KR20190095925A - 가령 황반 변성증 치료용 펩티드 - Google Patents

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Abstract

신규 펩티드를 제공하는 것 서열 번호 30 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 프로테아제 활성을 저해하는 펩티드.

Description

가령 황반 변성증 치료용 펩티드
본 발명은, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 펩티드의 제조 방법, 이러한 방법에 의해 얻어지는 펩티드, 펩티드를 포함하는 조성물, 펩티드를 포함하는 의약 조성물, 펩티드를 포함하는 각종 질환의 치료 또는 예방을 위한 그 의약 조성물, 각종 질환의 치료 또는 예방을 위한 펩티드의 사용, 펩티드를 투여하는 공정을 포함하는 각종 질환의 치료 방법 등에 관한 것이다.
고온 요건 A 세린 펩티다아제 1 (High temperature requirement A serine peptidase 1: HTRA1) 은 트립신형 세린 프로테아제 (PRSS11；Clan PA, 패밀리 S1) 이고, IGFBP 형 모듈 및 카잘 (Kazal) 형 모듈로 이루어지는 N 말단 도메인, 프로테아제 도메인 및 C 말단의 PDZ 도메인으로 구성된다. HTRA1 은 HTRA2, HTRA3, HTRA4 를 포함하는 HTRA 패밀리에 속하고 있고, 다른 HTRA 분자와 마찬가지로, 가역적으로 활성형과 비활성형 구조를 나타낸다 (비특허문헌 1, 2). 그 발현은 인간의 체내에 있어서 편재적이고, 연골이나 활막, 태반 등에 있어서 상대적으로 높은 발현이 확인되고 있다. HTRA1 은 아밀로이드 전구체 단백질 (Amyloid precursor protein), 피브로모듈린 (Fibromodulin), 클러스테린 (Clusterin), ADAM9, 비트로넥틴 (Vitronectin) 등 많은 세포 외 매트릭스 구성 성분을 기질로서 절단하고, 관절염이나 골 석회화로 대표되는 질환과 관련된 것이 알려져 있다 (비특허문헌 3, 4, 5, 6). 또한, HTRA1 프로모터 영역에 유전자 다형 (rs11200638) 이 있는 경우, HTRA1 전사량이 상승하는 것이 알려져 있고, 또, 그 다형과 가령 황반 변성증 (Age-related Macular Degeneration：이하 AMD」 라고 한다) 이 강하게 상관하는 것이 게놈 와이드 관련 해석으로부터 밝혀져 있다 (비특허문헌 7, 8).
AMD 는 가령에 수반하는 만성 변성 질환이며, 중심 시력의 저하를 특징으로 한다. 후천적 실명 원인 질환으로서 구미에서는 제 1 위, 일본에서는 녹내장, 당뇨병 망막증, 망막 색소 변성에 이어 제 4 위의 환자수이다 (비특허문헌 12). AMD 환자의 림프구, 혹은 망막 색소 상피 세포에서 mRNA 및 단백질의 레벨로 HTRA11 이 상승하고 있다 (비특허문헌 13). 또, AMD 의 전구 병변인 드루젠, 변성된 망막 색소 상피 세포, 혹은 신생 혈관막에 있어서, HTRA1 의 단백질의 발현이 상승하고 있다는 보고가 있다 (비특허문헌 11 및 14 ∼ 16). 또, 망막 박리, 망막 정맥 폐색증, 유리체 출혈, 황반 원공 등의 유리체액 중에 HTRA1 단백질이 검출되어 있고, 그 값은 혈관 신생 마커인 VEGF 와 연동하고 있다는 보고도 있다 (비특허문헌 17). 또한, HTRA1 트랜스제닉 마우스에서는, 피불린5 (Fibulin5) 나 트로포엘라스틴 (Tropoelastin) 과 같은 기저막을 구성하는 단백질의 분해 및 브루흐막의 탄성 층 (Elastic layer) 의 단편화가 관찰되고 있다 (비특허문헌 9). 그러나, 상기 질환을 치료하기 위해서, 그리고 망막을 보호하기 위해서, HTRA1 의 프로테아제 활성의 저해가 유효한지 여부에 대해서는 직접적으로 개시되어 있지 않다.
SPINK2 (세린 프로테아제 저해제 카잘 제2형 (Serine Protease Inhibitor Kazal-type 2)) 는, 3 개의 디술파이드 결합을 갖는 카잘 (Kazal) 형 도메인이며, 트립신/아크로신 저해제 (trypsin/acrosin inhibitor) 로서 기능하지만 (비특허문헌 10), AMD 와의 관계는 명확하게 되어 있지 않다.
AMD 를 평가하는 동물 모델로는, 마우스와 토끼의 것이 알려져 있다 (비특허문헌 18, 19, 20). 인간 안질환에 외삽할 수 있는 모델로서 보다 바람직한 토끼에 대해 (비특허문헌 21), 종래의 모델에서는, 망막·맥락막 내의 이상 소견을 관찰할 뿐으로, 망막 색소 상피 세포 (RPE 세포) 의 기능 이상 등을 평가하는 것은 어려울 뿐만 아니라, 모델 형성에 8 개월이라고 하는 장기간을 필요로 하는 등 문제점이 있었다 (비특허문헌 20).
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신규 고온 요건 A 세린 펩티다아제 1 (HTRA1) 저해제를 제공하는 것.
본 발명은
(1)
서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 인간 HTRA1 이 갖는 프로테아제 활성을 저해하는, SPINK2 변이체 펩티드,
(2)
1 번째의 Xaa(X1) 은 Asp, Glu, Ser, Gly, 또는 Ile, 2 번째의 Xaa(X2) 는 Ala, Gly, Leu, Ser 또는 Thr, 3 번째의 Xaa(X3) 은 Asp, His, Lys, Met 또는 Gln, 4 번째의 Xaa(X4) 는 Asp, Phe, His, Ser 또는 Tyr, 5 번째의 Xaa(X5) 는 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Asn, 6 번째의 Xaa(X6) 은 Met 또는 Trp, 7 번째의 Xaa(X7) 은 Gln, Trp, Tyr 또는 Val, 8 번째의 Xaa(X8) 은 Phe, Leu 또는 Tyr, 9 번째의 Xaa(X9) 는 Phe 또는 Tyr, 10 번째의 Xaa(X10) 은 Ala, Glu, Met 또는 Val, 그리고, 11 번째의 Xaa(X11) 은 Ala, Thr 또는 Val 인, (1) 기재의 펩티드,
(3)
서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 내지 29 (도 15, 도 17, 도 19, 도 21, 도 23, 도 25, 도 27, 도 29, 도 31, 도 33 및, 도 35 내지 41) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 또는 (2) 기재의 펩티드,
(4)
서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열의 아미노 말단측에 1 내지 3 개의 아미노산이 펩티드 결합하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(5)
서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열의 카르복실 말단측에 1 또는 2 개의 아미노산이 펩티드 결합하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(6)
3 개의 디술파이드 결합을 갖고, 루프 구조, α 헬릭스 및 β 시트를 포함함으로써 특징지어지는 입체 구조를 갖는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(7)
(1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(8)
(7) 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터,
(9)
(7) 기재의 폴리뉴클레오티드 혹은 (8) 기재의 벡터를 포함하거나 또는 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 산생하는 세포,
(10)
하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, HTRA1 이 갖는 프로테아제 활성을 저해하는 SPINK2 변이체 펩티드의 제조 방법：
(i) (9) 기재의 세포를 배양하는 공정；
(ii) 그 배양물로부터 SPINK2 변이체 펩티드를 회수하는 공정,
(11)
(10) 기재의 방법에 의해 얻어지는 SPINK2 변이체 펩티드,
(12)
(1) 내지 (6) 및 (11) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 다른 부분이 연결되어 이루어지는 콘쥬게이트,
(13)
폴리펩티드인, (12) 기재의 콘쥬게이트,
(14)
(1) 내지 (6) 및 (11) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 결합하는, 항체 또는 그 기능 단편,
(15)
(1) 내지 (6) 및 (11) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, (7) 기재의 폴리뉴클레오티드, (8) 기재의 벡터, (9) 기재의 세포, (12) 혹은 (13) 기재의 콘쥬게이트, 및/또는, (14) 기재의 항체 혹은 그 기능 단편을 포함하는 조성물,
(16)
(1) 내지 (6) 및 (11) 중 어느 하나에 기재된 펩티드 및/또는 (12) 또는 (13) 에 기재된 콘쥬게이트를 포함하는 의약 조성물.
(17)
HTRA1 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한, (16) 기재의 의약 조성물,
(18)
HTRA1 관련 질환이 삼출형 가령 황반 변성증, 위축형 가령 황반 변성증, 지도상 위축, 당뇨병 망막증, 미숙아 망막증, 폴립상 맥락막 혈관증, 관절 류머티즘, 및 변형성 관절증으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상인, (17) 기재의 의약 조성물,
(19)
1 개 또는 2 개 이상의 다른 의약을 포함하는, (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(20)
1 개 또는 2 개 이상의 다른 의약과 조합하여 사용되는, (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(21)
망막 보호제인, (16) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(22)
하기의 공정 1 내지 공정 3 을 포함하는, 가령 황반 변성증의 치료약 또는 예방약을 동정 (同定) 하는 방법：
[공정 1] HTRA1 프로테아제 및 기질을, 피검 물질의 존재하 또는 비존재하에서 보온한다；
[공정 2] 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성을 검출한다；
[공정 3] 피검 물질의 존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성이, 피검 물질의 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성과 비교하여 작은 경우, 그 피검 물질을 양성으로 판정한다,
(23)
하기의 공정 1 내지 공정 3 을 포함하는, 망막 보호제를 동정하는 방법：
[공정 1] HTRA1 프로테아제 및 기질을, 피검 물질의 존재하 또는 비존재하에서 보온한다；
[공정 2] 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성을 검출한다；
[공정 3] 피검 물질의 존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성이, 피검 물질의 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성과 비교하여 작은 경우, 그 피검 물질을 양성으로 판정한다,
(24)
하이드로퀴논을 포함하는 고지방식을 3 내지 6 개월 섭식시키는 공정을 포함하는, 망막 장애 모델 토끼의 제조 방법으로서, 그 모델 토끼의 망막 색소 상피 세포가 정상 토끼의 망막 색소 상피 세포에 비해 비대해 있는 것을 특징으로 하는 방법,
(25)
(24) 기재의 방법에 의해 제조되고, 정상 토끼에 비해 비대한 망막 색소 상피 세포를 갖고 있는 것을 특징으로 하는, 망막 장애 모델 토끼,
(26)
하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, 가령 황반 변성증의 치료약 혹은 예방약, 또는, 망막 보호제를 동정하는 방법：
(i) (25) 기재의 토끼에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 비대를, 피검 물질 투여하 및 비투여하에서 측정하는 공정；및
(ii) 그 피검 물질 투여하에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 비대가 비투여하와 비교하여 억제된 경우, 그 피검 물질을 양성으로 판정하는 공정,
(27)
공정 (i) 에 있어서의 측정이, 망막 색소 상피 세포의 평균 면적 또는 비대한 망막 색소 상피 세포수의 측정인, (26) 기재의 방법,
(28)
위축형 가령 황반 변성증의 치료 또는 예방을 위한, (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물, 및,
(29)
삼출형 가령 황반 변성증의 치료 또는 예방을 위한, (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
등에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 펩티드, 그것을 포함하는 의약 조성물은, HTRA1 저해 활성을 갖고, 가령 황반 변성증의 치료 또는 예방 등에 유용하다.
도 1(A) 는, 인간/마우스/랫트/원숭이 HTRA1 의 서열 유사성을 비교한 도면. 파선은 효소 활성 도메인 (204Gly ∼ 364Leu) 을 나타낸다.
도 1(B) 는, 인간/마우스/랫트/원숭이 HTRA1 의 서열 유사성을 비교한 도면 (계속).
도 2 는, 펩티드 기질의 분해 속도를 지표로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (cat) 저해 활성을 평가한 도면. 패널 A 내지 C 에서는, 각 저해 펩티드를, 패널 D 는 대조의 야생형 SPINK2 로 각각 평가하였다.
도 3 은, 펩티드 기질의 분해 속도를 지표로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (full) 저해 활성을 평가한 도면 (패널 A 내지 C).
도 4(A) 는, 인간 비트로넥틴의 분해를 지표로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (cat) 저해 활성을 평가한 도면. 인간 비트로넥틴 항체 (Human Vitronectin Antibody) (R ＆ D Systems；MAB2349) 를 사용한 웨스턴 블롯 (Western blot) 에 의해 해석하였다.
도 4(B) 는, 인간 비트로넥틴의 분해를 지표로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (cat) 저해 활성을 평가한 도면 (계속).
도 5(A) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 1). 사용한 각 프로테아제의 명칭과 그 농도, 기질의 명칭과 그 농도 등은 실시예 3 참조.
도 5(B) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 2).
도 5(C) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 3).
도 5(D) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 4).
도 6 은, X 선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 HTRA1 (cat)/HTRA1 저해 펩티드 복합체를 나타낸 도면. HTRA1 (cat) 가 형성하는 HTRA1 3 량체에 각각 저해 펩티드가 결합되어 있었다.
도 7 은, X 선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 HTRA1 (cat)/HTRA1 저해 펩티드 복합체를 단량체로서 나타낸 도면. 그 저해 펩티드는 HTRA1 (cat) 활성 중심을 포함하는 영역에 결합되어 있었다.
도 8 은, H2-Opt 의 아미노산 서열 (서열 번호 54). N 말단의 「Mca-I」 는, N-(4-메틸쿠마릴-7-아미드)-이소류신 (N-(4-methylcoumaryl-7-amide)-isoleucine) 을, C 말단의 「(Dnp)K」 는, N 엡실론-(2,4-디니트로페닐)-라이신 (N epsilon-(2,4-dinitrophenyl)-lysine) 을, 각각 의미한다.
도 9 는, 랫트 광 조사 망막 장애 모델의 유리체액 중에서 HTRA1 의 발현이 항진한 것을 나타낸 도면. 인간 HTRA1/PRSS11 항체 (Human HTRA1/PRSS11 Antibody) (R ＆ D Systems；AF2916) 를 사용한 웨스턴 블롯 에 의해 해석하였다.
도 10 은, 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서, HTRA1 저해 펩티드 투여군이 망막 단층의 외과립층에 포함되는 핵수의 감소를 억제하는 것을 나타낸 도면. 생리 식염수 투여군의 예수는 4 이며, 그 밖의 군의 예수는 5 였다.
도 11 은, 펩티드 기질의 분해 속도를 지표로 하여, 5 종의 HTRA1 저해 펩티드 유도체의 HTRA1 (cat) 저해 활성을 평가한 도면.
도 12 는, HTRA1 (cat) 와 3 종의 HTRA1 저해 펩티드가 결합되어 있는 것을 면역 침강법에 의해 평가한 도면.
도 13 은, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1)
도 14 는, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 2)
도 15 는, 펩티드 H218 의 아미노산 서열 (서열 번호 3)
도 16 은, 펩티드 H218 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 4)
도 17 은, 펩티드 H223 의 아미노산 서열 (서열 번호 5)
도 18 은, 펩티드 H223 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 6)
도 19 는, 펩티드 H228 의 아미노산 서열 (서열 번호 7)
도 20 은, 펩티드 H228 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 8)
도 21 은, 펩티드 H308 의 아미노산 서열 (서열 번호 9)
도 22 는, 펩티드 H308 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 10)
도 23 은, 펩티드 H321 의 아미노산 서열 (서열 번호 11)
도 24 는, 펩티드 H321 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 12)
도 25 는, 펩티드 H322 의 아미노산 서열 (서열 번호 13)
도 26 은, 펩티드 H322 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 14)
도 27 은, 펩티드 유도체 H308AT 의 아미노산 서열 (서열 번호 15)
도 28 은, 펩티드 유도체 H308AT 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 16)
도 29 는, 펩티드 유도체 H321AT 의 아미노산 서열 (서열 번호 17)
도 30 은, 펩티드 유도체 H321AT 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 18)
도 31 은, 펩티드 유도체 H322AT 의 아미노산 서열 (서열 번호 19)
도 32 는, 펩티드 유도체 H322AT 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 20)
도 33 은, 펩티드 M7 의 아미노산 서열 (서열 번호 21)
도 34 는, 펩티드 M7 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 22)
도 35 는, 펩티드 유도체 H308＿S16A 의 아미노산 서열 (서열 번호 23)
도 36 은, 펩티드 유도체 H308＿D1G＿S16A 의 아미노산 서열 (서열 번호 24)
도 37 은, 펩티드 유도체 H308＿D1S＿S16A 의 아미노산 서열 (서열 번호 25)
도 38 은, 펩티드 유도체 H308＿D1E＿S16A 의 아미노산 서열 (서열 번호 26)
도 39 는, 펩티드 유도체 H308＿D1SLI＿S16A 의 아미노산 서열 (서열 번호 27)
도 40 은, 펩티드 유도체 H321AT＿D1S＿S16A 의 아미노산 서열 (서열 번호 28)
도 41 은, 펩티드 유도체 H322AT＿D1S＿S16A 의 아미노산 서열 (서열 번호 29)
도 42 는, HTRA1 저해 펩티드의 일반식 (서열 번호 30). X1 내지 X11 은 임의의 아미노산을 나타낸다.
도 43 은, S 태그 (S tag) 및 링커로 이루어지는 아미노산 서열 (서열 번호 31)
도 44 는, C 말단 헥사머의 아미노산 서열 (서열 번호 32)
도 45 는, 프라이머 1 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 33)
도 46 은, 프라이머 2 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 34)
도 47 은, 프라이머 3 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 35)
도 48 은, 프라이머 4 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 36)
도 49 는, 프라이머 5 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 37)
도 50 은, 프라이머 6 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 38)
도 51 은, 프라이머 7 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 39)
도 52 는, 프라이머 8 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 40)
도 53 은, 프라이머 9 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 41)
도 54 는, 프라이머 10 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 42)
도 55 는, 프라이머 11 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 43)
도 56 은, 프라이머 12 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 44)
도 57 은, 프라이머 13 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 45)
도 58 은, 프라이머 14 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 46)
도 59 는, 프라이머 15 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 47)
도 60 은, 프라이머 16 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 48)
도 61 은, 프라이머 17 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 49)
도 62 는, 프라이머 18 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 50)
도 63 은, 프라이머 19 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 51)
도 64 는, 프라이머 20 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 52)
도 65 는, 인간 HTRA1 (full) 의 아미노산 서열 (서열 번호 53)
도 66(A) 는, 펩티드 기질의 분해 속도를 지표로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (cat) 저해 활성을 평가한 도면.
도 66(B) 는, 펩티드 기질의 분해 속도를 지표로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (full) 저해 활성을 평가한 도면.
도 67 은, 인간 비트로넥틴의 분해를 지표로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (cat) 저해 활성을 평가한 도면. 인간 비트로넥틴 항체 (R ＆ D Systems；MAB2349) 를 사용한 웨스턴 블롯 에 의해 해석하였다.
도 68(A) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 1).
도 68(B) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 2).
도 68(C) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 3).
도 68(D) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 4).
도 68(E) 는, 펩티드 기질의 분해를 지표로 하여, 각 프로테아제에 대한 HTRA1 저해 펩티드의 교차성을 평가한 도면 (그 5).
도 69 는, HTRA1 (cat) 와 3 종의 HTRA1 저해 펩티드가 결합되어 있는 것을 면역 침강법에 의해 평가한 도면.
도 70(A) 는, 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서, HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1G＿S16A 투여군이 망막 단층의 외과립층에 포함되는 핵수의 감소를 억제하는 것을 나타낸 도면. 어느 군의 예수도 6, HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1G＿S16A 투여량은 0.2 및 1 ㎍/눈 (eye) 였다.
도 70(B) 는, 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서, HTRA1 저해 펩티드 H321AT＿D1G＿S16A 투여군이 망막 단층의 외과립층에 포함되는 핵수의 감소를 억제하는 것을 나타낸 도면. 어느 군의 예수도 6, HTRA1 저해 펩티드 H321AT＿D1G＿S16A 투여량은 0.2 및 1 ㎍/눈 였다.
도 70(C) 는, 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서, HTRA1 저해 펩티드 H322AT＿D1G＿S16A 투여군이 망막 단층의 외과립층에 포함되는 핵수의 감소를 억제하는 것을 나타낸 도면. 어느 군의 예수도 6, HTRA1 저해 펩티드 H322AT＿D1G＿S16A 투여량은 0.2 및 1 ㎍/눈 였다.
도 71(A) 는, 12 주령 토끼, 3 세령 토끼, 및, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼에 있어서의 RPE 세포를, ZO-1 항체 (Themo Fisher SCIENTIFIC) 를 사용하여 면역 염색한 도면.
도 71(B) 는, 12 주령 토끼, 3 세령 토끼, 및, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼에 있어서의 RPE 세포의 평균 면적.
도 71(C) 는, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼의 망막 조직에 있어서, AMD 관련 인자인 보체 제 3 성분 C3 의 mRNA 가 발현 항진하고 있는 것을 나타낸 도면.
도 71(D) 는, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼의 RPE/맥락막 조직에 있어서, AMD 관련 인자인 보체 제 3 성분 C3 의 mRNA 가 발현 항진하고 있는 것을 나타낸 도면.
도 71(E) 는, LC-MS/MS 에 의해, 12 주령 토끼, 3 세령 토끼, 및, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼에 있어서의 유리체액 중의 HTRA1 농도를 측정한 도면.
도 72(A) 는, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼에 있어서, HTRA1 저해 펩티드 H308 투여군이 RPE 세포의 비대에 대하여 억제 효과를 나타낸 도면. 어느 군도 예수는 5 이고, 평균 면적을 지표로 하였다.
도 72(B) 는, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼에 있어서, HTRA1 저해 펩티드 H308 투여군이 RPE 세포의 비대에 대하여 억제 효과를 나타낸 도면. 어느 군도 예수는 5 이고, 세포 면적이 1500 ㎛2 이상인 RPE 세포수를 지표로 하였다.
도 73 은, 인간/원숭이/토끼/마우스/랫트 HTRA1 의 서열 유사성을 비교한 도면. 파선은 효소 활성 도메인 (204Gly ∼ 364Leu) 을 나타낸다.
도 74 는, H2O2 및 정상 인간 혈청 보체 (Normal Human Serum Complement), HTRA1 첨가에 의해, 인간 망막 색소 상피 세포주 ARPE-19 에 있어서 유도된 VEGF mRNA 에 대하여, HTRA1 저해 펩티드가 억제 효과를 나타낸 도면.
도 75 는, 혈청에 의해 유도된 인간 제대 정맥내 피세포 (HUVEC) 의 유주에 대하여, HTRA1 저해 펩티드가 억제 효과를 나타낸 도면.
도 76 은, 프라이머 21 의 뉴클레오티드 서열 (도 66)
도 77 은, 프라이머 22 의 뉴클레오티드 서열 (도 67)
또한, 본 발명에 있어서 「서열 번호 X (도 Y)」 또는 「도 Y (서열 번호 X)」 라고 기재되는 경우, 당해 서열은 서열 번호 X 에 의해 나타내거나 또는 도 Y 에 의해 나타내는 것을 의미한다.
1. 정의
본 발명에 있어서, 「유전자」 란, 단백질에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그 상보 사슬을 의미하며, 1 본쇄, 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상으로 이루어지고, DNA 사슬과 RNA 사슬의 회합체, 1 개의 사슬 상에 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드가 혼재하는 것 및 그러한 사슬을 포함하는 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상의 핵산 분자도 「유전자」 의 의미에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「유전자」, 「폴리뉴클레오티드」 및 「핵산 분자」 는 동일한 의미이며, 그들의 구성 단위인 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 등의 개수에 의해서는 조금도 한정되지 않고, 예를 들어, DNA, RNA, mRNA, cDNA, cRNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 프라이머 등도 그 범위에 포함된다. 「핵산 분자」 는 약기하여 「핵산」 이라고 불리는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「폴리펩티드」, 「펩티드」 및 「단백질」 은 동일한 의미이다. 표적 분자 X 가 갖는 1 개 또는 2 개 이상의 활성 또는 기능을 저해 또는 억제하는 (이하, 그들의 저해 또는 억제 작용을 정리하여 「X 저해 활성」 이라고 한다.) 펩티드를, 「X 저해 펩티드」 라고 부를 수 있다.
「SPINK2」 는, 세린 프로테아제 저해제 카잘 제 2 형 (Serine Protease Inhibitor Kazal-type 2) 를 의미하며, 3 개의 디술파이드 결합을 갖는 카잘 (Kazal) 형 도메인으로 이루어지는 7kDa 의 단백질이다. 적합한 SPINK2 는 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 인간 SPINK2 를 간단히 「SPINK2」 라고 한다.
「HTRA1」 은, 고온 요건 A 세린 펩티다아제 1 (high temperature requirement A serine peptidase 1) 을 의미하며, IGFBP 형 모듈 및 카잘 (Kazal) 용 모듈로 이루어지는 N 말단 도메인, 프로테아제 도메인 그리고 C 말단의 PDZ 도메인으로 구성되는, HTRA 패밀리가 속하는 단백질이다. 적합한 HTRA1 은 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 인간 HTRA1 을 간단히 「HTRA1」 이라고 하는 경우가 있다.
「HTRA1 저해 펩티드」 는, HTRA1 이 갖는 1 개 또는 2 개 이상의 활성 또는 기능을 저해 또는 억제하는 펩티드를 의미한다. 「HTRA1 저해 펩티드」 의 범위에는, 당해 펩티드의 단편, 다른 부분 (moiety) 의 부가체, 또는, 콘쥬게이트 중, HTRA1 저해 활성을 유지하고 있는 것이 포함된다. 즉, HTRA1 저해 활성을 유지하는 당해 펩티드의 단편, 부가체 및 수식체도 「HTRA1 저해 펩티드」 에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체에서 유래하는 각종 세포, 계대 배양 세포, 초대 배양 세포, 세포주, 재조합 세포, 효모, 미생물 등도 포함된다.
본 발명에 있어서, 펩티드가 결합하는 「부위」, 즉 펩티드가 인식하는 「부위」 란, 펩티드가 결합 또는 인식하는 표적 분자 상의 연속적 혹은 단속적인 부분 아미노산 서열 또는 부분 고차 구조를 의미한다. 본 발명에 있어서는, 이러한 부위를 표적 분자 상의 에피토프 또는 결합 부위라고 부를 수 있다.
「SPINK2 변이체」 란, 야생형 SPINK2 가 갖는 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산이 야생형과는 상이한 아미노산으로 치환되고, 1 개 또는 2 개 이상의 야생형의 아미노산이 결실하고, 1 개 또는 2 개 이상의 야생형에는 없는 아미노산이 삽입되고, 및/또는, 야생형에는 없는 아미노산이 야생형의 아미노 말단 (N 말단) 및/또는 카르복실 말단 (C 말단) 에 부가되어 (이하, 「변이」 라고 총칭한다) 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 의미한다. 「SPINK2 변이체」 중, HTRA1 저해 활성을 갖는 것은, HTRA1 저해 펩티드에 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서는 「삽입」 도 「부가」 의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 「1 내지 수 개」 에 있어서의 「수 개」 란, 3 내지 10 개를 가리킨다.
본 발명에 있어서, 「스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 5 × SSC 를 포함하는 용액 중에서 65 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시하고, 이어서 2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 0.5 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 그리고, 0.2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 각각 세정하는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. SSC 란, 150 mM NaCl - 15 mM 시트르산나트륨의 수용액이고, n × SSC 는 n 배 농도의 SSC 를 의미한다.
본 발명에 있어서 「특이적」 및 「특이성」 이라는 말은 「선택적」 및 「선택성」 과 각각 동일한 의미이며, 호환성이 있다. 예를 들어, HTRA1 특이적인 저해 펩티드는, HTRA1 선택적인 저해 펩티드와 동일한 의미이다.
2. 펩티드
2-1. 아미노산
「아미노산」 은, 아미노기 및 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이며, 적합하게는 단백질에, 보다 적합하게는 천연의 단백질에, 구성 단위로서 포함되는 α-아미노산을 의미한다. 본 발명에 있어서, 보다 적합한 아미노산은, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 이며, 특별히 명기하지 않는 한 「아미노산」 은 이들의 합계 20 아미노산을 의미한다. 그들의 합계 20 아미노산을 「천연 아미노산」 이라고 부를 수 있다. 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드는, 적합하게는 천연 아미노산을 함유한다.
본 발명에 있어서는 「아미노산 잔기」 는 「아미노산」 이라고 약기되는 경우가 있다.
또, 본 발명에 있어서, 아미노산은, L-아미노산, D-아미노산, 또는 그 혼합물 (DL-아미노산) 이지만, 특별히 명기하지 않는 한 L-아미노산을 의미한다.
천연 아미노산은, 그 공통되는 측사슬의 성질에 기초하여, 예를 들어, 다음의 그룹으로 나눌 수 있다.
(1) 소수성 아미노산 그룹：Met, Ala, Val, Leu, Ile
(2) 중성 친수성 아미노산 그룹：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln
(3) 산성 아미노산 그룹：Asp, Glu
(4) 염기성 아미노산 그룹：His, Lys, Arg
(5) 주사슬의 방위에 영향을 주는 아미노산의 그룹：Gly, Pro
(6) 방향족 아미노산 그룹：Trp, Tyr, Phe
단, 천연 아미노산의 분류는 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서는, 천연 아미노산은 보존적 아미노산 치환을 받을 수 있다.
「보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)」 이란, 기능적으로 등가 또는 유사한 아미노산과의 치환을 의미한다. 펩티드에 있어서의 보존적 아미노산 치환은, 그 펩티드의 아미노산 서열에 정적 변화를 가져온다. 예를 들어, 동일한 극성을 갖는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산은 기능적으로 등가로 작용하고, 이러한 펩티드의 아미노산 서열에 정적 변화를 가져온다. 일반적으로, 어느 그룹 내의 치환은 구조 및 기능에 대해 보존적이라고 생각할 수 있다. 그러나, 당업자에게는 자명한 바와 같이, 특정한 아미노산 잔기가 완수하는 역할은 당해 아미노산을 포함하는 분자의 3 차원 구조에 있어서의 그 의미에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는, 환원형의 (티올) 폼과 비교하여 보다 극성이 낮은, 산화형의 (디술파이드) 폼을 취할 수 있다. 아르기닌 측사슬의 긴 지방족의 부분은 구조적 및 기능적으로 중요한 특징을 구성할 수 있다. 또, 방향 고리를 포함하는 측사슬 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌) 은 이온-방향족 상호 작용 또는 양이온-pi 상호 작용에 기여할 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 이들 측사슬을 갖는 아미노산을, 산성 또는 비극성 그룹에 속하는 아미노산과 치환해도, 구조적 및 기능적으로는 보존적일 수 있다. 프롤린, 글리신, 시스테인 (디술파이드·폼) 등의 잔기는 주사슬의 입체 구조에 직접적인 효과를 줄 가능성이 있어, 자주 구조적 왜곡 없이 치환할 수는 없다.
보존적 아미노산 치환은, 이하에 나타내는 바와 같이, 측사슬의 유사성에 기초하는 특이적 치환 (레닌저, 생화학, 개정 제 2 판, 1975년 간행, 73 내지 75 페이지：L. Lehninger, Biochemistry, 2nd edition, pp 73-75, Worth Publisher, New York (1975)) 및 전형적 치환을 포함한다.
(1) 비극성 아미노산 그룹：알라닌 (이하, 「Ala」 또는 간단히 「A」 라고 기재한다), 발린 (이하, 「Val」 또는 간단히 「V」 라고 기재한다), 류신 (이하, 「Leu」 또는 간단히 「L」 이라고 기재한다), 이소류신 (이하, 「Ile」 또는 간단히 「I」 라고 기재한다), 프롤린 (이하, 「Pro」 또는 간단히 「P」 라고 기재한다), 페닐알라닌 (「Phe」 또는 간단히 「F」 라고 기재한다), 트립토판 (이하, 「Trp」 또는 간단히 「W」 라고 기재한다), 메티오닌 (이하, 「Met」 또는 간단히 「M」 이라고 기재한다)
(2) 비하전극성 아미노산 그룹：글리신 (이하, 「Gly」 또는 간단히 「G」 라고 기재한다), 세린 (이하, 「Ser」 또는 간단히 「S」 라고 기재한다), 트레오닌 (이하, 「Thr」 또는 간단히 「T」 라고 기재한다), 시스테인 (이하, 「Cys」 또는 간단히 「C」 라고 기재한다), 티로신 (이하, 「Tyr」 또는 간단히 「Y」 라고 기재한다), 아스파라긴 (이하, 「Asn」 또는 간단히 「N」 이라고 기재한다), 글루타민 (이하, 「Gln」 또는 간단히 「Q」 라고 기재한다)
(3) 산성 아미노산 그룹：아스파르트산 (이하, 「Asp」 또는 간단히 「D」 라고 기재한다), 글루타민산 (이하, 「Glu」 또는 간단히 「E」 라고 기재한다)
(4) 염기성 아미노산 그룹：리신 (이하, 「Lys」 또는 간단히 「K」 라고 기재한다), 아르기닌 (이하, 「Arg」 또는 간단히 「R」 이라고 기재한다), 히스티딘 (이하, 「His」 또는 간단히 「H」 라고 기재한다)
본 발명에 있어서, 아미노산은, 천연 아미노산 이외의 아미노산이어도 된다. 예를 들어, 천연의 펩티드나 단백질에 있어서 발견되는 셀레노시스테인, N-포르밀메티오닌, 피롤리딘, 피로글루타민산, 시스틴, 하이드록시프롤린, 하이드록시리신, 티록신, O-포스포세린, 데스모신, β-알라닌, 사르코신, 오르니틴, 크레아틴, γ아미노부티르산, 오파인, 테아닌, 트리콜롬산, 카이닌산, 도우모이산, 아크로멜릭산 등을 들 수 있으며, 노르로이신, Ac-아미노산, Boc-아미노산, Fmoc-아미노산, Trt-아미노산, Z-아미노산 등의 N 말단 보호 아미노산, 아미노산t-부틸에스테르, 벤질에스테르, 시클로헥실에스테르, 플루오레닐에스테르 등의 C 말단 보호 아미노산, 디아민, ω아미노산, β아미노산, γ아미노산, 아미노산의 Tic 유도체, 아미노 포스폰산을 포함하는 그 밖의 천연계에는 발견되지 않는 아미노산 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정하지 않고 상기 20 의 「천연 아미노산」 이외의 아미노산을, 본 발명에서는 편의적으로 「비천연 아미노산」 이라고 총칭한다.
2-2. HTRA1 저해 펩티드
본 발명의 HRTA1 저해 펩티드는, SPINK2 가 갖는 골격이 적어도 부분적으로 유지된 SPINK2 변이체 (이하, 「SPINK2 변이체」 라고 약기한다) 이며, HTRA1 또는 그 효소 활성이 유지된 단편 (이하, 「기능 단편」 이라고 한다) 이 갖는 프로테아제 활성을 저해 또는 억제한다 (이하, 이러한 저해 또는 억제를 정리하여 「HTRA1 저해 활성」 이라고 한다).
본 발명의 저해 펩티드의 표적인 HTRA1 은, 적합하게는 포유류의, 보다 적합하게는 영장류의, 보다 한층 적합하게는 인간의 HTRA1 이며, 전체 길이 성숙 인간 HTRA1 (이하, 「HTRA1 (full)」 이라고 한다) 의 아미노산 서열은 서열 번호 53 (도 65) 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 당해 아미노산 서열은, 23 번 내지 480 번으로 이루어지고, 1 번 내지 22 번으로 이루어지는 시그널 서열을 포함하지 않는다. 인간 HTRA1 의 기능 단편 (이하, 「HTRA1 (cat)」 라고 한다) 의 아미노산 서열로는, 그 프로테아제 활성이 유지되고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열 번호 53 (도 65) 의 158 번 Gly ∼ 373 번 Lys 로 이루어지는 것, 158 번 Gly ∼ 373 번 Lys 를 포함하는 것 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 저해 펩티드의 표적인 HTRA1 및 그 기능 단편은, HTRA1 프로테아제라고도 표기되고, 적합하게는 척추 동물, 보다 적합하게는 포유류, 보다 한층 적합하게는 영장류, 최적으로는 인간에서 유래하고, 그들의 조직이나 세포로부터 정제하거나, 또는, 유전자 재조합, 인·비트로 번역, 펩티드 합성 등의 단백질의 조제 방법으로서 당업자에게 공지된 방법에 의해, 조제할 수 있다. HTRA1 및 그 기능 단편에는, 시그널 서열, 면역 글로블린의 Fc 영역, 태그, 표지 등이 연결되어도 된다.
HTRA1 저해 활성은, HTRA1 이 갖는 프로테아제 활성을 지표로서 평가할 수 있다. 예를 들어, HTRA1 또는 그 기능 단편, 기질 및 본 발명의 저해 펩티드 또는 그 후보를 공존시킨 경우에, 대조의 존재하 또는 그 저해제 또는 그 후보의 비존재하와 비교하여, HTRA1 의 프로테아제 활성이 70 ％ 이하, 50 ％ 이하, 30 ％ 이하, 20 ％ 이하, 10 ％ 이하, 5 ％ 이하, 1 ％ 이하 또는 0 ％ 인 경우, HTRA1 저해가 발생하고 있고, 그 저해 활성은 각각 30 ％ 이상, 50 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 99 ％ 이상 또는 100 ％ 이다. HTRA1 저해 활성은, 반응 조건, 기질의 종류나 농도 등에 따라 상이할 수 있다. 반응 조건에 대해서는, 실시예에 기재된 것을 예시할 수 있지만, 그것에 한정되지 않는다. 일정 농도의 HTRA1 에 기질 펩티드 또는 기질 단백질을 첨가하고, 일정 시간 반응시킨 후, 기질 펩티드의 형광을 검출하거나, 또는 기질 단백질을 SDS-PAGE 나 웨스턴 블롯 법, 액체 크로마토그래피 등에 의해 검출함으로써, 효소 활성은 평가할 수 있다. 완충액으로는, 예를 들어, 포스페이트·완충제·식염수 (phosphate buffer saline：이하 「PBS」 라고 한다), 붕산 완충제 (50 mM 붕산, pH 7 내지 9, 예를 들어 pH 8.5), 트리스 완충제 (50 mM 트리스, pH 6 내지 9, 예를 들어 pH 8.0) 등을 사용할 수 있으며, NaCl (50 내지 300 mM, 예를 들어 150 mM) 이나 CHAPS 나 옥틸 β-D-글루코피라노시드 등의 계면 활성제를 첨가할 수도 있지만, 그것들에 한정되지 않는다.
HTRA1 이 갖는 프로테아제의 기질은, 내재성의 기질, 외인성의 기질, 합성 기질 등, 특별히 한정되는 것은 아니다. 인간의 내재성의 기질로는, 비트로넥틴 등을 예시할 수 있다. 합성 기질로는, 특별히 한정되지 않지만, H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K) 나 β-카세인 (β-Casein), 다른 HTRA1 기질 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 펩티드의 HTRA1 저해 활성 (IC50 또는 Ki) 은, 1 μM 이하, 적합하게는 100 nM 이하이다.
또, 본 발명의 저해 펩티드는, HTRA1 이외의 프로테아제 활성을 저해 혹은 억제하지 않거나, 또는 그들에 대한 저해 혹은 억제의 정도가 상대적으로 약한 것이 바람직하다. 바꿔 말하면, 본 발명의 저해 펩티드는, 적합하게는, HTRA1 특이성이 높다. 적합한 본 발명의 저해 펩티드는, 트립신, α-키모트립신, 트립타아제, 플라스민, 트론빈, 매트립타아제, 프로테인 C, 조직 플러스미노겐 활성화 인자 (tPA), 우로키나아제 (uPA), 플라스민, 혈장 칼리크레인 등의 프로테아제 활성을 저해 혹은 억제하지 않거나, 또는 그들에 대한 저해 혹은 억제의 정도가 상대적으로 약하다. 그러한 본 발명의 적합한 펩티드는, 다른 프로테아제 활성을 저해 혹은 억제하는 것에서 기인하는 부작용을 나타내지 않고, HTRA1 에 관련된 질환 (후술) 의 치료약 또는 예방약으로서 적합하게 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드의 표적인 HTRA1 은, 척추 동물, 적합하게는 포유 동물, 보다 적합하게는 영장류, 보다 한층 적합하게는 인간에서 유래하지만, 비인간 동물, 예를 들어, 랫트, 마우스 등 설치류, 게잡이 원숭이, 코먼 마모셋, 붉은털 원숭이 등의 영장류에서 유래해도 된다. 비인간 동물 유래의 HTRA1 에 대하여 저해 활성을 갖는 펩티드는, 이러한 비인간 동물에 있어서의 HTRA1 에 관련된 질환의 진단, 검사, 치료 또는 예방 등에 사용할 수 있다. 또, 그러한 펩티드가, 인간 HTRA1 도 저해하는 경우, 인간 HTRA1 에 관련된 질환의 치료약 또는 예방약으로서의 그 펩티드의 비임상 연구 개발에 있어서, 이러한 비인간 동물을 동물 병태 모델로서 사용한 약효 약리 시험이나 약물 동태 시험, 정상 동물로서 사용한 안전성 시험이나 독성 시험 등을 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드는, 의약 및 진단약으로서 당해 분야에서 사용되는 항체 등의 다른 생체 고분자와 비교하여 분자량이 작고, 그 제조 (후술) 가 비교적 용이하고, 조직에 대한 침투성, 보존 안정성이나 열 안정성 등의 물성의 면에서 우수하고, 의약 조성물 (후술) 로서 사용되는 경우의 투여 경로, 투여 방법, 제제 등의 선택의 폭이 넓은 등의 장점을 갖는다. 또, 생체 고분자나 폴리머의 부가 등, 공지된 방법을 적용하여 본 발명의 펩티드의 분자량을 크게 함으로써, 의약 조성물로서 사용되었을 경우의 혈중 반감기를 보다 길게 조절할 수도 있다. 그러한 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드의 분자량은 10,000 미만, 적합하게는 8,000 미만, 보다 적합하게는 약 7,000 ∼ 7,200 이다. 또, 서열 번호 23 (도 29) 의 15 번 Cys ∼ 31 번 Cys 로 이루어지는 가변 루프 부분 또는 15 번 Cys ∼ 63 번 Cys 로 이루어지는 부분 (이하 「6 개의 Cys 를 포함하는 부분」 이라고 한다) 중, HTRA1 저해 활성을 갖는 것도, 본 발명 HTRA1 저해 펩티드에 각각 포함되고, 가변 루프 부분의 분자량은 2,500 미만, 적합하게는 약 1,800 ∼ 2,000 이며, 6 개의 Cys 를 포함하는 부분의 분자량은 6,000 미만, 적합하게는 약 5,300 ∼ 5,500 이다.
또한, 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드의 범위에 포함되는, SPINK2 가 갖는 골격이 적어도 부분적으로 유지된 SPINK2 변이체 (이하, 「SPINK2 변이체」 라고 약기한다) 는, HTRA1 에 결합해도 되고, 적합하게는 포유류의, 보다 적합하게는 영장류의, 보다 한층 적합하게는 인간의 HTRA1 에 결합할 수 있다. 그러한 HTRA1 에 결합하는 펩티드는, HTRA1 의 부분 펩티드, 부분 고차 구조 등을 인식하거나, 또는 그것들에 결합한다 (이하, 이러한 인식 또는 결합 작용을 정리하여 「표적 결합 활성」 이라고 한다).
또, 어느 양태에 있어서의 본 발명의 저해 펩티드는, HTRA1 의 면역원성 단편에 결합할 수 있다. HTRA1 의 면역원성 단편은, 1 개 또는 2 개 이상의 에피토프, 미모토프 또는 그 밖의 항원 결정기를 가지므로, 면역 응답을 유발할 수 있거나 또는 당해 단편에 대한 항체가 산생될 수 있다.
본 발명에 있어서의 SPINK2 변이체와 HTRA1 또는 그 면역원성 단편의 결합은, 검출 가능한 결합 친화성의 측정 (ELISA 법, 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance：이하, 「SPR」 이라고 한다) 해석법 (「BIAcore」 법이라고도 한다), 등온 적정 열량 측정 (Isothermal Titration Calorimetry：이하 「ITC」 라고 한다) 법, 플로 사이토메트리, 면역 침강법 등) 등에 의해, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 평가, 측정 또는 판정할 수 있다.
ELISA 법으로는, 플레이트 상에 고상화된 HTRA1 을 인식하여 결합한 HTRA1 저해 펩티드를 검출하는 방법을 들 수 있다. HTRA1 의 고상화에는, 비오틴-스트렙토아비딘 외, HTRA1 에 융합한 태그를 인식하는 고상용 항체 등을 이용할 수 있다. HTRA1 저해 펩티드의 검출에는, 표지된 스트렙토아비딘 외, HTRA1 저해 펩티드에 융합한 태그를 인식하는 표지된 검출용 항체 등을 이용할 수 있다. 표지에는, 비오틴 외, HRP, 알칼리 포스파타아제, FITC 등 생화학적 해석에 실시 가능한 방법을 이용할 수 있다. 효소 표지를 이용한 검출에는 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)), BCIP (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)), p-NPP (p-니트로페닐 포스페이트 (p-nitrophenyl phosphate)), OPD (o-페닐렌디아민 (o-Phenylenediamine)), ABTS (3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산 (3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), 슈퍼 시그널 ELISA 피코 화학발광 기질 (Super Signal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate) (Thermo Fisher Scientific) 등의 발색 기질이나 QuantaBlu (상표) 형광발생 퍼옥시다아제 기질 (Fluorogenic Peroxidase Substrate) (Thermo Fisher Scientific) 등의 형광 기질, 및 화학 발광 기질을 사용할 수 있다. 검출 시그널의 측정에는, 흡광 플레이트 리더, 형광 플레이트 리더, 발광 플레이트 리더, RI 액체 신틸레이션 카운터 등을 이용할 수 있다.
SPR 해석에 사용하는 기기로는, BIAcore (상표) (GE Healthcare), ProteOn (상표) (BioRad), SPR-Navi (상표) (BioNavisOy), Spreeta (상표) (Texas Instruments), SPRi-PlexII (상표) (호리바), Autolab SPR (상표) (Metrohm) 등을 예시할 수 있다. BLI 법에 사용하는 기기로는, Octet (상표) (Pall) 를 예시할 수 있다.
면역 침강법으로는, 비즈 상에 고상화된 HTRA1 저해 펩티드에 의해 인식되고, 결합한 HTRA1 을 검출하는 방법을 들 수 있다. 비즈에는 자기 비즈나 아가로오스 비즈 등을 이용할 수 있다. HTRA1 저해 펩티드의 고상화에는, 비오틴-스트렙토아비딘 외, 그 펩티드 또는 그 펩티드에 융합한 태그를 인식하는 항체, 프로테인 A 또는 프로테인 G 등을 이용할 수 있다. 자석이나 원심 분리 등에 의해 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 HTRA1 을 SDS-PAGE 나 웨스턴 블롯 법으로 검출한다. HTRA1 의 검출에는, 표지된 스트렙토아비딘 외, HTRA1 에 융합한 태그를 인식하는 표지된 검출용 항체 등을 이용할 수 있다. 표지에는, 비오틴 외, HRP, 알칼리 포스파타아제, FITC 등 생화학적 해석에 실시 가능한 방법을 이용할 수 있다. 효소 표지를 이용한 검출에는 ELISA 법과 동일한 기질을 이용할 수 있다. 검출 시그널의 측정에는 ChemiDoc (상표) (BioRad) 나 LuminoGraph (ATTO) 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 「특이적인 인식」, 즉 「특이적인 결합」 이란, 비특이적인 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 결합이 특이적인지 여부의 판정 기준으로는, 예를 들어, ELISA 법에 있어서의 결합 활성 EC50 을 들 수 있다. 다른 판정 기준으로는, 예를 들어, 해리 상수 (dissociation constant：이하, 「KD」 라고 한다) 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 에 대한 KD 값은 1 × 10-4 M 이하, 1 × 10-5 M 이하, 5 × 10-6 M 이하, 2 × 10-6 M 이하 또는 1 × 10-6 M 이하, 보다 적합하게는 5 × 10-7 M 이하, 2 × 10-7 M 이하 또는 1 × 10-7 M 이하, 보다 한층 적합하게는 5 × 10-8 M 이하, 2 × 10-8 M 이하 또는 1 × 10-8 M 이하, 보다 더 한층 적합하게는 5 × 10-9 M 이하, 2 × 10-9 M 이하 또는 1 × 10-9 M 이하이다. 다른 판정 기준으로는, 예를 들어, 면역 침강법에서의 해석 결과를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 적합한 HTRA1 저해 펩티드를 비즈에 고상화하고, 각각 HTRA1 을 첨가한 후에 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 HTRA1 을 검출한 경우, HTRA1 의 시그널이 검출된다.
전술한 기재에도 불구하고, HTRA1 저해 활성을 갖는 한에 있어서, HTRA1 또는 그 면역원성 단편에 대한 결합능은 본 발명의 저해 펩티드로서의 SPINK2 변이체에 있어 필수는 아니다.
본 발명의 저해 펩티드는, HTRA1 에 대한 프로테아제 기질의 결합에 있어서, 경합적이어도 된다.
또, 적합한 몇 가지 양태에 있어서, 본 발명의 저해 펩티드는, 망막 보호 효과를 갖는다. 예를 들어, 실시예에 있어서 상세히 서술되는 광 조사 망막 장애 모델에 있어서, 본 발명의 적합한 저해제는, 외과립층에 포함되는 핵의 수의 광 조사에 의한 감소를 억제할 수 있다. 당해 모델에 있어서는, 비조사의 군과 비교하여, 광 조사한 군의 유리체액 중에 보다 다량의 HTRA1 단백질이 검출되고 있고, 망막 장애에 HTRA1 이 관여하는 것, HTRA1 저해 활성이 망막 보호 효과를 가져오는 것을, 본 발명은 개시하고 있다.
본 발명의 저해 펩티드로서의 SPINK2 변이체는, 상기와 같은 활성, 성질, 기능, 특징 등을 가질 수 있는 한편, 그 전체 길이 아미노산 서열은 인간 야생형 SPINK2 의 아미노산 서열에 대하여 높은 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 SPINK2 변이체는, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1：도 13) 과 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는다.
「동일성」 이란, 2 개의 서열 사이의, 유사성 또는 관계의 정도를 나타내는 성질을 의미한다. 아미노산 서열의 동일성 (％) 은, 동일한 아미노산 혹은 아미노산 잔기의 수를 아미노산 혹은 아미노산 잔기의 총수로 나누어 얻어지는 수치에, 100 을 곱합으로써, 산출된다.
「갭」 이란, 2 개 이상의 서열 중 적어도 1 개에 있어서의 결실 및/또는 부가의 결과인, 당해 서열간의 얼라인먼트에 있어서의 간극을 의미한다.
완전히 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 100 ％ 이지만, 일방의 아미노산 서열을 타방과 비교하여 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 또는 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가가 있으면, 양자의 동일성은 100 ％ 미만이 된다. 갭도 고려하여 2 개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 알고리즘이나 프로그램으로는, 표준적인 파라미터를 사용하는 BLAST (Altschul, et al. Nucleic Acids Res. 25 권, 3389-3402 페이지, 1997년), BLAST2 (Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215 권, 403-410 페이지, 1990년), Smith-Waterman (Smith, et al. J. Mol. Biol. 147 권, 195-197 페이지, 1981년) 등의 당업자에게 공지된 것을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「변이하였다」 란, 천연에 존재하는 핵산 분자 또는 펩티드와 비교의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 뉴클레오티드 혹은 뉴클레오티드 잔기 또는 아미노산 혹은 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입이 이루어져 있는 것을 의미한다. 본 발명의 SPINK2 변이체의 아미노산 서열은, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열과 비교하여, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 또는 아미노산 잔기가 변이되어 있다.
본 발명의 어느 양태에 있어서, SPINK2 변이체의 아미노산 서열은, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1：도 13) 의：
16 번 Ser ∼ 22 번 Gly 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개 또는 7 개의 아미노산이 다른 아미노산 또는 아미노산 잔기로 치환되어 있고；
24 번 Pro ∼ 28 번 Asn 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산이 다른 아미노산 또는 아미노산 잔기로 치환되어 있고；
39 번 Ala 및 43 번 Thr 중 1 개 또는 2 개의 아미노산이 다른 아미노산 또는 아미노산 잔기로 치환되어 있어도, 야생형이더라도, 16 번 ∼ 30 번 등의 아미노산 잔기로 구성되는 루프 주사슬 3 차 구조가, HTRA1 저해 활성을 적어도 부분적으로 발휘할 수 있는 한에 있어서, 어느 것이어도 되고 (당해 2 아미노산 또는 아미노산 잔기는 α 헬릭스에 포함된다)；
15 번 Cys, 23 번 Cys, 31 번 Cys, 42 번 Cys, 45 번 Cys 및 63 번 Cys 는, 천연형의 디술파이드 결합을 유지하기 위해서는 야생형과 동일하게 Cys 인 것이 바람직하고, 천연형의 디술파이드 결합을 소실시키거나, 비천연형의 디술파이드 결합을 발생시키거나 하기 위해서는, 그들 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개를 다른 아미노산으로 치환해도 된다. 본 발명의 SPINK2 변이체 중 보다 적합한 HTRA1 저해 펩티드에 있어서는, 천연형과 동일한 당해 6 개 지점에 Cys 가 유지되고, 디술파이드 결합이 유지되어 있다. 이러한 저해 펩티드 중 보다 적합한 일부의 양태에 있어서는, 15 번 Cys-45 번 Cys, 23 번 Cys-42 번 Cys, 및, 31 번 Cys-63 번 Cys 가, 각각 디술파이드 결합을 형성하고 있다.
그러한 SPINK2 변이체가 갖는 아미노산 서열이 HTRA1 저해 펩티드에 포함되는 경우, 야생형 SPINK2 의 아미노산 서열에 포함되는 16 번 Ser 내지 30 번 Val 로 이루어지는 루프 구조, 31 번 Cys 및 32 번 Gly 로 이루어지는 β 스트랜드 (1) 그리고 57 번 Ile 내지 59 번 Arg 로 이루어지는 β 스트랜드 (2) 로 구성되는 β 시트, 41 Glu 번 아미노산 내지 51 번 Gly 로 이루어지는 α 헬릭스, 또는, 그것들에 유사하고 있거나 혹은 그것들 (의 위치) 에 적어도 부분적으로 대응하는 루프 구조, β 시트, α 헬릭스 등으로 구성되는 입체 구조가, HTRA1 저해 활성을 발휘할 수 있는 정도로, 유지되고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 SPINK2 변이체 중, 일부의 HTRA1 저해 펩티드가 갖는 아미노산 서열에 대해 이하에 서술한다. 상기 서술한 바와 같이, 본 발명에 있어서 「아미노산 잔기」 는 간단히 「아미노산」 이라고 표기되는 경우가 있다.
서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 번째 내지 11 번째의 Xaa (각각 X1 내지 X11 에 동일) 는, HTRA1 에 결합하고 또한 HTRA1 활성을 저해하는 한에 있어서 각각 임의의 아미노산이면 특별히 한정되지 않는다. 이하, X1 내지 X11 의 적합한 아미노산에 대해 기재하지만, 그들 아미노산 중에는 천연형, 즉 야생형 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 중과 동일한 아미노산이 포함되어 있는 경우가 있다.
1 번 X1 은, 적합하게는 Asp, Glu, Gly, Ser 또는 Ile, 보다 적합하게는 Asp 또는 Gly, 보다 한층 적합하게는 Gly 이고；
16 번 X2 는, 적합하게는 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Ala, Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser 또는 Thr, 보다 한층 적합하게는 Ala, Gly, Lys, Leu, Ser 또는 Thr, 보다 더 한층 적합하게는 Ala, Gly, Leu, Ser 또는 Thr, 더욱이 보다 더 한층 적합하게는 Ala 또는 Ser 이고；
17 번 X3 은, 적합하게는, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Tyr, 보다 한층 적합하게는 Asp, His, Lys, Met 또는 Gln, 보다 더 한층 적합하게는 Asp 또는 Gln 이고；
18 번 X4 는, 적합하게는 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Asp, Phe, His, Met, Asn, Gln, Ser 또는 Tyr, 보다 한층 적합하게는 Asp, Phe, His, Ser 또는 Tyr, 보다 더 한층 적합하게는 Phe 또는 His 이고；
19 번 X5 는, 적합하게는 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Val, 보다 한층 적합하게는 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Asn, 보다 더 한층 적합하게는 Ala, Asp 또는 Glu 이고；
21 번 X6 은, 적합하게는 Ala, Glu, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Trp 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Glu, Phe, Ile, Leu, Met, Gln, Arg 또는 Trp, 보다 한층 적합하게는 Met 또는 Trp, 보다 더 한층 적합하게는 Met 이고；
24 번 X7 은, 적합하게는 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Asp, Glu, His, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr, 보다 한층 적합하게는 Gln, Trp, Tyr 또는 Val, 보다 더 한층 적합하게는 Tyr 또는 Val 이고；
26 번 X8 은, 적합하게는 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Val 또는 Tyr 이고, 보다 적합하게는 Ala, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Val 또는 Tyr 이고, 보다 한층 적합하게는 Phe, Leu 또는 Tyr 이고, 보다 더 한층 적합하게는 Phe 또는 Leu 이고；
27 번 X9 는, 적합하게는 Glu, Phe, Leu, Ser, Thr 또는 Tyr 이고, 보다 적합하게는 Phe, Leu, Ser, Thr 또는 Tyr 이고, 보다 한층 적합하게는 Phe 또는 Tyr, 보다 더 한층 적합하게는 Tyr 이고；
39 번 X10 은, 적합하게는 Ala, Glu, Met 또는 Val, 보다 적합하게는 Ala 또는 Glu 이고；
43 번 X11 은, 적합하게는 Ala, Thr 또는 Val, 보다 적합하게는 Thr 또는 Val 이다.
또한, 야생형의 X1 내지 X11 은, 각각 Asp, Ser, Gln, Tyr, Arg, Pro, Pro, His, Phe, Ala 및 Thr 이다. 또, 20 번은 Leu, 22 번은 Gly, 25 번은 Arg, 28 번은 Asn 이다.
본 발명에 있어서는, 1 번 아미노산의 N 말단측에, 또한 1 개 내지 수 개 또는 그 이상의 아미노산이 부가되어 있어도 되고, 그러한 부가되는 아미노산으로는, 예를 들어, Ser-Leu, S 태그 및 링커로 이루어지는 아미노산 서열 (서열 번호 31：도 43) 등을 들 수 있다.
또한, C 말단에 위치하는 63 번 Cys 에 1 내지 수 개의 아미노산이 부가되어 있어도 되고, 예를 들어, C 말단이 64 번 Gly 인 아미노산 서열, Gly-Gly 를 더하여 C 말단이 65 번 Gly 인 아미노산 서열 등을 들 수 있다. 그러한 부가되는 아미노산으로는, 예를 들어, Gly-Gly, C 말단 헥사머 (서열 번호 32：도 44) 등을 들 수 있다.
서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열 또는 서열 번호 30 으로부터 파생한 아미노산 서열의 N 말단 및/또는 C 말단에 다른 아미노산이 부가되어 이루어지는 아미노산 서열로서, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 내지 29 (도 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 및 35 내지 41) 그리고 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22 (도 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 및 34) 중 어느 하나에 의해 나타내는 뉴클레오티드 서열이 코드하는 아미노산 서열은 보다 적합한 양태에, 서열 번호 24, 28 및 29 (도 36, 40 및 41) 는 보다 한층 적합한 양태에 각각 포함된다.
본 발명에 있어서는, SPINK2 변이체 펩티드 또는 SPINK2 변이체 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단 부가체 (이하, 「부모 펩티드」 라고 부른다) 에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산이 치환, 부가 및/또는 결실되어 이루어지는 펩티드를 「부모 펩티드의 유도체」 또는 「부모 펩티드 유도체」 라고 부르는 경우가 있다 (예를 들어, 실시예 6). 이러한 「유도체」 도 본 발명의 「펩티드」 의 범위에 포함된다.
본 발명의 저해 펩티드의 범위에 포함되는 SPINK2 변이체가 갖는 아미노산 서열에 있어서는, X1 내지 X11 이외의 부분, 즉, 야생형 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1：도 13) 중의, 2 번 Pro ∼ 15 번 Cys, 20 번 Pro, 22 번 Gly, 23 번 Cys, 25 번 Arg, 28 번 Asn ∼ 38 번 Tyr, 41 Glu, 42 번 Cys 및 44 번 Thr ∼ 63 번 Cys 의 위치에 있어서, 천연형의 아미노산 혹은 변이한 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, SPINK2 변이체는, HTRA1 저해 활성 또는 폴딩을 적어도 부분적으로 방해하지 않거나 또는 간섭을 하지 않는 한에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 있어서 변이해도 된다. 그러한 변이는, 당업자에게 공지된 표준적인 방법을 사용함으로써 이룰 수 있다. 아미노산 서열 중의 전형적인 변이로는, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 들 수 있으며, 치환으로는, 보존적 치환을 예시할 수 있다. 보존적 치환에 의해, 어느 아미노산 잔기는, 부피가 클 뿐만 아니라, 극성의 면에 대해서도 화학적 특징이 유사한 아미노산 잔기에 의해 치환된다. 보존적 치환의 예는, 본 명세서의 다른 부분에 기재되어 있다. 한편, X1 내지 X11 이외의 부분은, HTRA1 저해 활성 또는 폴딩을 적어도 부분적으로 방해하지 않거나 또는 간섭을 하지 않는 한에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산의 비보존적 치환도 허용할 수 있다.
본 발명의 저해 펩티드로서의 SPINK2 변이체가 갖는 아미노산 서열은, X1 내지 X11 이, 적합하게는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 내지 29 (도 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 및 35 내지 41) 의, 보다 적합하게는 서열 번호 24, 28 및 29 (도 36, 40 및 내지 41) 중 어느 하나에 있어서의 X1 내지 X11 의 각 아미노산이며, 또한, X1 내지 X11 이외의 부분이 HTRA1 저해 활성 또는 폴딩을 적어도 부분적으로 방해하지 않거나 또는 간섭을 하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또, 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드로서의 SPINK2 변이체의 아미노산 서열의 예로서, 다음의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 각각 들 수 있다：
(a) 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 내지 29 (도 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33, 35 내지 41) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열；
(b) (a) 에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 HTRA1 저해 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열；
(c) (a) 에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 이루어지고, 또한 HTRA1 저해 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열；
(d) (a) 에 기재된 아미노산 서열과 60 ％, 70 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 92 ％, 94 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％ 이상 동일하고, 또한 HTRA1 저해 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열；및,
(e) 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22 (도 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 및 34) 중 어느 하나로 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열.
그러나, HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자는 (a) 내지 (e) 에 한정되는 것은 아니고, HTRA1 저해 활성을 갖는 SPINK2 변이체에 포함되는 아미노산 서열, 적합하게는 서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 널리 HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자의 범위에 포함된다.
본 발명의 저해 펩티드에, 그 폴딩 안정성, 열 안정성, 보존 안정성, 혈중 반감기, 수용성, 생물 활성, 약리 활성, 부차적 작용 등을 개선하는 목적으로, 변이를 도입할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 하이드록시에틸 전분 (HES), 비오틴, 펩티드 또는 단백질 등의 다른 물질에 콘쥬게이트 시키기 위해서, Cys 와 같은 새로운 반응성기를 변이에 의해 도입할 수 있다. 본 발명에 있어서, HTRA1 저해 펩티드는 다른 부분에 부가, 연결 또는 결합하고 있어도 되고, 그러한 콘쥬게이트체를 「HTRA1 저해 펩티드의 콘쥬게이트」 라고 총칭한다. 본 발명에 있어서 「콘쥬게이트」 란, 본 발명의 펩티드 또는 그 단편에 다른 부분이 부가, 연결 또는 결합하여 이루어지는 분자를 의미한다. 「콘쥬게이트」 또는 「콘쥬게이션」 에는, 어느 부분이 가교제 등의 화학 물질을 개재하여, 어느 부분을 아미노산의 측사슬에 연결하는 데에 적합한 작용 물질 등을 개재하여, 본 발명의 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 합성 화학적 수법이나, 유전자 공학적 수법 등에 의해, 본 발명의 펩티드에 연결 또는 결합되는 형태가 포함된다. 그러한 「부분」 에는, 혈중 반감기를 개선하는 것으로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 폴리알킬렌글리콜 분자, 하이드록시에틸 전분, 팔미트산 등의 지방산 분자, 면역 글로블린의 Fc 영역, 면역 글로블린의 CH3 도메인, 면역 글로블린의 CH4 도메인, 알부민 또는 그 단편, 알부민 결합 펩티드, 연쇄 구균 프로테인 G 등의 알부민 결합 단백질, 트랜스페린을, 예시할 수 있다. 그 밖의 「부분」 으로는, 이러한 「부분」 은 펩티드 링커 등의 링커를 개재하여 본 발명의 펩티드가 연결될 수 있다.
또, 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드에는, 약리 활성을 발휘하거나 또는 증강하기 위해서, 다른 약물이 콘쥬게이트 되어 있어도 된다. 항체 분야에 있어서 항체-약물 복합체 (antibody-drug conjugate：ADC) 로서 당업자에게 공지된 기술이나 양태는, 항체를 본 발명의 펩티드로 치환함으로써, 본 발명의 일부의 양태가 된다.
본 발명의 HTRA1 저해 펩티드는, HTRA1 이외의 표적 분자에 대한 결합 친화성, 저해 활성, 길항 활성, 작동 활성 등을 발휘하는 1 개 또는 2 개 이상의 부분을 추가로 포함하거나, 그러한 부분에 콘쥬게이트 되어 있어도 된다. 이러한 「부분」 으로는, 항체 또는 그 단편, SPINK2 변이체와 같은 항체 이외의 골격을 갖는 단백질 또는 그 단편을 예시할 수 있다. 항체 분야에 있어서 다중 특이적 항체 및 이중 특이적 항체 (multispecific antibody, bispecific antibody) 로서 당업자에게 공지된 기술이나 양태는, 그것들에 포함되는 2 개 이상의 「항체」 중 적어도 1 개를 본 발명의 펩티드로 치환함으로써, 본 발명의 콘쥬게이트의 일부의 양태가 된다.
본 발명의 펩티드 또는 그 전구체는, 시그널 서열을 포함할 수 있다. 어느 폴리펩티드 혹은 그 전구체의 N 말단에 존재하거나 또는 부가된 시그널 서열은, 당해 폴리펩티드를 세포의 특정한 구획, 예를 들어, 대장균이면 주변질, 진핵 세포이면 소포체에 송달하기 위해서 유용하고, 많은 시그널 서열이 당업자에게 공지이며, 숙주 세포에 따라 선택될 수 있다. 대장균의 주변질 중에 원하는 펩티드를 분비시키기 위한 시그널 서열로는, OmpA 를 예시할 수 있다, 시그널 서열을 포함하는 형태도, 본 발명의 콘쥬게이트에, 그 일부의 양태로서 포함될 수 있다.
또, 본 발명의 펩티드에 미리 태그를 부가시킴으로써, 어피니티 크로마토그래피에 의해 그 펩티드를 정제할 수 있다. 본 발명의 펩티드는, 예를 들어, 그 C 말단에, 비오틴, Strep 태그 (상표), Strep 태그 II (상표), His6 등의 올리고 히스티딘, 폴리히스티딘, 면역 글로블린 도메인, 말토오스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스페라아제 (GST), 칼모듈린 결합 펩티드 (CBP), 디곡시게닌이나 디니트로페놀 등의 하프텐, FLAG (상표) 등의 에피토프 태그, myc 태그, HA 태그 등 (이하 정리하여 「어피니티·태그」 라고 부른다) 을 포함할 수 있다. 태그 부가체도, 본 발명의 콘쥬게이트에, 그 일부의 양태로서 포함될 수 있다. 본 발명의 콘쥬게이트는, 전체적으로 펩티드 (폴리펩티드) 여도 된다.
본 발명의 펩티드는, 표지를 위한 부분을 포함할 수 있으며, 구체적으로는, 효소 표지, 방사성 표지, 착색 표지, 형광 표지, 발색 표지, 발광 표지, 하프텐, 디곡시게닌, 비오틴, 금속 복합체, 금속, 콜로이드 금 등의 표지 부분이 콘쥬게이트 될 수 있다. 표지를 위한 부분을 포함하는 양태도, 본 발명의 콘쥬게이트에, 그 일부의 양태로서 포함될 수 있다.
본 발명의 저해 펩티드는, 그 펩티드 부분에 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있으며, 천연 아미노산으로는 L-아미노산 및 D-아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 저해 펩티드의 아미노산 서열에는, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있으며, 천연 아미노산으로는 L-아미노산 및 D-아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 저해 펩티드는, 단량체, 2 량체, 3 량체 이상의 올리고머 또는 다량체로서 존재할 수 있다. 2 량체, 3 량체 이상의 올리고머 및 다량체는, 단일의 단량체로 구성되는 호모, 및, 2 개 이상의 상이한 단량체로 구성되는 헤테로, 중 어느 것이어도 된다. 단량체는, 예를 들어, 신속하게 확산하여 조직에 대한 침투가 우수한 경우가 있다. 2 량체, 올리고머 및 다량체는, 예를 들어, 국소에 있어서 표적 분자에 대하여 높은 친화성 혹은 결합 활성을 갖거나, 느린 해리 속도를 갖거나, 또는 높은 HTRA1 저해 활성을 나타내는 등의 우수한 측면을 가질 수 있다. 자발적인 2 량체화, 올리고머화 및 다량체화에 더하여, 의도한 2 량체화, 올리고머화 및 다량체화도, jun-fos 도메인, 류신 지퍼 등을 본 발명의 저해 펩티드에 도입함으로써, 이룰 수 있다.
본 발명의 저해 펩티드는, 단량체, 2 량체, 3 량체 이상의 올리고머 또는 다량체로, 1 개 또는 2 개 이상의 표적 분자에 결합하거나 또는 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 저해 펩티드가 취할 수 있는 형태로는, 단리된 형태 (동결 건조 표품, 용액 등), 상기 서술한 콘쥬게이트체, 다른 분자에 결합한 형태 (고상화된 형태, 이분자와의 회합체, 표적 분자와 결합한 형태 등) 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니고, 발현, 정제, 사용, 보존 등에 적합한 형태를 임의로 선택할 수 있다.
3. HTRA1 저해 펩티드의 동정
HTRA1 저해 펩티드는, SPINK2 의 아미노산 서열 또는 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드가 갖는 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 내지 29 로 이루어지는 군, 또는, 도 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 및 35 내지 41 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열), 그 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열, 그 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 등을 출발 재료로 하여, 당업자에게 주지의 방법에 의해, 동정할 수 있다. 적합한 일례로서, 인간 SPINK2 변이체 라이브러리로부터, HTRA1 저해 활성을 지표로서 동정할 수 있고, HTRA1 결합 활성도 지표로서 조합해도 된다.
예를 들어, 출발 재료로서의 핵산 분자는, 변이 유발에 제공되고, 재조합 DNA 기술을 사용하여 적절한 세균 숙주 또는 진핵성 숙주 중에 도입될 수 있다. SPINK2 변이체 라이브러리는, 표적 분자의 바인더나 저해제를 동정하기 위한 기술로서 공지이며, 예를 들어, WO2012/105616 공보에 있어서의 개시도, 그 전체를 참조함으로써 본 발명의 개시에 포함된다. 적절한 숙주에 있어서 변이 유발에 제공된 뉴클레오티드 서열을 발현시킨 후, 원하는 성질, 활성, 기능 등을 갖는 SPINK2 변이체가 그 유전 형질과 링크하여 이루어지는 클론을, 상기의 라이브러리로부터 농축 및/또는 선발하여, 동정할 수 있다. 클론의 농축 및/또는 선발에는, 세균 디스플레이법 (Francisco, J. A., et al. (1993년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 권, 10444-10448 페이지), 효모 디스플레이법 (Boder, E. T., et al. (1997년) Nat. Biotechnol. 15 권, 553-557 페이지), 포유 동물 세포 디스플레이법 (Ho M, et al. (2009년) Methods Mol Biol. 525 권：337-52 페이지), 파지 디스플레이법 (Smith, G. P. (1985년) Science. 228 권, 1315-1317 페이지), 리보솜 디스플레이법 ((Mattheakis LC, et al. (1994년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 권 19 호, 9022-9029 페이지)), mRNA 디스플레이 등의 핵산 디스플레이법 (Nemoto N, et al. (1997년) FEBS Lett. 414 권 2호, 405-408 페이지), 콜로니 스크리닝법 (Pini, A. et al. (2002년) Comb. Chem. High Throughput Screen. 5 권, 503-510 페이지) 등, 당업자에게 공지된 방법을 사용함으로써, 선발되고 동정된 클론에 포함되는 SPINK2 변이체의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써, 그 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을, 당해 클론에 포함되는 SPINK2 변이체 즉 HTRA1 저해 펩티드가 갖는 아미노산 서열로서 결정할 수 있다.
본 발명의 SPINK2 변이체는, 예를 들어, 천연형의 SPINK2 에 변이를 유발함으로써, 얻을 수 있다. 「변이의 유발」 이란, 어느 아미노산 서열의 각 위치에 존재하는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 혹은 결실시키거나, 또는 당해 아미노산 서열 중에는 존재하지 않는 아미노산을 부가 혹은 삽입할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 이러한 결실 또는 부가 혹은 삽입에 의해, 서열 길이가 바뀔 수 있다. 본 발명의 SPINK2 변이체에 있어서, 변이의 유발은, 적합하게는, 서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열 중의, X1 내지 X11 의 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 있어서 발생할 수 있다.
단, 그러한 바람직한 변이의 유발 후에, X1 내지 X11 의 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 있어서, 천연형의 아미노산, 즉 천연형의 아미노산 서열 중의 특정한 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산이 유지된 것도, 전체적으로 적어도 1 개의 아미노산이 변이되어 있으면, 변이체의 범위에 포함된다. 마찬가지로, 본 발명의 어느 양태에 있어서, X1 내지 X11 이외의 부분의 하나 이상의 위치에 변이를 유발한 후에, 당해 위치에 천연형의 아미노산, 즉 천연형의 아미노산 서열 중의 특정한 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산이 유지된 것도, 전체적으로 적어도 1 개의 아미노산이 변이되어 있으면, 변이체의 범위에 포함된다.
「랜덤 변이의 유발」 이란, 서열 상의 특정한 위치에 대해, 1 개 또는 2 개 이상의 상이한 아미노산이, 변이의 유발에 의해, 당해 위치에 일정한 확률로 도입시키는 것을 의미하지만, 적어도 2 개의 상이한 아미노산이 도입되는 확률이 모두 동일하지는 않아도 된다. 또, 본 발명에 있어서는, 적어도 2 개의 상이한 아미노산에, 천연형의 아미노산 (1 종) 이 포함되는 것을 방해하는 것은 아니고, 그러한 경우도 「랜덤 변이의 유발」 의 범위에 포함된다.
특정한 위치에 랜덤 변이를 유발하는 방법으로는, 당업자에게 공지된 표준적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 서열 중의 특정한 위치에, 축중 (縮重) 뉴클레오티드 조성물을 포함하는 합성 올리고 뉴클레오티드의 혼합물을 사용한 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction)) 에 의해 변이를 유발할 수 있다. 예를 들어, 코돈 NNK 또는 NNS (N = 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민；K = 구아닌 또는 티민；S = 아데닌 또는 시토신) 를 사용하면, 천연 아미노산 20 종 모두에 더하여, 정지 코돈이 도입되는 변이가 유발되는 데 반해, 코돈 VVS (V = 아데닌, 구아닌 또는 시토신) 를 사용하면, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr 및 Val 이 도입될 가능성이 없고, 남는 12 의 천연 아미노산의 도입이 변이 유발된다. 또, 예를 들어, 코돈 NMS (M = 아데닌 또는 시토신) 를 사용하면, Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val 이 도입될 가능성이 없고, 남는 11 의 천연 아미노산의 도입이 변이 유발된다. 비천연 아미노산의 도입을 변이 유발하기 위해서, 특수한 코돈, 인공적인 코돈 등을 사용할 수 있다.
부위 특이적 변이 유발은, 고차 구조를 포함하는 표적 및/또는 그 표적에 대한 펩티드 혹은 펩티드가 유래하는 야생형 펩티드의 구조 정보를 이용해도 실시할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 표적인 HTRA1 및/또는 표적에 대한 SPINK2 변이체 혹은 야생형 SPINK2 의, 또는 양자의 복합체의, 고차 정보를 포함하는 구조 정보를 이용하여, 부위 특이적 변이를 도입할 수 있다. 예를 들어, HTRA1 저해 활성을 갖는 SPINK2 변이체를 동정하고, 이어서 HTRA1 및 당해 SPINK2 변이체의 복합체의 결정을 취득하여 X 선 결정 구조 해석을 실시하고, 그 해석 결과에 기초하여 그 SPINK2 변이체가 결합하는 HTRA1 분자 상의 부위 및 그 부위와의 상호 작용에 관련된 그 SPINK2 변이체 중의 아미노산 잔기를 특정하는 것 등을 통해서 얻어지는 구조 정보와, HTRA1 저해 활성의 상관을 찾아낼 수 있는 경우가 있다. 그러한 구조 활성 상관에 기초하여, 특정한 위치에 있어서 특정한 아미노산으로의 치환, 특정한 위치에 있어서의 아미노산의 삽입 또는 결실 등을 디자인하고, 실제로 HTRA1 활성을 확인할 수 있다.
또, 예를 들어, 이노신 등의 염기쌍의 특이성이 개편된 뉴클레오티드 구성 단위를 사용하여, 변이를 유발할 수 있다.
또한, 예를 들어, Taq DNA 폴리머라아제 등의, 교정 기능이 결여되고, 에러율이 높은 DNA 폴리머라아제를 사용한 에러·프론 PCR 법, 화학 변이 유발 등에 의해, 랜덤인 위치에 대한 변이 유발이 가능하다.
HTRA1 저해 펩티드는, 세균 디스플레이, 효모 디스플레이, 포유 세포 디스플레이, 파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 핵산 디스플레이, 콜로니 스크리닝 등을 이용하여, 파지 라이브러리, 콜로니 라이브러리 등 각각의 스크리닝 방법에 적합한 당업자에게 공지된 라이브러리로부터 농축 및/또는 선발할 수 있다. 그들 라이브러리 중, 파지 라이브러리에는 파지미드, 콜로니 스크리닝에는 코스미드 등, 각각의 라이브러리에 적합한 당업자에게 공지된 벡터 및 방법에 의해 구축할 수 있다. 그 관련된 벡터는, 원핵 세포 또는 진핵 세포에 감염하는 바이러스 또는 바이러스성 벡터여도 된다. 그들의 재조합 벡터는, 유전자 조작 등 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다.
세균 디스플레이는, 예를 들어, 대장균의 외막 리포단백질 (Lpp) 의 일부 및 외막 단백질 OmpA 와 원하는 단백질을 융합시켜, 대장균 표면 상에 원하는 단백질을 제시시키는 기술이다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 DNA 군을 세균 디스플레이에 적합한 벡터에 도입하고, 당해 벡터로 세균 세포를 형질 전환하면, 형질 전환 세균 세포 표면 상에, 랜덤 변이 유발된 단백질군을 제시하는 라이브러리를 얻을 수 있다 (Francisco, J. A., et al. (1993년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 권, 10444-10448 페이지).
효모 디스플레이는, 효모의 세포 표면의 외곽에 있는 α-아글루티닌 등의 단백질에 원하는 단백질을 융합시켜, 효모 표면 상에 제시시키는 기술이다. α-아글루티닌에는, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커-부착 시그널로 추정되는 C 말단 소수성 영역, 시그널 서열, 활성 도메인, 세포벽 도메인 등이 포함되고, 그것들을 조작함으로써, 효모의 세포 표면 상에 원하는 단백질을 디스플레이 할 수 있다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 DNA 군을 효모 디스플레이에 적합한 벡터에 도입하고, 당해 벡터로 효모 세포를 형질 전환하면, 형질 전환 효모 세포 표면 상에, 랜덤 변이 유발된 단백질군을 제시하는 라이브러리를 얻을 수 있다 (Ueda, M. ＆ Tanaka, A., Biotechnol. Adv., 18 권, 121 페이지 ∼, 2000 년간：Ueda, M. ＆ Tanaka, A., J. Biosci. Bioeng., 90 권, 125 페이지 ∼, 2000 년간 등).
동물 세포 디스플레이는, 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 로 대표되는 막 단백질의 막 관통 영역과 원하는 단백질을 융합시켜, HEK293 이나 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 등의 포유 동물 세포 표면 상에 원하는 단백질을 제시시키는 기술이다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 DNA 군을 동물 세포 디스플레이에 적합한 벡터에 도입하고, 당해 벡터로 동물 세포를 형질 전환하면, 형질 전환 동물 세포 표면 상에, 랜덤 변이 유발된 단백질군을 제시하는 라이브러리를 얻을 수 있다 (Ho M, et al. (2009년) Methods Mol Biol. 525 권：337-52 페이지).
효모, 세균, 동물 세포 등의 세포 상에 제시된 원하는 라이브러리는, 표적 분자의 존재하에서 보온하거나, 또는, 표적 분자와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 비오틴 등으로 수식된 HTRA1 과 라이브러리를 포함하는 세포를 일정 시간 보온한 후, 자성 비즈 등의 담체를 첨가하고, 세포를 담체로부터 분리하고, 이어서 담체를 세정함으로써 비특이적인 흡착물 및 결합물을 제거하고, 담체 (에 결합한 HTRA1) 에 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물이 제시된 세포군을 회수할 수 있다. 마찬가지로, 자성 비즈 첨가 후에 자기 세포 분리 (MACS) 를 하거나, 또는, 항 HTRA1 항체를 사용한 세포 염색 후에 FACS 를 실시함으로써, 담체 (에 결합한 HTRA1) 또는 HTRA1 과 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물이 제시된 세포군을 회수할 수 있다. 비특이적인 흡착물 부위 및/또는 결합 부위는, 예를 들어, 블로킹 하는 (포화시킨다 (saturate)) 것도 가능하고, 블로킹 공정도 적절한 방법이면 도입될 수 있다. 그와 같이 하여 얻어진 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을 발현하고 있는 벡터를 회수하고, 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 갖는 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그 뉴클레오티드 서열이 코드하는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또, 벡터를 재차 숙주 세포에 도입하고, 상기 서술한 조작을 사이클로서 1 회 내지 수 회 반복함으로써, 표적 분자에 결합하는 펩티드 집합물을 보다 고도로 농축할 수 있다.
파지 디스플레이의 경우, 예를 들어, 파지미드는, 플라스미드 복제 기점 외에, 1 본쇄 박테리오파지로부터 유도된 제 2 복제 기점을 포함하는 세균 플라스미드이다. 파지미드를 갖는 세포는, M13 또는 그것에 유사한 헬퍼 박테리오파지에 의한 중감염에 있어서, 1 본쇄 복제 모드를 통하여 파지미드를 복제할 수 있다. 즉, 박테리오파지 피복 단백질에 의해 피복된 감염성 입자 중에, 1 본쇄 파지미드 DNA 가 패키지된다. 이와 같이 하여, 파지미드 DNA 를, 감염 세균 안에 클론 2 본쇄 DNA 플라스미드로서, 파지미드를, 중감염한 세포의 배양 상청으로부터 박테리오파지상의 입자로서 각각 형성할 수 있다. 박테리오파지상의 그 입자를, F 성 선모를 갖는 세균에 이러한 DNA 를 감염시키기 위해서 그 세균 안에 주입함으로써, 입자 자체를 플라스미드로서 재형성할 수 있다.
피검 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 박테리오파지 피복 단백질 (coat protein) 유전자를 포함하여 구성되는 융합 유전자를 그 파지미드에 삽입하여 세균에 감염시키고, 그 세포를 배양하면, 이러한 펩티드를, 그 세균 상 또는 파지형 입자 상에 발현 혹은 제시 (디스플레이와 동일한 의미) 시키거나, 또는, 그 피복 단백질과의 융합 단백질로서 파지 입자 중 혹은 그 세균의 배양 상청 중에 산생할 수 있다.
예를 들어, 그 폴리뉴클레오티드 및 박테리오파지 피복 단백질 유전자 gpIII 을 포함하여 구성되는 융합 유전자를 파지미드에 삽입하고, M13 또는 그것에 유사한 헬퍼 파지와 함께 대장균에 중감염시키면, 그 펩티드 및 그 피복 단백질을 포함하여 구성되는 융합 단백질로서, 그 대장균의 배양 상청 중에 산생시킬 수 있다.
파지미드 대신에, 고리형 또는 비고리형의 각종 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용하는 경우, 당업자에게 공지된 방법에 따라서, 그 벡터에 삽입된 그 폴리뉴클레오티드가 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를, 그 벡터가 도입된 세포 혹은 바이러스형 입자 상에 발현 또는 제시시키거나, 또는 그 세포의 배양 상청 중에 산생할 수 있다.
그와 같이 하여 얻어지는, 펩티드를 발현하고 있는 라이브러리를, 표적 분자의 존재하에서 보온하거나, 또는, 표적 분자와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, HTRA1 이 고상화된 담체를, 라이브러리를 포함하는 이동상과 일정 시간 보온한 후, 이동상을 담체로부터 분리하고, 이어서 담체를 세정함으로써 비특이적인 흡착물 및 결합물을 제거하고, 담체 (에 결합한 HTRA1) 에 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을, 용출에 의해 회수할 수 있다. 용출은, 상대적으로 높은 이온 강도, 낮은 pH, 중 (中) 정도의 변성 조건, 카오트로픽염의 존재하 등에서, 비선택적으로 실시하거나, 또는, HTRA1 등의 가용성의 표적 분자, 표적 분자에 결합하는 항체, 천연의 리간드, 기질 등을 첨가하여 고상화된 표적 분자와 경합시킴으로써 선택적으로 실시할 수 있다. 비특이적인 흡착물 부위 및/또는 결합 부위는, 예를 들어, 블로킹 처리하는 것도 가능하고, 블로킹 공정도 적절한 방법이면 도입될 수 있다.
그와 같이 하여 얻어진 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을 발현하고 있는 벡터를 회수하고, 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 갖는 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그 뉴클레오티드 서열이 코드하는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또, 벡터를 재차 숙주 세포에 도입하고, 상기 서술한 조작을 사이클로서 1 회 내지 수 회 반복함으로써, 표적 분자에 결합하는 펩티드 집합물을 보다 고도로 농축할 수 있다.
리보좀 디스플레이는, 예를 들어, 시종 코돈을 갖지 않는 원하는 단백질을 코드하는 mRNA 와 무세포 단백질 합성계를 사용함으로써, 시험관 내에서 원하는 단백질과 그것에 대응하는 mRNA, 및 리보좀이 연결한 분자를 합성하는 기술이다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 mRNA 군과 무세포 단백질 합성계를 이용함으로써, 랜덤 변이 유발된 단백질군이 리보좀 상에 제시된 라이브러리를 얻을 수 있다 (Mattheakis LC, et al. (1994년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 권 19 호, 9022-9029 페이지).
핵산 디스플레이는, mRNA 디스플레이라고도 불리며, 예를 들어, 티로실 tRNA 의 3' 말단에 유사 구조를 갖는 퓨로마이신 등의 링커를 사용함으로써, 원하는 단백질, 그것을 코드하는 mRNA 및 리보좀이 연결된 분자를 합성하는 기술이다. 당해 기술은 생 세포가 아니라, 무세포 단백질 합성계를 이용하기 때문에, 시험관 내에서 합성하는 것이 가능하다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 mRNA 군과 퓨로마이신 등의 링커, 및, 무세포 단백질 합성계를 이용함으로써, 랜덤 변이 유발된 단백질군이 리보좀 상에 제시된 라이브러리를 얻을 수 있다 (Nemoto N, et al. (1997년) FEBS Lett. 414 권 2호, 405-408 페이지).
리보좀 디스플레이나 핵산 디스플레이 등의 무세포 합성계를 통하여 얻어지는, 펩티드를 발현하고 있는 라이브러리는, 표적 분자의 존재하에서 보온하거나, 또는, 표적 분자와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, HTRA1 이 고상화된 담체를, 라이브러리를 포함하는 이동상과 일정 시간 보온한 후, 이동상을 담체로부터 분리하고, 이어서 담체를 세정함으로써 비특이적인 흡착물 및 결합물을 제거하고, 담체 (에 결합한 HTRA1) 에 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을, 용출에 의해 회수할 수 있다. 용출은, 상대적으로 높은 이온 강도, 낮은 pH, 중 정도의 변성 조건, 카오트로픽염의 존재하 등에서, 비선택적으로 실시하거나, 또는, HTRA1 등의 가용성의 표적 분자, 표적 분자에 결합하는 항체, 천연의 리간드, 기질 등을 첨가하여 고상화된 표적 분자와 경합시킴으로써 선택적으로 실시할 수 있다. 비특이적인 흡착물 부위 및/또는 결합 부위는, 예를 들어, 블로킹 처리하는 것도 가능하고, 블로킹 공정도 적절한 방법이면 도입될 수 있다.
그와 같이 하여 얻어진 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을 발현하고 있는 핵산을 회수하고, mRNA 의 경우에는 cDNA 에 역전사 반응 후에 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그 뉴클레오티드 서열이 코드하는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또, 회수한 핵산으로부터 mRNA 를 전사하고, 상기 서술한 조작을 사이클로서 1 회 내지 수 회 반복함으로써, 표적 분자에 결합하는 펩티드 집합물을 보다 고도로 농축할 수 있다.
펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물에 미리 어피니티·태그를 콘쥬게이트시켜 두면, 효율적으로 당해 펩티드 또는 그들의 집합물을 정제할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 기질을 태그로서 미리 펩티드 집합물에 콘쥬게이트시켜 두면, 그 프로테아제 활성에 의해 절단됨으로써, 펩티드를 용출할 수 있다.
얻어진 서열 정보 및 펩티드의 기능 등에 기초하여, 얻어진 클론 또는 라이브러리에 추가적인 변이를 유발시키고, 변이가 도입된 라이브러리로부터, 그 기능 (예를 들어, HTRA1 저해 활성), 물성 (열 안정성, 보존 안정성 등), 체내 동태 (분포, 혈중 반감기) 등이 개선된 펩티드를 취득하는 것도 가능하다.
얻어진 펩티드가, HTRA1 저해 활성을 갖고 있는지 여부를 결정함으로써, HTRA1 저해 펩티드를 동정할 수 있다.
또, HTRA1 저해 펩티드는, 적합하게는, 야생형 SPINK2 의 아미노산 서열에 포함되는 16 번 Ser 내지 30 번 Val 로 이루어지는 루프 구조, 31 번 Cys 및 32 번 Gly 로 이루어지는 β 스트랜드 (1) 그리고 57 번 Ile 내지 59 번 Arg 로 이루어지는 β 스트랜드 (2) 로 구성되는 β 시트, 그리고, 41 Glu 번 아미노산 내지 51 번 Gly 로 이루어지는 α 헬릭스, 또는, 그것들에 유사하거나 혹은 그들 (의 위치에) 적어도 부분적으로 대응하는 루프 구조, β 시트, α 헬릭스 등으로 구성되는 입체 구조가, HTRA1 저해 활성을 발휘할 수 있는 정도로, 유지될 수 있다. 이러한 입체 구조 (전체 구조 또는 부분 구조) 를 지표의 일부로 하여, 보다 적합한 HTRA1 저해 펩티드를 동정하는 것도 가능하다.
4. HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자, 그것을 포함하는 벡터, 그것들을 포함하는 세포, 그리고, 재조합 HTRA1 저해 펩티드의 제조 방법
본 발명은, HTRA1 저해 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (이하, 「HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자」 라고 한다), 그 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 유전자 혹은 벡터가 도입된 세포 (이하, 「HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자 함유 세포」 라고 한다), 또는 HTRA1 저해 펩티드를 산생하는 세포 (이하, 「HTRA1 저해 펩티드 산생 세포」 라고 한다) 도 제공한다.
본 발명의 HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자의 일부의 적합한 예로서, 다음의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (이하, 「HTRA1 저해 펩티드의 뉴클레오티드 서열」 이라고 한다) 을 포함하여 이루어지거나, 항체 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 또는 항체 유전자 서열로 이루어지는 것을 들 수 있다：
(a) 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 내지 29 (도 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33, 35 내지 41) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열；
(b) 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22 (도 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 및 34) 중 어느 하나로 나타내는 뉴클레오티드 서열；
(c) (a) 또는 (b) 에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 HTRA1 저해 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열；
(d) (a) 또는 (b) 에 기재된 뉴클레오티드 서열에 있어서 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 잔기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 이루어지고, 또한 HTRA1 저해 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열；및,
(e) (a) 또는 (b) 에 기재된 뉴클레오티드 서열과 60 ％, 70 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 92 ％, 94 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％ 이상 동일하고, 또한 HTRA1 저해 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열.
그러나, HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자는 (a) 내지 (e) 에 한정되는 것이 아니라, HTRA1 저해 활성을 갖는 SPINK2 변이체에 포함되는 아미노산 서열, 적합하게는 서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 널리 HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자의 범위에 포함된다.
아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 설계하려면, 각 아미노산에 대응하는 코돈을 1 종 또는 2 종 이상 사용할 수 있다. 그 때문에, 어느 펩티드가 갖는 단일의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은, 복수의 배리에이션을 가질 수 있다. 이러한 코돈의 선택 시에는, 그 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 또는 그것을 포함하는 벡터가 도입되는, 발현용의 숙주 세포의 코돈 사용 (codon usage) 에 따라 적절히 코돈을 선택하거나, 복수의 코돈의 사용의 빈도 혹은 비율을 적절히 조절하거나 할 수 있다. 예를 들어, 대장균을 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 대장균에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 사용하여 뉴클레오티드 서열을 설계해도 된다.
HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자는, 1 개 또는 2 개 이상의 조절 서열에 기능적으로 연결되어 있어도 된다. 「기능적으로 연결된다」 란, 연결된 핵산 분자를 발현시킬 수 있거나, 또는, 그 분자에 포함되는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는, 것을 의미한다. 조절 서열은, 전사 조절 및/또는 번역 조절에 관한 정보를 포함하는 서열 엘리먼트를 포함한다. 조절 서열은, 종에 따라 다양하지만, 일반적으로, 프로모터를 포함하고, 원핵 생물의 -35/-10 박스 및 샤인·달가르노 서열, 진핵 생물의 TATA 박스, CAAT 서열, 및 5' 캡핑 서열 등으로 예시되는, 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5' 비코드 서열을 포함한다. 이러한 서열은, 인핸서 엘리먼트 및/또는 리플렛서 엘리먼트, 그리고 숙주 세포 내외의 특정한 구획으로 천연형 또는 성숙형의 펩티드를 송달하기 위한, 번역될 수 있는 시그널 서열, 리더 서열 등을 포함해도 된다. 또한, 조절 서열은 3' 비코드 서열을 포함해도 되고, 이러한 서열에는, 전사 종결 또는 폴리아데닐화 등에 관여하는 엘리먼트를 포함할 수 있다. 단, 전사 종결에 관한 서열이, 특정한 숙주 세포에 있어서 충분히 기능하지 않는 경우에는, 당해 세포에 적합한 서열로 치환될 수 있다.
프로모터 서열로는, 원핵 생물에서는 tet 프로모터, lacUV5 프로모터, T7 프로모터 등을, 진핵 세포에서는 SV40 프로모터, CMV 프로모터 등을 예시할 수 있다.
HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자는, 단리된 형태, 벡터 혹은 다른 클로닝 비히클 (이하, 간단히 「벡터」 라고 한다：플라스미드, 파지미드, 파지, 바큘로바이러스, 코스미드 등) 중 또는 염색체 중에 포함되는 형태여도 되지만, 그들의 형태에 한정되지 않는다. 벡터에는, HTRA1 저해 펩티드의 뉴클레오티드 서열 및 상기 조절 서열에 더하여, 발현에 사용되는 숙주 세포에 적합한 복제 서열 및 제어 서열, 그리고 형질 전환 등에 의해 핵산 분자가 도입된 세포를 선택 가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함하고 있어도 된다.
HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자, HTRA1 저해 펩티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는, 당해 펩티드 또 뉴클레오티드 서열을 발현 가능한 숙주 세포에 형질 전환 등의 당업자에게 공지된 방법에 의해 도입할 수 있다. 그 핵산 분자 또는 벡터가 도입된 숙주 세포는, 당해 펩티드 또 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 건하에서 배양될 수 있다. 숙주 세포는, 원핵 및 진핵 중 어느 것이어도 되고, 원핵에서는 대장균, 고초균 등, 진핵에서는 삭카로미세스·세레비시에, 피키아·파스토리스 등의 효모, SF9, High5 등의 곤충 세포, HeLa 세포, CHO 세포, COS 세포, NS0 등의 동물 세포를 예시할 수 있다. 진핵 세포 등을 숙주 세포로서 사용함으로써, 발현한 본 발명의 펩티드에 원하는 번역 후 수식을 실시할 수 있다. 번역 후 수식으로는, 당사슬 등의 관능기 부가, 펩티드 또는 단백질의 부가, 아미노산의 화학적 성질의 변환 등을 예시할 수 있다. 또, 본 발명의 펩티드에 대한 원하는 수식을 인공적으로 실시하는 것도 가능하다. 그러한 펩티드의 수식체도, 본 발명의 「펩티드」 의 범위에 포함된다.
본 발명은 HTRA1 저해 펩티드의 제조 방법도 포함한다. 당해 방법에는, HTRA1 저해 펩티드를 코드하는 핵산 분자 혹은 HTRA1 저해 펩티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 도입된 숙주 세포 또는 HTRA1 저해 펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 공정 1, 및/또는, 공정 1 에서 얻어진 배양물로부터 HTRA1 저해 펩티드를 회수하는 공정 2 가 포함된다. 공정 2 에는, 당업자에게 공지된 분획, 크로마토그래피, 정제 등의 조작을 적용할 수 있고, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 항체를 이용한 어피니티 정제가 적용 가능하다.
본 발명의 일부의 양태에 있어서, HTRA1 저해 펩티드는, 분자 내 디술파이드 결합을 갖는다. 분자 내 디술파이드 결합을 갖는 펩티드는, 시그널 서열 등을 사용하여, 산화성의 산화 환원 환경을 갖는 세포 구간에 송달시키는 것이 바람직한 경우가 있다. 산화성 환경은, 대장균 등의 그램 음성 세균의 주변질, 그램 양성 세균의 세포 외 환경, 진핵 세포의 소포체 내강 등에 의해 제공하는 것이 가능하고, 이러한 환경하에서는, 구조적인 디술파이드 결합의 형성이 촉진될 수 있다. 또, 대장균 등의 숙주 세포의 세포질에 있어서 분자 내 디술파이드 결합을 갖는 펩티드를 제조하는 것도 가능하고, 그 경우 펩티드는, 가용성의 접힌 상태로 직접적으로 획득되거나, 또는 봉입체의 형태로 회수되고, 이어서 인·비트로에서 복원될 수 있다. 또한, 산화성의 세포 내 환경을 갖는 숙주 세포를 선택하고, 그 세포질에 있어서 분자 내 디술파이드 결합을 갖는 펩티드를 제조할 수도 있다. 한편, HTRA1 저해 펩티드가 분자 내 디술파이드 결합을 갖지 않는 경우에는, 환원성의 산화 환원 환경을 갖는 세포 구간, 예를 들어, 그램 음성 세균의 세포질에 있어서 제조될 수 있다.
본 발명의 HTRA1 저해 펩티드는, 메리필드 외의 펩티드 고상 합성법, 그리고, t-부톡시카르보닐 (t-Butoxycarbonyl：Boc) 이나 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (9-Fluorenylmethoxycarbonyl：Fmoc) 등을 이용한 유기 합성 화학적 펩티드 합성법에 의해 예시되는 화학 합성, 인·비트로 번역 등의, 다른 당업자에게 공지된 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
본 발명은, 그 일부의 양태로서, HTRA1 저해 활성을 갖는 SPINK2 변이체 펩티드에 결합하는 항체 및 그 기능 단편을 제공한다. 항체는, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 되고, 모노클로날 항체로는, 면역 글로블린 또는 거기에서 유래하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 항체의 기능 단편은, 항원 결합 활성 즉 그 SPINK2 변이체 펩티드에 대한 결합 활성을 갖고 있는 범위에 있어서 한정은 없고, 중사슬 및 경사슬의 양방 혹은 일방 또는 그 단편, 정상 영역이나 Fc 영역이 결여된 것, 다른 단백질이나 표지용 물질과의 콘쥬게이트체 등도 포함된다. 이러한 항체 및 그 기능 단편은, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있고, 그 SPINK2 변이체 펩티드의 어피니티·크로마토그래피에 의한 정제, 그 펩티드를 포함하는 의약 조성물 또는 그 사용에 관련한 임상 검사, 진단 등에 있어서의 그 펩티드의 검출, 이뮤노어세이 등에 유용하다. 본 발명의 항체는, 그 항체가 결합하는 본 발명의 펩티드를 사용한 어피니티·크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
5. 의약 조성물
본 발명은 HTRA1 저해 펩티드, 또는, 그 콘쥬게이트를 포함하는 의약 조성물도 제공한다.
본 발명의 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트 의약 조성물은, HTRA1 에 의해 야기되거나 또는 증악화 되고, HTRA1 의 발현 또는 기능을 저해 또는 억제함으로써, 이러한 야기 또는 증악화의 억제, 치유, 증상의 유지 혹은 개선, 2 차성 질환의 회피 등 할 수 있는 각종 질환 (이하, 「HTRA1 에 관련된 질환」 또는 「HTRA1 관련 질환」 이라고 한다) 의 치료 및/또는 예방에 유용하다. HTRA1 에 관련된 질환에는, 망막 보호 효과에 의해 야기 또는 증악화의 억제, 치유, 증상의 유지 혹은 개선, 2 차성 질환의 회피 등 할 수 있는 각종 질환도 포함된다. HTRA1 저해 펩티드는 망막 보호 효과를 갖고, HTRA1 에 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
HTRA1 에 관련된 질환으로는, 예를 들어, 가령 황반 변성증, 미숙아 망막증, 폴립상 맥락막 혈관증, 관절 류머티즘, 또는 변형성 관절증 등을 들 수 있으며, 가령 황반 변성증으로는, 삼출형 가령 황반 변성증, 위축형 가령 황반 변성증, 지도상 위축 등을 들 수 있지만, 그들에 한정되는 것은 아니다. 또, 본 발명의 의약 조성물은, 시세포 보호제, 망막 보호제 등 (정리하여 「망막 보호제」 라고 한다) 으로서도 사용될 수 있다.
가령성 황반 변성증은, 삼출형 및 위축형으로 나뉜다. 삼출형은, 또한 전형 가령성 황반 변성증 (전형 AMD), 폴립상 맥락막 혈관증 (PCV), 망막 혈관종상 증식 (RAP) 으로 분류된다. 삼출형에 대해서는, 항 VEGF 약이나 광선 역학 요법 (PDT) 등의 치료법이 존재하지만 반드시 충분한 것은 아니고, 위축형에 대해서는, 식생활의 개선이나 연령 관련 눈 질환 연구 (Age-Related Eye Disease Study) (AREDS) 에 기초하는 서플리먼트 섭취가 실시되고 있는 것에 불과하다.
본 발명의 의약 조성물이, 가령 황반 변성증의 치료 또는 예방에 사용할 수 있는 것은, 예를 들어, 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서, 광 조사 전 또는 후에, 각각 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드를 투여함으로써, 대조군에서는 외과립층에 포함되는 핵의 수가 감소하는 데 반해, 투여군에서는 외과립층에 포함되는 핵의 수의 감소를 억제하였기 때문에 (실시예 5, 10 및 14), 혹은 고지방식 및 하이드로퀴논의 섭식에 의해 제조되는 토끼 망막 장애 모델 (후술) 에 있어서, 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드를 투여함으로써, 대조군에서는 망막 색소 상피 세포 (RPE 세포) 의 면적 또는 일정 이상의 세포 면적을 갖는 RPE 세포수가 증가하는 데 반해, 투여군에서는 이러한 증가가 억제되는 것 (실시예 11) 으로부터 나타난다. 토끼 망막 장애 모델은, 인간 위축형 가령 황반 변성증의 리스크 인자를 가미하고 있기 때문에, 특히 위축형 가령 황반 변성증의 모델로서 우수하다.
망막 색소 상피 세포 (RPE 세포) 를 사용한 VEGF mRNA 유도 시험에 있어서, HTRA1 저해 펩티드를 투여하면, VEGF mRNA 의 발현 억제가 확인되었다 (실시예 12). 망막 색소 상피 세포로부터의 VEGF 유도는 삼출형 가령성 황반 변성 병태 형성에 관여하고 있는 것에 더하여 (Klettner A. et al., (2009) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 권：1487-1492 페이지), 병태의 유지에도 그들의 병적인 VEGF 유도가 관여하고 있는 것으로 생각되고 있고, 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드는, 위축형 가령성 황반 변성증 그리고 삼출형 가령성 황반 변성증의 치료 및 예방에 대하여 유용한 것이 나타난다.
인간 제대 정맥내 피세포 (皮細胞) (HUVEC) 의 유주 (遊走) 시험에 있어서, HTRA1 저해 펩티드를 투여하면, 유주의 억제가 확인되었기 때문에 (실시예 13), 혈관 신생을 특징으로 하는 삼출형 가령 황반 변성증의 치료 및 예방에 유용한 것이 나타난다.
삼출형 가령성 황반 변성증은 진행성이다. 또 항 VEGF 약의 투여에 의해 병상을 일시적으로 억제할 수 있기는 하지만, 고빈도로 재발을 반복하는 것이 문제가 되고 있다 (Yand S 외, Drug Des Devel Ther., 2 권 10 호：1857-67 페이지, 2016년간). 또, 최근에는 삼출형 가령성 황반 변성증 환자에게 새롭게 위축을 발증하여 시력 저하를 일으키는 것이 문제가 되고 있다 (Berg K 외, Acta Ophthalmologica, 95 권 8 호：796-802 페이지, 2017년간). 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드의 투여는, 단독 또는 항 VEGF 약과 병용함으로써, 이들 삼출형 가령성 황반 변성증 (폴립상 맥락막 혈관증, 망막내 혈관종상 증식을 포함한다) 에 대한 치료 효과를 발휘할 수 있다. 게다가, 그 펩티드를 예방적으로 투여함으로써, 병상의 재발을 저지하거나 또는 늦추고, 항 VEGF 약에 의한 치료의 개시 또는 재개를 늦추는 것 등이 가능하다. 또한, 삼출 가령성 황반 변성증 환자에 있어서의 위축의 형성에 대해서도 그 펩티드는 억제적으로 작용하기 때문에, 장기적인 시력 상의 베네핏을 가져올 수 있다.
본 발명의 HTRA1 저해 펩티드는, 조직에 대한 침투성이 우수하고 (실시예 11), 물성·안정성, 안전성, 투여 후의 동태, 생산성 등도 우수하고, 의약 조성물에 유효 성분으로서 적합하게 함유시킬 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에는, 치료 또는 예방에 유효한 양의 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유시킬 수 있다.
「치료 또는 예방에 유효한 양」 이란, 특정한 질환, 투여 형태 및 투여 경로에 대해 치료 또는 예방 효과를 발휘하는 양을 의미하며, 「약리학적으로 유효한 양」 과 동일한 의미이다.
본 발명의 의약 조성물에는, pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 그 조성물 또는 거기에 포함되는 본 발명의 펩티드, 그 콘쥬게이트의 안정성, 용해성, 서방성, 흡수성, 침투성, 제형, 강도, 성상, 형상 등을 변화시키거나, 유지하거나, 보유하거나 하기 위한 물질 (이하, 「제제용의 물질」 이라고 한다) 을 함유시킬 수 있다. 제제용의 물질로는, 약리학적으로 허용되는 물질이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 비독성 또는 저독성인 것은, 제제용의 물질이 적합하게 구비하는 성질이다.
제제용의 물질로서, 예를 들어, 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다；글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 완충제, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-Hcl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류나 글루코오스, 만노오스나 덱스트린 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르빈산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당알코올, 현탁제, PEG, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨이나 소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제.
이들 제제용의 물질의 첨가량은, HTRA1 저해 펩티드의 중량에 대하여 0.001 내지 1000 배, 적합하게는 0.01 내지 100 배, 보다 적합하게는 0.1 내지 10 배이다.
HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 리포솜 중에 함유시킨 것, HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트와 리포솜이 결합하여 이루어지는 수식체를 함유하는 의약 조성물도, 본 발명의 의약 조성물에 포함된다.
부형제나 담체는, 통상적으로 액체 또는 고체이며, 주사용의 물, 생리 식염수, 인공 뇌척수액, 그 밖의, 경구 투여 또는 비경구 투여용의 제제에 사용되는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. 생리 식염수로는, 중성의 것, 혈청 알부민을 포함하는 것 등을 들 수 있다.
완충제로는, 의약 조성물의 최종 pH 가 7.0 내지 8.5 가 되도록 조제된 Tris 완충제, 동일하게 4.0 내지 5.5 가 되도록 조제된 아세트산 완충제, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 시트르산 완충제, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 히스티딘 완충제 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 고체, 액체, 현탁액 등이다. 동결 건조 제제를 들 수 있다. 동결 건조 제제를 성형하려면, 수크로오스 등의 부형제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로는, 점안, 경장 투여, 국소 투여 및 비경구 투여 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 결막 상에 대한 점안, 유리체내 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 골내 투여, 관절내 투여 등을 들 수 있다.
이러한 의약 조성물의 조성은, 투여 방법, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 결합 친화성 등에 따라 결정할 수 있다. 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드의 표적인 HTRA1 에 대한 저해 활성이 강하거나 (IC50 값이 작다) 또는 HTRA1 단백질에 대한 친화성이 높을수록 (KD 값이 낮다), 적은 투여량으로 그 약효를 발휘할 수 있다.
본 발명의 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트의 투여량은, 약리학적으로 유효한 양이면 한정되지 않고, 개체의 종, 질환의 종류, 증상, 성별, 연령, 지병, 그 펩티드의 HTRA1 단백질 결합 친화성 또는 그 생물 활성, 그 밖의 요소에 따라 적절히 결정할 수 있지만, 통상적으로, 0.01 내지 1000 ㎎/㎏, 적합하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 을, 1 내지 180 일간에 1 회, 또는 1 일 2 회 혹은 3 회 이상 투여할 수 있다.
의약 조성물의 형태로는, 주사제 (동결 건조 제제, 점적제를 포함한다), 좌제, 경비형 흡수 제제, 경피형 흡수 제제, 설하제, 캡슐, 정제, 연고제, 과립제, 에어졸제, 환제, 산제, 현탁제, 유제, 점안제, 생체 매립형 제제 등을 예시할 수 있다.
HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물은, 다른 의약과 동시에 또는 별개로 투여할 수 있다. 예를 들어, 다른 의약을 투여한 후에 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물을 투여하거나, 이러한 의약 조성물을 투여한 후에, 다른 의약을 투여하거나, 또는, 당해 의약 조성물과 다른 의약을 동시에 투여해도 된다. 동시에 투여하는 경우, HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트와 다른 의약이란, 단일의 제제, 및, 별개의 제제 (복수의 제제), 중 어느 것에 함유되어도 된다.
본 발명의 의약 조성물과 조합하여 사용되는 다른 의약으로는, 예를 들어, 항 VEGF 제, 항염증제, 염증성 사이토카인 중화제, 보체 활성화 경로 억제제 등을 들 수 있다. 항 VEGF 제는, 항 VEGF 항체, VEGF 저해제, VEGF 수용체 안타고니스트 및 가용형 VEGF 수용체 등으로 분류되고, 베바시주맙, 라니비주맙, 애플리버셉트, 페가프타니브, 브로루시투맵 (brolucitumab) 등이 포함된다. 항염증제로는, 안내 또는 관절내 염증을 억제하기 위해서 국소 투여될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 염증성 사이토카인 중화제에는, 항 TNFα 항체, 항인터류킨-6 (이하, 「IL-6」 이라고 한다) 항체, 항 IL-6 수용체 항체, 가용형 TNF 수용체 등이 있으며, 구체적으로는 인플릭시맵, 어댈리무맵, 골리무맵, 세르톨리주맙, 토실리주맙, 에타네르셉트 등을 들 수 있다. 보체 활성화 경로 억제제로는, 람팔리주맙 등을 들 수 있다. 그것들은 HTRA1 에 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위해서 적합하지만, HTRA1 에 관련된 질환 이외의 질환의 치료 또는 예방에 있어서도 본 발명의 의약 조성물과 조합할 수 있다.
그들의 다른 의약은, 1 개인 경우도 있고, 2 개, 3 개 혹은 그 이상을 투여하거나 또는 수용할 수도 있다. 그것들을 정리하여 본 발명의 의약 조성물과 「다른 의약과의 병용」 또는 「다른 의약과의 조합」 이라고 부르며, 본 발명의 항체, 그 결합 단편 혹은 그 수식체에 더하여 다른 의약을 포함하거나 또는 다른 요법과 조합하여 사용되는 본 발명의 의약 조성물도 「다른 의약과의 병용」 또는 「다른 의약과의 조합」 의 양태로서 본 발명에 포함된다.
본 발명은, HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 투여하는 공정을 포함하는, 가령 황반 변성증 등 HTRA1 에 관련된 질환의 치료 방법 또는 예방 방법, 그 질환의 치료용 또는 예방용 의약 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트의 사용, 그 질환의 치료 또는 예방을 위한 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트의 사용도 제공한다. 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 포함하는 치료용 또는 예방용 키트도 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은, HTRA1 펩티드 또는 그 콘쥬게이트가 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는, 그 폴리뉴클레오티드 혹은 그 벡터를 포함하거나 또는 본 발명의 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물도 제공한다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 HTRA1 에 관련된 질환의 유전자 치료에, 이러한 세포는 HTRA1 에 관련된 질환의 세포 치료에, 각각 공지된 수법을 이용하여 적용할 수 있다. 또, 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를, 자가 세포 또는 타가 세포 (동종 세포) 에 도입함으로써, 세포 치료용의 세포를 조제할 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터는, 세포 치료약 조제용의 조성물로서도, 본 발명에 포함된다. 그러나, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 등을 포함하는 의약 조성물의 양태는 상기의 것에 한정되지 않는다.
6. 진단용 조성물 및 HTRA1 의 검출 및 분리 방법
본 발명의 HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트는, HTRA1 프로테아제 저해 활성에 더하여, HTRA1 결합 활성을 갖고 있어도 되고, HTRA1 저해제 탐색 연구의 포지티브 컨트롤로서의 사용 등의 다양한 연구, HTRA1 의 검출, 그 검출을 이용한 검사 및 진단, HTRA1 의 분리, 시약 및 그 밖의 용도에서 사용될 수 있다. HTRA1 의 검출이나 분리 시에는, 본 발명의 펩티드 및 HTRA1 중 적어도 일방이 고상화 될 수 있다.
본 발명은, HTRA1 에 결합하는 본 발명의 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 포함하는 검사용 또는 진단용 조성물 (이하, 정리하여 「진단용 조성물」 이라고 한다) 을 제공한다.
본 발명의 진단용 조성물은, HTRA1 에 관련된 질환, HTRA1 발현 등의 검사 또는 진단에 유용하다. 본 발명에 있어서 검사 또는 진단에는, 예를 들어, 이환 리스크의 판정 또는 측정, 이환 유무의 판정, 진행이나 증악화 정도의 측정, HTRA1 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 포함하는 의약 조성물에 의한 약물 치료 효과의 측정 또는 판정, 약물 치료 이외의 치료 효과의 측정 또는 판정, 재발 리스크의 측정, 재발 유무의 판정 등이 포함되지만, 검사 또는 진단이면 그것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 진단용 조성물은, 본 발명의 펩티드 또는 그 콘쥬게이트, 그것들을 포함하는 조성물, 그것들을 포함하는 의약 조성물을 투여하는 개체의 동정에 유용하다.
이러한 진단용 조성물에는, pH 완충제, 삼투압 조절제, 염류, 안정화제, 방부제, 현색제, 증감제, 응집 방지제 등을 함유시킬 수 있다.
본 발명은 HTRA1 에 관련된 질환의 검사 방법 또는 진단 방법, 그 질환의 진단용 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 펩티드의 사용, 그 질환의 검사 또는 진단을 위한, HTRA1 에 결합하는 본 발명의 펩티드 또는 그 콘쥬게이트의 사용도 제공한다. 이러한 본 발명의 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 포함하는 검사 또는 진단용 키트도 본 발명에 포함된다.
HTRA1 에 결합하는 본 발명의 펩티드를 포함하는 검사 또는 진단의 방법으로는 샌드위치 ELISA 가 바람직하지만, 통상적인 ELISA 법이나 RIA 법, ELISPOT 법, 도트 블롯법, 옥털로니법, CIE 법, CLIA, 플로 사이토메트리 등의 검출 방법이 이용 가능하다. 면역 침강법을 이용한 방법으로도 검사 또는 진단이 가능하다.
또, 본 발명은 피검 샘플 중의 HTRA1 을 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다. 이들의 검출 또는 측정 방법에는, 본 발명의 진단용 조성물을 사용할 수 있다. HTRA1 저해 펩티드, 또는, 그 콘쥬게이트를 피검 시료와 접촉시키고 (공정 1), 이어서 그 펩티드에 결합한 HTRA1 의 양 또는 측정을 측정함 (공정 2) 으로써, 그 시료 중의 HTRA1 을 검출할 수 있다. 공정 1 로는, 예를 들어, HTRA1 저해 펩티드에 면역 글로블린의 Fc 영역을 콘쥬게이트 한 것을, 프로테인 G 를 개재하여 자기 비즈에 고상화하고, 거기에 피검 시료를 첨가하는 등, 공정 2 로는, 예를 들어, 자기 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 가용성 단백질을 SDS-PAGE 나 웨스턴 블롯 법으로 해석하여, HTRA1 을 검출하는 등을 들 수 있다. 본 측정에는, 인간 또는 비인간 동물 유래의 시료에 더하여, 재조합 단백질 등의 인공적인 처리를 더한 시료도 제공할 수 있다. 생물 개체 유래의 피검 시료로는, 예를 들어, 혈액, 관절액, 복수, 림프액, 뇌척수액, 폐포 세정액, 타액, 담, 조직 호모지네이트 상청, 조직 절편 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
상기의 HTRA1 의 검출은, 인·비트로 뿐만 아니라, 인·비보에서도 실시할 수 있다. 화상 진단의 경우에는, 약학적으로 허용 가능한 방사성 핵종이나 발광체로 표지된 HTRA1 저해 펩티드, 또는, 그 콘쥬게이트를 이용할 수 있다. 공정 1 로는, 예를 들어, 피험자에게, 표지된 그 펩티드 혹은 그 콘쥬게이트를 투여하는, 공정 2 로는, 예를 들어, PET/CT 등의 화상 진단 기술을 사용하여 화상을 취하고, HTRA1 의 존재를 판정 또는 검사하는 등을 들 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 펩티드 또는 그 콘쥬게이트는 HTRA1 에 결합하고, 적합하게는 HTRA1 특이적 결합 활성을 갖는다.
본 발명의 의약 조성물이 투여되는 개체를 동정하는 방법도 본 발명에 포함된다. 이러한 동정 방법에 있어서는, 그 개체 유래 샘플 중의 HTRA1 을 본 발명의 HTRA1 결합 펩티드를 사용하여 측정하고, 그 샘플 중에, HTRA1 이 검출되었거나, 또는, 정상 개체 유래 샘플 중에 검출된 HTRA1 의 양과 비교하여 보다 많은 HTRA1 이 검출된 경우에, 그 개체를 양성으로 판정할 수 있다. 당해 방법에는, 본 발명의 진단용 조성물을 사용할 수 있다.
또, 이러한 동정 방법의 적합한 일 양태에 있어서, 그 개체는 HTRA1 관련 질환에 이환하고 있거나 또는 그 리스크가 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은, 그 일 양태에 있어서, 이러한 동정 방법에 있어서 양성으로 판정된 개체에 투여될 수 있다.
HTRA1 에 특이적인 결합 활성을 갖는 본 발명의 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 사용하여, HTRA1 과 다른 성분이 혼재한 시료 중으로부터, HTRA1 을 특이적으로 분리할 수 있다. 펩티드로부터의 HTRA1 의 유리는, 상대적으로 높은 이온 강도, 낮은 pH, 중 정도의 변성 조건, 카오트로픽염의 존재하 등에서, 비선택적으로 실시할 수 있지만, HTRA1 의 프로테아제 활성을 감약시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
7. HTRA1 에 관련된 질환의 치료약 또는 예방약의 동정 방법
본 발명은 그 어느 양태에 있어서, HTRA1 저해 활성을 지표로서, HTRA1 에 관련된 질환, 적합하게는 가령 황반 변성증의 치료약 혹은 예방약, 또는 그 후보를 동정하는 방법을 제공한다. 그 방법에는, HTRA1 프로테아제 및 기질을, 피검 물질의 존재하 또는 비존재하 (혹은 비히클 존재하) 에서 보온하는 공정 1, 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성을 결정하는 공정 2, 및/또는, 피검 물질의 존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성이, 피검 물질의 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성과 비교하여 작은 경우, 그 피검 물질을 가령 황반 변성증의 치료약 혹은 예방약, 또는 그 후보로 판정하는 공정 3, 을 포함할 수 있다. 피검 물질은, 펩티드성, 비펩티드성 중 어느 것이어도 되고, 펩티드성으로는 SPINK2 변이체에 한정되지 않고, 항체, 면역 글로블린이 아닌 단백질의 골격을 갖는 SPINK2 변이체 이외의 펩티드, HTRA1 기질 아날로그 등을 예시할 수 있고, 비펩티드성으로는 합성 저분자 화합물, 핵산 등을 예시할 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다. 또, 상기의 1 개 또는 2 개 이상의 공정은, 망막 보호 효과를 갖는 물질 또는 그 후보의 동정 방법에도, 적합하게 포함될 수 있다. 본 발명은 망막 보호 효과를 갖는 물질 또는 그 후보의 동정 방법에도 관한 것이다.
8. 토끼 망막 장애 모델
본 발명은, 하이드로퀴논 (Hydriguinone：이하 「HQ」 라고 한다) 을 함유하는 고지방식 (Hgih Fat Diet：이하 「HFD」 라고 한다) 부하에 의한 토끼 망막 장애 모델, 그 제조 방법, 당해 모델을 사용한 시험 방법 등도 제공한다.
본 모델에는, 2 세 이상의 백색종 토끼이면, 자웅 구별없이, NZW, JW 등 임의의 것을 사용할 수 있다.
HFD 로는, 0.1 ∼ 2 ％ (w/v) 콜레스테롤, 1 ∼ 10 ％ (w/v) 코코넛 오일, 1 ∼ 10 ％ (w/v) 피너츠 오일, 1 ∼ 10 ％ (wv) 대두유, 10 ∼ 20 ％ (w/v) 우지 (牛脂), 10 ∼ 50 ％ (w/v) 라드, 1 ∼ 10 ％ (w/v) 콘 오일로 예시되는 바와 같은, 임의의 유지를 임의의 분량 함유시킬 수 있지만, 당해 모델의 제조에 적합하면 그것들에 한정되지 않는다.
HQ-HFD 에 함유시키는 HQ 의 양은, 0 ∼ 4 ％ (w/v), 적합하게는 0.5 ∼ 3.5 ％ (w/v) 이고, 보다 적합하게는 1.0 ∼ 3.0 ％ (w/v), 보다 한층 적합하게는 2.2 ∼ 2.8 ％ (w/v), 최적으로는 2.4 ％ (w/v) 이다.
HQ-HFD 의 섭식 기간은, 3 ∼ 6 개월, 적합하게는 3.5 ∼ 5 개월, 보다 적합하게는 4 개월이다. 8 개월 이상 섭식을 계속하는 것은 피해야 한다.
본 발명의 모델은, 마우스의 모델 (비특허문헌 18, 19) 과 비교하여, 안구의 사이즈, 기능의 점에서 보다 인간에 가까운 점에서 바람직하다. 또, 토끼의 모델 (비특허문헌 20) 에서 그 제조에 8 개월을 필요로 하고 있었지만, 본 발명의 모델은 보다 단기간에 제조 가능할 뿐만 아니라, 종래의 모델에서는 불명확했던 RPE 세포의 비대를 유도할 수 있어, 가령 황반 변성증의 모델로서 보다 바람직하다.
본 발명의 모델은, 망막 색소 상피 세포 (RPE 세포) 가, 정상 토끼에 비해 비대해 있고, 가령 황반 변성증의 초기 병태를 발증하고 있다. 한편, 종래의 토끼 모델 (비특허문헌 20) 에 가까운 10 주령의 토끼에게 HQ-HFD 를 4 개월간 섭취시켰지만, RPE 세포 비대는 시각적으로 확인할 수 없었다.
병태를 발증한 본 모델을 사용함으로써, 가령 황반 변성증의 치료약 및/혹은 예방약, 또는 망막 보호제를 동정할 수 있다. 이러한 동정 방법은 (i) 본 모델의 토끼에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 비대를, 피검 물질 투여하 및 비투여하에서 측정하는 공정；및 (ii) 그 피검 물질 투여하에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 비대가 비투여하와 비교하여 억제된 경우, 그 피검 물질을 양성으로 판정하는 공정, 을 포함할 수 있다. 공정 (i) 에 있어서의 측정은, 망막 색소 상피 세포의 평균 면적, 및/또는, 비대한 망막 색소 상피 세포수가 적합하다.
실시예
이하의 실시예에 있어서, 본 발명의 일부의 양태에 대해 더욱 상세히 서술하는데, 본 발명은 그것들에 한정되지 않는다.
또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 에서 1982년 발간 또는 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는, 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라서 실시하였다.
실시예 1. HTRA1 저해 펩티드의 조제
(1-1) HTRA1 저해 펩티드 발현 벡터의 구축
(1-1-1) pET 32a (개변)＿HTRA1 저해 펩티드의 구축
먼저, SPINK2scaffold 를 골격으로 한 HTRA1 저해 펩티드의 발현 벡터를 구축하였다. 각 저해 펩티드의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22) 과 SPINK2 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 2) 을 주형 (鑄型) 으로 하여, 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 30 초) × 30 사이클) 에 의해 저해제 단편을 증폭하였다.
Figure pct00001
증폭한 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit) (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편 및 pET 32a (개변) 를 제한 효소 EcoRI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 PCR 정제 키트 (QIAquick PCR Purification Kit) (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Ligase) (NEB) 를 사용하여, 정제한 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 리게이션 (ligation) 반응을 실시하였다. 리게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치 (靜置) 한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상 (氷上) 에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균으로 형질 전환하였다. 다음날, 형질 전환한 대장균을, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 트리픽 브로쓰 (Terrific Broth) 배지 (Invitrogen) 에 식균하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양 후, QIAprep 96 터보 미니프렙 키트 (QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit) (Qiagen) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 회수하고 (이하, 「미니프렙 (miniprep) 처리」 라고 한다), 서열 해석을 실시함으로써 「pET 32a (개변)＿HTRA1 저해 펩티드」 를 구축하였다.
(1-1-2) pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드＿Kex2 의 구축
마찬가지로, 각 저해제의 서열 (서열표) 과 SPINK2 를 주형으로 하여, 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 30 초) × 30 사이클) 에 의해 저해제 단편을 증폭하였다.
Figure pct00002
증폭한 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편 및 pET 32a (Novagen) 를 제한 효소 BamHI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 PCR 정제 키트 (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (NEB) 를 사용하여, 각각의 정제 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 리게이션 반응을 실시하였다. 리게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균을 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 배양한 후에, 미니프렙 및 서열 해석을 실시함으로써, 「pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드＿Kex2」 를 구축하였다. 또한, 조작은 (1-1-1) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(1-2) HTRA1 저해 펩티드의 발현 정제
(1-1-1) 에서 구축한 벡터 pET 32a (개변)＿HTRA1 저해 펩티드를 대장균 Origami B (DE3) (Novagen) 으로 형질 전환하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 배지를 사용하여 37 ℃ 에서 배양 후, IPTG (최종 농도 1 mM) 를 첨가하고, 16 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 원심 분리 (3,000 g, 20 분, 4 ℃) 에 의해 집균 후, 버그버스터 마스터 믹스 (BugBuster Master Mix) (Novagen) 를 사용하여 용해물 (lysate) 을 조제하고, TALON 금속 친화도 수지 (TALON Metal Affinity Resin) (Clontech) 을 사용하여 His 태그 (His tag) 융합 목적 단백질을 정제하였다. 다음으로, 트롬빈 절단 포획 키트 (Thrombin Cleavage Capture Kit) (Novagen) 를 사용하여 티오레독신 태그 (thioredoxin tag) 와 원하는 단백질을 절단하고, TALON 을 사용하여 정제하였다. 또한, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex75 10/300 GL) 또는 역상 크로마토그래피 (YMC-Pack ODS-AM) 에 제공함으로써, HTRA1 저해 펩티드를 조제하였다. 얻어진 펩티드의 N 말단에는 S 태그 및 링커로 이루어지는 부분 (서열 번호 31：도 43) 이, C 말단에는 Gly-Gly 대신에 C 말단 헥사머 (서열 번호 32：도 44) 가, 각각 콘쥬게이트 되어 있다.
마찬가지로, (1-1-2) 에서 구축한 벡터 pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드＿Kex2 를 대장균 Origami B (DE3) (Novagen) 으로 형질 전환하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 배지를 사용하여 37 ℃ 에서 배양 후, IPTG (최종 농도 1 mM) 를 첨가하고, 16 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 원심 분리 (3,000 g, 20 분, 4 ℃) 에 의해 집균 후, 버그버스터 마스터 믹스 (Novagen) 를 사용하여 용해물을 조제하고, TALON 금속 친화도 수지 (Clontech) 을 사용하여 His 태그 융합 목적 단백질을 정제하였다. 다음으로, Kex2 (사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)：Accession CAA96143) 를 사용하여 티오레독신 태그와 원하는 단백질을 절단하고, TALON 을 사용하여 정제하였다. 또한, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex75 10/300 GL) 또는 역상 크로마토그래피 (YMC-Pack ODS-AM) 에 제공함으로써, HTRA1 저해 펩티드 (N 말단 및 C 말단에 태그, 링커 등은 콘쥬게이트 되어 있지 않다) 를 조제하였다.
실시예 2. HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성 평가
인간/마우스/랫트/원숭이 HTRA1 의 서열 유사성을 도 1 에 나타낸다. 효소 활성 도메인인 HTRA1 프로테아제 도메인 (204Gly-364Leu) 을 구성하는 1 차 서열은 인간과 원숭이에 있어서 완전히 일치하고 있다. 인간과 마우스 또는 랫트의 HTRA1 프로테아제 도메인 서열은 1 잔기 상이하지만, 구조 상, 당해 잔기는 효소 활성 중심의 반대측에 위치하고 있기 때문에 효소 활성 중심에 영향을 주지 않는 것으로 추측되었다 (도 1). 따라서, HTRA1 프로테아제 도메인은 인간/마우스/랫트/원숭이의 종에 상관없이 동 (同) 서열이기 때문에, 종에 관해서는 명시하지 않는다.
(2-1) HTRA1 프로테아제 도메인 HTRA1 (cat) 의 조제
(2-1-1) pET 21b＿HTRA1 (cat) 의 구축
인간 HTRA1 (Q92743) 의 N 말단 도메인 및 PDZ 도메인을 제외한 프로테아제도메인 (158Gly-373Lys) 을 HTRA1 (cat) 로서, HTRA1 (cat) 발현 벡터를 구축하였다. 인간 HTRA1 삽입 플라스미드 (GeneCopoeia；GC-M0558) 를 주형으로 하여 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 45 초) × 30 사이클) 에 의해 원하는 DNA 단편을 증폭하였다.
Figure pct00003
증폭한 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편 및 pET 32a (Novagen) 를 제한 효소 NdeI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 PCR 정제 키트 (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (NEB) 를 사용하여, 각각의 정제 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 리게이션 반응을 실시하였다. 리게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균을 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 배양한 후에, 미니프렙 및 서열 해석을 실시함으로써, 「pET 21b＿HTRA1 (cat)」 를 구축하였다. 또한, 조작은 (1-1-1) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(2-1-2) HTRA1 (cat) 의 조제
구축한 pET 21b＿HTRA1 (cat) 는 대장균 BL21 (DE3) (Novagen) 으로 형질 전환하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 배지를 사용하여 37 ℃ 에서 배양 후, IPTG (최종 농도 1 mM) 를 첨가하고, 28 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 집균 후에 1 ㎎/㎖ 리소자임을 포함하는 인산 완충제 (50 mM 소듐 포스페이트 (Sodium phosphate), 300 mM NaCl) 로 현탁하고, 초음파 파쇄에 의해 용해물을 조제하였다. TALON (Clontech) 을 사용하여 원하는 His 태그 융합 단백을 회수하고, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL) 에 제공함으로써 HTRA1 (cat) 를 정제하였다.
(2-2) HTRA1 전체 길이 HTRA1 (full) 의 조제
(2-2-1) pcDNA3.1＿HTRA1 (full)＿His 의 구축
합성한 인간 HTRA1 (Q92743) DNA (GENEART) 를 주형으로 하고, 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 90 초) × 30 사이클) 에 의해 원하는 DNA 단편을 증폭하였다.
Figure pct00004
증폭한 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편과 pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) 을 제한 효소 EcoRI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 PCR 정제 키트 (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (NEB) 를 사용하여, 각각의 정제 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 리게이션 반응을 실시하였다. 리게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균을 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 배양한 후에, 미니프렙 및 서열 해석을 실시함으로써, 「pcDNA3.1＿HTRA1 (full)＿His」 를 구축하였다. 또한, 조작은 (1-1-1) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(2-2-2) pcDNA3.3＿HTRA1 (full)＿FLAG＿His 의 구축
(2-2-1) 에서 구축한 pcDNA3.1＿HTRA1 (full)＿His 를 주형으로 하여, 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 90 초) × 30 사이클) 에 의해 단편 A 를 증폭하였다.
Figure pct00005
다음으로, 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 10 초) × 30 사이클) 에 의해 단편 B 를 증폭하였다.
Figure pct00006
단편 A 및 단편 B 를 주형으로 하여, 프라이머 7 및 11, KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 90 초) × 30 사이클) 에 의해 원하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭한 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편과 pcDNA3.3 (ThermoFisher Scientific) 을 주형으로 한 벡터) 을 제한 효소 EcoRI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 PCR 정제 키트 (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (NEB) 를 사용하여, 각각의 정제 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 리게이션 반응을 실시하였다. 리게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균을 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 배양한 후에, 미니프렙 및 서열 해석을 실시함으로써, 「pcDNA3.3＿HTRA1 (full)＿FLAG＿His」 를 구축하였다. 또한, 조작은 (1-1-1) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(2-2-3) HTRA1 (full) 의 조제
(2-2-2) 에서 구축한 pcDNA3.3＿HTRA1 (full)＿FLAG＿His 는 폴리에틸렌이민 맥스 (Polyethylenimine Max) (Polysciences, Inc.) 를 사용하여 FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific) 에 트랜스펙션 (transfection) 하고, 6 일 후에 배양 상청을 회수하였다. HisTrap 엑셀 (HisTrap excel) (GE Healthcare) 에 의해 His 태그 융합 단백질을 회수하고, 추가로 항-FLAG M2 친화도 아가로오스 겔 (ANTI-FLAG M2 Affinity Agarose Gel) (Sigma-Aldrich) 을 사용함으로써 HTRA1 (full) 을 정제하였다.
(2-3) HTRA1 불활성 변이체 HTRA1 (S328A) 의 조제
(2-3-1) pcDNA3.3＿HTRA1 (S328A)＿FLAG＿His 의 구축
HTRA1 불활성 변이체 HTRA1 (S328A) 발현 벡터를 구축하기 위해서, 실시예 (2-2-2) 에서 구축한 벡터 「pcDNA3.3＿HTRA1 (full)＿FLAG＿His」 를 주형으로 하여, 하기 프라이머 및 QuikChange II 부위 지정 돌연변이유발 키트 (QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kits) (애질런트·테크놀로지 주식회사) 를 사용한 PCR 법 ((95 ℃ 30 초, 55 ℃ 1 분, 68 ℃ 7 분) ×18 사이클) 를 실시하였다.
Figure pct00007
PCR 반응 후, 키트 부속의 프로토콜에 따라서, DpnI 처리한 PCR 반응액을 사용하여 대장균 JM109 (TOYOBO) 를 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 배양한 후에, 미니프렙 및 서열 해석을 실시함으로써, 「pcDNA3.3＿HTRA1 (S328A)＿FLAG＿His」 를 구축하였다. 또한, 조작은 (1-1-1) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(2-3-2) HTRA1 (S328A) 의 조제
(2-2-3) 에 기재된 방법에 따라서, FreeStyle 293F 를 사용하여 HTRA1 (S328A) 를 발현하고, 친화도 (Affinity) 정제에 의해 HTRA1 (S328A) 를 조제하였다.
실시예 3. HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성 평가
(3-1) 펩티드 기질을 사용한 HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성 평가
기질 펩티드 H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K) (주식회사 펩티드 연구소：서열 번호 54, 도 8) 를 10 mM 이 되도록 DMSO 로 용해하고, 어세이 완충제 (Assay buffer) (50 mM 보레이트 (borate), 150 mM NaCl, pH 8.5) 로 희석하여 종농도 10 μM 로 사용하였다. 어세이 완충제로 희석한 HTRA1 (HTRA1 (cat) 또는 HTRA1 (full)) 과 HTRA1 저해 펩티드를 각각 25 ㎕ 씩 섞고, 37 ℃ 에서 20 분 반응시킨 후에 어세이 완충제로 희석한 기질을 50 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (여기 (excitation) 328 ㎚/방출 (emission) 393 ㎚) 을 측정하였다. HTRA1 은 종농도 100 nM, HTRA1 저해 펩티드는 종농도 1.875 ∼ 1,000 nM, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (등록상표) SS96F 흑색 플레이트 (스미토모 베이크라이트 주식회사) 를 사용하였다.
각 농도에 있어서의 HTRA1 저해 펩티드의 기질 펩티드 분해 속도를 산출하고, 저해제 농도 0 nM 의 분해 속도를 100 ％ 로 하여, 각 HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (cat) 및 HTRA1 (full) 저해 활성을 평가하였다 (도 2 및 3). GraphPad Prism (version 5.0；GraphPad Software Inc.) 을 사용하여 50 ％ 저해 농도 (IC50) 를 산출한 결과, 어느 HTRA1 저해 펩티드도 저농도로 HTRA1 (cat) 및 HTRA1 (full) 효소 활성을 저해하는 것이 밝혀졌다 (도 2A 내지 C 및 도 3). 대조적으로, 야생형 SPINK2 (wt) 는 HTRA1 저해 활성을 나타내지 않았다 (도 2 D).
HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성
Figure pct00008
(3-2) 단백 기질을 사용한 HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성 평가
인간 비트로넥틴을 단백 기질로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성을 평가하였다. 어세이 완충제 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0) 로 희석한 HTRA1 (cat) 와 각 HTRA1 저해 펩티드를 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응하였다. 다음으로, 어세이 완충제로 희석한 인간 비트로넥틴 (BD Biosciences；354238) 을 첨가하여 37 ℃ 에서 2 시간 반응시키고, SDS 샘플 완충제를 첨가하고, 99 ℃ 에서 5 분 처리함으로써 효소 반응을 정지하였다. 그 후, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 해석에 의해, 인간 비트로넥틴의 분해를 평가하였다. HTRA1 저해 펩티드의 종농도는 0 ∼ 25 μM, HTRA1 (cat) 의 종농도는 1 μM, 인간 비트로넥틴의 종농도는 1 μM 였다. 또, 웨스턴 블롯 해석에서는, 1 차 항체에 인간 비트로넥틴 항체 (R ＆ D Systems；MAB2349), 2 차 항체에 항-마우스 IgG (Anti-Mouse IgG), HRP-연결된 전체 Ab 양 (HRP-Linked Whole Ab Sheep) (GE Healthcare；NA931) 을 사용하였다.
(3-1) 과 마찬가지로, 인간 비트로넥틴을 기질로 한 경우에서도 HTRA1 저해 펩티드는 강력하게 HTRA1 (cat) 저해를 나타내었다 (도 4).
(3-3) HTRA1 저해 펩티드의 특이성 평가
기질 펩티드의 절단을 지표로, 다른 프로테아제에 대한 특이성을 평가하였다. (3-1) 에 기재된 방법과 마찬가지로, 어세이 완충제로 희석한 프로테아제와 샘플 (종농도 1 μM) 을 각각 25 ㎕ 씩 섞고, 37 ℃ 에서 20 분 반응시킨 후에 어세이 완충제로 희석한 기질을 50 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (여기 380 ㎚/방출 460 ㎚) 을 측정하였다. 또한, HTRA2 활성 평가에서는 실시예 2 와 동일한 어세이 완충제 (50 mM 보레이트, 150 mM NaCl, pH 8.5), HTRA2 이외의 프로테아제 활성 평가에는 어세이 완충제 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0) 를 사용하고, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (등록상표) SS96F 흑색 플레이트 (스미토모 베이크라이트 주식회사) 를 사용하였다. 특이성 평가에 사용한 프로테아제 및 기질의 조합은 이하와 같음.
소 트립신 (trypsin) 저해 활성 평가；종농도 5 nM 트립신 (Pierce；20233), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-VPR-AMC 형광발생 펩티드 기질 (Fluorogenic Peptide Substrate) (R ＆ D Systems；ES011)
소 α-키모트립신 (α-chymotrypsin) 저해 활성 평가；종농도 10 nM 키모트립신 (Worthington Biochemical Corporation；LS001434), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3120-v)
인간 트립타아제 (tryptase) 저해 활성 평가；종농도 1 nM 트립타아제 (Sigma-Aldrich；T7063), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3107-v)
인간 키마아제 (chymase) 저해 활성 평가；종농도 100 nM 키마아제 (Sigma-Aldrich；C8118), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3120-v)
인간 플라스민 (plasmin) 저해 활성 평가；종농도 50 nM 플라스민 (Sigma-Aldrich；P1867), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-Val-Leu-Lys-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3104-v)
인간 트롬빈 (thrombin) 저해 활성 평가；종농도 1 nM 트롬빈 (Sigma-Aldrich；T6884), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-VPR-AMC 형광발생 펩티드 기질 (R ＆ D Systems；ES011)
인간 마트립타아제 (matriptase) 저해 활성 평가；종농도 1 nM 마트립타아제 (R ＆ D Systems；E3946-SE), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-QAR-AMC 형광발생 펩티드 기질 (R ＆ D Systems；ES014)
인간 프로테인 C 저해 활성 평가；종농도 100 nM 프로테인 C (Sigma-Aldrich；P2200), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3112-v)
인간 tPA 저해 활성 평가；종농도 10 nM tPA (Sigma-Aldrich；T0831), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Pyr-Gly-Arg-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3145-v)
인간 uPA 저해 활성 평가；종농도 10 nM uPA (Sigma-Aldrich；T0831), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Pyr-Gly-Arg-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3145-v)
인간 혈장 칼리크레인 (plasma kallikrein) 저해 활성 평가；종농도 0.125 ㎍/㎖ 혈장 칼리크레인 (Sigma-Aldrich；T0831), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Z-Phe-Arg-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3095-v)
인간 HTRA2 저해 활성 평가；종농도 200 nM HTRA2 (R ＆ D Systems；1458-HT), 종농도 50 μM 기질 펩티드 H2-Opt (주식회사 펩티드 연구소)
(3-2) 와 마찬가지로, 펩티드 기질의 분해를 지표로 HTRA1 이외의 프로테아제에 대한 교차성을 평가하였다. 저해제의 종농도 1 μM 에 있어서는, 어느 프로테아제에 대해서도 각 HTRA1 저해 펩티드는 프로테아제 활성을 억제하지 않고, HTRA1 저해 펩티드는 HTRA1 특이적 저해 작용을 갖는 것이 나타났다 (도 5).
실시예 4. X 선 결정 구조를 사용한 HTRA1 저해 펩티드의 해석
(4-1) HTRA1 (cat)/HTRA1 저해 펩티드 복합체의 조제
(1-2) 및 (2-1) 에 기재한 방법에 따라서, HTRA1 (cat) 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 HTRA1 저해 펩티드를 각각 조제하였다. 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6 의 조건하에서 양자를 혼합 후, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300 GL) 에 의해 복합체를 단리 정제하였다.
(4-2) X 선 결정 구조 해석
(4-1) 에서 조제한 복합체 용액을 18 ㎎/㎖ 까지 농축 후, 리저버 용액 (LiCl 1.0 M, 7.5 ％ PEG6000, 0.1 M Tris/HCl (pH 8.5)) 과 1 대 1 로 혼합하고, 증기 확산법에 의해 결정화하였다. 얻어진 입방체상의 단결정을, 20 ％ 의 에틸렌글리콜을 포함하는 리저버 용액에 침지한 후 액체 질소로 동결하였다. 동결 결정을 크라이오 기류하에서 X 선 조사하고, 회절 이미지를 얻었다 (광자 공장 (photon factory) BL5A：고에너지 가속기 연구 기구). HKL2000 을 사용한 해석에 의해, 최대 분해능 2.6A 의 스케일링 데이터를 취득하였다. 세린 프로테아제 HTRA1 (PDB ID：3NZI) 을 주형으로 한 분자 치환법에 의해 위상을 결정하고, 구조 정밀화 후, 분해능 2.6 A 로 HTRA1 (cat)/그 펩티드의 복합체 결정을 결정하였다. 단위 격자 중에는 HTRA1 과 SPINK2 가 각 1 분자씩 포함되어 있었다. SPINK2 분자에 대해서는, 서열 정보라고 관측된 전자 밀도에 기초하여, HTRA1 (cat) 과의 상호 작용 부위를 포함하는 부분적인 분자 모델을 구축하였다. 당해 HTRA1 저해 펩티드는 HTRA1 효소 활성 중심을 포함하는 영역에 결합되어 있는 것이 확인되었다 (도 6 및 7).
실시예 5. 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 저해에 의한 망막 보호 효과
(5-1) 랫트 광 조사 망막 장애 모델의 제조
랫트 광 조사 망막 장애 모델은 광 조사에 의해 망막 시세포의 세포사를 유발시키는 모델이며, 망막 변성의 모델 동물로서 범용되고 있다 (Daniel T. Organisciak et al., (1996) Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 권 (11 호)：2243-2257 페이지). 72 시간 암(暗)순응시킨 랫트에 대하여, 0.5 ％ (W/V) 트로피카마이드-0.5 ％ 염산페닐레프린 점안액을 암순응하에서 점안하고, 그 후 5500 Lux 의 백색광을 3 시간 조사하였다. 조사 후, 다시 약 24 시간 암순응시키고, 그 후에는 통상 사육의 명암 조건으로 되돌려 2 일간 사육하였다. 안락사 후에 안구를 적출하고, 3.7 ％ (W/V) 포름알데히드-0.5 ∼ 1 ％ (W/V) 메탄올-0.2 ％ (W/V) 피크르산 고정액으로 24 시간 이상 침지시키고 고정하였다. 파라핀 포매 후, 박절 절편을 제조하였다. 절편은 헤마톡시린-에오진 염색을 실시하고, 망막 단층의 외과립층에 포함되는 핵의 수를 세는 것으로, 망막 장애를 평가하였다. 랫트 광 조사 망막 장애 모델은 광 조사에 의해, 외과립층에 포함되는 핵의 수가 현저하게 감소하는 것이 밝혀졌다.
(5-2) 망막 장애 시의 세포외 HTRA1 의 발현 확인
랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 의 관여를 조사하기 위해서, (5-1) 에서 제조한 모델 랫트로부터 유리체액을 채취하고, 웨스턴 블롯 해석에 의해 HTRA1 발현량을 평가하였다. 유리체액은 환원 조건하에서 SDS-PAGE 에 제공하고, 1 차 항체 인간 HTRA1/PRSS11 항체 (R ＆ D Systems；AF2916) 및 2 차 항체 양 IgG 홀스래디시 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 항체 (Horseradish Peroxidase-conjugated Antibody) (R ＆ D Systems；HAF016) 를 사용하여 랫트 HTRA1 을 검출하였다. 비조사군과 비교하여, 광 조사한 군에 있어서는 유리체액 중의 HTRA1 량의 증가가 확인되었기 때문에, 당해 모델에서는, 광 조사에 의한 망막 장애의 과정에 HTRA1 이 관여하는 것으로 생각된다 (도 9).
(5-3) 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 저해 펩티드의 망막 보호 효과
랫트에 대한 광 조사 직전에 마취하에서, 0.04 ㎎/㎖ 또는 0.2 ㎎/㎖ 농도의 HTRA1 저해 펩티드 H308 을 5 μL 유리체 내에 투여하였다. 또한, 생리 식염수 투여군의 예수 (例數) 는 4 이고, 그 밖의 군의 예수는 5 였다. 생리 식염수 투여군은 광 조사에 의해 망막 단층의 외과립층에 포함되는 핵이 감소한 것에 대하여, HTRA1 저해 펩티드 투여군에서는 외과립층에 포함되는 핵의 감소를 억제하는 효과가 확인되었다 (도 10). 이상으로부터, HTRA1 에 의해 야기된 조직 장애에 대하여, HTRA1 저해 펩티드는 약효를 나타내는 것이 밝혀졌다.
실시예 6. HTRA1 저해 펩티드 유도체의 평가
(6-1) pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드 H308＿S16A＿Kex2 의 구축
HTRA1 저해 펩티드 H308 을 주형으로 하여, 서열 번호 9 (도 21) 로 나타내는 아미노산 서열 중의 16 번 Ser 이 Ala 로 치환된 아미노산 서열을 갖는 유도체 S16A 를 조제하였다. 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 15 초) × 30 사이클) 에 의해 단편 C 를 증폭하였다.
Figure pct00009
다음으로, HTRA1 저해 펩티드 H308 을 주형으로 하여, 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 20 초) × 30 사이클) 에 의해 단편 D 를 증폭하였다.
Figure pct00010
단편 C 와 D, 하기 프라이머, KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 20 초) × 30 사이클) 에 의해 원하는 DNA 단편을 증폭하였다.
Figure pct00011
증폭한 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편 및 pET 32a (Novagen) 를 제한 효소 BamHI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 PCR 정제 키트 (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (NEB) 를 사용하여, 각각의 정제 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 리게이션 반응을 실시하였다. 리게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균을 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 배양한 후에, 미니프렙 및 서열 해석을 실시함으로써, 「pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드 H308＿S16A＿Kex2」 를 구축하였다. 또한, 조작은 (1-1-1) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(6-2) HTRA1 저해 펩티드＿N 말단 유도체 발현 벡터의 조제
서열 번호 9 (도 21) 로 나타내는 아미노산 서열 중, 1 번 Asp 가 Gly, Ser, Glu 또는 Ser-Leu-Ile 로 치환된 아미노산 서열을 갖는, HTRA1 저해 펩티드의 N 말단 서열 유도체 4 종 (각각 D1G, D1S, D1E 또는 D1SLI 라고 표기한다) 을 조제하기 위해서, (6-1) 과 동일한 수법으로 발현 벡터를 구축하였다. 단편 C 및 D, 하기 프라이머, KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 20 초) × 30 사이클) 에 의해 목적 단편 4 종을 각각 증폭하였다.
D1G 제조 프라이머
Figure pct00012
D1S 제조 프라이머
Figure pct00013
D1E 제조 프라이머
Figure pct00014
D1SLI 제조 프라이머
Figure pct00015
증폭한 4 종의 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편 및 pET 32a (Novagen) 를 제한 효소 BamHI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIA퀵 PCR 정제 키트 (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (NEB) 를 사용하여, 각각의 정제 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 리게이션 반응을 실시하였다. 리게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균을 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 배양한 후에, 미니프렙 및 서열 해석을 실시함으로써, 「pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1G＿S16A＿Kex2」 「pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1S＿S16A＿Kex2」 「pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1E＿S16A＿Kex2」 「pET 32a＿HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1SLI＿S16A＿Kex2」 를 구축하였다. 또한, 조작은 (1-1-1) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(6-3) HTRA1 저해 펩티드 유도체의 조제
(6-1) 및 (6-2) 에서 구축한 벡터 5 종을 각각 대장균 Origami B (DE3) (Novagen) 으로 형질 전환하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 배지를 사용하여 37 ℃ 에서 배양 후, IPTG (최종 농도 1 mM) 를 첨가하고, 16 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 원심 분리 (3,000 g, 20 분, 4 ℃) 에 의해 집균 후, 버그버스터 마스터 믹스 (Novagen) 를 사용하여 용해물을 조제하고, TALON 금속 친화도 수지 (Clontech) 을 사용하여 His 태그 융합 목적 단백질을 정제하였다. 다음으로, Kex2 (전술) 를 사용하여 티오레독신 태그와 원하는 단백질을 절단하고, TALON 을 사용하여 정제하였다. 또한, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex75 10/300 GL) 또는 역상 크로마토그래피 (YMC-Pack ODS-AM) 에 제공함으로써, HTRA1 저해 펩티드 유도체 5 종을 조제하였다. 그 유도체가 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 23 내지 27 (도 35 내지 39) 에 기재되어 있다.
(6-4) HTRA1 저해 펩티드 유도체의 평가
(3-1) 기재의 방법에 따라서, HTRA1 (cat) 저해 활성을 측정한 결과, 어느 유도체도 저해 활성은 H308 과 동등하였다 (도 11).
실시예 7. HTRA1 저해 펩티드와 HTRA1 (cat) 의 결합성 평가
실시예 (1-2) 에서 조제한 3 종의 HTRA1 저해 펩티드 (H308, H321AT, H322AT) 및 (2-1) 에서 조제한 HTRA1 (cat) 를 사용하여, 면역 침강법에 의해 결합성을 평가하였다. 2.5 ㎍ 의 각 HTRA1 저해 펩티드와 10 ㎍ 의 HTRA1 (cat) 를 실온에서 30 분 반응한 후, 10 ㎕ 의 TALON 금속 친화도 수지 (Clontech) 을 첨가하였다. 또한 30 분의 반응 후의 수지를 면역침강 (Immunoprecipitation) (IP) 획분으로서 회수하고, SDS-PAGE 에 제공함으로써 결합성을 평가하였다. 또한, 반응 완충제에는 PBS 를 사용하였다.
3 종의 HTRA1 저해 펩티드 또는 HTRA1 (cat) 각각과 TALON 을 반응시킨 경우, His 태그가 융합한 HTRA1 (cat) 만의 밴드가 인풋 (input) 레인에 검출되었다. 한편, 각 저해 펩티드와 HTRA1 (cat) 를 반응시킨 IP 레인만에서, 저해 펩티드와 효소의 밴드가 검출되었다. 따라서, 3 종의 HTRA1 저해 펩티드는 각각 HTRA1 (cat) 에 결합하는 것이 확인되었다.
실시예 8. HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성 평가
(8-1) 펩티드 기질을 사용한 HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성 평가
실시예 6 에서 구축한 3 종의 HTRA1 저해 펩티드 (H308＿D1G＿S16A, H321AT＿D1G＿S16A, H322AT＿D1G＿S16A) 에 대해, 기질 펩티드 H2-Opt 를 사용하여, HTRA1 (cat) 또는 HTRA1 (full) 저해 활성을 평가하였다 (n = 3). 기질 펩티드 H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K) (주식회사 펩티드 연구소：서열 번호 54, 도 8) 를 10 mM 이 되도록 DMSO 로 용해하고, 어세이 완충제 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.25 ％ CHAPS, pH 8.0) 로 희석하여 종농도 10 μM 로 사용하였다. 어세이 완충제로 희석한 HTRA1 (HTRA1 (cat) 또는 HTRA1 (full)；실시예 2) 과 HTRA1 저해 펩티드를 각각 25 ㎕ 씩 섞고, 37 ℃ 에서 20 분 반응시킨 후에 어세이 완충제로 희석한 기질을 50 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (여기 328 ㎚/방출 393 ㎚) 을 측정하였다. HTRA1 은 종농도 10 nM, HTRA1 저해 펩티드는 종농도 1.875 ∼ 1,000 nM, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (등록상표) SS96Fb 흑색 플레이트 (스미토모 베이크라이트 주식회사) 를 사용하였다.
각 농도에 있어서의 HTRA1 저해 펩티드의 기질 펩티드 분해 속도를 산출하고, 저해제 농도 0 nM 의 분해 속도를 100 ％ 로 하여, 각 HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 (cat) 및 HTRA1 (full) 저해 활성을 평가하였다.
GraphPad Prism (version 5.0；GraphPad Software Inc.) 을 사용하여 50 ％ 저해 농도 (IC50) 를 산출한 결과, 어느 HTRA1 저해 펩티드도 저농도로 HTRA1 (cat) 및 HTRA1 (full) 효소 활성을 저해하는 것이 밝혀졌다 (도 66).
HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성
Figure pct00016
(8-2) 단백 기질을 사용한 HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성 평가
인간 비트로넥틴을 단백 기질로 하여, HTRA1 저해 펩티드의 HTRA1 저해 활성을 평가하였다. 조작은 실시예 (3-2) 에 따랐다.
(8-1) 과 마찬가지로, 인간 비트로넥틴을 기질로 한 경우에도 HTRA1 저해 펩티드는 강력하게 HTRA1 (cat) 저해를 나타내었다 (도 67).
(8-3) HTRA1 저해 펩티드의 특이성 평가
기질 펩티드의 절단을 지표로, 다른 프로테아제에 대한 특이성을 평가하였다. 소 트립신, 소 α-키모트립신, 프로테인 C, 트립타아제, 키마아제, 트롬빈, 플라스민, tPA, 혈장 칼리크레인, 마트립타아제, uPA, HTRA2 에 대해서는 실시예 (3-3) 에 기재된 방법에 따랐다 (n = 3). 또, 다른 프로테아제에 대한 저해 활성의 순서, 프로테아제 및 기질의 조합은 이하와 같음.
반응 및 측정에는 프로테오세이브 (등록상표) SS96F 흑색 플레이트 (스미토모 베이크라이트 주식회사) 를 사용하고, 어세이 완충제로 희석한 프로테아제와 샘플 (종농도 1 μM) 을 각각 25 ㎕ 씩 섞고, 37 ℃ 에서 20 분 반응시킨 후에 어세이 완충제로 희석한 기질을 50 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널을 측정하였다.
인간 트립신 저해 활성 평가；종농도 1 nM 트립신 (Sigma-Aldrich；T6424), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-VPR-AMC 형광발생 펩티드 기질 (R ＆ D Systems；ES011), 형광 시그널 여기 380 ㎚/방출 460 ㎚.
인간 키모트립신 저해 활성 평가；종농도 10 nM 키모트립신 (Sigma-Aldrich；C8946), 종농도 10 μM 기질 펩티드 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3120-v), 형광 시그널 여기 380 ㎚/방출 460 ㎚.
인간 인자XIIa (FactorXIIa) 저해 활성 평가；종농도 100 nM 인자 알파-XIIa (Factor Alpha-XIIa) (Enzyme Research Laboratories), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Pyr-Gly-Arg-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3145-v), 형광 시그널 여기 380 ㎚/방출 460 ㎚.
인간 MMP-2 저해 활성 평가；종농도 1 nM 트립타아제 (Calbiochem；PF023), 종농도 100 μM 기질 펩티드 MOCAx-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR (주식회사 펩티드 연구소；3226-v), 형광 시그널 여기 328 ㎚/방출 393 ㎚.
인간 TPP1 저해 활성 평가；종농도 0.5 ㎍/㎖ TPP1 (Calbiochem；2237-SE), 종농도 200 ㎛ 기질 펩티드 AAF-MCA (주식회사 펩티드 연구소；3201-v), 형광 시그널 여기 380 ㎚/방출 460 ㎚.
펩티드 기질의 분해를 지표로 HTRA1 이외의 프로테아제에 대한 교차성을 평가하였다. 어느 프로테아제에 대해서도, 각 HTRA1 저해 펩티드의 종농도 1 μM 에서는 프로테아제 활성을 억제하지 않고, HTRA1 저해 펩티드는 HTRA1 특이적 저해 작용을 갖는 것이 나타났다 (도 68).
실시예 9. HTRA1 저해 펩티드와 HTRA1 (cat) 의 결합성 평가
실시예 6 에서 조제한 3 종의 HTRA1 저해 펩티드 및 (2-1) 에서 조제한 HTRA1 (cat) 를 사용하여, 실시예 7 의 조작에 따라서, 면역 침강법에 의해 결합성을 평가하였다.
3 종의 HTRA1 저해 펩티드 또는 HTRA1 (cat) 각각과 TALON 을 반응시킨 경우, His 태그가 융합한 HTRA1 (cat) 만의 밴드가 인풋 레인에 검출되었다. 한편, 각 저해 펩티드와 HTRA1 (cat) 를 반응시킨 IP 레인만에서, 저해 펩티드와 효소의 밴드가 검출되었다. 따라서, 3 종의 HTRA1 저해 펩티드는 각각 HTRA1 (cat) 에 결합하는 것이 확인되었다 (도 69).
실시예 10. 랫트 광 조사 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 저해에 의한 망막 보호 효과 (그 2)
실시예 (5-1) 에서 구축한 랫트 광 조사 망막 장애 모델을 사용하여, 실시예 6 에서 제조한 3 종의 HTRA1 저해 펩티드의 망막 보호 효과를 평가하였다. 조작은 실시예 5 에 따랐다. 어느 군도 예수는 6 이었다.
망막 병리 평가의 결과를 도 70 에 나타낸다. 3 종의 HTRA1 저해 펩티드는, 광 조사에 의해 야기되는 외과립층에 포함되는 핵의 수의 감소에 대하여 현저한 억제 작용을 나타내었다.
실시예 11. 하이드로퀴논 함유 고지방식 부하에 의한 토끼 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 저해에 의한 망막 색소 상피 세포의 보호 효과
(11-1) 하이드로퀴논 함유 고지방식 부하에 의한 토끼 망막 장애 모델의 제조
고지방식 (High Fat Diet；HFD) 과 하이드로퀴논 (Hydroquinone；HQ) 을 사용한 망막 장애 모델은, 산화 촉진 물질에 의해 산화 스트레스를 야기하여 망막 장애를 일으키는 모델이며, 마우스에 있어서만 모델이 보고되어 있다 (Diego G. Espinosa-Heidmann et al., (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 권 (2 호)：729-737 페이지). 그래서, 1.5 ％ (W/V) 코코넛 오일-0.25 ％ (W/V) 콜레스테롤-1.5 ％ (W/V) 피너츠 오일-2.4 ％ (W/V) 하이드로퀴논 함유 RC4 (오리엔탈 효모) 식 (食) (HFD-HQ) 을 3 세령 JW 토끼에게 4 개월간 섭식시킴으로써 토끼 망막 장애 모델을 구축하였다. 안락살 후에 안구를 적출하고, 각막륜부로부터 5 ㎜ 정도 외측에서 절개하여 전안부를 제거하고, 또한 유리체를 분리한 후, 망막-맥락막-강막을 4 ％ (W/V) 파라포름알데히드 고정액으로 24 시간 이상 침지시키고 고정하였다. 고정 후, 맥락막을 분리하고, 1 차 항체 ZO-1 모노클로날 항체 (Monoclonal Antibody) (ZO1-1A12) (Themo Fisher SCIENTIFIC；33-9100) 및 2 차 항체 닭 항-마우스 IgG (H＋L) 교차-흡착된 이차 항체 (Cross-Adsorbed Secondary Antibody), Alexa Fluor 594 (Themo Fisher SCIENTIFIC；A-21201) 를 사용하여 면역 염색을 실시하였다. 형광 현미경 (BZ-9000；KEYENCE) 을 사용하여 염색한 맥락막을 관찰하고, 염색된 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 면적을 구하고, RPE 세포 장애를 평가하였다.
도 71 에, 12 주령 토끼, 3 세령 토끼 및, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼의 RPE 세포의 염색 이미지 (도 71(A)) 와 RPE 세포의 평균 면적 (도 71(B)) 의 그래프를 나타낸다. 3 세령의 토끼에서는 12 주령의 토끼보다 RPE 세포가 비대해 있고, HFD-HQ 부하로 더욱 비대하는 것이 확인되고, RPE 세포에 장애가 나타나 있는 것을 확인하였다. 가령 황반 변성증 환자의 안구에 있어서도 동일한 변화가 관찰되어 있다 (Ding JD et al., (2011) Proc Natl Acad Sci USA. 108 권 (28 호)：279-87 페이지).
(11-2) 망막 장애 시의 AMD 관련 인자 C3 발현량의 증가
AMD 관련 인자의 발현을 평가하기 위해서, 당해 토끼 망막 장애 모델로부터 망막 및 RPE/맥락막으로부터 각각 조직을 채취하고, RNeasy 미니 키트 (mini kit) (QIAGEN) 를 사용하여 mRNA 를 추출 후, TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 (Gene Expression Master Mix) (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 역전사 반응을 실시하였다. TaqMan 유전자 발현 어세이 (Gene Expression Assay) (Oc03397832＿g1 및 Oc03824857＿g1；Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여, 7900HT 고속 실시간 PCR 시스템 (Fast Real-Time PCR System) (Applied Biosystems) 에 의해 보체 제 3 인자 C3 및 내부 표준 β-액틴의 mRNA 량을 정량 해석하였다. 또한, 3 세령 토끼의 예수는 4, HFD-HQ 부하 3 세령 토끼의 예수는 10 으로 하여 해석을 실시하였다.
망막, 및, RPE 세포와 맥락막에 있어서의 C3 발현량을 도 71(C) 및 (D) 에 나타낸다. 어느 조직에 있어서도, HFD-HQ 를 부여한 토끼군에서 C3 의 발현량이 항진하고 있는 것을 확인하였다.
(11-3) 망막 장애 시의 HTRA1 단백량의 증가
토끼 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 의 관여를 조사하기 위해서, (6-1) 에서 제조한 모델 토끼로부터 유리체액을 채취하고, 트립신/Lys-C 믹스 (Promega) 를 사용하여 효소 소화 후, LC (EASY-nLC 1000；Thermo Fisher Scientific)-MS (TripleTOF 6600；SCIEX) 를 사용하여 HTRA1 의 펩티드 단편을 정량하였다. HFD-HQ 를 부여한 토끼의 유리체액 중에서는 HTRA1 단백량이 증가되어 있는 것이 밝혀졌다 (도 71(E)). 이상으로부터, RPE 세포 비대화 및 AMD 관련 인자 C3, HTRA1 의 발현 항진이 확인되었기 때문에, 당해 토끼 망막 장애 모델이 가령성 망막 질환 연구에 유용한 것이 나타났다.
(11-4) 토끼 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 저해제의 망막 보호 효과
당해 토끼 모델을 사용하여, 실시예 1 에서 제조한 HTRA1 저해 펩티드 H308 의 망막 보호 효과를 평가하였다. HFD-HQ 의 급이 (給餌) 개시부터 2 개월 후에, 40 ㎎/㎖ 의 H308 용액 50 ㎕ 를 마취하에서 편안에 유리체 내에 투여하였다.타안에는 생리 식염수를 유리체 내 투여하였다. 어느 군도 예수는 5 였다.
급이 개시 4 개월 후에, 모델 동물의 RPE 세포 비대를 평가한 결과를 도 72 에 나타낸다. RPE 세포의 평균 면적 (도 72(A)) 또는 세포 면적이 1500 ㎛2 이상인 비대한 RPE 세포수 (도 72(B)), 어느 지표에 있어서도, HTRA1 저해제는 RPE 세포의 비대에 대하여 억제 효과를 나타내었다. 도 71(E) 에 나타내는 바와 같이, 당해 모델의 유리체액 중에서는 HTRA1 의 증가가 확인되고, HFD-HQ 에 의한 RPE 세포의 장애 과정에 대하여 HTRA1 의 관여가 시사되었다. 이와 같이, HTRA1 저해 펩티드는, 항가령 황반 변성증제로서 유용하고, 본 시험에서는 특히 위축형의 가령 황반 변성증의 예방에 유용한 것이 나타났다.
또, HTRA1 저해 펩티드를 투여한 정상 토끼 망막에 있어서 HTRA1 저해 펩티드의 존재가 확인되고, HTRA1 저해 펩티드의 높은 조직 침투성이 나타났다.
실시예 12. 인간 망막 색소 상피 세포 ARPE-19 를 사용한 VEGF mRNA 유도 시험에 있어서의 HTRA1 저해 펩티드의 억제 효과
ARPE-19 세포를 10 ％ 소태아 혈청 (Fetal bovine serum) (FBS), 페니실린-스트렙토마이신 (Thermo Fisher Scientific) 함유의 DMEM/F-12 배지 (와코 쥰야쿠 공업 주식회사) 를 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서, 12 ㎜ 트랜스웰 (Transwell) (0.4 ㎛ 포어 폴리에스테르 멤브레인 인서트 (Pore Polyester Membrane Insert) 포함, 멸균 (Sterile)) (Corning) 중에서 콘플루언트가 될 때까지 배양하였다. 그 후, FBS 비함유의 DMEM/F-12 에서 5 일간 배양하고, 챔버 상하층에 종농도가 500 μM 인 H2O2 를, 챔버 상층에 종농도 25 ％ 의 정상 인간 혈청 보체 (Quidel) 를 각각 첨가하였다. 또한 챔버 상하층에 HTRA1 (실시예 2-2), HTRA1 프로테아제 불활성 변이체 HTRA1 (S328A) (실시예 2-3), 또는, HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1G＿S16A (실시예 6) 를 각각 종농도 1 μM 가 되도록 첨가하였다. 4 시간 후에 배양 상청을 제거하고, PBS 로 세정 후, qPCR 용 SuperPrepTM 세포 용해 & RT 키트 (토요보 주식회사) 에 의해 mRNA 를 추출하고, 역전사 반응을 실시하였다. TaqMan 유전자 발현 어세이 (Hs000900055＿m1 및 Hs02786624＿g1；Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여, 7900HT 고속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems) 에 의해 VEGF 의 mRNA 량을 정량 해석하였다. 또한, mRNA 의 보정에는 GAPDH 를 사용하였다.
결과를 도 74 에 나타낸다. H2O2, 정상 인간 혈청 보체 및 HTRA1 불활성 변이체 HTRA1 (S328A) 첨가 조건과 비교하여, H2O2, 정상 인간 혈청 보체 및 HTRA1 을 첨가함으로써, VEGF 의 mRNA 량이 현저하게 증가하였다. 또한, HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1G＿S16A 를 공첨가함으로써, VEGF 의 발현 억제가 확인되었다. 망막 색소 상피 세포로부터의 VEGF 유도는 삼출형 가령성 황반 변성 병태 형성에 중요하게 여겨지고 있다 (Klettner A. et al., (2009) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 권：1487-1492 페이지). 또, 병태 형성 뿐만 아니라, 병태의 유지에도 이들의 병적인 VEGF 유도가 관여하고 있는 것으로 생각되고 있고, HTRA1 저해 펩티드 H308＿D1G＿S16A 등 본 발명의 펩티드의 투여는 삼출형 가령성 황반 변성의 예방 및 치료에 대하여 유효하다.
실시예 13. HTRA1 저해 펩티드 H308＿DIG＿S16A 에 의한 인간 제대 정맥내 피세포 (HUVEC) 유주 억제 효과
(13-1) HUVEC 유주 시험
HUVEC (Kurabo Industries) 는 0.1 ％ BSA 함유 EBMTM-2 기본 배지 (Lonza Walkersville) 에 혈청과 VEGF 를 제외한 EGMTM-2 SingleQuotsTM 첨가 인자 세트를 첨가한 배지 (0.1 ％ BSA 함유 무혈청 EGM) 에서 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 18 시간 배양한 후, 0.1 ％ BSA 함유 무혈청 EGM 으로 4 × 105 개/㎖ 가 되도록 조제하였다. 멤브레인을 젤라틴 코트한 Corning FluoroBlok HTS 96 웰 멀티웰 퍼미어블 서포트 시스템 (Well Multiwell Permeable Support System) (3.0 ㎛ 고밀도 PET 멤브레인 (High Density PET Membrane) 포함) (Corning) 의 챔버 상층에, 4 × 105 개/㎖ 의 HUVEC 현탁액을 50 ㎕/웰로 첨가한 후, 챔버 하층에 210 ㎕/웰로 하기 샘플 (배지 1 또는 2, 3) 을 첨가하였다 (n = 3). 또, HUVEC 를 첨가하고 있지 않은 챔버 상층에는, 0.1 ％ BSA 함유 무혈청 EGM 을 50 ㎕ 첨가하고, 그 챔버 하층에는, 0.1 ％ BSA 함유 무혈청 EGM 을 210 ㎕ 첨가하였다 (n = 3).
배지 1；0.1 ％ BSA 함유 무혈청 EGM
배지 2；모든 EGMTM-2 SingleQuotsTM 첨가 인자를 첨가한 EBMTM-2 배지 (EGM 증식 배지)
배지 3；300 nM 의 H308＿DIG＿S16A 를 포함하는 EGM 증식 배지
세포와 샘플을 첨가한 FluoroBlok HTS 96 웰
멀티 웰 서포트 시스템 (Multi well Support System) 을 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 2 시간 인큐베이션하고, 하층으로 유주한 HUVEC 를 PBS 로 세정 후, 4 ㎍/㎖ 의 칼세인-AM (Calcein-AM) (Thermo Fisher Scientific) 함유 0.1 ％ BSA 함유 무혈청 EGM 으로 15 분간 염색하였다. 그 후, 배지를 PBS 로 치환하고, 각 웰의 형광 강도 (여기 파장/형광 파장：485 ㎚/535 ㎚) 를 플레이트 리더 (ARVO-MX, PerkinElmer) 로 측정하고, 다음 식으로 각 웰의 유주 세포를 산출하였다.
유주 세포 = HUVEC 존재 웰의 형광 강도의 평균 (n = 3) ― 블랭크 웰의 형광 강도의 평균 (n = 3).
결과를 도 75 에 나타낸다. HTRA1 저해 펩티드 H308＿DIG＿S16A 는 혈청 함유 배지에서 유도된 HUVEC 의 유주에 대하여 억제 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명의 펩티드는, 삼출형 가령 황반 변성증의 특징인 혈관 신생에 대하여 억제 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다.
실시예 14. 토끼 망막 장애 모델에 있어서의 HTRA1 저해 펩티드의 망막 보호 효과 (그 2)
실시예 (11-1) ∼ (11-3) 에서 제조, 평가한 토끼 망막 장애 모델을 사용하여, 실시예 1 에서 제조한 HTRA1 저해 펩티드 H308 또는 실시예 6 에서 제조한 3 종의 HTRA1 저해 펩티드 중 1 종의 망막 장애에 대한 치료 효과를 평가한다. 40 ㎎/㎖ 의 저해 펩티드 용액 50 ㎕ 를 마취하에서 모델 동물의 편안에 유리체 내에 투여하고 2 개월간 사육한다. 타안에는 생리 식염수를 유리체 내 투여한다. 어느 군도 예수는 5 로 한다.
생리 식염수 투여군에서는 RPE 세포 면적의 증대 또는 세포수의 증가가 보이는 데 반해, HTRA1 저해 펩티드 투여군에서는 RPE 세포 면적의 증대 또는 세포수의 증가가 억제될 것이다. 이와 같이, HTRA1 저해 펩티드는, 항가령 황반 변성증제로서 유용한 것, 본 실시예에서는 특히 위축형의 가령 황반 변성증의 치료에 유용한 것을 확인할 수 있다.
산업상 이용가능성
본 발명이 제공하는 펩티드, 및, 그것을 포함하는 의약 조성물은, 가령 황반 변성증 등의 치료 또는 예방 등에 유용하다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 1：인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (도 13)
서열 번호 2：인간 SPINK2 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 14)
서열 번호 3：펩티드 H218 의 아미노산 서열 (도 15)
서열 번호 4：펩티드 H218 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 16)
서열 번호 5：펩티드 H223 의 아미노산 서열 (도 17)
서열 번호 6：펩티드 H223 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 18)
서열 번호 7：펩티드 H228 의 아미노산 서열 (도 19)
서열 번호 8：펩티드 H228 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 20)
서열 번호 9：펩티드 H308 의 아미노산 서열 (도 21)
서열 번호 10：펩티드 H308 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 22)
서열 번호 11：펩티드 H321 의 아미노산 서열 (도 23)
서열 번호 12：펩티드 H321 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 24)
서열 번호 13：펩티드 H322 의 아미노산 서열 (도 25)
서열 번호 14：펩티드 H322 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 26)
서열 번호 15：펩티드 유도체 H308AT 의 아미노산 서열 (도 27)
서열 번호 16：펩티드 유도체 H308AT 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 28)
서열 번호 17：펩티드 유도체 H321AT 의 아미노산 서열 (도 29)
서열 번호 18：펩티드 유도체 H321AT 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 30)
서열 번호 19：펩티드 유도체 H322AT 의 아미노산 서열 (도 31)
서열 번호 20：펩티드 유도체 H322AT 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 32)
서열 번호 21：펩티드 M7 의 아미노산 서열 (도 33)
서열 번호 22：펩티드 M7 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 34)
서열 번호 23：펩티드 유도체 H308＿S16A 의 아미노산 서열 (도 35)
서열 번호 24：펩티드 유도체 H308＿D1G＿S16A 의 아미노산 서열 (도 36)
서열 번호 25：펩티드 유도체 H308＿D1S＿S16A 의 아미노산 서열 (도 37)
서열 번호 26：펩티드 유도체 H308＿D1E＿S16A 의 아미노산 서열 (도 38)
서열 번호 27：펩티드 유도체 H308＿D1SLI＿S16A 의 아미노산 서열 (도 39)
서열 번호 28：펩티드 유도체 H321AT＿D1G＿S16A 의 아미노산 서열 (도 40)
서열 번호 29：펩티드 유도체 H322AT＿D1G＿S16A 의 아미노산 서열 (도 41)
서열 번호 30：HTRA1 저해 펩티드의 일반식 (도 42)
서열 번호 31：S 태그 및 링커로 이루어지는 아미노산 서열 (도 43)
서열 번호 32：C 말단 헥사머의 아미노산 서열 (도 44)
서열 번호 33：프라이머 1 의 뉴클레오티드 서열 (도 45)
서열 번호 34：프라이머 2 의 뉴클레오티드 서열 (도 46)
서열 번호 35：프라이머 3 의 뉴클레오티드 서열 (도 47)
서열 번호 36：프라이머 4 의 뉴클레오티드 서열 (도 48)
서열 번호 37：프라이머 5 의 뉴클레오티드 서열 (도 49)
서열 번호 38：프라이머 6 의 뉴클레오티드 서열 (도 50)
서열 번호 39：프라이머 7 의 뉴클레오티드 서열 (도 51)
서열 번호 40：프라이머 8 의 뉴클레오티드 서열 (도 52)
서열 번호 41：프라이머 9 의 뉴클레오티드 서열 (도 53)
서열 번호 42：프라이머 10 의 뉴클레오티드 서열 (도 54)
서열 번호 43：프라이머 11 의 뉴클레오티드 서열 (도 55)
서열 번호 44：프라이머 12 의 뉴클레오티드 서열 (도 56)
서열 번호 45：프라이머 13 의 뉴클레오티드 서열 (도 57)
서열 번호 46：프라이머 14 의 뉴클레오티드 서열 (도 58)
서열 번호 47：프라이머 15 의 뉴클레오티드 서열 (도 59)
서열 번호 48：프라이머 16 의 뉴클레오티드 서열 (도 60)
서열 번호 49：프라이머 17 의 뉴클레오티드 서열 (도 61)
서열 번호 50：프라이머 18 의 뉴클레오티드 서열 (도 62)
서열 번호 51：프라이머 19 의 뉴클레오티드 서열 (도 63)
서열 번호 52：프라이머 20 의 뉴클레오티드 서열 (도 64)
서열 번호 53：인간 HTRAI(full) 의 아미노산 서열 (도 65)
서열 번호 54：H2-Opt 의 아미노산 서열 (도 8)
서열 번호 55：프라이머 21 의 뉴클레오티드 서열 (도 76)
서열 번호 56：프라이머 22 의 뉴클레오티드 서열 (도 77)
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Peptides for Treating Age-related Macular Degeneration <130> FP1726 <150> JP2016-249020 <151> 2016-12-22 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser 1 5 10 15 Gln Tyr Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys 50 55 60 <210> 2 <211> 192 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcca gtatcgtctg 60 cctggttgtc cgcgtcattt taatccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat 120 gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat 180 ggtccgtgct aa 192 <210> 3 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 3 Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Leu 1 5 10 15 Lys Ser Glu Gly 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60 atggcatgtt acgctctgta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat 120 gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat 180 ggtccgtgcg gcggctaa 198 <210> 21 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 21 Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser 1 5 10 15 Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Phe Tyr Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly 50 55 60 Gly 65 <210> 22 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 22 gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcga ccatgctggt 60 atggcatgtg ttgcttttta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat 120 gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat 180 ggtccgtgcg gcggctaa 198 <210> 23 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 23 Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly 50 55 60 Gly 65 <210> 24 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 24 Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly 50 55 60 Gly 65 <210> 25 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 25 Ser Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly 50 55 60 Gly 65 <210> 26 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 26 Glu Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly 50 55 60 Gly 65 <210> 27 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 27 Ser Leu Ile Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn 1 5 10 15 Cys Ala Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val 20 25 30 Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met 35 40 45 Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro 50 55 60 Cys Gly Gly 65 <210> 28 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 28 Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala 1 5 10 15 Asp Phe Asp Gly Met Ala Cys Tyr Ala Phe Tyr Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly 50 55 60 Gly 65 <210> 29 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <400> 29 Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala 1 5 10 15 Gln His Glu Gly Met Ala Cys Tyr Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly 50 55 60 Gly 65 <210> 30 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(19) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> any amino acid <400> 30 Xaa Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Cys Xaa Ala Xaa Xaa Glu Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Xaa Asn Glu Cys Xaa Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys 50 55 60 <210> 31 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 31 Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His 1 5 10 15 Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala 20 25 30 Asp Ile Gly Ser Ala Asn Ser 35 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 32 Gly Ala Ser Ala Ala Ala 1 5 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 aaaagaattc tgatccgcag tttggtctgt ttag 34 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 aaaactcgag ttatgcggcc gcagacgcgc cgcacggacc 40 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aaaaggatcc ctggacaaac gtgatccgca gtttggtctg tttag 45 <210> 36 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 aaaactcgag ttagccgccg cacggaccat tgcgaataat ttta 44 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 aaacatatgg ggcaggaaga tcccaacagt ttgc 34 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 aaactcgagt ttggcctgtc ggtcatggga ctc 33 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 aaaagaattc gccaccatgc agattcctag agccg 35 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 aaaactcgag tcagtggtga tggtggtggt ggccgg 36 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cttgtcgtca tcgtccttgt agtcgccggg gtcgatttcc tc 42 <210> 42 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gcgactacaa ggacgatgac gacaagcacc accaccatca tcac 44 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 aaaaactcga gctagtgatg atggtggtgg tgcttgtcgt c 41 <210> 44 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ccgcagtttg gtctgtttag caaatatcgt accccgaatt gt 42 <210> 45 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gccataccag catggtccgc acaattcggg gtacgatatt tgc 43 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artifiicial Sequence <400> 46 gcggaccatg ctggtatggc atgtgttgct ctgtatgaac 40 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 aaaactcgag ttagccgccg cacggaccat tgcgaataa 39 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 aaaaggatcc ctggacaaac gtgatccgca gtttggtctg tttag 45 <210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 aaaaggatcc ctggacaaac gtggcccgca gtttggtctg tttag 45 <210> 50 <211> 45 <212> DNA <213> artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 aaaaggatcc ctggacaaac gtagcccgca gtttggtctg tttag 45 <210> 51 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 aaaaggatcc ctggacaaac gtgaaccgca gtttggtctg tttag 45 <210> 52 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 aaaaggatcc ctggacaaac gtagcctgat tccgcagttt ggtctgttta g 51 <210> 53 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Cys Pro 1 5 10 15 Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro Gln Pro Glu His Cys Glu 20 25 30 Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Glu Val Cys Gly Ala 35 40 45 Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu Gly Pro Cys Gly Glu Gly 50 55 60 Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro Ala Ser Ala Thr Val Arg 65 70 75 80 Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys Ala Ser Ser Glu Pro Val 85 90 95 Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn Leu Cys Gln Leu Arg Ala 100 105 110 Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg Pro Pro Val Ile Val Leu 115 120 125 Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg 130 135 140 His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala 145 150 155 160 Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg Glu 165 170 175 Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly Leu 180 185 190 Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn Lys His Arg Val Lys Val 195 200 205 Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp 210 215 220 Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe 245 250 255 Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr 260 265 270 Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg 275 280 285 Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr Gly 290 295 300 Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile 305 310 315 320 Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp 325 330 335 Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu 355 360 365 Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro 370 375 380 Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp Thr Pro 385 390 395 400 Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp Val Ile Ile Ser Ile Asn 405 410 415 Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val Ser Asp Val Ile Lys Arg 420 425 430 Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg Gly Asn Glu Asp Ile Met 435 440 445 Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro 450 455 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> N-(4-methylcoumaryl-7-amide)-isoleucine <220> <221> BINDING <222> (10)..(10) <223> N epsilon-(2,4-dinitrophenyl)-lysine <400> 54 Xaa Arg Arg Val Ser Tyr Ser Phe Lys Xaa 1 5 10 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ccatcatcaa ctacggcaac gcgggcggac ccctcgtgaa cc 42 <210> 56 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ggttcacgag gggtccgccc gcgttgccgt agttgatgat gg 42

Claims (29)

  1. 서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 인간 HTRA1 이 갖는 프로테아제 활성을 저해하는, SPINK2 변이체 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    1 번째의 Xaa(X1) 은 Asp, Glu, Ser, Gly, 또는 Ile, 2 번째의 Xaa(X2) 는 Ala, Gly, Leu, Ser 또는 Thr, 3 번째의 Xaa(X3) 은 Asp, His, Lys, Met 또는 Gln, 4 번째의 Xaa(X4) 는 Asp, Phe, His, Ser 또는 Tyr, 5 번째의 Xaa(X5) 는 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Asn, 6 번째의 Xaa(X6) 은 Met 또는 Trp, 7 번째의 Xaa(X7) 은 Gln, Trp, Tyr 또는 Val, 8 번째의 Xaa(X8) 은 Phe, Leu 또는 Tyr, 9 번째의 Xaa(X9) 는 Phe 또는 Tyr, 10 번째의 Xaa(X10) 은 Ala, Glu, Met 또는 Val, 그리고, 11 번째의 Xaa(X11) 은 Ala, Thr 또는 Val 인, SPINK2 변이체 펩티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 내지 29 (도 15, 도 17, 도 19, 도 21, 도 23, 도 25, 도 27, 도 29, 도 31, 도 33 및, 도 35 내지 41) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는, SPINK2 변이체 펩티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열의 아미노 말단측에 1 내지 3 개의 아미노산이 펩티드 결합하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, SPINK2 변이체 펩티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 30 (도 42) 으로 나타내는 아미노산 서열의 카르복실 말단측에 1 또는 2 개의 아미노산이 펩티드 결합하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, SPINK2 변이체 펩티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 개의 디술파이드 결합을 갖고, 루프 구조, α 헬릭스 및 β 시트를 포함함으로써 특징지어지는 입체 구조를 갖는, SPINK2 변이체 펩티드.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 7 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  9. 제 7 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 혹은 제 8 항에 기재된 벡터를 포함하거나 또는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 산생하는 세포.
  10. 하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, HTRA1 이 갖는 프로테아제 활성을 저해하는 SPINK2 변이체 펩티드의 제조 방법：
    (i) 제 9 항에 기재된 세포를 배양하는 공정；
    (ii) 그 배양물로부터 SPINK2 변이체 펩티드를 회수하는 공정.
  11. 제 10 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 SPINK2 변이체 펩티드.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드에 다른 부분이 연결되어 이루어지는 콘쥬게이트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    폴리펩티드인, 콘쥬게이트.
  14. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드에 결합하는 항체 또는 그 기능 단편.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드, 제 7 항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 제 8 항에 기재된 벡터, 제 9 항에 기재된 세포, 제 12 항 혹은 제 13 항에 기재된 콘쥬게이트, 및/또는, 제 14 항에 기재된 항체 또는 그 기능 단편을 포함하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 및/또는 제 12 항 또는 제 13 항에 기재된 콘쥬게이트를 포함하는 의약 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    HTRA1 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한, 의약 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    HTRA1 관련 질환이 삼출형 가령 황반 변성증, 위축형 가령 황반 변성증, 지도상 위축, 당뇨병 망막증, 미숙아 망막증, 폴립상 맥락막 혈관증, 관절 류머티즘, 및 변형성 관절증으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상인, 의약 조성물.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 개 또는 2 개 이상의 다른 의약을 포함하는, 의약 조성물.
  20. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 개 또는 2 개 이상의 다른 의약과 조합하여 사용되는, 의약 조성물.
  21. 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    망막 보호제인, 의약 조성물.
  22. 하기의 공정 1 내지 공정 3 을 포함하는, 가령 황반 변성증의 치료약 또는 예방약을 동정 (同定) 하는 방법：
    [공정 1] HTRA1 프로테아제 및 기질을, 피검 물질의 존재하 또는 비존재하에서 보온한다；
    [공정 2] 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성을 검출한다；
    [공정 3] 피검 물질의 존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성이, 피검 물질의 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성과 비교하여 작은 경우, 그 피검 물질을 양성으로 판정한다.
  23. 하기의 공정 1 내지 공정 3 을 포함하는, 망막 보호제를 동정하는 방법：
    [공정 1] HTRA1 프로테아제 및 기질을, 피검 물질의 존재하 또는 비존재하에서 보온한다；
    [공정 2] 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성을 검출한다；
    [공정 3] 피검 물질의 존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성이, 피검 물질의 비존재하에서의 HTRA1 프로테아제 활성과 비교하여 작은 경우, 그 피검 물질을 양성으로 판정한다.
  24. 하이드로퀴논을 포함하는 고지방식을 3 내지 6 개월 섭식시키는 공정을 포함하는, 망막 장애 모델 토끼의 제조 방법으로서, 그 모델 토끼의 망막 색소 상피 세포가 정상 토끼의 망막 색소 상피 세포에 비해 비대해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 기재된 방법에 의해 제조되고, 정상 토끼에 비해 비대한 망막 색소 상피 세포를 갖고 있는 것을 특징으로 하는, 망막 장애 모델 토끼.
  26. 하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, 가령 황반 변성증의 치료약 혹은 예방약, 또는, 망막 보호제를 동정하는 방법：
    (i) 제 25 항에 기재된 토끼에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 비대를, 피검 물질 투여하 및 비투여하에서 측정하는 공정；및
    (ii) 그 피검 물질 투여하에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 비대가 비투여하와 비교하여 억제된 경우, 그 피검 물질을 양성으로 판정하는 공정.
  27. 제 26 항에 있어서,
    공정 (i) 에 있어서의 측정이, 망막 색소 상피 세포의 평균 면적 또는 비대한 망막 색소 상피 세포수의 측정인, 동정 방법.
  28. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    위축형 가령 황반 변성증의 치료 또는 예방을 위한, 의약 조성물.
  29. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    삼출형 가령 황반 변성증의 치료 또는 예방을 위한, 의약 조성물.
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