BR112019012635A2 - peptídeo mutante spink2, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um peptídeo mutante spink2, para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, dpara identificar um agente de proteção retinal e para preparar um coelho modelo e dano retinal, conjugado, anticorpo, composição, composição farmacê utica, e, coelho modelo de dano retinal. - Google Patents

peptídeo mutante spink2, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um peptídeo mutante spink2, para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, dpara identificar um agente de proteção retinal e para preparar um coelho modelo e dano retinal, conjugado, anticorpo, composição, composição farmacê utica, e, coelho modelo de dano retinal. Download PDF

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Abstract

é provido um novo peptídeo que inclui uma sequência de aminoácido indicada pela seq id no: 30 e inibe a atividade de protease.

Description

PEPTÍDEO MUTANTE SPINK2, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM PEPTÍDEO MUTANTE SPINK2, PARA IDENTIFICAR UM FÁRMACO TERAPÊUTICO OU UM FÁRMACO PROFILÁTICO PARA DEGENERAÇÃO MACULAR RELACIONADA À IDADE, PARA IDENTIFICAR UM AGENTE DE PROTEÇÃO RETINAL E PARA PREPARAR UM COELHO MODELO DE DANO RETINAL, CONJUGADO, ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, COELHO MODELO DE DANO RETINAL
Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se a um peptídeo, um polinucleotídeo, um vetor, uma célula, um método para produzir o peptídeo, um peptídeo obtido pelo método, uma composição compreendendo o peptídeo, uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo, a composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de várias doenças compreendendo o peptídeo, o uso do peptídeo para o tratamento ou prevenção de várias doenças, um método para tratar várias doenças compreendendo a etapa de administrar o peptídeo, etc.
Fundamentos da Técnica [002] A serina peptidase Al com necessidade de alta temperatura (HTRA1) é uma serina protease semelhante à tripsina (PRSS11; Clan PA, família Si) e é constituída por um domínio de terminal N consistindo em um módulo semelhante a IGFBP e um módulo semelhante a Kazal, um domínio de protease e um domínio de PDZ de terminal C. A HTRA1 pertence à família de HTRA que inclui HTRA2, HTRA3, e HTRA4 e exibe reversivamente estruturas ativas e inativas, da mesma maneira como as outras moléculas de HTRA (Literatura Não Patentária 1 e 2). Sua expressão é mal distribuída no corpo humano e verificada em níveis relativamente altos na cartilagem, na membrana sinovial, na placenta, e semelhantes. É conhecido
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2/113 que a HTRA1 cliva muitos constituintes da matriz extracelular tais como uma proteína precursora amiloide, fibromodulina, clusterina, ADAM9, e vitronectina como substratos e está relacionada com as doenças tipificadas por artrite e calcificação óssea (Literatura Não Patentária 3, 4, 5, e 6). Também é conhecido que se uma região promotora de HTRA1 tem um polimorfismo de gene (rs 11200638), o nível de transcrição de HTRA1 é elevado. A análise de associação ampla ao genoma também revelou que o polimorfismo se correlaciona fortemente com a degeneração macular relacionada à idade (em seguida, referida como AMD) (Literatura Não Patentária 7 e 8).
[003] A AMD é uma doença degenerativa crônica com o envelhecimento e é distinguida pela perda da visão central. Esta doença é a causa principal da cegueira adquirida nos USA e é a quarta causa mais comum da cegueira adquirida depois do glaucoma, retinopatia diabética e retinite pigmentosa no Japão (Literatura Não Patentária 12). O mRNA e os níveis proteicos de HTRA1 são elevados nos linfócitos ou células epiteliais pigmentares retinais de pacientes com AMD (Literatura Não Patentária 13). Também foi indicado que a expressão da proteína HTRA1 é elevada para as células epiteliais pigmentares retinais drusas ou degeneradas que são lesões precursoras da AMD, ou membranas neovasculares (Literatura Não Patentária 11 e 14 a 16). Também foi indicado que a proteína HTRA1 é detectada no humor vítreo em associação com o descolamento da retina, oclusão da veia da retina, hemorragia vítrea, furo macular, e outros, e este valor é sincronizado com um marcador de angiogênese VEGF (Literatura Não Patentária 17). Além disso, a decomposição das proteínas que constituem a membrana de base, tais como fibulina 5 ou tropoelastina, e a fragmentação da camada elástica da membrana de Bruch foi observada em camundongos transgênicos HTRA1 (Literatura Não Patentária 9). Contudo, não foi diretamente mostrado que a inibição da atividade de protease de HTRA1 fosse eficaz ou não para tratar as doenças descritas acima e para proteger a retina.
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3/113 [004] O SPINK2 (inibidor de senna protease tipo Kazal 2) é um domínio tipo Kazal tendo três ligações de dissulfeto e funções como um inibidor de tripsina/acrosina (Literatura Não Patentária 10). Contudo, esta relação para AMD ainda não foi esclarecida.
[005] Os modelos de camundongo e coelho são conhecidos como modelos animais para avaliar a AMD (Literatura Não Patentária 18, 19, e 20). Como para os coelhos, que são mais preferidos como os modelos que podem ser extrapolados para as doenças oculares humanas (Literatura Não Patentária 21), os modelos convencionais são usados meramente para observar as verificações anormais na retina e na coroide e têm a dificuldade de avaliar as funções anormais das células epiteliais pigmentares retinais (células RPE), etc. Outro problema dos mesmos é um período tão longo quanto 8 meses necessário para a formação do modelo (Literatura Não Patentária 20).
Lista de Citação
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Literatura Não Patentária 21: Zernii E.Y, et al., CNS & Neurological Disorders-Drug Targets, 2016, Vol. 15: p. 267-291
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Sumário da Invenção
Problema Técnico [006] Um objetivo da presente invenção é fornecer um novo inibidor da serina peptidase Al com necessidade de alta temperatura (HTRA1).
Solução para o Problema [007] A presente invenção refere-se a:
(1) Um peptídeo mutante SPINK2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42) e inibe a atividade de protease de HTRA1 humana;
(2) O peptídeo de acordo com (1), em que o primeiro Xaa (Xi) é Asp, Glu, Ser, Gly, ou Ile, o segundo Xaa (X2) é Ala, Gly, Leu, Ser ou Thr, o terceiro Xaa (X3) é Asp, His, Lys, Met ou Gin, o quarto Xaa (X4) é Asp, Phe, His, Ser ou Tyr, o quinto Xaa (X5) é Ala, Asp, Glu, Met ou Asn, o sexto Xaa (Xô) é Met ou Trp, o sétimo Xaa (X7) é Gin, Trp, Tyr ou Vai, o oitavo Xaa (Xg) é Phe, Leu ou Tyr, o nono Xaa (X9) é Phe ou Tyr, o décimo Xaa (X10) é Ala, Glu, Met ou Vai, e o décimo primeiro Xaa (Xh) é Ala, Thr ou Vai;
(3) O peptídeo de acordo com (1) ou (2), que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 a 29 (Figuras 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35 a 41);
(4) O peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (3), que compreende uma sequência de aminoácidos preparada pela ligação peptídica de um a três aminoácidos ao lado de terminal amino da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42);
(5) O peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (4), que compreende uma sequência de aminoácidos preparada pela ligação peptídica de um ou dois aminoácidos ao lado de terminal carboxila da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42);
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6/113 (6) O peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (5), que tem uma estrutura tridimensional distinguida por ter três ligações de dissulfeto e compreende uma estrutura de laço, hélice α e folha β;
(7) Um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos compreendida no peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (6);
(8) Um vetor compreendendo o polinucleotídeo de acordo com (7);
(9) Uma célula compreendendo o polinucleotídeo de acordo com (7) ou o vetor de acordo com (8) ou produzindo o peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (6);
(10) Um método para produzir um peptídeo mutante SPINK2 que inibe a atividade de protease de HTRA1, compreendendo as seguintes etapas de (i) e (ii):
(i) cultivar a célula de acordo com (9); e (11) recuperar o peptídeo mutante SPINK2 da cultura:
(11) Um peptídeo mutante SPINK2 obtido pelo método de acordo com (10);
(12) Um conjugado compreendendo o peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (6) e (11) unido a uma porção adicional;
(13) O conjugado de acordo com (12), que é um polipeptídeo;
(14) Um anticorpo que se liga ao peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (6) e (11), ou um fragmento funcional do mesmo;
(15) Uma composição compreendendo o peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (6) e (11), o polinucleotídeo de acordo com (7), o vetor de acordo com (8), a célula de acordo com (9), o conjugado de acordo com (12) ou (13), e/ou o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo de acordo com (14);
(16) Uma composição farmacêutica compreendendo o
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7/113 peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (6) e (11) e/ou o conjugado de acordo com (12) ou (13);
(17) A composição farmacêutica de acordo com (16), que é para o tratamento ou prevenção de uma doença relacionada com HTRA1;
(18) A composição farmacêutica de acordo com (17), em que a doença relacionada com HTRA1 é uma, duas ou mais doenças selecionadas a partir do grupo consistindo em degeneração macular úmida relacionada à idade, degeneração macular seca relacionada à idade, atrofia geográfica, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, vasculopatia polipoidal da coroide, artrite reumatoide e osteoartrite;
(19) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (16) a (18), que compreende um, dois ou mais medicamentos adicionais;
(20) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (16) a (18), que é usada em combinação com um, dois ou mais medicamentos adicionais;
(21) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (16) a (20), que é um agente de proteção retinal;
(22) Um método para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, compreendendo as seguintes etapas de 1 a 3:
[etapa 1] incubar a HTRA1 protease e um substrato na presença e ausência de uma substância de teste;
[etapa 2] detectar a atividade de HTRA1 protease na presença e ausência da substância de teste; e [etapa 3] determinar que a substância de teste é positiva quando a atividade de HTRA1 protease na presença da substância de teste for menor do que a atividade de HTRA1 protease na ausência da substância de teste;
(23) Um método para identificar um agente de proteção
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8/113 retinal, compreendendo as seguintes etapas de 1 a 3:
[etapa 1] incubar a HTRA1 protease e um substrato na presença e ausência de uma substância de teste;
[etapa 2] detectar a atividade de HTRA1 protease na presença e ausência da substância de teste; e [etapa 3] determinar que a substância de teste é positiva quando a ati vidade de HTRA1 protease na presença da substância de teste for menor do que a atividade de HTRA1 protease na ausência da substância de teste;
(24) Um método para preparai- um coelho modelo de dano retinal, compreendendo a etapa de alimentar um coelho com uma dieta com alto teor de gordura contendo hidroquinona durante 3 a 6 meses, em que as células epiteliais pigmentares retinais do coelho modelo são hipertrofiadas quando comparadas com as células epiteliais pigmentares retinais de um coelho normal;
(25) Um coelho modelo de dano retinal preparado pelo método de acordo com (24), em que o coelho modelo de dano retinal tem células epiteliais pigmentares retinais hipertrofiadas quando comparado com um coelho normal;
(26) Um método para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, ou um agente de proteção retinal, compreendendo as seguintes etapas (i) e (ii):
(i) medir a hipertrofia das células epiteliais pigmentares retinais no coelho de acordo com (25) com e sem a administração de uma substância de teste; e (ii) determinar que a substância de teste é positiva quando a hipertrofia de células epiteliais pigmentares retinais com a administração da substância de teste é suprimida quando comparada com a hipertrofia de células epiteliais pigmentares retinais sem a administração do mesmo;
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9/113 (27) O método de acordo com (26), em que a medição na etapa (i) é a medição de uma área média das células epiteliais pigmentares retinais ou o número de células epiteliais pigmentares retinais hipertrofiadas;
(28) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (16) a (18), que é para o tratamento ou prevenção da degeneração macular seca relacionada à idade; e (29) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (16) a (18), que é para o tratamento ou prevenção da degeneração macular úmida relacionada à idade; etc.
Efeitos Vantajosos Invenção [008] O peptídeo provido pela presente invenção, e uma composição farmacêutica compreendendo tal peptídeo têm uma atividade inibidora de HTRA1 e são úteis no tratamento ou prevenção, etc. da degeneração macular relacionada à idade.
Breve Descrição dos Desenhos [009] [Figura 1(A)] A Figura 1(A) é um diagrama que mostra os resultados da similaridade da sequência de comparação a entre a HTRA1 de humanos, camundongos, ratos e macacos. A linha tracejada representa um domínio enzimaticamente ativo (204Gly a 364Leu).
[0010] [Figura 1(B)] A Figura 1(B) é um diagrama mostrando os resultados da similaridade da sequência de comparação entre a HTRA1 de ser humano, camundongo, rato e macaco (Cont.).
[0011] [Figura 2] A Figura 2 é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da atividade inibidora de HTRA1 (cat) de um peptídeo que inibe HTRA1 usando-se a taxa de decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador. Os painéis de A a C mostram cada um os resultados de avaliação para cada peptídeo de inibição, e o painel D mostra os resultados de avaliação para o SPINK2 tipo selvagem de controle.
[0012] [Figura 3] A Figura 3 é um diagrama mostrando os resultados
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10/ 113 da avaliação da atividade inibidora de HTRA1 (total) de um peptídeo que inibe HTRA1 usando-se a taxa de decomposição de um substrato de peptídeo como um i ndicador (painéis de A a C).
[0013] [Figura 4(A)] A Figura 4(A) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da atividade inibidora de HTRA1 (cat) de um peptídeo que inibe HTRA1 usando-se a decomposição de vitronectina humana como um indicador. A análise foi conduzida por Western blot usando um Anticorpo de Vitronectina Humana (R&D Systems, Inc.; MAB2349).
[0014] [Figura 4(B)] A Figura 4(B) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da atividade inibidora de HTRA1 (cat) de um peptídeo que inibe HTRA1 usando-se a decomposição da vitronectina humana como um indicador (Cont.).
[0015] [Figura 5(A)] A Figura 5(A) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRA1 com cada protease usando-se a decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador (parte 1). Para o nome de cada protease usada e sua concentração e o nome do substrato e sua concentração, etc., ver o Exemplo 3.
[0016] [Figura 5(B)] A Figura 5(B) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRA1 com cada protease usando-se a decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador (parte 2).
[0017] [Figura 5(C)] A Figura 5(C) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRA1 com cada protease usando-se a decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador (parte 3).
[0018] [Figura 5(D)] A Figura 5(D) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRA1 com cada protease usando-se a decomposição de um substrato de
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[0019] [Figura 6] A Figura 6 é um diagrama mostrando um complexo de HTRA1 (cat)Zpeptídeo que inibe HTRA1 obtido através da cristalografia de raios X. O peptídeo de inibição é ligado a cada molécula de um trímero de HTRA1 formado pela HTRA1 (cat).
[0020] [Figura 7] A Figura 7 é um diagrama mostrando um complexo de HTRA1 (cat)Zpeptídeo inibidor de HTRA1 obtido através da Cristalografia de raios X como um monômero. O peptídeo de inibição é ligado a uma região contendo o centro ativo de HTRA1 (cat).
[0021] [Figura 8] A Figura 8 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 54) de H2-Opt. “Mca-I” de terminal N significa N-(4metilcoumaril-7-amida)~isoleucina, e “(Dnp)K” de terminal C significa N épsilon-(2,4-dinitrofenil)-lisina.
[0022] [Figura 9] A Figura 9 é um diagrama mostrando que a expressão de HTRA1 foi aumentada no humor vítreo de um modelo de rato de dano na retina induzido pela exposição à luz. A análise foi conduzida por Western blot usando Anticorpo Humana HTRA1/PRSS11 (R&D Systems, Inc.; AF2916).
[0023] [Figura 10] A Figura 10 é um diagrama mostrando que um grupo de administração de peptídeo que inibe HTRA1 do modelo de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz suprimiu uma diminuição na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa em uma seção cruzada da retina, n = 4 para um grupo de administração de solução salina normal, e n = 5 para os outros grupos.
[0024] [Figura 11] A Figura 11 é um diagrama mostrando os resultados d avaliação da atividade inibidora de HTRA1 (cat) de cinco derivados de peptídeo que inibem HTRA1 usando-se a taxa de decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador.
[0025] [Figura 12] A Figura 12 é um diagrama mostrando os
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12/113 resultados da avaliação da ligação de três peptídeos que inibem HTRA1 para HTRA1 (cat) através de um método de imunoprecipitação.
[0026] [Figura 13] A Figura 13 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) do SPINK2 humano.
[0027] [Figura 14] A Figura 14 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2) codificando a sequência de aminoácidos de SPINK2 humano.
[0028] [Figura 15] A Figura 15 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) do peptídeo H218.
[0029] [Figura 16] A Figura 16 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 4) codificando a sequência de aminoácidos de peptídeo H218.
[0030] [Figura 17] A Figura 17 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) do peptídeo H223.
[0031] [Figura 18] A Figura 18 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 6) codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H223.
[0032] [Figura 19] A Figura 19 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) do peptídeo H228.
[0033] [Figura 20] A Figura 20 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 8) codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H228.
[0034] [Figura 21] A Figura 21 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) do peptídeo H308.
[0035] [Figura 22] A Figura 22 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 10) codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H308.
[0036] [Figura 23] A Figura 23 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) do peptídeo H321.
[0037] [Figura 24] A Figura 24 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 12) codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H321.
[0038] [Figura 25] A Figura 25 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) do peptídeo H322.
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13/113 [0039] [Figura 26] A Figura 26 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 14) codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H322.
[0040] [Figura 27] A Figura 27 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) do derivado de peptídeo H308AT.
[0041] [Figura 28] A Figura 28 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 16) codificando a sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H308AT.
[0042] [Figura 29] A Figura 29 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) do derivado de peptídeo H321AT.
[0043] [Figura 30] A Figura 30 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 18) codificando a sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H321 AT.
[0044] [Figura 31] A Figura 31 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) do derivado de peptídeo H322AT.
[0045] [Figura 32] A Figura 32 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 20) codificando a sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H322AT.
[0046] [Figura 33] A Figura 33 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) do peptídeo M7.
[0047] [Figura 34] A Figura 34 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 22) codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo M7.
[0048] [Figura 35] A Figura 35 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) do derivado de peptídeo H308_S16A.
[0049] [Figura 36] A Figura 36 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) do derivado de peptídeo H308JDlG_S16A.
[0050] [Figura 37] A Figura 37 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) do derivado de peptídeo H308JDlS_S16A.
[0051] [Figura 38] A Figura 38 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) do derivado de peptídeo H308JDlE_S16A.
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14/113 [0052] [Figura 39] A Figura 39 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) do derivado de peptídeo H308_D1SLI_S16A.
[0053] [Figura 40] A Figura 40 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 28) do derivado de peptídeo H321 AT_D1G_S16A.
[0054] [Figura 41] A Figura 41 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) do derivado de peptídeo H322AT_D1G_S16A.
[0055] [Figura 42] A Figura 42 mostra a fórmula geral (SEQ ID NO: 30) de um peptídeo que inibe HTRA1. Xi a Xn cada um representa um aminoácido arbitrário.
[0056] [Figura 43] A Figura 43 mostra uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 31) consistindo em etiqueta S e um ligante.
[0057] [Figura 44] A Figura 44 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) de um hexâmero de terminal C.
[0058] [Figura 45] A Figura 45 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 33) do iniciador 1.
[0059] [Figura 46] Figura 46 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 34) do iniciador 2.
[0060] [Figura 47] A Figura 47 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 35) do iniciador 3.
[0061] [Figura 48] A Figura 48 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 36) do iniciador 4.
[0062] [Figura 49] A Figura 49 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 37) do iniciador 5.
[0063] [Figura 50] A Figura 50 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 38) do iniciador 6.
[0064] [Figura 51] A Figura 51 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 39) do iniciador 7.
[0065] [Figura 52] A Figura 52 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 40) do iniciador 8.
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15/ 113 [0066] [Figura 53] A Figura 53 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 41) do iniciador 9.
[0067] [Figura 54] A Figura 54 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 42) do iniciador 10.
[0068] [Figura 55] A Figura 55 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 43) do iniciador 11.
[0069] [Figura 56] A Figura 56 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 44) do iniciador 12.
[0070] [Figura 57] A Figura 57 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 45) do iniciador 13.
[0071] [Figura 58] A Figura 58 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 46) do iniciador 14.
[0072] [Figura 59] A Figura 59 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 47) do iniciador 15.
[0073] [Figura 60] A Figura 60 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 48) do iniciador 16.
[0074] [Figura 61] A Figura 61 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 49) do iniciador 17.
[0075] [Figura 62] A Figura 62 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 50) do iniciador 18.
[0076] [Figura 63] A Figura 63 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 51) do iniciador 19.
[0077] [Figura 64] A Figura 64 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 52) do iniciador 20.
[0078] [Figura 65] A Figura 65 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 53) de HTRA1 humana (completa).
[0079] [Figura 66(A)] A Figura 66(A) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da atividade inibidora de HTRA1 (cat) de peptídeos que inibem a HTRA1 usando-se a taxa de decomposição de um peptídeo
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16/ 113 substrato como um indicador.
[0080] [Figura 66(B)] A Figura 66(B) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da atividade inibidora de HTRA1 (completa) de um peptídeo que inibe a HTRA1 usando-se a taxa de decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador.
[0081] [Figura 67] A Figura 67 é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da Atividade inibidora de HTRA1 (cat) de um peptídeo que inibe HTR.A1 usando-se a decomposição de vitronectina humana como um indicador. A análise foi conduzida por Western blot usando Anticorpo de Vitronectina Humana (R&D Systems, Inc.; MAB2349).
[0082] [Figura 68(A)] A Figura 68(A) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de peptídeos que inibem HTRA1 com cada protease usando-se a decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador (parte 1).
[0083] [Figura 68(B)] A Figura 68(B) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRA1 com cada protease usando a decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador (parte 2).
[0084] [Figura 68(C)] A Figura 68(C) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRAlcom cada protease usando-se a decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador (parte 3).
[0085] [Figura 68(D)] A Figura 68(D) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRA1 com cada protease usando-se a decomposição de um substrato de peptídeo como um indicador (parte 4).
[0086] [Figura 68(E)] A Figura 68(E) é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da reatividade cruzada de um peptídeo que inibe HTRA1 com cada protease usando-se a decomposição de um substrato de
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17/ 113 peptídeo como um indicador (parte 5).
[0087] [Figura 69] A Figura 69 é um diagrama mostrando os resultados da avaliação da ligação de três peptídeos que inibem HTRA1 para HTRA1 (cat) através de um método de imunoprecipitação.
[0088] [Figura 70(A)] A Figura 70(A) é um diagrama mostrando que um grupo de administração do peptídeo H308_DlG_S16A que inibe HTRA1 do modelo de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz suprimiu uma diminuição na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa em um seção cruzada da retina, a ···· 6 para todos os grupos. A dose do peptídeo H308_DlG_S16A que inibe a HTRA1 foi de 0,2 e 1 pg/olho.
[0089] [Figura 70(B)] A Figura 70(B) é um diagrama mostrando que um grupo de administração do peptídeo H321ATJD1G_S16A que inibe HTRA1 do modelo de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz suprimiu uma diminuição na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa em uma seção da retina, n ~ 6 para todos os grupos. A dose do Peptídeo H321AT_D1G_S16A que inibe HTRA1 foi de 0,2 e 1 pg/olho.
[0090] [Figura 70(C)] A Figura 70(C) é um diagrama mostrando que um grupo de administração do peptídeo H322ATJD1G_S16A que inibe HTRA1 de modelo de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz suprimiu uma diminuição na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa em uma seção cruzada da retina, n = 6 para todos os grupos. A dosagem do peptídeo H322AT_D1G_S16A que inibe HTRA1 foi de 0,2 e 1 pg/olho.
[0091] [Figura 71(A)] A Figura 71(A) é um diagrama mostrando os resultados das células de RPE de imunotingimento em um coelho de 12 semanas de idade, um coelho de 3 anos de idade, e um coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQ com um anticorpo ZO-1 (Thermo Fisher Scientific Inc.).
[0092] [Figura 71(B)] A Figura 71(B) mostra as áreas médias das
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18/113 células RPE em um coelho de 12 semanas de idade, um coelho com 3 anos de idade, e um coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQ.
[0093] [Figura 71(C)] A Figura 71(C) é um diagrama que mostra a expressão aumentada do mRNA do componente de complemento 3 “C3”, que é um fator relacionado com AMD, no tecido da retina de um coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQ.
[0094] [Figura 71(D)] A Figura 71(D) é um diagrama que mostra a expressão aumentada do mRNA do componente de complemento 3 “C3”, que é um fator relacionado com AMD, no tecido RPE/coroide de um coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQ.
[0095] [Figura 71(E)] A Figura 71(E) é um diagrama mostrando os resultados da medição de uma concentração de HTRA1 no humor vítreo de um coelho com 12 semanas de idade, um coelho com 3 anos de idade, e um coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQ por LC-MS/MS.
[0096] [Figura 72(A)] A Figura 72(A) é um diagrama mostrando que um grupo de administração do peptídeo H308 que inibe HTRA1 de coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQs apresentou um efeito supressivo na hipertrofia das células de RPE. n = 5 para todos os grupos. Uma área média foi usada como um indicador.
[0097] [Figura 72(B)] A Figura 72(B) é um diagrama mostrando que um grupo de administração do peptídeo H308 que inibe HTRA1 de coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQs apresentou um efeito supressivo na hipertrofia das células RPE. n = 5 para todos os grupos. O número de células RPE tendo uma área celular de 1500 μιη2 ou maior foi usada como um indicador.
[0098] [Figura 73] A Figura 73 é um diagrama mostrando os resultados da similaridade da sequência de comparação entre a HTRA1 humana, de macaco, coelho, camundongo e rato. A linha tracejada representa um domínio enzimaticamente ativo (204Gly até 364Leu).
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19/ 113 [0099] [Figura 74] A Figura 74 é um diagrama mostrando que um peptídeo que inibe HTRA1 apresentou um efeito supressivo no mRNA VEGF induzido em uma linha celular epitelial do pigmento retinal humano ARPE-19 através da adição de H2O2, complemento de soro humano normal, e HTR.A1, [00100] [Figura 75] A Figura 75 é um diagrama mostrando que um peptídeo que inibe HTRA1 apresentou um efeito supressivo na migração das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) induzido por soro.
[00101] [Figura 76] A Figura 76 mostra a sequência de nucleotídeos do iniciador 21.
[00102] [Figura 77] A Figura 77 mostra a sequência de nucleotídeos do iniciador 22.
[00103] Na presente invenção, a frase “SEQ ID NO: X (Figura Y)” ou “Figura Y (SEQ ID NO: X)” significa que a sequência é mostrada na SEQ ID NO: X ou mostrada na Figura Y.
Descrição das Modalidades
I. Definição [00104] Na presente invenção, o termo “gene” é usado para significar uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos contida em uma proteína, ou um filamento complementar da mesma. O gene consiste em um filamento único, um filamento duplo ou um filamento triplo ou mais. Uma associação de um filamento de DNA e um filamento de RNA, ribonucleotídeos e deoxirribonucleotídeos coexistindo em um filamento, e uma molécula de ácido nucléico de filamento duplo ou triplo ou mais filamentos incluindo tais filamentos também são incluídos no significado de “gene”.
[00105] Na presente invenção, os termos “gene”, “polinucleotídeo” e “molécula de ácido nucléico” são sinônimos entre si e não são limitados pelo número de suas unidades constituintes tais como ribonucleotídeos,
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20/113 desoxirribonucleotídeos, nucleotídeos, e nucleosídeos através de qualquer meio. Por exemplo, DNA, RNA, mRNA, cDNA, cRNA, uma sonda, um oligonucleotide©, um iniciador, e outros também são incluídos no escopo destes. O termo “molécula de ácido nucléico” também é abreviado para um “ácido nucléico”.
[00106] Na presente invenção, os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são sinônimos uns com os outros. Um peptídeo que inibe ou suprime uma, duas ou mais atividades ou funções da molécula X (em seguida, esses efeitos inibidores ou supressivos são coletivamente referidos como “atividade inibidora de X”) pode ser referido como um “peptídeo que inibe X”.
[00107] O termo “SPINK2” é usado para significar um inibidor de serina protease tipo Kazal 2. Esta proteína de 7 kDa consiste em um domínio tipo Kazal tendo três ligações de dissulfeto. O SPINK2 é preferivelmente derivado de humano. Na presente invenção, o SPINK2 humano é simplesmente referido como “SPINK2”, a menos que de outro modo especificado.
[00108] O termo “HTRA1” é usado para significar serina peptidase Al com necessidade de alta temperatura. Esta proteína é constituída por um domínio de terminal N consistindo em um módulo semelhante a IGFBP e um módulo semelhante a Kazal, um domínio de protease e um domínio de PDZ de terminal C e pertence à família HTRA. A HTRA1 é preferivelmente derivada de ser humano. Na presente invenção, a HTRA1 humana também é simplesmente referida como “HTRA1”, a menos que de outro modo especificado.
[00109] O termo “peptídeo que inibe HTRA1” é usado para significar um peptídeo que inibe ou suprime uma, duas ou mais atividades ou funções de HTRA1. Um fragmento do peptídeo, um aduto do peptídeo com uma porção adicional, ou um conjugado do peptídeo que mantém a atividade
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21/113 inibidora de HTRA1 é incluído no escopo do termo peptídeo que inibe HTRA1”. Especificamente, um fragmento, um aduto e uma forma modificada do peptídeo que mantêm a atividade inibidora de HTRA1 também estão incluídos dentro do termo “peptídeo que inibe HTRA1”.
[00110] Na presente invenção, o termo “célula” é usado para incluir várias células derivadas dos animais individuais, células subcultivadas, células cultivadas primárias, linhas celulares, células recombinantes, leveduras, micróbios e semelhantes.
[00111] Na presente invenção, o termo “sítio” ao qual um peptídeo se liga, isto é, o “sítio” que é reconhecido por um peptídeo é usado para significar uma sequência de aminoácidos consecutiva ou intermitente parcial ou configuração parcial em uma molécula alvo a ser ligada ou reconhecida por um peptídeo. Na presente invenção, tal sítio pode ser referido como um epítopo ou um sítio de ligação na molécula alvo.
[00112] O termo “mutante SPINK2” é usado para significar um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de SPINK2 do tipo selvagem através da substituição de um ou dois ou mais aminoácidos através dos aminoácidos diferentes daqueles do tipo selvagem, a exclusão de um ou dois ou mais aminoácidos do tipo selvagem, a inserção de um ou dois ou mais aminoácidos ausentes no tipo selvagem, e/ou a adição de aminoácido(s) ausente(s) no tipo selvagem para o terminal amino (terminal N) e/ou terminal carboxila (terminal C) do tipo selvagem (em seguida, coletivamente referido como uma “mutação”). Um “mutante de SPINK2” tendo atividade inibidora de HTRA1 é incluído no peptídeo que inibe HTRA1. Na presente invenção, a “inserção” também pode ser incluída na “adição”.
[00113] Na presente invenção, o termo “vários” na frase “um ou vários” se refere a 3 a 10.
[00114] Na presente invenção, a frase “para hibridizar sob condições
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22/113 severas” é usada para significar que a hibridização é realizada sob condições nas quais a hibridização é realizada a 65 °C em uma solução contendo 5 x SSC, e o resultante é depois lavado a 65 °C por 20 minutos em uma solução aquosa contendo 2 x SSC e 0,1% de SDS, a 65 °C por 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,5 x SSC e 0,1% de SDS, e a 65 °C por 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,2 x SSC e 0,1% de SDS, ou condições equivalentes a estas. SSC significa uma solução aquosa de 150 mM de NaCl e 15 mM de citrato de sódio, e η x SSC significa uma concentração de n vezes de SSC.
[00115] Na presente invenção, os termos específico” e “especificidade” são sinônimos e permutáveis com os termos “seletivo” e “seletividade”, respectivamente. Por exemplo, um peptídeo de inibição específico de HTRA1 é sinônimo com um peptídeo de inibição seletiva de HTRA1.
2. Peptídeo
2-1. Aminoácido [00116] O termo “aminoácido” é usado para significar um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo carboxila e para significar um a-aminoácido contido como uma unidade constituinte preferivelmente em uma proteína, e mais preferivelmente em uma natural proteína. Na presente invenção, o aminoácido é mais preferivelmente Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Vai. O termo “aminoácido” é usado para significar estes 20 aminoácidos no total, a menos que de outro modo especificado. Estes 20 aminoácidos no total podem ser referidos como “aminoácidos naturais”. O peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção preferivelmente contém aminoácidos naturais.
[00117] Na presente invenção, o termo “resíduo de aminoácido” também é referido como um “aminoácido”.
[00118] Na presente invenção, o aminoácido pode ser um L
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23/113 aminoácido, um D-aminoácido, ou uma mistura do mesmo (DL-aminoácido) e significa um L-aminoácido, a menos que de outro modo especificado.
[00119] Os aminoácidos naturais podem ser divididos em, por exemplo, os seguintes grupos, com base nas propriedades comuns das cadeias laterais:
(1) grupo de aminoácidos hidrofóbico: Met, Ala, Vai, Leu, e Tie;
(2) grupo de aminoácidos hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, e Gin;
(3) grupo de aminoácidos ácidos: Asp e Glu;
(4) grupo de aminoácidos básicos: His, Lys, e Arg;
(5) grupo de aminoácidos influenciando a direção da cadeia principal: Gly e Pro; e (6) grupo de aminoácidos aromático: Trp, Tyr, e Phe.
[00120] Contudo, a classificação dos aminoácidos naturais não é limitada aos mesmos.
[00121] Na presente invenção, cada aminoácido natural pode receber uma substituição de aminoácido conservativa.
[00122] A “substituição de aminoácido conservative” significa uma substituição através de um aminoácido funcionalmente equivalente ou similar. A substituição de aminoácido conservativa em um peptídeo provoca uma mudança estática na sequência de aminoácidos do peptídeo. Por exemplo, uma, duas ou mais substituições de aminoácidos tendo polaridade similares agem de maneira funcionalmente equivalente e provocam a mudança estática na sequência de aminoácidos do peptídeo. Em geral, uma substituição dentro de um certo grupo pode ser considerada como sendo conservativa em termos de estruturas e funções. Contudo, como é óbvio àquele versado na técnica, o papel de um resíduo de aminoácido específico pode ser determinado pela sua posição na estrutura tridimensional de uma molécula contendo o aminoácido.
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Por exemplo, um resíduo de cisteína pode tomar uma forma oxidada (dissulfeto) tendo uma polaridade mais baixa do que de uma forma reduzida (tiol). A porção alifática longa de uma cadeia lateral de arginina é capaz de constituir características estrutural e funcionalmente importantes. Altemativamente, uma cadeia lateral contendo um anel aromático (triptofano, tirosina e fenilalanina) é capaz de contribuir com a interação íon-aromático ou interação de cátion-pi. Em tal caso, mesmo a substituição dos aminoácidos tendo estas cadeias laterais com os aminoácidos pertencendo a um grupo ácido ou não polar pode ser estrutural e funcionalmente conservativa. Os resíduos tais como prolina, glicina e cisteína (forma de dissulfeto) podem ter um efeito direto na estrutura tridimensional da cadeia principal e não pode ser frequentemente substituída sem uma distorção estrutural.
[00123] A substituição de aminoácidos conservativa inclui, como mostrado abaixo, uma substituição específica com base na similaridade da cadeia lateral (L. Lehninger, Biochemistry', 2â edição, pp. 73-75, Worth Publisher, Nova Iorque (1975)) e uma substituição típica.
[00124] (1) Grupo de aminoácidos não polares: alanina (em seguida referida como “Ala” ou simplesmente “A”), valina (em seguida, referida como “Vai” ou simplesmente “V”), leucina (em seguida, referida como “Leu” ou simplesmente “L”), isoleucina (em seguida, referida como “He” ou simplesmente “I”), prolina (em seguida, referida como “Pro” ou simplesmente “P”), fenilalanina (em seguida, referida como “Phe” ou simplesmente “F”), triptofano (em seguida, referida como “Trp” ou simplesmente “W”), e metionina (em seguida, referida como “Met” ou simplesmente “M”) (2) grupo de aminoácidos polares não carregados: glicina (em seguida, referida como “Gly” ou simplesmente “G”), serina (em seguida, referida como “Ser” ou simplesmente “S”), treonina (em seguida, referida como “Thr” ou simplesmente “T”), cisteína (em seguida, referida como “Cys” ou simplesmente “C”), ‘tirosina (em seguida, referida como “Tyr” ou
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25/113 simplesmente “Y”), asparagina (em seguida, referida como “Asn” ou simplesmente “N”), e glutamina (em seguida, referida como “Gin” ou si mplesmente “Q”) (3) Grupo de aminoácidos ácidos: ácido aspártico (em seguida, referido como “Asp” ou simplesmente “D”) e ácido glutâmico (em seguida, referido como “Glu” ou simplesmente Έ”) (4) Grupo de aminoácidos básicos: lisina (em seguida, referida como “Lys” ou simplesmente “K”), arginina (em seguida, referida como “Arg” ou simplesmente “R”), e histidina (em seguida, referida como “His” ou simplesmente “H”) [00125] Na presente invenção, os aminoácidos podem ser aminoácidos outros que não os aminoácidos naturais. Os exemplos destes podem incluir selenocisteína, N-formilmetionina, pirrolisina, ácido piroglutâmico, cistina, hidróxi-prolina, hidróxi-lisina, tiroxina, O-fosfosserina, desmosina, β-alanina, sarcosina, omitina, creatina, ácido γ-aminobutírico, opina, teanina, ácido tricolômico, ácido caínico, ácido domóico, e ácido acromélico, que são verificados em peptídeos ou proteínas naturais, e podem incluir: aminoácidos de terminal N protegidos tais como norleucina, Ac-aminoácido, Bocaminoácido, Fmoc-aminoácido, Trt-aminoácido, e Z-aminoácido; aminoácidos terminal de C protegidos tais como éster t-butílico, éster benzílico, éster cicloexílico, e éster de fluorenila de aminoácidos: e outros aminoácidos que não são verificados no mundo natural, incluindo diamina, aminoácido oy aminoácido β, aminoácido γ, derivados de Tic de aminoácidos, e ácido aminofosfônico. Os aminoácidos outros que não os 20 “aminoácidos naturais” não são limitados a este e são coletivamente referidos como “aminoácidos não naturais” na presente invenção por uma questão de conveniência.
2-2. Peptídeo que inibe HTRA1 [00126] O peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção é uma
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26/113 mutante do SPINK2 a qual mantém pelo menos parcialmente a estrutura do SPINK2 (em seguida, referido como um “mutante do SPINK2”) e inibe ou suprime a atividade de protease de HTRAl ou um fragmento que inibe sua atividade enzimática (em seguida, referida como um “fragmento funcional”) (em seguida, tais inibição e supressão são coletivamente referidas como “atividade inibidora de HTRAl”).
[00127] A HTRAl, que é um alvo do peptídeo de inibição da presente invenção, é preferivelmente um HTRA1 mamífero, mais preferivelmente HTRA1 de primata, e ainda mais preferivelmente HTRA1 humana. A sequência de aminoácidos da HTRA1 humana maduro de comprimento total (em seguida, referido como “HTRAl (total)”) tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 53 (Figura 65). Esta sequência de aminoácidos consiste nas posições 23 a 480 e é isenta da sequência de sinal consistindo nas posições de 1 a 22. A sequência de aminoácidos do fragmento funcional de HTRAl humana (em seguida, referido como “HTRAl (cat)”) não é particularmente limitada contanto que o fragmento funcional retenha a atividade de protease. Os exemplos do mesmo podem incluir um fragmento funcional consistindo em 158Gly a 373Lys da SEQ ID NO: 53 (Figura 65), e um fragmento funcional compreendendo 158Gly a 373Lys do mesmo. A HTRAl ou o fragmento funcional do mesmo que é um alvo do peptídeo de inibição da presente invenção também é indicado coma HTRAl protease. A HTRAl protease é preferivelmente derivada de vertebrado, mais preferivelmente derivada de mamífero, ainda mais preferivelmente derivada de primatas, e ainda mais preferivelmente derivada de humano, e pode ser preparada através da purificação a partir dos tecidos ou células de qualquer um destes animais, ou através de um método conhecido a uma pessoa habilitada na técnica como um método de preparação de proteínas tal como uma recombinação genética, tradução in vitro, ou síntese de peptídeos. A HTRAl ou o fragmento funcional do mesmo pode ser unido a uma sequência
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27/113 de sinais, uma região de imunoglobulina Fc, etiqueta, um rótulo, ou outros.
[00128] A atividade inibi dora de HTRA1 pode ser avaliada usando-se a atividade de protease de HTRA1 como um indicador. Por exemplo, HTRA1 ou o fragmento funcional do mesmo, um substrato e o peptídeo de inibição da presente invenção ou um candidato do mesmo são deixados coexistir uns com os outros. Neste caso, quando a atividade de protease de HTRA1 é de 70% ou de menos do que 50% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 1 % ou menos ou 0% quando comparada com aquela na presença de um controle ou na ausência do inibidor ou o candidato do mesmo, a inibição of HTRA1 ocorre com a atividade inibidora de 30% ou mais, 50% ou mais, 70% ou mais, 80%; ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 99% ou mais ou 100%, respectivamente. A atividade inibidora de HTRA1 pode diferir dependendo das condições de reação, do tipo de substrato, concentração, etc. Os exemplos das condições de reação podem incluir, mas não são limitados a, aqueles descritos nos Exemplos. A atividade enzimática pode ser avaliada adicionando-se um substrato de peptídeo ou um substrato proteico a uma dada concentração de HTRA1, e reagindo a mistura por um dado período, após a detecção da fluorescência do substrato de peptídeo, ou detecção o substrato proteico por SDS-PAGE, Western blot, cromatografia líquida, ou outros. Por exemplo, uma solução salina tamponada com fosfato (em seguida, referida como “PBS”), um tampão de borato (50 mM de borato, pH 7 a 9, por exemplo, pH 8,5), ou um tampão Tris (50 mM de Tris, pH de 6 a 9, por exemplo, pH 8,0) podem ser usadas como uma solução de tampão. NaCl (50 a 300 mM, por exemplo, 150 mM) ou um tensoativo tal como CHAPS, ou octil β-D-glicopiranosida podem ser adicionados ao sistema de reação, se o aditivo não for limitado a estes.
[00129] Os Exemplos do substrato da HTRA1 protease incluem, mas não são particularmente limitados a, substratos endógenos, substratos exógenos, e substratos sintéticos. Os exemplos do substrato humano
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28/113 endógeno podem incluir vitronectina. Os exemplos do substrato sintético podem incluir, mas não são particularmente limitados a, H2-Opt (MeaIRRVSYSFK(Dnp)K), β-caseína, e outros substratos de HTRA1. A atividade inibidora de HTRA1 (IC50 ou KO do peptídeo da presente invenção é 1 μΜ ou inferior, mais preferivelmente de 100 nM ou inferior.
[00130] E preferido que o peptídeo de inibição da presente invenção não iniba ou suprima a atividade de uma protease outra que não da HTRA1, ou deve ter um grau relativamente fraco de inibição ou supressão de tal atividade. Em outras palavras, o peptídeo de inibição da presente invenção preferivelmente tem alta especificidade de HTRA1. Preferivelmente, o peptídeo de inibição da presente invenção não inibe ou suprime as atividades das proteases tais como tripsina, a-quimotripsina, triptase, plasmina, trombina, matriptase, proteína C, ativador do plasminogênio tissular (tPA), urocinase (uPA), plasmina, e calicreína plasmática, ou tem um grau relativamente fraco de inibição ou supressão de tais atividades. Tal peptídeo preferido da presente invenção não apresenta uma reação adversa causada pela inibição ou supressão das atividades de outras proteases e pode ser preferivelmente usado como um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para uma doença relacionada com a HTRA1 (mencionada mais tarde).
[00131] Como mencionado acima, a HTRA1 que é um alvo do peptídeo da presente invenção é preferivelmente derivada de vertebrado, mais preferivelmente derivado de mamífero, ainda mais preferivelmente derivado de primatas, e ainda mais preferivelmente derivado de humano. Alternativamente, a HTRA1 que é um alvo do peptídeo da presente invenção pode ser derivado de um animal não humano, por exemplo, um roedor tal como um rato ou um camundongo, ou um primata tal como um macaco cinomolgo, um sagui comum, ou um macaco rhesus. Um peptídeo tendo atividade inibidora contra HTRA1 derivado de um animal não humano pode
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29/113 ser usado no diagnóstico, exame, tratamento ou prevenção, etc. de uma doença relacionada com HTRA1 no animal não humano. Quando tal peptídeo também inibe a HTRA1 humana, o animal não humano pode ser usado: na pesquisa não clínica e desenvolvimento do peptídeo como um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para uma doença humana relacionada com HTRA1; ou para conduzir um teste farmacológico ou um teste farmacocinético usando o animal não humano como um modelo animal da doença; ou para conduzir um teste de segurança, um teste de toxicidade, ou outros, usando o animal não humano como um animal saudável.
[00132] O peptídeo que inibe a HTRA1 da presente invenção tem vantagens tais como: um peso molecular menor do que aquele de outras biomoléculas tais como anticorpos para o uso como medicamentos e fármacos de diagnóstico na técnica; a produção relativamente fácil (mencionada mais tarde) do mesmo; excelentes propriedades físicas em termos de penetração tissular, estabilidade no armazenamento, estabilidade térmica, e outros; e uma ampla faixa de escolha para a via de administração, método de administração, preparação, e outros para o uso como uma composição farmacêutica (mencionada mais tarde). A meia-vida no sangue do peptídeo da presente invenção usada como uma composição farmacêutica pode ser ajustada para ser mais longa aplicando-se um método conhecido tal como a adição de uma biomolécula ou um polímero e aumentando deste modo o peso molecular do peptídeo. O peso molecular de tal peptídeo que inibe a HTRA1 da presente invenção para menos do que 10.000, preferivelmente para menos do que 8.000, e mais preferivelmente cerca de 7.000 a 7.200. Uma porção de ciclo variável consistindo em 15Cys a 31Cys da SEQ ID NO: 23 (Figura 29) ou uma porção consistindo em 15Cys a 63Cys do mesmo (em seguida, referida como uma “porção contendo seis resíduos Cys”) e tendo atividade inibidora de HTRA1 também são incluídas no peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção. O peso molecular da porção de ciclo variável para menos do que
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2.500, e preferivelmente cerca de 1.800 a 2.000. 0 peso molecular da porção contendo seis resíduos Cys para menos do que 6.000, e preferivelmente cerca de 5.300 a 5.500.
[00133] A mutante do SPINK2 que pelo menos parcialmente mantém a estrutura de SPINK2 (em seguida, referida como a “mutante de SPINK2”), incluída no escopo do peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção, pode ligar-se a HTRA1 e é capaz de ligar-se preferivelmente à HTRA1 mamífera, mais preferivelmente HTRA1 primata, e ainda mais preferivelmente HTRA1 humana. Tal peptídeo, que se liga a HTRA1, reconhece ou se liga a um peptídeo parcial, uma configuração parcial, ou outros da HTRA1 (em seguida, tais efeitos de reconhecimento e ligação são coletivamente referidos como “atividade de ligação alvo”).
[00134] Em um aspecto, o peptídeo de inibição da presente invenção é capaz de ligar a um fragmento imunogênico de HTRA1. O fragmento imunogênico de HTRA1 tem um, dois ou mais epítopos, mimótopos ou outras determinantes antigênicas e é, portanto, capaz de induzir uma resposta imune ou é capaz de formar um anticorpo contra o fragmento a ser produzido.
[00135] A ligação do mutante de SPINK2 de acordo com a presente invenção para HTRA1 ou o fragmento imunogênico da mesma pode ser avaliada, medida ou determinada através do uso de um método conhecido a uma pessoa versada na técnica, tal como a medição da afinidade de ligação detectável (ELISA, análise de ressonância plasmônica superficial (em seguida, referida como “SPR”) (também referida como um método “BIAcore”), calorimetria de titulação isotérmica (em seguida, referida como “ITC”), citometria de fluxo, um método de imunoprecipitação, etc.).
[00136] Os exemplos do ELISA incluem um método que envolve detectar um peptídeo que inibe HTRA1 que reconheceu e ligado à HTRA1 imobilizada em uma placa. A imobilização da HTRA1 pode utilizar biotinaestreptavidina além de, por exemplo, um anticorpo para a imobilização que
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31/113 reconhece uma etiqueta fundida com HTRA1. A detecção do peptídeo que inibe HTRA1 pode utilizar a estreptavidina rotulada além de, por exemplo, um anticorpo rotulado para a detecção que reconhece uma etiqueta fundida com o peptídeo que inibe HTRA1. A rotulação pode utilizar a biotina além de um método possível na análise clínica bioquímica, tal como HRP, fosfatase alcalina, ou FITC. A detecção usando a rotulação automática pode utilizar um substrato cromogênico tal como TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina), BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila), p-NPP (fosfato de p-nitrofenila), OPD (o-fenilenodiamina), ABTS (ácido 3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico), ou Substrato Quimioluminescente de Pico SuperSignal ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc.), um substrato fluorescente tal como Substrato de Peroxidase Fluorogênico QuantaBlu® (Thermo Fisher Scientific Inc.), e um substrato quimioluminescente. A medição de um sinal de detecção pode utilizar um leitor de placa por absorbância, um leitor de placa fluorescente, um leitor de placa luminescente, um contador de cintilação líquida de RI, ou semelhantes. [00137] Os exemplos de um instnimento para o uso na análise de SPR podem incluir BIAcore® (GE Healthcare), ProteOn® (Bio-Rad Laboratories, Inc.), SPR-Navi® (Oy BioNavis Ltd.), Spreeta® (Texas Instruments Inc.), SPRi-PlexII(TM) (HORIBA, Ltd.), e Autolab SPR® (Metrohm AG). Os exemplos de um instnimento para o uso em BLI pode incluir Octet® (Pall Corp.).
[00138] Os Exemplos do método de imunoprecipitação incluem um método que envolve detectar o HTRA1 que foi reconhecido e ligado a um peptídeo que inibe a HTRA1 imobilizado nas esferas. As esferas magnéticas, esferas de agarose, ou semelhantes podem ser usadas como as esferas. A imobilização do peptídeo que inibe HTRA1 podem utilizar biotinaestreptavidina bem como um anticorpo que reconhece o peptídeo ou uma fundida a etiqueta com o peptídeo, proteína A ou proteína G, etc. As esferas são separadas usando um ímã, centrifugação, ou semelhantes, e a HTRA1
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32/113 precipitada com as esferas é detectada por SDS-PAGE ou Western blot. A detecção da HTRA1 pode utilizar estreptavidina rotulada, bem como, por exemplo, um anticorpo rotulado para a detecção que reconhece uma fundida a rótulo com HTRA1. A rotulação pode utilizar biotina bem como um método praticável na análise bioquímica, tal como HRP, alcalino fosfatase, ou FITC. A detecção usando rotulação enzimática pode utilizar o mesmo substrato como em ELISA. A medição de um sinal de detecção pode utilizar ChemiDoc® (Bio-Rad Laboratories, Inc.), LuminoGraph (ATTO Corp.), ou semelhantes.
[00139] Na presente invenção, o termo “reconhecimento específico”, isto é, “ligação específica”, é usado para significar a ligação que não seja a adsorção não específica. Os exemplos de um critério para determinar se a ligação é ou não é específica podem incluir a atividade de ligação de EC50 em ELISA. Outros exemplos dos critérios para determinação podem incluir a constante de dissociação (em seguida, referida como “Kd”). O valor Kd do peptídeo que inibe HTRA1 de acordo com a presente invenção para HTRA1 é de 1 x IO’4 M ou menor, 1 x 10'5 M ou menor, 5 x 10’° M ou menor, 2 x 10’6 M ou menor ou 1 x 10’6 M ou menor, more preferivelmente 5 x IO’7 M ou menor, 2 x IO’7 M ou menor ou 1 x IO'7 M ou menor, ainda mais preferivelmente 5 x 10’8 M ou menor, 2 x 10’8 M ou menor ou 1 x 10’8 M ou menor, ainda mais preferivelmente 5 x IO’9 M ou menor, 2 x IO'9 M ou menor ou 1 x IO’9 M ou menor. Outros exemplos do critério de determinação podem incluir os resultados das análises através de um método de imunoprecipitação. O peptídeo preferido que inibe HTRA1 de acordo com a presente invenção é imobilizado em esferas, e HTRA1 é adicionada a este. Depois, as esferas são separadas, e a HTRA1 precipitada com as esferas é detectada. Neste caso, o sinal de HTRA1 é detectado.
[00140] Apesar da descrição acima, a capacidade de ligar à HTRA1 ou ao fragmento imunogênico do mesmo não é essencial para a SPINK2 mutante
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33/113 servindo como o peptídeo de inibição da presente invenção contanto que o mutante de SPINK2 tenha atividade inibidora de HTRA1.
[00141] O peptídeo de inibição da presente invenção pode ser competiti vo na ligação de um substrato de protease à HTRA1.
[00142] Em alguns aspectos preferidos, o peptídeo de inibição da presente invenção tem um efeito protetivo da retina. Por exemplo, o inibidor preferido da presente invenção pode suprimir uma diminuição induzida pela exposição à luz na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa em um modelo de dano na retina induzido pela exposição à luz, que é descrito em detalhe nos Exemplos. Uma grande quantidade da proteína HTRA1 foi detectada no humor vítreo do grupo de exposição à luz deste modelo, se comparado com um grupo que não de exposição. Deste modo, a presente invenção divulga que: HTRA1 está envolvido no dano na retina; e a atividade inibidora de HTRA1 provoca um efeito protetivo da retina.
[00143] O SPINK2 mutante servindo como o peptídeo de inibição da presente invenção pode ter as atividades, as propriedades, as funções, as características, etc. como descrito acima, enquanto que sua sequência de aminoácidos de comprimento total tem uma alta identidade de sequência para a sequência de aminoácidos do SPINK2 tipo selvagem humano. O mutante de SPINK2 da presente invenção tem 60% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1: Figura 13) do SPINK2 humano.
[00144] O termo “identidade” é usado para significar uma propriedade que indica o grau de similaridade ou relação entre as duas sequências. A identidade (%) da sequência de aminoácidos é calculada dividindo-se o número de aminoácidos ou resíduos de aminoácidos idênticos pelo número total de aminoácidos ou resíduos de aminoácidos e multiplicando o valor numérico resultante por 100.
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34/113 [00145] O termo “lacuna” é usado para significar o espaço no alinhamento entre duas ou mais sequências como resultado da exclusão e/ou adição em pelo menos uma das duas ou mais sequências.
[00146] A identidade entre duas sequências de aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos completamente idêntica é de 100%. Contanto que uma das sequências de aminoácidos tenha a substituição, exclusão ou adição de um ou dois ou mais aminoácidos ou resíduos de aminoácidos se comparado com as outras sequências de aminoácidos, a identidade entre estas duas sequências de aminoácidos é menor do que 100%;. Os exemplos de um algoritmo ou um programa para determinar a identidade entre duas sequências em consideração de um lacuna pode incluir aqueles conhecidos a uma pessoa habilitada na técnica, tal como BLAST (Altschul, et al., Nucleic Acids Res., Vol. 25, p. 3389-3402, 1997), BLAST2 (Altschul, et al., J. Mol. Biol., Vol. 215, p. 403-410, 1990), e Smith-Waterman (Smith, et al., J. Mol. Biol., Vol. 147, p. 195-197, 1981).
[00147] Na presente invenção, o termo “mutado” é usado para significar que um, dois ou mais nucleotídeos ou resíduos de nucleotídeo ou aminoácidos ou resíduo de aminoácidos são substituídos, excluídos ou inseridos em uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de aminoácidos se comparado com uma molécula de ácido nucléico ou peptídeo de ocorrência natural. A sequência de aminoácidos do mutante de SPINK2 da presente invenção tem um, dois ou mais aminoácidos ou resíduos de aminoácido mutados quando comparada com a sequência de aminoácidos do SPINK2 humano.
[00148] Em um aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácidos do mutante de SPINK2 pode ter qualquer uma de:
a substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos de 16Ser a 22Gly através de outros aminoácidos ou resíduos de aminoácidos;
a substituição de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos de 24Pro a 28Asn
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35/113 por outros aminoácidos ou resíduo de aminoácidos;
a substituição de 1 ou 2 aminoácidos de 39Ala e 43Thr por outros aminoácidos ou resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1: Figura 13) do SPINK2 humano, ou pode ter estes aminoácidos como aqueles do tipo selvagem (os 2 aminoácidos ou resíduos de aminoácidos são incluídos em uma hélice a) contanto que a estrutura temária da cadeia principal de uma alça constituída pelos resíduos de aminoácidos nas posições de 16 a 30, etc. seja capaz de exercer pelo menos parcialmente a atividade inibidora de HTRA1; cada um de 15Cys, 23Cys, 31Cys, 42Cys, 45Cys e 63Cys é preferivelmente Cys, como no tipo selvagem, de modo a manter as ligações de dissulfeto. 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 do mesmo podem ser substituídos com outros aminoácidos de modo a excluir as ligações de dissulfeto naturais ou gerar uma ligação de dissulfeto não natural. Alguns peptídeos preferidos que inibem as HTRA1 entre as mutantes de SPINK2 da presente invenção mantêm a Cys netas 6 posições, como no SPINK2 natural, e retêm as ligações de dissulfeto. Em alguns casos, as formas mais preferidas de tal peptídeo de inibição, 15Cys-45Cys, 23Cys42Cys, e 31Cys-63Cys respectivamente formam ligações de dissulfeto.
[00149] Quando a sequência de aminoácidos de tal mutante de SPINK2 está contida no peptídeo que inibe a HTRA1, é preferido que uma estrutura tridimensional constituída, por exemplo, de uma estrutura de laço consistindo em 16Ser a 30Val, a folha β constituída pelo filamento β (1) consistindo em 31Cys e 32Gly e o filamento β (2) consistindo em 57Ile a 59Arg, a hélice α consistindo em 41Glu a 51Gly, ou uma estrutura de laço, folha β, ou hélice α similar a estes ou pelo menos parcialmente correspondendo a estes (ou a estas posições), contida na sequência de aminoácidos do SPINK2 do tipo selvagem deve ser mantida até o grau em que a atividade inibidora de HTRA1 possa ser exercida.
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36/113 [00150] As sequências de aminoácidos de alguns peptídeos que inibem as HTRAls entre as mutantes de SPINK2 da presente invenção serão mencionadas abaixo. Como mencionado acima, na presente invenção, o termo “resíduo de aminoácido” é também simplesmente referido como um “aminoácido”.
[00151] Cada um do primeiro até o décimo primeiro Xaa (que são os mesmos de XI a XI1, respectivamente) na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42) é qualquer um aminoácido arbitrário sem limitações particulares contanto que a mutante resultante se ligue à HTRA1 e iniba a atividade de HTRA1. Em seguida, os aminoácidos preferidos de XI a XI1 serão descritos. Contudo, estes aminoácidos podem incluir os aminoácidos naturais, isto é, aminoácidos idênticos àqueles na sequência de aminoácidos da SPINK2 humana do tipo selvagem.
[00152] XI na posição 1 é preferivelmente Asp, Glu, Gly, Ser ou Ile, more preferivelmente Asp ou Gly, e ainda mais preferivelmente Gly:
X2 na posição 16 é preferivelmente Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gin, Arg, Ser, Thr ou Tyr, mais preferivelmente Ala, Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gin, Arg, Ser ou Thr, ainda mais preferivelmente Ala, Gly, Lys, Leu, Ser ou Thr, mais preferivelmente Ala, Gly, Leu, Ser ou Thr, e ainda mais preferivelmente Ala ou Ser:
X3 na posição 17 é preferivelmente Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr ou Tyr, mais preferivelmente Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr ou Tyr, ainda mais preferivelmente Asp, His, Lys, Met ou Gin, e ainda mais preferivelmente Asp ou Gin:
X4 na posição 18 é preferivelmente Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr, mais preferivelmente Asp, Phe, His, Met, Asn, Gin, Ser ou Tyr, ainda mais preferivelmente Asp, Phe, His, Ser ou Tyr, e ainda mais preferivelmente Phe
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37/113 ou His;
X5 na posição 19 é preferivelmente Ala, Asp, Glu, Gly, His, lie, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr, mais preferivelmente Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser ou Vai, ainda mais preferivelmente Ala, Asp, Glu, Met ou Asn, e ainda mais preferivelmente Ala, Asp ou Glu;
X6 na posição 21 é preferivelmente Ala, Glu, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Gin, Arg, Ser, Trp ou Tyr, mais preferivelmente Glu, Phe, Ile, Leu, Met, Gin, Arg ou Trp, ainda mais preferivelmente Met ou Trp, ainda mais preferivelmente Met;
X7 na posição 24 é preferi velmente Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr, mais preferivelmente Asp, Glu, His, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr, ainda mais preferivelmente Gin, Trp, Tyr ou Vai, e ainda mais preferivelmente Tyr ou Vai;
X8 na posição 26 é preferivelmente Ala, Asp, Glu, Phe, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Vai ou Tyr, mais preferivelmente Ala, Phe, His, lie, Leu, Met, Gin, Arg, Ser, Vai ou Tyr, ainda mais preferivelmente Phe, Leu ou Tyr, e mais preferivelmente Phe ou Leu;
X9 na posição 27 é preferivelmente Glu, Phe, Leu, Ser, Thr ou Tyr, mais preferivelmente Phe, Leu, Ser, Thr ou Tyr, ainda mais preferivelmente Phe ou Tyr, mais preferivelmente Tyr;
X10 na posição 39 é preferivelmente Ala, Glu, Met ou Vai, e mais preferivelmente Ala ou Glu; e
XI1 na posição 43 é preferivelmente Ala, Thr ou Vai, mais preferivelmente Thr ou Vai.
[00153] XI a XI1 do tipo selvagem são Asp, Ser, Gin, Tyr, Arg, Pro, Pro, His, Phe, Ala e Thr, respectivamente. A posição 20 é Leu, a posição 22 é Gly, a posição 25 é Arg, e a posição 28 é Asn.
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38/113 [00154] Na presente invenção, um, vários ou mais aminoácidos também podem ser adicionados ao lado de terminal N do primeiro aminoácido. Os exemplos de tais aminoácidos a ser adicionados podem incluir Ser-Leu, e uma sequência de aminoácidos consistindo em etiqueta S e um ligante (SEQ ID NO: 31: Figura 43).
[00155] Um ou vários aminoácidos também podem ser adicionados à 63Cys posicionada no terminal C. Os exemplos de tal sequência de aminoácidos podem incluir uma sequência de aminoácidos tendo 64Gly no terminal C, e uma sequência de aminoácidos tendo 65Gly no terminal C através da adição de Gly-Gly. Os exemplos de tal aminoácido a ser adicionado podem incluir Gly-Gly, e um hexâmero de terminal C (SEQ ID NO: 32: Figura 44).
[00156] Uma forma mais preferida de uma sequência de aminoácidos preparada através da adição de outros aminoácidos ao terminal N e/ou terminal C da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42) ou uma sequência de aminoácidos derivada da SEQ ID NO: 30 inclui uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5,
7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 a 29 (Figuras 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35 a 41) e uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 6,
8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22 (Figuras 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 34). Ainda uma forma mais preferida do mesmo inclui uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 24, 28 e 29 (Figuras 36, 40 e 41).
[00157] Na presente invenção, um peptídeo preparado pela substituição, adição e/ou exclusão de um ou dois ou mais aminoácidos no, ao ou do peptídeo mutante SPINK2 ou o aduto terminal N e/ou terminal C do peptídeo mutante SPINK2 (em seguida, referido como um “peptídeo precursor”) é referido como um “derivado do peptídeo precursor” ou um
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39/113 “derivado de peptídeo precursor” (por exemplo, Exemplo 6). Tal “derivado” também é incluído no escopo do “peptídeo” da presente invenção.
[00158] A sequência de aminoácidos do mutante de SPINK2 incluída no escopo do peptídeo de inibição da presente invenção pode compreender um aminoácido natural ou um aminoácido mutado ou sequência de aminoácidos nas porções outras que não de XI a XI1, isto é, as posições de 2Pro a 15Cys, 20Pro, 22Gly, 23Cys, 25Arg, 28Asn a 38Tyr, 41Glu, 42Cys e 44Thr a 63Cys, na sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1: Figura 13) do SPINK2 humano tipo selvagem. Por exemplo, o mutante de SPINK2 pode ter uma mutação em uma, duas ou mais posições contanto que a atividade inibidora de HTRA1 ou dobra pelo menos não seja parcialmente por ela nem impedida nem obstruída. Tal mutação é obtida através do uso de um método padrão conhecido àquele versado na técnica. Os exemplos típicos da mutação na sequência de aminoácidos podem incluir a substituição, exclusão ou adição de um ou dois ou mais aminoácidos. Os exemplos da substituição podem incluir a substituição conservativa. A substituição conservai iva substitui um certo resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido similar a este em características químicas em termos não somente de volume mas também de polaridade. Os exemplos da substituição conservativa são descritos em outra parte do presente relatório descritivo. Por outro lado, as porções outras que não XI a XII podem aceitar a substituição não conservativa de um, dois ou mais aminoácidos contanto que a atividade inibidora de HTRA1 ou dobra pelo menos não seja por esta nem impedida nem obstruída.
[00159] Na sequência de aminoácidos do mutante de SPINK2 que serve como o peptídeo de inibição da presente invenção, XI a XI1 são preferivelmente aminoácidos de XI a XI1, respectivamente, em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 a 29 (Figura 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35 a 41), e mais preferivelmente as SEQ ID NOs: 24, 28 e 29 (Figuras 36, 40 e a 41), e as porções outras que não XI a
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XI1 pode ter um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos que pelo menos parcialmente nem interfere ou obstrui a atividade inibidora de HTRA1 ou dobra.
[00160] Os Exemplos da sequência de aminoácidos do mutante de SPINK2 que serve como o peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção podem incluir qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos de (a) a (e):
(a) uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, e 23 a 29 (Figuras 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33, e 35 a 41);
(b) uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições severas para uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos (a) e codifica uma sequência de aminoácidos compreendida em um peptídeo tendo atividade inibidora de HTRA1;
(c) uma sequência de aminoácidos que é derivada da sequência de aminoácidos (a) através da substituição, exclusão, adição e/ou inserção de 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 ou 2, ou 1 aminoácido e compreendida em um peptídeo tendo atividade inibidora de HTRA1;
(d) uma sequência de aminoácidos que tem 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou maios de identidade à sequência de aminoácidos (a) e é compreendida em um peptídeo tendo atividade inibidora de HTRA1; e (e) uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22 (Figuras 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 34). [00161] Contudo, a molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1 não é limitado a (a) a (e). Cada molécula de ácido nucléico
Petição 870190065362, de 11/07/2019, pág. 46/119 / 113 compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos contida em um mutante de SPINK2 tendo atividade inibidora de HTRA1, e preferivelmente a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42), é incluída no escopo da molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1.
[00162] Uma mutação pode ser introduzida ao peptídeo de inibição da presente invenção com o propósito de melhorar sua capacidade de dobra, estabilidade térmica, estabilidade no armazenamento, meia-vida no sangue, solubilidade da água, atividade biológica, atividade farmacocinética, efeito secundário, etc. Por exemplo, um novo grupo reativo tal como Cys pode ser introduzido a este através de uma mutação de modo a conjugar o peptídeo de inibição a uma substância adicional talo como polietileno glicol (PEG), amido de hidróxi-etila (HES), biotina, um peptídeo ou uma proteína. Na presente invenção, o peptídeo que inibe HTRA1 pode ser adicionado, unido, ou ligado a uma porção adicional. Tais conjugados são coletivamente referidos como um “conjugado do peptídeo que inibe HTRA1”. Na presente invenção, o termo “conjugado” é usado para significar uma molécula do peptídeo da presente invenção ou um fragmento do mesmo, adicionado, unido ou ligado a uma porção adicional. O termo “conjugado” ou “conjugação” inclui uma forma na qual uma certa porção é unida ou ligada, por intermédio de um agente ou outros, adequados para a ligação de certa porção da cadeia lateral de um aminoácido, incluindo uma substância química, tal como um agente de reticulação, ao terminal N e/ou terminal C do peptídeo da presente invenção através de um método químico sintético, um método de engenharia genética, ou semelhantes. Os exemplos de tal “porção” para melhorar a meia-vida no sangue podem incluir as moléculas de polialquileno glicol tais como polietileno glicol (PEG), amido de hidróxi-etila, moléculas de ácido graxo tal como ácido palmítico, regiões de imunoglobulina Fc, domínios de imunoglobulina CH3, domínios de imunoglobulina CH4, albumina ou
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42/113 fragmentos desta, peptídeos de ligação à albumina, proteínas de ligação à albumina tais como proteína estreptocócica G, e transferrina. Altemativamente, a “porção” pode ser unida ao peptídeo da presente invenção por intermédio de um ligante tal como um ligante de peptídeo.
[00163] O peptídeo que inibe HTRAl da presente invenção pode ser conjugado com um fármaco adicional de modo a exercer ou aumentar a atividade farmacocinética. No campo dos anticorpos, uma técnica ou uma forma conhecida a uma pessoa versada na técnica como conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) constituem alguns aspectos da presente invenção através da substituição do anticorpo com o peptídeo da presente invenção.
[00164] O peptídeo que inibe a HTRAl da presente invenção também pode compreender uma, duas ou mais porções que exercem afinidade de ligação, atividade inibidora, atividade antagonista, atividade agonista, ou semelhantes contra uma molécula alvo outra que não HTRAl, ou pode ser conjugado com tais porções. Os exemplos da “porção” podem incluir anticorpos ou fragmentos do mesmo, e as proteínas tendo uma estrutura que não de anticorpo, tal como mutante de SPINK2s, ou fragmentos do mesmo. No campo dos anticorpos, uma técnica ou uma forma conhecida a uma pessoa versada na técnica como anticorpos multiespecíficos e anticorpos biespecíficos constituem alguns aspetos do conjugado da presente invenção através da substituição de pelo menos um, dois ou mais “anticorpos” aqui compreendidos com o peptídeo da presente invenção.
[00165] O peptídeo da presente invenção ou um precursor do mesmo pode compreender uma sequência de sinais. Uma sequência de sinais presente no ou adicionada ao terminal N de um certo polipeptídeo ou um precursor do mesmo é útil para liberar o polipeptídeo a um compartimento específico de uma célula, por exemplo, o periplasma de E. coli ou o retículo endoplasmático de uma célula eucariótica. Muitas sequências de sinais são conhecidas àquele versado na técnica, e a sequência de sinais pode ser
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43/113 selecionada de acordo com as células hospedeiras. Os exemplos da sequência de sinais para see retar o peptídeo desejado no periplasma de E. coli podem incluir OmpA. A forma compreendendo a sequência de sinais também pode ser incluída em alguns aspectos do conjugado da presente invenção.
[00166] O peptídeo da presente invenção pode ser rotulado de antemão e deste modo purificado através da cromatografia de afinidade. O peptídeo da presente invenção pode compreender, por exemplo, biotina, Strep tag®, Strep tag II®, oligo-histidina tal como His6, poli-histidina, um domínio de imunoglobulina, uma proteína de ligação à maltose, glutationa-S-transferase (GST), um peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), um hapteno tal como digoxigenina ou dinitrofenol, um etiqueta epitópico tal como FLAG®, etiqueta myc, ou etiqueta HA (em seguida, coletivamente referidos como um “etiqueta de afinidade”) neste terminal C. A forma rotulada também pode ser incluída em alguns aspectos do conjugado da presente invenção. O conjugado da presente invenção pode ser um peptídeo (polipeptídeo) como um todo.
[00167] O peptídeo da presente invenção pode compreender uma porção para rotulação. Especificamente, o peptídeo da presente invenção pode ser conjugado a uma porção de rótulo tal como um rótulo enzimático, um radiorrótulo, um rótulo colorido, um rótulo fluorescente, um rótulo de cor, um rótulo luminescente, um hapteno, digoxigenina, biotina, um complexo metálico, um metal, ou ouro coloidal. A forma compreendendo a porção para rotulação também pode ser incluída em alguns aspectos do conjugado da presente invenção.
[00168] O peptídeo de inibição da presente invenção pode compreender qualquer um dos aminoácidos naturais e aminoácidos não naturais na usa porção peptídica e pode compreender um L-aminoácido e um D-aminoácido como um aminoácido natural.
[00169] A sequência de aminoácidos do peptídeo de inibição da presente invenção pode compreender qualquer um dos aminoácidos naturais e
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44/113 aminoácidos não naturais e pode compreender um L-aminoácido e um Daminoácido como um aminoácido natural.
[00170] O peptídeo de inibição da presente invenção pode estar presente como um monômero, um dímero, ou um trímero ou oligômero ou multímero maior. O dímero ou o trímero ou oligômero ou multímero maiores podem ser qualquer um de uma forma homo constituída pelos monômeros únicos, e uma forma hetero constituída por dois ou mais monômeros diferentes. O monômero pode ser rapidamente espalhado e ser excelente em permeação nos tecidos, por exemplo. O dímero, o oligômero e o multímero podem ter um excelente aspecto, por exemplo, alta afinidade local ou atividade de ligação para uma molécula alvo, uma taxa de dissociação lenta, ou alta atividade inibidora de HTRA1. Além da dimerização espontânea, oligomerização e multi merização, dimerização intencionada, oligomerização e multimerização são obtidas introduzindo-se um domínio jun-fos, zíper de leucina, ou semelhantes ao peptídeo de inibição da presente invenção.
[00171] O peptídeo de inibição da presente invenção pode ligar a uma, duas ou mais moléculas alvo ou inibir a atividade das moléculas alvo, na forma de um monômero, um dímero, ou um trímero ou oligômero ou multímero maior.
[00172] Os Exemplos da forma que pode ser tomada pelo peptídeo de inibição da presente invenção podem incluir, mas não são limitados a, formas isoladas (preparações secadas por congelamento, soluções, etc.), os conjugados mencionados acima, e as formas ligadas a outras moléculas (formas imobilizadas, associadas com uma molécula diferente, forma ligação a uma molécula alvo, etc.). Uma forma compatível com a expressão, purificação, uso, armazenamento, ou semelhantes pode ser arbitrariamente selecionada.
3. Identificação do peptídeo que inibe HTRA1 [00173] O peptídeo que inibe HTRA1 pode ser identificado através de
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45/113 um método bem conhecido àquele versado na técnica usando um material de partida tal como a sequência de aminoácidos de SPINK2 ou a sequência de aminoácidos (por exemplo, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 a 29, ou do grupo consistindo nas Figuras 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35 a 41) do peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção, uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos, ou uma molécula de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeo. Como um exemplo preferido, o peptídeo que inibe HTRA1 pode ser identificado a partir de uma biblioteca de mutante de SPINK2 humano usando-se a atividade inibidora de HTRA1 como um indicador que pode ser combinado com a atividade de ligação de HTRA1 como outro indicador.
[00174] Por exemplo, a molécula de ácido nucléico servindo como um material de partida pode ser submetida à mutagênese e transferida em um hospedeiro bacteriano apropriado ou hospedeiro eucariótico através do uso de uma técnica de DNA recombinante. A biblioteca de mutante de SPINK2 é conhecida como uma técnica para identificar um aglutinante ou um inibidor de uma molécula alvo. Por exemplo, a divulgação da W02012/105616 também é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Após a expressão da sequência mutagenizada de nucleotídeos no hospedeiro apropriado, um clone em que uma mutante de SPINK2 tendo as propriedades, atividade, função, etc. desejadas são unidas ao seu genótipo pode ser enriquecido e/ou selecionado da biblioteca e identificado. O enriquecimento e/ou seleção do clone utiliza um método conhecido àquele versado na técnica, tal como um método de demonstração em bactéria (Francisco, J.A., et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 90, p. 10444-10448), um método de demonstração em levedura (Boder, E.T., et al., (1997), Nat. Biotechnol., Vol. 15, p. 553-557), um método de demonstração em célula mamífera (Ho M, et al., (2009), Methods Mol Biol., Vol. 525: p. 337-52), um método de
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46/113 demonstração em fago (Smith, G.P. (1985), Science., Vol. 228, p. 13151317), um método de demonstração em ribossomo (Mattheakis LC, et al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. Vol. 91, No. 19, p. 9022-9029), um método de demonstração em ácido nucléico tal como a demonstração em mRNA (Nemoto N, et al., (1997), FEBS Lett., Vol. 414, No. 2, p. 405-408), ou um método de triagem de colônia (Pini, A. et al., (2002), Comb. Chem. High Throughput Screen., Vol. 5, p. 503-510). As sequências de nucleotídeos de uma mutante de SPINK2 contida no clone deste modo selecionadas e identificadas podem ser determinadas para determinar uma sequência de aminoácidos codificada pelas sequências de nucleotídeos como a sequência de aminoácidos do mutante de SPINK2 contido no clone, isto é, o peptídeo que inibe HTRA1.
[00175] A mutante de SPINK2 da presente invenção pode ser obtida, por exemplo, através da mutagênese do SPINK2 natural. O termo “mutagênese” é usado para significar que um, dois ou mais aminoácidos nas suas respectivas posições de uma certa sequência de aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos ou excluídos, ou um aminoácido ausente da sequência de aminoácidos pode ser adicionado ou inserido nesta. Tal exclusão ou tal adição ou inserção podem mudar o comprimento da sequência. No mutante de SPINK2 da presente invenção, a mutagênese pode preferivelmente ocorrer em uma, duas ou mais posições de XI a XI1 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42).
[00176] Contudo, uma forma que mantém, depois de tal mutagênese preferida, aminoácidos naturais em uma, duas ou mais posições de XI a XI1, isto é, o mesmo aminoácido como aquele presente na posição específica na sequência de aminoácidos natural, também é incluído no escopo do mutante contanto que pelo menos um aminoácido seja mutado no todo. Igualmente, em um aspecto da presente invenção, uma forma que mantém, depois da mutagênese em uma ou mais posições de porções outras que não de XI a
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XI1, aminoácidos naturais nestas posições, isto é, o mesmo aminoácido como aquele presente na posição específica na sequência de aminoácidos natural, também é incluída no escopo do mutante contanto que pelo menos um aminoácido seja mutado no todo.
[00177] O termo “mutagênese aleatória” é usado para significar que como para uma posição específica em uma sequência, um, dois ou mais aminoácidos diferentes são introduzidos com uma dada probabilidade para a posição pela mutagênese. As probabilidades de introdução de pelo menos dois aminoácidos diferentes podem nem sempre ser as mesmas. A presente invenção não exclui os ditos pelo menos dois aminoácidos diferentes de incluir o aminoácido que ocorre naturalmente (como um dos aminoácidos). Um tal caso também é incluído no escopo do termo “mutagênese aleatória”.
[00178] Um método padrão conhecido por uma pessoa versada na técnica pode ser usado como um método para a mutagênese aleatória em uma posição específica. A mutagênese pode ser atingida, por exemplo, pela PCR (reação da cadeia da polimerase) usando uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos incluindo uma composição de nucleotídeo degenerada em uma posição específica em uma sequência. Por exemplo, o uso de códon NNK ou NNS (N - adenina, guanina, citosina ou timina; K = guanina ou timina; e S ~ guanina ou citosina) causa mutagênese para introduzir qualquer um de todos os 20 aminoácidos naturais assim como um códon de parada, enquanto que o uso de códon WS (V ~ adenina, guanina ou citosina) elimina a possibilidade de introduzir Cys, He, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr e Vai e causa mutagênese para introduzir qualquer um dos 12 aminoácidos naturais remanescentes. Por exemplo, o uso de códon NMS (M - adenina ou citosina) elimina a possibilidade de introduzir Arg, Cys, Gly, He, Leu, Met, Phe, Trp e Vai e causa mutagênese para introduzir qualquer um dos 11 aminoácidos naturais remanescentes. Um códon específico, um códon artificial, ou semelhantes podem ser usados para mutagênese para introduzir um aminoácido não
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48/113 natural.
[00179] A mutagênese sítio-dirigida também pode ser realizada através do uso de informação estrutural sobre um alvo contendo uma conformação e/ou um peptídeo contra o alvo ou um peptídeo do tipo selvagem a partir do qual o peptídeo é derivado. Na presente invenção, uma mutação sítio-dirigida pode ser introduzida através do uso de informação estrutural incluindo informação de ordem superior sobre o HTRA1 alvo e/ou um mutante de SPINK2 contra o alvo ou SPINK2 do tipo selvagem, ou um complexo entre eles. Em um exemplo, um mutante de SPINK2 tendo atividade inibidora de HTRA1 é identificado. Subsequentemente, um complexo cristalino de HTRA1 e o mutante de SPINK2 é obtido e submetido à cristalografia de raios-X. Com base nos resultados da, um sítio na molécula HTRA1 à qual o mutante de SPINK2 se liga, e um resíduo de aminoácido no mutante de SPINK2 envolvido na interação com o sítio são identificados. A correlação de informação estrutural obtida através de tais procedimentos com atividade inibidora de HTRA1 pode ser verificada. Com base em tal correlação de estrutura-atividade, a substituição de um aminoácido em uma posição específica por um aminoácido específico, a inserção ou exclusão de um aminoácido a uma posição específica, ou semelhantes pode ser planejada para de fato confirmar a atividade de HTRA1.
[00180] A mutagênese também pode ser atingida usando, por exemplo, uma unidade constituinte de nucleotídeo com especificidade de par de bases modificada, tal como inosina.
[00181] Além disso, a mutagênese em uma posição aleatória é alcançada, por exemplo, pela PCR propensa a erro usando DNA polimerase, tal como Taq DNA polimerase, que carece de uma função que corrige erro e produz uma alta taxa de erros, ou mutagênese química.
[00182] O peptídeo que inibe HTRA1 pode ser enriquecido e/ou selecionado de uma biblioteca, tal como uma biblioteca de fago ou uma
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49/113 biblioteca de colônia, que seja adequada para o respecti vo método de triagem e conhecida por uma pessoa versada na técnica, através do uso de demonstração em bactéria, demonstração em levedura, demonstração em célula mamífera, demonstração em fago, demonstração em ribossoma, demonstração em ácido nucléico, triagem de colônia, ou semelhantes. Estas bibliotecas podem ser construídas usando um vetor e um método, tal como um fagomídeo para a biblioteca de fago ou um cosmídeo para a triagem de colônia, que sejam adequados para cada biblioteca e conhecidos por uma pessoa versada na técnica, um tal vetor pode ser um vírus ou vetor viral que infecte células procarióticas ou células eucarióticas. Estes vetores recombinantes podem ser preparados por um método conhecido por uma pessoa versada na técnica, tal como pela manipulação genética.
[00183] A demonstração em bactéria é uma técnica de fundir uma proteína desejada com, por exemplo, uma porção da lipoprotein a da membrana externa da E. coli (Lpp) e proteína da membrana externa OmpA, e demonstrar a proteína desejada na superfície da E. coli. Um grupo de DNA obtido pela mutagênese aleatória de uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos de uma certa proteína é inserido em vetores adequados para a demonstração em bactéria, e as células bacterianas podem ser transformadas com os vetores para se obter uma biblioteca demonstrando um grupo de proteínas randomicamente mutagenizadas na superfície da célula bacteriana transformada (Francisco, J.A., et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 90, p. 10444-10448).
[00184] A demonstração em levedura é uma técnica de fundir uma proteína desejada com uma proteína de revestimento tal como a-aglutinina que está sobre a superfície celular de levedura, e demonstrando a proteína desejada na superfície de levedura. A α-aglutinina compreende uma região hidrofóbica de terminal C com um sinal de fixação de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) putativo, uma sequência de sinais, um domínio
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50/113 ativo, um domínio de parede celular, e outros. A proteína desejada pode ser demonstrada sobre a superfície celular de levedura pela manipulação da mesma. Um grupo de DNA obtido pela mutagênese aleatória de uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos de uma certa proteína é inserido dentro de vetores adequados para a demonstração em levedura, e as células de levedura podem ser transformadas com os vetores para se obter uma biblioteca demonstrando um grupo de proteínas aleatoriamente mutagenizadas sobre a superfície celular de levedura transformada (Ueda, M. & Tanaka, A., Biotechnol. Adv., Vol. 18, p. 121-, 2000; Ueda, M. & Tanaka, A., J. Biosci. Bioeng., Vol. 90, p. 125-, 2000; etc.).
[00185] A demonstração em célula animal é uma técnica de fundir uma proteína desejada com, por exemplo, a região de transmembrana de uma proteína de membrana tipificada pelo receptor do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR), e demonstrando a proteína desejada sobre a superfície de células de mamífero (por exemplo, células HEK293 e do ovário do hamster chinês (CHO)). Um grupo de DNAs obtido pela mutagênese aleatória de uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos de uma certa proteína é inserido dentro de vetores adequados para demonstração em célula animal, e as células de animal podem ser transfectadas com os vetores para se obter uma biblioteca demonstrando um grupo de proteínas aleatoriamente mutagenizadas na superfície de células de animal transfectadas (Ho M, et al., (2009), Methods Mol Biol. Vol. 525: p. 337-52).
[00186] A biblioteca desejada demonstrada nas células tais como células de levedura, células bacterianas, ou células animais pode ser incubada na presença de uma molécula alvo ou contatada com uma molécula alvo. Por exemplo, as células envolvendo a biblioteca são incubadas durante um tempo dado com HTRA1 modificada com biotina ou semelhantes. Depois, um
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51/ 113 suporte tal como grânulos magnéticos é adicionado a ele, e as células são separadas do suporte. Subsequentemente, o suporte pode ser lavado para efetuar a remoção de matéria não específica adsorvida e matéria ligada de modo a recuperar um grupo de células demonstrando um peptídeo, uma coleção de peptídeos ou uma coleção de peptídeos enriquecida ligados ao suporte (que tem HTRA1 ligada a ele). Igualmente, o grupo de célula demonstrando um peptídeo, uma coleção de peptídeos ou uma coleção de peptídeos enriquecida ligados ao suporte (que tem HTRA1 ligada a ele), ou o grupo de célula demonstrando um peptídeo, uma coleção de peptídeo ou uma coleção de peptídeo enriquecida ligados à HTRA1, podem ser recuperados pela classificação de célula ativada magnética (MACS) depois da adição dos grânulos magnéticos, ou pela FACS depois do tingimento de célula usando um anticorpo anti-HTRAl, respectivamente. Um sítio de adsorção não específica e/ou sítio de ligação podem ser bloqueados (saturados), por exemplo. A etapa de bloqueio pode ser aqui incorporada contanto que o bloqueio seja realizado por um método apropriado. O vetor expresso do peptídeo, coleção de peptídeo ou uma coleção de peptídeo enriquecida assim obtido é recuperado, e a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo inserida dentro do vetor pode ser determinada para determinar a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeo. Além disso, o vetor pode ser transferido mais uma vez dentro de células hospedeiras, e um ciclo da operação mencionada acima pode ser repetido uma vez a diversas vezes para altamente enriquecer uma coleção de peptídeo que se liga à molécula alvo.
[00187] No caso de demonstração em fago, por exemplo, o fagomídeo é um plasmídeo bacteriano contendo uma origem de replicação de plasmídeo assim como a segunda origem de replicação derivada de um bacteriófago de filamento único. Uma célula tendo o fagomídeo pode replicar o fagomídeo por meio de um modo de replicação de filamento único pela coinfecção com
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M13 ou um bacteriófago auxiliar similar a este. Especificamente, o DNA de fagomídeo de filamento único é empacotado em uma partícula infecciosa revestida com uma proteína de revestimento de bacteriófago. Deste modo, o DNA de fagomídeo pode ser formado como um clone de plasmídeo de DNA de filamento duplo em uma bactéria infectada, ao passo que o fagomídeo pode ser formado como uma partícula tipo bacteriófago a partir de um sobrenandante de cultura de células coinfectadas. A partícula tipo bacteriófago é injetada em uma bactéria tendo pelo F para a infecção da bactéria com o DNA de modo que a própria partícula possa ser reformada como um plasmídeo.
[00188] Um gene de fusão compreendendo um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos de um peptídeo de teste e um gene da proteína de revestimento de bacteriófago é inserido no fagomídeo, e uma bactéria é infectada com o fagomídeo resultante. As células são cultivadas de modo que o peptídeo possa ser expresso ou demonstrado na bactéria ou sobre uma partícula tipo fago, ou possa ser produzido como uma proteína de fusão com a proteína de revestimento em uma partícula de fago ou em um sobrenandante de cultura da bactéria.
[00189] Por exemplo, um gene de fusão compreendendo o polinucleotídeo e a proteína de revestimento do gene de bacteriófago gpIII é inserida no fagomídeo, e a E. coli é coinfectada com o fagomídeo resultante e Ml3 ou um fago auxiliar similar a este de modo que uma proteína de fusão compreendendo o peptídeo e a proteína de revestimento possa ser produzida e liberada no sobrenandante de cultura da E. coli.
[00190] No caso de usar vários vetores circulares ou não circulares, por exemplo, um vetor viral, ao invés do fagomídeo, um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo inserida no vetor pode ser expresso ou demonstrado nas
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53/113 células ou partículas tipo vírus que abrigam o vetor, ou pode ser produzido e liberado no sobrenandante de cultura das células, de acordo com um método conhecido por uma pessoa versada na técnica.
[00191] A biblioteca expressando peptídeo assim obtida pode ser incubada na presença de uma molécula alvo, ou contatada com uma molécula alvo. Por exemplo, um suporte imobilizado com HTRA1 é incubado durante um dado tempo com uma fase móvel contendo a biblioteca. Depois, a fase móvel é separada do suporte. Subsequentemente, o suporte é lavado para efetuar a remoção de matéria adsorvida não específica e matéria ligada. Um peptídeo, uma coleção de peptídeo ou um uma coleção de peptídeo enriquecida ligados ao suporte (que tem HTRA1 ligada a ele) pode ser recuperado pela elução. A elução pode ser não seletivamente realizada, por exemplo, na presença de força iônica relativamente alta, pH baixo, condições de desnaturação moderada, ou sal caotrópico, ou pode ser seletivamente realizada adicionando-se uma molécula alvo solúvel tal como HTRA1, um anticorpo que se liga à molécula alvo, um ligante natural, um substrato, ou semelhantes e competindo com uma molécula alvo imobilizada. Um sítio de adsorção não específico e/ou sítio de ligação podem ser bloqueados, por exemplo. A etapa de bloqueio pode ser aqui incorporada contanto que o bloqueio seja realizado por um método apropriado.
[00192] O vetor do peptídeo expresso, coleção de peptídeos ou uma coleção de peptídeos enriquecida assim obtidos é recuperado, e a sequência de nucleotideos do polinucleotídeo inserida no vetor pode ser determinada para determinar uma sequência de aminoácidos codificada pela sequencia de nucleotídeo. Além disso, o vetor pode ser transferido mais uma vez em células hospedeiras, e um ciclo da operação mencionada acima pode ser repetido uma vez a várias vezes para altamente enriquecer uma coleção de peptídeos que se ligue à molécula alvo.
[00193] A demonstração em ribossoma é uma técnica de usar, por
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54/113 exemplo, mRNA que codifica uma proteína desejada e carece de um códon de parada, e um sistema de síntese de proteína livre de célula, e sintetizando deste modo in vitro uma molécula da proteína desejada, o seu mRNA correspondente, e um ribossoma unidos entre si. Uma biblioteca demonstrando um grupo de proteínas aleatoriamente mutagenizado nos ribossomas pode ser obtida através do uso de um grupo de mRNA obtido pela mutagênese aleatória de uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos de uma certa proteína, e um sistema de síntese de proteína livre de célula (Mattheakis LC, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. Vol. 91, No. 19, p. 9022-9029).
[00194] A demonstração em ácido nucléico, também chamada de demonstração em mRNA, é uma técnica de usar, por exemplo, um ligante tal como puromicina estruturalmente similar à extremidade 3’ de tirosil tRNA, e sintetizando deste modo uma molécula de uma proteína desejada, o seu mRNA codificador e um ribossoma unidos um ao outro. Esta técnica utiliza um sistema de síntese de proteína livre de célula, não células vivas, e portanto permite a síntese in vitro. Uma biblioteca demonstrando um grupo de proteína randomicamente mutagenizada em um ribossoma pode ser obtido através do uso de um grupo de mRNA obtido pela mutagênese aleatória de uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos de uma certa proteína, um ligante tal como puromicina, e um sistema de síntese de proteína livre de célula (Nemoto N, et al., (1997), FEBS Lett., Vol. 414, No. 2, p. 405-408).
[00195] A biblioteca demonstrando peptídeo obtida por meio de um sistema de síntese livre de célula, tal como demonstração em ribossoma ou demonstração em ácido nucléico, pode ser incubada na presença de uma molécula alvo, ou contatada com uma molécula alvo. Por exemplo, um suporte imobilizado em HTRA1 é incubado durante um dado tempo com uma fase móvel contendo a biblioteca. Depois, a fase móvel é separada do suporte.
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Subsequentemente, o suporte é lavado para efetuar a remoção de matéria não específica adsorvida e matéria ligada. Um peptídeo, uma coleção de peptídeo ou uma coleção de peptídeo enriquecida ligados ao suporte (que tem HTRA1 ligada a ele) podem ser recuperados pela elução. A elução pode ser não seletivamente realizada, por exemplo, na presença de concentração iônica relativamente alta, pH baixo, condições de desnaturação moderadas, ou sal caotrópico, ou pode ser seletivamente realizada pela adição de uma molécula alvo solúvel tal como HTRA1, um anticorpo que se liga à molécula alvo, um ligante natural, um substrato, ou semelhantes e competindo com uma molécula alvo imobilizada. Um sítio de adsorção não específico e/ou sítio de ligação podem ser bloqueados, por exemplo. A etapa de bloqueio pode ser aqui incorporada contanto que o bloqueio seja realizado por um método apropriado.
[00196] O ácido nucléico expresso do peptídeo, coleção de peptídeos ou uma coleção de peptídeos enriquecida assim obtido é recuperado. No caso de mRNA, a sequência de nucleotídeos pode ser determinada depois de uma reação de transcrição reversa no cDNA para determinar uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeo. Além disso, o ácido nucléico recuperado é transcrito em mRNA, e um ciclo da operação mencionada acima pode ser repetido uma vez a várias vezes para altamente enriquecer uma coleção de peptídeo que se liga à molécula alvo.
[00197] Contanto que o peptídeo, a coleção de peptídeo ou a uma coleção de peptídeo enriquecida sejam conjugados de antemão com uma etiqueta de afinidade, o peptídeo ou a coleção podem ser eficientemente purificados. Por exemplo, a coleção de peptídeo é conjugada de antemão um substrato de protease como uma etiqueta de modo que o peptídeo possa ser eluído pela divagem através da ati vidade de protease.
[00198] Com base na informação de sequência obtida e a função do peptídeo, etc., o clone ou biblioteca obtidos podem ser mutagenizados ainda,
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56/113 e um peptídeo melhorado na sua função (por exemplo, atividade inibidora de HTRA1), propriedades físicas (estabilidade térmica, estabilidade no armazenamento, etc.), cinéticas in vivo (distribuição e meia-vida no sangue), etc. pode ser obtido a partir da biblioteca mutada.
[00199] O peptídeo que inibe HTRA1 pode ser identificado determinando-se se ou peptídeo obtido tem atividade inibidora de HTRA1 ou não.
[00200] O peptídeo que inibe HTRA1 é preferivelmente capaz de manter uma estrutura tridimensional constituída, por exemplo, por uma estrutura de laço consistindo em 16Ser a 30Val, folha β constituída pelo filamento β (1) consistindo em 31Cys e 32Gly e filamento β (2) consistindo em 57Ile a 59Arg, e hélice α consistindo em 41 Glu a 51 Gly, ou uma estrutura de laço, folha β, ou hélice α similar a esta ou pelo menos parcialmente correspondendo a esta (ou a estas posições), contidas na sequência de aminoácidos de SPINK2 do tipo selvagem, até o grau que a atividade inibidora de HTRA1 possa ser exercida. Um peptídeo mais preferido que inibe HTRA1 pode ser identificado usando-se uma tal estrutura tridimensional (estrutura integral ou estrutura parcial) como uma porção de um indicador.
4. Molécula de ácido nucléico codificando peptídeo que inibe HTRA1, vetor compreendendo a molécula de ácido nucléico, célula compreendendo a molécula de ácido nucléico ou o vetor, e método para produzir peptídeo recombinante que inibe HTRA1 [00201] A presente invenção também provê um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos contida no peptídeo que inibe HTRA1 (em seguida, referida como uma “molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1”), um vetor recombinante tendo um inserto do gene, uma célula que abriga o gene ou o vetor (em seguida, referido como uma “célula contendo a molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1”), ou
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57/113 uma célula produzindo o peptídeo que inibe HTRA1 (em seguida, referida como uma “célula produzindo peptídeo que inibe HTRA1”).
[00202] Alguns exemplos preferidos da molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção podem incluir uma molécula de ácido nucléico compreendendo qualquer uma das seguintes sequências de nucleotídeo (a) a (e) (em seguida, referida como a “sequência de nucleotídeos do peptídeo que inibe HTRA1”), uma molécula de ácido nucléico consistindo em uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequencia de gene de anticorpo, e uma molécula de ácido nucléico consistindo em uma sequência de gene de anticorpo:
(a) uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, e 23 a 29 (Figuras 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33, e 35 a 41);
(b) uma sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22 (Figuras 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 34);
(c) uma sequência de nucleotídeos que híbridiza sob condições severas a uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos (a) ou (b) e codifica uma sequência de aminoácidos compreendida em um peptídeo tendo atividade inibidora de HTRA1;
(d) uma sequência de nucleotídeos que é derivada da sequência de nucleotídeos (a) ou (b) pela substituição, exclusão, adição e/ou inserção de 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 ou 2, ou 1 nucleotídeo(s) ou resíduo(s) de nucleotídeo e codifica(m) uma sequência de aminoácidos compreendida em um peptídeo tendo atividade inibidora de HTRAl;e (e) uma sequência de nucleotídeos que tenha 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou maior identidade com a
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58/113 sequência de nucleotídeos (a) ou (b) e codifique uma sequência de aminoácidos compreendida em um peptídeo tendo atividade inibidora de HTRA1.
[00203] Contudo, a molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRAl não é limitada às sequências de nucleotídeo (a) a (e). Cada molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos compreendida em um mutante de SPINK2 tendo atividade inibidora de HTRAl, e preferivelmente a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42), é incluída no escopo da molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1.
[00204] Um ou dois ou mais códons correspondendo a cada aminoácido podem ser usados para designar a sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos. Consequentemente, uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência única de aminoácidos de um certo peptídeo pode ter uma pluralidade de variações. Para a seleção de tais códons, os códons podem ser apropriadamente selecionados de acordo com o uso de códon de células hospedeiras para a expressão para abrigar um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos ou um vetor compreendendo o polinucleotídeo, ou a frequência ou taxa de uma pluralidade de códons usados podem ser apropriadamente ajustados. Por exemplo, no caso de usar células de Escherichia coli como células hospedeiras, a sequência de nucleotídeos pode ser planejada usando códons com alta frequência de uso na Escherichia coli.
[00205] A molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRAl pode ser funcionalmente unida a uma, duas ou mais sequências reguladoras. A frase “funcionalmente unida” é usada para significar que a molécula de ácido nucléico unida pode ser expressa, ou uma sequência de nucleotídeos contida na molécula é expressável. A sequência reguladora
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59/113 inclui um elemento de sequência envolvendo informação sobre a regulagem transcricional e/ou regulagem translacional. Embora a sequência reguladora varie dependendo da espécie, a sequência reguladora geralmente inclui um promotor e inclui sequências não codificadoras 5’ envolvidas na iniciação de transcrição e tradução, por exemplo, uma caixa procariótica -35/-10 e sequência de Shine-Dalgamo ou uma caixa TATA eucariótica, sequência CA AT, e sequência de encapuzamento 5’. Esta sequência pode compreender um elemento realçador e/ou um elemento repressor, e uma sequência de sinais, sequência líder, ou semelhantes para a liberação de um peptídeo natural ou maduro a um compartimento específico dentro ou fora de uma célula hospedeira. A sequência reguladora pode incluir ainda uma sequência não codificadora 3’, e esta sequência pode compreender um elemento envolvido na terminação de transcrição ou poliadenilação, etc. contudo, a sequência relacionada com a terminação de transcrição, quando funcionando insuficientemente nas células hospedeiras específicas, pode ser substituída com uma sequência adequada para as células.
[00206] Os exemplos da sequência promotora podem incluir um promotor tet procariótico, um promotor lacUV5, e um promotor T7, e um promotor SV40 e um promotor CMV para as células eucarióticas.
[00207] A molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1 pode estar em uma forma isolada ou em uma forma contida em um vetor ou um outro veículo de clonagem (em seguida, simplesmente referida como um “vetor”; plasmídeo, fagomídeo, fago, baculovírus, cosmídeo, etc.) ou em um cromossoma, embora a forma não seja limitada a estas. O vetor pode compreender, além da sequência de nucleotídeos do peptídeo que inibe HTRA1 e da sequência reguladora, uma sequência de replicação e uma sequência de controle adequada para as células hospedeiras para o uso na expressão, e um marcador seletivo que confere um fenótipo que permita a seleção de células que abrigam a molécula de ácido nucléico pela
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60/113 transformação ou semelhantes.
[00208] A molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1 ou o vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos do peptídeo que inibe HTRA1 pode ser transferida para células hospedeiras capazes de expressar o peptídeo ou a sequência de nucleotídeos por um método conhecido por uma pessoa versada na técnica, tal como transformação. As células hospedeiras que abrigam a molécula de ácido nucléico ou o vetor podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão do peptídeo ou da sequência de nucleotídeo. As células hospedeiras podem ser qualquer uma de células procarióticas e eucarióticas. Os exemplos do procariota podem incluir E. coli e Bacillus subtilis. Os exemplos das células eucarióticas podem incluir células de leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, células de inseto tais como SF9 e High 5, e células animais tais como células HeLa, células CHO, células COS, e NSO. O peptídeo da presente invenção expresso usando-se células hospedeiras tais como células eucarióticas pode passar por uma modificação pós-translacional desejada. Os exemplos da modificação pós-translacional podem incluir a adição de um grupo funcional tal como uma cadeia de açúcar, a adição de um peptídeo ou uma proteína, e a conversão das propriedades químicas de um aminoácido. Alternativamente, o peptídeo da presente invenção pode ser artificialmente modificado como desejado. Uma tal forma modificada do peptídeo também é incluída dentro do escopo do “peptídeo” da presente invenção.
[00209] A presente invenção também inclui um método para produzir o peptídeo que inibe HTRA1. O método compreende: a etapa 1 de cultivar uma célula hospedeira abrigando a molécula de ácido nucléico codificando o peptídeo que inibe HTRA1 ou o vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos do peptídeo que inibe HTRA1, ou uma célula expressando o peptídeo que inibe HTRA1; e/ou a etapa 2 de recuperar o peptídeo que inibe HTRA1 das culturas obtidas na etapa 1. Uma operação, tal como
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61/ 113 fracionamento, cromatografia, ou purificação, conhecida por uma pessoa versada na técnica pode ser aplicada à etapa 2. Por exemplo, purificação por afinidade usando o anticorpo da presente invenção mencionado mais tarde é aplicável neste ponto.
[00210] Em alguns aspectos da presente invenção, o peptídeo que inibe HTRAl tem uma ligação de dissulfeto intramolecular. Pode ser preferido que o peptídeo tendo uma ligação de dissulfeto intramolecular deva ser fornecido a um compartimento celular tendo um ambiente redox oxidante, usando-se uma sequência de sinais ou semelhantes. O ambiente oxidante pode ser provido pelo periplasma de uma bactéria gram-positiva tal como E. coli, o ambiente extracelular de uma bactéria gram-positiva, o lúmen do retículo endoplasmático de uma célula eucariótica, ou semelhantes. Um tal ambiente é capaz de promover a formação de uma ligação de dissulfeto estrutural. Alternativamente, o peptídeo tendo uma ligação de dissulfeto intramolecular pode ser preparada no citoplasma de uma célula hospedeira tal como uma célula da E. coli. Neste caso, o peptídeo pode ser diretamente adquirido em um estado dobrado solúvel ou recuperado na forma de um corpo de inclusão e subsequentemente reconstruído in vitro. Além disso, uma célula hospedeira tendo um ambiente intracelular oxidante é selecionada, e o peptídeo tendo uma ligação de dissulfeto intramolecular também pode ser preparado no citoplasma do mesmo. Por outro lado, quando o peptídeo que inibe HTRAl não tem nenhuma ligação de dissulfeto intramolecular, o peptídeo pode ser preparado em um compartimento celular tendo um ambiente redox redutor, por exemplo, o citoplasma de uma bactéria gram-negativa.
[00211] O peptídeo que inibe HTRAl da presente invenção também pode ser produzido por outros métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica, tal como síntese química, por exemplo, o método de síntese de peptídeo de fase sólida de Merrifield, et al. e um método de síntese de peptídeo da química orgânica sintética usando t-butoxicarbonila (Boc) ou 9
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62/113 fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), e tradução in vitro.
[00212] Em alguns aspectos, a presente invenção provê um anticorpo que se liga a um peptídeo mutante SPINK2 tendo atividade inibidora de HTRA1, e um fragmento funcional do mesmo. O anticorpo pode ser qualquer um de um anticorpo policlonal e um anticorpo monoclonal. O anticorpo monoclonal não é particularmente limitado contanto que o anticorpo monoclonal seja uma imunoglobulina ou seja derivada da mesma. O fragmento funcional do anticorpo não é limitado contanto que o fragmento funcional tenha atividade de ligação de antígeno, isto é, atividade de ligação contra o peptídeo mutante SPINK2. Os exemplos do mesmo incluem ambas ou uma das cadeias pesada e leve ou um fragmento das mesmas, um fragmento de anticorpo carecendo de uma região constante ou uma região Fc, e um conjugado com uma proteína adicional ou uma substância para rotulação. Um tal anticorpo e um fragmento funcional do mesmo pode ser preparado por um método conhecido por uma pessoa versada na técnica e são úteis, por exemplo, na purificação do peptídeo mutante SPINK2 pela cromatografia de afinidade, examinação clínica relacionada com uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo ou uso do mesmo, a detecção do peptídeo no diagnóstico ou semelhantes, e imunoensaio. O anticorpo da presente invenção pode ser purificado pela cromatografia de afinidade usando o peptídeo da presente invenção ao qual o anticorpo se liga.
5. Composição farmacêutica [00213] A presente invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo que inibe HTRA1 ou um conjugado do mesmo.
[00214] A composição farmacêutica compreendendo o peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção ou o conjugado do mesmo é útil no tratamento e/ou prevenção de várias doenças que são induzidas ou exacerbadas pela HTRA1 e permitem a supressão da indução ou a
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63/113 exacerbação, cura, manutenção ou melhora de um sintoma, evitamento de uma doença secundária, etc. pela inibição ou supressão da expressão ou função de HTRA1 (em seguida, estas doenças são referidas como “doenças relacionadas com HTRA1”). As doenças relacionadas com HTRA1 também incluem várias doenças que permitem a supressão de indução ou exacerbação, cura, manutenção ou melhora de um sintoma, evitamento de uma doença secundária, etc. através de um efeito protetivo da retina. O peptídeo que inibe HTRA1 tem um efeito protetivo da retina e é útil no tratamento e/ou prevenção destas doenças relacionadas com HTRA1.
[00215] Os exemplos da doença relacionada com HTRA1 podem incluir, mas não são limitados a, degeneração macular relacionada à idade, retinopatia de prematuridade, vasculopatia polipoidal da coroide, artrite reumatoide, e osteoartrite. Os exemplos da degeneração macular relacionada à idade pode incluir, mas não são limitados à, degeneração macular úmida relacionada à idade, degeneração macular seca relacionada à idade, e atrofia geográfica. Também, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada como um agente de proteção de célula fotorreceptora, um agente de proteção retinal, e outros (coletivamente referidos como um “agente de proteção retinal”).
[00216] A degeneração macular relacionada à idade é dividida em tipo úmido e tipo seco. A de tipo úmido é classificada ainda em degeneração macular relacionada à idade típica (AMD típica), vasculopatia polipoidal da coroide (PCV), e proliferação angiomatosa retinal (RAP). Para a do tipo úmido, existem métodos de tratamento tais como fármacos anti-VEGF e terapia fotodinâmica (PDT), que entretanto nem sempre são suficientes. Para o tipo seco, apenas modificações na dieta ou ingestão de suplemento com base no Estudo da Doença Ocular Relacionada à idade (AREDS) são praticadas.
[00217] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser
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64/113 usada no tratamento ou prevenção da degeneração macular relacionada à idade, por exemplo, como observado a partir dos resultados mostrando que: a contagem de núcleos em uma camada nuclear externa foi diminuída em um grupo de controle de modelos de rato de dano na retina induzido pela exposição à luz, enquanto que a administração do peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção antes ou depois da exposição à luz suprimiu a diminuição na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa em um grupo de modelos de rato de administração (Exemplos 5, 10 e 14); e a área de células epiteliais pigmentares retinais (células RPE) ou o número de células RPE tendo uma área de célula igual a ou maior do que um dado valor foi aumentado em um grupo de controle de modelos de coelho de dano na retina (mencionado mais tarde) preparado alimentando-se com uma dieta com alto teor de gordura e hidroquinona, enquanto que a administração do peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção suprimiu este aumento em um grupo dos modelos de coelho de administração (Exemplo 11). O modelo de coelho de dano na retina leva fatores de risco para a degeneração macular seca relacionada à idade humana em consideração e é portanto excelente como um modelo de degeneração macular seca relacionada à idade em particular.
[00218] Em um teste de indução de mRNA VEGF usando células epiteliais do pigmento retinal (RPE), confirmou-se que a administração do peptídeo que inibe HTRA1 suprime a expressão de mRNA VEGF (Exemplo 12). A indução de VEGF a partir das células epiteliais pigmentares retinais está envolvida na patogênese da degeneração macular úmida relacionada à idade (Klettner A. et al., (2009), Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol., Vol. 247: p. 1487-1492). Além disso, é considerado que tal indução de VEGF mórbida também esteja envolvida na manutenção da condição patológica, indicando que o peptídeo que inibe a HTRA1 da presente invenção é útil no tratamento e prevenção da degeneração macular seca relacionada à idade e degeneração macular úmida relacionada à idade.
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65/113 [00219] Em um teste de migração das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), confirmou-se que a administração do peptídeo que inibe HTRA1 suprime a migração (Exemplo 13), indicando que o peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção é útil no tratamento e prevenção da degeneração macular úmida relacionada à idade distinguida pela angiogênese.
[00220] A degeneração macular úmida relacionada à idade é progressiva. Embora a administração de um fármaco anti-VEGF possa suprimir temporariamente o estado da doença, a recorrência repetida com uma alta frequência é problemática (Yand S, et al.. Drug Des Devei Ther., Vol. 2, No. 10: p. 1857-67, 2016). Os problemas dos fármacos recentemente verificados nos anos recentes são o desenvolvimento da atrofia e um declínio na acuidade visual em pacientes de degeneração macular úmida relacionada à idade (Berg K, et al., Acta Ophthalmologica, Vol. 95, No. 8: p. 796-802, 2017). A administração do peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção sozinha ou através do uso combinado com um fármaco anti-VEGF pode exercer um efeito terapêutico na degeneração macular úmida relacionada à idade (incluindo proliferação de vasculopatia coroidal polipoidal e retinal angiomatosa). Além disso, a administração profilática do peptídeo pode prevenir ou atrasar a recorrência do estado da doença e atrasar o início ou reinicio do tratamento com um fármaco anti-VEGF, por exemplo. Além disso, o peptídeo trabalha de maneira supressiva no desenvolvimento da atrofia em pacientes com degeneração macular úmida relacionada à idade e, portanto, é capaz de provocar benefícios de longo prazo em termos de acuidade visual.
[00221] O peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção é excelente em termos de penetração tissular (Exemplo 11) e também excelente em termos das suas propriedades físicas, estabilidade, segurança, cinéticas após a administração, produtividade, etc. e pode, deste modo, estar preferivelmente contido como um ingrediente ativo em uma composição farmacêutica.
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66/113 [00222] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico ou profilático do peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo e um diluente, carregador, solubilizante, emulsificador, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis.
[00223] O termo “quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico ou profilático” é usado para significar uma quantidade que exerce um efeito terapêutico ou profilático em uma doença específica através de uma forma de dosagem e uma via de administração, e é sinônimo com uma “quantidade farmacologicamente eficaz”.
[00224] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter uma substância para alterar, manter, ou reter o pH, pressão osmótica, viscosidade, transparência, cor, isotonicidade, esterilidade, ou a estabilidade, solubilidade, taxa de liberação sustentada, absortividade, penetração, forma de dosagem, concentração, propriedades, formas, etc. da composição ou o peptídeo da presente invenção ou o conjugado do mesmo aqui contido (em seguida, referida como um “substância farmacêutica”). A substância farmacêutica não é particularmente limitada contanto que a substância seja farmacologicamente aceitável. Por exemplo, nenhuma ou baixa toxicidade é uma propriedade preferivelmente possuída pela substância farmacêutica.
[00225] Os exemplos da substância farmacêutica podem incluir as seguintes substâncias, mas não são limitados as estas: aminoácidos tais como glicina, alanina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, e Usina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tais como ácido ascórbico, sulfato de sódio, e bissulfeto de sódio; tampões tais como fosfato, citrato, ou tampões de borato, bicarbonate de sódio, e soluções de Tris-HCl; enchedores tais como manitol e glicina; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA); agentes de complexação tais como cafeína, polivinilpirrolidina, βciclodextrina, e hidróxi-propil-P-ciclodextrina; agentes de volume tais como
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67/113 glicose, manose, e dextrina; outros hidrocarbonetos tais como monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, manose, e dextrina; agentes de coloração; agentes de sabor; diluentes; emulsificadores; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidina; polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sal; antissépticos tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido ascórbico, e peróxido de hidrogênio; solventes tais como glicerina, propileno glicol, e polietileno glicol; álcoois de açúcar tais como manitol e sorbitol; agentes de suspensão; tensoativos tais como PEG, éster de sorbitano, polissorbatos tais como polissorbato 20 e polissorbato 80, triton, trometamino, lecitina, e colesterol; intensificadores de estabilidade tais como sacarose e sorbitol; intensificadores de elasticidade tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, manitol, e sorbitol; agentes de transporte; diluentes: excipientes; e/ou adjuvantes farmacêuticos.
[00226] Tal substância farmacêutica é adicionada ao peptídeo que inibe HTRA1 em uma quantidade de 0,001 a 1000 vezes, preferivelmente de 0,01 a 100 vezes, e mais preferivelmente de 0,1 a 10 vezes maior do que o peso do peptídeo que inibe HTRA1.
[00227] Um lipossomo contendo o peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo, ou uma composição farmacêutica contendo uma forma modificada compreendendo o peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo conjugado com um lipossomo também é incluído na composição farmacêutica da presente invenção.
[00228] Um excipiente ou um carregador não é particularmente limitado contanto que o excipiente ou o carregador sejam geralmente um líquido ou um sólido e sejam água para injeção, solução salina normal, um fluido cerebroespinhal artificial, ou outras substâncias para o uso nas preparações para a administração oral ou administração parenteral. Os
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68/113 exemplos da solução salina normal podem incluir solução salina neutra normal ou solução salina normal contendo albumina sérica.
[00229] Os exemplos do tampão podem incluir um tampão de Tris preparado para levar o pH final da composição farmacêutica a 7,0 a 8,5, um tampão de acetato preparado para levar o pH final do mesmo de 4,0 até 5,5, um tampão de citrato preparado para levar o pH final do mesmo de 5,0 a 8,0, e um tampão de histidina preparado para levar o pH final do mesmo de 5,0 a 8,0.
[00230] A composição farmacêutica da presente invenção é um sólido, um líquido, uma suspensão, ou semelhantes. Outro exemplo da composição farmacêutica da presente invenção pode incluir preparações secadas por congelamento. As preparações secadas por congelamento podem ser realizadas usando um excipiente tal como sacarose.
[00231] A via de administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser qualquer uma de instilação ocular, administração enteral, administração local, e administração parenteral. Os exemplos do mesmo podem incluir instilação conjuntival, administração intravítrea, administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intramuscular, administração intradérmica, administração subcutânea, administração intraperitoneal, administração transdérmica, administração intraóssea, e administração intra-articular.
[00232] A receita da composição farmacêutica pode ser determinada de acordo com um método de administração, a afinidade de ligação à HTRA1 do peptídeo que inibe HTRA1, etc. O peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção tendo atividade inibidora mais forte (valor IC50 menor) contra a HTRA1 alvo ou tendo afinidade mais alta (valor de KD menor) para a proteína de HTRA1 é capaz de exercer seus efeitos medicinais em uma dose mais baixa.
[00233] A dose do peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção ou
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69/113 o conjugado do mesmo não é limitada contanto que a dose seja uma quantidade fannacologicamente eficaz. A dose pode ser apropriadamente determinada de acordo com as espécies de um indivíduo, o tipo da doença, sintomas, sexo, idade, condições pré-existentes, a afinidade de ligação do peptídeo para a proteína HTRA1 ou sua atividade biológica, e outros fatores. A dose é geralmente de 0,01 a 1000 mg/kg, e preferivelmente de 0,1 a 100 mg/kg, que pode ser administrada uma vez ao dia a cada 180 dias ou duas vezes ou três ou mais vezes em um dia.
[00234] Os exemplos da forma da composição farmacêutica podem incluir as injeções (incluindo as preparações secadas por congelamento e infusões de gotejamento), supositórios, preparações de absorção transnasais, preparações de absorção transdérmica, agentes sublinguais, cápsulas, tabletes, unguentos, grânulos, aerossóis, pílulas, pós, suspensões, emulsões, colírios, e formulações de implante biológico.
[00235] A composição farmacêutica compreendendo o peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo como um ingrediente ativo pode ser administrada simultaneamente com ou separadamente de um medicamento adicional. Por exemplo, a composição farmacêutica compreendendo o peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo como um ingrediente ativo pode ser administrada depois da administração do medicamento adicional, ou o medicamento adicional pode ser administrado depois da administração da composição farmacêutica. Alternativamente, a composição farmacêutica e o medicamento adicional podem ser administrados simultaneamente. Para a administração simultânea, o peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo e o medicamento adicional podem estar contidos em uma preparação única ou podem estar contidos em preparações separadas (uma pluralidade de preparações).
[00236] Os Exemplos do medicamento adicional usado em combinação com a composição farmacêutica da presente invenção podem incluir agentes
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70/113 anti-VEGF, agentes anti-inflamatórios, agentes que neutralizam a citocina inflamatória, a os inibidores do caminho de ativação de complemento. Os agentes anti-VEGF são classificados em anticorpos anti-VEGF, inibidores de VEGF, antagonistas do receptor de VEGF e receptores de VEGF solúveis, etc. e incluem bevacizumab, ranibizumab, aflibercept, pelacunatanib, brolucizumab e semelhantes. O agente anti-inflamatório não é particularmente limitado contanto que o agente anti-inflamatório possa ser localmente administrado de modo a suprimir a inflamação intraocular ou intra-articular. Os exemplos do agente que neutraliza a citocina inflamatória incluem os anticorpos anti-TNFoc, anticorpos anti-interleucina-6 (em seguida, referidas como “IL-6”), anticorpos do receptor anti-IL-6, e receptores de TNF solúveis e podem incluir especificamente infliximab, adalimumab, golimumab, certolizumab, tocilizumab e etanercept. Os exemplos do inibidor do caminho de ativação de complemento podem incluir lampalizumab. Estes medicamentos são adequados para o tratamento ou prevenção da doença relacionada com HTRAls e também podem ser combinados com a composição farmacêutica da presente invenção no tratamento ou prevenção das doenças outras que não a doença relacionada com as HTRAls.
[00237] Um destes medicamentos adicionais pode ser usado, ou dois ou três ou mais do mesmo podem ser administrados ou recebidos. Estes métodos são coletivamente referidos como “uso combinado com o medicamento adicionar’ de ou “combinação com o medicamento adicional” e a composição farmacêutica da presente invenção. A composição farmacêutica da presente invenção compreendendo o medicamento adicional além do anticorpo da presente invenção, um fragmento de ligação do mesmo, ou uma forma modificada do anticorpo ou do fragmento, ou usada em combinação com terapia adicional também está incluída na presente invenção como um aspecto do “uso combinado com o medicamento adicional” ou a “combinação com o medicamento adicional”.
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71/ 113 [00238] A presente invenção também provê um método para tratar ou prevenir uma doença relacionada com HTRA1 tal como degeneração macular relacionada à idade, compreender a etapa de administrar o peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo, uso do peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção ou o conjugado do mesmo para preparar uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção da doença, e o uso do peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo para o tratamento ou prevenção da doença. A presente invenção também inclui um kit para o tratamento ou prevenção compreendendo o peptídeo que inibe a HTRA1 da presente invenção ou o conjugado do mesmo.
[00239] A presente invenção também provê um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácido do peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo, um vetor compreender o polinucleotídeo, e uma composição farmacêutica compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor ou compreendendo uma célula expressando o peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção ou o conjugado do mesmo. Por exemplo, o polinucleotídeo e o vetor podem ser aplicados à terapia de gene da doença relacionada com HTRAls através do uso de um método conhecido. A célula pode ser aplicada à terapia celular da doença relacionada com HTRAls através do uso de um método conhecido. Além disso, o polinucleotídeo ou o vetor podem ser transferidos, por exemplo, às células autólogas ou células halogênicas (células homólogas) para preparar as células para a terapia celular. Tal polinucleotídeo e vetor também são incluídos como as composições para a preparação do fármaco da terapia celular na presente invenção. Contudo, a forma da composição farmacêutica da presente invenção compreendendo o polinucleotídeo, o vetor, a célula, ou semelhantes não é limitada a esta descrita acima.
6. Composição para o diagnóstico e métodos para detectar e separar HTRA1 [00240] O peptídeo que inibe HTRA1 da presente invenção ou o
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72/113 conjugado do mesmo pode ter ati vidade de ligação HTRA1 além da atividade inibidora da protease HTRA1 e pode ser usado em vários estudos tais como uso como um controle positivo em estudos para pesquisar pelos inibidores de HTRA1, a detecção da HTRA1, exame e diagnóstico usando a detecção, a separação da HTRA1, reagentes e outros propósitos. Para a detecção ou separação da HTRA1, pelo menos um de peptídeo da presente invenção e HTRA1 pode ser imobilizado.
[00241] A presente invenção provê uma composição para a detecção ou para o diagnóstico (em seguida, coletivamente referida como uma “composição para o diagnóstico”) compreendendo o peptídeo da presente invenção que se liga a HTRA1, ou o conjugado do mesmo.
[00242] A composição para o diagnóstico da presente invenção é útil na examinação ou diagnóstico da doença relacionada com as HTRAls, expressão de HTRA1, etc. Na presente invenção, os exemplos da examinação ou o diagnóstico incluem, mas não são limitados à determinação ou medição do risco de adquirir uma doença, a determinação da presença ou ausência de uma doença, a medição do grau da progressão ou exacerbação, a medição ou determinação do efeito da medicação com uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo que inibe HTRA1 ou o conjugado do mesmo, a medição ou determinação do efeito do tratamento outro que não a medicação, a medição do risco de recorrência, e a determinação da presença ou ausência da recorrência.
[00243] A composição para o diagnóstico da presente invenção é útil na identificação de um indivíduo recipiente para o peptídeo da presente invenção ou o conjugado do mesmo, uma composição compreendendo o peptídeo ou o conjugado do mesmo, ou uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo ou o conjugado do mesmo.
[00244] A composição para o diagnóstico pode conter um tampão de pH, um ajustador de pressão osmótica, sais, um estabilizante, um
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73/113 antisséptico, um desenvolvedor, um sensibilizador, um agente de prevenção de agregação e semelhantes.
[00245] A presente invenção também provê um método para examinar ou diagnosticar uma doença relacionada com HTRA1, uso do peptídeo da presente invenção para preparar uma composição para o diagnóstico da doença, e o uso do peptídeo da presente invenção que se liga a HTRA1, ou o conjugado do mesmo para o exame ou diagnóstico da doença. A presente invenção também inclui um kit para a examinação ou diagnóstico compreendendo o peptídeo da presente invenção ou o conjugado do mesmo. [00246] O método de examinação ou diagnóstico compreende o peptídeo da presente invenção que se liga à HTRA1 é desejavelmente ELISA de sanduíche. Alternativamente, um método de detecção usual tal como ELISA, RIA, ELISPOT, ponto mancha, um método de Ouchterlony, CIE, CLIA, ou citometria de fluxo podem ser usados. A examinação ou o diagnóstico também são obtidos através de um método com base em um método de imunoprecipitação.
[00247] A presente invenção também provê um método para detectar ou medir HTRAl em uma amostra de teste. Tal método de detecção ou medição podem utilizar a composição para o diagnóstico da presente invenção. A HTRAl em uma amostra de teste pode ser detectada por: comunicar o peptídeo que inibe a HTRAl ou o conjugado do mesmo com a amostra de teste (etapa 1); e subsequentemente medir a quantidade de ligação de HTRAl ao peptídeo (etapa 2). A etapa 1 pode envolver, por exemplo, imobilizar um conjugado do peptídeo que inibe HTRAl com uma região de imunoglobulina Fc em esferas magnéticas por intermédio da proteína G, e adicionar a amostra de teste a este. A Etapa 2 pode envolver, por exemplo, separar as esferas magnéticas, e analisar uma proteína solúvel precipitada com as esferas por SDS-PAGE ou Western blot para detectai- a HTRAL Além de uma amostra humana ou derivada de um animal não humano, mesmo uma
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74/113 amostra arti ficial mente tratada tal como uma proteína recombinante pode ser submetida a esta medição. Os exemplos da amostra de teste derivada do organismo do indivíduo podem incluir, mas não são limitados a, sangue, fluido sinovial, fluido ascítico, linfas, fluido cerebroespinhal, lavagem broncoalveolar, saliva, catarro, sobrenadantes de homogenado tissular, e seções tissulares.
[00248] A detecção de HTRAl pode ser realizada não apenas in vitro mas in vivo. No vaso da visualização de diagnóstico, o peptídeo que inibe HTRAl ou o conjugado do mesmo, rotulado com um radionuclídeo farmaceuticamente aceitável ou emissor de luz podem ser usados. A Etapa 1 pode envolver, por exemplo, administrar o peptídeo rotulado ou conjugado do mesmo para um sujeito de teste. A Etapa 2 pode envolver, por exemplo, obter uma imagem através do uso de uma técnica de visualização de diagnóstico tal como PET/CT, e determinar ou examinar a presença de HTRAl.
[00249] O peptídeo ou o conjugado do mesmo contido na composição para o diagnóstico da presente invenção se liga a HTRAl, e preferivelmente tem atividade específica de ligação à HTRAl.
[00250] A presente invenção também inclui um método para identificar um indivíduo recipiente para a composição farmacêutica da presente invenção. Em tal método de identificação, a HTRAl em uma amostra derivada de um indivíduo é medida usando o peptídeo de ligação de HTRAl da presente invenção, e o indivíduo pode ser determinado ser positivo quando a HTRAl é detectada na amostra ou quando uma quantidade maior de HTRAl é aqui detectada se comparado com a quantidade da HTRAl detectada em uma amostra derivada de um indivíduo saudável. Este método pode utilizar a composição para o diagnóstico da presente invenção.
[00251] Em um aspecto preferido do método de identificação, o indivíduo tem uma doença relacionada com HTRAl ou tem um risco de adquirir a doença.
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75/113 [00252] Em um aspecto, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada ao indivíduo determinada ser positiva no método de identificação.
[00253] A HTRA1 pode ser especificamente separada de uma amostra na qual a HTRA1 coexiste com outros componentes, usando o peptídeo da presente invenção tendo a atividade de ligação específica para HTRA1, ou o conjugado do mesmo. A liberação da HTRA1 do peptídeo pode ser realizada de maneira não seletiva, por exemplo, na presença de uma concentração iônica relativamente alta, baixo pH, condições de desnaturação moderadas, ou sal caotrópico, e é preferivelmente realizada sem atenuar a atividade de protease da HTRA1.
7. Método para identificar o fármaco terapêutico ou fármaco profilático para a doença relacionada com HTRA1 [00254] Em um aspecto, a presente invenção provê um método para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para uma doença relacionada com HTRA1, e preferivelmente a degeneração macular relacionada à idade, ou um candidato do mesmo usando-se a atividade inibidora de HTRA1 como um indicador. O método pode compreender: a etapa 1 de incubar a HTRA1 protease e um substrato na presença ou ausência de uma substância de teste (ou na presença de um veículo); a etapa 2 de determinar atividade de HTRA1 protease na presença e ausência da substância de teste; e/ou etapa 3 de determinar a substância de teste como um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para a degeneração macular relacionada à idade, ou um candidato do mesmo quando a atividade de HTRA1 protease na presença da substância de teste for menor do que a atividade de HTRA1 protease na ausência da substância de teste. A substância de teste pode ser peptídica ou não peptídica. A substância de teste peptídica não é limitada à mutante de SPINK2. Os exemplos do mesmo podem incluir, mas não são limitados a, anticorpos, peptídeos outros que não mutante de
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SPINK2 tendo uma estrutura proteica que não de imunoglobulina, e análogos do substrato de HTRA1. Os exemplos da substância de teste não peptídica podem incluir, mas não são limitados aos, compostos de baixo peso molecular sintéticos e ácidos nucléicos. Uma, duas ou mais das etapas descritas acima também podem ser preferivelmente incluídas em um método para identificar uma substância tendo um efeito protetivo da retina, ou um candidato do mesmo. A presente invenção também refere-se a um método para identificar uma substância tendo um efeito protetivo da retina, ou um candidato do mesmo.
8. Modelo de dano na retina de coelho [00255] A presente invenção também provê um modelo de coelho de dano na retina causado pela carga com uma dieta com alto teor de gordura (em seguida, referida como “HFD”) contendo hidroquinona (em seguida, referida como “HQ”), um método para preparar o modelo, um método de teste usando o modelo, etc.
[00256] Este modelo pode utilizar um coelho branco arbitrário, tal como NZW ou JW, na idade 2 ou mais, independente do sexo.
[00257] A HFD pode conter uma quantidade arbitrária de uma gordura ou óleo arbitrários, por exemplo, de 0,1 a 2% (p/v) colesterol, 1 a 10% (p/v) de óleo de coco, 1 a 10% (p/v) de óleo de amendoim, de 1 a 10% (p/v) de óleo de soja, de 10 a 20% (p/v) de sebo bovino, 10 a 50% (p/v) de lardo, ou 1 a 10% (p/v) de óleo de milho, embora o componente não seja limitado a este contanto que o componente seja adequado para a preparação do modelo.
[00258] A quantidade de HQ contida em HQ-HFD é de 0 a 4% (p/v), preferivelmente de 0,5 a 3,5% (p/v), mais preferivelmente de 1,0 a 3,0% (p/v), ainda mais preferivelmente de 2,2 a 2,8% (p/v), e ainda mais preferivelmente 2,4% (p/v).
[00259] O período de alimentação de HQ-HFD é de 3 a 6 meses, preferivelmente de 3,5 a 5 meses, e mais preferivelmente de 4 meses. A
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77/113 continuação da alimentação por 8 meses ou mais deve ser evitada.
[00260] O modelo da presente invenção é preferido porque o modelo é mais similar aos seres humanos no tamanho do globo ocular e funções, quando comparado com os modelos de camundongo (Literatura Não Patentária 18 e 19). Os modelos de coelho convencionais (Literatura Não Patentária 20) requerem 8 meses para sua preparação. Ao contrário, o modelo da presente invenção pode ser preparado em um período mais curto, e adicionalmente, é mais preferido como um modelo de degeneração macular relacionada à idade porque o modelo pode induzir a hipertrofia das células de RPE, que são incertas em modelos convencionais.
[00261] As células epiteliais pigmentares retinais (células RPE) do modelo da presente invenção são hipertrofiadas quando comparadas com as células de RPE de um coelho normal, manifestando a condição patológica precoce da degeneração macular relacionada à idade. Por outro lado, a hipertrofia da célula RPE foi incapaz de ser visualizada e confirmada quando os coelhos com 10 semanas de idade similares aos modelos de coelho convencionais (Literatura Não Patentária 20) foram alimentados com HQHFD por 4 meses.
[00262] Um fármaco terapêutico e/ou um fármaco profilático para a degeneração macular relacionada à idade, ou um agente de proteção retinal podem ser identificados usando-se este modelo que manifesta a condição patológica. O método de identificação pode compreender as etapas de: (i) medir a hipertrofia das células epiteliais pigmentares retinais no coelho deste modelo com ou sem a administração de uma substância de teste; e (ii) determinar que a substância de teste é positiva quando a hipertrofia de células epiteliais pigmentares retinais com administração da substância de teste é suprimida quando comparada com a hipertrofia das células epiteliais pigmentares retinais sem administração do mesmo. A medição na etapa (i) é preferivelmente a medição de uma média área das células epiteliais
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78/113 pigmentares retinais e/ou o número de células epiteliais pigmentares retinais hipertrofiadas.
Exemplos [00263] Em seguida, alguns aspectos da presente invenção serão descritos em maiores detalhes com referência aos Exemplos. Contudo, a presente invenção não é limitada a estes exemplos.
[00264] Nos seguintes exemplos, a menos que de outro modo especificado, as operações individuais com relação à manipulação genética foram realizadas de acordo com o método descrito em “Molecular Cloning” (Sambrook, L, Fritsch, E. F. and Maniatis, T., publicada pela Cold Spring Harbor Laboratory' Press em 1982 ou 1989) ou outros métodos descritos nos manuais experimentais usados por aqueles versados na técnica, ou, quando os reagentes ou kits comercialmente disponíveis foram usados, os exemplos foram realizados de acordo com as instruções incluídas nos produtos comercialmente dispomvei s.
Exemplo 1. Preparação do peptídeo que inibe HTRA1 (1-1) Constnição do vetor de expressão de peptídeo que inibe HTRA1 (1-1-1) Construção de peptídeo pET 32a (modificado) que inibe HTRA1 [00265] Em primeiro lugar, um vetor de expressão de peptídeo que inibe HTRA1 com armação SPINK2 como uma estrutura dorsal foi constniído. Um fragmento inibidor foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 30 s) x 30 ciclos) com a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22) de cada peptídeo de inibição e a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2) do SPINK2 como modelos usando os seguintes iniciadores e KOD-plus(Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 1: 5’-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
Iniciador 2: 5’-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCAC GGACC-3’
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79/113 [00266] Cada fragmento amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose. Depois, o fragmento do DNA desejado foi removido do gel, e o DNA foi preparado usando um Kit de Extração QIAquick Gel (Qiagen
N.V.). O fragmento de DNA preparado e pET 32a (modificado) foram cada um tratado com enzimas de restrição EcoRI (New England BioLabs Inc.) e Xhol (New England BioLabs Inc.) a 37° C por 1 hora ou mais. Depois da eletroforese em gel de agarose, os fragmentos de DNA desejados foram removidos do gel e purificados usando um Kit de Purificação PCR QIAquick (Qiagen N.V.). Os fragmentos purificados foram reagidos durante a noite a 16° C através de uma reação de ligação usando T4 DNA Ligase (New England BioLabs Inc.). A solução de ligação foi adicionada a E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), e a mistura foi deixada em repouso no gelo por 30 minutos, depois tratada com calor a 42 ° C por 45 segundos, novamente deixada em repouso no gelo por 5 minutos, e inoculada a uma placa 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina, seguido pela cultura estática durante a noite a 37° C para transformar a E. coli. No dia seguinte, a E. coli transformada foi inoculada a um meio de Caldo Terrífico (Invitrogen Corp.) contendo 0,1 mg/ml de ampicilina e cultivada durante a noite a 37 ° C. Depois, o DNA plasmídico foi recuperado usando um Kit QIAprep 96 Turbo Miniprep (Qiagen N.V.) (em seguida, este tratamento é referido como “tratamento miniprep”) e submetido à análise de sequência ao construto “peptídeo pET 32a (modificado) que inibe HTRA1”.
(1-1-2) Construção de peptídeo pET 32a que inibe HTRA1_ Kex2 [00267] Do mesmo modo, um fragmento inibidor foi amplificado por PCR ((94 ° C por 15 segundos, 60 ° C por 30 segundos, e 68 ° C por 30 segundos) x 30 ciclos) com a sequência (Listagem de Sequência) de cada inibidor e a sequência de nucleotídeos de SPINK2 como modelos usando os seguintes iniciadores e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
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Iniciador 3: 5 ’ - AAA AGGATCCCTGG AC AAACGTG ATCCGCAGTTTG GTCTGTTTAG-3’
Iniciador 4: 5 ’ - AA A ACTCGAGTT AGCCGCCGC ACGG ACC ATTGCG
AATAATTTTA-3’ [00268] Cada fragmento amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose. Depois, o fragmento de DNA desejado foi removido do gel, e o DNA foi preparado usando um Kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen N.V.). O fragmento de DNA preparado e pET 32a (Novagen) foram, cada um, tratados com as enzimas de restrição BamHÍ (New England BioLabs Inc.) e Xhol (New England BioLabs Inc.) a 37° C por 1 hora ou mais. Depois da eletroforese em gel de agarose, os fragmentos de DNA desejados foram removidos do gel e purificados usando um Kit de Purificação PCR QIAquick (Qiagen N.V.). os fragmentos purificados foram reagidos durante a noite a 16 ° C através de uma reação de ligação usando a T4 DNA Ligase (New England BioLabs Inc.). A solução de ligação foi adicionada a E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), e a mistura foi deixada em repouso no gelo por 30 minutos, depois tratada por calor a 42 ° C por 45 segundos, novamente deixando em repouso no gelo por 5 minutos, e inoculada em uma placa 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina, seguido pela cultura estática durante a noite a 37° C para transformar a E. coli. A E. coli transformada foi cultivada, e miniprep e a análise de sequência foi então realizada para construir o “pET 32a_peptídeo que inibe HTRAI_Kex2”. A operação foi realizada de acordo com o método descrito em (1-1-1).
(1-2) Expressão e purificação do peptídeo que inibe HTRA1 [00269] E. coli Origami B (DE3) (Novagen) foi transformada com o vetor de peptídeo pET 32a (modificado) que inibe a HTRA1 construída em (1-1-1), e cultivada a 37° C usando um meio 2YT meio contendo 0,1 mg/ml de ampicilina. Depois, IPTG (concentração final: 1 mM) foi adicionado a esta, e a E. coli foi cultivada durante a noite a 16 ° C. No dia seguinte, depois
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81/113 de coletar por centrifugação (3.000 g, 20 min, 4o C), um lisado foi preparado usando BugBuster Master Mix (Novagen), e uma proteína de fusão à etiqueta His de interesse foi purificada usando uma Resina de Afinidade Metálica TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Em seguida, uma etiqueta de tiorredoxina e a proteína desejada foram clivadas usando um Kit de Captura de Clivagem de Trombina (Novagen) e purificadas usando TALON. O resultante foi submetido à cromatografia de filtração em gel (Superdex 75 10/300 GL) ou cromatografia de fase reversa (YMC-Pack ODS-AM) para preparar um peptídeo que inibe HTRA1. O peptídeo obtido foi conjugado no seu terminal N com uma porção consistindo em etiqueta S e um ligante (SEQ ID NO: 31: Figura 43) e no seu terminal C com um hexâmero C-terminal (SEQ ID NO: 32: Figura 44) ao invés de Gly-Gly.
[00270] Do mesmo modo, E. coli Origami B (DE3) (Novagen) foi transformada com o vetor pET 32a_peptídeo que inibe HTRAl_Kex2 constniído (1-1-2), e cultivada a 37° C usando um meio 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina. Depois, IPTG (concentração final: 1 mM) foi adicionado a esta, e a E. coli foi cultivada durante a noite a 16° C. No dia seguinte, depois de coletar por centrifugação (3.000 g, 20 min, 4o C), um lisado foi preparado usando BugBuster Master Mix (Novagen), e uma etiqueta His da proteína de fusão de interesse foi purificada usando uma Resina de Afinidade Metálica TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Em seguida, uma etiqueta de tiorredoxina e a proteína desejada foram clivadas usando Kex2 (Saccharomyces cerevisiae: Aquiescência CAA96143) e purificada usando TALON. O resultante foi submetido à cromatografia de filtração em gel (Superdex 75 10/300 GL) ou cromatografia de fase reversa (YMC-Pack ODS-AM) para preparar um peptídeo que inibe HTRA1 (sem o terminal N nem o terminal C conjugado com uma etiqueta, um ligante ou semelhantes).
Exemplo 2. Avaliação do peptídeo que inibe HTRA1 para a atividade
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82/113 inibidora de HTRA1 [00271] A similaridade de sequência entre a HTRA1 humana, de camundongos, ratos, e macacos é mostrada na Figura 1. Uma sequência primária constituindo um domínio de protease HTRA1 (204Gly a 364Leu), que é um domínio enzimaticamente ativo, é completamente idêntica entre o macaco e o ser humano. As sequências de domínio de protease da HTRA1 humana e de camundongo ou rato diferem em 1 resíduo. Contudo, este resíduo é estruturalmente posicionado em um lado oposto ao centro ativo da enzima e foi, portanto, presumido não ter nenhuma influência no centro ativo da enzima (Figura 1). Portanto, o domínio de protease HTRA1 tem eficazmente a mesma sequência, independente da espécie (humano/ camundongo/rato/macaco). Deste modo, nenhuma menção particular foi feita sobre estas espécies.
(2-1) Preparação do domínio HTRA1 da protease HTRA1 (cat) (2-1-1) Construção de pET 21b_HTRAl (cat) [00272] O domínio de protease (158Gly a 373Lys), exceto para o domínio N-terminal e o domínio de PDZ, o HTRA1 humana (Q92743) foi usado como a HTRA1 (cat) para construir um vetor de expressão de HTRA1 (cat). O fragmento de DNA desejado foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 45 segundos) x 30 ciclos) com um plasmídeo inserido à HTRA1 humana (GeneCopoeia, Inc.; GC-M0558) como um modelo usando os seguintes iniciadores e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 5:5’ - AA AC ATATGGGGCAGGAAG ATCCCAACAGTTTGC-3 ’ Iniciador 6: 5’-AAACTCGAGTTTGGCCTGTCGGTCATGGGACTC-3’ [00273] O fragmento amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose. Depois, o fragmento de DNA desejado foi removido do gel, e o DNA foi preparado usando um Kit de extração em Gel QIAquick (Qiagen N.V.). O fragmento de DNA preparado e pET 32a (Novagen) foram, cada um,
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83/113 tratados com enzimas de restrição Ndel (New England BioLabs Inc.) e Xhol (New England BioLabs Inc.) a 37° C por 1 hora ou mais longo. Depois da eletroforese em gel de agarose, os fragmentos de DNA desejados foram removidos do gel e purificados usando um Kit de Purificação em PCR QIAquick (Qiagen N.V.). Os fragmentos purificados foram reagidos durante a noite a 16° C por uma reação de ligação usando a DNA Ligase T4 (New England BioLabs Inc.). A solução de ligação foi adicionada à E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), e a mistura foi deixada em repouso no gelo por 30 minutos, depois tratada com calor a 42° C por 45 segundos, novamente deixada em repouso no gelo por 5 minutos, e inoculada em uma placa de 2YT contendo 0,1 mg/ml ampicilina, após a cultura estática durante a noite a 37° C para transformar a E. coli. A E. coli transformada foi cultivada, e miniprep e análise de sequência foram depois realizadas para construir “pET 21b_HTRAl (cat)”. A operação foi realizada de acordo com o método descrito em (1-1-1).
(2-1-2) Preparação de HTRAl (cat) [00274] E. coli BL21 (DE3) (Novagen) foi transformada com o pET 21b_HTRAl (cat) construído e cultivada a 37° C usando um meio de 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina. Depois, IPTG (concentração final: 1 mM) foi adicionada a esta, e a E. coli foi cultivada durante a noite 28° C. Depois da coleta, um lisado foi preparado suspendendo-se em um tampão de fosfato (50 mM de fosfato de sódio e 300 mM de NaCl) contendo 1 mg/ml de lisozima e ultrassonicação, e a proteína de fusão desejada com rótulo His foi recuperada usando TALON (Clontech Laboratories, Inc.). O resultante foi submetido à cromatografia de filtração em gel (Superdex 200 10/300 GL) para purificar HTRAl (cat).
(2-2) Preparação de HTRAl de comprimento total (HTRAl (total)) (2-2-1) Construção de pcDNA3,l_HTRAl (total)_His [00275] O fragmento de DNA desejado foi amplificado por PCR ((94°
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C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 90 segundos) x 30 ciclos) com HTRA1 humana sintetizada (Q92743) DNA (GeneArt) como um modelo usando os seguintes imciadores e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 7: 5’-AAAAGAATTCGCCACCATGCAGATTCCTAGAGCC G3’
Iniciador 8: 5’-AAAACTCGAGTCAGTGGTGATGGTGGTGGTGGCCG G-3’ [00276] O fragmento amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose. Depois, o fragmento de DNA desejado foi removido do gel, e o DNA foi preparado usando um Kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen N.V.). O fragmento de DNA preparado e pcDNA3,l (Thermo Fisher Scientific Inc.) foram cada um tratado com enzimas de restrição EcoRI (New England BioLabs Inc.) e Xhol (New England BioLabs Inc.) a 37° C por 1 hora ou mais. Depois da eletroforese em gel de agarose, os fragmentos de DNA desejados foram removidos do gel e purificados usando um Kit de Purificação PCR QIAquick (Qiagen N.V.). os fragmentos purificados foram reagidos durante a noite a 16° C através de uma reação de ligação usando DNA Ligase T4 (New England BioLabs Inc.). A solução de ligação foi adicionada à E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), e a mistura foi deixada em repouso no gelo por 30 minutos, depois tratada com calor a 42° C por 45 segundos, novamente deixada em repouso no gelo por 5 minutos, e inoculada em uma placa de 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina, seguido pela cultura estática durante a noite a 37° C para transformar a E. coli. A E. coli transformada foi cultivada, e miniprep e análise de sequência foram depois realizadas para construir “pcDNA3,l_HTRAl (total)_His”. A operação foi realizada de acordo com o método descrito em (1-1-1).
(2-2-2) Construção de pcDNA3,3_HTRAl (total)_FLAG_His [00277] O fragmento A foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 90 segundos) x 30 ciclos) com
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85/113 pcDNA3,l_HTRAl (total)_His construído em (2-2-1) como um modelo usando os seguintes iniciadores e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 7
Iniciador 9: 5 ’-CTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCGCCGGGGTCG A
TTTCCTC-3’ [00278] Em seguida, o fragmento B foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 10 segundos) x 30 ciclos) usando os seguintes iniciadores e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 10: 5 ’-GCGACTACAAGGACG ATG ACGACAAGCACCACCA CCATCATCAC-3’
Iniciador 11: 5 ’ - AAAA ACTCGAGCTAGTG ATGATGGTGGTGGTGC
TTGTCGTC-3’ [00279] O fragmento de DNA desejado foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 90 segundos) x 30 ciclos) com o fragmento A e fragmento B como modelos usando iniciadores 7 e 11 e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.), o fragmento amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose. Depois, o fragmento de DNA desejado foi removido do gel, e o DNA foi preparado usando um Kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen N.V.). O fragmento de DNA preparado e pcDNA3,3 (Thermo Fisher Scientific Inc.) foram cada um tratados com enzimas de restrição EcoRI (New England BioLabs Inc.) e Xhol (New England BioLabs Inc.) a 37° C por 1 hora ou mais. Depois da eletroforese em gel de agarose, os fragmentos de DNA desejados foram removidos do gel e purificados usando um Kit de Purificação por PCR QIAquick (Qiagen N.V.). Os fragmentos purificados foram reagidos durante a noite a 16° C através de uma reação de ligação usando DNA Ligase T4 (New England BioLabs Inc.). A solução de ligação foi adicionada à E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), e a mistura foi deixada em repouso no gelo por 30 minutos, depois tratada com calor a 42° C por 45 segundos, novamente deixada em repouso no gelo por 5
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86/113 minutos, e inoculada em uma placa de 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina, seguido por uma cultura estática durante a noite a 37° C para transformar a E. coli. A E. coli transformada foi cultivada, e miniprep e análise de sequência foram depois realizadas para construir “pcDNA3,3_HTRAl (total)_FLAG_His”. A operação foi realizada de acordo com o método descrito em (1-1-1).
(2-2-3) Preparação de HTR.A1 (total) [00280] FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi transfectado com pcDNA3,3_HTRAl (total)_FLAG_His construído em (2-22) usando Polietilenimina Max (Polisciences, Inc.). Seis dias mais tarde, um sobrenadante de cultura foi recuperado. Uma proteína de fusão rótulo His foi recuperada usando HisTrap excel (GE Healthcare), e HTRA1 (total) foi novamente purificado usando um Gel de Agarose por Afinidade ANTI-FLAG M2 (Sigma-Aldrich Co. LLC).
(2-3) Preparação de HTRA1 mutante do HTRA1 inativo (S328A) (2-3-1) Construção de pcDNA3,3_HTRAl(S328A)_FLAG_His [00281] De modo a construir um vetor de expressão de HTRA1 do mutante HTRA1 inativo (S328A), PCR ((95° C por 30 segundos, 55° C por 1 min, e 68° C por 7 min) x 18 ciclos) foi realizado com o vetor “pcDNA3,3_HTRAl (total)_FLAG_His” construído no Exemplo (2-2-2) como um modelo usando os seguintes iniciadores e Kits de Mutagênese Direcionados ao Local II QuikChange (Agilent Technologies Japan, Ltd.).
Iniciador 21: 5’CCATCATCAACTACGGCAACGCGGGCGGACCCCTCGTGAACC-3’ (SEQ ID NO: 55: Figura 76)
Iniciador 22: 5 ’ -GGTTCACGAGGGGTCCGCCCGCGTTGCCGTAGTT GATGATGG-3’ (SEQ ID NO: 56: Figura 77) [00282] Depois da reação de PCR, E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) foi transformada com a solução de reação de PCR tratada com Dpnl de
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87/113 acordo com o protocolo ligado ao kit. A E. coli transformada foi cultivada, e miniprep e análise de sequência foram depois realizadas para construir “pcDNA3,3_HTRAl(S328A)_FLAG_His”. A operação foi realizada de acordo com o método descrito em (1-1-1).
(2-3-2) Preparação de HTRA1 (S328A) [00283] HTRA1 (S328A) foi expresso usando FreeStyle 293F de acordo com o método descrito em (2-2-3), e HTRA1 (S328A) foi preparada através da purificação por afinidade.
Exemplo 3. Avaliação do peptídeo que inibe HTRA1 para a atividade inibidora de HTRA1 (3-1) A avaliação do peptídeo que inibe HTRA1 quanto a atividade inibidora de HTRA1 usando um substrato peptídeo [00284] Um substrato peptídeo H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp) K) (Peptide Institute, Inc.: SEQ ID NO: 54, Figura 8) foi dissolvido a 10 mM em DMSO, diluído com um tampão de ensaio (50 mM de borato e 150 mM de NaCl, pH 8,5), e usado em uma concentração final de 10 μΜ. HTRA1 (HTRA1 (cat) ou HTRA1 (total)) e cada peptídeo que inibe HTRA1 diluído com um tampão de ensaio foi misturado a 25 μΐ cada e reagido a 37° C por 20 minutos. Depois, 50 μΐ do substrato diluído com um tampão de ensaio foram adicionados a este. Um sinal fluorescente (excitação a 328 nm/emissão a 393 nm) foi medido usando Enspire (PerkinElmer, Inc.). A concentração final de HTRA1 foi de 100 nM, e a concentração final do peptídeo que inibe HTRA1 foi de 1,875 a 1,000 nM. Uma placa negra PROTEOSAVE(R) SS96F (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) foi usada na reação e na medição.
[00285] A taxa de decomposição do substrato peptídeo do peptídeo que inibe HTRA1 em cada concentração foi calculada. Quando a taxa de decomposição em uma concentração inibidora de 0 nM foi definida como 100%, a HTRA1 (cat) e atividade inibidora de HTRA1 (completa) de cada peptídeo que inibe HTRA1 foram avaliadas (Figuras 2 e 3). Como resultado
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88/113 do cálculo de uma concentração inibidora a 50% (IC50) usando GrapbPad Prism (versão 5.0; GrapbPad Software Inc.), verificou-se que todos os peptídeos que inibem as HTRAl s inibiem HTRAl (cat) e a atividade enzimática de HTRAl (total) em uma concentração baixa (Figuras 2A a 2C e Figura 3). Para controle, SPINK2 tipo selvagem (wt) não apresentou nenhuma atividade inibidora de HTRAl (Figura 2D).
Atividade inibidora de HTRAl do peptídeo que inibe HTRAl [Tabela 1]
ID IC50 (t)M) para HTRAl (cat) IC50 (nM) para HTRA1 (total)
H218 72 55
H223 41 66
H228 71 38
H308 37 15
H321 48 29
H322 50 17
H308AT 49 31
H321AT 46 18
H322AT 45 25
M7 43 24
(3-2) Avaliação do peptídeo que inibe HTRAl quanto a atividade inibidora de HTRAl usando o substrato de proteína [00286] A atividade inibidora de HTRAl de um peptídeo que inibe HTRAl foi avaliada com vitronectina humana como uni substrato de proteína. HTRAl (cat) e cada peptídeo que inibe HTRAl diluído com um tampão de ensaio (50 mM Tris e 150 mM NaCl, pH 8,0) foram misturados e reagidos a 37° C por 1 hora. Em seguida, a vitronectina humana (BD Biosciences; 354238) diluída com um tampão de ensaio foi adicionada a este e reagida a 37° C por 2 horas. Um tampão de amostra SDS foi adicionado a esta, e a reação enzimática foi terminada pelo tratamento a 99° C por 5 minutos. Depois, a decomposição da vitronectina humana foi avaliada pelas análises de SDS-PAGE e Western blot. A concentração final do peptídeo que inibe HTRAl foi de 0 a 25 μΜ, a concentração final de HTRAl (cat) foi de 1 μΜ, e a concentração final da vitronectina humana foi de 1 μΜ. Para a análise de Western blot, o Anticorpo de Vitronectina Humana (R&D Systems, Inc.;
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MAB2349) foi usado como um anticorpo primário, e IgG anticamundongo, Ab de Ovelha Integral Unido a HRP (GE Healthcare; NA931) foi usado como um anticorpo secundário.
[00287] Como em (3-1), os peptídeos que inibem HTRA1 também apresentaram uma forte inibição da HTRA1 (cat) quando a vitronectina humana foi usada como um substrato (Figura 4).
(3-3) Avaliação do peptídeo que inibe HTRA1 quanto a especificidade [00288] A especificidade para outras proteases foi avaliada usando-se a divagem de um substrato peptídeo como um indicador. Da mesma maneira que o método descrito em (3-1), cada protease e cada amostra (concentração final: 1 μΜ) diluída com um tampão de ensaio foi misturada a 25 μΐ cada e reagida a 37° C por 20 minutos. Depois, 50 μΐ de cada substrato diluído com um tampão de ensaio foi adicionado a estas. Um sinal fluorescente (excitação a 380 nm/emissão a 460 nm) foi medido usando Enspire (PerkinElmer, Inc.). o mesmo tampão de ensaio (50 mM de borato e 150 mM de NaCl, pH 8,5) como no Exemplo 2 foi usado na avaliação da atividade de HTRA2. Um tampão de ensaio (50 mM de Tris e 150 mM de NaCl, pH 8,0) foi usado na avaliação da atividade de protease outra que não a atividade de HTRA2. A placa negra PROTEOSAVE(R) SS96F (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) foi usada na reação e na medição. As combinações da protease e do substrato usadas na avaliação da especificidade foram como segue.
[00289] Avaliação da atividade inibidora de tripsina bovina; 5 nM (concentração final) tripsina (Pierce; 20233) e 100 μΜ (concentração final) substrato peptídeo Boc-VPR- Substrato de Peptídeo Fluorogênico AMC (R&D Systems, Inc.: ES011) [00290] Avaliação da atividade inibidora da α-quimiotripsina Bovina; 10 nM (concentração final) quimiotripsina (Worthington Biochemical Corporation; LS001434) e 100 μΜ (concentração final) substrato peptídeo Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.: 3120-v)
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90/113 [00291] Avaliação da atividade inibidora da triptase humana; 1 nM (concentração final) triptase (Sigma-Aldrich Co. LLC; T7063) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3107-v) [00292] Avaliação da atividade inibidora da quimase humana; 100 nM (concentração final) quimase (Sigma-Aldrich Co. LLC; C8118) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v) [00293] Avaliação da atividade inibidora de plasmina humana; 50 nM (concentração final) plasmina (Sigma-Aldrich Co. LLC; P1867) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Boc-Val-Leu-Lys-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3104-v) [00294] Avaliação da atividade inibidora da trombina humana; 1 nM (concentração final) de trombina (Sigma-Aldrich Co. LLC; T6884) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Boc-VPR-Substrato de Peptídeo Fluorogênico AMC (R&D Systems, Inc.; ES011) [00295] Avaliação da atividade inibidora de matriptase humana; 1 nM (concentração final) de matriptase (R&D Systems, Inc.; E3946-SE) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Boc-QAR-Substrato de Peptídeo Fluorogênico AMC (R&D Systems, Inc.; ES014) [00296] Avaliação da atividade inibidora da proteína C humana; 100 nM (concentração final) da proteína C (Sigma-Aldrich Co. LLC; P2200) e 100 μΜ (concentração final) do substrato peptídeo Boc-Leu-Ser-Thr-ArgMCA (Peptide Institute, Inc.; 3112-v) [00297] Avaliação da atividade inibidora de tPA humana; 10 nM (concentração final) de tPA (Sigma-Aldrich Co. LLC; T0831) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v) [00298] Avaliação da atividade inibidora da uPA humana; 10 nM
Petição 870190065362, de 11/07/2019, pág. 96/119 / 113 (concentração final) de uPA (Sigma-Aldrich Co. LLC; TO831) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v) [00299] Avaliação da atividade inibidora da calicreína plasmática humana: 0,125 pg/ml (concentração final) de calicreína plasmática (SigmaAldrich Co. LLC; TO831) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Z-Phe-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3095-v) [00300] Avaliação da atividade inibidora de HTRA2 humana; 200 nM (concentração final) de HTRA2 (R&D Systems, Inc.; 1458-HT) e 50 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo H2-Opt (Peptide Institute, Inc.) [00301] A reatividade cruzada com as proteases outras que não HTRAl foi avaliada usando-se a decomposição do substrato peptídeo como um indicador da mesma maneira como em (3-2). Cada peptídeo que inibe HTRAl não suprimiu a atividade de protease de qualquer uma das proteases em uma concentração inibidora final de 1 micro M, indicando que o peptídeo que inibe HTRAl tem um efeito inibidor específico para HTRAl (Figura 5).
Exemplo 4. Análise do peptídeo que inibe HTRAl usando uma estrutura cristalina de raios X (4-1) Preparação do complexo de HTRAl (cat)Zpeptídeo que inibe HTRAl [00302] HTRAl (cat) e um peptídeo que inibe HTRAl tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 foram cada um preparados de acordo com os métodos descritos em (1-2) e (2-1). Estes foram misturados sob condições de 20 mM de Tris-HCl e 150 mM de NaCl, pH 7,6. Depois, um complexo foi isolado e purificado através da cromatografia de filtração em gel (Superdex 200 10/300 GL).
(4-2) Cristalografia de raios X [00303] A solução complexa preparada em (4-1) foi concentrada em 18 mg/ml e depois misturada com uma solução de reservatório (1,0 M de LiCl, 7,5% de PEG6000, e 0,1 M de Tris/HCl (pH 8,5)) em uma razão de 1:1, e a
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92/113 mistura foi cristalizada através do método de difusão de vapor. Os monocristais cúbicos obtidos foram imersos em uma solução de reservatório contendo 20% de etileno glicol e então congelados em nitrogênio líquido. Os cristais congelados foram expostos aos raios X sob fluxo de ar criogênico para obter uma imagem de difração (photon factory BL5A: High Energy Accelerator Research Organization). Os dados em escala com uma resolução máxima de 2,6 Angstrom foram obtidos através da análise usando HKL2000. A fase foi determinada através do método de substituição molecular usando serina protease HTRA1 (PDB ID: 3NZI) como um modelo. Depois do refinamento da estrutura, um complexo cristalino de HTRA1 (cat) e o peptídeo foram determinados em uma resolução de 2,6 Angstrom. Cada uma das moléculas de HTRA1 e SPINK2 estavam contidas na célula única. Como para a molécula de SPINK2, um modelo molecular parcial contendo um sítio de interação com HTRA1 (cat) foi construído com base na informação de sequência e a densidade de elétrons observada. O peptídeo que inibe HTRA1 foi confirmado ligar a uma região contendo o centro ativo da enzima HTRA1 (Figuras 6 e 7).
Exemplo 5. O efeito protetivo da retina produzido pela inibição de HTRA1 no modelo de rato de dano na retina induzido pela exposição à luz (5-1) Preparação do modelo de rato de dano na retina induzido pela exposição à luz [00304] Os modelos de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz são modelos que induzem a morte celular das células fotorreceptoras da retina através da exposição à luz e são universalmente usadas como animais de modelo de degeneração da retina (Daniel T. Organisciak et al., (1996) Invest Ophthalmol Vis Sci. Vol. 37 (No. 11): p. 2243-2257). Uma solução oftálmica de 0,5% (P/V) de tropicamida-0,5% de cloridreto de fenilefrina foi ocularmente instilada sob adaptação até a escuridão aos ratos adaptados ao escuro por 72 horas. Depois, os ratos foram expostos à luz branca de 5500
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Lux por 3 horas. Os ratos assim expostos foram novamente adaptados ao escuro por cerca de 24 horas e depois criados por 2 dias sob condições de luzescuro de criação comum. Depois da eutanásia, os globos oculares foram extirpados e fixados por imersão em um fixador de 3,7% (P/V) de formaldeído-0,5 a 1% (P/V) de metanol-0,2% (PA7) de ácido pírico por 24 horas ou mais. Depois de embeber em parafina, as seções fatiadas finas foram preparadas. As seções foram tingidas com hematoxilina-eosina, e uma contagem de núcleos em uma camada nuclear externa de uma seção cruzada da retina foi determinada para avaliar o dano na retina. Verificou-se que os modelos de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz têm uma diminuição notável na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa devido à exposição à luz.
(5-2) Confirmação da expressão da HTRA1 extracelular no tempo do dano na retina [00305] De modo a examinar o envolvimento da HTRA1 nos modelos de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz, o humor vítreo foi coletado dos ratos modelos preparados em (5-1) e avaliados quanto um nível de expressão de HTRA1 através da análise de Western blot. O humor vítreo foi submetido a SDS-PAGE sob condições de redução. A HTRA1 de rato foi detectada usando como um anticorpo humano primário o Anticorpo HTRA1/PRSS11 (R&D Systems, Inc.; AF2916) e como um anticorpo secundário, Anticorpo conjugado à Peroxidase de Rábano de IgG de Ovelha (R&D Systems, Inc.; HAF016). A quantidade aumentada da HTRA1 no humor vítreo foi confirmada no grupo de exposição à luz quando comparado com um grupo que não de exposição, sugerindo que neste modelo, o HTRA1 está envolvido no processo do dano na retina causado pela exposição à luz (Figura 9).
(5-3) Efeito protetivo da retina do peptídeo que inibe HTRA1 no modelo de rato de dano na retina induzido pela exposição à luz
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94/113 [00306] Imediatamente antes da exposição à luz dos ratos, 5 μΐ do peptídeo que inibe HTRA1 H308 tendo uma concentração de 0,04 mg/ml ou 0,2 mg/ml foram administrados intravitrealmente sob anestesia, n ····· 4 por um grupo de administração de solução salina normal, e n = 5 para os outros grupos. A exposição à luz diminuiu a contagem de núcleos em uma camada nuclear externa em uma seção transversal da retina no grupo de administração de solução salina normal, enquanto que o efeito de supressão da diminuição na contagem de núcleos em uma camada nuclear externa foi confirmado no grupo de administração de peptídeo que inibe HTRA1 (Figura 10). Estes resultados demonstraram que o peptídeo que inibe HTRA1 apresenta efeitos medicinais no dano tissular causado por HTRA1.
Exemplo 6. Avaliação do derivado de peptídeo que inibe HTRA1 (6-1) Construção do peptídeo pET 32a que inibe HTRA1 H308_S16A_Kex2 [00307] O derivado S16A tendo uma sequência de aminoácido em que 16Ser na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9 (Figura 21) foi substituído com Ala foi preparado com o peptídeo que inibe HTRA1 H308 como um modelo. O fragmento C foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 15 segundos) x 30 ciclos) usando os seguintes iniciadores e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 12: 5’-CCGCAGTTTGGTCTGTTTAGCAAATATCGTACCCC
GAATTGT-3’
Iniciador 13: 5 ’ -GCCATACCAGCATGGTCCGCAC AATTCGGGGTA
CGATATTTGC-3’ [00308] Em seguida, o fragmento D foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 20 segundos) x 30 ciclos) com o peptídeo que inibe HTRA1 H3O8 como um modelo usando os seguintes iniciadores e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 14: 5’-GCGGACCATGCTGGTATGGCATGTGTTGCTCT
GTATGAAC-3’
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Iniciador 15: 5 ’ -A A A ACTCG AGTTAGCCGCCGCACGGACCATT
GCGAATAA-3’ [00309] O fragmento de DNA desejado foi amplificado por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 20 segundos) x 30 ciclos) usando os fragmentos C e D, os seguintes iniciadores, e KOD-plus(Toyobo Co., Ltd.).
Iniciador 16: 5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGATCCGCAG TTTGGTCTGTTTAG-3 ’
Iniciador 15 [00310] O fragmento amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose. Depois, o fragmento de DNA desejado foi removido do gel, e o DNA foi preparado usando um Kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen N.V.). O fragmento de DNA preparado e pET 32a (Novagen) foram, cada um, tratados com enzimas de restrição BamHI (New England BioLabs Inc.) e Xhol (New England BioLabs Inc.) a 37° C por 1 hora ou mais. Depois da eletroforese em gel de agarose, os fragmentos de DNA desejados foram removidos do gel e purificados usando um Kit de Purificação por PCR QIAquick (Qiagen N.V.). Os fragmentos purificados foram reagidos durante a noite a 16° C para uma reação de ligação usando o DNA Ligase T4 (New England BioLabs Inc.). A solução de ligação foi adicionada a E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), e a mistura foi deixada em repouso no gelo por 30 minutos, depois tratada com calor a 42° C por 45 segundos, novamente deixada em repouso no gelo por 5 minutos, e inoculada em uma placa 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina, seguido por uma cultura estática durante a noite a 37° C para transformar a E. coli. A E. coli transformada foi cultivada, e miniprep e análise de sequência foram depois realizadas para construir o “pET 32a_peptídeo que inibe HTRA1 H308_S16A_Kex2”. A operação foi realizada de acordo com o método descrito em (1-1-1).
(6-2) Preparação de peptídeo que inibe o vetor de expressão do derivado de
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HTRA1 _N-terminal [00311] De modo a preparar quatro derivados de sequência N-temiinal (referidos como DIG, DIS, DIE, e D1SLI, respectivamente) do peptídeo que inibe HTRA1 tendo uma sequência de aminoácido em que lAsp na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9 (Figura 21) foi substituída com Gly, Ser, Glu ou Ser-Leu-Ile, os vetores de expressão foram construídos pelo mesmo método como em (6-1). Quatro fragmentos de interesse foram, cada um, amplificados por PCR ((94° C por 15 segundos, 60° C por 30 segundos, e 68° C por 20 segundos) x 30 ciclos) usando fragmentos C e D, os seguintes iniciadores, e KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Iniciadores da preparação de DIG
Iniciador 17: 5 AAAAGGATCCCTGGAC AAACGTGGCCCGCAG
TTTGGTCTGTTTAG-3 ’
Iniciador 15
Iniciadores da preparação de D1S
Iniciador 18: 5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCCGCAG
TTTGGTCTGTTTAG-3 ’
Iniciador 15
Iniciadores da preparação de DIE
Iniciador 19: 5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGAACCGCAG
TTTGGTCTGTTTAG-3 ’
Iniciador 15
Iniciadores da preparação de D1SLI
Iniciador 20: 5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCTGATTCCG
CAGTTTGGTCTGTTTAG-3 ’
Iniciador 15 [00312] Cada um dos quatro fragmentos amplificado foram submetidos à eletroforese em gel de agarose. Depois, o fragmento de DNA desejado foi removido do gel, e o DNA foi preparado usando um Kit de Extração em
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QIAquick (Qiagen N.V.). o fragmento de DNA preparado e pET 32a (Novagen) foram, cada um, tratados com enzimas de restrição BamHI (New England BioLabs Inc.) e Xhol (New England BioLabs Inc.) a 37° C por 1 hora ou mais. Depois da eletroforese em gel de agarose, os fragmentos de DNA desejados foram removidos do gel e purificados usando um QIAquick PCR Purificação Kit (Qiagen N.V.). Os fragmentos purificados foram reagidos durante a noite a 16° C por uma reação de ligação usando DNA Ligase T4 (New England BioLabs Inc.). A solução de ligação foi adicionada a
E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), e a mistura foi deixada em repouso no gelo por 30 minutos, depois tratada com calor a 42° C por 45 segundos, novamente deixada em repouso no gelo por 5 minutos, e inoculada em uma placa 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina, seguido por uma cultura estática durante a noite a 37° C para transformar a E. coli. A E. coli transformada foi cultivada, e miniprep e análise de sequência foram depois realizadas para construir “pET 32a_peptídeo que inibe HTRA1 H308_DlG_S16A_Kex2”, “pET
32a_peptídeo que inibe HTRA1 H308_DlS_S16A_Kex2”, “pET
32a_peptídeo que inibe HTRA1 H308_DlE_S16A_Kex2”, e “pET 32a_peptídeo que inibe HTRA1 H308_DlSLI_S16A_Kex2”. A operação foi realizada de acordo com o método descrito em (1-1-1).
(6-3) Preparação de derivado de peptídeo que inibe HTRA1 [00313] E. coli Origami B (DE3) (Novagen) foi transformada com cada um dos cinco vetores construídos em (6-1) e (6-2), e cultivados a 37° C usando um meio de 2YT contendo 0,1 mg/ml de ampicilina. Depois, IPTG (concentração final: 1 mM) foi adicionado a este, e a E. coli foi cultivada durante a noite a 16° C. No dia seguinte, depois da coleta por centrifugação (3.000 g, 20 min, 4o C), um lisado foi preparado usando BugBuster Master Mix (Novagen), e uma proteína de fusão rótulo His de interesse foi purificada usando uma Resina de Afinidade Metálica TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Em seguida, uma etiqueta de tiorredoxina e a proteína desejada foram
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98/113 clivadas usando Kex2 (mencionado acima) e purificadas usando TALON. O resultante foi submetido à cromatografia de filtração em gel (Superdex 75 10/300 GL) ou cromatografia de fase reversa (YMC-Pack ODS-AM) para preparar cinco derivados de peptídeos que inibem HTRAl. As sequências de aminoácidos dos derivados são mostradas nas SEQ ID NOs: 23 a 27 (Figuras 35 a 39).
(6-4) Avaliação do derivado de peptídeo que inibe HTRAl [00314] Como resultado da medição da atividade inibidora de HTRAl (cat) de acordo com o método descrito em (3-1), todos os derivados tiveram a atividade inibidora equivalente àquela de H308 (Figura 11).
Exemplo 7. A avaliação do peptídeo que inibe HTRAl para a atividade de ligação contra HTRAl (cat) [00315] A atividade de ligação foi avaliada pelo método de imunoprecipitação usando três peptídeos que inibem HTRAl s (H308, H321AT e H322AT) preparados no Exemplo (1-2) e HTRAl (cat) preparada em (2-1). 2,5 pg de cada peptídeo que inibe HTRAl e 10 pg de HTRAl (cat) foram reagidos na temperatura ambiente por 30 minutos. Depois, 10 pl de Resina de Afinidade Metálica TALON (Clontech Laboratories, Inc.) foram adicionados a este. Depois de outra reação por 30 minutos, a resina foi recuperada como uma fração de imunoprecipitação (IP) e submetida a SDSPAGE para avaliar a atividade de ligação. A PBS foi usada como um tampão na reação.
[00316] Quando cada um dos três peptídeos que inibem HTRAls ou HTRAl (cat) foram reagidos com TALON, a faixa apenas do rótulo de HTRAl (cat) fundida a His foi detectada em uma linha de entrada. Por outro lado, a faixa de cada peptídeo de inibição e apenas a enzima foram detectadas em uma linha IP onde o peptídeo de inibição foi reagido com HTRAl (cat). Portanto, cada um dos três peptídeos que inibem as HTRAls foi confirmado como se ligando à HTRAl (cat).
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Exemplo 8. Avaliação do peptídeo que inibe HTRAl para a atividade inibidora de HTRAl (8-1) Avaliação do peptídeo que inibe HTRAl para a atividade inibidora de HTRAl usando o substrato peptídeo [00317] Três peptídeos que inibem HTRAls (H3O8JD1G_S16A, H321AT_D1G_S16A, e H322AT_D1G_S16A) construídos no Exemplo 6 foram avaliados quanto sua atividade inibidora de HTRAl (cat) ou HTRAl (completa) usando um substrato peptídeo H2-Opt (n ~ 3). Um substrato peptídeo H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K) (Peptide Institute, Inc.: SEQ ID NO: 54, Figura 8) foi dissolvido a 10 mM em DMSO, diluído com um tampão de ensaio (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, e 0,25% de CHAPS, pH 8,0), e usado em uma concentração final de 10 μΜ. HTRAl (HTRAl (cat) ou HTRAl (total); Exemplo 2) e cada peptídeo que inibe HTRAl diluído com um tampão de ensaio foi misturado a 25 μΐ cada e atingiu 37° C por 20 minutos. Depois, 50 μΐ do substrato diluído com um tampão de ensaio foram adicionados a este. Um sinal fluorescente (excitação a 328 nm/emissão a 393 nm) foi medido usando Enspire (PerkinElmer, Inc.). A concentração final de HTRAl foi de 100 nM, e a concentração final do peptídeo que inibe HTRAl foi de 1,875 a 1,000 nM. Placa negra PROTEOSAVE(R) SS96F (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) foi usada na reação e na medição.
[00318] A taxa de decomposição do substrato peptídeo do peptídeo que inibe HTRAl em cada concentração foi calculada. Quando a taxa e decomposição em uma concentração inibidora de 0 nM foi definida como 100%, a HTRAl (cat) e a atividade inibidora de HTRAl (completa) de cada peptídeo que inibe HTRAl foi avaliada.
[00319] Como resultado do cálculo de uma concentração inibidora de 50% (IC50) usando GraphPad Prism (versão 5.0; GraphPad Software Inc.), verificou-se que todos os peptídeos que inibem as HTRAl s inibem a atividade enzimática de HTRAl (cat) e HTRAl (total) em uma concentração
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100/113 baixa (Figura 66).
A atividade inibidora de HTRAl do peptídeo que inibe HTRA1 [Tabela 2]___________________________________________________
IC50 (nM) para HTR./ Xi (cat) IC50 (nM) para HTRAl (completo)
H308LdÍG„S16A 7,9+1,3 9,1+1,4
H321AT.D1G_.S16A 9,0+0,6 12.0+1,9
H322AT..D1G...S16A 12.9+0,2 12,2+2,2
(8-2) Avaliação do peptídeo que inibe HTRA1 quanto a atividade inibidora de HTRAl usando substrato de proteína [00320] A atividade inibidora de HTRAl de um peptídeo que inibe HTRA1 foi avaliada com vitronectina humana como um substrato de proteína. A operação seguiu o Exemplo (3-2).
[00321] Corno em (8-1), o peptídeo que inibe HTRAls também apresentou fortemente a inibição da HTRAl (cat) quando a vitronectina humana foi usada como um substrato (Figura 67).
(8-3) A avaliação do peptídeo que inibe HTRAl quanto especificidade [00322] A especificidade para outras proteases foi avaliada usando-se a divagem de um substrato peptídeo como um indicador. A operação para a tripsina bovina, α-quimotripsina bovina, proteína C, triptase, quimase, trombina, plasmina, tPA, calicreína plasmática, matriptase, uPA, e HTRA2 seguindo o método descrito no Exemplo (3-3) (n ---- 3). Os procedimentos de medição da atividade inibidora contra outras proteases e combinações da protease e do substrato foram como segue.
[00323] Uma placa preta PROTEOSAVE(R) SS96F (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) foi usada na reação e medição. Cada protease e cada amostra (concentração final: 1 μΜ) diluída com um tampão de ensaio foram misturadas 25 μΐ cada e reagidas a 37° C por 20 minutos. Depois, 50 μΐ de cada substrato diluído com um tampão de ensaio foram adicionados a estas. Um sinal fluorescente foi medido usando Enspire (PerkinElmer, Inc.).
[00324] Avaliação da atividade inibidora de tripsina humana; 1 nM (concentração final) de tripsina (Sigma-Aldrich Co. LLC; T6424) e 100 μΜ
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101 / 113 (concentração final) de substrato peptídeo Boc-VPR-Substrato Peptídeo Fluorogênico AMC (R&D Systems, Inc.; ES011), sinal fluorescente: excitação a 380 nm/emissão a 460 nm.
[00325] Avaliação da atividade inibidora da quimotripsina humana; 10 nM (concentração final) de quimotripsina (Sigma-Aldrich Co. LLC; C8946) e 10 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Suc-Leu-Leu-Val-TyrMCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v), sinal fluorescente: excitação a 380 nm/emissão a 460 nm.
[00326] Avaliação da atividade inibidora do fator humano Xlla; 100 nM (concentração final) Fator Alfa-XIIa (Enzyme Research Laboratories Inc.) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v), sinal fluorescente: excitação a 380 nm/emissão a 460 nm.
[00327] Avaliação da atividade inibidora de MMP-2 humana; 1 nM (concentração final) de triptase (Calbiochem; PF023) e 100 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo MOCAx-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR (Peptide Institute, Inc.; 3226-v), sinal fluorescente: excitação a 328 nm/emissão a 393 nm.
[00328] Avaliação da atividade inibidora de TPP1 humana; 0,5 pg/ml (concentração final) de TPP1 (Calbiochem; 2237-SE) e 200 μΜ (concentração final) de substrato peptídeo AAF-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3201-v), sinal fluorescente: excitação a 380 nm/emissão a 460 nm.
[00329] A reatividade cruzada com as proteases outras que não HTRA1 foi avaliada usando-se a decomposição do substrato de peptídeo como um indicador. Cada peptídeo que inibe HTRA1 não suprimiu a atividade de protease de qualquer uma das proteases em uma concentração final de 1 μΜ, indicando que o peptídeo que inibe HTRA1 tem um efeito inibidor específico para HTRA1 (Figura 68).
Exemplo 9. Avaliação do peptídeo que inibe HTRA1 para a atividade de
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102/113 ligação contra HTRA1 (cat) [00330] A atividade de ligação foi avaliada pelo método de imunoprecipitação de acordo com a operação do Exemplo 7 usando três peptídeos que inibem HTRA1 preparados no Exemplo 6 e HTRA1 (cat) preparado em (2-1).
[00331] Quando cada um dos três peptídeos que inibem HTRA1 ou HTRA1 (cat) foram reagidos com TALON, a faixa de apenas HTRA1 fundida à etiqueta His (cat) foi detectada em uma linha de entrada. Por outro lado, a faixa de cada peptídeo de inibição e a enzima foi detectada somente em uma linha IP onde o peptídeo de inibição foi reagido com HTRA1 (cat). Portanto, cada um os três peptídeos que inibem HTRA1 foi confirmado ligar à HTRA1 (cat) (Figura 69).
Exemplo 10. Efeito protetivo da retina provocado pela inibição de HTRA1 no modelo de rato de dano na retina induzido pela exposição à luz (parte 2) [00332] O efeito protetivo das retinas dos três peptídeos que inibem HTRA1 preparados no Exemplo 6 foi avaliado usando o modelo de ratos de dano na retina induzido pela exposição à luz, construído no Exemplo (5-1). A operação seguiu o Exemplo 5. n = 6 para todos os grupos.
[00333] Os resultados da avaliação patológica da retina são mostrados na Figura 70. Os três peptídeos que inibem HTRA1 apresentaram um efeito supressivo notável na diminuição da contagem de núcleos em uma camada nuclear externa causada pela exposição à luz.
Exemplo 11. Efeito de proteção nas células epiteliais pigmentares retinais através da inibição de HTRA1 no modelo de coelho de dano na retina causado pela carga com dieta com alto teor de gordura contendo hidroquinona (11-1) Preparação de modelo de coelho de dano na retina pela carga com uma dieta com alto teor de gordura contendo hidroquinona [00334] Os modelos de dano na retina preparados usando uma dieta rica em gordura (HFD) e hidroquinona (HQ) são modelos em que o estresse
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103/113 oxidativo é induzido por um pró-oxidante para causar um dano na retina. Estes modelos foram indicados somente para camundongo (Diego G. Espinosa-Heidmann et al., (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci., Vol. 47 (No. 2): p. 729-737). Portanto, os coelhos JW com 3 anos de idade foram alimentados 4 meses com dieta RC4 (Oriental Yeast Co., Ltd.) contendo 1,5% (P/V) de óleo de coco a 0,25% (P/V) de colesterol a 1,5% (PA7) de óleo de amendoim-2,4% (P/V) de hidroquinona (HFD-HQ) para construir modelos de coelho de dano na retina. Depois da eutanásia, os globos oculares foram extirpados e o segmento anterior do olho foi removido por uma incisão externa de cerca de 5 mm no limbo da córnea. O corpo vítreo foi novamente separado. Depois, a retina-coroide-esclera foi fixada por imersão em 4% (P/V) de fixante de paraformaldeído por 24 horas ou mais. Depois da fixação, a coroide foi separada e imunotingida usando como um anticorpo primário ZO-1, Anticorpo Monoclonal (ZO1-1A12) (Thermo Fisher Scientific Inc.; 339100) e como um anticorpo secundário o Anticorpo Secundário Absorvido Cruzado de IgG de Galinha anti-Camundongo (H+L), Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific Inc.; A-21201). A coroide tingida foi observada sob um microscópio (BZ-9000; Keyence Corp.). A área das células epiteliais tingidas do pigmento retinal (RPE) foi determinada para avaliar o dano na célula RPE.
[00335] A Figura 71 mostra as imagens tingidas das células de RPE de um coelho de 12 semanas de idade, um coelho com 3 anos de idade e um coelho com 3 anos de idade carregado com HFD-HQ (Figura 71(A)) e um gráfico das áreas médias das células de RPE (Figura 71(B)). As células de RPE foram confirmadas ser mais hipertrofiadas no coelho com 3 anos de idade do que no coelho com 12 semanas de idade e ser mais hipertrofiadas pela carga de HFD-HQ. O dano foi confirmado aparecer nas células de RPE. Uma mudança similar foi observada nos globos oculares dos pacientes com degeneração macular relacionada à idade (Ding JD et al., (2011) Proc Natl
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Acad Sci U S A., Vol. 108 (No. 28): p. 279-87).
(11-2) Aumento no nível de expressão de C3 do fator relacionado com AMD na hora do dano na retina [00336] De modo a avaliar a expressão de um fator relacionado com AMD, os tecidos foram respectivamente coletados da retina e da RPE/coroide dos modelos de dano na retina em coelhos. O mRNA foi extraído usando um mini kit RNeasy (Qiagen N.V.) e depois submetido a uma reação de transcrição reversa usando um TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific Inc.). Os níveis de mRNA do componente de complemento 3 (C3) e uma β-actina padrão interno foram quantitativamente analisados por um Ensaio de Expressão de Gene TaqMan (Oc03397832_gl e Oc03824857_gl; Thermo Fisher Scientific Inc.) usando o Sistema de PCR em Tempo-Real Rápido 7900HT (Applied Biosystems, Inc.). A análise foi realizada an = 4 para os coelhos com 3 nos de idade en = 10 para os coelhos com 3 anos de idade carregados com HFD-HQs.
[00337] Os níveis de expressão de C3 na retina e nas células de RPE e na coroide são mostrados na Figura 71 (C) e (D). Para ambos os tecidos, o nível de expressão de C3 foi confirmado ser aumentado no grupo de coelho que recebeu HFD-HQ.
(11-3) Aumento no nível de proteína HTRA1 no tempo de dano na retina [00338] De modo a examinar o envolvimento de HTRA1 nos modelos de coelho de dano na retina, o humor vítreo foi coletado dos coelhos modelos preparados em (11-1), e enzimaticamente digerido com uma mistura de Trypsin/Lys~C (Promega Corp.). Depois, um fragmento de peptídeo de HTRA1 foi quantificado usando LC (EASY-nLC 1000; Thermo Fisher Scientific Inc.)-MS (TripleTOF 6600; AB Sciex Pte. Ltd). Verificou-se que o nível proteína de HTRA1 é aumentado no humor vítreo dos coelhos que receberam HFD-HQ (Figura 71(E)). A partir destes resultados, a hipertrofia das células de RPE e a expressão aumentada do fator C3 relacionado com
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AMD e HTRA1 foram confirmadas, indicando que os modelos de coelho de dano na retina são úteis na pesquisa na doença da retina relacionada à idade.
(11-4) Efeito protetivo na retina do inibidor de HTRA1 no modelo de coelho de dano na retina [00339] O efeito protetivo na retina do peptídeo que inibe HTR.A1 H308 preparado no Exemplo 1 foi avaliado usando os modelos de coelho. Depois de 2 meses do início da alimentação com HFD-HQ, 50 μΐ de uma solução de 40 mg/ml de H308 foram intravitrealmente administrados a um olho sob anestesia. A solução salina normal foi intravitrealmente administrada ao olho companheiro, n --- 5 para todos os grupos.
[00340] Depois de 4 meses do início da alimentação, a hipertrofia da célula de RPE nos modelos animais foi avaliada. Os resultados são mostrados na Figura 72. O inibidor de HTRA1 apresentou um efeito supressivo na hipertrofia das células de RPE, como visto a partir de ambos os indicadores, isto é, a área média das células de RPE (Figura 72(A)) e o número de células de RPE hipertrofiadas tendo uma área celular de 1500 um2 ou maior (Figura 72(B)). Como mostrado na Figura 71(E), um aumento no HTRA1 foi confirmado no humor vítreo dos modelos, sugerindo o envolvimento de HTRA1 no processo de dano nas células de RPE devido ao HFD-HQ. Deste modo, o peptídeo que inibe HTRA1 é útil como um agente de antidegeneração macular relacionada à idade. Este teste indicou que o peptídeo que inibe HTRA1 é útil na prevenção, particularmente, da degeneração macular seca relacionada à idade.
[00341] A presença do peptídeo que inibe HTRA1 foi confirmada na retina de um coelho normal que recebeu o peptídeo que inibe HTRA1, indicando a alta penetração tissular do peptídeo que inibe HTRA1.
Exemplo 12. Efeito supressivo do peptídeo que inibe HTRA1 no teste de indução de mRNA VEGF usando uma célula epitelial de pigmento na retina humana ARPE-19
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106/113 [00342] As células ARPE-19 foram cultivadas até confluentes em Transwell de 12 mm com 0,4 gde Inserto de Membrana de Poliéster Porosa, Estéril (Coming Inc.) sob condições de 37° C e 5% de CO2 usando um meio de DMEM/F-12 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e penicilina-estreptomicina (Thermo-Fisher Scientific Inc.). Depois, as células foram cultivadas em DMEM/F-12 sem FBS por 5 dias. H2O2 (concentração final: 500 μΜ) foi adicionado às camadas superiores e inferiores da câmara, e o complemento de soro humano normal (Quidel Corp.) (concentração final: 25%) foi adicionado à camada superior da câmara. Cada um de HTRA1 (Exemplo 2-2), HTRA1 mutante da protease de HTRA1 inativa (S328A) (Exemplo 2-3), ou peptídeo que inibe HTRA1 H308_DlG_S16A (Exemplo 6) foram novamente adicionados em uma concentração final de 1 μΜ às camadas superiores e inferiores da câmara. Quatro horas mais tarde, o sobrenadante de cultura foi removido, e as células foram lavadas com PBS. Depois, o mRNA foi extraído usando SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Toyobo Co., Ltd.) e submetido a uma reação de transcrição reversa. O nível de mRNA do VEGF foi quantitativamente analisado pelos Ensaios de Expressão de Gene TaqMan (Hs000900055_ml e Hs02786624_gl; Thermo Fisher Scientific Inc.) usando um Sistema de PCR e Tempo-Real Rápido 7900HT (Applied Biosystems, Inc.). LACUNADH foi usado na correção do nível de mRNA.
[00343] Os resultados são mostrados na Figura 74. A adição de H2O2, complemento de soro humano normal e HTRA1 aumentou notavelmente o nível de mRNA de VEGF quando comparado com as condições envolvendo a adição de H2O2, complemento de soro humano normal e HTRA1 mutante de HTRA1 inativo (S328A). Confirmou-se que a coadição do peptídeo que inibe HTRA1 H308_DlG_S16A suprime a expressão de VEGF. A indução de VEGF das células epiteliais pigmentares retinais foi notavelmente importante para a patogênese da degeneração macular úmida relacionada à idade
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107/113 (Klettner A. et al., (2009) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol., Vol. 247: p. 1487-1492). Além disso, foi considerado que tal indução de VEGF mórbida é envolvida não somente na patogênese mas na manutenção da condição patológica. Deste modo, a administração do peptídeo da presente invenção tal como peptídeo que inibe HTRA1 H308_D1G_S16A é eficaz para a prevenção e tratamento da degeneração macular úmida relacionada à idade.
Exemplo 13. Efeito supressivo do peptídeo que inibe a migração de HTRA1 H3O8JD1G_S16A na célula endotelial da veia umbilical humana (HUVEC) (13-1) teste de migração de HUVEC [00344] HUVEC (Kurabo Industries Ltd.) foi cultivada por 18 horas sob condições de 37° C e 5% de CO2 em um meio (EGM isento de soro contendo BS A a 0,1%) em que o meio basal EBM(TM)-2 (Lonza Walkersville, Inc.) contendo 0,1% de BS A foi suplementado com um conjunto de fator aditivo de EGM(TM)-2 SingleQuots(TM) exceto para soro e VEGF. Depois, as células foram ajustadas a 4 x 105 células/ml com 0,1% de EGM isento de soro contendo BSA. 4 x 105 células/ml da suspensão de HUVEC foi adicionada a 50 μΐ/poço a uma camada superior de uma câmara de um Sistema de Suporte Permeável de Poços Múltiplos com 96 Poços de HTS Corning FluoroBlok com um 3,0 μιη de uma Membrana PET de Alta Densidade (Corning Inc.) tendo uma membrana revestida com gelatina. Depois, cada amostra descrita abaixo (meios 1, 2 ou 3) foi adicionada a 210 μΐ/poço à camada inferior da câmara (n - 3). EGM isento de soro contendo BSA a 0,1% foi adicionado a 50 μΐ/poço à camada superior de uma câmara sem a adição de HUVEC, e EGM isento de soro contendo BSA a 0,1% foi adicionado a 210 μΐ/poço à camada inferior da câmara (n ~ 3).
[00345] Meio 1; EGM isento de soro contendo BSA a 0,1%
Meio 2; meio EBM(TM)-2 suplementado com todos os fatores aditivos de EGM(TM)-2 SingleQuots(TM) (meio de crescimento EGM)
Meio 3; Meio de crescimento EGM contendo 300 nm de
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H3O8_D1G_S16A [00346] Um Sistema de Suporte de Reservatórios Múltiplos de 96
Reservatórios de HTS FluoroBlok suplementado com as células e a amostra foi incubada por 2 horas sob condições de 37° C e 5% de CO2. A HUVEC que migrou para a camada inferior foi lavada com PBS e depois tingida por 15 minutos com EGM isento de soro contendo BS A a 0,1% contendo 4 pg/mL de Calceína-AM (Thermo Fisher Scientific Inc.). Depois, o meio foi substituído com PBS. A intensidade de fluorescência (comprimento de onda da excitação/comprimento de onda de fluorescência: 485 nm/535 nm) de cada poço foi medida usando um leitor de placa (ARVO-MX, PerkinElmer, Inc.), e as células migradas foram contadas para cada poço de acordo com a seguinte expressão.
[00347] Células Migradas - Intensidade de fluorescência média dos poços contendo HUVEC (n = 3) - intensidade de fluorescência média dos poços vazios (n = 3).
[00348] Os resultados são mostrados 11a Figura 75. Confirmou-se que o peptídeo que inibe HTRAl H308_DlG_S16A tem um efeito supressivo 11a migração da HUVEC induzida no meio contendo soro. Portanto, verificou-se que o peptídeo da presente invenção apresenta um efeito supressivo 11a angiogênese, uma característica da degeneração macular úmida relacionada à idade.
Exemplo 14. Efeito protetivo da retina do peptídeo que inibe HTRAl em um modelo de coelho de dano na retina (parte 2) [00349] O peptídeo que inibe HTRAl H308 preparado 110 Exemplo 1 ou um dos três peptídeos que inibem a HTRAl preparados no Exemplo 6 é avaliado quanto seu efeito terapêutico 110 dano na retina usando os modelos de coelho de dano na retina preparados e avaliados nos Exemplos (11-1) a (11-
3). 50 μΐ de um 40 mg/ml de solução de peptídeo de inibição foram intravitrealmente administrados a um olho de cada modelo animal sob
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109/113 anestesia, e o animal é criado por 2 meses. Uma solução salina normal é intravitrealmente administrada ao olho companheiro, n ~ 5 para todos os grupos.
[00350] O aumento na área da célula de RPE ou aumento na contagem de célula de RPE deve ser verificado no grupo de administração de solução salina normal, enquanto que o aumento na área da célula de RPE ou o aumento na contagem de célula de RPE deve ser suprimido no grupo de administração de peptídeo que inibe HTRAl. Deste modo, o peptídeo que inibe HTRAl pode ser confirmado ser útil como um agente antidegeneração macular relacionada à idade. Neste Exemplo, o peptídeo que inibe HTRAl pode ser confirmado ser útil no tratamento, em particular, da degeneração macular seca relacionada à idade.
Aplicabilidade Industrial [00351] O peptídeo provido pela presente invenção, e uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo são úteis no tratamento ou prevenção, etc. da degeneração macular relacionada à idade e outros.
Texto Livre da Listagem de Sequência
SEQ ID NO: 1 - Sequência de aminoácidos do SPINK2 humano (Figura 13)
SEQ ID NO: 2 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do SPINK2 humano (Figura 14)
SEQ ID NO: 3 - Sequência de aminoácidos do peptídeo H218 (Figura 15)
SEQ ID NO: 4 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H218 (Figura 16)
SEQ ID NO: 5 - Sequência de aminoácidos do peptídeo H223 (Figura 17)
SEQ ID NO: 6 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H223 (Figura 18)
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SEQ ID NO: 7 - Sequência de aminoácidos do peptídeo H228 (Figura 19)
SEQ ID NO: 8 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H228 (Figura 20)
SEQ ID NO: 9 - Sequência de aminoácidos do peptídeo H308 (Figura 21)
SEQ ID NO: 10 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H308 (Figura 22)
SEQ ID NO: 11 - Sequência de aminoácidos do peptídeo H321 (Figura 23)
SEQ ID NO: 12 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H321 (Figura 24)
SEQ ID NO: 13 - Sequência de aminoácidos do peptídeo H322 (Figura 25)
SEQ ID NO: 14 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo H322 (Figura 26)
SEQ ID NO: 15 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H308AT (Figura 27)
SEQ ID NO: 16 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H308AT (Figura 28)
SEQ ID NO: 17 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H321AT (Figura 29)
SEQ ID NO: 18 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H321AT (Figura 30)
SEQ ID NO: 19 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H322AT (Figura 31)
SEQ ID NO: 20 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H322AT (Figura 32)
SEQ ID NO: 21 - Sequência de aminoácidos do peptídeo M7
Petição 870190065362, de 11/07/2019, pág. 116/119 in /113 (Figura 33)
SEQ ID NO: 22 - Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo M7 (Figura 34)
SEQ ID NO: 23 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H308_S16A (Figura 35)
SEQ ID NO: 24 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H3O8_D1G_S16A (Figura 36)
SEQ ID NO: 25 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H3O8_D1S_S16A (Figura 37)
SEQ ID NO: 26 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H3O8_D1E_S16A (Figura 38)
SEQ ID NO: 27 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H3O8_D1SLI_S16A (Figura 39)
SEQ ID NO: 28 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H321ATJD1GJS16A (Figura 40)
SEQ ID NO: 29 - Sequência de aminoácidos do derivado de peptídeo H322ATJD1G_S16A (Figura 41)
SEQ ID NO: 30 - Fórmula Geral do peptídeo que inibe
HTRA1 (Figura 42)
SEQ ID NO: 31 - Sequência de aminoácidos consistindo na etiqueta S e ligante (Figura 43)
SEQ ID NO: 32 - Sequência de aminoácidos do hexâmero Cterminal (Figura 44)
SEQ ID NO: 33 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 1 (Figura 45)
SEQ ID NO: 34 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 2 (Figura 46)
SEQ ID NO: 35 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 3 (Figura 47)
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112/113
SEQ ID NO: 36 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 4
(Figura 48) SEQ ID NO: 37 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 5
(Figura 49) SEQ ID NO: 38 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 6
(Figura 50) SEQ ID NO: 39 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 7
(Figura 51) SEQ ID NO: 40 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 8
(Figura 52) SEQ ID NO: 41 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 9
(Figura 53) SEQ ID NO: 42 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 10
(Figura 54) SEQ ID NO: 43 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 11
(Figura 55) SEQ ID NO: 44 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 12
(Figura 56) SEQ ID NO: 45 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 13
(Figura 57) SEQ ID NO: 46 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 14
(Figura 58) SEQ ID NO: 47 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 15
(Figura 59) SEQ ID NO: 48 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 16
(Figura 60) SEQ ID NO: 49 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 17
(Figura 61) SEQ ID NO: 50 - Sequência de nucleotídeos do iniciador 18
Petição 870190065362, de 11/07/2019, pág. 118/119
113/113 (Figura 62)
SEQ ID NO: 51 - Sequência de nucleotideos do iniciador 19 (Figura 63)
SEQ ID NO: 52 - Sequência de nucleotideos do iniciador 20 (Figura 64)
SEQ ID NO: 53 - Sequência de aminoácidos de HTRA1 humano (total) (Figura 65)
SEQ ID NO: 54 - Sequência de aminoácidos de H2-Opt (Figura 8)
SEQ ID NO: 55 - Sequência de nucleotideos do iniciador 21 (Figura 76)
SEQ ID NO: 56 - Sequência de nucleotideos do iniciador 22 (Figura 77)

Claims (29)

1. Peptídeo mutante SPINK2, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42) e inibe a atividade de protease de HTRA1 humano.
2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro Xaa (Xi) é Asp, Glu, Ser, Gly, ou Ile, o segundo Xaa (X2) é Ala, Gly, Leu, Ser ou Thr, o terceiro Xaa (X3) é Asp, His, Lys, Met ou Gin, o quarto Xaa (X4) é Asp, Phe, His, Ser ou Tyr, o quinto Xaa (X5) é Ala, Asp, Glu, Met ou Asn, o sexto Xaa (Xô) é Met ou Trp, o sétimo Xaa (X7) é Gin, Trp, Tyr ou Vai, o oitavo Xaa (Xs) é Phe, Leu ou Tyr, o nono Xaa (X9) é Phe ou Tyr, o décimo Xaa (X10) é Ala, Glu, Met ou Vai, e o décimo primeiro Xaa (Xn) é Ala, Thr ou Vai.
3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 a 29 (Figuras 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35 a 41).
4. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido preparada pela ligação peptídica de um a três aminoácidos ao lado de terminal amino da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42).
5. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido preparada pela ligação peptídica de um ou dois aminoácidos ao lado de terminal carboxila da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 30 (Figura 42).
6. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura tridimensional distinguida por ter três ligações de dissulfeto e compreender uma estrutura de laço, hélice α e folha β.
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2/5
7. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido compreendida no peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 7.
9. Célula, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 7 ou o vetor como definido na reivindicação 8 ou que produz o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
10. Método para produzir um peptídeo mutante SPINK2 que inibe a atividade de protease de HTRA1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas (i) e (ii):
(i) cultivar a célula como definida na reivindicação 9; e (ii) recuperar o peptídeo mutante SPINK2 da cultura.
11. Peptídeo mutante SPINK2, caracterizado pelo fato de ser obtido pelo método como definido na reivindicação 10.
12. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 11 unido a uma porção adicional.
13. Conjugado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser um polipeptídeo.
14. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga ao peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 11, ou um fragmento funcional do mesmo.
15. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 11, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 7, o vetor como definido na reivindicação 8, a célula como definida na reivindicação 9, o conjugado como
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3/5 definido na reivindicação 12 ou 13, e/ou o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo como definido na reivindicação 14.
16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 11 e/ou o conjugado como definido na reivindicação 12 ou 13.
17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação
16, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento ou a prevenção de uma doença relacionada com HTRA1.
18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação
17, caracterizada pelo fato de que a doença relacionada com HTRA1 é uma ou duas ou mais doenças selecionadas a partir do grupo consistindo em degeneração macular úmida relacionada à idade, degeneração macular seca relacionada à idade, atrofia geográfica, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, vasculopatia coroidal polipoidal, artrite reumatoide e osteoartrite.
19. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que compreende um ou dois ou mais medicamentos adicionais.
20. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de ser usada em combinação com um ou dois ou mais medicamentos adicionais.
21. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizada pelo fato de ser um agente de proteção retinal.
22. Método para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas 1 a 3:
[etapa 1] incubar HTRA1 protease e um substrato na presença e ausência de uma substância de teste;
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4/5 [etapa 2] detectar atividade de HTRA1 protease na presença e ausência da substância de teste; e [etapa 3] determinar que a substância de teste é positiva quando a atividade de HTRA1 protease na presença da substância de teste for menor do que a atividade de HTRA1 protease na ausência da substância de teste.
23. Método para identificar um agente de proteção retinal, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas 1 a 3:
[etapa 1] incubar HTRA1 protease e um substrato na presença e ausência de uma substância de teste;
[etapa 2] detectar atividade de HTRA1 protease na presença e ausência da substância de teste; e [etapa 3] determinar que a substância de teste é positiva quando a atividade de HTRA1 protease na presença da substância de teste for menor do que a atividade de HTRA1 protease na ausência da substância de teste.
24. Método para preparar um coelho modelo de dano retinal, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de alimentar um coelho com uma dieta com alto teor de gordura contendo hidroquinona durante 3 a 6 meses, em que as células epiteliais pigmentares retinais do coelho modelo são hipertrofiadas quando comparadas com as células epiteliais pigmentares retinais de um coelho normal.
25. Coelho modelo de dano retinal preparado pelo método como definido na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o coelho modelo de dano retinal tem células epiteliais pigmentares retinais hipertrofiadas quando comparado com um coelho normal.
26. Método para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, ou um agente de proteção retinal, caracterizado pelo fato de que compreende as
Petição 870190065354, de 11/07/2019, pág. 124/168
5/5 seguintes etapas (i) e (ii):
(i) medir a hipertrofia de células epiteliais pigmentares retinais no coelho como definido na reivindicação 25 com e sem administração de uma substância de teste; e (ii) determinar que a substância de teste é positiva quando a hipertrofia de células epiteliais pigmentares retinais com a administração da substância de teste for suprimida quando comparada com a hipertrofia de células epiteliais pigmentares retinais sem a administração da mesma.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a medição na etapa (i) é a medição de uma área média das células epiteliais pigmentares retinais ou o número de células epiteliais pigmentares retinais hipertrofiadas.
28. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento ou a prevenção de degeneração macular seca relacionada à idade.
29. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento ou a prevenção de degeneração macular úmida relacionada à idade.
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