TWI506037B - 捲曲結合劑類及彼等之用途 - Google Patents
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Description
本申請案主張美國臨時申請案序號61/176,741(2009年5月8日提出申請)、美國臨時申請案序號61/144,284(2009年1月13日提出申請)、美國臨時申請案序號61/144,058(2009年1月12日提出申請)及美國臨時申請案序號61/100,639(2009年9月26日提出申請)的優先權,前述申請案藉此各以參照方式整體納入此處。
本發明之領域大致上關於與人捲曲受體結合之抗體及其他劑類以及使用該等抗體或其他劑類治療疾病諸如癌症之方法。
癌症是已開發國家的主要死因之一,且僅美國每年就有超過一百萬人被診斷罹癌及500,000人死亡。整體來說,根據估計每3人中超過1人在一生中將發生某些形式之癌症。目前有超過200種不同類型的癌,其中4種-乳癌、肺癌、結直腸癌及前列腺癌-佔所有新發病例的一半以上(Jemal et al.,2003,Cancer J. Clin. 53:5-26)。
Wnt傳訊途徑已被識別為癌症治療之潛在標靶。Wnt傳訊途徑是胚胎模式形成、胚胎後組織維持及幹細胞生物學之數種關鍵調節劑之一。更具體地說,Wnt傳訊在細胞極性的產生及細胞命運的特化包括幹細胞族群之自行更新上扮演重要角色。未經調節之Wnt途徑活化係與數種人癌症有關,其可改變腫瘤細胞之發展命運以維持彼等細胞處於未分化及增生之狀態。因此致癌作用可藉由奪取幹細胞控制正常發展及組織修復之恆定機構以進行(於Reya & Clevers,2005,Nature 434:843;Beachy et al.,2004,Nature 432:324中回顧)。
Wnt傳訊途徑最早在果蠅(Drosophila)發育突變無翅(wingless)基因(wg)及鼠之原致癌基因int-1(現名Wnt1)中發現(Nusse & Varmus,1982,Cell 31:99-109;Van Ooyen & Nusse,1984,Cell 39:233-40;Cabrera et al.,1987,Cell 50:659-63;Rijsewijk et al.,1987,Cell 50:649-57)。Wnt基因編碼分泌型脂修飾(lipid-modified)糖蛋白,其中已在哺乳動物鑑別出19種。該些分泌型配位體活化由捲曲(Fzd)受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白5或6(LPR5/6)所組成之受體複合物。Fzd受體係G蛋白偶合受體(GPCR)超家族中的7個跨膜結構域蛋白,其包含具有10個保守性半胱胺酸之大型胞外N端配位體結合結構域,稱為富含半胱胺酸結構域(CRD)或Fri結構域。人FZD受體共有10種:FZD1至10。不同的Fzd CRD對特定Wnts有不同的結合親和性(Wu & Nusse,2002,J. Biol. Chem. 277:41762-9),且Fzd受體被分成活化典型β-連鎖蛋白(catenin)途徑及活化下述非典型途徑者(Miller et al.,1999,Oncogene 18:7860-72)。為了形成與FZD配位體結合之受體複合物,FZD受體與具有四個胞外EGF樣結構域之單次跨膜蛋白LRP5/6交互作用,該四個胞外EGF樣結構域被6個YWTD胺基酸重複分開(Johnson et al.,2004,J. Bone Mineral Res. 19:1749)。
受體結合所活化之典型Wnt傳訊途徑係由細胞質蛋白散亂蛋白(Dishevelled)(Dsh)直接與Fzd受體交互作用所媒介且導致細胞質中β-連鎖蛋白之穩定及累積。在缺乏Wnt傳訊時,β-連鎖蛋白被侷限於包括腫瘤抑制蛋白結腸腺瘤樣息肉蛋白(APC)及軸蛋白(Axin)之細胞質摧毀複合物中。該些蛋白之功用為允許糖原合成酶激酶(GSK)-3β結合及磷酸化β-連鎖蛋白之重要支架,以標定β-連鎖蛋白經泛素/蛋白酶體途徑之降解。活化Dsh導致GSK3β之磷酸化及該摧毀複合物之解離。累積之細胞質β-連鎖蛋白接著被運送至細胞核中,其在該處與Tcf/Lef家族之DNA結合蛋白交互作用以活化轉錄作用。
除了典型傳訊途徑之外,Wnt配位體亦活化β-連鎖蛋白非依賴性途徑(Veeman et al.,2003,Dev. Cell 5:367-77)。非典型Wnt傳訊曾被暗示與數種過程有關,但最具說服力的是經由類似果蠅平面細胞極性(PCP)途徑之機構的原腸形成移動。其它可能的非典型Wnt傳訊機構包括鈣離子通道、JNK及小型和異三聚體G蛋白二者。在典型和非典型途徑之間通常具有拮抗作用,若干證據顯示非典型傳訊可抑制癌症形成(Olson & Gibo,1998,Exp. Cell Res. 241:134;Topol et al.,2003,J. Cell Biol. 162:899-908)。因此,在特定環境中,Fzd受體之作用為典型Wnt傳訊途徑之負向調節劑。舉例來說,當FZD6經由TAK1-NLK途徑與FZD1共表現時(Golan et al.,2004,JBC 279:14879-88),FZD6抑制Wnt-3a誘發之典型傳訊。同樣的,當Wnt-5a存在時Fzd2經由TAK1-NLK MAPK級聯拮抗典型Wnt傳訊(Isbitani et al.,2003,Mol. Cell. Biol. 23:131-9)。
典型Wnt傳訊途徑在小腸及結腸中之幹細胞族群的維持上亦扮演中心角色,此途徑之不當活化在結直腸癌中扮演重要角色(Reya & Clevers,2005,Nature 434:843)。小腸之吸收上皮係經排列成絨毛及腺窩。幹細胞位處於隱窩中,其緩慢分裂以產生快速增生細胞,該等快速增生細胞形成所有分化細胞族群,該分化細胞族群向上移動出隱窩以佔據小腸絨毛。Wnt傳訊級聯在沿著隱窩絨毛軸控制細胞之命運上扮演主要作用且係維持幹細胞族群所必須。藉由同源重組造成Tcf7/2基因喪失(Korinek et al.,1998,Nat. Genet. 19:379)或過度表現強效分泌性Wnt拮抗劑Dickkopf-1蛋白(DKK1)(Pinto et al.,2003,Genes Dev. 17:1709-13;Kuhnert et al.,2004,Proc. Nat’l. Acad. Sci. 101:266-71)而中斷Wnt傳訊將導致清除小腸幹細胞族群。
結直腸癌最常因活化Wnt傳訊級聯中之突變而引發。大約5至10%之所有結直腸癌病例遺傳家族性腺瘤樣息肉症(FAP)的主要形式之一,家族性腺瘤樣息肉症是一種體染色體顯性疾病,其中約80%之罹病個體的結腸腺瘤樣息肉(APC)基因中包含生殖細胞突變。在其他Wnt途徑成分包括軸蛋白及β-連鎖蛋白中亦發現突變。個別腺瘤係含有第二未活化等位基因之上皮細胞的細胞系贅疣,且大量之FAP腺瘤無可避免地經由在致癌基因及/或腫瘤抑制基因中加入突變導致腺癌發生。另外,Wnt傳訊途徑之活化,包括APC及β-連鎖蛋白中之獲得功能突變,可於小鼠模型中誘發增生性發育及腫瘤生長(Oshima et al.,1997,Cancer Res. 57:1644-9;Harada et al.,1999,EMBO J. 18:5931-42)。
Wnt傳訊在癌症中之作用最早是藉由鑑別Wnt1(原名int1)為鄰近插入鼠病毒所轉型之乳房腫瘤的致癌基因而發現(Nusse & Varmus,1982,Cell 31:99-109)。自此之後累積有關Wnt傳訊於乳癌中之角色的其他證據。舉例來說,β-連鎖蛋白於乳腺中之基因轉殖過度表現導致細胞增生及腺癌(Imbert et al.,2001,J. Cell Biol. 153:555-68;Michaelson & Leder,2001,Oncogene 20:5093-9),然而喪失Wnt傳訊干擾正常乳腺發育(Tepera et al.,2003,J. Cell Sc. 116:1137-49;Hatsell et al.,2003,J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 8:145-58)。近來乳腺幹細胞已被證實可為Wnt傳訊所活化(Liu et al.,2004,Proc. Nat’l Acad. Sci. 101:4158)。在人乳癌中,β-連鎖蛋白累積在超過50%之癌中與活化之Wnt傳訊有關,雖然未找出特定突變,但可觀察到捲曲受體表現之上調(Brennan & Brown,2004,J. Mammary Gland Neoplasia 9:119-31;Malovanovic et al.,2004,Int. J. Oncol. 25:1337-42)。
FZD10、FZD8、FZD7、FZD4和FZD5係10個經識別之人Wnt受體中的5個。Fzd10與Wnt7b在肺中共表現,細胞轉染試驗證實Fzd10/LRP5共受體應答Wnt7b而活化典型Wnt傳訊途徑(Wang et al.,2005,Mol. Cell Biol. 25:5022-30)。FZD10 mRNA在多種癌細胞系包括子宮頸、胃及神經膠母細胞瘤細胞系及原發癌症包括約40%之原發性胃癌、結腸癌及滑膜肉瘤中係經上調(Saitoh et al.,2002,Int. J. Oncol. 20:117-20;Terasaki et al.,2002,Int. J. Mol. Med. 9:107-12;Nagayama et al.,2005,Oncogene 1-12)。FZD8在數種人癌細胞系、原發性胃癌及腎癌中係經上調(Saitoh et al.,2001,Int. J. Oncol. 18:991-96;Kirikoshi et al.,2001,Int. J. Oncol. 19:111-5;Janssens et al.,2004,Tumor Biol. 25:161-71)。FZD7在胃腸道各處表現,在6例人原發性胃癌中之1例上調(Kirikoshi et al.,2001,Int. J. Oncol. 19:111-5)。由結腸細胞系所表現之FZD7胞外域(ectodomain)在異種移植模型中誘發型態學改變及降低腫瘤生長(Vincan et al.,2005,Differentiation 73:142-53)。FZD5係卵黃囊及胎盤血管形成上所必須(Ishikawa et al.,2001,Dev. 128:25-33),且在與Wnt/β-連鎖蛋白傳訊活化有關之腎癌中上調(Janssens et al.,2004,Tumor Biology 25:161-71)。FZD4係於小腸隱窩上皮細胞中高度表現且係於正常與贅生組織中展現分化表現之數種因子之一(Gregorieff et al.,2005,Gastroenterology 129:626-38)。確定FZD受體為癌幹細胞之標記,因此使該些蛋白質成為癌症治療劑之理想標靶。
發明摘要
本發明提供與人捲曲受體(FZD)結合之新穎劑類,包括但不限於與兩種或超過兩種人捲曲受體結合之抗體或其他劑類,及使用該等劑類之方法。本發明另提供新穎之多肽,諸如與一或多種人捲曲受體結合之抗體、該抗體之片段及其他與該抗體有關之多肽。在特定實施態樣中,該與FZD結合之劑、抗體、其他多肽或劑類係與此處稱為生物結合位(BBS)之FZD之區結合,目前由發明人首次辨識該區為抑制Wnt傳訊及/或腫瘤生長之標靶。本發明亦提供包含與超過一種FZD結合之抗原結合位之抗體及其他多肽。本發明亦提供包含編碼該多肽之核酸序列之多核苷酸,如包含該多核苷酸之載體。本發明另提供包含如本發明之多肽及/或多核苷酸之細胞。本發明亦提供包含該新穎之FZD結合劑或抗體之組成物(例如醫藥組成物)。此外,本發明亦提供製備及使用該新穎之FZD結合劑或抗體之方法,諸如使用該新穎之FZD結合劑或抗體以抑制腫瘤生長及/或治療癌症之方法。
因此,在一態樣中,本發明提供與人捲曲受體專一性結合之劑。在特定實施態樣中,該劑抑制配位體(例如Wnt)與人捲曲受體之生物結合位(BBS)結合。在特定實施態樣中,該劑與人捲曲受體內至少部分之生物結合位(BBS)結合。在特定實施態樣中,該劑與該BBS之結合導致抑制Wnt傳訊及/或腫瘤生長。在特定實施態樣中,該人捲曲受體係FZD8且該劑與至少部分之(a)由胺基酸72(F)、74-75(PL)、78(I)、92(Y)、121-122(LM)及129-132(WPDR)(SEQ ID NO:70)所形成之構型表位;(b)由序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO: 67)所組成之FZD8之區;及/或(c)由序列QYGFA(SEQ ID NO: 66)所組成之FZD8之區結合。在特定實施態樣中,該人捲曲受體係選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8,且該劑與至少部分之人捲曲受體內之序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO: 24)結合。舉例來說,在特定實施態樣中,該人捲曲受體係FZD8且該劑與FZD8內至少部分之序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO:67)結合。在特定實施態樣中,該劑與至少部分之序列GLEVHQ(SEQ ID NO: 25)結合。在特定實施態樣中,該人捲曲受體係FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10且該劑與至少部分之人捲曲受體之區結合,該區係對應FZD8之由QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO: 67)所組成之區。在特定實施態樣中,該劑與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8內至少部分之序列(K/Q)(F/Y)GF(Q/A)(SEQ ID NO: 69)結合。舉例來說,在特定實施態樣中,該人捲曲受體係FZD8且該劑與FZD8內至少部分之序列QYGFA(SEQ ID NO: 66)結合。在特定替代性實施態樣中,該人捲曲受體係FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10且該劑與至少部分之人捲曲受體之區結合,該區係對應FZD8之由QYGFA(SEQ ID NO: 66)所組成之區。在特定實施態樣中,該劑與2種或超過2種、3種或超過3種或4種或超過4種人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該劑與包含FZD5及FZD8之人捲曲受體專一性結合。
在另一態樣中,本發明提供同抗體競爭與人捲曲受體專一性結合之劑(例如在活體外競爭結合測定中),其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 10且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14。在一實施態樣中,該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 10且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 14。在特定實施態樣中,該劑競爭與2種或超過2種、3種或超過3種或4種或超過4種人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該劑競爭與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8專一性結合。
在另一態樣中,本發明提供同抗體競爭與人FZD5及/或FZD8專一性結合之劑,其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 85且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 86。
在另一態樣中,本發明提供與2種或超過2種人捲曲受體專一性結合之劑。在特定實施態樣中,該2種或超過2種捲曲受體包含:(a)FZD1及選自FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之第二捲曲受體;(b)FZD2及選自FZD5、FZD7或FZD8之第二捲曲受體;(c)FZD5及FZD7;或(d)FZD7及FZD8。在特定實施態樣中,該劑與3種或超過3種(意即3、4或5種)人捲曲受體專一性結合,其中該3種或超過3種人捲曲受體包含FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8。在特定實施態樣中,該3種或超過3種人捲曲受體包含FZD5及FZD8。在特定實施態樣中,該3種或超過3種人捲曲受體另包含FZD3、FZD4、FZD6、FZD9及/或FZD10。
在其他態樣中,本發明提供與人捲曲受體專一性結合之多肽,其中該多肽包含重鏈可變區,該重鏈可變區包含:(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)之重鏈CDR1或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)之重鏈CDR2或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;及/或(c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)之重鏈CDR3或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體。在特定實施態樣中,該多肽與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8專一性結合。在特定實施態樣中,該多肽與2種或超過2種人捲曲受體包括FZD5及FZD8專一性結合。在特定實施態樣中,該胺基酸取代係保守性取代。
在另一態樣中,本發明提供與人捲曲受體專一性結合之多肽,其中該多肽包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(a)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7之變異體的輕鏈CDR1;(b)包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8之變異體的輕鏈CDR2;及/或(c)包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9之變異體的輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該多肽與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8專一性結合。在特定實施態樣中,該多肽與2種或超過2種人捲曲受體包括FZD5及FZD8專一性結合。在特定實施態樣中,該胺基酸取代係保守性取代。
在另一態樣中,本發明提供一種多肽,其包含:(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)的重鏈CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)的重鏈CDR2及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)的重鏈CDR3;及/或(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)的輕鏈CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)的輕鏈CDR2及包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)的輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該多肽與人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該多肽與2種或超過2種(例如至少FZD5及FZD8)、3種或超過3種或4種或超過4種人捲曲受體專一性結合。
在其他態樣中,本發明提供一種與選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之人捲曲受體專一性結合之抗體,其中該抗體包含重鏈可變區,該重鏈可變區包含:(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)之重鏈CDR1或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)之重鏈CDR2或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)之重鏈CDR3或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;及/或(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)、SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)或含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代之SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7之變異體的輕鏈CDR1;包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)、DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)或含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代之SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8之變異體的輕鏈CDR2;及包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)、QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)或含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代之SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9之變異體的輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該抗體包含(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)的重鏈CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)的重鏈CDR2及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)的重鏈CDR3;及/或(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)的輕鏈CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)的輕鏈CDR2及包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)的輕鏈CDR3。
在另一態樣中,本發明提供一種多肽,其包含(a)具有與SEQ ID NO:10至少約80%之序列同一性的多肽;及/或(b)具有與SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14至少約80%之序列同一性的多肽。在特定實施態樣中,本發明提供一種多肽,其包含(a)具有與SEQ ID NO:10至少約80%之序列同一性的多肽;及/或(b)具有與SEQ ID NO:14至少約80%之序列同一性的多肽。在特定實施態樣中,該多肽與人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該多肽與2種或超過2種、3種或超過3種或4種或超過4種人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該人捲曲受體係選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8。
在另一態樣中,本發明提供一種與人FZD5及/或FZD8專一性結合之劑諸如抗體,其中該抗體包含:(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO:77)之重鏈CDR1或彼之含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代的變異體;包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO:78)之重鏈CDR2或彼之含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代的變異體;及包含SIVFDY(SEQ ID NO:79)之重鏈CDR3或彼之含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代的變異體;及/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO:80)之輕鏈CDR1或彼之含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代的變異體;包含SG(SEQ ID NO:81)之輕鏈CDR2或彼之含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代的變異體;及包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO:82)之輕鏈CDR3或彼之含有1、2、3或4個保守性胺基酸取代的變異體。在特定實施態樣中,該抗體包含:(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO:77)的重鏈CDR1、包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO:78)的重鏈CDR2及包含SIVFDY(SEQ ID NO:79)的重鏈CDR3;及/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO:80)的輕鏈CDR1、包含SG(SEQ ID NO:81)的輕鏈CDR2及包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO:82)的輕鏈CDR3。
在另一態樣中,本發明提供一種與FZD5及/或FZD8專一性結合之多肽,其中該多肽包含:(a)具有與SEQ ID NO:85至少約80%之同一性的多肽;及/或(b)具有與SEQ ID NO:86至少約80%之同一性的多肽。
在其他態樣中,本發明提供一種同18R8、18R5、18R4605或18R4805競爭與人FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8專一性結合之劑。
在其他態樣中,本發明提供一種同44R24競爭與人FZD5及/或FZD8專一性結合之劑。
在前述各個態樣之特定實施態樣以及此處所描述之其他態樣中,該劑或多肽係抗體。在特定替代性實施態樣中,該劑非為抗體。
在前述各個態樣之特定實施態樣以及此處所描述之其他態樣中,該劑或多肽或抗體係與其所結合之人捲曲受體或多種受體之胞外結構域(ECD)結合。在前述各個態樣之特定實施態樣以及此處所描述之其他態樣中,該劑或多肽或抗體係與其所結合之人捲曲受體或多種受體之Fri結構域(Fri)結合。
在前述各個態樣之特定實施態樣以及本申請案他處所描述之其他態樣中,抗體或其他多肽之個別抗原結合位與超過一種人捲曲受體專一性結合(或能與彼等結合)。
在前述各個態樣之特定實施態樣以及此處所描述之其他態樣中,該劑或多肽或抗體抑制配位體與人捲曲受體之結合。在特定實施態樣中,該配位體係Wnt。
在前述各個態樣以及此處所描述之其他態樣之特定實施態樣中,該與FZD結合之劑或多肽或抗體係FZD之拮抗劑。
在前述各個態樣之特定實施態樣以及此處所描述之其他態樣中,該劑或多肽或抗體抑制Wnt傳訊。在特定實施態樣中,該被抑制之Wnt傳訊係典型Wnt傳訊。在若干實施態樣中,該被FZD結合劑所抑制之Wnt傳訊係非典型Wnt傳訊。在特定實施態樣中,該Wnt傳訊係非典型Wnt傳訊。
在前述各個態樣之特定實施態樣以及此處所描述之其他態樣中,該FZD結合劑或多肽或抗體抑制腫瘤生長。
本發明另提供抗體18R8、18R5、18R4605及18R4805以及彼等之片段。
本發明另提供包含FZD結合劑或抗體之組成物,諸如醫藥組成物。
本發明提供抑制Wnt傳訊(例如典型Wnt傳訊)及/或抑制個體內腫瘤生長之方法,該方法包含投予治療有效量之FZD結合劑或多肽或抗體。
本發明亦提供一種減低包含癌幹細胞之腫瘤的腫瘤發生之方法。在特定實施態樣中,該方法包含對包含該腫瘤之個體投予治療有效量之FZD結合劑或多肽或抗體。在特定實施態樣中,該腫瘤中癌幹細胞之頻率係藉由投予該抗體被降低。在特定實施態樣中,投予該FZD結合劑導致該腫瘤中之腫瘤發生細胞分化成為非腫瘤發生狀態。
本發明亦提供誘發個體之腫瘤內之細胞分化之方法,該方法包含對該個體投予治療有效量之FZE結合劑、多肽或抗體。
本發明另提供治療個體之癌症之方法,該方法包含對該個體投予治療有效量之FZD結合劑、多肽或抗體。
此外,本發明提供減低實質腫瘤之基質中的肌纖維母細胞活化之方法,該方法包含使該基質與有效量之FZD結合劑、多肽或抗體接觸。
在特定實施態樣中,該等包含投予FZD結合劑、多肽或抗體之方法另包含對個體投予第二抗癌劑(例如化學治療劑)。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係吉斯他濱(gemcitabine)、愛萊諾迪肯(irinotecan)或太平洋紫杉醇(paclitaxel)。在特定實施態樣中,該第二劑係血管生成抑制劑及/或刻痕(Notch)傳訊抑制劑。
在另一態樣中,本發明提供包含選自SEQ ID NO:10至15之序列的多肽。本發明同時提供包含選自SEQ ID NO:85至86之序列的多肽。本發明亦提供包含編碼該等多肽之核酸序列的多核苷酸。
在其他態樣中,本發明提供包含選自SEQ ID NO:17至22之序列的多核甘酸。本發明提供包含選自SEQ ID NO:87至90、92或94至95之序列的多核苷酸。
在其他態樣中,本發明提供一種多核苷酸,其包含在高嚴謹度之條件下與下列雜交之多核苷酸:選自SEQ ID NO:17、19、21、87至90、92或94至95之多核苷酸,或編碼選自序列SEQ ID NO:10、12、14或85至86之多肽之多核苷酸。在特定實施態樣中,本發明包含一種多核苷酸,該多核苷酸在高嚴謹度之條件下與序列SEQ ID NO:17、19或21所組成之多核苷酸或編碼序列SEQ ID NO:10、12或14之多核苷酸雜交。
在前述各個態樣之特定實施態樣以及此處所描述之其他態樣中,該劑或多肽或抗體或多核苷酸係經分離。在特定實施態樣中,該劑或多肽或抗體或多核苷酸係實質上純的。
本發明另提供可用於辨識可能對FZD結合劑(例如人捲曲受體之拮抗劑及/或Wnt傳訊之抑制劑)或其他Wnt傳訊抑制劑之治療有反應之腫瘤及/或病患的Wnt基因簽署(gene signature)。本發明亦提供使用Wnt基因簽署以選擇供FZD結合劑或其他Wnt傳訊抑制劑治療之病患的方法。在特定實施態樣中,該方法涉及評估Wnt基因簽署中一或多個基因之量。本發明亦提供篩選候選藥物以拮抗利用Wnt基因簽署所識別之腫瘤之方法。本發明亦提供可用於該等方法中之組合、套組及其他組成物。
本發明亦提供篩選潛在候選藥物之方法。該等方法包括但不限於包含比較已經暴露於候選藥物之第一實質腫瘤中之一或多種分化標記之量與未經暴露於該候選藥物之第二實質腫瘤中之該一或多種分化標記之量之方法。在特定實施態樣中,該等方法包含:(a)使第一實質腫瘤暴露於候選藥物,但第二實質腫瘤則否;(b)檢測該第一及第二實質腫瘤中之一或多種分化標記之量;及(c)比較該第一及第二實質腫瘤中之該一或多種分化標記之量。
當本發明之態樣或實施態樣係以馬庫西(Markush)群組或其他替代物群組之形式描述時,本發明不僅包含列出為整體之整個群組,但亦包含該群組之個別成員及該主要群組之所有可能的亞群以及缺乏一或多個該群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除一或多個在所主張之發明中之任何群組成員。
本發明提供新穎劑類,包括但不限於與人捲曲受體(FZD)結合之多肽諸如抗體。本發明亦提供相關多肽及多核苷酸、包含該FZD結合劑類之組成物及製備該FZD結合劑類之方法。本發明另提供使用該新穎FZD結合劑類之方法,諸如抑制腫瘤生長及/或治療癌症之方法。
本發明部分係根據識別人捲曲受體內適合作為FZD結合、抗癌劑之標靶之區。兩種抗FZD抗體18R8及18R5被發現與FZD7專一性結合,但亦與FZD1、FZD2、FZD5及FZD8交叉反應(見下列實施例1及2)。使用18R8抗體之活體外試驗顯示該抗體能抑制Wnt傳訊(見下列實施例3)及抑制Wnt配位體與FZD8之結合(見下列實施例4)。使用18R5抗體之活體內試驗證實該抗體能抑制腫瘤生長(實施例7)。使用這些活性18R8及18R5抗體之表位定位實驗顯示,兩種抗體皆與FZD8內至少部分之序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)及至少部分之序列YGFA(SEQ ID NO:74)結合(見下列實施例5)。有鑒於該等抗體該經證實之生物活性,鼠捲曲蛋白8之晶體結構(Dann et al.,Nature,412:86-90(2001))係經分析且包含這些序列之捲曲蛋白的細胞外區域首次被識別在FZD生物學及Wnt傳訊中具有重要之功能作用(實施例6),該些序列先前並未被歸屬任何特定功能。人捲曲受體之該區被稱為生物結合位(BBS),其係抗癌症治療之適當標靶。
I. 定義
為了促使對本發明之了解,以下定義一些名詞及用語。
「抗體」一詞係指一種免疫球蛋白分子,該免疫球蛋白分子透過其可變區內之至少一個抗原辨識位辨識及專一性地結合標靶,諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂肪或前述之組合。此處所使用之「抗體」一詞包含完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2
及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)突變、多專一性抗體諸如由至少兩個完整抗體產製之雙特異性抗體、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、包含抗體之抗原決定部位之融合蛋白質及包含抗原辨識位之任何其他經修飾之免疫球蛋白分子只要該抗體展現所欲之生物活性。抗體可為五種主要免疫球蛋白類型之任何類型,包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或彼之亞型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2),根據彼等之重鏈恆定結構域為何而定,該些重鏈恆定結構域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型之免疫球蛋白具有不同且廣為週知之次單位結構及三維構型。抗體可為裸抗體或與其它分子諸如毒素、放射性同位素等共軛。
「抗體片段」一詞係指完整抗體之一部分及指完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2
及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及自抗體片段形成之多專一性抗體。
「單株抗體」係指涉及高度專一性辨識及結合單一抗原決定基或表位之同源抗體族群。這和多株抗體不同,多株抗體通常包括以不同抗原決定基為標靶之不同抗體。「單株抗體」一詞包含完整及全長單株抗體兩者以及抗體片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2
、Fv)、單鏈(scFv)突變、包含抗體部分之融合蛋白質及包含抗原辨識位之任何其他經修飾之免疫球蛋白分子。另外,「單株抗體」係指以許多方式製備之抗體,該等方式包括但不限於雜交瘤、噬菌體選擇、重組表現及基因轉殖動物。
用語「人化抗體」係指非人(例如鼠)抗體之形式,該形式為含有最低度非人(例如鼠)序列之專一性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或彼等之片段。一般而言,人化抗體係其中來自互補決定區(CDR)之殘基被來自具有所欲專一性、親和性及能力之非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)的CDR之殘基所取代之人免疫球蛋白(Jones et al.,1986,Nature,321:522-525;Riechmann et al.,1988,Nature,332:323-327;Verhoeyen et al.,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情況中,人免疫球蛋白之Fv骨架區(FR)殘基被具有所欲專一性、親和性及能力之非人物種抗體中之對應殘基取代。該人化抗體可進一步藉由取代Fv骨架區及/或該經取代之非人殘基內之額外殘基被修飾,以改善及最佳化抗體之專一性、親和性及/或能力。整體而言,該人化抗體將包含實質上所有之至少一個(且通常為兩個或三個)可變結構域,該可變結構域包含所有或實質上所有之對應該非人免疫球蛋白之CDR區,然而所有或實質上所有之FR區係該些具有人免疫球蛋白共識序列者。該人化抗體亦可包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc),通常為人免疫球蛋白之恆定區或結構域。用於產製人化抗體之方法實例係描述於美國專利號5,225,539。
「人抗體」一詞係指由人產製之抗體或利用該領域已知之任何技術所製備之具有對應由人產製之抗體之胺基酸序列的抗體。此定義之人抗體包括完整或全長抗體、彼之片段及/或包含至少一個人重鏈及/或輕鏈多肽之抗體諸如舉例來說包含鼠輕鏈及人重鏈多肽之抗體。
「嵌合抗體」一詞係指其中該免疫球蛋白分子之胺基酸序列係源自兩或多個物種之抗體。一般來說,輕鏈及重鏈兩者之可變區對應源自一具有所欲專一性、親和性及能力之哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之抗體的可變區,然而該恆定區係與源自另一物種(通常是人)之抗體的序列同源以避免在該物種誘發免疫反應。
用語「表位」或「抗原決定基」在此處可交換使用,係指能被特定抗體辨識及專一性結合之抗原的部分。當該抗原係多肽時,表位可自連續胺基酸及藉由蛋白質三級摺疊被並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位在蛋白質變性時通常被保留,然而藉三級折疊所形成之表位通常在蛋白質變性時喪失。表位通常包括至少3個(通常為至少5個或8至10個)採取獨特空間構型之胺基酸。
抗體與表位或蛋白質「專一性結合」係指該抗體相較於與其他物質包括不相干蛋白質反應或結合時,以更為頻繁、更為快速、作用期間更長、親和性(affinity)更高或上述若干之組合與表位或蛋白質反應或結合。在特定實施態樣中,「專一性結合」係指例如抗體以約0.1mM或低於0.1mM之KD
與蛋白質結合,但通常低於約1μM。在特定實施態樣中,「專一性結合」係指抗體以至少約0.1μM或低於0.1μM及其他時候至少約0.01μM或低於0.01μM之KD
與蛋白質結合。由於不同物種之同源蛋白質之間具有序列同一性,專一性結合可包括辨識超過一個物種之特定蛋白質諸如捲曲受體之抗體。同樣的,由於不同FZD受體(例如FZD5及FZD8)在該等受體之多肽序列的特定區域之間具有同源性,因此專一性結合可包括辨識超過一種捲曲受體之抗體(或其他多肽或劑)。應了解的是,與第一標靶專一性結合之抗體或結合基團可能與或不與第二標靶專一性結合。因此,「專一性結合」不一定需要(雖然可包括)排他性結合,意即與單一標靶結合。因此,在特定實施態樣中,抗體可能與超過一種標靶專一性結合(例如人FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8)。在特定實施態樣中,多種標靶可能被抗體上相同之抗原結合位結合。舉例來說,抗體在特定情況中可能包含兩個相同之抗原結合位,該等抗原結合位各與2種或超過2種人捲曲受體(例如人FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8)專一性結合。在特定替代性實施態樣中,抗體可能為雙特異性抗體且包含至少兩個具有不同專一性之抗原結合位。在非限制性實施例中,雙特異性抗體可能包含辨識一種捲曲受體諸如人FZD5上之表位的一個抗原結合位,且另包含辨識第二捲曲受體諸如人FZD8上之不同表位的不同之第二抗原結合位。結合通常但不一定指專一性結合。
「經分離」之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係指呈天然中不被發現之形式之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物。經分離之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括該些已經被純化至不再以天然所發現之形式存在之程度的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物。在一些實施態樣中,經分離之抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係實質上純的。
此處所使用之「實質上純的」係指至少為50%純的(意即不含汙染物)、更佳至少為90%純的、更佳至少為95%純的、更佳至少為98%純的、更佳至少為99%純的物質。
用語「癌」及「癌性」係指或描述哺乳動物之生理狀況,其中一群細胞之特徵為不受調節之細胞生長。癌之實例包括但不限於癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。癌更具體之實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝臟癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾腺癌、腎臟癌、肝臟癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各種頭頸癌。
「腫瘤」及「瘤(neoplasm)」係指過度細胞生長或增生所導致之任何組織實質,不論良性(非癌性)或惡性(癌性)包括前癌性病灶。
用語「癌幹細胞」、「腫瘤幹細胞」或「實質腫瘤幹細胞」在此處可交換使用,係指一群來自實質腫瘤之細胞,其(1)具有大量增生能力;(2)能進行不對稱細胞分裂以產生一或多種增生或發育潛能降低之分化後代;及(3)能進行對稱細胞分裂以自我更新或自我維持。「癌幹細胞」、「腫瘤幹細胞」或「實質腫瘤幹細胞」之這些特性令該些癌幹細胞相較於無法形成腫瘤之大部分腫瘤細胞,具有在被連續移植至免疫不全小鼠時形成可觸知腫瘤之能力。癌幹細胞以混亂的方式進行自我更新及分化以形成具有異常細胞種類之腫瘤,該細胞種類可在突變發生時隨時間改變。
用語「癌細胞」、「腫瘤細胞」及文法相等語係指源自腫瘤或前-癌性病灶之細胞總族群,包括非腫瘤發生細胞及腫瘤發生幹細胞(癌幹細胞)二者,非腫瘤發生細胞包含腫瘤細胞族群之團塊。此處所使用之用語「腫瘤細胞」當僅指該些缺乏更新及分化能力之腫瘤細胞時將由用語「非腫瘤發生」修飾,以區別該些腫瘤細胞與癌幹細胞。
用語「腫瘤發生」係指實質腫瘤幹細胞之功能特徵,包括自我更新(導致額外的腫瘤發生癌幹細胞)及增生以產生所有其他腫瘤細胞(導致經分化且因此為非腫瘤發生腫瘤細胞)之特性,以允許實質腫瘤幹細胞形成腫瘤。這些自我更新及增生以產生所有其他腫瘤細胞之特性授予癌幹細胞在被連續移植至免疫不全小鼠時相較於非腫瘤發生腫瘤細胞形成可觸知腫瘤之能力,非腫瘤發生腫瘤細胞在被連續移植時無法形成腫瘤。人們已經觀察到自實質腫瘤得到非腫瘤發生腫瘤細胞後,將該腫瘤細胞初次移植至免疫不全小鼠時可形成腫瘤,但該些非腫瘤發生腫瘤細胞之連續移植無法導致腫瘤。
用語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物),其包括但不限於人、非人靈長動物、齧齒動物及類似動物,該動物為特定治療之接受者。一般來說,在此處提及人個體時用語「個體」及「病患」可交換使用。
「醫藥上可接受之鹽」係指化合物之鹽,其為醫藥上可接受且具有該母體化合物之所欲藥學活性。
「醫藥上可接受之賦形劑、載劑或佐劑」係指可與本發明之至少一種抗體一起投予至個體之賦形劑、載劑或佐劑,且該賦形劑、載劑或佐劑不會破壞該至少一種抗體之藥學活性且當以足以遞送治療量之化合物之劑量投予時不具有毒性。
「醫藥上可接受之載具(vehicle)」係指與本發明之至少一種抗體一起投予之稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。
用語「治療有效量」係指能有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或病症之抗體、多肽、多核苷酸、有機小分子或其他藥物之量。在癌症之例中,藥物之治療有效量可減少癌細胞之數量;縮小腫瘤體積;抑制或停止癌細胞浸潤至週邊器官包括例如癌擴散至軟組織及骨;抑制及停止腫瘤轉移;抑制及停止腫瘤生長;緩解若干程度之一或多種與癌症有關之徵候;降低發病率及死亡率;改善生活品質;降低腫瘤之腫瘤發生性、腫瘤發生頻率或腫瘤發生能力;降低腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率;使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生狀態;或具有該等效應之組合。就藥物防止已存在之癌細胞生長及/或殺死已存在之癌細胞之範圍上而言,其可被稱為具有細胞抑制性及/或細胞毒性。
諸如「治療(treating)」或「治療(treatment)」或「以治療」或「減輕(alleviating)」或「以減輕」之用語係指1)治癒、減慢、減輕徵候及/或阻止經診斷之病理狀況或病症之進展的治療性方法及2)預防及/或減慢目標病理狀況或病症之發展的預防或預防性方法兩者。因此,該些需要治療者包括該些已有病症者;該些易於罹患病症者;及該些應予以預防病症者。在特定實施態樣中,個體係成功地以本發明之方法「治療」癌症,如果該病患顯示下列一或多項:減少癌細胞之數量或完全清除癌細胞;縮小腫瘤體積;抑制或沒有癌細胞浸潤至週邊器官包括例如癌擴散至軟組織及骨;抑制及沒有腫瘤轉移;抑制或沒有腫瘤生長;緩解一或多種與特定癌症有關之徵候;降低發病率及死亡率;改善生活品質;降低腫瘤之腫瘤發生性、腫瘤發生頻率或腫瘤發生能力;降低腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率;使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生狀態;或該等效應之若干組合。
「多核苷酸」或「核酸」在此處可交換使用,係指任何長度之核苷酸之聚合物,包括DNA及RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼等之類似物,或可藉由DNA或RNA聚合酶被納入聚合物中之任何基質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸,諸如甲基化核苷酸及彼等之類似物。若存在的話,可在該聚合物裝配之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列可被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可在聚合後被進一步修飾,諸如與標記成分共軛。其它類型之修飾包括例如「加蓋(caps)」、以類似物取代一或多個天然發生之核苷酸、核苷酸間修飾諸如例如該些具有不帶電鍵合(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸醯胺、胺甲酸酯等)及具有帶電鍵合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、該些含有懸掛基團者諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-離胺酸等)、該些具有嵌合劑者(例如吖啶、補骨脂素等)、該些含有螯合劑者(例如金屬、放射活性金屬、硼、氧化性金屬等)、該些含有烷化劑者、該些具有經修飾鍵合者(例如α變旋異構核酸等)以及未經修飾形式之多核苷酸。另外,任何原本存在糖中之羥基可被例如膦酸酯基團、磷酸酯基團所取代,被標準保護基團所保護,或經活化以與額外核苷酸製備額外鍵合,或可被共軛至固體支持物。該5’及3’端OH可被胺或具有自1至20個碳原子之有機蓋基團磷酸化或取代。其它羥基亦可被衍生成標準保護基團。多核苷酸亦可包含該領域通常已知之類似形式之核糖或去氧核糖糖類,包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基-、2’-氟基-或2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天糖、無環類似物及無鹼基核苷類似物諸如甲基核糖苷。一或多種磷酸二酯鍵合可被選擇性連接基團取代。這些選擇性連接基團包括但不限於其中磷酸酯被P(O)S(「硫代」)、P(S)S(「二硫代」)、(O)NR2(「醯胺」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2
(「甲縮醛(formacetal)」)所取代之實施態樣,其中各R或R’係獨立的H或經取代或未經取代之烷基(1至20個碳),該烷基可選擇的包含醚(--O--)鍵合、芳基、烯基、環烷基、環烯基或araldyl。多核苷酸中之所有鍵結不需要完全相同。前述說明適用於此處提及之所有多核苷酸,包括RNA及DNA。
抗體之「可變區」係指不論單獨或經組合之該抗體輕鏈之可變區或該抗體重鏈之可變區。該重鏈及輕鏈之可變區各由四個骨架區(FR)組成,該四個骨架區係由三個又名超可變區之互補決定區(CDR)所連接。各鏈中之CDR藉由FR緊密地拉靠在一起且與來自另一鏈之CDR導致形成抗體之抗原結合位。至少有兩種技術用於決定CDR:(1)以跨種序列變異性為基礎之方式(意即Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5th
ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.));及(2)以抗原-抗體複合物之結晶學試驗為基礎之方式(Al-lazikani et al(1997)J. Molec. Biol. 273:927-948)。此外,這兩種方式之組合有時候被用於該領域以決定CDR。
用語「載體」係指建構物,其能在宿主細胞中傳送且較佳的是表現感興趣之一或多個基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體、包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及特定真核細胞諸如生產細胞(producer cells)。
用語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在此處可交換使用以指稱任何長度之胺基酸之聚合物。該聚合物可為線性或分支,其可包含經修飾之胺基酸且可能被非胺基酸所中斷。該用語亦包含已經天然或人為介入修飾之胺基酸聚合物;例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾,諸如與標記成份共軛。該定義亦包括例如包含一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及該技藝習知之其他修飾之多肽。應了解的是,由於本發明之多肽在特定實施態樣中係基於抗體,因此該多肽可發生為單鏈或結合之鏈。
就兩個或超過兩個核酸或多肽而言「同一」或「同一性」百分比之用語係指當比較及排列(若需要的話導入缺口)兩個或超過兩個序列或子序列以達最大相關性且不考慮任何保守性胺基酸取代以為該序列同一性之部分時,該兩個或超過兩個序列或子序列係為相同或具有係為相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。同一性百分比可利用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢測測量。多種演算法及軟體係為該領域所知,其可被用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排列。序列排列演算法之一個該非限制性實例係於Karlin et al,1990,Proc. Natl. Acad. Sci.,87:2264-2268中所述、於Karlin et al.,1993,Proc. Natl. Acad. Sci.,90:5873-5877中修改且納入NBLAST及XBLAST程式(Altschul et al.,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)之演算法。在特定實施態樣中,Gapped BLAST可如Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402中所述被使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul et al.,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(加州南舊金山基因科技公司(Genentech))或Megalign(DNASTAR公司)為其他可公開取得之軟體程式,彼等可被用於排列序列。在特定實施態樣中,兩個核苷酸序列之間的同一性百分比係利用GCG軟體中之GAP程式決定(例如使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或90之缺口重量及1、2、3、4、5或6之長度重量)。在特定選擇性之實施態樣中,納入尼德曼(Needleman)及文許(Wunsch)演算法(J. Mol. Biol.(48):444-453(1970))之GCG套裝軟體的GAP程式可被用於決定兩個胺基酸序列之間的同一性百分比(例如使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣,及16、14、12、10、8、6或4之缺口重量及1、2、3、4、5之長度重量)。可選擇的是,在特定實施態樣中,核苷酸或胺基酸序列之間的同一性百分比係利用邁爾斯(Myers)及米勒(Miller)演算法決定(CABIOS,4:11-17(1989))。舉例來說,同一性百分比可利用ALIGN程式(2.0版)決定及使用具有殘基表、缺口長度罰值12及缺口罰值4之PAM120。藉由特定排列軟體得到最佳排列之適當參數可由該領域之技藝人士決定。在特定實施態樣中,使用該排列軟體之內建參數。在特定實施態樣中,第一胺基酸序列對第二胺基酸序列之同一性百分比X係由100×(Y/Z)計算,其中Y係在第一及第二序列之排列中被紀錄為同一性匹配之胺基酸殘基數(以目視檢測或特定序列排列程式排列)且Z係第二序列中之殘基總數。如果第一序列之長度較第二序列為長,第一序列對第二序列之同一性百分比相較於第二序列對第一序列之同一性百分比將更長。
在非限制性實例中,任何特定多核苷酸是否具有與參照序列特定之序列同一性百分比(例如至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性,及在一些實施態樣中,至少95%、96%、97%、98%或99%之同一性),可在特定實施態樣中利用Bestfit程式決定(威斯康辛序列分析套組,Unix第8版,53711威斯康辛州麥迪遜科學大道575號大學硏究園區基因電腦集團(Genetics Computer Group))。Bestfit利用史密斯(Smith)及華特曼(Waterman)之局部同源性演算法(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))以找出兩個序列之間具同源性之最佳區段。當使用Bestfit或任何其他序列排列程式以決定特定序列是否與本發明之參照序列具有例如95%之同一性時,參數係經設定以使同一性百分比係根據該參照核苷酸序列之全長計算且允許同源性中之缺口最高可達該參照序列中核苷酸總數之5%。
在一些實施態樣中,本發明之兩個核酸或多肽實質上係同一,表示當比較及排列以達最大相關性時,它們具有至少70%、至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%,及在一些實施態樣中至少95%、96%、97%、98%、99%之核苷酸或胺基酸殘基同一性,使用序列比較演算法或藉由目視檢測測量。較佳的是,同一性存在於至少約10個、較佳約20個、更佳約40至60個殘基長度或任何介於之間之整數值之序列之區中,較佳的是存在於超過60至80個殘基之較長區域、更佳的是至少約90至100個殘基,且最佳的是該等序列與被比較序列之全長係實質上同一的,諸如舉例來說核苷酸序列之編碼區。
「保守性胺基酸取代」係指其中一個胺基酸殘基被另一個具有類似側鏈之胺基酸殘基所取代之胺基酸取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族在該領域中已被定義,包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香性側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例來說,以苯丙胺酸取代酪胺酸係保守性取代。較佳的是,在本發明之多肽及抗體之序列中的保守性取代不廢止包含該胺基酸序列之多肽或抗體與抗原之結合,也就是該多肽或抗體所結合之一或多種人捲曲受體。鑑別不廢除抗原結合之核苷酸及胺基酸保守性取代之方法係該領域所廣為週知(參見例如Brummell et al.,Biochem. 32: 1180-1187(1993);Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884(1999)及Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417(1997))。
本揭示及申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數形式,除非文中清楚地另外說明。
應了解的是,不論本發明之實施態樣在何處以「包含」之用語描述,本發明亦提供以「組成」及/或「實質上組成」所描述之其他類似實施態樣。
「高嚴謹度條件」可被定義為該些:(1)採用低離子張力及高溫以供清洗者,例如50℃之0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二基硫酸鈉;(2)在雜交期間採用變性劑,諸如甲醯胺,例如50%(體積/體積)甲醯胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/42℃之含有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉之50mM磷酸鈉緩衝液pH 6.5;或(3)於42℃採用50%甲醯胺、5倍SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5倍丹哈德(Denhardt’s)溶液、經超音波化之鮭魚精子DNA(50微克/毫升)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖,並於42℃以0.2倍SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)清洗及於55℃以50%甲醯胺清洗,之後於55℃以含有EDTA之0.1倍SSC進行高嚴謹度清洗。
II. FZD結合劑
本發明提供與一或多種人捲曲受體(FZD)專一性結合之劑類。該等劑類在此處被稱為「FZD結合劑」。在特定實施態樣中,該等劑類與2、3、4、5、6、7、8、9或10種捲曲受體專一性結合。被該劑結合之人捲曲受體或多種受體可選自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。在特定實施態樣中,該一或多種人捲曲受體包含FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8。在特定實施態樣中,該一或多種人捲曲受體包含FZD5及/或FZD8。在特定實施態樣中,該劑與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8專一性結合。FZD1至10之全長胺基酸(aa)及核苷酸(nt)序列係為該領域所知,且亦於此處提供為SEQ ID NO:26(FZD1 aa)、SEQ ID NO:30(FZD2 aa)、SEQ ID NO:34(FZD3 aa)、SEQ ID NO:38(FZD4 aa)、SEQ ID NO:42(FZD5 aa)、SEQ ID NO:46(FZD6 aa)、SEQ ID NO:50(FZD7 aa)、SEQ ID NO:54(FZD8 aa)、SEQ ID NO:58(FZD9 aa)、SEQ ID NO:62(FZD10 aa)、SEQ ID NO:29(FZD1 nt)、SEQ ID NO:33(FZD2 nt)、SEQ ID NO:37(FZD3 nt)、SEQ ID NO:41(FZD4 nt)、SEQ ID NO:45(FZD5 nt)、SEQ ID NO:49(FZD6 nt)、SEQ ID NO:53(FZD7 nt)、SEQ ID NO:57(FZD8 nt)、SEQ ID NO:61(FZD9 nt)及SEQ ID NO:65(FZD10 nt)。
在特定實施態樣中,此處所描述之抗體或其他多肽或劑與FZD7專一性結合。在特定實施態樣中,該抗體、多肽或劑可能另與一或多種額外之人捲曲受體專一性結合。
在特定實施態樣中,該劑與2種或超過2種人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該2種或超過2種人捲曲受體係選自FZD2、FZD5、FZD7或FZD8。在特定實施態樣中,該2種或超過2種捲曲受體包含FZD1及選自FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之第二捲曲受體。在特定實施態樣中,該2種或超過2種捲曲受體包含FZD2及選自FZD1、FZD5、FZD7或FZD8之第二捲曲受體。在特定實施態樣中,該2種或超過2種捲曲受體包含FZD5及選自FZD1、FZD2、FZD7或FZD8之第二捲曲受體。在特定實施態樣中,該2種或超過2種捲曲受體包含FZD7及選自FZD1、FZD2、FZD5或FZD8之第二捲曲受體。
在特定實施態樣中,該劑與3種或超過3種人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該3種或超過3種人捲曲受體包含3種或超過3種選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之捲曲受體。在特定實施態樣中,該劑另與一或多種額外之人捲曲受體專一性結合。
在特定實施態樣中,該劑或抗體與其所結合之一或多種人捲曲受體內之胞外結構域(ECD)專一性結合。各種人捲曲受體之胞外結構域的序列係為該領域所知,且亦於此處提供為SEQ ID NO:27(FZD1 ECD)、SEQ ID NO:31(FZD2 ECD)、SEQ ID NO:35(FZD3 ECD)、SEQ ID NO:39(FZD4 ECD)、SEQ ID NO:43(FZD5 ECD)、SEQ ID NO:47(FZD6 ECD)、SEQ ID NO:51(FZD7 ECD)、SEQ ID NO:55(FZD8 ECD)、SEQ ID NO:59(FZD9 ECD)及SEQ ID NO:63(FZD10 ECD)。
在特定實施態樣中,該劑或抗體與其所結合之人捲曲受體內之Fri結構域(FRI)(亦稱為富含半胱胺酸結構域(CRD))專一性結合。各種人捲曲受體之Fri結構域的序列係為該領域所知,且亦於此處提供為SEQ ID NO:28(FZD1 FRI)、SEQ ID NO:32(FZD2 FRI)、SEQ ID NO:36(FZD3 FRI)、SEQ ID NO:40(FZD4 FRI)、SEQ ID NO:44(FZD5 FRI)、SEQ ID NO:48(FZD6 FRI)、SEQ ID NO:52(FZD7 FRI)、SEQ ID NO:56(FZD8 FRI)、SEQ ID NO:60(FZD9 FRI)及SEQ ID NO:64(FZD10 FRI)。
在特定實施態樣中,此處所描述之FZD結合抗體或多肽之個別抗原結合位能與1、2、3、4或5種(或超過5種)人捲曲受體結合。在特定實施態樣中,該FZD結合抗體或多肽之個別抗原結合位能與1、2、3、4或5種選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該抗體或多肽之個別結合位與至少FZD5及FZD8專一性結合。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑或抗體以約1μM或低於1μM、約100nM或低於100nM、約40nM或低於40nM、約20nM或低於20nM或約10nM或低於10nM之解離常數(KD)與一或多種(例如2種或超過2種、3種或超過3種、或4種或超過4種)人捲曲受體結合。舉例來說,在特定實施態樣中,該FZD結合劑或抗體以約40nM或低於40nM之解離常數與下列一或多種(例如1、2、3、4或5種)FZD中之每一者結合:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8。在特定實施態樣中,該FZD結合劑或抗體以約10nM或低於10nM之解離常數與下列一或多種FZD中之每一者結合:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8。在特定實施態樣中,該FZD結合劑或抗體以約10nM或低於10nM之解離常數與下列FZD中之每一者結合:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8。在特定實施態樣中,該劑或抗體與特定FZD之解離常數係利用固定在Biacore晶片上之FZD-Fc融合蛋白質所決定之解離常數,該FZD-Fc融合蛋白質包含FZD胞外結構域或Fri結構域。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑(例如抗體)與包含重鏈可變區和輕鏈可變區之抗體(例如18R5或18R8 IgG抗體)的表位相同之表位結合或與該抗體之表位重疊之表位結合,該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 10,且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14。在特定實施態樣中,該FZD結合劑或抗體與包含重鏈和輕鏈之抗體的表位相同之表位結合或與該抗體之表位重疊之表位結合,該重鏈包含SEQ ID NO: 11之序列,且該輕鏈包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15之序列。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑在競爭結合測定中同抗體競爭與人捲曲受體之專一性結合,其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 10且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14。在特定實施態樣中,該FZD結合劑同包含重鏈和輕鏈之抗體競爭與人捲曲受體之專一性結合,該重鏈包含SEQ ID NO: 11之序列且該輕鏈包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15之序列。在特定量施態樣中,同該劑競爭與人捲曲受體專一性結合之抗體係18R5 IgG抗體。在特定可選擇之實施態樣中,該抗體係18R8 IgG抗體。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑或抗體與至少部分之人捲曲受體之區結合,該區被發明人稱為生物結合位(BBS)(實施例6圖9)。在人FZD8中(SEQ ID NO:54),該BBS係由下列組成:(a)由胺基酸72(F)、74-75(PL)、78(I)、92(Y)、121-122(LM)及129-132(WPDR)(SEQ ID NO:70)所形成之構型表位(圖8及9所示之BBS之「裂縫」);(b)由序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)所組成之FZD8之區(圖8及9所示之BBS之「頂部邊緣」);及(c)由序列YGFA(SEQ ID NO:74)所組成之FZD8之區(圖8及9所示之BBS之「底部邊緣」)。FZD1至7、FZD9及FZD10上之BBS的對應殘基係列於下表1及圖8。在特定實施態樣中,阻斷配位體(例如Wnt)與FZD結合之劑抑制該配位體與BBS之結合。應了解在特定實施態樣中,與至少部分之BBS結合之劑類亦可與該人捲曲受體上他處(例如該BBS以外)之一或多區結合。換句話說,在特定實施態樣中,FZD結合劑或抗體所結合之表位係在該FZD受體之胞外結構域內之區,該區與BBS重疊但不完全包含在該BBS之內。在特定可選擇之實施態樣中,FZD結合劑或抗體所結合之表位係完全包含在該BBS之內(也就是該BBS包含FZD結合抗體或其他劑所結合之整個表位)。
在不受理論之限制下,BBS被認為包含可能的配位體結合位,諸如Wnt之結合位。在FZD8上,此可能的配位體結合位包含由胺基酸72(F)、74-75(PL)、78(I)、92(Y)、121-122(LM)及129-132(WPDR)(SEQ ID NO:70)所形成之構型表位(圖8及9所示之BBS之「裂縫」)。在FZD1至7、FZD9及FZD10上可能的配位體結合位之對應殘基係如圖8中之序列比對所示。在特定實施態樣中,阻斷配位體(例如Wnt)與BBS結合之劑抑制該配位體與此構型表位之結合。應了解在特定實施態樣中,與至少部分之此配位體結合位結合之劑類亦可與該人捲曲受體上他處(例如該BBS以外)之區結合。在特定可選擇之實施態樣中,該劑不與該構型表位以外之FZD之任何部分結合。
在特定實施態樣中,若該人捲曲受體係FZD8,該劑與至少部分之該人捲曲受體內之序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO:67)結合,或若該人捲曲受體係FZD1至7、FZD9或FZD10之該對應序列。FZD上之此區包含如圖8及9所示之BBS之「頂部邊緣」。各捲曲受體中對應FZD8之表位QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO:67)之序列係如表2所示,亦可從圖8之比對顯而易見。在特定實施態樣中,該劑與選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之人捲曲受體專一性結合,且該劑與至少部分之人捲曲受體內之序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO:24)結合。在特定實施態樣中,該劑與至少部分之人捲曲受體FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8內之序列AGLEVHQF(SEQ ID NO:68)專一性結合。在特定實施態樣中,該劑與至少部分之FZD3、FZD4、FZD6、FZD9及/或FZD10中之序列結合,該序列對應FZD8中之序列AGLEVHQF(SEQ ID NO:68)。在特定實施態樣中,該劑與至少部分之人捲曲受體FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8內之序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)專一性結合。此序列係圖9所示之BBS之「頂部邊緣」。在特定實施態樣中,該劑與至少部分之FZD3、FZD4、FZD6、FZD9及/或FZD10中之序列結合,該序列對應FZD8中之序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)。對應FZD8之序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)的序列係於下表2第二及三欄中以劃底線表示,且可從圖8之序列比對中顯而易見。在特定實施態樣中,與至少部分之FZD8中之SEQ ID NO:67或68或另一FZD中之對應表位結合之劑抑制配位體(例如Wnt)與該FZD(例如FZD之BBS)之結合。在特定實施態樣中,與上述區域結合之劑亦可與人捲曲受體上他處(意即上述區域以外)之額外之區結合。
在特定實施態樣中,若該人捲曲受體係FZD8,該FZD結合劑與至少部分之由序列QYGFA(SEQ ID NO:66)所組成之區結合,該區包含該BBS之「底部邊緣」,或若該人捲曲受體係FZD1至7、FZD9或FZD10之該對應序列。各捲曲受體中對應該區QYGFA(SEQ ID NO:66)之序列係如圖8及上表2所示。在特定實施態樣中,若該人捲曲受體係FZD8,該FZD結合劑與至少部分之由序列YGFA(SEQ ID NO:74)所組成之區意即該BBS之「底部邊緣」結合,或若該人捲曲受體係FZD1至7、FZD9或FZD10之該對應序列。各捲曲受體中對應該區YGFA(SEQ ID NO:74)之序列係如圖8所示,且在上表2第4欄中以劃底線表示。在特定實施態樣中,與至少部分之FZD8中之SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:74或另一FZD中彼之對應序列結合之劑抑制配位體(例如Wnt)與該FZD(例如FZD之BBS)之結合。在特定實施態樣中,與此區結合之劑亦可與人捲曲受體上他處(意即此區以外)之一或多個胺基酸殘基結合。
在特定實施態樣中,FZD結合劑與至少部分之形成該BBS之「頂端邊緣」之區以及至少部分之形成該BBS之「底端邊緣」之區結合。在特定實施態樣中,與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8內至少部分之Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO:24)、FZD8內之QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO:67)、FZD8內之AGLEVHQF(SEQ ID NO:68),及/或FZD8內之GLEVHQ(SEQ ID NO:25),及/或對應不同的人捲曲受體中任何該些序列之序列(如上表2所定義)結合之FZD結合劑,另與FZD8內至少部分之QYGFA(SEQ ID NO:66)或FZD8內之YGFA(SEQ ID NO:74),及/或對應FZD1-7、FZD9或FZD10內該些序列之一之序列(如上表2所定義)結合。在特定實施態樣中,該FZD結合劑與FZD8內至少部分之序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)以及FZD8內至少部分之序列YGFA(SEQ ID NO:74)結合。在特定實施態樣中,該FZD結合劑與至少部分之FZD1-7、FZD9或FZD10對應FZD8之序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)之區,以及至少部分之FZD1-7、FZD9或FZD10對應FZD8之序列YGFA(SEQ ID NO:74)之區結合。在特定實施態樣中,與所示序列結合之FZD結合劑亦與其所結合之人捲曲受體內他處之一或多種序列結合。換句話說,在特定實施態樣中,該FZD結合劑或抗體所結合之表位係該FZD胞外結構域內之區,該區僅部分與上示序列重疊。在特定可選擇之實施態樣中,該FZD結合劑所結合之整個表位係完全包含在該上示序列之內。
在特定實施態樣中,該劑係多肽。在特定實施態樣中,該劑或多肽係抗體。在特定實施態樣中,該抗體係IgG1抗體或IgG2抗體。在特定實施態樣中,該抗體係單株抗體。在特定實施態樣中,該抗體係人抗體或人化抗體。在特定實施態樣中,該抗體係抗體片段。
本發明之抗體或其他劑類之專一性結合可藉由該領域所知之任何方法檢測。可被使用之免疫測定法包括但不限於使用下列技術之競爭及非競爭性檢測系統,諸如BIAcore分析、FACS分析、免疫螢光法、免疫細胞化學法、西方墨漬法、放射性免疫測定法、ELISA、「三明治」免疫測定法、免疫沉降測定法、沉降反應、膠體擴散沉澱反應、免疫擴散測定法、凝集試驗、補體結合試驗、免疫放射量測定法、螢光免疫測定法及蛋白A免疫測定法。該等測定法係例行性且為該領域所廣為週知(參見例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol. 1,John Wiley & Sons,Inc.,New York,該文以參照方式整體納入此處)。
舉例來說,抗體與人捲曲受體之專一性結合可利用ELISA決定。ELISA測定法包含製備抗原、以抗原覆蓋96孔微量滴定盤之孔槽、將與可偵測之化合物諸如酵素受質(例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)共軛之FZD結合抗體或其他FZD結合劑加入孔槽中、培養一段時間及偵測該抗原之存在。在一些實施態樣中,該FZD結合抗體或劑不與可偵測之化合物共軛,取而代之的是將辨識該FZD結合抗體或劑之第二共軛抗體加入孔槽中。在一些實施態樣中不以抗原覆蓋孔槽,反而是令該FZD結合抗體或劑覆蓋孔槽,且在將抗原加入該覆蓋孔槽後,可加入與可偵測化合物共軛之第二抗體。該領域之技藝人士將知道可被調整以增強該偵測信號之參數以及其他該領域所知之ELISA之變異(參見例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol. 1,John Wiley & Sons,Inc.,New York之11.2.1)。
抗體或其他劑與人捲曲受體之結合親和性及抗體一抗原交互作用之解離速率可藉由競爭性結合測定法決定。競爭性結合測定法之一個實例係放射性免疫測定法,該法包含在增加量之未經標示之抗原存在時,培養經標示之抗原(例如3H或125I)或彼之片段或變異體與感興趣之抗體,之後偵測與該經標示之抗原結合之抗體。該抗體對捲曲受體之親和性及結合解離速率可從斯可恰圖(scatchard plot)分析之資料決定。在一些實施態樣中,BIAcore動力學分析被用於決定與一或多種人捲曲受體結合之抗體或劑之結合及解離速率。BIAcore動力學分析包含分析抗體自晶片與其表面經固定之FZD抗原之結合及解離。
在特定實施態樣中,該劑(例如抗體)係由該劑所結合之至少一種人捲曲受體(意即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種FZD)之拮抗劑。在特定實施態樣中,該劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%之該經結合之人捲曲受體之一或多種活性。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑抑制配位體與至少一種人捲曲受體之結合。在特定實施態樣中,該FZD結合劑抑制配位體與人捲曲受體之生物結合位(BBS)結合。在特定實施態樣中,該配位體係人Wnt蛋白。已被發現之19種人Wnt蛋白為WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A(先前為WNT14)、WNT9B(先前為WNT15)、WNT10A、WNT10B、WNT11及WNT16。在特定實施態樣中,該劑抑制WNT3A與FZD8之結合。在特定實施態樣中,由該FZD結合劑所提供之抑制特定配位體與特定人捲曲蛋白之結合係至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%。在特定實施態樣中,抑制配位體諸如Wnt與FZD結合之劑進一步抑制Wnt傳訊(例如抑制典型Wnt傳訊)。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑抑制Wnt傳訊。應了解抑制Wnt傳訊之FZD結合劑可能在特定實施態樣中抑制一或多種Wnt但不一定所有Wnt之傳訊。在特定可選擇之實施態樣中,所有人Wnt傳訊可能被抑制。在特定實施態樣中,選自WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A(先前為WNT14)、WNT9B(先前為WNT15)、WNT10A、WNT10B、WNT11或WNT16之一或多種Wnt之傳訊係經抑制。在特定實施態樣中,該經抑制之Wnt傳訊係由WNT1、WNT2、WNT3、WNT3A、WNT7a、WNT7b及/或WNT10B傳訊。在特定實施態樣中,該劑抑制(至少)WNT1、WNT3A、WNT7b及WNT10B之傳訊。在特定實施態樣中,該劑抑制(至少)WNT3A之傳訊。在特定實施態樣中,由FZD結合劑所提供之抑制Wnt傳訊係降低至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%之由Wnt所傳訊之量。在特定實施態樣中,該被抑制之Wnt傳訊係典型Wnt傳訊。
用於決定FZD結合劑(或候選FZD結合劑)是否抑制Wnt傳訊之活體內及活體外測定係該領域所知。舉例來說,利用TCF/Luc報告載體之以細胞為基礎之螢光素酶報告測定法可被用於測量活體外之典型Wnt傳訊量,該TCF/Luc報告載體在螢火蟲螢光素酶報告基因上游包含多套之TCF結合結構域(Gazit et al.,1999,Oncogene 18;5959-66)。在一或多種Wnt(例如由轉染細胞所表現或由Wnt條件培養基所提供之Wnt)及FZD結合劑存在時,該Wnt傳訊之量係與無FZD結合劑存在時之傳訊量比較。使用該螢光素酶報告測定以檢測典型Wnt傳訊抑制之非限制性特定實例係於下列實施例3及11中提供。除了TCF/luc報告測定之外,FZD結合劑(或候選劑)對典型Wnt傳訊之效應可於活體外或活體內藉由測量該劑對β連鎖蛋白(catenin)調節基因之表現量之效應加以測量,諸如c-myc(He et al.,Science,281:1509-12(1998))、週期素D1(Tetsu et al.,Nature,398:422-6(1999))及纖維黏連蛋白(fibronectin)(Gradl et al. Mol. Cell Biol.,19:5576-87(1999))。在特定實施態樣中,劑對Wnt傳訊之效應亦可能藉由測量該劑對散亂蛋白1(Dishevelled-1)、散亂蛋白2、散亂蛋白3、LRP5、LRP6及/或β連鎖蛋白之磷酸化狀態之效應加以檢測。在其他實施態樣中,FZD結合劑對Wnt傳訊之效應係藉由檢測FZD結合劑對Wnt簽署中之一或多個基因之表現量的影響而決定。
在特定實施態樣中,FZD結合劑具有一或多種下列效應:抑制腫瘤細胞增生、藉由降低腫瘤中癌幹細胞之頻率以減低該腫瘤之腫瘤發生性、抑制腫瘤生長、增加存活、引起腫瘤細胞之細胞死亡、使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生狀態或防止腫瘤細胞轉移。
在特定實施態樣中,與一或多種人捲曲受體專一性結合之抗體或其他劑類經由共軛毒素、化學治療劑、放射性同位素或其他該劑引起細胞死亡。舉例來說,在特定實施態樣中,人捲曲受體之抗體係與毒素共軛,該毒素在表現FZD之腫瘤細胞中藉由蛋白質內化被活化。在特定可選擇之實施態樣中,該劑或抗體不與毒素、化學治療劑或放射性同位素共軛。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑能抑制腫瘤生長。在特定實施態樣中,該FZD結合劑能抑制活體內腫瘤生長(例如在具有癌症之異種移植小鼠模型及/或人)。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑能減低腫瘤之腫瘤發生性。在特定實施態樣中,該劑或抗體能減低動物模型諸如小鼠異種模型中包含癌幹細胞之腫瘤的腫瘤發生性。在特定實施態樣中,腫瘤中癌幹細胞之數量及頻率被降低至少約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約50倍、約100倍或約1000倍。在特定實施態樣中,癌幹細胞之數量及頻率之降低係利用動物模型藉由限制稀釋測定法決定。用於測試抗FZD抗體之療效的限制稀釋測定法之實例係提供於下列實施例8。有關使用限制稀釋測定法以決定腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率之降低之額外實例及指導可見於例如國際公開號WO 2008/042236、美國專利申請公開號2008/0064049及美國專利申請號2008/0178305,各以參照方式整體納入此處。
在特定實施態樣中,抗人捲曲受體之抗體經由抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)媒介表現FZD蛋白之細胞的細胞死亡。ADCC涉及由效應細胞作用之細胞溶解,效應細胞辨識抗體之Fc部分。舉例來說,許多淋巴細胞、單核細胞、組織巨噬細胞、顆粒細胞及嗜酸性細胞具有Fc受體且可媒介細胞溶解(Dillman,1994,J. Clin. Oncol. 12:1497)。
在特定實施態樣中,抗一或多種FZD之抗體藉由活化補體依賴性細胞毒性(CDC)引起表現FZD蛋白之細胞的細胞死亡。CDC涉及血清補體與抗體之Fc部分結合且隨後活化補體蛋白級聯,導致細胞膜傷害及最後細胞死亡。抗體之生物活性在很大程度上已知可由該抗體分子之恆定結構域或Fc區決定(Uananue and Benacerraf,Textbook of Immunology,2nd
Edition,Williams & Wilkins,p.218(1984))。不同類型及亞型之抗體就這方面有所不同,如同相同亞型但來自不同物種之抗體。在人抗體中,IgM係結合補體最有效之抗體類型,隨後為IgG1、IgG3及IgG2,然而IgG4似乎相當不足以活化該補體級聯(Dillman,1994,J. Clin. Oncol. 12:1497;Jefferis et al.,1998,Immunol. Rev. 163:59-76)。根據本發明,製備具有所欲生物活性之該些類型之抗體。
拮抗一或多種FZD之任何特定抗體藉由補體活化及/或ADCC以媒介目標細胞溶解之能力可被檢測。使感興趣之細胞於活體外生長及標示;將該抗體與血清補體或免疫細胞組合添加於細胞培養液,該血清補體或免疫細胞可藉由抗原抗體複合物被活化。目標細胞之細胞溶解係藉由例如自該溶解細胞釋放標記而被檢測。事實上,可利用病患本身之血清作為補體及/或免疫細胞之來源以篩選抗體。能在活體外試驗活化補體或媒介ADCC之抗體接著可被治療性地用於該特定病患。
本發明提供多肽,其包括但不限於與一或多種人捲曲受體專一性結合之抗體,該抗體包含18R5及/或18R8之1、2、3、4、5及/或6個CDR(見下列實施例1之表4),每個CDR含有最多4個(意即0、1、2、3或4個)保守性胺基酸取代。因此,本發明提供多肽,其包括但不限於與一或多種人捲曲受體專一性結合之抗體,該抗體包含18R5及/或18R8之1、2、3、4、5及/或6個CDR。在特定實施態樣中,該多肽包含18R8之重鏈CDR3及/或18R5或18R8之輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該重鏈CDR被包含在重鏈可變區內及/或該輕鏈CDR被包含在輕鏈可變區內。
舉例來說,本發明提供與人捲曲受體專一性結合之多肽(例如抗體),其中該多肽包含重鏈可變區,該重鏈可變區包含:(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)之重鏈CDR1或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)之重鏈CDR2或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;及/或(c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)之重鏈CDR3或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體。在特定實施態樣中,該多肽另包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(a)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7之變異體的輕鏈CDR1;(b)包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8之變異體的輕鏈CDR2;及/或(c)包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9之變異體的輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該胺基酸取代係保守性胺基酸取代。
因此,本發明提供包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及/或重鏈CDR3之多肽或抗體,該重鏈CDR1包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1),該重鏈CDR2包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2),該重鏈CDR3包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)。在特定實施態樣中,該輕鏈CDR被包含於抗體重鏈之可變區內。在特定實施態樣中,該多肽或抗體包含與一或多種人捲曲受體專一性結合之一或多個重鏈CDR。在特定實施態樣中,該CDR已經1、2、3或4個保守性胺基酸取代之修飾。在特定實施態樣中,該重鏈CDR之每一者已經不超過1至2個保守性胺基酸取代之修飾。
本發明亦提供與人捲曲受體專一性結合之抗體,其中該抗體包含重鏈可變區,該重鏈可變區包含:(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)之重鏈CDR1或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)之重鏈CDR2或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體;及(c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)之重鏈CDR3或彼之含有1、2、3或4個胺基酸取代的變異體。在特定實施態樣中,該多肽另包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(a)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7之變異體的輕鏈CDR1;(b)包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8之變異體的輕鏈CDR2;及(c)包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9之變異體的輕鏈CDR3。在一些可選擇之實施態樣中,該抗體反而另包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(a)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)之輕鏈CDR1;(b)包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)之輕鏈CDR2;及(c)包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)之輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該抗體與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8專一性結合。在特定實施態樣中,該抗體與2種或超過2種人捲曲受體包括FZD5及FZD8專一性結合。在特定實施態樣中,該胺基酸取代係保守性胺基酸取代。
本發明另提供與人捲曲受體專一性結合之多肽(例如抗體),其中該多肽包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含:(a)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7之變異體的輕鏈CDR1;(b)包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8之變異體的輕鏈CDR2;及/或(c)包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)或含有1、2、3或4個胺基酸取代之SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9之變異體的輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該胺基酸取代係保守性胺基酸取代。
本發明亦提供包含下列之多肽或抗體:(a)包含序列SGD(K/N)(L/I)G(K/S)(K/F)Y(A/V)(S/H)(SEQ ID NO:71)或含有最高4個(意即0、1、2、3或4個)保守性胺基酸取代之SEQ ID NO:71之序列的輕鏈CDR1,(b)包含序列(E/D)K(D/S)NRPSG(SEQ ID NO:72)或含有最高4個保守性胺基酸取代之SEQ ID NO:72之序列的輕鏈CDR2,及/或(c)包含序列(S/Q)S(F/Y)A(G/N)(N/T)(no aa/L)SL(E/no aa)(其中「no aa/L」表示L或無胺基酸,「E/no aa」表示E或無胺基酸;SEQ ID NO:73)或含有最高4個保守性胺基酸取代之SEQ ID NO:73之序列的輕鏈CDR3。
本發明亦提供包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及/或輕鏈CDR3之多肽或抗體,該輕鏈CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7),該輕鏈CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8),該輕鏈CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)。在特定實施態樣中,該多肽或抗體包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3,該輕鏈CDR1包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7),該輕鏈CDR2包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:8),該輕鏈CDR3包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)。在特定可選擇之實施態樣中,該多肽或抗體包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3,該輕鏈CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4),該輕鏈CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5),該輕鏈CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)。在特定實施態樣中,該輕鏈CDR被包含於抗體輕鏈之可變區內。在特定實施態樣中,該多肽或抗體與一或多種人捲曲受體專一性結合。在特定實施態樣中,該多肽或抗體包含該一或多個與一或多種人捲曲受體專一性結合之輕鏈CDR。在特定實施態樣中,該CDR已經1、2、3或4個保守性修飾之修飾。在特定實施態樣中,該輕鏈CDR之每一者已經不超過1至2個保守性胺基酸取代之修飾。
在特定實施態樣中,該抗體包含(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)之重鏈CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)之重鏈CDR2及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)之重鏈CDR3;及/或(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)之輕鏈CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)之輕鏈CDR2及包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)之輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該抗體包含(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)之重鏈CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)之重鏈CDR2及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)之重鏈CDR3;及(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4)之輕鏈CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5)之輕鏈CDR2及包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)之輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該抗體包含(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)之重鏈CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)之重鏈CDR2及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)之重鏈CDR3及(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7)之輕鏈CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:8)之輕鏈CDR2及包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)之輕鏈CDR3。在特定實施態樣中,該CDR已經1、2、3或4個保守性胺基酸取代之修飾。在特定實施態樣中,該CDR之每一者已經不超過1至2個保守性胺基酸取代之修飾。
本發明亦提供包含此處所描述之個別輕鏈或重鏈之一者之多肽以及包含輕鏈和重鏈二者之多肽(例如抗體)。
本發明亦提供包含下列之多肽:(a)具有與SEQ ID NO:10至少約80%之序列同一性的多肽;及/或(b)具有與SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14至少約80%之序列同一性的多肽。在特定實施態樣中,該多肽包含具有與SEQ ID NO:10、12或14至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列同一性的多肽。在特定實施態樣中,該多肽包含(a)具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的多肽;及/或(b)具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14之胺基酸序列的多肽。在特定實施態樣中,該多肽包含(a)具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的多肽;及/或(b)具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15之胺基酸序列的多肽。在特定實施態樣中,該多肽係抗體及/或該多肽與一或多種人捲曲受體(例如FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8)專一性結合。舉例來說,本發明提供與人捲曲受體專一性結合之抗體,該抗體包含(a)具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的多肽;及(b)具有SEQ ID NO:14之胺基酸序列的多肽。在特定實施態樣中,該包含SEQ ID NO:10之多肽係重鏈可變區。在特定實施態樣中,該包含SEQ ID NO:12或14之多肽係輕鏈可變區。在特定實施態樣中,具有與SEQ ID NO:10、12或14特定百分比之序列同一性的多肽與SEQ ID NO:10、12或14之間僅有保守性胺基酸取代之差異。
在特定實施態樣中,該多肽或抗體包含:(a) SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:12;(b) SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:14;(c) SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13;或(d) SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:15。
本發明另提供與FZD5及/或FZD8專一性結合之抗體或其他多肽,其包含:(a)具有與SEQ ID NO:85至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之同一性的多肽;及/或(b)具有與SEQ ID NO:86至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之同一性的多肽。在特定可選擇的實施態樣中,該多肽或抗體包含SEQ ID NO:85及/或SEQ ID NO:86。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑包含選自18R8、18R5、18R4605、18R4805或44R24之抗FZD抗體、該FZD結合劑實質上由選自18R8、18R5、18R4605、18R4805或44R24之抗FZD抗體所組成或該FZD結合劑由選自18R8、18R5、18R4605、18R4805或44R24之抗FZD抗體所組成。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑包含18R8 IgG2抗體之重鏈和輕鏈(包含或不含前導序列)。在特定實施態樣中,該FZD結合劑係18R8 IgG2抗體。編碼該18R8 IgG2抗體之重鏈和輕鏈的DNA根據布達佩斯條約之條件於2008年9月29日被寄存於美國菌種保存中心(ATCC)(美國維吉尼亞州馬納沙斯市大學大道10801號),並分配到ATCC寄存登錄號PTA-9540。在特定實施態樣中,該FZD結合劑包含18R5 IgG2抗體之重鏈和輕鏈(包含或不含前導序列)。在特定實施態樣中,該FZD結合劑係18R5 IgG2抗體。編碼該18R5 IgG2抗體之重鏈和輕鏈的DNA根據布達佩斯條約之限制於2008年9月29日被寄存於美國菌種保存中心(ATCC),並分配到ATCC寄存登錄號PTA-9541。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑係由2009年8月26日寄存於ATCC並獲得寄存登錄號PTA-10307、PTA-10309或PTA-10311之質體所編碼之抗體。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑於小鼠、石蟹獼猴或人中具有至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週或至少約2週之循環半衰期。在特定實施態樣中,該FZD結合劑係IgG(例如IgG1或IgG2)抗體,其於小鼠、石蟹獼猴或人中具有至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週或至少約2週之循環半衰期。增加劑諸如多肽及抗體之半衰期之方法係該領域所知。舉例來說,已知之增加IgG抗體之循環半衰期之方法包括在Fc區導入突變,該導入之突變增加該抗體與新生兒Fc受體(FcRn)於pH 6.0之pH依賴性結合(參見例如美國專利公開號2005/0276799、2007/0148164及2007/0122403)。增加缺乏該Fc區之抗體片段之循環半衰期的已知方法包括諸如PEG化之技術。
多株抗體可藉由任何已知之方法製備。多株抗體係藉由以相關抗原(經純化之肽片段、全長重組蛋白、融合蛋白等)經多次皮下或腹腔內注射以免疫接種動物(例如兔、大鼠、小鼠、驢等)所產生,該相關抗原係可選擇地與鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)、血清白蛋白等共軛、被稀釋於無菌鹽水及與佐劑組合(例如完全或不完全弗氏佐劑)以形成安定之乳化液。接著自以此方式免疫接種之動物的血液、腹水及該類似物收集該多株抗體。使收集之血液凝集,倒出血清,經離心以澄清化並檢測抗體力價。該多株抗體可根據該領域之標準方法自血清或腹水純化,包括親和層析法、離子交換層析法、膠體電泳法、透析等。
單株抗體可利用雜交瘤方法製備,諸如該些由Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495所描述之方法。利用雜交瘤方法,小鼠、倉鼠或其他適當之宿主動物如上述經免疫接種,以誘發淋巴細胞產製將與免疫接種抗原專一性結合之抗體。淋巴細胞亦可於活體外被免疫接種。在免疫接種之後,該淋巴細胞係經分離並利用例如聚乙二醇與適當之骨髓瘤細胞系融合以形成雜交瘤細胞,該雜交瘤細胞接著可自未經融合之淋巴細胞與骨髓瘤細胞中被選取。產製專一性拮抗選定抗原之單株抗體的雜交瘤接著可利用標準方法於活體外培養基(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986),或於活體內以動物腹水腫瘤之方式加以繁殖,該選定抗原係藉由免疫沉降法、免疫印漬法決定、或藉由活體外結合測定法(例如放射性免疫測定法(RIA)、酵素連結免疫吸附測定法(ELISA))決定。該單株抗體接著可自該培養基或腹水液體中如上述多株抗體之方法純化。
可選擇的是,單株抗體亦可利用美國專利4,816,567所述之重組DNA方法製備。該編碼單株抗體之多核苷酸係自成熟B細胞或雜交瘤細胞中分離,諸如藉由利用專一性放大編碼該抗體之重鏈和輕鏈之基因的寡核苷酸引子進行RT-PCR,且彼等之序列係利用習知方法決定。該經分離之編碼該重鏈和輕鏈之多核苷酸接著被選殖至適當之表現載體中,當該表現載體被轉染至本來不產製免疫球蛋白之宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中時,單株抗體藉由該宿主細胞被產製。同樣的,該所欲物種之重組單株抗體或彼之片段可如文獻所述(McCafferty et al.,1990,Nature,348:552-554;Clackson et al.,1991,Nature,352:624-628及Marks et al.,1991,J. Mol. Biol.,222:581-597)自表現該所欲物種之CDR的噬菌體展示庫中被分離。
編碼單株抗體之多核苷酸可進一步利用重組DNA技術以多種不同方式修飾以產製可選擇之抗體。在一些實施態樣中,舉例來說小鼠單株抗體之輕鏈和重鏈的恆定結構域可1)以例如人抗體之該些區域取代以產製嵌合抗體,或2)以非免疫球蛋白多肽取代以產製融合抗體。在一些實施態樣中,該恆定區被截短或移除以產製該所欲之單株抗體之抗體片段。可變區之定點或高密度突變形成可被用於最佳化單株抗體之專一性、親和性等。
在一些實施態樣中,抗人捲曲受體之單株抗體係人化抗體。在特定實施態樣中,該等抗體被治療性地用於減低抗原性及當對人個體投予時之HAMA(人抗鼠抗體)反應。人化抗體可利用該領域已知之多種技術產製。在特定可選擇之實施態樣中,抗人捲曲受體之抗體係人抗體。
人抗體可利用該領域已知之多種技術直接製備。可產製於活體外免疫接種或自免疫接種個體分離之永生化人B淋巴細胞,該淋巴細胞產製拮抗標靶抗原之抗體(參見例如Co1e et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss,p. 77(1985);Boemer et al.,1991,J. Immunol.,147(1):86-95及美國專利號5,750,373。同樣的,該人抗體可選自噬菌體文庫,其中該噬菌體文庫表現人抗體(例如如Vaughan et al.,1996,Nat. Biotech.,14:309-314;Sheets et al.,1998,Proc. Nat’1. Acad. Sci.,95:6157-6162;Hoogenboom and Winter,1991,J. Mol. Biol.,227:381及Marks et al.,1991,J. Mol. Biol.,222:581中所述)。產製技術及抗體噬菌體文庫之用途亦描述於美國專利號5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484及7,264,963及Rothe et al.,2007,J. Mol. Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(各以參照方式整體納入此處)。親和性成熟策略諸如鏈洗牌(chain shuffling)(Marks et al.,1992,Bio/Technology 10:779-783,以參照方式整體納入)係該領域所知且可被採用以產製高親和性人抗體。
人化抗體亦可於包含人免疫球蛋白基因座之基因轉殖小鼠中製備,在經免疫接種時該免疫球蛋白基因座能產製完全之人抗體庫,但不產製內源性免疫球蛋白。此方法係描述於美國專利號5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016中。
本發明亦包含專一性辨識人捲曲受體之雙特異性抗體。雙特異性抗體係能專一性辨識且結合至少兩種不同表位之抗體。該不同之表位可位於相同分子(例如相同之人捲曲受體)或在不同分子上,以使例如兩個抗體可專一性辨識且結合人捲曲受體以及例如1)在白血球上之效應分子諸如T細胞受體(例如CD3)或Fc受體(例如CD64、CD32或CD16)或2)如下詳細描述之細胞毒性劑。在特定實施態樣中,該雙特異性抗體與至少一種人捲曲受體以及VEGF、刻痕配位體諸如δ樣配位體(例如DLL4)或缺口(jagged)、或至少一種選自Notch 1、Notch 2、Notch 3或Notch 4之刻痕受體專一性結合。雙特異性抗體可為完整抗體或抗體片段。
示範性雙特異性抗體可與二種不同的表位結合,其中至少一種源自本發明之多肽。可選擇的是,免疫球蛋白分子之抗抗原臂可與一臂組合,該臂與白血球上之誘發分子諸如T細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或IgG之Fc受體結合,以使細胞防禦機制專注於表現該特定抗原之細胞。雙特異性抗體亦可被用於使細胞毒性劑以表現特定抗原之細胞為標靶。該些抗體具有抗原結合臂及一與細胞毒性劑或放射性核素螯合劑諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA結合之臂。製備雙特異性抗體之技術係該領域所常見(Millstein et al.,1983,Nature 305:537-539;Brennan et al.,1985,Science 229:81;Suresh et al,1986,Methods in Enzymol. 121:120;Traunecker et al.,1991,EMBO J. 10:3655-3659;Shalaby et al.,1992,J. Exp. Med. 175:217-225;Kostelny et al.,1992,J. Immunol. 148:1547-1553;Gruber et al.,1994,J. Immunol. 152:5368及美國專利5,731,168)。具有超過2種效價之抗體亦被考慮。舉例來說,可製備三特異性抗體(Tutt et al.,J. Immunol. 147:60(1991))。因此,在特定實施態樣中抗人捲曲受體之抗體係多特異性。
可選擇的是,在特定可選擇之實施態樣中,本發明之FZD結合劑不是雙特異性抗體。
在特定實施態樣中,此處所描述之抗體(或其他多肽)可為單特異性。舉例來說,在特定實施態樣中,抗體所包含之一或多個抗原結合位之每一者能與相同之一或多個人FZD受體結合(例如FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8或FZD若干組合之同源表位)。在特定實施態樣中,此處所描述之單特異性抗體之抗原結合位能與1、2、3、4或5種(或超過5種)人捲曲受體結合。
在特定實施態樣中提供例如增加腫瘤穿透之抗體片段。已知多種技術可用於產製抗體片段。傳統上,該些片段係來自完整抗體之蛋白溶解消化(例如Morimoto et al.,1993,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117;Brennan et al.,1985,Science,229:81)。在特定實施態樣中,抗體片段係經重組產製。Fab、Fv及scFv抗體片段所有均可在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現及分泌,因此允許大量產製該些片段。該等抗體片段亦可自以上討論之抗體噬菌體文庫分離。該抗體片段亦可為例如美國專利5,641,870中所描述之線性抗體,且可為單特異性或雙特異性。其它用於產製抗體片段之技術係為技藝人士所顯而易見。
根據本發明,技術可經調整以供產製對一或多種人捲曲受體具專一性之單鏈抗體(見美國專利號4,946,778)。此外,方法可經調整以供建構Fab表現文庫(Huse,et al.,Science 246:1275-1281(1989))以允許快速及有效地辨識對FZD受體具有所欲專一性之單株Fab片段或彼之衍生物、片段、類似物或同源物。抗體片段可藉由該領域之技術產製,其包括但不限於:(a)以胃蛋白酶消化抗體分子所產製之F(ab’)2
片段、(b)藉由減少F(ab’)2
片段之雙硫鍵所產製之Fab片段、(c)藉由以木瓜酶及還原劑處理抗體分子所產製之Fab片段及(d)Fv片段。
特別在抗體片段之例中,另外所欲的是修飾抗體以增加其血清半衰期。這可藉由例如將救援受體結合表位納入抗體片段、藉由使抗體片段中之適當區域突變,或藉由將表位納入肽標籤接著使該肽標籤與抗體片段之任一端或中間部分融合(例如藉由DNA或肽合成)以達成。
異源共軛抗體亦屬於本發明之範圍內。異源共軛抗體係由兩個共價連結之抗體組成。該等抗體已被提議用於例如使免疫細胞以非所欲細胞為標靶(美國專利號4,676,980)。考慮到該抗體可利用合成性蛋白化學之已知方法於活體外製備,包括該些涉及交聯劑之方法。舉例來說,免疫毒素可利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵以建構。供此目的使用之適當試劑實例包括亞胺基硫醇鹽(iminothiolate)及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
就本發明之目的而言,應了解經修飾之抗體可包含任何類型之可變區,該可變區提供該抗體與人捲曲受體之多肽之連接。就這方面而言,該可變區可包含或源自任何種類之哺乳動物,該哺乳動物可被誘導以啟動體液反應及產生拮抗該所欲之腫瘤相關抗原之免疫球蛋白。因此,該經修飾之抗體之可變區可為例如人、鼠、非人靈長動物(例如石蟹獼猴、恆河猴等)或狼來源。在一些實施態樣中,經修飾之免疫球蛋白之可變區和恆定區二者皆為人的。在其他實施態樣中,相容抗體(通常源自非人來源)之可變區可經基因工程改造或專一性修改以增進該分子之結合特性或降低該分子之致免疫性。就此方面而言,可用於本發明之可變區可為人化或以其他方式經包含輸入性胺基酸序列之改變。
在特定實施態樣中,重鏈及輕鏈中之可變結構域藉由至少部分取代一或多個CDR而被改變,如果需要的話藉由部分骨架區取代及序列改變而改變。雖然CDR可能源自與該骨架區所源自之抗體相同類型或甚至亞型之抗體,可想見的是該CDR將源自不同類型之抗體且較佳為源自不同物種之抗體。可能不需要用來自捐贈者可變區之完整CDR取代所有CDR以將一可變結構域之抗原結合能力轉移給另一者。相反的,可能只需要轉移該些維持抗原結合位之活性所必需之殘基。基於美國專利號5,585,089、5,693,761及5,693,762中之解釋,不論藉由實施例行實驗或藉由嘗試錯誤測試,要獲得具有減低致免疫性之功能性抗體係屬該領域之技藝人士之能力範圍內。
儘管可變區有所改變,該領域之技藝人士將了解本發明經修飾之抗體將包含其中至少部分之一或多個恆定區結構域已被刪除或以其他方式改變之抗體(例如全長抗體或彼之免疫活性片段),當與具有大約相同致免疫性之包含天然或未經改變之恆定區之抗體比較時,本發明經修飾之抗體可提供所欲之生化特性,諸如提升腫瘤定位或降低血清半衰期。在一些實施態樣中,該經修飾之抗體的恆定區將包含人恆定區。相容於本發明之對恒定區之修飾包含加入、刪除或取代一或多個結構域中之一或多個胺基酸。也就是說,此處所揭示之經修飾之抗體可能包含對三個重鏈恆定區(CH1、CH2或CH3)之一或多者及/或對該輕鏈恆定區(CL)之改變或修飾。在一些實施態樣中,其中一或多個結構域被部分或完全刪除之經修飾之恆定區被考慮。在一些實施態樣中,該經修飾之抗體將包含結構域刪除建構體或變異體,其中該整個CH2結構域已被移除(ΔCH2建構體)。在一些實施態樣中,被刪除之恆定區結構域將由短胺基酸間隔物(例如10個殘基)所取代,以提供一些通常由該不存在之恆定區所給予之分子可塑性。
除了彼等之構型以外,在該領域中已知的是該恆定區媒介數種效應功能。舉例來說,補體之C1成份與抗體結合活化該補體系統。補體活化在細胞病原體之調理及溶解上係重要的。補體活化亦刺激發炎反應且亦可涉及自體免疫過敏反應。另外,抗體經由Fc區與細胞結合,以抗體Fc區上之Fc受體部位與細胞上之Fc受體(FcR)結合。有一些Fc受體對不同類型之抗體具專一性,包括IgG(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(a受體)及IgM(μ受體)。抗體與細胞表面上之Fc受體結合引起一些重要且廣泛之生物反應,包括吞食及破壞抗體包裹顆粒、清除免疫複合體、藉由殺手細胞溶解抗體包裹目標細胞(稱為抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性或ADCC)、釋放發炎媒介物、胎盤轉移及控制免疫球蛋白之生產。
在特定實施態樣中,該FZD結合抗體提供改變之效應功能,該效應功能因而影響該投予抗體之生物特徵。舉例來說,刪除或不活化(透過點突變或其他方式)恆定區結構域可能減少Fc受體與循環經修飾之抗體之結合因此增加腫瘤定位。在其他例中,可能與本發明一致之恆定區修飾緩和補體之結合,因此縮短血清半衰期及共軛細胞毒素之非專一性結合。然而該恆定區之其它修飾可被用於消除雙硫鍵或寡糖基團以允許定位因為增加抗原專一性或抗體可塑性。同樣的,本發明中恆定區之修飾可輕易地利用該領域之技藝人士眾所週知之生化或分子工程技術製備。
在特定實施態樣中,係為抗體之FZD結合劑不具有一或多種效應功能。舉例來說,在一些實施態樣中,該抗體不具抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)活性及/或不具補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在特定實施態樣中,該抗體不與Fc受體及/或補體因子結合。在特定實施態樣中,該抗體不具效應功能。
應注意在特定實施態樣中,該經修飾之抗體可能經基因工程改造以將該CH3結構域直接融合至個別修飾抗體之鉸鏈區。在其他建構體中,可能想要在該鉸鏈區與該經修飾之CH2及/或CH3結構域之間提供肽間隔物。舉例來說,相容建構物可被表現,其中該CH2結構域已被刪除且該剩餘之CH3結構域(經修飾或未經修飾)係以5至20個胺基酸間隔物與該鉸鏈區連接。舉例來說,該間隔物可能被添加以確保該恆定結構域之調節元件維持自由及可接近或該鉸鏈區維持可塑的。然而,應注意的是胺基酸間隔物在若干案例中可被證實為具致免疫性且誘發對該建構物之非所欲之免疫反應。因此,在特定實施態樣中,任何加至該建構物中之間隔物將為相對非致免疫性,或甚至全部略過,以維持該經修飾抗體所欲之生化品質。
除了刪除整個恆定區結構域之外,將了解本發明之抗體可能以部分刪除或取代少數或甚至單一個胺基酸之形式提供。舉例來說,在CH2結構域之選定區域中之單一胺基酸之突變可能足以實質上減低Fc結合且藉此增加腫瘤定位。同樣的,簡單地刪除一或多個恆定區結構域之部分可能係為所欲,該恆定區結構域之部分控制所欲調節之效應功能(例如補體CLQ結合)。該恆定區之部分刪除可能改善該抗體之選定特徵(血清半衰期)然而保留完整之與主題恆定區結構域有關之其他所欲功能。另外,如上所暗示的,該揭示抗體之恆定區可能經一或多個胺基酸之突變或取代之修飾以增進該形成建構體之特徵。在這方面有可能干擾由保守性結合位(例如Fc結合)所提供之活性然而實質上維持該經修飾之抗體的構性及致免疫性特徵。特定實施態樣可包含添加一或多個胺基酸至恆定區以改善所欲之特徵諸如降低或增加效應功能或提供更多之細胞毒素或碳水化合物連接。在該實施態樣中,導入或複製源自選定恆定區結構域之特定序列可為所欲。
本發明另包含實質上與上述之嵌合、人化及人抗體或彼等之抗體片段同源之變異體及相等物。這些可包含例如保守性取代突變,也就是以類似胺基酸取代一或多個胺基酸。舉例來說,保守性取代係指以在相同一般類型中之另一胺基酸取代,諸如舉例來說,以另一個酸性胺基酸取代一個酸性胺基酸,以另一個鹼性胺基酸取代一個鹼性胺基酸或以另一個中性胺基酸取代一個中性胺基酸。保守性胺基酸取代所意圖達成之目的係該領域所廣為週知。
本發明亦關於免疫共軛物,其包含與細胞毒性劑共軛之抗體。細胞毒性劑包括化學治療劑、生長抑制劑、毒素(例如細菌性、真菌性、植物或動物來源之酵素活性毒素或彼等之片段)、放射線活性同味素(意即放射性共軛物)等。可用於產製該免疫共軛物之化學治療劑包括例如胺甲喋呤、甲烯土黴素(adriamicin)、阿黴素(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C、氯芥苯丁酸、正定黴素(daunorubicin)或其他插入劑。可被使用之酵素活性毒素及彼之片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α次黃嘌呤、油桐蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆素、肥皂草抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素及新月毒素。多種放射性核素可被取得以產製放射性共軛抗體包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。抗體和細胞毒性劑之共軛物係利用多種雙功能性蛋白偶合劑製備,諸如N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亞胺環硫丁烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能基衍生物(諸如己二亞胺二甲酯HCL)、活性酯之雙官能基衍生物(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺)、醛之雙官能基衍生物(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)-己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。抗體與一或多種小分子毒素之共軛物亦可被使用,該一或多種小分子毒素諸如卡利奇黴素(calicheamicin)、美坦素類(maytansinoids)、新月毒素(trichothecene)及CC1065及具有毒素活性之該些毒素之衍生物。
共軛抗體係由兩個共價連結之抗體所組成。該等抗體舉例來說已被提議用於使免疫細胞以非所欲細胞為標靶(美國專利號4,676,980)。考慮到該抗體可利用合成性蛋白化學之已知方法於活體外製備,包括該些涉及交聯劑之方法。舉例來說,免疫毒素可利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵以建構。供此目的使用之適當試劑實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
不論獲得多少量之抗體,本發明之抗體可被用於數種共軛(意即免疫共軛)或非共軛形式中之任一者。可選擇的是,本發明之抗體可被用於非共軛或「裸」形式。在特定實施態樣中,該抗體可以非共軛形式使用以與該個體之天然防禦機制包括補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)聯手以消滅惡性細胞。在一些實施態樣中,該抗體可利用數種著名之螯合劑之任一者或直接標記法以與放射性同位素共軛,諸如90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re及188Re。在其他實施態樣中,該揭示之組成物可包含與藥物、前藥或生物反應調節劑諸如胺甲喋呤、阿德力黴素(adriamycin)及淋巴介質諸如干擾素偶合之抗體。本發明之其他實施態樣包含與特定生物毒素諸如蓖麻毒素或白喉毒素共軛之抗體之用途。在其他實施態樣中,該經修飾之抗體可與其他免疫活性配位體(例如抗體或彼之片段)複合,其中該形成之分子可與腫瘤細胞及效應細胞諸如T細胞二者結合。選擇使用何種共軛或非共軛之經修飾抗體將依癌症之種類及分期、輔助治療之使用(例如化學治療或體外放射線)及病患狀況而定。將了解的是,該領域之技藝人士有鑑於此處之揭示可輕易地作出選擇。
本發明之多肽可為重組多肽、天然多肽或合成多肽,其包含抗人FZD受體之抗體或彼之片段。在該領域中將了解到,本發明之一些胺基酸序列可有所差異但不對該蛋白質之結構或功能造成顯著影響。因此,本發明另包括多肽之變異體,其顯示拮抗人FZD受體蛋白之實質活性或其包括拮抗人FZD受體蛋白之抗體之區或彼之片段。該等突變包括刪除、導入、倒置、重複及型別取代。
該多肽及類似物可經進一步修飾以包含通常不是該蛋白質之部分之額外化學基團。該些衍生基團可改善該蛋白質之可溶性、生物半衰期或吸收性。該等基團亦可減低或消除該蛋白質及類似物任何所欲之副作用。該些基團之回顧可見於REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,20th
ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)。
此處所描述之該經分離之多肽可藉由該領域已知之任何適當方法產製。該些方法從直接蛋白合成法至建構編碼該經分離之多肽序列之DNA序列及在適當轉形宿主中表現該些序列不等。在一些實施態樣中,DNA序列係利用重組技術藉由分離或合成編碼感興趣之野生型蛋白質之DNA序列以建構。可隨意選擇的是,該序列可藉由定點突變形成而產生突變以提供彼之功能性類似物。參見例如Zoeller et al.,Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066(1984)及美國專利號4,588,585。
在一些實施態樣中,編碼感興趣多肽之DNA序列將利用寡核苷酸合成儀藉由化學合成建構。該等寡核苷酸可根據該所欲多肽之胺基酸序列設計並選擇該些為宿主細胞所偏好之密碼子,該感興趣之重組多肽將在該宿主細胞中被產製。標準方法可被應用以合成經分離之多核苷酸序列,該多核苷酸序列編碼感興趣之經分離多肽。舉例來說,完整的胺基酸序列可被用於建構反轉譯基因。另外,包含核苷酸序列之DNA寡聚物可被合成,該核苷酸序列編碼特定經分離之多肽。舉例來說,數個編碼該所欲多肽之部分之小型寡核苷酸可被合成然後被連接。個別之寡核苷酸通常包含5’或3’突出物以供互補裝配。
一經裝配後(藉由合成、定點突變或其他方法),該編碼特定感興趣之經分離多肽之多核苷酸序列將被插入表現載體中且與表現控制序列可操作地連接,該表現控制序列適用於在所欲宿主中表現蛋白質。適當裝配可藉由核苷酸定序、限制酶圖譜及在適當宿主中表現生物活性多肽被證實。如該領域眾所週知的是,為了在宿主中獲得轉染基因之高表現量,該基因必須與在該選定之表現宿主中具功能性之轉錄及轉譯表現控制序列可操作地連接。
在特定實施態樣中,重組表現載體係用於放大及表現拮抗人捲曲受體之DNA編碼抗體或彼之片段。重組表現載體係可複製之DNA建構體,其具有編碼抗FZD抗體之多肽鏈或彼之片段之合成性或cDNA衍生性DNA片段,該片段與源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之適當轉錄或轉譯調節元件可操作地連接。轉錄單位通常包含裝配(1)在基因表現上具有調節作用之基因元件,例如轉錄啟動子或增強子,(2)被轉錄至mRNA及轉譯至蛋白質之結構或編碼序列,及(3)適當之轉錄及轉譯起始及終止序列,如下詳細描述。該調節元件可包括控制轉錄之操縱子序列。在宿主中複製之能力可額外被納入,該能力通常由複製起點及有利於轉形體辨識之選擇基因授予。彼此功能相關之DNA區係可操作地連接。舉例來說,如果信號肽之DNA(分泌訊息前導序列)係以參與多肽分泌之前驅物表現,則該信號肽DNA係與該多肽之DNA可操作地連接;如果啟動子控制序列之轉錄,則該啟動子係與編碼序列可操作地連接;或如果核糖體結合位被放置以允許轉譯,則該核糖體結合位係與編碼序列可操作地連接。意圖用於酵母菌表現系統中之結構元件包括使宿主細胞得以進行轉譯蛋白胞外分泌之前導序列。可選擇的是,當重組蛋白質係於無前導或運送序列存在時表現,該重組蛋白可包括N端甲硫胺酸殘基。此殘基隨後可隨意選擇地自該表現之重組蛋白剪切以提供終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇將視宿主選擇而定。廣泛種類之表現宿主/載體之組合可被採用。可用於真核細胞宿主之表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及細胞巨大病毒之表現控制序列之載體。可用於細菌性宿主之表現載體包括已知之細菌性質體,諸如來自大腸桿菌之質體,包括pCR1、pBR322、pMB9及彼等之衍生物,更廣泛宿主範圍質體諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。
供表現FZD結合多肽或抗體(或用來作為抗原之FZD蛋白質)之適當宿主細胞包括在適當啟動子控制之下的原核生物、酵母菌、昆蟲或更高等之真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體,例如大腸桿菌或芽孢桿菌。更高等之真核細胞如下所述包括哺乳動物來源之已建立之細胞系。無細胞轉譯系統亦可被採用。供細菌、真菌、酵母菌及哺乳動物細胞宿主使用之適當選殖及表現載體係由Pouwels et al.(Cloning Vectors: A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)描述,其相關揭示藉此以參照方式納入。
多種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統亦可有利地採用以表現重組蛋白質。重組蛋白質可在哺乳動物細胞中表現因為該蛋白質一般經正確之摺疊、經適當之修飾及具完全之功能。適當之哺乳動物宿主細胞系之實例包括由古斯曼(Gluzman)(Cell 23:175,1981)所描述之猴腎細胞COS-7細胞系及其他能表現適當載體之細胞系包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa及BHK細胞系。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件諸如複製起點、與所欲表現基因連接之適當之啟動子及增強子及其他5’或3’側面非轉錄序列,及5’或3’非轉譯序列諸如必需核糖體結合位、聚腺苷酸化位、剪接捐贈者及接受者位及轉錄終止序列。於昆蟲細胞中供產製異源性蛋白質之桿狀病毒(baculovirus)系統由Luckow and Summers,Bio/Technology 6:47(1988)所回顧。
由轉形宿主所產製之蛋白質可根據任何適當之方法被純化。該標準方法包括層析法(例如離子交換、親和性及大小排除管柱層析法)、離心、差別性溶解度或藉由任何其他供蛋白質純化之標準技術。親和性標籤諸如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感病毒外膜序列及麩胱甘肽S轉移酶可被連接至蛋白質以允許藉由通過適當之親和性管柱所進行之簡單純化。經分離之蛋白質亦可利用諸如蛋白質溶解、核磁共振及x光結晶學之技術被物理特徵化。
舉例來說,來自分泌重組蛋白質至培養基之系統的上清液首先可利用商業可得之蛋白質濃縮過濾器濃縮,例如阿密康(Amicon)或密理博(Millipore)派利康(Pellicon)超過濾單位。在經濃縮步驟之後,該濃縮物可被施用於適當之純化基質。可選擇的是,可採用陰離子交換樹脂,例如具有二乙胺乙基(DEAE)側基之基質或底物。該基質可為丙烯醯胺、洋菜糖、聚葡萄糖、纖維素或其他經常用於蛋白質純化之類型。可選擇的是,可採用陽離子交換步驟。適當之陽離子交換劑包括多種包含磺酸丙基或羧甲基基團之不可溶基質。最後,可採用一或多個逆相高效液態層析法(RP-HPLC)步驟以進一步純化FZD-Fc組成物,該RP-HPLC步驟使用疏水性RP-HPLC基質,例如具有甲基或其他脂肪族側基之矽膠。亦可採用一些或所有不同組合之前述純化步驟以提供同源重組蛋白質。
在細菌培養中產製之重組蛋白質可被分離,舉例來說藉由自細胞團塊初次抽取,隨後經一或多次濃縮、鹽析、含水離子交換或大小排除層析步驟。高效液態層析法(HPLC)可被用於最後純化步驟。表現重組蛋白質所使用之微生物細胞可藉由任何方便之方法破壞,包括冷凍解凍循環、超音波化、機械破壞或使用細胞溶解劑。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑係多肽,該多肽非為抗體。多種用於辨識及產製非抗體多肽之方法係該領域所知,該非抗體多肽以高親和性與蛋白質標靶結合。參見例如Skerra,Curr. Opin. Biotechnol.,18:295-304(2007),Hosse et al.,Protein Science,15:14-27(2006),Gill et al.,Curr. Opin. Biotechnol.,17:653-658(2006),Nygren,FEBS J.,275:2668-76(2008)及Skerra,FEBS J.,275:2677-83(2008),其各以參照方式整體納入此處。在特定實施態樣中,噬菌體展示技術已被用於辨識/產製該FZD結合多肽。在特定實施態樣中,該多肽包含選自蛋白A、疏水性分子結合蛋白(lipocalin)、纖維黏連蛋白(fribronectin)結構域、錨定蛋白(ankyrin)共同重複結構域及硫氧還蛋白(thioredoxin)之類型之蛋白質骨架。
在一些實施態樣中,該劑係非蛋白分子。在特定實施態樣中,該劑係小分子。可用於辨識非蛋白FZD結合劑之組合式化學文庫及技術係該領域之技藝人士所知。參見例如Kennedy et al.,J. Comb. Chem,10:345-354(2008),Dolle et al,J. Comb. Chem.,9:855-902(2007)及Bhattacharyya,Curr. Med. Chem.,8:1383-404(2001),其各以參照方式整體納入此處。在其他特定實施態樣中,該劑係碳水化合物、糖胺聚多糖、糖蛋白或蛋白多糖。
在特定實施態樣中,該劑係核酸適體。適體係已經根據彼等與其他分子結合之能力而選擇(例如自隨機或突變形成池)之多核苷酸分子。在一些實施態樣中,該適體包含DNA多核苷酸。在特定可選擇之實施態樣中,該適體包含RNA多核苷酸。在特定實施態樣中,該適體包含一或多個經修飾之核酸殘基。產製及篩選與蛋白質結合之核酸適體之方法係該領域所廣為週知。參見美國專利號5,270,163、美國專利號5,683,867、美國專利號5,763,595、美國專利號6,344,321、美國專利號7,368,236、美國專利號5,582,981、美國專利號5,756,291、美國專利號5,840,867、美國專利號7,312,325、美國專利號7,329,742、國際專利公開號WO 02/077262、國際專利公開號WO 03/070984、美國專利申請案公開號2005/0239134、美國專利申請案公開號2005/0124565及美國專利申請案公開號2008/0227735,其各以參照方式整體納入此處。
本發明另提供篩選具有抑制Wnt傳訊之效果、具有抗腫瘤療效及/或具有拮抗癌幹細胞之療效之劑之方法。該些方法包括但不限於包含比較已經暴露於候選藥物之第一實質腫瘤中之一或多種分化標記之量與未經暴露於該候選藥物之第二實質腫瘤中之該一或多種分化標記之量之方法。在特定實施態樣中,該些方法包括包含(a)使第一實質腫瘤暴露於候選藥物,但第二實質腫瘤則否;(b)檢測該第一及第二實質腫瘤中之一或多種分化標記之量;及(c)比較該第一及第二實質腫瘤中之該一或多種分化標記之量。在特定實施態樣中,該候選藥物係典型Wnt傳訊途徑之抑制劑,及/或抑制一或多種人Wnt蛋白與一或多種人捲曲受體之結合。在特定實施態樣中,該候選藥物係與一或多種人捲曲受體專一性結合之抗體。在特定實施態樣中,該第一實質腫瘤相較於該第二實質腫瘤所增加之該一或多種分化標記之量顯示對實質腫瘤幹細胞之療效。在特定實施態樣中,該實質腫瘤係胰臟腫瘤。在特定實施態樣中,該實質腫瘤係胰臟腫瘤且該一或多種分化標記可包含一或多種黏液素(例如Muc16)及/或嗜鉻粒蛋白A(CHGA)。在特定可選擇之實施態樣中,該實質腫瘤係結腸腫瘤。在一些實施態樣中,該實質腫瘤係結腸腫瘤且該一或多種分化標記包含細胞角蛋白7。胰臟及結腸以及其他腫瘤類型之其它可能之分化標記係為該領域之技藝人士所知。可能之分化標記於篩選方法中之有效性可輕易地由該領域之技藝人士檢測,該檢測藉由以此處所揭示之一或多種抗FZD抗體諸如18R5及/或44R24治療該所欲之腫瘤類型,然後評估該被治療之腫瘤相較於對照組之該標記的表現變化。該等方法之非限制性實例可舉例來說見於以下特定之實施例。
III. 多核苷酸
在特定實施態樣中,本發明包含多核苷酸,該多核苷酸包含編碼與人FZD受體專一性結合之多肽或該多肽之片段之多核苷酸。舉例來說,本發明提供一種多核苷酸,該多核苷酸包含編碼抗人捲曲受體之抗體或編碼該抗體之片段之核酸序列。本發明之多核苷酸可為RNA之形式或為DNA之形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成性DNA;且可為雙股或單股,若為單股者可為該編碼序列或非編碼(反義)序列。
在特定實施態樣中,該多核苷酸係經分離。在特定實施態樣中,該多核苷酸係實質上純的。
本發明提供一種多核苷酸,該多核苷酸包含編碼多肽之多核苷酸,該多肽包含選自SEQ ID NO:10、12或14之序列。本發明另提供一種多核苷酸,該多核苷酸包含編碼多肽之多核苷酸,該多肽包含選自SEQ ID NO:85至86之序列。本發明亦提供一種多核苷酸,該多核苷酸包含編碼多肽之多核苷酸,該多肽包含SEQ ID NO:11、13或15。
本發明另提供一種多核苷酸,該多核苷酸包含選自SEQ ID NO:17、19或21之序列。可選擇的是,在特定實施態樣中,該多核苷酸可包含選自SEQ ID NO:87至90、92或94至95之序列。本發明亦提供包含SEQ ID NO:18、20或22之多核苷酸序列。
本發明亦提供一種多核苷酸,該多核苷酸包含與具有SEQ ID NO:17、19或21之序列的多核苷酸及/或與編碼具有SEQ ID NO:10、12或14之序列之多肽的多核苷酸雜交之多核苷酸。本發明亦提供一種多核苷酸,該多核苷酸包含與具有選自SEQ ID NO:87至90、92或94至95之序列的多核苷酸及/或與編碼具有SEQ ID NO:85或86之序列之多肽的多核苷酸雜交之多核苷酸。在特定實施態樣中,該雜交係於高嚴謹度之條件下進行。
在特定實施態樣中,該多核苷酸包含成熟多肽之編碼序列,該成熟多肽係與例如協助多肽自宿主細胞表現及分泌之多核苷酸(例如作為分泌性序列以控制多肽自細胞運送之前導序列)的相同閱讀框融合。該具有前導序列之多肽係前蛋白質(preprotein)且可令該前導序列被該宿主細胞切割以形成成熟形式之多肽。該多核苷酸亦可編碼原蛋白質(proprotein),其係成熟蛋白質加上額外之5,胺基酸殘基。具有原序列(prosequence)之成熟蛋白質係原蛋白質且係該蛋白質之不活化形式。一旦該原序列被切除後,剩下的是活性成熟蛋白質。
在特定實施態樣中,該多核苷酸包含成熟多肽之編碼序列,該成熟多肽係與例如允許該編碼多肽純化之標記序列的相同閱讀框融合。舉例來說,該標記序列可為由pQE-9載體所供應之六組胺酸標籤,以供在細菌性宿主中純化與該標記融合之成熟多肽,或當使用哺乳動物宿主時(例如COS-7細胞),該標記序列可為源自流感血球凝集素蛋白之血球凝集素(HA)標籤。
本發明另關於上述多核苷酸之變異體,該變異體編碼例如片段、類似物及衍生物。
在特定實施態樣中,本發明提供經分離之多核苷酸,該多核苷酸包含與編碼多肽之多核苷酸具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性,至少95%同一性,及在一些實施態樣中,至少96%、97%、98%或99%同一性之核苷酸序列之多核苷酸,該多肽包含此處所述之抗人FZD受體之抗體或彼之片段。
與參照核苷酸序列具有至少例如95%「同一性」之核苷酸序列的多核苷酸係指該多核苷酸之核苷酸序列係與該參照序列一致,除了該多核苷酸序列在該參照核苷酸序列之每100個核苷酸中可包括最多5個點突變。換句話說,要獲得與參照核苷酸序列具有至少95%同一性之核苷酸序列的多核苷酸,在該參照序列中最多5%之核苷酸可被刪除或以另一個核苷酸取代,或最多5%之參照序列核苷酸總數之核苷酸可被導入該參照序列中。這些參照序列之突變可發生在該參照核苷酸序列之胺基或羧基端位置或介於該等末端位置之間之任何地方,不論是個別分散於該參照序列之核苷酸之間亦或是以一或多個相鄰群體分散於該參照序列之內。
該多核苷酸變異體可包含在編碼區、非編碼區或二者中之改變。在一些實施態樣中,該多核苷酸變異體包含產生緘默取代、添加或刪除之改變,但不改變該編碼多肽之性質或活性。在一些實施態樣中,核苷酸變異體係由基因密碼簡倂所致之緘默取代產生。多核苷酸變異體可因多種原因產生,例如為了最佳化特定宿主之密碼子表現(將人mRNA中之密碼子改變成該些細菌宿主諸如大腸桿菌所偏好者)。
本發明亦提供包含此處所述之多核苷酸之載體及細胞。
IV. 使用方法及醫藥組成物
本發明之FZD結合劑(包括多肽及抗體)可用於各種應用,包括但不限於治療性治療方法,諸如癌症之治療。在特定實施態樣中,該等劑類可用於抑制Wnt傳訊(例如典型Wnt傳訊)、抑制腫瘤生長、誘發分化、減低腫瘤體積及/或減低腫瘤之腫瘤發生性。使用方法可為試管內(in vitro)、活體外(ex vivo)或活體內(in vivo)方法。在特定實施態樣中,該FZD結合劑或多肽或抗體係其所結合之一或多種人捲曲受體之拮抗劑。
在特定實施態樣中,該FZD結合劑或拮抗劑係用於治療與Wnt傳訊活化有關之疾病。在特定實施態樣中,該疾病係依賴Wnt傳訊之疾病。在特定實施態樣中,該Wnt傳訊係典型Wnt傳訊。在特定實施態樣中,該FZD結合劑或拮抗劑係用於治療病症,該病症之特徵在於幹細胞及/或祖細胞之量增加。
在特定實施態樣中,由該FZD結合劑或拮抗劑(例如抗FZD抗體)所治療之疾病係癌症。在特定實施態樣中,該癌症之特徵在於Wnt依賴性腫瘤。在特定實施態樣中,該癌症之特徵在於表現一或多種被FZD結合劑(例如抗體)所結合之捲曲受體之腫瘤。在特定實施態樣中,該癌症之特徵在於表現Wnt基因簽署中一或多個基因之腫瘤。
在特定實施態樣中,由FZD結合劑或拮抗劑所治療之該疾病非為癌症。舉例來說,該疾病可能是代謝性病症諸如肥胖或糖尿病(例如第二型糖尿病)(Jin T.,Diabetologia,2008 Oct;51(10):1771-80)。可選擇的是,該疾病可能為骨病症諸如骨質疏鬆症、骨關節炎或類風濕性關節炎(Corr M.,Nat Clin Pract Rheumatol,2008 Oct;4(10):550-6;Day et al.,Bone Joint Surg Am,2008 Feb;90 Suppl 1:19-24)。該疾病亦可為腎臟病症,諸如多囊性腎病(Harris et al.,Annu Rev Med,2008 Oct. 23;Schmidt-Ott et al.,Kidney Int,2008 Oct;74(8):1004-8;Benzing et al.,J Am Soc Nephrol,2007 May;18(5):1389-98)。可選擇的是,眼病症包括但不限於黃斑變性及家族性滲出性玻璃體視網膜病變可被治療(Lad et al.,Stem Cells Dev,2008 Aug. 8)。心血管病症包括心肌梗塞、動脈粥狀硬化及瓣膜病症亦可被治療(Al-Aly Z.,Transl Res,2008 May;151(5):233-9;Kobayashi et al.,Nat Cell Biol,2009 Jan;11(1):46-55;van Gijn et al.,Cardiovasc Res,2002 Jul;55(1):16-24;Christman et a1.,Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008 Jun;294(6):H2864-70)。在一些實施態樣中,該疾病係肺病症諸如自發性肺動脈高血壓或肺纖維化(Laumanns et al.,Am J Respir Cell Mol Biol,2008 Nov 21;Knigshoff et al.,PLoS ONE,2008 May 14;3(5):e2142)。在一些實施態樣中,由FZD結合劑所治療之疾病係肝臟疾病,諸如肝硬化或肝纖維化(Cheng et al.,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2008 Jan;294(1):G39-49)。
本發明提供治療癌症之方法,該方法包含對個體(例如需要治療之個體)投予治療有效量之FZD結合劑。在特定實施態樣中,該癌係選自結直腸癌、胰臟癌、肺臟癌、卵巢癌、肝臟癌、乳房癌、腎臟癌、前列腺癌、胃腸道癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤或頭頸癌之癌。在特定實施態樣中,該癌係胰臟癌。在特定實施態樣中,該癌係結直腸癌。在特定實施態樣中,該個體係人。
本發明另提供利用此處所述之抗體或其他劑類抑制腫瘤生長之方法。在特定實施態樣中,該抑制腫瘤生長之方法包含使細胞於活體外與FZD結合劑(例如抗體)接觸。舉例來說,將表現該標靶FZD之永生化細胞系或癌細胞系培養於培養基,該培養基中加入抗體或其他劑以抑制腫瘤生長。在一些實施態樣中,腫瘤細胞係分離自病患樣本諸如舉例來說組織活體檢查、胸膜滲出液或血液樣本且培養於其中添加FZD結合劑以抑制腫瘤生長之培養基。
在一些實施態樣中,抑制腫瘤生長之方法包含令該腫瘤或腫瘤細胞於活體內與FZD結合劑(例如抗體)接觸。在特定實施態樣中,令腫瘤或腫瘤細胞與FZD結合劑接觸係於動物模型中進行。舉例來說,FZD結合劑可能被投予至已在免疫不全小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中生長之表現一或多種FZD之異種移植物以抑制腫瘤生長。在一些實施態樣中,癌幹細胞係分離自病患樣本諸如舉例來說組織活體檢查、胸膜滲出液或血液樣本且被注射至免疫不全小鼠體內,接著對該免疫不全小鼠投予FZD結合劑以抑制腫瘤生長。在一些實施態樣中,該FZD結合劑係於腫瘤發生細胞被導入動物體內同時或不久後投予以預防腫瘤生長。在一些實施態樣中,該FZD結合劑係於腫瘤發生細胞已經生長至特定大小後投予以作為治療劑。
在特定實施態樣中,抑制腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量之FZD結合劑。在特定實施態樣中,該個體係人。在特定實施態樣中,該個體具有腫瘤或已經移除腫瘤。
在特定實施態樣中,該腫瘤係其中Wnt傳訊具活性之腫瘤。在特定實施態樣中,該具活性之Wnt傳訊係典型Wnt傳訊。在特定實施態樣中,該腫瘤係Wnt依賴性腫瘤。舉例來說,在一些實施態樣中,該腫瘤對軸蛋白過度表現敏感。在特定實施態樣中,該腫瘤不包含在結腸腺瘤樣息肉蛋白(APC)腫瘤抑制基因中之不活化突變(例如截短突變)或在β-連鎖蛋白基因中之活化突變。在特定實施態樣中,該腫瘤表現Wnt基因簽署中之一或多個基因。在特定實施態樣中,個體接受治療之該癌涉及該腫瘤。
在特定實施態樣中,該腫瘤表現由該FZD結合劑或抗體所結合之一或多種人捲曲受體。在特定實施態樣中,該腫瘤過度表現該人捲曲受體。
在特定實施態樣中,該腫瘤係選自結直腸腫瘤、胰臟腫瘤、肺臟腫瘤、卵巢腫瘤、肝臟腫瘤、乳房腫瘤、腎臟腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤或頭頸腫瘤之腫瘤。在特定實施態樣中,該腫瘤係結直腸腫瘤。在特定實施態樣中,該腫瘤係胰臟腫瘤。
本發明亦提供抑制細胞中Wnt傳訊之方法,該方法包含令該細胞與有效量之FZD結合劑接觸。在特定實施態樣中,該細胞係腫瘤細胞。在特定實施態樣中,該方法係活體內方法,其中令細胞與劑接觸之步驟包含對該個體投予治療有效量之劑。在一些可選擇之實施態樣中,該方法係試管內或活體外方法。在特定實施態樣中,被抑制之Wnt傳訊係典型Wnt傳訊。在特定實施態樣中,該Wnt傳訊係由WNT1、WNT2、WNT3、WNT3A、WNT7a、WNT7b及/或WNT10B傳訊。在特定實施態樣中,該Wnt傳訊係由WNT1、WNT3A、WNT7b及/或WNT10B傳訊。
此外,本發明提供一種減少個體內之腫瘤的腫瘤發生之方法,該方法包含對該個體投予治療有效量之FZD結合劑。在特定實施態樣中,該腫瘤包含癌幹細胞。在特定實施態樣中,該腫瘤中癌幹細胞之頻率係藉由投予該劑被降低。
本發明另提供使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生細胞之方法,該方法包含使該腫瘤發生細胞與FZD結合劑接觸,舉例來說藉由對個體投予FZD結合劑,該個體具有包含該腫瘤發生細胞之腫瘤或該個體已經移除該腫瘤。在特定實施態樣中,該腫瘤發生細胞係胰臟腫瘤細胞。在特定可選擇之實施態樣中,該腫瘤發生細胞係結腸腫瘤細胞。
本發明亦提供以此處所描述之FZD結合劑、多肽或抗體誘發腫瘤細胞分化之用途。舉例來說,本發明提供誘發個體之腫瘤內之細胞分化之方法,該方法包含對該個體投予治療有效量之FZD結合劑、多肽或抗體。在特定實施態樣中,該腫瘤係胰臟腫瘤。在其他特定實施態樣中,該腫瘤係結腸腫瘤。
本發明另提供治療個體之疾病或病症之方法,其中該疾病或病症係與Wnt傳訊活化有關及/或特徵在於幹細胞及/或祖細胞之量增加。在一些實施態樣中,該治療方法包含對該個體投予治療有效量之FZD結合劑、多肽或抗體。在特定實施態樣中,該Wnt傳訊係典型Wnt傳訊。
本發明另提供減低實質腫瘤之基質中的肌纖維母細胞活化之方法,該方法包含使該基質與有效量之FZD結合劑、多肽或抗體接觸。
本發明另提供醫藥組成物,其包含此處所述之一或多種FZD結合劑。在特定實施態樣中,該醫藥組成物另包含醫藥上可接受之載劑。這些醫藥組成物在人病患中具有抑制腫瘤生長及治療癌症之用途。
在特定實施態樣中,藉由組合本發明之純化抗體或劑與醫藥上可接受之載具(例如載劑、賦形劑)以製備調製劑以供儲存及使用(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th
Edition Mack Publishing,2000)。適當之醫藥上可接受之載具包括但不限於無毒緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;鹽諸如氯化鈉;抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(例如十八基二甲基苄基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇或苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)、低分子量多肽(例如少於約10個胺基酸殘基)、蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白、親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮、胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸、碳水化合物諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或糊精、螯合劑諸如EDTA、糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇、鹽形成反離子諸如鈉、金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)及非離子性介面活性劑諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本發明之醫藥組成物可經任何方式投予以供局部或系統性治療。投予可為局部性(諸如經黏膜包括陰道及直腸遞送)諸如經皮貼布、軟膏、乳液、乳膏、膠劑、滴劑、栓劑、噴劑、液劑及粉劑;經肺(例如藉由吸入或吹入粉末或噴霧,包括藉由噴霧器、經氣管內、經鼻內、經表皮及經皮);經口;或非經腸途徑包括靜脈內、動脈內、皮下、腹腔內或肌肉內注射或輸注;或顱內(例如腦脊髓膜內或腦室內)投予。
該治療調製劑可為單位劑量形式。該等調製劑包括錠劑、丸劑、膠囊、粉末、粒劑、於水或非含水介質中之溶液或懸浮液、或供經口、非經腸或經直腸投予或供吸入投予之栓劑。在實質組成物諸如錠劑中,該主要活性成分係與醫藥載體混合。習知之壓錠成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠及其他稀釋劑(例如水)以形成包含本發明之化合物之同源混合物或彼之醫藥上可接受之無毒性鹽之實質處方設計組成物。該實質處方設計組成物接著被再分成上述類型之單位劑量形式。該新穎組成物之錠劑、丸劑等可被包膜或以其他方式化合以提供具有長效優點之劑量形式。舉例來說,該錠劑或丸劑可包含被外部成分覆蓋之內部組成物。另外,該二種成分可被腸溶層分離,該腸溶層用來對抗崩解及允許該內部成分完整通過胃部或延緩釋放。多種材料可被用於該腸溶層或腸溶衣,該材料包括多種聚合物酸及聚合物酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及醋酸纖維素之材料之混合物。
抗體或劑亦可被包封於微膠囊中。該等微膠囊係藉由例如膠質凝聚技術或藉由界面聚合作用製備,舉例來說如Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th
Ed. Mack Publishing(2000)所述之分別於膠體藥物遞送系統(舉例來說脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米膠囊)或於巨乳化液中之羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。
在特定實施態樣中,醫藥調製劑包括與脂質體複合(Epstein,et al.,1985,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688;Hwang,et al.,1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030及美國專利4,485,045及4,544,545)之本發明之抗體或其他劑。延長循環時間之脂質體係揭示於美國專利5,013,556。有些脂質體可利用逆相蒸發包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂肪組成物產製。脂質體係經過已定義孔洞大小之過濾器擠出以產生所欲直徑之脂質體。
除此之外可製備持續釋放製劑。適當之持續釋放製劑實例包括含有該抗體之固相疏水性聚合物之半透性基質,該基質係呈形狀物件(例如膜或微囊)。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM
(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
在特定實施態樣中,除了投予FZD結合劑外,該方法或治療另包含投予第二抗癌劑(在投予該FZD結合劑之前、投予該FZD結合劑同時及/或投予該FZD結合劑之後)。本發明亦提供包含該FZD結合劑及該第二抗癌劑之醫藥組成物。
將瞭解的是,FZD結合劑及第二抗癌劑之組合可以任何順序或同時投予。在選定之實施態樣中,該FZD結合劑將對先前已接受該第二抗癌劑治療之病患投予。在其他特定實施態樣中,該FZD結合劑與該第二抗癌劑將被實質上同時投予。舉例來說,在進行第二抗癌劑(例如化學治療)之治療期間可對個體投予FZD結合劑。在特定實施態樣中,該FZD結合劑將在第二抗癌劑治療1年內投予。在特定可選擇之實施態樣中,該FZD結合劑將在第二抗癌劑任何治療之10、8、6、4或2個月內投予。在其他特定實施態樣中,該FZD結合劑將在第二抗癌劑任何治療之4、3、2或1週內投予。在一些實施態樣中,該FZD結合劑將在第二抗癌劑任何治療之5、4、3、2或1天內投予。將另外了解的是,該二種劑或治療可在數小時或數分鐘之內(意即實質上同時)對個體投予。
可使用之抗癌劑類別包括例如抗微管蛋白劑、奧瑞他汀(auristatins)、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如鉑複合物諸如順鉑(cis-platin)、單(鉑)、雙(鉑)及三核鉑複合物及卡鉑(carboplatin))、蒽環類(anthracyclines)、抗生素抗葉酸劑、抗代謝物、化學治療敏感劑、杜卡黴素(duocarmycins)、依托泊苷(etoposides)、氟化嘧啶、離子載體(ionophores)、來昔多新(lexitropsins)、亞硝基脲(nitrosoureas)、普拉汀諾(platinols)、執行化合物(performing compounds)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycins)、放射線敏感劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼類或該類似物。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。
可與FZD結合劑組合投予之抗癌劑包括化學治療劑。因此,在一些實施態樣中,該方法或治療涉及本發明之抗體或劑與化學治療劑或多種不同化學治療劑之混合物之組合投予。抗體之治療可發生在投予化學治療之前、投予化學治療同時或投予化學治療之後。本發明所考慮之化學治療包括該領域已知且可自商業取得之化學物質或藥物,諸如吉斯他濱(Gemcitabine)、愛萊諾迪肯(Irinotecan)、阿黴素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、阿糖胞苷(Cytosine arabinoside)(Ara-C)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、塞替派(Thiotepa)、白消安(Busulfan)、細胞毒素(Cytoxin)、紫杉醇(TAXOL)、甲胺喋呤(Methotrexate)、順鉑(Cisplatin)、黴法蘭(Melphalan)、長春鹼(Vinblastine)及卡鉑(Carboplatin)。組合投予可包括不論是以單一醫藥調製劑或使用分開調製劑之共同投予,或依任何順序但通常在一段期間內以使所有活性劑可同時展現彼等之生物活性之運續投予。該化學治療劑之製備及投藥計畫可根據製造商之說明使用或由技藝人士之經驗決定。該化學治療之製備及投藥計畫亦被描述於Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,Md.(1992)。
本發明所使用之化學治療劑亦包括但不限於烷化劑諸如烷化劑諸如塞替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide)(CYTOXAN);烷基磺酸鹽諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌醯硫烷(piposulfan);氮丙啶(aziridines)諸如苯並多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米得派(meturedopa)及尿烷亞胺(uredopa);乙烯亞胺及甲基三聚氫胺(methylamelamines)包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)及三甲醇蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogen mustards)諸如氯氨布西(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、環磷醯胺(cyolophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、異環磷酸胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、黴法蘭(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亞硝基脲(nitrosureas)諸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福泰氮芥(fotemustine)、羅氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷諾氮芥(ranimustine);抗生素諸如阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安曲黴素(authramycin)、氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡利奇黴素(calicheamicin)、卡拉比素(carabicin)、洋紅黴素(caminom
ycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、更生黴素(dactinomycin)、正定黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧-L-正白胺酸、阿黴素(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、波弗黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黴黑素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、紅比腙(zorubicin);抗代謝物諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU);葉酸類似物諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶醯三穀氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊諾他濱(enocitabine)、氟苷(floxuridine)、5-FU;雄性素諸如7β,17α-二甲睪酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone);抗腎上腺素(anti-adrenals)諸如胺基乙哌啶酮(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛斯坦(trilostane);葉酸補充劑諸如醛葉酸(frolinic acid);醋葡醛內酯(aceglatone);醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside);胺基酮戊酸(aminolevulinic acid);安吖啶(amsacrine);貝斯布西(bestrabucil);比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地弗伐明(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);二氮醌(diaziquone);艾弗米西(elformithine);依利醋銨(elliptinium acetate);乙環氧定(etoglucid);硝酸鎵(gallium nitrate);羥基尿素(hydroxyurea);香菇糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);米托胍腙(mitoguazone);雙羥蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide);甲基苄胼(procarbazine);PSK;丙亞胺(razoxane);西佐喃(sizofuran);螺旋鍺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone);2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine);烏拉坦(urethan);長春鹼醯胺(vindesine);氮烯唑胺(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌醯溴烷(pipobroman);加胞嘧啶(gacytosine);阿糖胞苷(arabinoside)(Ara-C);環磷醯胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);紫杉烷類(taxoids)例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL,紐澤西州普林斯頓必治妥施貴寶腫瘤學部門)及多西紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE,法國安東尼市羅納普朗克羅爾(Rhone-Poulenc Rorer)公司);氯氨布西(chlorambucil);吉斯他濱(gemcitabine);6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);甲胺喋呤(methotrexate);鉑類似物諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin);長春鹼(vinblastine);鉑;依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環磷酸胺(ifosfamide);絲裂黴素C(mitomycin C);雙羥蒽醌(mitoxantrone);長春新鹼(vincristine);長春瑞濱(vinorelbine);溫諾平(navelbine);能滅瘤(novantrone);鬼臼噻吩苷(teniposide);正定黴素(daunomycin);胺喋呤(aminopterin);截瘤達(xeloda);伊班磷酸鹽(ibandronate);CPT11;拓撲異構酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylornithine)(DMFO);視黃酸(retinoic acid);埃斯培拉黴素(esperamicins);卡培他濱(capecitabine);及上述任何之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括用來調節或抑制荷爾蒙對腫瘤作用之抗荷爾蒙劑,諸如抗雌性素包括舉例來說它莫西芬(tamoxifen)、雷洛西芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基它莫西芬、氫萘吡苯酮(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(Fareston);及抗雄性素諸如拂劼璐(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳菩林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin);及上述任何之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
在特定實施態樣中,該化學治療劑係拓撲異構酶抑制劑。拓撲異構酶抑制劑係干擾拓撲異構酶酵素(例如拓撲異構酶I或II)作用之化學治療劑。拓撲異構酶抑制劑包括但不限於鹽酸阿黴素、檸檬酸正定黴素、鹽酸雙羥蒽醌、放線菌素D、依扥泊苷、鹽酸拓撲替康(Topotecan HCL)、鬼臼噻吩苷(VM-26)及愛萊諾迪肯(irinotecan)。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係愛萊諾迪肯。在特定實施態樣中,該被治療之腫瘤係結直腸腫瘤且該第二抗癌劑係拓撲異構酶抑制劑,諸如愛萊諾迪肯。
在特定實施態樣中,該化學治療劑係抗代謝物。抗代謝物係具有與正常生化反應所需之代謝物類似結構之化學物,但其不同之處足以干擾一或多種細胞之正常功能諸如細胞分裂。抗代謝物包括但不限於吉斯他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、呋氟尿嘧啶(tegafur)、阿糖胞苷、硫鳥嘌呤(葛蘭素史克藥廠)、5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azacytidine)、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達拉濱或克拉屈濱(cladribine),及該些任何之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係吉斯他濱。在特定實施態樣中,該被治療之腫瘤係胰臟腫瘤且該第二抗癌劑係抗代謝物(例如吉斯他濱)。
在特定實施態樣中,該化學治療劑係抗有絲分裂劑,其包括但不限於與微管蛋白結合之劑。就非限制性實例而言,該劑包含紫杉烷。在特定實施態樣中,該劑包含太平洋紫杉醇或多西紫杉醇,或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在特定實施態樣中,該劑係太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、與白蛋白結合之太平洋紫杉醇(例如ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在特定可選擇之實施態樣中,該抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼,諸如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱或長春鹼醯胺,或彼等之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施態樣中,該抗有絲分裂劑係Eg5驅動蛋白(kinesin)之抑制劑或有絲分裂激酶諸如Aurora A或Plk1之抑制劑。在特定實施態樣中,其中與FZD結合劑或多肽或抗體組合投予之化學治療劑包含抗有絲分裂劑,該被治療之癌或腫瘤係乳癌或乳房腫瘤。
在特定實施態樣中,該治療關於組合投予本發明之抗體(或其他劑)與放射線治療。抗體(或劑)之治療可發生在投予放射線治療之前、投予放射線治療同時或投予放射線治療之後。可使用由技藝人士所決定之任何放射線治療之投予計畫。
在一些實施態樣中,該第二抗癌劑包含抗體。因此,治療可關於組合投予本發明之抗體(或其他劑)與其他拮抗額外之腫瘤相關抗原之抗體,包括但不限於與EGFR、ErbB2、HER2、DLL4、刻痕(Notch)及/或VEGF結合之抗體。示範性抗DLL4抗體舉例來說係描述於美國專利申請案公開號US 2008/0187532,其以參照方式整體納入此處。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係抗體,該抗體係血管生成抑制劑(例如抗VEGF抗體)。其它抗DLL4抗體係描述於例如國際專利公開號WO 2008/091222及WO 2008/0793326及美國專利申請案公開號US 2008/0014196、US 2008/0175847、US 2008/0181899及US 2008/0107648,其各以參照方式整體納入此處。示範性抗刻痕抗體舉例來說係描述於美國專利申請案公開號US 2008/0131434,其以參照方式整體納入此處。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係抗體,該抗體係血管生成抑制劑(例如抗VEGF抗體)。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係刻痕傳訊抑制劑。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係AVASTIN(貝伐單抗(Bevacizumab))、賀癌平(Herceptin) (曲妥珠單抗(Trastuzumab))、VECTIBIX(帕尼單抗(Panitumumab))或爾必得舒(Erbitux)(西妥昔單抗(Cetuximab))。組合投予可包括不論是以單一醫藥調製劑或使用分開調製劑之共同投予,或依任何順序但通常在一段期間內以使所有活性劑可同時展現彼等之生物活性之連續投予。
另外,治療可包括投予一或多種細胞介素(例如淋巴介素、介白素、腫瘤壞死因子及/或生長因子)或可伴隨手術移除癌細胞或任何由治療醫師認為是必要之其他治療。
在治療疾病時,本發明之抗體或劑之適當劑量取決於所欲治療之疾病種類、該疾病之嚴重性及病程、該疾病之反應性、該抗體或劑係以治療性或預防性目的投予、先前治療、病患之臨床病史等等由治療醫師所決定之所有因素。該抗體或劑可被一次投予或在持續數天至數月或直到疾病被治癒或達成減少疾病狀態(例如腫瘤大小縮小)之連續治療期間投予。最佳之投藥計畫可從病患體內之藥物累積測量值計算,且將因個別抗體或劑之相對效價而異。投藥醫師可輕易地決定最佳劑量、投藥方法及重複頻率。在特定實施態樣中,劑量介於每公斤體重0.01微克至100毫克,且每天、每週、每月或每年可給予一次或超過一次。治療醫師可根據藥物在體液或組織中之測量滯留時間及濃度預估投藥之重複頻率。
V. Wnt基因簽署及彼之用途
本發明另提供Wnt基因簽署,意即顯示腫瘤中Wnt傳訊活性之基因簽署,其可被用於篩選腫瘤、病患及/或治療。
該Wnt基因簽署包含相較於Wnt傳訊未經活化之腫瘤,差別表現Wnt傳訊被活化之腫瘤(及/或依賴Wnt傳訊之腫瘤)中的一組基因。在特定實施態樣中,該Wnt傳訊係典型Wnt傳訊。該Wnt基因簽署可用於識別腫瘤及/或可能對Wnt傳訊抑制劑(例如為至少一種人捲曲受體之拮抗劑及/或Wnt傳訊之抑制劑之FZD結合劑)治療有反應之病患。
在特定實施態樣中,該Wnt基因簽署包含一或多個列於下表3中之基因(意即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個基因)。「探針組識別號」係用於GeneChip人基因組U133 Plus 2.0陣列(HG_U133_Plus_2;加州聖克拉拉艾菲曼曲公司(Affymetrix))之探針組識別編號。在具有Wnt傳訊活性之腫瘤中(意即Wnt基因簽署呈陽性之腫瘤),表3中包含該Wnt基因簽署之基因的表現量相較於Wnt傳訊不具活性之腫瘤為增加。在一些實施態樣中,該Wnt基因簽署包含下表3所列之2個或超過2個基因。在一些實施態樣中,該Wnt基因簽署包含下表3所列之3個或超過3個基因、4個或超過4個基因、5個或超過5個基因、6個或超過6個基因、7個或超過7個基因、8個或超過8個基因、9個或超過9個基因、10個或超過10個基因、11個或超過11個基因、12個或超過12個基因、13個或超過13個基因、14個或超過14個基因、15個或超過15個基因、16個或超過16個基因、17個或超過17個基因、18個或超過18個基因或19個或超過19個基因。在特定實施態樣中,被檢測表3之1個或超過1個基因之表現量之腫瘤係結直腸腫瘤。在特定實施態樣中,該Wnt基因簽署包含AXIN2及/或FOXQ1。在特定實施態樣中,該腫瘤係結直腸腫瘤且該Wnt基因簽署包含AXIN2、LGR5及/或FOXQ1。
本發明亦提供使用Wnt基因簽署以篩選(或識別)適合接受Wnt途徑抑制劑治療之病患或評估特定治療之療效之方法。在特定實施態樣中,該Wnt傳訊抑制劑係FZD結合劑,諸如拮抗性FZD抗體。舉例來說,藉由決定病患體內之腫瘤或已經自病患體內移除之腫瘤是否展現Wnt基因簽署,可識別病患是否適合接受FZD結合劑(或多種FZD結合劑)治療。在特定實施態樣中,檢測Wnt基因簽署包含檢測表3之一或多個基因於腫瘤中之表現量。若包含Wnt基因簽署之表3之一或多個基因於腫瘤中之表現量提高(因此表示Wnt傳訊在腫瘤中具有活性),該病患被識別為適合接受FZD結合劑之治療,諸如抑制Wnt傳訊之抗FZD抗體。本發明亦提供使用Wnt基因簽署以選擇對特定病患為適當治療之方法。
本發明提供治療病患之癌之方法,該病患具有腫瘤或腫瘤已自該病患移除,該方法包含(a)提供表3之一或多個基因於腫瘤中之表現量,(b)根據該一或多個基因之表現量篩選病患以開始或繼續接受FZD結合劑之治療,及(c)對該病患投予FZD結合劑。在特定實施態樣中,該方法包含測量該一或多個基因於腫瘤中之表現量。在特定實施態樣中,該一或多個基因之表現量係與對照或參考量比較。
本發明亦提供識別對Wnt傳訊抑制劑治療有反應之腫瘤之方法。在特定實施態樣中,Wnt傳訊之抑制劑係FZD結合劑。在特定實施態樣中,該方法包含測試該腫瘤之Wnt基因簽署。在特定實施態樣中,該方法包含測試表3中之一或多個基因於腫瘤中之表現量。
本發明亦提供篩選候選藥物之方法,該候選藥物能拮抗被識別為展現Wnt基因簽署之腫瘤。在特定實施態樣中,該候選藥物係Wnt傳訊抑制劑。較佳地測試該等候選藥物對該些其中具有Wnt傳訊活性及/或依賴Wnt傳訊之腫瘤之療效。本發明亦提供一種篩選候選藥物之方法,該方法包含(a)檢測表3之一或多個基因於腫瘤中之表現量(b)(至少部分)根據該一或多個基因之表現量篩選用於測試候選藥物之腫瘤及(c)測試該候選藥物對腫瘤之效果。
此外,在特定實施態樣中,藥物對Wnt基因簽署之效果可被決定且用於檢測治療對具有Wnt傳訊活性之腫瘤的療效。在特定實施態樣中,此提供一種監測病患治療之方法。在一些可選擇之實施態樣中,此提供一種檢測候選藥物之療效之方法。在特定實施態樣中,表3之一或多個基因之表現量降低(意即Wnt基因簽署減低或消除)顯示治療之療效。
在特定實施態樣中,檢測Wnt基因簽署中一或多個基因之量包含決定該一或多個基因之多核苷酸之表現量。在特定實施態樣中,偵測Wnt基因簽署包含偵測該一或多個基因之多核苷酸之mRNA表現,該一或多個基因包含該簽署。在一些實施態樣中,mRNA表現之偵測係經由北方墨漬法。在一些實施態樣中,mRNA表現之偵測係經由RT-PCR、即時PCR或定量PCR,使用專一性放大包含該癌幹細胞簽署之多核苷酸之引子組。在特定實施態樣中,mRNA之偵測包含使樣本暴露於與多核苷酸互補之核酸探針,該多核苷酸包含癌幹細胞簽署。在一些實施態樣中,該樣本之mRNA在偵測前被轉換成cDNA。在一些實施態樣中,mRNA之偵測係經由包含多核苷酸之微陣列,該多核苷酸與Wnt基因簽署中之一或多個基因雜交。
在特定實施態樣中,檢測Wnt基因簽署中一或多個基因之量包含偵測由該一或多個基因所編碼之多核苷酸。在一些實施態樣中,檢測該一或多個基因之多肽表現產物之量包含使樣品暴露於該多肽之專一性抗體及藉由例如定量免疫螢光法或ELISA偵測該抗體與該多肽之結合。其它偵測方法係該領域之一般技藝人士所知,參見例如美國專利號6,057,105。
本發明亦提供一種陣列,該陣列包含在嚴謹條件下與表3之一或多個基因雜交之多核苷酸。本發明亦提供包含該陣列之套組。
本發明亦提供包含抗體之套組,該抗體與表3之一或多個基因之表現產物結合。
VI. 包含Fzd結合劑之套組
本發明提供包含此處所描述之抗體或其他劑之套組,且該套組可被用於進行此處所描述之方法。在特定實施態樣中,套組在一或多個容器中包含拮抗一或多種人捲曲受體之至少一種純化抗體。在特定實施態樣中,該套組包含所有需要及/或足以進行偵測測定之成分,包括所有對照物、進行測定之說明及分析及呈現結果所需之任何軟體。該領域之技藝人士將輕易地了解到,本發明所揭示之抗體或劑可被輕易地納入該領域所廣為週知之一種已建立套組格式之中。
本發明另提供包含FZD結合劑(例如FZD結合抗體)以及第二抗癌劑之套組。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係化學治療劑(例如吉斯他濱或愛萊諾迪肯)。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係血管生成抑制劑。在特定實施態樣中,該第二抗癌劑係刻痕(Notch)傳訊抑制劑(例如抗DLL4或抗刻痕抗體)。
本發明亦提供包含FZD結合劑及試劑或多種試劑之套組,該試劑或多種試劑用於檢測上表3之一或多個基因之表現(「示範性Wnt基因簽署基因」)。
本揭示之實施態樣可進一步參照下列非限制性實施例加以定義,該些實施例詳細描述本揭示之特定抗體之製備及使用本揭示之抗體之方法。對該領域之技藝人士而言將顯而易見的是,可實施對材料及方法二者之許多修飾而不背離本揭示之範圍。
實施例
應了解的是此處所描述之實施例及實施態樣僅供說明目的之用,對彼等之各種修飾或改變將被建議給該領域之技藝人士且應被包括在此應用之精神及範圍內。
實施例1
抗FZD抗體之識別/產製
專一性辨識一或多種人捲曲受體之人抗體可利用噬菌體展示加以分離。舉例來說,包含人抗體可變結構域之合成性抗體文庫可被篩選以找出對人FZD7受體之胞外結構域具專一性及高親和性辨識之抗體。一旦具有所欲特徵之特定Fab被識別後,該Fab之人可變區接著被選殖至包含人IgG2重鏈及輕鏈(κ或λ)之Ig表現載體以於CHO細胞中表現人抗體。
噬菌體展示被用於識別專一性Fab,意即18R8,其與FZD7之胞外結構域結合。使2x1013
來自人Fab噬菌體文庫之Fab展示噬菌體顆粒與被動固定之重組FZD7 ECD Fc蛋白一起培養。非專一性噬菌體被洗掉,接著以DTT溶析專一性噬菌體。該溶析產出物被用於感染由幫助噬菌體所救援之TG1 F+細菌。接著以IPTG(0.25mM)誘導Fab展示。此第1回合救援之產出物被用來作為其他篩選回合之起點。篩選持續進行至第3回合,接著該產出物於ELISA中篩選以找出對重組FZD7 ECD Fc蛋白具專一性之Fab。與人FZD7專一性結合之Fab被識別。
取得該被識別之Fab之可變區的序列。透過定點突變誘發,自該母體序列移除N連接糖基化位點。在重鏈CDR1中之N連接糖基化位點Asn被換成His。製備此突變是為了預防在哺乳動物系統中表現期間之糖基化作用。該形成之Fab被定名為18R8。18R8之重鏈及輕鏈CDR序列係顯示於下表4。18R8之VH及VL序列分別提供於SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:12。
抗FZD抗體18R5係藉由連接18R8 Fab之VH-CH1鏈與來自原始Fab噬菌體文庫之各種VL-CL鏈以產製,18R8係自該原始Fab噬菌體文庫被識別。在以固定化之重組FZD7 ECD Fc蛋白淘選三個回合後,自該文庫分離18R5。18R5之CDR的序列係顯示於上表4。18R5抗體之VL具有如SEQ ID NO:14所示之序列。18R5抗體之重鏈CDR及VH係與18R8抗體一致。
18R8及18R5 Fab之人可變區被選殖至包含人IgG2重鏈及輕鏈(λ)之Ig表現載體以於CHO細胞中表現。18R8 IgG抗體之重鏈及輕鏈的胺基酸序列(包括信號序列)係分別提供於SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13。當分泌時,在各鏈之胺基酸序列N端的信號序列被切下。編碼18R8 IgG抗體之重鏈及輕鏈的核酸序列係分別提供於SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:20。18R5 IgG抗體之重鏈及輕鏈的胺基酸序列係分別提供於SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:15。(同樣的當分泌時,在各鏈之胺基酸序列N端的信號序列被切下。)編碼18R5 IgG抗體之重鏈及輕鏈的核酸序列係分別提供於SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:22。蛋白A純化被用於純化該些抗體。
18R8及18R5抗體之KD
S係利用來自拜可生命科學公司(Biacore Lifescience)(GE健康醫療(GE Healthcare))之Biacore 2000系統決定。具體地說,經純化之抗Fzd7抗體於HBS-P中(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,0.005%體積/體積界面活性劑P20)自100nM連續2倍稀釋至0.78nM。測試每個稀釋液與固定在CM5 Biacore晶片上之重組Fzd Fc蛋白之結合。測量結合及解離速率,並利用Biaevaluation軟體程式決定KD
值(下表5)。
實施例2
抗FZD抗體之FACS分析證實與多種細胞表面人FZD結合
利用流式細胞分析決定抗體與細胞表面表現之FZD蛋白結合之能力。
為了使細胞表面能高度表現經選擇之FZD蛋白,利用標準重組DNA技術產製在編碼FZD之多核苷酸上游包含CMV啟動子之哺乳動物表現載體(該建構體被稱為「FL no FLAG」)。類似之表現載體被產製以供10種人捲曲蛋白之每一者使用。亦製備可選擇版本之FZD表現載體,其中編碼N端信號序列-FLAG表位標籤之多核苷酸亦利用標準重組技術製備,該FLAG表位標籤與該成熟FZD蛋白之N端融合(該建構體被稱為「FL flag」)。此外,編碼嵌合蛋白之表現質體係經設計,該嵌合蛋白包含與N端信號序列-FLAG表位融合之該FZD之CRD結構域(亦稱為fri結構域)或該FZD蛋白之整個N端細胞外結構域(分別稱為「fri flag」及「ECD flag」)以及編碼人CD4蛋白之跨膜及細胞質結構域之C端區段。
為了藉由流式細胞法測量抗體與FZD之結合,以FZD表現載體及轉染標記GFP共轉染HEK293細胞。在轉染後24至48小時,將細胞收集於懸浮液中並於冰上與抗FZD抗體(10微克/毫升除非另外說明)或對照IgG一起培養以偵測背景抗體結合。細胞經過清洗,用與螢光發色團共軛之Fc結構域專一性二次抗體(例如藻紅素共軛之抗人IgG)偵測一次抗體。經標記之細胞接著利用流式細胞法分析以識別專一性辨識細胞表面表現之FZD蛋白之抗FZD抗體。單株抗體18R5及18R8辨識轉染細胞上之FZD。如圖1及圖2所示,18R8及18R5皆與多種FZD結合,包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。為了檢查18R8及18R5與各個FZD蛋白結合之相對能力因此進行滴定分析,其中結合反應中之抗體量不等(圖2)。此分析證實18R5相較於18R8展現較高之與各個FZD受體(FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8)結合之能力。
實施例3
18R8及18R5對Wnt傳訊之抑制
抗FZD IgG抗體18R8及18R5阻斷Wnt傳訊途徑活化之能力係利用螢光素酶受體測定於活體外決定。
STF293細胞被培養於添加抗生素與10% FCS之DMEM中。該STF293細胞係已穩定整合下列之293細胞:(1)包含7套與位於螢火蟲螢光素酶報告基因上游之啟動子連接之TCF結合位之8xTCF Luc報告載體,以測量典型Wnt傳訊量(Gazit et al.,1999,Oncogene 18:5959-66)及(2)作為轉染效率內部對照之水母(Renilla)螢光素酶報告子(威斯康辛州麥迪遜市普羅麥加公司(Promega))。該細胞被加入培養皿中。加入欲被測試之FZD抗體(或無抗體)。該細胞接著在Wnt3A條件培養基存在或不存在下培養,該Wnt3A條件培養基係自穩定表現Wnt3a之L細胞(ATCC CRL-2647)製備,或對照條件培養基來自不過度表現Wnt3A之L細胞(ATCC細胞系CRL-2648)。經隔夜培養後,利用雙螢光素酶測試套組(威斯康辛州麥迪遜市普羅麥加公司)測量螢光素酶之量,該雙螢光素酶測試套組之螢火蟲螢光素酶活性被正常化至水母螢光素酶活性。
18R8及18R5抗體抑制Wnt誘發途徑活化之能力因此被決定。STF293細胞係以不同濃度之18R8或18R5 IgG抗體處理並加入Wnt3A條件培養基。細胞在18小時後利用雙螢光素酶測定套組檢測。結果顯示於圖3。觀察到抗FZD抗體18R5對Wnt3a途徑之TCF傳訊具有較高之抑制作用。
在進一步的試驗中,決定18R8抗體拮抗不同之Wnt配位體傳訊之能力。HEK293細胞係以Wnt1、Wnt2、Wnt2b2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9b及Wnt10b經Fugene 6試劑(羅氏藥廠(Roche))轉染48小時。Wnt3A條件培養基(WNT3ACM)被用來作為活化之陽性對照。STF293細胞被培養於添加抗生素與10%FCS之DMEM中,且經20微克/毫升之18R8抗體或無抗體處理。接著加入Wnt過度表現之HEK293細胞。經過處理18小時後,利用雙螢光素酶測定套組測量螢光素酶之量。該結果係顯示於圖4。抗FZD抗體18R8經顯示可抑制多種Wnt之傳訊,除了Wnt3A之外,包括抑制Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt7A、Wnt7B及Wnt10B。
實施例4
18R8阻斷FZD與Wnt之結合
要檢測18R8阻斷FZD與Wnt結合之能力,將2微升之1.32微克/微升可溶性FZD8-Fc單獨或在18R8 IgG抗體(加入4微升之3.71微克/微升)存在下加入培養基,以與Wnt3A(以20微升之Wnt3A條件培養基加入)結合,該可溶性FZD8-Fc包含Fri結構域(與人IgG1 Fc讀框內連接之FZD8之胺基酸1-157)。該混合物係單獨或在蛋白A瓊脂糖微珠(GE健康醫療產品;20微升之50%於PBS中之溶液)存在下於4℃培養2小時。在培養後,離心移除各樣本中之蛋白A微珠(及任何與該蛋白A微珠複合之蛋白質),並測定上清液誘發8xTCF螢光素酶活性之能力。將該上清液加入穩定表現8xTCF(8套位於螢火蟲螢光素酶報告基因上游之TCF結合結構域)之STF293細胞中以測量典型Wnt傳訊量,且該STF293細胞被培養於添加抗生素及10% FCS之DMEM中。STF293細胞經處理18小時後,利用雙螢光素酶測定套組(威斯康辛州麥迪遜市普羅麥加公司)測量螢光素酶之量。
如圖5所示,Wnt3A加蛋白A誘發以螢光素酶單位(RLU)測量之該報告基因之強烈活化(圖5第1行)。添加Fzd8-fc誘發Wnt3A-Fzd8及該Fc融合蛋白與蛋白A瓊脂糖微珠之間形成複合物,一旦該蛋白A-Wnt3A-Fzd8複合物被離心移除後,該形成之上清液不再能夠活化該報告基因(圖5第2行)。當添加18R8時,此複合物藉由該抗體阻斷Wnt3A與Fzd8之結構域之交互作用而被假設性地瓦解,因為雖然蛋白A-Fzd8-fc複合物隨著可透過彼自身之Fc部分與蛋白A輕易地交互作用之18R8被移除,仍可輕易地被觀察到報告活性,顯示有足夠量之未經複合之Wnt3A(圖5第3行)。18R8亦對存在於STF293細胞上之內源性Fzd發揮作用,因為不經蛋白A移除18R8,則無法顯示Wnt3A活化之回復(圖5第6行)。
圖5之資料顯示,相較於僅有FZD8-Fc存在時所觀察到之活性,18R8 IgG抗體之存在於培養反應中導致保留上清液內之Wnt3A活性。這些結果顯示,18R8阻斷FZD8與Wnt3A結合之能力,且顯示與18R8所辨識之表位結合之抗體能阻斷Wnt-FZD之交互作用。
實施例5
18R8及18R5之表位圖譜
為了識別由18R8 IgG抗體所辨識之FZD表位,進行表位圖譜定位。利用流式細胞法分析細胞表面所表現之FZD以測量抗體結合。利用標準重組技術製備包含CMV啟動子之哺乳動物表現質體載體,該CMV啟動子係位於編碼與FZD8之Fri結構域之N端融合之N端信號序列FLAG表位標籤之多核苷酸上游,該FZD8之Fri結構域轉而與CD4蛋白之跨膜結構域及細胞內結構域融合。此表現建構體允許FZD8 Fri結構域在細胞表面上表現,也允許FLAG表位標籤之表現以監測表現。定點突變誘發接著被用於修飾FZD之胞外結構域內經選擇之胺基酸。以編碼該FZD及該轉染標記GFP之表現載體共轉染HEK293細胞。在轉染後48小時,將細胞收集於懸浮液中並於冰上與抗FZD抗體或對照IgG一起培養以偵測背景抗體結合。細胞經過清洗,用與螢光發色團共軛之抗抗體二次抗體偵測一次抗體。經標記之細胞接著利用流式細胞法分析以測量抗FZD抗體與細胞表面FZD之結合。
以此方式,可識別在FZD胞外結構域內對抗FZD抗體結合而言係為重要之特定胺基酸。當FZD8之胺基酸殘基82-83從PD突變成SQ時,18R8與FZD8之結合幾乎不受影響(圖6)。同樣的,當胺基酸109S被換成109Q時,沒有觀察到對結合之重要影響。在另一方面,當FZD8之殘基70-71從HQ被換成AE時,18R8與細胞上FZD8之結合明顯減低(圖6及圖7)。當胺基酸66-67從GL突變成AA時,或當胺基酸68-69從EV突變成QL時,或當胺基酸126-127從FG突變成NV時,18R8抗體與細胞上FZD8之結合同樣喪失。當特定胺基酸被取代而喪失對FZD之結合時,該FZD之胞外結構域顯示該抗體之專一性辨識位置。因此,抗體18R8被決定與包含FZD8之胺基酸66-71 GLEVHQ(SEQ ID NO:25)及人FZD8之胺基酸124-128 GF之表位結合。此表位區在18R8所結合之人捲曲受體(亦即FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8)中具有高度保守性,但在該等18R8所不結合之人捲曲受體(亦即FZD3、FZD4、FZD6、FZD9或FZD10)中則不具高度保守性。
亦進行比較18R5 IgG及18R8 IgG與細胞上之野生型及突變型FZD8之結合的FACS試驗。這些試驗證實18R8抗體及18R5抗體與FZD8上類似之表位結合(圖7)。
實施例6
識別生物結合位(FZD受體之BBS)
有關抑制Wnt傳訊之抗體的發現以及由該些抗體所結合之FZD蛋白內之表位的發現,使現在已經能夠分析FZD蛋白結構之哪些區域對Wnt傳訊係重要的。為了此項目的,鼠Fzd8之Fri結構域之晶體結構係經檢查。我們識別出18R8及18R5之結合表位係位於該FZD結構之區內,該區之特定功能作用以前未被發現。另外該表位包含2個分開之Fzd表面元件(我們稱為由裂縫所分開之「頂部邊緣」及「底部邊緣」)。在比較10種人捲曲受體時也發現,位於此裂縫底部之胺基酸同一性具有驚人的保守性。包含此裂縫以及由18R8和18R5所結合之「頂部邊緣」及「底部邊緣」之該區已被命名為FZD之生物結合位(BBS)。根據先前報告之鼠FZD8晶體結構之分析(Dann CE et al.,Nature 412(6842)86-90,2001)以及利用軟體程式Pymol進行之分析,圖9顯示的是Fzd Fri結構域之構造圖。左上圖所顯示的是FZD Fri結構域之表面視圖,該包含生物結合位(BBS)之Fzd蛋白之區以白色圓圈表示。被稱為BBS之「頂部邊緣」、「底部邊緣」及「裂縫」之區在圖9下方之不同圖片中各自以較暗之表面顏色強調。圖9右上圖以較暗表面強調的是在10種人Fzd家族成員之9或10者中具保守性之殘基。
實施例7
18R5於活體內抑制腫瘤生長
1
8R5預防Wnt依賴性腫瘤生長
對5至7週齡之NOD/SCID母鼠注射50,000個鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)-WNT1腫瘤衍生性細胞至上右側乳房脂肪墊。基因轉殖(MMTV)-Wnt-1小鼠展現乳房腫瘤發生之個別階段,包括增生、侵入性腺管癌及遠端轉移,因此此小鼠乳癌模型提供Wnt對腫瘤形成及生長之作用分析上之有用工具(Nusse & Varmus(1982)Cell 31:99-109)。來自這些小鼠之腫瘤被解離,且這些經解離之腫瘤細胞用於腫瘤繁殖目的。對乳房脂肪墊注入腫瘤細胞之小鼠進行每週二次之監測。一旦腫瘤可觸摸得到時,每週測量二次腫瘤且利用1/2(axb2
)之公式決定腫瘤體積;其中a=長度,b=寬度。資料被表示為平均值及平均值±S.E.M.。組別平均值係利用學生雙尾、未配對t檢定比較。小於0.05之可能性(p)數值被解讀為具有顯著差異。第19天時,平均腫瘤體積44立方毫米之小鼠被隨機分配至2組,每組各有10隻動物。動物經注射對照抗體或18R5 IgG抗體(10毫克/公斤)。抗體之投予係藉由每週二次注射至腹腔內進行。以抗體18R5治療相較於以對照抗體治療之腫瘤完全阻斷腫瘤生長(圖10;p=0.002)。
18R5與愛萊諾迪肯之組合治療減低OMP-C28異種移植腫瘤生長
在另一實施態樣中,分析抗FZD抗體減低OMP-C28結腸腫瘤異種移植生長之能力。經解離之人OMP-C28細胞(每隻動物10000個)被經皮下注射至6至8週齡NOD/SCID公鼠。每週監測腫瘤生長,一旦腫瘤可觸摸得到時開始測量腫瘤。第24天時,平均腫瘤體積129立方毫米之小鼠被隨機分配至4組,每組各有10隻動物。動物經注射對照抗體或18R5 IgG抗體(10毫克/公斤)或愛萊諾迪肯(7.5毫克/公斤)或18R5與愛萊諾迪肯二者之組合。抗體及愛萊諾迪肯之投予係藉由每週二次注射至腹腔內進行。每週測量二次腫瘤且利用1/2(axb2
)之公式決定腫瘤體積;其中a=長度,b=寬度。資料被表示為平均值及平均值±S.E.M.。組別平均值係利用學生雙尾、未配對t檢定比較。小於0.05之可能性(p)數值被解讀為具有顯著差異。18R5之治療導致減低40%之腫瘤生長,如圖11所示(p=0.02)。另外,18R5及愛萊諾迪肯之治療相較於以愛萊諾迪肯單獨治療導致減低53%之腫瘤生長(p=0.0002相較於愛萊諾迪肯單獨治療)(圖11)。因此,18R5證實在OMP-C28結腸腫瘤模型中以單獨投予以及與愛萊諾迪肯之組合皆具有抗腫瘤生長之活性。
18R5與吉斯他濱之組合治療減低OMP-Pn4異種移植腫瘤生長
在另一實施態樣中,分析抗FZD抗體減低OMP-Pn4胰臟腫瘤異種移植生長之能力。NOD/SCID鼠係購自哈蘭公司(Harlan)(印第安納州印第安納波利),讓小鼠適應數天之後再進行試驗。活體內癌幹細胞驅動胰臟異種移植模型之建立及特徵在先前被描述(Li et al.,Cancer Res.,67:1030-7,2007)。在療效試驗中,OMP-Pn4人胰臟腫瘤細胞被解離成單細胞懸浮液,並重懸於1:1(體積/體積)FACS緩衝液(添加2%熱不活化胎牛血清及20mM Hepes之Hank’s平衡鹽溶液[HBSS])與Matrigel(BD生物科技公司,加州聖荷西市)之混合物中,以含有50000細胞/100微升之25G針筒經皮下注入6至7週齡NOD/SCID公鼠之右腹區域。每週監測腫瘤生長,一旦腫瘤可觸摸得到時開始測量腫瘤。第36天時,平均腫瘤體積達到約120立方毫米,荷腫瘤動物被隨機分組(4組每組9隻動物)。2天後開始治療。動物經注射對照抗體、18R5 IgG抗體(10毫克/公斤)、吉斯他濱(40毫克/公斤)或18R5 IgG抗體與吉斯他濱二者之組合。抗體及/或吉斯他濱之投予係藉由每週一次注射至腹腔內進行。以電子游標尺(海岸工具公司(Coast Tools Company),加州聖里安卓)測量腫瘤生長。每週測量一次腫瘤且利用1/2(axb2
)之公式決定腫瘤體積;其中a=長度(腫瘤之最長軸),b=寬度(腫瘤之最短軸)。若動物體重減輕超過15%則每天測量體重,若動物體重為20%則予以安樂死。資料被表示為平均值±S.E.M.。組別間平均值之差異係利用非參數t檢定分析。多重比較利用單因子變異數分析檢定及事後(posthoc)t檢定比較。p<0.05之差異被認為具有顯著差異。統計分析之軟體為GraphPad Prism4(GraphPad軟體公司,加州聖地牙哥)。在試驗結束時,利用二氧化碳麻醉隨後以頸椎分離法安樂死小鼠。收集腫瘤以進行RNA及組織學分析。剩餘腫瘤被轉移至冷培養基199以處理成單細胞懸浮液以供分析癌幹細胞頻率。
OMP-Pn4異種移植試驗之結果顯示於圖12。以18R5抗體單獨治療在此試驗中不導致顯著減低腫瘤生長。然而,18R5與吉斯他濱之治療相較於吉斯他濱治療導致減低42%腫瘤生長(圖12;p=<0.001相較於吉斯他濱單獨治療)。因此,在OMP-Pn4胰臟腫瘤模型中18R5與吉斯他濱之組合證實具有協同性抗腫瘤生長活性,吉斯他濱為經核准之醫療照護標準化學治療劑。
18R5與太平洋紫杉醇之組合治療減低PE-13乳房腫瘤生長
將10000個PE-13人乳房腫瘤細胞(HER2陰性)注入NOD-SCID鼠,令腫瘤生長22天直到平均體積達到約120立方毫米。該些動物接著被隨機分配至4組,每組有10隻動物,並對動物投予對照抗體、抗FZD 18R5、太平洋紫杉醇(TAXOL)或18R5加上太平洋紫杉醇。圖37顯示投予對照抗體、抗FZD 18R5、太平洋紫杉醇或18R5加太平洋紫杉醇之小鼠的平均腫瘤體積。抗體以10毫克/公斤每週二次經腹腔內投予。太平洋紫杉醇以10毫克/公斤每週一次經腹腔內投予。腫瘤係於圖37所示之天數測量。圖38顯示18R5加太平洋紫杉醇組中個別動物之腫瘤生長。18R5加太平洋紫杉醇治療係經顯示能導致抗腫瘤活性及已建立乳房腫瘤之消退。
實施例8
決定對癌幹細胞頻率影響之測定
限制稀釋測定法(LDA)可被用於檢測FZD結合劑或抗體對實質腫瘤癌幹細胞及包含該癌幹細胞之腫瘤的腫瘤發生性之影響。該測定法可被用於決定癌幹細胞於腫瘤中之頻率,該腫瘤來自以FZD結合抗體或其他劑治療之動物,及比較該頻率與來自對照動物之腫瘤中之癌幹細胞的頻率。
18R5與愛萊諾迪肯之組合治療對OMP-C28腫瘤中之癌幹細胞的影響
在上述OMP-C28異種移植試驗(實施例7)結束時(第48天),收集對照組及治療組之腫瘤。該些腫瘤經處理及解離成單細胞。腫瘤細胞接著與生物素基化小鼠抗體(α小鼠CD45-生物素1:200稀釋及大鼠α小鼠H2Kd-生物素1:100稀釋,BioLegend公司,加州聖地牙哥)於冰上培養30分鐘,隨後添加鏈黴抗生物素蛋白標記之磁珠(Invitrogen公司,加州卡斯白市)以在磁鐵作用下移除小鼠細胞。
在LDA中,懸浮液中之人細胞被收集、計數,且於FACS緩衝液中以適當細胞劑量(5、25及125個細胞)與Matrigel混合成1:1混合液,並經皮下注射至NOD/SCID小鼠(每治療組每細胞劑量10隻動物)。允許腫瘤生長最長達4個月。在所欲之時間點,決定所有注射經抗FZD抗體治療之腫瘤細胞組中具有可偵測腫瘤之小鼠百分比,並與對照組中具有可偵測腫瘤之小鼠百分比比較。舉例來說,以125對照治療之腫瘤細胞注射而具有可偵測腫瘤之小鼠數量係經決定並與以125 FZD抗體治療之腫瘤細胞注射而具有可偵測腫瘤之小鼠數量比較。接著利用L-CalcTM軟體(幹細胞技術公司(Stem Cell Technologies Inc.);可自www.stemcell.com/search/default.asp下載)計算該癌幹細胞頻率。簡言之,根據波氏(Poisson)統計學,若37%之動物無法發生腫瘤,則在該已知數量之注射細胞中正好有1個癌幹細胞存在。
為了分析細胞表面標記,單一腫瘤細胞懸浮液係以抗ESA(拜美達(Biomeda)公司)及抗CD44(BD生物科技)抗體染色,該等抗體直接與螢光發色團共軛。利用細胞活性染料DAPI排除死亡細胞。使用FACS Aria分選儀(貝克狄克森公司(Becton Dickinson))進行流式細胞法。側散射及前散射圖被用於消除細胞團塊。以對照抗體治療之腫瘤分析顯示,有64%之整體腫瘤族群高度表現ESA及CD44二者(圖39)。如圖39所示,該雙陽性族群不受愛萊諾迪肯單獨治療之顯著影響(55%),但以18R5或18R5與愛萊諾迪肯組合之治療減低該雙陽性族群(分別為40%及32%)。
18R5與吉斯他濱之組合治療對OMP-Pn4腫瘤中之癌幹細胞的影響
上述OMP-Pn4異種移植試驗(實施例7)於41天治療結束時,收集對照組及治療組之腫瘤。該些腫瘤經處理及解離成單細胞。腫瘤細胞接著與生物素基化小鼠抗體(α小鼠CD45-生物素1:200稀釋及大鼠α小鼠H2Kd-生物素1:100稀釋,BioLegend公司,加州聖地牙哥)於冰上培養30分鐘,隨後添加鏈黴抗生物素蛋白標記之磁珠(Invitrogen公司,加州卡斯白市)以移除小鼠細胞。在懸浮液中之剩餘人細胞被收集,計數及稀釋至適當細胞劑量(30、90、270及810個細胞),於1:1(體積/體積)FACS緩衝液及Matrigel之混合液中混合,並經皮下注射至NOD/SCID小鼠(每治療組每細胞劑量10隻動物)。如圖40所示,允許腫瘤生長75天。圖40中之各點代表個別小鼠之腫瘤體積。決定所有注射經抗FZD抗體治療之腫瘤細胞組中具有可偵測腫瘤之小鼠百分比,並與對照組中具有可偵測腫瘤之小鼠百分比比較。舉例來說,以810對照治療之腫瘤細胞注射而具有可偵測腫瘤之小鼠數量係經決定並與以810 FZD抗體治療之腫瘤細胞注射而具有可偵測腫瘤之小鼠數量比較。該腫瘤生長頻率被用於利用L-CalcTM軟體以計算該癌幹細胞頻率。各治療組中該經計算之癌幹細胞頻率係顯示於圖41。以18R5單獨治療及18R5與吉斯他濱組合治療減低癌幹細胞頻率,然而以吉斯他濱單獨治療不具效應。
實施例9
FZD抗體之產製
抗原產製
人FZD受體(FZD)之胞外結構域(ECD)或Fri結構域(Fri)之重組多肽片段係經產製以作為抗體產製之抗原。標準重組DNA技術係用於分離編碼該所欲人捲曲受體或多種受體之該些結構域之胺基酸的多核苷酸。這些多核苷酸係與人Fc-tag或組胺酸-tag之N端以讀框內連接,且被選殖至轉移質體載體以供昆蟲細胞中之桿狀病毒媒介表現。標準轉染、感染及細胞培養方法被用於產製表現該對應FZD多肽之重組昆蟲細胞(O’Reilley et al.,Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual,Oxford: Oxford University Press(1994))。
抗原蛋白係利用蛋白A及鎳離子螯合親和性管柱自昆蟲細胞條件培養基中純化。經純化之抗原蛋白對PBS(pH=7)透析,經濃縮至約1毫克/毫升,且經無菌過濾以供免疫接種使用。
免疫接種
利用標準技術以經純化之FZD抗原蛋白對小鼠進行免疫接種。在初次免疫接種後約70天,利用ELISA及FACS分析(於下詳細描述)篩選來自個別小鼠之血液的抗原辨識性。選擇具有最高抗體力價之2隻動物以進行最終抗原補強注射,之後分離脾臟細胞以產製雜交瘤。將雜交瘤細胞以每孔1個細胞種入96孔盤,來自各孔之上清液藉ELISA及FACS分析以篩選抗原蛋白。數個具有高抗體力價之雜交瘤被選擇,並於靜置角瓶培養中按比例增量。利用蛋白A或蛋白G洋菜糖層析法,自雜交瘤之上清液純化抗體。經純化之抗體以FACS再次測試,並經分型以選擇IgG及IgM抗體。
表位圖譜
為了識別能辨識FZD胞外結構域之特定區域包括富含半胱胺酸結構域之抗體,進行表位圖譜定位。利用標準重組DNA技術製備包含CMV啟動子之哺乳動物表現質體載體,該CMV啟動子係位於編碼該胞外FZD結構域片段之多核苷酸上游。接著以暫時轉染法於經培養之哺乳動物細胞中表現重組蛋白。轉染後24至48小時收集細胞,在SDS-PAGE丙烯醯胺膠體上分離細胞溶解物蛋白以進行西方墨漬分析,使用來自FZD抗原免疫之小鼠的抗體。辨識FZD之配位體結合結構域之抗體可進一步以ELISA分析與Wnt蛋白之競爭結合。
為了識別拮抗FZD抗體所辨識之胞外結構域內之專一性表位,使用SPOT系統(Sigma Genosys公司,德州伍德蘭茲市)。一系列有1個胺基酸重疊且覆蓋整個FZD胞外結構域之10殘基線性肽被合成且藉由SPOT合成技術被共價結合至纖維素膜。該膜於室溫中以封閉緩衝液預培養8小時,於4℃以抗體雜交隔夜。接著清洗該膜,以辣根過氧化酶(HRP)共軛之二次抗體培養(安森生物科技(Amersham Bioscience),紐澤西州皮斯卡塔威),再次清洗,以包含3-胺基-9-乙基咔唑之信號顯色溶液檢視。由抗體所辨識之專一性表位因此被決定。
FACS分析
為了選擇可辨識天然細胞表面FZD蛋白之由雜交瘤細胞株所產製之單株抗體,使用FACS分析。HEK293細胞以編碼該對應FZD之全長cDNA殖株之表現載體單獨轉染或與表現GFP之載體共轉染。Flag表位標籤可被導入胺基端,其允許驗證在細胞表面上標籤FZD受體之表現。在轉染後24至48小時,將細胞收集於懸浮液中並於冰上與抗FZD抗體、FLAG抗體、免疫血清(FZD5表現細胞)或對照IgG一起培養以偵測背景抗體結合。細胞經過清洗,用與螢光發色團共軛之抗小鼠二次抗體偵測一次抗體。經標記之細胞接著利用FACS分選以識別專一性辨識細胞表面表現之對應FZD受體之抗FZD抗體。辨識該所欲人捲曲受體之抗體被識別。
嵌合抗體
當專一性辨識FZD受體之單株抗體被識別後,該些抗體係經修飾以克服人抗鼠抗體(HAMA)免疫反應,其發生在齧齒動物抗體被用來作為治療劑時。經選擇之單株抗體之重鏈及輕鏈之可變區係利用RT-PCR自雜交瘤細胞分離,並分別與多個哺乳動物表現載體中之人IgG1重鏈及κ輕鏈恆定區以讀框內連接。可選擇的是使用人Ig表現載體諸如TCAE 5.3,其在相同質體上包含該人IgG1重鏈及κ輕鏈恆定區(Preston et al.,1998,Infection & Immunity 66:4137-42)。編碼嵌合重鏈及輕鏈之表現載體接著被共轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞以產製嵌合抗體。嵌合抗體之免疫反應性及親和性係利用ELISA及FACS與母體鼠抗體比較。
人化抗體
由於嵌合抗體治療仍常有抗原性,產生人抗嵌合抗體(HACA)免疫反應,拮抗FZD受體之嵌合抗體可進行進一步人化。要產製人化抗體,該抗體之專一性決定模體(motifs)之重要態樣可能包括來自3個超變異短序列或補體決定區(CDR)及/或正確放置該抗體重鏈及輕鏈可變結構域之上述CDR區所需之骨架區二者之元件係利用重組DNA技術被分別工程化至人重鏈及輕鏈抗體基因之生殖細胞DNA序列中,接著被選殖至哺乳動物表現載體以於CHO細胞中表現。該人化抗體之免疫反應性及親和性係利用ELISA及FACS與母體嵌合抗體比較。此外,可變區之定點或高密度突變可被用於最佳化該人化抗體之專一性、親和性等。
人抗體
在一些實施態樣中,專一性辨識FZD受體之胞外結構域的人抗體係利用噬菌體展示技術分離。包含展示為單鏈Fv或為fab結構域之人抗體可變結構域的噬菌體展示抗體文庫係經篩選對上述FZD受體抗原之專一性及高親和性辨識。該經識別之可變結構域抗體序列接著被重建(reformatted)至包含人IgG1重鏈及κ輕鏈之Ig表現載體以於CHO細胞中表現人抗體。
實施例10
產製辨識特定表位之抗體
來自雜交瘤之單株抗體
在特定實施態樣中,辨識FZD受體之功能性表位的抗體係藉由以一或多種FZD受體抗原免疫接種小鼠產製。使用標準技術以純化之FZD抗原蛋白對小鼠免疫接種。在特定實施態樣中,以不同之FZD受體抗原對小鼠連續免疫接種。來自個別小鼠之血液係於初次免疫接種後約70天被篩選。選擇對FZD抗原具有高抗體力價之動物以進行最終抗原補強注射,之後分離脾臟細胞以產製雜交瘤。將雜交瘤細胞以每孔1個細胞種入96孔盤,來自各孔之上清液經ELISA及流式細胞分析之篩選。為了識別能辨識專一性表位之單株抗體,包括在生物結合位(BBS)以內或與之重疊之表位,該雜交瘤上清液係篩選與該所欲FZD結合但無法與在該所欲之專一性表位(例如BBS)內具有特定胺基酸取代之FZD結合之抗體。
人抗體
噬菌體展示庫可被用於識別能辨識FZD受體之所欲表位的抗體(例如多種FZD共用之表位及/或在BBS或彼之部分以內或與BBS或彼之部分重疊之表位)。舉例來說,經選擇之FZD的Fri結構域係以重組蛋白表現且以10微克/毫升塗佈在適當表面上。人噬菌體文庫接著經過2個或超過2個回合富集之淘選(參見例如Griffiths et al.,EMBO J. 12:715-34)。可隨意選擇的是,後續回合之淘洗可利用不同FZD蛋白進行。可隨意選擇的是,各回合之淘洗可在誘餌可溶性FZD蛋白存在下進行,該誘餌可溶性FZD蛋白包含在所欲標靶表位區內之特定胺基酸取代(例如包括在生物結合位(BBS)以內之表位)。來自淘選選擇之產出物的個別菌株接著藉由ELISA或流式細胞分析以篩選與所欲FZD蛋白結合之能力,且與所欲表位結合係藉由缺乏與包含在所欲標靶表位內之特定胺基酸取代的FZD蛋白結合而評估。編碼抗原結合結構域之基因接著可自噬菌體被取回且藉由連接抗原結合結構域與恆定區以於適當之宿主細胞系中表現以用於建構完整的人抗體分子。如本發明他處所述,抗體被識別及測試其預防腫瘤細胞生長之能力。
實施例11
評估拮抗FZD受體之抗體的額外活體外測試
此實施例描述多種代表性活體外測試,以測試拮抗FZD受體所產製之抗體對細胞增生、途徑活化及細胞毒性之活性。
增生測定
不同癌細胞系之FZD受體表現係利用Taqman分析定量。被識別為表現FZD受體之細胞系以每孔104細胞之密度被接種於96孔組織培養微孔盤,允許其擴散24小時。之後使細胞於含有2% FCS之新鮮DMEM中再培養12小時,此時在10μmol/L BrdU存在下於培養基中加入抗FZD抗體與對照抗體。在經BrdU標示後,移除培養基,使細胞在室溫中用乙醇固定30分鐘,與過氧化酶共軛單株抗BrdU抗體(BMG 6H8株,Fab片段)反應90分鐘。該受質於包含四甲基聯苯胺之溶液中顯色,15分鐘後以25微升之1mol/L H2
SO4
終止。以自動ELISA孔盤讀取器,使用450奈米濾鏡測量顏色反應(UV微盤讀取器;Bio-Rad實驗室,加州里查蒙市)。所有試驗進行三次。抗FZD抗體相較於對照抗體抑制細胞增生之能力被決定。
途徑活化測定
在特定實施態樣中,拮抗FZD受體抗體阻斷Wnt傳訊途徑活化之能力係於活體外決定。舉例來說,於添加抗生素及10% FCS之DMEM中培養之HEK293細胞係與下列共轉染:1)Wnt7B及FZD10表現載體以活化Wnt傳訊途徑;2)在螢火蟲螢光素酶報告基因上游包含3套或8套TCF結合結構域之TCF/Luc野生型或突變報告載體以測量典型Wnt傳訊量(Gazit et al.,1999,Oncogene 18:5959-66);及3)作為轉染效率內部對照之水母螢光素酶報告子(威斯康辛州麥迪遜市普羅麥加公司)。抗FZD10及對照抗體接著被加入細胞培養基。轉染48小時後,利用雙螢光素酶測試套組(威斯康辛州麥迪遜市普羅麥加公司)測量螢光素酶之量,該螢火蟲螢光素酶活性被正常化至水母螢光素酶活性。三個獨立試驗被進行三次。FZD抗體抑制Wnt途徑活化之能力因此被決定。
補體依賴性細胞毒性測定
在特定實施態樣中,表現FZD受體之癌細胞系或分離自以異種移植繼代於免疫不全小鼠之病患樣本的癌幹細胞被用於測量由拮抗FZD受體之抗體所媒介之補體依賴性細胞毒性(CDC)。細胞以106細胞/毫升被重懸於添加抗生素及5% FBS之200微升RPMI 1640培養基。重懸細胞接著與200微升血清或熱不活化血清及拮抗FZD受體之抗體或對照抗體混合成三份。細胞混合物於37℃、5% CO2
中培養1至4小時。經處理之細胞接著被收集、重懸於100微升以培養基稀釋之FITC標記磷脂結合蛋白(annexin)V,並於室溫中培養10分鐘。加入100微升以HBSS稀釋之碘化丙啶溶液(25微克/毫升),於室溫中培養5分鐘。細胞經收集、重懸於培養基並以流式細胞法分析。FITC染色細胞之流式細胞法提供總細胞數,以總細胞數之百分比表示之由死亡細胞吸收之碘化丙啶被用於測量在血清及拮抗FZD之抗體相較於熱不活化血清及對照抗體存在時之細胞死亡。抗FZD抗體媒介補體依賴性細胞毒性之能力因此被決定。
抗體依賴性細胞性細胞毒性測定
表現FZD受體之癌細胞系或分離自以異種移植繼代於免疫不全小鼠之病患樣本的癌幹細胞可被用於測量由拮抗FZD受體之抗體所媒介之抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)。細胞以106細胞/毫升被重懸於添加抗生素及5% FBS之200微升無酚紅RPMI 1640培養基。以Ficoll-Paque密度梯度離心法自肝素化週邊血液分離之週邊血液單核細胞(PBMC)被用來作為效應細胞。接著將目標細胞(T)與PBMC效應細胞(E)以E/T比25:1、10:1及5:1混合於有至少一種FZD受體抗體或對照抗體存在之96孔盤。對照組包括在抗體存在時單獨培養目標細胞及單獨培養效應細胞。細胞混合物於37℃、5% CO2
中培養1至6小時。經釋放之乳酸去氫酶(LDH)(一種當細胞溶解時被釋放之安定細胞溶質酵素)接著以比色測定法測量(CytoTox96非放射活性細胞毒性測定法;威斯康辛州麥迪遜市普羅麥加公司)。以標準96孔盤讀取器收集490奈米之吸收度資料,背景經過校正。特定細胞毒性之百分比係根據公式計算:細胞毒性%=100x(實驗性LDH釋放-效應細胞自發性LDH釋放-目標細胞自發性LDH釋放)/(目標細胞最高LDH釋放-目標自發性LDH釋放)。拮抗FZD受體抗體媒介抗體依賴性細胞性細胞毒性之能力因此被決定。
實施例12
於活體內使用抗FZD受體抗體以預防腫瘤生長
此實施例描述使用抗FZD受體抗體以預防異種移植模型中之腫瘤生長。在特定實施態樣中,來自以異種移植繼代於小鼠之病患樣本(實質腫瘤活體檢查或胸膜滲出液)的腫瘤細胞被製備以再繼代於實驗動物。腫瘤組織在無菌條件下移除,切成小塊,利用無菌刀片完全切碎,並以酵素消化及機械破碎得到單細胞懸浮液。具體地說,胸膜滲出液細胞或所形成之腫瘤碎片與極純之膠原酶III於培養基中混合(每毫升200-250單位之膠原酶),於37℃培養3至4小時,每15至20分鐘以10毫升吸注管上下吸注以均勻混合。經消化之細胞經45微米之尼龍網目過濾,以RPMI/20% FBS清洗,並以HBSS清洗二次。經解離之腫瘤細胞接著經皮下注射至NOD/SCID鼠之乳房脂肪墊以誘發腫瘤生長。
在特定實施態樣中,經解離之腫瘤細胞在被注入實驗動物之前,首先根據細胞表面標記被分選成腫瘤發生及非腫瘤發生細胞。具體地說,如上述解離之腫瘤細胞用包含2%熱不活化胎牛血清(HICS)之Hepes緩衝鹽水溶液(HBSS)清洗二次並以每100微升106細胞被重懸。加入抗體,令細胞於冰上培養20分鐘,隨後以HBSS/2% HICS清洗二次。抗體包括抗ESA(加州福斯特市拜美達公司)、抗CD44、抗CD24及細胞系標記抗CD2、抗CD3、抗CD10、抗CD16、抗CD18、抗CD31、抗CD64及抗CD140b(統稱為Lin;加州聖荷西市法美基公司(PharMingen))。抗體直接與螢光發色團共軛以陽性或陰性篩選表現該等標記之細胞。藉由篩選H2Kd+細胞以清除鼠細胞,死亡細胞則利用細胞活性染料7AAD清除。流式細胞法係於FACSVantage分選儀(紐澤西州富蘭克林湖貝克狄克森公司)進行。側散射及前散射圖被用於消除細胞團塊。經分離之ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-腫瘤發生細胞接著經皮下被注入NOD/SCID小鼠以誘發腫瘤生長。
舉例來說,抗FZD抗體係經分析彼之減低腫瘤細胞生長之能力。經解離之腫瘤細胞(每隻動物10000個)經皮下注射至6至8週齡NOD/SCID小鼠之腹脇區域。腫瘤細胞注射2天後,動物經腹腔內(ip)注射10毫克/公斤之任一抗FZD抗體每週二次。每週監測腫瘤生長直到生長可被偵測得到,之後每週測量二次腫瘤生長共8週。相較於PBS注射對照組,能顯著減低腫瘤生長之FZD結合抗體因此被識別。
實施例13
於活體內使用抗FZD受體抗體以治療腫瘤
此實施例描述使用抗FZD受體抗體以治療異種移植模型中之癌症。在特定實施態樣中,來自以異種移植繼代於小鼠之病患樣本(實質腫瘤活體檢查或胸膜滲出液)的腫瘤細胞被製備以再繼代於實驗動物。腫瘤組織係經移除,切成小塊,利用無菌刀片完全切碎,並以酵素消化及機械破碎得到單細胞懸浮液。經解離之腫瘤細胞接著經皮下注射至NOD/SCID鼠以誘發腫瘤生長,在乳房腫瘤之例被注射至乳房脂肪墊,或在非乳房腫瘤之例被注射至腹脇區域。可選擇的是,ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-腫瘤發生腫瘤細胞如上述被分離及注射。
在腫瘤細胞注射之後,監測動物之腫瘤生長。一旦腫瘤達到約150至200毫米之平均體積,即開始抗體治療。每隻動物接受100微克FZD受體抗體或對照抗體腹腔內注射每週2至5次,總共6週。在這6週期間,每週檢測2次腫瘤體積。FZD受體抗體相較於對照抗體防止進一步腫瘤生長或減低腫瘤體積之能力因此被決定。
在抗體治療結束時,收集腫瘤以供進一步分析。在一些實施態樣中,一部分之腫瘤係經免疫螢光分析以檢測抗體之穿透腫瘤及腫瘤反應。一部分收集自抗FZD受體治療及對照抗體治療小鼠之各種腫瘤被以液態氮新鮮冷凍,經O.C.T.包埋,在冷凍切片機上切成黏附在玻片上之10微米切片。在一些實施態樣中,一部分之各種腫瘤係經福馬林固定、石蠟包埋,並在切片機上切成黏附在玻片上之10微米切片。切片經後固定並與專一性辨識注射抗體之發色團標記抗體一起培養,以偵測存在於腫瘤活體檢查中之抗FZD受體或對照抗體。另外,偵測不同腫瘤及腫瘤吸引細胞種類之抗體可被用於檢測抗體治療對於例如血管生成、腫瘤生長及腫瘤形態學之效果,諸如舉例來說偵測血管內皮細胞之抗VE鈣黏著素(CD144)或抗PECAM-1(CD31)抗體、偵測血管平滑肌細胞之抗平滑肌α-肌動蛋白抗體、偵測增生細胞之抗Ki67抗體、偵測瀕死細胞之TUNEL測定、偵測Wnt傳訊之抗β連鎖蛋白抗體及偵測刻痕傳訊之抗細胞內結構域(ICD)刻痕片段抗體。
在特定實施態樣中,抗FZD受體抗體治療對腫瘤細胞基因表現之效果亦被檢測。總RNA係自一部分收集自FZD抗體治療及對照抗體治療小鼠之各種腫瘤抽取,且用於進行定量RT-PCR。FZD受體、Wnt傳訊途徑之成分包括例如Wnt1及β連鎖蛋白以及額外之先前被識別之癌幹細胞標記(例如CD44)相對於作為內部對照之管家基因GAPDH之表現量被分析。FZD受體抗體治療時腫瘤細胞基因表現之改變因此被決定。
此外,抗FZD受體抗體治療對腫瘤中癌幹細胞頻率之效果被檢測。來自FZD與對照抗體治療小鼠之腫瘤樣本被切成小塊,利用無菌刀片完全切碎,並以酵素消化及機械破碎得到單細胞懸浮液。經解離之腫瘤細胞接著根據如上詳述之ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表面細胞標記之表現,利用FACS分析以檢測腫瘤發生癌幹細胞之存在。
在抗FZD抗體治療後,根據ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表現所分離之細胞的腫瘤發生性可接著被檢測。自FZD抗體治療與對照抗體治療小鼠分離之ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-癌幹細胞經皮下被再注入NOD/SCID小鼠之乳房脂肪墊。根據持續腫瘤形成所需之注射細胞數量所定義之癌幹細胞之腫瘤發生性接著被決定。
實施例14
識別Wnt基因簽署
進行試驗以識別一組其表現對人結腸腫瘤中之Wnt傳訊途徑活化具特異性之基因。
軸蛋白(axin)過度表現所中止之腫瘤生長
軸蛋白是典型Wnt途徑之重要調節因子。它是引發β-連鎖蛋白降解之多蛋白複合物之一部分,因此使該途徑在缺乏Wnt時維持緘默。此效應被Wnt所逆轉,Wnt自該摧毀複合物移除軸蛋白,使β-連鎖蛋白得以被轉位及允許TCF媒介性特定目標基因之活化。外源性軸蛋白過度表現及表現顯性陰性截短形式之TCF(DNTCF4)代表廣為週知之阻斷Wnt傳訊途徑之方法。
我們顯示慢病毒(lentivirus)媒介性軸蛋白過度表現完全中止UM-PE13及UM-T3乳房腫瘤之生長,以及NOD/SCID小鼠中OMP-C11及OMP-C17結腸腫瘤之生長。在UM-T3腫瘤細胞中穩定表現之DNTCF4具有相同效果。總結來說,這些資料證實細胞內Wnt阻斷可負向影響不同腫瘤種類之發展,因此支持Wnt途徑係為乳癌及直腸癌治療之重要目標。
Wnt傳訊途徑在許多腫瘤種類中被構成性地活化。在大部分結腸腫瘤中,此活化係因APC之截短突變或β-連鎖蛋白之活化突變所致。該些突變未曾在其他組織中被報告,其中Wnt傳訊途徑可透過其他組突變或自體分泌機制被活化。在該些Wnt傳訊途徑對自體分泌刺激維持應答性之腫瘤中,利用細胞外方法諸如抗體或其他可溶性蛋白質抑制劑阻斷該途徑應為可行及對腫瘤發展有影響。識別該些Wnt依賴性腫瘤有助於發展抗Wnt劑及定義為臨床目標之腫瘤類型。
免疫組織化學資料顯示,大部分OMP-C11腫瘤細胞表現高量之細胞質/細胞核β-連鎖蛋白,顯示Wnt傳訊途徑在此腫瘤類型中係被構成性地活化。這可由在OMP-C11中藉由西方墨漬法偵測高量之β-連鎖蛋白加以證實。Wnt途徑活化及對軸蛋白過度表現之敏感性之組合使得OMP-C11成為硏究因應Wnt及Wnt阻斷之基因表現調節之良好腫瘤,且自OMP-C11衍生出Wnt基因簽署。
微陣列分析因應軸蛋白過度表現之差異化基因表現
以軸蛋白治療OMP-C11結腸腫瘤細胞時之差異化基因表現係由微陣列分析決定。
自NOD/SCID小鼠(異種移植腫瘤模型)新鮮移除之人結腸OMP-C11腫瘤係用來作為結腸腫瘤細胞之來源。二個慢病毒載體被製備以遞送分別被稱為LOM91及LOM92之構成性軸蛋白-IRES-GFP表現卡匣及對照性IRES-GFP表現卡匣。
OMP-C11腫瘤係經處理為單細胞懸浮液,並將小鼠譜系細胞清除。該譜系清除細胞以2.5之感染複數感染LOM91(軸蛋白)或92(對照)慢病毒載體,維持培養3至4天,並以GFP表現分選。總RNA係自各分選細胞之樣本抽取。該RNA係於GeneChip人基因組U133 Plus 2.0微陣列(加州聖克拉拉艾菲曼曲公司)上分析。該試驗重複二次。
包含由Wnt途徑所調節之核心基因組的基因簽署係藉由分析多個基因產製,該些基因在軸蛋白治療後差異化表現且在正常及惡性結腸腫瘤樣本盤中亦展現軸蛋白2表現之相關性。基因係由軸蛋白微陣列試驗(上述)識別,該試驗因應軸蛋白過度表現而顯示下調基因。此選擇之界限值係軸蛋白1過度表現樣本相較於對照樣本下調50%或更多(軸蛋白1過度表現樣本與對照樣本之對數2(log2)之比必須為-1或更小),且T檢定p值小於0.1。由於軸蛋白1係已知之Wnt途徑抑制劑,軸蛋白1過度表現所媒介之基因下調將是直接或間接之Wnt途徑目標。此選擇接著藉由識別該些在一組結腸/小腸/其他消化組織惡性腫瘤樣本(232個樣本)中與軸蛋白2顯示高度相關性(相關值>0.3)之基因而被進一步改進。由於軸蛋白2係已知之Wnt目標,顯示與軸蛋白2類似表現模式之基因亦將可能是Wnt目標。此分析產生Wnt途徑活性之基因簽署(表6)。在此簽署中之基因的表現量可被用於評估個別腫瘤樣本或不同類型之腫瘤是否顯示Wnt途徑傳訊改變之證據。
實
施例15
使用抗FZD受體抗體以治療人癌症
此實施例描述利用拮抗FZD受體之抗體以將包含癌幹細胞及/或腫瘤細胞之腫瘤作為標靶以治療癌症之方法,其中FZD受體表現已被偵測及/或具有Wnt基因簽署之腫瘤細胞顯示它們對Wnt傳訊抑制有反應(例如實施例14之Wnt基因簽署)。
癌幹細胞標記或FZD受體之存在或Wnt基因簽署中一或多個基因之表現可先自腫瘤活體檢查中決定。來自被診斷為癌病患之活體檢查之腫瘤細胞在無菌條件下移除。在一些實施態樣中,該組織活體檢查樣本以液態氮新鮮冷凍,經O.C.T.包埋,在冷凍切片機上切成黏附在玻片上之10微米切片。在一些實施態樣中,該組織活體檢查樣本係經福馬林固定、石蠟包埋,並在切片機上切成黏附在玻片上之10微米切片。
切片與拮抗FZD受體之抗體一起培養以偵測FZD蛋白表現。可選擇的是,切片可經分析實施例14所述之Wnt基因簽署中一或多個基因之存在。
癌幹細胞之存在亦可被決定。組織活體檢查樣本被切成小塊,利用無菌刀片完全切碎,並以酵素消化及機械破碎得到單細胞懸浮液。經解離之腫瘤細胞接著與抗ESA、抗CD44、抗CD24、抗Lin及抗FZD抗體一起培養以偵測癌幹細胞,ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-、FZD+腫瘤幹細胞之存在係由如上詳述之流式細胞法決定。
腫瘤被診斷為表現FZD受體及/或Wnt基因簽署中一或多個基因之癌病患係以抗FZD受體抗體治療。在特定實施態樣中,如上述產製之人化或人單株抗FZD受體抗體係經純化及與適當之醫藥載具調製以供注射。在一些實施態樣中,病患係以FZD抗體治療一個月至少一次共至少10週。在一些實施態樣中,病患係以FZD抗體治療一週至少一次共至少約14週。每次投予抗體應為醫藥上有效之劑量。在一些實施態樣中,投予介於約2至約100毫克/毫升之抗FZD抗體。在一些實施態樣中,投予介於約5至約40毫克/毫升之抗FZD抗體。該抗體可在標準放射治療或化學治療之前、同時或之後投予,該化學治療使用一或多種化學治療劑,諸如草酸鉑(oxaliplatin)、氟尿嘧啶、菊白葉酸(leucovorin)或鏈脲佐菌素。監測病患以決定該治療是否導致抗腫瘤反應,舉例來說根據腫瘤消退、新腫瘤之發生率降低、較低之腫瘤抗原表現、癌幹細胞之數量減少或其他評估疾病癒後之方法。
實施例16
胰臟腫瘤細胞在以18R5及吉斯他濱治療後之分化
經治療之胰臟腫瘤細胞的定量PCR(Q-PCR)基因表現分析
如上述(實施例7)經對照抗體、18R5 IgG抗體、吉斯他濱或吉斯他濱與18R5 IgG抗體之組合治療之PN4異種移植腫瘤係以定量PCR分析嗜鉻粒蛋白A(CHGA)之表現。CHGA係廣為週知之多種腫瘤之神經內分泌分化標記,包括乳房腫瘤、結腸腫瘤、肺臟腫瘤及胰臟腫瘤,且在胰臟腫瘤中CHGA之表現增加已被發現與改善存活率有關(Tezel et al. 2000. Cancer 89,2230-6)。
總RNA係自PN4異種移植試驗中各組之5個腫瘤製備,並根據標準程序使用應用生物系統公司(Applied Biosystems)Taqman目錄探針以單一步驟逆轉錄(RT)PCR評估。該用於CHGA分析之探針引子組(Hs00154441_m1)包括FAM染料標記探針及下列引子:5’-CGCTCTCCAAGGCGCCAAGGAGAGG-3’(SEQ ID NO:75)。Gus B被用來作為內部對照。簡言之,RT係於48℃進行30分鐘,於95℃初步變性10分鐘,隨後為40個循環之95℃變性15秒及60℃延伸1分鐘,且螢光探針之放大/納入可被即時觀察。
胰島β細胞標記CHGA只有在以吉斯他濱與18R5組合治療之小鼠樣本中被評估為顯著增加。來自對照抗體、18R5及吉斯他濱單獨治療組之腫瘤表現類似量之CHGA RNA,然而組合治療組之腫瘤顯示CHGA表現之明顯增加。在二個試驗中以18R5與吉斯他濱組合治療之腫瘤的CHGA量增加10倍及7倍。代表性試驗之結果顯示於圖42。
經治療之胰臟腫瘤細胞的免疫組織化學基因表現分析
CHGA之表現增加亦可藉由免疫組織化學法在組織切片之蛋白質量上觀察到,該組織切片係自經治療之腫瘤製備(資料未顯示)。對照抗體治療之腫瘤顯示分散腫瘤各處之小量亞群細胞有強陽性染色反應。單獨18R5或單獨吉斯他濱治療之腫瘤表現與對照組類似量之CHGA。相反的,以18R5和吉斯他濱組合治療之腫瘤顯示CHGA陽性細胞數量增加,與Q-PCR所偵測之RNA表現增加一致。
以
阿爾新藍及ki67抗體染色
內分泌、分泌性或腺管細胞之另一特徵係產生黏液素,且該些細胞可藉由阿爾新藍染色偵測(van Es et al. 2005. Nature 435 959-63)。在收集與處理腫瘤時可觀察到,經18R5治療之腫瘤遠較對照治療腫瘤具有黏性。因此,來自對照抗體、單獨吉斯他濱、單獨18R5、或18R5加吉斯他濱治療小鼠之PN4腫瘤切片係以阿爾新藍染色。18R5治療腫瘤在單獨18R5及18R5加吉斯他濱兩組相較於對照組及單獨吉斯他濱組均顯示阿爾新藍染色明顯增加(資料未顯示)。
以18R5或對照抗體治療後,黏液性細胞增加亦可在第二胰臟腫瘤細胞系PN13中被觀察到(圖43)。在此試驗中,荷PN13腫瘤小鼠係如上述被治療(實施例7)。腫瘤切片以阿爾新藍染色以顯示黏液性細胞,亦以ki67抗體進行免疫組織化學染色以顯示進行增生之細胞。結果顯示18R5治療導致阿爾新藍陽性黏液性細胞數量大量增加。此外,ki67陽性細胞之頻率被18R5治療減少。有趣的是,在黏液性細胞與ki67陽性細胞之間並無重疊,顯示該黏液性細胞並不增生。此提供18R5治療係促進腫瘤細胞分化成非增生性子代細胞之證據。
總結來說,CHGA之表現增加、阿爾新藍染色顯示之黏液素產生增加及ki67抗體染色顯示之非增生性子代之產生係與18R5治療抑制Wnt-FZD傳訊而促進胰臟腫瘤細胞分化成多種具有非增生性分化細胞特徵之不同細胞種類之模型一致。
實施例17
單獨使用18R5及/或與其他抗癌劑組合之額外活體內療效試驗
對OMP-LU24異種移植腫瘤生長之效果
單獨或與Taxol(太平洋紫杉醇)組合使用之抗FZD抗體18R5抑制OMP-LU24人肺臟腫瘤於活體內生長之療效係經評估。
50000個OMP-LU24人肺臟腫瘤細胞被經皮下注射至NOD/SCID小鼠。允許腫瘤生長27天,直到腫瘤平均體積達到143立方毫米。動物被隨機分配至4組(每組n=9),並以對照抗體(「對照抗體」)、抗FZD 18R5(「18R5」)、Taxol(「Taxol」)或18R5加Taxol之組合(「18R5+Taxol」)治療。腫瘤測量係於圖44所示之天數進行。抗體以10毫克/公斤每週一次經腹腔內(IP)投予,Taxol以15毫克/公斤每週一次經腹腔內投予。
結果係顯示於圖44。抗FZD治療被發現可減低腫瘤生長,該組合治療相較於單獨Taxol顯示增進之抗腫瘤活性。
對OMP
-LU33異種移植腫瘤生長之效果
單獨或與Avastin(貝伐單抗(bevacizumab))組合使用之抗FZD抗體18R5抑制OMP-LU33人肺臟腫瘤於活體內生長之療效亦經評估。
10000個OMP-LU33人肺臟腫瘤細胞被經皮下注射至NOD-SCID小鼠。允許腫瘤生長30天,直到腫瘤平均體積達到124立方毫米。動物被隨機分配至4組(每組n=10),並以對照抗體(方形)、Avastin(倒三角形)、抗FZD 18R5(三角形)或18R5加Avastin之組合(圓形)治療。腫瘤測量係於圖45所示之天數進行。抗體以10毫克/公斤每週二次經腹腔內投予。
結果係顯示於圖45。抗FZD治療被發現可減低腫瘤生長,該組合治療相較於單獨Avastin顯示增進之抗腫瘤活性。
對T3異種移植腫瘤生長之效果
單獨或與賀癌平(Herceptin)(曲妥珠單抗(trastuzumab))組合使用之抗FZD抗體18R5抑制T3人HER2陽性乳房腫瘤於活體內生長之療效亦經評估。
50000個T3人乳房腫瘤細胞被經皮下注射至NOD-SCID小鼠。允許腫瘤生長32天,直到腫瘤平均體積達到125立方毫米。動物被隨機分配至4組(每組n=10),並以對照抗體(方形)、抗FZD 18R5(三角形)、賀癌平(小實心圓)或18R5加賀癌平之組合(空心圓)治療。腫瘤測量係於圖46所示之天數進行。抗體以10毫克/公斤每週二次經腹腔內投予。
結果係顯示於圖46。18R5與賀癌平之組合治療相較於單獨賀癌平顯示增進之抗腫瘤活性。
實施例18
抗FZD抗體序列
若干示範性抗FZD抗體之重鏈及輕鏈CDR分別提供於下表7及8。抗FZD抗體之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)及彼等之編碼序列係列示於下表9。表9所列之VH及VL之胺基酸及多核苷酸序列係提供於圖13至15或下表10及11。編碼抗FZD抗體之重鏈或輕鏈之序列係提供於圖14至15或下表12。
自大腸桿菌(E. coli
)分離之編碼抗FZD抗體18R4605(寄存編號PTA-10307)、18R4805(寄存編號PTA-10309)及44R24(寄存編號PTA-10311)之質體根據布達佩斯條約之條件於2009年8月26日被寄存於美國菌種保存中心(ATCC)(美國維吉尼亞州馬納沙斯市大學大道10801號)。
實施例19
其他抗FZD抗體之結合特性
FACS分析係用於特徵化抗FZD單株抗體(mAb)之FZD1、2、5、7及8之結合特性。
HEK293細胞係以表現全長FZD1、2、5、7或8之質體DNA與用來作為轉染標記之另一表現報告基因GFP之質體共轉染。Fugene 6(羅氏藥廠)根據廠商說明被用來作為轉染試劑。轉染細胞於37℃及5% CO2
中培養24至48小時。抗FZD單株抗體接著被稀釋至終體積50微升,濃度從20微克/毫升開始,且以4倍連續稀釋共稀釋8次。每個FZD/GFP 293暫時轉染池以懸浮液收集,將100000個轉染細胞與所欲測試之經稀釋抗FZD單株抗體於冰上培養30至60分鐘。細胞經過清洗,經結合之抗Fzd抗體係以與螢光發色團共軛之二次抗人抗體偵測。標記細胞接著以FACS偵測及計數。所產生之FACS資料以平均螢光強度(MFI)單位表示。GraphPad Prism軟體被用於作圖及分析資料。MFI以抗體濃度之函數作圖以建立劑量反應曲線。非線性迴歸係應用於數字以配適曲線及計算EC50。
單株抗體18R5及44R24之結合特性係經決定及比較。代表18R5與44R24各者與Fzd1、2、5、7及8結合之劑量反應曲線係顯示於圖47。經計算之二個單株抗體之EC50(nM)係顯示於表13。44R24以良好親和性與Fzd5及Fzd8結合。其他3個Fzd受體無法建立反曲之劑量反應曲線,顯示44R24不與Fzd1、2及7結合。18R5經證實以高親和性與Fzd1、2、5及7結合。
實施例20
於細胞基底測試中評估抗FZD單株抗體之抗Wnt活性
18R5及44R24抑制STF-293細胞中Wnt傳訊之能力係經決定及比較。STF細胞是以Super Top Flash(STF)報告卡匣穩定轉染之人胚胎腎(HEK)-293細胞,在Super Top Flash(STF)報告卡匣中螢光素酶(Luc)報告基因之表現係由多套在最小啟動子上游之TCF結合位調節。低基底Luc表現可因應Wnt3a被誘發30至60倍,提供一大範圍以評估抗Fzd抗體之抑制活性。
要評估單株抗體,使STF-293細胞生長於DMEM-10% FBS中。在第1天,每孔10000個細胞被種入96孔透明底白色盤(Nunc #165306)。該細胞係於37℃及5% CO2
中隔夜培養。第2天時,欲測試之抗體以培養基稀釋至終濃度40微克/微升。進行7次5倍連續稀釋。將STF-293細胞培養基以包含50微升抗體稀釋液、25微升來自Wnt3a穩定L細胞之Wnt3a條件培養基及25微升DMEM-10% FBS之混合物取代。各抗體之測試終濃度為20、4、0.8、0.16、0.03、0.006、0.0013、0.0003微克/毫升。各抗體濃度測試三次。人抗半抗原抗體LZ1被用來作為陰性對照抗體。來自母體L細胞之非Wnt3a條件培養基被用來作為陰性對照誘發物。將孔盤放回培養箱。螢光素酶活性係於第3天測量,根據廠商說明使用Promega Steady Glo套組(VWR# PAE2550-A)。結果以每秒光子數表示。GraphPad Prism軟體被用於作圖及分析資料。螢光素酶活性以抗體濃度之函數作圖以建立劑量反應曲線。非線性迴歸係應用於數字以配適曲線及計算IC50。
44R24及18R5抑制STF細胞中Wnt傳訊之能力以類似上述之方式經決定及比較。結果係顯示於圖48及表14。44R24之活性僅在較高之抗體濃度偵測到,顯示該抗體在測定中之低活性。44R24之IC50經計算相較於18R5之IC50低13倍。
18R5及44R24抑制A549細胞中Wnt傳訊之能力亦經決定。A549細胞是人肺癌細胞,其中軸蛋白2(Axin2)基因被高度表現,轉譯Wnt傳訊之內源性活性。Axin2係廣為週知之Wnt目標基因,其對該途徑活化之反應係藉由上調彼之轉錄及最後透過回饋環機制下調Wnt傳訊。此系統被用於以qPCR測試抗Fzd抗體對Axin2 mRNA量之影響。
將每孔30000個A549細胞種入12孔盤,於DMEM+10% FBS中生長3天。加入不同濃度(5、1、0.2、0.04、0.008微克/毫升)之抗體24小時,從該細胞抽取總RNA。非結合抗體LZ1被用來作為僅最高濃度之陰性對照。
30000個A549細胞被種入12孔盤,並於DMEM+10%FBS中生長3天。抗FZD抗體18R5或44R24以不同之濃度(5、1、0.2、0.04、0.008微克/毫升)加入,非結合抗體LZ1被用來作為僅最高濃度之陰性對照。RNA於處理後24小時製備,接著以DNAse酶處理。
Axin2已知是Wnt傳訊中之強效目標基因,其表現量係由Taqman相對表現(ΔΔCT)測定利用應用生物系統7900 HT儀器檢測。每點使用50奈克之RNA三次,GUSB探針被用來作為內源性對照。所有結果被正常化至LZ1對照樣本中之Axin2量。
劑量反應曲線顯示18R5及44R24抑制axin2基因表現之基底量,這些抗體經計算之EC50係顯示於圖49。18R5及44R24以類似效率相較於LZ1對照抑制Axin2之基底量。
實施例21
於胰臟異種移植模型中評估抗FZD單株抗體之抗腫瘤活性
OMP-PN13胰臟腫瘤:
自Oncomed腫瘤銀行取得已於小鼠繼代二次之冷凍OMP-PN13腫瘤細胞。細胞經解凍並於解凍後立即經皮下注射至NOD/SCID小鼠之左腹。每隻動物約注射25000個活細胞。每週監測小鼠之腫瘤生長。在腫瘤發生後,以游標尺每週測量一次腫瘤大小。負荷200至300立方毫米腫瘤之小鼠被分配至各包含5隻動物之治療組。各組之平均腫瘤體積類似。抗體治療從隨機分組後之當天開始。LZ1被用來作為陰性對照抗體。3劑10毫克/公斤之抗體在12天期間經腹腔內注射投予。在最後一次注射後24小時將小鼠安樂死。收集腫瘤、十二指腸及肝臟。
腫瘤組織被固定於福馬林以供石蠟包埋及切片。Muc16偵測係藉由免疫組織化學法(IHC)進行以監測黏液素產生細胞之出現。黏液素係胰臟中分化細胞亞群所特有,因此被用來作為腫瘤模型中之分化標記。
福馬林固定、石蠟包埋(FFPE)之切片係經去石蠟化。切片首先以二甲苯連續處理二次各5分鐘以去石蠟化。該組織接著被浸入乙醇於水中系列溶液以再水化,100%二次各3分鐘,90%一次1分鐘,80%一次1分鐘及70%一次1分鐘。以流動蒸餾水清洗該組織1分鐘。
黏液素16抗體(來自AbCAM公司之X325株,目錄編號ab10033)被用於IHC以偵測FFPE組織切片中之黏液素16表現細胞。熱誘發之抗原修復係於高壓鍋中以10mM檸檬酸緩衝液pH 6.0進行。接著將切片保持於室溫中,使蛋白質得以緩慢地回復抗原性(約2小時)。
組織切片係以3%過氧化氫於水中溶液封閉、清洗,接著用正常馬血清封閉溶液(50毫升中包含PBS(38.5毫升)、10% NHS(5毫升)、1% BSA(5毫升)、0.1%明膠(500微升)、0.1% Tx-100(500微升)、0.05% NaN3(500微升))於室溫中再次封閉1小時。切片接著以1:200稀釋於達文西綠色稀釋液pH 7.3(PD 900,生物照顧醫學公司(Biocare Medical))之Muc16一次抗體於室溫中染色1小時,隨後以含有0.1%特里湯(triton)X-100之磷酸鹽緩衝鹽水清洗三次。切片接著以3滴ImmPress抗鼠IgG HRP共軛物(目錄編號101098-260,VWR)在室溫中染色30分鐘,然後以含有0.1%特里湯X-100之磷酸鹽緩衝鹽水清洗三次。切片被置於培養皿中,利用Vector NovaRed套組(SK4800,維克實驗室公司(Vector labs))顯色1至2分鐘。加入蒸餾水以停止反應。在流動蒸餾水下徹底潤洗切片。組織切片接著利用蘇木精(目錄編號H3401,維克實驗室公司吉爾(Gill’s)調製劑)反染色1分鐘,清洗,接著以發藍溶液中和30秒。切片放置隔夜乾燥,並利用VectaMount封片劑(維克實驗室公司)封片。
經對照抗體(LZ1)、18R5或44R24治療之腫瘤的代表性鏡檢係顯示於圖50。當LZ1係呈現低強度染色時,以18R5治療之腫瘤中被偵測到高量之Muc16抗體染色。這顯示腫瘤細胞被18R5誘發以分化成黏液素產生細胞系。44R24治療腫瘤中的Muc16染色量相較於18R5治療腫瘤係呈中度,但仍稍微高於此試驗中之LZ1治療腫瘤。
總RNA亦自腫瘤、十二指腸及肝臟中抽取以利用qPCR進行Wnt目標基因表現分析。
組織在收集時被立即轉移至RNAlater試劑中(凱捷公司(QIAGEN))。根據廠商說明利用QIAGEN RNeasy纖維組織微量套組抽取RNA。取50奈克之總RNA以利用ABI單一步驟RT-PCR方法及試劑進行基因表現分析。GusB基因表現被用來作為內源性對照。每個樣本進行三次試驗。各治療組中所有5個腫瘤皆被分析。ABI 7900 TaqMan儀器被用於進行試驗。使用ABI SDS 2.2.1軟體以分析資料及計算被轉換成相對量之ΔCT值。各治療組中所有5個腫瘤之三次數值被平均。接著計算相對於對照抗體(LZ1)之倍數抑制因子。
該結果顯示於表15。Wnt目標基因係可變地受到抗FZD抗體之影響。18R5在腫瘤及肝臟中誘發2.3倍及8倍之抑制,而在十二指腸中不受影響。由44R24所誘發之改變較為輕微。
OMP-PN4胰臟腫瘤:
在OMP-PN4胰臟腫瘤異種移植模型中18R5對腫瘤基質之影響亦被硏究。表現量因治療而改變之數個基因以微陣列識別。在這些基因之中,編碼平滑肌肌動蛋白(SMA)蛋白之ACTA2特別受到注意。SMA已被顯示與活化之腫瘤基質有關。其下調因此可被視為腫瘤發生表現型減少之徵兆。
如上面實施例7所述,OMP-PN4荷腫瘤NOD/SCID小鼠接受對照抗體(LZ-1)、18R5、吉斯他濱或18R5與吉斯他濱之組合治療一週一次共6週。抗體係以10毫克/公斤之濃度投予。在腫瘤被收集後,來自該試驗之腫瘤分別利用微陣列及IHC分析Wnt目標基因於RNA及蛋白質上之表現。
總RNA係自腫瘤抽取、放大及供微陣列分析。總RNA係利用Ovation RNA放大系統V2(加州聖卡洛斯NuGEN公司)放大。所形成之經放大、反義ss-cDNA利用FL-Ovation cDNA生物素模組V2(NuGEN)被片段化及生物素化以供Affymetrix晶片使用。Affymetrix HG-U133 plus 2或MG 430 2.0寡核苷酸微陣列被用於這些試驗中(於北卡羅萊納州德罕市阿梅克診斷公司(Almac Diagnostics)進行)。在雜交後,基因晶片根據廠商說明被清洗、染色及掃描(加州聖克拉拉艾菲曼曲公司)。該cDNA及片段cDNA之品質係由光譜儀及生物分析器在陣列雜交前檢測。該掃描之原始晶片資料係利用GCOS軟體套件(Affymetrix)經定量及換算比例,並進行由Affymetrix所建議之基因晶片品質控制完整評估以偵測任何晶片缺失及變異值,其自後續資料分析中排除。
陣列背景調整及信號強度正常化係於開放來源之Bioconductor軟體中(www.bioconductor.org)以GCRMA演算法進行。在二組或二個時間點之間差別化表現之基因以貝氏t檢定(Cyber-T)識別,該檢定結合學生t檢定與得自類似表現量之探針組所觀察到之變異數之組內變異數貝氏估計(Baldi P,Long AD. A Bayesian framework for the analysis of microarray expression data:regularized t-test and statistical inferences of gene changes. Bioinformatics. 2001;17(6):509-19)。
在人腫瘤基因晶片分析中,樣本在人及鼠二種晶片上檢測以獨立評估對整體人腫瘤及鼠基質之治療效果。該些不具物種專一性之Affymetrix探針組被排除在我們的分析之外。
在準備平滑肌肌動蛋白α(SMAa)免疫螢光測定法時,腫瘤組織利用OCT冷凍。取得4微米切片並儲存於-80℃。要進行SMAa染色時,組織利用冰丙酮於-20℃固定15分鐘,接著允許其乾燥及回到室溫,接著使用疏水性PAP筆標示。然後利用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗切片。組織利用正常馬血清R.T.U.(維克實驗室)於室溫中封閉2小時。一次抗體染色係利用1:10000稀釋之FITC共軛平滑肌肌動蛋白α抗體(cline 1A4,#F3777,SIGMA)進行1小時。切片以含有0.1%特里湯X-100之PBS清洗三次。接著令玻片風乾,再利用含有DAPI之Hard套組封片培養基(vectashied H-500)封片。
圖51A顯示以微陣列偵測之ACTA2基因表現量。抗FZD抗體18R5治療腫瘤顯示降低之ACTA2表現量。圖51B顯示對照單株抗體(上圖)及18R5(下圖)治療OMP-PN4腫瘤之平滑肌肌動蛋白α(SMAa)免疫螢光測定結果。在18R5治療腫瘤上偵測到減低量之SMAa。在腫瘤基質中ACTA2之表現及SMA之量因18R5而大幅減低,顯示Wnt阻斷(i)影響此腫瘤部分及(ii)係藉由減低良好建立之腫瘤發生標記發生。這些結果顯示肌纖維母細胞活化之減低可能是18R5抗腫瘤作用機制之一。
實施例22
評估Muc16陽性OMP-PN13細胞之腫瘤發生潛力
如上所述,18R5治療在胰臟腫瘤中誘發基因表現及細胞表現型改變,包括增加之黏液素表現。具體地說,在經治療之PN-13腫瘤上所進行之IHC顯示Muc16陽性細胞之數量增加。經治療之腫瘤中的Muc16基因表現量亦高於對照腫瘤。評估18R5所誘發之Muc16陽性細胞的腫瘤發生性以測試18R5所誘發之Muc16陽性細胞代表已分化之腫瘤細胞次族群之假設。
OMP-PN13荷瘤小鼠係根據實施例21所描述之方法以18R5治療。在抗體治療開始後12天將小鼠安樂死。腫瘤係經收集及處理,利用膠原酶III消化組織以取得單細胞懸浮液。小鼠基質細胞係以生物素基化抗H-2Kd抗體及生物素基化抗CD45抗體染色。細胞接著與鏈黴抗生物素蛋白共軛磁珠(Thermo MagnaBind)一起培養,並利用Dynal磁鐵清除。該所形成之譜系清除(lin-depleted)腫瘤細胞係以抗Muc16單株抗體染色,該抗Muc16單株抗體以PE共軛二次抗體偵測。利用執行DIVA軟體之ARIA FACS儀器分選Muc16陽性及Muc16陰性細胞。見圖52A。細胞經皮下被再度注射至NOD/SCID小鼠之左腹脅以比較它們的腫瘤發生潛力。各細胞種類被注射至10隻小鼠。每隻小鼠接受75個細胞。因注射Muc16-(上圖)及Muc16+(下圖)細胞所導致之腫瘤的代表性照片係顯示於圖52B。在注射至小鼠後Muc16-及Muc16+腫瘤之生長曲線係顯示於圖52C。在注射Muc16+細胞後沒有腫瘤生長,然而10隻注射Muc16-細胞之小鼠中有7隻發生腫瘤。該資料顯示,18R5所誘發之Muc16+細胞係非腫瘤發生性,支持誘發分化係為18R5抗腫瘤活性之潛在機制。
實施例23
抗FZD抗體之其他活體內試驗
18R5單株抗體之PE13乳房腫瘤復發試驗:PE13乳房腫瘤細胞被注射至Nod-Scid小鼠並允許其生長直到腫瘤體積約達100立方毫米。該些動物被隨機分配至2組(n=10),給予taxol(15毫克/公斤,每週二次)+對照抗體(黑色方形)或相同劑量之taxol+抗FZD 18R5(灰色空心圓)。抗體以20毫克/公斤每週投予一次。Taxol治療於第70天停止,抗體治療則持續。結果顯示於圖53。我們觀察到18R5促進腫瘤消退之速率且在taxol治療停止後延緩腫瘤之復發。
18R5單株抗體之PE13乳房腫瘤限制稀釋測定(LDA)試驗:荷PE13乳房腫瘤動物係以對照抗體(灰色圓)、18R5(空心三角形)、taxol(黑色圓)或taxol與18R5之組合(空心方形)治療。Taxol以15毫克/公斤每週投予二次,抗體以20毫克/公斤每週投予一次。腫瘤係經收集,且該人腫瘤細胞藉由lin清除純化。50、150或500個腫瘤細胞被注射至新世代之小鼠(每種細胞劑量n=10)。結果顯示於圖54。59天後監測腫瘤生長頻率,並用於計算CSC頻率(L-calc)。
18R5單株抗體之PN4胰臟腫瘤復發試驗:PN4胰臟腫瘤細胞被注射至Nod-Scid小鼠並允許其生長直到腫瘤體積約達250立方毫米。對該些動物投予吉斯他濱(75毫克/公斤,每週一次)共5週直到腫瘤已消退。該些動物被隨機分配至2組,給予對照抗體(黑色方形)或抗FZD 18R5(灰色空心圓)。抗體以10毫克/公斤每週投予一次。結果顯示於圖55。我們觀察到18R5在吉斯他濱治療後延緩腫瘤之復發。
44R24單株抗體之PN4胰臟腫瘤生長試驗:PN4胰臟腫瘤被注射至Nod-Scid小鼠。允許腫瘤生長直到體積達到約150立方毫米。動物被隨機分配至4組(每組n=10),給予對照抗體(黑色圓形)、抗FZD5/8 44R24(灰色空心三角形)、吉斯他濱(實心三角形)或44R24加吉斯他濱之組合(灰色空心圓)。吉斯他濱以15毫克/公斤每週投予一次,抗體以20毫克/公斤每週投予二次。結果顯示於圖56。我們觀察到44R24與吉斯他濱之組合相較於單獨使用吉斯他濱減低腫瘤生長。
實施例24
抗FZD抗體44R24之表位圖譜
抗FZD抗體44R24之表位圖譜係以類似實施例5所描述之抗體18R8及18R5之方式進行。44R24與類似18R8之表位結合之能力係以流式細胞法評估,利用先前顯示可干擾18R8結合之一系列FZD8之胺基酸變異體(見實施例5及圖6及7)。由共轉染(GFP陽性)細胞族群內染色減低顯示,FZD8之胺基酸126-127被認為是44R24結合所必需。FACS試驗之結果顯示於圖57。該些結果顯示44R24所結合之表位和18R8之表位重疊且包含共用胺基酸126-127。
實施例25
抗FZD抗體18R5、18R8及44R24之C28結腸腫瘤生長試驗
C28腫瘤細胞經皮下被注射至Nod-Scid小鼠。允許腫瘤生長直到腫瘤平均體積達到126立方毫米。荷瘤動物被隨機分配至4組(每組n=10隻小鼠),並以對照抗體(黑色方形)、18R8(灰色三角形)、44R24(黑色空心圓)或18R5(灰色圓形)治療。抗體以15毫克/公斤經腹腔內每週投予二次。腫瘤體積係經顯示。相較於對照組,抗體44R24及18R5之治療減低生長,但18R8不具效果(圖58)。
動物經圖58所示之試驗治療後,腫瘤係經收集、固定於福馬林、以石蠟包埋,並切成5微米切片。以免疫組織化學法(Vectastain kit,Vector Labs)分析腫瘤切片中細胞角蛋白7之表現,這是一種結腸細胞分化標記。在44R24或18R5治療後,細胞角蛋白7之表現被發現增加(圖59)。
所有此處所引述之出版物、專利、專利申請案、網站及登錄號/資料庫序列(包括多核苷酸及多肽序列)藉此以參照方式整體納入以符合所有目的,如同各個別出版物、專利、專利申請案、網站或登錄號/資料庫序列所具體及個別明示而以參照方式納入之相同範圍。
圖1. 18R8與多種人捲曲受體結合。FACS分析證實18R8與暫時轉染之HEK293細胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8序列結合。FACS之圖係顯示18R8與HEK293細胞之結合,該HEK293細胞以編碼該所示FZD之表現載體和GFP之表現載體轉染。18R8結合係顯示為在共轉染(GFP陽性)細胞族群內之染色加深。FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8之FACS圖為粗線邊框,以強調顯示18R8結合之FZD。
圖2. 抗FZD抗體18R5與細胞上之多種人捲曲受體結合。FACS分析證實18R5類似18R8,與細胞上之FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8序列結合。抗體18R8和18R5以一個範圍之濃度與過度表現該所示FZD之HEK293細胞一起培養,並以流式細胞法檢測抗體之結合。雖然18R8和18R5皆與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8結合,但18R5以較高之親和性結合。
圖3. 螢光素酶報告測定係於STF293細胞中進行,該STF293細胞穩定表現與螢光素酶連接之8xTCF啟動子元件。細胞係以含有Wnt3A以及一個濃度範圍之18R8及18R5之條件培養基處理,接著在18小時後利用雙Glo螢光素酶測定報告系統(Promega)檢測。該結果證實18R8及18R5二者皆抑制Wnt傳訊且18R5相較於18R8以較高之親和性結合。
圖4. 18R8阻斷由多種Wnt媒介之TCF傳訊。螢光素酶報告測定係於STF293細胞中進行,該STF293細胞穩定表現與螢光素酶連接之8xTCF啟動子元件。使用Fugene 6試劑(Roche)將編碼所示Wnt蛋白之表現載體轉染至HEK293細胞(ATCC),藉此製備各種Wnt過度表現細胞。STF293細胞係經18R8處理,並加入Wnt過度表現HEK293細胞,經過18小時後利用雙Glo螢光素酶測定報告系統測定。
圖5. 18R8直接抑制Wnt與FZD之結合。螢光素酶報告測定係於STF293細胞中進行,該STF293細胞穩定表現8xTCF啟動子元件。包含Wnt3A條件培養基、經純化之FZD8-Fc及/或18R8之混合物係在蛋白A瓊脂糖微珠存在/不存在下,如所示地於4℃共培養2小時。在培養後,將該蛋白A瓊脂糖微珠移除,該培養物被加入STF293細胞中。該經處理之STF293細胞於18小時後利用雙Glo螢光素酶測定報告系統測定。此試驗顯示,當18R8不存在時,Fzd8-Fc能抑制Wnt3A刺激傳訊之能力,但是18R8能阻斷FZD8與Wnt3A結合之能力,由該傳訊在使用瓊脂糖A微珠移除共培養物中之FZD8-Fc(及18R8)時回復可得到證明。
圖6. 18R8與突變FZD8及野生型FZD8結合之FACS分析。為了評估18R8在FZD上之表位,進行表位圖譜試驗。能表現具有N端FLAG標籤之人FZD8之Fri結構域及C端CD4跨膜結構域及細胞內結構域之表現建構體與編碼GFP之表現載體一起被用於暫時轉染試驗。亦製備此表現載體之變異體,其包含在FZD8序列內經選擇之胺基酸取代以編碼其它不為18R8所結合之特定FZD之Fri結構域內對應位置之胺基酸。18R8與這些變異FZD8序列結合之能力接著以流式細胞法分析。特定位置包括FZD8之胺基酸66-71及126-127被發現是18R8結合所需,如共轉染(GFP陽性)細胞族群內減低染色所示。FACS圖形中顯示18R8與共轉染細胞族群結合之區域係以方框強調,該些顯示18R8結合顯著減低之胺基酸取代為粗線方框。
圖7. 18R5及18R8經顯示具有類似之人FZD8上之結合表位。18R5與類似18R8之表位結合之能力係利用先前顯示可干擾18R8結合之一系列胺基酸變異以流式細胞法評估。包括FZD8之胺基酸66-71及126-127之位置被發現是18R8及18R5二者結合所需,如共轉染(GFP陽性)細胞族群內減低染色所示。FACS圖形中顯示18R8與共轉染細胞族群結合之區域係以方框強調,該些顯示18R8及18R5結合顯著減低之胺基酸取代為粗線方框。
圖8. 人捲曲受體Fri結構域序列之部分的胺基酸序列比較。具有保守性殘基之位置以黑色陰影表示;具有類似胺基酸殘基之位置以灰色陰影表示。18R8及18R5之FZD表位包含以底線表示且標示為「頂部邊緣」及「底部邊緣」之區。根據Fri結構域晶體結構之檢查,用語「頂部邊緣」及「底部邊緣」反應一項認識,也就是這些區域位於該FZD蛋白表面上裂縫之側面。此裂縫包含多個高度保守性殘基。包含此裂縫之胺基酸在序列比對內之各對應位置上方以倒三角形強調。此區先前未被賦予特定功能。有關與此區結合之抗體的發現及這些抗體抑制Wnt結合及Wnt傳訊的發現以及我們對此裂縫之保留特性的認識,使我們能將此區視為FZD蛋白之關鍵功能態樣。
圖9. FZD之生物結合位(BBS)。顯示Fzd fri結構域之構造圖。該些圖片係根據先前報告之鼠FZD8晶體結構之分析(Dann CE et al.,Nature 412(6842)86-90,2001)以及利用軟體程式Pymol所進行之分析。左上圖所顯示的是FZD Fri結構域之表面視圖,該包含我們已發現之生物結合位(BBS)之Fzd蛋白之區以白色圓圈表示。此為抗體18R8及18R5所結合之區。此區包含我們稱為「頂部邊緣」、「底部邊緣」及「裂縫」之結構元件。這些各自在圖9下方之不同圖片中以較暗之表面顏色強調。右上圖以較暗表面強調的是在10種人Fzd家族成員之9或10者中具保守性之殘基,且強調在該「裂縫」區之中心內有該些殘基明顯群組之認識,該裂縫區之側面為與抑制Fzd功能之抗體結合之表位。
圖10. 抗FZD單株抗體預防Wnt依賴性腫瘤生長。NOD/SCID鼠注射50,000個MMTV WNT1腫瘤衍生性細胞,每週監測腫瘤生長直到生長被偵測到,接著每週測量二次腫瘤生長。10隻具有已建立腫瘤之小鼠接受18R8或對照抗體以為對照之治療。相較於在對照抗體治療動物中所觀察到的腫瘤生長,18R8治療動物之腫瘤生長幾乎被消除。
圖11. 18R5與愛萊諾迪肯之組合治療減低OMP-C28異種移植腫瘤生長。NOD/SCID鼠被注射10,000個OMP-C28結腸腫瘤細胞,第24天時平均腫瘤體積129立方毫米之小鼠被隨機分組,並開始所示治療。每週監測腫瘤生長。18R5治療動物之腫瘤生長被顯著減低。另外,18R5與愛萊諾迪肯之組合相較於各劑單獨治療具有顯著療效。
圖12. 18R5與吉斯他濱之組合治療減低OMP-PN4異種移植腫瘤生長。NOD/SCID鼠經注射50000個OMP-PN4胰臟腫瘤細胞,第38天時平均腫瘤體積約120立方毫米之小鼠被隨機分組,且該所示治療於二天後開始。18R5與吉斯他濱之組合治療相較於吉斯他濱單獨治療顯著減低動物之腫瘤生長。
圖13. 18R8及18R5之重鏈及輕鏈胺基酸序列,包括VH及VL序列。
圖14. 編碼18R8及18R5之重鏈及VH序列之核苷酸序列。
圖15. 編碼18R8及18R5之輕鏈及VL序列之核苷酸序列。
圖16. FZD7 ECD Fc蛋白之胺基酸序列及編碼相同物之核苷酸序列。
圖17. 人FZD1(SEQ ID NO:26)、FZD1之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:27,顯示為SEQ ID NO:26之劃底線胺基酸1-321)及FZD1之Fri結構域(SEQ ID NO:28)之胺基酸序列。
圖18. 人FZD2(SEQ ID NO:30)、FZD2之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:31,顯示為SEQ ID NO:30之劃底線胺基酸1-250)及FZD2之Fri結構域(SEQ ID NO:32)之胺基酸序列。
圖19. 編碼人FZD1之核苷酸序列。
圖20. 編碼人FZD2之核苷酸序列。
圖21. 人FZD3(SEQ ID NO:34)、FZD3之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:35,顯示為SEQ ID NO:34之劃底線胺基酸1-204)及FZD3之Fri結構域(SEQ ID NO:36)之胺基酸序列。
圖22. 人FZD4(SEQ ID NO:38)、FZD4之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:39,顯示為SEQ ID NO:38之劃底線胺基酸1-224)及FZD4之Fri結構域(SEQ ID NO:40)之胺基酸序列。
圖23. 編碼人FZD3之核苷酸序列。
圖24. 編碼人FZD4之核苷酸序列。
圖25. 人FZD5(SEQ ID NO:42)、FZD5之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:43,顯示為SEQ ID NO:42之劃底線胺基酸1-233)及FZD5之Fri結構域(SEQ ID NO:44)之胺基酸序列。
圖26. 人FZD6(SEQ ID NO:46)、FZD6之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:47,顯示為SEQ ID NO:46之劃底線胺基酸1-207)及FZD6之Fri結構域(SEQ ID NO:48)之胺基酸序列。
圖27. 編碼人FZD5之核苷酸序列。
圖28. 編碼人FZD6之核苷酸序列。
圖29. 人FZD7(SEQ ID NO:50)、FZD7之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:51,顯示為SEQ ID NO:50之劃底線胺基酸1-255)及FZD7之Fri結構域(SEQ ID NO:52)之胺基酸序列。
圖30. 人FZD8(SEQ ID NO:54)、FZD8之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:55,顯示為SEQ ID NO:54之劃底線胺基酸1-277)及FZD8之Fri結構域(SEQ ID NO:56)之胺基酸序列。
圖31. 編碼人FZD7之核苷酸序列。
圖32. 編碼人FZD8之核苷酸序列。
圖33. 人FZD9(SEQ ID NO:58)、FZD9之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:59,顯示為SEQ ID NO:58之劃底線胺基酸1-230)及FZD9之Fri結構域(SEQ ID NO:60)之胺基酸序列。
圖34. 人FZD10(SEQ ID NO:62)、FZD10之胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO:63,顯示為SEQ ID NO:62之劃底線胺基酸1-227)及FZD10之Fri結構域(SEQ ID NO:64)之胺基酸序列。
圖35. 編碼人FZD9之核苷酸序列。
圖36. 編碼人FZD10之核苷酸序列。
圖37. 18R5抗體與太平洋紫杉醇之組合治療減低PE-13乳房腫瘤生長。對NOD/SCID小鼠注射10000個PE-13乳房腫瘤細胞,第22天時平均腫瘤體積約120立方毫米之小鼠被隨機分組。接著以對照抗體(「對照抗體」)、18R5抗體(「抗FZD」)、太平洋紫杉醇(「Taxol」)或18R5抗體加太平洋紫杉醇(「抗FZD+Taxol」)治療小鼠。18R5抗體與太平洋紫杉醇之組合治療導致抗腫瘤活性。
圖38. 接受18R5抗體與太平洋紫杉醇組合治療之個別動物的乳房腫瘤生長。18R5抗體與太平洋紫杉醇之組合治療導致已建立乳房腫瘤之消退。
圖39. 結直腸腫瘤細胞經對照抗體、18R5抗體、愛萊諾迪肯或18R5與愛萊諾迪肯二者治療後之流式細胞分析。
圖40. 在小鼠體內植入30、90、270或810個腫瘤細胞後之腫瘤生長,該腫瘤細胞得自已經以對照抗體(「對照」)、18R5抗體(「抗FZD」)、吉斯他濱(「吉斯他濱」)或18R5加吉斯他濱之組合(「組合」)治療41天之小鼠。
圖41. PN-4胰臟腫瘤在經對照抗體(「對照抗體」)、單獨18R5抗體(「抗FZD」)、單獨吉斯他濱(「吉斯他濱」)或18R5抗體與吉斯他濱之組合(「組合」)治療後之癌幹細胞(CSC)頻率,以限制稀釋分析決定。
圖42. 已經對照抗體(「LZ-1」)、單獨18R5抗體(「18R5」)、單獨吉斯他濱(「Gem」)或吉斯他濱與18R5之組合(「Combo」)治療之胰臟腫瘤細胞中之嗜鉻粒蛋白基因表現。
圖43. 抗FZD抗體18R5之治療促進腫瘤細胞分化成非增生性黏液性細胞。50000個OMP-PN13胰臟腫瘤細胞被注射至NOD/SCID小鼠,第23天時腫瘤平均體積約107立方毫米之小鼠被隨機分組,對照抗體或18R5之治療係於4天後開始。20天後收集腫瘤並加以切片。來自18R5治療小鼠或對照抗體治療小鼠之腫瘤切片係以阿爾新藍染色以顯示黏液性細胞,以ki67抗體進行免疫組織化學染色以顯示增生性細胞。示範性黏液性細胞及增生性細胞係以箭頭強調。
圖44. 單獨及與Taxol(太平洋紫杉醇)組合使用之抗FZD抗體18R5抑制OMP-LU24異種移植腫瘤生長。荷OMP-LU24人肺臟腫瘤小鼠係以對照抗體(「對照抗體」)、抗FZD 18R5(「18R5」)、Taxol(「Taxol」)或18R5加Taxol之組合(「18R5+Taxol」)治療。
圖45. 單獨及與Avastin(貝伐單抗(bevacizumab))組合使用之抗FZD抗體18R5抑制OMP-LU33異種移植腫瘤生長。荷OMP-LU33人肺臟腫瘤小鼠係以對照抗體(方形)、Avastin(倒三角形)、抗FZD 18R5(三角形)或18R5加Avastin之組合(圓形)治療。
圖46. 抗FZD抗體18R5與賀癌平(Herceptin)(曲妥珠單抗(trastuzumab))之組合抑制T3異種移植腫瘤生長。荷T3人乳房腫瘤小鼠係以對照抗體(方形)、抗FZD18R5(三角形)、賀癌平(實心圓)或18R5加賀癌平之組合(空心圓)治療。
圖47. 18R5與44R24之Fzd結合特性。劑量反應曲線代表各單株抗體與Fzd1、2、5、7及8之結合。
圖48. 18R5及44R24抑制STF細胞中Wnt3a誘發之報告活性(劑量反應曲線)。
圖49. 18R5及44R24抑制axin2基因表現之基底量。
圖50. IHC偵測18R5及44R24治療OMP-PN13腫瘤中之Muc16。
圖51. 18R5治療胰臟腫瘤中之平滑肌肌動蛋白抑制。A.以微陣列偵測之ACTA2基因表現量。B. 對照單株抗體(上圖)及18R5(下圖)治療OMP-PN4腫瘤上之SMA偵測。
圖52. 測試18R5誘發之Muc16+OMP-PN13細胞之腫瘤發生性。A.譜系清除OMP-PN13腫瘤細胞之Muc16染色FACS分析圖。該2種分選族群被圈起。B.因注射Muc16-(上圖)及Muc16+(下圖)細胞所導致之腫瘤的代表性照片。C.腫瘤生長曲線。
圖53. 抗FZD單株抗體18R5於PE13乳房腫瘤異種移植中抑制腫瘤復發。
圖54. 抗FZD單株抗體18R5減低乳癌幹細胞之頻率。
圖55. 抗FZD單株抗體18R5於PN4胰臟腫瘤異種移植中抑制腫瘤復發。
圖56. 抗FZD單株抗體44R24與吉斯他濱之組合於PN4胰臟腫瘤異種移植中抑制腫瘤生長。
圖57. 抗FZD單株抗體44R24與突變FZD8及野生型FZD8結合之FACS分析。FACS圖形中顯示44R24與共轉染細胞族群結合之區域係以方框強調。該些顯示44R24結合顯著減低之胺基酸取代之方框以箭頭標示。
圖58. 抗FZD抗體44R24及18R5於C28結腸腫瘤異種移植中之抗腫瘤活性。
圖59. 經抗FZD抗體44R24及18R5治療之C28結腸腫瘤異種移植誘導細胞角蛋白7之表現。
Claims (24)
- 一種與一或多種選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之人捲曲受體專一性結合之經分離之抗體,其中該抗體包含:(a)重鏈CDR1、CDR2及CDR3,該重鏈CDR1包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1),該重鏈CDR2包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2),且該重鏈CDR3包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3);及(b)輕鏈CDR1、CDR2及CDR3,該輕鏈CDR1包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7),該輕鏈CDR2包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:8),且該輕鏈CDR3包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:9);或,輕鏈CDR1、CDR2及CDR3,該輕鏈CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4),該輕鏈CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5),且該輕鏈CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)。
- 如申請專利範圍第1項之抗體,其包含輕鏈CDR1、CDR2及CDR3,該輕鏈CDR1包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:7),該輕鏈CDR2包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:8),且該輕鏈CDR3包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:9)。
- 如申請專利範圍第1項之抗體,其包含輕鏈CDR1、CDR2及CDR3,該輕鏈CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO:4),該輕鏈CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO:5),且 該輕鏈CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO:6)。
- 如申請專利範圍第1項之抗體,其專一性結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。
- 如申請專利範圍第2項之抗體,其專一性結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。
- 如申請專利範圍第3項之抗體,其專一性結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。
- 一種與一或多種選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8之人捲曲受體專一性結合之經分離之抗體,其中該抗體包含:(a)具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的多肽;及(b)具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:12之胺基酸序列的多肽。
- 如申請專利範圍第7項之抗體,其包含(a)具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的多肽;及(b)具有SEQ ID NO:14之胺基酸序列的多肽。
- 如申請專利範圍第7項之抗體,其專一性結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。
- 如申請專利範圍第8項之抗體,其專一性結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。
- 一種與人FZD5及/或FZD8專一性結合之經分離之抗體,其中該抗體包含:(a)重鏈CDR1、CDR2及CDR3,該重鏈CDR1包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO:77),該重鏈CDR2包 含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO:78),且該重鏈CDR3包含SIVFDY(SEQ ID NO:79);及(b)輕鏈CDR1、CDR2及CDR3,該輕鏈CDR1包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO:80),該輕鏈CDR2包含SG(SEQ ID NO:81),且該輕鏈CDR3包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO:82)。
- 一種與FZD5及/或FZD8專一性結合之抗體,其中該抗體包含:(a)具有SEQ ID NO:85之胺基酸序列的多肽;及(b)具有SEQ ID NO:86之胺基酸序列的多肽。
- 一種由下述序列所編碼之抗體:(a)SEQ ID NO:96與SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:97之組合;或(b)SEQ ID NO:91與SEQ ID NO:93之組合。
- 如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體,其係單株抗體、人化抗體、人抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、或抗體片段。
- 如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體,其係與細胞毒性劑共軛。
- 一種經分離之細胞,其產製如申請專利範圍第1至14項中任一項之抗體。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
- 一種如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體之 用途,其係用於製造供治療癌症之藥物。
- 一種如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體之用途,其係用於製造供抑制典型Wnt傳訊之藥物。
- 一種如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體之用途,其係用於製造供抑制腫瘤生長之藥物。
- 如申請專利範圍第18至20項中任一項之用途,其另包含對個體投予第二抗癌劑。
- 如申請專利範圍第21項之用途,其中該第二抗癌劑係化學治療劑、血管生成抑制劑、刻痕(Notch)傳訊抑制劑、抗刻痕抗體或抗刻痕配體抗體。
- 一種經分離之多核苷酸,其編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體。
- 一種載體,其包含如申請專利範圍第23項之多核苷酸。
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