다른 분자와의 결합 능력에 기초하여 (예를 들어, 무작위 또는 돌연변이된 풀로부터) 선택된 폴리뉴클레오티드 분자이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 압타머는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 하나 이상의 변형된 핵산 잔기를 포함한다. 단백질과의 결합에 대해 핵산 압타머를 생성 및 스크리닝하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,270,163호, 미국 특허 제5,683,867호, 미국 특허 제5,763,595호, 미국 특허 제6,344,321호, 미국 특허 제7,368,236호, 미국 특허 제5,582,981호, 미국 특허 제5,756,291호, 미국 특허 제5,840,867호, 미국 특허 제7,312,325호, 미국 특허 제7,329,742호, 국제 특허 공개공보 제WO 02/077262호, 국제 특허 공개공보 제WO 03/070984호, 미국 특허 출원 공개공보 제2005/0239134호, 미국 특허 출원 공개공보 제2005/0124565호, 및 미국 특허 출원 공개공보 제2008/0227735호를 참조하고, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 추가로 작용제에 대해 Wnt 신호전달을 억제하는 효능, 항종양 효능, 및/또는 암 줄기 세포에 대한 효능을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에는 작용제에 노출된 제1 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준을 작용제에 노출되지 않은 제2 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 것을 포함하는 방법이 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 제1 충실성 종양을 작용제에 노출시키고 제2 충실성 종양은 작용제에 노출시키지 않는 단계; (b) 제1 및 제2 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준을 평가하는 단계; 및 (c) 제1 및 제2 충실성 종양에서의 1종 이상의 분화 마커의 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 고전적 Wnt 신호전달 경로의 억제제이고/이거나, 1종 이상의 인간 Wnt 단백질이 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 제2 충실성 종양에 비해 제1 충실성 종양에서 1종 이상의 분화 마커의 수준이 증가되면, 이는 충실성 종양 줄기 세포에 대한 효능을 나타낸다. 특정 대안적 실시양태에서, 제2 충실성 종양에 비해 제1 충실성 종양에서 1종 이상의 분화 마커 (즉, 분화에 대한 음성 마커)의 수준이 감소되면, 이는 충실성 종양 줄기 세포에 대한 효능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 충실성 종양은 췌장 종양이다. 특정 실시양태에서, 충실성 종양은 췌장 종양이고, 1종 이상의 분화 마커는 하나 이상의 뮤신 (예를 들어 Muc16) 및/또는 크로모그라닌 A (CHGA)를 포함할 수 있다. 특정 대안적 실시양태에서, 충실성 종양은 결장 종양이다. 일부 실시양태에서, 충실성 종양은 결장 종양이고, 1종 이상의 분화 마커는 사이토케라틴 7을 포함한다. 췌장 및 결장 뿐만 아니라 다른 종양 유형에 대한 다른 잠재적인 분화 마커가 당업자에게 공지되어 있다. 스크리닝 방법에서의 잠재적인 분화 마커의 유용성은 본원에서 개시하는 18R5 및/또는 44R24와 같은 1종 이상의 항-FZD 항체로 목적하는 종양 유형을 치료한 다음, 대조군에 비해 치료된 종양에 의한 마커의 발현에 있어서의 변화를 평가하는 것에 의해 당업자가 용이하게 평가할 수 있다. 그러한 방법의 비 제한적인 예를, 예를 들어 하기 구체적인 실시예에서 찾아볼 수 있다.
III. 폴리뉴클레오티드
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 FZD 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 그러한 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 인간 프리즐드 수용체에 대한 항체를 코딩하거나 또는 그러한 항체의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하고; 이중 가닥 또는 단일 가닥이 코딩 가닥이거나 비-코딩 (안티센스) 가닥일 경우 단일 가닥일 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
본 발명은 서열 10, 12, 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 서열 85-86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한 서열 11, 13, 또는 15를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 추가로 서열 17, 19, 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 별법적으로, 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 87-90, 92, 및 94-95로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 또한 서열 18, 20, 또는 22를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
또한 서열 17, 19, 또는 21의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 10, 12, 또는 14의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한 서열 87-90, 92, 및 94-95로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 85 또는 86의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 혼성화는 고 엄격성 조건하에서 이루어진다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에, 예를 들어 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하는 분비 서열로서 기능하는 리더 서열)에 융합된 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 전구단백질이며, 리더 서열은 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 형태의 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질 및 추가 5' 아미노산 잔기인 전구단백질을 코딩할 수 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질이 전구단백질이며, 이는 단백질의 불활성화 형태이다. 프로서열이 절단된 직후, 활성의 성숙한 단백질이 남는다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 융합된 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 제공된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주 (예를 들어 COS-7 세포)를 사용하는 경우 인플루엔자 헤마글루티딘 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌 (HA) 태그일 수 있다.
본 발명은 추가로 예를 들어 상기 기재한 단편, 유사체, 및 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 기재하는 인간 FZD 수용체에 대한 항체 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 80％ 동일성, 적어도 85％ 동일성, 적어도 90％ 동일성, 적어도 95％ 동일성, 및 일부 실시양태에서, 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어 95％ "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각 100개의 뉴클레오티드 당 최대 5개의 점 돌연변이 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것이 의도된다. 다시 말하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 참조 서열 내 뉴클레오티드의 5％ 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열 내 총 뉴클레오티드의 최대 5％의 뉴클레오티드가 참조 서열로 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치, 또는 이들 말단 위치 사이의 어느 곳 (참조 서열 또는 참조 서열 내 하나 이상의 연속 그룹의 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 산재됨)에서 일어날 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 둘 모두에서 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 잠재적 치환, 부가 또는 결실을 생성하는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경하지는 않는다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인한 잠재적 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로 생성되어 예를 들어 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화할 수 있다 (인간 mRNA의 코돈을 이. 콜라이와 같은 박테리아 숙주에 의해 바람직한 코돈으로 변화시킴).
또한 본원에서 기재하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포를 제공한다.
IV. 사용 방법 및 제약 조성물
본 발명의 FZD 결합 작용제 (폴리펩티드 및 항체를 포함)는 치유적 치료 방법, 예컨대 암의 치료를 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아닌 다양한 적용분야에 유용하다. 특정 실시양태에서, 작용제는 Wnt 신호전달 (예를 들어 고전적 Wnt 신호전달)을 억제하고/거나, 종양 성장을 억제하고/거나, 분화를 유도하고/거나, 종양 부피를 감소시키고/거나, 종양의 종양형성성을 감소시키는데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 방법일 수 있다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 그것이 결합하는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체의 길항제이다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 길항제는 Wnt 신호전달 활성과 관련된 질환을 치료하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 질환은 Wnt 신호전달에 의존적인 질환이다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달은 고전적 Wnt 신호전달이다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 길항제는 증가된 줄기 세포 및/또는 전구 세포 수준을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 길항제 (예를 들어 항-FZD 항체)에 의해 치료되는 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 Wnt-의존성 종양인 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 FZD 결합 작용제 (예를 들어 항체)가 결합하는 1종 이상의 프리즐드 수용체를 발현하는 종양인 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 Wnt 유전자 표지 내의 1종 이상의 유전자를 발현하는 종양인 것을 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 또는 길항제에 의해 치료되는 질환은 암이 아니다. 예를 들어, 질환은 비만 또는 당뇨병 (예를 들어 제II형 당뇨병)과 같은 대사 장애일 수 있다 (문헌 [Jin T., Diabetologia, 2008 Oct;51(10):1771-80]). 별법적으로, 질환은 골 장애 예컨대 골다공증, 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다 (문헌 [Corr M., Nat Clin Pract Rheumatol, 2008 Oct;4(10):550-6]; [Day et al., Bone Joint Surg Am, 2008 Feb;90 Suppl 1 :19-24]). 또한 질환은 신장 장애, 예컨대 다낭성 신장 질환일 수 있다 (문헌 [Harris et al., Annu Rev Med, 2008 Oct. 23]; [Schmidt-Ott et al., Kidney Int, 2008 Oct;74(8): 1004-8]; [Benzing et al., J Am Soc Nephrol, 2007 May;18(5):1389-98]). 별법적으로, 황반 변성 및 가족성 삼출 유리체망막병증을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 눈 장애를 치료할 수 있다 (문헌 [Lad et al., Stem Cells Dev, 2008 Aug. 8]). 또한 심근경색, 아테롬성동맥경화증 및 밸브 장애를 비롯한 심혈관 장애를 치료할 수 있다 (문헌 [Al-Aly Z., Transl Res, 2008 May;151(5):233-9]; [Kobayashi et al., Nat Cell Biol, 2009 Jan;11(1):46-55]; [van Gijn et al., Cardiovasc Res, 2002 Jul;55(1): 16-24]; [Christman et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008 Jun;294(6):H2864-70]). 일부 실시양태에서, 질환은 폐 장애 예컨대 특발성 폐 동맥 고혈압 또는 폐섬유증이다 (문헌 [Laumanns et al., Am J Respir Cell MoI Biol, 2008 Nov 21]; [Koenigshoff et al., PLoS ONE, 2008 May 14;3(5):e2142]). 일부 실시양태에서, FZD 결합 작용제에 의해 치료되는 질환은 간 질환, 예컨대 경변증 또는 간 섬유증이다 (문헌 [Cheng et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2008 Jan;294(1):G39-49]).
본 발명은 치료 유효량의 FZD 결합 작용제를 대상체 (예를 들어 치료를 필요로 하는 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 방광암, 교모세포종 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 추가로 본원에서 기재하는 항체 또는 기타 작용제를 이용하여 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 시험관내에서 세포를 FZD 결합 작용제 (예를 들어 항체)와 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 표적화된 FZD(들)을 발현하는 불멸화 세포주 또는 암 세포주를 종양 성장을 억제하기 위한 항체 또는 기타 작용제가 첨가된 배지에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포를 환자 샘플, 예컨대 조직 생검, 흉막 유출물, 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, 종양 성장을 억제하기 위한 FZD 결합 작용제가 첨가된 배지에서 배양한다.
일부 실시양태에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 생체내에서 종양 또는 종양 세포를 FZD 결합 작용제 (예를 들어 항체)와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 또는 종양 세포를 FZD 결합 작용제와 접촉시키는 것은 동물 모델에서 행한다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하기 위해 FZD 결합 작용제를 면역손상 마우스 (예를 들어 NOD/SCID 마우스)에서 성장된 1종 이상의 FZD를 발현하는 이종이식편에 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포를 환자 샘플, 예컨대 조직 생검, 흉막 유출물, 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, 면역손상된 마우스에 주사한 다음, 종양 세포 성장을 억제하기 위한 FZD 결합 작용제를 투여한다. 일부 실시양태에서, 종양 성장을 방지하기 위해 FZD 결합 작용제를 종양형성 세포의 도입과 동시에 또는 그 직후에 투여한다. 일부 실시양태에서, 종양형성 세포가 명시된 크기로 성장한 이후에 FZD 결합 작용제를 치료제로서 투여한다.
특정 실시양태에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 FZD 결합 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양을 갖고 있거나 또는 종양이 제거되었다.
특정 실시양태에서, 종양은 Wnt 신호전달이 활성인 종양이다. 특정 실시양태에서, 활성인 Wnt 신호전달은 고전적 Wnt 신호전달이다. 특정 실시양태에서, 종양은 Wnt-의존적 종양이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 종양은 액신 과다발현에 민감하다. 특정 실시양태에서, 종양은 선종성 폴립증 콜라이 (APC) 종양 억제 유전자 내에 불활성화 돌연변이 (예를 들어 절단 돌연변이) 또는 베타-카테닌 유전자 내에 활성화 돌연변이를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 종양은 Wnt 유전자 표지 내의 1종 이상의 유전자를 발현한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 치료하고자 하는 암에는 그러한 종양이 포함된다.
특정 실시양태에서, 종양은 FZD 결합 작용제 또는 항체가 결합하는 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체를 발현한다. 특정 실시양태에서, 종양은 인간 프리즐드 수용체(들)을 과다발현한다.
특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다.
또한 본 발명은 세포를 유효량의 FZD 결합 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포내에서 Wnt 신호전달을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 특정 실시양태에서, 방법은 생체내 방법이며, 세포를 작용제와 접촉시키는 단계는 치료 유효량의 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안적 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 특정 실시양태에서, 억제되는 Wnt 신호전달은 고전적 Wnt 신호전달이다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달은 WNT1, WNT2, WNT3, WNT3A, WNT7a, WNT7b, 및/또는 WNT10B에 의한 신호전달이다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달은 WNT1, WNT3A, WNT7b, 및/또는 WNT10B에 의한 신호전달이다.
또한 본 발명은 치료 유효량의 FZD 결합 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 종양형성성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 작용제의 투여에 의해 감소된다.
이에 따라, 본 발명은 또한 종양을 유효량의 FZD 결합 작용제 (예를 들어 항-FZD 항체)와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 (예를 들어 종양형성 세포를 포함하는 종양을 갖거나 또는 종양이 제거된 대상체에게 FZD 결합 작용제를 투여하는 것에 의해) 종양형성 세포를 FZD 결합 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양형성 세포를 비종양형성 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양형성 세포는 췌장 종양 세포이다. 특정 대안적 실시양태에서, 종양형성 세포는 결장 종양 세포이다.
또한 종양 세포를 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아닌 세포의 분화를 유도하기 위한, 본원에서 기재하는 FZD 결합 작용제, 폴리펩티드, 또는 항체의 용도를 제공한다. 예를 들어, 세포를 본원에서 기재하는 FZD 결합 작용제 (예를 들어 항-FZD 항체)의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 분화를 유도하는 방법이 계획된다. 또한 FZD 결합 작용제, 폴리펩티드, 또는 항체의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 종양에서 세포의 분화를 유도하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 다른 특정 실시양태에서, 종양은 결장 종양이다.
추가로, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로 상기 질환 또는 장애가 Wnt 신호전달 활성화와 관련이 있고/있거나 증가된 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수준을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 FZD 결합 작용제, 폴리펩티드, 또는 항체의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달은 고전적 Wnt 신호전달이다.
본 발명은 추가로 기질을 유효량의 FZD 결합 작용제, 폴리펩티드 또는 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 충실성 종양의 기질에서 근섬유모세포 활성화를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 본원에서 기재하는 1종 이상의 FZD 결합 작용제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 추가로 제약상 허용되는 비히클을 포함한다. 이들 제약 조성물에서 인간 환자에서 종양 성장을 억제하고 암을 치료하는 용도가 발견된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 정제된 항체 또는 작용제를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어 담체, 부형제)과 조합하는 것에 의해 보관 및 사용을 위한 제제가 제조된다 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000]). 적합한 제약상 허용되는 비히클로는 비독성 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위해 임의의 개수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는, 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액제 및 산제와 같은 (예컨대, 질 및 직장 전달을 포함한 점막으로의) 국부 투여; 폐 투여 (예를 들어, 네뷸라이저에 의한 것을 포함한, 산제 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해서; 기관내, 비내, 상피 및 경피); 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 종양내, 또는 근육내 주사 또는 투입을 비롯한 비경구 투여; 또는 두개내 (예를 들어, 경막내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다.
치료 제제는 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제제로는 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 투여를 위한 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제, 물 또는 비수성 매질 내 액제 또는 현탁액제, 또는 좌제를 들 수 있다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주 활성 성분을 제약 담체와 혼합한다. 본 발명의 화합물 또는 그의 비독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유한 고체 사전-제제화(preformulation) 조성물을 형성하는 통상적인 정제화 성분으로는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘 또는 검, 및 기타 희석제 (예를 들어, 물)를 들 수 있다. 이어서, 상기 고체 사전-제제화 조성물을 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분화한다. 신규 조성물의 정제, 환제 등을 코팅하거나 다르게는 배합하여 지속 작용의 이점을 주는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분으로 덮힌 내부 조성물을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 두 성분을, 붕해에 내성이 있어 내부 성분이 손상 없이 위를 통과하게 하거나, 또는 방출을 지연시키는 역할을 하는 장용 층(enteric layer)에 의해 분리할 수 있다. 다양한 물질을 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용할 수 있고, 이러한 물질로는 다수의 중합체 산, 및 중합체 산 및 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 들 수 있다.
항체 또는 작용제는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐은 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기재된 바와 같은 매크로에멀젼에서 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된다.
특정 실시양태에서, 제약 제제는 리포좀과 복합체를 형성한 본 발명의 항체 또는 기타 작용제를 포함한다 (문헌 [Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688]; [Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030]; 및 미국 특허 제4,485,045 및 4,544,545호). 순환 시간이 증진된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 몇몇 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포좀을 규정된 공극 크기의 필터를 통해 추출하여 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다.
또한 서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 항체를 함유한 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 들 수 있고, 여기서 상기 매트릭스는 성형품의 형태 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포 TM(LUPRON DEPOT TM) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다.
특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제를 투여하는 것에 더하여, 방법 또는 치료법은 추가로 (FZD 결합 작용제의 투여 이전, 투여와 동시, 및/또는 투여에 후속하여) 제2 항암제를 투여하는 것을 포함한다. 또한 FZD 결합 작용제 및 제2 항암제을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
FZD 결합 작용제 및 제2 함암제의 조합을 임의의 순서로 또는 함께 투여할 수 있음은 명백할 것이다. 선택된 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 사전에 제2 항암제로 처리된 환자에게 투여될 것이다. 다른 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제 및 제2 항암제는 실질적으로 동시에 또는 함께 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 항암제 (예를 들어, 화학요법)에 의한 치료 과정 동안 FZD 결합 작용제를 제공받을 수 있다. 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 제2 항암제에 의한 치료 이후 1년 이내에 투여될 것이다. 다른 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 제2 항암제에 의한 임의의 치료의 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 다른 특정 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 제2 항암제에 의한 임의의 치료의 4, 3, 2 또는 1주 이내에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, FZD 결합 작용제는 제2 항암제에 의한 임의의 치료의 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 것이다. 또한 두 작용제 또는 치료제가 대상체에 수 시간 또는 수 분 내에 (즉, 실질적으로 동시에) 투여될 수 있음은 명백할 것이다.
유용한 항암제 부류에는, 예를 들어 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 부홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 착체, 예컨대 시스플라틴, 단핵(백금), 이핵(백금) 및 삼핵 백금 착체 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항엽산제, 항대사물, 화학요법 민감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 불소화 피리미딘, 이온 투과담체, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 기능성 화합물, 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 민감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제 또는 빈카 알칼로이드 등이 포함된다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 항대사물, 항유사분열제, 토포이소머라제 억제제 또는 혈관신생 억제제이다.
FZD 결합 작용제 함께 투여될 수 있는 항암제에는 화학요법제가 포함된다. 이에 따라, 일부 실시양태에서 방법 또는 치료법은 본 발명의 항체 또는 작용제 및 화학요법제 또는 다중의 다양한 화학요법제의 칵테일을 조합 투여하는 것을 포함한다. 항체로의 치료는 화학요법제의 투여 전에, 그와 함께, 또는 그 후에 일어날 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 화학요법제에는 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능한 화학 물질 또는 약물, 예컨대 겜시타빈, 이리노테칸, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴 및 카르보플라틴이 포함된다. 조합 투여는 단일 제약 제제물로의 또는 별도의 제제를 사용하는 공동투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성 작용제들이 그의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있는 시간 내인 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투약 스케줄은 제조사의 지침에 따라 또는 숙련된 전문가가 경험적으로 결정하는 바에 따라 이용될 수 있다. 또한 이러한 화학요법을 위한 제제 및 투여 스케줄은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, Md. (1992)]에 기재되어 있다.
또한 본 발명에 유용한 화학요법제에는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (사이톡산(CYTOXAN)); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민, 및 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 비롯한 메틸라멜라민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포프아민; 데모콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL), 브리스톨-마이어스 스퀴브 옹콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴 소재) 및 독세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE), 론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플로오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 임의의 상기의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또한 화학요법제에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤)을 비롯한 항-에스트로겐; 및 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린을 비롯한 항안드로겐; 및 임의의 상기의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCL, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCL, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCL, 테니포시드 (VM-26) 및 이리노테칸을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 이리노테칸이다. 특정 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양은 결장직장 종양이며, 제2 항암제는 토포이소머라제 억제제, 예컨대 이리노테칸이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물이다. 항대사물은 정상적인 생화학 반응에 요구되는 대사물질과 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상적인 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분하게 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물에는 겜시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 나트륨, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈, 뿐만 아니라 임의의 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 겜시타빈이다. 특정 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양은 췌장 종양이며, 제2 항암제는 항대사물 (예를 들어, 겜시타빈)이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 작용제를 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아닌 항유사분열제이다. 비제한적 예로서, 작용제는 탁산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 제약상 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀 (탁소테레), 알부민-결합된 파클리탁셀 (예를 들어 아브락산), DHA-파클리탁셀, 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈데신 또는 그의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 Eg5 키네신의 억제제 또는 유사분열 키나제의 억제제, 예컨대 오로라 A 또는 Plk1이다. FZD 결합 작용제 또는 폴리펩티드 또는 항체와 함께 투여된 화학요법제가 항유사분열제를 포함하는 것인 특정 실시양태에서, 치료하고자 하는 암 또는 종양은 유방암 또는 유방 종양이다.
특정 실시양태에서, 치료법은 본 발명의 항체 (또는 기타 작용제) 및 방사선 요법의 조합 투여를 포함한다. 항체 (또는 작용제)에 의한 치료는 방사선 요법 이전에, 그와 동시에, 또는 그에 후속하여 행할 수 있다. 그러한 방사선 요법을 위한 임의의 투약 스케줄은 숙련된 진료의의 판단에 따라 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 항암제는 항체를 포함한다. 이에 따라, 치료법은 본 발명의 항체 (또는 기타 작용제)와 그 밖에 부가적인 종양 관련 항원에 대한 항체, 예컨대 EGFR, ErbB2, HER2, DLL4, 노치 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 항체의 조합 투여를 포함할 수 있다. 예시적인 항-DLL4 항체는, 예를 들어 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개공보 제US 2008/0187532에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 혈관신생 억제제인 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)이다. 추가의 항-DLL4 항체는, 예를 들어 각각 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개공보 제WO 2008/091222 및 WO 2008/0793326, 및 미국 특허 출원 공개공보 제US 2008/0014196, US 2008/0175847, US 2008/0181899 및 US 2008/0107648에 기재되어 있다. 예시적인 항-노치 항체는, 예를 들어 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개공보 제US 2008/0131434에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 혈관신생 억제제인 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)이다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 노치 신호전달의 억제제이다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 아바스틴 (베바시주맙), 헤르셉틴 (트라스투주맙), 벡티빅스 (파니투무맙) 또는 에르비툭스 (세툭시맙)이다. 조합 투여는 단일 제약 제제로의 또는 별도의 제제를 사용한 공동투여, 또는 임의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제들이 그의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있는 시간 내로의 연속 투여를 포함할 수 있다.
또한 치료는 1종 이상의 시토카인 (예를 들어, 림포킨, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)의 투여를 포함할 수 있거나, 암 세포의 외과적 제거 또는 치료의에 의해 필요한 것으로 여겨지는 임의의 다른 치료법이 동반될 수 있다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 작용제의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 항체 또는 작용제가 치료를 위해 투여되는지 아니면 예방 목적을 위해 투여되는지, 이전 요법 및 환자의 임상 이력 등에 따라 좌우되고, 이들 모두는 치료의의 판단에 따른다. 항체 또는 작용제는 한번에, 또는 수 일 내지 수 개월 동안 지속하는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유되거나 질환 상태의 축소(예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투여 스케줄은 환자의 체내 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있으며, 개별 항체 또는 작용제의 상대적 효능에 따라 달라질 것이다. 투여의는 최적의 투여량, 투여 방법론 및 반복 속도를 용이하게 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여량은 체중 kg당 0.01 ㎍ 내지 100 mg이며, 매일, 매주, 매달 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 다른 FZD 결합 작용제는 매 2 주마다 1회 또는 매 3 주마다 1회 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 다른 FZD 결합 작용제의 투여량은 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg이다. 치료의는 체액 또는 체조직 내에서의 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여를 위한 반복 속도를 추정할 수 있다.
V. Wnt 유전자 표지 및 그의 용도
본 발명은 추가로 종양에서의 Wnt 신호전달 활성을 보여주는 유전자 표지인 Wnt 유전자 표지를 제공하며, 이는 종양, 환자, 및/또는 요법을 선별하는데 사용될 수 있다.
Wnt 유전자 표지는 Wnt 신호전달이 활성화되지 않은 종양에 비해 Wnt 신호전달이 활성화된 (및/또는 Wnt 신호전달에 의존적인) 종양에서의 일련의 유전자의 차별적인 발현을 포함한다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달은 고전적 Wnt 신호전달이다. Wnt 유전자 표지는 Wnt 신호전달 억제제 (예를 들어 적어도 하나의 인간 프리즐드 수용체의 길항제 및/또는 Wnt 신호전달 억제제인 FZD 결합 작용제)에 의한 치료에 반응할 것으로 예상되는 종양 및/또는 환자를 확인하는데 유용하다.
특정 실시양태에서, Wnt 유전자 표지는 하기 표 3에 열거한 1종 이상의 유전자 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19종의 유전자)를 포함한다. "프로브 세트 ID" 번호는 진칩(GeneChip)® 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 ("HG_U133_Plus_2"; 아피메트릭스(Affymetrix), 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 대한 프로브 세트 ID 번호이다. Wnt 신호전달이 활성인 종양 (즉, Wnt 유전자 표지에 대해 양성인 종양)에서, Wnt 유전자 표지를 포함하는 표 3의 유전자(들)의 발현 수준(들)은 Wnt 신호전달이 활성이 아닌 종양에 비해 상승된다. 일부 실시양태에서, Wnt 유전자 표지는 하기 표 3에 열거한 2 이상의 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt 유전자 표지는 하기 표 3에 열거한 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상, 13종 이상, 14종 이상, 15종 이상, 16종 이상, 17종 이상, 18종 이상, 또는 19종의 유전자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표 3의 1종 이상의 유전자의 발현 수준에 대해 평가되는 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, Wnt 유전자 표지는 AXIN2 및/또는 FOXQ1을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이고, Wnt 유전자 표지는 AXIN2, LGR5, 및/또는 FOXQ1을 포함한다.
Figure 112011030538926-pct00003
또한 Wnt 경로 억제제로 치료하는데 적합하거나 또는 특정 요법의 효능을 평가하는데 적합한 환자를 선별하기 위한 (또는 환자를 확인하기 위한) Wnt 유전자 표지의 사용 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달 억제제는 FZD 결합 작용제, 예컨대 길항제 FZD 항체이다. 예를 들어, 환자는 환자의 종양 또는 환자로부터 제거된 종양이 Wnt 유전자 표지를 나타내는지 여부를 판단하는 것에 의해 FZD 결합 작용제 (또는 FZD 결합 작용제)에 의한 치료가 적합한 환자인지 확인될 수 있다. 특정 실시양태에서, Wnt 유전자 표지를 검출하는 것은 종양에서 표 3에 나타낸 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 평가하는 것을 포함한다. Wnt 유전자 표지를 포함하는 표 3의 1종 이상의 유전자의 발현 수준이 종양에서 상승될 경우 (이에 따라 Wnt 신호전달이 종양에서 활성임이 표시될 경우), 환자는 Wnt 신호전달을 억제하는 FZD 결합 작용제, 예컨대 항-FZD 항체로 치료하는데 적합한 환자로서 확인된다. 특정 환자에 대해 적합한 요법을 선별하기 위해 Wnt 유전자 표지를 사용하는 방법도 마찬가지로 제공된다.
본 발명은 (a) 종양에서 표 3의 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 제공하는 단계 (b) 1종 이상의 유전자의 발현 수준에 기초하여 FZD 결합 작용제에 의한 치료를 개시 또는 계속하기 위한 환자를 선별하는 단계, 및 (c) 환자에게 FZD 결합 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖고 있는 환자 또는 종양이 제거된 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 종양에서 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 대조군 또는 참조 수준과 비교한다.
또한 Wnt 신호전달 억제제에 의한 치료에 반응할 수 있는 종양을 확인하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, Wnt 신호전달 억제제는 FZD 결합 작용제이다. 특정 실시양태에서, 방법은 Wnt 유전자 표지에 대해 종양을 시험하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 종양에서 표 3의 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 평가하는 것을 포함한다.
또한 Wnt 유전자 표지를 나타내는 것으로 확인된 종양에 대한 약물 후보를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 약물 후보는 Wnt 신호전달 억제제이다. 그러한 약물 후보는 바람직하게는 Wnt 신호전달이 활성이고/거나 Wnt 신호전달 의존적인 종양에 대한 효능에 대해 시험된다. 또한 본 발명은 (a) 종양에서 표 3의 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 평가하는 단계, (b) 1종 이상의 유전자의 발현 수준에 (적어도 일부) 기초하여 약물 후보로 시험하기 위한 종양을 선별하는 단계, 및 (c) 종양에 대한 약물 후보의 효과를 시험하는 단계를 포함하는, 약물 후보를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한 특정 실시양태에서, Wnt 유전자 표지에 대한 약물의 효과를 판단할 수 있고, Wnt 신호전달이 활성인 종양을 치료하는데 있어서의 효능을 평가하는데 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이는 환자의 치료를 모니터링하는 방법을 제공한다. 일부 대안적 실시양태에서, 이는 약물 후보의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 표 3의 1종 이상의 유전자의 발현 수준이 감소된 것은 (즉, Wnt 유전자 표지의 감소 또는 제거는) 치료의 효능을 나타낸다.
특정 실시양태에서, Wnt 유전자 표지 중에서 1종 이상의 유전자의 수준을 평가하는 것은 1종 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 판단하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, Wnt 유전자 표지를 검출하는 것은 표지를 포함하는 1종 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드의 mRNA 발현을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 발현의 검출은 노던 블롯을 통하여 행한다. 일부 실시양태에서, mRNA 발현의 검출은 암 줄기 세포 표지를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭시키는 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR, 실시간 PCR 또는 정량적 PCR을 통하여 행한다. 특정 실시양태에서, mRNA의 검출은 샘플을 암 줄기 세포 유전자 표지를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 프로브에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플의 mRNA를 검출 이전에 cDNA로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, mRNA의 검출은 Wnt 유전자 표지 중의 1종 이상의 유전자에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이를 통하여 행한다.
특정 실시양태에서, Wnt 유전자 표지 중의 1종 이상의 유전자의 수준을 평가하는 것은 1종 이상의 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 폴리펩티드 발현 생성물의 수준을 평가하는 것은 샘플을 폴리펩티드에 특이적인 항체에 노출시키고, 예를 들어 정량적 면역형광법 또는 ELISA에 의해 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다. 그 밖의 검출 수단이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제6,057,105호를 참조한다.
또한 엄격한 조건하에서 표 3의 1종 이상의 유전자에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이를 제공한다. 또한 그러한 어레이를 포함하는 키트를 제공한다.
또한 표 3의 1종 이상의 유전자의 발현 생성물에 결합하는 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
VI. FZD 결합 작용제를 포함하는 키트
본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 기타 작용제를 포함하고 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체에 대한 적어도 하나의 정제된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는, 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지침서, 및 분석 및 결과의 표시를 위한 임의의 분석용 소프트웨어를 비롯한, 검출 검정을 수행하기 위해 필수이고/이거나 충분한 성분을 함유한다. 당업자는 개시되어 있는 본 발명의 항체 또는 작용제가 당업계에 잘 알려져 있는 확립된 키트 포맷들 중 하나에 용이하게 도입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
추가로, FZD 결합 작용제 (예를 들어 FZD 결합 항체), 뿐만 아니라 제2 항암제를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈 또는 이리노테칸)이다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 혈관신생 억제제이다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 노치 신호전달의 억제제 (예를 들어 항-DLL4 또는 항-노치 항체)이다.
또한 FZD 결합 작용제 및 상기 표 3의 1종 이상의 유전자 ("예시적인 Wnt 유전자 표지 유전자")의 발현을 평가하기 위한 시약 또는 시약들을 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용의 실시양태는, 본 개시내용의 특정 항체의 제조 및 본 개시내용의 항체의 사용 방법을 상술하는 하기의 비제한적 실시예를 참고하여 추가로 규정될 수 있다. 물질 및 방법 둘 다에 대한 많은 변형이 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 실행될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 설명을 위한 것이며, 이러한 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이고, 이는 본 출원의 취지 및 범위 내에 포함됨을 이해한다.
실시예 1
항-FZD 항체의 확인/생성
파지 디스플레이를 이용하여 1종 이상의 인간 프리즐드 수용체를 특이적으로 인식하는 인간 항체를 단리할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체 가변 도메인을 함유하는 합성 항체 라이브러리를 인간 FZD7 수용체의 세포외 도메인의 특이적이고 높은 친화도 인식에 대해 패닝할 수 있다. 목적하는 특징을 갖는 특이적 Fab가 확인되면, CHO 세포에서 인간 항체를 발현시키기 위해 Fab의 인간 가변 영역을 인간 IgG2 중쇄 및 경쇄 (카파 또는 람다)를 함유하는 Ig 발현 벡터에 클로닝한다.
파지 디스플레이를 사용하여 FZD7의 세포외 도메인에 결합하는 특이적 Fab, 18R8을 확인하였다. 인간 Fab 파지 라이브러리로부터의 2×1013 Fab 디스플레이 파지 입자를 비활성적으로 고정된 재조합 FZD7 ECD Fc 단백질과 인큐베이션하였다. 비-특이적 파지를 세척에 의해 제거한 다음, 특이적 파지를 DTT로 용출하였다. 용출된 생성물을 사용하여 TG1 F+ 박테리아를 감염시키고, 헬퍼 파지로 회복시켰다. 이어서 Fab 디스플레이를 IPTG (0.25 mM)로 유도하였다. 이러한 회복 라운드 1의 생성물은 추가의 선별 라운드를 위한 출발점으로서 작용하였다. 선별을 라운드 3까지 계속한 다음, 생성물을 ELISA에서 재조합 FZD7 ECD Fc 단백질에 대해 특이적인 Fab에 대해 스크리닝하였다. 인간 FZD7에 특이적으로 결합하는 Fab를 확인하였다.
확인된 Fab의 가변 영역 서열을 수득하였다. N-연결된 글리코실화 부위를 부위 지정 돌연변이유발을 통해 모 서열로부터 제거하였다. 중쇄 CDR1 내의 N-연결된 글리코실화 부위, Asn을 His로 바꾸었다. 이러한 돌연변이는 포유동물 시스템에서 발현되는 동안 글리코실화를 방지하기 위한 것이다. 생성된 Fab를 18R8로 지정하였다. 18R8의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 하기 표 4에 나타낸다. 18R8의 VH 및 VL 서열을 각각 서열 10 및 서열 12로 제공하였다.
Figure 112011030538926-pct00004
18R8 Fab의 VH-CH1 사슬을 18R8이 확인된 본래의 Fab 파지 라이브러리로부터의 다양한 VL-CL 사슬과 회합시켜 항-FZD Fab 18R5를 생성하였다. 고정된 재조합 FZD7 ECD Fc 단백질로 3 라운드 패닝한 이후에 라이브러리로부터 18R5를 단리하였다. 18R5의 CDR 서열을 상기 표 4에 나타낸다. 18R5 항체의 VL은 서열 14에 나타낸 서열을 갖는다. 18R5 항체의 중쇄 CDR 및 VH는 18R8 항체에서의 그것과 동일하다.
CHO 세포에서 발현시키기 위해 18R8 및 18R5 Fab의 인간 가변 영역을 인간 IgG2 중쇄 및 경쇄 (람다)를 함유하는 Ig 발현 벡터에 클로닝하였다. 18R8 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 (신호 서열을 포함함)을 각각 서열 11 및 서열 13으로 제공한다. 각각의 사슬의 아미노산 서열의 N-말단에서의 신호 서열은 분비시에 절단된다. 18R8 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 각각 서열 18 및 서열 20으로 제공한다. 18R5 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열 11 및 서열 15로 제공한다. (역시, 각각의 사슬의 아미노산 서열의 N-말단에서의 신호 서열은 분비시에 절단된다.) 18R5 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 각각 서열 18 및 서열 22로 제공한다. 단백질 A 정제를 사용하여 항체를 정제하였다.
18R8 및 18R5 항체의 KD를 비아코어 라이프사이언시즈(Biacore Lifescience) (GE 헬스케어(GE Healthcare)) 사의 비아코어 2000 시스템을 사용하여 판단하였다. 구체적으로, 정제된 항-Fzd7 항체를 HBS-P (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005％ v/v 계면활성제 P20) 중에서 2배 증분으로 100에서 0.78 nM까지 연속 희석하였다. 각각의 희석액을 CM5 비아코어 칩 상에 고정된 재조합 Fzd Fc 단백질에 대해 시험하였다. 회합율 및 해리율을 측정하고, 비아이밸루에이션 소프트웨어 프로그램(Biaevaluation software program)을 사용하여 KD 값을 판단하였다 (하기 표 5).
Figure 112011030538926-pct00005
실시예 2
항-FZD 항체의 FACS 분석은 다중 세포 표면 인간 FZD에 대한 결합을 입증하였다
유동세포계수 분석을 사용하여 항체가 세포 표면 발현된 FZD 단백질에 결합하는 능력을 판단하였다.
선택된 FZD 단백질의 왕성한 세포 표면 발현을 가능하게 하기 위해, 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 FZD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 CMV 프로모터 상류를 포함하는 포유동물 발현 플라스미드를 생성하였다 (그러한 구축물을 "FL no 플래그"라 명명함). 10종의 인간 프리즐드 단백질 각각에 대해 유사한 발현 벡터를 생성하였다. 또한 FZD 발현 벡터의 별법적 버전을 제조하였고, 여기서 성숙한 FZD 단백질의 N-말단에 융합된 N-말단 신호 서열-플래그 에피토프 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 표준 재조합 기술을 이용하여 생성하였다 (그러한 구축물을 "FL 플래그"라 명명함). 추가로, N-말단 신호 서열-플래그 에피토프에 융합된 FZD의 CRD 도메인 (또한 "fri" 도메인이라고도 칭함) 또는 FZD 단백질의 전체 N-말단 세포외 도메인 (각각 "fri 플래그" 및 "ECD 플래그"라 명명함), 뿐만 아니라 인간 CD4 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인을 코딩하는 C-말단 부분으로 구성된 키메라 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드를 디자인하였다.
유동세포계수법에 의해 항체의 FZD에 대한 결합을 측정하기 위해, HEK293 세포를 FZD 발현 벡터 및 형질감염 마커 GFP로 공동형질감염시켰다. 형질감염 24 내지 48 시간 이후에, 세포를 현탁액 중에 수집하고, 얼음상에서 항-FZD 항체 (달리 나타내지 않는 한 10 ㎍/ml) 또는 대조군 IgG와 인큐베이션하여 배경 항체 결합을 검출하였다. 세포를 세척하고, Fc 도메인 특이적 2차 항체에 의해 검출되는 1차 항체를 형광 발색단에 접합시켰다 (예를 들어 피코에리트린 접합된 항-인간 IgG). 이어서 표지된 세포를 유동세포계수법에 의해 분석하여 FZD 단백질의 세포 표면 발현을 특이적으로 인식하는 항-FZD 항체를 확인하였다. 모노클로날 항체 18R5 및 18R8은 형질감염된 세포 상의 FZD를 인식하였다. 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 18R8 및 18R5는 둘 모두 FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8을 비롯한 다중 FZD에 결합하였다. 18R8 및 18R5가 각각의 FZD 단백질에 결합하는 상대적 능력을 조사하기 위해, 결합 반응에서 항체량을 달리하여 적정 분석을 행하였다 (도 2). 이 분석에 의해, 18R5가 18R8 보다 각각의 FZD (FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8) 수용체에 대해 더 큰 결합능을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3 18R8 및 18R5에 의한 Wnt 신호전달의 억제
항-FZD IgG 항체 18R8 및 18R5가 Wnt 신호전달 경로의 활성화를 차단하는 능력을 루시페라제 리포터 검정을 이용하여 시험관내에서 판단하였다.
STF293 세포를 항생제 및 10％ FCS가 보충된 DMEM 중에서 배양하였다. STF293 세포는 다음과 같은 것이 안정적으로 통합된 293 세포이다: (1) 고전적 Wnt 신호전달 수준을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 프로모터 상류에 연결된 7개의 카피의 TCF 결합 부위를 함유하는 8xTCF Luc 리포터 벡터 (문헌 [Gazit et al., 1999, Oncogene 18:5959-66]) 및 (2) 형질감염 효율에 대한 내부 대조군으로서 레닐라 루시페라제 리포터 (프로메가; 위스콘신주 매디슨 소재). 상기 세포를 배양 플레이트에 첨가하였다. 시험할 FZD 항체를 첨가하였다 (또는 어떤 항체도 첨가하지 않았다). 이어서 세포를 Wnt3a (ATCC CRL-2647)를 안정적으로 발현하는 L 세포로부터 제조된 Wnt3 A-조건화 배지의 존재 또는 부재하에서, 또는 Wnt3A (ATCC 세포주 CRL-2648)를 과다발현하지 않는 L 세포로부터의 대조군 조건화 배지에서 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 반딧불이 루시페라제 활성을 레닐라 루시페라제 활성에 대해 표준화한 이중 루시페라제 검정 키트 (프로메가; 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 루시페라제 수준을 측정하였다.
이어서, 18R8 및 18R5 항체가 Wnt-유도된 경로 활성화를 억제하는 능력을 판단하였다. STF293 세포를 상이한 농도의 18R8 또는 18R5 IgG 항체로 처리하고, Wnt3A-조건화 배지를 첨가하였다. 세포를 이중 루시페라제 검정 키트를 이용하여 18 시간 후에 검정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. Wnt3a 경로의 TCF 신호전달이 항-FZD 항체 18R5에 의해 크게 억제되었음이 관찰되었다.
추가의 실험에서, 18R8 항체가 다양한 Wnt 리간드에 의한 신호전달에 대해 길항작용을 하는 능력을 판단하였다. HEK 293 세포를 퓨진 6 (로슈)에 의해 48 시간 동안 Wnt1, Wnt2, Wnt2b2, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt9b, 및 Wnt10b로 형질감염시켰다. Wnt3A 조건화 배지 ("WNT3ACM")를 활성화의 양성 대조군으로서 사용하였다. STF293 세포를 항생제 및 10％ FCS가 보충된 DMEM 중에서 배양하고, 20 ㎍/ml 18R8 항체로 처리하거나 어떤 항체로도 처리하지 않았다. 이어서 Wnt-과다발현 HEK293 세포를 첨가하였다. 처리 18 시간 후, 이중 루시페라제 검정 키트를 이용하여 루시페라제 수준을 측정하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 항-FZD 항체 18R8은 Wnt3A에 더하여 Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt7A, Wnt7B, 및 Wnt10B를 억제하는 것을 비롯하여 다양한 Wnt의 신호전달을 억제하는 것으로 나타났다.
실시예 4 18R8는 FZD가 Wnt에 결합하는 것을 차단한다
FZD가 Wnt에 결합하는 것을 차단하는 18R8의 능력을 평가하기 위해, Fri 도메인 (인간 IgG1 Fc에 인 프레임 연결된 FZD8의 아미노산 1-157)을 함유하는 2 ㎕의 1.32 ㎍/㎕ 가용성 FZD8-Fc를 단독으로 또는 18R8 IgG 항체 (4 ㎕의 3.71 ㎍/㎕로서 첨가됨)의 존재하에서 Wnt3A (20㎕의 Wnt3A 조건화 배지로서 첨가됨)와 결합하도록 배양 배지에 첨가하였다. 혼합물을 단독으로 또는 단백질 A 세파로스 비드 (GE 헬스케어 프로덕츠(GE Healthcare products); 20㎕의 PBS 중의 50％ 용액)의 존재하에서 4℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 각 샘플 내의 단백질 A 비드 (및 단백질 A 비드와 복합체를 형성한 임의의 단백질)를 스피닝에 의해 제거하고, 상청액에 대해 8xTCF 루시페라제 활성을 유도하는 능력을 검정하였다. 고전적 Wnt 신호전달 수준을 측정하기 위해 상청액을 8xTCF (반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 TCF-결합 도메인 상류의 8개의 카피)를 안정적으로 발현하는 STF293 세포에 첨가하고, 항생제 및 10％ FCS가 보충된 DMEM 중에서 배양하였다. STF293 세포를 처리하고 18 시간 후에, 이중 루시페라제 검정 키트 (프로메가; 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 루시페라제 수준을 측정하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Wnt 3A 플러스 단백질 A는 루시페라제 유닛 (RLU)으로 측정된 바와 같이 리포터 유전자의 강력한 활성화를 유도하였다 (도 5, 1열). Fzd8-fc의 첨가는 Wnt 3A-Fzd8 및 단백질 A 세파로스 비드와 Fc 융합 단백질 사이에 복합체형성을 유도하였고, 단백질 A-Wnt3A-Fzd8 복합체를 원심분리에 의해 제거하였고, 생성된 상청액은 더 이상 리포터 유전자를 활성화할 수 없었다 (도 5, 2열). 18R8의 첨가시, 항체가 Fzd8의 Wnt3 A 상호작용 도메인을 차단하는 것에 의해 아마도 이러한 복합체형성은 저해될 것인데, 이는 단백질 A-Fzd8-fc 복합체형성이 18R8 자체적 Fc 부위를 통해 단백질 A와 쉽게 상호작용할 수 있는 18R8에 의해 제거될 것이기 때문이며, 리포터 활성은 쉽게 관찰될 수 있고, 이는 복합체를 형성하지 않은 충분한 수준의 Wnt 3A를 시사한다 (도 5, 3열). 18R8은 또한 STF293 세포 상에 존재하는 내인성 Fzd에 대해 기능하는데, 이는 단백질 A에 의한 18R8의 제거 실패가 Wnt 3A 활성화를 회복시키는 것으로 보이지 않기 때문이다 (도 5, 6열).
도 5의 데이터는 인큐베이션 반응에서의 18R8 IgG 항체의 존재가 FZD8-Fc 단독의 경우에서 관찰된 활성에 비해 상청액 내에서 Wnt3 A 활성을 정체시킴을 보여준다. 이러한 결과는 18R8이 FZD8이 Wnt3A에 결합하는 능력을 차단함을 나타내고, 18R8에 의해 인식되는 에피토프에 결합한 항체는 Wnt-FZD 상호작용을 차단할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5
18R8 및 18R5의 에피토프 맵핑
18R8 IgG 항체에 의해 인식되는 FZD 에피토프를 확인하기 위해, 에피토프 맵핑을 수행하였다. 세포 표면 발현된 FZD의 유동세포계수 분석은 항체 결합을 측정하는데 사용하였다. 표준 재조합 기술을 이용하여, FZD8의 Fri 도메인의 N-말단에 이어 차례로 CD4 단백질의 막횡단 도메인 및 세포내 도메인에 융합된 N-말단 신호 서열 플래그 에피토프 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 CMV 프로모터 상류를 포함하는 포유동물 발현 플라스미드 벡터를 생성하였다. 이러한 발현 구축물은 세포 표면 상에 FZD8 Fri 도메인 뿐만 아니라 발현을 모니터링하기 위한 플래그 에피토프 태그의 발현을 가능하게 하였다. 이어서, 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여 FZD의 세포외 도메인 내에 선택된 아미노산을 변형시켰다. HEK293 세포를 FZD 및 형질감염 마커 GFP를 코딩하는 발현 벡터로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 48 시간 후에, 세포를 현탁액 중에 수집하고, 얼음상에서 항-FZD 항체 또는 대조군 IgG와 함께 인큐베이션하여 배경 항체 결합을 검출하였다. 세포를 세척하고, 1차 항체를 형광 발색단에 접합된 항-항체 2차 항체로 검출하였다. 이어서, 표지된 세포를 유동세포계수법에 의해 분석하여 세포 표면 FZD에 대한 항-FZD 항체의 결합을 측정하였다.
이러한 방식으로, 항-FZD 항체의 결합에 중요한 FZD 세포외 도메인 내의 특이적 아미노산을 확인하였다. FZD8의 아미노산 잔기 82-83을 PD에서 SQ로 돌연변이화하였을때, 18R8에 의한 FZD8의 결합은 대체로 영향을 받지 않았다 (도 6). 유사하게, 아미노산 109S를 109Q로 바꾸었을때, 결합에 대해 어떤 주목할 만한 효과도 관찰되지 않았다. 한편, FZD8의 잔기 70-71을 HQ에서 AE로 바꾸었을때, 18R8에 의한 세포상 FZD8에 대한 결합은 분명하게 감소되었다 (도 6 및 도 7). 아미노산 66-67을 GL에서 AA로 돌연변이화하였을때, 또는 아미노산 68-69를 EV에서 QL로 돌연변이화하였을때, 또는 아미노산 126-127을 FG에서 NV로 돌연변이화하였을때, 세포상 FZD8에 대한 18R8 항체의 결합은 유사하게 상실되었다. 특정 아미노산을 치환하였을때 FZD에 대한 결합이 상실되는 것은, 그러한 FZD의 세포외 도메인이 항체의 특이적 인식 부위임을 나타낸다. 이에 따라, 항체 18R8은 FZD8의 아미노산 66-71 GLEVHQ (서열 25) 및 인간 FZD8의 아미노산 124-128 GF를 포함하는 에피토프에 결합하는 것으로 판단되었다. 이러한 에피토프 영역은 FZD8이 결합하는 인간 프리즐드 수용체 (즉, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, 및 FZD8) 사이에서는 널리 보존되어 있지만, FZD8이 결합하지 않는 인간 프리즐드 수용체 (즉, FZD3, FZD4, FZD6, FZD9, 또는 FZD10)에서는 고도로 보존되어 있지 않다.
세포상 야생형 및 돌연변이체 FZD8에 대한 18R5 IgG 및 18R8 IgG의 결합을 비교하기 위한 FACS 실험을 또한 수행하였다. 이러한 실험에 의해 18R8 항체 및 18R5 항체가 FZD8 상의 유사한 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 7).
실시예 6
생물학적 결합 부위 (FZD 수용체의 BBS)의 확인
Wnt 신호전달을 억제하는 항체의 발견 및 이들 항체에 의해 결합되는 FZD 단백질 내의 에피토프의 발견은 FZD 단백질 구조의 영역이 Wnt 신호전달에 중요한지를 분석하는 것을 가능하게 하였다. 이를 조사하기 위해, 마우스 Fzd 8의 Fri 도메인의 결정 구조를 조사하였다. 본 발명자들은 종전에는 특이적 기능적 역할이 인식되지 않았던 FZD 구조의 영역 내에 자리잡고 있는 18R8 및 18R5의 결합 에피토프를 확인하였다. 또한 그러한 에피토프는 틈에 의해 분리된 Fzd의 2개의 구분되는 표면 요소 (본 발명자들은 "상부 가장자리" 및 "하부 가장자리"라 명명함)를 함유하였다. 또한 10 종의 인간 프리즐드 수용체를 비교했을때, 이러한 틈의 하부에 정렬된 아미노산의 동일성이 놀랍게도 보존되어 있음을 확인하였다. 18R8 및 18R5가 결합하는 이러한 틈 뿐만 아니라 "상부 가장자리" 및 "하부 가장자리"를 포함하는 영역을 FZD의 생물학적 결합 부위 (BBS)로 지정하였다. 도 9에 나타낸 것은 종전에 보고된 마우스 FZD8의 결정 구조의 분석 (문헌 [Dann CE et al., Nature 412 (6842) 86-90, 2001]) 및 소프트웨어 프로그램 피몰을 이용하여 행한 분석에 기초한 Fzd Fri 도메인의 구조의 영상이다. 상단 좌측 영상에 나타낸 것은 백색 원형으로 표시한 생물학적 결합 부위 (BBS)를 포함하는 Fzd 단백질 영역을 갖는 FZD Fri 도메인의 표면도이다. BBS의 "상부 가장자리", "하부 가장자리" 및 "틈"으로 지정한 영역을 각각 패널의 하단에 개별 영상으로 보다 짙은 표면 색으로 강조표시하였다. 도 9의 상단 우측 영상은 10종의 인간 Fzd 패밀리 구성원의 9종 또는 10종에 보존되어 있는 잔기를 보다 짙은 표면으로 강조표시하였다.
실시예 7
18R5에 의한 생체내 종양 성장의 억제
18R5에 의한 Wnt-의존적 종양 성장의 방지
5-7 주령의 암컷 NOD/SCID 마우스에 50,000개의 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV)-WNT1 종양 유래 세포를 상부 우측 유방 지방체에 주사하였다. 트랜스제닉 (MMTV)-Wnt-1 마우스는 증식증, 침윤성 관암종, 및 원격전이를 비롯한 별개의 유방 종양형성 단계를 나타내었고, 이에 따라 이러한 마우스 유방암 모델은 종양 형성 및 성장에서 Wnt의 역할을 분석하는데 유용한 도구를 제공한다 (문헌 [Nusse and Varmus (1982) Cell 31 :99-109]). 이러한 마우스로부터 종양을 떼어내고, 떼어낸 종양 세포를 종양 증식 목적으로 사용하였다. 유방 지방체에 이식된 종양 세포를 갖는 마우스를 한 주에 2회 모니터링하였다. 종양이 감지되면, 종양을 매주 2회 측정하고, ½(a x b2)의 공식을 이용하여 종양 부피를 판단하였다 (상기 식에서 a = 길이이고, b = 너비임). 데이터는 평균 및 평균 ±S.E.M으로 나타내었다. 스튜던트의 양방 t 시험(Student's two-tailed, unpaired t test)을 이용하여 그룹 평균을 비교하였다. 현저한 차이로서 0.05 미만의 확률(p) 값이 해석되었다. 19일 째에, 평균 종양 부피가 44 mm3인 마우스를 각각 10 마리씩 2 그룹으로 무작위화하였다. 동물에 대조군 항체, 또는 18R5 IgG 항체 (10 mg/kg)를 주사하였다. 항체의 투여는 매주 2회 복강내 주사를 통해 행하였다. 항체 18R5에 의한 처리는 대조군 항체로 처리한 종양에 비해 종양 성장을 완전히 차단하였다 (도 10; p = 0.002).
18R5 및 이리노테칸의 조합물 처리에 의한 0MP-C28 이종이식 종양 성장의 감소
또 다른 실시양태에서, 항-FZD 항체에 대해 OMP-C28 결장 종양 이종이식의 성장을 감소시키는 능력을 평가하였다. 떼어낸 인간 OMP-C28 세포 (동물 당 10,000)를 6-8 주령의 수컷 NOD/SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양 성장을 매주 모니터링하고, 종양이 감지되면 종양 측정을 개시하였다. 24 일째에 평균 종양 부피가 129 mm3인 마우스를 각각 10 마리씩 4 개의 그룹으로 무작위화하였다. 동물에 대조군 항체, 또는 18R5 IgG 항체 (10 mg/kg), 또는 이리노테칸 (7.5 mg/kg) 또는 18R5 및 이리노테칸 둘 모두의 조합물을 주사하였다. 항체 및 이리노테칸의 투여는 매주 2회 복강내 주사를 통해 행하였다. 종양을 한 주에 2회 측정하고, ½(a x b2)의 공식을 이용하여 종양 부피를 판단하였다 (상기 식에서 a = 길이이고, b = 너비임). 데이터는 평균 및 평균 ±S.E.M으로 나타내었다. 스튜던트의 양방 t 시험을 이용하여 그룹 평균을 비교하였다. 현저한 차이로서 0.05 미만의 확률(p) 값이 해석되었다. 18R5에 의한 처리는 도 11에 나타낸 바와 같이 종양 성장을 40％ 감소시켰다 (p = 0.02). 또한 18R5 및 이리노테칸에 의한 처리는 이리노테칸을 단독으로 처리한 경우에 비해 종양 성장을 53％ 감소시켰다 (p = 0.0002 대 이리노테칸 단독) (도 11). 즉, 18R5는 OMP-C28 결장 종양 모델에서 단독 작용제로서 뿐만 아니라 이리노테칸과의 조합물로서 항종양 성장 활성을 나타내었다.
18R5 및 겜시타빈의 조합물 처리에 의한 OMP-Pn4 이종이식 종양 성장의 감소
또 다른 실시양태에서, 항-FZD 항체에 대해 OMP-Pn4 췌장 종양 이종이식의 성장을 감소시키는 능력을 평가하였다. NOD/SCID 마우스는 하를란(Harlan) (인디애나주 인디애나폴리스 소재)에서 구입하였고, 연구이전에 수 일 동안 순응시켰다. 생체내 암 줄기 세포-유도 췌장 이종이식 모델의 확립 및 특징규명은 종전에 기재되어 있다 (문헌 [Li et al., Cancer Res., 67:1030-7, 2007]). 효능 연구를 위해, OMP-Pn4 인간 췌장 종양 세포를 단일 세포 현탁액으로 떼어내고, FACS 완충액 (2％ 열-불활성화 태아 소 혈청 및 20 mM Hepes가 보충된 행크의 균형 염류 용액 [HBSS]) 및 매트리겔(Matrigel) (BD 바이오사이언시즈(BD Bioscience), 캘리포니아주 산 호세 소재)의 1:1 (v/v) 혼합물에 재현탁시키고, 6-7 주령 수컷 NOD/SCID 마우스의 우측 옆구리 영역에 50,000개 세포/100μL를 함유하는 25-게이지 바늘로 피하 주입하였다. 종양 성장을 매주 모니터링하고, 종양이 감지되면 종양 측정을 개시하였다. 36 일째에, 평균 종양 부피가 약 120 mm3에 달하였고, 종양-보유 동물을 무작위화하였다 (그룹 당 9 마리의 4 그룹). 이틀 후에 처리를 개시하였다. 동물에 대조군 항체, 18R5 IgG 항체 (10 mg/kg), 겜시타빈 (40 mg/kg), 또는 18R5 IgG 항체 및 겜시타빈 둘 모두의 조합물을 주사하였다. 항체 및/또는 겜시타빈의 투여는 매주 1회 복강내 주사를 통해 행하였다. 종양 성장을 전자 캘리퍼 (코스트 툴스 컴퍼니(Coast Tools Company), 캘리포니아주 샌 리앤드로 소재)를 이용하여 측정하였다. 종양을 한 주에 1회 측정하고, ½(a x b2)의 공식을 이용하여 종양 부피를 판단하였다 (상기 식에서 a = 길이 (종양의 가장 긴 축)이고, b = 너비 (종양의 가장 짧은 축)임). 동물이 15％ 초과의 체중 감소를 보이면 동물을 칭량하고, 20％의 체중을 나타내면 안락사시켰다. 데이터를 평균 ±S.E.M으로 나타내었다. 그룹간 평균값의 차이를 비-파라미터 t 시험으로 분석하였다. 다중 비교는 사후 t 시험 비교와 함께 일원 ANOVA 시험을 이용하였다. p<0.05의 차이를 현저하게 상이한 것으로 간주하였다. 통계적 분석을 위한 소프트웨어로 그래프패드 프리즘4(GraphPad Prism4) (그래프패드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software Inc.), 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 사용하였다. 연구 말미에, CO2 챔버를 이용하고 경추 탈구시켜 마우스를 안락사시켰다. RNA 및 조직학 분석을 위해 종양을 수집하였다. 암 줄기 세포 빈도를 분석하기 위한 단일 세포 현탁액으로 가공하기 위해 남아있는 종양을 냉 배지 199로 옮겼다.
OMP-Pn4 이종이식 연구의 결과를 도 12에 나타낸다. 단독요법으로서 18R5 항체에 의한 처리는 본 실험에서 종양 성장을 현저하게 감소시키지 않았다. 그러나, 18R5 및 겜시타빈에 의한 처리는 겜시타빈을 처리한 것보다 42％ 더 종양 성장을 감소시켰다 (도 12; p = < 0.001 대 겜시타빈 단독). 즉, 18R5는 OMP-Pn4 췌장 종양 모델에서 승인된 진료표준 화학요법제인 겜시타빈과 함께 상승작용적 항종양 성장 활성을 나타냈다.
18R5 및 파클리탁셀의 조합물 처리에 의한 PE-13 유방 종양 성장의 감소
10,000개의 PE-13 인간 유방 종양 세포 (HER2-음성)를 NOD-SCID 마우스에 주입하고, 평균 부피가 대략 120 mm3에 달할 때까지 22일 동안 성장시켰다. 이어서 동물을 각각 10 마리의 4 그룹으로 무작위화하고, 대조군 항체, 항-FZD 18R5, 파클리탁셀 (탁솔®), 또는 18R5 플러스 파클리탁셀을 투약하였다. 도 37은 대조군 항체, 항-FZD 18R5, 파클리탁셀, 또는 18R5 플러스 파클리탁셀을 투약한 마우스에서의 평균 종양 부피를 나타낸다. 항체는 주 당 2회 IP로 10 mg/kg 투약하였다. 파클리탁셀은 주 당 1회 IP로 10 mg/kg 투약하였다. 종양을 도 37에 나타낸 날에 측정하였다. 도 38은 18R5 플러스 파클리탁셀 그룹의 개개의 동물에서의 종양 성장을 보여준다. 18R5 플러스 파클리탁셀 처리는 항종양 활성 및 확립된 유방 종양의 퇴보를 야기하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 8
암 줄기 세포 빈도에 대한 효과를 판단하기 위한 검정
제한 희석 검정법 (LDA)을 이용하여 충실성 종양 암 줄기 세포, 및 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성성에 대한 FZD 결합 작용제 또는 항체의 효과를 평가할 수 있다. 상기 검정법을 사용하여 FZD 결합 항체 또는 기타 작용제로 처리된 동물로부터의 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도를 판단하고, 이 빈도를 대조군 동물로부터의 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도와 비교할 수 있다.
OMP-C28 종양의 암 줄기 세포에 대한 18R5 및 이리노테칸 조합물 처리의 효과
상기 (실시예 7)에서 기재한 OMP-C28 이종이식 연구로부터의 대조군 및 처리된 종양을 연구 말미 (48 일)에 수확하였다. 종양을 프로세싱하고 단일 세포로 떼어내었다. 이어서, 종양 세포를 비오티닐화 마우스 항체 (α-마우스 CD45-비오틴 1:200 희석액 및 래트 α-마우스 H2Kd-비오틴 1:100 희석액, 바이오레전드(BioLegend), 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 함께 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션한 다음, 스트렙타비딘-표지된 자기 비드 (인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 첨가하여 자석의 도움하에 마우스 세포를 제거하였다.
LDA를 위해, 현탁액 내의 인간 세포를 수확하고, 계수하고, 및 FACS 완충액 중의 적절한 세포 용량 (5, 25, 및 125 세포)을 매트리겔과의 1:1 혼합물 중에서 혼합하고, NOD/SCID 마우스 (10 마우스/세포 용량/처리 그룹)에 피하 주사하였다. 종양을 4 개월까지 성장시켰다. 목적하는 시점에, 검출가능한 종양을 갖는 마우스의 백분률을 항-FZD 항체 처리된 종양 세포를 주사한 모든 그룹에서 판단하고, 대조군에서 검출가능한 종양을 갖는 마우스의 백분률과 비교하였다. 예를 들어, 검출가능한 종양을 갖는 125개의 대조군 처리된 종양 세포를 주사한 마우스의 수를 판단하고, 검출가능한 종양을 갖는 125개의 FZD 항체 처리된 종양 세포를 주사한 마우스의 수와 비교하였다. 이어서 L-CalcTM 소프트웨어 (스템셀 테크놀로지스 인크.(StemCell Technologies Inc.))를 사용하여 암 줄기 세포 빈도를 계산하였다. 간략하게, 푸아송 통계(Poisson statistics)를 기초로 하여, 37％의 동물이 종양 발생에 실패하면, 공지된 개수의 주사한 세포 중에서 암 줄기 세포는 정확하게 1개 존재한다.
세포 표면 마커의 분석을 위해, 단일 종양 세포 현탁액을 형광색소에 직접 접합된 항-ESA (바이오메다(Biomeda)) 및 항-CD44 (BD 바이오사이언시즈) 항체로 염색하였다. 사멸 세포를 생육 염료 DAPI를 이용하여 배제시켰다. FACS 아리아 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))를 이용하여 유동세포계수법을 수행하였다. 측면 산란 및 전방 산란 프로파일을 이용하여 세포 덩어리를 제거하였다. 대조군 항체로 처리된 종양의 분석에 의해 64％의 벌크 종양 군집이 ESA 및 CD44를 둘 모두 높은 수준으로 발현함이 밝혀졌다 (도 39). 이중 양성 군집은 도 39에서 볼 수 있는 바와 같이 이리노테칸을 단독으로 처리하는 것에 의해 현저하게 영향받지 않았지만 (55％), 18R5 또는 18R5의 이리노테칸과의 조합물로 처리한 경우에는 이중 양성 군집이 감소되었다 (각각 40％ 및 32％).
OMP-Pn4 종양 내 암 줄기 세포에 대한 18R5 및 겜시타빈 조합물 처리의 효과
상기 (실시예 7)에서 기재한 OMP-Pn4 이종이식 연구로부터의 대조군 및 처리된 종양을 처리 마지막 41 일째에 수확하였다. 종양을 프로세싱하고 단일 세포로 떼어내었다. 이어서, 종양 세포를 비오티닐화 마우스 항체 (α-마우스 CD45-비오틴 1:200 희석액 및 래트 α-마우스 H2Kd-비오틴 1:100 희석액, 바이오레전드, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 함께 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션한 다음, 스트렙타비딘-표지된 자기 비드 (인비트로겐, 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 첨가하여 마우스 세포를 제거하였다. 현탁액 내에 남아있는 인간 세포를 수집하고, 계수하고, 적절한 세포 용량 (30, 90, 270 및 810 세포)으로 희석하고, FACS 완충액 및 매트리겔의 1:1 (v/v) 혼합물 중에서 혼합하고, NOD/SCID 마우스 (10 마우스/세포 용량/처리 그룹)에 피하 주사하였다. 종양을 도 40에 나타낸 바와 같이 75 일 동안 성장시켰다. 도 40의 각 점은 개별 마우스의 종양 부피를 나타낸다. 검출가능한 종양을 갖는 마우스의 백분률을 항-FZD 항체 처리된 종양 세포를 주사한 모든 그룹에서 판단하고, 대조군에서 검출가능한 종양을 갖는 마우스의 백분률과 비교하였다. 예를 들어, 검출가능한 종양을 갖는 810개의 대조군 처리된 종양 세포를 주사한 마우스의 수를 판단하고, 검출가능한 종양을 갖는 810개의 FZD 항체 처리된 종양 세포를 주사한 마우스의 수와 비교하였다. L-CalcTM 소프트웨어를 사용하여 암 줄기 세포 빈도를 계산하였다. 각각의 처리 그룹에 대해 계산된 암 줄기 세포 빈도를 도 41에 나타낸다. 18R5 단독으로의 처리 및 겜시타빈과 함께 18R5로의 처리는 암 줄기 세포 빈도를 감소시킨 반면에, 겜시타빈 단독으로의 처리는 어떤 효과도 없었다.
실시예 9
FZD 항체 생산
항원 생산
인간 FZD 수용체 (FZD)의 세포외 도메인 (ECD) 또는 Fri 도메인 (Fri)의 재조합 폴리펩티드 단편을 항체 생산을 위한 항원으로서 생성하였다. 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 목적하는 인간 프리즐드 수용체 또는 수용체들의 이들 도메인의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하였다. 이들 폴리뉴클레오티드를 인 프레임 N-말단으로 인간 Fc-태그 또는 히스티딘-태그에 라이게이션하고, 곤충 세포에서의 바큘로바이러스 매개 발현을 위해 전송 플라스미드 벡터로 클로닝하였다. 표준 형질감염, 감염 및 세포 배양 프로토콜을 이용하여 상응하는 FZD 폴리펩티드를 발현하는 재조합 곤충 세포를 생성하였다 (문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]).
항원 단백질은 단백질 A 및 Ni++-킬레이트 친화도 크로마토그래피를 사용하여 곤충 세포 조건화 배지로부터 정제하였다. 정제된 항원 단백질을 PBS (pH=7)에 대하여 투석하고, 대략 1 mg/ml로 농축하고, 면역화에 대비하여 멸균 여과하였다.
면역화
표준 기술을 이용하여 마우스를 정제된 FZD 항원 단백질로 면역화하였다. 개별 마우스로부터의 혈액을 ELISA 및 FACS 분석 (하기 상세히 기재함)을 이용하여 항원 인식을 위한 최초 면역화 이후 대략 70 일째에 스크리닝할 수 있다. 가장 높은 항체 역가를 갖는 동물 2마리를 최종 항원 부스트를 위해 선별하고, 그 후 비장 세포를 하이브리도마 생성을 위하여 단리하였다. 하이브리도마 세포를 96 웰 플레이트에서 웰당 1개의 세포로 플레이팅하고, 각 웰로부터의 상청액을 항원 단백질에 대한 ELISA 및 FACS 분석에 의해 스크리닝하였다. 높은 항체 역가를 갖는 몇몇 하이브리도마를 선별하고, 정적 플라스크 배양으로 규모를 증대하였다. 항체를 단백질 A 또는 단백질 G 아가로스 크로마토그래피를 사용하여 하이브리도마 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 모노클로날 항체는 다시 FACS에 의해 시험하였고, 이는 IgG 및 IgM 항체를 선별하기 위한 동기준표본이 된다.
에피토프 맵핑
시스테인 풍부 도메인을 비롯한 FZD 세포외 도메인의 특이적 영역을 인식하는 항체를 확인하기 위해, 에피토프 맵핑을 수행하였다. 세포외 FZD 도메인의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 CMV 프로모터 상류를 포함하는 포유동물 발현 플라스미드 벡터를 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성하였다. 이어서, 일시적 형질감염에 의해 배양된 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시켰다. 형질감염 24 내지 48 시간 후, 세포를 수확하고, FZD 항원에 의해 면역화된 마우스로부터의 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 위해 세포 용해물 단백질을 SDS-PAGE 아크릴아미드 겔 상에 분리시켰다. FZD의 리간드 결합 도메인을 인식하는 항체는 추가로 ELISA에 의해 Wnt 단백질과의 경쟁 결합에 대해 분석될 수 있다.
FZD에 대한 항체에 의해 인식되는 세포외 도메인 내의 특이적 에피토프를 확인하기 위해, SPOT 시스템을 사용한다 (시그마 지노시스(Sigma Genosys, 텍사스주 더 우드랜즈 소재)). 하나의 아미노산에 의해 중첩되고 전체 FZD 세포외 도메인을 포함하는 일련의 10-잔기 선형 펩티드를 SPOT 합성 기술에 의해 합성하고 셀룰로오스 멤브레인에 공유 결합시켰다. 멤브레인을 차단 완충액과 함께 실온에서 8시간 동안 사전 인큐베이션하고, 항체와 밤새 4℃에서 혼성화시켰다. 이어서, 멤브레인을 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) (아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience), 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에 접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 재세척하고, 3-아미노-9-에틸카르바졸을 함유하는 신호 발생 용액으로 가시화하였다. 이에 따라, 항체에 의해 인식되는 특이적 에피토프를 판단하였다.
FACS 분석
천연 세포 표면 FZD 단백질을 인식하는 하이브리도마 클론에 의해 생산된 모노클로날 항체를 선별하기 위해, FACS 분석을 이용하였다. HEK293 세포를 상응하는 FZD의 전장 cDNA 클론을 코딩하는 발현 벡터 단독으로 형질감염시키거나, 또는 GFP를 발현하는 벡터와 함께 공동형질감염시켰다. 세포 표면 상에서 태그된 FZD 수용체의 발현을 확인시켜주는 플래그 에피토프 태그는 아미노 말단에 도입할 수 있다. 형질감염 24 내지 48 시간 후, 현탁액 내에서 세포를 수집하고, 항-FZD 항체, FLAG 항체, 면역 혈청 (FZD5 발현 세포에 대한 것), 또는 대조군 IgG와 함께 얼음상에서 인큐베이션하여 배경 항체 결합을 검출하였다. 세포를 세척하고, 형광 발색단에 접합된 항-마우스 2차 항체를 이용하여 1차 항체를 검출하였다. 이어서 표지된 항체를 FACS에 의해 분류하여 상응하는 FZD 수용체의 세포 표면 발현을 특이적으로 인식하는 항-FZD 항체를 확인하였다. 목적하는 인간 프리즐드 수용체(들)를 인식하는 항체를 확인하였다.
키메라 항체
FZD 수용체를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 확인한 후, 설치류 항체를 치료제로서 사용하는 경우의 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 면역 반응을 극복하기 위해 이들 항체를 변형시켰다. 선택된 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 하이브리도마 세포로부터 RT-PCR에 의해 단리하고, 포유동물 발현 벡터에서 각각 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역에 인-프레임 라이게이션하였다. 별법적으로, 동일한 플라스미드 상에 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역 유전자를 함유하는 인간 Ig 발현 벡터, 예컨대 TCAE 5.3을 사용하였다 (문헌 [Preston et al., 1998, Infection ＆ Immunity 66:4137-42]). 이어서, 키메라 항체 생성을 위해 키메라 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터를 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 공동 형질감염시켰다. 키메라 항체의 면역반응성 및 친화도를 ELISA 및 FACS에 의해 모 뮤린 항체와 비교하였다.
인간화 항체
치료제로서 키메라 항체는 여전히 빈번하게 항원성이 있어서 인간 항-키메라 항체 (HACA) 면역 반응을 생성하기 때문에, FZD 수용체에 대한 키메라 항체를 추가로 인간화할 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위해, 재조합 DNA 기술을 이용하여 상기에서 기재한 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 CDR 영역을 정확하게 배치하기 위해 요구되는 3개의 짧은 초가변 서열, 또는 상보성 결정 영역 (CDR), 및/또는 프레임워크 영역 모두로부터의 요소를 잠재적으로 포함하는, 항체의 모티프를 결정하는 특이성의 핵심 측면을 각각 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자의 배선 DNA로 조작한 다음, CHO 세포 내에서 발현시키기 위해 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다. 인간화 항체의 면역반응성 및 친화도를 ELISA 및 FACS에 의해 모 키메라 항체와 비교하였다. 추가로, 인간화 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하기 위하여 가변 영역의 부위 지정 또는 고-밀도 돌연변이유발을 이용할 수 있다.
인간 항체
일부 실시양태에서, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 FZD 수용체의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 인간 항체를 단리하였다. 단일쇄 Fv 또는 fab 도메인으로서 디스플레이되는 인간 항체 가변 도메인을 함유하는 파지 디스플레이 항체 라이브러리에 대해 상기에서 기재한 FZD 수용체 항원을 특이적이고 높은 친화도로 인식하는지 스크리닝하였다. 이어서 CHO 세포에서 인간 항체를 발현시키기 위해 확인된 가변 도메인 항체 서열을 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 함유하는 Ig 발현 벡터로 재구성시켰다.
실시예 10
특이적 에피토프를 인식하는 항체의 생산
하이브리도마로부터의 모노클로날 항체
특정 실시양태에서, 마우스를 1종 이상의 FZD 수용체 항원으로 면역화하여 FZD 수용체의 기능적 에피토프를 인식하는 항체를 생성하였다. 표준 기술을 사용하여 정제된 FZD 항원 단백질로 마우스를 면역화하였다. 특정 실시양태에서, 마우스를 별개의 FZD 수용체 항원으로 순차적으로 면역화하였다. 개개의 마우스로부터의 혈액을 초기 면역화 이후 대략 70 일째에 스크리닝하였다. FZD 항원에 대해 높은 항체 역가를 갖는 동물을 최종 항원 부스트에 대해 선별하고, 그 후 하이브리도마를 생산하기 위해 비장 세포를 단리하였다. 하이브리도마 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 1 개의 세포로 플레이팅하고, 각 웰로부터의 상청액을 ELISA 및 유동세포계수 분석에 의해 스크리닝하였다. 생물학적 결합 부위 (BBS) 내의 또는 그와 중첩되는 에피토프를 비롯한, 특이적 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체를 확인하기 위해, 하이브리도마 상청액을 목적하는 FZD(들)에 대한 항체 결합 및 목적하는 특이적 에피토프 (예를 들어 BBS) 내에 특이적 아미노산 치환을 갖는 FZD에 대한 결합 실패 둘 모두에 대해 스크리닝하였다.
인간 항체
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 FZD 수용체의 목적하는 에피토프 (예를 들어 다중 FZD에 공통적인 에피토프 및/또는 BBS 또는 그의 일부 내에 존재하거나 그와 중첩되는 에피토프)를 인식하는 항체를 확인할 수 있다. 예를 들어, 분비된 FZD의 Fri 도메인을 재조합 단백질로서 발현시키고, 10 ㎍/mL로 적절한 표면 상에 코팅하였다. 이어서 인간 파지 라이브러리를 2회 이상의 풍부화 라운드를 통해 패닝하였다 (예를 들어 문헌 [Griffiths et al., EMBO J. 12:715-34] 참조). 임의로, 별개의 FZD 단백질을 이용하여 후속 라운드의 패닝을 수행하였다. 임의로, 목적하는 표적 에피토프 영역 (예를 들어 생물학적 결합 부위 (BBS) 내의 에피토프를 포함함) 내에 특이적 아미노산 치환을 함유하는 디코이 가용성 FZD 단백질의 존재하에 각각의 라운드의 패닝을 수행하였다. 이어서 패닝 선별로부터의 산물의 개별 클론에 대해 ELISA 또는 유동세포계수 분석에 의해 목적하는 FZD 단백질(들)에 결합하는 능력을 스크리닝하고, 목적하는 에피토프에의 결합을 목적하는 표적 에피토프 내에 특이적 아미노산 치환을 함유하는 FZD 단백질에 결합의 결여에 의해 평가하였다. 이어서, 파지로부터 항원 결합 도메인을 코딩하는 유전자를 회복시키고 이를 사용하여 적합한 숙주 세포주에서 발현시키기 위해 항원 결합 도메인을 불변 영역과 연결하여 완전한 인간 항체 분자를 구축하였다. 항체를 확인하고, 본원의 다른 곳에서 기술한 바와 같이 종양 세포 성장을 방지하는 능력에 대해 시험하였다.
실시예 11
FZD 수용체에 대한 항체를 평가하기 위한 부가적인 시험관내 검정
본 실시예는 세포 증식, 경로 활성화 및 세포독성에 대한 FZD 수용체에 대해 생성된 항체의 활성을 시험하기 위한 대표적인 시험관내 검정을 기술한다.
증식 검정
다양한 암 세포주에 의한 FZD 수용체의 발현을 택맨(Taqman) 분석을 이용하여 정량하였다. FZD 수용체를 발현하는 것으로 확인된 세포주를 96 웰 조직 배양 마이크로플레이트에 웰 당 104 개의 세포 밀도로 플레이팅하고, 24 시간 동안 스프레딩하였다. 이어서 세포를 2％ FCS를 함유하는 신선한 DMEM 중에서 추가로 12 시간 동안 배양하고, 이 시점에 항-FZD 항체 대 대조군 항체를 10 μmol/L BrdU의 존재하에서 배양 배지에 첨가하였다. BrdU 표지화이후 배양 배지를 제거하고, 세포를 실온에서 30 분 동안 에탄올 중에서 고정시키고, 퍼옥시다제 접합된 모노클로날 항-BrdU 항체 (클론 BMG 6H8, Fab 단편)와 90 분 동안 반응시켰다. 기질을 테트라메틸벤지딘을 함유하는 용액 중에서 발색시키고, 15 분 후에 25 ㎕의 1 mol/L H2SO4로 정지시켰다. 색깔 반응을 450 nm 필터를 이용하여 자동화 ELISA 플레이트 판독기 (UV 마이크로플레이트 리더(UV Microplate Reader); 바이오-래드 래버러터리즈(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 리치몬드 소재)로 측정하였다. 모든 실험은 3 중으로 수행하였다. 항-FZD 항체가 세포 증식을 억제하는 능력을 대조군 항체와 비교하여 판단하였다.
경로 활성화 검정
특정 실시양태에서, FZD 수용체에 대한 항체가 Wnt 신호전달 경로의 활성화를 차단하는 능력을 시험관내에서 판단하였다. 예를 들어, 항생제 및 10％ FCS가 보충된 DMEM 중에서 배양한 HEK 293 세포를 1) Wnt 신호전달 경로를 활성화하기 위한 Wnt7B 및 FZD10 발현 벡터; 2) 고전적 Wnt 신호전달 수준을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 3 또는 8 카피의 TCF-결합 도메인 상류를 함유하는 TCF/Luc 야생형 또는 돌연변이 리포터 벡터 (문헌 [Gazit et al., 1999, Oncogene 18:5959-66]); 및 3) 형질감염 효능에 대한 내부 대조군으로서 레닐라 루시페라제 리포터 (프로메가; 위스콘신주 매디슨 소재)로 공동 형질감염시켰다. 이어서 항-FZD10 및 대조군 항체를 세포 배양 배지에 첨가하였다. 형질감염 48 시간 후, 반딧불이 루시페라제 활성을 레닐라 루시페라제 활성에 대해 표준화한 이중 루시페라제 검정 키트 (프로메가; 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 루시페라제 수준을 측정하였다. 3번의 독립된 실험을 3 중으로 수행하였다. 이에 따라 FZD 항체가 Wnt 경로 활성화를 억제하는 능력을 판단하였다.
보체 의존적 세포독성 검정
특정 실시양태에서, 면역손상 마우스 내에서 이종이식으로서 계대배양된 환자 샘플로부터 단리된 FZD 수용체를 발현하는 암 세포주 또는 암 줄기 세포를 사용하여 FZD 수용체에 대한 항체에 의해 매개된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 측정하였다. 세포를 항생제 및 5％ FBS가 보충된 200 ㎕ RPMI 1640 배양 배지에 106 세포/ml로 현탁시켰다. 이어서, 현탁된 세포를 FZD 수용체에 대한 항체 또는 대조군 항체를 함유하는 200 ㎕ 혈청 또는 열-불활성화된 혈청과 혼합하였다 (3 벌). 세포 혼합물을 1 내지 4시간 동안 37℃에서 5％ CO2 중에서 인큐베이션하였다. 이어서, 처리된 세포를 수집하고, 배양 배지에서 희석된 100 ㎕ FITC-표지된 아넥신 V에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. HBSS 중에 희석된 프로피디움 요오다이드 용액 (25 ㎍/ml) 100 ㎕를 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 수집하고, 배양 배지에 재현탁하고, 유동세포계수법으로 분석하였다. FITC 염색된 세포의 유동세포계수법으로 총 세포수를 수득하고, 총 세포수에 대한 백분률로서 사멸 세포에 의한 프로피디움 요오다이드 흡수를 이용하여 혈청 및 FZD에 대한 항체의 존재하에서의 세포 사멸을 열-불활성화된 혈청 및 대조군 항체와 비교하여 측정하였다. 이에 따라 항-FZD 항체의 보체 의존적 세포독성을 매개하는 능력을 판단하였다.
항체 의존적 세포성 세포독성 검정
면역손상 마우스 내에서 이종이식으로서 계대배양된 환자 샘플로부터 단리된 FZD 수용체를 발현하는 암 세포주 또는 암 줄기 세포를 사용하여 FZD 수용체에 대한 항체에 의해 매개된 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 측정할 수 있다. 세포를 항생제 및 5％ FBS가 보충된 200 ㎕ 페놀 레드-무함유 RPMI 1640 배양 배지에 106개 세포/ml로 현탁시켰다. 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하기 위하여 피콜-파크(Ficoll-Paque) 밀도 구배 원심분리에 의하여 헤파린처리된 말초혈로부터 단리하였다. 이어서, 표적 세포 (T)를 적어도 1종의 FZD 수용체 항체 또는 대조군 항체의 존재하에 96 웰 플레이트에서 25:1, 10:1 및 5:1의 E/T 비율로 PBMC 이펙터 세포 (E)와 혼합하였다. 대조군은 항체의 존재하에 표적 세포 단독 및 이펙터 세포 단독의 인큐베이션을 포함하였다. 세포 혼합물을 37℃에서 5％ CO2 중에서 1 내지 6시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 용해시에 방출되는 안정한 세포질 효소인 방출된 락테이트 데히드로게나제 (LDH)를 비색 검정 (사이토톡스96(CytoTox96) 비방사성 세포독성 검정; 프로메가; 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 측정하였다. 490 nm에서의 흡광도 데이터를 표준 96-웰 플레이트 판독기로 수집하고, 배경을 보정하였다. 특이적 세포독성 백분률을 다음의 방정식에 따라 계산하였다: ％ 세포독성 = 100 x (실험적 LDH 방출 - 이펙터 자발적 LDH 방출 - 표적 자발적 LDH 방출) / (표적 최대 LDH 방출 - 표적 자발적 LDH 방출). 이에 따라 FZD 수용체에 대한 항체가 항체 의존적 세포성 세포독성을 매개하는 능력을 판단하였다.
실시예 12
항-FZD 수용체 항체를 이용한 생체내 종양 성장의 방지
본 실시예는 이종이식 모델에서 종양 성장을 방지하기 위한 항-FZD 수용체 항체의 용도를 기술한다. 특정 실시양태에서, 마우스에서 이종이식으로서 계대배양된 환자 샘플로부터의 종양 세포 (충실성 종양 생검 또는 흉막 유출물)를 실험 동물에서 재계대배양하기 위해 준비하였다. 종양 조직을 멸균 조건하에서 떼어내고, 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 분쇄하고, 효소적 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 구체적으로, 흉막 유출물 세포 또는 생성된 종양 조각을 배양 배지 중에서 초순수 콜라게나제 III (mL 당 콜라게나제 200-250 단위)와 혼합하고, 15-20 분 마다 10 mL 피펫을 통해 위아래로 피펫팅하면서 37℃에서 3-4 시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 세포를 45 μM 나일론 메쉬를 통해 여과하고, RPMI/20％ FBS로 세척하고, HBSS로 2회 세척하였다. 이어서, 해리된 종양 세포를 NOD/SCID 마우스의 유방 지방체에 피하 주사하여 종양 성장을 유도하였다.
특정 실시양태에서, 해리된 종양 세포를 먼저 세포 표면 마커를 기초로 하여 종양형성 세포 및 비종양형성 세포로 분류한 후 실험 동물에 주사하였다. 구체적으로, 상기 기재한 해리된 종양 세포를 2％ 열 불활성화 송아지 혈청 (HICS)을 함유하는 Hepes 완충 염 용액 (HBSS)으로 2회 세척하고 100 ㎕ 당 106개의 세포로 재현탁시켰다. 항체를 첨가하고, 세포를 얼음상에서 20 분 동안 인큐베이션 한 후, HBSS/2％ HICS로 2회 세척하였다. 항체는 항-ESA (바이오메다(Biomeda), 캘리포니아주 포스터 시티 소재)), 항-CD44, 항-CD24, 및 계통 마커 항-CD2, -CD3, -CD10, -CD16, -CD18, -CD31, -CD64 및 -CD140b (총체적으로 Lin이라 칭함; 파밍겐(PharMingen), 캘리포니아주 산 호세 소재))를 포함하였다. 항체를 형광색소에 직접 접합시켜 상기 마커를 발현시키는 세포를 양성 또는 음성 선별하였다. 마우스 세포는 H2Kd+ 세포에 대해 선별하여 제거하고, 사멸 세포는 생존능 염료 7AAD를 사용하여 제거하였다. 유동세포계수법을 FACS밴티지(FACSVantage) (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재) 상에서 실행하였다. 측면 산란 및 전방 산란 프로파일을 사용하여 세포 덩어리를 제거하였다. 이어서, 단리된 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-종양형성 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하 주사하여 종양 성장을 유도하였다.
예로서, 항-FZD 항체에 대해 종양 세포의 성장을 감소시키는 능력을 분석하였다. 해리된 종양 세포 (동물 당 10,000 개)를 6-8 주령의 NOD/SCID 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 세포 주사 이틀 후에, 동물에 10 mg/kg의 항-FZD 항체를 주당 2회 복강내 (i.p.) 주사하였다. 성장이 검출될 때까지 종양 성장을 매주 모니터링하고, 그 시점 이후의 종양 성장을 총 8 주 동안 매주 2회 측정하였다. 이에 따라 FZD-결합 항체가 PBS 주사한 대조군에 비해 종양 성장을 현저하게 감소시키는 것이 확인되었다.
실시예 13
항-FZD 수용체 항체를 이용한 종양의 생체내 치료
본 실시예는 이종이식 모델에서 암을 치료하기 위한 항-FZD 수용체 항체의 용도를 기재한다. 특정 실시양태에서, 마우스에서 이종이식으로서 계대배양된 환자 샘플로부터의 종양 세포 (충실성 종양 생검 또는 흉막 유출물)를 실험 동물에서 재계대배양하기 위해 준비하였다. 종양 조직을 떼어내고, 작은 조각으로 절단내고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 분쇄하고, 효소적 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이어서, 해리된 종양 세포를 유방 종양의 경우에는 NOD/SCID 마우스의 유방 지방체에, 비-유방 종양의 경우에는 NOD/SCID 마우스의 옆구리에 피하 주사하여 종양 성장을 유도하였다. 별법적으로, ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-종양형성 종양 세포를 상기한 바와 같이 단리하고 주사하였다.
종양 세포를 주사한 후, 동물에서 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 평균 크기가 대략 150 내지 200 mm에 달하면, 항체 처리를 시작하였다. 각 동물에 100 ㎍ FZD 수용체 항체 또는 대조군 항체를 총 6 주 동안 주당 2 내지 5 회 i.p. 투여하였다. 이러한 6 주 동안 한 주에 2회 종양 크기를 평가하였다. 이에 따라 FZD 수용체 항체가 대조군 항체와 비교하여 추가로 종양 성장을 방지하거나 종양 크기를 감소시키는 능력을 판단하였다.
항체 처리의 마지막 시점에, 추가의 분석을 위해 종양을 수확하였다. 일부 실시양태에서, 종양의 일부를 면역형광법으로 분석하여 종양으로의 항체 침투 및 종양 반응을 평가하였다. 항-FZD 수용체 처리된 마우스 및 대조군 항체 처리된 마우스로부터 수확한 각 종양의 일부를 액체 질소 중에서 새롭게 동결시키고, O.C.T.에서 포매하고, 저온유지장치에서 10 μm 절편으로서 유리 슬라이드 상에서 절단하였다. 일부 실시양태에서, 각 종양의 일부를 포르말린-고정시키고, 파라핀-포매하고, 마이크로톰에서 10 ㎛ 절편으로서 유리 슬라이드 상에서 절단하였다. 절편을 후-고정시키고 주사된 항체를 특이적으로 인식하는 발색단 표지 항체와 함께 인큐베이션하여 종양 생검에 존재하는 항-FZD 수용체 또는 대조군 항체를 검출하였다. 또한 상이한 종양 및 종양구성 세포 유형을 검출하는 항체, 예를 들어 혈관 내피 세포를 검출하는 항-VE 카드헤린 (CD144) 또는 항-PECAM-1 (CD31) 항체, 혈관 평활근 세포를 검출하는 항-평활근 알파-액틴 항체, 증식 세포를 검출하는 항-Ki67 항체, 사멸한 세포를 검출하는 튜넬(TUNEL) 검정, 및 Wnt 신호전달을 검출하는 항-β-카테닌 항체, 및 노치 신호전달을 검출하는 항-세포내 도메인 (ICD) 노치 단편 항체를 사용하여 혈관신생, 종양 성장, 및 종양 형태에 대한 항체 처리의 효과를 평가할 수 있다.
특정 실시양태에서, 종양 세포 유전자 발현에 대한 항-FZD 수용체 항체 처리의 효과를 또한 평가하였다. FZD 항체 처리된 마우스 및 대조군 항체 처리된 마우스로부터 수확한 각 종양의 일부로부터 전체 RNA를 추출하고, 정량적 RT-PCR에 사용하였다. 예를 들어 Wnt1 및 β-카테닌을 비롯한 Wnt 신호전달 경로의 성분인 FZD 수용체 뿐만 아니라 종전에 확인된 부가적인 암 줄기 세포 마커 (CD44)의 발현 수준을 내부 대조군으로서 하우스-키핑 유전자 GAPDH와 비교하여 분석하였다. 이에 따라, FZD 수용체 항체 처리시 종양 세포 유전자 발현에서의 변화를 판단하였다.
또한 종양 내 암 줄기 세포의 빈도에 대한 항-FZD 수용체 항체 처리의 효과를 평가하였다. 대조군 항체 처리한 마우스와 대비하여 FZD로부터의 종양 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 분쇄하고, 효소적 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이어서, 해리된 종양 세포를 상기에서 상술한 바와 같이 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-표면 세포 마커 발현에 기초하여 종양형성 암 줄기 세포의 존재에 대해 FACS 분석에 의해 분석하였다.
이어서, 항-FZD 항체 처리 후 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-발현에 기초하여 단리된 세포의 종양형성성을 평가할 수 있다. 대조군 항체 처리된 마우스와 대비하여 FZD 항체 처리된 마우스로부터 단리된 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-암 줄기 세포를 NOD/SCID 마우스의 유방 지방체에 다시 피하 주사하였다. 이로써 지속적인 종양 형성에 요구되는 주사되는 세포의 수에 기초하여 암 줄기 세포의 종양형성성을 판단하였다.
실시예 14
Wnt 유전자 표지의 확인
그의 발현이 인간 결장 종양에서 Wnt 신호전달 경로 활성화에 특이적인 유전자 그룹을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
액신 과다발현에 의한 종양 성장의 폐지
액신은 고전적 Wnt 경로의 중요한 조절자이다. 이것은 β-카테닌 분해를 촉발하여 Wnt의 부재하에 경로를 침묵시키는 다중단백질 복합체의 일부이다. 그 효과는 Wnt에 의해 역전되고, 이는 파괴 복합체로부터 액신을 제거하여 β-카테닌 전위 및 특이적 표적 유전자의 TCF-매개된 활성화를 가능하게 한다. 외인성 액신 과다발현 및 우세한 음성 절단형 TCF (DNTCF4)의 발현은 둘 모두 Wnt 신호전달 경로을 차단하는 널리 특징이 규명된 수단이다.
본 발명자들은 렌티바이러스-매개된 액신 과다발현이 NOD/SCID 마우스에서 UM-PE13 및 UM-T3 유방 종양의 성장 뿐만 아니라 OMP-C11 및 OMP-C17 결장 종양의 성장을 완전히 폐지시킴을 밝혀내었다. UMTS 종양 세포에서의 DNTCF4의 안정한 발현은 동일한 효과를 가졌다. 종합하면, 이러한 데이터는 세포내 Wnt 차단이 다양한 종양 유형의 발생에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 증명하고, 유방암 및 결장암의 치료를 위한 관련 표적으로서의 Wnt 경로를 지지한다.
Wnt 신호전달 경로는 많은 종양 유형에서 구성적으로 활성화된다. 대부분의 결장 종양에서, 이러한 활성화는 APC의 절단 돌연변이 또는 β-카테닌의 활성화 돌연변이에서 기인한다. 그러한 돌연변이는 Wnt 신호전달 경로가 다른 세트의 돌연변이 또는 자가분비 메카니즘을 통해 활성화될 수 있는 다른 조직에서는 보고되어 있지 않다. Wnt 신호전달 경로가 자가분비 자극에 여전히 반응성인 종양에서, 항체 또는 다른 가용성 단백질 억제제와 같은 세포외 수단을 이용하여 경로를 차단하는 것은 실현가능하며 종양 발생에 영향을 미칠 것이다. 그러한 Wnt-의존적 종양을 확인하는 것은 임상에서 표적화하기 위한 항-Wnt 작용제를 개발하고 종양 유형을 규정짓는데 도움이 될 것이다.
면역조직화학 데이터는 대부분의 OMP-C11 종양 세포가 높은 수준의 세포질성/핵성 β-카테닌을 발현함을 보여주며, 이는 Wnt 신호전달 경로가 이러한 종양 유형에서 구성적으로 활성화됨을 시사한다. 이는 웨스턴 블롯에 의해 OMP-C11에서 높은 수준의 β-카테닌이 검출된 것에 의해 확인되었다. Wnt 경로 활성화 및 액신 과다발현에 대한 민감도의 조합은 OMP-C11를 Wnt에 반응한 유전자 발현의 조절 및 Wnt 차단을 연구하고 그로부터 Wnt 유전자 표지를 이끌어낼 수 있는 적합한 종양으로 만든다.
액신 과다발현에 반응한 차별적 유전자 발현의 마이크로어레이 분석
액신으로 OMP-C11 결장 종양 세포를 처리한 경우의 차별적 유전자 발현을 마이크로어레이 분석에 의해 판단하였다.
NOD/SCID 마우스 (이종이식 종양 모델)로부터 새롭게 떼어낸 인간 결장 OMP-C11 종양을 결장 종양 세포 공급원으로서 사용하였다. 구성적 액신-IRES-GFP 발현 카세트 및 대조군 IRES-GFP 발현 카세트 (각각 L0M91 및 LOM92라 명명함)를 전달하기 위한 2개의 렌티바이러스 벡터를 생성하였다.
OMP-C11 종양을 단일 세포 현탁액으로 프로세싱하고, 마우스 계통 세포를 고갈시켰다. lin-고갈 세포를 2.5의 다수의 감염을 이용하여 L0M91 (액신) 또는 92 (대조군) 렌티바이러스 벡터로 감염시키고, 배양물 중에 3-4 일 유지시키고, GFP 발현에 대해 분류하였다. 분류된 각각의 세포 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. RNA를 진칩® 인간 게놈 U133 플러스 2.0 마이크로어레이 (아피메트릭스, 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 상에서 분석하였다. 이러한 실험을 2회 반복하였다.
액신 처리 이후에 차별적으로 발현되고 또한 정상 및 악성 결장 종양 샘플 패널 간에 액신2의 발현과 관련성을 나타내는 유전자를 분석하는 것에 의해 Wnt 경로에 의해 조절되는 핵심 유전자 세트를 함유하는 유전자 표지를 생성하였다. 액신 과다발현에 반응하여 하향 조절을 보이는 유전자를 액신 마이크로어레이 실험 (상기)으로부터 확인하였다. 이러한 선별의 범위는 하향 조절이 대조군 샘플에 비해 액신 과다발현 샘플에서 50％ 이상 (대조군 샘플에 대한 액신 과다발현 샘플의 log2비율이 -1 이하)이면서 T 시험 p 값이 0.1 보다 작은 것이다. 액신1이 공지된 Wnt 경로 억제제이기 때문에, 액신1 과다 발현에 의해 하향 조절되는 유전자는 직접적 또는 간접적인 Wnt 경로 표적이 될 것이다. 이에 따라 이러한 선별은 일련의 결장/장/기타 소화 조직 악성 종양 샘플 (232 샘플) 중에서 액신2와 높은 관련성 (상관값 > 0.3)을 나타내는 유전자를 확인하는 것에 의해 추가로 정교화된다. 액신2가 공지된 Wnt 표적이기 때문에, 액신2와 유사한 발현 패턴을 나타내는 유전자도 또한 Wnt 표적일 것이다. 이러한 분석에 의해 Wnt 경로 활성에 대한 유전자 표지를 생성하였다 (표 6). 이러한 표지의 유전자의 발현 수준은 개개의 종양 샘플 또는 상이한 유형의 종양이 변경된 Wnt 경로 신호전달의 증거를 나타내는지 여부를 평가하는데 사용될 수 있다.
Figure 112011030538926-pct00006
실시예 15
항-FZD 수용체 항체를 이용한 인간 암의 치료
본 실시예는 FZD 수용체 발현이 검출된 암 줄기 세포 및/또는 종양 세포 및/또는 Wnt 신호전달의 억제에 반응성인 Wnt 유전자 표지 (예를 들어 실시예 14의 Wnt 유전자 표지)를 갖는 종양 세포를 포함하는 종양을 표적으로 하는 FZD 수용체에 대한 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 기술한다.
암 줄기 세포 마커 또는 FZD 수용체의 존재 또는 Wnt 유전자 표지 중 1종 이상의 유전자의 발현은 종양 생검으로부터 먼저 판단될 수 있다. 암이 진단된 환자의 생검으로부터의 종양 세포를 멸균 조건하에서 떼어내었다. 일부 실시양태에서, 조직 생검을 액체 질소 중에서 새롭게 동결시키고, O.C.T.에서 포매하고, 저온유지장치에서 10 μm 절편으로 유리 슬라이드 상에서 절단하였다. 일부 실시양태에서, 조직 생검을 포르말린 고정시키고, 파라핀 포매하고, 마이크로톰에서 10 μm 절편으로서 유리 슬라이드 상에서 절단하였다.
절편을 FZD 단백질 발현을 검출하기 위한 FZD 수용체에 대한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 별법적으로, 실시예 14에서 기술한 바와 같은 Wnt 유전자 표지 중의 1종 이상의 유전자의 존재에 대해 절편을 분석할 수 있다.
또한 암 줄기 세포의 존재를 판단할 수 있다. 조직 생검 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 분쇄하고, 세포를 효소적 소화 및 기계적 파괴시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이어서, 해리된 종양 세포를 항-ESA, -CD44, -CD24, -Lin, 및 -FZD 항체와 함께 인큐베이션하여 암 줄기 세포를 검출하고, ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-, FZD+ 종양 줄기 세포의 존재를 상기에서 상술한 바와 같이 유동세포계수법에 의해 판단하였다.
FZD 수용체 및/또는 Wnt 유전자 표지 중의 1종 이상의 유전자의 발현으로서 종양이 진단된 암 환자를 항-FZD 수용체 항체로 처리하였다. 특정 실시양태에서, 상기한 바와 같이 생성한 인간화 또는 인간 모노클로날 항-FZD 수용체 항체를 정제하고, 주사용으로 적합한 제약상 비히클과 함께 제제화하였다. 일부 실시양태에서, 환자를 FZD 항체로 적어도 한달에 1회 적어도 10주 동안 처리하였다. 일부 실시양태에서, 환자를 FZD 항체로 적어도 한 주에 1회 적어도 약 14주 동안 처리하였다. 각각의 항체 투여는 제약상 효과적인 용량일 것이다. 일부 실시양태에서, 약 2 내지 약 100 mg/ml의 항-FZD 항체를 투여하였다. 일부 실시양태에서, 약 5 내지 약 40 mg/ml의 항-FZD 항체를 투여하였다. 항체는 표준 방사능요법 섭생 또는 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 류코보린, 또는 스트렙토조신을 사용하는 화학요법 섭생 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여할 수 있다. 환자를 모니터링하여, 이러한 처리가 예컨대 종양 퇴행을 기초로 하는 항종양 반응, 신생 종양 발생의 감소, 종양 항원 발현 감소, 암 줄기 세포 수의 감소, 또는 질환 예후를 평가하는 다른 수단을 야기했는지를 판단하였다.
실시예 16
18R5 및 겜시타빈 처리 이후의 췌장 종양 세포의 분화
처리된 췌장 종양 세포의 정량적 PCR (Q-PCR)에 의한 유전자 발현 분석
상기 (실시예 7)한 바와 같이 대조군 Ab, 18R5 IgG 항체, 겜시타빈, 또는 겜시타빈 및 18R5 IgG 항체의 조합물로 처리한 PN4 이종이식 종양에 대해 정량적 PCR 분석에 의해 크로모그라닌 A (CHGA)의 발현을 분석하였다. CHGA는 유방, 결장, 폐 및 췌장 종양을 비롯한 다양한 종양의 신경내분비 분화 마커임이 널리 공지되어 있고, 췌장 종양에서의 CHGA의 상승된 발현은 개선된 생존과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Tezel et al., 2000. Cancer 89, 2230-6]).
PN4 이종이식 연구에서 각 그룹의 5 종양으로부터 전체 RNA를 준비하고, 표준 프로토콜에 따른 목록화된 프로브인 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 택맨®을 이용하여 1 단계 역 전사 (RT)-PCR에 의해 평가하였다. CHGA의 분석을 위해 사용된 프로브-프라이머 세트 (Hs00154441_m1)에는 FAM-염료 표지된 프로브 및 다음과 같은 프라이머: 5'-CGCTCTCCAAGGCGCCAAGGAGAGG-3' (서열 75)가 포함된다. 거스(Gus) B는 내부 대조군으로서 사용되었다. 간략하게, 48℃에서 30 분 동안 RT를 행하고, 95℃에서 10 분 동안 초기 변성한 후, 95℃에서 15 초 동안 40 주기로 변성하고, 60℃에서 1 분 동안 연장시키고, 형광 프로브의 증폭/혼입을 실시간으로 관찰하였다.
베타 섬 세포 마커 CHGA는 겜시타빈 및 18R5를 둘 다 처리한 마우스 샘플에서만 현저하게 상승되었다. 대조군 Ab, 18R5, 및 겜시타빈 단독 처리군으로부터의 종양은 유사한 수준의 CHGA RNA를 발현한 반면, 조합물 군으로부터의 종양은 명백한 CHGA 발현 증가를 보였다. CHGA 수준은 두 번의 실험에서 18R5 및 겜시타빈을 둘 다 처리한 종양에서 10배 및 7배 상승되었다. 대표적인 실험의 결과를 도 42에 나타낸다.
처리된 췌장 종양 세포의 면역조직화학에 의한 유전자 발현 분석
또한 증가된 CHGA 발현이 처리된 종양으로부터 제조한 조직 절편에서의 면역조직화학에 의해 단백질 수준에서도 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 대조군 Ab 처리된 종양은 종양을 통해 산란된 작은 하위세트의 세포의 강한 염색을 나타내었다. 18R5 단독 또는 겜시타빈 단독으로 처리한 종양은 CHGA를 대조군과 유사한 수준으로 발현하였다. 대조적으로, 18R5 및 겜시타빈의 조합물로 처리한 종양에서는 Q-PCR에 의해 검출된 증가된 RNA 발현과 일관되게 CHGA-양성 세포의 개수가 증가된 것으로 나타났다.
ki67에 대한 알시안 블루 및 항체에 의한 염색
내분비, 분비 또는 췌관 세포의 또 다른 특징은 뮤신을 생산한다는 것으로, 이들 세포는 알시안 블루 염색으로 검출할 수 있다 (문헌 [van Es et al., 2005. Nature 435 959-63]). 종양을 수확하고 프로세싱하는 동안, 18R5 처리된 종양이 대조군 처리된 종양에 비해 훨씬 더 점액성임이 관찰되었다. 따라서, 대조군 항체, 겜시타빈 단독, 18R5 단독, 또는 18R5 플러스 겜시타빈으로 처리된 마우스로부터의 PN4 종양 절편을 알시안 블루로 염색하였다. 18R5 처리된 종양은 대조군 및 겜시타빈 단독 그룹에 비해 18R5 단독 및 18R5 플러스 겜시타빈 그룹 둘 모두에서 알시안 블루 염색에 있어서 분명한 증가를 보였다 (데이터는 나타내지 않음).
또한 증가된 점액 세포는 18R5 또는 대조군 항체를 처리한 이후에 제2 췌장 종양주 PN13에서도 관찰되었다 (도 43). 본 실험에서는 PN13 종양을 보유한 마우스를 상기 (실시예 7)한 바와 같이 처리하였다. 종양 절편을 알시안 블루로 염색하여 점액 세포를 밝혀내었고, 또한 ki67에 대해 항체로 면역조직화학에 의해 염색하여 증식 중인 세포를 밝혀내었다. 그 결과 18R5 처리가 알시안 블루 양성 점액 세포의 개수를 매우 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 ki67 양성 세포의 빈도는 18R5 처리에 의해 감소되었다. 흥미롭게도, 점액 세포 및 ki67 양성인 세포 사이에 중첩되는 것은 없었고, 이는 점액 세포가 증식되지 않는다는 것을 시사한다. 이는 18R5 처리가 종양 세포를 비증식 자손으로 분화되도록 촉진한다는 증거를 제공한다.
요약하면, CHGA의 증가된 발현, 알시안 블루 염색에 의해 증명된 바와 같은 뮤신의 증가된 생산, 및 ki67에 대한 항체에 의한 염색에 의해 증명된 바와 같은 비증식 자손의 생산은 18R5 처리에 의한 Wnt-FZD 신호전달 억제가 췌장 종양 세포를 비증식성 분화 세포 특징을 갖는 다중의 별개 세포 유형으로의 분화를 촉진한다는 모델과 일치한다.
실시예 17
18R5 단독 및/또는 다른 항암제와의 조합물에 의한 추가의 생체내 효능 연구
OMP-LU24 이종이식 종양 성장에 대한 효과
OMP-LU24 인간 폐 종양 성장의 생체내 억제에 있어서 항-FZD 항체 18R5의 단독 효능 및 탁솔® (파클리탁셀)과의 조합물 효능 둘 모두를 평가하였다.
50,000개의 OMP-LU24 인간 폐 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양 평균 부피가 143 mm3에 달할 때까지 27일 동안 성장시켰다. 동물을 4 그룹 (n=9/그룹)으로 무작위화하고, 대조군 항체 ("대조군 Ab"), 항-FZD 18R5 ("18R5"), 탁솔® ("탁솔") 또는 18R5 플러스 탁솔®의 조합물 ("18R5+탁솔")로 처리하였다. 종양의 측정은 도 44에 나타낸 날짜에 행하였다. 항체를 주당 1회 10 mg/kg을 복강내 (IP)로 투약하였고, 탁솔®은 주당 1회 15 mg/kg을 IP로 투약하였다.
결과를 도 44에 나타낸다. 항-FZD 처리는 종양 성장을 감소시키는 것으로 나타났고, 조합물 처리는 탁솔® 단독에 비해 증강된 항종양 활성을 보였다.
OMP-LU33 이종이식 종양 성장에 대한 효과
또한 OMP-LU33 인간 폐 종양 성장의 생체내 억제에 있어서 항-FZD 항체 18R5의 단독 효능 및 아바스틴® (베바시주맙)과의 조합물 효능 둘 모두를 시험하였다.
10,000개의 OMP-LU33 인간 폐 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양 평균 부피가 124 mm3에 달할 때까지 30일 동안 성장시켰다. 동물을 4 그룹 (n=10/그룹)으로 무작위화하고, 대조군 항체 (사각형), 아바스틴® (역삼각형), 항-FZD 18R5 (삼각형), 또는 18R5 플러스 아바스틴®의 조합물 (원형)로 처리하였다. 종양의 측정은 도 45에 나타낸 날짜에 행하였다. 항체를 주당 2회 10 mg/kg을 IP로 투약하였다.
결과를 도 45에 나타낸다. 항-FZD 처리는 종양 성장을 감소시키는 것으로 나타났고, 조합물 처리는 아바스틴® 단독에 비해 증강된 항종양 활성을 보였다.
T3 이종이식 종양 성장에 대한 효과
또한 T3 인간 HER2-양성 유방 종양 성장의 생체내 억제에 있어서 항-FZD 항체 18R5의 단독 효능 및 헤르셉틴® (트라스투주맙)과의 조합물 효능 둘 모두를 평가하였다.
50,000개의 T3 인간 유방 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양 평균 부피가 125 mm3에 달할 때까지 32일 동안 성장시켰다. 동물을 4 그룹 (n=10/그룹)으로 무작위화하고, 대조군 항체 (사각형), 항-FZD 18R5 (삼각형), 헤르셉틴® (작은 흑색 원형), 또는 185 플러스 헤르셉틴®의 조합물 (백색 원형)로 처리하였다. 종양의 측정은 도 46에 나타낸 날짜에 행하였다. 항체를 주당 2회 10 mg/kg을 IP로 투약하였다.
결과를 도 46에 나타낸다. 18R5 및 헤르셉틴®의 조합물 처리는 헤르셉틴® 단독에 비해 증강된 항종양 활성을 보였다.
실시예 18
항-FZD 항체 서열
항-FZD 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR을 하기 표 7 및 8에 각각 제공한다. 항-FZD 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 및 그의 코딩 서열은 하기 표 9에서 확인된다. 표 9에 열거한 VH 및 VL의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열을 도 13-15 또는 하기 표 10 및 11에 제공한다. 항-FZD 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 서열은 도 14-15 또는 하기 표 12에 제공한다.
Figure 112011030538926-pct00007
Figure 112011030538926-pct00008
Figure 112011030538926-pct00009
Figure 112011030538926-pct00010
Figure 112011030538926-pct00011
<표 12>
Figure 112011030538926-pct00012
Figure 112011030538926-pct00013
Figure 112011030538926-pct00014
항-FZD IgG 항체 18R4605 (ATCC 기탁 번호 PTA-10307), 18R4805 (ATCC 기탁 번호 PTA-10309), 및 44R24 (ATCC 기탁 번호 PTA-10311)를 코딩하는 이. 콜라이로부터 단리된 플라스미드를 2009년 8월 26일 부다페스트 조약의 조건하에 미국 버지니아주 머내서스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁하였다.
실시예 19
항-FZD 항체의 결합 프로파일
항-FZD 모노클로날 항체 (mAb)의 FZD1, 2, 5, 7 및 8 결합 프로파일의 특징을 규명하기 위해 FACS 분석을 사용하였다.
HEK293 세포를 전장 FZD1, 2, 5, 7 또는 8을 발현하는 플라스미드 DNA와 함께 형질감염 마커로서 사용되는 리포터 유전자 GFP를 발현하는 또 다른 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 퓨진 6 (로슈)을 제조자의 지침에 따라 형질감염 시약으로서 사용하였다. 형질감염된 세포를 37℃ 및 5％ CO2에서 24 내지 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 항-FZD mAb를 20 ㎍/ml의 농도로 출발하여 최종 부피 50㎕로 희석하고, 총 8회 희석하는 동안 4배로 연속 희석하였다. 각각의 FZD/GFP 293 일시적 형질감염 풀을 현탁액 중에서 수집하고, 100,000개의 형질감염된 세포를 시험대상인 희석된 항-FZD mAb와 함께 30-60 분간 얼음상에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 결합된 항-Fzd 항체를 형광 발색단에 접합된 2차 항-인간 항체로 검출하였다. 이어서 표지된 세포를 검출하고, FACS로 계수하였다. 생성된 FACS 데이터를 평균 형광 강도 (MFI) 단위로 표현하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터를 그래프화하고 분석하였다. MFI를 Ab 농도의 함수로 플롯팅하여 용량 반응 곡선을 확립하였다. 수치에 비선형 회귀를 적용하여 곡선에 맞추고 EC50을 계산하였다.
mAb 18R5 및 44R24에 대한 결합 프로파일을 판단하고 비교하였다. FZD1, 2, 5, 7 및 8에 대한 18R5 및 44R24의 각각의 결합을 보여주는 용량 반응 곡선을 도 47에 나타내었다. 2종의 mAb에 대해 계산된 EC50 (nM)을 표 13에 나타낸다. 44R24는 Fzd5 및 Fzd8에 양호한 친화도로 결합되었다. 다른 3종의 Fzd 수용체에 대해서는 S 자형 용량 반응 곡선을 확립할 수 없었는데, 이는 44R24가 FZD1, 2 및 7에 결합하지 않음을 시사한다. FZD1, 2, 5 및 7의 고 친화도 결합을 18R5에 대해 확인하였다.
Figure 112011030538926-pct00015
실시예 20
세포 기반 검정에서의 항-FZD mAb의 항-Wnt 활성의 평가
18R5 및 44R24가 STF-293 세포에서 Wnt 신호전달을 억제하는 능력을 판단하고 비교하였다. STF 세포는 슈퍼 탑 플래쉬(Super Top Flash) (STF) 리포터 카세트에 의해 안정적으로 형질감염된 인간 배아 신장 (HEK)-293 세포로서, 상기 리포터 카세트에서 루시페라제 (Luc) 리포터 유전자의 발현은 최소 프로모터의 다중 카피의 TCF 결합 부위 상류에 의해 조절된다. 낮은 기저의 Luc 발현을 Wnt3a에 대한 반응으로 30-60배 유도할 수 있고, 이는 항-Fzd Ab의 억제 활성을 평가하기 위한 넓은 창구를 제공한다.
mAb를 평가하기 위해, STF-293 세포를 DMEM-10％ FBS에서 성장시켰다. 1 일째에, 96-웰 시각화 바닥 백색 플레이트 (Nunc #165306)에 웰 당 10,000개의 세포를 플레이팅하였다. 세포를 37℃ 및 5％ CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 2 일째에, 배양 배지를 이용하여 시험할 Ab를 최종 농도 40 ㎍/㎕로 희석하였다. 7 회의 5배 연속 희석을 수행하였다. STF-293 세포 배양 배지를 50 ㎕ Ab 희석액, Wnt3a 안정한 L-세포로부터의 25 ㎕ Wnt3a-조건화 배지 및 25 ㎕ DMEM-10％ FBS를 함유하는 혼합물로 대체하였다. 각각의 Ab에 대해, 시험한 최종 농도는 20, 4, 0.8, 0.16, 0.03, 0.006, 0.0013, 0.0003 ㎍/ml이었다. 각각의 Ab 농도로 3 중 시험하였다. 인간 항-합텐 Ab, LZ1을 음성 대조군 Ab로서 사용하였다. 모 L-세포로부터의 비-Wnt3a-조건화 배지를 음성 대조군 유도제로서 사용하였다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌렸다. 루시페라제 활성은 3 일째에 프로메가 스테디 글로 키트 (VWR # PAE2550-A)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 측정하였다. 그 결과를 초당 광자로 표현하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터를 그래프화하고 분석하였다. 루시페라제 활성을 Ab 농도의 함수로서 플롯팅하여 용량 반응 곡선을 확립하였다. 수치에 비선형 회귀를 적용하여 곡선에 맞추고 IC50을 계산하였다.
44R24 및 18R5가 STF 세포에서 Wnt 신호전달을 억제하는 능력을 상기한 바와 같이 판단하고 비교하였다. 결과를 도 48 및 표 14에 나타낸다. 44R24 활성은 오직 높은 Ab 농도에서만 검출되었고, 이는 본 검정에서의 항체의 낮은 활성을 반영한다. 44R24의 IC50은 18R5의 그것보다 13배 낮은 것으로 계산되었다.
Figure 112011030538926-pct00016
18R5 및 44R24가 A549 세포에서 Wnt 신호전달을 억제하는 능력을 또한 판단하였다. A549 세포는 액신2 유전자가 고도로 발현되고 Wnt 신호전달의 내인성 활성이 번역되는 인간 폐 암종 세포이다. 액신2는 널리 공지된 Wnt 표적 유전자로서, 상기 유전자는 그의 전사를 상향 조절하고 최종적으로는 피드백 루프 메카니즘을 통해 Wnt 신호전달을 하향조절함으로써 경로의 활성화에 반응한다. 이러한 시스템을 사용하여 qPCR에 의해 액신2 mRNA 수준에 대한 항-Fzd Ab의 영향을 시험하였다.
12-웰 플레이트에 웰당 30,000개의 A549 세포로 시딩하고, DMEM+10％ FBS 중에서 3 일 동안 성장시켰다. 항체를 다양한 농도 (5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 ㎍/ml)로 24 시간 동안 첨가하고, 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. LZ1, 비결합 항체를 단지 최고 농도로만 음성 대조군으로서 사용하였다.
30,000개의 A549 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고, DMEM+10％ FBS 중에서 3 일 동안 성장시켰다. 항-FZD 항체 18R5 또는 44R24를 다양한 농도 (5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 ㎍/ml)로 첨가하고, LZ1, 비결합 항체를 단지 최고 농도로만 음성 대조군으로서 사용하였다. RNA를 24 시간 후처리한 다음, DNase로 처리하였다.
액신2는 Wnt 신호전달에서의 강력한 표적 유전자로 알려져 있고, 그의 발현 수준은 어플라이드 바이오시스템즈 7900 HT 기계를 이용한 택맨 상대 발현 (ΔΔCT) 검정으로 조사하였다. 시점당 50 ng의 RNA를 3 중으로 사용하였고, GUSB 프로브를 내인성 대조군으로 사용하였다. 모든 결과를 LZ1 대조군 샘플에서의 액신2 수준에 대해 표준화하였다.
18R5 및 44R24에 의한 액신2 유전자 발현의 기저 수준을 억제하는 것을 나타내는 용량 반응 곡선 및 이들 항체에 대해 계산된 EC50 값을 도 49에 나타낸다. 18R5 및 44R24는 LZ1 대조군에 비해 액신2 기저 수준을 비슷한 효율로 억제하였다.
실시예 21
췌장 이종이식 모델에서 항-FZD mAb의 항종양 활성의 평가
OMP-PN13 췌장 종양:
마우스에서 2회 계대배양된 동결 OMP-PN13 종양 세포를 옹코메드(Oncomed)의 종양 은행에서 수득하였다. 이를 해동시키고 해동 직후에 NOD/SCID 마우스의 좌측 옆구리에 피하 주사하였다. 동물 당 약 25,000개의 생존 세포를 주사하였다. 마우스를 매주 종양 성장에 대해 모니터링하였다. 개시 이후, 종양의 크기를 캘리퍼로 매주 1회 측정하였다. 200-300 mm3의 종양 보유 마우스를 각각 5 마리의 동물을 함유하는 처리 그룹으로 구분하였다. 각 그룹에서의 평균 종양 크기는 비슷하였다. 무작위화한 다음날 Ab 처리를 개시하였다. LZ1을 음성 대조군 Ab로서 사용하였다. 3 용량의 10 mg/kg의 Ab를 12 일에 걸쳐 복강내 주사를 통해 투여하였다. 마지막 주사 24 시간 후에 마우스를 안락사시켰다. 종양, 십이지장 및 간을 수확하였다.
파라핀 포매 및 절편화를 위해 종양 조직을 포르말린으로 고정시켰다. 면역조직화학 (IHC)에 의해 Muc16을 검출하여 뮤신 생산 세포의 외양을 모니터링하였다. 뮤신은 췌장에서 분화된 세포의 아형에 대해 특이적이었고, 따라서 종양 모델에서 분화 마커로서 사용하였다.
포르말린 고정된, 파라핀 포매 (FFPE) 절편에서 파라핀을 제거하였다. 슬라이드에서 먼저 크실렌으로 2회 각각 5 분 동안 순차적으로 처리하여 파라핀을 제거하였다. 이어서 조직을 에탄올 100％에 각각 3 분 동안 2회, 물 중 90％에 1 분 동안 1회, 80％에 1 분 동안 1회, 및 70％에 1 분 동안 1회 연속 침지시켜 재수화하였다. 조직을 흐르는 증류수로 1 분 동안 세척하였다.
뮤신 16 항체 (AbCAM로부터의 클론 X325, 카탈로그 ab10033)를 FFPE 조직 절편에서 뮤신 16 발현 세포의 IHC 검출을 위해 사용하였다. 오토클레이브에서 10 mM 시트레이트 완충액 (pH 6.0)을 이용하여 열-유도된 항원을 회수하였다. 이어서, 슬라이드를 실온으로 유지시키고, 단백질이 천천히 항원성을 회복하도록 하였다 (대략 2 시간).
조직 절편을 물 중의 3％ 과산화수소 용액으로 차단시키고, 세척한 다음, 정상 말 혈청 차단 용액 (50 mL; PBS (38.5 mL), 10％ NHS (5 mL), 1％ BSA (5 mL), 0.1％ 젤라틴 (500 μL), 0.1％ Tx-100 (500 μL), 0.05％ NaN3 (500 μL))을 이용하여 실온에서 1 시간 동안 다시 차단시켰다. 이어서 절편을 다 빈치 그린 희석액 (Da Vinci Green Diluent) pH 7.3 (PD 900, 바이오케어 메디칼(Biocare Medical)) 중의 Muc16 1차 항체의 1:200 희석액을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 염색한 후, 0.1％ 트리톤 X-100을 함유하는 인산염 완충 염수를 이용하여 3회 세척하였다. 이어서, 절편을 3 소적의 임프레스(ImmPress) 항-마우스 IgG HRP-접합체 (카탈로그 101098-260, VWR)로 30 분 동안 실온에서 염색한 후, 0.1％ 트리톤 X-100을 함유하는 인산염 완충 염수를 이용하여 3회 세척하였다. 슬라이드를 페트리디쉬에 놓고, 벡터 노바레드 키트(Vector NovaRed kit) (SK4800, 벡터 랩스)를 이용하여 1-2 분 동안 발색시켰다. 증류수를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 슬라이드를 흐르는 물로 철저히 세정하였다. 이어서 조직 절편을 헤마톡실린 (카탈로그 H3401, 벡터 랩스 길즈 포뮬러(Vector Labs Gill's formula))으로 1 분 동안 대비염색하고, 세척한 다음, 블루잉 용액을 이용하여 30 초 동안 중화시켰다. 슬라이드를 밤새 건조시키고, 벡타마운트(VectaMount) (벡터 랩스)를 이용하여 표본제작하였다.
대조군 Ab (LZ1), 18R5, 또는 44R24로 처리된 종양의 대표적인 영역을 도 50에 나타낸다. LZ1은 낮은 강도의 염색과 관련이 있는 반면, Muc16 항체에 의한 보다 높은 수준의 염색은 18R5 처리된 종양에서 검출되었다. 이는 종양 세포가 18R5에 의해 뮤신 생산 세포 계통으로 분화되도록 유도되었음을 시사한다. 44R24-처리된 종양에서의 Muc16의 염색 수준은 18R5 처리된 종양에서 보다 더 평범하였지만, 여전히 본 실험에서 LZ1-처리된 종양에 비해 약간 더 높은 것으로 보였다.
또한 qPCR을 이용한 Wnt 표적 유전자 발현 분석을 위해 종양, 십이지장 및 간으로부터 전체 RNA를 추출하였다.
조직을 수확한 즉시 RNAlater (퀴아겐(QIAGEN))로 옮겼다. 섬유성 조직 미니 키트용 퀴아겐 RNeasy를 이용하여 제조사의 지침에 따라 RNA를 추출하였다. 50 ng의 전체 RNA를 ABI 1 단계 RT-PCR 프로토콜 및 시약을 이용한 유전자 발현 분석에 제공하였다. GusB 유전자 발현을 내인성 대조군으로서 사용하였다. 각 샘플에 대해 3중으로 구성하였다. 각 처리 그룹의 모든 5종의 종양을 분석하였다. ABI 7900 택맨 기계를 사용하여 실험을 수행하였다. ABI SDS 2.2.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 DeltaCt 값을 계산하였고, 이것을 상대량으로 전환하였다. 모든 5 종양에 대한 3중의 값을 각 처리 그룹에 대해 평균내었다. 이어서 대조군 항체 (LZ1)에 대한 배수 억제율을 계산하였다.
결과를 표 15에 나타낸다. Wnt 표적 유전자는 항-FZD Ab에 의해 일정하지 않은 영향을 받았다. 18R5은 종양 및 간에서 2.3x 및 8x 억제를 유도한 반면, 십이지장에서는 어떤 영향도 미치지 않았다. 44R24에 의해 유도된 변화가 보다 더 평범하였다.
Figure 112011030538926-pct00017
OMP-PN4 췌장 종양:
또한 OMP-PN4 췌장 종양 이종이식 모델에서 종양 기질에 대한 18R5의 영향을 조사하였다. 마이크로어레이에 의해 여러개의 유전자를 확인하였고, 그의 발현 수준은 처리에 의해 변경되었다. 이들 중에서, 평활근 액틴 (SMA) 단백질을 코딩하는 ACTA2가 특히 관심대상이다. SMA는 활성화된 종양 기질과 관련이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 그의 하향 조절은 감소된 종양형성 표현형의 징후로 간주할 수 있다.
상기 실시예 7에서 기술한 바와 같이, OMP-PN4 종양-보유 NOD/SCTD 마우스를 대조군 Ab (LZ-1), 18R5, 겜시타빈, 또는 18R5 및 겜시타빈의 조합물로 6 주 동안 한주에 1회 처리하였다. 항체를 10 mg/kg의 농도로 투여하였다. 이를 수확한 후, 본 실험으로부터의 종양에 대해 RNA 및 단백질 수준 둘 모두에서 Wnt 표적 유전자의 발현을 각각 마이크로어레이 및 IHC를 이용하여 분석하였다.
종양으로부터 전체 RNA를 추출하고, 증폭시키고, 마이크로어레이 분석하였다. 전체 RNA를 오베이션(Ovation) RNA 증폭 시스템 V2 (뉴겐(NuGEN), 캘리포니아주 샌 카를로스 소재)를 이용하여 증폭시켰다. 생성된 증폭된 안티센스 ss-cDNA를 단편화하고, 아피매트릭스 칩 상에서 사용하기 위해 FL-오베이션 cDNA 비오틴 모듈 V2 (뉴겐)를 이용하여 비오티닐화하였다. 본 실험에 아피매트릭스 HG-U133 플러스 2 또는 MG 430 2.0 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 사용하였다 (노스캐롤라이나주 더햄 소재의 알맥 다이어그노스틱스(Almac Diagnostics)에서 수행함). 혼성화 이후에, 유전자 칩을 세척하고, 염색하고, 제조사 (아피매트릭스, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)의 지침에 따라 스캐닝하였다. 어레이 혼성화 이전에 분광광도계 및 바이오분석기(Bioanalyzer)를 이용하여 cDNA 및 단편화된 cDNA의 질을 평가하였다. 스캐닝된 로우 칩(raw chip) 데이터를 정량하고, GCOS 소프트웨어 패키지 (아피매트릭스)를 이용하여 스케일링하고, 임의의 칩 결함 및 아웃라이어를 검출하기 위해 아피매트릭스가 권장하는 유전자 칩 품질 관리의 종합적인 평가를 행하여 이를 후속 데이터 분석에서 배제시켰다.
어레이 배경 조정 및 신호 강도 표준화는 오픈 소스 바이오컨덕터 소프트웨어 (www.bioconductor.org)의 GCRMA 알고리즘을 이용하여 수행하였다. 2개의 그룹 또는 시점 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 베이지안(Bayesian) t-시험 (사이버-T)으로 확인하고, 이것을 유사한 발현 수준에서 관찰된 프로브 세트의 변동성으로부터 수득한 그룹간 변동성의 베이지안 추정을 이용하여 스튜던트의 t 시험과 조합하였다 (문헌 [Baldi P, Long AD. A Bayesian framework for the analysis of microarray expression data: regularized t-test and statistical inferences of gene changes. Bioinformatics. 2001;17(6):509-19]).
인간 종양 유전자 칩 분석을 위해, 샘플을 인간 및 마우스 칩 둘 모두에 대해 검정하여, 벌크 인간 종양 및 마우스 기질에 대한 처리 효과를 독립적으로 평가하였다. 종 특이적이지 않은 아피메트릭스 프로브 세트는 분석에서 제외시켰다.
평활근 액틴 알파 (SMAa) 면역형광법을 준비하는데 있어서, OCT를 이용하여 종양 조직을 동결시켰다. 4 ㎛의 절편을 수득하고 -80℃에서 동결 보관하였다. SMAa 염색을 위해, 조직을 냉각 아세톤을 이용하여 -20℃에서 15 분 동안 고정시킨 다음, 건조되도록 하고, 실온으로 회복시킨 후 소수성 PAP 펜을 이용하여 표시하였다. 이어서, 인산염 완충 염수 (PBS)를 이용하여 슬라이드를 세척하였다. 조직을 정상 말 혈청 R.T.U. (벡터 랩스)를 이용하여 2 시간 동안 실온에서 차단시켰다. 1차 항체 염색은 FITC-접합된 평활근 액틴 알파 항체 (클라인 1A4, #F3777, SIGMA)의 1:10,000 희석액으로 1 시간 동안 행하였다. 0.1％ 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 절편을 3회 세척하였다. 이어서 슬라이드를 공기건조시킨 다음, DAPI를 함유하는 하드 셋 표본제작 배지 (벡타쉬드(vectashied) H-500)를 이용하여 표본제작하였다.
도 51a는 마이크로어레이에 의해 검출된 ACTA2 유전자 발현 수준을 나타낸다. 항-FZD 항체 18R5로 처리된 종양은 감소된 ACTA2 발현 수준을 나타내었다. 도 51b는 대조군 mAb (상부 패널) 및 18R5 (하부 패널)-처리된 OMP-PN4 종양에 대한 평활근 액틴 알파 (SMAa) 면역형광법의 결과를 나타낸다. 18R5-처리된 종양에서 감소된 양의 SMAa가 검출되었다. ACTA2의 발현 및 SMA의 양은 18R5에 반응한 종양 기질에서 현저하게 감소되었고, 이는 Wnt 차단이 (i) 이러한 종양 구획에 영향을 미치며 (ii) 잘 확립된 종양형성 마커를 감소시키는 것에 의한 것임을 시사한다. 이러한 결과는 섬유모세포 활성화의 감소가 18R5의 항종양 작용 메카니즘 중 하나일 수 있음을 시사한다.
실시예 22
Muc16-양성 OMP-PN13 세포의 종양형성 잠재력의 평가
상기 기술한 바와 같이, 18R5 처리는 췌장 종양에서 유전자 발현 및 세포 표현형 변화를 유도할 뿐만 아니라, 뮤신 발현을 증가시켰다. 특히, 처리된 PN-13 종양에 대한 IHC에 의해 Muc16-양성 세포의 수가 증가됨이 밝혀졌다. Muc16 유전자 발현 수준은 또한 대조군 종양에 비해 처리된 종양에서 더 높았다. 18R5 유도된 Muc16-양성 세포가 분화된 종양 세포 하위 집단을 대표한다는 가설을 시험하기 위해 18R5 유도된 Muc16-양성 세포의 종양형성성을 평가하였다.
OMP-PN13-보유 마우스를 실시예 21에서 기재한 프로토콜에 따라 18R5로 처리하였다. Ab 처리를 개시하고 12 일 후에 마우스를 안락사시켰다. 종양을 수확하고, 조직을 소화시키기 위해 콜라게나제 III를 이용하여 프로세싱하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 마우스 기질 세포를 비오티닐화된 항-H-2Kd 항체 및 비오티닐화된 항-CD45 항체로 염색하였다. 이어서 이들을 스트렙타비딘에 접합된 자기 비드 (써모 마그나바인드(Thermo MagnaBind))와 함께 인큐베이션하고, 다이날(Dynal) 자석을 이용하여 고갈시켰다. 생성된 lin-고갈 종양 세포를 PE-접합된 2차 Ab에 의해 검출되는 항-Muc16 mAb로 염색하였다. Muc16-양성 및 Muc16-음성 세포를 DIVA 소프트웨어에 의해 구동되는 ARIA FACS 기계를 이용하여 분류하였다. 도 52a를 참조한다. 종양형성 잠재력을 비교하기 위해 세포를 NOD/SCED 마우스의 좌측 옆구리에 다시 피하 주사하였다. 각각의 세포 유형을 10 마리의 마우스에 주사하였다. 각각의 마우스에 75개의 세포가 투여되었다. Muc16- (상부 패널) 및 Muc16+ (하부 패널) 세포의 주사 결과로서 대표적인 종양 도면을 도 52b에 나타낸다. 마우스에 주사한 이후 Muc16- 및 Muc16+ 종양에 대한 성장 곡선을 도 52c에 나타낸다. Muc16+ 세포를 주사한 후에는 어떤 종양도 성장하지 않은 반면, Muc16- 세포로 주사한 10 마리의 마우스 중 7 마리에서 종양이 발생하였다. 이러한 데이터는 18R5 유도된 Muc16+ 세포가 비종양형성성임을 시사하며, 18R5 항종양 활성의 기반이 되는 메카니즘으로서 분화의 유도를 지지한다.
실시예 23
항-FZD 항체에 의한 추가의 생체내 연구
18R5 mAb에 의한 PE13 유방 종양 재발 연구: PE13 유방 종양 세포를 Nod-Scid 마우스에 주사하고, 종양이 대략 100 mm3에 이를 때까지 성장시켰다. 동물을 2 그룹으로 무작위화하고 (n=10), 탁솔 (15 mg/kg, 주당 2회) + 대조군 항체 (흑색 사각형) 또는 동량의 탁솔 + 항-FZD 18R5 (회색 개방 원형)를 투여하였다. 항체는 주당 1회 20 mg/kg으로 투약하였다. 탁솔 처리는 70 일째에 중단하였고, 항체 처리는 계속하였다. 그 결과를 도 53에 나타낸다. 18R5는 탁솔 처리를 중단한 이후에 종양 회귀율을 증진시키고 종양 재발을 지연시키는 것으로 관찰되었다.
18R5 mAb에 의한 PE13 유방 종양 제한 희석 검정 (LDA) 연구: PE13 유방 종양을 보유하는 동물을 대조군 항체 (회색 원형), 18R5 (개방형 삼각형), 탁솔 (흑색 원형), 또는 탁솔 및 18R5의 조합물 (개방형 사각형)로 처리하였다. 탁솔은 주당 2회 15 mg/kg으로 투약하고, 항체는 주당 1회 20 mg/kg으로 투약하였다. 종양을 수확하고, 인간 종양 세포를 린 고갈에 의해 정제하였다. 50, 150, 또는 500개의 종양 세포를 새로운 마우스 코호트 (n=10/세포 용량)에 주사하였다. 결과를 도 54에 나타낸다. 59일 후에 종양 성장 빈도를 모니터링하고 CSC 빈도 (L-calc)를 계산하는데 사용하였다.
18R5 mAb에 의한 PN4 췌장 종양 재발 연구: PN4 췌장 종양 세포를 Nod-Scid 마우스에 주사하고, 종양이 대략 250 mm3에 달할 때까지 성장시켰다. 종양이 회귀될 때까지 동물에 겜시타빈 (75 mg/kg, 주당 1회)을 5 주 동안 투여하였다. 동물을 2 그룹으로 무작위화하고, 대조군 항체 (흑색 사각형) 또는 항-FZD 18R5 (회색 개방형 원형)를 투여하였다. 항체는 주당 1회 10 mg/kg으로 투약하였다. 결과를 도 55에 나타낸다. 18R5는 겜시타빈 처리 이후에 종양 재발을 지연시키는 것으로 관찰되었다.
44R24 mAb에 의한 PN4 췌장 종양 성장 연구: PN4 췌장 종양을 Nod-Scid 마우스에 주사하였다. 종양 부피가 대략 150 mm3에 달할 때까지 종양을 성장시켰다. 동물을 4 그룹으로 무작위화하고 (n=10/그룹), 대조군 항체 (흑색 사각형), 항-FZD5/8 44R24 (회색 개방형 삼각형), 겜시타빈 (흑색 삼각형), 또는 44R24 플러스 겜시타빈의 조합물 (회색 개방형 원형)을 투여하였다. 겜시타빈은 주당 1회 15 mg/kg으로 투약하고, 항체는 주당 2회 20 mg/kg으로 투약하였다. 결과를 도 56에 나타낸다. 44R24는 겜시타빈 단독에 비해 겜시타빈과의 조합물로서 종양 성장을 감소시키는 것으로 관찰되었다.
실시예 24
항-FZD 항체 44R24의 에피토프 맵핑
항체 18R8 및 18R5에 대해 실시예 5에서 기재한 것과 유사한 방식으로 항-FZD 항체 44R24에 대한 에피토프 맵핑을 수행하였다. 44R24가 18R8과 유사한 에피토프에 결합하는 능력을 18R8의 결합을 방해하는 것으로 종전에 밝혀진 (실시예 5 및 도 6 및 7 참조) FZD8의 일련의 아미노산 변이체를 이용하여 유동세포계수법에 의해 평가하였다. 공동 형질감염된 (GFP 양성) 세포 집단 내에서 감소된 염색에 의해 표시되는 바와 같이, FZD8의 아미노산 126-127이 44R24 결합에 요구되는 것으로 확인되었다. FACS 실험의 결과를 도 57에 나타낸다. 이러한 결과는 44R24가 18R8의 에피토프와 중첩되고 아미노산 126-127을 공유하는 에피토프에 결합함을 나타낸다.
실시예 25
항-FZD 항체 18R5, 18R8 및 44R24에 의한 C28 결장 종양 성장 연구.
C28 종양 세포를 Nod-Scid 마우스에 피하 주사하였다. 종양 평균 부피가 126 mm3에 달할 때까지 종양을 성장시켰다. 종양 보유 동물을 4 개의 그룹으로 무작위화하고 (n=10 마우스/그룹), 대조군 Ab (흑색 사각형), 18R8 (회색 삼각형), 44R24 (흑색 개방형 원형), 또는 18R5 (회색 원형) (도 58)로 처리하였다. 항체는 주당 2회 15 mg/kg을 복강내로 투약하였다. 종양 부피를 나타내었다. 항체 44R24 및 18R5에 의한 처리는 대조군 그룹에 비해 성장을 감소시킨 반면, 18R8은 어떤 영향도 미치지 않았다 (도 58).
도 58에 나타낸 실험에서 동물을 처리한 후, 종양을 수확하고, 포르말린으로 고정시키고, 파라핀 포매하고, 5 ㎛의 절편으로 절단하였다. 종양 절편에 대해 결장 세포 분화의 마커인 사이토케라틴 7 발현을 면역조직화학 (벡타스타틴 키트(Vectastain kit), 벡터 랩스)에 의해 분석하였다. 사이토케라틴 7 발현은 44R24 또는 18R5의 처리 이후에 상승되는 것으로 관찰되었다 (도 59).
본원에서 언급된 모든 출판물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 및 접근 번호/데이터베이스 서열 (폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 둘 모두 포함)은 그러한 각각의 개별 출판물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 또는 접근 번호/데이터베이스 서열이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 같이 모든 목적상 그 전문은 동일한 범위로 본원에 참고로 포함된다.
ATCC PTA-9540 20080929 ATCC PTA-9541 20080929 ATCC PTA-10307 20090826 ATCC PTA-10309 20090826 ATCC PTA-10311 20090826
SEQUENCE LISTING <110> Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Gurney, Austin L. Sato, Aaron K. Axelrod, Fumiko T. Hoey, Timothy C. Satyal, Sanjeev H. Mitra, Satyajit Sujit Kumar <120> Frizzled-Binding Agents and Uses Thereof <130> 2293.051PC04 <140> PCT/US09/58635 <141> 2009-09-28 <150> 61/176,741 <151> 2009-05-08 <150> 61/144,284 <151> 2009-01-13 <150> 61/144,058 <151> 2009-01-12 <150> 61/100,639 <151> 2008-09-26 <160> 107 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Thr Leu Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 <400> 2 Val Ile Ser Gly Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 <400> 3 Asn Phe Ile Lys Tyr Val Phe Ala Asn 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <400> 4 Ser Gly Asp Lys Leu Gly Lys Lys Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 <400> 5 Glu Lys Asp Asn Arg Pro Ser Gly 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<220> <223> synthetic fragment of human frizzled receptor <400> 68 Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic fragment of human frizzled receptor <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Is lysine/glutamine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Is phenylalanine/tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Is glutamine/alanine <400> 69 Xaa Xaa Gly Phe Xaa 1 5 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conformational epitope of FZD8 <400> 70 Trp Pro Asp Arg 1 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Is lysine/asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Is leucine/isoleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Is lysine/serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Is lysine/phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Is alanine/valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Is serine/histidine <400> 71 Ser Gly Asp Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa 1 5 10 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Is glutamic acid/aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Is aspartic acid/serine <400> 72 Xaa Lys Xaa Asn Arg Pro Ser Gly 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Is serine/glutamine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Is phenylalanine/tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Is glycine/asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Is asparagine/threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Is no amino acid/leucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Is glutamic acid/no amino acid <400> 73 Xaa Ser Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ser Leu Xaa 1 5 10 <210> 74 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of FZD8 <400> 74 Tyr Gly Phe Ala 1 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 75 cgctctccaa ggcgccaagg agagg 25 <210> 76 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R5 light chain of anti-FZD IgG antibodies <400> 76 atggcctggg ccctgctgct gctgaccctg ctgacacagg gcaccggctc ttgggccgac 60 atcgagctga cccagcctcc ctccgtgtcc gtggcccctg gccagaccgc ccggatctcc 120 tgctccggcg acaacatcgg cagcttctac gtgcactggt atcagcagaa acctggacag 180 gcccctgtgc tggtgatcta cgacaagtcc aaccggcctt ccggcatccc tgagcggttc 240 tccggctcca actccggcaa caccgccacc ctgaccatct ccggcaccca ggccgaggac 300 gaggccgact actactgcca gtcctacgcc aacaccctgt ccctggtgtt tggcggcgga 360 acaaagctga ccgtgctggg ccagcctaag gccgctcctt ccgtgaccct gttccctcct 420 tcctccgagg agctgcaggc caacaaggcc accctggtgt gcctgatctc cgacttctac 480 cctggcgctg tgactgtggc ttggaaggcc gactcctccc ctgtgaaggc cggcgtggag 540 acaaccaccc cttccaagca gtccaacaac aagtacgccg cctcctccta cctgtccctg 600 acccctgagc agtggaagtc ccaccggtcc tactcttgcc aggtgaccca cgagggctcc 660 accgtggaaa agacagtggc acccaccgag tgctcc 696 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <400> 77 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile Thr 1 5 10 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 <400> 78 Thr Ile Ser Tyr Ser Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 <400> 79 Ser Ile Val Phe Asp Tyr 1 5 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <400> 80 Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asn Arg Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 <400> 81 Ser Gly 1 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 <400> 82 Gly Ser Trp Asp Thr Arg Pro Tyr Pro Lys Tyr 1 5 10 <210> 83 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R4605 light chain of anti-FZD antibodies <400> 83 atggcatggg cattattgct acttactcta ttgacgcaag gaacgggttc atgggcagac 60 atagaactaa ctcagccacc ctctgttagc gttgcaccgg gacagacggc acgtatatcg 120 tgctcgggag acaatatagg aagtttctat gtacattggt atcaacagaa acctggtcaa 180 gcacctgtat tagtaatcta tgacaaaagt aaccgacctt ccggaatacc tgagcgtttc 240 agtggttcga actccggcaa cactgcaact ttaactatat ctggaactca ggcggaggat 300 gaggctgact actactgcca gagttacgca aacactctgt ccctggtgtt tggcggcgga 360 acaaagttaa ccgtgctggg ccagcctaag gccgcacctt cggtgaccct attccctcct 420 tcatccgagg agctacaggc caacaaggcc accttagtgt gcctaatctc cgacttctat 480 cctggtgctg taacggtagc gtggaaggcc gactcatcgc cggtgaaggc cggtgtggag 540 acaacgactc cttccaagca gtccaacaac aaatacgccg cgtcctccta cctgtcccta 600 acccctgagc agtggaagtc ccaccgttca tactcgtgcc aggtgacgca cgagggttca 660 acggtcgaaa agacagtagc acctactgaa tgctca 696 <210> 84 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R4805 light chain of anti-FZD antibodies <400> 84 atggcatggg cattattact acttactcta cttacgcaag gaacgggttc atgggcagac 60 atagaactaa ctcagccgcc gtctgttagc gttgcaccgg gacagacggc acgtatatcg 120 tgctcgggag acaatattgg ttctttctat gtacattggt atcaacagaa acctggtcaa 180 gcacctgtat tagtaatata tgacaaaagt aaccgtcctt cgggaatacc tgagcgtttc 240 agtggttcga actcgggcaa cactgcaact ttaactatat ctggaacgca ggcggaggat 300 gaggcggact actattgcca aagttacgca aacactctat ccttagtgtt tggtggagga 360 acaaagttaa ccgtgctagg ccagcctaag gccgcacctt cggtgaccct attccctcct 420 tcatccgagg agctacaggc gaacaaagcc accttagtgt gcctaatctc agacttttat 480 cctggtgctg taacggtagc gtggaaggcg gactcatcgc cggtgaaggc cggtgtggag 540 acaacgactc cttccaagca gtccaacaac aaatacgcag cgagtagtta cctgtcccta 600 acccctgagc agtggaagtc gcaccgttca tactcgtgcc aggttacgca cgagggttca 660 acggtcgaaa agacagtagc acctacggaa tgctca 696 <210> 85 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 44R24 heavy chain of anti-FZD antibodies <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 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Lys Tyr Val Phe Gly Gly 85 90 95 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 <210> 87 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R5/18R8 heavy chain of anti-FZD antibodies <400> 87 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc cactacaccc tgtcctgggt gcgccaggca 120 ccagggaagg gactggagtg ggtctccgtg atctccggcg acggctccta cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcctccgaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actctctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaacttc 300 atcaagtacg tgttcgccaa ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 354 <210> 88 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R8 light chain of anti-FZD antibodies <400> 88 gacatcgagc tgacccagcc tccctccgtg tctgtggctc ctggccagac cgcccggatc 60 tcctgctccg gcgacaagct gggcaagaag tacgcctcct ggtatcagca gaagcctgga 120 caggcccctg tgctggtcat ctacgagaag gacaaccggc ctagcggcat ccctgagcgg 180 ttctccggct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccggcac ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg ctcctccttc gccggcaact ccctggaagt gttcggcgga 300 ggcaccaagc tgaccgtgct gggc 324 <210> 89 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R5 light chain of anti-FZD antibodies <400> 89 gacatcgagc tgacccagcc tccctccgtg tccgtggccc ctggccagac cgcccggatc 60 tcctgctccg gcgacaacat cggcagcttc tacgtgcact ggtatcagca gaaacctgga 120 caggcccctg tgctggtgat ctacgacaag tccaaccggc cttccggcat ccctgagcgg 180 ttctccggct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccggcac ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg ccagtcctac gccaacaccc tgtccctggt gtttggcggc 300 ggaacaaagc tgaccgtgct gggc 324 <210> 90 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R4605 anti-FZD antibodies <400> 90 gacatagaac taactcagcc accctctgtt agcgttgcac cgggacagac ggcacgtata 60 tcgtgctcgg gagacaatat aggaagtttc tatgtacatt ggtatcaaca gaaacctggt 120 caagcacctg tattagtaat ctatgacaaa agtaaccgac cttccggaat acctgagcgt 180 ttcagtggtt cgaactccgg caacactgca actttaacta tatctggaac tcaggcggag 240 gatgaggctg actactactg ccagagttac gcaaacactc tgtccctggt gtttggcggc 300 ggaacaaagt taaccgtgct gggc 324 <210> 91 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 44R24 heavy chain of anti-FZD antibodies <400> 91 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ctagatgggt gctgtccgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120 tgcgccgcct ccggcttcac cttctcctct tactacatca cctgggtgcg ccaggctcct 180 ggcaagggac tggaatgggt gtccaccatc tcctactcct ccagcaacac ctactacgcc 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtccatcgtg 360 ttcgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cttccgtgtt ccctctggcc 420 ccttgctccc ggtccacctc tgagtctacc gccgctctgg gctgcctggt gaaggactac 480 ttccctgagc ctgtgaccgt gtcctggaac tctggcgccc tgacctctgg cgtgcacacc 540 ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg tactccctgt cctccgtggt gaccgtgcct 600 tcctccaact tcggcaccca gacctacacc tgcaacgtgg accacaagcc ttccaacacc 660 aaggtggaca agaccgtgga gcggaagtgc tgcgtggagt gccctccttg tcctgctcct 720 cctgtggctg gcccttctgt gttcctgttc cctcctaagc ctaaggacac cctgatgatc 780 tcccggaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga ccctgaggtg 840 cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ccaagaccaa gcctcgggag 900 gaacagttca actccacctt ccgggtggtg tctgtgctga ccgtggtgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcctgc ccctatcgaa 1020 aagaccatct ctaagaccaa gggccagcct cgcgagcctc aggtctacac cctgcctcct 1080 agccgggagg aaatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac 1140 ccttccgata tcgccgtgga gtgggagtct aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc 1200 acccctccta tgctggactc cgacggctcc ttcttcctgt actccaagct gacagtggac 1260 aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg tctcctggca agtga 1365 <210> 92 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18R4805 anti-FZD antibodies <400> 92 gacatagaac taactcagcc gccgtctgtt agcgttgcac cgggacagac ggcacgtata 60 tcgtgctcgg gagacaatat tggttctttc tatgtacatt ggtatcaaca gaaacctggt 120 caagcacctg tattagtaat atatgacaaa agtaaccgtc cttcgggaat acctgagcgt 180 ttcagtggtt cgaactcggg caacactgca actttaacta tatctggaac gcaggcggag 240 gatgaggcgg actactattg ccaaagttac gcaaacactc tatccttagt gtttggtgga 300 ggaacaaagt taaccgtgct aggc 324 <210> 93 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 44R24 light chain of anti-FZD antibodies <400> 93 atggcttggg ctctgctgct gctgaccctg ctgacacagg gcaccggctc ttgggccgac 60 atcgagctga cccagcctcc ctctgtgtct gtggcccctg gccagaccgc caggatctct 120 tgctctggcg acgccctggg caacagatac gtgtactggt atcagcagaa gccaggccag 180 gcccctgtgc tggtgatccc ttccggcatc cctgagcggt tctccggctc caactccggc 240 aacaccgcca ccctgaccat ctctggcacc caggccgagg acgaggccga ctactactgc 300 ggctcctggg acacccggcc ttaccctaag tacgtgttcg gcggaggcac caagctgacc 360 gtgctgggcc cttccgtgac cctgttccct ccatcctccg aggaactgca ggccaacaag 420 gccaccctgg tgtgcctgat ctccgacttc taccctggcg ccgtgaccgt ggcttggaag 480 gccgactcta gccctgtgaa 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cctccggcgt gcacaccttc cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 600 tccctgtcct ccgtggtgac agtgccttcc tccaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaaga ccgtggagcg gaagtgctgc 720 gtggagtgcc ctccttgccc tgcccctcct gtggctggtc ctagcgtgtt cctgttccct 780 cctaagccta aggacaccct gatgatctcc cggacccctg aggtgacctg cgtggtggtg 840 gacgtgtccc acgaggatcc tgaagtccag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cacaacgcca agaccaagcc tcgggaggag cagttcaact ccaccttccg ggtggtgtcc 960 gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg aacggcaaag aatacaagtg caaagtctcc 1020 aacaagggcc tgcctgcccc tatcgaaaag accatcagca agaccaaggg ccagcctcgc 1080 gagcctcagg tgtacaccct gcctccctct cgcgaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1140 ctgacctgtc tggtgaaggg cttctaccct tccgatatcg ccgtggagtg ggagtccaac 1200 ggccagcctg agaacaacta caagaccacc cctcctatgc tggactccga cggctctttc 1260 ttcctgtact ccaagctgac agtggacaag tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc 1320 tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat cactacaccc agaagtccct gtccctgtct 1380 cctggcaag 1389 <210> 97 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<400> 98 Phe Cys Gln Pro Ile Ser Ile Pro Leu Cys Thr Asp Ile Ala Tyr Asn 1 5 10 15 Gln Thr Ile Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gln Glu Asp Ala 20 25 30 Gly Leu Glu Val His Gln Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gln Cys Ser 35 40 45 Pro Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val Cys Thr 50 55 60 Val Leu Glu Gln Ala Ile Pro Pro Cys Arg Ser Ile Cys Glu Arg Ala 65 70 75 80 Arg Gln Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gln Trp Pro 85 90 95 Glu Arg Leu Arg Cys Glu His Phe Pro Arg His Gly Ala Glu Gln Ile 100 105 110 Cys Val Gly Gln Asn 115 <210> 99 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz7" <400> 99 Phe Cys Gln Pro Ile Ser Ile Pro Leu Cys Thr Asp Ile Ala Tyr Asn 1 5 10 15 Gln Thr Ile Leu Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gln Glu Asp Ala 20 25 30 Gly Leu Glu Val His Gln Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gln Cys Ser 35 40 45 Pro Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val Cys Thr 50 55 60 Val Leu Asp Gln Ala Ile Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu Arg Ala 65 70 75 80 Arg Gln Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gln Trp Pro 85 90 95 Glu Arg Leu Arg Cys Glu Asn Phe Pro Val His Gly Ala Gly Glu Ile 100 105 110 Cys Val Gly Gln Asn 115 <210> 100 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz1" <400> 100 Tyr Cys Gln Pro Ile Ser Ile Pro Leu Cys Thr Asp Ile Ala Tyr Asn 1 5 10 15 Gln Thr Ile Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gln Glu Asp Ala 20 25 30 Gly Leu Glu Val His Gln Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gln Cys Ser 35 40 45 Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val Cys Thr 50 55 60 Val Leu Glu Gln Ala Leu Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu Arg Ala 65 70 75 80 Arg Gln Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gln Trp Pro 85 90 95 Asp Thr Leu Lys Cys Glu Lys Phe Pro Val His Gly Ala Gly Glu Leu 100 105 110 Cys Val Gly Gln Asn 115 <210> 101 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz5" <400> 101 Val Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Met Cys Arg Gly Ile Gly Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Thr His Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln Asp Glu Ala 20 25 30 Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile Gln Cys Ser 35 40 45 Pro Asp Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro Ile Cys Leu 50 55 60 Pro Asp Tyr His Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu Arg 65 70 75 80 Ala Lys Ala Gly Cys Ser Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly Phe Ala Trp 85 90 95 Pro Glu Arg Met Ser Cys Asp Arg Leu Pro Val Leu Gly Arg Asp Ala 100 105 110 Glu Val Leu Cys Met Asp Tyr Asn 115 120 <210> 102 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz8" <400> 102 Ala Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Leu Cys Lys Gly Ile Gly Tyr Asn 1 5 10 15 Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln Asp Glu Ala 20 25 30 Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile Gln Cys Ser 35 40 45 Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro Ile Cys Leu 50 55 60 Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu Arg 65 70 75 80 Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly Phe Ala Trp 85 90 95 Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro Glu Gln Gly Asp Pro Asp 100 105 110 Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn 115 <210> 103 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz9" <400> 103 Pro Cys Gln Ala Val Glu Ile Pro Met Cys Arg Gly Ile Gly Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Thr Arg Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Ser Gln Gly Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Glu Leu Ala Glu Phe Ala Pro Leu Val Gln Tyr Gly Cys His 35 40 45 Ser His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr 50 55 60 Asp Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Pro Met Cys Glu Gln 65 70 75 80 Ala Arg Leu Arg Cys Ala Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Gly Trp 85 90 95 Pro Asp Ser Leu Asp Cys Ala Arg Leu Pro Thr Arg Asn Asp Pro His 100 105 110 Ala Leu Cys Met Glu Ala Pro 115 <210> 104 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz10" <400> 104 Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn 1 5 10 15 Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala 20 25 30 Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His 35 40 45 Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr 50 55 60 Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln 65 70 75 80 Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp 85 90 95 Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn 100 105 110 Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro 115 <210> 105 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz4" <400> 105 Arg Cys Asp Pro Ile Arg Ile Ser Met Cys Gln Asn Leu Gly Tyr Asn 1 5 10 15 Val Thr Lys Met Pro Asn Leu Val Gly His Glu Leu Gln Thr Asp Ala 20 25 30 Glu Leu Gln Leu Thr Thr Phe Thr Pro Leu Ile Gln Tyr Cys Cys Ser 35 40 45 Ser Gln Leu Gln Phe Phe Leu Cys Ser Val Tyr Val Pro Met Cys Thr 50 55 60 Glu Lys Ile Asn Ile Pro Ile Gly Pro Cys Gly Gly Met Cys Leu Ser 65 70 75 80 Val Lys Arg Arg Cys Glu Pro Val Leu Lys Glu Phe Gly Phe Ala Trp 85 90 95 Pro Glu Ser Leu Asn Cys Ser Lys Phe Pro Pro Gln Asn Asp His Asn 100 105 110 His Met Cys Met Glu Gly Pro 115 <210> 106 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz3" <400> 106 Ser Cys Glu Pro Ile Thr Leu Arg Met Cys Gln Asp Leu Pro Tyr Asn 1 5 10 15 Thr Thr Phe Met Pro Asn Leu Leu Asn His Tyr Asp Gln Gln Thr Ala 20 25 30 Ala Leu Ala Met Glu Pro Phe His Pro Met Val Asn Leu Asp Cys Ser 35 40 45 Arg Asp Phe Arg Pro Phe Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Pro Ile Cys Met 50 55 60 Glu Tyr Gly Arg Val Thr Leu Pro Cys Arg Arg Leu Cys Gln Arg Ala 65 70 75 80 Tyr Ser Glu Cys Ser Lys Leu Met Glu Met Phe Gly Val Pro Trp Pro 85 90 95 Glu Asp Met Glu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Cys Asp Glu Pro Tyr Pro 100 105 110 <210> 107 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "h-Fz6" <400> 107 Thr Cys Glu Pro Ile Thr Val Pro Arg Cys Met Lys Met Ala Tyr Asn 1 5 10 15 Met Thr Phe Phe Pro Asn Leu Met Gly His Tyr Asp Gln Ser Ile Ala 20 25 30 Ala Val Glu Met Glu His Phe Leu Pro Leu Ala Asn Leu Glu Cys Ser 35 40 45 Pro Asn Ile Glu Thr Phe Leu Cys Lys Ala Phe Val Pro Thr Cys Ile 50 55 60 Glu Gln Ile His Val Val Pro Pro Cys Arg Lys Leu Cys Glu Lys Val 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Phe Gly Ile Arg Trp Pro 85 90 95 Glu Glu Leu Glu Cys Asp Arg Leu Gln Tyr Cys Asp Glu Thr Val Pro 100 105 110

Claims (107)

  1. FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 프리즐드(frizzled) 수용체에 특이적으로 결합하고,
    (a) GFTFSHYTLS (서열 1)를 포함하는 중쇄 CDR1, VISGDGSYTYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 NFIKYVFAN (서열 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
    (b) SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QSYANTLSL (서열 9)을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는 SGDKLGKKYAS (서열 4)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SSFAGNSLE (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, SGDNIGSFYVH (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR1, DKSNRPSG (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QSYANTLSL (서열 9)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, SGDKLGKKYAS (서열 4)를 포함하는 경쇄 CDR1, EKDNRPSG (서열 5)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 SSFAGNSLE (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 10과 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열 12 또는 서열 14와 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
    를 포함하는 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드
    를 포함하는 항체.
  6. FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및 FZD8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 프리즐드 수용체에 특이적으로 결합하고,
    (a) 인간 프리즐드 수용체(들) 내의 서열 Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL (서열 24)에 결합하거나;
    (b) 인간 프리즐드 수용체(들) 내의 서열 (K/Q)(F/Y)GF(Q/A) (서열 69)에 결합하거나; 또는
    (c) 인간 프리즐드 수용체(들) 내의 서열 24 및 서열 69에 결합하는
    단리된 항체.
  7. 제6항에 있어서, 인간 프리즐드 수용체(들) 내의 서열 GLEVHQ (서열 25) 및 서열 QYGFA (서열 66)에 결합하는 항체.
  8. 제6항에 있어서, 인간 프리즐드 수용체가 FZD8이고,
    (a) 아미노산 72(F), 74-75(PL), 78(I), 92(Y), 121-122(LM) 및 129-132(WPDR)에 의해 형성된 입체형 에피토프;
    (b) 서열 QDEAGLEVHQFWPL (서열 67)로 이루어진 영역; 또는
    (c) 서열 QYGFA (서열 66)로 이루어진 영역;
    또는 상기 (a), (b) 및 (c) 중 2개 이상
    에 결합하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및 FZD8에 특이적으로 결합하는 항체.
  10. 제4항에 있어서, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및 FZD8에 특이적으로 결합하는 항체.
  11. 제6항에 있어서, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 및 FZD8에 특이적으로 결합하는 항체.
  12. 인간 FZD5 또는 FZD8, 또는 FZD5 및 FZD8에 특이적으로 결합하고,
    (a) GFTFSSYYIT (서열 77)를 포함하는 중쇄 CDR1, TISYSSSNTYYADSVKG (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIVFDY (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및
    (b) SGDALGNRYVY (서열 80)를 포함하는 경쇄 CDR1, SG (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 GSWDTRPYPKY (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 단리된 항체.
  13. 제12항에 있어서,
    (a) 서열 85와 80％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열 86과 80％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드
    를 포함하는 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, 또는 항체 단편인 항체.
  15. 수탁번호 PTA-9541, PTA-9540, PTA-10307, PTA-10309 또는 PTA-10311로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 서열에 의해 코딩된 항체.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제에 접합된 항체.
  17. 제15항의 항체 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는, 암의 치료를 위한 제약 조성물.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 세포.
  19. 수탁번호 PTA-9541, PTA-9540, PTA-10307, PTA-10309 또는 PTA-10311로 ATCC에 기탁된 플라스미드.
  20. 서열 10-15, 서열 85 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  22. (a) 제20항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (b) 서열 17-22, 87-90, 92 및 94-95로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열
    을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  23. 제21항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  24. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  25. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암의 치료를 위한 제약 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 암의 치료가 항체 및 제2 항암제의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 제2 항암제가 화학요법제, 혈관신생 억제제, 노치(Notch) 신호전달의 억제제, 또는 제2 항체인 제약 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 암이 편평세포암, 폐암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 암이 유방암인 제약 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 유방암의 치료가 항체 및 항유사분열제의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 항유사분열제가 탁산인 제약 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 탁산이 파클리탁셀인 제약 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 유방암이 HER2-음성 유방암인 제약 조성물.
  34. 제28항에 있어서, 암이 폐암인 제약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 폐암의 치료가 항체 및 항유사분열제의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 항유사분열제가 탁산인 제약 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 탁산이 도세탁셀인 제약 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 암이 비소세포 폐암인 제약 조성물.
  39. 제28항에 있어서, 암이 췌장암인 제약 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 췌장암의 치료가 항체 및 항유사분열제의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 항유사분열제가 탁산인 제약 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 탁산이 nab-파클리탁셀인 제약 조성물.
  43. 제39항에 있어서, 췌장암의 치료가 항체 및 항대사물의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 항대사물이 겜시타빈인 제약 조성물.
  45. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 종양 성장의 억제를 위한 제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 종양 성장의 억제가 항체 및 제2 항암제의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 제2 항암제가 화학요법제, 혈관신생 억제제, 노치 신호전달의 억제제, 또는 제2 항체인 제약 조성물.
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