CN112512556A - 用于抑制wnt信号传导的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文中提供了与卷曲受体(FZD)的脂质结合沟结合的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是对应于SEQ ID NO：1的第1285至1804位氨基酸的TcdB的片段。在一些实施方案中，所述药剂与所述FZD的脂质结合沟的结合抑制TcdB进入细胞，和/或抑制Wnt信号传导。还提供了治疗艰难梭菌(Clostridium difficile)感染(CDI)的方法和治疗癌症的方法。

Description

用于抑制WNT信号传导的组合物和方法

相关申请

本申请要求根据35 U.S.C.§119(e)于2018年1月16日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING WNT SIGNALING”的美国临时申请No.62/618,042和于2018年5月11日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITINGWNT SIGNALING”的美国临时申请No.62/670,225的权益，其全部内容通过引用并入本文。

政府支持

本公开内容是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号R01 AI091823、R01 AI125704、R21AI123920、R01 NS080833和R01 AI132387的政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)是当正常肠微生物组被破坏时定植在人结肠中的机会致病菌。艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)导致结肠上皮屏障的破坏，从而导致腹泻和假膜性结肠炎。与CDI相关的疾病由两种同源外毒素：艰难梭菌毒素A(TcdA)和艰难梭菌毒素B(TcdB)引起。在这两种毒素中，单独的TcdB能够引起人中的全谱疾病。TcdB进入结肠上皮细胞是通过其与卷曲受体(Frizzled，FZD)的结合而介导的。FZD是脂质修饰的形态发生素(morphogen)Wnt的跨膜受体家族。TcdB与FZD的结合抑制Wnt信号传导。

发明内容

在一些方面中，本公开内容涉及包含与人FZD2富含半胱氨酸区域(CRD2)复合的FZD结合区域(sTcdB)的TcdB片段的共晶体结构。从共晶体结构中出乎意料地发现，内源性游离脂肪酸被埋在CRD2中的疏水性沟中，并且同时被TcdB结合。脂质结合沟(lipid-binding groove)在FZD中是保守的并且容纳Wnt的棕榈油酸(palmitoleic acid，PAM)脂质修饰。当CRD与内源性脂肪酸或预先加载的外源PAM结合时，TcdB与FZD的结合增强。在另一方面，TcdB通过阻碍Wnt PAM的对接而阻止Wnt与CRD结合，而不是直接与Wnt竞争蛋白质-蛋白质相互作用。

本文中描述了与FZD的脂质结合沟结合的药剂，例如人工蛋白质、抗体小分子或TcdB片段。在一些实施方案中，这样的药剂阻断TcdB与卷曲受体的结合。在一些实施方案中，这样的药剂阻断TcdB进入上皮细胞中。在一些实施方案中，这样的药剂阻断Wnt与FZD的结合。还提供了用于治疗多种疾病(例如，CDI或癌症)的组合物和方法。

本公开内容的一些方面提供了分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽在SEQ ID NO：2和19至25中的任一个中包含1至50个保守氨基酸替换。在一些实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽由SEQ IDNO：2和19至25中任一个的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，多肽是交联的、环化的、缀合的、酰化的、羧基化的、脂化的、乙酰化的、巯基乙酸酰胺化的、烷基化的、甲基化的、聚苷氨酰化的(polyglycylated)、糖基化的、聚唾液酸化的(polysialylated)、磷酸化的、腺苷酰化的(adenylylated)、PEG化的，或其组合。在一些实施方案中，分离的多肽在C端或在N端包含修饰。

在一些实施方案中，分离的多肽还包含融合结构域。在一些实施方案中，融合结构域选自：多聚组氨酸(polyhistidine)、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(glutathione Stransferase，GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)或人血清白蛋白。在一些实施方案中，融合结构域是人IgG1的Fc部分。在一些实施方案中，人IgG1的Fc部分包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽由SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，融合结构域包含卷曲受体的富含半胱氨酸结构域(cysteine-rich domain，CRD)。在一些实施方案中，CRD包含SEQ ID NO：3至6中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：10至17和39至95中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽由SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，融合结构域包含治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是抗菌剂或卷曲受体共受体的抗体。在一些实施方案中，抗菌剂是抗生素。在一些实施方案中，卷曲受体共受体是脂蛋白受体相关蛋白(lipoprotein receptor-related protein，LRP)-5/6、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)或酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR2)。

在一些实施方案中，分离的多肽与聚合物连接。在一些实施方案中，聚合物延长分离的多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，聚合物延长分离的多肽的保质期。

在一些实施方案中，多肽与卷曲受体结合。在一些实施方案中，多肽降低Wnt信号传导。

本公开内容的另一些方面提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO：2和8至95中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。提供了包含这样的核酸的载体。还提供了包含这样的核酸分子或载体的细胞。

本公开内容的另一些方面提供了产生分离的多肽的方法，该方法包括在其中产生所述多肽的条件下培养本文中所述的细胞的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括从培养物回收多肽。

本文中还提供了与卷曲受体的脂质结合沟结合的药剂。在一些实施方案中，药剂是人工蛋白质。在一些实施方案中，药剂是抗体。在一些实施方案中，药剂是小分子。在一些实施方案中，药剂包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，药剂包含含有SEQ ID NO：2和19至25的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，药剂阻断TcdB与卷曲受体的结合。在一些实施方案中，药剂阻断Wnt与卷曲受体的结合。

本公开内容的另一些方面提供了包含本文中所述的分离的多肽或药剂的组合物。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含可药用载体。

本公开内容的另一些方面提供了治疗艰难梭菌感染(CDI)的方法，该方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文中所述的分离的多肽、药剂或药物组合物。在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用有效量的诱导细胞中卷曲受体下游的Wnt信号传导的第二药剂。在一些实施方案中，第二药剂是GSK-3抑制剂。在一些实施方案中，GSK-3抑制剂是锂(LiCl)、CHIR99021、SB 216763、BIO、TCS 2002、TC-G 24、TWS 119、SB 415286、A1070722、AR-A 014418、L803-mts，或其组合。在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用有效量的抑制细胞中TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性的第三药剂。在一些实施方案中，第三药剂是依布硒。在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用卷曲受体抗体。

本文中还提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文中所述的分离的多肽、药剂或药物组合物。在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用有效量的阻断Wnt信号传导的第二药剂。在一些实施方案中，第二药剂是Dkk家族蛋白、分泌型卷曲受体相关蛋白(S ecreted Frizzled Related Protein，sFRP)、Draxin、IGFBP-4、SOST/骨硬化蛋白(Sclerostin)、USAG1、WIF-1或卷曲受体抗体。

在一些实施方案中，癌症是转移癌。在一些实施方案中，癌症是骨肉瘤。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、胃癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用治疗有效量的抗癌剂。

附图简述

附图并不旨在按比例绘制。在附图中，在不同图中展示的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为清楚起见，并非每个组件在每个附图中都进行标记。在附图中：

图1A至1E.与CRD2复合的sTcdB的总体结构。(图1A)示出TcdB和FZD2的结构域结构，以及本研究中使用的两个相互作用的片段的示意图。GTD：葡萄糖基转移酶结构域；CPD：半胱氨酸蛋白酶结构域；递送/RBD：递送和受体结合结构域；CROP：组合的重复寡肽结构域；CRD：富含半胱氨酸结构域；7TM：7个跨膜螺旋。(图1B)在灰色球形模型中sTcdB和CRD2以及PAM的复合物的卡通表示。由于CRD2-N53上的N-连接糖基化，N-乙酰基氨基葡萄糖(N-acetyl glucosamine，NAG)显示为棒状。(图1C)sTcdB-CRD2和Wnt8-CRD8复合物的叠加结构。Wnt8与CRD8之间的两个不同的界面以圆圈突出显示(位点1&2)。(图1D)在sTcdB与CRD2之间结合的PAM的电子密度。轮廓(contoured)为2.5σ的省略电子密度图用最终精制模型覆盖。(图1E)脂质结合沟的特写视图。结合在sTcdB-CRD2和Wnt8-CRD8复合物中的PAM分子分别显示为深灰色和浅灰色棒状。

图2A至2F.sTcdB通过组合脂肪酸和肽介导的相互作用识别CRD2。(图2A)sTcdB-CRD2界面的开卷视图(open-book view)。参与蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质或这二者的残基为深灰色。(图2B、2C)PAM分子同时与CRD2(图2B)和sTcdB(图2C)相互作用。关键的PAM结合残基和PAM显示为棒状模型。(图2D、2E)sTcdB与CRD2之间的两个相邻的蛋白质介导的界面，其围绕CRD2中的脂质结合沟。(图2F)在sTcdB相互作用区域内的10个人FZD间的氨基酸序列比对。不变的残基为灰色阴影。与PAM和sTcdB结合的CRD2残基分别标记为立方体和椭圆形。

图3A至3F.TcdB与FZD2之间相互作用的基于结构的诱变分析。(图3A)破坏其与PAM和/或CRD2的相互作用的sTcdB中的突变，损害sTcdB(50nM)与过表达FZD2的HeLa细胞的结合。(图3B)当在HeLa细胞中表达时，野生型(wild type，WT)而非FZD2的突变形式介导全长TcdB(10nM)在细胞表面上的稳健结合。K127A、K127E和Y77A是CRD2中的突变，其破坏蛋白质介导的与TcdB的相互作用。F76A、F76D和L79D是CRD2中核心脂质结合沟中的突变。F130D和F128D是与PAM和TcdB部分相互作用的两个表面残基中的突变。在破坏脂质结合沟的4个突变中未检测到FZD2适当的糖基化(在橙色框中突出显示)。(图3C)如通过检测细胞表面上生物素化的FZD2所检查的，这些FZD2突变体未能到达细胞表面。(图3D)FZD2-K127A/E突变体能够介导Wnt信号传导至类似于WT的水平。(图3E)如通过TOPFLASH报道子测定所测量的，WTsTcdB而非突变体(F1597G，M1437D/L1493A)抑制Wnt3A CM在HEK293T细胞中的信号传导。数据为平均值±s.d.，n＝6，*p＜0.001，t-检验。(图3F)通过细胞变圆测定确定FZD1/2/7三重敲除HeLa细胞和CSPG4 KO HeLa细胞对全长WT TcdB和TcdB^GFE的敏感性。CR₅₀被定义为在24小时内诱导50％的细胞变圆的毒素浓度。

图4A至4H.PAM促进TcdB与FZD-CRD的结合，这继而防止Wnt脂肪酸的对接。(图4A、4B)基于下拉测定(pull-down assay)，用棕榈油酸(图4A)或Wnt3A(图4B)预先加载FZD5-CRD增强了其与sTcdB的结合。(图4C)基于BLI测定，将Wnt3A预先加载至FZD5-CRD增强了其与sTcdB的结合。对于sTcdB-F1597G的增强最小。示出了不同蛋白质向生物传感器的依次加载和结合解离。(图4D)将Wnt3A预先加载至CRD2不干扰sTcdB的后续结合。(图4E)用sTcdB预先加载CRD2阻止了Wnt3A的后续结合。(图4F)被提出参与Wnt活化的CRD二聚体的两种不同构型被叠加到sTcdB-CRD2复合物。由于空间竞争，所提出的CRD二聚体组件均与sTcdB-CRD2复合物不相容。(图4G)针对TcdB抑制Wnt信号传导所提出的模型。(图4H)TcdB-FBD-CRD2和Wnt8-CRD8复合物的叠加结构。Wrnt8与CRD8之间的两个不同的界面以圆圈突出显示(位点1&2)。

图5A至5F.sTcdB变体与CRD2的结合。通过BLI测定检查sTcdB变体对重组Fc标记的CRD2的代表性结合曲线。(图5A)WT sTcdB以高亲和力与CRD2结合。该研究中测试的4个sTcdB突变体显示出与CRD2显著弱化的结合：sTcdB-D1501A(图5B)、sTcdB-Y1509A/N1511A(图5C)、sTcdB-Y1509A/Q1599A(图5D)和sTcdB-L1433D(图5E)。测试的所有其他突变体均未示出与CRD2的可检测的结合。sTcdB变体的浓度在图5A至5F中标记。动力学分析结果总结在(图5F)中。

图6A至6C.sTcdB与TcdA中的同源片段之间的结构和序列比较。(图6A、6B)L形sTcdB可分为两个分别由第1285至1509位和第1510至1804位残基构成的亚结构域。TcdB(浅灰色)和TcdA(深灰色)的这两个亚结构域形成略微不同的角度。当两个亚结构域单独地(图6A)或作为整体(图6B)排列时，均方根偏差为约

约

和约

(图6C)在CRD2结合区域中的sTcdB与TcdA之间的氨基酸序列比对。sTcdB的二级结构在顶部示出。与PAM和CRD2结合的sTcdB的残基分别标记为立方体和椭圆形。

图7.sTcdB突变体采用野生型样结构。在StepOne实时PCR系统(ThermoFisher)上使用基于荧光的热位移测定测量蛋白质的热稳定性。当温度以线性斜坡从25℃升高至95℃时，使用疏水性染料SYPRO Orange(Sigma-Aldrich)监视蛋白质熔解。使用由仪器制造商提供的软件确定蛋白质熔解曲线的中点(Tm)。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。所有sTcdB突变体均示出与野生型蛋白质相当的Tm值，表明正确的蛋白质折叠。

图8A至8C.sTcdB变体与细胞表面上的FZD7CRD-GPI或与His标记的CRD2结合的表征。(图8A)如通过抗Myc抗体检测的，FZD7CRD-Myc-GPI在HeLa/FZD7CRD-GPI细胞系中稳定表达。(图8B)当与WT sTcdB相比时，携带突变以破坏其与PAM和/或CRD2的相互作用的sTcdB变体(约50nM)未能结合HeLa/FZD7CRD-GPI细胞。收获细胞裂解物并进行免疫印迹分析c，使用下拉测定检查sTcdB变体(约1.5μM)与固定化的His标记的CRD2的结合。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析样品。在检测CRD2与sTcdB突变体之间弱的相互作用时，下拉测定(图8C)和BLI测定(图5A至5F)比基于细胞的测定(图3A、图8B)更灵敏。这可能是由于在细胞表面上表达的FZD2/5浓度相对较低，而下拉测定和BLI测定使用了固定在基质上的高度纯化的CRD2的较高浓度。

图9A至9D.通过测量Wnt诱导的DVL2磷酸化来表征选定的sTcdB和FZD2突变体。(图9A)在WT和FZD1/2/7三重KO HeLa细胞中由Wnt3A CM诱导的DVL2磷酸化。星形(*)表示磷酸化的DVL2。(图9B)在FZD1/2/7三重KO细胞中，由Wnt3A CM诱导的DVL2磷酸化表达WT FZD2或K127A/E突变体。(图9C)sTcdB(40nM)能够抑制在HEK293T细胞中由Wnt3A CM诱导的DVL2的磷酸化。(图9D)Wnt诱导的DVL2磷酸化被WT sTcdB抑制，但不被F1597G或M1437D/L1493A突变体抑制。

图10A至10D.预先加载Wnt3A增强TcdB与多种CRD的结合。(图10A)通过在BLI测定中将Wnt3A预先加载至CRD5来增强全长TcdB与CRD5的结合。将CRD5-Fc和Wnt3A预先混合并加载到生物传感器，随后依次暴露于1μM TcdB。sTcdB与FZD4(图10B)、FZD8(图10C)和FZD9(图10D)的CRD的结合通过在BLI测定中将Wnt3A预先加载到CRD而增强。将CRD-Fc和Wnt3A预先混合并加载到生物传感器，随后依次暴露于5μM sTcdB。

图11A至11B.Wnt3A没有损害全长TcdB与CRD2的结合，但TcdB阻止Wnt3A与CRD2的结合。Wnt3A与全长TcdB在其与CRD2结合方面的关系通过在BLI测定中依次的蛋白质加载来获得。当CRD2与Wnt3A预先结合时，全长TcdB与CRD2的结合略有改变(图11A)。相反，TcdB与CRD2的结合阻断了后续Wnt3A的结合(图11B)。BSA(0.1mg/ml)作为对照。标注了不同的加载步骤。

图12.用sTcdB处理的骨肉瘤细胞在体内形成较小的肿瘤。将U2OS细胞在培养基中暴露于sTcdB(150nM)或sTcdB突变体(F1597D)6小时。然后收集细胞并皮下注射到无胸腺裸鼠(每组10只小鼠，每个部位5×10⁶个细胞)中。注射的细胞随时间生长成为实体瘤。每四天对肿瘤尺寸进行测量，持续20天。

图13A至13B.sTcdB抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。在小鼠模型中敲除基因P53和BRCA1产生乳腺癌。这些癌组织具有人三阴性乳腺癌的特征。癌组织从敲除小鼠中分离，并作为类器官模型体外生长。将一万个类器官细胞皮下注射到无胸腺裸鼠中，其长成新的癌症。在第12、14、17、20和23天以20mg/kg剂量通过腹膜内途径注射sTcdB。与注射PBS的对照组相比，注射sTcdB抑制这些乳腺癌细胞在体内生长。N＝6，*p＜0.05(图13A)。MDA-MB-231是代表三阴性乳腺癌细胞的广泛使用的人乳腺癌细胞系。这些细胞在培养期间体外生长为球形(对照)。将sTcdB添加至培养基中阻断这些细胞的生长(图13B)。

图14A至14D.FZD和与FZD结合的脂肪酸是结肠组织中针对TcdB的主要病理相关受体。(图14A)将WT TcdB、TcdB^GFE或盐水对照体内注射到WT小鼠的盲肠中。12小时之后收获盲肠组织。示出了代表性盲肠组织，并且测量每个盲肠的重量并作图。(方框代表平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)，并且棒代表s.d.，Mann-Whitney)。(图14B和14C)对盲肠组织切片进行苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色。代表性图像在图B中示出。基于上皮细胞破坏、出血性充血、黏膜水肿和炎性细胞浸润评估组织学评分(图C)。(数据为平均值±s.d.，Mann-Whitney)。比例尺，100μm。(图14D)来自注射了盐水、TcdB或TcdB^GFE的小鼠的盲肠中上皮细胞连接标志物密封蛋白-3(Claudin-3)的免疫荧光染色。比例尺，50μm。

图15A至15B.TcdB阻断CRD二聚化。(图15A)提出两个不同构型的CRD二聚体参与Wnt活化。(图15B)将这两个提出的CRD二聚体组件叠加到TcdB-FBD-CRD2复合物。由于空间竞争，二者与TcdB-FBD-CRD2复合物不相容。

具体实施方式

艰难梭菌感染(CDI)是发达国家中抗生素相关性腹泻和胃肠炎相关死亡的最常见原因^1-6。艰难梭菌毒素B(TcdB)是负责与CDI相关疾病的关键毒力因子。TcdB通过受体介导的内吞作用进入细胞，并通过关键残基的葡糖基化而使小GTP酶失活，从而导致肌动蛋白细胞骨架破坏和细胞死亡^3，7-9。Wnt受体卷曲受体家族(FZD)是结肠上皮中针对TcdB的主要受体¹⁰。TcdB与FZD的保守Wnt结合区(被称为富含半胱氨酸结构域(CRD))结合，对FZD1、2和7具有最高的亲和力。在本公开内容中示出了包含与人FZD2-CRD(CRD2)复合的FZD结合区的TcdB片段的共晶体结构。

出乎意料地，发现内源性游离脂肪酸被埋在CRD2中的疏水沟中并同时被TcdB结合。TcdB与脂肪酸之间的疏水性相互作用网络与直接的TcdB-CRD2相互作用组合，形成TcdB与CDR2的高亲和力和特异性结合的基础。CRD中的这种脂质结合沟在FZD中很大程度上是保守的，其容纳Wnt的棕榈油酸(PAM)脂质修饰^11-13。当CRD与内源性脂肪酸或预先加载的外源PAM结合时，增强TcdB与FZD的结合。此外，当与Wnt预先结合时，多个FZD示出提高的TcdB结合，这表明对接在FZD脂质结合沟中的Wnt PAM可被TcdB使用来加强结合。在另一方面，TcdB通过阻碍Wnt PAM的对接而阻止Wnt与CRD结合，而不是直接与Wnt竞争蛋白质-蛋白质相互作用。这些发现建立了TcdB利用FZD-CRD的保守脂质结合功能的分子机制，这对于宿主识别的Wnt信号传导至关重要。

本公开内容的一些方面提供了与卷曲受体(FZD)的脂质结合沟结合的药剂。“卷曲受体(FZD)”是指参与Wnt信号传导的跨膜蛋白受体家族。这些受体跨越质膜七次并构成G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)的独特家族。FZD在控制细胞极性、胚胎发育、神经突触的形成、细胞增殖以及发育和成年生物体中的许多其他过程中发挥关键作用，其中许多与Wnt信号传导途径相关。

Wnt信号传导途径是包含通过细胞表面受体将信号传递到细胞中的蛋白质的一组信号转导途径。已经表征了三种Wnt信号传导途径：经典Wnt途径、非经典平面细胞极性途径和非经典Wnt/钙途径。通过使Wnt-蛋白质配体与卷曲受体家族受体结合来活化所有三种途径，所述卷曲受体家族受体将生物信号传递至细胞内的蛋白质。经典的Wnt途径导致基因转录的调节。非经典的平面细胞极性途径调节负责细胞形状的细胞骨架。非经典的Wnt/钙途径调节细胞内的钙。Wnt信号传导途径使用附近的细胞-细胞通信(旁分泌)或同一细胞通信(自分泌)。

首先鉴定了Wnt信号传导在癌发生中的作用，然后是其在胚胎发育中的功能。Wnt信号传导还控制成人骨髓、皮肤和肠中的组织再生。例如，Wnt信号传导对于维持体内结肠干细胞是必需的，结肠干细胞不断产生新的上皮细胞。干细胞的健康对于维持和修复上皮细胞至关重要，上皮细胞以惊人的速率更新：整个结肠上皮细胞每5至7天完全更换一次。因此，如本公开内容中所举例说明的，在艰难梭菌感染期间，Wnt信号传导途径的抑制导致结肠干细胞的消耗并且极大地增大了对上皮细胞的损伤。

先前已示出TcdB在富含半胱氨酸结构域(CRD)中与FZD结合，并且该结合介导TcdB进入细胞(例如Tao et al.，Nature 538(7625)：350-355，2016，通过引用并入本文)。TcdB和Wnt二者均与FZD的N端胞外富含半胱氨酸结构域(FZD-CRD)结合。本文在表4中提供了FZD1、2、7和8的CRD的氨基酸序列。

如本文中所述，FZD蛋白中的“脂质结合沟”至少包含对应于FZD2(SEQ ID NO：4)的Q75、F76、M125、F130、P78、L79、V82、L124和F128的残基。不希望受到科学理论的束缚，如图2B中所示，脂质结合沟主要通过以下疏水性相互作用与脂质(PAM)结合：残基Q75、F76、M125和F130稳定PAM的羧基末端，并且残基P78、L79、V82、L124和F128稳定PAM的烃链。本领域技术人员可通过比对不同FZD的氨基酸序列(例如使用序列比对软件)来鉴定构成脂质结合沟的其他FZD中的对应残基。

出乎意料地发现，在脂质结合沟中存在脂质的情况下，TcdB与FZD-CRD的结合增强。然而，脂质和/或TcdB与脂质结合沟的结合阻止PAM在Wnt上的对接，PAM通过翻译后修饰添加至Wnt，这继而阻断Wnt与FZD的结合。可设计其他药剂与FZD的脂质结合沟结合。在一些实施方案中，这样的药剂阻断Wnt与FZD结合并且阻断Wnt信号传导。用于设计可与蛋白质中已知结构的结合位点(例如，FZD的脂质结合沟)结合的药剂的方法和工具是本领域技术人员可获得的。例如，本领域技术人员可使用能够进行分子建模的分子设计软件。分子设计软件的一些非限制性实例包括：Abalone、AMBER、Ascalaph Designer、BOSS、DENEB、DiscoveryStudio、DOCK、Firefly、FoldX、具有HMHN和DSHC的HyperChem、Lead Finder、LigandScout、Maestro、MAPS、Materials Studio、Molecular Operating Environment、SAMSON、Scigress、Spartan、Tinker和Winmostar。可从头设计与蛋白质中已知结构的结合位点(例如，FZD的脂质结合沟)结合的药剂，或者可通过修饰现有分子来产生药剂。这样的药剂可以是但不限于肽、人工蛋白质、抗体、核酸或小分子。

在一些实施方案中，药剂是人工蛋白质。本文中使用的“人工蛋白质”是指不由天然存在的遗传序列编码的蛋白质。人工蛋白质模仿真实蛋白质的功能和结构。此外，尽管天然蛋白质的构建模块是氨基酸，但是人工蛋白质可包含氨基酸、核苷酸、核苷酸类似物和其他化学部分。不同类型的人工蛋白质及其设计已在本领域中有所描述，例如在Razeghifardet al.，Curr Protein Pept Sci.2007Feb；8(1)：3-18和Lou et al.，NatureCommunications 7，Article number：12294 2016中，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，药剂是抗体。“抗体”或“免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)”是主要由浆细胞产生的大的Y形蛋白，其由免疫系统用于中和外源物质(例如，病原体，如细菌和病毒)。抗体分类为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。“抗体”和“抗体片段”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个CL结构域构成。VH和VL区域可进一步细分为被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)的高变区，其散布有被称为框架区(framework region，FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包含免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

基础4链抗体单元是由两条相同的L链和两条H链构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基础异四聚体单元和被称为J链的另外的多肽组成，并且因此包含10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个基础4链单元和J链的多价聚集体)。在IgG的情况下，4链单元一般为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链则根据H链的同种型通过一个或更多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有可变结构域(variable domain，VH)，随后是对于每个α和γ链的三个恒定结构域(constant domain，CH)，以及对于μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(the first constant domain of the heavy chain，CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，(例如，Basic and ClinicalImmunology，8th edition，Daniel P.Stites，Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，page 71and Chapter 6，其通过引用并入本文)。

来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域的氨基酸序列分配成两种明显不同的类型(被称为κ和λ)之一。根据其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分配为不同类别或同种型。免疫球蛋白有五种类别：具有分别命名为α、δ、ε、γ和μ的重链的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。根据CH序列中相对较小差异和功能γ和α类别进一步分为亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀地分布于可变结构域的110个氨基酸跨度(span)中。相反，V区由15至30个氨基酸的被称为框架区(FR)的相对不变的段(stretch)组成，所述相对不变的段被每个9至12个氨基酸长的被称为“高变区”的极度可变的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过被形成环连接的三个高变区连接的四个FR，所述四个FR主要采用β-片层构型，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每个链中的高变区通过FR紧密贴近地保持在一起，并且与来自其他链的高变区一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见，例如，Kabatet al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，通过引用并入本文)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应物功能，例如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。

产生抗体(例如，单克隆抗体或多克隆抗体)的方法是本领域中已知的。例如，多克隆抗体可通过用所选择的变应原对动物(优选哺乳动物)进行免疫，随后从血液、骨髓、淋巴结或脾分离产生抗体的B淋巴细胞来制备。或者，可从动物分离产生抗体的细胞，并使其在体外暴露于针对其产生抗体的变应原。然后，任选地在与永生化细胞系(例如骨髓瘤)融合之后，可培养产生抗体的细胞以获得产生抗体的细胞群。在一些实施方案中，可从变应性患者的组织分离作为起始物质的B淋巴细胞，以产生全人多克隆抗体。抗体可在针对人免疫球蛋白基因转基因的小鼠、大鼠、猪(pig、swine)、绵羊、牛材料或其他动物中产生，作为起始物质以产生全人多克隆抗体。在一些实施方案中，针对人免疫球蛋白基因转基因的小鼠或其他动物(例如如美国专利No.5,939,598中公开的)，可对动物进行免疫以刺激特异性抗体和产生抗体之细胞的体内产生，然后通过提取B淋巴细胞或纯化多克隆血清从动物中制备多克隆抗体。

单克隆抗体通常通过细胞培养来制备，其涉及将骨髓瘤细胞与用所期望的抗原免疫的小鼠脾细胞进行融合(即，杂交瘤技术)。将细胞混合物稀释，并且克隆在微滴定孔上从单亲本细胞生长。然后测定由不同克隆分泌的抗体与抗原(用例如ELISA或抗原微阵列测定的测试)或免疫斑点印迹结合的能力。然后选择最高生产力且稳定的克隆用于将来使用。

在一些实施方案中，本文中所述的抗体被“人源化”以在人中使用(例如，作为治疗剂)。非人(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是包含最小的来源于非人抗体之序列的嵌合抗体。人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基被来自具有所期望的抗体特异性、亲和力和能力的例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含不存在于接受者抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还任选地将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。对于进一步的细节，参见Joneset al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

在一些实施方案中，药剂是小分子。“小分子”是指无论是天然存在的还是人工创造的(例如，通过化学合成)具有相对较低分子量的有机化合物。通常来说，有机化合物包含碳。有机化合物可包含多个碳-碳键、立构中心和其他官能团(例如胺、羟基、羰基或杂环)。在一些实施方案中，小分子是分子量小于约1500g/mol的单体有机化合物。在一些实施方案中，小分子的分子量小于约1000g/mol或小于约500g/mol。在一些实施方案中，小分子是药物，例如，已经被适当的政府机构或监管机构认为在人或动物中安全有效使用的药物。小分子的一些非限制性实例包括脂质、单糖、第二信使、其他天然产物和代谢产物，以及药物和其他异生物质。

“脂质”是指一组天然存在的分子，其包含脂肪；蜡；固醇；脂溶性维生素(例如维生素A、D、E和K)；甘油单酯；甘油二酯；甘油三酯；磷脂等。“单糖”是指不能水解以得到更简单糖的糖类(例如，葡萄糖)。单糖的一些非限制性实例包括葡萄糖(右旋糖)、果糖(左旋糖)和半乳糖。“第二信使”是这样的分子，其将细胞表面上的受体(例如，从蛋白激素、生长因子等)接收到的信号传达到胞质溶胶和/或细胞核中的靶分子。第二信使分子的一些非限制性实例包括环AMP、环GMP、肌醇三磷酸、二酰甘油和钙。“代谢物”是作为代谢的中间产物形成的分子。代谢物的一些非限制性实例包括乙醇、谷氨酸、天冬氨酸、5’鸟苷酸、异抗坏血酸、乙酸、乳酸、甘油、以及维生素B2。“异生物质”是在生物体中发现的通常不由生物自然产生的或预期不存在于生物体中的外来化学物质。异生物质的一些非限制性实例包括药物、抗生素、致癌物、环境污染物、食品添加剂、碳氢化合物、以及农药。

在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低TcdB与FZD的结合(例如，降低至少20％)。在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低TcdB与FZD的结合至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低TcdB与FZD的结合20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。

在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低Wnt与FZD的结合(例如，降低至少20％)。在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低Wnt与FZD的结合至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低Wnt与FZD的结合20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。

在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低Wnt信号传导(例如，降低至少20％)。在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低Wnt信号传导至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少有95％、至少99％或更多。在一些实施方案中，与没有药剂的情况相比，该药剂降低Wnt信号传导20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。

在一些实施方案中，与FZD的脂质结合沟结合的药剂是来源于TcdB的多肽。本文中证明了对应于全长(野生型TcdB(SEQ ID NO：1))的第1285至1804位氨基酸的短的TcdB片段与FZD的脂质结合沟结合。该片段被命名为TcdB_1285-1804(也称为“sTcdB”或“TcdB-FBD”SEQID NO：2)。还发现了数种sTcB变体与FZD的脂质结合沟结合。

因此，本公开内容的一些方面提供了与本文中所述的TcdB片段具有至少80％同一性的分离的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽用作与FDZ的脂质结合沟结合的药剂。本文中使用的“分离的多肽”是指从中分离或基本上不含(例如，至少80％、90％、95％、97％、99％或99.5％不含)其他蛋白质和/或其他多肽(例如，TcdB多肽种类)的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽100％不含其他蛋白质和/或其他多肽(例如，TcdB多肽种类)。

在一些实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽不包含SEQ ID NO：1的氨基酸。在一些实施方案中，分离的多肽由SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：2和19至25中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。例如，分离的多肽可包含与SEQ ID NO：2和19至25中任一个具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：2和19至25中任一个具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，与sTcdB的天然氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或也与FZD的脂质结合沟结合的任何TcdB变体(例如，SEQ ID No：19至25中任一个)相比，分离的多肽包含氨基酸替换。在一些实施方案中，氨基酸替换是保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是指将氨基酸改变为具有相似生物化学性质(例如，电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸的氨基酸替换。氨基酸的保守替换包括，例如，在以下组内的氨基酸之间进行的替换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。保守的氨基酸替换不改变其中进行氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或大小特征。保守氨基酸替换通常不改变肽的总体结构和/或可用于与结合伴侣(binding partner)结合形成范德华键(van der Waals bond)的氨基酸侧链的类型。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，分离的多肽可包含1至100个保守氨基酸替换。例如，与SEQ ID NO：2相比，分离的多肽可包含1至100、1至95、1至90、1至85、1至80、1至75、1至70、1至65、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至5、5至100、5至95、5至90、5至85、5至80、5至75、5至70、5至65、5至60、5至55、5至50、5至45、5至40、5至35、5至30、5至25、5至20、5至15、5至10、10至100、10至95、10至90、10至85、10至80、10至75、10至70、10至65、10至60、10至55、10至50、10至45、10至40、10至35、10至30、10至25、10至20、10至15、15至100、15至95、15至90、15至85、15至80、15至75、15至70、15至65、15至60、15至55、15至50、15至45、15至40、15至35、15至30、15至25、15至20、20至100、20至95、20至90、20至85、20至80、20至75、20至70、20至65、20至60、20至55、20至50、20至45、20至40、20至35、20至30、20至25、25至100、25至95、25至90、25至85、25至80、25至75、25至70、25至65、25至60、25至55、25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、30至100、30至95、30至90、30至85、30至80、30至75、30至70、30至65、30至60、30至55、30至50、30至45、30至40、30至35、35至100、35至95、35至90、35至85、35至80、35至75、35至70、35至65、35至60、35至55、35至50、35至45、35至40、40至100、40至95、40至90、40至85、40至80、40至75、40至70、40至65、40至60、40至55、40至50、40至45、45至100、45至95、45至90、45至85、45至80、45至75、45至70、45至65、45至60、45至55、45至50、50至100、50至95、50至90、50至85、50至80、50至75、50至70、50至65、50至60、50至55、55至100、55至95、55至90、55至85、55至80、55至75、55至70、55至65、55至60、60至100、60至95、60至90、60至85、60至80、60至75、60至70、60至65、65至100、65至95、65至90、65至85、65至80、65至75、65至70、70至100、70至95、70至90、70至85、70至80、70至75、75至100、75至95、75至90、75至85、75至80、80至100、80至95、80至90、80至85、85至100、85至95、85至90、90至100、90至95、或95至100个保守氨基酸替换。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，分离的多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个保守氨基酸替换。通过在合成过程中以合适的顺序添加期望的替代氨基酸，可在肽的化学合成期间实现氨基酸替换。或者，可使用分子生物学方法(例如，重组DNA技术)。

在一些实施方案中，分离的多肽包含修饰。包含修饰的多肽具有除氨基酸内容之外的另外特征。本文中使用的肽的“修饰”或“衍生物”产生修饰的或衍生化的多肽，其是相对于参照肽进行化学修饰的给定肽的形式，所述修饰包括但不限于寡聚化或多聚化、氨基酸残基或肽骨架的修饰、交联、环化、缀合、聚乙二醇化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰化、羧基化、脂化、巯基乙酸酰胺化、烷基化、甲基化、聚苷氨酰化、糖基化、聚唾液酸化、腺苷酰化、PEG化、与另外的异源氨基酸序列融合，或基本上改变肽的稳定性、溶解性或其他性质同时基本上保留本文中所述多肽的活性的其他修饰。包含此类修饰的分离的多肽是交联的、环化的、缀合的、酰化的、羧基化的、脂化的、乙酰化的、巯基乙酸酰胺化的、烷基化的、甲基化的、聚苷氨酰化的、糖基化的、唾液酸化的、磷酸化的、腺苷酰化的、PEG化的，或其组合。

在一些实施方案中，包含修饰的分离的多肽包含非氨基酸要素，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸酯。在一些实施方案中，修饰在分离的多肽的C端(例如，C端酰胺化)。在一些实施方案中，修饰在分离的多肽的N端(例如，N端乙酰化)。在一些实施方案中，分离的多肽的N端和C端二者均包含修饰。末端修饰是有用的，并且是公知的以降低对蛋白酶消化的易感性，并因此用于延长多肽在溶液中，特别是在可存在蛋白酶的生物流体中的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽在序列内进一步修饰，例如通过末端-NH2酰化修饰，例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化，通过末端羧基酰胺化，例如用氨、甲胺以及类似的末端修饰。

氨基端修饰包括甲基化(例如，--NHCH3或--N(CH3)2)、乙酰化(例如，用乙酸或其卤代衍生物，例如α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸)、添加苄氧基羰基(Cbz)基团，或用任何包含由RCOO--定义的羧酸酯官能团或由R--SO2--定义的磺酰基官能团的封闭基团(其中R选自烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基等，以及类似的基团)来封闭氨基端。还可在N端并入脱氨基酸(使得不存在N端氨基)以降低对蛋白酶的易感性或限制多肽的构象。在某些实施方案中，N端用乙酸或乙酸酐乙酰化。

羧基端修饰包括用羧酰胺基团替代游离酸或在羧基端形成环状内酰胺以引入结构限制(structural constraint)。还可使本文中所述的肽环化，或在肽的末端并入脱氨基或脱羧基残基，以使得不存在末端氨基或羧基，以降低对蛋白酶的易感性或限制肽的构象。环肽合成的方法是本领域中已知的，例如，在美国专利申请No.20090035814；Muralidharan和Muir，2006，Nat Methods，3：429-38；以及Lockless和Muir，2009，Proc Natl Acad Sci US A.Jun 18，Epub中。本文中所述的肽的C端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基和羧基，及其低级酯衍生物，及其可药用盐。

在一些实施方案中，分离的多肽是磷酸化的。磷酸化可发生在其中通过翻译后修饰机制产生多肽的细胞中。或者，可在体外使肽磷酸化(例如，如在Hruby，et al.(1990)Biochem J.268：249-262中所述，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，分离的多肽可通过用其他侧链替换遗传编码的氨基酸(或立体异构D氨基酸)的天然存在的侧链进行修饰，例如用以下基团：例如烷基，低级(C1-C6)烷基，环4-、5-、6-至7-元烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基及其低级酯衍生物，以及用4-、5-、6-至7-元杂环。特别地，可使用其中脯氨酸残基的环大小从5元变为4、6或7元的脯氨酸类似物。环状基团可以是饱和的或不饱和的，并且如果是不饱和的，可以是芳香族或非芳香族的。杂环基团优选包含一个或更多个氮、氧和/或硫杂原子。这样的基团的一些实例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异

唑基、吗啉基(例如，吗啉代)、

唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶子基(piperidino))、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)和三唑基。这些杂环基可以是经取代的或未经取代的。当基团被取代时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧或者经取代或未经取代的苯基。

在一些实施方案中，分离的多肽是多聚体的，例如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方案中，用于形成寡聚多肽的分子接头是肽接头分子。在一些实施方案中，肽连接分子包含至少一个氨基酸残基，其连接至少两个根据本公开内容的肽。肽接头包含例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽接头少于50个氨基酸残基。肽连接分子可共价或非共价地偶联多肽或蛋白质。用于连接的典型的氨基酸残基是甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。肽接头在其氨基端连接至一个肽、多肽或多肽结构域(例如，C-肽)，并且在其羧基端连接至另一个肽、多肽或多肽结构域(再次，例如，C-肽)。可用接头肽的一些实例包括但不限于甘氨酸聚合物((G)n)，包括甘氨酸-丝氨酸和甘氨酸-丙氨酸聚合物(例如，(Gly4Ser)n重复，其中n＝1至8，优选地n＝3、4、5或6)。肽接头分子的另一些实例描述于美国专利No.5,856,456，并通过引用在此并入。

在一些实施方案中，分子接头是化学接头，例如通过半胱氨酸氨基酸残基之间的二硫键或通过胺交联剂(例如，戊二醛、双(亚氨基酯)、双(琥珀酰亚胺酯)、二异氰酸酯和二酰氯)形成的化学桥的连接。关于化学交联剂的大量数据可见于INVITROGEN的MolecularProbe的5.2节中。

在一些实施方案中，本文中所述的分离的肽通过共价连接至至少一个接头部分而二聚化或多聚化。接头部分优选但非必须是C1-12连接部分，其任选地以一个或两个--NH--连接封端，并且任选地在一个或更多个可用的碳原子上被低级烷基取代基所取代。在一些实施方案中，接头包含--NH-R--NH--，其中R是被官能团(例如羧基或氨基)取代的低级(C1-C6)亚烷基，其能够与另一个分子部分(例如，如在肽合成期间可存在于固体支持物的表面上或与药代动力学修饰剂(例如PEG))结合。在某些实施方案中，接头是赖氨酸残基。在一些实施方案中，接头通过同时连接至每个单体的C端氨基酸而桥接两个肽单体的C端。在一些实施方案中，接头通过连接至不在C端的氨基酸侧链而桥接肽。当接头连接至不在肽的C端氨基酸的侧链时，侧链优选包含胺，例如见于赖氨酸中的那些，并且接头包含两个或更多个能够与肽形成酰胺键的羧基。

在一些实施方案中，分离的肽(例如，单体、二聚体或多聚体)连接至一个或更多个聚合物部分。在一些实施方案中，这些聚合物共价连接至分离的多肽。在一些实施方案中，对于最终产品制备物的治疗用途，聚合物是可药用的。本领域技术人员将能够基于如下考虑选择所期望的聚合物：聚合物-肽缀合物是否将在治疗上使用，并且如果是，所期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性和其他考虑因素。

示例性的合适的聚合物包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、纤维素和纤维素衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α，β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。这样的聚合物可具有或不具有其自身的生物学活性。聚合物可与多肽共价或非共价缀合。用于延长血清半衰期和用于放射治疗的缀合方法在本领域中是已知的，例如，在美国专利No.：5,180,816、6,423,685、6,884,780和7,022,673中，其通过引用在此整体并入。

在一些实施方案中，分离的肽(例如，单体、二聚体或多聚体)连接至一个或更多个水溶性聚合物部分。水溶性聚合物可以是：例如聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三

烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物和聚氧乙烯化多元醇。在一些实施方案中，水溶性聚合物是PEG。

聚合物可以是任何分子量，并且可以是支链或非支链的。反应物PEG的平均分子量优选为约3,000至约50,000道尔顿(术语“约”表示在PEG的制备中，一些分子将比所述分子量更大，以及一些比所述分子量更小)。更优选地，PEG的分子量为约10kDa至约40kDa，并且甚至更优选地，PEG的分子量为15kDa至30kDa。可使用其他大小，这取决于所期望的治疗特征(例如，所期望的持续释放的持续时间；对生物学活性的影响(如果有的话)；易于处理；抗原性程度或缺乏；以及本领域技术人员已知的PEG对治疗肽的其他影响)。

连接的聚合物分子的数目可变化；例如，一个、两个、三个或更多个水溶性聚合物可连接至本公开内容的肽上。多个连接的聚合物可以是相同或不同的化学部分(例如，不同分子量的PEG)。

在一些实施方案中，PEG可连接至分离的多肽的至少一端(N端或C端)。在另一些实施方案中，PEG可连接至分离的多肽二聚体或多聚体的接头部分。在一些实施方案中，接头包含多于一个能够用适当活化的PEG物质衍生化的反应性胺。

在一些实施方案中，连接至PEG聚合物的分离的多肽被称为“PEG化的”。PEG化是将聚乙二醇聚合物链共价连接至另一分子(通常是药物或治疗性蛋白质)的过程。通常通过将PEG的反应性衍生物与靶标大分子一起孵育来实现PEG化。PEG与药物或治疗性蛋白质的共价连接可从宿主免疫系统“掩蔽”药剂(降低免疫原性和抗原性)，并提高药剂的流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)，这通过降低肾清除率来延长其循环时间。PEG化还可为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。与未经修饰形式相比，PEG化通过提高分子的分子量可赋予数个显著的药理学优势，例如：改善的药物溶解性、降低的剂量频率、没有减弱效力而具有潜在降低的毒性、延长的循环寿命、提高的药物稳定性和增强免于蛋白水解降解的保护。此外，PEG化药物具有更广泛的新递送形式和给药方案的机会。使分子、蛋白质和肽PEG化的方法是本领域中公知的，例如，如在美国专利No.5,766,897；7,610,156；7,256,258和国际申请No.WO/1998/032466中所描述的。

在一些实施方案中，分离的多肽(具有或不具有本文中所述的修饰)可与除聚乙二醇(PEG)之外的其他聚合物缀合。该聚合物可具有或可不具有其自身的生物学活性。聚合物缀合的另一些实例包括但不限于聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、纤维素和纤维素衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α，β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。与聚合物的缀合可改善血清半衰期等效果。可使用多种螯合剂来缀合本文中所述的肽。这些螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三氨基戊乙酸(DTPA)、乙二醇-0，0′-双(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、N，N′-双(羟基苄基)乙二胺-N，N′-二乙酸(HBED)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十三烷-1，4，7，10-四乙酸(TITRA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)和1，4，8，11-四氮杂环十四烷(TETRA)。缀合方法是本领域中公知的，例如P.E.Thorpe，et.al，1978，Nature 271，752-755；Harokopakis E.，et.al.，1995，Journal of Immunological Methods，185：31-42；S.F.Atkinson，et.al.，2001，J.Biol.Chem.，276：27930-27935；以及美国专利No.：5,601,825、5,180,816、6,423,685、6,706,252、6,884,780和7,022,673，其通过引用在此整体并入。

在一些实施方案中，与未连接至聚合物的分离的多肽相比，将分离的多肽连接至聚合物(例如PEG)延长分离的多肽的血清半衰期(例如，延长至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、2倍、5倍、10倍、100倍或更多)。在一些实施方案中，与未连接至聚合物的分离的多肽相比，将分离的多肽连接至聚合物(例如PEG)延长分离的多肽的货架半衰期(例如，延长至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、2倍、5倍、10倍、100倍或更多)。本文中使用的分离的多肽的“血清半衰期”是指体内多肽的浓度或量降低一半所需的时间段。多肽的血清半衰期取决于它从血清中消除的有多快。血清半衰期越长，多肽在体内越稳定。“保质期”是指从制造日起，产品在规定条件下储存时，预期保持在其批准的产品规格内的时间段。期望的是，治疗剂(例如本公开内容的分离的多肽)具有更长的保质期。

用于稳定本领域中已知的肽的其他方法可用于本文中所述的方法和组合物。例如，使用D-氨基酸，使用用于肽骨架的还原的酰胺键，以及使用非肽键来连接侧链，包括但不限于吡咯啉酮和糖模拟物各自可提供稳定化。Hirschmann et al.描述了糖支架肽模拟物的设计和合成(J.Med.Chem.，1996，36，2441-2448，其通过引用整体并入本文)。此外，基于吡咯啉酮的肽模拟物在稳定的背景下呈现肽药效团，其具有改善的生物利用度特征(参见例如Smith et al.，J.Am.Chem.Soc.2000，122，11037-11038)，其通过引用整体并入本文。本文中所述的多肽可缀合或以其他方式共价连接至其他分子(例如，使用化学接头)。一种这样的连接形式是通过非酰胺键(例如，二硫键)。

在一些实施方案中，本文中所述的分离的多肽还包含融合结构域。这样的融合结构域的公知的实例包括但不限于多聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构域以赋予所期望的特性。例如，一些融合结构域特别可用于通过亲和色谱法分离融合蛋白。出于亲和纯化的目的，使用用于亲和色谱法的相关基质，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-和镍-或钴-缀合的树脂。许多这样的基质可以以“试剂盒”形式获得，例如可用于(HIS6)融合伴侣(fusion partner)的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统(Qiagen)。在一些实施方案中，分离的多肽片段与在体内稳定分离的多肽片段的结构域(“稳定者”结构域)融合。本文中使用的“稳定”意指体内多肽的血清半衰期或货架半衰期延长，无论这是否是由于破坏降低、通过肾的清除率降低或其他药代动力学效应。已知与免疫球蛋白的Fc部分的融合对多种蛋白质赋予所期望的药代动力学性质。同样地，与人血清白蛋白的融合可赋予所期望的性质。可选择的其他类型的融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能结构域。

在一些实施方案中，融合结构域是适用于增强分子的血清半衰期或货架半衰期的抗体或其结构域。在一些实施方案中，分离的多肽与融合结构域连接(例如，共价连接，例如通过接头分子)。在一些实施方案中，融合结构域在免疫球蛋白Fc区中包含一个或更多个恒定结构域。本文中使用的术语“免疫球蛋白Fc区”或简称为“Fc结构域”意指免疫球蛋白链恒定区的羧基端部分，优选为免疫球蛋白重链恒定区或其一部分。例如，免疫球蛋白Fc区可包含1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或5)两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区至少包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选地缺少CH1结构域。

在一些实施方案中，获得重链恒定区的免疫球蛋白的类别是IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)。可使用其他类型的免疫球蛋白，IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。美国专利No.5,541,087和5,726,044中详细讨论了合适的免疫球蛋白重链恒定区的选择。选择来自某些免疫球蛋白类别和亚类的特定免疫球蛋白重链恒定区序列以实现特定结果被认为在本领域技术水平内。在一些实施方案中，Fc结构域来自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。在一些实施方案中，编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分包含铰链结构域的至少一部分和/或Fc γ的CH3结构域的至少一部分，或者IgA、IgD、IgE或IgM中任一种的同源结构域。

在一些实施方案中，分离的多肽还包含人IgG的Fc部分。在一些实施方案中，Fc结构域包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的氨基酸序列。例如，Fc结构域可包含与ID NO：7具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID NO：7具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，包含Fc融合结构域的分离的多肽包含与SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。例如，包含Fc融合结构域的分离的多肽可包含与SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含Fc融合结构域的分离的多肽包含与SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含Fc融合结构域的分离的多肽包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含Fc融合结构域的分离的多肽由SEQ IDNO：8、9和26至39中任一个的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，Fc结构域可在残基例如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434处具有一个或更多个突变。在一些实施方案中，具有一个或更多个这些突变(例如，Asp-265突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有降低的与Fc受体结合的能力。在一些实施方案中，具有一个或更多个这些突变(例如，Asn-434突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有提高的与MHC I类相关Fc受体(FcRN)结合的能力。

此外，考虑了免疫球蛋白重链恒定区内氨基酸的替换或缺失可用于实践本文中所公开的方法和组合物。一个实例是在上部CH2区域中引入氨基酸替换以产生对Fc受体具有降低的亲和力的Fc变体(Cole et al.(1997)J.Immunol.159：3613)。

在一些实施方案中，分离的多肽包含含有卷曲受体的富含半胱氨酸结构域(CRD)的融合结构域。在一些实施方案中，FZD的CRD结构域包含SEQ ID NO：3至6中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，FZD的CRD结构域包含与SEQ ID NO：3至6中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。例如，FZD的CRD结构域可包含与SEQ ID NO：3至6中任一个具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FZD的CRD结构域包含与SEQ ID NO：3至6中任一个具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FZD的CRD结构域由SEQ ID NO：3至6中任一个的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，包含作为FZD的CRD结构域的融合结构域的分离的肽包含SEQID NO：10至17和40至95中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含作为FZD的CRD结构域的融合结构域的分离的肽包含与SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。例如，包含作为FZD的CRD结构域的融合结构域的分离的肽可包含与SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含作为FZD的CRD结构域的融合结构域的分离的肽包含与SEQ ID NO：10至17中任一个具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含作为FZD的CRD结构域的融合结构域的分离的肽由SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，分离的多肽与包含治疗剂(例如，抗菌剂)的融合结构域融合。在一些实施方案中，治疗剂是抗生素。可根据本公开内容使用的抗菌剂的类别包括但不限于氨基糖苷类、安沙霉素类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、林可酰胺类、脂肽类、大环内酯类、单环β-内酰胺类(monobactams)、硝基呋喃类、

唑烷酮类、青霉素类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。

在一些实施方案中，治疗剂是针对FZD共受体的抗体。在本领域中已知，为了促进Wnt信号传导，在Wnt蛋白与FZD之间的相互作用的同时可需要共受体。在活化受体之后，将信号发送至磷蛋白Dishevelled(Dsh)，其位于细胞质中。通过抗体的结合阻断卷曲受体共受体也阻断了Wnt信号传导。卷曲受体共受体的一些实例包括但不限于脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6、受体酪氨酸激酶(RTK)以及酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR2)。

对于本文中所述的分离的多肽，预见了不同修饰和衍生化的所有组合。衍生化多肽的修饰、衍生物和方法描述于公布的国际申请WO 2010/014616，其内容通过引用并入本文。

使用如在Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993中修改的Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990的算法确定两个氨基酸序列的“百分比同一性”。将这种算法引入Altschul，et al.J.Mol.Biol.215：403-10，1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质检索，以获得与目的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可使用如在Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997中所述的GappedBLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。

在一些实施方案中，本文中所述的分离的多肽或任何变体或者衍生物与FZD结合。在一些实施方案中，与不存在分离的多肽的情况相比，本文中所述的分离的多肽或任何变体或者衍生物降低Wnt信号传导(例如，降低至少20％)。例如，与不存在分离的多肽的情况相比，本文中所述的分离的多肽或任何变体或者衍生物可降低Wnt信号传导至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施方案中，与不存在分离的多肽的情况相比，本文中所述的分离的多肽或任何变体或者衍生物降低Wnt信号传导20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％。

包含氨基酸替换、修饰或融合结构域的分离的多肽将基本上保留未修饰的多肽的活性。“基本上保留”意指在相似的条件下，与类似测定中的原始多肽的活性相比，变体的一种或更多种活性为至少30％；优选地与未修饰的多肽相比，活性为至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍或更高活性。

本公开内容的分离的多肽通常将通过在合适的细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或昆虫细胞)中表达形式重组核酸来产生并分离。可通过本领域已知的任何方法获得编码本文中所述的多肽的核酸，并确定核酸的核苷酸序列。本文中还提供了编码本文中所公开的任何分离的多肽片段的分离和/或重组核酸。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：2和8至95中任一个具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：2和8至95中任一个具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，核酸包含在载体(例如表达载体)内。在一些实施方案中，载体包含与核酸可操作地连接的启动子。

多种启动子可用于表达本文中所述的多肽，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒LTR(例如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lac UV5启动子和单纯疱疹tk病毒启动子。

还可使用可调节的启动子。这样的可调节启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节子来调节含有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录的那些[Brown，M.et al.，Cell，49：603-612(1987)]，使用四环素阻遏物(tetR)的那些[Gossen，M.，和Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992)；Yao，F.et al.，Human GeneTherapy，9：1939-1950(1998)；Shockelt，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995)]。其他系统包括FK506二聚体、使用astradiol的p65或VP16、RU486、二酚米乐甾酮(diphenol murislerone)或雷帕霉素。可诱导系统可从Invitrogen、Clontech和Ariad获得。

可使用包含具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可作为转录调节子发挥作用以调节来自含有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown et al.，Cell，49：603-612(1987)]；Gossen和Bujard(1992)；[M.Gossen et al.，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)]，将四环素阻遏物(tetR)与转录活化子(VP16)组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录活化子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，其具有来自人巨细胞病毒(hCMV)的主要立即早期启动子的含有tetO的最小启动子，以产生tetR-tet操纵子系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关(Yao et al.，Human Gene Therapy；Gossen et al.，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)；Shockett et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995))。

另外，载体可包含例如以下的一些或全部：选择标志物基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的附加体复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRESes)、多功能多克隆位点；以及用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于产生包含转基因的载体的合适载体和方法是本领域中公知的和可获得的。

可通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含核酸的表达载体转移至宿主细胞，并随后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文中所述的多肽。在一些实施方案中，本文中所述多肽的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。

用于表达本文中所述的分离的多肽的宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌)，或优选真核细胞。特别地，与来自例如人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体联合的哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO))是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking et al.(1986)“Powerful And VersatileEnhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors，”Gene 45：101-106；Cockett et al.(1990)“High Level Expression Of Tissue Inhibitor OfMetalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine SynthetaseGene Amplification，”Biotechnology 8：662-667)。

可使用多种宿主表达载体系统来表达本文中所述的分离的多肽。这样的宿主表达系统不仅代表可产生和随后纯化本文中所述的分离的多肽的编码序列的载剂，而且也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文中所述的分离的多肽的细胞。这些包括但不限于用包含本文中所述分离多肽的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用包含编码本文中所述分离多肽的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，Saccharomyces pichia)；用包含编码本文中所述分离多肽的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或用包含编码本文中所述分离的多肽的序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利No.5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的人视网膜细胞)，所述哺乳动物细胞系统包含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自于哺乳动物病毒基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。

在细菌系统中，根据预期用于被表达的多肽的用途，可有利地选择多种表达载体。例如，当要产生大量这样的蛋白质时，为了产生本文中所述多肽的药物组合物，可期望易于纯化的指导高水平融合蛋白产物表达的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Rüther et al.(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones，”EMBO J.2：1791-1794)，其中编码序列可用lacZ编码区单独连接到载体框架中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye et al.(1985)“Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of EscherichiaColi，”Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke et al.(1989)“Expression OfHuman Asparagine Synthetase In Escherichia Coli，”J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等。还可使用pGEX载体来用谷胱甘肽S-转移酶(GST)将外源多肽表达为融合蛋白。通常来说，这样的融合蛋白是可溶的，并且可通过吸附和与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠结合，随后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱而易于从裂解的细胞中纯化。设计pGEX载体以包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点以使得克隆的靶基因产物可从GST部分释放。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。编码序列可单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，目的编码序列可连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，E1区或E3区)将产生可存活并且能够在受感染的宿主中表达免疫球蛋白分子的重组病毒(例如，参见Logan et al.(1984)“Adenovirus TripartiteLeader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。对于插入的抗体编码序列的高效翻译，还可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所期望编码序列的阅读框同相(in phase)以确保整个插入序列的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有多种来源(天然的和合成的二者)。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可增强表达的效率(参见Bitter et al.(1987)“Expression AndSecretion Vectors For Yeast，”Methods in Enzymol.153：516-544)。在一些实施方案中，将表达载体引入宿主细胞中用于产物的瞬时表达。

另外，可选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或以所期望的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可以是重要的。例如，在某些实施方案中，本文中所述的多肽可作为单个基因产物(例如，作为单个多肽链，即作为多蛋白前体(polyprotein precursor))表达，需要通过天然或重组细胞机制进行蛋白水解切割以形成本文中所述的单独多肽。本公开内容因此涵盖改造核酸序列以编码包含本文中所述的多肽的多蛋白前体分子，其包括能够指导所述多蛋白前体的翻译后切割的编码序列。多蛋白前体的翻译后切割产生了本文中所述的多肽。包含本文中所述的多肽的前体分子的翻译后切割可在体内发生(即，在宿主细胞内通过天然或重组细胞系统/机制，例如在适当位点处的弗林蛋白酶切割)或可在体外发生(例如，在包含已知活性的蛋白酶或肽酶的组合物中和/或在包含已知促进所期望蛋白水解作用的条件或试剂的组合物中孵育所述多肽链)。重组蛋白的纯化和修饰是本领域中公知的，使得多蛋白前体的设计可包括技术人员容易理解的多个实施方案。本领域中已知的任何已知蛋白酶或肽酶可用于所描述的前体分子修饰，例如凝血酶或因子Xa(Nagai et al.(1985)“OxygenBinding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In EscherichiaColi，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：7252-7255，并在Jenny et al.(2003)“A CriticalReviewOf The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And FactorXa，”Protein Expr.Purif.31：1-11中进行了综述，其中各自通过引用整体并入本文)、肠激酶(Collins-Racie et al.(1995)“Production Of Recombinant Bovine EnterokinaseCatalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory FusionPartner DsbA，”Biotechnology13：982-987，其通过引用在此整体并入本文))、弗林蛋白酶和AcTEV(Parks et al.(1994)“Release Of Proteins And Peptides From FusionProteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase，”Anal.Biochem.216：413-417，其通过引用在此整体并入本文))和口蹄疫病毒蛋白酶C3。

不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特异性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物之细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。

对于重组蛋白的长期高产率生产，优选稳定表达。例如，可改造稳定表达本文中所述的多肽的细胞系。不是使用包含病毒复制起点的表达载体，而是可用适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和选择性标志物控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，可使改造细胞在富集培养基中生长1至2天，并随后转换为选择性培养基。重组质粒中的选择性标志物赋予对选择的抗性并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中并生长形成转化灶(foci)，其可进而被克隆并扩增成细胞系。该方法可有利地用于改造表达本文中所述的多肽的细胞系。这样的改造细胞系可特别地用于筛选和评价与本文中所述的多肽直接或间接相互作用的多肽。

可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To CulturedMouse Cells，”Cell 11：223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska etal.(1992)“Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward DevelopingHybridoma Techniques And Gene Therapy，”Bioessays 14：495-500)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.(1980)“Isolation Of Transforming DNA：Cloning The Hamsteraprt Gene，”Cell 22：817-823)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，可使用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler et al.(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-ActingGene，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567-3570；O′Hare et al.(1981)“TransformationOf Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant PlasmidExpressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527-1531)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan et al.(1981)“Selection ForAnimal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，CurrentTrials And Future Directions，”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science OfGene Therapy，”Science 260：926-932；和Morgan et al.(1993)“Human Gene Therapy，”Ann.Rev.Biochem.62：191-217)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre et al.(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For HygromycinB And G418Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells，”Gene 30：147-156)。可使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel et al.(eds.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；以及在第12章和第13章中，Dracopoli et al.(eds)，1994，Current Protocols in Human Genetics，JohnWiley&Sons，NY.；Colberre-Garapin et al.(1981)“A New Dominant Hybrid SelectiveMarker For Higher Eukaryotic Cells，”J.Mol.Biol.150：1-14。

本文中所述多肽的表达水平可通过载体扩增来提高(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3(Academic Press，NewYork，1987))。当表达本文中所述多肽的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将提高标志物基因的拷贝数。因为扩增的区域与本文中所述多肽的核苷酸序列或本文中所述的多肽相关，所以多肽的产生也将提高(Crouse et al.(1983)“Expression And Amplification Of Engineered Mouse DihydrofolateReductase Minigenes，”Mol.Cell.Biol.3：257-266)。

一旦本文中所述的多肽被重组表达，可通过本领域中已知的用于纯化多肽、多蛋白或抗体(例如，类似于基于抗原选择性的抗体纯化方案)的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，特别是通过对特异性抗原的亲和力(任选地在其中多肽包含Fc结构域(或其一部分)的蛋白A选择之后)和尺寸筛分柱色谱法(sizing columnchromatography))、离心、溶解度差异、或通过用于纯化多肽或抗体的任何其他标准技术。

本公开内容的另一些方面涉及包含本文中所述的核酸或本文中所述的载体的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞在哺乳动物细胞中。本文中描述了示例性细胞类型。通过获得包含编码分离的多肽的核酸的细胞，表达该细胞的核酸，并分离和纯化该多肽，可重组产生本文中所述的分离的多肽。

本公开内容的另一些方面提供了包含本文中所述的分离的多肽或任何变体和衍生物的组合物。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含可药用载体。本文中使用的术语“可药用载体”意指可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)或参与将多肽从身体的一个部位(例如，递送部位)运送或运输至另一个部位(例如，器官、组织或身体的一部分)的溶剂包封材料。可药用载体在与制剂的其他成分相容且在对对象的组织无害的意义上是“可接受的”(例如，生理学相容的、无菌的、生理学的pH等)。可用作可药用载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可豆脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇类，例如乙醇；以及(23)药物制剂中使用的其他无毒性相容物质。制剂中也可存在润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。术语例如“赋形剂”、“载体”、“可药用载体”等在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，组合物中本公开内容的分离的多肽通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物施用，所述植入物是多孔的、无孔的、或者凝胶状材料，包括膜(例如硅橡胶膜(sialastic membrane))或纤维。通常来说，当施用所述组合物时，使用本公开内容的多肽不吸收的材料。

在另一些实施方案中，本公开内容的分离的多肽在控释系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见例如Langer，1990，Science249：1527-1533；Sefton，1989，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald et al.，1980，Surgery 88：507；Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。(参见例如Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise eds.，CRC Press，BocaRaton，Fla.，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPertormance(Smolen和Ball eds.，Wiley，New York，1984)；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61.另参见Levy et al.，1985，Science 228：190；Duringet al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105.)。在例如Langer(同上)中讨论了另一些控释系统。

本公开内容的分离的多肽可作为包含治疗有效量的结合剂和一种或更多种药学上相容成分的药物组合物施用。

在一些典型的实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制成适合于向对象(例如人)进行静脉内或皮下施用的药物组合物。通常来说，用于通过注射施用的组合物是无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。通常来说，在表明活性剂的量的密封容器(例如安瓿或药囊)中，以单位剂量形式单独或混合在一起供应成分，例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物。当待通过输注施用药物时，可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用药物时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以在施用之前混合所述成分。

用于全身施用的药物组合物可以是液体，例如无菌盐水、乳酸林格液或Hank液(Hank’s solution)。此外，药物组合物可以是固体形式，并在使用之前立即重新溶解或混悬。还考虑了冻干形式。

药物组合物可包含在脂质颗粒或囊泡中，例如脂质体或微晶，其也适用于肠胃外施用。颗粒可以是任何合适的结构，例如单层或多层，只要其中包含组合物即可。本公开内容的多肽可包埋在含有促融性脂质(fusogenic lipid)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、低水平(5至10mol％)的阳离子脂质的‘稳定化质粒-脂质颗粒’(SPLP)中，并通过聚乙二醇(PEG)包衣稳定化(Zhang Y.P.et al.，Gene Ther.1999，6：1438-47)。带正电荷的脂质(例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵或“DOTAP”)特别优选用于这样的颗粒和囊泡。这样的脂质颗粒的制备是公知的。参见例如美国专利No.4,880,635；4,906,477；4,911,928；4,917,951；4,920,016；和4,921,757。

例如，本公开内容的药物组合物可作为单位剂量施用或包装。当用于提及本公开内容的药物组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于对象的单位剂量的物理上离散的单元，每个单元包含经计算产生所期望治疗效果的预定量的活性物质以及所需的稀释剂；即载体或载剂。

在一些实施方案中，本文中所述的分离的多肽可与治疗部分(例如，抗生素)缀合。将这样的治疗性部分与多肽(包括例如Fc结构域)缀合的技术是公知的；参见例如Amon etal.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，1985，pp.243-56，Alan R.Liss，Inc.)；Hellstrom et al.，“Antibodies For Drug Delivery”，inControlled Drug Delivery(第2版)，Robinson et al.(eds.)，1987，pp.623-53，MarcelDekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，1985，pp.475-506)；“Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin etal.(eds.)，1985，pp.303-16，Academic Press；和Thorpe et al.(1982)“The PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，”Immunol.Rev.，62：119-158。

此外，药物组合物可作为药盒(pharmaceutical kit)提供，其包含(a)包含冻干形式的本公开内容的多肽的容器和(b)包含用于注射的可药用稀释剂(例如，无菌水)的第二容器。可药用稀释剂可用于重构或稀释本公开内容的冻干多肽。任选地与这样的容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的须知，该须知反映了用于人施用的制造、使用或销售机构的批准。

在另一方面中，包括含有可用于治疗上述疾病的物质的制造的制品。在一些实施方案中，制造的制品包含容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，容器容纳有效用于治疗本文中所述疾病的组合物，并且可具有无菌进入口。例如，容器可以是静脉溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。组合物中的活性剂是本公开内容的分离的多肽。在一些实施方案中，容器上或与容器相关的标签表明所述组合物用于治疗所选疾病。所述制造的制品还可包含第二容器，所述第二容器包含可药用缓冲液，例如磷酸缓冲盐水、林格液或右旋糖溶液。其还可包含从商业和使用者角度所期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。

分离的多肽、变体或衍生物或者包含其的组合物可用于治疗多种疾病。在一些实施方案中，所述疾病至少部分地由Wnt信号传导途径的调节异常引起。在一些实施方案中，疾病是艰难梭菌感染(CDI)。本文中还提供了治疗CDI的方法，该方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的分离的多肽、变体或衍生物或者包含其的组合物来治疗CDI。sTcdB多肽虽然能够阻断野生型TcdB进入细胞，但由于其占据FZD受体，仍然抑制Wnt信号传导。因此，活化FZD受体下游的Wnt信号传导的药剂可针对CDI提供另外的治疗作用。因此，在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用有效的诱导细胞中卷曲受体下游的Wnt信号传导的第二药剂。活化FZD受体下游的Wnt信号传导的药剂是本领域已知的。这样的药剂的非限制性实例包括：GSK-3抑制剂，例如锂(LiCl)和CHIR99021。GSK-3抑制FZD受体下游的Wnt信号传导。因此，GSK-3抑制剂能够活化FZD受体下游的Wnt信号传导。诱导Wnt信号传导的药剂的其他非限制性实例包括但不限于SB 216763(Tocris Bioscience，目录号1616)、BIO(Tocris Bioscience，目录号3194)、TCS 2002(Tocris Bioscience，目录号#3869)、TC-G24(Tocris Bioscience，目录号4353)、TWS 119(Tocris Bioscience，目录号3835)、SB415286(Tocris Bioscience，目录号1617)、A 1070722(Tocris Bioscience，目录号4431)、AR-A 014418(Tocris Bioscience，目录号3966)、L803-mts(Tocris Bioscience，目录号2256)。Wnt信号传导的活化发生在细胞中。在一些实施方案中，细胞是结肠上皮细胞。

在一些实施方案中，治疗CDI的方法还包括向对象施用治疗有效量的抑制细胞中TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性的第三药剂。在一些实施方案中，第三药剂是依布硒。依布硒(也称为PZ 51、DR3305和SPI-1005)是具有抗炎、抗氧化和细胞保护活性的合成有机硒药物分子。其作为谷胱甘肽过氧化物酶的模拟物，并且还可与过氧亚硝酸盐反应。依布硒是过氧化氢和氢过氧化物(包括膜结合磷脂和胆固醇酯氢过氧化物)的强效清除剂。已经显示数种依布硒类似物在存在硫醇的情况下清除过氧化氢。本领域中已知依布硒抑制TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的其他非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(stefin)和凋亡抑制剂(Inhibitor ofapoptosis，IAP)。

在一些实施方案中，治疗CDI的方法还包括向对象施用治疗有效量的有助于阻断TcdB与FZD结合的第四药剂。这样的药剂可以是例如FZD抗体。应理解，可使用与TcdB竞争与FZD结合的任何药剂。

在一些实施方案中，由Wnt信号传导调节异常引起的疾病是癌症。Wnt信号传导途径的调节异常是已知的癌症病因，并且是癌症生物学中的中心机制。例如，Wnt过表达可导致小鼠乳腺组织的恶性转化。因此，Wnt信号传导的抑制一直是开发癌症治疗剂的焦点。如本文中所述，分离的多肽、变体或衍生物或者包含其的组合物抑制Wnt信号传导。因此，本公开内容的另一些方面提供了治疗癌症的方法，该方法向有此需要的对象施用治疗有效量的分离的多肽、变体或衍生物，或者包含其的组合物。

在一些实施方案中，治疗癌症的方法还包括向对象施用治疗有效量的阻断Wnt信号传导的第二药剂。阻断Wnt信号传导的药剂的非限制性实例包括Dkk家族蛋白、分泌型卷曲受体相关蛋白(sFRP)、Draxin、IGFBP-4、SOST/骨硬化蛋白、USAG1和WIF-1。在一些实施方案中，阻断Wnt信号传导的药剂是FZD抗体。这些药剂在阻断Wnt信号传导中的用途是本领域中已知的。许多类型的癌症的特征在于过度活化的Wnt信号传导和卷曲受体的过表达。例如，＞90％的结肠癌特征在于异常的Wnt信号传导。最近的研究(Gujral et al，Cell，2014，159，844-856)显示卷曲受体2在转移性肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌中过表达。该表达与上皮-间质转化的标志物高度相关。

在一些实施方案中，治疗癌症的方法还包括向对象施用治疗有效量的抗癌剂。在一些实施方案中，所述抗癌剂选自：小分子、寡核苷酸、多肽、及其组合。在一些实施方案中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂选自：放线菌素、全反式视黄酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、多西氟尿啶(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、伊马替尼、伊立替康、二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine)、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康(Topotecan)、戊柔比星(Valrubicin)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)。在一些实施方案中，化学治疗剂是多柔比星。

在一些实施方案中，抗癌剂是免疫检查点抑制剂。“免疫检查点”是增强免疫应答信号(共刺激分子)或降低免疫应答信号的免疫系统中的蛋白质。许多癌症通过利用抑制性免疫检查点蛋白抑制T细胞信号来保护自身免受免疫系统的侵害。示例性的抑制性检查点蛋白包括但不限于：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性死亡1受体(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM3)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、包含V-组结构域的T细胞活化抑制剂1(VTVN1或B7-H4)、分化簇276(CD276或B7-H3)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、半乳凝素9(GAL9)、检查点激酶1(Chk1)、腺苷A2A受体(A2aR)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)和T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)。

这些免疫检查点蛋白中的一些需要其同源结合伴侣或配体用于其免疫抑制活性。例如，A2AR是腺苷A2A的受体，并且A2A与A2AR的结合活化了负免疫反馈环。作为另一个实例，PD-1与其两个配体PD-L1和PD-L2缔合，通过防止T细胞活化来下调免疫系统。PD-1促进淋巴结中抗原特异性T细胞的程序性细胞死亡，并且同时降低抑制型T细胞的程序性细胞死亡，从而实现其免疫抑制功能。作为另一个实例，CTLA4存在于T细胞表面上，并且当与抗原呈递细胞(antigen-present cell，APC)表面上的其结合伴侣CD80或CD86结合时，其向T细胞传递抑制信号，从而降低免疫应答。

“免疫检查点抑制剂”是防止或弱化免疫检查点蛋白活性的分子，例如，免疫检查点抑制剂可抑制免疫检查点蛋白与其同源结合伴侣例如PD-1、CTLA-4或A2aR的结合。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是小分子。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是核酸适配体(例如，靶向任一个免疫检查点蛋白的siRNA)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是重组蛋白。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM3、抗LAG3、抗B7-H3、抗B7-H4、抗BTLA、抗GAL9、抗Chk、抗A2aR、抗IDO、抗KIR、抗LAG3、抗VISTA抗体，或前述抗体中任意两种或更多种的组合。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA-4或前述抗体中任意两种或更多种的组合。例如，抗PD-1抗体是派姆单抗

或纳武单抗

并且抗CTLA-4抗体是伊匹单抗

因此，在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗或前述抗体中两种或更多种的任意组合。本文中所述的实例并不意指是限制性的，并且可根据本公开内容使用本领域中已知的任何免疫检查点抑制剂及其任意组合。

可使用本文中所公开的方法治疗的癌症类型包括但不限于：赘生物、恶性肿瘤、转移瘤，或以不受控制的细胞生长为特征使得其被认为是癌性的任何疾病或病症。癌症可以是原发性癌症或转移癌。癌症包括但不限于胆管癌；膀胱癌；脑癌，包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；血液系统肿瘤(hematological neoplasm)，包括急性淋巴细胞和髓性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括鲍恩病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括生殖肿瘤(germinal tumor)，例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤、畸胎瘤、绒毛膜癌；间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；以及肾癌，包括腺癌和肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)。常见的癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌和脑癌。在一些实施方案中，本公开内容的方法可用于治疗结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是骨肉瘤。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，癌细胞是转移性的。应理解，实例不意味着限制，并且可使用本文中公开的方法来治疗显示过度活跃的Wnt信号传导或卷曲受体的过表达的任何类型的癌症。

本文中使用的“治疗有效量”是指赋予对象治疗效果所需的本公开内容的每种治疗剂(例如，分离的多肽片段、另外的分离的多肽片段和活化Wnt信号传导的药剂)的量，单独或与一种或更多种其他治疗剂组合。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗持续时间、同时治疗的性质(如果有的话)、特定的施用途径等健康从业者的知识和专业知识中的因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员所公知的，并且可仅通过常规实验来解决。通常优选使用最大剂量的单个组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，对象可出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因坚持较低剂量或可耐受剂量。

经验考虑因素(例如半衰期)通常将有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的治疗剂(例如包含来自人源化抗体或完全人抗体的区域的多肽)可用于延长多肽的半衰期并防止多肽被宿主的免疫系统攻击。施用频率可在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，多肽的持续连续释放制剂可以是合适的。用于实现持续释放的多种制剂和装置是本领域中已知的。

在一些实施方案中，剂量是每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每六天。在一些实施方案中，给药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次，或每3个月或更长时间一次。通过常规技术和测定可容易地监测该治疗的进展。给药方案(包括所使用的多肽)可随时间变化。

在一些实施方案中，对于正常体重的成年对象，可施用约0.01至1000mg/kg的剂量。在一些实施方案中，剂量为1至200mg。具体的剂量方案(即，剂量、时机和重复)将取决于特定对象和对象的病史以及多肽的性质(例如多肽的半衰期，以及本领域中公知的其他考虑因素)。

对于本公开内容的目的，如本文中所述的治疗剂的合适剂量将取决于所用的具体药剂(或其组合物)、制剂和施用途径、疾病的类型和严重程度，无论多肽是否施用用于预防或治疗目的，先前的治疗、对象的临床病史和对拮抗剂的响应，以及主治医师的判定如何。通常来说，临床医生将施用多肽直至实现所期望结果的剂量。一种或更多种多肽的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况，施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及技术人员已知的其他因素。多肽的施用可在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量，例如在疾病发生之前、期间或之后。

本文中使用的术语“治疗”是指向有此需要的对象应用或施用多肽或包含多肽的组合物。“有此需要的对象”是指患有疾病、具有疾病的症状或对疾病有倾向的个体，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或对疾病的倾向。

考虑施用的“对象”是指人(即任何年龄组的男性或女性，例如，儿科对象(例如，婴儿、儿童或青少年)或成人对象(例如，年轻成年人，中年成人或老年成人))或非人动物。在一些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、灵长类动物(例如，食蟹猴或恒河猴)，商业相关的哺乳动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或犬)或鸟(例如，商业相关的鸟，例如鸡、鸭、鹅或火鸡)。非人动物可以是处于发育任何阶段的雄性或雌性。非人动物可以是转基因动物或遗传改造动物。

在一些实施方案中，对象是伴侣动物(宠物)。本文中使用的“伴侣动物”是指宠物和其他家畜。伴侣动物的一些非限制性实例包括犬和猫；牲畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在一些实施方案中，对象是研究动物。研究动物的一些非限制性实例包括：啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠和仓鼠)、兔或非人灵长类动物。

在一些实施方案中，“有此需要的对象”是指需要治疗本文中所述疾病的对象。在一些实施方案中，对象患有或处于发生CDI之风险中。在一些实施方案中，对象患有癌症或处于癌症之风险中。在一些实施方案中，对象具有调节异常的Wnt信号传导。

减轻疾病包括延迟疾病的发生或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病并不一定需要有疗效的结果。如其中使用的“延迟”疾病的发生意味着延迟、阻碍、减慢、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，这取决于病史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发生或延迟疾病发作的方法是这样的方法，其与不使用该方法相比，在给定时间框架内降低发生一种或更多种疾病症状的可能性和/或降低症状的程度。这样的比较通常基于使用足以给出统计学上显著结果的许多对象的临床研究。

疾病的“发生”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。使用本领域中公知的标准临床技术可检测和评估疾病的发生。然而，发生也指可无法检出的进展。对于本公开内容的目的，发生或进展是指症状的生物学过程。“发生”包括发生、复发和发作。本文中使用的疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。

可使用医学领域普通技术人员已知的常规方法将分离的多肽或药物组合物施用于对象，这取决于待治疗疾病的类型或疾病的部位。该组合物还可通过其他常规途径施用，例如经口、肠胃外、通过吸入喷雾、表面、经直肠、经鼻、口含(buccally)、经阴道或通过植入的储库(implanted reservoir)施用。本文中使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内(intralesional)和颅内注射或输注技术。另外，其可通过可注射的储器(injectable depot)施用途径施用于对象，例如使用1个月、3个月或6个月储器式可注射或可生物降解物质和方法。

通过以下实施例，将更充分地理解本文中公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。实施例旨在举例说明本公开内容的一些益处并描述一些具体实施方案，但不旨在例示本公开内容的全部范围，并且因此不限制本公开内容的范围。

实施例

艰难梭菌(C.difficile)是当正常肠微生物组被破坏时定植在人结肠中的机会致病菌。感染导致结肠上皮屏障的破坏，从而导致腹泻和假膜性结肠炎^1-4，6。与CDI相关的疾病由两种同源外毒素：艰难梭菌毒素A(TcdA)和艰难梭菌毒素B(TcdB)引起，其作为使小的GTP酶失活的葡糖基转移酶^3，7-9。在这两种毒素中，单独的TcdB能够引起人中的全谱疾病，因为已经在临床上分离了TcdA-TcdB+菌株^14-17。硫酸软骨素蛋白聚糖4(Chondroitin sulfateproteoglycan 4，CSPG4)、脊髓灰质炎病毒受体样3(poliovirus receptor-like 3，PVRL3)和FZD最近被鉴定为TcdB受体^10，18，19，而FZD被认为是结肠上皮中的主要受体^10，20。FZD是脂质修饰的形态发生素Wnt的跨膜受体家族^21，22。TcdB与FZD的结合不仅介导毒素进入，而且还抑制调节结肠干细胞自我更新和结肠上皮分化的Wnt信号传导^10，23，24。TcdB特异性识别FZD并抑制Wnt信号传导的机制尚不清楚。

TcdB是大的多结构域蛋白(约270kDa)(图1A)。筛选了一系列TcdB截短(表3)并最后缩小为包含FZD结合位点的短TcdB片段(第1285至1804位残基，称为sTcdB)。生物层干涉术(Bio-layer interferometry，BLI)分析证实，sTcdB以与全长TcdB相似的亲和力(解离常数，KD为约13 nM)与CRD2结合(图5A、5F)¹⁰。在

分辨率下测定了与人CRD2(第24至156位残基)复合的sTcdB的共晶体结构，其由在大肠杆菌中产生的sTcdB和作为分泌型蛋白从人胚肾(human embryonic kidney，HEK)细胞产生的CRD2构成。sTcdB-CRD2复合物的配位和结构因子已经以登录号6C0B存入蛋白质数据库(the Protein Data Bank)中。该结构揭示了一个不对称单元中的一个sTcdB-CRD2复合物，该复合物掩埋了其之间界面的总共约

(图1B、表1)。CRD2采用具有由五个69二硫桥稳定的四个α螺旋和两个β链的保守CRD折叠。CRD2与FZD7-CRD(PDB：5URV)以及FZD8-CRD(PDB：4F0A)之间的比较分别得出均方根偏差为约

和约

^11，25。sTcdB采用其顶点被CRD2结合的L形(图1B)。sTcdB的总体结构类似于TcdA中的同源区域(图6A、6B)²⁶。

表1.数据收集、分阶段(phasing)和细化统计

*括号中的值用于最高分辨率壳(shell)。每个数据集均来源于单个晶体。

FZD-CRD包含Wnt的结合位点，其随后触发下游信号传导途径^11，21，24。与爪蟾(Xenopus)Wnt8复合的小鼠FZD8-CRD(CRD8)的晶体结构揭示了Wnt在两个分开的结合位点识别CRD¹¹。在一个位点上，与Wnt8-S187共价连接的棕榈油酸(PAM)结合在CRD8的疏水性沟中，该沟被CRD8与Wnt8之间的蛋白质-蛋白质接触所包围。另一个位点位于CRD8中的不同区域，并且仅涉及蛋白质-蛋白质相互作用(图1C)。与CRD8-Wnt8复合物相比，sTcdB从Wnt结合界面的相反侧与CRD2接合(图1C)。因此，sTcdB与Wnt的蛋白质部分之间没有空间竞争。但是sTcdB覆盖了CRD2中的疏水性沟，该沟在CRD8中保守并作为Wnt PAM的对接位点(dockingsite)。出乎意料的是，观察到长度为约

的长圆柱状电子密度在CRD2中沟中结合，其在sTcdB与CRD2之间完全被埋(图1D)。该电子密度与在CRD8-Wnt8复合物中鉴定的PAM部分相似，并因此被分配为游离PAM(图1D、1E)¹¹，尽管不能明确确定其是棕榈油酸还是棕榈酸。

游离PAM被CRD2和sTcdB二者结合，在复合物中形成中间物(图2A)。CRD2主要通过疏水性相互作用与PAM结合：残基Q75、F76、M125和F130稳定PAM的羧基末端，并且残基P78、L79、V82、L124和F128稳定PAM的烃链(图2B)。这种结合模式类似于如何在CRD8中稳定WntPAM¹¹。然而，在CRD2和CRD8中发现的这种保守的脂质结合模式使PAM酰基链的尾以及CRD2和CRD8中的一些疏水性PAM结合残基暴露于溶剂，这在水性环境中在能量上是不利的。有趣的是，sTcdB形成了从CRD2的相反侧完全屏蔽PAM的疏水性相互作用的网络。特别地，TcdB中的F1597稳定PAM的中间部分，而残基L1433、M1437、S1486、L1493和S1495(以及CRD2的V82和L124)形成疏水性口袋以容纳从CRD沟突出的PAM尾(图2B、2C)。因此，游离PAM完全被埋在CRD2与sTcdB之间，与CRD2和sTcdB相关的掩埋表面积分别为约

和约

除PAM介导的相互作用之外，sTcdB还通过围绕脂质结合沟的氢键和疏水性相互作用的网络直接识别CRD2。CRD2中的残基H74、Q75、Y77、P78、K81、V82和Q83与在PAM一侧上的sTcdB中的残基E1468、L1488、D1490、V1491、L1493、Y1509、N1511、Q1599和F1597相互作用，而CRD2中的残基V82、Q83、A123、L124、K127、F128和F130与在PAM另一侧上的sTcdB中的残基K1434、M1437、L1438、S1495、V1497、D1501、S1505、F1597和L1598结合(图2D、2E和表2)。这些参与蛋白质-蛋白质相互作用的残基中的许多也参与PAM结合，表明sTcdB与CRD之间的结合由蛋白质和PAM二者协同介导(图2F)。

表2.s TcdB-CRD2复合物中的蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用

*“vdW”代表范德华相互作用。“mc”和“sc”指示接触是由主链还是由侧链原子介导的。

接下来，在sTcdB中设计了一系列结构指导的突变来验证结构发现。选择sTcdB-F1597G/D、M1437D/L1493A和L1433D/M1437D/L1493A来破坏sTcdB-PAM和sTcdB-CRD2二者的相互作用，而L1433D将仅影响PAM结合。选择sTcdB-D1501A、Y1509A/N1511A和Y1509A/Q1599A以优先降低与CRD2的蛋白质-蛋白质相互作用。如通过热位移测定所证实的，这些sTcdB突变体均不干扰适当的蛋白质折叠(图7)。检查这些sTcdB突变体与用全长FZD2瞬时转染的HeLa细胞的结合(图3A)或与稳定表达GPI锚定的FZD7-CRD的HeLa细胞系的结合(图8A、8B)。尽管FZD2和FZD7-CRD-GPI二者均介导细胞表面上野生型(WT)sTcdB的稳健结合，但在该测定中使用的浓度(50nM)下，sTcdB突变体均未显示出可检测的结合。为了进一步分析结合的亲和力和动力学，使用下拉测定(图8C)检查sTcdB突变体与固定化的His标记的CRD2的结合(图8C)，并且使用BLI测定检查sTcdB突变体与固定化的Fc标记的CRD2的结合(图5A至5F)。sTcdB突变体与PAM和CRD2二者的结合均被破坏，例如F1597G/D、M1437D/L1493A和L1433D/M1437D/L1493A，在下拉测定或BLI测定(K_D＞10μM)中均没有产生可检测的结合。与WT sTcdB相比，在蛋白质-蛋白质界面的突变显著弱化sTcdB-CRD2结合亲和力约41至140(或约43至138)倍。破坏TcdB上容纳PAM末端酰基尾的疏水性口袋的单个点突变(L1433D)也降低与CRD2的结合约35(或约37)倍。如通过热位移测定所证实的，这些TcdB-FBD变体均不干扰蛋白质折叠(图7)。然后检查TcdB-FBD变体与用全长FZD2瞬时转染的HeLa细胞(图3A)或稳定表达GPI锚定的FZD7-CRD(图8A至8C)的结合。TcdB-FBD变体在测试浓度(50nM)下未显示与FZD2或FZD7-CRD-GPI的可检测结合，而WT TcdB-FBD与这些细胞稳健结合。在检测CRD2与TcdB-FBD变体之间的弱相互作用时，下拉测定(图8A)和BLI(图5)测定比基于细胞的测定(图3A和图8B)更灵敏，这可能是在细胞表面上表达的FZD2/7浓度相对较低的结果。诱变研究因此验证了结构发现并表明TcdB利用游离脂肪酸作为共受体与FZD接合。

TcdB中的CRD2或PAM相互作用残基在TcdA中不保守(图6C)，这解释了FZD对TcdA的无反应性。结构和序列比对揭示了TcdA和TcdB在包含与PAM和CRD2结合的三个残基(F1597、L1598和Q1599)的小区域中非常不同(图6C)。当在TcdB(¹⁵⁹⁵VNFLQS)中用TcdA(¹⁵⁹⁶GFE)中对应的残基替代该区域时，该突变体可不再结合CRD2。该发现证实了该区域在TcdB中对于有效受体结合的重要性，并且还解释了FZD对TcdA的无反应性¹⁰。

全长TcdB携带消除FZD结合的相同突变(称为TcdB^GFE)，并将其用作确定FZD和脂质与TcdB毒性的生理相关性的分子工具。TcdB^GFE的活性首次使用细胞变圆测定(CR50)在FZD1/2/7KO HeLa细胞上验证，该细胞仍表达可介导毒素进入的高水平的CSPG4(13)。如图3F中所示，TcdB^GFE和WT TcdB对FZD1/2/7KO HeLa细胞显示出相似的毒性，表明TcdB^GFE被适当折叠。为了分开CSPG4和FZD对毒素细胞进入的贡献，进一步测试了TcdB^GFE和WT TcdB对CSPG4 KO HeLa细胞的活性。事实上，与WT毒素相比，FZD结合缺陷TcdB^GFE显示出约190倍的降低的毒性，证明了FZD在介导TcdB结合和进入细胞中的功能性作用(图3F)。

然后进行了CRD2中的互补诱变研究。基于晶体结构，选择突变K127A/E和Y77A来优先破坏CRD2与TcdB之间的蛋白质-蛋白质相互作用，同时设计突变F76A/D、L79D、M125D来选择性破坏CRD2中脂质结合沟的核心。还检查了CRD2表面上与PAM和TcdB部分相互作用的两个残基(F128D和F130D)。将包含这些突变的全长小鼠FZD2转染到HeLa细胞中(残基编号基于人FZD2序列)。FZD通常是糖基化的，这对于其适当成熟和运输到质膜上至关重要²⁷。尽管在CRD2中具有被破坏的脂质结合沟的FZD2的所有四个突变(F76A/D、L79D、M125D)均在细胞中表达，但其缺乏可检测的糖基化水平(图3B)。表面生物素化测定证实这四个突变体未能到达细胞表面(图3C)。这些发现表明，内源性游离脂肪酸在CRD2中的疏水性沟中的结合对于FZD2的适当成熟和运输可能是至关重要的。蛋白质-蛋白质界面(K127A/E、Y77A)或两个残基(F128D和F130D)在不存在TcdB结合的情况下暴露于溶剂的突变没有显著改变FZD2的糖基化和表面表达，但当在CSPG4^-/-HeLa细胞中表达时不能介导全长TcdB的结合(图3B、3C)。此外，证实了FZD2-K127A/E介导与WT FZD2在细胞中相似的Wnt信号传导水平，表明其被正确折叠并且选择性地损害TcdB结合而不影响Wnt信号传导(图3D、图9A、9B)。综上所述，本文中讨论的基于结构的综合诱变研究表明，TcdB-FZD接合由脂质-蛋白质相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用二者介导。

CRD2中的疏水性脂质结合沟在人FZD的所有10个成员中很大程度上都保守(图2F)，尽管该区域中细微的残基差异可影响脂肪酸与CRD结合的紧密程度。这个口袋也是WntPAM的对接位点²⁸。FZD1、2和7的CRD中的脂质结合沟相同。一致地，已经报道了纯化的FZD7-CRD在其疏水性沟中保留了来自表达宿主的游离脂肪酸²⁵。另外，先前在小鼠FZD8-CRD²⁹和人FZD4-CRD^25，30，31的晶体结构中的该疏水性沟中观察到一些未分配的电子密度，这可表示游离脂肪酸以低的占有率结合。这些发现表明，一些CRD可对内源性脂肪酸具有较弱的结合亲和力，这在蛋白质纯化期间可部分脱落。与该观点一致，最近的研究表明，纯化的CRD5不包含游离脂肪酸，但在共结晶期间其可在保守的脂质结合沟中结合外源PAM²⁵。发现单独的CRD5仅微弱地下拉sTcdB，但是CRD5与PAM的预先孵育显著提高了CRD5与sTcdB的结合(图4A)。这种由游离PAM引起的CRD5结合sTcdB的“功能获得”进一步证明CRD结合的脂肪酸对于TcdB识别至关重要。

CRD2-sTcdB与CRD8-Wnt8复合物之间的结构比较表明，Wnt PAM可模拟游离脂肪酸以促进TcdB结合，而Wnt的肽部分不干扰TcdB结合(图1C、1E)。事实上，在下拉测定和BLI测定中，Wnt3A与CRD5的预先孵育增强了sTcdB与CRD5的结合，而对于sTcdB-F1597G，这种增强降低(图4B、4C)。对于全长TcdB与CRD5的结合也观察到这种Wnt介导的增强(图10A)。此外，当将Wnt3A预先加载到这些CRD上时，sTcdB显示出增强的与在BLI测定中检查到的三种其他CRD(人FZD4、FZD8和FZD9)的结合(图10B、10C、10D)。综上所述，这些发现进一步支持了CRD疏水性沟中的脂肪酸强化TcdB结合的结构模型，并证明TcdB可利用Wnt PAM(保守的Wnt翻译后修饰)来增强其与CRD的结合。

对于携带有内源性脂肪酸的纯化的CRD2，将其用Wnt3A预先孵育不影响其与sTcdB或全长TcdB的结合(图4D、图11A)，表明CRD2中结合的内源性脂肪酸可能被Wnt PAM替代，因为二者都可支持TcdB结合。相反，sTcdB或全长TcdB与CRD2的预先孵育明显阻止了Wnt3A与CRD2的结合(图4E、图11B)。这些发现表明，TcdB可稳定CRD2中内源脂肪酸的结合，从而阻碍其被Wnt PAM替代。该假设与sTcdB能够阻断报道细胞中Wnt3A诱导的信号传导而CRD结合缺陷sTcdB突变不能阻断报道细胞中Wnt3A诱导的信号传导的观察一致(图3E、图9C、9D)。

在此报道的sTcdB-CRD2复合物的共晶体结构建立了基于TcdB识别FZD用于宿主细胞结合的分子机制。其揭示了内源性脂肪酸的出乎意料的中心作用，该内源性脂肪酸结合在CRD中保守的疏水性沟中，用于TcdB结合。尽管尚不确定所有FZD是否均与细胞中的内源性脂肪酸相关，但是TcdB利用这种脂肪酸来增强其与多种FZD成员的结合能力。在10个FZD中，FZD1、2和7是TcdB的高亲和力受体¹⁰，这可能是其与脂肪酸的紧密相互作用以及其与TcdB的特异性蛋白质-蛋白质相互作用的组合。例如，与TcdB形成多个电荷和疏水性相互作用的CRD2的残基Y77、K81、V82、A123和K127仅在FZD1、2和7中保守(图2F)。

本文中讨论的晶体结构还提出了用于抑制Wnt信号传导的新机制。与Wnt直接竞争FZD结合将耗费能源，因为Wnt和FZD彼此紧密接合，涉及广泛的蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用¹¹。相反，TcdB通过用内源性脂肪酸堵塞(jam)CRD的脂质结合沟阻止Wnt的关键脂肪酸部分的对接(图4G)。另外，最近的研究表明，Wnt PAM可有助于CRD二聚化，随后激活下游信号传导途径，尽管这样的FZD二聚化在Wnt信号传导中的贡献仍有待充分确定^25，32。已经报道了两种不同的CRD二聚体构型^25，32。TcdB的结合，甚至仅仅是sTcdB的结合，将阻止在任一模型中的CRD二聚化，并且也可以有助于Wnt信号传导抑制(图4F)。Wnt信号传导对于发育和组织稳态至关重要。它的调节异常在包括癌症在内的许多疾病中起着重要的作用^24，33。

已经良好地确定Wnt与FZD-CRD结合通过Wnt PAM作为主要驱动力。Wnt PAM在CRD中占据与游离脂质相同的疏水性沟(图1E)。已发现使用Wnt PAM作为共受体，TcdB-FBD可与Wnt-FZD复合物结合，因为TcdB-FBD从Wnt结合界面的另一侧与CRD2接合而没有与Wnt的直接空间竞争(图4H)。识别Wnt结合的FZD的能力可能对于TcdB识别某些可对游离脂质具有较弱亲和力的FZD特别有利。事实上，我们发现在下拉测定和BLI测定中Wnt3A与CRD5的预先孵育增强了TcdB-FBD与CRD5的结合，而对于TcdB-FBD-F1597G这种增强显著降低(图4B和4C)。对于三种其他CRD(人FZD4、FZD8和FZD9)也观察到相似的Wnt介导的增强(图10B至10D)，并且使用全长TcdB和CRD5进一步证实(图10A)。因此，TcdB可使用Wnt PAM(保守的Wnt翻译后修饰)作为共受体来识别多种FZD，尽管其序列有所不同。

CRD2和预先形成的CRD2-Wnt3A复合物被TcdB-FBD或全长TcdB相等完好地识别(图4D和图11A)。这表明游离脂质或Wnt PAM均支持TcdB与CRD2结合。相反，在与TcdB-FBD或全长TcdB结合时，CRD2不能再结合Wnt3A(图4E和图11B)。这可能是因为Wnt PAM一旦被TcdB锁定就位，就不能取代游离脂肪酸。这与TcdB-FBD阻断细胞中Wnt3A诱导的信号传导而CRD结合缺陷TcdB-FBD变体没有阻断细胞中Wnt3A诱导的信号传导的观察一致(图3E以及图9C和9D)。最近的研究表明，Wnt PAM可有助于CRD二聚化，尽管这样的FZD二聚化活化Wnt信号传导的贡献仍有待充分确定(25，32)。已经报道了两种不同的CRD二聚体构型(图15A)。由于空间竞争，TcdB或TcdB-FBD的结合将阻止以任一种构型的CRD二聚化，这也可有助于Wnt信号传导抑制(图15B)。

鉴于大量的体外和离体数据表明FZD和FZD结合的脂肪酸作为TcdB受体的作用，试图确定TcdB-脂质-FZD相互作用与体内TcdB毒性的生理相关性。结肠组织是TcdB的病理相关靶组织。尽管CSPG4不在结肠上皮细胞中表达而在上皮下肌成纤维细胞中表达，已经表明FZD是结肠上皮细胞中的主要受体(10)。因此，使用了鼠盲肠注射模型，所述模型先前已用于评估TcdB诱导的结肠组织损伤(39，40)。简而言之，将全长FZD-结合缺陷TcdB突变体、TcdB^GFE(图3F)、WT TcdB或对照盐水溶液注射到WT小鼠的盲肠中。允许小鼠恢复并在12小时之后收获盲肠组织用于分析。WT TcdB在盲肠中诱导严重的血性液体累积和囊泡充血，导致如预期那样的剧烈肿胀。相反，TcdB^GFE诱导少得多的液体累积，并且没有明显的囊泡充血(图14A)。为了进一步检查对组织的损害，用石蜡包埋的盲肠组织切片进行组织学分析。这些组织基于四种组织学标准(包括上皮细胞破坏、出血性充血、黏膜水肿和炎性细胞浸润)，基于0至3(正常、轻度、中度或严重)的量表进行评分。WT TcdB诱导上皮细胞的广泛破坏和炎性细胞浸润，以及严重的出血性充血和黏膜水肿，而TcdB^GFE在所有四个标准上诱导少得多的损伤(图14B和14C)。上皮紧密连接的完整性通过免疫荧光染色针对紧密连接标志物密封蛋白-3进一步评估。WT TcdB诱导上皮细胞中密封蛋白-3的大量损失，而在用TcdB^GFE处理之后，上皮紧密连接的总体形态没有改变(图14D)。综上所述，这些数据进一步证明FZD是结肠组织中TcdB的主要病理相关受体。

Wnt信号传导对于发育、组织稳态、干细胞生物学和许多其他过程至关重要，并且其功能异常与包括多种人癌症和退行性疾病在内的疾病相关(24，33)。TcdB利用的FZD结合机制为FZD-脂质结合对于调节FZD功能非常重要增加了越来越多的证据^25，32，并提出了通过靶向FZD中的脂质结合沟来调节Wnt信号传导的新的药理学策略。TcdB与FZD之间出乎意料的脂肪酸依赖性结合也暴露了TcdB的缺点，可利用该缺点来开发阻断毒素受体识别的2种新的抗毒素。

用sTcdB处理的癌细胞

进行研究以检查sTcdB片段是否可以能够抑制癌细胞的生长。首先，筛选了癌细胞系的列表，并发现骨肉瘤细胞系表现出高水平的Wnt活性。因此，选择骨肉瘤细胞系U2OS作为用于原理验证研究的模型。首先将细胞在培养基中暴露于sTcdB 6小时。包含降低FZD结合的点突变的sTcdB(F1597D)用作对照。将处理过的细胞注射到裸鼠中并发展成肿瘤。如图12中所示，由预先暴露于sTcdB的细胞形成的肿瘤小于从对照细胞和暴露于突变体sTcdB的细胞(F1597D)形成的肿瘤，表明sTcdB抑制了肿瘤的形成和/或肿瘤生长速率。这种作用取决于sTcdB与FZD的结合，因为突变体sTcdB没有作用。

进一步检查了sTcdB是否可以抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。在小鼠模型中敲除基因P53和BRCA1产生乳腺癌。这些癌组织具有人三阴性乳腺癌的特征。从敲除小鼠分离癌组织，并在体外作为类器官模型生长。将一万个类器官细胞皮下注射到无胸腺裸鼠中，其长成新的癌症。在第12、14、17、20和23天，通过腹膜内途径以20mg/kg剂量注射sTcdB。与注射PBS的对照组相比，注射sTcdB TD3抑制了这些乳腺癌细胞在体内的生长。N＝6，*p＜0.05(图13A)。MDA-MB-231是代表三阴性乳腺癌细胞的广泛使用的人乳腺癌细胞系。这些细胞在培养期间在体外生长为球形(对照)。将sTcdB添加至培养基中阻断了这些细胞的生长(图13B)。

方法

重组蛋白的克隆、表达和纯化

将编码sTcdB(第1285至1804位残基)的基因克隆到经修饰pET28a载体中，该载体具有引入其N端的6xHis/SUMO(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Smt3p)标签。通过向C端添加另外的HA标签来制备第二sTcdB构建体，其用于BLI、下拉和细胞表面结合测定。将人卷曲受体2(第24至156位残基)的CRD克隆到经修饰pcDNA载体中用于哺乳动物细胞表达，并将人IL2信号序列(MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：18))、9xHis标签和人鼻病毒3C蛋白酶切割位点添加至其N端。所有sTcdB突变体均通过两步PCR生成，并通过DNA测序验证。

sTcdB在大肠杆菌BL21-Star(DE3)(Invitrogen)中表达。在包含卡那霉素的LB培养基中在37℃下培养细菌。当OD₆₀₀达到约0.8时将温度降低至16℃。用1mM IPTG(异丙基-b-D-硫代半乳糖苷)诱导表达，并在16℃下继续过夜。通过离心收获细胞并储存在-80℃下直至使用。

使用Ni²⁺-NTA(氨三乙酸，Qiagen)亲和树脂在包含50mM Tris，pH 8.0，400mM NaCl和40mM咪唑的缓冲液中纯化His标记的sTcdB(WT和突变体)。用高咪唑缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，400mM NaCl和300mM咪唑)洗脱蛋白质，并随后在4℃下对包含20mM HEPES，pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液进行透析。在SUMO蛋白酶切割His-SUMO标签之后，通过MonoQ离子交换(20mM Tris，pH 8.5)和Superdex-200尺寸排阻色谱法(GE Healthcare，20mM Tris，pH8.0和100mM NaCl)进一步纯化sTcdB。

His标记的CRD2从FreeStyle HEK 293细胞(ThermoFisher)中表达和分泌，并使用Ni²⁺-NTA树脂直接从细胞培养基中纯化。通过在冰上以约1∶3的摩尔比将纯化的sTcdB和CRD2混合2小时来制备sTcdB-CRD2复合物，并使用MonoQ离子交换柱(20mm Tris，pH 8.5)进一步纯化该复合物。将复合物浓缩至约10mg/ml用于结晶。

结晶

在20℃下使用具有高通量结晶筛选套件(Hampton Research和Qiagen)的Gryphon结晶机器人(Art Robbins Instruments)进行初始结晶筛选。在包含0.1M乙酸钠(pH 5.0)和1M硫酸铵的储库中，使用悬滴蒸气扩散获得适用于X射线衍射的sTcdB-CRD2复合物的最佳晶体。对于冷冻保护，储库溶液补充有另外2.2M丙二酸钠。通过将天然晶体浸泡在100mM四氰基铂酸钾(II)中5分钟获得铂来源的sTcdB-CRD2复合物的晶体，并且以与天然晶体相似进行冷冻保护。

数据收集和结构确定

在NE-CAT光束线24-ID-C，先进光子源(Advanced Photon Source，APS)下以100K收集X射线衍射数据。如RAPD(github.com/RAPD/RAPD)中实施的用XDS处理数据³⁴。对于Pt浸泡的sTcdB-CRD2复合物，使用一个晶体在吸收边缘

上方的铂LIII峰处，使用PILATUS 6MF收集0.2度，0.2秒曝光精细phi-切片的数据。使用一个晶体在

波长处使用0.2度，0.2秒曝光收集天然

数据集。sTcdB-CRD2复合物的单波长反常色散数据集足以使用PHENIX.AutoSol³⁵计算初始相位。相位信息用于使用PHENIX.AutoBuild³⁵建立初始模型，其通过COOT³⁶中的手动模型构建的多个循环以及Phenix³⁵中的细化进行改进。然后，使用PHENIX.Phaser³⁵在天然

数据集上使用这种部分细化结构作为分子置换中的搜索模型。使用COOT³⁶和Phenix.Refinement³⁵迭代地进行进一步的结构建模和细化。使用5％随机选择的测试集以自由R值监视所有细化过程³⁷。通过MolProbity³⁸验证结构。表1中列出了数据收集和结构细化统计。所有结构图均用Pymol(DeLano Scientific)制作。

蛋白质熔解测定

在StepOne实时PCR仪器(Life Technologies)上使用基于荧光的热位移测定测量sTcdB变体的热稳定性。将每种蛋白质(约0.1mg/ml)与荧光染料SYPRO Orange(Sigma-Aldrich)混合，并以线性梯度从25℃加热至95℃。使用由仪器制造商提供的分析软件确定蛋白质熔解曲线的中点(Tm)。将从三个独立实验获得的数据进行平均以生成条形图。

细胞系、抗体和构建体

HeLa(H1，#CRL-1958)、293T(#CRL-3216)、L细胞(#CRL-2648)和L/Wnt3A(#CRL-2647)细胞最初从ATCC获得。其对支原体污染测试为阴性，但尚未得到验证。HeLa-Cas9、HeLa-Cas9 FZD1/2/7^-/-和HeLa-Cas9CSPG4^-/-细胞在内部产生并且先前已有描述¹⁰。通过用表达FZD7^CRD-Myc-GPI的构建体(pLEX_307载体，#41392，Addgene)进行HeLa H1细胞的慢病毒转导，然后用5μg/ml嘌呤霉素进行选择来产生稳定的HeLa-FZD7^CRD-Myc-GPI细胞。从指定的供应商购买以下小鼠单克隆抗体：1D4标签(MA1-722，ThermoFisher Scientific)、HA标签(16B12，Covance)、β-肌动蛋白(AC-15，Sigma)、Myc标签(9E10，ThermoFisherScientific)。针对DVL2(30D2，#3224)和Wnt3a(#2391)的兔单克隆抗体购自CellSignaling。针对密封蛋白-3的兔多克隆抗体(ab15102)购自Abcam。针对TcdB的鸡多克隆IgY(#754A)购自List Biological Labs.。抗体验证可在制造商的网站上获得。pRK5-FZD2-1D4最初在J.Nathans的实验室(Baltimore，MD)生成并从Addgene(#42254)获得。通过定点诱变从pRK5-FZD2-1D4生成全长FZD2-1D4突变体(Agilent Technologies，CA)。

TcdB、卷曲受体和其他重组蛋白

重组全长TcdB(来自艰难梭菌菌株VPI 10463)如前所述在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中表达^10，39，并纯化为6xHis标记的蛋白。重组人蛋白购自R&DSystems(FZD2^CRD-Fc、FZD8^CRD-Fc和FZD9^CRD-Fc)、Sino Biologics(FZD4^CRD-Fc和FZD5^CRD-Fc)和StemRD(Wnt3A)。

TcdB与细胞结合以及免疫印迹分析

使用PolyJet(SignaGen)进行HeLa细胞的瞬时转染。通过在室温下将细胞暴露于TcdB(10nM)或HA标记的sTcdB(100nM)10分钟来分析TcdB与细胞的结合。细胞用PBS洗涤3次，并随后用RIPA缓冲液(50mM Tris、1％NP40、150mM NaCl、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS，加上蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich))收获。将细胞裂解物离心并对上清液进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。按照制造商的说明，使用Pierce^TM细胞表面蛋白分离试剂盒(#89881，ThermoFisher Scientific)进行细胞表面蛋白质的生物素化和分离。

致细胞病变测定

使用标准的细胞变圆测定分析TcdB的致细胞病变作用(细胞变圆)。简而言之，将细胞暴露于TcdB和TcdB^GFE的梯度中24小时。拍摄细胞的相位对比图像(Olympus IX51，×10至20物镜)。手动计数圆形形状和正常形状细胞的数目。绘制圆形形状细胞的百分比并使用Origin软件进行拟合。CR50定义为在24小时内诱导50％的细胞变圆的毒素浓度。

下拉测定

使用Ni²⁺-NTA树脂在1ml包含50mM Tris，pH 8.5，400mM NaCl，10mM咪唑和0.1％Tween-20的结合缓冲液中进行His-标记的CRD2与sTcdB变体之间的下拉测定。His标记的CRD2用作诱饵(bait)并且sTcdB变体(WT和突变体)为猎物(prey)。将CRD2用Ni²⁺-NTA树脂在室温下预先孵育30分钟，并使用结合缓冲液洗去未结合的蛋白质。然后将树脂分成小的等分试样并与sTcdB变体(约1.5μM，相比CRD2摩尔过量约2.5倍)混合。在室温下进行下拉测定30分钟。然后将树脂洗涤两次，并用400mM咪唑从树脂中释放结合的蛋白质。

对于在FZD5^CRD与sTcdB之间的测定，将与或不与100ng Wnt3A预先混合的100ngFZD5^CRD-Fc蛋白通过在4℃下孵育30分钟，随后用PBS洗涤固定在30ul蛋白G琼脂糖珠(#20398，ThermoFisher Scientific)上。添加在指定缓冲液中稀释的sTcdB并在4℃下孵育30分钟。然后洗涤珠、沉淀、在SDS样品缓冲液中煮沸，并进行免疫印迹分析。如先前所述生成棕榈油酸(#P9417，Sigma-Aldrich)饱和的PBS²⁵。简而言之，将100μl棕榈油酸储备液(在DMSO中为10mg/ml)添加至10ml PBS中，随后在室温下剧烈涡旋孵育2小时。然后将棕榈油酸混悬液以14,000rpm离心20分钟，并将中心部分作为饱和缓冲液。在饱和的棕榈油酸和对照缓冲液二者中，DMSO均保持恒定在1％。

生物层干涉术(BLI)测定

sTcdB变体与FZD2^CRD之间的结合亲和力使用Blitz系统(ForteBio)通过BLI测定进行测量。简而言之，将FZD2^CRD-Fc(20μg/ml)固定在捕获生物传感器(Dip and Read Anti-hIgG-Fc，ForteBio)上并用PBS平衡。然后将生物传感器暴露于不同浓度的sTcdB或其突变体，随后在PBS中解离。使用Blitz系统软件(ForteBio)计算结合亲和力(K_D)。为了分析TcdB与CRD-Wnt复合物的结合，将FZD5、4、8和9的Fc标记的CRD(20μg/ml)与或不与Wnt3A(20μg/ml)预先混合，并在冰上孵育30分钟。然后将蛋白质固定在捕获生物传感器上并用PBS平衡。然后将5μM sTcdB或1μM TcdB施加到加载生物传感器上，随后用PBS洗涤。为了分析Wnt3A和TcdB与CRD2的依次结合，将FZD2^CRD-Fc(20μg/ml)固定在捕获生物传感器上并用PBS平衡。将加载生物传感器首先暴露于20μg/ml Wnt3A，再次用PBS平衡，并随后暴露于5μM sTcdB或1μM TcdB。或者，将生物传感器首先暴露于5μM sTcdB或1μM TcdB，用PBS平衡，并随后暴露于20μg/ml Wnt3A。然后用PBS洗涤所有生物传感器用于解离。

Wnt信号传导测定

TOPFLASH/TK-海肾(Renilla)双荧光素酶报道子测定用于检测Wnt信号传导。简而言之，用TOPFLASH(50ng/孔)、TK-海肾(内部对照，10ng/孔)和pcDNA3(200ng/孔)共转染24孔板中的HeLa或293T细胞。从L/Wnt3a细胞培养物中产生Wnt3A条件培养基(conditionalmedium，CM)。来自L细胞的培养基用作对照培养基。24小时之后，在有或没有sTcdB(200nM，除非另有说明)的情况下，将细胞暴露于Wnt3A CM或对照培养基6小时。收获细胞裂解物，并进行萤火虫/海肾双荧光素酶测定或免疫印迹分析用于检测磷酸化的DVL2。Wnt信号传导活化TOPFLASH荧光素酶报道子(萤火虫荧光素酶)的表达。共转染的海肾荧光素酶用作内部对照。通过共转染TOPFLASH(100ng/孔)、TK-海肾(内部对照，20ng/孔)和WT或FZD2突变体(500ng/孔)，使用FZD1/2/7^-/-HeLa细胞检查FZD2^K127A/E突变体介导Wnt信号传导的能力。24小时之后，将细胞暴露于Wnt3A CM或对照培养基持续另外6小时。收获细胞裂解物，并进行萤火虫/海肾双荧光素酶测定或免疫印迹分析用于检测磷酸化的DVL2。

盲肠毒素注射测定

小鼠(CD1，6至8周，雄性和雌性二者，来自Envigo)在过夜禁食之后麻醉。进行中线剖腹术(laparotomy)以定位盲肠。通过胰岛素注射器(29G1/2)将100μl盐水或毒素(15μg)注射到回肠与盲肠之间的连接部位，随后用缝线缝合伤口。允许小鼠恢复并在12小时之后安乐死以收获盲肠组织。注意到少数小鼠在手术之后数小时内以未知原因死亡(＜5小时，TcdB为10只中4只死亡，TcdB^GEF为10只中3只死亡)。这些小鼠不包括在分析研究中。然后将盲肠组织固定、石蜡包埋、切片、并进行苏木精和伊红(H&E)染色用于组织学评分分析或用于密封蛋白-3的免疫荧光染色。

组织学分析和免疫荧光染色

盲肠组织用PBS洗涤3次，随后在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定24小时。将组织包埋在石蜡中并每片切成5μm。用H&E染色进行组织学分析。通过观察者对实验组不知情，基于4个标准：包括上皮破坏、出血性充血、黏膜水肿和炎性细胞浸润，基于0至3(正常、轻度、中度或重度)的量表对染色切片进行评分。使用兔抗密封蛋白-3(1∶100)多克隆抗体进行密封蛋白-3的免疫荧光分析。用Ultraview Vox Spinning Disk Confocal System捕获共聚焦成像。

用sTcdB治疗三阴性乳腺癌

将一万个p53-/-Brcal-/-乳腺癌来源的类器官细胞皮下注射到无胸腺裸鼠中，这产生新的肿瘤。当肿瘤尺寸达到约85mm³时，在第12、14、17、20和23天通过腹膜内注射以20mg/kg给予TD3。在肿瘤形成之后每2至3天测定肿瘤尺寸。对于卡尺测量通过下式计算肿瘤体积：V＝(W2×L)/2，其中V是肿瘤体积，W是肿瘤宽度，L是肿瘤长度。在第24天处死小鼠并对肿瘤进行称重。

表3.另外的TcdB片段及其活性

片段边界	表达	生物化学行为	被His-CRD2下拉
				792-1835	是	差	N/A
1024-1804	是	良好	是
				1028-1835	是	良好	是
1071-1512	是	良好	否
				1114-1835	是	良好	是
1114-2101	是	良好	是
				1133-1835	是	差	N/A
1285-1608	否	N/A	N/A
				1285-1640	否	N/A	N/A
1285-1660	否	N/A	N/A
				1285-1804(sTcdB)	是	良好	是
1294-1835	是	差	N/A
				1313-1616	否	N/A	N/A
1340-1616	否	N/A	N/A
				1365-1804	是	差	N/A
1394-1835	是	差	N/A
				1400-1804	是	差	N/A
1401-1835	是	差	N/A
				1430-1804	是	良好	否
1454-1804	是	良好	否
				1501-1835	是	差	N/A
1510-1688	是	良好	否
				1510-1804	是	良好	否
1688-1835	是	良好	否

表4.氨基酸序列

*突变位置对应于全长野生型TcdB(SEQ ID NO：1)中的氨基酸位置。

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在本文中(例如，在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献部分中)所提及的所有出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目(例如，序列数据库条目)均通过引用在此整体并入如同每个单独的出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目均通过引用特别地和单独地并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

等同方案和范围

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文中所述的一些实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围并不旨在限于以上描述，而是如在所附权利要求中阐述的那样。

除非指出相反或者在其他情况下从上下文中明显，否则没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。除非指出相反或者在其他情况下从上下文中明显，否则如果存在一个、多于一个或全部组成员，则在组的两个或更多个成员之间包含“或/或者”的权利要求或描述被认为符合要求。在两个或更多个组成员之间包含“或/或者”的组的公开内容提供了其中存在恰好一个组成员的实施方案、其中存在多于一个组成员的实施方案以及其中存在全部组成员的实施方案。为简洁起见，这些实施方案在本文中没有被单独地阐述，但是应理解，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

应理解，本公开内容涵盖其中将来自一个或更多个权利要求或来自说明书的一个或更多个相关部分的一个或更多个限制、要素、条款或描述性术语引入到另一个权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，引用另一权利要求的权利要求可被修改为包含在引用相同基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或更多个限制。此外，在权利要求书中记载组合物的情况下，应理解，除非另有说明或者除非对于本领域普通技术人员明显的是将出现矛盾或不一致，否则包括根据本文中所公开的任一种制造或使用方法或者根据本领域中已知的方法制造或使用组合物的方法(如果有的话)。

在要素以列表(例如，以马库什组形式)表示的情况下，应理解还公开了要素的每个可能的亚组，并且任何要素或要素的亚组都可从该组中移除。还应注意，术语“包含/包括”旨在是开放性的，并且允许包含另外的要素或步骤。应理解，一般而言，在实施方案、产品或方法被称为包含特定要素、特征或步骤的情况下，还提供了由这样的要素、特征或步骤组成或者基本上由这样的要素、特征或步骤组成的实施方案、产品或方法。为简洁起见，这些实施方案在本文中没有被单独地阐述，但是应理解，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解，除非另有说明或者在其他情况下从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显，否则表示为范围的值在一些实施方案中可假定为所述范围内的任何特定值至所述范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。为简洁起见，每个范围中的值在本文中没有被单独地阐述，但是应理解，这些值中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。还应理解，除非另有说明或者在其他情况下从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显，否则表示为范围的值可假定为给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点以与该范围下限的单位的十分之一相同的准确度表示。

在提供网站的情况下，URL地址作为非浏览器可执行的代码提供，括号中是相应网址的句点(periods)。实际的网址不包含括号。

另外，应理解，本公开内容的任何具体实施方案可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。本公开内容的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可从任何一个或更多个权利要求中排除。为简洁起见，本文中未明确阐述其中排除了一个或更多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。

Claims (58)

1.分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽在SEQ ID NO：2和19至25中的任一个中包含1至50个保守氨基酸替换。

3.权利要求1所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的分离的多肽，其由SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列组成。

5.权利要求1至4中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽是交联的、环化的、缀合的、酰化的、羧基化的、脂化的、乙酰化的、巯基乙酸酰胺化的、烷基化的、甲基化的、聚苷氨酰化的、糖基化的、聚唾液酸化的、磷酸化的、腺苷酰化的、PEG化的，或其组合。

6.权利要求1至5中任一项所述的分离的多肽，其在C端或在N端包含修饰。

7.权利要求1至3中任一项所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽还包含融合结构域。

8.权利要求7所述的分离的多肽，其中所述融合结构域选自：多聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。

9.权利要求8所述的分离的多肽，其中所述融合结构域是人IgGl的Fc部分。

10.权利要求9所述的分离的多肽，其中所述人IgGl的Fc部分包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

11.权利要求10所述的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

12.权利要求11所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个的氨基酸序列。

13.权利要求12所述的分离的多肽，其由SEQ ID NO：8、9和26至39中任一个的氨基酸序列组成。

14.权利要求7所述的分离的多肽，其中所述融合结构域包含卷曲受体的富含半胱氨酸结构域(CRD)。

15.权利要求14所述的分离的多肽，其中所述CRD包含SEQ ID NO：3至6中任一个的氨基酸序列。

16.权利要求15所述的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

17.权利要求16所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个的氨基酸序列。

18.权利要求16所述的分离的多肽，其由SEQ ID NO：10至17和40至95中任一个的氨基酸序列组成。

19.权利要求7所述的分离的多肽，其中所述融合结构域包含治疗剂。

20.权利要求19所述的分离的多肽，其中所述治疗剂是抗菌剂或卷曲受体共受体的抗体。

21.权利要求20所述的分离的多肽，其中所述抗菌剂是抗生素。

22.权利要求21所述的分离的多肽，其中所述卷曲受体共受体是脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6、受体酪氨酸激酶(RTK)或酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR2)。

23.权利要求1至22中任一项所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽与聚合物连接。

24.权利要求23所述的分离的多肽，其中所述聚合物延长所述分离的多肽的血清半衰期。

25.权利要求23所述的分离的多肽，其中所述聚合物延长所述分离的多肽的保质期。

26.权利要求1至25中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽与卷曲受体结合。

27.权利要求1至26中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽降低Wnt信号传导。

28.核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：2和8至95中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。

29.载体，其包含权利要求28所述的核酸。

30.细胞，其包含权利要求28所述的核酸分子或权利要求29所述的载体。

31.产生权利要求1至27中任一项所述的分离的多肽的方法，所述方法包括在其中产生所述多肽的条件下培养权利要求A30所述的细胞的步骤。

32.权利要求31所述的方法，其还包括从培养物回收所述多肽。

33.药剂，其与卷曲受体的脂质结合沟结合。

34.权利要求33所述的药剂，其中所述药剂是人工蛋白质。

35.权利要求33所述的药剂，其中所述药剂是抗体。

36.权利要求33所述的药剂，其中所述药剂是小分子。

37.权利要求33所述的药剂，其中所述药剂包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NOs：SEQID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

38.权利要求37所述的药剂，其中所述药剂包含含有SEQ ID NOs：SEQ ID NO：2和19至25中任一个的氨基酸序列的多肽。

39.权利要求33至38中任一项所述的药剂，其中所述药剂阻断TcdB与卷曲受体的结合。

40.权利要求33至38中任一项所述的药剂，其中所述药剂阻断Wnt与卷曲受体的结合。

41.组合物，其包含权利要求1至27中任一项所述的分离的多肽或权利要求33至40中任一项所述的药剂。

42.权利要求41所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

43.权利要求42所述的组合物，其还包含可药用载体。

44.治疗艰难梭菌(Clostridium difficile)感染(CDI)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至27中任一项所述的分离的多肽、权利要求33至40中任一项所述的药剂或权利要求41至43中任一项所述的组合物。

45.权利要求44所述的方法，其还包括向所述对象施用有效量的诱导细胞中卷曲受体下游的Wnt信号传导的第二药剂。

46.权利要求45所述的方法，其中所述第二药剂是GSK-3抑制剂。

47.权利要求46所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是锂(LiCl)、CHIR99021、SB216763、BIO、TCS 2002、TC-G 24、TWS 119、SB 415286、A 1070722、AR-A014418、L803-mts，或其组合。

48.权利要求44至47中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用有效量的抑制细胞中TcdB的半胱氨酸蛋白酶活性的第三药剂。

49.权利要求48所述的方法，其中所述第三药剂是依布硒。

50.权利要求44至49中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用卷曲受体抗体。

51.治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至27中任一项所述的分离的多肽、权利要求33至40中任一项所述的药剂或权利要求41至43中任一项所述的组合物。

52.权利要求51所述的方法，其还包括向所述对象施用有效量的阻断Wnt信号传导的第二药剂。

53.权利要求52所述的方法，其中所述第二药剂是Dkk家族蛋白、分泌型卷曲受体相关蛋白(sFRP)、Draxin、IGFBP-4、SOST/骨硬化蛋白、USAG1、WIF-1或卷曲受体抗体。

54.权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移癌。

55.权利要求51至54中任一项所述的方法，其中所述癌症是骨肉瘤。

56.权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、胃癌、胰腺癌或前列腺癌。

57.权利要求56所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。

58.权利要求51至55中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用治疗有效量的抗癌剂。

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