CN109311950A - 用于抑制wnt信号传导的组合物和方法 - Google Patents

用于抑制wnt信号传导的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109311950A
CN109311950A CN201780018577.7A CN201780018577A CN109311950A CN 109311950 A CN109311950 A CN 109311950A CN 201780018577 A CN201780018577 A CN 201780018577A CN 109311950 A CN109311950 A CN 109311950A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
seq
tcdb
cell
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780018577.7A
Other languages
English (en)
Inventor
董民
陶亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Childrens Medical Center Corp
Original Assignee
Childrens Medical Center Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Childrens Medical Center Corp filed Critical Childrens Medical Center Corp
Publication of CN109311950A publication Critical patent/CN109311950A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C12N2015/8572—Animal models for proliferative diseases, e.g. comprising an oncogene

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本公开内容涉及抑制Wnt信号传导的分离的多肽、包含所述分离的多肽的药物组合物、及其使用方法。还公开了与所述分离的多肽和组合物相关的核酸、细胞和生产方法。

Description

用于抑制WNT信号传导的组合物和方法
相关申请
本申请要求根据35U.S.C.§119于2016年3月21日提交的标题为Compositions andMethods for Inhibiting WNT Signaling的美国临时申请序列号62/311,381的提交日权益，其全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本公开内容是在国立卫生研究院授予的资助1R01NS080833的政府支持下完成的。政府在本公开内容中具有某些权利。
背景技术
艰难梭菌毒素B(Clostridium difficile toxin B，TcdB)是引起与艰难梭菌感染(C.difficile infection，CDI)相关的疾病的关键毒力因子。在发达国家中，CDI是抗生素相关腹泻的最常见原因，并且也是胃肠炎相关死亡的首要原因。现有的CDI抗生素治疗方案无效，且该疾病的复发率高。
发明内容
艰难梭菌毒素B(TcdB)是引起与艰难梭菌感染(CDI)相关的疾病的关键毒力因子。利用全基因组CRISPR/Cas9介导的敲除筛选，我们将Wnt受体卷曲受体(Frizzled，FZD)鉴定为TcdB受体。TcdB与Wnt竞争与FZD中保守的富含半胱氨酸结构域(cysteine-rich domain，CRD)结合，对FZD1、2和7具有最高的亲和力，并且是Wnt信号传导的强效抑制剂。重组FZD2-CRD片段保护细胞免受TcdB。三重FZD1/2/7敲除(KO)细胞对毒素进入具有显著抗性。因此，FZD作为TcdB的生理学上相关的上皮受体，并且在CDI发病机制以及与提高的Wnt信号传导相关的疾病(例如，癌症)中的Wnt信号传导阻断中发挥作用。
本公开内容的一个方面提供了分离的多肽，其包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中所述多肽不具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列。。
本公开内容的另一方面提供了分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：18具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
本公开内容的另一方面提供了分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
本公开内容的另一方面提供了分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽具有SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽是交联的、环化的、缀合的、酰化的、羧基化的、脂化的、乙酰化的、巯基乙酸酰胺化的、烷基化的、甲基化的、聚苷氨酰化的(polyglycylated)、糖基化的、聚唾液酸化的(polysialylated)、磷酸化的、腺苷酰化的(adenylylated)、PEG化的，或其组合。在一些实施方案中，多肽在C端或在N端具有修饰。
在一些实施方案中，多肽还含有融合结构域。在一些实施方案中，融合结构域选自：多聚组氨酸(polyhistidine)、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(glutathione Stransferase，GST)、硫氧还蛋白、蛋白A(protein A)、蛋白G(protein G)、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。在一些实施方案中，多肽还含有人IgG1的Fc部分。
本文中还提供了融合蛋白，其包含：含有与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合。在一些实施方案中，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在一些实施方案中，融合蛋白由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成。
本公开内容的另一方面提供了嵌合分子，其包含第一部分和第二部分，其中第一部分是本文中公开的分离的多肽，并且其中第二部分是不为本文公开的分离的多肽的分子。
在一些实施方案中，分离的多肽结合卷曲受体(FZD)。在一些实施方案中，分离的多肽阻断Wnt信号传导。在一些实施方案中，分离的多肽是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方案中，分离的多肽与聚合物连接。在一些实施方案中，聚合物延长分离的多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，聚合物延长分离的多肽的保质期(shelf-life)。在一些实施方案中，分离的多肽具有1至100个保守的氨基酸替换。
在一些实施方案中，第二部分是抗菌剂。在一些实施方案中，抗菌剂是抗生素。在一些实施方案中，第二部分是结合卷曲受体共受体的抗体。在一些实施方案中，卷曲受体共受体是脂蛋白受体相关蛋白(lipoprotein receptor-related protein，LRP)-5/6、受体酪氨酸激酶(RTK)或酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR2)。
在一些实施方案中，第二部分包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二部分包含与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ IDNO：26具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
本文中还提供了分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性、或100％同一性的氨基酸序列。
本文中还提供了核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性、或100％同一性的氨基酸序列。
本文中还提供了核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性、或100％同一性的氨基酸序列。
本文中还提供了核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：21具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性、或100％同一性的氨基酸序列。
本文中还提供了核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：22具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，至少98％，至少99％、或至少99.5％同一性，或100％同一性的氨基酸序列。
本文中还提供了核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：23具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性、或100％同一性的氨基酸序列。
本公开内容的另一方面提供了包含本文中公开的分离的多肽或嵌合分子的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物还包含另外的分离的多肽，所述另外的分离的多肽包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，另外的分离的多肽包含与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，另外的分离的多肽由SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，多肽是乙酰化的、羧基化的、糖基化的、磷酸化的、脂化的、酰化的、PEG化的、巯基乙酸酰胺化的，或其组合。
在一些实施方案中，多肽还包含融合结构域。在一些实施方案中，融合结构域选自：多聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。在一些实施方案中，另外的多肽包含人IgG1的Fc部分。在一些实施方案中，融合结构域是人IgG1的Fc部分。
本公开内容的另一方面提供了治疗艰难梭菌感染(CDI)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文中公开的分离的多肽、嵌合分子或药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含在细胞中诱导卷曲受体(FZD)下游的Wnt信号传导的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是GSK-3抑制剂。在一些实施方案中，GSK-3抑制剂是锂(LiCl)、CHIR99021、SB 216763、BIO、TCS 2002、TC-G 24、TWS 119、SB 415286、A 1070722、AR-A 014418、L803-mts或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物还包含在细胞中抑制TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是依布硒(ebselen)。在一些实施方案中，药物组合物还包含卷曲受体抗体。
在一些实施方案中，细胞是结肠上皮细胞。
本公开内容的又一方面提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文中公开的分离的多肽、嵌合分子或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是结肠癌、肺癌、肝癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，药物组合物还包含阻断Wnt信号传导的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是Dkk家族蛋白、分泌型卷曲受体相关蛋白(Secreted Frizzled RelatedProtein，sFRP)、Draxin、IGFBP-4、SOST/硬化蛋白(Sclerostin)、USAG1或WIF-1。在一些实施方案中，药剂是卷曲受体抗体。在一些实施方案中，癌症是转移癌。
本公开内容的每种限制可涵盖本公开内容的多个实施方案。因此，预期涉及任何一种要素或要素组合的本公开内容的每种限制可包含在本公开内容的每个方面中。本公开内容在其应用时不限于在以下描述中阐述的或在附图中展示的构造和组件布置的细节。本公开内容能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或实施。此外，本文中使用的措辞和术语是出于描述的目的，而不应被视为限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及另外的项目。
附图简述
附图并不旨在按比例绘制。在附图中，在不同图中展示的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为清楚起见，并非每个组件在每个附图中都进行标记。在附图中：
图1示出了全基因组CRISPR/Cas9介导的筛选以鉴定TcdB的宿主因子。图A是CRISPR/Cas9筛选的示意图。用TcdB(0.05pM、0.1pM、0.2pM和0.5pM)和TcdB1-1830(5pM、10pM、20pM和50pM)分别进行四轮筛选。图B和C示出了在筛选中用TcdB(图B)或TcdB1-1830(图C)鉴定的排序和作图的基因。CRISPR文库包含六个独特的sgRNA/基因。因为用多个独特的sgRNA鉴定的基因不太可能是假阳性，所以Y轴是基于针对每个基因鉴定的独特sgRNA的数目。X轴是基因的总sgRNA NGS读取，其反映了在选择后带有突变基因之细胞的丰度。图中记录的百分比表示在总sgRNA读取中所指示基因的sgRNA读取的相对丰度。
图2示出FZD是TcdB的CROP非依赖性受体。在图A中，具有通过CRISPR/Cas9突变的所指示基因的HeLa细胞暴露于一系列浓度的TcdB或TcdB1-1830，以及如图9，图A-C中所述定量圆形细胞的百分比。它们对毒素的敏感性(定义为诱导50％细胞变圆的毒素浓度(CR50，在图9，图C中列出)被归一化为WT HeLa细胞并作图(*P＜0.005，单因素方差分析)。图B示出了通过免疫染色测定的CSPG4-/-细胞中TcdB(10nM，10分钟)的结合与WT细胞相比大大降低。大鼠NG2的异位表达提高了TcdB的结合。比例尺＝20μm。使用多克隆抗CSPG4/NG2抗体检测NG2。使用多克隆鸡抗TcdB抗体检测TcdB。图C示出了FZD2的转染提高了TcdB与CSPG4-/-细胞的结合。通过与FZD2的C端胞质结构域融合的1D4标签鉴定转染的FZD2。比例尺＝20μm。图D展示了NG2或FZD2二者的异位表达均恢复TcdB进入CSPG4-/-细胞，当CSPG4-/-细胞在暴露于TcdB(5pM，3小时)后尚未显示出任何细胞变圆效应时，这导致几乎所有转染的细胞的细胞变圆。使用共转染的GFP来标记转染的细胞。比例尺＝50μm。图E示出了用暴露于TcdB(10nM，10分钟)的指定FZD成员转染的CSPG4-/-细胞。清洗细胞并对细胞裂解物进行免疫印迹分析。通过与FZD的胞质结构域融合的1D4标签证实FZD的表达。肌动蛋白用作上样对照。FZD1、2和7的转染极大地提高了TcdB与细胞的结合。图F示出了使用如图2，图A中所述的致细胞病变的细胞变圆测定(cytopathic cell-rounding assays)评估的FZD1-/-、FZD2-/-、FZD7-/-以及三重FZD1/2/7-/-细胞对TcdB和TcdB1-1830的敏感性(*P＜0.005，单因素方差分析)。图G示出了FZD1、2或7的异位表达恢复了TcdB1-1830进入FZD1/2/7-/-细胞，导致几乎所有转染细胞的细胞变圆(300pM，3小时)。共转染的GFP标记转染的细胞。比例尺＝50μm。图H是FZD的示意图。在拉下(pull-down)测定中，重组Fc标记的FZD2-CRD与固定的GST标记的TcdB1501-2366直接结合，但不与GST标记的CROP区(残基1831-2366)结合。图I是使用生物层干涉(bio-layerinterferometry，BLI)测定法的TcdB与FZD1、2、5和7的Fc标记的CRD之间的相互作用的表征。FZD1/2/7与TcdB之间的结合曲线符合具有低纳摩尔Kd的单个结合位点(对于详细的Kd分析，参见图14)。图J示出了当通过GPI锚在CSPG4-/-细胞表面上表达时，FZD7-CRD而非FZD8-CRD介导TcdB与细胞的结合。
图3示出了FZD可作为独立于CSPG4的TcdB受体发挥作用。图A示出了CSPG4/NG2-E固定在微量滴定板上，然后结合TcdB，洗去未结合的TcdB，并添加FZD-CRD。FZD2-CRD与通过微量滴定板上的CSPG4/NG2-EC预结合的TcdB稳健地结合。在没有TcdB的情况下FZD2-CRD不与CSPG4/NG2-EC结合，在该测定中，FZD5-CRD没有示出与CSPG4/NG2-TcdB复合物的可检出的结合。图B和C示出了通过致细胞病变的细胞变圆测定(图B)和Racl的葡糖基化(图C)二者测量的，过量的重组FZD2-CRD阻止TcdB(300pM，3小时)进入CSPG4-/-细胞。人IgG1-Fc用作阴性对照。图3，图D和E示出了FZD2-CRD保护HT29(图D)和Caco-2细胞(图E)免受TcdB1-1830(300pM，3小时)。图F示出了通过细胞裂解物(200μg)的免疫印迹分析检查HeLa、HT29和Caco-2细胞表达中的内源性CSPG4。图G至图I示出了在指定的时间点通过致细胞病变的细胞变圆测定使用重组FZD2-CRD和CSPG4/NG2-EC对HeLa(图G，5pM TcdB)、HT29(图H，50pMTcdB)和Caco-2(图I，150pM TcdB)的TcdB保护程度的分析和定量。细胞的代表性图像在图15中示出。CSPG4/NG2-EC单独降低了TcdB进入HeLa细胞，表明CSPG4是HeLa细胞中的显性受体。CSPG4/NG2-EC和FZD2-CRD的组合为HT29细胞提供了免受TcdB的重要保护，表明CSPG4和FZD可能对毒素进入HT29细胞具有等同的贡献。FZD2-CRD单独保护Caco-2细胞免受TcdB，表明FZD是Caco-2细胞中TcdB的显性受体。
图4示出了FZD是结肠类器官(colonic organoid)中TcdB的功能性受体。图A示出了WT和FZD7-/-/FZD1/2KD类器官在有和没有暴露于TcdB(0.5pM，3天)的情况下的微分干涉相差(differential interference contrast，DIC)图像，这表明TcdB诱导WT类器官的萎缩和死亡。比例尺表示200μm。图B示出了当WT和FZD7-/-/FZD1/2KD类器官暴露于TcdB的滴定时，用MTT测定对WT和FZD7-/-/FZD1/2KD类器官进行类器官生存力的定量(*p＜0.005，n＝4)。图C示出了TcdB对WT、FZD7-/-和FZD7-/-/FZD1/2KD类器官的IC50(定义为3天后导致50％生存力的TcdB浓度)(*p＜0.005，n＝4)。图D示出了TcdB的无毒片段(残基1114-1835)在细胞中阻断Wnt3a介导的信号传导，这是使用TOPFLASH/TK-海肾双萤光素酶报道子测定法分析的。图E示出了无毒片段TcdB1114-1835抑制WT结肠类器官的生长并导致类器官死亡，这通过添加CHIR99021而被挽救。标记了正常的类器官(用字母“a”表示)、生长受抑制的类器官(用字母“b”表示)和破坏的/死亡的类器官(*)。比例尺表示200μm。图F示出了在存在和不存在5μMCHIR99021的情况下，暴露于25nM TcdB1114-1835后的类器官的生存力，如用MTT测定法测量并作图(*p＜0.005，n＝4)。
图5示出了FZD是体内结肠上皮中的生理学相关受体。图A是结肠环结扎测定的示意图。在图B中，将TcdB与FZD2-CRD或IgG1-Fc对照一起注射到WT小鼠中的结扎的结肠段中，并孵育2小时。然后切下结肠段，用PBS清洗，并进行免疫组织化学分析以检测TcdB与结肠组织的结合。TcdB的位置用箭头标出。PBS注射用作阴性对照(左图)。TcdB与结肠上皮结合(中图)。共注射FZD2-CRD消除了TcdB与结肠上皮的结合(右图)。图C示出了注射到WT和FZD7-/-KO小鼠的结扎结肠段中的TcdB1-1830。盐水注射用作阴性对照。使小鼠恢复并存活8小时，之后切下结扎的结肠段。通过测量重量与长度来记录切下的结肠段中的流体积聚。框表示平均值±SE，且条形表示SD(*p＜0.005)。图D示出了如图C中所述进行的实验，不同之处在于将切下的结肠段固定、切片并进行H&E染色。比例尺表示100μm。图E示出了图5，图D中所述的H&E染色的结肠切片的组织学评分(平均值±SE，*p＜0.005)。图F示出了如图C中所述进行的实验，不同之处在于将切下的结肠段固定、切片并进行检测密蛋白3(Claudin 3)的免疫组织化学分析。右图是从左图中标记的区域放大的，以显示紧密连接的细节。密蛋白3用箭头标记。比例尺表示200μm。
图6示出了TcdB1-1830仍然是可在多种细胞系中诱导细胞变圆的强效毒素。图A给出了TcdB和缺少CROP区的截短的TcdB(TcdB1-1830)的示意图。GTD：葡糖基转移酶结构域；CPD：半胱氨酸蛋白酶结构域；TD：转位结构域；RBD：受体结合结构域，包括假定的受体结合区和CROP区。图B示出了暴露于如指示的TcdB和TcdB1-1830的滴定24小时的HeLa细胞。可容易地观察到细胞变圆。HeLa细胞对TcdB1-1830的敏感性低于TcdB，但TcdB1-1830仍然是诱导在皮摩尔浓度下细胞变圆的强效毒素。比例尺＝50μm。图C-E示出了暴露于如指示的TcdB和TcdB1-1830的滴定24小时的CHO(图C)、HT-29(图D)和Caco-2(图E)细胞。比例尺＝25(图D)或50μm(图C，E)。
图7示出了用TcdB和TcdB1-1830筛选之后4个细胞文库中sgRNA的排序。图A示出了sgRNA的序列通过PCR扩增并进行NGS。图B-E是排在最前面的sgRNA及其在总sgRNA读取中的相对丰度的列表。
图8示出了CRISPR/Cas9介导的敲除HeLa细胞中靶向突变位点的深度测序。用表达靶向指定基因的sgRNA的慢病毒转导HeLa-Cas9细胞。进一步用2.5μg/ml嘌呤霉素(Gibco)和200μg/ml潮霉素B选择细胞以产生稳定细胞的混合群体。提取这些细胞的基因组DNA，并且靶向突变位点的序列通过PCR扩增并进行NGS。列出了突变基因的总百分比和每个细胞群的独特突变的总数。表1至6中列出了每种细胞群的前100个特定序列。深度测序显示诱变率高(例如对于CSPG4-/-为98.7％和对于FZD2-/-为96.3％)，其大部分是移码突变(表S1-6)。由于单个细胞中随机的NHEJ(非同源末端连接)修复过程，每个sgRNA在细胞群中诱导高度多样化的突变。
图9示出了CRISPR/Cas9介导的敲除HeLa细胞对TcdB和TcdB1-1830的敏感性的评估。图A和B示出了暴露于TcdB和TcdB1-1830的滴定24小时的具有通过CRISPR/Cas9突变的所指示基因的HeLa-Cas9细胞以及WTHela-Cas9细胞。对每个指定细胞系的细胞变圆百分比进行定量，并针对TcdB(图A)或TcdB1-1830(图B)的浓度作图。图C示出了根据图A和B中的拟合曲线，在24小时之后诱导50％的细胞变圆的毒素浓度(定义为CR50)的测定。误差表示SD。*P＜0.005，单因素方差分析。图D示出了具有暴露于TcdB(上图)或TcdB1-1830(下图)3小时的突变的所指示基因的HeLa细胞。对细胞裂解物进行免疫印迹分析以得到总的Racl水平，以及未经TcdB修饰的非葡糖基化Racl。UGP2-/-细胞具有在暴露于TcdB或TcdB1-1830后仍保持非葡糖基化的显著水平的Racl。CSPG4-/-细胞在暴露于TcdB后具有显著水平的非葡糖基化Racl。与WT细胞相比，FZD2-/-和EMC4-/-细胞二者在暴露于TcdB1-1830后均具有略高水平的非葡糖基化Racl。
图10示出TcdB的CROP对于其与CSPG4/NG2-EC的结合是必需的。图A示出了CSPG4/NG2的示意图。使用重组胞外结构域(extracellular domain，EC)片段的两种级分：一种不含硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)链(EC P1)，且另一种含有CS(EC P2)。TMD-cyto：跨膜结构域和胞质结构域。图B示出了在基于微量滴定板的结合测定中，TcdB而非TcdB1-1830与CSPG4/NG2的EC P1和EC P2二者直接结合。图C示出了用暴露于TcdB(上图，10nM，10分钟)或TcdB1-1830(下图，10nM，10分钟)的所指定构建体转染的CSPG4-/-细胞。清洗细胞并对裂解物进行免疫印迹分析。IL1RAPL2和突触结合蛋白II(Synaptotagmin II，Syt II，一种肉毒杆菌神经毒素受体)用作阴性对照。CSPG4的表达提高TcdB的结合，但不提高TcdB1-1830的结合，而FZD2的表达提高TcdB和TcdB1-1830二者的结合。图D示出了CROP片段以浓度依赖性方式与细胞表面上的CSPG4/NG2结合。这种结合依赖于CSPG4/NG2，因为其在CSPG4-/-细胞中基本上被消除。高浓度的CROP片段降低了全长TcdB与细胞的CSPG4/NG2依赖性结合，这表明CROP可与全长TcdB竞争与CSPG4/NG2结合。
图11示出了FZD1、2和7可介导TcdB与CSPG4-/-细胞的结合。用1D4标记的FZD1、2、5、7和9转染CSPG4-/-HeLa细胞。将细胞暴露于TcdB(10nM，10分钟)。将细胞清洗、固定、透化，并进行免疫染色分析。比例尺＝20μm。
图12示出了FZD2可介导TcdBl501-2366与细胞的结合，但不介导CROP区与细胞的结合。用FZD2转染CSPG4-/-Hela细胞，并随后暴露于TcdB或所指示的TcdB片段。清洗细胞并对细胞裂解物进行免疫印迹分析。FZD2介导TcdB、TcdB1-1830和TcdB1501-2366的结合，但不介导CROP区(TcdB1831-2366)的结合。
图13示出了FZD1、2和7的CRD的序列比对。比对了人FZD1(残基102-235)、FZD2(残基25-158)和FZD7(残基35-168)的CRD结构域。用Vector NTI软件进行序列比对。序列从上到下对应于SEQ ID NO：14-17。
图14示出了使用BLI测定法确定的FZD同种型与TcdB之间的结合亲和力。图A示出了不同浓度的TcdB与FZD1、2、5和7的Fc标记的CRD的代表性结合/解离曲线。表征Fc标记的FZD同种型与TcdB的结合的参数由这些结合曲线计算并在表中列出。图B示出了TcdB1-1830与Fc标记的FZD2-CRD的代表性结合/解离曲线。表征FZD2与TcdB1-1830结合的参数在表中列出。FZD2示出了对TcdB(KD＝19nM)与TcdB1-1830(KD＝17nM)相似的结合亲和力。
图15示出了使用FZD2-CRD-Fc和CSPG4/NG2-EC显示保护免于TcdB的细胞的代表性图像。如图3，图G-I中所述对HeLa(图A，5pM TcdB)、HT29(图B，50pM TcdB)和Caco-2(图C，150pM TcdB)进行实验。比例尺＝50(图A和C)或25μm(图B)。
图16示出了结肠类器官对TcdB和TcdB1-1830的易感性。图A示出了由WT小鼠培养的结肠类器官。它们暴露于TcdB或TcdB1-1830的梯度。使用MTT测定法定量类器官的生存力。TcdB和TcdB1-1830示出了相似的IC50，表明WT类器官对TcdB和TcdB1-1830同样易感。图B和C示出了通过测量转染的1D4标记的FZD1和FZD2在HEK293细胞中的KD效率验证的靶向FZD1和FZD2的shRNA序列。所选的shRNA用星号标记(对于FZD1为shRNA2且对于FZD2为shRNA5)并用于产生腺病毒。肌动蛋白用作上样对照。
图17示出了TcdB1114-1835抑制Wnt信号传导。图A和B示出了暴露于培养基中的Wnt3a(50ng/ml)和TcdB1114-1835(与Wnt3a的摩尔比分别为1∶8、1∶40和1∶200)6小时的24孔板中的HEK 293T细胞。收获细胞裂解物并进行检测磷酸化的Dvl2(图A)和LRP6(图B)的免疫印迹分析。Wnt信号传导活化导致Dvl2和LRP6的磷酸化。磷酸化的Dvl2用星号标记。
图18示出了小鼠和人结肠组织中FZD1/2/7和CSPG4的表达。图A-C示出了进行免疫组织化学测定以检测FZD7(图A)、FZD2(图B)和CSPG4/NG2(图C)的表达的小鼠(左图)和人(右图)结肠冷冻切片。目靶蛋白用箭头标记。Ep：上皮细胞；Mf：上皮下肌成纤维细胞；SM：平滑肌。比例尺＝50μm。图D示出了如图A中所述进行的实验，不同之处在于检测FZD1。使用试验的抗体在小鼠和人结肠组织中检测不到FZD1的表达。
图19示出了在EMC4-/-细胞中FZD表达的降低。图A示出了用1D4标记的FZD1、2或7转染的WT和EMC4-/-HeLa细胞。对细胞裂解物进行检测FZD的免疫印迹分析。肌动蛋白用作内对照。与WT细胞相比，EMC4-/-细胞中FZD1、2和7的表达显著降低。图B示出了EMC4-/-细胞仍然表达与WT细胞相似水平的CSPG4，表明单次跨膜蛋白的表达不需要EMC。
图20示出了PVRL3无法介导TcdB的结合和进入。图A示出了用指定的构建体转染的CSPG4-/-HeLa细胞暴露于培养基中的TcdB持续10分钟。清洗细胞，并收集裂解物并进行免疫印迹分析。使用抗PVRL3抗体确认PVRL3的表达。TcdB与用FZD2转染的细胞结合，但不与用PVRL3转染的细胞结合。图B示出了在指定的时间段内用300pM TcdB攻击的细胞。PVRL3的异位表达无法恢复CSPG4-/-HeLa细胞对TcdB的敏感性，而FZD2的表达恢复了CSPG4-/-细胞中TcdB的进入。使用共转染的GFP来标记转染的细胞。比例尺＝50μm。图C示出了通过致细胞病变的细胞变圆测定法分析的过量的PVRL3重组胞外结构域(PVRL3-EC)不降低TcdB进入Caco-2细胞。相反，FZD2-CRD阻止TcdB进入Caco-2细胞。比例尺＝20μm。
图21是CRISPR/Cas9筛选中鉴定的细胞因子的示意总览图。将在我们的无偏好的全基因组筛选中鉴定的经验证的和貌似合理的细胞因子基于其存在于相同的蛋白质复合物和/或信号传导途径中而分组。基因名称的颜色反映了鉴定的独特sgRNA的数目。箭头将这些基因与TcdB作用的四个主要步骤中经确认的或貌似合理的作用联系起来：(1)受体介导的内吞作用；(2)内体中的低pH触发TD的构象改变，其使GTD穿过内体膜转位；(3)GTD随后通过自身蛋白水解由CPD而释放，所述CPD由胞质辅因子肌醇六磷酸(inositolhexakisphosphate，InsP6)活化；(4)使用UDP-葡萄糖作为供体，释放的GTD使小GTP酶(例如Rho、Rac和CDC42)葡糖基化。
发明详述
艰难梭菌毒素B(TcdB)是引起与艰难梭菌感染(CDI)相关疾病的关键毒力因子。CDI导致从腹泻到危及生命的伪膜性结肠炎和中毒性巨结肠的一系列病理状况(1，2)。它是发达国家中抗生素相关性腹泻的最常见原因以及胃肠炎相关死亡的首要原因，在美国每年造成近50万病例以及29,000例死亡(3)。两种同源艰难梭菌外毒素(毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB))是与CDI相关的疾病的致病病原(4-6)。这些毒素通过受体介导的内吞作用进入细胞，并通过将关键残基葡糖基化而使小GTP酶失活，这导致细胞变圆并最终导致细胞死亡(4，5，7)。
本文中公开了Wnt受体卷曲受体(FZD)鉴定为TcdB受体。TcdB与Wnt竞争与FZD中保守的富含半胱氨酸结构域(CRD)结合并且作为Wnt信号传导的强效抑制剂发挥作用。TcdB与FZD的结合通过抑制Wnt信号传导直接破坏结肠上皮细胞的完整性及其自我更新。在本公开内容的一个方面中，我们鉴定了结合FZD的TcdB区域(例如，TcdB1114-1835)。TcdB1114-1835是含有FZD结合结构域但不包含酶结构域(即，半胱氨酸蛋白酶结构域或葡糖基转移酶结构域)的TcdB无毒片段，其与野生型TcdB竞争并抑制野生型TcdB。因此，还考虑使用TcdB1114-1835用于治疗CDI和其他疾病。
不希望受任何特定机制或理论的束缚，认为本公开内容的一些方面至少部分地依赖于艰难梭菌感染的新机制。这种机制涉及TcdB在结肠上皮细胞中抑制Wnt信号传导的作用。在两种艰难梭菌毒素中，TcdB单独就能够引起多种疾病。然而，由于缺乏已建立的受体，TcdB如何靶向结肠上皮细胞很大程度上仍然不明确。硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4，在啮齿动物中也称为神经胶质抗原2(NG2))已经被鉴定为HeLa细胞和结直肠细胞系HT-29中TcdB的功能性受体。然而，CSPG4在结肠上皮细胞中不表达。最近表明脊髓灰质炎病毒受体样3(Poliovirus receptor-like 3，PVRL3)是在HeLa细胞和结直肠细胞系Caco-2中暴露于高浓度的TcdB后导致坏死细胞死亡过程(细胞毒性)的细胞因子，但PVRL3是否是结肠上皮细胞中相关的TcdB受体仍然未知，并且其在直接介导TcdB进入细胞中的作用尚未确定。
本公开内容的实施例和附图中描述的是使用CRISPR/Cas9介导的敲除筛选系统鉴定和验证结肠上皮细胞中的TcdB受体。CRISPR/Cas9系统及其用途是本领域中已知的，例如美国专利公开US20140357530，其全部内容通过引用在此并入。在本公开内容中数种卷曲受体家族蛋白(FZD)被鉴定并验证为新的和病理学上相关的TcdB受体。在10种已知的FZD蛋白中，FZD1、2和7被鉴定为介导艰难梭菌发病机制的最重要的TcdB受体。此外，FZD1、2和7对于TcdB而言是冗余受体并且具有重叠功能。TcdB与FZD的结合介导毒素进入细胞。TcdB催化上皮细胞内小GTP酶的糖基化，导致细胞变圆和死亡。因此，本文中展示了独立于TcdB发病机制的细胞内机制的新机制，涉及通过竞争FZD受体来抑制Wnt信号传导。
FZD是已知参与Wnt信号传导的跨膜蛋白。这些受体跨越质膜七次并构成G蛋白偶联受体(GPCR)的独特家族。FZD在控制细胞极性、胚胎发育、神经突触的形成、细胞增殖以及发育和成年生物体中的许多其他过程中发挥关键作用，其中许多与Wnt信号传导途径相关。
Wnt信号传导途径是包含通过细胞表面受体将信号传递到细胞中的蛋白质的一组信号转导途径。已经表征了三种Wnt信号传导途径：经典Wnt途径、非经典平面细胞极性途径和非经典Wnt/钙途径。通过使Wnt-蛋白质配体与卷曲受体家族受体结合来活化所有三种途径，所述卷曲受体家族受体将生物信号传递至细胞内的蛋白质。经典的Wnt途径导致基因转录的调节。非经典的平面细胞极性途径调节负责细胞形状的细胞骨架。非经典的Wnt/钙途径调节细胞内的钙。Wnt信号传导途径使用附近的细胞-细胞通信(旁分泌)或同一细胞通信(自分泌)。
首先鉴定了Wnt信号传导在癌发生中的作用，然后是其在胚胎发育中的功能。Wnt信号传导还控制成人骨髓、皮肤和肠中的组织再生。例如，Wnt信号传导对于维持体内结肠干细胞是必需的，结肠干细胞不断产生新的上皮细胞。干细胞的健康对于维持和修复上皮细胞至关重要，上皮细胞以惊人的速率翻转：整个结肠上皮细胞每5至7天完全更换一次。因此，如本公开内容中所展示的，在艰难梭菌感染期间，Wnt信号传导途径的抑制导致结肠干细胞的消耗并且极大地增大了对上皮的损伤。
本文中还提供了与TcdB和Wnt二者相互作用的FZD区域，这导致竞争。TcdB和Wnt二者均与FZD的N端胞外富含半胱氨酸结构域(FZD-CRD)结合。显示TcdB优先结合FZD1、2和7。FZD1、2和7的CRD高度保守，具有超过98％的序列相似性(序列比对参见图13)。本文中提供了FZD1、2和7的CRD的氨基酸序列。
FZD1-CRD(SEQ ID NO：24)
FZD2-CRD(SEQ ID NO：25)
FZD3-CRD(SEQ ID NO：26)
与FZD-CRD相互作用的TcdB区域被鉴定为在TcdB蛋白(全长TcdB蛋白，SEQ ID NO：27)的第1501至1830位氨基酸之间。对应于与FZD-CRD相互作用的TcdB区域的多肽片段，例如第1114至1835位氨基之间的TcdB多肽片段(下文中称为“TcdB1114-1835”，SEQ ID NO：18)能够与Wnt竞争并且抑制Wnt信号传导，并且缺乏TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性和葡糖基转移酶活性。这样的TcdB1114-1835多肽片段阻止野生型致病性TcdB进入细胞。此外，由于其缺乏半胱氨酸蛋白酶活性和葡糖基转移酶活性，进入细胞的TcdB1114-1835片段是无毒的。此外，还提供了具有与TcdB1114-1835相似活性的两种另外的无毒多肽：TcdB1028-1835(SEQ ID NO：19)和TcdB1114-2101(SEQ ID NO：20)。
全长TcdB氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
TcdB1114-1835氨基酸序列(SEQ ID NO：18)
TcdB1028-1835氨基酸序列(SEQ ID NO：19)
TcdB1114-2101氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
在一些实施方案中，本公开内容使得可获得分离和/或纯化形式的多肽。本文中使用的“分离的多肽”是指从中分离或基本上不含(例如，至少80％、90％、95％、97％、99％或99.5％不含)其他蛋白质和/或其他多肽(例如，TcdB多肽种类)的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽100％不含其他蛋白质和/或其他多肽(例如，TcdB多肽种类)。
本公开内容的分离的多肽阻断或抑制细胞中的Wnt信号传导。本文中使用的“阻断”或“抑制”意指与正常生理状况相比，Wnt信号传导的幅度降低。Wnt信号传导的抑制加剧了CDI的病理学结果。相反，在某些异常或病理状况(例如，癌症)中，与正常生理状况相比，Wnt信号传导也可提高或是过度活跃的。在不同细胞类型的正常生理条件下Wnt信号传导的幅度可变化并且是本领域中已知的。异常的Wnt信号传导或Wnt信号传导途径的功能障碍是多种疾病的潜在机制。因此，在本公开内容中随后考虑了治疗此类疾病的方法。
在一些实施方案中，本公开内容的分离的多肽包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中所述多肽不具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少85％、至少至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：19具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的多肽包含与SEQ ID NO：19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：20具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的多肽包含与SEQ ID NO：20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：18具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：19具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：20具有85％、86％、87&、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。
使用如在Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993中修改的Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990的算法确定两个氨基酸序列的“百分比同一性”。这种算法被引入Altschul等J.Mol.Biol.215：403-10，1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可使用如在Altschul等Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997中的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本文中描述的多肽可缀合或以其他方式共价连接至其他分子(例如，使用化学接头)。一种这样的连接形式是通过非酰胺连接(例如，二硫键)。在一些实施方案中，多肽共价连接(例如，通过接头分子)至适于增强分子半衰期的抗体或其结构域(例如，Fc结构域中的一个或更多个恒定结构域)。在一些实施方案中，多肽与本文中公开的Fc结构域(例如，IgG、IgA、IgM、IgD或IgE)连接。
在一些实施方案中，本公开内容的分离的多肽还包含融合结构域。因此，本文中还提供了具有一个或更多个融合结构域的多肽片段的功能变体或修饰形式。这样的融合结构域的公知实例包括但不限于多聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构域以便赋予所期望的特性。例如，一些融合结构域特别适用于通过亲和色谱分离融合蛋白。出于亲和纯化的目的，使用用于亲和色谱的相关基质，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-和镍-或钴-缀合的树脂。许多这样的基质可以以“试剂盒”形式获得，例如可用于(HIS6)融合伴侣(fusion partner)的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统(Qiagen)。在一些实施方案中，分离的多肽片段与在体内稳定分离的多肽片段的结构域(“稳定者”结构域)融合。本文中使用的“稳定”意指体内多肽的半衰期延长，无论这是否是由于破坏降低、通过肾的清除率降低或其他药代动力学效应。已知与免疫球蛋白的Fc部分融合可对多种蛋白质赋予所期望的药代动力学性质。同样地，与人血清白蛋白的融合可赋予所期望的性质。可选择的其他类型的融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能结构域。
在一些实施方案中，本公开内容的分离的多肽还包含人IgG1的Fc部分(SEQ IDNO：28)。因此，本文中还考虑了融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc部分。在一些实施方案中，融合蛋白包含含有与SEQ ID NO：18具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合。例如，本公开内容的融合蛋白中的多肽可包含与SEQ ID NO：18具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含含有与SEQ ID NO：18具有95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含含有与SEQID NO：19具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合。例如，本公开内容的融合蛋白中的多肽可包含与SEQ ID NO：19具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含含有与SEQ ID NO：19具有95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含含有与SEQ ID NO：20具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合。例如，本公开内容的融合蛋白中的多肽可包含与SEQ ID NO：20具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99％、至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含含有与SEQ ID NO：20具有95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含与人IgG1的Fc部分融合的由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的多肽。本文中还提供了示例性融合蛋白，其包含与Fc结构域融合的TcdB1114-1835多肽(SEQ ID NO：21)、与Fc结构域融合的TcdB1028-1835多肽(SEQID NO：22)和与Fc结构域融合的TcdB1114-2101多肽(SEQ ID NO：23)。提供了示例性的分离的多肽片段仅用于举例说明目的，并不意味着限制。
人IgG1的Fc部分(SEQ ID NO：28)
TcdB1114-1835-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：21)
TcdB1028-1835-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：22)
TcdB1114-2101-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：23)
任选地，Fc结构域可在残基例如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434处具有一个或更多个突变。在某些情况下，具有一个或更多个这些突变(例如，Asp-265突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有降低的与Fc受体结合的能力。在另一些情况下，具有一个或更多个这些突变(例如，Asn-434突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有提高的与结合MHCI类相关Fc受体(FcRN)结合的能力。
应理解，融合蛋白的不同元件可以以与所期望功能一致的任何方式排列。例如，TcdB1114-1835多肽可位于异源结构域的C端，或者，异源结构域可位于TcdB1114-1835多肽的C端。TcdB1114-1835多肽结构域和异源结构域不需要在融合蛋白中相邻，并且另外的结构域或氨基酸序列可包括在结构域的C端或N端或者在结构域之间。
本文中使用的术语“免疫球蛋白Fc区”或简称“Fc”应理解为意指免疫球蛋白链恒定区的羧基端部分，优选免疫球蛋白重链恒定区或其一部分。例如，免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或5)两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc区至少包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选缺少CH1结构域。
在一些实施方案中，获得重链恒定区的免疫球蛋白类别是IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)。可使用其他类别的免疫球蛋白，IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。在美国专利No.5,541,087和5,726,044中详细讨论了合适的免疫球蛋白重链恒定区的选择。选择来自某些免疫球蛋白类别和亚类的特定免疫球蛋白重链恒定区序列以实现被认为在本领域技术水平内的特定结果。编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分优选包含铰链结构域的至少一部分，且优选Fcγ的CH3结构域的至少一部分或者IgA、IgD、IgE或IgM中任一种的同源结构域。
此外，考虑了免疫球蛋白重链恒定区内氨基酸的替换或缺失可用于实践本文中公开的方法和组合物。一个实例是在上部CH2区域中引入氨基酸替换以产生对Fc受体具有降低的亲和力的Fc变体(Cole等(1997)J.Immunol.159：3613)。
任选地，本公开内容的分离的多肽可包含修饰。包含修饰的多肽具有除氨基酸内容之外的另外特征。本文中使用的肽的“修饰”或“衍生物”产生修饰的或衍生化的多肽，其是相对于参照肽进行化学修饰的给定肽的形式，所述修饰包括但不限于寡聚化或多聚化，氨基酸残基或肽骨架的修饰，交联、环化、缀合、PEG化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰化、羧基化、脂化、巯基乙酸酰胺化、烷基化、甲基化、聚苷氨酰化、糖基化、聚唾液酸化、腺苷酰化、PEG化、与另外异源氨基酸序列融合，或基本上改变肽的稳定性、溶解性或其他性质同时基本上保留本文中所述多肽的活性的其他修饰。应理解的是，包含此类修饰的分离的多肽是交联的、环化的、缀合的、酰化的、羧基化的、脂化的、乙酰化的、巯基乙酸酰胺化的、烷基化的、甲基化的、聚苷氨酰化的、糖基化的、唾液酸化的、磷酸化的、腺苷酰化的、PEG化的，或其组合。因此，本公开内容的经修饰的多肽片段可包含非氨基酸要素，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸酯。本公开内容的分离的多肽可包含本文中公开的在C端的修饰(例如，C端酰胺化)、N端的修饰(例如，N端乙酰化)。末端修饰是有用的，并且是公知的，以降低对蛋白酶消化的易感性，并因此用于延长多肽在溶液中，特别是在可能存在蛋白酶的生物流体中的半衰期。在一些实施方案中，本文中所述的多肽或融合蛋白在序列内进一步修饰，例如通过末端-NH2酰化修饰，例如，乙酰化或巯基乙酸酰胺化，通过末端羧基酰胺化，例如用氨、甲胺以及类似的末端修饰。
末端修饰是可用的，以降低对蛋白酶消化的易感性，并因此用于延长多肽在溶液中(特别是在可存在蛋白酶的生物流体中)的半衰期。氨基端修饰包括甲基化(例如，-NHCH3或-N(CH3)2)、乙酰化(例如，用乙酸或其卤代衍生物，例如α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸)、添加苄氧基羰基(Cbz)基团，或用任何含有由RCOO-定义的羧酸酯官能团或由R-SO2-定义的磺酰基官能团的封闭基团(其中R选自烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基等，以及类似的基团)来封闭氨基端。还可在N端并入脱氨基酸(使得不存在N端氨基)以降低对蛋白酶的易感性或限制多肽的构象。在某些实施方案中，N端用乙酸或乙酸酐乙酰化。
羧基端修饰包括用羧酰胺基团替代游离酸或在羧基端形成环状内酰胺以引入结构限制(structural constraint)。还可使本文中所述的肽环化，或在肽的末端并入脱氨基或脱羧基残基，以使得不存在末端氨基或羧基，以降低对蛋白酶的易感性或限制肽的构象。环肽合成的方法是本领域中已知的，例如，在美国专利申请No.20090035814；Muralidharan和Muir，2006，Nat Methods，3：429-38；以及Lockless和Muir，2009，Proc Natl Acad Sci US A.6月18日，Epub。本文中所述肽的C端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基和羧基，及其低级酯衍生物，及其可药用盐。
在一些实施方案中，本文中所述的多肽或融合蛋白是磷酸化的。还可通过磷酸化和其他方法容易地修饰肽(例如，如在Hruby等，(1990)Biochem J.268：249-262中所述)。还可用其他侧链替换遗传编码的氨基酸(或立体异构D氨基酸)的天然存在的侧链，例如用例如烷基，低级(C1-6)烷基，环4-、5-、6-至7-元烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基及其低级酯衍生物，以及用4-、5-、6-、7-元杂环。特别地，可使用其中脯氨酸残基的环大小从5元变为4、6或7元的脯氨酸类似物。环状基团可以是饱和的或不饱和的，且如果是不饱和的，可以是芳香族或非芳香族的。杂环基团优选含有一个或更多个氮、氧和/或硫杂原子。此类基团的实例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异唑基、吗啉基(例如，吗啉代)、唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶子基(piperidino))、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)和三唑基。这些杂环基可以是经取代的或未经取代的。当基团被取代时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧或者经取代或未经取代的苯基。
在一些实施方案中，本公开内容的分离的多肽是多聚体的，例如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方案中，用于形成寡聚多肽的分子接头是肽接头分子。在一些实施方案中，肽连接分子包含至少一个氨基酸残基，其连接至少两个根据本发明的肽。肽接头包含例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基，且优选少于50个氨基酸残基。肽连接分子可共价或非共价地偶联多肽或蛋白质。用于连接的典型氨基酸残基是甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。肽接头在其氨基端连接至一个肽、多肽或多肽结构域(例如，C-肽)，并且在其羧基端连接至另一个肽、多肽或多肽结构域(再次，例如，C-肽)。可用的接头肽的实例包括但不限于甘氨酸聚合物((G)n)，包括甘氨酸-丝氨酸和甘氨酸-丙氨酸聚合物(例如，(Gly4Ser)n重复，其中n＝1至8，优选地，n＝3、4、5或6)。肽接头分子的另一些实例描述于美国专利号5,856,456中，并通过引用在此并入。
在另一个实施方案中，分子接头是化学接头，例如通过半胱氨酸氨基酸残基之间的二硫键或通过胺交联剂(例如，戊二醛、双(亚氨基酯)、双(琥珀酰亚胺酯)、二异氰酸酯和二酰氯)形成的化学桥的连接。关于化学交联剂的大量数据可见于INVITROGEN的MolecularProbe的5.2节中。
在某些实施方案中，本文中所述的肽单体通过共价连接至至少一个接头部分而被二聚化或多聚化。接头部分优选但非必须是C1-12连接部分，其任选地以一个或两个-NH-连接封端，并且任选地在一个或更多个可用的碳原子上被低级烷基取代基所取代。优选地，接头包含--NH-R--NH--，其中R是被官能团(例如羧基或氨基)取代的低级(C1-6)亚烷基，其能够与另一个分子部分(例如，如在肽合成期间可存在于固体支持物的表面上或与药代动力学修饰剂(例如PEG))结合。在某些实施方案中，接头是赖氨酸残基。在某些另一些实施方案中，接头通过同时连接至每个单体的C端氨基酸而桥接两个肽单体的C端。在另一些实施方案中，接头通过连接至不在C端的氨基酸侧链而桥接肽。当接头连接至不在肽C端氨基酸的侧链时，侧链优选含有胺，例如见于赖氨酸中的那些，并且接头含有两个或更多个能够与肽形成酰胺键的羧基。
本文中所述的多肽、融合蛋白和多肽多聚体可连接至一个或更多个聚合物部分。优选地，这些聚合物共价连接至本公开内容的多肽。优选地，对于最终产品制备物的治疗用途，聚合物是可药用的。本领域技术人员将能够基于如下考虑选择所期望的聚合物：聚合物-肽缀合物是否将在治疗上使用，如果是，所需的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性和其他考虑因素。
合适的聚合物包括，例如，聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、纤维素和纤维素衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α，β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。这样的聚合物可具有或不具有其自身的生物学活性。聚合物可与多肽共价或非共价缀合。用于延长血清半衰期和用于放射疗法的缀合方法是本领域中已知的，例如，在美国专利No.5,180,816、6,423,685、6,884,780和7,022,673中，其通过引用在此整体并入。
在一些实施方案中，如本文中所述的多肽单体、二聚体或多聚体可连接至一个或更多个水溶性聚合物部分。水溶性聚合物可以是例如聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(propropylene glycol homopolymer)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物和聚氧乙烯化多元醇。优选的水溶性聚合物是PEG。
聚合物可以是任何分子量，并且可以是支链的或非支链的。反应物PEG的平均分子量优选为约3,000至约50,000道尔顿(术语“约”表示在PEG的制备中，一些分子将比所述分子量更大，以及一些比所述分子量更小)。更优选地，PEG具有约10kDa至约40kDa的分子量，且甚至更优选地，PEG具有15至30kDa的分子量。可使用其他大小，这取决于期望的治疗特征(例如，期望的持续释放的持续时间；对生物学活性的影响，如果有的话；易于处理；抗原性的程度或缺乏；以及本领域技术人员已知的PEG对治疗肽的其他影响)。
连接的聚合物分子的数量可变化；例如，一个、两个、三个或更多个水溶性聚合物可连接至本公开内容的肽上。多个连接的聚合物可以是相同或不同的化学部分(例如，不同分子量的PEG)。
在某些实施方案中，PEG可连接至肽单体或二聚体的至少一端(N端或C端)。在另一些实施方案中，PEG可连接至肽单体或二聚体的接头部分。在一个优选的实施方案中，PEG连接至肽二聚体的接头部分。任选地，接头包含多于一个能够用适当活化的PEG物质衍生化的反应性胺。
在一些实施方案中，本文中所述的分离的多肽、融合蛋白或多肽多聚体(无论是单体的、寡聚的还是环状的)是PEG化的。PEG化是将聚乙二醇聚合物链共价连接到另一分子(通常是药物或治疗性蛋白质)的过程。通常通过将PEG的反应性衍生物与靶标大分子一起孵育来实现PEG化。PEG与药物或治疗性蛋白质的共价连接可从宿主免疫系统“掩蔽”药剂(降低免疫原性和抗原性)，并提高药剂的流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)，这通过降低肾清除率来延长其循环时间。PEG化还可为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。与未经修饰形式相比，PEG化通过提高分子的分子量可赋予数个显著的药理学优势，例如：改善的药物溶解性、降低的剂量频率、没有减弱效力而具有潜在降低的毒性、延长的循环寿命、提高的药物稳定性和增强免于蛋白水解降解的保护。此外，PEG化药物具有更广泛的新递送形式和给药方案的机会。使分子、蛋白质和肽PEG化的方法是本领域中公知的，例如，如在美国专利No.5,766,897；7,610,156；7,256,258和国际申请No.WO/1998/032466中所描述的。
本文中涵盖本文中描述的多肽或其变体或衍生物的缀合物。除聚乙二醇(PEG)外，这些多肽还可与其他聚合物缀合。聚合物可具有或不具有其自身的生物学活性。聚合物缀合的其他实例包括但不限于聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、纤维素和纤维素衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α，β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。与聚合物的缀合可改善血清半衰期等效果。可使用多种螯合剂来缀合本文中所述的肽。这些螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三氨基戊乙酸(DTPA)、乙二醇-0，0′-双(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、N，N′-双(羟基苄基)乙二胺-N，N′-二乙酸(HBED)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十三烷-1，4，7，10-四乙酸(TITRA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)和1，4，8，11-四氮杂环十四烷(TETRA)。缀合方法是本领域中公知的，例如P.E.Thorpe等，1978，Nature 271，752-755；Harokopakis E.，等，1995，Journal of Immunological Methods，185：31-42；S.F.Atkinson，等，2001，J.Biol.Chem.，276：27930-27935；以及美国专利No.：5,601,825，5,180,816，6,423,685，6,706,252，6,884,780和7,022,673，其通过引用在此整体并入。
在一些实施方案中，当与分离的多肽连接时，聚合物延长分离的多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，当与分离的多肽连接时，聚合物延长分离的多肽的保质期。本文中使用的分离的多肽的“血清半衰期”是指体内多肽的浓度或量降低一半所需的时间。多肽的血清半衰期取决于它从血清中消除的有多快。血清半衰期越长，多肽在体内越稳定。“保质期”是指从制造日起，产品在规定条件下储存时，预期保持在其批准的产品规格内的时间段。期望的是，治疗剂(例如本公开内容的分离的多肽)具有更长的保质期。
用于稳定本领域中已知的肽的其他方法可用于本文中所述的方法和组合物。例如，使用D-氨基酸，使用用于肽骨架的还原的酰胺键，以及使用非肽键来连接侧链，包括但不限于吡咯啉酮和糖模拟物各自可提供稳定化。Hirschmann等描述了糖支架肽模拟物的设计和合成(J.Med.Chem.，1996，36，2441-2448，其通过引用整体并入本文)。此外，基于吡咯啉酮的肽模拟物在稳定的背景下呈现肽药效团，其具有改善的生物利用度特征(参见例如Smith等，J.Am.Chem.Soc.2000，122，11037-11038)，其通过引用整体并入本文。
本公开内容的分离的多肽可包含保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”是指将氨基酸变为具有相似生物化学性质(例如，电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸的氨基酸替换。氨基酸的保守替换包括例如在下列组中的氨基酸之间进行的替换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；(g)E、D。保守的氨基酸替换不改变其中进行氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或大小特征。保守的氨基酸替换通常不改变肽的总体结构和/或可用于与结合伴侣(binding partner)结合形成范德华键的氨基酸侧链的类型。在一些实施方案中，分离的多肽可包含1至100个保守的氨基酸替换。例如，分离的多肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46，47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个保守的氨基酸替换。
通过在合成过程中以合适的顺序添加期望的替代氨基酸，可在肽的化学合成过程中实现氨基酸替换。或者，可使用分子生物学方法。在其基本上保留本文中所述那些肽的活性的程度上也涵盖非保守性替换。
氨基酸替换的多肽将基本上保留未替换的多肽的活性。“基本上保留”意指在相似的条件下，与类似测定中的原始多肽的活性相比，变体的一种或更多种活性为至少50％；优选活性为与原始多肽相比至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少为10倍，至少100倍或更高的活性。
预见了本文中所述的多肽、融合蛋白和寡聚物多肽的不同修饰和衍生化的所有组合。衍生化多肽的修饰物、衍生物和方法描述于公布的国际申请WO 2010/014616中，其内容通过引用并入本文。
本公开内容的另一些方面提供了包含第一部分和第二部分的嵌合分子，其中第一部分是本文中公开的任何分离的多肽、融合蛋白、多聚体多肽或变体/衍生物。应理解，嵌合分子的第二部分不是与嵌合分子的第一部分相同的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子的第一部分是结合卷曲受体(FZD)的分离的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽与FZD的结合阻断Wnt信号传导途径。
在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分包含治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是抗菌剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是抗生素。可根据本公开内容使用的抗菌剂的类别包括但不限于氨基糖苷类、安沙霉素类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、林可酰胺类、脂肽类、大环内酯类、单环β-内酰胺类(monobactams)、硝基呋喃类、唑烷酮类、青霉素类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。应理解，本文中可使用可与多肽连接的本领域中任何已知的抗菌剂。
在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分可以是结合卷曲受体共受体的结合剂或抗体。本领域中已知，为了促进Wnt信号传导，在Wnt蛋白和FZD之间的相互作用的同时可需要共受体。在活化受体后，将信号发送至磷蛋白Dishevelled(Dsh)，其位于细胞质中。通过抗体的结合阻断卷曲受体共受体也阻断了Wnt信号传导。卷曲受体共受体的实例包括但不限于脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6、受体酪氨酸激酶(RTK)以及酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR2)。因此，本文中所述的卷曲受体共受体的抗体可用作本公开内容的嵌合分子的第二部分，在受体水平促进Wnt信号传导的阻断。
在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分可以是与第一部分的多肽融合的FZD-CRD。在一些实施方案中，第二部分包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分包含与SEQ ID NO：24具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分包含与SEQ ID NO：24具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分包含与SEQ ID NO：25具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或99.5％同一性的氨基酸序列。在在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分包含与SEQ ID NO：25具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分包含与SEQ ID NO：26具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合分子的第二部分包含与SEQ ID NO：26具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列。
本公开内容的分离的多肽(例如，包含SEQ ID NO：18至26中任一个的氨基酸序列的多肽)通常将通过在合适的细胞(例如，大肠杆菌或昆虫细胞)中表达形式重组核酸来产生并分离的。可通过本领域中已知的任何方法获得编码本文中所述编码多肽的核酸并确定核酸的核苷酸序列。本文中还提供了编码本文中公开的任何分离的多肽片段的分离的和/或重组的核酸。例如，SEQ ID NO：29编码TcdB1114-1835多肽。编码本公开内容的分离的多肽片段的核酸可以是双链或单链的DNA或RNA。
TcdB1114-1835核酸序列(SEQ ID NO：29)
在某些方面，编码分离的多肽片段的目标核酸进一步理解为包含编码作为SEQ IDNO：18至23的变体的多肽的核酸。变体核苷酸序列包括差别是一个或更多个核苷酸替换、添加或删除的序列，例如等位基因变体。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：21具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：22具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：23至少具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：18具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：19具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：20具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：21具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：22具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：23具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，核酸包含在载体(例如表达载体)内。在一些实施方案中，载体包含与核酸可操作地连接的启动子。
多种启动子可用于表达本文中所述的多肽，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒LTR(例如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lacUV5启动子和单纯疱疹病毒tk启动子。
还可使用可调节的启动子。这样的可调节启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节子来调节含有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录的那些[Brown，M.等，Cell，49：603-612(1987)]，使用四环素阻遏物(tetR)的那些[Gossen，M.，和Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992)；Yao，F.等，Human Gene Therapy，9：1939-1950(1998)；Shockelt，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995)]。其他系统包括FK506二聚体、使用astradiol的p65或VP16、RU486、diphenol murislerone或雷帕霉素。可诱导系统可从Invitrogen、Clontech和Ariad获得。
可使用包括具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可作为转录调节子发挥作用以调节来自含有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等，Cell，49：603-612(1987)]；Gossen和Bujard(1992)；[M.Gossen等Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)]将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP16)组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，其具有来自人巨细胞病毒(hCMV)的主要立即早期启动子的含有tetO的最小启动子，以产生tetR-tet操纵子系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关(Yao等，Human Gene Therapy；Gossen等，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)；Shockett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995))。
另外，载体可含有例如以下的一些或全部：选择标记基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的附加体复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRESes)、多功能多克隆位点；以及用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6RNA启动子。用于产生含有转基因的载体的合适载体和方法是本领域中公知的和可获得的。
可通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含核酸的表达载体转移至宿主细胞，并随后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文中所述的多肽。在一些实施方案中，本文中所述多肽的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
用于表达本文中所述的分离的多肽的宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌)，或优选真核细胞。特别地，与来自例如人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体联合的哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO))是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等(1986)“Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors，”Gene 45：101-106；Cockett等(1990)“High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases InChinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification，”Biotechnology 8：662-667)。
可使用多种宿主表达载体系统来表达本文中所述的分离的多肽。这样的宿主表达系统不仅代表可产生和随后纯化本文中所述的分离的多肽的编码序列的载剂，而且也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文中所述的分离的多肽的细胞。这些包括但不限于用含有本文中所述分离多肽的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有编码本文中所述分离多肽的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，Saccharomyces pichia)；用含有编码本文中所述分离多肽的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有编码本文中所述分离的多肽的序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利No.5,807,715)、PerC.6细胞(由Crucell开发的人视网膜细胞)，所述哺乳动物细胞系统含有来自于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自于哺乳动物病毒基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
在细菌系统中，根据预期用于被表达的多肽的用途，可有利地选择多种表达载体。例如，当要产生大量这样的蛋白质时，为了产生本文中所述多肽的药物组合物，可期望易于纯化的指导高水平融合蛋白产物表达的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Rüther等(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones，”EMBO J..2：1791-1794)，其中编码序列可用lacZ编码区单独连接到载体框架中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等(1985)“Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli，”Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等(1989)“Expression Of HumanAsparagine Synthetase In Escherichia Coli，”J.Biol.Chem.24：5503-5509)等。还可使用pGEX载体来用谷胱甘肽S-转移酶(GST)将外源多肽表达为融合蛋白。通常来说，这样的融合蛋白是可溶的，并且可通过吸附和与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠结合，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而易于从裂解的细胞中纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点以使得克隆的靶基因产物可从GST部分释放。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。编码序列可单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，目的编码序列可连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，E1区或E3区)将产生可存活并且能够在受感染的宿主中表达免疫球蛋白分子的重组病毒(例如，参见Logan等(1984)“Adenovirus Tripartite LeaderSequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。为了高效地翻译插入的抗体编码序列，还可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望编码序列的阅读框同相(in phase)以确保整个插入序列的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有多种来源，包括天然的和合成的。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可增强表达的效率(参见Bitter等(1987)“Expression And SecretionVectors For Yeast，”Methods in Enzymol.153：516-544)。
另外，可选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或以所期望的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可以是重要的。例如，在某些实施方案中，本文中所述的多肽可作为单个基因产物(例如，作为单个多肽链，即作为多蛋白前体(polyprotein precursor))表达，需要通过天然或重组细胞机制进行蛋白水解切割以形成本文中所述的单独多肽。本公开内容因此涵盖改造核酸序列以编码包含本文中所述多肽的多蛋白前体分子，其包括能够指导所述多蛋白前体的翻译后切割的编码序列。多蛋白前体的翻译后切割产生了本文中所述的多肽。包含本文中所述多肽的前体分子的翻译后切割可在体内发生(即，在宿主细胞内通过天然或重组细胞系统/机制，例如在适当位点处的弗林蛋白酶切割)或可在体外发生(例如，在包含已知活性的蛋白酶或肽酶的组合物中和/或在包含已知促进所期望蛋白水解作用的条件或试剂的组合物中孵育所述多肽链)。重组蛋白的纯化和修饰是本领域中公知的，使得多蛋白前体的设计可包括技术人员容易理解的多个实施方案。本领域中已知的任何已知蛋白酶或肽酶可用于所描述的前体分子修饰，例如凝血酶或因子Xa(Nagai等(1985)“Oxygen BindingProperties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：7252-7255，并在Jenny等(2003)“A Critical Review Of TheMethods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa，”ProteinExpr.Purif.31：1-11中进行了综述，其中各自通过引用整体并入本文)、肠激酶(Collins-Racie等(1995)“Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic SubunitIn Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA，”Biotechnology 13：982-987，其通过引用在此整体并入本文))、弗林蛋白酶和AcTEV(Parks等(1994)“Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using ARecombinant Plant Virus Proteinase，”Anal.Biochem.216：413-417，其通过引用在此整体并入本文))和口蹄疫病毒蛋白酶C3。
不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特异性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物之细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
对于重组蛋白的长期高产率生产，优选稳定表达。例如，可改造稳定表达本文中所述多肽的细胞系。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可用适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和选择性标志控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可使改造细胞在富集培养基中生长1至2天，并随后转换为选择性培养基。重组质粒中的选择性标志赋予对选择的抗性并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中并生长形成转化灶(foci)，其可进而被克隆并扩增成细胞系。该方法可有利地用于改造表达本文中所述的多肽的细胞系。这样的改造细胞系可特别地用于筛选和评价与本文中所述多肽直接或间接相互作用的多肽。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured MouseCells，”Cell 11：223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等(1992)“UseOf The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-MediatedTransformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing HybridomaTechniques And Gene Therapy，”Bioessays 14：495-500)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等(1980)“Isolation Of Transforming DNA：Cloning The Hamster aprt Gene，”Cell22：817-823)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，可使用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567-3570；O′Hare等(1981)“Transformation Of MouseFibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing AProkaryotic Dihydrofolate Reductase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527-1531)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等(1981)“Selection For Animal Cells ThatExpress The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，Current TrialsAnd Future Directions，”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy，”Science 260：926-932；和Morgan等(1993)“Human Gene Therapy，”Ann.Rev.Biochem.62：191-217)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells，”Gene 30：147-156)。可使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等(编辑)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；以及在第12章和第13章中，Dracopoli等(编辑)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY.；Colberre-Garapin等(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker ForHigher Eukaryotic Cells，”J.Mol.Biol.150：1-14。
本文中所述多肽的表达水平可通过载体扩增来提高(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3(Academic Press，NewYork，1987)。当表达本文中所述多肽的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将提高标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与本文中所述多肽的核苷酸序列或本文中所述多肽相关，所以多肽的产生也将提高(Crouse等(1983)“Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate ReductaseMinigenes，”Mol.Cell.Biol.3：257-266)。
一旦本文中所述的多肽被重组表达，可通过本领域中已知的用于纯化多肽、多蛋白或抗体(例如，类似于基于抗原选择性的抗体纯化方案)的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，特别是通过对特异性抗原的亲和力(任选地在其中多肽包含Fc结构域(或其一部分)的蛋白A选择之后)和定大小柱色谱(sizing columnchromatography))、离心、溶解度差异、或通过用于纯化多肽或抗体的任何其他标准技术。
本公开内容的另一些方面涉及包含本文中所述的核酸或本文中所述的载体的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。本文中描述了示例性细胞类型。
本公开内容的另一些方面涉及产生本文中所述的多肽的方法，所述方法包括获得本文中所述的细胞并在所述细胞中表达本文中所述的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括分离和纯化本文中所述的多肽。
本公开内容的另一些方面涉及包含本文中所述的分离的多肽或嵌合分子的药物组合物。本文中使用的术语“药物组合物”是指本文中所述的分离的多肽与可药用载体组合的制剂。药物组合物还可包含另外的药剂(例如用于特定递送，延长半衰期，或其他治疗剂)。
在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物包含其他治疗剂。在一些实施方案中，这样的其他治疗剂包含另外的分离的多肽片段。在一些实施方案中，所述另外的分离的多肽片段包含FZD的富含半胱氨酸结构域(FZD-CRD)的氨基酸序列。在本公开内容的实施例中还展示了FZD-CRD通过竞争对TcdB与细胞表面FZD结合的抑制作用。通过阻止TcdB与FZD结合，FZD-CRD多肽不仅阻断TcdB进入细胞，而且还阻止TcdB对Wnt信号转导的抑制。因此，本文中还提供了FZD-CRD多肽如何保护细胞免于TcdB诱导的CDI的实例。如本文中所展示的，三重FZD1/2/7敲除(KO)细胞对毒素进入具有显著抗性。此外，FZD1/2/7降低的结肠类器官对TcdB较不敏感。最后，FZD2-CRD阻止TcdB与小鼠中结肠组织结合，且FZD7KO小鼠的结肠上皮对TcdB诱导的组织损伤较不易感。这些发现将FZD确立为TcdB的生理学相关上皮受体，指出Wnt信号传导阻断在CDI发病机理中的作用，并提供用于治疗CDI的新治疗靶标。重组人FZD-CRD蛋白和变体是可商购获得的(例如，从ACRO Biosystems)。
在一些实施方案中，本公开内容的另外的分离的多肽片段可包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽片段包含与SEQ ID NO：24具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的多肽片段包含与SEQ IDNO：24具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽片段包含与SEQ ID NO：25具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的多肽片段包含与SEQ ID NO：25具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽片段包含与SEQ ID NO：26具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的多肽片段包含与SEQ ID NO：26具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的氨基酸序列。
本公开内容的另外的分离的多肽片段可包含本文中公开的任何修饰或衍生化。这样的另外的分离的多肽片段也可与本文中所述的任何异源伴侣(例如，Fc结构域)融合。
如在本公开内容后面也变得清楚的，本公开内容的药物组合物还可包含适合于这样的组合物被设计用于治疗的特定疾病的其他治疗剂。
本文中使用的术语“可药用载体”意指可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌)或参与将多肽从身体的一个部位(例如，递送部位)运送或运输至另一个部位(例如，器官、组织或身体的一部分)的溶剂包封材料。可药用载体在与制剂的其他成分相容且在对对象的组织无害的意义上是“可接受的”(例如，生理学相容的、无菌的、生理学的pH等)。可用作可药用载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可豆脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇类，例如乙醇；以及(23)药物制剂中使用的其他无毒性相容物质。制剂中也可存在润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。术语如“赋形剂”、“载体”、“可药用载体”等在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，组合物中本公开内容的分离的多肽通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物施用，所述植入物是多孔的、无孔的、或者凝胶状材料，包括膜(例如硅橡胶膜(sialastic membrane))或纤维。通常来说，当施用所述组合物时，使用本公开内容的多肽不吸收的材料。
在另一些实施方案中，本公开内容的分离的多肽在控释系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见例如Langer，1990，Science 249：1527-1533；Sefton，1989，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald 等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。(参见例如MedicalApplications of Controlled Release(Langer和Wise编辑，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance(Smolen和Ball编辑，Wiley，New York，1984)；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61.另参见Levy等，1985，Science 228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105.)在例如Langer(同上)中还讨论了另一些控释系统。
本公开内容的分离的多肽可作为包含治疗有效量的结合剂和一种或更多种药学上相容成分的药物组合物施用。
在一些典型的实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制成适合于向对象(例如人)进行静脉内或皮下施用的药物组合物。通常来说，用于通过注射施用的组合物是无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。通常来说，在表明活性剂的量的密封容器(例如安瓿或药囊)中，以单位剂量形式单独或混合在一起供应成分，例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物。当待通过输注施用药物时，可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用药物时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以便在施用前混合所述成分。
用于全身施用的药物组合物可以是液体，例如无菌盐水、乳酸林格液或Hank氏液。此外，药物组合物可以是固体形式，并在使用前立即重新溶解或混悬。还考虑了冻干形式。
药物组合物可包含在脂质颗粒或囊泡中，例如脂质体或微晶，其也适用于肠胃外施用。颗粒可以是任何合适的结构，例如单层或多层，只要其中含有组合物即可。本公开内容的多肽可包埋在含有促融性脂质(fusogenic lipid)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、低水平(5-10mol％)的阳离子脂质的‘稳定化质粒-脂质颗粒’(SPLP)中，并通过聚乙二醇(PEG)包衣稳定化(Zhang Y.P.等，Gene Ther.1999，6：1438-47)。带正电荷的脂质(例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵或“DOTAP”)特别优选用于这样的颗粒和囊泡。这样的脂质颗粒的制备是公知的。参见例如美国专利No.4,880,635；4,906,477；4,911,928；4,917,951；4,920,016；和4,921,757。
例如，本公开内容的药物组合物可作为单位剂量施用或包装。当用于提及本公开内容的药物组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于对象的单位剂量的物理上离散的单元，每个单元含有经计算产生所期望治疗效果的预定量的活性物质以及所需的稀释剂；即载体或载剂。
在一些实施方案中，本文中所述的分离的多肽可与治疗部分(例如，抗生素)缀合。将这样的治疗性部分与多肽(包括例如Fc结构域)缀合的技术是公知的；参见例如Amon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(编辑)，1985，第243-56页，Alan R.Liss，Inc.)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in ControlledDrug Delivery(第2版.)，Robinson等(编辑)，1987，第623-53页，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，inMonoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，1985，第475-506页)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，1985，第303-16页，Academic Press；and Thorpe等(1982)“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates，”Immunol.Rev.，62：119-158。
此外，药物组合物可作为药盒(pharmaceutical kit)提供，其包含(a)含有冻干形式的本公开内容的多肽的容器和(b)含有用于注射的可药用稀释剂(例如，无菌水)的第二容器。可药用稀释剂可用于重构或稀释本公开内容的冻干多肽。任选地与这样的容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的须知，该须知反映了用于人施用的制造、使用或销售机构的批准。
在另一方面中，包括含有可用于治疗上述疾病的物质的制品。在一些实施方案中，制造的制品包含容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，容器容纳有有效地用于治疗本文中所述疾病的组合物，并且可具有无菌进入口。例如，容器可以是静脉溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。组合物中的活性剂是本公开内容的分离的多肽。在一些实施方案中，容器上或与容器相关的标签表明所述组合物用于治疗所选疾病。所述制造的制品还可包含第二容器，所述第二容器包含可药用缓冲液，例如磷酸缓冲盐水、林格液或右旋糖溶液。它还可包含从商业和使用者角度所期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。
分离的多肽、嵌合分子和包含本公开内容的这样的分离的多肽的药物组合物可用于治疗多种疾病。在一些实施方案中，所述疾病至少部分地由Wnt信号传导途径的调节异常引起。在一些实施方案中，疾病是艰难梭菌感染。因此，本文中还提供了治疗艰难梭菌感染的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的分离的多肽或包含本文中公开的这样的分离的多肽的药物组合物。分离的多肽或包含这样的分离的多肽的药物组合物可有效地阻断TcdB与FZD的结合。
在一些实施方案中，用于治疗本公开内容的CDI的药物组合物还包含另外的治疗剂或多肽。例如，本公开内容的分离的TcdB1114-1835多肽片段虽然能够阻断野生型TcdB进入细胞，但由于其占据FZD受体，仍然抑制Wnt信号传导。因此，活化FZD受体下游的Wnt信号传导的药剂可针对CDI提供另外的治疗效果。活化FZD受体下游的Wnt信号传导的药剂是本领域中已知的。此类药剂的非限制性实例包括GSK-3抑制剂，例如锂(LiCl)和CHIR99021。GSK-3抑制FZD受体下游的Wnt信号传导。因此，GSK-3抑制剂能够活化FZD受体下游的Wnt信号传导。诱导Wnt信号传导的药剂的其他非限制性实例包括但不限于SB 216763(TocrisBioscience，目录号1616)、BIO(Tocris Bioscience，目录号3194)、TCS 2002(TocrisBioscience，目录号3869)、TC-G 24(Tocris Bioscience，目录号4353)、TWS 119(TocrisBioscience，目录号3835)、SB 415286(Tocris Bioscience，目录号1617)、A 1070722(Tocris Bioscience，目录号4431)、AR-A 014418(Tocris Bioscience，目录号3966)、L803-mts(Tocris Bioscience，目录号2256)。Wnt信号传导的活化发生在细胞中。在一些实施方案中，细胞是结肠上皮细胞。
在一些实施方案中，用于治疗本公开内容的CDI的药物组合物还包含抑制TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性的药剂。在一些实施方案中，药剂是依布硒。依布硒(也称为PZ 51、DR3305和SPI-1005)是合成的有机硒药物分子，具有抗炎、抗氧化和细胞保护作用。它可作为谷胱甘肽过氧化物酶的模拟物，并且还可与过氧亚硝酸盐反应。依布硒是过氧化氢和氢过氧化物(包括膜结合磷脂和胆固醇酯氢过氧化物)的强效清除剂。已经显示数种依布硒类似物在硫醇存在下清除过氧化氢。本领域中已知依布硒抑制TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的其他非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(stefin)和凋亡抑制剂(inhibitor of apoptosis，IAP)。
在另一些实施方案中，用于治疗本公开内容的CDI的药物组合物还包含有助于阻断TcdB与FZD结合的药剂。这样的药剂可以是例如FZD抗体。应理解，本文中可使用与TcdB竞争与FZD结合的任何药剂。
在另一些实施方案中，由Wnt信号传导调控异常引起的疾病是癌症。Wnt信号传导途径的调控异常是已知的癌症病因，并且是癌症生物学中的中心机制。例如，Wnt过表达可导致小鼠乳腺组织的恶性转化。因此，Wnt信号传导的抑制一直是开发癌症治疗剂的焦点。如本文中所述，本公开内容的分离的多肽(例如，TdcB1114-1835多肽)能够通过与Wnt竞争FZD受体来抑制/阻断Wnt信号传导。因此，本公开内容的另一些方面涉及治疗癌症的方法。这样的方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的分离的多肽，或包含本公开内容的分离的多肽的药物组合物。
在一些实施方案中，治疗本公开内容的癌症的方法还包括向对象施用阻断Wnt信号传导的药剂。阻断Wnt信号传导的药剂的非限制性实例包括Dkk家族蛋白、分泌型卷曲受体相关蛋白(sFRP)、Draxin、IGFBP-4、SOST/硬化蛋白、USAG1和WIF-1。在一些实施方案中，阻断Wnt信号传导的药剂是FZD抗体。这些药剂在阻断Wnt信号传导中的用途是本领域中已知的。
许多类型的癌症的特征在于过度活化的Wnt信号传导和卷曲受体的过表达。例如，＞90％的结肠癌特征在于异常的Wnt信号传导。最近的研究(Gujral等，Cell，2014，159，844-856)显示卷曲受体2在转移性肝、肺、结肠和乳腺癌中过表达。该表达与上皮-间质细胞转化的标志物高度相关。因此，可使用本文中公开的方法治疗的癌症类型包括但不限于肿瘤、恶性肿瘤、转移瘤，或以不受控制的细胞生长为特征使得其被认为是癌性的任何疾病或病症。癌症可以是原发性癌症或转移癌。癌症包括但不限于胆管癌；膀胱癌；脑癌，包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；血液系统肿瘤(hematological neoplasm)，包括急性淋巴细胞和髓性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括鲍恩病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括生殖肿瘤(germinal tumor)，例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤、畸胎瘤、绒毛膜癌；间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；以及肾癌，包括腺癌和肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)。常见的癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌和脑癌。在一些优选的实施方案中，本公开内容的方法可用于治疗结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌。在一些实施方案中，癌细胞是转移性的。应理解，实例不意味着限制，并且可使用本文中公开的方法治疗显示过度活跃的Wnt信号传导或卷曲受体的过表达的任何类型的癌症。
本文中使用的“治疗有效量”是指赋予对象治疗效果所需的本公开内容的每种治疗剂(例如，分离的多肽片段、另外的分离的多肽片段和活化Wnt信号传导的药剂)的量，单独或与一种或更多种其他治疗剂组合。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗持续时间、同时治疗的性质(如果有的话)、特定的施用途径等健康从业者的知识和专业知识中的因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员所公知的，并且可仅通过常规实验来解决。通常优选使用最大剂量的单个组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，对象可出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因坚持较低剂量或可耐受剂量。
经验考虑因素(例如半衰期)通常将有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的治疗剂(例如包含来自人源化抗体或完全人抗体的区域的多肽)可用于延长多肽的半衰期并防止多肽被宿主的免疫系统攻击。施用频率可在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，多肽的持续连续释放制剂可以是合适的。用于实现持续释放的多种制剂和装置是本领域中已知的。
在一些实施方案中，剂量是每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每六天。在一些实施方案中，给药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次，或每3个月或更长时间一次。通过常规技术和测定可容易地监测该治疗的进展。给药方案(包括所使用的多肽)可随时间变化。
在一些实施方案中，对于正常体重的成年对象，可施用约0.01至1000mg/kg的剂量。在一些实施方案中，剂量为1至200mg。具体的剂量方案(即，剂量、时机和重复)将取决于特定对象和对象的病史以及多肽的性质(例如多肽的半衰期，以及本领域中公知的其他考虑因素)。
对于本公开内容的目的，如本文中所述的治疗剂的合适剂量将取决于所用的具体药剂(或其组合物)、制剂和施用途径、疾病的类型和严重程度，无论多肽是否施用用于预防或治疗目的，先前的治疗、对象的临床病史和对拮抗剂的响应，以及主治医师的判定如何。通常来说，临床医生将施用多肽直至实现所期望结果的剂量。一种或更多种多肽的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况，施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及技术人员已知的其他因素。多肽的施用可在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量，例如在疾病发生之前、期间或之后。
本文中使用的术语“治疗”是指向有此需要的对象应用或施用多肽或包含多肽的组合物。“有此需要的对象”是指患有疾病、具有疾病症状或易患疾病倾向的个体，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或对疾病的倾向。在一些实施方案中，对象患有CDI。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是非人灵长类。在一些实施方案中，对象是人。
减轻疾病包括延迟疾病的发生或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病并不一定需要有疗效的结果。如其中使用的“延迟”疾病的发生意味着推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，这取决于病史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发生或延迟疾病发作的方法是这样的方法，其与不使用该方法相比，在给定时间框架内降低发生一种或更多种疾病症状的可能性和/或降低症状的程度。这样的比较通常基于使用足以给出统计学上显著结果的许多对象的临床研究。
疾病的“发生”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。使用本领域中公知的标准临床技术可检测和评估疾病的发生。然而，发生也指可无法检出的进展。对于本公开内容的目的，发生或进展是指症状的生物学过程。“发生”包括发生、复发和发作。本文中使用的疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
在一些实施方案中，将以体内或体外足以抑制TcdB活性至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量向有治疗需要的对象施用包含本文中所述的治疗剂(例如，分离的多肽)的药物组合物。
可使用医药领域普通技术人员已知的常规方法向对象施用分离的多肽或药物组合物，这取决于待治疗的疾病类型或疾病部位。该组合物还可通过其他常规途径施用，例如经口、肠胃外、通过吸入喷雾、表面、经直肠、经鼻、口含、经阴道或通过植入储库(implantedreservoir)。本文中使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内(intralesional)和颅内注射或输注技术。另外，它可通过可注射的储器(depot)施用途径向对象施用，例如使用1个月、3个月或6个月的储器式可注射或可生物降解物质和方法。
实施例
全基因组CRISPR/Cas9筛选揭示卷曲受体为艰难梭菌毒素B的受体
为了鉴定生理学上相关受体和参与TcdB作用的其他宿主因子，使用CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas9方法进行了两次无偏全基因组诱变筛选(unbiasedgenome-wide mutagenesis screen)(15，16)。TcdA和TcdB的C端部分含有称为组合的重复寡肽的区域(combined repetitive oligopeptide，CROP，图6，图A)，其可结合碳水化合物并且可介导毒素与细胞结合(17)。最近的研究表明存在除CROP之外的另外的受体结合区域(18-21)。实际上，缺乏CROP的截短的毒素(TcdB1-1830)在临床上相关皮摩毒素浓度下仍然对多种细胞系诱导细胞变圆(图6，图B-E)(22)。由于CROP-碳水化合物相互作用可掩盖特定蛋白质受体的贡献，因此分别使用全长TcdB和TcdB1-1830进行两次单独的筛选(图1，图A)。
稳定表达RNA指导的内切核酸酶Cas9的HeLa细胞用慢病毒文库转导，该文库表达靶向19,052个基因的小指导RNA(small guide RNA，sgRNA)，每个基因具有6个sgRNA(15)。在用提高浓度的毒素进行四轮选择后，通过新一代测序(next-generation sequencing，NGS)鉴定来自剩余细胞的sgRNA序列。基于对每个基因鉴定的独特sgRNA的数目(Y轴)相对于代表具有靶向该基因的sgRNA的细胞的丰度的其总NGS读取(X轴)对候选基因进行排序(图1，图B和图7表1-4)。
UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP2)在这两个筛选中都很突出(图1，图B和C)。UGP2是产生UDP-葡萄糖的胞质酶，它是TcdA和TcdB用来使小GTP酶糖基化的必需底物(23)。CSPG4是全长TcdB筛选中的最佳命中(图1，B组)，这证实了在HeLa细胞中使用基于shRNA的筛选鉴定CSPG4的先前报道(12)。令人感兴趣的命中是卷曲受体2(FZD2)，它是TcdB1-1830筛选中排名最高的膜蛋白(图1，图C)。FZD2是公知的Wnt信号传导受体，它是调节结肠上皮细胞增殖和自我更新的中枢途径(24，25)。除了FZD2之外，不同寻常的高排序命中(high-ranking hit)组是ER膜蛋白复合物(EMC)的亚基，包括EMC1、3、4、5和6(图1，图B和C)。
为了验证筛选结果，使用CRISPR/Cas9方法产生用于最佳候选物的单个敲除HeLa细胞系，包括UGP2-/-，CSPG4-/-，FZD2-/-和EMC4-/-(图8，表1-6)。还测试了筛选中出现的两个另外的基因SGMS1-/-(鞘磷脂合酶1)和IL1RAPL2-/-(白细胞介素-1受体辅助蛋白样2)。使用已确立的致细胞病变测定(1)，用TcdB或TcdB1-1830攻击上述6个敲除细胞系，通过定量在暴露于一系列浓度的毒素后圆形细胞的百分比进行(图9，图A-C)。与野生型(WT)HeLa细胞相比，UGP2-/-对TcdB和TcdB1-1830二者都具有高抗性(～3000倍)。CSPG4-/-示出对TcdB的抗性提高(～240倍)，但对TcdB1-1830则没有。FZD2-/-和EMC4-/-二者均示出对TcdB1-1830的中等抗性(分别为～15和～11倍)，但对TcdB则没有(图2，图A；图9，图C)。SGMS1-/-和IL1RAPL2-/-对TcdB或TcdB1-1830没有显著抗性(P＜0.005)。通过免疫印迹分析毒素底物Racl的葡糖基化水平进一步证实了UGP2-/-、CSPG4-/-、FZD2-/-和EMC4-/-对TcdB或TcdB1-1830的抗性提高(图9，图D)。
研究了CSPG4/NG2和FZD2作为受体的潜力。TcdB与CSPG4-/-细胞的结合急剧降低，且大鼠NG2的异位表达恢复结合(图2，图B)。TcdB直接与CSPG4/NG2的纯化的胞外结构域(EC)结合，不依赖于CSPG4/NG2上的糖胺聚糖(GAG)(26)(图10，图A和B)。以上结果与先前的报告(12)一致。与先前表明CSPG4可能是CROP非依赖性受体相反(12)，发现TcdB的CROP区域对于与CSPG4/NG2结合是必需的，因为TcdB1-1830不与细胞表面上的纯化的CSPG4/NG2-EC或CSPG4/NG2结合(图10，图B和C)，并且单独的分离的CROP结构域与CSPG4/NG2结合，并且可与TcdB竞争与细胞表面上的CSPG4/NG2结合(图10，图D)。这些结果解释了为什么CSPG4-/-仍然对TcdB1-1830敏感(图2，图A)。先前的结论是基于CSPG4与TcdB1500-2366结合，而不与TcdB1851-2366结合的发现(12)。最近的结构研究证实，CROP结构域起始于残基1831而不是1851(27)，因此在本研究中使用完整的CROP结构域(残基1831-2366)。CROP的第一重复可能对与CSPG4/NG2结合至关重要。
用全长FZD2转染CSPG4-/-细胞也提高了TcdB的结合(图2，图C)。与此一致地，CSPG4/NG2或FZD2的转染恢复了TcdB进入CSPG4-/-细胞，导致转染细胞的变圆(图2，图D)。这些结果表明FZD2可独立于CSPG4介导TcdB的结合和进入细胞。FZD家族有10个成员(FZD1-10)，且HeLa细胞表达低水平的多个FZD(28)。用FZD1-10转染CSPG4-/-细胞，且发现FZD1、2和7的过表达各自显著提高TcdB与细胞的结合(图2，图E，图11)。FZD1、2和7彼此高度同源并在FZD家族中形成亚组(24)。在筛选中还鉴定了FZD7(表3)。为了证实FZD的冗余，产生了FZD1和FZD7单KO HeLa细胞以及三重FZD1/2/7KO HeLa细胞。FZD1-/-和FZD7-/-细胞表现出类似于FZD2-/-细胞：每个细胞在对TcdB1-1830的敏感性方面均显示适度降低，但对TcdB则没有。引人注目的是，FZD1/2/7三重KO对TcdB1-1830具有高度抗性(～300倍)。仍表达CSPG4的这些细胞也变得对TcdB有显著抗性(～10倍，图2，图F)。FZD1、2或7的转染恢复TcdB1-1830进入FZD1/2/7三重KO细胞(图2，图G)，表明FZD1/2/7是冗余受体。
与CSPG4相反，在CSPG4-/-细胞中转染FZD2提高了TcdB和TcdB1-1830二者的结合(图10，图C)。进一步的作图分析(mapping)显示FZD2介导TcdB1501-2366的结合，但不介导分离的CROP结构域的结合(图12)。FZD是7次跨膜蛋白，具有唯一的有区别的胞外结构域，称为富含半胱氨酸结构域(CRD，图2，图H，上图)，其也是Wnt结合位点(24)。重组Fc标记的FZD2-CRD与GST标记的TcdB1501-2366直接结合，但不与GST标记的CROP结构域结合(图2，图H)，这表明FZD2-CRD与TcdB区域1501-1830之间的直接相互作用。。
FZD1、2和7的CRD高度保守，具有～98％的序列相似性和～84％同一性(图13)(24)。使用生物层干涉(bio-layer interferometry，BLI)测定，证实FZD1、2和7的CRD均以纳摩尔亲和力与TcdB结合(对于FZD1，KD＝32nM，对于FZD2为19nM，且对于FZD7为21nM)(图2，图I；图14，图A)。与此一致，当通过GPI锚在细胞表面上表达时，分离的FZD7-CRD能够介导TcdB与细胞的强结合，而FZD8-CRD则不能(图2，图J)。此外，FZD2-CRD对TcdB1-1830(KD＝17nM)显示与全长TcdB相同的结合亲和力(图14，图B)，证实了CROP区域不参与与FZD的结合。其他FZD的CRD(例如FZD5-CRD)也与TcdB结合，但亲和力较弱(KD＝670nM，图2，图I；图14，图A)，这表明FZD1/2/7以外的FZD在高毒素浓度下可仍然作为另外的受体发挥作用，这可解释为什么FZD1/2/7KO细胞对TcdB1-1830不具有完全抗性。实际上，在筛选中还鉴定出FZD6，尽管只有一种sgRNA(表3)。
由于FZD和CSPG4是被TcdB的不同区域所识别，因此本数据支持先前提出的TcdB的双受体模型(19)。与该模型一致，FZD2-CRD与在微滴定板上固定的CSPG4/NG2-EC预先结合的TcdB稳健地结合(图3，图A)，证实了TcdB可与CSPG4和FZD同时结合。另一方面，皮摩尔水平的TcdB仍然可进入CSPG4-/-细胞(图9，图C)。这种进入被重组FZD2-CRD阻断，如缺乏细胞变圆和Racl葡糖基化所表明的(图3，图B和C)。因此，单独的内源性FZD可在临床相关的皮摩尔浓度下介导独立于CSGP4的TcdB进入。
进一步检查了FZD和CSPG4在表达多种FZD的人结直肠细胞系HT-29和Caco-2中的作用(29)。FZD2-CRD完全保护了这两种细胞类型免于TcdB1-1830(图3，图D和E)，证实了FZD作为这些细胞中的毒素受体的作用。有趣的是，CSPG4在HeLa细胞中高度表达，这可解释为什么单独丢失CSPG4导致TcdB进入HeLa细胞的急剧下降。CSPG4表达在HT-29中低得多并且在Caco-2细胞中检测不到(图3，图F)。与该表达谱一致，单独的CSPG4/NG2-EC能够降低HeLa细胞中的TcdB进入(图3，图G，图15，图A)。FZD2-CRD或CSPG4/NG2-EC表明HT-29细胞的适度保护，且二者的组合产生更强的保护作用，这表明FZD和CSPG4可能有助于毒素等同地进入HT-29细胞(图3，图H；图15，图B)。最后，FZD2-CRD单独保护Caco-2细胞免于全长TcdB，表明FZD是Caco-2细胞中的主要受体(图3，图I；图15，图C)。总之，这些结果表明FZD与CSPG4对特定细胞类型中TcdB进入的相对贡献取决于它们的相对表达水平。
接下来检查了FZD是否是结肠上皮细胞中病理学相关的TcdB受体。首先，使用原代结肠类器官模型，其在3-D基质中培养时发育成“迷你肠(mini-gut)”并显示正常结肠上皮的许多重要特征(30)。暴露于TcdB引起通过生存力测定法定量的浓度依赖性萎缩和类器官死亡(图4，图A和B)。TcdB1-1830对结肠类器官与TcdB同样强效(图16，图A)，表明CROP-CSPG4相互作用对TcdB进入结肠类器官没有显著贡献，这与CSPG4在结肠上皮中不表达的先前报道一致(13)。为了降低FZD的表达，我们利用与腺病毒介导的FZD1和FZD2的敲低(KD)组合的从FZD7 KO小鼠培养的结肠类器官(图16，图B和C)。最近显示FZD7对于维持肠类器官是至关重要的，但FZD7-/-类器官可在小分子抑制剂CHIR99021的存在下培养，其抑制GSK3激酶并活化FZD下游的Wnt/β-联蛋白信号传导途径(31)。结果发现，与WT类器官相比，FZD7-/-/FZD1/2KD类器官对TcdB表现出明显的抗性，三天后导致50％生存力的TcdB浓度(定义为IC50)为19.7pM，而WT类器官为2.2pM(图4，图B和C)。实际上，甚至在腺病毒介导的FZD1/2的KD之前，与WT类器官相比，FZD7-/-类器官已经显示IC50提高约3倍(图4，图C)。FZD1/2的不完全消耗和/或其他FZD的表达可解释结肠类器官的残余毒素敏感性。
Wnt信号传导对肠类器官和结肠类器官的生长和存活发挥关键作用。TcdB和Wnt二者均与FZD-CRD结合。发现TcdB的无毒片段(残基1114-1835)强效阻断培养的细胞中Wnt3a介导的信号传导，如通过TOPFLASH萤光素酶报道子测定以及分别为FZD共受体和下游组分的LRP6和Dvl2的磷酸化水平所表明的(图4，图D，图17)(24)。TcdB1114-1835在纳摩浓度下强烈抑制结肠类器官的生长并诱导类器官死亡(图4，图E和F)。当通过CHIR99021直接活化Wnt/β-联蛋白信号传导时，结肠类器官的死亡得以挽救(图4，图E和F)。这些数据揭示了TcdB在CDI中的潜在新机制：TcdB与FZD的结合可通过抑制Wnt信号传导直接破坏结肠上皮细胞的完整性及其自我更新，是独立的并且与上皮细胞内的小GTP酶的葡糖基化并行。
接下来检查了使用小鼠模型体内FZD的作用。因为在CDI期间TcdB被自然地释放到结肠腔中，所以通过将TcdB直接注射到小鼠的结扎结肠段的腔中开发了模型(图5，图A)，其导致TcdB特异性结合并进入结肠上皮细胞。共注射FZD2-CRD在很大程度上阻止了TcdB与结肠组织的结合(图5，图B)，表明FZD是结肠上皮中的主要受体。与此一致，发现FZD2和FZD7二者均在小鼠和人结肠组织的上皮细胞中表达(图18，图A和B)。相反，CSPG4表达仅限于称为ISEMF(肠上皮下肌成纤维细胞(intestinal sub-epithelial myofibroblast))的多核上皮下细胞，并且在小鼠和人二者的上皮细胞中均不存在(图18，图C)，这与先前的报道一致(13)。
FZD2/7双KO小鼠是胚胎致死性的(25，32)。由于FZD7看来是肠上皮中占优势的Wnt受体(３1)，因此利用FZD7-/-小鼠作为模型来确定FZD7的消耗是否可降低TcdB对体内结肠上皮的毒性。为了检测对结肠组织的损伤，将TcdB1-1830直接注射到活小鼠的结扎的结肠段中，然后是8小时孵育期。为了集中在结肠上皮上并避免在结肠上皮受损后潜在的TcdB进入表达CSPG4的ISEMF的并发症，使用TcdB1-1830代替TcdB。在暴露于TcdB1-1830后，在WT小鼠的结扎结肠段的腔中观察到流体的积聚，但是在FZD7-/-小鼠中显著降低(图5，图C)。通过苏木精和伊红染色(H&E)检查结肠组织显示WT小鼠中上皮层的广泛损伤，但在FZD7-/-小鼠中则少得多(图5，图D和E)。最后，紧密连接标志物密蛋白3的免疫组织化学染色显示WT小鼠中的紧密连接被破坏，但在FZD7-/-小鼠中基本保持完整(图5，图F)。总之，这些数据将FZD7建立为体内结肠上皮细胞中TcdB的生理学相关受体。
除了受体之外，筛选还揭示了其他细胞因子，例如EMC复合物(图1，图B和C)。尽管其功能尚不清楚，但最近的研究表明，EMC对于多跨膜蛋白的生物合成和/或折叠可能至关重要(33，34)。实际上，与WT细胞相比，瞬时转染的FZD1、2或7的表达在EMC4-/-细胞中显著降低(图19)。因此，EMC缺陷细胞中的FZD的降低可能是它们对TcdB1-1830抗性提高的可能的解释(图2，图A)。除EMC外，其他鉴定的蛋白质复合物包括液泡型H+-ATP酶的5个亚基。这与引发毒素移位穿过内体膜所需的酸化相一致(5)。
PVRL3在筛选中没有出现，这可能并不出人意料，因为PVRL3在筛选中被鉴定为参与毒素浓度诱导的坏死细胞死亡的因子，比本研究中用于筛选致细胞病变细胞变圆和凋亡的毒素浓度高几个数量级(14)。通过实验检查了PVRL3的作用，并发现异位表达的PVRL3不介导TcdB结合或进入CSPG4-/-HeLa细胞(图20，图A和B)。此外，PVRL3的重组胞外结构域在致细胞病变细胞变圆测定中无法保护Caco-2细胞免于TcdB，而FZD2-CRD提供完全保护(图20，图C)。因此，PVRL3不太可能是由TcdB诱导的致细胞病变细胞变圆效应和凋亡的相关受体。
无偏好的全基因组CRISPR介导的筛选揭示了毒素作用的所有主要步骤中涉及的多种宿主因子，从表面受体(FZD和CSPG4)到内体中的酸化(液泡型H+-ATP酶)以及胞质溶胶中的毒素酶活性(UGP2)。筛选还表明EMC是用于折叠/运输Wnt受体的关键因子。有趣的是，筛选鉴定了参与Wnt信号传导途径的共11种蛋白质，包括APC、GSK-3β、Wnt5a和LRP6(图21)。
本研究显示FZD是结肠上皮细胞中TcdB的生理学相关受体，表明了潜在的新机制：TcdB可通过直接阻断Wnt信号传导来破坏结肠上皮细胞。本研究还提供了用于治疗CDI的新治疗靶标。此外，Wnt信号传导途径的异常调控与许多癌症相关，特别是结直肠癌。因此，认为TcdB的受体结合结构域或其同源物是用于靶向Wnt途径的有价值的工具和治疗剂。
材料和方法
细胞系、抗体和构建体。HeLa(H1)、CHO(K1)、HT-29、Caco-2和HEK293T细胞获自ATCC。以下小鼠单克隆抗体购自指定供应商：Rac1(23A8，Abcam)、非葡糖基化Rac1(Clone102，BD Biosciences)、1D4标签(MA1-722，ThermoFisher Scientific)、HA标签(16B12，Covance)、β-肌动蛋白(AC-15，Sigma)。针对人CSPG4的兔单克隆IgG(ab139406)和针对FZD1(ab150553)、FZD2(ab150477)、FZD7(ab51049)、PVRL3(ab63931)和密蛋白3(ab15102)的兔多克隆抗体均购自Abcam。针对Dvl2(30D2)和LRP6(C5C7)的兔单克隆抗体和针对磷酸化LRP6(Ser1490)的兔多克隆抗体均购自Cell Signaling。针对TcdB的鸡多克隆IgY(#754A)购自List Biological Labs。在W.Stallcup的实验室中产生针对啮齿动物CSPG4/NG2的兔多克隆抗体和表达全长大鼠CSPG4/NG2(在pcDNA载体中)的构建体。pRK5载体中的1D4标记的全长FZD1-10构建体最初在J.Nathans的实验室(Baltimore，MD)中产生，并从Addgene获得。FZD7和FZD8CRD-myc-GPI构建体由J.Nathan的实验室慷慨提供，并且先前已有描述(35)。表达全长人ILlRAPL2和全长PVRL3的构建体购自Vigene Biosciences。先前描述了在pcDNA3.1载体中表达全长小鼠Syt II的构建体(36)。
TcdB及其他重组蛋白。如先前所述(37)在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中表达重组TcdB(来自艰难梭菌菌株VPI10463)，并纯化为His6标记的蛋白质。按照用于与TcdB相同的程序，将TcdB1-1830克隆到pHis1522载体(MoBiTec)中并在巨大芽孢杆菌中表达。将TcdB1831-2366、TcdB1501-2366和TcdB1114-1835克隆到pGEX-6P-1或pET28a载体中，并在大肠杆菌中纯化为GST标记的或His6标记的蛋白质。如先前所述(38)，CSPG4/NG2EC(P1和P2)在HEK293细胞中表达，用具有DEAE-琼脂糖柱的培养基纯化，并用梯度缓冲液(NaCl从0.2至0.8M，50mM Tris-Cl，pH 8.6)洗脱。以下重组人蛋白质购自ACRO Biosystems(IgG1 Fc和FZD2-CRD-Fc)、R&D Systems(FZD1-CRD-Fc、FZD5-CRD-Fc和FZD7-CRD-Fc)和SinoBiologics(PVRL3-EC)。
产生稳定的HeLa-Cas9细胞和慢病毒sgRNA文库。将化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9的人密码子优化序列从质粒lentiCas9-Blast(Addgene#52962)亚克隆到pQCXIH逆转录病毒载体(Clontech)中，所述逆转录病毒载体用于产生逆转录病毒以转导到H1 HeLa细胞(ATCCCRL-1958)中。在存在200μg/ml潮霉素B(Life Technologies)的情况下，选择混合的稳定细胞。使用靶向人类基因组中的19,052个基因的人GeCKO v2 sgRNA文库(Addgene#1000000049)(15)按照公开的方案产生慢病毒sgRNA文库。GeCKO v2文库由在两个半文库(文库A和文库B)中的Addgene递送。每个半文库每个基因含有三个独特的sgRNA，并且两个半文库独立地用毒素进行筛选。用慢病毒包装的GeCKOv2 sgRNA文库以0.2的MOI转导细胞。
用TcdB和TcdB1-1830筛选CRISPR文库。对于每个半CRISPR文库，将4×107个细胞平板接种到两个15-cm培养皿上以确保sgRNA的充分覆盖，每个sgRNA平均代表约650倍(即，平均有650个细胞被用相同的sgRNA转导)。这种过高代表率(over-representation rate)是从与文库平行设置的滴定板计算的。将这些细胞分别暴露于TcdB或TcdB1-1830持续48小时。然后用PBS清洗细胞三次以除去松散附着的圆形细胞。将剩余的细胞重新接种到新培养皿上，并用不含毒素的正常培养基培养，直至细胞达到～70％汇合。然后用提高浓度的毒素对细胞进行下一轮筛选。分别以TcdB(0.05pM、0.1pM、0.2pM和0.5pM)和TcdB1-1830(5pM、10pM、20pM和50pM)进行四轮筛选。收获剩余的细胞，并使用血液和细胞培养DNA微型试剂盒(Blood and Cell Culture DNA mini kit)(Qiagen)提取其基因组DNA。用引物lentiGP-1_F(AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)(SEQ ID NO：1)和lentiGP-3_R(ATGAATACTGCCATTTGTCTCAAGATCTAGTTACGC)(SEQ ID NO：2)通过PCR扩增含有sgRNA序列的DNA片段。由商业供应商(Genewiz)进行下一代测序(Illumina MiSeq)。
通过CRISPR产生敲除细胞系。将以下sgRNA序列克隆到LentiGuide-Puro载体(Addgene)中以靶向所指示的基因：ccggagacacggagcagtgg(cspg4)(SEQ ID NO：3)，gcgctgctgggacatcgcct(emc4)(SEQ ID NO：4)，accttataccacacaacatc(i11rapl2)(SEQ IDNO：5)，tgcgagcacttcccgcgcca(fzd2)(SEQ ID NO：6)，agcgcatgaccactacactg(sgms1)(SEQID NO：7)，acaggcagaaaacggctcct(ugp2)(SEQ ID NO：8)，GTGTAATGACAAGTTCGCCG(FZD1)(SEQ ID NO：9)和GAGAACGGTAAAGAGCGTCG(FZD7)(SEQ ID NO：10)。用表达这些sgRNA的慢病毒转导HeLa-Cas9细胞。用2.5μg/ml嘌呤霉素(Gibco)和200μg/ml潮霉素B选择稳定细胞的混合群体。通过将FZD1和7个sgRNA慢病毒依次转导到FZD2-/-细胞中产生FZD1/2/7的三重敲除细胞，然后用50pMTcdB1-1830进行选择。通过NGS示出敲除效率(图8，表1-6)。
致细胞病变测定。如先前所述(1)，使用已确立的标准细胞变圆测定监测TcdB和TcdB1-1830的致细胞病变效应(细胞变圆)。简言之，将细胞暴露于添加到培养基中的TcdB和TcdB1-1830的梯度24小时，如图9，图A和B中所示。使用显微镜(Olympus IX51，10-20X物镜)拍摄细胞的相差图像。每种条件下使用三个随机选择的图像进行分析。手动计数圆形和正常形状细胞的数目。将圆形细胞相对于细胞总数的比值进行作图并用Origin软件拟合。使用单因素方差分析测试进行统计学分析。此处及其后描述的实验至少重复了三次。
用CSPG4/NG2和FZD2的胞外结构域阻断TcdB进入细胞。将用于细胞保护测定的重组蛋白质预过滤(0.22μM过滤器，Millipore)。将毒素与FZD2-CRD-Fc和/或CSPG4-EC(P1)在冰上预孵育30分钟，毒素∶蛋白质比例为1∶400，除非在附图说明中指出。将混合物添加到细胞培养基中。如上所述通过致细胞变圆测定分析细胞病变效应。
转染和检测TcdB结合。按照制造商的说明，用POLYJETTM转染试剂(SignaGen)进行HeLa细胞的瞬时转染。通过将在室温下细胞暴露于TcdB或截短的TcdB片段(10nM，除非在附图中指出)10分钟，然后用PBS清洗三次来分析TcdB与细胞的结合。然后将细胞固定并进行免疫染色，或收获细胞并进行免疫印迹分析。
GST拉下分析。如先前所述(36)使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B进行GST拉下测定。简言之，将5μg的GST标记的TcdB1831-2366和TcdB1501-2366固定在谷胱甘肽珠上，并与10nM FZD2-CRD-Fc在4℃下孵育1小时。然后将珠子清洗、沉淀并在SDS样品缓冲液中煮沸。样品进行免疫印迹分析。
生物层干涉测定。通过具有Blitz系统(ForteBio)的BLI测定法测量TcdB与FZD之间的结合亲和力。简言之，将FZD1、2、5、7的CRD-Fc或人IgG1Fc(20μg/ml)固定到DIP ANDREADTM抗-hIgGFc捕获生物传感器(ForteBio)上并用PBS缓冲液平衡。然后将生物传感器暴露于系列浓度的TcdB或TcdB1-1830，然后用PBS清洗。使用Blitz系统软件(ForteBio)计算结合亲和力(KD)。
Wnt信号传导测定。如先前所述(39)，使用TOPFLASH/TK-海肾双萤光素酶报道子测定来检测Wnt信号传导活性。简言之，用TOPFLASH(50ng/孔)、TK-海肾(内对照，10ng/孔)和pcDNA3(200ng/孔)共转染24孔板中的HEK293T细胞。24小时之后，将细胞暴露于在培养基中的Wnt3a(50ng/ml)和TcdB1114-1835(与Wnt3a的摩尔比分别为1∶8、1∶40和1∶200)6小时。收获细胞裂解物并进行萤火虫/海肾双萤光素酶测定，以及检测磷酸化Dvl2和LRP6的免疫印迹分析。Wnt信号传导活化TOPFLASH萤光素酶报道子(萤火虫萤光素酶)的表达。共转染的海肾萤光素酶用作内对照。
基于微滴定板的结合测定。如先前所述(38)，在EIA/RIA半区96孔板(高结合，Corning Costar)上进行结合测定。简言之，微量滴定板在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH8.3)中用10μg/ml CSPG4/NG2蛋白在4℃下包被过夜，并随后用PBS中的1％牛血清白蛋白封闭1小时。然后将平板与指定的蛋白质在PBS中孵育1小时。在室温下用PBS加0.05％吐温-20将孔清洗三次。使用One-step Turbo TMB(Thermo Scientific)作为底物，用微板读取器测量450nm处的吸光度。
类器官培养、腺病毒转导和TcdB攻击测定。如先前所述进行来自WT或FZD7-/-小鼠结肠的隐窝(Crypt)分离，并使用条件化培养基(40)将类器官扩增为球状培养物。除了用于Wnt信号传导抑制测定的WT类器官外，向培养基中补充3μM CHIR99021(31)。传代之后5天，用细胞回收溶液(Cell Recovery Solution)(Fisher Scientific)重悬类器官并机械破碎。使用补充有烟酰胺(10mM，Sigma)、聚凝胺(polybrene)(8ug/ml，Sigma)和Y-27632(10uM，Sigma)的转导培养基，用表达针对FZD1的shRNA、针对FZD2的shRNA或对照序列的腺病毒转导片段，清洗并平板接种在生长因子降低的基质胶(Matrigel)(Corning)(41)中。病毒转导之后3天，通过将毒素直接添加到培养基中，用系列稀释的TcdB攻击类器官。进行MTT测定以测量暴露于毒素之后72小时的细胞生存力。
WT结肠类器官中的Wnt信号传导抑制测定。将指定浓度的TcdB1114-1835直接添加到WT结肠类器官的培养基中。对于挽救实验，将5μM CIR99021添加至培养基。每隔48小时更换培养基，使其同时存在TcdB1114-1835和CHIR99021。六天之后分析细胞生存力。
腺病毒介导的KD。所有shRNA均购自sigma TRC shRNA设计的文库。如图16，图B，C中所述验证敲低效率。使用显示最高效率的ShRNA序列(对于FZD1的shRNA#2和对于FZD2的shRNA#5)来产生腺病毒。简言之，使用Block-it U6腺病毒RNAi系统(Life Technologies)构建了表达对照shRNA(CTGGACTTCCAGAAGAACA-3’)(SEQ ID NO：11)，针对小鼠FZD1的shRNA(TGGTGTGCAACGACAAGTTTG)(SEQ ID NO：12)或FZD2(CGCTTCTCAGAGGACGGTTAT)(SEQ ID NO：13)的腺病毒，然后按照制造商的方案在293A细胞(Life Technologies)中进行病毒包装和多轮扩增。
使用MTT测定评估结肠类器官的生存力。如先前所述(42)，通过降低MTT的能力评估类器官的生存力。简言之，将MTT溶液添加至类器官培养物至终浓度为500μg/ml。在37℃下孵育2小时之后，弃去培养基。对于每个孔(20μl的基质胶，在48孔板中)，添加60μl的2％SDS溶液以溶解基质胶(1小时，37℃)，然后添加300μl的DMSO以溶解降低的MTT(2小时，37℃)。在微板读取器上测量562nm处的吸光度。使用20μl不含类器官的基质胶作为空白对照。将未暴露于毒素的正常类器官定义为100％存活。
免疫组织化学(IHC)和组织学分析。将来自成年C57BL/6小鼠(10至12周龄)的结肠切下，并进行冷冻切片，切片测量厚度为8至10μm。将结肠切片在冷丙酮中固定5分钟，并随后用PBS清洗三次。然后将结肠切片用PBS中的5％山羊血清在室温下封闭30分钟，并与一抗(抗-TcdB：1：600；抗-FZD：1：250；兔抗NG2：1：250)一起孵育过夜，然后用生物素化的山羊抗鸡或兔IgG二抗(1：200，Vector Lab)在室温下孵育1小时。然后将它们与HRP缀合的链霉亲和素(1：500，DAKO)一起孵育30分钟。用3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-thyl carbazole)(DAKO)将免疫反应性可视化为红色。用Gill的苏木精(1：3.5，Sigma)将细胞核标记为蓝色。冷冻的人结肠组织切片购自BioChain Institute Inc.，并进行IHC分析。使用在10％福尔马林中固定的小鼠结肠组织进行密蛋白3的IHC分析，并按照标准程序包埋在石蜡中(抗密蛋白3抗体：1：100)，并用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)检测。用H&E染色的石蜡包埋切片进行组织学分析。基于上皮破坏、炎性细胞滤过和水肿，通过盲法观察者对染色切片按0至3级(轻度至重度)进行编码和评分。
用重组蛋白在结肠组织中进行竞争测定。将TcdB(40nM)与人IgG1-Fc或FZD2-Fc(2.4μM)在冰上预孵育30分钟。为了产生离体结肠段，将小鼠(C57BL/6，6至8周)安乐死并通过剖腹术暴露结肠。通过用丝线结扎两端来密封升结肠中的区段(～2cm长)。通过LV导管将毒素样品(40μl)注射到密封的结肠段中。然后用止血钳(hemostat)密封注射部位。用PBS浸泡的纱布覆盖结肠2小时。然后切除结肠段并用通过针头注射的PBS清洗其腔三次，并随后进行IHC分析。
结肠环结扎测定。按照波士顿儿童医院IACUC的指南进行所有程序。WT或FZD7-/-小鼠(6至8周)在禁食过夜后麻醉。进行中线剖腹术以找到升结肠并用丝线结扎密封～2cm长的环。通过LV导管将在80μl生理盐水中的2μg的TcdB1-1830或80μl生理盐水注射到密封的结肠段中，然后用缝线缝合伤口。使小鼠恢复。8小时之后，使小鼠安乐死并切离结扎的结肠段。测量并记录结扎结肠的重量和长度。将结肠段固定并进行H&E染色和IHC。
在异种移植模型中抑制肿瘤生长。使用已确立的小鼠异种移植模型在体内评估用TcdB1114-1835阻断Wnt信号传导对肿瘤生长的影响。使用肝癌细胞系FOCUS和Huh7细胞。这些细胞系表达高水平的FZD2，并且通过FDZ抗体抑制Wnt信号传导可降低小鼠异种移植模型中通过这些癌细胞形成的肿瘤生长(Gujral TS等Cell，2014，159：844-856)。在第0天，将FOCUS或Huh7细胞(混悬液中2×106个)皮下(s.c.)接种到无胸腺裸鼠中。每2至3天追踪肿瘤生长。使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸。使用下式计算肿瘤体积：V＝AB2/2(A，轴直径；B，旋转直径)。当肿瘤达到～200mm3时，将小鼠分成两组(对照和治疗)。治疗组在肿瘤部位皮下注射TcdB1114-1835(盐水中20mg/kg)，每周两次，长达三周。对照组注射生理盐水。每2至3天测量肿瘤尺寸。切下肿瘤组织并进行免疫组织化学分析以评价Wnt信号传导和细胞增殖和活性的标志物(例如β-联蛋白，Ki67)。
与对照组相比，在治疗组中观察到肿瘤尺寸显著减小，表明使用TcdB1114-1835阻断Wnt信号传导抑制了体内肿瘤生长。
参考文献
1.D.M.Lyerly，H.C.Krivan，T.D.Wilkins.Clinical Microbiology Reviews 1，1(Jan，1988).
2.M.Rupnik，M.H.Wilcox，D.N.Gerding，Nat Rev Microbiol7，526(Jul，2009).
3.F.C.Lessa et al.，The New England Journal of Medicine 372，825(Feb26，2015).
4.T.Jank，K.Aktories，Trends Microbiol 16，222(May，2008).
5.D.E.Voth，J.D.Ballard，Clinical Microbiology Reviews 18，247(Apr，2005).
6.X.Sun，T.Savidge，H.Feng，Toxins(Basel)2，1848(Jul，2010).
7.I，Just et al.，Nature 375，500(Jun 8，1995).
8.D.Drudy，S.Fanning，L.Kyne，Int J Infect Dis11，5(Jan，2007).
9.D.Lyras et al.，Nature 458，1176(Apr 30，2009).
10.S.A.Kuehne et al.，Nature 467，711(Oct7，2010).
11.G.P，Carter et al.，MBio6，e00551(2015).
12.P.Yuan et al.，Cell Res 25，157(Feb，2015).
13.N.Terada et al.，Histochem Cell Biol 126，483(Oct，2006).
14.M.E.LaFrance et al.，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 112，7073(Jun 2，2015).
15.O.Shalem et al.，Science 343，84(Jan 3，2014).
16.J.A.Doudna，E.Charpentier，Science 346，1258096(Nov 28，2014).
17.A.Greco et al.，Nature Structural&Molecular Biology13，460(May，2006).
18.L.A.Barroso，J.S.Moncrief，D.M.Lyerly，T.D.Wilkins，MicrobialPathogenesis16，297(Apr，1994).
19.S.Genisyuerek et al.，Molecular Microbiology 79，1643(Mar，2011).
20.A.Olling et al.，PLoS ONE6，e17623(2011).
21.B.Schorch et al.，Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 111，6431(Apr29，2014).
22.A.B.Ryder et al.，Journal of Clinical Microbiology 48，4129(Nov，2010).
23.M.Flores-Diaz et al.，The Journal of Biological Chemistry272，23784(Sep 19，1997).
24.B.T.MacDonald，X.He，Cold Spring Harb Perspect Biol 4，(Dec，2012).
25.A.Gregorieff，H.Clevers，Genes Dev 19，877(Apr 15，2005).
26.W.B.Stallcup，F.J.Huang，Cell Adh Migr2，192(Jul-Sep.2008).
27.P.Orth et al.，The Journal of Biological Chemistry 289，18008(Jun27，2014).
28.N.Sagara，G.Toda，M.Hirai，M.Terada，M.Katoh，Biochemical andBiophysical Research Communications 252，117(Nov 9，1998).
29.K.Ueno et al.，Neoplasia 10，697(Jul，2008).
30.T.Sato et al.，Nature 459，262(May 14，2009).
31.D.J.Flanagan et al.，Stem Cell Reports4，759(May 12，2015).
32.H.Yu，X.Ye，N.Guo，J.Nathans，Development 139，4383(Dec1，2012).
33.M.Richard，T.Boulin，V.J.Robert，J.E.Richmond，J.L.Bessereau，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 110，E1055(Mar12，2013).
34.T.Satoh，A.Ohba，Z.Liu，T.Inagaki，A.K.Satoh，Elife4，(2015).
35.J.C.Hsieh，A.Rattner，P.M.Smallwood，J.Nathans，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America96，3546(Mar30.1999).
36.M.Dong et al.，The Journal of Cell Biology 162，1293(Sep 29，2003).
37.G.Yang et al.，BMC Microbiol8，192(2008).
38.E.Tillet，F.Ruggiero，A.Nishiyama，W.B.Stallcup，The Journal ofBiological Chemistry272，10769(Apr 18，1997).
39.B.T，MacDonald，C.Yokota，K.Tamai，X.Zeng，X.He，The Journal ofBiological Chemistry 283，16115(Jun 6，2008).
40.H.Miyoshi，T.S.Stappenbeck，Nature Protocols8，2471(Dec，2013).
41.N.Wang et al.，PLoS ONE 9，e93608(2014).
42.T.Grabinger et al.，Cell Death Dis5.e1228(2014)
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任意组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一般系列等同或类似特征的示例。
根据以上描述，本领域技术人员可容易地确定本公开内容的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本公开内容进行多种改变和修改以使其适应多种用途和情况。因此，其他实施方案也在权利要求内。
等同方案
虽然本文中已描述并展示了数个发明的实施方案，但是本领域普通技术人员将容易预见用于执行功能和/或获得结果和/或本文中所述的一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改都被视为在本文中所述的本发明实施方案的范围之内。更一般地，本领域的技术人员将容易理解，本文中所描述的所有参数、尺寸、材料和构造意指示例性的且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文中所描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。因此，可以理解的是，前述实施方案仅通过示例的方式给出，且在所附权利要求书及其等同方案的范围之内，可以以除了具体描述和要求保护的其他方式来实施本发明。本公开内容的本发明实施方案涉及本文中所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法相互不矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合也包括在本公开内容的本发明范围内。
如本文中定义和使用的所有定义应理解为优先于词典的定义、通过引用并入的文献中的定义、和/或所定义术语的普通含义。
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请关于每篇所引用的主题均通过引用并入本文，在某些情况下可涵盖整个文件。
除非明确指出相反，否则如本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应被理解为意指如此结合起来的要素(即，在一些情况下联合存在而其他情况下分开存在的要素)的“任一或二者”。以“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此连接的“一个或更多个”要素。除了通过由“和/或”子句具体确定的要素之外，可任选地存在其他要素，无论其与具体确定的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言(例如“包含”)联合使用时，提及“A和/或B”在一个实施方案中可指仅A(任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指仅B(任选包括除了A之外的要素)；在另一个实施方案中，可指A和B二者(任选包含其他要素)等。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的“或”应被理解为具有与如上所定义“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括数字或要素列表中的至少一个，但还包含了多于一个，并且任选地包含另外的未列出的项目。只有明确表示相反的术语(例如“仅之一”或“正好之一”)，或者，在权利要求书中使用“由......组成”时，才将指仅包含许多要素或要素列表中的一个要素。一般而言，当前面有排他性的术语(例如“任一”、“之一”、“仅有之一”或“恰好之一”)时，本文中所使用的术语“或”应该仅解释为表示排他性的替代选择(即，“一个或另一个但不是二者”)。当在权利要求书中使用时，“基本由......组成”应具有其在专利法领域中所使用的通常含义。
关于一个或更多个要素的列表，如本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中任意一个或更多个要素中的至少一个要素，但是不一定包含要素列表内具体列出的各个要素和每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任意组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指的要素列表内的明确指出的要素之外，要素可任选地存在，不论其与那些明确指出的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性的实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指，至少一个A，任选包含多于一个A，而不存在B(且任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个B，任选包含多于一个B，而不存在A(且任选地包含除A之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，以及至少一个B，任选包含多于一个B(且任选地包含其他要素)等。
还应理解，除非明确指出相反，否则在本文中所要求保护的任何包括多于一个步骤或动作的方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于所记载方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求书以及在上述说明书中，所有的连接词(例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等)应理解为开放式的，即意指包括但不限制于。仅连接词“由......组成”和“基本上由...组成”应分别是封闭的或半封闭的连接词，如美国专利局专利审查程序手册2111.03部分中所述。

Claims (56)

1.分离的多肽，其包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中所述多肽不具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
2.分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：18具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
3.分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
4.分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQID NO：20的氨基酸序列组成。
6.权利要求1至5中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽是交联的、环化的、缀合的、酰化的、羧基化的、脂化的、乙酰化的、巯基乙酸酰胺化的、烷基化的、甲基化的、聚苷氨酰化的、糖基化的、聚唾液酸化的、磷酸化的、腺苷酰化的、PEG化的，或其组合。
7.权利要求1至6中任一项所述的分离的多肽，其在C端或在N端包含修饰。
8.权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽还包含融合结构域。
9.权利要求8所述的分离的多肽，其中所述融合结构域选自：多聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。
10.权利要求8所述的分离的多肽，其中所述多肽还包含人IgG1的Fc部分。
11.融合蛋白，其包含：含有与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合。
12.权利要求11所述的融合蛋白，其中所述Fc部分是人IgG1的Fc部分。
13.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成。
14.嵌合分子，其包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分是权利要求1至13中任一项所述的分离的多肽；并且其中所述第二部分不是权利要求1至13中任一项所述的分离的多肽。
15.权利要求14所述的嵌合分子，其中所述分离的多肽结合卷曲受体(FZD)。
16.权利要求15所述的嵌合分子，其中所述分离的多肽阻断Wnt信号传导。
17.权利要求14所述的嵌合分子，其中所述分离的多肽是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。
18.权利要求14至17中任一项所述的嵌合分子，其中所述分离的多肽与聚合物连接。
19.权利要求18所述的嵌合分子，其中所述聚合物延长所述分离的多肽的血清半衰期。
20.权利要求18所述的嵌合分子，其中所述聚合物延长所述分离的多肽的保质期。
21.权利要求14至20中任一项所述的嵌合分子，其中所述分离的多肽具有1至100个保守的氨基酸替换。
22.权利要求14至20中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二部分是抗菌剂。
23.权利要求22所述的嵌合分子，其中所述抗菌剂是抗生素。
24.权利要求14至21中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二部分是结合卷曲受体共受体的抗体。
25.权利要求24中任一项所述的嵌合分子，其中所述卷曲受体共受体是脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6、受体酪氨酸激酶(RTK)或酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR2)。
26.权利要求14至21中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二部分包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
27.权利要求14至21中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二部分包含与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
28.分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。
29.分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。
30.分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。
31.分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：21具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。
32.分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：22具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。
33.分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。
34.药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的分离的多肽，或权利要求14至27中任一项所述的嵌合分子。
35.权利要求34所述的药物组合物，其还包含另外的分离的多肽，所述另外的分离的多肽包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
36.权利要求34所述的药物组合物，其中所述另外的分离的多肽包含与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。
37.权利要求34所述的药物组合物，其中所述另外的分离的多肽由SEQ ID NO：24、SEQID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成。
38.权利要求35至37中任一项所述的另外的分离的多肽，其中所述多肽是乙酰化的、羧基化的、糖基化的、磷酸化的、脂化的、酰化的、PEG化的、巯基乙酸酰胺化的，或其组合。
39.权利要求35所述的另外的分离的多肽，其中所述多肽还包含融合结构域。
40.权利要求39所述的另外的分离的多肽，其中所述融合结构域选自：多聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。
41.权利要求39所述的另外的分离的多肽，其中所述多肽包含人IgG1的Fc部分。
42.权利要求41所述的另外的分离的多肽，其中所述融合结构域是人IgG1的Fc部分。
43.治疗艰难梭菌(Clostridium difficile)感染(CDI)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项所述的分离的多肽、权利要求14至27中任一项所述的嵌合分子或权利要求34至42中任一项所述的药物组合物。
44.权利要求43所述的方法，其中所述药物组合物还包含在细胞中诱导卷曲受体(FZD)下游的Wnt信号传导的药剂。
45.权利要求44所述的方法，其中所述药剂是GSK-3抑制剂。
46.权利要求45所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是锂(LiC1)、CHIR99021、SB216763、BIO、TCS 2002、TC-G 24、TWS 119、SB 415286、A 1070722、AR-A 014418、L803-mts或其组合。
47.权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述药物组合物还包含在细胞中抑制TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性的药剂。
48.权利要求47所述的方法，其中所述药剂是依布硒。
49.权利要求47所述的方法，其中所述药物组合物还包含卷曲受体抗体。
50.权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述细胞是结肠上皮细胞。
51.治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项所述的分离的多肽、权利要求14至27中任一项所述的嵌合分子或权利要求34至42中任一项所述的药物组合物。
52.权利要求51所述的方法，其中所述癌症选自：结肠癌、肺癌、肝癌和乳腺癌。
53.权利要求51所述的方法，其中所述药物组合物还包含阻断Wnt信号传导的药剂。
54.权利要求53所述的方法，其中所述药剂是Dkk家族蛋白、分泌型卷曲受体相关蛋白(sFRP)、Draxin、IGFBP-4、SOST/硬化蛋白、USAG1或WIF-1。
55.权利要求54所述的方法，其中所述药剂是卷曲受体抗体。
56.权利要求51所述的方法，其中所述癌症是转移癌。
CN201780018577.7A 2016-03-21 2017-03-21 用于抑制wnt信号传导的组合物和方法 Pending CN109311950A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662311381P 2016-03-21 2016-03-21
US62/311,381 2016-03-21
PCT/US2017/023381 WO2017165398A1 (en) 2016-03-21 2017-03-21 Compositions and methods for inhibiting wnt signaling

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109311950A true CN109311950A (zh) 2019-02-05

Family

ID=59900646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780018577.7A Pending CN109311950A (zh) 2016-03-21 2017-03-21 用于抑制wnt信号传导的组合物和方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10913786B2 (zh)
EP (1) EP3433264A4 (zh)
CN (1) CN109311950A (zh)
CA (1) CA3014498A1 (zh)
WO (1) WO2017165398A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112980880A (zh) * 2021-03-08 2021-06-18 浙江大学 基于CRISPR/Cas9构建Fzd6-Q152E定点突变小鼠模型的方法及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019143552A1 (en) * 2018-01-16 2019-07-25 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for inhibiting wnt signaling

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103957931A (zh) * 2010-09-03 2014-07-30 瓦尔内瓦奥地利有限责任公司 艰难梭状芽胞杆菌毒素a和毒素b蛋白的分离多肽及其用途
WO2014138924A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 National Health Research Institutes Compositions and methods for treating clostridium difficile-associated diseases
US20150093389A1 (en) * 2012-04-04 2015-04-02 The Secretary Of State For Health Clostridium difficile antigens

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1341121A (zh) 1999-01-07 2002-03-20 利思进药品公司 作为Fc融和蛋白之抗肥胖蛋白质的表达和外运
US7625867B2 (en) 2004-03-26 2009-12-01 Acceleron Pharma Inc. BMP-3 propeptides and related methods
EP1846039A2 (en) * 2005-01-10 2007-10-24 Research Development Foundation Targeted chimeric molecules for cancer therapy
PE20081217A1 (es) * 2006-09-08 2008-09-24 Genentech Inc Antagonistas del gen wnt y su uso en el diagnostico y tratamiento de trastornos mediados por el wnt
WO2010037041A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
JP6290918B2 (ja) 2012-12-05 2018-03-07 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
KR102096796B1 (ko) * 2013-10-22 2020-05-27 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna의 전달을 위한 지질 제형
WO2019143552A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for inhibiting wnt signaling

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103957931A (zh) * 2010-09-03 2014-07-30 瓦尔内瓦奥地利有限责任公司 艰难梭状芽胞杆菌毒素a和毒素b蛋白的分离多肽及其用途
US20150093389A1 (en) * 2012-04-04 2015-04-02 The Secretary Of State For Health Clostridium difficile antigens
WO2014138924A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 National Health Research Institutes Compositions and methods for treating clostridium difficile-associated diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAYA S.SALNIKOVA 等: "Physical Characterization of Clostridium Difficile Toxins and Toxoids: Effect of the Formaldehyde Crosslinking on Thermal Stability", 《JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES》 *
PENG CHEN 等: "Structural insight into Wnt signaling inhibition by Clostridium difficile toxin B", 《FEBS J.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112980880A (zh) * 2021-03-08 2021-06-18 浙江大学 基于CRISPR/Cas9构建Fzd6-Q152E定点突变小鼠模型的方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3014498A1 (en) 2017-09-28
EP3433264A1 (en) 2019-01-30
US20190031734A1 (en) 2019-01-31
WO2017165398A1 (en) 2017-09-28
EP3433264A4 (en) 2019-08-28
US10913786B2 (en) 2021-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9969774B2 (en) Cell penetrating peptide and method for delivering biologically active substance using same
KR20140035337A (ko) Ｗｎｔ 조성물 및 이의 사용 방법
CN112512556A (zh) 用于抑制wnt信号传导的组合物和方法
US20200095590A1 (en) Transcription system
CN109311950A (zh) 用于抑制wnt信号传导的组合物和方法
BR112019012635A2 (pt) peptídeo mutante spink2, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um peptídeo mutante spink2, para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, dpara identificar um agente de proteção retinal e para preparar um coelho modelo e dano retinal, conjugado, anticorpo, composição, composição farmacê utica, e, coelho modelo de dano retinal.
CA2458565A1 (en) New angiogenesis inhibitors based on soluble cd44 receptor hyaluronic acid binding domain
CN111197057B (zh) 调控免疫细胞迁移的组合物和方法
US20230090247A1 (en) Molecules targeting ras protein
US7517667B2 (en) Methods for promoting, inhibiting and detecting toxin entry into cells
JP2019534858A (ja) Ｆｒｉｚｚｌｅｄの選択的ペプチド阻害剤
WO2019245012A1 (ja) 網膜色素変性症治療用ペプチド
US20230192794A1 (en) Engineered interleukin-22 polypeptides and uses thereof
JP6233932B2 (ja) ＢＢＦ２Ｈ７（ＢＢＦ２ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ７）部分アミノ酸配列を有するペプチドまたはそれに結合する抗体を含む細胞増殖調節用組成物
US11136368B2 (en) Cancer treatment using CX26 blocking peptides
CN115768897A (zh) 改进的粒酶b变体
Blair et al. HELICOBACTER PYLORI CSD5 LINKS A CELL SHAPE PROMOTING PROTEIN COMPLEX TO THE CELL WALL AND ATP SYNTHASE TO PROMOTE HELICAL SHAPE
AU2007281048B2 (en) Cleavage of BiP by subtilase cytotoxin
WO2024078828A1 (en) Cytotoxic necrotizing factors as exogenous carriers in mammalian cells
Fatimathas An investigation into the physiological role of annexin A11
Poulin Regulation of eukaryotic translation initiation by the eIF4E-binding proteins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190205