TWI774717B - 老年性黃斑部變性症治療用肽及其製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題為提供一種新穎的肽。
本發明之解決手段為一種肽,其包含序列識別號30所表示的胺基酸序列,且阻礙蛋白酶活性。
Description
本發明係關於肽、多核苷酸、載體、細胞、肽的製造方法、藉由相關方法而獲得之肽、包含肽的組成物、包含肽的醫藥組成物、包含肽的用於各種疾病之治療或預防的該醫藥組成物、用於各種疾病之治療或預防的肽之用途、包含投予肽之步驟的各種疾病之治療方法等。
高溫需求絲胺酸蛋白酶A1(High temperature requirement A serine peptidase 1(HTRA1))係類胰蛋白酶絲胺酸蛋白酶(PRSS11;Clan PA,family S1),由包含類IGFBP組件(module)及類Kazal組件的N末端域、蛋白酶域及C末端的PDZ域所構成。HTRA1屬於包含HTRA2、HTRA3、HTRA4的HTRA家族,與其他HTRA分子相同,可逆地顯示活性型與非活性型結構(非專利文獻1、2)。其表現在人類的體內並非均勻分布,被認為於軟骨或滑膜、胎盤等中相對為高的表現。HTRA1係已知將類澱粉前驅蛋白(Amyloid precursor protein)、纖連蛋白(Fibromodulin)、血漿簇集蛋白(Clusterin)、ADAM9、
玻連蛋白(Vitronectin)等許多的細胞外基質構成成分切斷作為基質,且與以關節炎或骨鈣化為代表之疾病相關(非專利文獻3、4、5、6)。再者,於HTRA1啟動子區域有基因多型性(rs11200638)的情形,已知HTRA1轉錄量會上升,又,已由全基因體關聯分析明白該多型性與老年性黃斑部變性症(Age-related Macular Degeneration:以下稱為AMD)有強烈關聯(非專利文獻7、8)。
AMD係伴隨老化的慢性變性疾病,且特徵為中心視力的降低。作為後天失明原因之疾病而在歐美為第1名,在日本則為接著青光眼、糖尿病視網膜病變、視網膜色素變性而為第4名的病患數(非專利文獻12)。在AMD病患的淋巴球、或者視網膜色素上皮細胞,HTRA11係以mRNA及蛋白質的層級上升(非專利文獻13)。又,有報告於AMD之前期病變的隱結(drusen)、變性的視網膜色素上皮細胞、或者新生血管膜中,HTRA1之蛋白質的表現上升(非專利文獻11及14~16)。又,也有報告於視網膜剝離、視網膜靜脈阻塞、玻璃體出血、黃斑裂孔(macular hole)等之玻璃體液中檢測到HTRA1蛋白質,且其值與血管新生標記之VEGF連動(非專利文獻17)。再者,在HTRA1基因轉殖小鼠,觀察到Fibulin5或原彈性蛋白(Tropoelastin)等構成基底膜之蛋白質的分解及布魯赫氏膜(Bruch’s membrane)的Elastic layer的斷裂化(非專利文獻9)。但是,並未直接地顯示關於用以治療上述疾病、以及用以保護視網膜,HTRA1的蛋白酶活性之抑制是否有效。
SPINK2(Kazal型絲胺酸蛋白酶抑制因子2(serine protease inhibitors Kazal-type 2))係具有3個雙硫鍵的類kazal域,係作為胰蛋白酶/精帽粒蛋白抑制劑而發揮作用(非專利文獻10),但與AMD的關係尚未被解明。
就評價AMD的動物模型而言,已知有小鼠與兔的模型(非專利文獻18、19、20)。但關於作為可外推至人類眼疾病之模型而較佳的兔(非專利文獻21),在以往的模型,僅藉由觀察視網膜‧脈絡膜內的異常表現,來評價視網膜色素上皮細胞(RPE細胞)的機能異常等係困難,而且有模型形成需要長達8個月的期間等問題點(非專利文獻20)。
非專利文獻1 Truebestein L, et al., Nat Struct Mol Biol., 2011, 18(3):386-8
非專利文獻2 Eigenbrot C, et al., Structure, 2012, 20(6):1040-50
非專利文獻3 Grau S, et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2005, 102(17):6021-26
非專利文獻4 Grau S, et al., J. Biol Chem., 2006, 281(10):6124-29
非專利文獻5 Hadfield KD, et al., J. Biol Chem., 2008, 283(9):5928-38
非專利文獻6 An E, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 2010, 51(7):3379-86
非專利文獻7 Yang Z, et al., Science., 2006, 314(5801):992-93
非專利文獻8 Tang NP, et al., Ann Epidemiol., 2009, 19(10):740-45
非專利文獻9 Vierkotten S, et al., PLoS One., 2011, 6(8):e22959
非專利文獻10 Chen T, et al., Proteins., 2009, 77(1):209-19
非專利文獻11 Yang Z, et al., Science, 2006, 314(5801):992-93
非專利文獻12 中江 公裕等,日本厚生勞動省難治性疾病克服研究事業,網脈絡膜‧視神經萎縮症調查研究班 平成19年度班會議(2007年刊)
非專利文獻13 Black JR and Clark SJ, Genet.Med., 2016, 18(4):283-89
非專利文獻14 Cameron DJ, et al., Cell Cycle, 2007, 6(9):1122-25
非專利文獻15 Chan CC, et al., Trans. Am.. Soc., 2007, 105:92-97
非專利文獻16 Tuo J, et al., 2008, 115(11):1891-98
非專利文獻17 Ng TK, et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 2011, 52(6):3706-12
非專利文獻18 Espinosa-Haidemann D.G, et al., Investigative Ophthamology & Visual Science, 2006, 47(2):729-37
非專利文獻19 Pons M, et al., American Journal of Pathology, 2010, 177:1198-1213
非專利文獻20 Trivino A, et al., Experimental Eye Research, 2006, 83:357-366
非專利文獻21 Zernii E.Y,et al., CNS & Neurological Disorders-Drug Targets, 2016, 15:267-291
提供新穎的高溫需求絲胺酸蛋白酶A1(High temperature requirement A serine peptidase 1(HTRA1))抑制劑。
本發明係有關於(1)一種SPINK2變異體肽,其包含序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列,且阻礙人類HTRA1所具有之蛋白酶活性;(2)(1)記載之肽,其係第1個Xaa(X1)為Asp、Glu、Ser、Gly、或Ile,第2個Xaa(X2)為Ala、Gly、Leu、Ser或Thr,第3個Xaa(X3)為Asp、His、Lys、Met或Gln, 第4個Xaa(X4)為Asp、Phe、His、Ser或Tyr,第5個Xaa(X5)為Ala、Asp、Glu、Met或Asn,第6個Xaa(X6)為Met或Trp,第7個Xaa(X7)為Gln、Trp、Tyr或Val,第8個Xaa(X8)為Phe、Leu或Tyr,第9個Xaa(X9)為Phe或Tyr,第10個Xaa(X10)為Ala、Glu、Met或Val,以及第11個Xaa(X11)為Ala、Thr或Val;(3)(1)或(2)記載之肽,其係包含序列識別號3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23至29(圖15、圖17、圖19、圖21、圖23、圖25、圖27、圖29、圖31、圖33及、圖35至41)之任一者所表示的胺基酸序列;(4)(1)至(3)之任一者所記載之肽,其係包含1至3個胺基酸於序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列之胺基末端側肽鍵結而成的胺基酸序列;(5)(1)至(4)之任一者所記載之肽,其係包含1或2個胺基酸於序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列之羧基末端側肽鍵結而成的胺基酸序列;(6)(1)至(5)之任一者所記載之肽,其係具有特徵為具有3個雙硫鍵,且包含環狀結構、α螺旋及β摺疊的立體結構; (7)一種多核苷酸,其係包含編碼(1)至(6)之任一者所記載之肽所包含的胺基酸序列之核苷酸序列;(8)一種載體,其包含(7)記載之多核苷酸;(9)一種細胞,其包含(7)記載之多核苷酸或是(8)記載之載體,或產生(1)至(6)之任一者所記載之肽;(10)一種阻礙HTRA1所具有之蛋白酶活性的SPINK2變異體肽的製造方法,其包含下述步驟(i)及(ii):(i)培養(9)記載之細胞的步驟、(ii)自該培養物回收SPINK2變異體肽的步驟;(11)一種SPINK2變異體肽,其係藉由(10)記載之方法而可獲得;(12)一種複合體(conjugate),其係其他部分連結於(1)至(6)及(11)之任一者所記載之肽而成;(13)(12)記載之複合體,其為多肽;(14)一種抗體或其功能片段,其鍵結於(1)至(6)及(11)之任一者所記載之肽; (15)一種組成物,其係包含(1)至(6)及(11)之任一者所記載之肽、(7)記載之多核苷酸、(8)記載之載體、(9)記載之細胞、(12)或是(13)記載之複合體、及/或(14)記載之抗體或是其功能片段;(16)一種醫藥組成物,其包含(1)至(6)及(11)之任一者所記載之肽及/或(12)或(13)所記載之複合體;(17)(16)記載之醫藥組成物,其係用於HTRA1相關疾病之治療或預防;(18)(17)記載之醫藥組成物,其中HTRA1相關疾病係選自包含滲出型老年性黃斑部變性症、萎縮型老年性黃斑部變性症、地圖狀萎縮(geographic atrophy)、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、息肉狀脈絡膜血管病變、類風濕性關節炎、及骨關節炎(Osteoarthritis)之群組的1個或2個以上;(19)(16)至(18)之任一者所記載之醫藥組成物,其係包含1個或2個以上的其他醫藥;(20)(16)至(18)之任一者所記載之醫藥組成物,其係與1個或2個以上的其他醫藥組合而被使用; (21)(16)至(20)之任一者所記載之醫藥組成物,其係視網膜保護劑;(22)一種鑑定老年性黃斑部變性症之治療藥或預防藥的方法,其係包含下述之步驟1至步驟3:[步驟1]在待測物質的存在下或非存在下保溫HTRA1蛋白酶及基質,[步驟2]檢測在待測物質的存在下及非存在下之HTRA1蛋白酶活性,[步驟3]待測物質的存在下之HTRA1蛋白酶活性與待測物質的非存在下之HTRA1蛋白酶活性比較而較小的情形,判定該待測物質為陽性;(23)一種鑑定視網膜保護劑的方法,其係包含下述之步驟1至步驟3:[步驟1]在待測物質的存在下或非存在下保溫HTRA1蛋白酶及基質,[步驟2]檢測待測物質的存在下及非存在下之HTRA1蛋白酶活性,[步驟3]待測物質的存在下之HTRA1蛋白酶活性與待測物質的非存在下之HTRA1蛋白酶活性比較而較小的情形,判定該待測物質為陽性; (24)一種視網膜損傷模型兔的製作方法,其包含使3至6個月攝食含氫醌之高脂肪食物的步驟,其特徵為該模型兔的視網膜色素上皮細胞比正常兔的視網膜色素上皮細胞肥大;(25)一種視網膜損傷模型兔,其特徵為藉由(24)記載之方法製作,且具有比正常兔肥大的視網膜色素上皮細胞;(26)一種鑑定老年性黃斑部變性症之治療藥或是預防藥、或、視網膜保護劑的方法,其包含下述步驟(i)及(ii):(i)在待測物質投予下及非投予下測定(24)記載之兔中的視網膜色素上皮細胞的肥大之步驟、及(ii)於該待測物質投予下的視網膜色素上皮細胞的肥大與非投予下比較為被抑制的情形,判定該待測物質為陽性之步驟;(27)(26)記載之方法,其中步驟(i)中的測定係視網膜色素上皮細胞的平均面積、或肥大的視網膜色素上皮細胞數之測定;(28)(16)至(18)之任一者所記載之醫藥組成物,其係用於萎縮型老年性黃斑部變性症的治療或預防;及 (29)(16)至(18)之任一者所記載之醫藥組成物,其係用於滲出型老年性黃斑部變性症的治療或預防;等。
本發明所提供的肽、包含其之醫藥組成物,係具有HTRA1抑制活性,且對於老年性黃斑部變性症的治療或預防等有用。
圖1(A)係將人類/小鼠/大鼠/猴HTRA1的序列類似性進行比較之圖。虛線係表示酵素活性域(204Gly~364Leu)。
圖1(B)係將人類/小鼠/大鼠/猴HTRA1的序列類似性進行比較之圖(續)。
圖2係以肽基質的分解速度作為指標,而評價HTRA1抑制肽(inhibitory peptide)的HTRA1(cat)抑制活性之圖。分別將各抑制肽在圖片A至C進行評價,而圖片D以對照的野生型SPINK2進行評價。
圖3係以肽基質的分解速度作為指標,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1(full)抑制活性之圖(圖片A至C)。
圖4(A)係以人類玻連蛋白的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1(cat)抑制活性之圖。藉由使用人玻連蛋白抗體(R&D Systems;MAB2349)的西方墨點法進行解析。
圖4(B)係以人類玻連蛋白的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1(cat)抑制活性之圖(續)。
圖5(A)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之1)。所使用的各蛋白酶的名稱與其濃度、基質的名稱與其濃度等,係參照實施例3。
圖5(B)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之2)。
圖5(C)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之3)。
圖5(D)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之4)。
圖6係呈示藉由X射線晶體結構分析所獲得之HTRA1(cat)/HTRA1抑制肽複合體之圖。於HTRA1(cat)所形成的HTRA1三聚體上分別鍵結抑制肽。
圖7係作為單體而呈示藉由X射線晶體結構分析所獲得之HTRA1(cat)/HTRA1抑制肽複合體之圖。該抑制肽係鍵結於包含HTRA1(cat)活性中心之區域。
圖8係H2-Opt的胺基酸序列(序列識別號54)。分別地,N末端的「Mca-I」意指N-(4-甲基香豆基-7-醯胺)-異白胺酸(N-(4-methylcoumaryl-7-amide)-isoleucine),而C末端的「(Dnp)K」意指Nε-(2,4-二硝基苯基)-離胺酸(N epsilon-(2,4-dinitrophenyl)-lysine)。
圖9係呈示在大鼠的光照射視網膜損傷模型之玻璃體液中HTRA1的表現亢進之圖。藉由使用人 HTRA1/PRSS11抗體(R&D Systems;AF2916)的西方墨點法進行解析。
圖10係呈示於大鼠的光照射視網膜損傷模型中,HTRA1抑制肽投予組會抑制視網膜斷層的外顆粒層所含之核數的減少之圖。生理食鹽水投予組的例數為4,其他組的例數為5。
圖11係以肽基質的分解速度作為指標,而評價5種HTRA1抑制肽衍生物的HTRA1(cat)抑制活性之圖。
圖12係藉由免疫沉澱法,而評價3種HTRA1抑制肽與HTRA1(cat)鍵結之圖。
圖13係人類SPINK2的胺基酸序列(序列識別號1)。
圖14係編碼人類SPINK2的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號2)。
圖15係肽H218的胺基酸序列(序列識別號3)。
圖16係編碼肽H218的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號4)。
圖17係肽H223的胺基酸序列(序列識別號5)。
圖18係編碼肽H223的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號6)。
圖19係肽H228的胺基酸序列(序列識別號7)。
圖20係編碼肽H228的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號8)。
圖21係肽H308的胺基酸序列(序列識別號9)。
圖22係編碼肽H308的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號10)。
圖23係肽H321的胺基酸序列(序列識別號11)。
圖24係編碼肽H321的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號12)。
圖25係肽H322的胺基酸序列(序列識別號13)。
圖26係編碼肽H322的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號14)。
圖27係肽衍生物H308AT的胺基酸序列(序列識別號15)。
圖28係編碼肽衍生物H308AT的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號16)。
圖29係肽衍生物H321AT的胺基酸序列(序列識別號17)。
圖30係編碼肽衍生物H321AT的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號18)。
圖31係肽衍生物H322AT的胺基酸序列(序列識別號19)。
圖32係編碼肽衍生物H322AT的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號20)。
圖33係肽M7的胺基酸序列(序列識別號21)。
圖34係編碼肽M7的胺基酸序列之核苷酸序列(序列識別號22)。
圖35係肽衍生物H308_S16A的胺基酸序列(序列識別號23)。
圖36係肽衍生物H308_D1G_S16A的胺基酸序列(序列識別號24)。
圖37係肽衍生物H308_D1S_S16A的胺基酸序列(序列識別號25)。
圖38係肽衍生物H308_D1E_S16A的胺基酸序列(序列識別號26)。
圖39係肽衍生物H308_D1SLI_S16A的胺基酸序列(序列識別號27)。
圖40係肽衍生物H321AT_D1S_S16A的胺基酸序列(序列識別號28)。
圖41係肽衍生物H322AT_D1S_S16A的胺基酸序列(序列識別號29)。
圖42係HTRA1抑制肽的通式(序列識別號30)。X1至X11表示任意的胺基酸。
圖43係包含S標記(S tag)及連接子(linker)的胺基酸序列(序列識別號31)。
圖44係C末端6聚物的胺基酸序列(序列識別號32)。
圖45係引子1的核苷酸序列(序列識別號33)。
圖46係引子2的核苷酸序列(序列識別號34)。
圖47係引子3的核苷酸序列(序列識別號35)。
圖48係引子4的核苷酸序列(序列識別號36)。
圖49係引子5的核苷酸序列(序列識別號37)。
圖50係引子6的核苷酸序列(序列識別號38)。
圖51係引子7的核苷酸序列(序列識別號39)。
圖52係引子8的核苷酸序列(序列識別號40)。
圖53係引子9的核苷酸序列(序列識別號41)。
圖54係引子10的核苷酸序列(序列識別號42)。
圖55係引子11的核苷酸序列(序列識別號43)。
圖56係引子12的核苷酸序列(序列識別號44)。
圖57係引子13的核苷酸序列(序列識別號45)。
圖58係引子14的核苷酸序列(序列識別號46)。
圖59係引子15的核苷酸序列(序列識別號47)。
圖60係引子16的核苷酸序列(序列識別號48)。
圖61係引子17的核苷酸序列(序列識別號49)。
圖62係引子18的核苷酸序列(序列識別號50)。
圖63係引子19的核苷酸序列(序列識別號51)。
圖64係引子20的核苷酸序列(序列識別號52)。
圖65係人類HTRA1(full)的胺基酸序列(序列識別號53)。
圖66(A)係以肽基質的分解速度作為指標,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1(cat)抑制活性之圖。
圖66(B)係以肽基質的分解速度作為指標,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1(full)抑制活性之圖。
圖67係以人類玻連蛋白的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1(cat)抑制活性之圖。藉由使用人玻連蛋白抗體(R&DSystems;MAB2349)的西方墨點法進行解析。
圖68(A)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之1)。
圖68(B)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之2)。
圖68(C)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之3)。
圖68(D)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之4)。
圖68(E)係以肽基質的分解作為指標,而評價HTRA1抑制肽對於各蛋白酶的交叉反應性之圖(之5)。
圖69係藉由免疫沉澱法,而評價3種HTRA1抑制肽與HTRA1(cat)鍵結之圖。
圖70(A)係呈示於大鼠的光照射視網膜損傷模型中,HTRA1抑制肽H308_D1G_S16A投予組會抑制視網膜斷層的外顆粒層所含之核數的減少之圖。任一組的例數都是6,HTRA1抑制肽H308_D1G_S16A投予量為0.2及1μg/eye。
圖70(B)係呈示於大鼠的光照射視網膜損傷模型中,HTRA1抑制肽H321AT_D1G_S16A投予組會抑制視網膜斷層的外顆粒層所含之核數的減少之圖。任一組的例數都是6,HTRA1抑制肽H321AT_D1G_S16A投予量為0.2及1μg/eye。
圖70(C)係呈示於大鼠的光照射視網膜損傷模型中,HTRA1抑制肽H322AT_D1G_S16A投予組會抑制視網膜斷層的外顆粒層所含之核數的減少之圖。任一組的例數都是6,HTRA1抑制肽H322AT_D1G_S16A投予量為0.2及1μg/eye。
圖71(A)係將12週齡兔、3歲齡兔、及HFD-HQ負載之3歲齡兔的RPE細胞使用ZO-1抗體(Themo Fisher SCIENTIFIC)進行免疫染色之圖。
圖71(B)係12週齡兔、3歲齡兔、及HFD-HQ負載之3歲齡兔的RPE細胞的平均面積。
圖71(C)係呈示於HFD-HQ負載之3歲齡兔的視網膜組織中,為AMD相關因子之補體第三成分C3的mRNA表現亢進之圖。
圖71(D)係呈示於HFD-HQ負載之3歲齡兔的RPE/脈絡膜組織中,為AMD相關因子之補體第三成分C3的mRNA表現亢進之圖。
圖71(E)係藉由LC-MS/MS,而測定12週齡兔、3歲齡兔、及HFD-HQ負載之3歲齡兔的玻璃體液中之HTRA1濃度之圖。
圖72(A)係於HFD-HQ負載之3歲齡兔中,HTRA1抑制肽H308投予組對於RPE細胞的肥大顯示抑制效果之圖。任一組都是例數為5,且以平均面積作為指標。
圖72(B)係於HFD-HQ負載之3歲齡兔中,HTRA1抑制肽H308投予組對於RPE細胞的肥大顯示抑制效果 之圖。任一組都是例數為5,且以細胞面積為1500μm2以上的RPE細胞數作為指標。
圖73係將人類/猴/兔/小鼠/大鼠HTRA1的序列類似性進行比較之圖。虛線係表示酵素活性域(204Gly~364Leu)。
圖74係藉由H2O2及正常人血清補體(Normal Human Serum Complement)、HTRA1添加,而對於在人類視網膜色素上皮細胞株ARPE-19被誘導之VEGF mRNA,HTRA1抑制肽顯示抑制效果之圖。
圖75係對於因血清而被誘導之人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)的游走,HTRA1抑制肽顯示抑制效果之圖。
圖76係引子21的核苷酸序列(圖66)。
圖77係引子22的核苷酸序列(圖67)。
而且,於本發明中被記載為「序列識別號X(圖Y)」或「圖Y(序列識別號X)」的情形,意指該序列係藉由序列識別號X表示或藉由圖Y表示。
於本發明中,「基因」係意指包含編碼蛋白質所含胺基酸序列之核苷酸序列的核酸分子或其互補股,且包含單股、雙股或三股以上,而DNA股與RNA股的集合體、於一條鏈上混合存在核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸者及包含該種之鏈的雙股或三股以上的核酸分子,亦包含在「基因」的定義中。
於本發明中,「基因」、「多核苷酸」及「核酸分子」係同義,並不因彼等之構成單元的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、核苷酸、核苷等之個數而受任何限定,例如DNA、RNA、mRNA、cDNA、cRNA、探針、寡核苷酸、引子等亦包含在其範圍中。「核酸分子」有被簡稱為「核酸」的情形。
於本發明中,「多肽」、「肽」及「蛋白質」係同義。可將阻礙或抑制標的分子X所具有之1個或2個以上的活性或機能(以下,將彼等之阻礙或抑制作用統稱為「X抑制活性」。)之肽稱為「X抑制肽」。
「SPINK2」意指Kazal型絲胺酸蛋白酶抑制因子2,係包含具有3個雙硫鍵的類kazal域的7kDa之蛋白質。合適的SPINK2係來自人類。於本發明中,除於其他段落有記載的情形,將人類SPINK2僅稱為「SPINK2」。
「HTRA1」意指高溫需求絲胺酸蛋白酶A1(high temperature requirement A serine peptidase 1),係屬於由包含類IGFBP組件及類Kazal組件的N末端域、蛋白酶域以及C末端的PDZ域所構成之HTRA家族的蛋白質。合適的HTRA1係來自人類。於本發明中,除其他段落有記載的情形,有時將人類HTRA1僅稱為「HTRA1」。
「HTRA1抑制肽」意指會阻礙或抑制HTRA1所具有之1個或2個以上的活性或機能之肽。「HTRA1抑制肽」的範圍中包含該肽的片段、其他部分(moiety)的加成物、或複合體當中維持著HTRA1抑制活性者。亦即,會維持HTRA1抑制活性之該肽的片段、加成物及改質物亦包含在「HTRA1抑制肽」中。
於本發明中,「細胞」中亦包含來自動物個體的各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞、酵母、微生物等。
於本發明中,肽所鍵結的「部位」,亦即肽所辨識的「部位」係意指肽所鍵結或辨識之標的分子上的連續或是斷續的部分胺基酸序列或部分高階結構。於本發明中,可將相關部位稱為標的分子上的抗原決定位或鍵結部位。
「SPINK2變異體」係意指於野生型SPINK2所具有之胺基酸序列中包含1個或2個以上的胺基酸被與野生型不同的胺基酸取代、1個或2個以上的野生型之胺基酸缺失、1個或2個以上之野生型中沒有的胺基酸被插入、及/或野生型中沒有的胺基酸被附加於野生型的胺基末端(N末端)及/或羧基末端(C末端)(以下,總稱為「變異」)而成之胺基酸序列的肽。「SPINK2變異體」之中,具有HTRA1抑制活性者,係包含在HTRA1抑制肽中。而且,於本發明中「插入」亦可被包含在「附加」的範圍中。
於本發明中,「1至數個」中的「數個」係指3至10個。
於本發明中,「在嚴苛條件下進行雜交」係意指在以下條件或與其同等的條件下進行雜交,該條件係在含5×SSC之溶液中以65℃進行雜交,接著分別在含2×SSC-0.1%SDS之水溶液中於65℃進行20分鐘、在含0.5×SSC-0.1%SDS之水溶液中於65℃進行20分鐘、以 及在含0.2×SSC-0.1%SDS之水溶液中於65℃進行20分鐘清洗。SSC為150mM氯化鈉-15mM檸檬酸鈉的水溶液,n×SSC意指n倍濃度的SSC。
於本發明中「專一性的」及「特異性」之語彙係與「有選擇性的」及「選擇性」分別同義,有互換性。例如,HTRA1專一性的抑制肽係與有HTRA1選擇性的抑制肽同義。
「胺基酸」意指含胺基及羧基的有機化合物,合適為蛋白質中作為構成單元所包含的,更合適為天然之蛋白質中作為構成單元所包含的α-胺基酸。於本發明中,更合適的胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val,若無特別述明的話,「胺基酸」意指此等之總共20個胺基酸。可將彼等的總共20個胺基酸稱為「天然胺基酸」。本發明之HTRA1抑制肽係合適為含有天然胺基酸。
於本發明中,係有「胺基酸殘基」被略記為「胺基酸」的情形。
又,於本發明中,胺基酸為L-胺基酸、D-胺基酸、或其混合物(DL-胺基酸),但若無特別述明的話,意指L-胺基酸。
天然胺基酸係可根據其共通之側鏈的性質,而分為例如以下的群組。
(1)疏水性胺基酸群組:Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性親水性胺基酸群組:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性胺基酸群組:Asp、Glu
(4)鹼性胺基酸群組:His、Lys、Arg
(5)對主鏈的方向造成影響之胺基酸的群組:Gly、Pro
(6)芳香族胺基酸群組:Trp、Tyr、Phe
但是,天然胺基酸的分類並不受限於此等。
於本發明中,天然胺基酸可受到保存性胺基酸取代。
「保存性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」,係意指與就機能而言為等價或類似的胺基酸之取代。肽中的保存性胺基酸取代係會對該肽的胺基酸序列帶來靜態變化。例如,具有相同的極性之一個或二個以上的胺基酸,係就機能而言等價地進行作用,對相關之肽的胺基酸序列帶來靜態變化。一般地,可認為某群組內的取代係關於結構及機能為保存性的。然而,如該專業人員所知,特定的胺基酸殘基所扮演的角色可在包含該胺基酸之分子的三維結構的意義上來決定。例如,半胱胺酸殘基係可採取與還原型的(巰基)形式比較而極性較低之氧化型的(雙硫)形式。精胺酸側鏈之長的脂肪族的部分,係可於結構上及機能上構成重要 的特徵。又,含芳香環之側鏈(色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸)會對離子-芳香族相互作用或陽離子-pi相互作用有貢獻。於相關情形下,即使將此等之具有側鏈的胺基酸與屬於酸性或非極性群組的胺基酸進行取代,於結構上及機能上亦可為保存性的。脯胺酸、甘胺酸、半胱胺酸(雙硫‧形式)等之殘基係有對主鏈的立體結構賦予直接性的效果之可能性,而有時會無法無結構上歪斜地進行取代。
保存性胺基酸取代係如以下所示,包含根據側鏈的類似性之專一性的取代(Lehninger,生化學,改訂第2版,1975年出版,第73至75頁:L.Lehninger,Biochemistry,2nd edition,pp73-75,Worth Publisher,New York(1975))、及典型的取代。
(1)非極性胺基酸群組:丙胺酸(以下,記為「Ala」或僅記為「A」)、纈胺酸(以下,記為「Val」或僅記為「V」)、白胺酸(以下,記為「Leu」或僅記為「L」)、異白胺酸(以下,記為「Ile」或僅記為「I」)、脯胺酸(以下,記為「Pro」或僅記為「P」)、苯丙胺酸(記為「Phe」或僅記為「F」)、色胺酸(以下,記為「Trp」或僅記為「W」)、甲硫胺酸(以下,記為「Met」或僅記為「M」)
(2)不帶電的極性胺基酸群組:甘胺酸(以下,記為「Gly」或僅記為「G」)、絲胺酸(以下,記為「Ser」或僅記為「S」)、蘇胺酸(以下,記為「Thr」或僅記為「T」)、半胱胺酸(以下,記為「Cys」或僅記為「C」)、酪胺酸(以下,記為「Tyr」或僅記為「Y」)、天門冬醯胺酸(以下,記為「Asn」或僅記為「N」)、麩醯胺酸(以下,記為「Gln」或僅記為「Q」)
(3)酸性胺基酸群組:天門冬胺酸(以下,記為「Asp」或僅記為「D」)、麩胺酸(以下,記為「Glu」或僅記為「E」)
(4)鹼性胺基酸群組:離胺酸(以下,記為「Lys」或僅記為「K」)、精胺酸(以下,記為「Arg」或僅記為「R」)、組胺酸(以下,記為「His」或僅記為「H」)
於本發明中,胺基酸亦可為天然胺基酸以外的胺基酸。可舉出例如:會在天然的肽或蛋白質中被找到的硒半胱胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、吡咯離胺酸、焦麩胺酸、胱胺酸、羥脯胺酸、羥離胺酸、甲狀腺素、O-磷絲胺酸、鎖鏈素(desmosine)、β-丙胺酸、肌胺酸、烏胺酸、肌酸、γ-胺基丁酸、冠癭鹼(opine)、茶胺酸、口蘑酸(tricholomic acid)、紅藻胺酸、軟骨藻酸、肢端酸(acromelic acid)等、正白胺酸、Ac-胺基酸、Boc-胺基酸、Fmoc-胺基酸、Trt-胺基酸、Z-胺基酸等的N末端保護胺基酸、胺基酸三級丁酯、苄酯、環己酯、茀酯(fluorenyl ester)等的C末端保護胺基酸、包含二胺、ω胺基酸、β胺基酸、γ胺基酸、胺基酸的Tic衍生物、胺基膦酸之其他於自然界不會被找到的胺基酸等,但不限於彼等,在本發明將上述20個「天然胺基酸」以外的胺基酸取其便而總稱為「非天然胺基酸」。
本發明之HRTA1抑制肽,係SPINK2所具有之骨架至少部分地被維持的SPINK2變異體(以下,略記為 「SPINK2變異體」),阻礙或抑制HTRA1或保有其酵素活性的片段(以下稱為「功能片段」)所具有之蛋白酶活性(以下,將相關阻礙或抑制統稱為「HTRA1抑制活性」)。
本發明之抑制肽的標的之HTRA1,係合適為哺乳類的,更合適為靈長類的,更進一步合適為人類的HTRA1,全長成熟人類HTRA1(以下稱為「HTRA1(full)」)的胺基酸序列係具有序列識別號53(圖65)所表示的胺基酸序列。該胺基酸序列包含第23個至第480個,不含由第1個至第22個所構成的訊息序列。就人類HTRA1的功能片段(以下稱為「HTRA1(cat)」)的胺基酸序列而言,若保有該蛋白酶活性,則不特別受限定,但可例示包含序列識別號53(圖65)的第158的Gly~第373的Lys者、含第158的Gly~第373的Lys者等。本發明之抑制肽的標的之HTRA1及其功能片段亦被表示為HTRA1蛋白酶,合適為來自脊椎動物,更合適為來自哺乳類,更進一步合適為來自靈長類,最合適為來自人類,且由彼等的組織或細胞進行純化,或可藉由基因重組、活體外轉譯、肽合成等之作為蛋白質的調製方法而為該專業人員公知的方法來調製。HTRA1及其功能片段中,訊息序列、免疫球蛋白的Fc區、標記(tag)、標示(label)等亦可被連結。
HTRA1抑制活性係可以HTRA1所具有之蛋白酶活性作為指標來進行評價。例如於使HTRA1或其功能片段、基質及本發明之抑制肽或其候補共存之情形, 與對照的存在下或該抑制劑或其候補的非存在下比較,而HTRA1的蛋白酶活性為70%以下、50%以下、30%以下、20%以下、10%以下、5%以下、1%以下或0%的情形,有發生HTRA1抑制,其抑制活性分別為30%以上、50%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、99%以上或100%。HTRA1抑制活性因反應條件、基質的種類或濃度等而會有所不同。關於反應條件,可例示實施例所記載者,但不限定於該者。酵素活性可利用以下方法評價:將基質肽或基質蛋白質添加於一定濃度的HTRA1,使其進行反應一定時間後檢測基質肽的螢光、或藉由SDS-PAGE或西方墨點法、液相層析法等檢測基質蛋白質。就緩衝液而言,可使用例如磷酸鹽‧緩衝液‧鹽水(磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline):以下稱為「PBS」)、硼酸緩衝液(50mM硼酸,pH7至9,例如pH8.5)、Tris緩衝液(50mM三羥甲基胺基甲烷,pH6至9,例如pH8.0)等,亦可添加氯化鈉(50至300mM,例如150mM)或CHAPS或辛基-β-D-葡萄哌喃糖苷等的界面活性劑,但不限定於彼等。
HTRA1所具有之蛋白酶的基質係內在性的基質、外因性的基質、合成基質等,並非特別限定之物。就人類之內在性的基質而言,可例示玻連蛋白等。就合成基質而言,並不特別受限定,但可例示H2-Opt(Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K)或β-酪蛋白、其他HTRA1基質等。本發明之肽的HTRA1抑制活性(IC50或Ki)為1μM以下,合適為100nM以下。
又,本發明之抑制肽較佳為並不阻礙或是抑制HTRA1以外的蛋白酶活性,或對於彼等之阻礙或是抑制的程度相對為弱的。換而言之,本發明之抑制肽係合適為HTRA1特異性高。合適的本發明之抑制肽並不阻礙或是抑制胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、類胰蛋白酶(tryptase)、血纖維蛋白溶酶、凝血酶、間質蛋白酶(matriptase)、蛋白質C、組織纖維蛋白溶酶原激活酶(tPA)、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活酶(uPA)、血纖維蛋白溶酶、血漿激肽釋放酶(Plasma kallikrein)等的蛋白酶活性,或對於彼等之阻礙或是抑制的程度相對為弱的。該種本發明之合適的肽並不顯示起因於阻礙或是抑制其他蛋白酶活性的副作用,可被適合地使用來作為HTRA1關連疾病(後述)之治療藥或預防藥。
如前述,本發明之肽的標的之HTRA1係來自脊椎動物、合適為來自哺乳動物,更合適為來自靈長類,更進一步合適為來自人類,但亦可來自非人類動物,例如大鼠、小鼠等的齧齒類、食蟹獼猴、普通狨、恒河猴等的靈長類。對來自非人類動物的HTRA1具有抑制活性的肽來說,可使用於相關非人類動物中之HTRA1關連疾病的診斷、檢查、治療或預防等。又,該種肽也會阻礙人類HTRA1的情形,於作為人類HTRA1關連疾病之治療藥或預防藥之該肽的非臨床研究開發中,可進行將相關非人類動物作為疾病模型動物來使用的藥效藥理試驗或藥物動態試驗、作為健康動物來使用的安全性試驗或毒性試驗等。
又,本發明之HTRA1抑制肽,係與在該領域作為醫藥及診斷藥所使用之抗體等的其他生物高分子比較而分子量小,且其製造(後述)比較容易,在對組織的滲透性、保存安定性或熱安定性等的物性方面優異,具有被使用作為醫藥組成物(後述)之情形的投予途徑、投予方法、製劑等的選擇之寬度廣等的優點。又,亦可應用生物高分子或聚合物的附加等公知的方法來加大本發明之肽的分子量,藉此而將作為醫藥組成物使用的情形之血中半衰期調節到更長。該種本發明之HTRA1抑制肽的分子量係小於10,000,合適為小於8,000,更合適為約7,000~7,200。又,序列識別號23(圖29)之包含第15的Cys~第31的Cys之可變環狀部分或包含第15的Cys~第63的Cys之部分(以下稱為「包含6個Cys的部分」)當中,具有HTRA1抑制活性者亦分別被包含在本發明HTRA1抑制肽中,且可變環狀部分的分子量係小於2,500,合適為約1,800~2,000,包含6個Cys之部分的分子量係小於6,000,合適為約5,300~5,500。
再者,本發明之HTRA1抑制肽的範圍所包含的SPINK2所具有之骨架至少部分地被維持的SPINK2變異體(以下,略記為「SPINK2變異體」),亦可與HTRA1鍵結,合適為能夠與哺乳類的HTRA1鍵結,更合適為能夠與靈長類的的HTRA1鍵結,更進一步合適為能夠與人類的HTRA1鍵結。該種與HTRA1鍵結之肽,係辨識HTRA1的部分肽、部分高階結構等,或鍵結於彼等(以下,將相關辨識或鍵結作用統稱為「標的鍵結活性」)。
又,某態樣中的本發明之抑制肽係可鍵結於HTRA1的免疫原性片段。HTRA1的免疫原性片段因具有1個或2個以上的抗原決定位、模擬表位(Mimotopes)或其他的抗原決定基,所以可誘發免疫反應或可產生對於該片段之抗體。
本發明中之SPINK2變異體與HTRA1或其免疫原性片段的鍵結,係可藉由可檢測之鍵結親和性的測定(ELISA法、表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance:以下稱為「SPR」)解析法(亦稱為「BIAcore」法)、恆溫滴定量熱測定(Isothermal Titration Calorimetry:以下稱為「ITC」)法、流動式細胞測量術、免疫沉澱法等)等,而使用該專業人員公知的方法來進行評價、測定或判定。
就ELISA法而言,可舉出檢測HTRA1抑制肽之方法,該HTRA1抑制肽係辨識在盤上被固相化的HTRA1而進行鍵結。對HTRA1的固相化來說,除生物素-鏈親和素(streptavidin)以外,還可利用會辨識與HTRA1融合之標記的固相用抗體等。對HTRA1抑制肽的檢測來說,除被標示之鏈親和素以外,還可利用會辨識與HTRA1抑制肽融合之標記的被標示之檢測用抗體等。對標示來說,除生物素以外,還可利用能夠於HRP、鹼性磷酸酶、FITC等生化學之解析實施的方法。對利用酵素標示之檢測來說,可使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine))、5-浿-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate))、對硝基磷酸酯(p-NPP(p-nitrophenyl phosphate))、鄰伸苯基二胺(OPD(o-Phenylenediamine))、3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS(3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)等之顯色基質或QuantaBlu(商標)Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Fisher Scientific)等之螢光基質、及化學發光基質。對檢測訊號的測定來說,可利用吸光盤判讀機、螢光盤測讀儀、發光盤測讀儀、RI液體閃爍計數儀等。
就用於SPR解析的機器而言,可例示BIAcore(商標)(GE Healthcare)、ProteOn(商標)(BioRad)、SPR-Navi(商標)(BioNavisOy)、Spreeta(商標)(Texas Instruments)、SPRi-PlexII(商標)(HORIBA)、Autolab SPR(商標)(Metrohm)等。就用於BLI法的機器而言,可例示Octet(商標)(Pall)。
就免疫沉澱法而言,可舉出檢測藉由在珠粒上被固相化之HTRA1抑制肽所辨識並結合的HTRA1。對珠粒來說,可利用磁珠或瓊脂糖珠等。對HTRA1抑制肽的固相化來說,除生物素-鏈親和素以外,還可利用會辨識該肽或與該肽融合之標記的抗體、蛋白質A或蛋白質G等。利用磁鐵或離心分離等而將珠粒分離,並將與珠粒一起沉澱之HTRA1以SDS-PAGE或西方墨點法進行檢測。對HTRA1的檢測來說,除被標示之鏈親和素以 外,還可利用會辨識與HTRA1融合之標記的被標示之檢測用抗體等。對標示來說,除生物素以外,還可利用能夠在HRP、鹼性磷酸酶、FITC等生化學之解析實施的方法。對利用酵素標示的檢測來說,可利用與ELISA法相同的基質。對檢測訊號的測定來說,可利用ChemiDoc(商標)(BioRad)或LuminoGraph(ATTO)等。
於本發明中「專一性的辨識」亦即「專一性的鍵結」,係意指不是非專一性的吸附之鍵結。就鍵結是否為專一性之判定基準而言,可舉出例如ELISA法中之鍵結活性EC50。就其他判定基準而言,可舉出例如離解常數(dissociation constant:以下稱為「KD」)。本發明中之HTRA1抑制肽的對HTRA1之KD值為1×10-4M以下、1×10-5M以下、5×10-6M以下、2×10-6M以下或1×10-6M以下;更合適為5×10-7M以下、2×10-7M以下或1×10-7M以下;更進一步合適為5×10-8M以下、2×10-8M以下或1×10-8M以下;進而更進一步合適為5×10-9M以下、2×10-9M以下或1×10-9M以下。就其他判定基準而言,可舉出例如在免疫沉澱法之解析結果。將本發明中之合適的HTRA1抑制肽固相化於珠粒,分別添加HTRA1之後將珠粒分離,並檢測與珠粒一起沉澱之HTRA1之情形,會檢測到HTRA1的訊號。
雖有前述之記載,但只要是在具有HTRA1抑制活性的情況下,對作為本發明之抑制肽的SPINK2變異體來說,對HTRA1或其免疫原性片段的鍵結能力並非必要。
本發明之抑制肽於對HTRA1的蛋白酶基質之鍵結中亦可為競爭性的。
又,於合適的幾個態樣中,本發明之抑制肽係具有視網膜保護效果。例如,於實施例中所詳述之光照射視網膜損傷模型中,本發明之合適的抑制劑可抑制光照射所導致的外顆粒層所含之核的數量之減少。於該模型中,與非照射之群組進行比較,而於經光照射之群組的玻璃體液會檢測到更大量的HTRA1蛋白質,本發明揭載:HTRA1涉及視網膜損傷、HTRA1抑制活性帶來視網膜保護效果。
作為本發明之抑制肽的SPINK2變異體可具有如上述之活性、性質、機能、特徵等,而另一方面,其全長胺基酸序列係具有對人類野生型SPINK2的胺基酸序列為高的序列相同度。本發明之SPINK2變異體係與人類SPINK2的胺基酸序列(序列識別號1:圖13)具有60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同度。
「相同度」係意指顯示2個序列之間的類似性或關係之程度的性質。胺基酸序列的相同度(%),係藉由以下方法算出:對於將相同的胺基酸或是胺基酸殘基之數除以胺基酸或是胺基酸殘基之總數所得之數值,乘以100。
「間隔(gap)」係意指2個以上的序列之中至少1個的缺失及/或附加之結果,即該序列間的比對中之空隙。
具有完全相同之胺基酸序列的2個胺基酸序列之間的相同度為100%,但若將其中一者的胺基酸序列與另一者比較而有1個或2個以上的胺基酸或胺基酸殘基之取代、缺失或附加,則二者之相同度就小於100%。就將間隔也放入考慮而用以決定2個序列間的相同度之演算法或程式而言,可例示使用具代表性之參數的BLAST(Altschul,et al.Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402)、BLAST2(Altschul,et al.J.Mol.Biol.1990,215:403-410)、Smith-Waterman(Smith,et al.J.Mol.Biol.1981,147:195-197)等之該專業人員所周知者。
於本發明中,「經變異」係意指在與存在於天然的核酸分子或肽比較之核苷酸序列或胺基酸序列中,有1個或2個以上的核苷酸或是核苷酸殘基、或胺基酸或是胺基酸殘基的取代、缺失或插入。本發明之SPINK2變異體的胺基酸序列係與人類SPINK2的胺基酸序列進行比較,而1個或2個以上的胺基酸或胺基酸殘基有變異。
於本發明之某態樣中,SPINK2變異體的胺基酸序列,係人類SPINK2的胺基酸序列(序列識別號1:圖13)之:第16的Ser~第22的Gly之中1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個胺基酸被其他胺基酸或胺基酸殘基取代;第24的Pro~第28的Asn之中1個、2個、3個、4個或5個胺基酸被其他胺基酸或胺基酸殘基取代; 無論第39的Ala及第43的Thr之中1個或2個胺基酸被其他胺基酸或胺基酸殘基取代、或為野生型,只要是在由第16的~第30的等之胺基酸殘基所構成之環形主鏈三級結構可至少部分地發揮HTRA1抑制活性的情況下,任一者皆可(該2胺基酸或胺基酸殘基包含在α螺旋中);第15的Cys、第23的Cys、第31的Cys、第42的Cys、第45的Cys及第63的Cys為要維持天然型的雙硫鍵,較佳為與野生型相同地為Cys,而為要使天然型的雙硫鍵消失、或使非天然型的雙硫鍵產生,亦可將彼等之中1個、2個、3個、4個、5個或6個取代為其他胺基酸。於本發明之SPINK2變異體中一部分之合適的HTRA1抑制肽中,係於與天然型相同的該6處Cys被維持,且雙硫鍵被保持。於相關抑制肽之中更合適的一部分之態樣中,第15的Cys-第45的Cys、第23的Cys-第42的Cys、及第31的Cys-第63的Cys係分別形成雙硫鍵。
該種SPINK2變異體所具有之胺基酸序列包含在HTRA1抑制肽的情形,較佳為包含野生型SPINK2的胺基酸序列所包含的第16的Ser至第30的Val之環狀結構、由包含第31的Cys及第32的Gly之β股(1)以及包含第57的Ile至第59的Arg之β股(2)所構成之β摺疊、包含第41的Glu胺基酸至第51的Gly之α螺旋、或由類似彼等或是至少部分地對應彼等(的位置)之環狀結構、β摺疊、α螺旋等所構成的立體結構係被維持在可發揮HTRA1抑制活性之程度。
本發明之SPINK2變異體之中,於以下針對一部分之HTRA1抑制肽所具有之胺基酸序列進行描述。如上述,於本發明中「胺基酸殘基」有時僅表示為「胺基酸」。
於序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列中,第1個至第11個Xaa(分別與X1至X11相同),只要是在與HTRA1鍵結且會阻礙HTRA1活性的情況下,若為分別為任意的胺基酸,則不特別受限定。以下,針對X1至X11之合適的胺基酸進行記載,但於彼等的胺基酸之中,係有與天然型、亦即野生型人類SPINK2的胺基酸序列中包含相同的胺基酸之情形。
第1的X1係合適為Asp、Glu、Gly、Ser或Ile,更合適為Asp或Gly,更進一步合適為Gly;第16的X2係合適為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr,更合適為Ala、Asp、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser或Thr,更進一步合適為Ala、Gly、Lys、Leu、Ser或Thr,進而更進一步合適為Ala、Gly、Leu、Ser或Thr,其上進而更進一步合適為Ala或Ser;第17的X3係合適為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr,更合適為Asp、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr,更進一步合適為Asp、His、Lys、Met或Gln,進而更進一步合適為Asp或Gln; 第18的X4係合適為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly,His、Ile、Leu、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr,更合適為Asp、Phe、His、Met、Asn、Gln、Ser或Tyr,更進一步合適為Asp、Phe、His、Ser或Tyr,進而更進一步合適為Phe或His;第19的X5係合適為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr,更合適為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Val,更進一步合適為Ala、Asp、Glu、Met或Asn,進而更進一步合適為Ala、Asp或Glu;第21的X6係合適為Ala、Glu,Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Ser,Trp或Tyr,更合適為Glu,Phe、Ile、Leu、Met、Gln、Arg或Trp,更進一步合適為Met或Trp,進而更進一步合適為Met;第24的X7係合適為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr,Val、Trp或Tyr,更合適為Asp、Glu、His、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr,更進一步合適為Gln、Trp、Tyr或Val,進而更進一步合適為Tyr或Val;第26的X8係合適為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val或Tyr,更合適為Ala、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Val或Tyr,更進一步合適為Phe、Leu或Tyr,進而更進一步合適為Phe或Leu; 第27的X9係合適為Glu、Phe、Leu、Ser、Thr或Tyr,更合適為Phe、Leu、Ser、Thr或Tyr,更進一步合適為Phe或Tyr,進而更進一步合適為Tyr;第39的X10係合適為Ala、Glu、Met或Val,更合適為Ala或Glu;第43的X11係合適為Ala、Thr或Val,更合適為Thr或Val。
而且,野生型的X1至X11係分別為Asp、Ser、Gln、Tyr、Arg、Pro、Pro、His、Phe、Ala及Thr。又,第20的是Leu,第22的是Gly,第25的是Arg,第28的是Asn。
於本發明中,亦可於第1的胺基酸的N末端側進一步附加有1個至數個或其以上的胺基酸,就該種被附加的胺基酸而言,可舉出例如包含Ser-Leu、S標記及連接子的胺基酸序列(序列識別號31:圖43)等。
再者,亦可於位於C末端之第63的Cys附加有1至數個胺基酸,可舉出例如C末端為第64的Gly之胺基酸序列、加上Gly-Gly而C末端為第65的Gly之胺基酸序列等。就該種被附加的胺基酸而言,可舉出例如Gly-Gly、C末端6聚物(序列識別號32:圖44)等。
作為其他胺基酸被附加於序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列或自序列識別號30衍生之胺基酸序列的N末端及/或C末端而成的胺基酸序列,而藉由序列識別號3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23至29(圖15、17、19、21、23、25、27、29、31、33 及35至41)以及序列識別號4、6、8、10、12、14、16、18、20及22(圖16、18、20、22、24、26、28、30、32及34)之任一者表示的核苷酸序列所編碼之胺基酸序列、與序列識別號24、28及29(圖36、40及41),係分別被包含在更合適的態樣中與更進一步合適的態樣中。
於本發明中,有時會將於SPINK2變異體肽或SPINK2變異體肽之N末端及/或C末端加成物(以下稱為「母肽」)中有1個或2個以上的胺基酸被取代、附加及/或缺失而成的肽稱為「母肽的衍生物」或「母肽衍生物」(例如實施例6)。相關「衍生物」亦包含在本發明之「肽」的範圍中。
於本發明之抑制肽的範圍所包含的SPINK2變異體所具有之胺基酸序列中,可於X1至X11以外的部分,亦即野生型人類SPINK2的胺基酸序列(序列識別號1:圖13)中之第2的Pro~第15的Cys、第20的Pro、第22的Gly、第23的Cys、第25的Arg、第28的Asn~第38的Tyr、第41的Glu、第42的Cys及第44的Thr~第63的Cys的位置包含天然型的胺基酸或是經變異之胺基酸或胺基酸序列。例如SPINK2變異體,只要是在至少不會部分地妨礙或干涉HTRA1抑制活性或折疊的情況下,可於1個或2個以上的位置上變異。該種變異,係藉由使用該專業人員公知的具代表性之方法而可完成。就胺基酸序列中之典型的變異而言,可舉出1個或2個以上之胺基酸的取代、缺失或附加,就取代而言,可例示保存性取代。藉由保存性取代,而某個胺基酸殘 基會被不僅是大小類似,關於極性方面亦為化學性特徵類似的胺基酸殘基取代。保存性取代之例係被記載於本說明書的其他部分。在另一方面,X1至X11以外的部分,只要是在至少不會部分地妨礙或干涉HTRA1抑制活性或折疊的情況下,也可容許1個或2個以上的胺基酸的非保存性取代。
作為本發明之抑制肽的SPINK2變異體所具有之胺基酸序列,係X1至X11合適為序列識別號序列識別號3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23至29(圖15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35至41)的,更合適為序列識別號24、28及29(圖36、40及41)之任一者中的X1至X11的各胺基酸,且X1至X11以外的部分可具有至少不會部分地妨礙或干涉HTRA1抑制活性或折疊的胺基酸或胺基酸序列。
又,就作為本發明之HTRA1抑制肽的SPINK2變異體的胺基酸序列之例而言,可分別舉出以下的(a)至(e)之任一者所記載的胺基酸序列:(a)序列識別號3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23至29(圖15、17、19、21、23、25、25、29、31、33、35至41)之任一者所表示的胺基酸序列;(b)與編碼(a)所記載的胺基酸序列之核苷酸序列為互補之核苷酸序列在嚴苛條件下會進行雜交,且藉由編碼具有HTRA1抑制活性的肽所包含的胺基酸序列之核苷酸序列而被編碼的胺基酸序列; (c)於(a)所記載的胺基酸序列中1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或是2個、或1個胺基酸取代、缺失、附加及/或插入而成,且具有HTRA1抑制活性的肽所包含的胺基酸序列;(d)與(a)所記載的胺基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%以上相同,且具有HTRA1抑制活性的肽所包含的胺基酸序列;及(e)藉由序列識別號4、6、8、10、12、14、16、18、20及22(圖16、18、20、22、24、26、28、30、32及34)之任一者所表示的核苷酸序列而被編碼的胺基酸序列。
然而,編碼HTRA1抑制肽的核酸分子,並不受限於(a)至(e),具有HTRA1抑制活性之SPINK2變異體所包含的胺基酸序列,合適為包含編碼序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列之核苷酸序列的核酸分子,係被普遍地包含在編碼HTRA1抑制肽之核酸分子的範圍中。
可對本發明之抑制肽,以改善其折疊安定性、熱安定性、保存安定性、血中半衰期、水溶性、生物活性、藥理活性、附加的作用等之目的而導入變異。例如可為使結合於聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、生物素、肽或蛋白質等之其他物質,而藉由變異來導入如Cys之新的反應性基。於本發明中,HTRA1抑制肽亦可附加、連結或鍵結於其他部分,且將該種複合體總稱為「HTRA1抑制肽的複合體」。於本發明中「複合體」 係意指於本發明的肽或其片段有其他部分附加、連結或鍵結而成的分子。「結合(conjugate)」或「接合(conjugation)」係包含下述形態:某部分透過交聯劑等之化學物質,而透過適於將某部分連結至胺基酸的側鏈的作用物質等,於本發明之肽的N末端及/或C末端藉由合成化學之手法、或基因工程之手法等,而被連結或鍵結於本發明之肽。對該種「部分」來說,作為會改善血中半衰期者,而可例示聚乙二醇(PEG)等之聚烯烴基二醇分子、羥乙基澱粉、棕櫚酸等之脂肪酸分子、免疫球蛋白的Fc區、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、白蛋白或其片段、白蛋白結合肽、鏈球菌蛋白質G等之白蛋白結合蛋白質、運鐵蛋白。就其他的「部分」而言,相關「部分」係透過肽連接子等之連接子而本發明的肽可被連結。
又,於本發明之HTRA1抑制肽,亦可為發揮或加強藥理活性,而結合有其他藥物。於抗體領域中作為抗體-藥物複合體(antibody-drug conjugate:ADC)而該專業人員公知的技術或態樣,係藉由將抗體取代為本發明之肽,而成為本發明之一部分的態樣。
本發明之HTRA1抑制肽亦可進一步包含會發揮對於HTRA1以外的標的分子之鍵結親和性、抑制活性、拮抗活性、作動活性等的1個或2個以上的部分;或被結合於該種部分。就相關「部分」而言,可例示抗體或其片段、具有如SPINK2變異體之抗體以外的骨架的蛋白質或其片段。作為於抗體領域中多重專一性的抗 體及二重專一性的抗體(multispecific antibody、bispecific antibody)而該專業人員公知的技術或態樣,係藉由將彼等所包含的2個以上之「抗體」之中至少1個取代為本發明的肽,而成為本發明之複合體之一部分的態樣。
本發明的肽或其前驅物可包含訊息序列。存在或被附加於某多肽或是其前驅物之N末端的訊息序列,係有用於為將該多肽送達細胞之特定的區域,例如若是大腸菌則為周質,若是真核細胞則為內質網,對於該專業人員有許多的訊息序列為公知,可因應宿主細胞來選擇。就於大腸菌的周質中使所欲之肽分泌的訊息序列而言,可例示OmpA。包含訊息序列之形態亦作為其一部分之態樣而被包含在於本發明之複合體中。
又,可藉由預先使標記附加於本發明的肽,而可利用親和性層析法來純化該肽。本發明的肽係例如可於其C末端包含生物素、Strep標記(商標)、Strep標記II(商標)、His6等之寡組胺酸(oligohistidine)、多組胺酸(polyhistidine)、免疫球蛋白域、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein)、麩胺基硫轉移酶(GST)、攜鈣素結合肽(CBP)、長葉毛地黃配質或二硝基酚等之不完全抗原、FLAG(商標)等之抗原決定位標記、myc標記、HA標記等(以下統稱為「親和性標記」)。標記加成物亦可作為其一部分之態樣而被包含在本發明之複合體中。本發明之複合體亦可作為整體而為肽(多肽)。
本發明的肽可包含用於標示的部分,具體而言可結合酵素標示、放射性標示、著色標示、螢光標示、顯色標示、發光標示、不完全抗原、長葉毛地黃配質、生物素、金屬複合體、金屬、膠態金等之標示部分。包含用於標示的部分之態樣亦可作為其一部分之態樣而包含在本發明之複合體中。
本發明之抑制肽可於其肽部分包含天然胺基酸及非天然胺基酸之任一者,就天然胺基酸而言,可包含L-胺基酸及D-胺基酸之任一者。
對本發明之抑制肽的胺基酸序列來說,可包含天然胺基酸及非天然胺基酸,就天然胺基酸而言,可包含L-胺基酸及D-胺基酸之任一者。
本發明之抑制肽可作為單體、二聚體、三聚體以上之寡聚體或多聚體而存在。二聚體、三聚體以上之寡聚體及多聚體可為由單一單體所構成的均質、及由2個以上之不同的單體所構成的異質之任一者。單體係有例如會迅速地擴散且對組織的滲透優異之情形。二聚體、寡聚體及多聚體,係例如具有於局部對標的分子之高親和性或是鍵結活性、或具有慢的解離速度,或可具有會顯示高的HTRA1抑制活性等之優異的側面。除自發性的二聚體化、寡聚體化及多聚體化以外,刻意進行的二聚體化、寡聚體化及多聚體化,亦可藉由將jun-fos域、白胺酸拉鍊等導入本發明之抑制肽而可完成。
本發明之抑制肽能夠以單體、二聚體、三聚體以上的寡聚體或多聚體來鍵結於1個或2個以上之標的分子、或會阻礙標的分子的活性。
就本發明之抑制肽可採取的形態而言,可舉出被單離之形態(冷凍乾燥樣品、溶液等)、上述之複合體、鍵結於其他分子之形態(被固相化之形態、與異分子之集合體、與標的分子鍵結之形態等)等,但並不受限於彼等,且可任意地選擇適合表現、純化、使用、保存等之形態。
HTRA1抑制肽,係能以SPINK2的胺基酸序列或本發明之HTRA1抑制肽所具有之胺基酸序列(例如選自包含序列識別號3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23至29之群組、或包含圖15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35至41之群組的胺基酸序列)、編碼該胺基酸序列的核苷酸序列、包含該核苷酸序列的核酸分子等作為起始材料,而藉由該專業人員所周知的方法來進行鑑定。作為合適的一例,可自人類SPINK2變異體庫(mutant library),以HTRA1抑制活性作為指標來進行鑑定,亦可將HTRA1鍵結活性也作為指標而進行組合。
例如,作為起始材料的核酸分子,係供作變異誘發,且可使用重組DNA技術而被導入恰當的細菌宿主或真核性宿主。SPINK2變異體庫係作為用以鑑定標的分子之黏合劑或抑制劑的技術而為公知,例如,WO2012/105616公報中的揭示亦藉由參照其整體,而包含在本發明之揭示開示中。可於恰當的宿主中使被供作變異誘發之核苷酸序列表現之後,將具有所欲之性質、 活性、機能等的SPINK2變異體與其基因特質(genetic trait)鏈結而成的純系(clone),從前述的庫來濃縮及/或選拔,且進行鑑定。對純系的濃縮及/或選拔來說,可藉由使用細菌表現法(Francisco,J.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:10444-10448)、酵母表現法(Boder,E.T.,et al.,Nat.Biotechnol.,1997,15:553-557)、哺乳動物細胞表現法(Ho M,et al.,Methods Mol Biol.,2009,525:337-52)、噬菌體表現法(Smith,G.P.,Science.,1985,228:1315-1317)、核醣體表現法(Mattheakis LC,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1994,91(19):9022-9029)、mRNA表現等之核酸表現法(Nemoto N,et al.,FEBS Lett.,1997,414(2):405-408)、菌落篩選法(Pini,A.et al.,Comb.Chem.High Throughput Screen,2002,5:503-510)等該專業人員公知的方法,決定所選拔、鑑定之純系所包含的SPINK2變異體之核苷酸序列,以決定藉由該核苷酸序列所編碼之胺基酸序列,來作為該純系所包含的SPINK2變異體亦即HTRA1抑制肽所具有之胺基酸序列。
本發明之SPINK2變異體,係例如可藉由對於天然型的SPINK2誘發變異而獲得。「變異的誘發」係意指使存在某胺基酸序列的各位置之1個或2個以上的胺基酸取代為其他胺基酸或是缺失,或可以附加或是插入於該胺基酸序列中並不存在的胺基酸的方式進行。藉由相關缺失或附加或是插入,而序列長可能改變。於本發明之SPINK2變異體中,變異的誘發係合適為可在序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列中的X1至X11之1個或2個以上的位置上發生。
但是,若是於該種合適的變異的誘發之後,在X1至X11之1個或2個以上的位置上,與天然型之胺基酸,亦即與存在天然型的胺基酸序列中之特定的位置的相同之胺基酸被維持者亦作為整體而至少1個胺基酸有變異,就包含在變異體的範圍中。同樣地,於本發明之某態樣中,若是在X1至X11以外的部分之1個以上的位置上誘發變異之後,於該位置上與天然型之胺基酸,亦即與存在天然型的胺基酸序列中之特定的位置的相同之胺基酸被維持者,亦作為整體而至少1個胺基酸有變異,就包含在變異體的範圍中。
「隨機變異的誘發」係意指關於序列上之特定的位置,1個或2個以上之不同的胺基酸藉由變異的誘發,而以一定的確率導入該位置,但至少2個不同的胺基酸被導入之確率亦可不完全相同。又,於本發明中,並非妨礙於至少2個不同的胺基酸包含天然型之胺基酸(1種)者,且該種情形亦包含在「隨機變異的誘發」之範圍中。
就在特定的位置誘發隨機變異之方法而言,可使用該專業人員公知的標準的方法。例如,可在序列中之特定的位置,藉由使用包含退化性核苷酸(degenerate nucleotide)組成物的合成寡核苷酸之混合物的PCR(polymerase chain reaction)來誘發變異。例如,相對於若使用密碼子NNK或NNS(N=腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸嘧啶;K=鳥嘌呤或胸嘧啶;S=腺嘌呤或胞嘧啶),則除天然胺基酸20種全部以外,會有終止密碼子被導入 之變異被誘發,而若使用密碼子VVS(V=腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶),則無Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr及Val被導入的可能性,會有剩餘12個天然胺基酸之導入的變異被誘發。又,例如,若使用密碼子NMS(M=腺嘌呤或胞嘧啶),則無Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp及Val被導入的可能性,會有剩餘11個天然胺基酸之導入的變異被誘發。可為誘發非天然胺基酸之導入的變異,而使用特殊的密碼子、人造的密碼子等。
部位專一性的變異誘發也可利用含高階結構之標的及/或對該標的之肽或是肽來自的野生型肽之結構資訊來進行。於本發明中可利用結構資訊來導入部位專一性的變異,該結構資訊係包含標的之HTRA1及/或對標的之SPINK2變異體或是野生型SPINK2的、或二者之複合體的高階資訊。例如,有可鑑定具有HTRA1抑制活性的SPINK2變異體,接著取得HTRA1及該SPINK2變異體之複合體的結晶而進行X射線晶體結構分析,找到結構資訊與HTRA1抑制活性之關聯的情形,而該結構資訊係根據其解析結果,透過特定該SPINK2變異體所鍵結之HTRA1分子上的部位及有關與該部位之相互作用的該SPINK2變異體中之胺基酸殘基等而可獲得。可根據該種結構活性關聯,而設計在特定的位置上對特定的胺基酸的取代、特定的位置上的胺基酸的插入或缺失等,實際地確認HTRA1活性。
又,例如可使用肌苷等之鹼基對的特異性被改質的核苷酸構成單元,而誘發變異。
再者,例如藉由使用Taq DNA聚合酶等之欠缺校正機能且錯誤率高的DNA聚合酶的易錯PCR(error-prone PCR)法、化學變異誘發等,而能夠進行對隨機之位置的變異誘發。
HTRA1抑制肽可利用細菌表現、酵母表現、哺乳細胞表現、噬菌體表現、核醣體表現、核酸表現、菌落篩選等,而從噬菌體庫、菌落庫等適於各個篩選方法之該專業人員公知的庫來濃縮及/或選拔。彼等的庫之中,對噬菌體庫來說可藉由噬菌體質體(phagemid)、對菌落篩選來說可藉由黏接質體等適於各個庫之該專業人員公知的載體及方法來構築。其相關載體亦可為會感染原核細胞或真核細胞的病毒或病毒性載體。彼等的重組載體可藉由基因操作等該專業人員公知的方法來調製。
細菌表現,係例如使大腸菌的外膜脂蛋白(Lpp)的一部分及外膜蛋白質OmpA與所欲之蛋白質融合,使大腸菌表面上呈現所欲之蛋白質的技術。若將於編碼某蛋白質所具有之胺基酸序列的核苷酸序列誘發隨機變異而可獲得之DNA群導入適於細菌表現的載體,以該載體將細菌細胞基因轉殖,則可於基因轉殖細菌細胞表面上,獲得呈現被隨機變異誘發的蛋白質群之庫(Francisco,J.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:10444-10448)。
酵母表現,係於位於酵母的細胞表面之外殼的α-凝集素等之蛋白質使所欲之蛋白質融合,於酵母表面上使其呈現之技術。對α-凝集素來說,係包含推測是 多醣磷脂肌醇(GPI)錨定物附著訊號的C末端疏水性區域、訊息序列、活性域、細胞壁域等,可藉由操作彼等,而於酵母的細胞表面上使所欲之蛋白質表現。若將於編碼某蛋白質所具有之胺基酸序列的核苷酸序列誘發隨機變異而可獲得之DNA群導入適於酵母表現的載體,以該載體將酵母細胞基因轉殖,則可於基因轉殖酵母細胞表面上獲得呈現被隨機變異誘發的蛋白質群之庫(Ueda,M.& Tanaka,A.,Biotechnol.Adv.,2000,18:121~、Ueda,M.& Tanaka,A.,J.Biosci.Bioeng.,2000,90:125~等)。
動物細胞表現,係例如使來自血小板的生長因子受體(PDGFR)所代表之膜蛋白質的跨膜區域與所欲之蛋白質融合,於HEK293或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等之哺乳動物細胞表面上使所欲之蛋白質呈現的技術。若將於編碼某蛋白質所具有之胺基酸序列的核苷酸序列誘發隨機變異而可獲得之DNA群導入適於動物細胞表現的載體,以該載體將動物細胞基因轉殖,則可於基因轉殖動物細胞表面上獲得呈現被隨機變異誘發的蛋白質群之庫(Ho M,et al.,Methods Mol Biol.,2009,525:337-52)。
於酵母、細菌、動物細胞等之細胞上所呈現的所欲之庫,係可在標的分子的存在下保溫、或使其與標的分子接觸。例如,將包含生物素等所修飾之HTRA1與庫的細胞進行一定時間保溫之後,添加磁珠等之載體,將細胞從載體分離,接著可藉由清洗載體來去除非專一性的吸附物及鍵結物,而回收呈現鍵結於載體(鍵結 於載體的HTRA1)之肽、肽的聚集體或被濃縮之肽聚集體的細胞群。同樣地,可於磁珠添加後進行磁性細胞分離(MACS)、或於使用抗HTRA1抗體的細胞染色後實施FACS,以回收呈現載體(鍵結於載體的HTRA1)或與HTRA1鍵結之肽、肽的聚集體或被濃縮之肽聚集體的細胞群。非專一性的吸附物部位及/或鍵結部位,係例如亦能夠進行封端(使飽和),封端步驟亦若為恰當的方法則可被納入。可將那樣進行所獲得之表現肽、肽的聚集體或被濃縮之肽聚集體的載體回收,決定被插入載體的多核苷酸所具有之核苷酸序列,決定該核苷酸序列所編碼之胺基酸序列。又,可藉由將載體再度導入宿主細胞,且將上述之操作作為循環而重複進行1次至數次,而將鍵結於標的分子的肽聚集體更高度地濃縮。
噬菌體表現的情形,例如噬菌體質體,係除質體複製起點以外還包含自單股噬菌體所誘導之第二複製起點之細菌質體。具有噬菌體質體之細胞,可於因M13或類似其的輔助噬菌體導致的重複感染中,透過單股複製模式而複製噬菌體質體。亦即,於藉由噬菌體外殼蛋白所被覆的感染性粒子之中,單股噬菌體質體DNA會被包覆。這樣進行,而可分別地於感染細菌中形成噬菌體質體DNA作為純系雙股DNA質體,從重複感染噬菌體質體之細胞的培養上清液形成噬菌體質體作為噬菌體狀的粒子。可為使具有F型性線毛的細菌感染相關DNA而將噬菌體狀的該粒子注入該細菌中,藉此而將粒子本身再形成作為質體。
若將包含具有編碼受檢肽的胺基酸序列之核苷酸序列的多核苷酸及噬菌體外殼蛋白(coat protein)基因所構成的融合基因插入該噬菌體質體,使細菌感染,且將該細胞進行培養,則會使相關肽於該細菌上或噬菌體樣粒子上表現或是呈現(與表現同義)、或可作為與該外殼蛋白之融合蛋白質而於噬菌體粒子中或是該細菌的培養上清液中產生。
例如,若將包含該多核苷酸及噬菌體外殼蛋白基因gpIII所構成的融合基因插入噬菌體質體,與M13或類似其的輔助噬菌體一起使大腸菌重複感染,則可於該大腸菌的培養上清液中使作為包含該肽及該外殼蛋白所構成的融合蛋白質產生。
取代噬菌體質體,而使用環狀或非環狀的各種載體,例如病毒載體之情形,可按照該專業人員公知的方法,使具有藉由被插入該載體的該多核苷酸所具有之核苷酸序列而被編碼的胺基酸序列之肽,於該載體被導入之細胞或是病毒樣粒子上表現或呈現、或於該細胞的培養上清液中產生。
可將那樣進行而能獲得的表現肽之庫,在標的分子的存在下保溫、或使其與標的分子接觸。例如,可將HTRA1被固相化之載體與包含庫之移動相一定時間保溫之後,將移動相由載體分離,接著清洗載體,藉此而去除非專一性的吸附物及鍵結物,將鍵結於載體(鍵結於載體的HTRA1)之肽、肽的聚集體或被濃縮之肽聚集體藉由洗提來進行回收。洗提係可在相對為高離子強 度、低pH、中程度之變性條件、離液鹽(chaotropic salt)的存在下等,非有選擇性地進行;或藉由使與添加HTRA1等之可溶性的標的分子、鍵結於標的分子之抗體、天然的配位體、基質等而被固相化之標的分子競爭,而有選擇性地進行。非專一性的吸附物部位及/或鍵結部位,係例如亦能夠進行封端處理,封端步驟亦若為恰當的方法即可被納入。
可將那樣進行所獲得之表現肽、肽的聚集體或被濃縮之肽聚集體的載體回收,決定被插入載體的多核苷酸所具有之核苷酸序列,決定該核苷酸序列所編碼之胺基酸序列。又,可藉由將載體再度導入宿主細胞,且將上述之操作作為循環而重複進行1次至數次,而將鍵結於標的分子的肽聚集體更高度地濃縮。
核醣體表現,係例如使用不具終止密碼子之編碼所欲之蛋白質的mRNA與無細胞蛋白質合成系,藉以在試驗管內合成連結所欲之蛋白質與對應其之mRNA、及核醣體之分子的技術。可利用於編碼某蛋白質所具有之胺基酸序列的核苷酸序列誘發隨機變異而可獲得之mRNA群與無細胞蛋白質合成系,藉以得到被隨機變異誘發之蛋白質群於核醣體上呈現之庫(Mattheakis LC,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1994,91(19),9022-9029)。
核酸表現亦被稱為mRNA表現,例如,使用於酪胺醯基tRNA的3’末端具有類似的結構的嘌呤黴素等之連接子,藉以合成連結所欲之蛋白質、編碼其之 mRNA及核醣體之分子的技術。由於該技術不是利用活細胞,而是利用無細胞蛋白質合成系,而夠在試驗管內進行合成。可利用於編碼某蛋白質所具有之胺基酸序列的核苷酸序列誘發隨機變異而可獲得之mRNA群與嘌呤黴素等之連接子、及無細胞蛋白質合成系,藉以得到被隨機變異誘發之蛋白質群於核醣體上呈現之庫(Nemoto N,et al.,FEBS Lett.,1997,414(2):405-408)。
透過核醣體表現或核酸表現等之無細胞合成系而可獲得之表現肽之庫,係可在標的分子的存在下保溫、或使其與標的分子接觸。例如,可將HTRA1被固相化之載體與包含庫之移動相一定時間保溫之後,將移動相由載體分離,接著清洗載體,藉此而去除非專一性的吸附物及鍵結物,將鍵結於載體(鍵結於載體的HTRA1)之肽、肽的聚集體或被濃縮之肽聚集體藉由洗提來進行回收。洗提係可在相對為高離子強度、低pH、中程度之變性條件、離液鹽的存在下等,非有選擇性地進行;或藉由使與添加HTRA1等之可溶性的標的分子、鍵結於標的分子之抗體、天然的配位體、基質等而被固相化之標的分子競爭,而有選擇性地進行。非專一性的吸附物部位及/或鍵結部位,係例如亦能夠進行封端處理,封端步驟也若有恰當的方法則可被納入。
將那樣進行所獲得之表現肽、肽的聚集體或被濃縮之肽聚集體的核酸回收,mRNA的情形可於反轉錄反應成為cDNA後決定核苷酸序列,決定該核苷酸序列所編碼之胺基酸序列。又,可藉由從回收之核酸轉錄 mRNA,且將上述之操作作為循環而重複進行1次至數次,而將鍵結於標的分子的肽聚集體更高度地濃縮。
若預先使親和性標記結合於肽、肽之聚集體或被濃縮之肽聚集體,則可有效率地純化該肽或彼等的聚集體。例如,若使蛋白酶的基質作為標記而預先結合於肽聚集體,則可藉由利用該蛋白酶活性來進行切斷,而洗提肽。
亦能根據所獲得之序列資訊及肽的機能等,於所獲得之純系或庫誘發進一步的變異,從被導入變異之庫取得其機能(例如HTRA1抑制活性)、物性(熱安定性、保存安定性等)、體內動態(分布、血中半衰期)等被改善之肽。
可藉由決定所獲得之肽是否具有HTRA1抑制活性,而鑑定HTRA1抑制肽。
又,HTRA1抑制肽係合適為包含野生型SPINK2的胺基酸序列所包含的第16的Ser至第30的Val之環狀結構、由包含第31的Cys及第32的Gly之β股(1)以及包含第57的Ile至第59的Arg之β股(2)所構成之β摺疊、以及包含第41的Glu胺基酸至第51的Gly之α螺旋、或由類似彼等或是至少部分地對應彼等(的位置)之環狀結構、β摺疊、α螺旋等所構成的立體結構係能夠被維持在可發揮HTRA1抑制活性之程度。亦能將相關立體結構(整體之結構或部分結構)作為指標的一部分,而鑑定更合適的HTRA1抑制肽。
本發明亦提供包含編碼HTRA1抑制肽所包含的胺基酸序列之核苷酸序列的多核苷酸(以下稱為「編碼HTRA1抑制肽的核酸分子」)、插入該基因的重組載體、導入該基因或是載體的細胞(以下稱為「含有編碼HTRA1抑制肽的核酸分子之細胞」)、或產生HTRA1抑制肽的細胞(以下稱為「HTRA1抑制肽產生細胞」)。
作為本發明之編碼HTRA1抑制肽的核酸分子的一部分之合適的例子,可舉出包含以下的(a)至(e)之任一者所記載之核苷酸序列(以下稱為「HTRA1抑制肽的核苷酸序列」)而成、或包含含抗體基因序列之核苷酸序列、或包含抗體基因序列者:(a)編碼序列識別號3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23至29(圖15、17、19、21、23、25、25、29、31、33、35至41)之任一者所表示的胺基酸序列之核苷酸序列;(b)序列識別號4、6、8、10、12、14、16、18、20及22(圖16、18、20、22、24、26、28、30、32及34)之任一者所表示的核苷酸序列;(c)與(a)或(b)所記載之核苷酸序列為互補之核苷酸序列在嚴苛條件下會進行雜交,且編碼具有HTRA1抑制活性的肽所包含的胺基酸序列之核苷酸序列;(d)於(a)或(b)所記載之核苷酸序列中1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1 至4個、1至3個、1或是2個、或1個核苷酸或核苷酸殘基取代、缺失、附加及/或插入而成,且編碼具有HTRA1抑制活性的肽所包含的胺基酸序列之核苷酸序列;及(e)與(a)或(b)所記載之核苷酸序列60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%以上相同,且編碼具有HTRA1抑制活性的肽所包含的胺基酸序列之核苷酸序列。
然而,編碼HTRA1抑制肽的核酸分子並不受限於(a)至(e),具有HTRA1抑制活性之SPINK2變異體所包含的胺基酸序列,合適為包含編碼序列識別號30(圖42)所表示的胺基酸序列之核苷酸序列的核酸分子,係被普遍地包含在編碼HTRA1抑制肽的核酸分子的範圍中。
要設計編碼胺基酸序列之核苷酸序列,可使用1種或2種以上的對應於各胺基酸之密碼子。因此,編碼某肽所具有之單一的胺基酸序列之鹼基序列可具有複數的變化。於相關密碼子的選擇之際,可因應導入包含該核苷酸序列之多核苷酸或包含其之載體的表現用之宿主細胞的密碼子使用(codon usage)而適當選擇密碼子、或適當調節複數之密碼子的使用之頻率或是比例。例如,使用大腸菌作為宿主細胞的情形,亦可於大腸菌中使用使用頻率高的密碼子來設計核苷酸序列。
編碼HTRA1抑制肽的核酸分子亦可被機能性地連結於1個或2個以上的調控序列。「被機能性地連結」係意指可使被連結的核酸分子表現、或使該分子所包含的核苷酸序列能夠表現。調控序列係包含序列元 件,該序列元件包含有關於轉錄調控及/或轉譯調控之資訊。調控序列係按照種而為各式各樣,但一般包含啟動子,包含原核生物的-35/-10匣及SD序列(Shine-Dalgarno sequence)、真核生物的TATA匣、CAAT序列、及5’端帽序列(capping sequence)等所例示之涉及轉錄及轉譯之起始的5’非編碼序列。相關序列亦可包含強化子元件及/或抑制子元件、以及用以將天然型或成熟型之肽往宿主細胞內外之特定的區域送達之可被轉譯的訊息序列、前導序列等。再者,調控序列亦可包含3’非編碼序列,對相關序列來說,可包含涉及轉錄終止或多腺核苷酸化等的元件。但是,有關於轉錄終止的序列於特定的宿主細胞中不會充分地發揮作用的情形,可被適於該細胞的序列所取代。
就啟動子序列而言,在原核生物可例示tet啟動子、lacUV5啟動子、T7啟動子等,在真核細胞可例示SV40啟動子、CMV啟動子等。
編碼HTRA1抑制肽的核酸分子可為被單離的形態、被包含在載體或是其他選殖載體(cloning vehicle)(以下僅稱為「載體」:質體、噬菌體質體、噬菌體、桿狀病毒、黏接質體等)中或染色體中的形態,但不限定於彼等之形態。對載體來說,除HTRA1抑制肽的核苷酸序列及上述調控序列以外,亦可包含適於被使用於表現的宿主細胞之複製序列及控制序列、以及會賦予能夠選擇藉由基因轉殖等而導入核酸分子之細胞的表現型之選擇標記。
編碼HTRA1抑制肽的核酸分子、包含HTRA1抑制肽的核苷酸序列之載體,可藉由基因轉殖等之該專業人員公知的方法,而導入能夠表現該肽又核苷酸序列的宿主細胞。導入該核酸分子或載體的宿主細胞,係可在適於該肽或核苷酸序列的表現之條件下培養。宿主細胞可為原核及真核之任一者,在原核可例示大腸菌、枯草菌等,在真核可例示釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等之酵母、SF9、High5等之昆蟲細胞、HeLa細胞、CHO細胞、COS細胞、NS0等之動物細胞。可藉由使用真核細胞等作為宿主細胞,而對表現之本發明的肽施加所欲之轉譯後修飾。就轉譯後修飾而言,可例示糖鏈等之官能基附加、肽或蛋白質的附加、胺基酸之化學性質的改變等。又,亦能夠人為地施加對本發明之肽之所欲的修飾。該種肽的改質物亦包含在本發明之「肽」的範圍中。
本發明亦包含HTRA1抑制肽的製造方法。對該方法來說,係包含步驟1,其係將導入編碼HTRA1抑制肽的核酸分子或是包含HTRA1抑制肽的核苷酸序列之載體的宿主細胞或會表現HTRA1抑制肽的細胞進行培養;及/或步驟2,其係自在步驟1所獲得之培養物回收HTRA1抑制肽。對步驟2來說,可應用該專業人員公知的分餾、層析法、純化等之操作,能夠應用例如後述之利用本發明之抗體的親和性純化。
於本發明之一部分之態樣中,HTRA1抑制肽具有分子內雙硫鍵。具有分子內雙硫鍵之肽,有較佳為 使用訊息序列等而送達具有氧化性的氧化還原環境之細胞區間的情形。氧化性環境係能夠藉由大腸菌等之革蘭氏陰性細菌的周質、革蘭氏陽性細菌的細胞外環境、真核細胞的內質網內腔等來提供,在相關環境下,可促進結構上的雙硫鍵之形成。又,亦能夠於大腸菌等之宿主細胞的細胞質中製作具有分子內雙硫鍵之肽,該情形下,肽會直接地以可溶性之被折疊的狀態獲得;或能以封入體的形態被回收,接著在活體外被復原。再者,亦可選擇具有氧化性的細胞內環境之宿主細胞,於其細胞質中製作具有分子內雙硫鍵的肽。另一方面,HTRA1抑制肽不具有分子內雙硫鍵之情形,可於具有還原性的氧化還原環境之細胞區間,例如於革蘭氏陰性細菌的細胞質中製作。
本發明之HTRA1抑制肽,係藉由利用Merrifield等人的肽固相合成法、以及三級丁氧羰基(t-Butoxycarbonyl:Boc)或9-芴甲氧羰基(9-Fluorenylmethoxycarbonyl:Fmoc)等之有機合成化學的肽合成法,亦可藉由所例示的化學合成、活體外轉譯等之其他該專業人員公知的方法來製造。
本發明係作為其一部分之態樣,而提供會鍵結具有HTRA1抑制活性的SPINK2變異體肽之抗體及其功能片段。抗體可為多株抗體及單株抗體之任一者,就單株抗體而言,若為免疫球蛋白或來自其者,則不特別受限定。抗體之功能片段,係於具有抗原鍵結活性,亦即具有對該SPINK2變異體肽的鍵結活性之範圍內並無 限定,亦包含重鏈及輕鏈的二者或是其中一者或其片段、欠缺恒定區或Fc區者、與其他蛋白質或標示用物質之複合體等。相關抗體及其功能片段可藉由該專業人員公知的方法來調製,且對於該SPINK2變異體肽之利用親和性層析法的純化、包含該肽的醫藥組成物或與其用途相關的臨床檢查、診斷等中之該肽的檢測、免疫分析法等有用。本發明之抗體可藉由使用該抗體所鍵結之本發明之肽的親和性層析法來進行純化。
本發明亦提供包含HTRA1抑制肽、或其複合體之醫藥組成物。
本發明之HTRA1抑制肽或其複合體醫藥組成物係對於下述疾病的治療及/或預防有用,該疾病係因HTRA1而被誘發或惡化,且可藉由阻礙或抑制HTRA1的表現或機能而可進行相關誘發或惡化的抑制、治癒、症狀的維持或是改善、續發性疾病的回避等之各種疾病(以下稱為「HTRA1關連疾病」或「HTRA1相關疾病」)。對HTRA1關連疾病來說,亦包含藉由視網膜保護效果而可進行誘發或惡化的抑制、治癒、症狀的維持或是改善、續發性疾病的回避等之各種疾病。HTRA1抑制肽具有網膜保護效果,且對於HTRA1關連疾病的治療及/或預防有用。
就HTRA1關連疾病而言,可舉出例如老年性黃斑部變性症、早產兒視網膜病變、息肉狀脈絡膜血管病變、類風濕性關節炎、或骨關節炎等,就老年性黃斑 部變性症而言,可舉出滲出型老年性黃斑部變性症、萎縮型老年性黃斑部變性症、地圖狀萎縮等,但並不受限於彼等。又,本發明之醫藥組成物亦可被使用作為視細胞保護劑、視網膜保護劑等(統稱為「視網膜保護劑」)。
老年性黃斑部變性症分為滲出型及萎縮型。滲出型進一步被分類為典型老年性黃斑部變性症(典型AMD)、息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)、視網膜血管瘤狀增殖(RAP)。對於滲出型係存有抗VEGF藥或光動力療法(PDT)等之治療法,但並不一定充分,而對於萎縮型則僅止於進行飲食習慣的改善或根據老年性眼病研究(Age-Related Eye Disease Study,AREDS)之保健食品攝取。
本發明之醫藥組成物可用於老年性黃斑部變性症的治療或預防係由下述所示:例如,藉由於大鼠的光照射視網膜損傷模型中,於光照射前或後,分別投予本發明之HTRA1抑制肽,而相對於在對照群係外顆粒層所含之核的數量減少,在投予組則抑制外顆粒層所含之核的數量之減少(實施例5、10及14);或者於藉由高脂肪食物及氫醌的攝食所製作之兔視網膜損傷模型(後述)中,藉由投予本發明之HTRA1抑制肽,而相對於在對照群係視網膜色素上皮細胞(RPE細胞)的面積或具有一定以上之細胞面積的RPE細胞數增加,在投予組則相關增加被抑制(實施例11)。兔視網膜損傷模型係加上人類萎縮型老年性黃斑部變性症的風險因子,所以作為萎縮型老年性黃斑部變性症之模型而特別優異。
於使用視網膜色素上皮細胞(RPE)細胞之VEGF mRNA誘導試驗中投予HTRA1抑制肽時,有認識到VEGF mRNA的表現抑制(實施例12)。除來自視網膜色素上皮細胞之VEGF誘導涉及滲出型老年性黃斑部變性病態形成(Klettner A.et al.,Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2009,247:1487-1492)以外,認為彼等之病理的VEGF誘導也涉及病態的維持,顯示本發明之HTRA1抑制肽對於萎縮型老年性黃斑部變性症以及滲出型老年性黃斑部變性症的治療及預防有用。
於人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)的游走試驗中投予HTRA1抑制肽時,有認識到游走之抑制(實施例13),因此顯示對於以血管新生為特徵之滲出型老年性黃斑部變性症的治療及預防有用。
滲出型老年性黃斑部變性症係進行性。而且雖可藉由抗VEGF藥之投予而暫時性地抑制病徵,但高頻率地重複復發係成為問題(Yand S,et al.,Drug Des Devel Ther.,2016,2(10):1857-67)。又,在近年,滲出型老年性黃斑部變性症病患中發生萎縮且引起視力降低係成為新問題(Berg K et al.,Acta Ophthalmologica,2017,95(8):796-802)。本發明之HTRA1抑制肽的投予,係藉由單獨或與抗VEGF藥併用,而可發揮對於此等滲出型老年性黃斑部變性症(包含息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜內血管瘤狀增殖)的治療效果。此外,藉由預防性地投予該肽,而能夠阻止或延緩病徵的復發、延緩利用抗VEGF藥之治療的開始或再開始等。再者,對於滲出型 老年性黃斑部變性症病患中之萎縮的形成也因該肽抑制性地作用,而可帶來長期性的視力上的效益。
本發明之HTRA1抑制肽,係對組織的滲透性優異(實施例11),對物性‧安定性、安全性、投予後的動態、生產性等亦優異,可作為有效成分而使其適合地含有於醫藥組成物中。
對本發明之醫藥組成物來說,可使其含有對治療或預防有效之量的HTRA1抑制肽或其複合體與藥學上可容許的稀釋劑、載體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或佐劑。
「對治療或預防有效之量」係意指對特定的疾病、投予形態及投予途徑會發揮治療或預防效果之量,與「藥理學上有效之量」同義。
對本發明之醫藥組成物來說,可使其含有用以使pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、該組成物或其所包含的本發明之肽、其複合體的安定性、溶解性、緩釋性、吸收性、滲透性、劑型、強度、性狀、形狀等變化、或維持、或保持的物質(以下稱為「製劑用的物質」)。就製劑用的物質而言,若為藥理學上所容許的物質,則非特別限定之物。例如,為非毒性或低毒性,係製劑用的物質所適合具備之性質。
作為製劑用的物質,可舉出例如以下之物,但並不受限於此等;甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、 磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、Tris-鹽酸(Tris-HCl)溶液等之緩衝劑、甘露醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螫合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等之錯合劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單醣類、雙醣類或葡萄糖、甘露糖或糊精等之其他碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨、安息香酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶劑、甘露醇或山梨醇等之糖醇、懸浮劑、PEG、山梨糖醇酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、三木甲胺(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨醇等之安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀、甘露醇或山梨醇等之彈性增強劑、傳輸劑、稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上之佐劑。
此等之製劑用的物質之添加量,係相對於HTRA1抑制肽的重量為0.001至1000倍,合適為0.01至100倍,更合適為0.1至10倍。
含有於脂質體中含有HTRA1抑制肽或其複合體者、HTRA1抑制肽或其複合體與脂質體鍵結而成的改質物之醫藥組成物,亦包含在本發明之醫藥組成物中。
賦形劑或載體通常為液體或固體,若為注射用的水、生理食鹽水、人工腦脊髓液、其他可用於經口 投予或非經口投予用之製劑的物質,則不特別受限定。就生理食鹽水而言,可舉出中性物、含血清白蛋白者等。
就緩衝劑而言,可例示以醫藥組成物的最終pH值成為7.0至8.5之方式所調製的Tris緩衝液、同樣地以成為4.0至5.5之方式所調製的醋酸緩衝液、同樣地以成為5.0至8.0之方式所調製的檸檬酸緩衝液、同樣地以成為5.0至8.0之方式所調製的組胺酸緩衝液等。
本發明之醫藥組成物為固體、液體、懸浮液等。可舉出冷凍乾燥製劑。對將冷凍乾燥製劑成型來說,可使用蔗糖等之賦形劑。
就本發明之醫藥組成物的投予途徑而言,可為點眼、經腸投予、局部投予及非經口投予之任一者,可舉出例如,朝結膜上的點眼、玻璃體內投予、靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。
相關醫藥組成物之組成,係可因應投予方法、HTRA1抑制肽的HTRA1鍵結親和性等來決定。對於本發明之HTRA1抑制肽的標的之HTRA1的抑制活性越強(IC50值小)、或對於HTRA1蛋白質的親和性越高(KD值低),則以越少的投予量就可發揮其藥效。
本發明之HTRA1抑制肽或其複合體的投予量,若為藥理學上有效之量則不受限定,可因應個體之種、疾病的種類、症狀、性別、年齡、慢性病、該肽的HTRA1蛋白質鍵結親和性或其生物活性、其他的要素來適當決定,但通常為0.01至1000mg/kg,合適為可將0.1 至100mg/kg於1至180日當中投予1次、或1日投予2次或是3次以上。
就醫藥組成物的形態而言,可例示注射劑(包含冷凍乾燥製劑、點滴劑)、栓劑、經鼻型吸收製劑、經皮型吸收製劑、舌下劑、膠囊、錠劑、軟膏劑、顆粒劑、噴霧劑、丸劑、散劑、懸浮劑、乳劑、點眼劑、活體植入型製劑等。
包含HTRA1抑制肽或其複合體作為有效成分的醫藥組成物,可與其他醫藥同時地或個別地投予。例如,於投予其他醫藥之後,投予包含HTRA1抑制肽或其複合體作為有效成分的醫藥組成物;或投予相關醫藥組成物之後,投予其他醫藥;或亦可將該醫藥組成物與其他醫藥同時地投予。同時地投予之情形,HTRA1抑制肽或其複合體與其他醫藥,可被單一製劑、及分別之製劑(複數之製劑)的任一者含有。
就與本發明的醫藥組成物組合而被使用之其他醫藥而言,可舉出例如抗VEGF劑、消炎劑、發炎性細胞激素中和劑、補體活性化路徑抑制劑。抗VEGF劑被分類為抗VEGF抗體、VEGF抑制劑、VEGF受體拮抗劑及可溶型VEGF受體等,包含貝伐單抗(bevacizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、阿柏西普(aflibercept)、哌加他尼(pegaptanib)、brolucizumab等。就消炎劑而言,若為為抑制眼內或關節內發炎而被可局部投予者,則不特別受限定。對發炎性細胞激素中和劑來說,有抗TNFα抗體、抗介白素-6(以下稱為「IL-6」) 抗體、抗IL-6受體抗體、可溶型TNF受體等,具體而言可舉出英利昔單抗(infliximab)、阿達莫單抗(Adalimumab)、戈利木單抗(golimumab)、培化舍珠單抗(certolizumab)、託珠單抗(tocilizumab)、依那西普(etanercept)等。就補體活性化路徑抑制劑而言,可舉出蘭帕珠單抗(lampalizumab)等。彼等係適合用於HTRA1關連疾病之治療或預防,但於HTRA1關連疾病以外的疾病之治療或預防中亦可與本發明之醫藥組成物組合。
彼等之其他醫藥亦有1個的情形,亦可投予或接受2個、3個或者其以上。將彼等統稱為本發明之醫藥組成物「與其他醫藥的併用」或「與其他醫藥的組合」,除本發明之抗體、其結合片段或是其改質物以外,包含其他醫藥、或與其他療法組合而被使用之本發明的醫藥組成物亦作為「與其他醫藥的併用」或「與其他醫藥的組合」之態樣而包含在本發明中。
本發明亦提供:老年性黃斑部變性症等HTRA1關連疾病之治療方法或預防方法,其係包含投予HTRA1抑制肽或其複合體之步驟;本發明之HTRA1抑制肽或其複合體之用途,其係用以調製該疾病之治療用或預防用醫藥組成物;用於該疾病之治療或預防的HTRA1抑制肽或其複合體之用途。本發明之HTRA1抑制肽或包含其複合體之治療用或預防用套組亦包含在本發明中。
再者,本發明亦提供:多核苷酸,其係包含編碼HTRA1肽或其複合體所具有之胺基酸序列的核苷 酸序列;包含該多核苷酸的載體;或醫藥組成物,其係包含該多核苷酸或是該載體或包含表現本發明之HTRA1抑制肽或其複合體之細胞。例如,相關多核苷酸及載體係對HTRA1關連疾病的基因治療,相關細胞係對HTRA1關連疾病的細胞治療,分別使用公知的手法而實施。又,例如,藉由將相關多核苷酸或載體導入自體細胞或異體細胞(同種細胞),來調製細胞治療用的細胞。該種多核苷酸及載體亦作為細胞治療藥調製用的組成物而包含在本發明中。然而,包含本發明之多核苷酸、載體、細胞等之醫藥組成物的態樣並不限定於上述之物。
本發明之HTRA1抑制肽或其複合體,除HTRA1蛋白酶抑制活性以外,亦可具有HTRA1鍵結活性,且可使用在作為HTRA1抑制劑探索研究之正調控的使用等之各樣的研究、HTRA1的檢測、利用該檢測的檢查及診斷、HTRA1的分離、試藥及其他的用途。於HTRA1的檢測或分離之際,本發明的肽及HTRA1之中至少其中一者可被固相化。
本發明係提供一種檢查用或診斷用組成物(以下,統稱為「診斷用組成物」),其係包含會與HTRA1鍵結之本發明的肽或其複合體。
本發明之診斷用組成物,係對於HTRA1關連疾病、HTRA1表現等之檢查或診斷有用。於本發明中對檢查或診斷來說,係包含例如,罹患風險的判定或測定、有無 罹患之判定、進行或惡化的程度之測定、藉由包含HTRA1抑制肽或其複合體之醫藥組成物的藥物治療之效果的測定或判定、藥物治療以外的治療之效果的測定或判定、復發風險之測定、有無復發之判定等,但若為檢查或診斷,就不特別受限於彼等。
本發明之診斷用組成物,係對於將要投予本發明的肽或其複合體、含彼等之組成物、含彼等之醫藥組成物之個體的鑑定有用。
對相關診斷用組成物來說,可使其含有pH緩衝劑、滲透壓調節劑、鹽類、安定劑、防腐劑、顯色劑、增敏劑、解凝劑等。
本發明亦提供:HTRA1關連疾病的檢查方法或診斷方法;本發明之肽的用途,其係用以調製該疾病之診斷用組成物;會與HTRA1鍵結之本發明的肽或其複合體之用途,其係用以檢查或診斷該疾病。包含相關本發明之肽或其複合體的檢查或診斷用套組,亦包含在本發明中。
就包含會與HTRA1鍵結之本發明的肽之檢查或診斷的方法而言,較佳為三明治酵素免疫吸附法(ELISA),能夠利用通常的酵素免疫吸附法或放射免疫分析法(RIA)、酵素免疫斑點法(ELISPOT)、點漬(dot blotting)法、歐氏擴散(Ouchterlony)法、交叉免疫電泳法(CIE)、CLIA、流動式細胞測量術等之檢測方法。以利用免疫沉澱法的方法亦能夠檢查或診斷。
又,本發明提供檢測或測定受檢樣品中之HTRA1的方法。對此等之檢測或測定方法來說,可使用本發明之診斷用組成物。使HTRA1抑制肽、或其複合體與受檢試料接觸(步驟1),接著進行測定鍵結於該肽之HTRA1之量或測定(步驟2),可藉此來檢測該試料中的HTRA1。就步驟1而言,係例如以下等:將於HTRA1抑制肽結合免疫球蛋白的Fc區者,透過蛋白質G而在磁珠上固相化,且對其添加受檢試料;就步驟2而言,可舉出例如以下等:將磁珠分離,並將與珠粒一起沉澱之可溶性蛋白質以SDS-PAGE或西方墨點法進行解析,檢測HTRA1。除來自人類或非人類動物的試料以外,亦可對本測定供與施加重組蛋白質等之人為的處理的試料。就來自生物個體的受檢試料而言,可舉出例如血液、關節液、腹水、淋巴液、腦脊髓液、肺泡灌洗液、唾液、痰、組織均質物上清液、組織切片等,但並不受限於彼等。
前述之HTRA1的檢測,不僅為活體外,亦可在活體內實施。影像診斷的情形,可利用以藥學上可容許的放射性核種或發光體所標示的HTRA1抑制肽、或其複合體。就步驟1而言,例如對受驗者投予被標示之該肽或是其複合體;就步驟2而言,可舉出例如以下等:使用正子/電腦斷層造影術(PET/CT)等之影像診斷技術而取得影像,並判定或檢查HTRA1的存在。
本發明之診斷用組成物所包含的肽或其複合體係與HTRA1鍵結,且合適為具有HTRA1專一性的鍵結活性。
鑑定本發明之醫藥組成物所被投予之個體的方法亦包含在本發明中。於相關鑑定方法中,在使用本發明之HTRA1鍵結肽來測定來自該個體之樣品中的HTRA1,且於該樣品中檢測到HTRA1、或與來自健常個體之樣品中所檢測到之HTRA1的量比較而檢測到更多的HTRA1之情形,可判定該個體為陽性。對該方法來說,可使用本發明之診斷用組成物。
又,於相關鑑定方法之合適的一態樣中,該個體係罹患HTRA1相關疾病中或有其風險。
再者,本發明之醫藥組成物,係於其一態樣中,可被投予於在相關鑑定方法中被判定為陽性的個體。
可使用對HTRA1具有專一性的鍵結活性之本發明的肽或其複合體,而從HTRA1與其他成分混合存在之試料中,專一性地分離HTRA1。HTRA1由肽的游離,可在相對為高離子強度、低pH、中程度之變性條件、離液鹽的存在下等,非有選擇性地進行,但較佳為在不使HTRA1之蛋白酶活性減弱的範圍進行。
本發明係於其某態樣中,以HTRA1抑制活性作為指標,提供HTRA1關連疾病,合適為老年性黃斑部變性症之治療藥或是預防藥、或鑑定其候補的方法。對該方法來說,可包含:步驟1,係在待測物質的存在下或非存在下(或是載具存在下)保溫HTRA1蛋白酶及基質;步驟2,係決定待測物質的存在下及非存在下之HTRA1蛋白 酶活性;及/或步驟3,係待測物質的存在下之HTRA1蛋白酶活性在與待測物質的非存在下之HTRA1蛋白酶活性比較而較小的情形,判定該待測物質為老年性黃斑部變性症之治療藥或是預防藥、或其候補。待測物質可為肽性、非肽性之任一者,就肽性而言,並不限定於SPINK2變異體,可例示抗體、具有非免疫球蛋白之蛋白質的骨架之SPINK2變異體以外的肽、HTRA1基質類似物等,就非肽性而言,可例示合成低分子化合物、核酸等,但不限定於彼等。又,上述之1個或2個以上的步驟亦可適合地包含在具有視網膜保護效果之物質或其候補的鑑定方法中。本發明亦有關於具有視網膜保護效果之物質或其候補的鑑定方法。
本發明亦提供:利用含有氫醌(Hydriguinone:以下稱為「HQ」)之高脂肪食物(Hgih Fat Diet:以下稱為「HFD」)負載的兔視網膜損傷模型、其製作方法、使用該模型的試驗方法等。
對本模型來說,若為2歲以上之白色種的兔,則可不分別雌雄地使用NZW、JW等任意者。
就HFD而言,可使其含有如0.1~2%(w/v)膽固醇、1~10%(w/v)椰子油、1~10%(w/v)花生油、1~10%(wv)大豆油、10~20%(w/v)牛脂、10~50%(w/v)豬油、1~10%(w/v)玉米油所例示的任意份量之任意油脂,但若適於該模型的製作,則不限定於彼等。
使HQ-HFD含有的HQ之量為0~4%(w/v),合適為0.5~3.5%(w/v),更合適為1.0~3.0%(w/v),更進一步合適為2.2~2.8%(w/v),最合適為2.4%(w/v)。
HQ-HFD的攝食期間為3~6個月,合適為3.5~5個月,更合適為4個月。應避免8個月以上持續攝食。
本發明之模型係與小鼠的模型(非專利文獻18、19)比較,而在眼球的尺寸、機能方面,在更接近人類的觀點上為較佳。又,在兔的模型(非專利文獻20),其製作原需要8個月,但本發明之模型能夠於更短的期間製作,而且可誘導在以往的模型並不明確之RPE細胞的肥大,而作為老年性黃斑部變性症之模型為更佳。
本發明之模型係視網膜色素上皮細胞(RPE細胞)比正常兔肥大,且已發生老年性黃斑部變性症的初期病態。另一方面,使接近以往之兔模型(非專利文獻20)的10週齡之兔於4個月中進行攝取HQ-HFD,但在視覺上並無法確認到RPE細胞肥大。
可藉由使用已發生病態之本模型,來鑑定老年性黃斑部變性症之治療藥及/或是預防藥、或視網膜保護劑。相關鑑定方法可包含:(i)在待測物質投予下及非投予下測定本模型之兔中的視網膜色素上皮細胞的肥大之步驟;及(ii)於該待測物質投予下的視網膜色素上皮細胞的肥大與非投予下比較為被抑制的情形,判定該待測物質為陽性之步驟。步驟(i)中的測定係適合為視網膜色素上皮細胞的平均面積、及/或肥大的視網膜色素上皮細胞數。
於以下的實施例中,進一步針對本發明之一部分態樣進行詳述,但本發明並不限定於彼等。
而且,於下述實施例中有關於基因操作的各操作若無特別明示的話,係藉由「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著,由Cold SpringHarbor Laboratory Press 1982年發行或1989年發行)所記載之方法及其他的該專業人員所使用之實驗文書所記載之方法進行;或於使用市售的試藥或套組之情形,係按照市售品的指示書來進行。
首先,構築以SPINK2scaffold為骨架之HTRA1抑制肽的表現載體。以各抑制肽的核苷酸序列(序列識別號4、6、8、10、12、14、16、18、20及22)與SPINK2的核苷酸序列(序列識別號2)作為模板,而藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30循環)來增幅抑制劑片段。
引子1:5’-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
引子2:5’-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCACGGACC-3’
於將所增幅的片段供與瓊脂糖凝膠電泳之後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速凝膠萃取套組(QIAquick Gel Extraction Kit)(QIAGEN)而調製DNA。將所調製之DNA片段及pET 32a(改質)使用制限酵素EcoRI(NEB)及XhoI(NEB),而以37℃處理1小時以上,於瓊脂糖凝膠電泳後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速PCR純化套組(QIAquick PCR Purification Kit)(QIAGEN)而進行純化。使用T4 DNA連接酶(NEB),而使經純化之片段以16℃進行反應過夜,藉以實施連接反應。連接溶液係添加於大腸菌JM109(TOYOBO),在冰上靜置30分鐘之後,以42℃進行45秒的熱處理,進一步在冰上靜置5分鐘,於含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT盤進行接種後,以37℃進行靜置培養過夜,藉以對大腸菌進行基因轉殖。次日,將經基因轉殖之大腸菌接菌於含0.1mg/ml胺苄青黴素的Terrific Broth培養基(Invitrogen),以37℃進行培養過夜後,使用QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(Qiagen)而回收質體(以下稱為「miniprep處理」),實施序列分析,藉以構築「pET 32a(改質)_HTRA1抑制肽」。
同樣地,以各抑制劑的序列(序列表)與SPINK2作為模板,而藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30循環)來增幅抑制劑片段。
引子3:5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
引子4:5’-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAATTTTA-3’
於將所增幅的片段供與瓊脂糖凝膠電泳之後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速凝膠萃取套組(QIAGEN)而調製DNA。將所調製之DNA片段及pET 32a(Novagen)使用制限酵素BamHI(NEB)及XhoI(NEB),而以37℃處理1小時以上,於瓊脂糖凝膠電泳後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速PCR純化套組(QIAGEN)而進行純化。使用T4 DNA連接酶(NEB),而使各個純化片段以16℃進行反應過夜,藉以實施連接反應。連接溶液係添加於大腸菌JM109(TOYOBO),在冰上靜置30分鐘之後,以42℃進行45秒的熱處理,進一步在冰上靜置5分鐘,於含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT盤進行接種後,以37℃進行靜置培養過夜,藉以將大腸菌進行基因轉殖。於將被基因轉殖之大腸菌進行培養之後,實施miniprep及序列分析,藉以構築「pET 32a_HTRA1抑制肽_Kex2」。此外,操作係依照(1-1-1)所記載之方法進行。
將在(1-1-1)構築之載體pET 32a(改質)_HTRA1抑制肽對大腸菌Origami B(DE3)(Novagen)進行基因轉殖,使用含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT培養基而以37℃進行培養後,添加IPTG(最終濃度1mM),以16℃進行培養過 夜。次日,藉由離心分離(3,000g、20分、4℃)而集菌後,使用BugBuster Master Mix(Novagen)而調製溶菌產物,使用TALON金屬親和樹脂(Clontech)而純化融合His標記(His tag)之目標蛋白質。接著,使用凝血酶Cleavage Capture Kit(Novagen)來將硫氧化還原蛋白標記(thioredoxin tag)與所欲之蛋白質切斷,使用TALON而進行純化。再者,供與膠濾層析法(Superdex75 10/300 GL)或逆相層析法(YMC-Pack ODS-AM),藉以調製HTRA1抑制肽。分別於所獲得之肽的N末端結合有包含S標記及連接子之部分(序列識別號31:圖43);於C末端取代Gly-Gly而結合有C末端6聚物(序列識別號32:圖44)。
同樣地,將在(1-1-2)構築之載體pET 32a_HTRA1抑制肽_Kex2對大腸菌Origami B(DE3)(Novagen)進行基因轉殖,使用含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT培養基而以37℃進行培養後,添加IPTG(最終濃度1mM),以16℃進行培養過夜。次日,藉由離心分離(3,000g、20分、4℃)而集菌後,使用BugBuster Master Mix(Novagen)而調製溶菌產物,使用TALON金屬親和樹脂(Clontech)而純化融合His標記之目標蛋白質。接著,使用Kex2(Saccharomyces cerevisiae:Accession CAA96143)來將硫氧化還原蛋白標記與所欲之蛋白質切斷,使用TALON而進行純化。再者,供與膠濾層析法(Superdex75 10/300 GL)或逆相層析法(YMC-Pack ODS-AM),藉以調製HTRA1抑制肽(於N末端及C末端未結合標記、連接子等)。
於圖1呈示人類/小鼠/大鼠/猴HTRA1的序列類似性。構成酵素活性域之HTRA1蛋白酶域(204Gly-364Leu)的一級序列,係於人類與猴完全一致。人類與小鼠或大鼠的HTRA1蛋白酶域序列有1殘基不同,但推測因結構上該殘基係位於酵素活性中心的相反側,並不會對酵素活性中心造成影響(圖1)。所以,HTRA1蛋白酶域並不因人類/小鼠/大鼠/猴的種而異,為相同序列,因此關於種並不明示。
以人類HTRA1(Q92743)除去N末端域及PDZ域的蛋白酶域(158Gly-373Lys)作為HTRA1(cat),而構築HTRA1(cat)表現載體。以插入人類HTRA1之質體(GeneCopoeia;GC-M0558)作為模板,而藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 45秒)×30循環)來增幅所欲之DNA片段。
引子5:5’-AAACATATGGGGCAGGAAGATCCCAACAGTTTGC-3’
引子6:5’-AAACTCGAGTTTGGCCTGTCGGTCATGGGACTC-3’
於將所增幅的片段供與瓊脂糖凝膠電泳之後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速凝膠萃取套組(QIAGEN) 而調製DNA。將所調製之DNA片段及pET 32a(Novagen)使用制限酵素NdeI(NEB)及XhoI(NEB),而以37℃處理1小時以上,於瓊脂糖凝膠電泳後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速PCR純化套組(QIAGEN)而進行純化。使用T4 DNA連接酶(NEB),而使各個純化片段以16℃進行反應過夜,藉以實施連接反應。連接溶液係添加於大腸菌JM109(TOYOBO),在冰上靜置30分鐘之後,以42℃進行45秒的熱處理,進一步在冰上靜置5分鐘,於含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT盤進行接種後,以37℃進行靜置培養過夜,藉以將大腸菌進行基因轉殖。於將被基因轉殖之大腸菌進行培養之後,實施miniprep及序列分析,藉以構築「pET 21b_HTRA1(cat)」。此外,操作係依照(1-1-1)所記載之方法進行。
經構築之pET 21b_HTRA1(cat)係對大腸菌BL21(DE3)(Novagen)進行基因轉殖,使用含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT培養基而以37℃進行培養後,添加IPTG(最終濃度1mM),以28℃進行培養過夜。於集菌後以含1mg/ml溶菌酶的磷酸緩衝液(50mM磷酸鈉,300mM氯化鈉)進行懸浮,藉由超音波粉碎而調製溶菌產物。使用TALON(Clontech)來回收所欲之融合His標記之蛋白質,藉由供與膠濾層析法(Superdex 200 10/300 GL)而將HTRA1(cat)進行純化。
以所合成之人類HTRA1(Q92743)DNA(GENEART)作為模板,而藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 90秒)×30循環)來增幅所欲之DNA片段。
引子7:5’-AAAAGAATTCGCCACCATGCAGATTCCTAGAGCCG-3’
引子8:5’-AAAACTCGAGTCAGTGGTGATGGTGGTGGTGGCCGG-3’
於將所增幅的片段供與瓊脂糖凝膠電泳之後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速凝膠萃取套組(QIAGEN)而調製DNA。將所調製之DNA片段與pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific)使用制限酵素EcoRI(NEB)及XhoI(NEB),而以37℃處理1小時以上,於瓊脂糖凝膠電泳後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速PCR純化套組(QIAGEN)而進行純化。使用T4 DNA連接酶(NEB),而使各個純化片段以16℃進行反應過夜,藉以實施連接反應。連接溶液係添加於大腸菌JM109(TOYOBO),在冰上靜置30分鐘之後,以42℃進行45秒的熱處理,進一步在冰上靜置5分鐘,於含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT盤進行接種後,以37℃進行靜置培養過夜,藉以將大腸菌進行基因轉殖。於將被基因轉殖之大腸菌進行培養之後,實施miniprep及序列分析,藉以構築「pcDNA3.1_HTRA1(full)_His」。此外,操作係依照(1-1-1)所記載之方法進行。
以在(2-2-1)構築之pcDNA3.1_HTRA1(full)_His作為模板,而藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 90秒)×30循環)來增幅片段A。
引子7
引子9:5’-CTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCGCCGGGGTCGATTTCCTC-3’
接著,藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30循環)而增幅片段B。
引子10:5’-GCGACTACAAGGACGATGACGACAAGCACCACCACCATCATCAC-3’
引子11:5’-AAAAACTCGAGCTAGTGATGATGGTGGTGGTGCTTGTCGTC-3’
以片段A及片段B作為模板,而藉由使用引子7及11、KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 90秒)×30循環)來增幅所欲之DNA片段。於將所增幅的片段供與瓊脂糖凝膠電泳之後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速凝膠萃取套組(QIAGEN)而調製DNA。將所調製之DNA片段與pcDNA3.3(ThermoFisher Scientific)作為模板之載體)使用制限酵素EcoRI(NEB)及XhoI(NEB),而以37℃處理1小時以上,於瓊脂糖凝膠電泳後,切出所欲之DNA片 段,藉由QIA快速PCR純化套組(QIAGEN)而進行純化。使用T4 DNA連接酶(NEB),而使各個純化片段以16℃進行反應過夜,藉以實施連接反應。連接溶液係添加於大腸菌JM109(TOYOBO),在冰上靜置30分鐘之後,以42℃進行45秒的熱處理,進一步在冰上靜置5分鐘,於含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT盤進行接種後,以37℃進行靜置培養過夜,藉以將大腸菌進行基因轉殖。於將被基因轉殖之大腸菌進行培養之後,實施miniprep及序列分析,藉以構築「pcDNA3.3_HTRA1(full)_FLAG_His」。此外,操作係依照(1-1-1)所記載之方法進行。
在(2-2-2)構築之pcDNA3.3_HTRA1(full)_FLAG_His係使用Polyethylenimine Max(Polysciences,Inc.)而對FreeStyle 293F(Thermo Fisher Scientific)進行轉染,於6天後回收培養上清液。藉由HisTrap excel(GE Healthcare)而回收融合His標記之蛋白質,進一步使用ANTI-FLAG M2親和性瓊脂糖凝膠(Sigma-Aldrich)以純化HTRA1(full)。
為構築HTRA1無活性變異體HTRA1(S328A)表現載體,而以在實施例(2-2-2)構築之載體「pcDNA3.3_HTRA1(full)_FLAG_His」作為模板,實施 使用下述引子及QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kits(Agilent Technologies Japan,Ltd.)的PCR法((95℃ 30秒、55℃ 1分、68℃ 7分)×18循環)。
引子21:5’-CCATCATCAACTACGGCAACGCGGGCGGACCCCTCGTGAACC-3’(序列識別號55:圖76)
引子22:5’-GGTTCACGAGGGGTCCGCCCGCGTTGCCGTAGTTGATGATGG-3’(序列識別號56:圖77)
PCR反應後,按照附屬於套組的步驟說明書,使用經DpnI處理之PCR反應液而將大腸菌JM109(TOYOBO)進行基因轉殖。於將被基因轉殖之大腸菌進行培養之後,實施miniprep及序列分析,藉以構築「pcDNA3.3_HTRA1(S328A)_FLAG_His」。此外,操作係依照(1-1-1)所記載之方法進行。
(2-2-3)按照所記載之方法,使用FreeStyle 293F使HTRA1(S328A)表現,藉由親和性純化而調製HTRA1(S328A)。
以DMSO溶解基質肽H2-Opt(Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K)(PEPTIDE INSTITUTE,INC.:序列識別號54、圖8),使其成為10mM,以測定緩衝液(Assay buffer)(50mM硼酸 鹽,150mM氯化鈉,pH8.5)進行稀釋而以終濃度10μM使用。將以測定緩衝液進行稀釋的HTRA1(HTRA1(cat)或HTRA1(full))與HTRA1抑制肽分別各混合25μL,於以37℃使進行反應20分鐘之後加入以測定緩衝液進行稀釋的基質50μL,以Enspire(PerkinElmer)測定螢光訊號(激發328nm/發射393nm)。HTRA1係終濃度100nM,HTRA1抑制肽係終濃度1.875~1,000nM,反應及測定中使用PROTEOSAVE(註冊商標)SS96F黑盤(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)。
算出各濃度中之HTRA1抑制肽的基質肽分解速度,以抑制劑濃度0nM的分解速度作為100%,而評價各HTRA1抑制肽的HTRA1(cat)及HTRA1(full)抑制活性(圖2及3)。使用GraphPad Prism(5.0版本;GraphPad Software Inc.)而算出50%抑制濃度(IC50)的結果,明白:任一之HTRA1抑制肽都低濃度且會阻礙HTRA1(cat)及HTRA1(full)酵素活性(圖2A至C及圖3)。而對照地,野生型SPINK2(wt)並未顯示HTRA1抑制活性(圖2D)。
以人類玻連蛋白作為蛋白質基質,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1抑制活性。將以測定緩衝液(50mM Tris,150mM氯化鈉,pH8.0)進行稀釋的HTRA1(cat)與各HTRA1抑制肽混合,以37℃進行1小時反應。接著,加入以測定緩衝液進行稀釋的人類玻連蛋白(BD Biosciences;354238)而以37℃使進行2小時反應,添加SDS樣品緩衝液,以99℃處理5分鐘,藉以停止酵素反應。然後,藉由SDS-PAGE及西方墨點法解析,而評價人類玻連蛋白的分解。HTRA1抑制肽的終濃度為0~25μM,HTRA1(cat)的終濃度為1μM,人類玻連蛋白的終濃度為1μM。又,在西方墨點法解析,係使用人玻連蛋白抗體(R&D Systems;MAB2349)為一次抗體,使用抗小鼠IgG,HRP-Linked Whole Ab Sheep(GE Healthcare;NA931)為二次抗體。
與(3-1)相同,即使在以人類玻連蛋白作為基質之情形,HTRA1抑制肽強烈地顯示HTRA1(cat)抑制(圖4)。
以基質肽的切斷為指標來評價對於其他蛋白酶的特異性。與(3-1)所記載之方法相同,將以測定緩衝液進行稀釋的蛋白酶與樣品(終濃度1μM)分別各混合25μL,於以37℃使進行反應20分鐘之後加入以測定緩衝液進行 稀釋的基質50μL,以Enspire(PerkinElmer)測定螢光訊號(激發380nm/發射460nm)。此外,在HTRA2活性評價係使用與實施例2相同的測定緩衝液(50mM硼酸鹽,150mM氯化鈉,pH8.5),HTRA2以外的蛋白酶活性評價中係使用測定緩衝液(50mM Tris,150mM氯化鈉,pH8.0),反應及測定中使用PROTEOSAVE(註冊商標)SS96F黑盤(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)。特異性評價中使用之蛋白酶及基質的組合係如下所述。
牛胰蛋白酶抑制活性評價;終濃度5nM胰蛋白酶(Pierce;20233)、終濃度100μM基質肽Boc-VPR-AMC螢光肽基質(R&D Systems;ES011)
牛α-胰凝乳蛋白酶抑制活性評價;終濃度10nM胰凝乳蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation;LS001434)、終濃度100μM基質肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3120-v)
人類類胰蛋白酶抑制活性評價;終濃度1nM類胰蛋白酶(Sigma-Aldrich;T7063)、終濃度100μM基質肽Boc-Phe-Ser-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3107-v)
人類凝乳酶抑制活性評價;終濃度100nM凝乳酶(Sigma-Aldrich;C8118)、終濃度100μM基質肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3120-v)
人類血纖維蛋白溶酶抑制活性評價;終濃度50nM血纖維蛋白溶酶(Sigma-Aldrich;P1867)、終濃度100μM基質肽Boc-Val-Leu-Lys-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3104-v)
人類凝血酶抑制活性評價;終濃度1nM凝血酶(Sigma-Aldrich;T6884)、終濃度100μM基質肽Boc-VPR-AMC螢光肽基質(R&D Systems;ES011)
人類間質蛋白酶抑制活性評價;終濃度1nM間質蛋白酶(R&D Systems;E3946-SE)、終濃度100μM基質肽Boc-QAR-AMC螢光肽基質(R&D Systems;ES014)
人類蛋白質C抑制活性評價;終濃度100nM蛋白質C(Sigma-Aldrich;P2200)、終濃度100μM基質肽Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3112-v)
人類組織纖維蛋白溶酶原激活酶(Human tPA)抑制活性評價;終濃度10nM組織纖維蛋白溶酶原激活酶(Sigma-Aldrich;T0831)、終濃度100μM基質肽Pyr-Gly-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3145-v)
人類尿激酶纖維蛋白溶酶原激活酶(Human uPA)抑制活性評價;終濃度10nM尿激酶纖維蛋白溶酶原激活酶(Sigma-Aldrich;T0831)、終濃度100μM基質肽Pyr-Gly-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3145-v)
人類血漿激肽釋放酶(plasma kallikrein)抑制活性評價;終濃度0.125μg/ml血漿激肽釋放酶(Sigma-Aldrich;T0831)、終濃度100μM基質肽Z-Phe-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3095-v)
人類HTRA2抑制活性評價;終濃度200nM HTRA2(R&D Systems;1458-HT)、終濃度50μM基質肽H2-Opt(PEPTIDE INSTITUTE,INC.)
與(3-2)相同,以肽基質的分解為指標來評價對HTRA1以外之蛋白酶的交叉反應性。於抑制劑的終濃度1uM下,各HTRA1抑制肽對任一之蛋白酶都無法抑制蛋白酶活性,顯示HTRA1抑制肽具有HTRA1專一性的抑制作用。
按照(1-2)及(2-1)所記載的方法,分別調製HTRA1(cat)及具有序列識別號3所表示的胺基酸序列之HTRA1抑制肽。在20mM Tris-鹽酸、150mM氯化鈉、pH7.6的條件下將二者混合後,藉由膠濾層析法(Superdex 200 10/300 GL)而單離純化複合體。
將在(4-1)調製的複合體溶液濃縮至18mg/ml後,與貯藏溶液(氯化鋰1.0M、7.5%PEG6000、0.1M Tris/鹽酸(pH8.5))以1比1混合,藉由蒸氣擴散法而進行結晶化。將所獲得之立方體狀的單結晶浸漬於含20%之乙二醇的貯藏溶液之後,以液態氮進行冷凍。將冷凍結晶在低溫氣流下進行X射線照射,得到繞射影像(photon factory BL5A:High Energy Accelerator Research Organization)。藉 由使用HKL2000的解析,而取得最大解析度2.6A的比例化數據。藉由以絲胺酸蛋白酶HTRA1(PDB ID:3NZI)作為模板的分子取代法而決定位相,結構精密化後,以解析度2.6A決定HTRA1(cat)/該肽之複合體結晶。於單位晶格中係包含HTRA1與SPINK2分別各1分子。關於SPINK2分子,係根據序列資訊與所觀測到的電子密度,構築包含與HTRA1(cat)之相互作用部位的局部的分子模型。該HTRA1抑制肽被認為對包含HTRA1酵素活性中心的區域鍵結(圖6及7)。
大鼠的光照射視網膜損傷模型,係藉由光照射而誘發視網膜視細胞之細胞死的模型,被通用作為視網膜變性的模型動物(Daniel T.Organisciak et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.,1996,37(11):2243-2257)。對於進行72小時暗適應的大鼠,在暗適應下將0.5%(W/V)托平卡胺(Tropicamide)-0.5%鹽酸苯腎上腺素(phenylephrine hydrochloride)點眼液予以點眼,然後照射3小時5500Lux的白色光。照射後,再進行約24小時暗適應,然後回到通常飼育的明暗條件飼育2天。於安樂死後摘出眼球,以3.7%(W/V)甲醛-0.5~1%(W/V)甲醇-0.2%(W/V)苦味酸固定液浸漬24小時以上進行固定。石蠟包埋後,製作薄片切片。切片係進行蘇木精-曙紅染色,將視網膜 斷層的外顆粒層所含之核的數量計數,藉以評價視網膜損傷。清楚得知大鼠的光照射視網膜損傷模型係藉由光照射而外顆粒層所含之核的數量會顯著地減少。
為調查大鼠的光照射視網膜損傷模型中之HTRA1的參與,而由在(5-1)製作之模型大鼠採集玻璃體液,藉由西方墨點法解析而評價HTRA1表現量。玻璃體液在還原條件下供與SDS-PAGE,使用一次抗體之人HTRA1/PRSS11抗體(R&D Systems;AF2916)及二次抗體之綿羊IgG山葵過氧化酶-結合抗體(R&D Systems;HAF016)而檢測大鼠HTRA1。與非照射群進行比較,於經光照射之群組中,有認識到玻璃體液中之HTRA1量的增加,因此認為該模型中,HTRA1係參與光照射所導致的視網膜損傷之過程者(圖9)。
於對大鼠的光照射即將進行前,在麻醉下對玻璃體內投予5uL的0.04mg/mL或0.2mg/mL之濃度的HTRA1抑制肽H308。此外,生理食鹽水投予組的例數為4,其他之群的例數為5。生理食鹽水投予組係相對於藉由光照射,而視網膜斷層的外顆粒層所含之核減少,在HTRA1抑制肽投予組,則有認識到抑制外顆粒層所含之核的減少之效果(圖10)。由以上明白:對於因HTRA1所引起的組織損傷,HTRA1抑制肽會顯示藥效。
以HTRA1抑制肽H308作為模板,而調製具有序列識別號9(圖21)所表示的胺基酸序列中之第16的Ser被Ala取代之胺基酸序列的衍生物S16A。藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 15秒)×30循環)而增幅片段C。
引子12:5’-CCGCAGTTTGGTCTGTTTAGCAAATATCGTACCCCGAATTGT-3’
引子13:5’-GCCATACCAGCATGGTCCGCACAATTCGGGGTACGATATTTGC-3’
接著,以HTRA1抑制肽H308作為模板,藉由使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 20秒)×30循環)而增幅片段D。
引子14:5’-GCGGACCATGCTGGTATGGCATGTGTTGCTCTGTATGAAC-3’
引子15:5’-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAA-3’
藉由使用片段C與D、下述引子、KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 20秒)×30循環),而增幅所欲之DNA片段。
引子16:5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
引子15
於將所增幅的片段供與瓊脂糖凝膠電泳之後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速凝膠萃取套組(QIAGEN)而調製DNA。將所調製之DNA片段及pET 32a(Novagen)使用制限酵素BamHI(NEB)及XhoI(NEB),而以37℃處理1小時以上,於瓊脂糖凝膠電泳後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速PCR純化套組(QIAGEN)而進行純化。使用T4 DNA連接酶(NEB),而使各個純化片段以16℃進行反應過夜,藉以實施連接反應。連接溶液係添加於大腸菌JM109(TOYOBO),在冰上靜置30分鐘之後,以42℃進行45秒的熱處理,進一步在冰上靜置5分鐘,於含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT盤進行接種後,以37℃進行靜置培養過夜,藉以將大腸菌進行基因轉殖。於將被基因轉殖之大腸菌進行培養之後,實施miniprep及序列分析,藉以構築「pET 32a_HTRA1抑制肽H308_S16A_Kex2」。此外,操作係依照(1-1-1)所記載之方法進行。
為調製具有序列識別號9(圖21)所表示的胺基酸序列中第1的Asp經Gly、Ser、Glu或Ser-Leu-Ile所取代的胺基酸序列之HTRA1抑制肽的4種N末端序列衍生物(分別表示為D1G,D1S,D1E或D1SLI),係以與(6-1)相同的手法而構築表現載體。藉由使用片段C及D、下述引子、KOD-plus-(TOYOBO)的PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 20秒)×30循環),而分別增幅4種目標片段。
製作之引子D1G
引子17:5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
引子15
製作之引子D1S
引子18:5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
引子15
製作之引子D1E
引子19:5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGAACCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
引子15
製作之引子D1SLI
引子20:5’-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCTGATTCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
引子15
將經增幅的4種片段供與瓊脂糖凝膠電泳之後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速凝膠萃取套組(QIAGEN)而調製DNA。將所調製之DNA片段及pET 32a(Novagen)使用制限酵素BamHI(NEB)及XhoI(NEB),而以37℃處理1小時以上,於瓊脂糖凝膠電泳後,切出所欲之DNA片段,藉由QIA快速PCR純化套組(QIAGEN)而進行純化。使用T4 DNA連接酶(NEB),而使各個純化片段以16℃進行反應過夜,藉以實施連接反應。連接溶液係添加於大腸菌JM109(TOYOBO),在冰上靜置30分 鐘之後,以42℃進行45秒的熱處理,進一步在冰上靜置5分鐘,於含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT盤進行接種後,以37℃進行靜置培養過夜,藉以將大腸菌進行基因轉殖。於將被基因轉殖之大腸菌進行培養之後,實施miniprep及序列分析,藉以構築「pET 32a_HTRA1抑制肽H308_D1G_S16A_Kex2」、「pET 32a_HTRA1抑制肽H308_D1S_S16A_Kex2」、「pET 32a_HTRA1抑制肽H308_D1E_S16A_Kex2」、「pET 32a_HTRA1抑制肽H308_D1SLI_S16A_Kex2」。此外,操作係依照(1-1-1)所記載之方法進行。
將在(6-1)及(6-2)構築之5種載體分別對大腸菌Origami B(DE3)(Novagen)進行基因轉殖,使用含0.1mg/ml胺苄青黴素的2YT培養基而以37℃進行培養後,添加IPTG(最終濃度1mM),以16℃進行培養過夜。次日,藉由離心分離(3,000g、20分、4℃)而集菌後,使用BugBuster Master Mix(Novagen)而調製溶菌產物,使用TALON金屬親和樹脂(Clontech)而純化融合His標記之目標蛋白質。接著,使用Kex2(前述)來將硫氧化還原蛋白標記與所欲之蛋白質切斷,使用TALON而進行純化。再者,供與膠濾層析法(Superdex75 10/300 GL)或逆相層析法(YMC-Pack ODS-AM),藉以調製5種HTRA1抑制肽衍生物。該衍生物所具有之胺基酸序列係記載於序列識別號23至27(圖35至39)。
按照(3-1)記載之方法,測定HTRA1(cat)抑制活性之結果,任一之衍生物都為抑制活性與H308同等(圖11)。
使用在實施例(1-2)調製之3種HTRA1抑制肽(H308、H321AT、H322AT)及在(2-1)調製之HTRA1(cat),藉由免疫沉澱法而評價鍵結性。將2.5μg的各HTRA1抑制肽與10μg的HTRA1(cat)在室溫進行30分鐘反應之後,添加10μL的TALON金屬親和樹脂(Clontech)。進一步將30分鐘之反應後的樹脂回收作為免疫沉澱(IP)餾分,供與SDS-PAGE,藉以評價鍵結性。此外,使用PBS為反應的緩衝液。
使3種HTRA1抑制肽或HTRA1(cat)分別與TALON進行反應之情形,僅經融合有His標記的HTRA1(cat)之帶於輸入線道(lane)被檢測到。另一方面,僅在使各抑制肽與HTRA1(cat)進行反應的IP線道,有檢測到抑制肽與酵素之帶。所以,確認3種HTRA1抑制肽係分別鍵結於HTRA1(cat)。
關於在實施例6構築之3種HTRA1抑制肽(H308_D1G_S16A、H321AT_D1G_S16A、H322AT_D1G_S16A),使用基質肽H2-Opt而評價HTRA1(cat)或HTRA1(full)抑制活性(n=3)。以DMSO溶解基質肽H2-Opt(Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K)(PEPTIDE INSTITUTE,INC.:序列識別號54、圖8),使其成為10mM,以測定緩衝液(50mM Tris,150mM氯化鈉,0.25% CHAPS,pH8.0)進行稀釋而以終濃度10μM使用。將以測定緩衝液進行稀釋的HTRA1(HTRA1(cat)或HTRA1(full);實施例2)與HTRA1抑制肽分別各混合25μL,於以37℃使進行反應20分鐘之後加入以測定緩衝液進行稀釋的基質50μL,以Enspire(PerkinElmer)測定螢光訊號(激發328nm/發射393nm)。HTRA1係終濃度10nM,HTRA1抑制肽係終濃度1.875~1,000nM,反應及測定中使用PROTEOSAVE(註冊商標)SS96F黑盤(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)。
算出各濃度中之HTRA1抑制肽的基質肽分解速度,以抑制劑濃度0nM的分解速度作為100%,而評價各HTRA1抑制肽的HTRA1(cat)及HTRA1(full)抑制活性。
使用GraphPad Prism(5.0版本;GraphPad Software Inc.)而算出50%抑制濃度(IC50)的結果,明白:任一之HTRA1抑制肽都低濃度且會阻礙HTRA1(cat)及HTRA1(full)酵素活性(圖66)。
以人類玻連蛋白作為蛋白質基質,而評價HTRA1抑制肽的HTRA1抑制活性。操作係按照實施例(3-2)。
與(8-1)相同,即使在以人類玻連蛋白作為基質的情形,HTRA1抑制肽強烈地顯示HTRA1(cat)抑制(圖67)。
以基質肽的切斷為指標來評價對於其他蛋白酶的特異性。關於牛胰蛋白酶、牛α-胰凝乳蛋白酶、蛋白質C、類胰蛋白酶、凝乳酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織纖維蛋白溶酶原激活酶、血漿激肽釋放酶、間質蛋白酶、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活酶、HTRA2,係按照實施例(3-3)所記載之方法(n=3)。又,對於其他蛋白酶的抑制活性之程序、蛋白酶及基質的組合係如下所述。
反應及測定中係使用PROTEOSAVE(註冊商標)SS96F黑盤(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.),將以測定緩衝液進行稀釋的蛋白酶與樣品(終濃度1μM)分別各混 合25μL,於以37℃使進行反應20分鐘之後加入以測定緩衝液進行稀釋的基質50μL,以Enspire(PerkinElmer)測定螢光訊號。
人類胰蛋白酶抑制活性評價;終濃度1nM胰蛋白酶(Sigma-Aldrich;T6424)、終濃度100μM基質肽Boc-VPR-AMC螢光肽基質(R&DSystems;ES011)、螢光訊號激發380nm/發射460nm。
人類胰凝乳蛋白酶抑制活性評價;終濃度10nM胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich;C8946)、終濃度10μM基質肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3120-v)、螢光訊號激發380nm/發射460nm。
人類第XIIa因子抑制活性評價;終濃度100nM第α-XIIa因子(Enzyme Research Laboratories)、終濃度100μM基質肽Pyr-Gly-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3145-v)、螢光訊號激發380nm/發射460nm。
人類MMP-2抑制活性評價;終濃度1nM類胰蛋白酶(Calbiochem;PF023)、終濃度100μM基質肽MOCAx-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3226-v)、螢光訊號激發328nm/發射393nm。
人類TPP1抑制活性評價;終濃度0.5μg/mL TPP1(Calbiochem;2237-SE)、終濃度200μM基質肽AAF-MCA(PEPTIDE INSTITUTE,INC.;3201-v)、螢光訊號激發380nm/發射460nm。
以肽基質的分解為指標來評價對HTRA1以外之蛋白酶的交叉反應性。以各HTRA1抑制肽的終濃度 1uM,對任一之蛋白酶都無法抑制蛋白酶活性,顯示HTRA1抑制肽具有HTRA1專一性的抑制作用(圖68)。
使用在實施例6調製之3種HTRA1抑制肽及在(2-1)調製之HTRA1(cat),按照實施例7的操作,藉由免疫沉澱法而評價鍵結性。
使3種HTRA1抑制肽或HTRA1(cat)分別與TALON進行反應之情形,僅經融合有His標記的HTRA1(cat)之帶於輸入線道被檢測到。另一方面,僅在使各抑制肽與HTRA1(cat)進行反應的IP線道有檢測到抑制肽與酵素之帶。所以,確認3種HTRA1抑制肽係分別鍵結於HTRA1(cat)(圖69)。
使用在實施例(5-1)構築之大鼠的光照射視網膜損傷模型,而評價在實施例6製作之3種HTRA1抑制肽的視網膜保護效果。操作係按照實施例5。任一群都是例數為6。
於圖70呈示視網膜病理評價的結果。3種HTRA1抑制肽係對於因光照射被引起的外顆粒層所含之核的數量之減少,顯示顯著的抑制作用。
使用高脂肪食物(High Fat Diet;HFD)與氫醌(Hydroquinone;HQ)的視網膜損傷模型,係因氧化促進物質而誘發氧化壓力且會引起視網膜損傷的模型,僅於小鼠報告有模型(Diego G.Espinosa-Heidmann et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.,2006,47(2):729-737)。於是,使3歲齡JW兔4個月中攝食含1.5%(W/V)椰子油-0.25%(W/V)膽固醇-1.5%(W/V)花生油-2.4%(W/V)氫醌之RC4(Oriental Yeast Co.,Ltd.)食(HFD-HQ),藉以構築兔視網膜損傷模型。於安樂死後摘出眼球,在自角膜輪部5mm程度外側進行切開而摘除前眼部,進一步分離玻璃體之後,將視網膜-脈絡膜-鞏膜以4%(W/V)聚甲醛固定液浸漬24小時以上,進行固定。固定後,分離脈絡膜,使用一次抗體ZO-1單株抗體(ZO1-1A12)(Themo Fisher SCIENTIFIC;33-9100)及二次抗體雞抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附二次抗體、Alexa Fluor 594(Themo Fisher SCIENTIFIC;A-21201)來進行免疫染色。使用螢光顯微鏡(BZ-9000;KEYENCE)來觀察經染色之脈絡膜,求出被染色之視網膜色素上皮(RPE)細胞的面積,評價RPE細胞損傷。
於圖71呈示12週齡兔、3歲齡兔及HFD-HQ負載之3歲齡兔的RPE細胞之染色像(圖71(A))、與RPE細胞的平均面積(圖71(B))之圖表。在3歲齡的兔,RPE細胞比12週齡的兔還要肥大,確認因HFD-HQ負載而進一步肥大,有認識到於RPE細胞出現損傷。於老年性黃斑部變性症病患的眼球亦觀察到相同的變化(Ding JD et al.,Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2011,108(28):279-87)。
為評價AMD相關因子的表現,分別由該兔視網膜損傷模型採集視網膜及由RPE/脈絡膜採集組織,使用RNeasy mini kit(QIAGEN)而抽出mRNA後,使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Thermo Fisher Scientific)而進行反轉錄反應。使用TaqMan Gene Expression Assay(Oc03397832_g1及Oc03824857_g1;Thermo Fisher Scientific),藉由7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems),而定量解析補體第三因子C3及內部標準β-肌動蛋白的mRNA量。此外,以3歲齡兔的例數4,以HFD-HQ負載之3歲齡兔的例數10來實施解析。
圖71(C)及(D)呈示視網膜、及RPE細胞與脈絡膜中之C3表現量。於任一之組織中都有認識到在餵食HFD-HQ之兔群,C3的表現量係亢進。
為調查兔視網膜損傷模型中之HTRA1的參與,由在(6-1)製作之模型兔採集玻璃體液,使用胰蛋白酶/Lys-C Mix(Promega)而酵素消化後,使用LC(EASY-nLC 1000;Thermo Fisher Scientific)-MS(TripleTOF 6600;SCIEX)來定量HTRA1的肽片段。明白:在餵食HFD-HQ的兔之玻璃體液中,HTRA1蛋白質量係增加(圖71(E))。由上述,而有認識到RPE細胞肥大化及AMD相關因子C3、HTRA1的表現亢進,因此顯示該兔視網膜損傷模型對於老年性視網膜疾病研究有用。
使用該兔模型,而評價在實施例1製作之HTRA1抑制肽H308的視網膜保護效果。於HFD-HQ的餵飼開始起2個月後,在麻醉下對單眼於玻璃體內投予40mg/mL的H308溶液50μL。對另一眼,係於玻璃體內投予生理食鹽水。任一群都是例數為5。
於圖72呈示於餵飼開始4個月後,評價模型動物之RPE細胞肥大的結果。於RPE細胞的平均面積(圖72(A))、或細胞面積為1500μm2以上的肥大RPE細胞數(圖72(B))任一之指標中,HTRA1抑制劑都對於RPE細胞的肥大而顯示抑制效果。如圖71(E)所示,在該模型的玻璃體液中有認識到HTRA1的增加,且對於HFD-HQ所導致的RPE細胞的損傷過程而暗示HTRA1的參與。如 此地,顯示:HTRA1抑制肽係作為抗老年性黃斑部變性症藥而有用;本試驗係尤其對於萎縮型之老年性黃斑部變性症的預防特別有用。
又,於投予HTRA1抑制肽的正常兔視網膜中有認識到HTRA1抑制肽的存在,顯示HTRA1抑制肽的高組織滲透性。
使用含10%胎牛血清(FBS)、青黴素-鏈黴素(Thermo Fisher Scientific)的DMEM/F-12培養基(Wako Pure Chemical Industries,Ltd),而在37℃、5%CO2條件下,於無菌之嵌0.4μm孔徑聚酯膜的12mm Transwell(Corning)中培養ARPE-19細胞至成為簇集狀態(confluent)。然後,以非含有FBS的DMEM/F-12培養5天,分別對腔室上下層添加終濃度為500μM的H2O2,對腔室上層添加終濃度25%的正常人血清補體(Quidel)。進一步對腔室上下層,以終濃度成為1μM的方式分別加入HTRA1(實施例2-2)、HTRA1蛋白酶無活性變異體HTRA1(S328A)(實施例2-3)、或HTRA1抑制肽H308_D1G_S16A(實施例6)。於4小時後,去除培養上清液,以PBS清洗後,藉由SuperPrepTM Cell Lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO CO.,LTD.)而抽出mRNA,進行反轉錄反應。使用TaqMan Gene Expression Assays(Hs000900055_m1及Hs02786624_g1;Thermo Fisher Scientific),藉由7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems),而定量解析VEGF的mRNA量。此外,於mRNA量的修正係使用甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH,Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)。
於圖74呈示結果。與H2O2、正常人血清補體及HTRA1無活性變異體HTRA1(S328A)添加條件比較,藉由添加H2O2、正常人血清補體及HTRA1,而VEGF的mRNA量係顯著地增加。再者,藉由將HTRA1抑制肽H308_D1G_S16A一起添加,而有認識到VEGF的表現抑制。有認為來自視網膜色素上皮細胞的VEGF誘導係對滲出型老年性黃斑部變性病態形成為重要的(Klettner A.et al.,Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.,2009,247:1487-1492)。又,認為不僅是病態形成,此等之病理的VEGF誘導亦涉及病態的維持,HTRA1抑制肽H308_D1G_S16A的投予係對於滲出型老年性黃斑部變性的預防及治療有效。
HUVEC(Kurabo Industries),係以於含0.1%BSA的EBMTM-2基本培養基(Lonza Walkersville)添加除去血清與VEGF之EGMTM-2 SingleQuotsTM添加因子組的培養基(含0.1%BSA之無血清EGM),在37℃、5%CO2條件下培養18小時之後,以含0.1%BSA的無血清EGM調製成 為4×105個/mL。對以明膠塗被膜的嵌3.0μm高密度PET膜之Corning FluoroBlok HTS 96 Well Multiwell Permeable Support System(Corning)的腔室上層,以50μL/格添加4×105個/mL的HUVEC懸浮液之後,對腔室下層以210μL/格添加下述樣品(培養基1或2、3)(n=3)。又,對於未添加HUVEC的腔室上層,係添加50μL含0.1%BSA之無血清EGM,對於其腔室下層,係添加210μL含0.1%BSA之無血清EGM(n=3)。
培養基1;含0.1%BSA之無血清EGM
培養基2;添加全部的EGMTM-2 SingleQuotsTM添加因子的EBMTM-2培養基(EGM增殖培養基)
培養基3;300nM之含H308_DIG_S16A的EGM增殖培養基
將添加細胞與樣品之FluoroBlok HTS 96 Well Multiwell Support System在37℃、5%CO2條件下培養2小時,以PBS清洗往下層游走的HUVEC後,以4μg/mL的含Calcein-AM(Thermo Fisher Scientific)含0.1%BSA之無血清EGM進行15分鐘染色。然後,將培養基取代為PBS,以盤測讀儀(ARVO-MX、PerkinElmer)測定各格的螢光強度(激發波長/螢光波長:485nm/535nm),以下式算出各格的游走細胞。
游走細胞=HUVEC存在格之螢光強度的平均(n=3)-空白格之螢光強度的平均(n=3)。
於圖75呈示結果。認識到HTRA1抑制肽H308_DIG_S16A係對於以含血清培養基所誘導之 HUVEC的游走有抑制效果。所以,明白:對於滲出型老年性黃斑部變性症之特徵的血管新生,會顯示抑制效果。
使用在實施例(11-1)~(11-3)製作、評價之兔視網膜損傷模型,評價在實施例1製作之HTRA1抑制肽H308或在實施例6製作之3種HTRA1抑制肽之中1種的對於視網膜損傷的治療效果。在麻醉下對模型動物的單眼於玻璃體內投予40mg/mL的抑制肽溶液50μL,飼育2個月。對另一眼,係於玻璃體內投予生理食鹽水。使任一群都是例數為5。
相對於在生理食鹽水投予組可觀察到RPE細胞面積的增大或細胞數的增加,在HTRA1抑制肽投予組則應該是RPE細胞面積的增大或細胞數的增加被抑制。如此地,可確認:HTRA1抑制肽係作為抗老年性黃斑部變性症藥而有用;本實施例係對於萎縮型之老年性黃斑部變性症的治療特別有用。
本發明所提供的肽、及包含其之醫藥組成物,係對於老年性黃斑部變性症等的治療或預防等有用。
序列識別號1:人類SPINK2的胺基酸序列(圖13)
序列識別號2:編碼人類SPINK2的胺基酸序列之核苷酸序列(圖14)
序列識別號3:肽H218的胺基酸序列(圖15)
序列識別號4:編碼肽H218的胺基酸序列之核苷酸序列(圖16)
序列識別號5:肽H223的胺基酸序列(圖17)
序列識別號6:編碼肽H223的胺基酸序列之核苷酸序列(圖18)
序列識別號7:肽H228的胺基酸序列(圖19)
序列識別號8:編碼肽H228的胺基酸序列之核苷酸序列(圖20)
序列識別號9:肽H308的胺基酸序列(圖21)
序列識別號10:編碼肽H308的胺基酸序列之核苷酸序列(圖22)
序列識別號11:肽H321的胺基酸序列(圖23)
序列識別號12:編碼肽H321的胺基酸序列之核苷酸序列(圖24)
序列識別號13:肽H322的胺基酸序列(圖25)
序列識別號14:編碼肽H322的胺基酸序列之核苷酸序列(圖26)
序列識別號15:肽衍生物H308AT的胺基酸序列(圖27)
序列識別號16:編碼肽衍生物H308AT的胺基酸序列之核苷酸序列(圖28)
序列識別號17:肽衍生物H321AT的胺基酸序列(圖29)
序列識別號18:編碼肽衍生物H321AT的胺基酸序列之核苷酸序列(圖30)
序列識別號19:肽衍生物H322AT的胺基酸序列(圖31)
序列識別號20:編碼肽衍生物H322AT的胺基酸序列之核苷酸序列(圖32)
序列識別號21:肽M7的胺基酸序列(圖33)
序列識別號22:編碼肽M7的胺基酸序列之核苷酸序列(圖34)
序列識別號23:肽衍生物H308_S16A的胺基酸序列(圖35)
序列識別號24:肽衍生物H308_D1G_S16A的胺基酸序列(圖36)
序列識別號25:肽衍生物H308_D1S_S16A的胺基酸序列(圖37)
序列識別號26:肽衍生物H308_D1E_S16A的胺基酸序列(圖38)
序列識別號27:肽衍生物H308_D1SLI_S16A的胺基酸序列(圖39)
序列識別號28:肽衍生物H321AT_D1G_S16A的胺基酸序列(圖40)
序列識別號29:肽衍生物H322AT_D1G_S16A的胺基酸序列(圖41)
序列識別號30:HTRA1抑制肽的通式(圖42)
序列識別號31:包含S標記及連接子的胺基酸序列(圖43)
序列識別號32:C末端6聚物的胺基酸序列(圖44)
序列識別號33:引子1的核苷酸序列(圖45)
序列識別號34:引子2的核苷酸序列(圖46)
序列識別號35:引子3的核苷酸序列(圖47)
序列識別號36:引子4的核苷酸序列(圖48)
序列識別號37:引子5的核苷酸序列(圖49)
序列識別號38:引子6的核苷酸序列(圖50)
序列識別號39:引子7的核苷酸序列(圖51)
序列識別號40:引子8的核苷酸序列(圖52)
序列識別號41:引子9的核苷酸序列(圖53)
序列識別號42:引子10的核苷酸序列(圖54)
序列識別號43:引子11的核苷酸序列(圖55)
序列識別號44:引子12的核苷酸序列(圖56)
序列識別號45:引子13的核苷酸序列(圖57)
序列識別號46:引子14的核苷酸序列(圖58)
序列識別號47:引子15的核苷酸序列(圖59)
序列識別號48:引子16的核苷酸序列(圖60)
序列識別號49:引子17的核苷酸序列(圖61)
序列識別號50:引子18的核苷酸序列(圖62)
序列識別號51:引子19的核苷酸序列(圖63)
序列識別號52:引子20的核苷酸序列(圖64)
序列識別號53:人類HTRAI(full)的胺基酸序列(圖65)
序列識別號54:H2-Opt的胺基酸序列(圖8)
序列識別號55:引子21的核苷酸序列(圖76)
序列識別號56:引子22的核苷酸序列(圖77)
<110> 第一三共股份有限公司(DAIICHI SANKYO COMPANY,LIMITED)
<120> 老年性黃斑部變性症治療用肽及其製造方法
<130> FP1726
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<151> 2016-12-22
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<221> 黏合
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<223> N-(4-甲基香豆基-7-醯胺)-異白胺酸
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<222> (10)..(10)
<223> Nε-(2,4-二硝基苯基)-離胺酸
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<223> 引子
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<213> 人工序列
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<223> 引子
Claims (23)
- 一種SPINK2變異體肽,其包含序列識別號3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23至29之任一者所表示的胺基酸序列,且阻礙人類HTRA1所具有之蛋白酶活性。
- 如請求項1之肽,其係包含1至3個胺基酸於胺基末端側肽鍵結而成的胺基酸序列。
- 如請求項1之肽,其係包含1或2個胺基酸於胺基酸序列之羧基末端側肽鍵結而成的胺基酸序列。
- 如請求項1至3中任一項之肽,其係具有特徵為具有3個雙硫鍵,且包含環狀結構、α螺旋及β摺疊的立體結構。
- 一種多核苷酸,其包含編碼如請求項1至4中任一項之肽所包含的胺基酸序列之核苷酸序列。
- 如請求項5之多核苷酸,其被機能性地連結於調控序列。
- 一種載體,其包含如請求項5或6之多核苷酸。
- 如請求項7之載體,其包含複製序列、控制序列、及/或選擇標記。
- 一種細胞,其包含如請求項5或6之多核苷酸或是如請求項7或8之載體、或產生如請求項1至4中任一項之肽。
- 一種阻礙HTRA1所具有之蛋白酶活性的SPINK2變異體肽的製造方法,其包含下述步驟(i)及(ii):(i)培養如請求項9之細胞的步驟; (ii)自該培養物回收SPINK2變異體肽的步驟。
- 一種SPINK2變異體肽,其藉由如請求項10之方法而可獲得。
- 一種複合體(conjugate),其係其他部分連結於如請求項1至4及11中任一項之肽而成。
- 如請求項12之複合體,其為多肽。
- 一種組成物,其包含如請求項1至4及11中任一項之肽、如請求項5或6之多核苷酸、如請求項7或8之載體、如請求項9之細胞、及/或如請求項12或是13之複合體。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項1至4及11中任一項之肽及/或如請求項12或13之複合體。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項5或6之多核苷酸及/或如請求項7或8之載體。
- 如請求項15或16之醫藥組成物,其係用於HTRA1相關疾病之治療或預防。
- 如請求項17之醫藥組成物,其中HTRA1相關疾病係選自包含滲出型老年性黃斑部變性症、萎縮型老年性黃斑部變性症、地圖狀萎縮、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、息肉狀脈絡膜血管病變、類風濕性關節炎、及骨關節炎(Osteoarthritis)之群組的1個或2個以上。
- 如請求項15或16之醫藥組成物,其係包含1個或2個以上的其他醫藥。
- 如請求項15或16之醫藥組成物,其係與1個或2個以上的其他醫藥組合而被使用。
- 如請求項15或16之醫藥組成物,其係視網膜保護劑。
- 如請求項15或16之醫藥組成物,其係用於萎縮型老年性黃斑部變性症的治療或預防。
- 如請求項15或16之醫藥組成物,其係用於滲出型老年性黃斑部變性症的治療或預防。
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