CN103002911A - 卷曲蛋白结合药剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与人类卷曲受体结合的新型抗癌药剂，所述药剂包括但不限于抗体。还鉴定了人类卷曲受体中的适合作为抗癌药剂靶标的新型表位。另外还提供了使用所述药剂或抗体的方法，例如使用所述药剂或抗体来抑制Wnt信号传导和/或抑制肿瘤生长的方法。

Description

卷曲蛋白结合药剂及其应用
技术领域
本发明的领域主要涉及与人类卷曲受体(frizzled receptors)结合的抗体及其他药剂，还涉及使用所述抗体或其他药剂来治疗诸如癌症等疾病的方法。
背景技术
在发达国家中癌症是引起死亡的主要原因之一，仅在美国每年就有超过一百万人被诊断患有癌症并有500,000人死亡。据估算，总体上每3个人中有超过1个人在其一生中将发展某种形式的癌症。有200种或多种不同类型的癌症，其中4种——乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和前列腺癌——占所有新病例的一半以上(Jemal等，2003，Cancer J.Clin.53：5-26)。
已经将Wnt信号传导途径鉴定为癌症疗法的潜在靶点。Wnt信号传导途径是胚胎模式形成、胚后组织维持和干细胞生物学的若干关键调控途径之一。更具体而言，Wnt信号传导在细胞极性产生和包括干细胞群的自我更新在内的细胞命运特化中起重要作用。Wnt途径的非调控活化与多种人类癌症有关，其中该活化能够改变肿瘤细胞的发育命运，从将肿瘤细胞保持在未分化且增殖的状态。因此癌的发生能够通过篡夺体内平衡机制来进行，所述体内平衡机制控制通过干细胞而进行的正常发育和组织修复(综述见于Reya和Clevers，2005，Nature 434：843；Beachy等，2004，Nature432：324)。
在果蝇发育无翅(wg)突变体中首次阐明了Wnt信号传导途径，该途径来自鼠原癌基因int-1(现名为Wnt1)(Nusse和Varmus，1982，Cell 31：99-109；Van Ooyen和Nusse，1984，Cell 39：233-40；Cabrera等，1987，Cell 50：659-63；Rijsewijk等，1987，Cell50：649-57)。Wnt基因编码分泌型脂质修饰糖蛋白，其中19种已在哺乳动物中鉴定出。这些分泌型配体激活由卷曲(Frizzled，Fzd)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LPR5/6)组成的受体复合体。Fzd受体是属于G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的具有7个跨膜结构域的蛋白，其包含具有10个保守半胱氨酸的大型细胞外N端配体结合结构域，即富含半胱氨酸的结构域(CRD)或Fri结构域。人类FZD受体有10种：FZD1～FZD10。对于特定的Wnt，不同的Fzd CRD具有不同的亲和力(Wu和Nusse，2002，J.Biol.Chem.277：41762-9)，而且已将Fzd受体划分为活化下文所描述的经典β-catenin途径的Fzd受体和活化非经典途径的Fzd受体(Miller等，1999，Oncogene 18：7860-72)。为了形成可结合FZD配体的受体复合体，FZD受体与LRP5/6相互作用，LRP5/6是具有由6个YWTD氨基酸重复序列分隔的四个细胞外EGF样结构域的单次穿膜蛋白(Johnson等，2004，J.Bone Mineral Res.19：1749)。
经典Wnt信号传导途径在结合受体时被激活，并且由直接与Fzd受体相互作用的散乱蛋白(Dishevelled，Dsh，一种细胞质蛋白)介导，导致β-catenin在细胞质中稳定和积累。在无Wnt信号的情况下，β-catenin定位于细胞质中的降解复合体(destructioncomplex)，该降解复合体包括肿瘤抑制蛋白：结肠腺瘤息肉蛋白(APC)和轴蛋白(Axin)。这些蛋白发挥下述功能：作为关键骨架使糖原合成酶激酶(GSK)-3β结合并磷酸化β-catenin，从而将其标记以便通过泛素/蛋白酶体途径进行降解。Dsh的活化导致GSK3β的磷酸化和降解复合体的解离。积累的细胞质β-catenin随后输送至细胞核，在细胞核中β-catenin与Tcf/Lef家族的DNA结合蛋白相互作用，从而激活转录。
除经典信号传导途径外，Wnt配体还激活β-catenin非依赖型途径(Veeman等，2003，Dev.Cell 5：367-77)。已表明非经典Wnt信号传导参与多种过程，但其中最有说服力的是通过与果蝇平面细胞极性(PCP)途径相似的机制来参与原肠胚形成活动。非经典Wnt信号传导的其他潜在机制包括钙流动、JNK和小G蛋白及异源三聚体G蛋白。在经典途径和非经典途径之间经常观察到拮抗作用，一些证据表明非经典信号传导能够抑制癌的形成(Olson和Gibo，1998，Exp.Cell Res.241：134；Topol等，2003，J.CellBiol.162：899-908)。因此，在某些背景下，Fzd受体可作为经典Wnt信号传导途径的负调节因子。举例而言，FZD6在与FZD1共表达时通过TAK1-NLK途径抑制Wnt-3a所引起的经典信号传导(Golan等，2004，JBC 279：14879-88)。类似地，Fzd2在Wnt-5a存在的情况下通过TAK1-NLK MAPK级联对经典Wnt信号传导起到拮抗作用(Ishitani等，2003，Mol.Cell.Biol.23：131-9)。
经典Wnt信号传导途径还在小肠和结肠干细胞群的维持中起核心作用，该途径的不当激活在结肠直肠癌中起主导作用(Reya和Clevers，2005，Nature 434：843)。肠吸收上皮的构造为绒毛和隐窝。干细胞居于隐窝中并缓慢分裂产生快速增殖的细胞，后者产生上行离开隐窝并占据肠绒毛的所有分化细胞群。Wnt信号传导级联在控制沿隐窝-绒毛轴的细胞命运中起主导作用，并且对维持干细胞群而言必不可少。同源重组所造成的Tcf7/2遗传丢失(Korinek等，1998，Nat.Genet.19：379)或强分泌型Wnt抗结剂Dickkopf-1(Dkkl)(Pinto等，2003，Genes Dev.17：1709-13；Kuhnert等，2004，Proc.Nat’l.Acad.Sci.101：266-71)的过表达会破坏Wnt信号传导，从而致使肠干细胞群耗尽。
结肠直肠癌最常见是由Wnt信号传导级联中的激活性突变引发的。在全部结肠直肠癌中大约5％～10％是遗传性的，其中一种主要形式是家族性腺瘤息肉病(FAP)，该病是一种常染色体显性疾病，其中约80％的患病个体具有结肠腺瘤息肉病(APC)基因的种系突变。在包括Axin和β-catenin在内的其他Wnt途径组分中也已经鉴定出了突变。个别腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮细胞的无性系长出物，而大量的FAP腺瘤通过在致癌基因和/或肿瘤抑制基因增加突变而不可避免地导致腺癌的发展。此外，Wnt信号传导途径的激活，包括APC和β-catenin的功能获得性突变，能够在小鼠模型中引发增生性发生和肿瘤生长(Oshima等，1997，Cancer Res.57：1644-9；Harada等，1999，EMBO J.18：5931-42)。
随着在通过鼠病毒的近位插入而转化的乳腺肿瘤中将Wnt1(原intl)鉴定为癌基因，首次揭示了Wnt信号传导在癌症中的作用(Nusse和Varmus，1982，Cell31：99-109)。之后已积累了Wnt信号传导在乳腺癌中作用的其他证据。举例而言，乳腺中β-catenin的转基因过表达导致增生和腺癌(Imbert等，2001，J.Cell Biol.153：555-68；Michaelson和Leder，2001，Oncogene 20：5093-9)，而Wnt信号传导的丢失则破坏正常的乳腺发育(Tepera等，2003，J.Cell Sci.116：1137-49；Hatsell等，2003，J.Mammary Gland Biol.Neoplasia 8：145-58)。最近已显示Wnt信号传导可激活乳腺干细胞(Liu等，2004，Proc.Nat’l Acad.Sci.101：4158)。在人类乳腺癌中，β-catenin的积累在超过50％的癌中意味着激活的Wnt信号传导，虽然未鉴定出特异性突变，但是已观察到了卷曲受体表达的上调(Brennan和Brown，2004，J.Mammary Gland Neoplasia9：119-31；Malovanovic等，2004，Int.J.Oncol.25：1337-42)。
FZD10、FZD8、FZD7、FZD4和FZD5是10种已鉴定的人类Wnt受体中的5种。在肺中Fzd10与Wnt7b共表达，而且细胞转染研究已表明Fzd10/LRP5共受体在响应于Wnt7b时激活经典Wnt信号传导途径(Wang等，2005，Mol.Cell Biol.25：5022-30)。在包括子宫颈、胃和成胶质细胞瘤细胞系在内的多种癌细胞系中，以及在包括约40％的原发性胃癌、结肠癌和滑膜肉瘤在内的原发性癌中，FZD10mRNA发生上调(Saitoh等，2002，Int.J.Oncol.20：117-20；Terasaki等，2002，Int.J.Mol.Med.9：107-12；Nagayama等，2005，Oncogene 1-12)。在若干人类癌细胞系、原发性胃癌和肾癌中FZD8发生上调(Saitoh等，2001，Int.J.Oncol.18：991-96；Kirikoshi等，2001，Int.J.Oncol.19：111-5；Janssens等，2004，Tumor Biol.25：161-71)。FZD7的表达遍及胃肠道，并且在6例人类原发性胃癌中的一例中发生上调(Kirikoshi等，2001，Int.J.Oncol.19：111-5)。结肠癌细胞系中FZD7胞外域的表达引起形态学变化，并且在异种移植模型中使肿瘤生长下降(Vincan等，2005，Differentiation 73：142-53)。在卵黄囊和胎盘血管发生中FZD5发挥必不可少的作用(Ishikawa等，2001，Dev.128：25-33)，并且在与Wnt/β-catenin信号传导的活化有关的肾癌中发生上调(Janssens等，2004，TumorBiology 25：161-71)。FZD4在肠隐窝上皮细胞中高度表达，并且是在正常组织中相对于瘤组织显示差异表达的若干因子中的一种(Gregorieff等，2005，Gastroenterology129：626-38)。因此，将FZD受体鉴定为癌干细胞(cancer stem cell)的标记物，使得这些蛋白成为癌症疗法的理想靶点。
发明内容
本发明提供与一种或多种人类卷曲受体(FZD)结合的新型药剂，所述药剂包括但不限于：与两种或多于两种人类卷曲受体结合的抗体或其他药剂，以及这些药剂的使用方法。本发明还提供新型多肽，例如与一种或多种卷曲受体结合的抗体、此类抗体的片段和与此类抗体有关的其他多肽。在某些实施方式中，所述药剂、抗体、其他多肽或与FZD结合的药剂，与在本文中称为生物学结合部位(BBS)的FZD区域结合，本发明人现已将所述区域首次鉴定为用于抑制Wnt信号传导和/或肿瘤生长的靶点。还提供了具有与多于一种FZD结合的抗原结合部位的抗体和其他多肽。还提供了包含编码所述多肽的核酸序列的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体。另外提供了含有本发明的多肽和/或多核苷酸的细胞。还提供了包含所述新型FZD结合药剂或抗体的组合物(例如，药物组合物)。此外还提供制造和使用所述新型FZD结合药剂或抗体的方法，例如使用所述新型FZD结合药剂或抗体来抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的方法。
因此，在一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性结合的药剂。在某些实施方式中，所述药剂抑制配体(例如Wnt)与人类卷曲受体生物学结合部位(BBS)的结合。在某些实施方式中，所述药剂与人类卷曲受体内生物学结合部位(BBS)的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与BBS的结合导致了对Wnt信号传导和/或肿瘤生长的抑制。在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与下述(a)、(b)和/或(c)的至少一部分结合：(a)由氨基酸72(F)、74～75(PL)、78(I)、92(Y)、121～122(LM)和129～132(WPDR(SEQ ID NO：70))构成的FZD8的构象表位；(b)由序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)组成的FZD8的区域；(c)由序列QYGFA(SEQ ID NO：66)组成的FZD8的区域。在某些实施方式中，人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8组成的组，并且所述药剂与所述人类卷曲受体中的序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO：24)的至少一部分结合。举例而言，在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与FZD8中的序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)的至少一部分结合。在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10，并且所述药剂与对应于由QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)组成的FZD8的区域的人类卷曲受体的区域的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD58中的序列(K/Q)(F/Y)GF(Q/A)(SEQ ID NO：69)的至少一部分结合。举例而言，在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与FZD8中的序列QYGFA(SEQ ID NO：66)的至少一部分结合。在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10，并且所述药剂与对应于由QYGFA(SEQ ID NO：66)组成的FZD8区域的人类卷曲受体区域的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合包括FZD5和FZD8在内的人类卷曲受体。
在另一个方面中，本发明提供与抗体竞争对人类卷曲受体的特异性结合的药剂(例如，在体外竞争性结合测定中)，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO：10的重链可变区和包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的轻链可变区。在某些实施方式中，所述抗体具有包含SEQ ID NO：10的重链可变区和包含SEQ ID NO：14的轻链可变区。在某些实施方式中，所述药剂竞争对两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体的特异性结合。在某些实施方式中，所述药剂竞争与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8的特异性结合。
在再一个方面中，本发明提供与抗体竞争对FZD5和/或FZD8的特异性结合的药剂，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO：85的重链可变区和包含SEQ ID NO：86的轻链可变区。
在又一个方面中，本发明提供与两种或更多种人类卷曲受体特异性地结合的药剂。在某些实施方式中，所述两种或更多种卷曲受体包括：(a)FZD1和选自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的第二卷曲受体；(b)FZD2和选自由FZD5、FZD7和FZD8组成的组的第二卷曲受体；(c)FZD5和FZD7；或(d)FZD7和FZD8。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合三种或更多种(即3、4或5种)人类卷曲受体，其中所述三种或更多种人类卷曲受体包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述三种或更多种人类受体包括FZD5和FZD8。在某些实施方式中，所述三种或更多种人类卷曲受体还包括FZD3、FZD4、FZD6、FZD9和/或FZD10。
在另外一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性结合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的重链可变区：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR1；(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR2；(c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR3。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合包括FZD5和FZD8在内的两种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。
在另一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性结合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的轻链可变区：(a)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7的变体；(b)轻链CDR2，所述轻链CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8的变体；(c)轻链CDR3，所述轻链CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9的变体。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合包括FZD5和FZD8在内的两种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。
在另一个方面中，本发明提供具有下述(a)和/或(b)的多肽：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)的重链CDR3；(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)的轻链CDR2和包含SSFAGNSLE(SEQID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合两种或更多种(例如至少FZD5和FZD8)、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体。
在又一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中所述人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组，其中所述抗体具有：重链可变区，所述重链可变区含有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR1；包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQID NO：2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR2；和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR3；和/或(b)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)、SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)，或者具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO：4或SEQID NO：7的变体；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)、DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)，或者具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8的变体；轻链CDR3，所述轻链CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ IDNO：6)、QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)，或者具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9的变体。在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ IDNO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)的重链CDR3；和/或(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)的轻链CDR2和包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ IDNO：3)的重链CDR3；和/或(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)的轻链CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。
在另一个方面中，本发明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽：(a)与SEQ ID NO：10的序列同一性至少为约80％的多肽；(b)与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的序列同一性至少为约80％的多肽。在某些实施方式中，本发明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽：(a)与SEQ ID NO：10的序列同一性至少为约80％的多肽；(b)与SEQ ID NO：14的序列同一性至少为约80％的多肽。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组。
在又一个方面中，本发明提供例如与人类FZD5和/或FZD8特异性地结合的抗体等药剂，其中所述抗体具有：(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO：77)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDR1；包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQID NO：78)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDR2；和包含SIVFDY(SEQ ID NO：79)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDR3；和/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO：80)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链CDR1；包含SG(SEQ ID NO：81)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链CDR2；包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO：82)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体具有：(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO：77)的重链CDR1、包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：78)的重链CDR2和包含SIVFDY(SEQ IDNO：79)的重链CDR3；和/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO：80)的轻链CDR1、包含SG(SEQ ID NO：81)的轻链CDR2和包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO：82)的轻链CDR3。
在另一个方面中，本发明提供与FZD5和/或FZD8特异性地结合的多肽，其中所述多肽包括：(a)与SEQ ID NO：85的同一性至少为约80％的多肽；和/或(b)与SEQ IDNO：86的同一性至少为约80％的多肽。
在又一个方面中，本发明提供与下述IgG抗体中的任一个竞争对人类FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的特异性结合的药剂，所述IgG抗体为：18R8、18R5、18R4605和18R4805。
在再一个方面中，本发明提供与抗FZD的IgG抗体44R24竞争对人类FZD5和/或FZD8的特异性结合的药剂。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽是抗体。在某些替代性实施方式中，所述药剂不是抗体。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体与其所结合的一种或多种人类卷曲受体的细胞外结构域(ECD)特异性地结合。在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体与其所结合的一种或多种人类卷曲受体的Fri结构域(Fri)特异性地结合。
在每个前述方面以及本文其他部分所述的其他方面的某些实施方式中，所述抗体或其他多肽的单个抗原结合部位特异性地结合(或能够结合)多于一种人类卷曲受体。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体抑制配体与人类卷曲受体的结合。在某些实施方式中，所述配体是Wnt。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，与FZD结合的药剂或多肽或抗体是该FZD的拮抗剂。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体抑制Wnt信号传导。在某些实施方式中，受到抑制的Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。在一些实施方式中，FZD结合药剂所抑制的Wnt信号传导是非经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，Wnt信号传导是非经典Wnt信号传导。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，FZD结合药剂或多肽或抗体抑制肿瘤生长。
本发明还提供抗体18R8、18R5、18R4605、44R24和18R4805及其片段。
本发明还提供包含FZD结合药剂或抗体的组合物(例如，药物组合物)。
本发明提供在受试者中抑制Wnt信号传导(例如经典Wnt信号传导)和/或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括施用治疗有效量的FZD结合药剂或多肽或抗体。
还提供了降低肿瘤的致瘤性的方法，所述肿瘤含有癌干细胞。在某些实施方式中，所述方法包括对具有肿瘤的受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂或多肽或抗体。在某些实施方式中，通过施用所述抗体减少了肿瘤中癌干细胞的频率。在某些实施方式中，FZD结合药剂的施用使得肿瘤中的致瘤性细胞分化为非致瘤状态。
还提供了诱导受试者肿瘤中的细胞进行分化的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。
另外提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。
此外，还提供了降低实体瘤基质中的成肌纤维细胞活化的方法，所述方法包括使所述基质接触治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。
在某些实施方式中，包括施用FZD结合药剂、多肽或抗体的方法还包括对受试者施用第二抗癌药剂(例如化疗剂)。在某些实施方式中，所述第二药剂是吉西他滨(gemcitabine)、依立替康(irinotecan)或紫杉醇。在某些实施方式中，所述第二药剂是血管发生抑制剂和/或Notch信号传导抑制剂。
在另一个方面中，本发明提供包含选自由SEQ ID NO：10～15组成的组的序列的多肽。同样提供了包含选自由SEQ ID NO：85～86组成的组的序列的多肽。还提供了包含编码所述多肽的核酸序列的多核苷酸。
在又一个方面中，本发明提供包含选自由SEQ ID NO：17～12组成的组的序列的多核苷酸。另外提供了包含选自由SEQ ID NO：87～90、92和94～95组成的组的序列的多核苷酸。
在再一个方面中，本发明提供多核苷酸，所述多核苷酸包含在高严谨度条件下与选自由SEQ ID NO：17、19、21、87～90、92和94～95组成的组的多核苷酸杂交或者与编码选自由SEQ ID NO：10、12、14和85～86组成的组的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。在某些实施方式中，本发明包括在高严谨度条件下与由SEQ ID NO：17、19或21组成的多核苷酸杂交或者与编码SEQ ID NO：10、12或14的多核苷酸杂交的多核苷酸。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，对所述药剂或多肽或抗体或多核苷酸进行了分离。在某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体或多核苷酸基本纯净。
本发明还提供Wnt基因标签(gene signature)，可用于鉴定可能会对用FZD结合药剂(例如，人类卷曲受体的拮抗剂和/或Wnt信号传导抑制剂)或Wnt信号传导的其他抑制剂进行的治疗产生应答的肿瘤和/或患者。还提供了使用Wnt基因标签来选择可用FZD结合药剂或Wnt信号传导的其他抑制剂治疗的患者的方法。在某些实施方式中，所述方法涉及对Wnt基因标签中的一种或多种基因的水平进行评估。还提供了筛选可对抗利用Wnt基因标签所鉴定的肿瘤的候选药物的方法。还提供了在所述方法中有用的阵列、试剂盒和其他组合物。
本发明还提供筛选潜在候选药物或其他药剂的方法。这些方法包括但不限于：包括对第一实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平和第二实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平进行比较的方法，所述第一实体瘤已暴露于所述药剂，而第二实体瘤未暴露于所述药剂。在某些实施方式中，这些方法包括：(a)使第一实体瘤暴露于所述药剂，而第二实体瘤不暴露于所述药剂；(b)对第一实体瘤和第二实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平进行评估；和(c)对第一实体瘤和第二实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平进行比较。
在本发明的方面或实施方式用马库什组或可选要素的其他分组进行描述时，本发明不仅涵盖作为一个整体列出的整个组，而且还单独涵盖该组中的每个成员以及大组的所有可能的小组，以及缺少一个或多个组成员的大组。本发明还包括在要求保护的发明中明确排除该组中的任何一个或多个成员。
附图说明
图1：18R8结合多种人类卷曲受体。FACS分析展示了18R8与瞬时转染的HEK293细胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列结合。显示了18R8与HEK293细胞结合的FACS绘图，所述HEK293细胞转染有编码所示FZD的表达载体和GFP表达载体。共转染(GFP阳性)细胞群中染色的升高表明18R8的结合。FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8的FACS绘图用粗线加框，从而突出这些显示与18R8结合的FZD。
图2：抗FZD抗体18R5与细胞上的多种人类卷曲受体结合。FACS分析展示了18R5同18R8一样与细胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列结合。将不同浓度的抗体18R8和18R5与过表达所示FZD的HEK293细胞进行共温育，并通过流式细胞术评估了抗体的结合。虽然18R8和18R5都与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8结合，但是18R5的结合具有更高的亲和力。
图3：在稳定表达与荧光素酶连接的8xTCF启动子元件的STF293细胞中进行了荧光素酶报告基因测定。用含有Wnt3A以及不同浓度的18R8和18R5的条件培养基处理细胞，并随后在18小时后使用Dual-Glo荧光素酶检测报告系统(Promega)来进行测定。结果表明18R8和18R5均抑制Wnt信号传导，而且18R5的结合亲和力比18R8更高。
图4：18R8通过多个Wnt阻断TCF信号传导。在稳定表达与荧光素酶连接的8xTCF启动子元件的STF293细胞中进行荧光素酶报告基因测定。通过使用Fugene 6(Roche)以编码所示Wnt蛋白的表达载体转染HEK293细胞(ATCC)来产生各种过表达Wnt的细胞。用18R8处理STF293细胞并添加过表达Wnt的HEK293细胞，随后在18小时后使用Dual-Glo荧光素酶检测报告系统来进行测定。
图5：18R8直接抑制Wnt与FZD的结合。在稳定表达8xTCF启动子元件的STF293细胞中进行荧光素酶报告基因测定。在用或不用蛋白A琼脂糖微球的情况下，将如图所示含有Wnt3A条件培养基、纯化的FZD8-Fc和/或18R8的混合物于4℃共温育2小时。温育后移除蛋白A琼脂糖凝胶微球并将其加至STF293细胞。18小时后使用Dual-Glo荧光素酶测定报告系统对经处理的STF293细胞进行测定。该实验显示，在无18R8的情况下Fzd8-Fc能够抑制Wnt3A刺激信号传导的能力，但是18R8能够阻断FZD8与Wnt3A结合的能力，当使用琼脂糖A微球从共温育物中除去FZD8-Fc(和18R8)时信号传导的恢复即证明了这一点。
图6：对18R8与突变FZD8(与野生型FZD8相比)的结合的FACS分析。为了评估FZD上的18R8表位，进行了表位作图研究。在瞬时转染研究中将编码GFP的表达载体与表达构建体共同使用，所述表达构建体能够表达带N端FLAG标签和C端CD4跨膜结构域及细胞内结构域的人类FZD8的Fri结构域。还制备了该表达载体的多种变体，所述变体具有在FZD8序列内的选定氨基酸取代，用来编码在不与18R8结合的其他特定FZD的Fri结构域中对应位置的氨基酸。随后通过流式细胞术来评估18R8结合这些FZD8序列变体的能力。如共转染(GFP阳性)细胞群中的染色降低所示，发现18R8的结合需要FZD8的某些位置的氨基酸，包括FZD8的氨基酸66～71和126～127。以线框突出了显示18R8与共转染的细胞群结合的FACS绘图区域，以粗线显示表现出显著下降的18R8结合的氨基酸取代的线框。
图7：显示出18R5和18R8在人类FZD8上具有相似的结合表位。使用此前显示出可破坏18R8结合的一系列氨基酸变体，通过流式细胞术来评估18R5与18R8结合表位的类似表位结合的能力。如共转染(GFP阳性)细胞群中的染色降低所示，发现与18R8和18R5结合均需要包括FZD8的氨基酸66～71和126～127在内的位置。以线框突出了显示18R8与共转染的细胞群结合的FACS绘图区域，并且加粗了对应于表现出显著下降的18R8和18R5结合的氨基酸取代的线框。
图8：各人类卷曲受体Fri结构域序列的部分氨基酸序列间的比较。具有保守残基的位点以黑色阴影标出；具有相似氨基酸残基的位点以灰色阴影标出。18R8和18R5的FZD表位包含由下划线标出且标记为“上边缘”和“下边缘”的区域。基于对Fri结构域晶体结构的细查，可认识到这些区域位于FZD蛋白表面上的裂缝两侧，术语“上边缘”和“下边缘”则反映了这种认识。所述裂缝包含多个高度保守的残基。构成该裂缝的氨基酸由比对结果中每个对应位置上的三角形状符号突出显示。之前并未认识到该区域的特定功能。对与该区域结合的抗体的发现，对这些抗体抑制Wnt结合及Wnt信号传导的发现，以及本发明人对该裂缝的保守性的认识，已使得本发明人能够将该区域鉴定为FZD蛋白的关键功能性部分。
图9：FZD的生物学结合部位(BBS)。显示了Fzd Fri结构域的结构图像。该图像基于对之前报导的小鼠FZD8晶体结构的分析(Dann CE等，Nature 412(6842)86-90，2001)和使用软件程序Pymol完成的分析。在左上图中显示了FZD Fri结构域的表面视图，其中Fzd蛋白区域包含以白色椭圆圈出的本发明人已发现的生物学结合部位(BBS)。该区域即抗体18R8和18R5所结合的区域。该区域包含被本发明人称为“上边缘”、“下边缘”和“裂缝”的结构元件。在该图底部的分开的图像中用较深的表面着色突出显示了各所述结构元件。右上图用较深色表面突出显示了在10个人类Fzd家族成员的9个或10个中保守的残基，并且突出了以下认识：在两侧为与抑制Fzd功能的抗体结合的表位的“裂缝”区域的中心内出现了这些残基的明显集群。
图10：通过抗FZD的mAb防止Wnt依赖型肿瘤生长。每周对注射有50,000个MMTV WNT1肿瘤来源细胞的NOD/SCID小鼠和肿瘤生长进行监视，直至检测到生长，随后每周对肿瘤生长进行两次测量。用18R8或作为对照的对照抗体对10只具有已建立肿瘤的小鼠进行治疗。与在用对照抗体治疗的动物中所观察到的相比，在用18R8治疗的动物中，几乎消除了肿瘤生长。
图11：通过18R5与依立替康的组合治疗减少OMP-C28异种移植肿瘤的生长。对NOD/SCID小鼠注射10,000个OMP-C28结肠肿瘤细胞，在第24天，将肿瘤平均体积为129mm3的小鼠随机分组并开始进行所示的治疗。每周对肿瘤生长进行监视。在用18R5治疗的动物中，肿瘤生长明显减少。此外，18R5与依立替康的组合与单独使用其中任何一个药剂进行的治疗相比显示出明显的减少。
图12：通过18R5与吉西他滨的组合治疗减少OMP-PN4异种移植肿瘤的生长。对NOD/SCID小鼠注射50,000个OMP-PN4胰腺肿瘤细胞，在第38天，将肿瘤平均体积为约120mm3的小鼠随机分组并在2天后开始进行所示的治疗。与单独使用吉西他滨的治疗相比，在用18R5与吉西他滨组合治疗的动物中肿瘤生长明显减少。
图13：18R8和18R5的重链和轻链氨基酸序列，包括VH和VL序列。
图14：编码18R8和18R5的重链和VH序列的核苷酸序列。
图15：编码18R8和18R5的轻链和VL序列的核苷酸序列。
图16：FZD7ECD Fc蛋白的氨基酸序列及编码该蛋白的核苷酸序列。
图17：人类FZD1(SEQ ID NO：26)、FZD1的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：27，显示为SEQ ID NO：26中带下划线的氨基酸1～321)和FZD1的Fri结构域(SEQ IDNO：28)的氨基酸序列。
图18：人类FZD2(SEQ ID NO：30)、FZD2的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：31，显示为SEQ ID NO：30中带下划线的氨基酸1～250)和FZD2的Fri结构域(SEQ IDNO：32)的氨基酸序列。
图19：编码人类FZD1的核苷酸序列。
图20：编码人类FZD2的核苷酸序列。
图21：人类FZD3(SEQ ID NO：34)、FZD3的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：35，显示为SEQ ID NO：34中带下划线的氨基酸1～204)和FZD3的Fri结构域(SEQ IDNO：36)的氨基酸序列。
图22：人类FZD4(SEQ ID NO：38)、FZD4的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：39，显示为SEQ ID NO：38中带下划线的氨基酸1～224)和FZD4的Fri结构域(SEQ IDNO：40)的氨基酸序列。
图23：编码人类FZD3的核苷酸序列。
图24：编码人类FZD4的核苷酸序列。
图25：人类FZD5(SEQ ID NO：42)、FZD5的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：43，显示为SEQ ID NO：42中带下划线的氨基酸1～233)和FZD5的Fri结构域(SEQ IDNO：44)的氨基酸序列。
图26：人类FZD6(SEQ ID NO：46)、FZD6的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：47，显示为SEQ ID NO：46中带下划线的氨基酸1～207)和FZD6的Fri结构域(SEQ IDNO：48)的氨基酸序列。
图27：编码人类FZD5的核苷酸序列。
图28：编码人类FZD6的核苷酸序列。
图29：人类FZD7(SEQ ID NO：50)、FZD7的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：51，显示为SEQ ID NO：50中带下划线的氨基酸1～255)和FZD7的Fri结构域(SEQ IDNO：52)的氨基酸序列。
图30：人类FZD8(SEQ ID NO：54)、FZD8的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：55，显示为SEQ ID NO：54中带下划线的氨基酸1～277)和FZD8的Fri结构域(SEQ IDNO：56)的氨基酸序列。
图31：编码人类FZD7的核苷酸序列。
图32：编码人类FZD8的核苷酸序列。
图33：人类FZD9(SEQ ID NO：58)、FZD9的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：59，显示为SEQ ID NO：58中带下划线的氨基酸1～230)和FZD9的Fri结构域(SEQ IDNO：60)的氨基酸序列。
图34：人类FZD10(SEQ ID NO：62)、FZD10的细胞外结构域(ECD)(SEQ IDNO：63，显示为SEQ ID NO：62中带下划线的氨基酸1～227)和FZD10的Fri结构域(SEQ ID NO：64)的氨基酸序列。
图35：编码人类FZD9的核苷酸序列。
图36：编码人类FZD10的核苷酸序列。
图37：用18R5抗体与紫杉醇的组合治疗减少PE-13乳腺肿瘤的生长。对NOD/SCID小鼠注射10,000个PE-13乳腺肿瘤细胞，在第22天，将肿瘤平均体积为约120mm3的小鼠随机分组。随后用对照抗体(“对照Ab”)、18R5抗体(“抗FZD”)、紫杉醇(“Taxol”)或18R5抗体与紫杉醇的组合(“抗FZD+Taxol”)对小鼠进行治疗。用18R5抗体与紫杉醇的组合进行的治疗具有抗肿瘤活性。
图38：在用18R5抗体与紫杉醇进行组合治疗的个体动物中的乳腺肿瘤生长。用18R5抗体与紫杉醇进行的组合治疗导致已建立的乳腺肿瘤的衰退。
图39：在用对照抗体、18R5抗体、依立替康或18R5抗体与依立替康的组合进行治疗后对结肠直肠肿瘤细胞的流式细胞术分析。
图40：在植入30、90、270或810个肿瘤细胞后的小鼠中的肿瘤生长，所述肿瘤细胞从已经用对照抗体(“对照”)、18R5抗体(“抗FZD”)、吉西他滨(“吉西他滨”)或18R5与吉西他滨的组合(“组合”)治疗41天的小鼠中获得。
图41：在用对照抗体(“对照Ab”)、仅用18R5抗体(“抗FZD”)、仅用吉西他滨(“吉西他滨”)或18R5抗体与吉西他滨的组合(“组合”)进行治疗后通过有限稀释分析确定的PN-4胰腺肿瘤中的癌干细胞(CSC)频率。
图42：在已用对照抗体(“LZ-1”)、仅用18R5抗体(“18R5”)、仅用吉西他滨(“吉西他滨”)或吉西他滨与18R5的组合(“组合”)进行治疗的胰腺肿瘤细胞中的嗜铬粒蛋白(Chromatogram)基因表达。
图43：用抗FZD抗体18R5进行的治疗促使肿瘤细胞分化为非增殖粘液性细胞。对NOD/SCID小鼠注射50,000个OMP-PN13胰腺肿瘤细胞，在第23天，将肿瘤平均体积为约107mm3的小鼠随机分组并在4天后开始用对照抗体或18R5进行治疗。20天后收集肿瘤并切片。来自经18R5治疗的小鼠或经对照抗体治疗的小鼠的肿瘤切片用阿尔新蓝染料进行染色以显示粘液性细胞，并通过用ki67的抗体的免疫组化显示增殖细胞。用箭头突出显示了示例性的粘液性细胞和增殖细胞。
图44：单独使用抗FZD抗体18R5或与
Figure BDA0000063718710000161
(紫杉醇)组合使用的抗FZD抗体18R5抑制OMP-LU24异种移植肿瘤的生长。用对照抗体(“对照Ab”)、抗FZD的18R5(“18R5”)、(“Taxol”)或18R5与的组合(“18R5+Taxol”)对携带有OMP-LU24人类肺肿瘤的小鼠进行治疗。
图45：单独使用抗FZD抗体18R5或与(贝伐单抗)组合使用的抗FZD抗体18R5抑制OMP-LU33异种移植肿瘤的生长。用对照抗体(方形)、
Figure BDA0000063718710000165
(指向上方的三角形)、抗FZD的18R5(指向下方的三角形)或18R5与
Figure BDA0000063718710000166
的组合(圆形)对携带有OMP-LU33人类肺肿瘤的小鼠进行治疗。
图46：抗FZD抗体18R5与
Figure BDA0000063718710000171
(曲妥单抗)的组合抑制T3异种移植肿瘤的生长。用对照抗体(方形)、抗FZD的18R5(三角形)、
Figure BDA0000063718710000172
(实心圆)或18R5与
Figure BDA0000063718710000173
的组合(空心圆)对携带有T3人类乳腺肿瘤的小鼠进行治疗。
图47：18R5和44R24的Fzd结合图谱。表示每个mAb与Fzd1、2、5、7和8的结合的剂量响应曲线(Dose-reponse curve)。
图48：18R5和44R24对STF细胞中Wnt3a所诱发的报告基因活性的抑制作用(剂量响应曲线)。
图49：18R5和44R24对axin2基因表达的本底水平的抑制作用。
图50：对经18R5和44R24治疗的OMP-PN13肿瘤中的Muc16的IHC检测。
图51：对经18R5治疗的胰腺肿瘤中平滑肌肌动蛋白的抑制作用。A.通过微阵列检测到的ACTA2基因表达水平。B.对经对照mAb(上图)和18R5(下图)治疗的OMP-PN4肿瘤的SMA检测。
图52：测试经18R5诱导的Muc16+OMP-PN13细胞的致瘤性。A.进行Muc16染色的lin消减的(lin-depleted)OMP-PN13肿瘤细胞的FACS作图。两个分选的群用圆圈圈出。B.因注射Muc16-(上图)和Muc16+(下图)细胞而产生的肿瘤的代表图。C.肿瘤生长曲线。
图53：在PE13乳腺肿瘤异种移植物中抗FZD的mAb 18R5对肿瘤复发的抑制作用。
图54：抗FZD的mAb 18R5使乳腺的癌干细胞频率降低。
图55：在PN4胰腺肿瘤异种移植物中抗FZD的mAb 18R5对肿瘤复发的抑制作用。
图56：在PN4胰腺肿瘤异种移植物中抗FZD的mAb 44R24与吉西他滨的组合对肿瘤生长的抑制作用。
图57：抗FZD的mAb 44R24与突变FZD8(相对于野生型FZD8)的结合的FACS分析。用线框突出了显示44R24与共转染的细胞群结合的FACS图区域。箭头标出了那些显示出显著下降的44R24结合的氨基酸取代的线框。
图58：在C25结肠肿瘤异种移植物中抗FZD的抗体44R24和18R5的抗肿瘤活性。
图59：在用抗FZD的抗体44R24或18R5治疗过的C28结肠肿瘤异种移植物中的细胞角蛋白7表达的诱导。
具体实施方式
本发明提供新型药剂，包括但不限于与一种或多种人类卷曲受体(FZD)结合的多肽(例如抗体)。还提供了相关多肽和多核苷酸、含有FZD结合药剂的组合物以及制备所述FZD结合药剂的方法。另外提供了该新型FZD结合药剂的使用方法，例如抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的方法。
本发明在部分上基于对人类卷曲受体中的一个区域的鉴定，所述区域是结合FZD的抗癌药剂的适合靶标。发现两种抗FZD抗体，18R8和18R5，与FZD7特异性地结合，还与FZD1、FZD2、FZD5和FZD8发生交叉反应(下文实施例1和2)。用18R8抗体进行的体外实验表明该抗体能够抑制Wnt信号传导(下文实施例3)并抑制Wnt配体与FZD8的结合(下文实施例4)。在基于细胞的测定中，还已显示18R5抗体同样能够抑制Wnt信号传导(下文实施例3和20)。用18R5抗体进行的体内实验表明该抗体能够抑制肿瘤生长或复发(下文实施例7、17和23)。本发明人还展示了抗FZD抗体18R5能够降低肿瘤中的癌干细胞频率(下文实施例8和23)并诱发肿瘤细胞的分化和/或降低肿瘤细胞致瘤性(下文实施例16、21、22和25)。用这些活性18R8和18R5抗体进行的表位作图实验表明这些抗体均可与FZD8中的序列GLEVHD (SEQ IDNO：25)的至少一部分和序列YGFA(SEQ ID NO：74)的至少一部分结合(下文实施例5)。根据所展示的这两种抗体的生物活性，对小鼠卷曲蛋白8的晶体结构(Dann等，Nature，412：86-90(2001))进行了分析，并将包含这些此前并未认为有任何特殊功能的序列的卷曲蛋白的细胞外区域首次鉴定为在FZD生物学和Wnt信号传导中起到重要功能性作用(实施例6)。人类卷曲受体的称为生物学结合部位(BBS)的这一区域是抗癌治疗的适合靶标。
此外，发现第三种抗体44R24特异性地结合人类FZD5和FZD8(下文实施例19)。已另外显示，该抗体能够在基于细胞的测定中抑制Wnt信号传导(下文实施例20)并在体内具有抗肿瘤效用(下文实施例23和25)。和用抗FZD抗体18R8和18R5进行的治疗相同，用44R24对肿瘤进行的治疗致使该肿瘤中的分化标记物水平升高(下文实施例25)。表位作图还已显示，抗FZD抗体44R24的表位与抗FZD抗体18R8和18R5的表位存在重叠。更具体而言，已显示44R24与BBS中的区域YGFA(SEQ IDNO：74)的至少一部分结合(下文实施例24)。
I.定义
为了便于理解本发明，下文定义了多个术语和短语。
术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其通过在该免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别部位识别并特异性地结合靶标，例如蛋白、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或其组合。本文所用的术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变物、从至少两种完整抗体产生的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、含有抗体的抗原决定部位的融合蛋白以及含有抗原识别部位的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体显示出所需的生物活性即可。根据抗体的重链恒定域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)，抗体可以是5种主要类别的免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或其亚类(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)中的任何一种。不同类别的免疫球蛋白具有不同且公知的亚基结构和三维构造。抗体可以是裸抗体，或者与诸如毒素、放射性同位素等其他分子偶联。
术语“抗体片段”指完整抗体的一部分，和指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线状抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”指参与高特异性地识别并结合单一抗原决定簇或表位的同源抗体群。与之相反的多克隆抗体则通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆抗体”涵盖完整全长单克隆抗体和抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(scFv)突变物、含有抗体部分的融合蛋白以及含有抗原识别部位的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”指以包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物的多种方式制成的此类抗体。
术语“人源化抗体”指含有最少的非人类(例如鼠类)序列的非人类(例如鼠类)抗体形式，所述形式有特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗体是人类免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的具有所需的特异性、亲和力和能力的残基所替换(Jones等，1986，Nature，321：522-525；Riechmann等，1988，Nature，332：323-327；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534-1536)。在一些情况中，用来自非人类物种的具有所需的特异性、亲和力和能力的抗体的残基替换人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)的相应残基。通过在Fv骨架区和/或已替换的非人类残基中进行附加残基的取代，可以进一步修饰人源化抗体，从而改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般而言，人源化抗体会基本上完整地包含至少一个、通常为两个或三个可变区，所述可变区含有全部或基本上全部与非人类免疫球蛋白对应的CDR区，然而全部或基本上全部FR区都属于人类免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白(通常为人类免疫球蛋白)的恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。在美国专利第5,225,539号中描述了用来产生人源化抗体的方法的实例。
术语“人类抗体”指由人类产生的抗体，或者是用任何本领域已知的技术制备的具有与人类所产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人类抗体的这种定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人类重链和/或轻链多肽的抗体(例如包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体)。
术语“嵌合抗体”指免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体。通常，其轻链和重链的可变区对应于源自一种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需的特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区则与源自另一物种(通常为人类)的抗体中的序列同源，从而避免在该物种中引起免疫应答。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用，指能够被特定抗体识别并特异性地结合的抗原的部分。当抗原是多肽时，表位能够由连续氨基酸构成，也能够由通过蛋白的三级结构折叠而并置的不连续氨基酸构成。由连续氨基酸构成的表位通常在蛋白变性时得以保留，然而通过三级结构折叠形成的表位通常在蛋白变性时丢失。表位通常包括具有独特空间构象的至少3个、更常见为至少5个或8～10个氨基酸。
抗体“特异性地结合”表位或蛋白是指该抗体与表位或蛋白的反应或联结比替代性物质(包括无关蛋白)更频繁、更快速、时间更长、亲和力更强或上述情况的某些组合。在某些实施方式中，“特异性地结合”是指，例如，抗体与蛋白结合的KD值为约0.1mM以下，但更常见为小于约1μM。在某些实施方式中，“特异性结合”指抗体与蛋白结合的KD有时为至少约0.1μM以下，而在其他时候为至少约0.01μM以下。由于不同物种中同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括对多于一种的物种中的特定蛋白(例如卷曲受体)进行识别的抗体。同样，由于不同FZD受体(例如，FZD5和FZD8)之间在这些受体多肽序列的某些区域中存在同源性，特异性结合可以包括对多于一种的卷曲受体进行识别的抗体(或其他多肽或药剂)。应了解的是，与第一靶标特异性结合的抗体或结合部分，可以与或可以不与第二靶标特异性结合。如此而言，“特异性结合”不必需要(虽然其可以包括)排他性结合，即与单一靶标结合。因此，在某些实施方式中，抗体可以特异性结合多于一种的靶标(例如人类FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些实施方式中，抗体上的相同抗原结合部位可以结合多个靶标。举例而言，在某些情况中，抗体可以含有两个相同的抗原结合部位，其中每个部位都特异性地结合两种或更多种人类卷曲受体(例如人类FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些替代性实施方式中，抗体可以是双特异性的，并且含有特异性不同的至少两个抗原结合部位。以非限制性的实例而言，双特异性抗体可以具有一个识别一种卷曲受体(例如人类FZD5)上的表位的抗原结合部位，并且还具有识别第二种卷曲受体(例如人类FZD8)上的不同表位的另一不同的抗原结合部位。一般而言，但不必需，述及结合是指特异性结合。
“已分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是指处于非自然发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。已分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括经纯化达到不再处于其在自然中所发现形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方式中，已分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物基本纯净。
本文所用的“基本纯净”指为至少50％纯净(即无杂质)、更优选为至少90％纯净、再优选为至少95％纯净、再更优选为至少98％纯净、进一步优选为至少99％纯净的材料。
术语“癌症”和“癌症的”是指或用于描述哺乳动物的生理病症，其中一群细胞的特征在于失调的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌肿、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更特定的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状上皮肿瘤、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜瘤或子宫瘤、唾液腺瘤、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌(hepatic carcinoma)以及各类型的头颈部癌症。
“肿瘤”和“赘生物”是指因过度细胞生长或增殖而产生的任何良性(非癌性)或包括癌前病灶在内的恶性(癌性)组织团块。
术语“癌干细胞”、“肿瘤干细胞(tumor stem cell)”或“实体瘤干细胞(solid tumorstem cell)”在本文中可互换使用，是指来自实体瘤的具有下述特征的细胞群：(1)具有较强的增殖能力；(2)能够进行非对称细胞分裂从而产生一种或多种具有减弱的增殖或发育潜能的分化的后代；和(3)能够进行对称分裂用于自我更新或自我维持。在对免疫功能低下的小鼠进行连续移植时，“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”的这些性质使这些癌干细胞与大多数不能形成肿瘤的肿瘤细胞相比能够形成可触知的肿瘤。相对于分化，癌干细胞以无序的方式进行自我更新，从而形成具有异常细胞类型的肿瘤，所述异常细胞类型在发生突变时能够随时间发生变化。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法上等价的词语是指源自肿瘤或癌前病灶的总细胞群，包括非致瘤性细胞(其包括大量的肿瘤细胞群)和致瘤干细胞(癌干细胞)。在仅述及缺少更新及分化能力的那些肿瘤细胞时，以术语“非致瘤”修饰本文所用的术语“肿瘤细胞”，从而将这些肿瘤细胞与癌干细胞区分开。
术语“致瘤性”是指实体瘤干细胞的功能性特征，其包括自我更新性质(产生额外的致瘤性癌干细胞)和增殖以产生使实体瘤干细胞形成肿瘤的全部其他肿瘤细胞(产生分化的因而不具有非致瘤性的肿瘤细胞)的性质。在对免疫功能低下的小鼠进行连续移植时，这些自我更新和增殖以产生全部其他肿瘤细胞的性质使得癌干细胞与非致瘤性肿瘤细胞相比能够形成可触知的肿瘤，所述非致瘤性肿瘤细胞在进行连续移植时不能形成肿瘤。已观察到，在从实体瘤获得肿瘤细胞后对免疫功能低下的小鼠进行初次移植时，非致瘤性肿瘤细胞可以形成肿瘤，但是进行连续移植时，这些非致瘤性肿瘤细胞不产生肿瘤。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物和啮齿动物等，其将是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在述及人类受试者时可在本文中互换使用。
“制药上可接受的盐”是指在制药上可接受的化合物的盐，其具有母化合物的所需药理学活性。
“制药上可接受的赋形剂、运载体(carrier)或佐剂”是指能够与本发明的至少一种抗体一起对受试者进行施用、不破坏其药理学活性而且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时无毒性的赋形剂、运载体或佐剂。
“制药上可接受的载质”是指与本发明的至少一种抗体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。
术语“治疗有效量”是指用来有效地“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其他药物的量。对于癌症，治疗有效量的药物能够减少癌细胞数量；减小肿瘤尺寸；抑制或阻止癌细胞浸润至周边器官，所述浸润包括例如癌扩散至软组织和骨中；抑制并阻止肿瘤转移；抑制或阻止肿瘤生长；一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生命质量；降低肿瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力；减少肿瘤中癌干细胞的数量或频率；使致瘤性细胞分化为非致瘤状态；或者这些效果的组合。对于药物防止生长和/或杀死已存在的癌细胞的情况，可称之为细胞抑制和/或细胞毒性。
诸如“治疗”(“treating”或“treatment”或“treat”)或“减轻”(“alleviating”或“alleviate”)等术语是指：1)治愈、缓解、减少已诊断出的病理状态或病症的症状和/或使所述病理状态或病症停止进展的治疗措施，和(2)预防和/或减缓目标病理状态或病症的发展的预防性或防止性措施。因此，需要治疗的对象包括已经患有病症的对象、易于患有病症的对象和要防止病症的对象。在某些实施方式中，如果患者显示出一种或多种的下述现象，则根据本发明的方法对受试者成功地进行了癌症“治疗”，所述现象为：癌细胞数量减少或完全消失；肿瘤尺寸减小；癌细胞向周边器官的浸润受到了抑制或消失，所述浸润包括例如癌扩散至软组织和骨中；使肿瘤转移受到了抑制或消失；使肿瘤生长受到了抑制或消失；使与特定癌症相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率降低；提高生命质量；肿瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力降低；肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少；致瘤性细胞分化为非致瘤状态；或者这些效果的某种组合。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物、或者能够通过DNA聚合酶或RNA聚合酶引入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在对核苷酸结构的修饰，其可以在聚合物装配之前或之后进行。非核苷酸成分可以中断核苷酸序列。在聚合后可以进一步对多核苷酸进行修饰，例如通过与标记成分偶联。其他类型的修饰包括例如：“封端”；用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有无电荷键的修饰(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和带电键的修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有悬突部分(pendant moiety)例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚L-赖氨酸等)的修饰、以嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)进行的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、带有经修饰键(例如α异头核酸等)的修饰；以及多核苷酸的未修饰形式。另外，对于通常存在于糖中的任何羟基，可以将其置换为例如膦酸酯基团、磷酸酯基团，可以用标准保护基对其进行保护，或者可以将其激活从而制备与其他核苷酸的额外键，或者可以使其与固体支持物偶联。可以用胺或含有1～20个碳原子的有机封端基团部分来取代或磷酸化5’端和3’端OH。还可以使其他羟基衍生为标准保护性基团。多核苷酸还可以包含本领域中公知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括例如2′-O-甲基核糖、2′-O-烯丙基核糖、2′-氟代核糖、2’-叠氮基核糖、碳环糖类似物、α异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及非碱基核苷类似物(例如甲基核糖苷)。可以用替代性连接基团来置换一个以上的磷酸二酯键。这些替代性连接基团包括但不限于下述实施方式：其中用P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、”(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲乙缩醛”)置换磷酸酯，其中R或R’各自独立地为H或者为具有取代基或不具有取代基的烷基(1～20C)并可选地包含醚(--O--)键、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。在一个多核苷酸中并不需要所有键都相同。以上描述对本文述及的所有多核苷酸(包括RNA和DNA)都适用。
抗体的“可变区”可以单独指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，也可以指其组合。重链和轻链的可变区各自由4个框架区(FR)组成，所述4个框架区由三个互补决定区(CDR)(也称高变区)连接。FR使每个链中的CDR近距离地聚集在一起，所述CDR与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合部位的形成。至少有两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda Md.))；和(2)基于对抗原-抗体复合体的晶体学研究的方法(Al-lazikani等，(1997)J.Molec.Biol.273：927-948)。此外，在本领域中有时使用这两种方法的组合来确定CDR。
术语“载体”是指能够在宿主细胞中传递、优选表达一种或多种所感兴趣的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝缩剂(cationic condensing agent)联结的DNA或RNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核生物细胞(例如产病毒细胞(producer cell))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，用来指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是链状或分枝状，可以包含经修饰的氨基酸，并且可以由非氨基酸中断。该术语还涵盖经天然修饰或干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰(例如与标记成分偶联)。本定义还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应了解的是，因为本发明的多肽以抗体为基础，在某些实施方式中，该多肽可以作为单个的链或联结的链出现。
在述及两个以上核酸或多肽时，术语“同一的”或百分比“同一性”是指：在进行比较和比对(如有必要则引入空位)以获得最大对应时，两个以上的序列或子序列相同或具有特定比例的相同核苷酸或氨基酸残基，且未将任何保守性氨基酸取代考虑为序列同一性的一部分。使用序列比较软件或算法或者通过目视检查，可以测量百分比同一性。可以用来获得对氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件在本领域中是已知的。序列比对算法的一个这种非限制性实例是在Karlin等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci，87：2264-2268中描述的算法，并在Karlin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci，90：5873-5877中对其进行了修改，且整合到了NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等，1991，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402)。在某些实施方式中，可以使用在Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402中所描述的空位BLAST(Gapped BLAST)。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等，1996，Methods in Enzymology，266：460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech，South San Francisco，California)或Megalign(DNASTAR)是能够用来进行序列比对的其他公用软件程序。在某些实施方式中，使用GCG软件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵，且空位权重为40、50、60、70或90，长度权重为1、2、3、4、5或6)来确定两个核苷酸序列间的百分比同一性。在某些替代性实施方式中，可以使用整合有Needleman和Wnsch的算法(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))的GCG软件包中的GAP程序来确定两个氨基酸序列间的百分比同一性(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5)。作为另一种选择，在某些实施方式中，使用Myers和Miller算法(CABIOS，4：11-17(1989))来确定核苷酸或氨基酸序列间的百分比同一性。举例而言，可以使用ALIGN程序(2.0版)来确定百分比同一性，其中使用带残基表的PAM120，且空位长度罚分为12，空位罚分为4。本领域技术人员能够确定适合的参数来获得特定比对软件的最大比对。在某些实施方式中，使用比对软件的缺省参数。在某些实施方式中，第一氨基酸序列相对于第二序列氨基酸的百分比同一性“X”用100×(Y/Z)计算，其中Y是在第一和第二序列的比对(通过目视检查或特定序列比对程序所做的比对)中评分为相同匹配的氨基酸残基数，而Z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列相对于第二序列的百分比同一性将长于第二序列相对于第一序列的百分比同一性。
作为非限制性的实例，在某些实施方式中，使用Bestfit程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package，版本8(用于Unix平台)，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)能够确定任何特定的多核苷酸是否具有相对于参照序列的某个百分比的序列同一性(例如，至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、以及在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％或99％同一性)。Bestfit使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482 489(1981)的局部同源性算法来发现两个序列间的最佳同源性片段。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列与本发明的参照序列是否具有例如95％同一性时，对参数进行设置从而使得：基于参照核苷酸序列的全长来计算同一性的百分比，并且允许同源性中的空位最多为参照序列中核苷酸总数的5％。
在一些实施方式中，本发明的两种核酸或多肽基本一致，即在进行比较和比对以获得最大对应时，通过用序列比较算法或目视检查来测量的其核苷酸或氨基酸残基同一性为至少70％、至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％以及在一些实施方式中为至少95％、96％、97％、98％、99％。优选的是，同一性存在于长度至少为约10个残基、优选为约20个残基、更优选为约40～60个残基或其间任何整数值的序列区域，优选存在于长于60～80个残基的区域，更优选为至少约90～100个残基的区域，并且最优选为与所对比的序列全长基本相同的序列(例如核苷酸序列的编码区)。
“保守性氨基酸取代”是用具有相似侧链的另一氨基酸残基置换某个氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已有界定，其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例而言，用苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。优选的是，本发明的多肽和抗体序列中的保守性取代并不会使含有该氨基酸序列的多肽或抗体与抗原(即，该多肽或抗体所结合的一种或多种人类卷曲受体)的结合消失。鉴定不会消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法已为本领域所公知(参见例如Brummell等，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：.412-417(1997))。
如在本公开和权利要求中所用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“一种”包括复数形式。
应了解的是，在本文中用词语“包括”来描述实施方式的任何情况下，还提供了用“由…组成”和/或“基本由…组成”描述的其他类似的实施方式。
本文中在诸如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样地，在诸如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”意在涵盖每种下述实施方式：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；仅A；仅B；以及仅C。
“高严谨度条件”可以通过以下条件来确定：(1)采用低离子强度和高温度来洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸纳/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂(例如甲酰胺)，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％(体积/体积)甲酰胺/0.1％聚蔗糖(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸纳缓冲液(pH6.5)，42℃；或(3)于42℃采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸纳(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、经超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并且于42℃进行洗涤，于55℃置于0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中，随后于55℃进行由含有EDTA的0.1×SSC组成的高严谨度洗涤。
II.FZD结合药剂
本发明提供与一种或多种人类卷曲受体(FZD)特异性地结合的药剂。在本文中将这些药剂称为“FZD结合药剂”。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种卷曲受体。所述药剂所结合的人类卷曲受体可以选自由FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10组成的组。在某些实施方式中，所述一种或多种人类卷曲受体包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述一种或多种人类卷曲受体包括FZD7。在某些实施方式中，所述一种或多种人类卷曲受体包括FZD5和/或FZD8。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。FZD1～FZD10的全长氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列在本领域中已知，并且还在本文中提供为SEQ ID NO：26(FZD1 aa)、SEQ ID NO：30(FZD2 aa)、SEQ ID NO：34(FZD3 aa)、SEQ ID NO：38(FZD4 aa)、SEQ ID NO：42(FZD5 aa)、SEQ ID NO：46(FZD6aa)、SEQ ID NO：50(FZD7 aa)、SEQ ID NO：54(FZD8 aa)、SEQ ID NO：58(FZD9 aa)、SEQ ID NO：62(FZD10 aa)、SEQ ID NO：29(FZD1 nt)、SEQ ID NO：33(FZD2 nt)、SEQID NO：37(FZD3 nt)、SEQ ID NO：41(FZD4 nt)、SEQ ID NO：45(FZD5 nt)、SEQ IDNO：49(FZD6 nt)、SEQ ID NO：53(FZD7 nt)、SEQ ID NO：57(FZD8 nt)、SEQ ID NO：61(FZD9 nt)和SEQ ID NO：65(FZD10 nt)。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或其他多肽或药剂特异性地结合FZD7。在某些实施方式中，该抗体、多肽或药剂还可以与一种或多种其他人类卷曲受体特异性地结合或发生交叉反应。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或其他多肽或药剂特异性地结合FZD5。在某些实施方式中，该抗体、多肽或药剂还可以与一种或多种其他人类卷曲受体特异性地结合或发生交叉反应。
在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合两种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体选自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD1和选自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的第二种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD2和选自由FZD1、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的第二种卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD5和选自由FZD1、FZD2、FZD7和FZD8组成的组的第二种卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD5和FZD8。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD7和选自由FZD1、FZD2、FZD5和FZD8组成的组的第二种人类卷曲受体。
在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合三种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述三种或更多种人类卷曲受体包括选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的三种或更多种卷曲受体。在某些实施方式中，所述药剂还特异性地结合一种或多种其他人类卷曲受体。
在某些实施方式中，所述药剂或抗体特异性地与其所结合的一种或多种人类卷曲受体中的细胞外结构域(ECD)结合。每种人类卷曲受体的细胞外结构域的序列在本领域中已知，且还将其提供为SEQ ID NO：27(FZD1 ECD)、SEQ ID NO：31(FZD2 ECD)、SEQ ID NO：35(FZD3 ECD)、SEQ ID NO：39(FZD4 ECD)、SEQ ID NO：43(FZD5ECD)、SEQ ID NO：47(FZD6 ECD)、SEQ ID NO：51(FZD7 ECD)、SEQ ID NO：55(FZD8ECD)、SEQ ID NO：59(FZD9 ECD)和SEQ ID NO：63(FZD10 ECD)。
在某些实施方式中，所述药剂或抗体特异性地与其所结合的人类卷曲受体中的Fri结构域(FRI)(亦称富含半胱氨酸的结构域(CRD))结合。每种人类卷曲受体的Fri结构域的序列在本领域中已知，且还将其提供为SEQ ID NO：28(FZD1 FRI)、SEQ IDNO：32(FZD2 FRI)、SEQ ID NO：36(FZD3 FRI)、SEQ ID NO：40(FZD4 FRI)、SEQ IDNO：44(FZD5 FRI)、SEQ ID NO：48(FZD6 FRI)、SEQ ID NO：52(FZD7 FRI)、SEQ IDNO：56(FZD8 FRI)、SEQ ID NO：60(FZD9 FRI)和SEQ ID NO：64(FZD10 FRI)。
在某些实施方式中，本文所述的FZD结合抗体或多肽的单个抗原结合部位结合或能够结合一种、两种、三种、四种或五种(或更多种)人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述FZD结合抗体或多肽的单个抗原结合部位能够特异性地结合选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组一种、两种、三种、四种或五种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述抗体或多肽的单个结合部位特异性地结合至少FZD5和FZD8。
在某些实施方式中，所述FZD结合药剂或抗体结合一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种)人类卷曲受体，且其解离常数(KD)为约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低或者约10nM或更低。举例而言，在某些实施方式中，本文所述的与一种或多种FZD结合的FZD结合药剂或抗体，与这些FZD结合的KD为约100nM或更低、约20nM或更低或者约10nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)的每一种结合的解离常数为约40nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一种或多种的每一种结合的解离常数为约10nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的每一种结合的解离常数为约10nM或更低。在某些实施方式中，所述药剂或抗体与特定FZD结合的解离常数是通过使用固定在Biacore芯片上的FZD-Fc融合蛋白而确定的解离常数，所述融合蛋白含有FZD细胞外结构域或Fri结构域。
在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体结合一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种)人类卷曲受体，且其EC50为约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低或者约1nM或更低。举例而言，在某些实施方式中，本文所述的与多于一种FZD结合的FZD结合药剂或抗体相对于这些FZD的EC50为约40nM或更低、约20nM或更低或者约10nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体相对于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)的EC50为约20nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体相对于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)的EC50为约10nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体对于结合FZD5和/或FZD8的EC50为约40nM或更低或者20nM或更低。
在某些实施方式中，FZD结合药剂(例如抗体)与下述表位结合：所述表位与具有包含SEQ ID NO：10的重链可变区和包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的轻链可变区的抗体(例如，18R5或18R8IgG抗体)的表位相同或重叠。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与下述表位结合：所述表位与具有包含SEQ ID NO：11的重链和包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的轻链的抗体的表位相同或重叠。在某些实施方式中，FZD结合药剂与下述表位结合：所述表位与具有包含SEQ ID NO：85的重链可变区和包含SEQ ID NO：86的轻链可变区的抗体(例如，44R24 IgG抗体)的表位相同或重叠。
在某些实施方式中，在竞争性结合测定中FZD结合药剂与抗体竞争对人类卷曲受体的特异性结合，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO：10的重链可变区和包含SEQID NO：12或SEQ ID NO：14的轻链可变区。在某些实施方式中，FZD结合药剂与具有包含SEQ ID NO：11的重链和包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的轻链的抗体竞争，以获得与人类卷曲受体的特异性结合。在某些实施方式中，与所述药剂竞争对人类卷曲受体的特异性结合的抗体是18R5IgG抗体。在某些替代性实施方式中，所述抗体是18R8 IgG抗体。
在某些实施方式中，在竞争性结合测定中FZD结合药剂与抗体竞争对人类卷曲受体的特异性结合，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO：85的重链可变区和包含SEQID NO：86的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述FZD结合药剂或抗体与被本发明人命名为生物学结合部位(BBS)的人类卷曲受体的至少一部分区域结合(图9，实施例6)。在人类FZD8(SEQID NO：54)中，所述BBS由下述(a)、(b)和(c)组成：(a)由氨基酸72(F)、74～75(PL)、78(I)、92(Y)、121～122(LM)和129～132(WPDR(SEQ ID NO：70))构成的构象表位(图8和图9中所示的BBS的“裂缝”)；(b)由序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)组成的FZD8的区域(图8和图9中所示的BBS的“上边缘”)；和(c)由序列YGFA(SEQ ID NO：74)组成的FZD8的区域(图8和图9中所示的BBS的“下边缘”)。位于FZD1～FZD7、FZD9和FZD10上的BBS的相应残基在下表1和图8中示出。在某些实施方式中，阻断配体(例如Wnt)与FZD结合的药剂抑制该配体与BBS的结合。应了解的是，在某些实施方式中，与BBS的至少一部分结合的药剂还结合人类卷曲受体上的一种或多种其他区域(即，在BBS之外)。换言之，在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体所结合的表位是位于FZD受体细胞外结构域中与BBS重叠但并不完全包含于BBS中的区域。在某些替代性实施方式中，FZD结合药剂或抗体所结合的表位完全包含于BBS中(即，BBS包含FZD结合抗体或其他药剂所结合的整个表位)。
表1：FZD受体的生物学结合部位(BBS)。
Figure BDA0000063718710000321
并非受理论束缚，据信BBS含有可能的配体结合部位，例如结合Wnt的部位。在FZD8上，所述可能的配体结合部位包含由氨基酸72(F)、74～75(PL)、78(I)、92(Y)、121～122(LM)和129～132(WPDR(SEQ ID NO：70))构成的构象表位(图8和图9中所示的BBS的“裂缝”)。所述可能的配体结合部位在FZD1～FZD7、FZD9和FZD10上的相应残基在图8的序列比对中示出。在某些实施方式中，阻断配体(例如Wnt)与BBS结合的药剂抑制该配体与所述构象表位的结合。应了解的是，在某些实施方式中，与该配体结合部位的至少一部分结合的药剂还结合人类卷曲受体上的其他区域(例如，在BBS之外的区域)。在某些替代性实施方式中，所述药剂不与FZD的所述构象表位之外的任何部分结合。
在某些实施方式中，如果所述人类卷曲受体为FZD8，则所述药剂与人类卷曲受体中的序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)的至少一部分结合，或如果所述人类卷曲受体为FZD1～FZD7、FZD9或FZD10，则所述药剂与对应序列的至少一部分结合。位于FZD上的该区域包含图8和图9中所示的BBS的“上边缘”。在各种卷曲受体中与FZD8的表位QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)对应的序列在下表2中示出，并且从图8的比对中也明显可见。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体，并且所述药剂与人类卷曲受体中的序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO：24)的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与人类卷曲受体FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8中的序列AGLEVHQF(SEQ ID NO：68)的至少一部分特异性地结合。在某些实施方式中，所述药剂与FZD3、FZD4、FZD6、FZD9和/或FZD10中的与FZD8的序列AGLEVHQF(SEQ ID NO：68)对应的序列的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与人类卷曲受体FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8中的序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)的至少一部分特异性地结合。该序列是图9中所示的BBS的“上边缘”。在某些实施方式中，所述药剂与FZD3、FZD4、FZD6、FZD9和/或FZD10中的与FZD8中的序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)对应的序列的至少一部分结合。与FZD8的序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)对应的序列在下表2的第二列和第三列中用下划线标出，并且从图8的序列比对中明显可见。在某些实施方式中，与FZD8中的SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68的至少一部分结合的药剂或者与其他FZD中的对应表位结合的药剂抑制配体(例如Wnt)与FZD(例如，与FZD的BBS)的结合。在某些实施方式中，与上文指出的区域结合的药剂还可以结合人类卷曲受体上的额外的其他(即，在上文指明的区域之外的)区域。
表2：人类卷曲受体上的对应区域。
(a)：标有下划线的是与FZD8(SEQ ID NO：54)的aa 66～71GLEVHQ(SEQ IDNO：25)对应的序列。
(b)：标有下划线的是与FZD8(SEQ ID NO：54)的aa 125～128YGFA(SEQ IDNO：74)对应的序列。
在某些实施方式中，所述FZD结合药剂(当所述人类卷曲受体为FZD8时)与由序列QYGFA(SEQ ID NO：66)组成的包含BBS“下边缘”的区域的至少一部分或(当所述人类卷曲受体为FZD1～FZD7、FZD9或FZD10时)与对应序列的至少一部分结合。各种卷曲受体中与区域QYGFA(SEQ ID NO：66)对应的序列在图8和上表2中示出。在某些实施方式中，所述FZD结合药剂(当所述人类卷曲受体为FZD8时)与由序列YGFA(SEQ ID NO：74)组成的BBS“下边缘”区域或(当所述人类卷曲受体为FZD1～FZD7、FZD9或FZD10时)与对应序列的至少一部分结合。各种卷曲受体中与区域YGFA(SEQ ID NO：74)对应的序列在图8中示出并上表2的第四列中用下划线标示出。在某些实施方式中，与FZD8中的SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：74的至少一部分结合的或者与其在另一FZD中的对应序列结合的药剂抑制配体(例如Wnt)与FZD(例如，与FZD的BBS)的结合。在某些实施方式中，与此区域结合的药剂还可以结合人类卷曲受体上其他位置(即，在所述区域之外)的一个或多个氨基酸残基。
在某些实施方式中，FZD结合药剂与形成BBS“上边缘”的区域的至少一部分以及形成BBS“下边缘”的区域的至少一部分结合。在某些实施方式中，与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8中的Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO：24)、FZD8中的QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)、FZD8中的AGLEVHQF(SEQ IDNO：68)、和/或FZD8中的GLEVHQ(SEQ ID NO：25)和/或不同人类卷曲受体中与这些序列中的任一个对应的序列(如在上表2中界定的)的至少一部分结合的FZD结合药剂还与FZD8中的QYGFA(SEQ ID NO：66)或FZD8中的YGFA(SEQ ID NO：74)和/或FZD1～FZD7、FZD9或FZD10中与这些序列中的一个对应的序列(如在上表2中界定的)的至少一部分结合。在某些实施方式中，FZD结合药剂与FZD8中的序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)的至少一部分以及FZD8中的序列YGFA(SEQ ID NO：74)的至少一部分结合。在某些实施方式中，FZD结合药剂与下述区域的至少一部分结合：所述区域是FZD1～FZD7、FZD9和FZD10中与FZD8中的序列GLEVHQ(SEQID NO：25)对应的区域，以及FZD1～FZD7、FZD9和FZD10中与FZD8中的序列YGFA(SEQ ID NO：74)对应的区域。在某些实施方式中，与所指出的序列结合的FZD结合药剂还与其所结合的人类卷曲受体中其他位置的一个或多个序列结合。换言之，在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体所结合的表位是FZD细胞外结构域中与上文指出的序列仅部分重叠的区域。在某些替代性实施方式中，FZD结合药剂所结合的整个表位完全包含于上文所指出的序列中。
在某些实施方式中，所述药剂是多肽。在某些实施方式中，所述药剂或多肽是抗体。在某些实施方式中，所述抗体是IgG1抗体或IgG2抗体。在某些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人类抗体或人源化抗体。在某些实施方式中，所述抗体是抗体片段。
可通过本领域中已知的任何方法对本发明的抗体或其他药剂进行特异性结合进行测定。能够使用的免疫测定包括但不限于：使用诸如BIAcore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射性免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定等技术的竞争性或非竞争性测定系统。此类测定在本领域中是公知且常规的测定(参见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，该文献通过参考完整地并入本文中)。
举例而言，可以使用ELISA来确定抗体与人类卷曲受体的特异性结合。ELISA测定包括：制备抗原、用抗原包被96孔微量滴定板的孔、在孔中添加与诸如酶底物(例如辣根过氧物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物偶联的FZD结合抗体或其他FZD结合药剂、温育一段时间和检测抗原的存在。在一些实施方式中，FZD结合抗体或药剂并未与可检测化合物偶联，而是在孔中加入可识别所述FZD结合抗体或药剂的第二种经偶联的抗体。在一些实施方式中，不用抗原对孔进行包被，而是用FZD结合抗体或药剂对孔包被，并且在将抗原加至所包被的孔中后加入与可检测化合物偶联的第二种抗体。本领域的技术人员知晓：经修改可提高检测信号的参数以及本领域中已知的其他ELISA变化(参见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，11.2.1)。
通过竞争性结合测定能够确定抗体或其他药剂与人类卷曲受体结合的亲和力以及抗体-抗原相互作用的脱离速率(off-rate)。竞争性结合测定的一个实例是放射性免疫测定，该测定包括：在逐渐加量的未标记抗原存在的情况下，将带标记的抗原(例如3H或125I标记)或者其片段或变体与所感兴趣的抗体进行温育，随后对结合有带标记抗原的抗体进行检测。通过斯卡恰特作图(scathard plot)分析能够从数据中确定抗体与卷曲受体的亲和力以及结合的脱离速率。在一些实施方式中，使用BIAcore动力学分析来确定与一种或多种人类卷曲受体结合的抗体或药剂的结合速率(on-rate)和脱离速率。BIAcore动力学分析包括由表面固定有FZD抗体的芯片来分析抗体的结合和解离。
在某些实施方式中，所述药剂(例如抗体)是该药剂所结合的至少一种人类卷曲受体(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种FZD)的拮抗剂。在某些实施方式中，对于所述药剂所结合的人类卷曲抗体的一种或多种的活性，所述药剂能对其形成至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的抑制。
在某些实施方式中，FZD结合药剂抑制配体与至少一种人类卷曲受体的结合。在某些实施方式中，FZD结合药剂抑制配体与人类卷曲受体生物学结合部位(BBS)的结合。在某些实施方式中，所述配体是人类Wnt蛋白。已鉴定出了19种人类Wnt蛋白：WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A(以前为WNT14)、WNT9B(以前为WNT15)、WNT10A、WNT10B、WNT11和WNT16。在某些实施方式中，所述药剂抑制WNT3A与FZD8的结合。在某些实施方式中，FZD结合药剂对特定配体与特定人类蛋白卷曲受体的结合所产生的抑制作用为至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，抑制配体(例如Wnt)与FZD结合的药剂还抑制Wnt信号传导(例如，抑制经典Wnt信号传导)。
在某些实施方式中，FZD结合药剂抑制Wnt信号传导。应了解的是，抑制Wnt信号传导的FZD结合药剂在某些实施方式中可以抑制一种或多种Wnt所进行的信号传导，但不必抑制全部Wnt所进行的信号传导。在某些替代性实施方式中，可以抑制所有人类Wnt所进行的信号传导。在某些实施方式中，抑制了一种或多种Wnt进行的信号传导，所述Wnt选自由WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A(以前为WNT14)、WNT9B(以前为WNT15)、WNT10A、WNT10B、WNT11和WNT16组成的组。在某些实施方式中，受到抑制的Wnt信号传导是WNT1、WNT2、WNT3、WNT3A、WNT7a、WNT7b和/或WNT10B进行的信号传导。在某些实施方式中，所述药剂抑制(至少)WNT1、WNT3A、WNT7b和WNT10B进行的信号传导。在特定实施方式中，所述药剂抑制(至少)WNT3A进行的信号传导。在某些实施方式中，FZD结合药剂对Wnt进行的信号传导的抑制作用使Wnt的信号传导水平下降至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，受到抑制的Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。
用于确定FZD结合药剂(或候选FZD结合药剂)是否抑制Wnt信号传导的体内和体外测定在本领域中是已知的。举例而言，可以使用基于细胞的荧光素酶报告基因测定来对经典Wnt信号传导水平进行体外测量，所述测定利用TCF/Luc报告基因载体，所述载体在萤火虫荧光素酶报告基因上游含有多个拷贝的TCF结合结构域(Gazit等，1999，Oncogene 18；5959-66)。对于在一种或多种Wnt(例如，由转染的细胞表达的Wnt或由Wnt条件培养基提供的Wnt)存在时的Wnt信号传导，将其在FZD结合药剂存在的情况下的水平与其在FZD结合药剂不存在的情况下的水平进行比较。在下文实施例3和11中提供了使用此类荧光素酶报告基因测定来评估对经典Wnt信号传导的抑制作用的非限制性具体实例。除了TCF/Luc报告基因测定外，FZD结合药剂(或候选药剂)对经典Wnt信号传导的影响可以通过体外或体内测量该药剂对β-catenin(β连接素)所调控的基因(例如c-myc(He等，Science，281：1509-12(1998))、细胞周期蛋白D1(Tetsu等，Nature，398：422-6(1999))和/或纤连蛋白(Gradl等，Mol.Cell Biol.，19：5576-87(1999)))的表达水平的影响来测得。在某些实施方式中，还可以通过测量药剂对散乱蛋白-1、散乱蛋白-2、散乱蛋白-3、LRP5、LRP6和/或β-catenin的磷酸化状态的影响来评估该药剂对Wnt信号传导的影响。在另外的实施方式中，通过评估FZD结合药剂对Wnt标签中的一种或多种基因的表达水平的影响来确定该FZD结合药剂对Wnt信号传导的影响。
在某些实施方式中，FZD结合药剂具有一种或多种下述效果：抑制肿瘤细胞增殖、通过减少肿瘤中的癌干细胞频率来降低肿瘤致瘤性、抑制肿瘤生长、提高存活率、触发肿瘤细胞的细胞死亡、使致瘤性细胞分化为非致瘤状态或防止肿瘤细胞的转移。
在某些实施方式中，与一种或多种人类卷曲受体特异性地结合的抗体或其他药剂通过所偶联的毒素、化疗剂、放射性同位素或其他此类药剂来触发细胞死亡。举例而言，在某些实施方式中，将针对人类卷曲蛋白抗体的抗体与毒素偶联，并通过蛋白内化作用所述毒素在表达FZD的肿瘤细胞中被活化。在某些替代性实施方式中，所述药剂或抗体未与毒素、化疗剂或放射性同位素偶联。
在某些实施方式中，FZD结合药剂能够抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，FZD结合药剂能够在体内抑制肿瘤生长(例如，在异种移植小鼠模型中和/或在患有癌的人类中)。
在某些实施方式中，FZD结合药剂能够降低肿瘤的致瘤性。在某些实施方式中，所述药剂或抗体能够在动物模型(例如小鼠异种移植模型)中降低含有癌干细胞的肿瘤的致瘤性。在某些实施方式中，肿瘤中癌干细胞的数量或频率降低了至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍或约1000倍。在某些实施方式中，使用动物模型通过有限稀释测定来确定癌干细胞的数量或频率的降低。下文实施例8中提供了用来测试抗FZD抗体效用的有限稀释测定的实例。关于利用有限稀释测定来确定肿瘤中癌干细胞的数量或频率的降低的其他实例和指导可见于例如国际公开第WO2008/042236号、美国专利申请公开第2008/0064049号和美国专利申请公开第2008/0178305号，将上述各篇文献以引用方式整体并入本文中。
在某些实施方式中，人类卷曲受体的抗体通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)来介导表达FZD蛋白的细胞的细胞死亡。ADCC涉及到效应细胞所进行的细胞溶解，所述效应细胞识别抗体的Fc部分。举例而言，很多淋巴细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、粒细胞和嗜曙红细胞具有Fc受体并能够介导细胞溶解(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497)。
在某些实施方式中，抗一种或多种FZD的抗体通过激活补体依赖的细胞毒性(CDC)来触发表达所述FZD蛋白的细胞的细胞死亡。CDC涉及到血清补体与抗体Fc部分的结合以及补体蛋白级联的随后激活，从而导致细胞膜损伤和最终的细胞死亡。抗体的生物活性已知在很大程度上由抗体分子的恒定区或Fc区决定(Uananue和Benacerraf，Textbook of Immunology，第二版，Williams & Wilkins，第218页(1984))。与来自不同物种的相同子类的抗体一样，不同类别和子类的抗体在此方面有所不同。在人类抗体中，IgM是最具效率的结合补体时的抗体类别，之后是IgG1、IgG3和IgG2，而IgG4对于激活补体级联看似非常缺乏效率(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497；Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59-76)。根据本发明，制备了那些具有所需生物活性的类别的抗体。
可以测定抗一种或多种FZD的任何特定抗体通过补体激活和/或ADCC来介导靶细胞溶解的能力。使所感兴趣的细胞在体外生长并对其进行标记；向细胞培养物中组合添加抗体和能够被抗原-抗体复合体激活的血清补体或免疫细胞。举例而言，根据标记从经溶解的细胞中的释放，可检测靶细胞的细胞溶解。实际上，能够使用患者自身的血清作为补体和/或免疫细胞源来筛选抗体。在该特定患者中可以治疗性地使用能够在体外测试中激活补体或介导ADCC的抗体。
本发明提供多肽，其包括但不限于与一种或多种人类卷曲受体特异性地结合的抗体，所述抗体包含18R5和/或18R8的CDR中的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个(参见下文实施例1的表4)，且每个CDR具有最多4(即0、1、2、3或4)个保守性氨基酸取代。因此本发明提供多肽，其包括但不限于与一种或多种人类卷曲受体特异性地结合的抗体，所述抗体包含18R5和/或18R8的CDR中的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个。在某些实施方式中，所述多肽包含18R8的重链CDR3和/或18R5或18R8的轻链CDR3。在某些实施方式中，重链CDR包含于重链可变区内，并且/或者轻链CDR包含于轻链可变区内。
举例而言，本发明提供与人类卷曲受体特异性地结合的多肽(例如抗体)，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的重链可变区：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ IDNO：1)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR1；(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR2；(c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR3。在某些实施方式中，所述多肽还具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的轻链可变区：(a)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ IDNO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQID NO：4或SEQ ID NO：7的变体；(b)轻链CDR2，所述轻链CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8的变体；(c)轻链CDR3，所述轻链CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9的变体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。
因此，本发明提供多肽或抗体，其中所述多肽或抗体具有包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和/或包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)的重链CDR3。在某些实施方式中，轻链CDR包含于抗体重链的可变区内。在某些实施方式中，所述多肽或抗体具有与一种或多种人类卷曲受体特异性地结合的一种或多种重链CDR。在某些实施方式中，CDR经1、2、3或4个保守性氨基酸取代修饰。在某些实施方式中，各重链CDR经不超过1～2个保守性氨基酸取代修饰。
本发明还提供与人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中所述抗体具有包含下述(a)、(b)和(c)的重链可变区：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR1；(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ IDNO：2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR2；(c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体还具有包含下述(a)、(b)和(c)的轻链可变区：(a)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ IDNO：7)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7的变体；(b)轻链CDR2，所述轻链CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8的变体；(c)轻链CDR3，所述轻链CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9的变体。在一些替代性实施方式中，所述抗体相反具有包含下述(a)、(b)和(c)的轻链可变区：(a)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQID NO：7)的轻链CDR1；(b)包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ IDNO：8)的轻链CDR2；(c)包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ IDNO：9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体特异性地结合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述抗体特异性地结合包括FZD5和FZD8在内的两种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。
本发明还提供与人类卷曲受体特异性地结合的多肽(例如抗体)，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的轻链可变区：(a)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7的变体；(b)轻链CDR2，所述轻链CDR2包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8的变体；(c)轻链CDR3，所述轻链CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)，或者具有1、2、3或4个氨基酸取代的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9的变体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。
还提供了具有下述(a)、(b)和/或(c)多肽或抗体：(a)包含序列SGD(K/N)(L/I)G(K/S)(K/F)Y(A/V)(S/H)(SEQ ID NO：71)或最多有4(即0、1、2、3或4)个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO：71序列的轻链CDR1；(b)包含序列(E/D)K(D/S)NRPSG(SEQ ID NO：72)或最多有4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO：72序列的轻链CDR2；(c)包含序列(S/Q)S(F/Y)A(G/N)(N/T)(无aa/L)SL(E/无aa)(其中“无aa/L”表示L或无氨基酸，“E/无aa”表示E或无氨基酸；SEQ NO：73)或最多有4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO：73序列的轻链CDR3。
本发明还提供多肽或抗体，所述多肽或抗体具有包含SGDKLGKKYAS(SEQ IDNO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ IDNO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)的轻链CDR2和/或包含SSFAGNSLE(SEQ IDNO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，多肽或抗体具有包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ IDNO：8)的轻链CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。在某些替代性实施方式中，多肽或抗体具有包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)的轻链CDR2和包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)的轻链CDR3。在某些实施方式中，轻链CDR包含于抗体轻链的可变区内。在某些实施方式中，多肽或抗体特异性地结合一种或多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，具有一种或多种轻链CDR的多肽或抗体与一种或多种人类卷曲受体特异性地结合。在某些实施方式中，已经通过1、2、3或4个保守性修饰对CDR进行修饰。在某些实施方式中，已经通过不超过1～2个保守性氨基酸取代对各轻链CDR进行修饰。
在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)的重链CDR3；和/或(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ IDNO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ IDNO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)的轻链CDR2和包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)的重链CDR3；和(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1、包含EKDNRPSG(SEQ ID NO：5)的轻链CDR2和包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ IDNO：3)的重链CDR3；和(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)的轻链CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，已经通过1、2、3或4个保守性氨基酸取代对CDR进行修饰。在某些实施方式中，已经通过不超过1～2个保守性氨基酸取代对各CDR进行修饰。
本发明还提供多肽，其包括但不限于与一种或多种人类卷曲受体特异性地结合的抗体，所述抗体包含抗FZD抗体44R24的CDR中的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个(参见下文实施例18的表7)，且每个CDR具有最多4(即0、1、2、3或4)个保守性氨基酸取代。因此本发明提供多肽，其包括但不限于与一种或多种人类卷曲受体特异性地结合的抗体，所述抗体包含44R24的CDR中的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个。在某些实施方式中，所述多肽包含44R24的重链CDR3和/或44R24的轻链CDR3。在某些实施方式中，重链CDR包含于重链可变区内，并且/或者轻链CDR包含于轻链可变区内。
本发明还提供与人类FZD5和/或FZD8特异性地结合的多肽(例如抗体)，其中所述抗体具有：(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO：77)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDR1；包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：78)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDR2；和包含SIVFDY(SEQ IDNO：79)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDR3；和/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO：80)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链CDR1；包含SG(SEQ ID NO：81)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链CDR2；和包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO：82)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体(或其他FZD结合多肽)具有：(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO：77)的重链CDR1、包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：78)的重链CDR2和包含SIVFDY(SEQ IDNO：79)的重链CDR3；和/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO：80)的轻链CDR1、包含SG(SEQ ID NO：81)的轻链CDR2和包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO：82)的轻链CDR3。
还提供了含有本文所述的单条轻链或重链中的一个的多肽，以及既含有轻链又含有重链的多肽(例如抗体)。
还提供了含有下述(a)和/或(b)的多肽：(a)与SEQ ID NO：10的序列同一性为至少约80％的多肽；(b)与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的序列同一性为至少约80％的多肽。在某些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO：10、12或14的序列同一性为至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的多肽。因此，在某些实施方式中，所述多肽包含(a)与SEQ ID NO：10的序列同一性为至少约95％的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的序列同一性为至少约95％的多肽。在某些实施方式中，所述多肽包含(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽；和/或(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的多肽。在某些实施方式中，所述多肽含有(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO：11的多肽；和/或(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的多肽。在某些实施方式中，所述多肽是抗体和/或与一种或多种人类卷曲受体(例如，FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)特异性地结合的多肽。举例而言，本发明提供与人类卷曲受体特异性地结合的抗体，所述抗体包含(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽；和(b)具有氨基酸序列SEQ IDNO：14的多肽。在某些实施方式中，具有SEQ ID NO：10的多肽是重链可变区。在某些实施方式中，具有SEQ ID NO：12或14的多肽是轻链可变区。在某些实施方式中，与SEQ ID NO：10、12或14具有一定百分比的序列同一性的多肽与SEQ ID NO：10、12或14的区别仅在于保守性氨基酸取代。
在某些实施方式中，所述多肽或抗体包含：(a)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；(b)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14；(c)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13；或(d)SEQID NO：11和SEQ ID NO：15。
本发明还提供与FZD5和/或FZD8特异性地结合的抗体或其他多肽，所述抗体或其他多肽包含：(a)与SEQ ID NO：85的同一性为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO：86的同一性为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的多肽。在某些替代性实施方式中，所述多肽或抗体包含SEQ ID NO：85和/或SEQ ID NO：86。
在某些实施方式中，FZD结合药剂包括抗FZD抗体、主要由抗FZD抗体组成或由抗FZD抗体组成，所述抗FZD抗体选自由18R8、18R5、18R4605、18R4805和44R24 IgG抗体组成的组。
在某些实施方式中，FZD结合药剂包含18R8 IgG2抗体的重链和轻链(带有或不带有前导序列)。在某些实施方式中，FZD结合药剂是18R8 IgG2抗体。依照布达佩斯条约的要求，已于2008年9月29日将编码18R8 IgG2抗体重链和轻链的DNA保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801 University Boulevard，Manassas，VA，USA)，且指定的ATCC保藏号为PTA-9540。在某些实施方式中，FZD结合药剂包含18R5 IgG2抗体的重链和轻链(带有或不带有前导序列)。在某些实施方式中，FZD结合药剂是18R5 IgG2抗体。依照布达佩斯条约的要求，已于2008年9月29日将编码18R5 IgG2抗体重链和轻链的DNA保藏于ATCC，且指定的ATCC保藏号为PTA-9541。
在某些实施方式中，FZD结合药剂是由质粒编码的IgG抗体，所述质粒在2009年8月26日保藏于ATCC，且指定的保藏号为PTA-10307、PTA10309或PTA-10311。
在某些实施方式中，FZD结合药剂是与抗体竞争(例如在竞争性结合测定中)对FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的特异性结合的药剂，所述抗体由ATCC保藏号为PTA-9540、PTA-9541、PTA-10307或PTA-10309的质粒编码。在某些替代性实施方式中，FZD结合药剂是与ATCC保藏号为PTA10311的质粒所编码的抗体竞争对FZD5和/或FZD8的特异性结合的药剂。
在某些实施方式中，FZD结合药剂在小鼠、食蟹猴(cynomologous monkey)或人体中的循环半衰期为至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。在某些实施方式中，FZD结合药剂是IgG(例如IgG1或IgG2)抗体，其在小鼠、食蟹猴或人体中的循环半衰期为至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。提高诸如多肽和抗体等药剂的半衰期的方法为本领域已知。举例而言，提高IgG抗体的循环半衰期的已知方法包括在FC区中引入突变，其提高pH为6.0时抗体与新生Fc受体(FcRn)的pH依赖型结合(参见例如美国专利公开第2005/0276799、2007/0148164和2007/0122403号)。提高缺少Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括诸如聚乙二醇化等技术。
能够用任何已知方法来制备多克隆抗体。通过多次皮下注射或腹膜内注射相关抗原(纯化的肽段、全长重组蛋白、融合蛋白等)来使动物(例如兔、大鼠、小鼠、驴等)免疫，从而产生多克隆抗体，所述抗原可选地与稀释于无菌盐水中的匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白等偶联并且与佐剂(例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂)组合以形成稳定乳浊液。随后从由此免疫的动物的血液、腹水等中回收多克隆抗体。所收集的血液发生凝结，随后倾析血清，离心澄清，并进行抗体效价测定。根据本领域中的标准方法能够从血清或腹水中纯化出多克隆抗体，所述方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶电泳、透析等。
能够使用例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495所描述的杂交瘤方法来制备单克隆抗体。通过使用杂交瘤方法，如上所述使小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物免疫，从而引发淋巴细胞产生与免疫抗原特异性地结合的抗体。还可以在体外使淋巴细胞免疫。免疫化之后，分离出淋巴细胞，并且使用例如聚乙二醇来使所述淋巴细胞与适合的骨髓瘤细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞，随后能够从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出所述杂交瘤细胞。通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定(例如放射性免疫检测(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定产生特异针对选定抗原的单克隆抗体的杂交瘤，随后可以将所述杂交瘤使用标准方法(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press，1986)在体外培养基中进行增殖，或者作为动物中的腹水瘤在体内进行增殖。随后可按照上文对多克隆抗体所做的描述，从培养基或腹水液中纯化出单克隆抗体。
作为另一种选择，还能够使用在美国专利第4,816,567号中所述的重组DNA方法来制备单克隆抗体。例如通过使用寡核苷酸引物的RT-PCR，从成熟B细胞或杂交瘤细胞中分离出编码单克隆抗体的多核苷酸，并使用常规程序来确定其序列，所述引物特异性地扩增编码抗体的重链和轻链的基因。随后将已分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆至适合的表达载体中，随后将所述载体转染至不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞中(例如E.coli细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)，并由该宿主细胞产生单克隆抗体。此外，能够从表达所需物种CDR的噬菌体展示文库中分离出该所需物种的重组单克隆抗体及其片段(McCafferty等，1990，Nature，348：552-554；Clackson等，1991，Nature，352：624-628；以及Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222：581-597)。
可以使用重组DNA技术以多种不同的方式对编码单克隆抗体的多核苷酸进行进一步的修饰，从而产生替代性抗体。在一些实施方式中，可用例如小鼠单克隆抗体的轻链及重链的恒定区替换1)例如人类抗体的这些区域从而产生嵌合抗体或者替换为2)非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方式中，将恒定区截短或除去以产生单克隆抗体的所需抗体片段。能够使用对可变区进行的定点突变或高密(high-density)突变来优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在一些实施方式中，抗人类卷曲受体的单克隆抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，在对人类受试者进行施用时，治疗性地使用此类抗体来减少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)应答。可以使用本领域中已知的各种技术来产生人源化抗体。在某些替代性实施方式中，人类卷曲受体的抗体是人类抗体。
能够使用本领域中已知的各种技术来直接制备人类抗体。能够制备从经免疫个体分离出的或者在体外免疫的永生化人类B淋巴细胞，所述永生化人类B淋巴细胞产生针对靶抗原的抗体(参见例如Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boemer等，1991，J.Immunol.，147(1)：86-95；以及美国专利第5,750,373号)。此外，所述人类抗体能够从表达人类抗体的噬菌体文库中选出，例如在下述文献中描述的：Vaughan等，1996，Nat.Biotech.，14：309-314；Sheets等，1998，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；以及Marks等，1991，J.Mol.Biol，222：581。在美国专利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号；第6,593,081号；第6,300,064号；第6,653,068号；第6,706,484号和第7,264,963号；以及Rothe等，2007，J.Mol.Bio.，doi：10.1016/j.jmb.2007.12.018(各篇文献通过参考整体并入本文)中也描述了用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术。亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等，1992，Bio/Technology 10：779-783，通过参考整体并入)为本领域已知，并且可以用来产生高亲和力人类抗体。
还可以在包含人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人源化抗体，在不产生内源免疫球蛋白的情况下，所述基因座能够在进行免疫时产生全套的人抗体。在美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016号中描述了该方法。
本发明还涵盖了特异性地识别人类卷曲受体的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性地识别并结合至少两个不同表位的抗体。所述不同表位可以在同一分子内(例如，同一人类卷曲受体)或位于不同分子上，以致于例如两个抗体都能够特异性地识别并结合人类卷曲受体以及例如1)诸如T细胞受体(例如CD3)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)等白细胞上的效应分子或者2)下文详细描述的细胞毒性剂。在某些实施方式中，双特异性抗体特异性地结合至少一种人类卷曲受体以及VEGF、Notch配体如δ样配体(例如DLL4)或Jagged配体、或者至少一种选自由Notch1、Notch2、Notch3和Notch4组成的组的Notch受体。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。
示例性双特异性抗体能够结合两种不同的表位，其中至少一种源自本发明的多肽。作为另一种选择，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与结合诸如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体等白细胞上的触发性分子的臂组合，从而使细胞防御机制集中到表达特定抗原的细胞上。双特异性抗体还能够用来将细胞毒性剂引导至表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。用于制备双特异性抗体的技术在本领域中是常见的(Millstein等，1983，Nature 305：537-539；Brennan等，1985，Science 229：81；Suresh等，1986，Methods in Enzymol.121：120；Traunecker等，1991，EMBO J.10：3655-3659；Shalaby等，1992，J.Exp.Med.175：217-225；Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547-1553；Gruber等，1994，J.Immunol.152：5368；以及美国专利第5,731,168号)。还提供了多于二价的抗体。举例而言，可以制备三特异性抗体(Tutt等，J.Immunol.147：60(1991))。因此，在某些实施方式中，人类卷曲受体的抗体是多特异性的。
作为另一种选择，在某些替代性实施方式中，本发明的FZD结合药剂不是双特异性抗体。
在某些实施方式中，本文所述的抗体(或其他多肽)可以是单特异性的。举例而言，在某些实施方式中，抗体所包含的一个或多个抗原结合部位中的每一个都结合或能够结合同样的一种或多种人类FZD受体(例如FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8，或者在某种组合的FZD上的同源表位)。在某些实施方式中，本文所述的单特异性抗体的抗原结合部位结合或能够结合一种、两种、三种、四种或五种(或更多种)人类卷曲受体。
在某些实施方式中，提供抗体片段，从而例如提高肿瘤渗透。用来产生抗体片段的各种技术是已知的。传统上通过对完整抗体进行蛋白水解性酶切来获得这些片段(例如Morimoto等，1993，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117；Brennan等，1985，Science，229：81)。在某些实施方式中，通过重组手段产生抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都能够在E.coli或其他宿主细胞中表达并分泌，从而可以产生大量这些片段。还可以从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离出此类抗体片段。抗体片段还可以是例如在美国专利5,641,870中描述的线状抗体，并且可以是单特异性的或双特异性的。用来产生抗体片段的其他技术对本领域技术人员而言是显而易见的。
根据本发明，可以对技术进行修改使之适于产生对一种或多种人类卷曲受体有特异性的单链抗体(参见美国专利第4,946,778号)。此外，可以对方法进行修改使之适于构建Fab表达文库(Huse等，Science 246：1275-1281(1989))从而可以快速有效地鉴定具有对FZD受体有所需的特异性的单克隆Fab片段或其衍生物、片段、类似物或同源物。抗体片段可以通过本领域中的技术来制备，所述抗体片段包括但不限于：(a)通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化而产生的F(ab’)2片段；(b)通过还原F(ab’)2片段的二硫键而产生的Fab片段，(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段，和(d)Fv片段。
更理想的是，对抗体进行修饰(尤其对于抗体片段而言)从而提高其血清半衰期。这可以通过下述方式来实现：例如，通过抗体片段中适合区域的突变将补救受体(salvage receptor)结合表位引入抗体片段中，或者将表位引入肽标签中并随后将所述肽标签融合至抗体片段的任一端或中部(例如通过DNA或肽合成)。
异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价结合的抗体组成。举例而言，已提出此类抗体会将免疫细胞靶向至有害细胞(美国专利第4,676,980号)。本发明还包括：使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括那些涉及交联剂的方法)在体外制备抗体。举例而言，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的适合试剂的实例包括亚氨基四氢噻吩和甲基-4-巯基丁酰亚胺酸酯。
出于本发明的目的，应意识到的是，修饰后的抗体能够包含用于使该抗体与人类FZD受体的多肽联结的任何类型的可变区。鉴于此，所述可变区可以包含或源自经诱导能够产生体液应答并产生针对所需的肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的哺乳动物的任何类型可变区。因此，修饰后的抗体的可变区可以属于例如人类、鼠类、非人类灵长动物(例如食蟹猴、猕猴等)或狼等来源。在一些实施方式中，修饰后的免疫球蛋白的可变区和恒定区都是人类的。在其他实施方式中，可以对相容性抗体(compatibleantibody)的可变区(通常源自非人类源)进行工程化或特殊裁剪，从而改善该分子的结合属性或减少其免疫原性。鉴于此，可以对本发明中有用的可变区进行人源化，或者通过包含引入的氨基酸序列来对其进行改变。
在某些实施方式中，通过对一个或多个CDR进行至少部分地置换，以及必要时通过部分框架区置换和序列改变，来更改重链和轻链中的可变域。虽然CDR可以源自与框架区所源自的抗体类别甚至子类相同的抗体，但是设计CDR源自不同类别的抗体且优选源自不同物种的抗体。为了将一种可变域的抗原结合能力转移至另一种可变域，可以不必用来自供体可变区的完整CDR来置换所有CDR。相反，可以仅须转移对于保持抗原结合部位活性而言必要的那些残基。鉴于在美国专利第5,585,089、5,693,761和5,693,762号中所进行的说明，对于本领域的技术人员而言有能力做到的是，通过进行常规实验或通过试错试验来获得具有减少的免疫原性的功能性抗体。
尽管对可变区做出了更改，但本领域的技术人员会意识到本发明的修饰后的抗体会包括下述抗体(例如全长抗体或其免疫反应性片段)：所述抗体中一个以上恒定区结构域的至少一部分已被缺失或更改，从而与含有天然或未经更改的恒定区并具有大致相同的免疫原性的抗体相比，其提供了所需的生物化学特性，例如提高的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一些实施方式中，修饰后的抗体的恒定区将包含人类恒定区。与本发明相容的恒定区修饰包括一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。换言之，本文所公开的修饰后的抗体可以包含对三个重链恒定域(CH1、CH2或CH3)中的一个以上和/或轻链恒定域(CL)的更改或修饰。在一些实施方式中，提供了一个或多个结构域部分缺失或完全缺失的修饰后的恒定区。在一些实施方式中，修饰后的抗体将包含已经移除了整个CH2域的域缺失构建体或变体(ΔCH2构建体)。在一些实施方式中，会用可提供一定分子柔性的短氨基酸间隔物(例如10个残基)置换所删掉的恒定区结构域，所述分子柔性通常由缺少的恒定区提供。
除了其构造以外，本领域已知恒定区可介导若干效应功能。举例而言，补体C1成分与抗体的结合激活补体系统。补体的激活在调理作用和细胞病原体溶解中起重要作用。补体的激活还刺激炎症反应，并且还可参与自身免疫性超敏反应。另外，抗体通过Fc区域与细胞结合，用抗体Fc区域上的Fc受体部位来结合细胞上的Fc受体(FcR)。存在对不同类别的抗体有特异性的很多Fc受体，所述抗体的类别包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合会触发很多重要而多样的生物学反应，包括对抗体包裹颗粒的吞噬和破坏、免疫复合体的清除、由杀伤细胞进行的抗体包裹的靶细胞的溶解(称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和对免疫球蛋白的产生的控制。
在某些实施方式中，FZD结合抗体提供了更改的效应功能，该功能反过来影响所施用的抗体的生物学特征。举例而言，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方法)可以减少循环中的修饰后抗体与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位。在其他情况下可能的是，与本发明一致的恒定区修饰会调节补体结合，并因此缩短血清半衰期并减少与所偶联的细胞毒素的非特异性联结。对恒定区的其他修饰还可以用来消除二硫键或寡糖部分，从而因抗原特异性或抗体柔性提高而增强定位。相似地，可以使用在技术人员知识范围内所熟知的生物化学或分子工程技术来容易地实现本发明对恒定区做出的修饰。
在某些实施方式中，FZD结合药剂是不具有一种或多种效应功能的抗体。举例而言，在一些实施方式中，抗体不具有抗体依赖的细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖的细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方式中，抗体不与Fc受体和/或补体因子结合。在某些实施方式中，抗体不具有效应功能。
应注意的是，在某些实施方式中，可以对修饰后的抗体进行工程化，使CH3结构域直接融合至相应的修饰后抗体的铰链区。在其他构建体中需要的是，可以在铰链区和修饰后的CH2和/或CH3结构域之间提供肽间隔序列。举例而言，可以表达兼容构建体，在所述兼容构建体中已缺失了CH2结构域并且用5～20个氨基酸的间隔序列将剩余的CH3结构域(经修饰或未修饰)连接至铰链区。举例而言，可以增加此间隔序列来确保恒定域的调控元件保持自由并可接触，或者确保铰链区保持柔性。然而应注意的是，在一些情况下能够证实氨基酸间隔序列具有免疫原性并引发对该构建体不利的免疫应答。因此，在某些实施方式中，任何加入该构建体的间隔序列将相对不具有免疫原性或者甚至完全略去，从而保持修饰后抗体的所需生物化学品质。
应意识到的是，除了缺失整个恒定区结构域以外，还可以通过部分缺失或对几个甚至单个氨基酸进行取代来提供本发明的抗体。举例而言，CH2结构域的选定区域中的单个氨基酸突变足以基本减弱Fc结合，从而增强肿瘤定位。类似地，理想的是对于控制待调节的效应功能(例如补体CLQ结合)的一个或多个恒定区结构域的上述部分，可以进行简单缺失。对恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的选定特性(血清半衰期)，同时完整地保留了与所处理恒定区结构域有关的其他所需功能。另外，如上所暗示的，可以通过对一个或多个氨基酸进行的突变或取代来修饰此处公开的抗体的恒定区，所述突变或取代增强所得构建体的特性。在这点上，有可能进行的是，破坏保守结合部位(例如Fc结合)所提供的活性，同时基本保留修饰后抗体的结构和免疫原特性。某些实施方式能够包括将一个或多个氨基酸添加至恒定区中，从而增强所需的特性，例如减弱或增强效应功能，或者为更多的细胞毒素或糖类提供附着。在此类实施方式中，理想的是可以插入或置换源自选定恒定区结构域的特定序列。
本发明还包括与本文所提出的嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体或其抗体片段基本同源的变体和等价物。上述变体和等价物可以包含例如保守性取代突变，即用相似的氨基酸对一个或多个氨基酸的取代。举例而言，保守性取代是指用同一大类的某一氨基酸来取代另一氨基酸，例如用某一酸性氨基酸取代另一酸性氨基酸，用某一碱性氨基酸取代另一碱性氨基酸，或者用某一中性氨基酸取代另一中性氨基酸。保守性氨基酸取代的目的为本领域所公知。
本发明还涉及免疫偶联物，其包含与细胞毒性剂偶联的抗体。细胞毒性剂包括化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如，源自细菌、真菌、植物或动物的酶活性毒素或其片段)、放射性同位素(即放射性偶联物)等。可用于产生此类免疫偶联物的化疗剂包括例如氨甲喋呤、亚德里亚霉素(adriamicin)、阿霉素(doxorubicin)、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、正定霉素或其他嵌入剂。能够使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(α-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordiiprotein)、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordicacharantia inhibitor)、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂(sapaonariaofficinalis inhibitor)、白树毒素(gelonin)、丝裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和三隔镰孢霉素(tricothecene)。多种放射性核素可以用来产生放射性偶联的抗体，包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒性剂的偶联物的制造使用了多种双功能蛋白偶联剂，例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基四氢噻吩(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如己二酰亚胺酸二甲酯盐酸盐，dimethyl adipimidate HCL)、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双(重氮基)衍生物(例如双(对-重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如亚苄基2，6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。还能够使用抗体和一种或多种小分子毒素(例如卡奇霉素(calicheamicin)、美登醇(maytansinoid)、三隔镰孢霉素和CC1065以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物)的偶联物。
偶联抗体由两个共价结合的抗体组成。举例而言，已提出此类抗体会将免疫细胞靶向至有害的细胞(美国专利第4,676,980号)。还包括的是，能够使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括那些涉及交联剂的方法)在体外制备抗体。举例而言，能够使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的适合试剂的实例包括亚氨基四氢噻吩和甲基-4-巯基丁酰亚胺酸酯。
不论有用的量是如何获得的，本发明的抗体能够以多种偶联形式(即免疫偶联物)或未偶联形式中的任何一种来进行使用。作为另一种选择，本发明的抗体能够以未偶联形式或“裸”形式来进行使用。在某些实施方式中，以未偶联形式来使用抗体，从而利用受试者的天然防御机制(包括补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖的细胞毒性(ADCC))来消灭恶性细胞。在一些实施方式中，可以使用多种公知的螯合剂或直接标记中的任何一种来使抗体与放射性同位素偶联，例如90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。在其他实施方式中，所公开的组合物可以包含与诸如氨甲喋呤、亚德里亚霉素和淋巴因子(例如干扰素)等药物、前药或生物反应修饰剂偶合的抗体。本发明另外的实施方式包括使用与特定生物毒素(例如蓖麻毒素或白喉毒素)偶联的抗体。在再另外的实施方式中，修饰后的抗体可以与其他免疫活性配体(例如抗体或其片段)复合，其中所得的分子同时与赘生性细胞和效应细胞(例如T细胞)结合。选择何种偶联的或未偶联的修饰后抗体来使用将取决于癌症的类型和阶段、对辅助治疗的使用(例如化学疗法或外部辐射)和患者状态。应意识到的是，提供本文的教导，本领域的技术人员可以容易地做出这样的选择。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，其包含抗人类FZD受体的抗体或其片段。在本领域中应认识到的是，能够在对蛋白的结构或功能无显著影响的情况下使本发明的一些氨基酸序列发生变化。因此，本发明还包括多肽的变体，其显示出基本的活性或包含抗人类FZD受体蛋白的抗体区域或其片段。此类突变体包括缺失、插入、倒位、重复和类型取代。
可以进一步修饰多肽及其类似物，从而使之包含通常不属于蛋白一部分的附加化学部分。这些衍生出的部分能够改善蛋白的溶解性、生物学半衰期或吸附。这些部分还能够减少或消除蛋白的任何需要的副作用等。对于这些部分的综述可见于REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第20版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(2000)。
能够通过本领域已知的任何适合的方法来产生本文所述的分离的多肽。这些方法包括直接的蛋白合成方法以及构建DNA序列，所述DNA序列编码分离多肽的序列且在适合的已转化宿主中表达这些序列。在一些实施方式中，使用重组技术通过分离或合成编码所感兴趣的野生型蛋白的DNA序列来构建DNA序列。可选的是，能够通过位点特异性突变来对该序列进行突变，从而提供其功能类似物。参见例如Zoeller等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 81：5662-5066(1984)以及美国专利第4,588,585号。
在一些实施方式中，可以使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建编码所感兴趣的多肽的DNA序列。可以基于所需多肽的氨基酸序列，并选择在将产生所感兴趣的重组多肽的宿主细胞中所偏好的密码子，从而设计此类寡核苷酸。能够使用标准方法来合成已分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码所感兴趣的分离的多肽。举例而言，可以使用完整的氨基酸序列来构建反向翻译的基因。另外，能够合成DNA寡聚体，其包含编码特定的分离多肽的核苷酸序列。举例而言，能够合成编码所需多肽各部分的若干小寡核苷酸并随后将其连接。单个的寡核苷酸通常包含用于互补装配的5’或3’突出端。
一旦装配完成(通过合成、定点突变或其他方法)，会将编码特定的分离的所感兴趣多肽的多核苷酸序列插入表达载体中，并可操作地连接至适合在所需宿主中表达蛋白的表达控制序列。能够通过核苷酸测序、限制性酶切作图和在适合的宿主中表达生物活性多肽来确认装配正确。如本领域所公知的，为了在宿主中获得所转染基因的高表达水平，必需将该基因操作性地连接至在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。
在某些实施方式中，使用重组表达载体来扩增并表达DNA，所述DNA编码抗人类卷曲受体的抗体或其片段。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有合成的或源自cDNA的DNA片段，所述片段编码抗FZD抗体的多肽链或其片段，并操作性地连接至源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫的基因的适合的转录或翻译调控元件。转录单元通常包含下述(1)、(2)和(3)的集合体：(1)在基因表达中起调控作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)结构序列或编码序列，其会转录成mRNA并翻译成蛋白，(3)下文所详细描述的适合的转录和翻译的起始序列和终止序列。此类调控元件可以包括控制转录的操纵子序列。可以额外加入在宿主中进行复制的能力(所述能力通常由复制起点赋予)和用来促进对转化体的识别的选择基因。D当DNA区域在功能上相互关联时，将其它们操作性连接起来。举例而言，如果表达为参与多肽分泌的前体，则将信号肽(分泌前导段)的DNA与该多肽的DNA操作性地连接；如果控制编码序列的转录，则将启动子与该编码序列操作性地连接；或者如果核糖体结合部位的位置可允许翻译进行，则将其与编码序列操作性地连接。经设计用于酵母表达系统的结构元件包括前导序列，该序列能够使宿主细胞将翻译出的蛋白分泌至细胞外。作为另一种选择，在无前导序列或转运序列的情况下表达重组蛋白时，所述蛋白可包含N端蛋氨酸残基。可以随后可选地将该残基从所表达的重组蛋白上切除，从而得到最终产物。
对表达控制序列和表达载体的选择将取决于对宿主的选择。能够采用多种表达宿主/载体组合。可用于真核生物宿主的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒(adenovim)和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR1、pBR332、pMB9及其衍生物)，以及广宿主质粒(例如M13和丝状单链DNA噬菌体)。
用于表达FZD结合多肽或抗体(或用作抗原的FZD蛋白)的适合的宿主细胞包括由适合的启动子控制的原核生物、酵母、昆虫或高等真核生物细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如E.coli或杆菌。高等真核生物细胞包括下述的已建立的哺乳动物来源细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。Pouwels等描述了用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适合的克隆载体和表达载体(Cloning Vectors：ALaboratory Manual，Elsevier，N.Y，1985)，因此将其中相关的公开内容通过参考并入本文中。关于产生蛋白(包括产生抗体)的方法的其他信息可见于例如美国专利公告第2008/0187954号、美国专利6,413,746号和6,660,501号以及国际专利第WO04009823号公告中，并因此将其中各篇通过参考整体并入本文。
采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白也是有利的。能够在哺乳动物细胞中进行重组蛋白的表达的原因在于此类蛋白通常可正确折叠、适当修饰并具有完全功能。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括由Gluzman描述的COS-7猴肾细胞系(Cell 23：175，1981)和能够表达适合载体的其他细胞系(包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、Hela和BHK细胞系)。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，例如复制起点、与待表达基因连接的适合的启动子及增强子和其他5’或3’侧非转录序列，以及5’或3’非翻译序列，例如必需的核糖体结合部位、多腺苷酸化部位、剪接供体及受体部位和转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统在Luckow和Summers，Bio/Technology 6：47(1988)中有所综述。
能够使用任何适合的方法来纯化由转化后的宿主产生的蛋白。此类标准方法包括层析(例如，离子交换层析、亲和层析和尺寸排阻柱层析)、离心、差异溶解度(differentialsolubility)或蛋白纯化的任何其他标准方法。可以将诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒外壳蛋白序列(influenza coat sequence)和谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签连接到蛋白上，从而可以使蛋白在经过适合的亲和柱时容易得到纯化。还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和X射线晶体学等技术来对已分离的蛋白进行物理表征。
举例而言，对于将重组蛋白分泌至培养基中的系统的上清液，可以首先使用商售蛋白浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)来进行浓缩。在浓缩步骤之后，可以将浓缩物加到适合的纯化基质中。作为另一种选择，可以采用阴离子交换树脂，例如具有悬突的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或常用于蛋白纯化的其他类型基质。作为另一种选择，可以使用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括包含磺丙基或羧甲基基团的各种不溶性基质。最后，可以利用一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化FZD结合药剂，所述RP-HPLC采用疏水性RP-HPLC介质，例如具有悬突的甲基或其他脂肪族基团的硅胶。还可以采用一些或全部上述纯化步骤的各种组合来提供均一的重组蛋白。
在细菌培养物中产生的重组蛋白可以通过例如下述步骤来进行分离：从细胞沉淀物中进行起始提取，随后进行一个或多个浓缩、盐析、水相离子交换或尺寸排阻层析步骤。高效液相色谱(HPLC)可用于最后的纯化步骤。可以通过任何便利的方法(包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞溶解剂)来破碎表达重组蛋白所用的微生物细胞。
纯化抗体及其他蛋白的领域中已知方法还包括例如那些在美国专利第2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005号公告(其中各篇都由此通过参考方式完整地并入本文)中所描述的方法。
在某些实施方式中，FZD结合药剂是非抗体多肽。用于鉴定并产生以高亲和力与蛋白靶标结合的非抗体多肽的多种方法为本领域中已知。参见例如Skerra，Curr.Opin.Biotechnol.，18：295-304(2007)；Hosse等，Protein Science，15：14-27(2006)；Gill等，Curr.Opin.Biotechnol.，17：653-658(2006)；Nygren，FEBS J.，275：2668-76(2008)；以及Skerra，FEBS J.，275：2677-83(2008)，其中各篇都通过参考方式完整地并入本文。在某些实施方式中，已使用噬菌体展示技术来鉴定/制备FZD结合多肽。在某些实施方式中，所述多肽包含选自由蛋白A、脂质运载蛋白(lipocalin)、纤维连接蛋白(fribronectin)结构域、锚蛋白共有重复结构域(ankyrin consensus repeat domain)和硫氧还蛋白组成的组的一种类型的蛋白框架。
在一些实施方式中，所述药剂是非蛋白分子。在某些实施方式中，所述药剂是小分子。在鉴定非蛋白FZD结合药剂中有用的组合化学库和技术对于本领域的技术人员而言是已知的。参见例如Kennedy等，J.Comb.Chem，10：345-354(2008)；Dolle等，J.Comb.Chem.，9：855-902(2007)；以及Bhattacharyya，Curr.Med.Chem.，8：1383-404(2001)，其中各篇都通过参考方式完整地并入本文。在某些其他实施方式中，所述药剂是糖类、糖胺聚糖、糖蛋白或蛋白聚糖。
在某些实施方式中，所述药剂是核酸适体(aptamer)。适体是根据其结合另一分子的能力而选出(例如，从随机池或突变库中选出)的多核苷酸分子。在一些实施方式中，适体包含DNA多核苷酸。在某些替代性实施方式中，适体包含RNA多核苷酸。在某些实施方式中，适体包含一个或多个经修饰的核酸残基。产生并筛选用于结合蛋白的核酸适体的方法为本领域所公知。参见例如美国专利第5,270,163号、美国专利第5,683,867号、美国专利第5,763,595号、美国专利第6,344,321号、美国专利第7,368,236号、美国专利第5,582,981号、美国专利第5,756,291号、美国专利第5,840,867号、美国专利第7,312,325号、美国专利第7,329,742号、国际专利第WO 02/077262号公告、国际专利第WO 03/070984号公告、美国专利申请第2005/0239134号公告、美国专利申请第2005/0124565号公告和美国专利申请第2008/0227735号公告，其中将各篇都通过参考方式完整地并入本文。
本发明还提供筛选具有抑制Wnt信号传导效用、抗肿瘤效用和/或抗癌干细胞效用的药剂的方法。这些方法包括但不限于：包括将第一实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平与第二实体瘤中的该一种或多种分化标记物的水平进行比较的方法，所述第一实体瘤已暴露于所述药剂，而所述第二实体瘤未暴露于所述药剂。在某些实施方式中，这些方法包括：(a)使第一实体瘤而非第二实体瘤暴露于所述药剂；(b)对第一实体瘤和第二实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平进行评估；和(c)将第一实体瘤与第二实体瘤中的所述一种或多种分化标记物的水平进行比较。在某些实施方式中，所述药剂是经典Wnt信号传导途径的抑制剂，并且/或者抑制一种或多种人类Wnt蛋白与一种或多种人类卷曲受体的结合。在某些实施方式中，所述药剂是特异性地结合一种或多种人类卷曲受体的抗体。在某些实施方式中，与第二实体瘤相比，第一实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平有所升高，这表明了抗实体瘤干细胞的效用。在某些替代性实施方式中，与第二实体瘤相比，第一实体瘤中的一种或多种分化标记物(即分化的负标记物)的水平有所降低，这表明了抗实体瘤干细胞的效用。在某些实施方式中，所述实体瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方式中，所述实体瘤是胰腺肿瘤并且所述一种或多种分化标记物可以包扩一种或多种粘蛋白(例如Muc16)和/或嗜铬粒蛋白A(CHGA)。在某些替代性实施方式中，所述实体瘤是结肠肿瘤。在一些实施方式中，所述实体瘤是结肠肿瘤，而且所述一种或多种分化标记物包扩细胞角蛋白7。胰腺和结肠以及其他肿瘤类型的其他潜在分化标记物对本领域的技术人员而言是已知的。通过用一种或多种本文所公开的抗FZD抗体(例如18R5和/或44R24)治疗所需的肿瘤类型和随后评估所治疗的肿瘤中相对于对照的标记物表达变化，本领域的技术人员能够容易地评估潜在分化标记物在筛选方法中的有用性。这些方法的非限制性实例可见于例如下文的具体实施例中。
III.多核苷酸
在某些实施方式中，本发明涵盖多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与人类FZD受体特异性地结合的多肽或这种多肽的片段的多核苷酸。举例而言，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗人类卷曲受体的抗体或编码这种抗体的片段的核酸序列。本发明的多核苷酸的形式可以是RNA或DNA。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链的，如果是单链的，其可以是编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方式中，所述多核苷酸是已分离的。在某些实施方式中，所述多核苷酸基本纯净。
本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码下述多肽的多核苷酸：所述多肽包含选自由SEQ ID NO：10、12、14组成的组的序列。本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码下述多肽的多核苷酸：所述多肽包含选自由SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86组成的组的序列。还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码下述多肽的多核苷酸：所述多肽包含SEQ ID NO：11、13或15。
本发明另外提供包含选自由SEQ ID NO：17、19和21组成的组的序列的多核苷酸。作为另一种选择，在某些实施方式中，所述多核苷酸可以包含选自由SEQ IDNO：87～90、92和94～95组成的组的序列。还提供了包含SEQ ID NO：18、20或22的多核苷酸序列。
还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与具有序列SEQ ID NO：17、19或21的多核苷酸杂交的和/或与编码具有序列SEQ ID NO：10、12或14的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与具有选自由SEQ IDNO：87～90、92和94～95组成的组的序列的多核苷酸杂交的和/或与编码具有序列SEQ ID NO：85或86的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。在某些实施方式中，所述杂交在高严谨度条件下进行。
在某些实施方式中，所述多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，所述编码序列在同一阅读框中与对例如宿主细胞表达和分泌多肽进行辅助的多核苷酸融合(例如，作为用于控制多肽从细胞的转运的分泌序列而起作用的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白，并且可以由宿主细胞将前导序列切除，从而形成成熟形式的多肽。所述多核苷酸还能够编码由成熟蛋白附加额外的5’氨基酸残基而构成的蛋白原。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，并且是非活性形式的蛋白。一旦切除所述序列原，即留下了活性成熟蛋白。
在某些实施方式中，所述多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，所述编码序列在同一阅读框中与标记物序列融合，所述标记序列例如用于纯化所编码的多肽。举例而言，在宿主为细菌时，该标记物序列可以是pQE-9载体所提供的六组氨酸标签，从而用来纯化与此标记物融合的成熟多肽，或者在使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，该标记物序列可以是源自流感病毒血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。
本发明还涉及上述多核苷酸的变体，所述变体编码例如片段、类似物和衍生物。
在某些实施方式中，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码下述多肽的多核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％且在一些实施方式中为至少96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的多核苷酸，所述多肽包含抗本文所述的人类FZD受体的抗体或其片段。
多核苷酸与参照核苷酸序列具有至少例如95％核苷酸序列“同一性”，其意思是，除了在参照核苷酸序列的每100个核苷酸中所述多核苷酸的序列可以含有最多5个点突变以外，所述多核苷酸的核苷酸序列与所述参照序列相同。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％核苷酸序列同一性的多核苷酸，在参照序列中最多有5％的核苷酸可以缺失或用其他核苷酸来取代，或者将在数量上占参照序列总核苷酸数最多5％的核苷酸插入该参照序列。对参照序列进行的这些突变可以出现在该参照核苷酸序列的氨基末端或羧基末端位置，或者在这些末端位置之间的任何位置，并且单独地散布在该参照序列的核苷酸中或者以一个以上连续组的形式在该参照序列内散布。
多核苷酸的变体可以包含编码区和/或非编码区的改变。在一些实施方式中，多核苷酸的变体所包含的改变会产生沉默取代、添加或缺失，但不会改变所编码的多肽的性质或活性。在一些实施方式中，核苷酸变体通过因遗传密码的简并性造成的沉默取代而产生。产生多核苷酸变体的原因可以有多种，例如，为了优化密码子在特定宿主中的表达(使人类mRNA中的密码子变成细菌宿主(例如E.coli)所偏好的密码子)。
还提供了含有本文所述的多核苷酸的载体和细胞。
IV.使用方法和药物组合物
本发明的FZD结合药剂(包括多肽和抗体)在多种应用中都是有用的，所述应用包括但不限于治疗方法(例如对癌症的治疗)。在某些实施方式中，所述药剂可用于抑制Wnt信号传导(例如，经典Wnt信号传导)、抑制肿瘤生长、诱发分化、减小肿瘤体积和/或降低肿瘤致瘤性。这些使用方法可以是体内、离体(ex vivo)或体外方法。在某些实施方式中，FZD结合药剂或多肽或抗体是其所结合的一种或多种人类卷曲受体的拮抗剂。
在某些实施方式中，FZD结合药剂或拮抗剂用于治疗与Wnt信号传导活化相关的疾病。在特定实施方式中，所述疾病是依赖于Wnt信号传导的疾病。在特定实施方式中，所述Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，所述FZD结合药剂或拮抗剂用于治疗以升高的干细胞和/或祖细胞水平为特征的病症。
在某些实施方式中，用FZD结合药剂或拮抗剂(例如，抗FZD抗体)治疗的疾病是癌症。在某些实施方式中，所述癌症的特征是Wnt依赖型肿瘤。在某些实施方式中，癌症的特征是表达一种或多种卷曲受体的肿瘤，所述卷曲受体结合所述FZD结合药剂(例如，抗体)。在某些实施方式中，所述癌症的特征是表达Wnt基因标签中的一种或多种基因的肿瘤。
在某些实施方式中，用FZD结合药剂或拮抗剂治疗的疾病不是癌症。举例而言，所述疾病可以是代谢紊乱，例如肥胖症或糖尿病(例如，II型糖尿病)(Jin T.，Diabetologia，2008 Oct；51(10)：1771-80)。或者，所述疾病可以是骨病，例如骨质疏松症、骨关节炎或风湿性关节炎(Corr M，Nat Clin Pract Rheumatol，2008Oct；4(10)：550-6；Day等，Bone Joint Surg Am，2008 Feb；90 Suppl 1：19-24)。所述疾病还可以是肾病，例如多囊肾病(Harris等，Annu Rev Med，2008 Oct.23；Schmidt-Ott等，Kidney Int，2008 Oct；74(8)：1004-8；Benzing等，J Am Soc Nephrol，2007May；18(5)：1389-98)。作为另一种选择，可以治疗眼病，包括但不限于黄斑变性和家族性渗出性玻璃体视网膜病变(Lad等，Stem Cells Dev，2008Aug.8)。还可以治疗心血管病，包括心肌梗死、动脉粥样硬化和瓣膜障碍(Al-Aly Z.，Transl Res，2008May；151(5)：233-9；Kobayashi等，Nat Cell Biol，2009 Jan；11(1)：46-55；van Gijn等，Cardiovasc Res，2002 Jul；55(1)：16-24；Christman等，Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008 Jun；294(6)：H2864-70)。在一些实施方式中，所述疾病是肺部疾病，例如特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension)或肺纤维化(Laumanns等，Am JRespir Cell Mol Biol，2008 Nov 21；
Figure BDA0000063718710000611
等，PLoS ONE，2008 May14；3(5)：e2142)。在一些实施方式中，用FZD结合药剂治疗的疾病是肝脏疾病，例如肝硬化或肝纤维化(Cheng等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008Jan；294(1)：G39-49)。
本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括对受试者(例如，需要治疗的受试者)施用治疗有效量的FZD结合药剂。在某些实施方式中，所述癌症是选自由结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤和头颈部癌组成的组的癌症。在某些实施方式中，所述癌症是胰腺癌。在某些实施方式中，所述癌症是结肠直肠癌。在某些实施方式中，所述受试者是人。
本发明还提供使用本文所述的抗体或其他药剂来抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方式中，所述抑制肿瘤生长的方法包括用FZD结合药剂(例如，抗体)在体外接触细胞。举例而言，在培养基中对表达靶FZD的永生化细胞系或癌细胞系进行培养，向其中添加所述抗体或其他药剂来抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，从诸如组织活检、胸腔积液或血样等患者样品中分离出肿瘤细胞并在培养基中进行培养，向其中添加FZD结合药剂来抑制肿瘤生长。
在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括用FZD结合药剂(例如，抗体)在体内接触肿瘤或肿瘤细胞。在某些实施方式中，用FZD结合药剂接触肿瘤或肿瘤细胞是在动物模型中进行的。举例而言，可以对已在免疫功能低下的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中长出的表达一种或多种FZD的异种移植物施用FZD结合药剂，从而抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，从诸如组织活检、胸腔积液或血样等患者样品中分离出癌干细胞并将其注射至免疫功能低下的小鼠中，随后向该小鼠施用FZD结合药剂来抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，在将致瘤性细胞导入动物中的同时或紧随其后即施用FZD结合药剂，从而抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，在致瘤性细胞已长到预定尺寸后，施用FZD结合药剂来作为治疗剂。
在某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括对受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，受试者具有肿瘤或其肿瘤已被移除。
在某些实施方式中，肿瘤是具有活跃Wnt信号传导的肿瘤。在某些实施方式中，所述活跃Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，所述肿瘤是Wnt依赖型肿瘤。举例而言，在一些实施方式中，所述肿瘤对axin的过表达敏感。在某些实施方式中，所述肿瘤不包含在结肠腺瘤息肉蛋白(APC)肿瘤抑制基因中的失活突变(例如，截短突变)或在β-catenin基因中的活化突变。在某些实施方式中，所述肿瘤表达Wnt基因标签中的一种或多种基因。在某些实施方式中，受试者的正在被治疗的癌症涉及此类肿瘤。
在某些实施方式中，肿瘤表达与FZD结合药剂或抗体结合的一种或多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述肿瘤过表达人类卷曲受体。
在某些实施方式中，所述肿瘤是选自由结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、成胶质细胞瘤和头颈部肿瘤组成的组的肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是结肠直肠肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是胰腺肿瘤。
本发明还提供在细胞中抑制Wnt信号传导的方法，所述方法包括用有效量的FZD结合药剂接触所述细胞。在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。在某些实施方式中，所述方法是体内方法，其中用所述药剂接触所述细胞的步骤包括对受试者使用治疗有效量的所述药剂。在一些替代性实施方式中，所述方法是体外或离体方法。在某些实施方式中，受到抑制的Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，Wnt信号传导是通过WNT1、WNT2、WNT3、WNT3A、WNT7a、WNT7b和/或WNT10B进行的信号传导。在某些实施方式中，Wnt信号传导是通过WNT1、WNT3A、WNT7b和/或WNT10B进行的信号传导。
此外，本发明提供降低受试者中肿瘤的致瘤性的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂。在某些实施方式中，所述肿瘤包含癌干细胞。在某些实施方式中，通过施用所述药剂降低了癌干细胞在所述肿瘤中的频率。
因此，本发明还提供降低癌干细胞在肿瘤中的频率的方法，所述方法包括用治疗有效量的FZD结合药剂(例如，抗FZD抗体)接触所述肿瘤。
本发明还提供使致瘤性细胞分化为非致瘤性细胞的方法，所述方法包括用FZD结合药剂接触所述致瘤性细胞(例如，通过对受试者施用所述FZD结合药剂，所述受试者具有含所述致瘤性细胞的肿瘤或该肿瘤已被移除)。在某些实施方式中，致瘤性细胞是胰腺肿瘤细胞。在某些替代性实施方式中，致瘤性细胞是结肠肿瘤细胞。
还提供了本文所述的FZD结合药剂、多肽或抗体在诱导细胞分化中的应用，所述细胞包括但不限于肿瘤细胞。举例而言，考虑了诱导细胞分化的方法，所述方法包括用有效量的本文所述的FZD结合药剂(例如，抗FZD抗体)接触所述细胞。还提供了诱导受试者肿瘤中的细胞进行分化的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。在某些实施方式中，所述肿瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是结肠肿瘤。
另外提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症与Wnt信号传导活化有关，并且/或者以干细胞和/或祖细胞水平升高为特征。在一些实施方式中，所述治疗方法包括对受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。在某些实施方式中，所述Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。
本发明还提供了降低实体瘤基质中的成肌纤维细胞活化的方法，所述方法包括用治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体接触所述基质。
本发明还提供包含本文所述的一种或多种FZD结合药剂的药物组合物。在某些实施方式中，所述药物组合物还包含制药上可接受的载质。发现这些药物组合物可用于在人类患者中抑制肿瘤生长和治疗癌症。
在某些实施方式中，通过将本发明的纯化的抗体或药剂与制药上可接受的载质(例如，运载体，赋形剂)结合，从而制备了用于储存和使用的制剂(Remington，TheScience and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing，2000)。适合的制药上可接受的载质包括但不限于：诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等无毒缓冲剂；诸如氯化钠等盐；包括抗坏血酸和蛋氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六甲二铵；氯化苯甲烷铵；氯化苯乙铵；酚、丁醇或苯甲醇；诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸烷基酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；小分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精等糖类；诸如EDTA等螯合剂；诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇等糖；诸如纳等成盐反荷离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；以及诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)等非离子表面活性剂。
本发明的药物组合物能够以多种用于局部治疗或系统治疗的途径来进行施用。施用可以是：局部施用(例如包括阴道递送和直肠递送在内的粘膜施用)，例如经皮贴剂、软膏、洗剂、乳霜、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末；经肺部施用(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂来施用，包括使用喷雾器；气管内施用、鼻内施用、表皮施用和经皮施用)；口服；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内的注射或注入；或者颅内(例如鞘内或脑室内)施用。
所述治疗制剂可以为单位剂量形式(单位剂型)。此类制剂包括用于口服、胃肠外施用、直肠施用或通过吸入施用的片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒剂、在水或非水性介质中的溶液或混悬剂、或者栓剂。在诸如片剂等固体组合物中，主要活性成分与制药运载体相混合。常规的制片成分包括用来形成固体预制剂组合物的玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶以及其他稀释液(例如水)，所述固体预制剂组合物包含本发明的化合物或其制药上可接受的无毒盐的均质混合物。随后将所述固体预制剂组合物再分为上述类型的单位剂型。可以对新型组合物的片剂、丸剂等进行涂覆或混配，从而提供具有长期作用的优点的剂型。举例而言，所述片剂或丸剂可以包含由外部成分包覆的内部组合物。另外，可以通过肠溶层(enteric layer)将这两种组分隔开，所述肠溶层用来抵抗崩解并允许内部组分完整地通过胃或延迟释放。多种材料可以用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种高分子酸及高分子酸与诸如虫胶、十六烷醇和乙酸纤维等材料的混合物。
还可以将抗体或药剂包裹在微囊中。在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微滴乳状液、纳米颗粒和纳米囊)或Remington，The Science and Practice ofPharmacy第20版.Mack Publishing(2000)中所述的粗滴乳状液中，通过例如凝聚技术或界面聚合来制备此类微囊，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。
在某些实施方式中，药物制剂包含与脂质体复合的本发明的抗体或其他药剂(Epstein，等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688；Hwang等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030；以及美国专利第4,485,045和4,544,545号)。在美国专利第5,013,556号中公开了具有增长的循环时间的脂质体。一些脂质体能够用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液体组合物通过反相蒸发法来产生。挤压脂质体使其穿过具有设定孔径的滤器，从而产生具有所需直径的脂质体。
此外，能够制备缓释制剂。缓释制剂的适合实例包括含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质处于成形物(例如，膜或微囊)形式。缓释基质的实例包括聚酯、诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)等水凝胶、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、诸如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的注射用微球体)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸异丁酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
在某些实施方式中，除了施用FZD结合药剂之外，所述方法或治疗还包括(在施用所述FZD结合药剂之前、同步和/或之后)施用第二抗癌药剂。还提供了包含所述FZD结合药剂和所述第二抗癌药剂的药物组合物。
应意识到的是，可以将FZD结合药剂和第二抗癌药剂的组合以任何顺序施用或同步施用。在选定的实施方式中，会对之前已用第二抗癌药剂治疗过的患者施用FZD结合药剂。在某些其他实施方式中，FZD结合药剂和第二抗癌药剂基本上同时或同步施用。举例而言，受试者在进行使用第二抗癌药剂(例如化疗剂)的治疗疗程的同时，可以接受FZD结合药剂。在某些实施方式中，在用第二抗癌药剂治疗后1年内施用所述FZD结合药剂。在某些替代性实施方式中，在用第二抗癌药剂进行的任何治疗后10、8、6、4或2个月内施用FZD结合药剂。在某些其他实施方式中，在用第二抗癌药剂进行的任何治疗后4、3、2或1周内施用FZD结合药剂。在一些实施方式中，在用第二抗癌药剂进行的任何治疗后5、4、3、2或1天内施用FZD结合药剂。还应意识到的是，可以在短短几小时或几分钟内(即，基本同时)将这两种药剂或治疗使用于受试者。
抗癌药剂的有用类型包括例如微管蛋白抑制剂、奥瑞他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，诸如顺铂、单铂、双铂和三核铂络合物以及卡波铂等铂络合物)、蒽环类物质、抗生素抗叶酸素、抗代谢物、化疗敏化剂、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、偏端霉素(lexitropsin)、亚硝基脲、顺氯氨铂(platinol)、执行化合物(performing compound)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、辐射敏化剂、类固醇、紫杉烷类化合物(taxane)、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱等。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是抗代谢物、抗有丝分裂物、拓扑异构酶抑制剂或血管发生抑制剂。
可以与FZD结合药剂组合施用的抗癌药剂包括化疗剂。因此，在一些实施方式中，所述方法或治疗涉及对化疗剂或多种不同化疗剂的混合物与本发明的抗体或药剂的组合施用。可以在实施化疗之前、同步或之后用抗体进行治疗。本发明所用的化疗物包括本领域已知的和商用的化学物质或药物，例如吉西他滨、依立替康、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、三胺硫膦、白消安、环磷酰胺(Cytoxin)、紫杉醇、氨甲喋呤、顺铂、美法仑、长春碱和卡波铂。组合施用可以包括单药物制剂的或使用单独的多个制剂的共施用，或者以任意顺序但通常在使所有活性药剂都能同时发挥其生物活性的一段时间内进行的连续施用。可以根据制造商的说明书或由本领域技术人员依经验所确定的来使用此类化疗剂的制剂和用量方案。用于此类化学治疗的制剂和用量方案还在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，Md.(1992)中有所描述。
本发明可用的化疗剂还包括但不限于：诸如三胺硫膦和癌得星(CYTOXAN)等烷化剂；诸如白消安、胺丙磺酯和丙酰哌嗪二甲烷磺酸酯(piposulfan)等烷基磺酸酯；诸如苯并多巴、卡波醌、甲尿多巴(meturedopa)和尿多巴(uredopa)等氮丙啶；包括三乙蜜胺、三乙烯基三聚氰胺、三乙烯基磷酰胺、三乙烯基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺在内的乙烯亚胺和甲基三聚氰胺；诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、氧化二氯甲基二乙胺盐酸盐、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥等氮芥；诸如卡氮芥、氯脲菌素、福莫司汀、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷诺氮芥等亚硝基脲；诸如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、正定霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、甲基丝裂霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星等抗生素；诸如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)等抗代谢物；诸如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸类似物；诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤等嘌呤类似物；诸如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；诸如卡鲁睾酮、屈它雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯等雄激素；诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺剂；诸如亚叶酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百特布昔(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；得福法胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；艾甲新(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；丙脒腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡喃阿霉素；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西索菲兰(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙基胺；氨基甲酸酯；长春地辛；氮烯唑胺；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；甘胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；三胺硫膦；紫杉烷类化合物(taxoid)，例如紫杉醇(TAXOL，Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ.)和多烯紫杉醇(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；诸如顺铂和卡波铂等铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT 11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；以及任何上述物质在制药上可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括可调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，例如抗雌激素，包括例如他莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林和戈舍瑞林(goserelin)；以及任何上述物质在制药上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些实施方式中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸阿霉素、柠檬酸正定霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和依立替康。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是依立替康。在某些实施方式中，待治疗的肿瘤是直肠结肠肿瘤，并且第二抗癌药剂是拓扑异构酶抑制剂，例如依立替康。
在某些实施方式中，化疗剂是抗代谢物。抗代谢物是一种化学物质，其结构与正常生物化学反应所需的代谢物相似，但是其间的差异足以干扰细胞的一种或多种正常功能，例如细胞分裂。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、氨甲喋呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(Pemetrexed)、喃氟啶、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤(GlaxoSmithKline)、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)和克拉屈滨(cladribine)，以及任何这些物质在制药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是吉西他滨。在某些实施方式中，待治疗的肿瘤是胰腺肿瘤，并且第二抗癌药剂是抗代谢物(例如吉西他滨)。
在某些实施方式中，化疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于与微管蛋白结合的药剂。作为非限制性的实例，所述药剂包含紫杉烷类化合物。在某些实施方式中，所述药剂包含紫杉醇或多烯紫杉醇，或者紫杉醇或多烯紫杉醇的制药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，所述药剂是紫杉醇(TAXOL)、多烯紫杉醇(TAXOTERE)、结合白蛋白的紫杉醇(例如ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代性实施方式中，所述抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或者其在制药上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，抗有丝分裂剂是Eg5驱动蛋白的抑制剂或有丝分裂激酶(例如Aurora A或Plk1)的抑制剂。在某些实施方式中，当与FZD结合药剂或多肽或抗体组合施用的化疗剂包含抗有丝分裂剂时，所治疗的癌或肿瘤是乳腺癌或乳腺肿瘤。
在某些实施方式中，治疗涉及对放射疗法与本发明的抗体(或其他药剂)的组合施用。可以在实施放射疗法之前、同步或之后用抗体(或其他药剂)进行治疗。可以使用技术人员所确定的用于此类放射疗法的任何用量方案。
在一些实施方式中，第二抗癌药剂包含抗体。因此，治疗能够涉及对本发明的抗体(或其他药剂)和抗另外的肿瘤相关抗原的其他抗体(包括但不限于与EGFR、ErbB2、HER2、DLL4、Notch和/或VEGF结合的抗体)的组合施用。在例如美国专利申请第2008/0187532号公告(通过参考方式完整地并入本文)中描述了示例性的抗DLL4抗体。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是抗体，该抗体是血管发生抑制剂(例如抗VEGF抗体)。另外的抗DLL4抗体描述于例如国际专利第WO2008/091222和WO2008/0793326号公告、美国专利申请第2008/0014196、2008/0175847、2008/0181899和2008/0107648号公告中，其中各篇都通过参考方式完整地并入本文。在例如美国专利申请第2008/0131434号公告(通过参考方式完整地并入本文)中描述了示例性的抗Notch抗体。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是抗体，该抗体是血管发生抑制剂(例如抗VEGF抗体)。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是Notch信号传导的抑制剂。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是AVASTIN(贝伐单抗)、Herceptin(曲妥单抗)、VECTIBIX(帕尼单抗)或Erbitux(西妥昔单抗)。组合施用可以包括单药物制剂的或使用单独的多个制剂的共施用，或者以任意顺序但通常在使所有活性药剂都能同时发挥其生物活性的一段时间内进行的连续施用。
另外，治疗可以包括施用一种或多种细胞因子(例如，淋巴因子、白介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)或者可以伴随有癌细胞的外科手术移除或被治疗医生视为必要的其他任何疗法。
对于疾病的治疗，本发明的抗体或药剂的适合用量取决于待治疗的疾病类型、该疾病的严重性和进程、该疾病的响应性、是否为治疗或预防目的而施用所述抗体或药剂、此前的疗法、患者临床史等，且都由治疗医生决定。所述抗体或药剂能够一次性施用，或者在为期几天至几个月的一系列治疗中进行施用，或者一直施用直至实现治愈或疾病状态有所减少(例如，肿瘤尺寸减小)。最佳用量方案能够从对患者体内药物积累的测量中计算出，且将随各抗体或药剂的相对效力而变化。施药医生能够容易地确定最佳用量、用量方法和重复率。在某些实施方式中，用量为0.01μg～100mg/kg体重，并且可以在每天、每周、每月或每年施药一次以上。在某些实施方式中，每两周或每三周给予一次所述抗体或其他FZD结合药剂。在某些实施方式中，抗体或其他FZD结合药剂的用量为约0.1mg～约20mg/kg体重。治疗医生能够根据所测量的停留时间和体液或组织中的药物浓度来估算重复率。
V.Wnt基因标签及其应用
本发明还提供Wnt基因标签，其系指示肿瘤中Wnt信号传导活性的基因标签，并可用于选择肿瘤、患者和/或疗法。
所述Wnt基因标签包括一组基因在Wnt信号传导已活化(和/或依赖Wnt信号传导)的肿瘤中与Wnt信号传导未活化的肿瘤相比的差异表达。在某些实施方式中，所述Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。所述Wnt基因标签可用于鉴定可能会对用Wnt信号传导抑制剂(例如，作为至少一种人类卷曲受体拮抗剂和/或Wnt信号传导抑制剂的FZD结合药剂)进行的治疗产生响应的肿瘤和/或患者。
在某些实施方式中，所述Wnt基因标签包含下表3所列的一种或多种基因(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种基因)。“探针组ID”序号是
Figure BDA0000063718710000701
人类基因组U133 Plus 2.0阵列(″HG_U133_Plus_2″；Affymetrix，Santa Clara，CA)的探针组ID序号。在Wnt信号传导已活化的肿瘤(即显示Wnt基因标签阳性的肿瘤)中，组成Wnt基因标签的表3中的基因的表达水平相对于Wnt信号传导未活化的肿瘤有所升高。在一些实施方式中，所述Wnt基因标签包含下表3所列的两种或更多种基因。在一些实施方式中，Wnt基因标签包含下表3所列基因中的三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、十六种或更多种、十七种或更多种、十八种或更多种或十九种基因。在某些实施方式中，接受基因表达水平评估的肿瘤是结肠直肠肿瘤，其中所述基因是表3中的一种或多种基因。在某些实施方式中，所述Wnt基因标签包含AXIN2和/或FOXQ1。在某些实施方式中，肿瘤是结肠直肠肿瘤，并且所述Wnt基因标签包含AXIN2、LGR5和/或FOXQ1。
表3：示例性Wnt基因标签基因
还提供了使用Wnt基因标签来选择(或鉴定)适合用Wnt途径抑制剂治疗的或适合进行特定疗法效用评估的患者的方法。在某些实施方式中，Wnt信号传导抑制剂是FZD结合药剂，例如拮抗性FZD抗体。举例而言，通过确定患者体内的肿瘤或已经从患者中移除的肿瘤是否显示Wnt基因标签，可以将患者鉴定为适合用一种FZD结合药剂(或多种FZD结合药剂)来进行治疗。在某些实施方式中，对Wnt基因标签的检测包括对表3中的一种或多种基因在肿瘤中的表达水平进行评估。如果组成Wnt基因标签的表3中的一种或多种基因在肿瘤中的表达水平升高(从而表明在该肿瘤中Wnt信号传导已活化)，则将该患者鉴定为适合用FZD结合药剂(例如抑制Wnt信号传导的抗FZD抗体)来治疗。同样提供了使用Wnt基因标签来为特定患者选择适合的疗法的方法。
本发明提供治疗患者癌症的方法，所述患者具有肿瘤或其肿瘤已被移除，所述方法包括(a)提供表3中的一种或多种基因在该肿瘤中的表达水平(b)根据所述一种或多种基因的表达水平来选择将用FZD结合药剂开始或继续进行治疗的患者，和(c)对所述患者施用所述FZD结合药剂。在某些实施方式中，所述方法包括测量一种或多种基因在肿瘤中的表达水平。在某些实施方式中，将一种或多种基因的表达水平与对照或参照水平进行比较。
还提供了鉴定可以对使用Wnt信号传导抑制剂的治疗产生响应的肿瘤的方法。在某些实施方式中，Wnt信号传导抑制剂是FZD结合药剂。在某些实施方式中，该方法包括对肿瘤进行Wnt基因标签测试。在某些实施方式中，该方法包括评估表3中的一种或多种基因在该肿瘤中的表达水平。
还提供了筛选抗肿瘤的候选药物的方法，所述肿瘤已被鉴定为显示Wnt基因标签。在某些实施方式中，候选药物是Wnt信号传导抑制剂。优选测试此类候选药物对具有活跃Wnt信号传导和/或依赖于Wnt信号传导的肿瘤的效用。本发明还提供筛选候选药物的方法，所述方法包括(a)评估表3中的一种或多种基因在肿瘤中的表达水平，(b)(至少在部分上)根据所述一种或多种基因的表达水平来选择用候选药物进行测试的肿瘤，和(c)测试该候选药物对肿瘤的效果。
此外，在某些实施方式中，可以确定药物对Wnt基因标签的效果并用来评估对具有活跃Wnt信号传导的肿瘤的治疗效用。在某些实施方式中，这提供了监控对患者进行的治疗的方法。在一些替代性实施方式中，这提供了评估候选药物效用的方法。在某些实施方式中，表3中的一种或多种基因表达水平的降低(即，Wnt基因标签的降低或消除)表明了治疗的效用。
在某些实施方式中，对Wnt基因标签中的一种或多种基因的水平的评估包括确定所述一种或多种基因的多核苷酸的表达水平。在某些实施方式中，对Wnt基因标签的检测包括检测组成所述标签的一种或多种基因的多核苷酸的mRNA表达。在一些实施方式中，对mRNA表达的检测是通过RNA印迹进行的。在一些实施方式中，对mRNA表达的检测是通过RT-PCR、实时PCR或定量PCR进行的，其中使用特异性地扩增组成癌干细胞签名的多核苷酸的引物组。在某些实施方式中，对mRNA的检测包括使样品接触核酸探针，所述探针与组成癌干细胞基因标签的多核苷酸互补。在一些实施方式中，在检测前将样品的mRNA转化为cDNA。在一些实施方式中，对mRNA的检测是通过微阵列进行的，其包含与Wnt基因标签中的一种或多种基因杂交的多核苷酸。
在某些实施方式中，对Wnt基因标签中的一种或多种基因的水平的评估包括检测所述一种或多种基因所编码的多肽。在一些实施方式中，对所述一种或多种基因的多肽表达产物的水平的评估包括使样品接触对该多肽有特异性的抗体并通过例如定量免疫荧光或ELISA检测该抗体与所述多肽的结合。其他检测方法对本领域技术人员而言是已知的，参见例如美国专利第6,057,105号。
还提供了包含多核苷酸的阵列，所述多核苷酸在严谨条件下与表3中的一种或多种基因杂交。还提供了包含所述阵列的试剂盒。
还提供了包含抗体的试剂盒，所述抗体与表3中的一种或多种基因的表达产物结合。
VI.包含FZD结合药剂的试剂盒
本发明提供包含本文所述的抗体或其他药剂的试剂盒，其能够用来实施本文所述的方法。在某些实施方式中，试剂盒包含在一个或多个容器中的抗一种或多种人类卷曲受体的至少一种纯化的抗体。在一些实施方式中，该试剂盒包含对实施检测测定而言必要和/或充分的所有组分，包括全部对照、用于实施测定的说明和用于分析和显示结果的任何必要的软件。本领域的技术人员将容易地认识到，能够容易地将本发明所公开的抗体或药剂引入本领域所公知的一种成形的试剂盒形式中。
还提供了包含FZD结合药剂(例如，FZD结合抗体)以及第二抗癌药剂的试剂盒。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是化疗剂(例如吉西他滨或依立替康)。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是血管发生抑制剂。在某些实施方式中，第二抗癌药剂是Notch信号传导抑制剂(例如，抗DLL4或抗Notch的抗体)。
还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含FZD结合药剂和一种或多种评估上表3(“示例性Wnt基因标签基因”)中一种或多种基因表达的试剂。
本公开的实施方式能够通过参考以下非限制性实施例来进一步界定，这些实施例详细描述了本公开的某些抗体的制备和本公开的抗体的使用方法。对本领域技术人员而言显而易见的是，可以在不背离本公开范围的情况下对材料和方法进行多种修改。
实施例
应了解的是，本文所述的实施例和实施方式仅出于说明性目的，而根据其所作的各种修改或改变对本领域的技术人员而言是有启示的，并将包含在本申请的主旨和范围内。
实施例1  抗FZD抗体的鉴定/制备
能够使用噬菌体展示来分离出特异性地识别一种或多种人类卷曲受体的人类抗体。举例而言，可以对包含人类抗体可变结构域的合成抗体文库进行淘筛，以筛得对人类FZD7受体细胞外结构域的特异性的和高亲和力的识别。一旦鉴定出具有所需特性的特定Fab，随后将Fab的人类可变区克隆至含有人类IgG2重链和轻链(κ或λ)的Ig表达载体中，该表达载体用于在CHO细胞中表达人类抗体。
使用噬菌体展示鉴定了与FZD7细胞外结构域结合的特定Fab：18R8。将来自人类Fab噬菌体文库的2×1013个展示Fab的噬菌体颗粒与被动固定的重组FZD7 ECD Fc蛋白温育。洗去非特异性的噬菌体，随后用DTT洗脱出特异性噬菌体。用洗脱产物来感染TG1 F+细菌，并用辅助噬菌体进行救援。随后用IPTG(0.25mM)诱导Fab展示。以经此救援的第一轮产物作为其他轮选择的起点。继续进行选择至第三轮，随后在ELISA中对产物进行筛选，以得到对重组FZD7 ECD Fc蛋白有特异性的Fab。鉴定出了特异性地结合人类FZD7的Fab。
获得了所鉴定的Fab的可变区序列。通过定点突变将N-连接糖基化位点从母序列中除去。将重链CDR1中的N连接糖基化位点Asn变为His。制造此突变用来防止在哺乳动物系统中的表达时发生糖基化。将所得的Fab命名为18R8。18R8的重链和轻链CDR序列示于下表4中。18R8的VH和VL序列分别在SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：12中提供。
表4：18R8和18R5人类抗体的CDR
Figure BDA0000063718710000741
*下划线标出了用来除去N-连接糖基化位点的定点改变。
使18R8 Fab的VH-CH1链与来自原始Fab噬菌体文库(即从中鉴定出18R8的文库)的多条VL-CL链联结，产生了抗FZD的Fab 18R5。用固定的重组FZD7 ECD Fc蛋白进行三轮淘筛后，从文库中分离出18R5。18R5的CDR序列示于上表4中。18R5抗体的VL具有SEQ ID NO：14所示的序列。18R5抗体的重链CDR和VH与18R8抗体的相同。
将18R8和18R5Fab的人类可变区克隆至含有人类IgG2重链和轻链(λ)的Ig表达载体中，所述表达载体用于在CHO细胞中进行表达。18R8IgG抗体的重链和轻链的氨基酸序列(包括信号序列)分别在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中提供。各链氨基酸序列N端的信号序列在分泌时会被切掉。编码18R8IgG抗体的重链和轻链的核酸序列分别在SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20中提供。18R5 IgG抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15中提供。(同样地，各链氨基酸序列N端的信号序列在分泌时会被切掉。)编码18R5IgG抗体的重链和轻链的核酸序列分别在SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22中提供。利用蛋白A纯化法来纯化这些抗体。
使用来自Biacore Lifescience(GE Healthcare)的Biacore 2000系统来确定18R8和18R5抗体的KD。具体而言，用HBS-P(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％(体积/体积)的表面活性剂P20)以两倍增量连续稀释所纯化的抗Fzd7抗体，使之从100nM稀释至0.78nM。针对固定于CM5 Biacore芯片上的重组Fzd Fc蛋白测试各稀释液。测量联结速率和解离速率，并用Biaevaluation软件程序确定KD值(下表5)。
表5：18R8和18R5IgG抗体的亲和力
Figure BDA0000063718710000751
实施例2  对抗FZD抗体的FACS分析展示了与多种细胞表面人类FZD的结合。
利用流式细胞术分析来确定抗体结合细胞表面表达的FZD蛋白的能力。
为了使细胞表面能够强表达所选定的FZD蛋白，使用标准重组DNA技术产生了哺乳动物表达质粒，所述质粒包含位于编码FZD的多核苷酸上游的CMV启动子(将此类构建体称为“FL无FLAG”)。为10种人类卷曲蛋白的每一种都产生了类似的表达质粒。还制备了FZD表达载体的替代版本，其中通过标准重组技术还产生了编码融合至成熟FZD蛋白N端的N端信号序列-FLAG表位标签的多核苷酸(将此类构建体称为“FL flag”)。此外，设计了编码嵌合蛋白的表达载体，所述嵌合蛋白由下述部分构成：融合至N端信号序列-FLAG表位的FZD的CRD结构域(又称“fri”结构域)或FZD蛋白的整个N端细胞外结构域(分别称为“fri flag”和“ECD flag”)，以及编码人类CD4蛋白的跨膜及细胞质结构域的C端部分。
为了通过流式细胞术测量抗体与FZD的结合，用FZD表达载体和转染标记物GFP来共转染HEK293细胞。在转染24～48小时后，将细胞收集于悬浮液中并在冰上与抗FZD抗体(10μg/ml，除非另有说明)温育，或者与检测背景抗体结合的对照IgG温育。清洗细胞，并且用与荧光生色团偶联的Fc段特异性二抗(例如与藻红蛋白偶联的抗人IgG)来检测一抗。随后通过流式细胞术来分析带标记的细胞，从而对特异性地识别细胞表面FZD蛋白表达的抗FZD抗体进行鉴定。单克隆抗体18R5和18R8识别位于转染后的细胞上的FZD。如图1和图2所示，18R8和18R5均可结合包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8在内的多种FZD。为了研究18R8和18R5结合每种FZD的相对能力，进行了滴定分析，其中结合反应中的抗体量有所不同(图2)。此分析显示，与18R8相比，18R5所显示出的与每种FZD受体(FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8)的结合能力更强。
实施例3 18R8和18R5对Wnt信号传导的抑制
使用荧光素酶报告基因测定在体外确定了抗FZD IgG抗体18R8和18R5阻断Wnt信号传导途径的活化的能力。
在补充有抗生素和10％FCS的DMEM中培养STF293细胞。STF293细胞是其中稳定整合有下述物的293细胞：(1)用来测量经典Wnt信号传导水平的8xTCF Luc报告基因载体，其包含7个拷贝的与启动子连接的TCF结合部位，所述启动子位于萤火虫荧光素酶报告基因上游(Gazit等，1999，Oncogene 18：5959-66)和(2)作为转染效率的内部对照的海肾荧光素酶报告基因(Promega；Madison，WI)。将细胞加至培养基平板上。添加待测试的FZD抗体(或不添加抗体)。随后在Wnt3A条件培养基或对照条件培养基存在或不存在的情况下温育细胞，所述Wnt3A条件培养基从稳定表达Wnt3a的L细胞(ATCC CRL-2647)制备，所述对照条件培养基从不过表达Wnt3A的L细胞(ATCC细胞系CRL-2648)制备。温育过夜之后，使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega；Madison，WI)来测量荧光素酶水平，其中将萤火虫荧光素酶活性对海肾荧光素酶活性进行标准化。
如此确定了18R8和18R5抗体抑制Wnt所诱导的途径活化的能力。用不同浓度的18R8或18R5 IgG抗体处理STF293细胞，添加Wnt3A条件培养基。18小时后使用双荧光素酶测定试剂盒对细胞进行测定。该结果示于图3中。在用抗FZD抗体18R5时观察到了对Wnt3a途径的TCF信号传导的更强抑制。
在其他实验中，确定了18R8抗体拮抗通过不同Wnt配体进行的信号传导的能力。通过Fugene 6(Roche)用Wnt1、Wnt2、Wnt2b2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9b和Wnt10b对HEK293细胞进行48小时的转染。将Wnt3A条件培养基(“WNT3ACM”)用作活化的阳性对照。在补充有抗生素和10％FCS的DMEM中培养STF293细胞，并用20μg/ml 18R8抗体对其进行处理或不用抗体进行处理。随后添加过表达Wnt的HEK293细胞。处理后18小时，使用双荧光素酶测定试剂盒来测量荧光素酶水平。该结果示于图4中。显示出抗FZD抗体18R8抑制多种Wnt的信号传导，除Wnt3A外，还包括抑制Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt7A、Wnt7B和Wnt10B。
实施例4 18R8阻断FZD与Wnt的结合
为了评估18R8的阻断FZD结合Wnt的能力，将2μl 1.32μg/μl的含有Fri结构域(在同一阅读框内连接至人类IgG1 Fc的FZD8氨基酸1～157)的可溶性FZD8-Fc单独添加或在18R8 IgG抗体(添加4μl 3.71μg/μl的抗体)存在的情况下添加到培养基中来结合Wnt3A(添加20μl Wnt3A条件培养基)。于4℃将该混合物单独温育2小时或与蛋白A琼脂糖凝胶微球(GE Healthcare产品；20μl 50％的溶液(在PBS中))一起温育2小时。温育后，通过离心除去每个样品中的蛋白A微球(以及与该蛋白A微球复合的任何蛋白)，并测定上清液的诱发8xTCF荧光素酶活性的能力。将该上清液添加至STF293细胞，该STF293细胞稳定表达用来测量经典Wnt信号传导水平的8xTCF(位于萤火虫荧光素酶报告基因上游的8个拷贝的TCF结合结构域)并在补充有抗生素和10％FCS的DMEM中培养。在处理STF293细胞18小时后，使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega；Madison，WI)来测量荧光素酶水平。
如在图5中所见，以荧光素酶单位(RLU)所测量，Wnt3A+蛋白A诱发报告基因的强烈活化(图5，柱1)。添加Fzd8-fc会诱导Wnt3A-Fzd8间以及该Fc融合蛋白与蛋白A琼脂糖凝胶微球间的复合，并且一旦通过离心除去蛋白A-Wnt3A-Fzd8复合物，上清液不再能够激活报告基因(图5，柱2)。添加18R8时，该抗体对Fzd8的与Wnt3A相互作用的结构域的阻断大概会使上述复合物分解，这是因为虽然蛋白A-Fzd8-fc复合物与18R8(其通过自身的Fc部分能够容易地与蛋白A相互作用)一起被移除，但是能够容易地观察到报告基因活性，这表示存在水平充足的未复合Wnt3A(图5，柱3)。18R8还对存在于STF293细胞上的内源Fzd起作用，因为未用蛋白A除去18R8并不显示Wnt3A活化的恢复(图5，柱6)。
图5中的数据显示，相对于单独使用FZD8-Fc所观察到的活性而言，在温育反应中存在18R8IgG抗体时，上清液中的Wnt3A活性会得以保留。这些结果表明18R8阻断了FZD8结合Wnt3A的能力，而且表明与18R8所识别的表位结合的抗体能够阻断Wnt-FZD的相互作用。
实施例5 18R8和18R5的表位作图
为了鉴定18R8IgG抗体所识别的FZD表位，进行了表位作图。利用对细胞表面表达的FZD的流式细胞术分析来测量抗体结合。通过标准重组技术产生了含有CMV启动子的哺乳动物表达质粒载体，该启动子位于下述多核苷酸的上游：所述多核苷酸编码融合至FZD8的Fri结构域N端的N端信号序列FLAG表位标签，所述Fri结构域又融合至CD4蛋白的跨膜结构域和细胞内结构域。此表达构建体使得FZD8Fri结构域可以在细胞表面表达，并表达用来监测表达的FLAG表位标签。随后用定点突变来对FZD的细胞外结构域中选定的氨基酸进行改变。用编码FZD和转染标记物GFP的表达载体来共转染HEK293细胞。转染后48小时，将细胞收集于悬浮液中并在冰上与抗FZD抗体温育，或者与检测背景抗体结合的对照IgG温育。清洗细胞，并且对于一抗，采用与荧光生色团偶联的抗抗体的二抗来进行检测。随后通过流式细胞术来分析带标记的细胞，从而测量抗FZD抗体与细胞表面FZD的结合。
这样，鉴定出了在FZD细胞外结构域中的对结合抗FZD抗体重要的特定氨基酸。当使FZD8的氨基酸残基82～83从PD突变为SQ时，18R8与FZD8的结合受到基本不受影响(图6)。类似地，当将氨基酸109S变为109Q时，未观察到对结合的显著影响。另一方面，当使FZD8的残基70～71从HQ变为AE时，18R8与细胞上的FZD8的结合明显变弱(图6和图7)。在使氨基酸66～67从GL突变为AA时，或者在使氨基酸68～69从EV突变为QL时，或者在使氨基酸126～127从FG突变为NV时，18R8抗体与细胞上FZD8的结合类似地消失。在FZD细胞外结构域的某些氨基酸被取代时，对FZD的结合消失，这揭示了该抗体的特异性识别部位。因此，确定出抗体18R8与FZD8的包含氨基酸66～71GLEVHQ(SEQ ID NO：25)和人类FZD8的氨基酸124～128GF的表位结合。在FZD8所结合的人类卷曲受体(即FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8)中此表位区域高度保守，而在FZD8不结合的那些人类卷曲受体(即FZD3、FZD4、FZD6、FZD9或FZD10)中此表位非高度保守。
还进行了FACS实验，该实验对18R5 IgG和18R8 IgG与细胞上的野生型和突变的FZD8的结合进行了比较。这些实验表明，18R8抗体和18R5抗体结合FZD8上的相似表位(图7)。
实施例6 鉴定生物学结合部位(FZD受体的BBS)
基于对抑制Wnt信号传导的抗体的发现以及对这些抗体所结合的FZD蛋白中的表位的发现，现已能够分析FZD蛋白结构的哪些区域对Wnt信号传导是重要的。为了对此进行研究，对小鼠Fzd8的Fri结构域的晶体结构进行了研究。本发明人鉴定出18R8和18R5结合表位位于FZD结构的一个区域中，之前从未认识到该区域有特定功能。另外所述表位包含由裂缝分隔的两个分离的Fzd表面元件(称其为“上边缘”和“下边缘”)。经过对10种人类卷曲受体的比较，还发现在所述裂缝底部排列的氨基酸在同一性上存在惊人的保守性。已将18R8和18R5所结合的、包含所述裂缝以及“上边缘”和“下边缘”的区域命名为FZD的生物学结合部位(BBS)。基于对之前报导的小鼠FZD8晶体结构的分析(Dann CE等，Nature 412(6842)86-90，2001)和使用软件程序Pymol完成的分析所得的Fzd Fri结构域的结构图像示于图9中。在左上图中显示了FZD Fri结构域的表面视图，其中用白色圆圈标出了Fzd蛋白的含有生物学结合部位(BBS)的区域。在该图底部的单幅图像中用较深的表面着色突出了BBS的命名为“上边缘”、“下边缘”和“裂缝”的每个区域。在图9的右上图像中用较深的表面着色突出了在人类Fzd家族成员的9个或10个成员中的保守残基。
实施例7 18R5对体内肿瘤生长的抑制
18R5阻止Wnt依赖型肿瘤生长
将50,000个小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)-WNT1肿瘤来源的细胞注射至5～7周龄的雌性NOD/SCID小鼠右上乳腺脂肪垫中。转基因(MMTV)-Wnt-1小鼠显示出不连续阶段的乳腺肿瘤发生，包括增生、侵袭性导管癌和远程转移，因此该乳腺癌小鼠模型为分析Wnt在肿瘤形成和生长中的作用提供了有效的工具(Nusse和Varmus(1982)Cell 31：99-109)。分离来自这些小鼠的肿瘤，并且将这些分离的肿瘤细胞用于肿瘤繁殖目的。每周对在乳腺脂肪垫中植入了肿瘤细胞的小鼠进行两次监测。一旦肿瘤变得可触知，每周测量肿瘤两次，使用式1/2(a×b2)来确定肿瘤体积，其中a＝长度，b＝宽度。将数据表述为平均值和平均值±S.E.M.。使用双尾非配对的学生t检验来比较组平均值。将小于0.05的概率(p)值认为是差异显著。在第19天，将肿瘤平均体积为44mm3的小鼠随机分为2组，每组10只动物。用对照抗体或18R5IgG抗体(10mg/kg)对动物进行注射。通过注射至腹膜内腔来施用抗体，每周两次。与用对照抗体治疗的肿瘤相比，用抗体18R5进行的治疗完全消除了肿瘤生长(图10；p＝0.002)。
18R5与依立替康的组合治疗减少OMP-C28异种移植肿瘤的生长
在另一实施方式中，分析了抗FZD抗体减少OMP-C28结肠肿瘤异种移植物的生长的能力。将分离的人类OMP-C28细胞(每只动物10,000个)皮下注射至6～8周龄雄性NOD/SCID小鼠中。每周监测肿瘤生长，一旦肿瘤变得可触知，就开始进行肿瘤测量。在第24天，将肿瘤平均体积为129mm3的小鼠随机分为4组，每组10只动物。用对照抗体或18R5IgG抗体(10mg/kg)或依立替康(7.5mg/kg)或18R5与依立替康的组合对动物进行注射。通过注射至腹膜内腔来施用抗体和依立替康，每周两次。每周测量肿瘤两次，使用式1/2(a×b2)来确定肿瘤体积，其中a＝长度，b＝宽度。将数据表述为平均值和平均值±S.E.M.。使用双尾非配对的学生t检验来比较组平均值。将小于0.05的概率(p)值认为是差异显著。如图11所示，用18R5进行的治疗使肿瘤生长减少了40％(p＝0.02)。此外，与单独使用依立替康进行的治疗相比，用18R5和依立替康进行的治疗使肿瘤生长减少了53％(相对于仅用依立替康，p＝0.0002)(图11)。因此，在OMP-C28结肠肿瘤模型中，作为单药剂的18R5以及与依立替康组合使用的18R5都显示了抗肿瘤生长活性。
18R5与吉西他滨的组合治疗减少OMP-Pn4异种移植肿瘤的生长
在另一实施方式中，分析了抗FZD抗体减少OMP-Pn4胰腺肿瘤异种移植物的生长的能力。NOD/SCID小鼠购自Harlan(Indianapolis，Indiana)，并在进行研究前使其适应若干天。先前对癌干细胞所促的体内胰腺异种移植模型的建立和表征已有描述(Li等，Cancer Res.，67：1030-7，2007)。为了进行效用研究，将OMP-Pn4人类胰腺肿瘤细胞分散至单细胞悬浮液中，并重悬于FACS缓冲液(补充有2％热灭活的胎牛血清和20mM Hepes的Hank’s平衡盐溶液[HBSS])和Matrigel(BD Bioscience，San Jose，CA)的1∶1(体积/体积)混合液中，并用含有50,000个细胞/100μl的25G针(25-gauge needle)将其皮下植入6～7周龄雄性NOD/SCID小鼠右侧肋部。每周监测肿瘤，一旦肿瘤变得可触知，就开始进行肿瘤测量。在第36天，肿瘤平均体积达到约120mm3，将携带肿瘤的动物随机分为4组，每组9只。两天后开始进行治疗。用对照抗体、18R5IgG抗体(10mg/kg)、吉西他滨(40mg/kg)或18R5IgG抗体与吉西他滨的组合对动物进行注射。通过注射至腹膜内腔来施用抗体和/或吉西他滨，每周一次。通过用电子卡尺(Coast Tools Company，San Leandro，CA)来测量肿瘤生长。每周测量肿瘤一次，使用式1/2(a×b2)来确定肿瘤体积，其中a＝长度(肿瘤最长轴)，b＝宽度(肿瘤最短轴)。如果动物的体重减少超过15％则每天对其进行称重，如果其体重减少20％则使其安乐死。将数据表述为平均值±S.E.M.。使用无母数(non-parimetric)t检验来分析组间的平均值差异。多重比较采用了带有事后(posthoc)t检验比较的单向方差分析(one-way ANOVAtest)。将p＜0.05的差异值认为是显著差异。用于统计学分析的软件是GraphPad Prism4(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)。在此研究结束时，使用CO2室及随后的颈脱位法来使小鼠安乐死。收集肿瘤以供RNA和组织学分析使用。将剩余肿瘤转移至冷介质199中，用于处理成单细胞悬浮液以供癌干细胞频率分析使用。
OMP-Pn4异种移植物研究的结果示于图12中。用18R5抗体进行的治疗作为单一疗法未使本实验中的肿瘤生长显著减少。然而，与使用吉西他滨进行的治疗相比，用18R5和吉西他滨进行的治疗使肿瘤生长减少了42％(图12；相对于仅用吉西他滨，p＝＜0.001)。因此，在OMP-Pn4胰腺肿瘤模型中，与吉西他滨(一种已认可的注意标准(standard-of-care)化疗剂)组合使用的18R5显示出协同性抗肿瘤生长活性。
18R5与紫杉醇的组合治疗减少PE-13乳腺肿瘤的生长
将10,000个PE-13人类乳腺肿瘤细胞(HER2阴性)植入NOD-SCID小鼠中，并使其生长22天，直至其达到约120mm3的平均体积。随后将动物随机分为4组，每组10只动物，并且用对照抗体、抗FZD的18R5、紫杉醇
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或18R5与紫杉醇的组合对其进行施药。图37显示了施用对照抗体、抗FZD的18R5、紫杉醇或18R5与紫杉醇的组合的小鼠的肿瘤平均体积。以10mg/kg的剂量腹膜内(IP)施用抗体，每周两次。以10mg/kg的剂量腹膜内(IP)施用紫杉醇，每周一次。在图37所示的天数测量肿瘤。图38显示了在18R5加紫杉醇的组中的动物个体的肿瘤生长。用18R5与紫杉醇的组合进行的治疗显示出抗肿瘤活性并导致成型乳腺肿瘤的消减。
实施例8 用来确定对癌干细胞频率的影响的测定
有限稀释测定(LDA)能够用来评估FZD结合药剂或抗体对实体瘤干细胞的影响以及对含有癌干细胞的肿瘤的致瘤性的影响。该测定能够用来确定肿瘤(该肿瘤来自用FZD结合抗体或其他药剂治疗过的动物)中癌干细胞的频率，并且将该频率与对照动物肿瘤中的癌干细胞频率进行比较。
18R5与依立替康的组合治疗对OMP-C28肿瘤中的癌干细胞的影响
在上述OMP-C28异种移植物研究(实施例7)结束时(第48天)，采集来自该研究中的对照肿瘤和治疗后的肿瘤。处理这些肿瘤并将其分散为单细胞。随后将肿瘤细胞与生物素化的小鼠抗体(α-小鼠CD45-生物素1∶200稀释，和大鼠α-小鼠H2Kd-生物素1∶100稀释，BioLegend，San Diego，CA)在冰上温育30分钟，随后添加带抗生蛋白链菌素(streptavidin)标记的磁珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从而在磁体辅助下除去小鼠细胞。
为进行LDA，对悬浮液中的人类细胞进行收集、计数，并将FACS缓冲液中的适当细胞剂量(2、25和125个细胞)以1∶1的比例与Matrigel混合，并皮下注射至NOD/SCID小鼠中(10小鼠/细胞剂量/治疗组)。使肿瘤生长最多4个月。在所需的时间点，在注射了经抗FZD抗体处理的肿瘤细胞的所有组中，确定具有可检测肿瘤的小鼠的百分比，并且与对照中的具有可检测肿瘤的小鼠百分比进行比较。举例而言，确定了注射有125个经对照处理的肿瘤细胞的具有可检测肿瘤的小鼠的数量，并且与注射有125个经FZD抗体处理的肿瘤细胞的具有可检测肿瘤的小鼠的数量进行比较。随后使用L-CalcTM软件(StemCell Technologies Inc.)计算出癌干细胞的频率。简言之，基于泊松统计，如果37％的动物未发展肿瘤，则在已知数量的注射的细胞中恰存在一个癌干细胞。
为了分析细胞表面标记物，用与荧光染料直接偶联的抗ESA抗体(Biomeda)和抗CD44抗体(BD Biosciences)对单肿瘤细胞悬浮液进行染色。利用存活染料DAPI来排除死细胞。使用FACS Aria(Becton Dickinson)来执行流式细胞术。使用侧向散射图和前向散射图来去除细胞团块。对用对照抗体处理的肿瘤的分析揭示了大片肿瘤群中有64％高水平地表达ESA和CD44(图39)。如图39所示，仅用依立替康进行的治疗并未对双阳性群产生显著影响(55％)，但是用18R5或者用18R5与依立替康的组合进行的治疗使双阳性群减少(分别为40％和32％)。
18R5与吉西他滨的组合治疗对OMP-Pn4肿瘤中的癌干细胞的影响
在上述OMP-Pn4异种移植物研究(实施例7)中的41天治疗结束时，收集来自该研究中的对照肿瘤和治疗后的肿瘤。处理这些肿瘤并将其分散为单细胞。随后将肿瘤细胞与生物素化的小鼠抗体(α-小鼠CD45-生物素1∶200稀释，和大鼠α-小鼠H2Kd-生物素1∶100稀释，BioLegend，San Diego，CA)在冰上温育30分钟，随后添加带抗生蛋白链菌素标记的磁珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从而除去小鼠细胞。对悬浮液中的剩余人类细胞进行收集、计数并稀释至适当的细胞剂量(30、90、270和810个细胞)，混合至FACS缓冲液与Matrigel的1∶1(体积/体积)混合物中，并皮下注射至NOD/SCID小鼠中(10小鼠/细胞剂量/治疗组)。如图40所示，使肿瘤生长75天。图40中的每个点表示个体小鼠的肿瘤体积。在注射了经抗FZD抗体处理的肿瘤细胞的所有组中，确定具有可检测肿瘤的小鼠的百分比，并且与对照中的具有可检测肿瘤的小鼠百分比进行比较。举例而言，确定了注射有810个经对照处理的肿瘤细胞的具有可检测肿瘤的小鼠的数量，并且与注射有810个经FZD抗体处理的肿瘤细胞的具有可检测肿瘤的小鼠的数量进行比较。使用肿瘤生长频率和L-CalcTM软件来计算癌干细胞频率。计算出的每个治疗组的癌干细胞频率示于图41中。单独使用18R5进行的治疗以及用18R5和吉西他滨的组合进行的治疗减少了癌干细胞的频率，而单独使用吉西他滨进行的治疗却无效果。
实施例9FZD抗体的产生
抗原产生
产生了人类FZD受体(FZD)的细胞外结构域(ECD)或Fri结构域(Fri)的重组多肽片段，来作为产生抗体用的抗原。使用标准重组DNA技术来分离多核苷酸，所述多核苷酸编码所需的一种或多种人类卷曲受体的上述结构域的氨基酸。这些多核苷酸在统一阅读框内与人类Fc标签或组氨酸标签的N端连接，并克隆至转移质粒载体中，该转移质粒载体用于在昆虫细胞中进行杆状病毒介导的表达。使用标准的转染、感染和细胞培养操作规程来产生表达对应的FZD多肽的重组昆虫细胞(O′Reilley等，Baculovirus expression vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994))。
使用蛋白A和Ni2+-螯合亲和层析来从昆虫细胞条件培养基中纯化出抗原蛋白。将纯化的抗原蛋白对PBS(pH＝7)进行透析，并浓缩至约1mg/ml，随后进行无菌过滤到免疫用制剂中。
免疫
使用标准技术用纯化的FZD抗原蛋白来免疫化小鼠。初始免疫化后约70天，使用ELISA和FACS分析，对来自各小鼠的血液进行抗原识别筛选(见下文详细描述)。选出抗体效价最高的两只动物来进行最终的抗原加强(antigen boost)，随后分离出用于产生杂交瘤的脾细胞。在96孔板中以1个细胞/孔的密度平板接种杂交瘤细胞，随后通过ELISA和FACS分析以抗原蛋白来对每个孔中的上清液进行筛选。选出具有高抗体效价的7个杂交瘤并在静态瓶培养基中进行增殖。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖层析来从杂交瘤上清液中纯化出抗体。通过FACS再次测试纯化的单克隆抗体，并进行同型分型以选出IgG和IgM抗体。
表位作图
为了对识别FZD细胞外结构域(包括富含半胱氨酸的结构域)的特定区域的抗体进行鉴定，进行了表位作图。使用标准重组DNA技术产生了含有CMV启动子的哺乳动物表达载体质粒，所述启动子位于编码细胞外FZD结构域的片段的多核苷酸上游。随后通过瞬时转染在培养的哺乳动物细胞中表达重组蛋白。转染后24～48小时，收集细胞，并在SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶上分离细胞裂解物蛋白，用于进行蛋白质印迹，所述蛋白质印迹使用来自用FZD抗原免疫的小鼠的抗体。对于识别FZD的配体结合结构域的抗体，可通过ELISA来进一步分析其与Wnt蛋白所竞争的结合。
为了鉴定抗FZD抗体所识别细胞外结构域中的特定表位，使用了SPOT系统(Sigma Genosys，The Woodlands，TX)。通过SPOT合成技术，合成了以一个氨基酸重叠并覆盖整个FZD细胞外结构域的一系列10残基线状肽，并使其共价结合到纤维素膜上。在室温下用封闭缓冲液预温育该膜8小时，并于4℃使其与抗体杂交过夜。随后清洗该膜，使其与偶联至辣根过氧化物酶(HRP)(Amersham Bioscience，Piscataway，NJ)的二抗温育，再次清洗，并用包含3-氨基-9-乙基咔唑的信号显影溶液将其可视化。从而确定了抗体所识别的特定表位。
FACS分析
为了选出由杂交瘤克隆产生的识别天然细胞表面FZD蛋白的单克隆抗体，使用了FACS分析。用编码对应的FZD的全长cDNA克隆的表达载体单独转染HEK293细胞，或者用其与表达GFP的载体一起对HEK293细胞进行共转染。可以在氨基端引入Flag表位标签，从而可以证实带标签的FZD受体在细胞表面上的表达。转染后24～48小时，将细胞收集于悬浮液中并在冰上与抗FZD抗体、FLAG抗体、免疫血清(用于FZD5表达细胞)温育，或者与用来检测背景抗体结合的对照IgG温育。清洗细胞，并且用与荧光生色团偶联的抗小鼠二抗来检测一抗。随后通过FACS来分选带标记的细胞，从而对特异性识别对应的FZD受体的细胞表面表达的抗FZD抗体进行鉴定。鉴定了识别所需人类卷曲受体的抗体。
嵌合抗体
在鉴定出特异性地识别FZD受体的单克隆抗体后，对这些抗体进行修饰，从而在将啮齿动物抗体用作治疗剂时可以克服人抗鼠抗体(HAMA)免疫应答。通过RT-PCR从杂交瘤细胞中分离出选定的单克隆抗体的重链和轻链的可变区，并且在哺乳动物表达载体中将其在同一阅读框内分别连接至人类IgG1重链和κ轻链恒定区。作为另一种选择，使用诸如TCAE 5.3等人类Ig表达载体，其在同一质粒上含有人类IgG1重链和κ轻链恒定区基因(Preston等，1998，Infection & Immunity 66：4137-42)。随后将编码嵌合的重链和轻链的表达载体共转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中来产生嵌合抗体。通过ELISA和FACS将嵌合抗体的免疫反应性和亲和力与鼠类亲本抗体进行比较。
人源化抗体
由于嵌合抗体治疗剂仍然常具有抗原性，并产生人抗嵌合抗体(HACA)免疫应答，抗FZD受体的嵌合抗体可以进行进一步的人源化。为了产生人源化抗体，对于抗体特异性决定基序的关键部位(其潜在地包括来自三个短超变序列或互补决定区(CDR)的元件)和/或使上述抗体重链和轻链可变域的CDR区正确定位所需的骨架区，使用重组DNA技术将其分别工程化为人类重链和轻链抗体基因的种系DNA序列，并随后克隆至用于在CHO细胞中进行表达的哺乳动物表达载体中。通过ELISA和FACS将人源化抗体的免疫反应性和亲和力与亲本嵌合抗体进行比较。此外，可利用对可变区进行的定点突变或高密(high-density)突变来优化人源化抗体的特异性、亲和力等。
人类抗体
在一些实施方式中，可使用噬菌体展示技术来分离特异性地识别FZD受体细胞外结构域的人类抗体。对包含展示为单链Fv或fab结构域的人类抗体可变区的噬菌体展示抗体文库进行筛选，以筛得对上述FZD受体抗原的特异性的和高亲和力的识别。随后将经鉴定的可变域抗体序列重新安排至含有人类IgG1重链和κ轻链的Ig表达载体中，该表达载体用于在CHO细胞中表达人类抗体。
实施例10产生识别特定表位的抗体
来自杂交瘤的单克隆抗体
在某些实施方式中，通过用一种或多种FZD受体抗原免疫小鼠来产生识别FZD受体的功能性表位的抗体。使用标准技术用纯化的FZD抗原蛋白来免疫小鼠。在某些实施方式中，用不同的FZD受体抗原依次免疫小鼠。初始免疫化后约70天，对各小鼠的血液进行筛选。选出对FZD抗原具有高抗体效价的动物来进行最终的抗原加强，随后分离出用于产生杂交瘤的脾细胞。在96孔板中以1个细胞/孔的密度平板接种杂交瘤细胞，随后通过ELISA和流式细胞术对每个孔中的上清液进行筛选。为了鉴定识别特定表位(包括在生物学结合部位(BBS)内的表位或与BBS重叠的表位)的单克隆抗体，对杂交瘤上清液进行筛选，以选出结合所需FZD的抗体和不结合在所需特殊表位(例如BBS)内具有特定氨基酸取代的FZD的抗体。
人类抗体
可以使用噬菌体展示文库来鉴定可识别FZD受体的所需表位(例如，多种FZD共有的表位，和/或在BBS内或者与BBS或其一部分重叠的表位)的抗体。举例而言，将选定FZD的Fri结构域表达为重组蛋白，并将其以10μg/ml的浓度包被在适合的表面上。随后通过两轮以上的富集对人类噬菌体文库进行淘筛(参见例如Griffiths等，EMBO J.12：715-34)。可选可以使用不同的FZD蛋白来可选地进行后续轮的淘筛。可选的是，可以在水溶性诱饵FZD蛋白存在的情况下进行每轮淘筛，所述诱饵蛋白在所需靶表位区(例如，包括位于生物学结合部位(BBS)中的表位)内具有特定的氨基酸取代。随后对淘筛结果中的各克隆，通过ELISA或流式细胞术分析筛选其结合所需FZD蛋白的能力，并通过缺乏对具有在所需靶表位内特定氨基酸取代的FZD蛋白的结合来评估与所需表位的结合。随后从噬菌体中回收编码抗原结合域的基因，并通过使抗原结合域与恒定区结合来用所述基因构建完整人类抗体分子，以供在适合的宿主细胞系中进行表达。如本文其他部分所述，鉴定并测试抗体的防止肿瘤细胞生长的能力。
实施例11 用来评估抗FZD受体的抗体的其他体外测定
本实施例描述了用来测试抗体在细胞增殖、途径活化和细胞毒性中活性的代表性体外测定，所述抗体针对FZD受体而产生。
增殖测定
使用Taqman分析对不同癌细胞系中的FZD受体的表达进行定量。在96孔组织培养微孔板中以104个细胞/孔的密度对被鉴定为表达FZD受体的细胞进行平板接种，并使之增殖24小时。随后在带有2％FCS的新鲜DMEM中再培养细胞12小时，届时在10μmol/l BrdU存在的情况下将抗FZD抗体和与之对比的对照抗体添加到培养基中。在进行BrdU标记后，除去培养基，将细胞在乙醇中室温固定30分钟，随后与偶联至过氧化物酶的单克隆抗BrdU抗体(克隆BMG 6H8，Fab片段)反应90分钟。在含有四甲基联苯胺的溶液中使底物显影，并在15分钟后用25μl 1mol/L的H2SO4终止。用使用450nm滤镜的自动ELISA平板读取仪(UV微孔板读取仪；Bio-RadLaboratories，Richmond，CA)来测量显色反应。所有实验平行进行三次。确定了抗FZD抗体抑制细胞增殖的能力(与对照抗体相比)。
途径活化测定
在某些实施方式中，在体外确定了抗FZD受体的抗体对Wnt信号传导途径活化的阻断能力。举例而言，用下述(1)、(2)和(3)来对在补充有抗生素和10％FCS的DMEM中培养的HEK293细胞进行共转染：(1)用来激活Wnt信号传导途径的Wnt7B和FZD10表达载体；(2)用来测量经典Wnt信号传导水平的TCF/Luc野生型或突变报告基因载体，其包含位于萤火虫荧光素酶报告基因上游的3或8个拷贝的TCF结合结构域(Gazit等，1999，Oncogene 18：5959-66)；和(3)作为转染效率的内部对照的海肾荧光素酶报告基因(Promega；Madison，WI)。随后将抗FZD10抗体和对照抗体添加到细胞培养基中。转染后48小时，使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega；Madison，WI)来测量荧光素酶水平，其中将萤火虫荧光素酶活性对海肾荧光素酶活性进行标准化。三个独立实验平行进行三次。从而确定了FZD抗体抑制Wnt途径活化的能力。
补体依赖的细胞毒性测定
在某些实施方式中，使用表达FZD受体的癌细胞系或分离自患者样品的且作为免疫功能低下小鼠中的异种移植物而传代的癌干细胞来测量抗FZD受体抗体所介导的补体依赖的细胞毒性(CDC)。将细胞以106个细胞/ml的密度悬浮于补充有抗生素和5％FBS的200μl RPMI1640培养基中。随后以三等分样式将悬浮的细胞与带有抗FZD受体的抗体或对照抗体的200μl血清或热灭活的血清混合。于37℃在5％CO2中温育细胞混合物1～4小时。随后收集经处理的细胞，重悬浮于100μl在培养基中稀释的带FITC标记的膜联蛋白V，并且于室温下温育10分钟。添加100μl在HBSS中稀释的碘化丙啶溶液(25μg/ml)并于室温下温育5分钟。收集细胞，重悬浮于培养基中并用流式细胞术进行分析。对经FITC染色的细胞进行的流式细胞术得到了总细胞计数；与热灭活血清和对照抗体相比，在血清和抗FZD抗体存在情况下使用占总细胞数一定百分比的死细胞所摄取的碘化丙啶来测量细胞死亡。从而确定了抗FZD抗体介导补体依赖的细胞毒性的能力。
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性测定
可以使用表达FZD受体的癌细胞系或分离自患者样品的且作为免疫功能低下小鼠中的异种移植物而传代的癌干细胞来测量抗FZD受体抗体所介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。将细胞以106个细胞/ml的密度悬浮于补充有抗生素和5％FBS的200μl无酚红的RPMI1640培养基中。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从肝素化的外周血中分离出外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞使用。随后在至少一种FZD受体抗体或对照抗体存在的情况下，在96孔板中使靶细胞(T)与PBMC效应细胞(E)按25∶1、10∶1和5∶1的E/T比进行混合。对照实验包括在抗体存在的情况下单独温育靶细胞和单独温育效应细胞。于37℃在5％CO2中温育细胞混合物1～6小时。随后通过比色测定(CytoTox96非放射性细胞毒性测定；Promega；Madison，WI)来测量所释放的乳酸脱氢酶(LDH)，LDH是在细胞裂解时所释放的一种稳定的胞质溶胶酶。用标准96孔板读取仪在490nm收集吸光度数据，并且进行背景校正。根据下式来计算特定细胞毒性的百分比：％细胞毒性＝100×(实验LDH释放-效应细胞自发LDH释放-靶细胞自发LDH释放)/(靶细胞最大LDH释放-靶细胞自发LDH释放)。从而确定了抗FZD受体的抗体介导抗体依赖型细胞介导的细胞毒性的能力。
实施例12 使用抗FZD受体的抗体在体内防止肿瘤生长
本实施例描述了在异种移植模型中使用抗FZD受体的抗体来防止肿瘤生长。在某些实施方式中，准备来自患者样品(实体瘤活检或胸腔积液)的且已作为小鼠中的异种移植物而传代的肿瘤细胞，用于向实验动物进行再传代。在无菌条件下移取肿瘤组织，切成小片，使用无菌刀片将其完全切碎，并通过酶消化和机械破碎来获得单细胞悬浮液。具体而言，使胸腔积液细胞或所得的肿瘤碎片与培养基中的超纯胶原酶III(200～250单位的胶原酶/ml)混合，并于37℃温育3～4小时，其间每15～20分钟用10ml吸移管进行吹吸。使经消化的细胞滤过45μM尼龙网，用RPMI/20％FBS进行清洗，并用HBSS清洗两次。随后将分散的肿瘤细胞皮下注射至NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中以引发肿瘤生长。
在某些实施方式中，在注射至实验动物中之前，根据细胞表面标记物首先将分散的肿瘤细胞分选为致瘤性细胞和非致瘤性细胞。具体而言，用含有2％热灭活小牛血清(HICS)的Hepes缓的盐水溶液(HBSS)将上述分散的肿瘤细胞清洗两次，并按106个细胞/100μl将其重新悬浮。添加抗体，在冰上温育细胞20分钟，随后用HBSS/2％HICS清洗两次。抗体包括抗ESA(Biomeda，Foster City，CA)、抗CD44、抗CD24和谱系标记物抗CD2、抗CD3、抗CD10、抗CD16、抗CD18、抗CD31、抗CD64和抗CD140b(统称为Lin；PharMingen，San Jose，CA)。抗体与荧光生色团直接偶联，从而对表达这些标记物的细胞进行阳性或阴性选择。通过针对H2Kd+细胞的选择除去了小鼠细胞，并通过使用存活染料7AAD来除去死细胞。在FACSVantage(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)上执行流式细胞术。侧向散射图和正向散射图用来消除细胞团块。随后将已分离的ESA+，CD44+，CD24-/low，Lin-致瘤性细胞皮下注射入NOD/SCID小鼠中以引发肿瘤生长。
举例而言，分析抗FZD抗体减少肿瘤细胞生长的能力。将分散的肿瘤细胞(每只动物10,000个)皮下注射至6～8周龄NOD/SCID小鼠肋部。注射肿瘤细胞后两天，将抗FZD抗体以10mg/kg腹膜内(i.p.)注射至动物中，每周两次。每周对肿瘤生长进行监视，直至检测到生长，此后每周测量肿瘤生长两次，共持续8周。从而鉴定出了与注射PBS的对照相比显著减少肿瘤生长的FZD结合抗体。
实施例13 使用抗FZD受体的抗体在体内治疗肿瘤
本实施例描述了在异种移植模型中使用抗FZD受体的抗体来治疗癌症。在某些实施方式中，准备来自患者样品(实体瘤活检或胸腔积液)的且已作为小鼠中的异种移植物而传代的肿瘤细胞，用于向实验动物进行再传代。移取肿瘤组织，切成小片，使用无菌刀片将其完全切碎，并通过酶消化和机械破碎来获得单细胞悬浮液。随后将分散的肿瘤细胞皮下注射入NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫(对于乳腺肿瘤而言)或者肋部(对于非乳腺肿瘤而言)以引发肿瘤生长。作为另一种选择，如上所述分离并注射ESA+，CD44+，CD24-/low，Lin-致瘤性细胞。
在注射肿瘤细胞后，监视动物的肿瘤生长。一旦肿瘤平均尺寸达到约150～200mm，就开始进行抗体治疗。每只动物以每周2～5次的频率腹膜内接受100μgFZD受体抗体或对照抗体，共持续6周。在此6周内每周对肿瘤尺寸进行2次评估。从而确定了FZD受体抗体与对照抗体相比防止肿瘤进一步生长或减少肿瘤尺寸的能力。
在抗体治疗结束时，收集肿瘤用于进一步分析。在一些实施方式中，通过免疫荧光来分析肿瘤的一部分，从而评估抗体对肿瘤的渗透和肿瘤响应。对于来自经抗FZD受体治疗的和经对照抗体治疗的小鼠的每个所收集的肿瘤，将其一部分新鲜冷冻于液氮中，包埋在O.C.T.内，并在低温恒温器上切成10μm的切片并置于载玻片上。在一些实施方式中，将每个肿瘤的一部分用福尔马林固定，石蜡包埋，并在切片机上切成10μm的切片并置于载玻片上。对切片进行后固定(post-fix)并且与特异性地识别所注射抗体的带生色团标记的抗体温育，从而检测存在于肿瘤活检物中的抗FZD受体抗体或对照抗体。此外，能够用检测不同肿瘤和肿瘤所募集的细胞类型的抗体来评估抗体治疗对例如血管发生、肿瘤生长和肿瘤形态的效果，例如用来检测血管内皮细胞的抗VE钙粘素(CD144)或抗PECAM-1(CD31)抗体、用来检测血管平滑肌细胞的抗平滑肌α-肌动蛋白抗体、用来检测增殖细胞的抗Ki67抗体、用来检测死细胞的TUNEL测定、用来检测Wnt信号传导的抗β-catenin抗体和用来检测Notch信号传导的抗细胞内结构域(ICD)Notch片段抗体。
在某些实施方式中，还评估了用抗FZD受体抗体进行的治疗对肿瘤细胞基因表达的影响。对于来自经FZD抗体治疗的和经对照抗体治疗的小鼠的每个所收集的肿瘤，从其一部分中提取出总RNA并用于定量RT-PCR。相对于作为内部对照的管家基因GAPDH，分析FZD受体、Wnt信号传导途径的组成部分(包括例如Wnt1和β-catenin)以及之前鉴定的其他癌干细胞标记物(例如CD44)的表达水平。从而确定了在进行FZD受体抗体治疗时肿瘤细胞基因表达的变化。
此外，评估了用抗FZD受体抗体进行的治疗对癌干细胞在肿瘤中的频率的影响。将来自经FZD治疗的以及经与其对比的对照抗体治疗的小鼠的肿瘤样品切成小片，使用无菌刀片将其完全切碎，并通过酶消化和机械破碎来获得单细胞悬浮液。随后，根据上文详述的ESA+，CD44+，CD24-/low，Lin-表面细胞标记物表达，通过FACS分析对分散的肿瘤细胞进行致瘤性癌干细胞存在的分析。
随后，对于在进行抗FZD抗体治疗后根据ESA+，CD44+，CD24-/low，Lin-的表达分离出的细胞，可以评估其致瘤性。对于从经FZD抗体治疗的以及经与其对比的对照抗体治疗的小鼠分离出的ESA+，CD44+，CD24-/low，Lin-癌干细胞，将其再次皮下注射至NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。随后确定了以稳定的肿瘤形成所需的注射细胞数量为基础的癌干细胞的致瘤性。
实施例14 Wnt基因标签的鉴定
进行实验来鉴定可对人类结肠肿瘤中Wnt信号传导途径的活化特异表达的一组基因。
Axin的过表达消除肿瘤生长
Axin是经典Wnt途径的重要调控因子。其系触发β-catenin降解的多蛋白复合体的一部分，因此在无Wnt的情况下使该途径沉默。Wnt可逆转这一效果，其将axin从降解复合体中除去，从而使β-catenin易位和特定靶基因由TCF介导而活化。外源axin的过表达和显性阴性截短形式TCF(DNTCF4)的表达代表了用来阻断Wnt信号传导途径的已充分表征的方式。
已显示慢病毒介导的axin过表达完全消除了UM-PE13和UM-T3乳腺肿瘤的生长以及NOD/SCID小鼠中的OMP-C11和OMP-C17结肠肿瘤的生长。DNTCF4在UM-T3肿瘤细胞中的稳定表达具有相同效果。综上，这些数据表明细胞内Wnt的阻断能够对不同肿瘤类型的发展产生负面影响，从而为Wnt途径作为治疗乳腺癌和结肠癌的相关靶标提供了支持。
Wnt信号传导途径在许多肿瘤类型中是组成型活化的。在多数结肠肿瘤中，该活化是由于APC的截短突变或β-catenin的激活突变。未曾报导过在其他组织中的此类突变，其他组织中Wnt信号传导途径可能通过另一组突变或自分泌机制激活。在Wnt信号传导途径对自分泌刺激保持响应性的那些肿瘤中，使用诸如抗体或其他可溶性蛋白抑制剂等细胞外方式阻断该途径应该是可行的，并且会影响肿瘤发展。鉴定此类Wnt依赖型肿瘤将有助于开发抗Wnt药剂和在临床中界定待靶定的肿瘤类型。
免疫组化数据显示多数OMP-C11肿瘤细胞表达高水平的细胞质/核β-catenin，这表示Wnt信号传导途径在该种肿瘤中为组成型活化。通过蛋白质印迹在OMP-C11中检测到高水平的β-catenin确认了这一点。Wnt途径活化和对axin过表达的敏感性的组合使OMP-C11成为用来在其中研究响应于Wnt和Wnt阻断的基因表达的调控并从中获得Wnt基因标签的适合肿瘤。
对响应于axin过表达的差异基因表达的微阵列分析
通过微阵列分析确定了在用axin对OMP-C11结肠肿瘤细胞进行处理时的差异基因表达。
将从NOD/SCID小鼠(异种移植肿瘤模型)新鲜移取的人类结肠OMP-C11肿瘤用作结肠肿瘤细胞的来源。产生两种慢病毒载体，用于递送组成型axin-IRES-GFP表达盒和对照IRES-GFP表达盒，将其分别称为LOM91和LOM92。
将OMP-C11肿瘤处理为单细胞悬浮液，并从小鼠谱系细胞中消减出。用LOM91(axin)或LOM92(对照)慢病毒载体以2.5的感染复数感染lin-消减的细胞，在培养物中保持3～4天，根据GFP表达进行分选。从所分选的每个细胞样品中提取出总RNA。在
Figure BDA0000063718710000921
人类基因组U133 Plus 2.0微阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)上分析该RNA。重复该实验两次。
通过分析在进行axin处理后差异表达的基因(这些基因还显示出与一组正常和恶性结肠肿瘤样品间的axin2表达的相关性)，得到了包含由Wnt途径调控的一组核心基因的基因签名。从上述axin微阵列实验中鉴定出了响应于axin过表达时显示出下调的基因。用于此选择的阈值是：与对照样品相比Axin1过表达样品中下调50％以上(Axin1过表达样品相对于对照样品的比率的log2值必须为-1以下)，且T检验p值小于0.1。由于Axin1是已知的Wnt途径抑制剂，Axin1的过表达所下调的基因将是直接或间接的Wnt途径靶标。随后，通过在一组结肠/肠/其他消化组织的恶性肿瘤样品(232个样品)中鉴定与aixin2高度相关(相关值＞0.3)的基因，进一步细化了上述选择。由于Axin2是已知的Wnt靶标，表达模式与Axin2相似的基因可能也会是Wnt靶标。此分析产生了Wnt途径活性的基因标签(表6)。可利用此标签中的基因的表达水平来评估各肿瘤样品或不同类型的肿瘤是否显示出Wnt途径信号传导发生更改的证据。
表6：源自结肠肿瘤的Wnt基因标签列表
Figure BDA0000063718710000931
实施例15 使用抗FZD受体的抗体治疗人类癌症
本实施例描述了使用抗FZD受体的抗体来靶定肿瘤从而治疗癌症的方法，所述肿瘤含有：癌干细胞，和/或已检测到FZD受体表达的肿瘤细胞，和/或具有的Wnt基因标签(例如实施例14的Wnt基因标签)表明其可响应于对Wnt信号传导的抑制的肿瘤细胞。
从肿瘤活检物中可首先确定癌干细胞标记物的存在或FZD受体的存在或Wnt基因标签中一种或多种基因的表达。在无菌条件下从来自诊断患有癌的患者的活检物中移取肿瘤细胞。在一些实施方式中，将组织活检物新鲜冷冻于液氮中，包埋入O.C.T.，并在低温恒温器上切成10μm的切片并置于载玻片上。在一些实施方式中，将组织活检物用福尔马林固定，石蜡包埋，并在切片机上切成10μm的切片并置于载玻片上。
使切片与抗FZD受体的抗体温育，从而检测FZD蛋白的表达。作为另一种选择，可以分析切片来确定实施例14所述的Wnt基因标签中的一种或多种基因的存在。
还可以确定癌干细胞的存在。将组织活检样品切成小片，使用无菌刀片将其完全切碎，并对细胞进行酶消化和机械破碎来获得单细胞悬浮液。随后，使分散的肿瘤细胞与抗ESA、抗CD44、抗CD24、抗Lin和抗FZD的抗体温育以检测癌干细胞，并且如上文所详细描述的，通过流式细胞术来确定ESA+，CD44+，CD24-/low，Lin-，FZD+癌干细胞的存在。
用抗FZD受体的抗体来治疗癌症患者，所述患者的肿瘤经诊断表达FZD受体和/或Wnt基因标签中的一种或多种基因。在某些实施方式中，对如上文所述而产生的抗FZD受体的人源化或人类单克隆抗体进行纯化，并与适合的注射用制药载质进行配制。在一些实施方式中，用FZD抗体治疗患者，每月至少一次，并持续至少10周。在一些实施方式中，用FZD抗体治疗患者，每周至少一次，并持续至少14周。抗体的每次施用应当是制药有效剂量。在一些实施方式中，施用约2mg/ml～约100mg/ml的抗FZD抗体。在一些实施方式中，施用约5mg/ml～约40mg/ml的抗FZD抗体。可以在实施标准放射治疗方案或实施使用一种或多种化疗剂(例如奥克赛铂、氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸或链脲菌素)的化疗方案之前、同步或之后施用抗体。对患者进行监控，从而确定此类治疗是否已引起了抗肿瘤应答，例如，根据肿瘤衰退、新肿瘤发生率的减少、更低的肿瘤抗原表达、癌干细胞数量的减少或评估疾病预后的其他方法。
实施例16 用18R5和吉西他滨治疗后胰腺肿瘤细胞的分化
通过定量PCR(Q-PCR)对经治疗的胰腺肿瘤细胞进行的基因表达分析
通过定量PCR分析对上述用对照Ab、18R5 IgG抗体、吉西他滨或吉西他滨与18R5 IgG抗体的组合治疗过的PN4异种移植肿瘤(实施例7)进行嗜铬粒蛋白A(CHGA)表达分析。已公知CHGA是多种肿瘤(包括乳腺、结肠、肺和胰腺肿瘤)的神经内分泌分化标记物，而且已发现在胰腺肿瘤中CHGA的表达升高与提高的存活率有关(Tezel等，2000.Cancer 89，2230-6)。
从PN4异种移植物研究中的每组的5个肿瘤中制备总RNA，并根据标准操作规程使用Applied Biosystems
Figure BDA0000063718710000951
所列示的探针通过一步式逆转录(RT)-PCR来对其进行评估。用于CHGA分析的探针-引物组(Hs00154441_ml)包括带FAM-染料标记的探针和以下引物：5′-CGCTCTCCAAGGCGCCAAGGAGAGG-S′(SEQ ID NO：75)。使用GusB作为内部对照。简言之，RT于48℃进行30分钟，于95℃进行10分钟的起始变性，随后进行40个循环：于95℃15秒变性，和于60℃进行1分钟的延伸，实时观察荧光探针的扩增/掺入。
胰岛β细胞标记物CHGA仅在来自用吉西他滨和18R5组合治疗的小鼠的样品中显著升高。来自对照Ab、18R5和仅用吉西他滨组的肿瘤表达相似水平的CHGARNA，而来自组合组的肿瘤显示出清楚升高的CHGA表达。在用18R5和吉西他滨组合治疗的肿瘤中，两个实验中的CHGA水平升高了10倍和7倍。代表性实验的结果示于图42中。
通过免疫组化对经治疗的胰腺肿瘤细胞进行的基因表达分析
通过对从经治疗的肿瘤中制备的组织切片实施免疫组化，在蛋白质水平上也观察到了升高的CHGA表达(数据未示出)。经对照Ab治疗的肿瘤显示出对散布在肿瘤中的小群细胞的密集染色。仅用18R5或仅用吉西他滨治疗的肿瘤表达与对照类似水平的CHGA。相比之下，用18R5和吉西他滨组合治疗的肿瘤显示出CHGA阳性细胞数量的升高，这与Q-PCR所检测到的升高的RNA表达一致。
用阿尔新蓝和抗ki67抗体进行染色
内分泌、分泌或导管细胞的另一特征是粘液素的产生，可通过阿尔新蓝染色来检测这些细胞(van Es等，2005.Nature 435 959-63)。在采集和处理肿瘤的过程中，观察到经18R5治疗的肿瘤比经对照治疗的肿瘤更具粘液性。因此，用阿尔新蓝对来自用对照抗体、仅吉西他滨、仅18R5或18R5和吉西他滨的组合治疗的小鼠的PN4肿瘤切片进行染色。相对于对照组和仅用吉西他滨的组，在仅用18R5的组和组合使用18R5和吉西他滨的组中经18R5治疗的肿瘤显示出明显增加的阿尔新蓝染色(数据未示出)。
第二种胰腺肿瘤系PN13在用18R5或对照抗体进行治疗后，也注意到增多的粘液性细胞(图43)。在此实验中携带PN13肿瘤的小鼠接受如上所述的治疗(实施例7)。用阿尔新蓝对肿瘤切片染色以揭示粘液性细胞，并且用抗ki67的抗体通过免疫组化对其染色以揭示进行增殖的细胞。该结果显示18R5治疗致使阿尔新蓝阳性粘液性细胞数量显著升高。此外，18R5治疗降低了ki67阳性细胞的频率。有趣的是，在粘液性细胞和ki67阳性细胞之间并无重叠，这表示粘液性细胞是非增殖性的。这为18R5治疗促使肿瘤细胞分化为非增殖性后代提供了证据。
总之，CHGA表达升高、通过阿尔新蓝染色证实的粘液素的产生提高和通过抗ki67抗体染色证实的非增殖性后代的产生与下述模型一致：用18R5治疗对Wnt-FZD信号传导进行的抑制促使胰腺肿瘤细胞向多种不同的细胞类型分化，所述多种不同的细胞类型具有非增殖性分化细胞的特征。
实施例17 仅用18R5和/或组合使用18R5和其他抗癌药剂而进行的其他体内效用研究
对OMP-LU24异种移植肿瘤生长的影响
对单独使用抗FZD抗体18R5或与
Figure BDA0000063718710000961
(紫杉醇)组合使用的抗FZD抗体18R5在体内抑制OMP-LU24人类肺肿瘤生长方面的效用进行了评估。
将50,000个OMP-LU24人类肺肿瘤细胞皮下注射至NOD/SCID小鼠中。使肿瘤生长27天，直至其平均体积达到143mm3。将动物随机分为4组(每组n＝9)，并且用对照抗体(“对照Ab”)、抗FZD的18R5(“18R5”)、(“Taxol”)或18R5与
Figure BDA0000063718710000963
的组合(“18R5+Taxol”)对其进行治疗。在图44中所示的天数进行肿瘤测量。以10mg/kg的剂量腹膜内(IP)施用抗体，每周一次；以15mg/kg的剂量腹膜内施用
Figure BDA0000063718710000964
每周一次。
该结果示于图44中。发现抗FZD治疗可减少肿瘤生长，并且与仅用
Figure BDA0000063718710000965
的治疗相比，组合治疗显示出增强的抗肿瘤活性。
对OMP-LU33异种移植肿瘤生长的影响
还对单独使用抗FZD抗体18R5或与
Figure BDA0000063718710000966
(贝伐单抗)组合使用的抗FZD抗体18R5在体内抑制OMP-LU33人类肺肿瘤生长方面的效用进行了测试。
将10,000个OMP-LU33人类肺肿瘤细胞皮下注射至NOD/SCID小鼠中。使肿瘤生长30天，直至其平均体积达到124mm3。将动物随机分为4组(每组n＝10)，并且用对照抗体(方形)、
Figure BDA0000063718710000967
(指向下的三角形)、抗FZD的18R5(指向上的三角形)或18R5与的组合(圆形)对其进行治疗。在图45中所示的天数进行肿瘤测量。以10mg/kg的剂量腹膜内施用抗体，一周两次。
该结果示于图45中。发现抗FZD治疗可减少肿瘤生长，并且与仅用
Figure BDA0000063718710000971
的治疗相比，组合治疗显示出增强的抗肿瘤活性。
对T3异种移植肿瘤生长的影响
还对单独使用抗FZD抗体18R5或与
Figure BDA0000063718710000972
(曲妥单抗)组合使用的抗FZD抗体18R5在体内抑制T3人类HER2阳性乳腺肿瘤生长方面的效用进行了评估。
将50,000个T3人类乳腺肿瘤细胞皮下注射至NOD/SCID小鼠中。使肿瘤生长32天，直至其平均体积达到125mm3。将动物随机分为4组(每组n＝10)，并且用对照抗体(方形)、抗FZD的18R5(三角形)、
Figure BDA0000063718710000973
(小实心圆形)或18R5与
Figure BDA0000063718710000974
的组合(空心圆形)对其进行治疗。在图46中所示的天数进行肿瘤测量。以10mg/kg的剂量腹膜内施用抗体，一周两次。
该结果示于图46中。与仅用
Figure BDA0000063718710000975
进行的治疗相比，用18R5和
Figure BDA0000063718710000976
进行的组合治疗显示出增强的抗肿瘤活性。
实施例18 抗FZD抗体的序列
下表7和下表8中分别提供了抗FZD抗体的重链和轻链CDR。下表9中示出了抗FZD抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)及其编码序列。图13～图15或下表10和表11中提供了表9中所列的VH和VL的氨基酸序列和多核苷酸序列。图14～图15或下表12中提供了编码抗FZD抗体的重链或轻链的序列。
表7：抗FZD人类抗体的重链CDR
Figure BDA0000063718710000977
表8：抗FZD人类抗体的轻链CDR
Figure BDA0000063718710000981
表9：抗FZD人类抗体的VH和VL
Figure BDA0000063718710000982
表10：其他抗FZD的VH和VL氨基酸序列
Figure BDA0000063718710000983
表11：编码抗FZD抗体的VH和VL的其他核苷酸序列
Figure BDA0000063718710000991
表12：编码抗FZD IgG抗体(包括信号序列)的重链(HC)或轻链(LC)的其他核苷酸
序列
Figure BDA0000063718710001001
Figure BDA0000063718710001021
依照布达佩斯条约的要求，将分离自E.coli的编码抗FZD IgG抗体18R4605的质粒(ATCC保藏号PTA-10307)、编码18R4805的质粒(ATCC保藏号PTA-10309)和编码44R24的质粒(ATCC保藏号PTA-10311)于2009年8月26日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA，USA。
实施例19 抗FZD抗体的结合图谱
使用FACS分析来表征抗FZD单克隆抗体(mAb)对FZD1、2、5、7和8的结合特性。
用表达全长FZD1、2、5、7或8的质粒DNA和表达用作转染标记物的报告基因GFP的另一质粒共转染HEK293细胞。根据制造商的操作说明使用Fugene 6(Roche)作为转染试剂。将转染后的细胞于37℃在5％CO2中温育24～48小时。随后将抗FZDmAb稀释至50μl的最终体积中，其中从20μg/ml的浓度开始进行4倍连续稀释，共稀释8次。将每个FZD/GFP 293瞬时转染库收集于悬浮液中，并且在冰上使100,000个转染后的细胞与待测试的稀释后的抗FZD mAb温育30～60分钟。清洗细胞，并且用与荧光生色团偶联的抗人类二抗来检测所结合的抗Fzd抗体。随后通过FACS检测带标记的细胞并对其进行计数。以平均荧光强度(MFI)单位来表达所产生的FACS数据。使用GraphPad Prism软件来对数据进行制图和分析。将MFI作为Ab浓度的函数来进行作图，从而建立剂量-反应曲线。对数字进行非线性回归曲线拟合并计算EC50。
确定并比较了mAb 18R5和44R24的结合特性。图47中显示了表示18R4和44R24中的每一个与FZD1、2、5、7和8的结合的剂量-反应曲线。表13中显示了为两种mAb计算出的EC50(nM)。44R24以良好的亲和力结合Fzd5和Fzd8。未能对其他3种Fzd受体建立S形剂量-反应曲线，这表示44R24不结合Fzd1、2和7。对于18R5，确定了与Fzd1、2、5和7结合的高亲和力。
表13：mAb 18R5和44R24的EC50(nM)
  EC50(nM)   Fzd1   Fzd2   Fzd5   Fzd7   Fzd8
  18R5   0.41   0.62   1.10   0.58   12.00
  44R24   117.95   无结合   1.89   92.31   1.09
实施例20 在基于细胞的测定中评估抗FZD mAb的抗Wnt活性
确定并比较了18R5和44R24在STF-293细胞中抑制Wnt信号传导的能力。STF细胞是稳定转染有Super Top Flash(STF)报告基因盒的人胚肾(HEK)-293细胞，其中荧光素酶(Luc)报告基因的表达受到位于最小启动子上游的多个拷贝的TCF结合部位的调控。低基底Luc表达在响应Wnt3a时能够被诱发30～60倍，从而提供了用来评估抗Fzd Ab的抑制活性的巨大窗口。
为了评估mAb，在DMEM-10％FBS中培养STF-293细胞。在第一天，在96孔光学底白色平板(Nunc#165306)的每个孔中接种10,000个细胞。于37℃在5％CO2中过夜温育细胞。在第二天，使用培养基将待测的Ab稀释至40μg/μl的最终浓度。进行7个连续5倍稀释。用含有50μl Ab稀释液、25μl Wnt3a条件培养基(来自Wnt3a稳定的L-细胞)和25μl DMEM-10％FBS的混合物置换STF-293细胞培养基。对于每种Ab，所测试的最终浓度为20、4、0.8、0.16、0.03、0.006、0.0013、0.0003μg/ml。每个Ab浓度进行三个平行测试。将人类抗半抗原Ab，LZ1，用作阴性对照Ab。使用来自亲本L-细胞的非Wnt3a条件培养基作为阴性对照诱导物。将平板放回培养箱中。在第3天，按照制造商的使用说明使用Promega Steady Glo试剂盒(VWR#PAE2550-A)来测量荧光素酶活性。以光子/秒来表示结果。使用GraphPad Prism软件来对数据进行制图和分析。将荧光素酶活性作为Ab浓度的函数来进行作图，从而建立剂量-反应曲线。对数字进行非线性回归曲线拟合并计算IC50。
如上所述同样确定并比较了44R24和18R5在STF细胞中抑制Wnt信号传导的能力。该结果示于图48和表14中。仅在较高的Ab浓度检测到了44R24活性，反映出抗体在该测定中的低活性。经计算44R24的IC50比18R5的低13倍。
表14：18R5和44R24对ST-293细胞中Wnt信号传导的抑制作用的IC50
  18R5   44R24
  IC50(nM)   2.73   34.43
还确定了18R5和44R24在A549细胞中抑制Wnt信号传导的能力。A549细胞是人类肺癌细胞，其中Axin2基因高度表达，标志着Wnt信号传导的内源活性。Axin2是公知的Wnt靶基因，其通过上调其转录来对该途径的激活产生响应并最终通过反馈回路机制下调Wnt信号传导。使用此系统来通过qPCR检测抗Fzd的Ab对Axin2mRNA水平的影响。
在12孔板中，每孔接种30,000个A549细胞，在DMEM+10％FBS中培养3天。添加不同浓度(5、1、0.2、0.04、0.008μg/ml)的抗体并保持24小时，从细胞中提取总RNA。仅在最高浓度使用LZ1(非结合性抗体)作为阴性对照。
在12孔板中，接种30,000个A549细胞，在DMEM+10％FBS中培养3天。添加不同浓度(5、1、0.2、0.04、0.008μg/ml)的抗FZD抗体18R5或44R24，并且仅在最高浓度使用LZ1(非结合性抗体)作为阴性对照。处理后24小时，制备RNA并随后用DNA酶处理。
已知Axin2是Wnt信号传导中的鲁棒(robust)的靶基因，并且使用AppliedBiosystems 7900HT仪通过进行Taqman相对表达(ΔΔCT)测定来检查其表达水平。在每个点(平行进行三次)使用50ng RNA，将GUSB探针用于内部对照。将所有结果对LZ1对照样品中的Axin2水平标准化。
显示18R5和44R24对axin2基因表达基底水平的抑制的剂量-反应曲线和计算出的这些抗体的EC50值示于图49中。相对于LZ1对照，18R5和44R24以相仿的效率抑制Axin2基底水平。
实施例21 评估胰腺异种移植模型中的抗FZD mAb的抗肿瘤活性
OMP-PN13胰腺肿瘤：
从Oncomed肿瘤库获得了已经在小鼠中传代2次的冷冻OMP-PN13肿瘤细胞。将其解冻并在解冻后立即皮下注射入NOD/SCID小鼠左肋。每只动物注射了约25,000个活细胞。每周监视小鼠的肿瘤生长。在肿瘤发生后，每周用卡尺对肿瘤尺寸进行一次测量。将携带200～300mm3的肿瘤的小鼠分到治疗组中，每组包含5只动物。每组中的平均肿瘤尺寸相仿。随机分组后第一天开始进行Ab治疗。使用LZ1作为阴性对照Ab。在12天期间，通过腹膜内注射施用3份剂量的Ab，每份为10mg/kg。最后一次注射后24小时使小鼠安乐死。采集肿瘤、十二指肠和肝脏。
将肿瘤组织固定于福尔马林中，用于石蜡包埋和切片。通过免疫组化(IHC)来进行Muc16检测，从而监视产生粘液素的细胞的出现。粘液素对胰腺中分化细胞亚型有特异性，并因此在肿瘤模型中用作分化标记物。
将经福尔马林固定的、用石蜡包埋的(FFPE)切片脱去石蜡。首先通过用二甲苯连续处理两次(每次5分钟)来使载片脱去石蜡。随后通过连续浸入100％的乙醇两次(每次3分钟)、90％的乙醇水溶液1次(1分钟)、80％的乙醇水溶液1次(1分钟)和70％的乙醇水溶液1次(1分钟)来使组织再水化。用流动的蒸馏水将该组织清洗1分钟。
将粘液素16抗体(来自AbCAM的克隆X325，目录号ab10033)用于对FFPE组织切片中的表达粘液素16的细胞的IHC检测。在高压灭菌器中用10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)进行热引发的抗原恢复(heat-induced antigen retrieval)。随后将载片置于室温下，使蛋白缓慢地恢复抗原性(约2小时)。
用3％过氧化氢水溶液封闭组织切片，清洗，随后用正常马血清封闭液(每50ml中含有PBS(38.5ml)、10％NHS(5ml)、1％BSA(5ml)、0.1％白明胶(500μl)、0.1％Tx-100(500μl)、0.05％NaN3(500μl))于室温下再次封闭1小时。随后用以1∶200稀释于Da Vinci Green稀释剂(pH7.3)(PD 900，Biocare Medical)中的Muc16一抗于室温下将切片染色1小时，随后用含有0.1％triton X-100的磷酸盐缓冲盐水清洗三次。随后用3滴ImmPress抗小鼠IgG HRP偶联物(目录号101098-260，VWR)于室温下将切片染色30分钟，随后用含有0.1％triton X-100的磷酸盐缓冲盐水清洗三次。将载片置于陪氏培养皿(petridish)中，并用Vector NovaRed试剂盒(SK4800，Vector labs)显色1～2分钟。通过添加蒸馏水来使反应停止。在流动的蒸馏水下充分冲洗载片。随后使用苏木精(目录号H3401，Vector Labs Gill′s formula)将组织切片复染1分钟，清洗，随后用发蓝液(blueing solution)中和30秒。使载片过夜干燥，随后使用VectaMount(Vector Labs)进行封片。
图50显示了用对照Ab(LZ1)、18R5或44R24治疗的肿瘤的代表性区域。LZ1对应于低密度染色，在用18R5治疗的肿瘤中检测到了更高水平的Muc16抗体染色。这表示18R5诱使肿瘤细胞向产生粘液素的细胞谱系分化。在本实验中，经44R24治疗的肿瘤中的Muc16染色水平弱于经18R5治疗的肿瘤中的水平，但仍然略高于经LZ1治疗的肿瘤中的水平。
还从肿瘤、十二指肠和肝脏中提取了总RNA，用于提供qPCR进行的Wnt靶基因表达分析。
在采集后立即将组织转移到RNAlater(QIAGEN)中。根据制造商的操作说明，使用QIAGEN纤维组织RNeasy袖珍试剂盒来提取RNA。使用ABI一步式RT-PCR操作规程及试剂对50ng总RNA进行基因表达分析。将GUSB基因的表达用作内源对照。将每个样品进行三个平行试验。对每个治疗组的全部5个肿瘤进行了分析。使用ABI 7900 TaqMan仪来进行这些实验。使用ABI SDS 2.2.1软件来分析数据并计算ΔCT值，将该值转化为相对量。对每个治疗组，将全部5个肿瘤的三个平行试验值取平均值。随后计算相对于对照抗体(LZ1)的抑制倍数(fold inhibition factor)。
该结果示于表15中。抗FZD Ab对Wnt靶基因产生了不同程度的影响。18R5在肿瘤和肝脏中诱发了2.3x和8x的抑制，而十二指肠中未受到影响。44R24所诱发的变化则更弱。
表15：对经18R5和44R24治疗的组织中的Wnt靶基因的qPCR基因表达分析
ND：未进行
单独的实验以斜体显示
OMP-PN4胰腺肿瘤：
还研究了18R5对OMP-PN4胰腺肿瘤异种移植模型中的肿瘤基质的影响。通过微阵列鉴定出了若干表达水平因治疗而发生改变的基因。其中，特别引人注意的是编码平滑肌肌动蛋白(SMA)的ACTA2。已显示SMA与活化的肿瘤基质有关。因此可以将SMA的下调视为致瘤表型减少的标志。
如在上文实施例7中所述，用对照Ab(LZ-1)、18R5、吉西他滨或18R5与吉西他滨的组合治疗携带OMP-PN4肿瘤的NOD/SCID小鼠，每周治疗一次并持续6周。以10mg/kg的浓度施用抗体。在采集肿瘤之后，分别使用微阵列和IHC，在RNA水平和蛋白水平上分析来自上述实验的肿瘤的Wnt靶基因表达。
从肿瘤中提取出总RNA，扩增，并进行微阵列分析。使用Ovation RNA扩增系统V2(NuGEN，San Carlos，CA)来扩增总RNA。将所得的扩增后的反义ss-cDNA片段化并使用FL-Ovation cDNA生物素模块V2(NuGEN)生物素化，以供在Affymetrix芯片上使用。在这些实验(在Almac Diagnostics，Durham，NC进行)中使用AffymetrixHG-U133 plus 2或MG 4302.0寡核苷酸微阵列。杂交后，根据制造商的操作说明(Affymetrix，Santa Clara，CA)对基因芯片进行清洗、染色并扫描。在阵列杂交前，通过光谱仪和Bioanalyzer对cDNA及片段化的cDNA的品质进行评估。使用GCOS软件包(Affymetrix)对所扫描的原始芯片数据进行定量和定标，并且进行由Affymetrix推荐的基因芯片品质控制(Gene Chip Quality Control)全面评估以检测任何的芯片缺陷和异常，并将所述缺陷和异常从后续的数据分析中剔除。
用在开源软件Bioconductor(www.bioconductor.org)中的GCRMA算法来进行阵列背景调整和信号强度标准化。用Bayesian T检验(Cyber-T)来鉴定两组间或两个时间点间差异表达的基因，所述Bayesian T检验结并了学生T检验和对组内变化的Bayesian评估，所述组内变化是从所观察到的表达水平相似的探针组变化获得的(Baldi P，LongAD.A Bayesian framework for the analysis of microarray expression data：regularizedt-test and statistical inferences of gene changes.Bioinformatics.2001；17(6)：509-19)。
为了进行人类肿瘤基因芯片分析，在人类和小鼠芯片上测定样品，从而独立地评估对整个人类肿瘤和对小鼠基质的治疗效果。将无物种特异性的Affymetrix探针组从分析中略去。
在准备平滑肌肌动蛋白α(SMAa)免疫荧光时，使用OCT冷冻肿瘤组织。获得了4μm切片并冻存于-80℃。为了进行SMAa染色，使用冰冷的丙酮于-20℃固定组织15分钟，随后使其干燥并达到室温，随后用疏水性PAP笔进行标记。随后使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗载片。使用正常马血清R.T.U.(Vector Labs)于室温封闭组织2小时。用以1∶10,000稀释的FITC偶联的平滑肌肌动蛋白α抗体(cline 1A4，#F3777，SIGMA)进行1小时的一抗染色。使用含有0.1％triton X-100的PBS清洗切片3次。随后使载片风干，随后使用包含DAPI的坚固封片介质(vectashied H-500)来进行封片。
图51A显示了通过微阵列检测到的ACTA2基因表达水平。用抗FZD抗体18R5治疗的肿瘤显示出ACTA2表达水平下降。图51B显示了对经对照mAb(上图)和18R5(下图)治疗的OMP-PN4肿瘤的平滑肌肌动蛋白α(SMAa)免疫荧光结果。在经18R5治疗的肿瘤上检测到SMAa量的减少。在肿瘤中ACTA2的表达和SMA的量响应于18R5而显著减少，这表示Wnt的阻断(i)影响该肿瘤分区(tumor compartment)且(ii)通过减少充分确定的致瘤标记物来达到上述效果。这些结果表示成肌纤维细胞活化的减少可能是18R5抗肿瘤作用机制中的一种。
实施例22 对Muc16阳性OMP-PN13细胞的致瘤潜力的评估
如上所述，18R5治疗诱发胰腺肿瘤中的基因表达和细胞表型变化，包括升高的粘液素表达。特别而言，对治疗后的PN-13肿瘤进行的IHC显示了增多的Muc16阳性细胞数量。在经治疗的肿瘤中Muc16基因表达水平也比对照肿瘤中高。评估了18R5所诱导的Muc16阳性细胞的致瘤性来检验下述假说：18R5所诱导的Muc16阳性细胞代表分化的肿瘤细胞亚群。
根据实施例21中描述的操作规程用18R5治疗携带OMP-PN13的小鼠。开始进行Ab治疗后12天，使小鼠安乐死。采集肿瘤并用胶原酶III来进行处理以消化组织，从而获得单细胞悬浮液。用生物素化的抗H-2Kd抗体和生物素化的抗CD45抗体对小鼠基质细胞进行染色。随后使其与偶联有抗生蛋白链菌素的磁珠(ThermoMagnaBind)温育，并使用Dynal磁体进行消减。用抗Muc16mAb对所得的lin-消减的肿瘤细胞进行染色，并用PE偶联的二抗Ab进行检测。使用由DIVA软件操纵的ARIAFACS仪对Muc16阳性细胞和Muc16阴性细胞进行分选。参见图52A。将细胞重新皮下注射入NOD/SCID小鼠左肋，以比较其致瘤潜力。每种细胞注射至10只小鼠。每只小鼠接受75个细胞。图52B显示了因注射Muc16-(上图)和Muc16+(下图)细胞而产生的肿瘤的代表图。图52C显示了在对小鼠进行注射后Muc16-和Muc16+肿瘤的生长曲线。在对小鼠注射Muc16+细胞后无肿瘤生长，而用Muc16-细胞注射的10只小鼠中有7只长出了肿瘤。此数据表示18R5所诱导的Muc16+细胞是非致瘤性的，从而支持了对分化的诱导是18R5抗肿瘤活性的内在机制。
实施例23 用抗FZD抗体进行的其他体内研究
用18R5mAb进行的PE13乳腺肿瘤复发研究：将PE-13乳腺肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠中，并使其生长直至肿瘤已达到约100mm3。将动物随机分为2组(n＝10)，并且给予taxol(15mg/kg，每周2次)加对照抗体(黑色方形)或相同剂量的taxol加抗FZD的18R5(灰色空心圆形)。以20mg/kg的剂量施用抗体，每周一次。在第70天停止Taxol治疗，并继续进行抗体治疗。该结果示于图53中。在停止taxol治疗后，观察到18R5提高肿瘤衰退速度并延缓肿瘤复发。
用18R5mAb进行的PE13乳腺肿瘤有限稀释测定(LDA)研究：用对照抗体(灰色圆形)、18R5(空心三角形)、taxol(黑色圆形)或taxol与18R5的组合(空心方形)对携带PE13乳腺肿瘤的动物进行治疗。以15mg/kg的剂量施用Taxol，每周2次；以20mg/kg的剂量施用抗体，每周1次。采集肿瘤，并通过lin消减来纯化人类肿瘤细胞。将50、150或500个肿瘤细胞注射至新的同龄小鼠组中(n＝10/细胞剂量)。该结果示于图54中。59天后监测肿瘤生长频率，并用其来计算CSC频率(L-calc)。
用18R5mAb进行的PN4胰腺肿瘤复发研究：将PN4胰腺肿瘤细胞注射至Nod-Scid小鼠中，并使其生长直至肿瘤已达到约250mm3。对动物给予吉西他滨(75mg/kg，每周1次)并持续5周，直至肿瘤已衰退。将动物随机分为2组，并且给予对照抗体(黑色方形)或抗FZD的18R5(灰色空心圆形)。以10mg/kg的剂量施用抗体，每周一次。该结果示于图55中。在用吉西他滨进行治疗后观察到18R5延缓肿瘤复发。
用44R24mAb进行的PN4胰腺肿瘤生长研究：将PN4胰腺肿瘤注射至Nod-Scid小鼠中。使肿瘤生长直至其体积已达到约150mm3。将动物随机分为4组(每组n＝10)，并且给予对照抗体(黑色方形)、抗FZD5/8的44R24(灰色空心三角形)、吉西他滨(实心三角形)或44R24与吉西他滨的组合(灰色空心圆形)。以15mg/kg的剂量施用吉西他滨，每周1次；以20mg/kg的剂量施用抗体，每周2次。该结果示于图56中。相对于单独使用吉西他滨的情况，观察到与吉西他滨组合的44R24减少肿瘤生长。
实施例24 抗FZD抗体44R24的表位作图
与上文实施例5中对抗体18R8和18R5描述相类似的方式，对抗FZD抗体44R24进行表位作图。使用之前显示破坏18R8的结合的FZD8的一系列氨基酸变体(参见实施例5和图6及图7)，通过流式细胞术来评估44R24与类似18R8表位的表位结合的能力。如共转染(GFP阳性)细胞群体中染色的降低所表明的，发现结合44R24需要FZD8的氨基酸126～127。FACS实验的结果示于图57中。这些结果显示，44R24所结合的表位与18R8的表位重叠且包含共有的氨基酸126～127。
实施例25 用抗FZD抗体18R5、18R8和44R24进行的C28结肠肿瘤生长研究
将C28肿瘤细胞皮下注射至Nod/Scid小鼠中。使肿瘤生长直至其平均体积已达到约126mm3。将携带肿瘤的动物随机分为4组(n＝10只小鼠/每组)，并且用对照Ab(黑色方形)、18R8(灰色三角形)、44R24(黑色空心圆形)或18R5(灰色圆形)进行治疗(图58)。抗体以15mg/kg的剂量腹膜内施用，每周两次。指示出了肿瘤体积。相对于对照组，用抗体44R24和18R5进行的治疗减少了生长，而18R8却无效果(图58)。
在图58所示的实验中对动物进行治疗后，采集肿瘤，固定于福尔马林中，石蜡包埋，并切成5μm的切片。通过免疫组化(Vectastain试剂盒，Vector Labs)分析肿瘤切片的细胞角蛋白7(结肠细胞分化标记物)的表达。发现在用44R24或18R5进行治疗后细胞角蛋白7的表达升高(图59)。
为所有目的，将本文所引用的全部出版物、专利、专利申请、互联网站点和访问号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)以参考方式方式完整地并入本文中，其程度即如同将每个单个的出版物、专利、专利申请、互联网站点或访问号/数据库序列特定地且单独地指明以参考方式方式并入一样。

Claims (107)

1.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，所述人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组，其中，所述药剂：
(a)与所述人类卷曲受体中的序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO：24)的至少一部分结合；和/或
(b)与所述人类卷曲受体中的序列(K/Q)(F/Y)GF(Q/A)(SEQ ID NO：69)的至少一部分结合。
2.如权利要求1所述的药剂，所述药剂特异性地结合选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的多于一种的人类卷曲受体。
3.如权利要求1或2所述的药剂，所述药剂与所述人类卷曲受体中的序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)的至少一部分结合。
4.如权利要求2或3所述的药剂，其中，所述药剂所结合的所述人类卷曲受体包括FZD5和FZD8。
5.一种在竞争性结合测定中与抗体竞争对人类FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的特异性结合的药剂，其中，所述抗体具有包含SEQ ID NO：10的重链可变区和包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的轻链可变区。
6.一种在竞争性结合测定中与抗体竞争对人类FZD5和/或FZD8的特异性结合的药剂，其中，所述抗体具有包含SEQ ID NO：85的重链可变区和包含SEQ ID NO：86的轻链可变区。
7.一种特异性地结合人类FZD8的药剂，其中，所述药剂：
(a)与FZD8中的序列GLEVHQ(SEQ ID NO：25)的至少一部分结合；和/或
(b)与FZD8中的序列QYGFA(SEQ ID NO：66)的至少一部分结合。
8.如权利要求7所述的药剂，所述药剂还特异性地结合人类FZD1、FZD2、FZD5和/或FZD7。
9.一种特异性地结合三种或多于三种人类卷曲受体的药剂，其中，所述三种或多于三种人类卷曲受体包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。
10.如权利要求9所述的药剂，其中，所述三种或多于三种人类卷曲受体还包括FZD3、FZD4、FZD6、FZD9和/或FZD10。
11.如权利要求9或10所述的药剂，其中，所述三种或多于三种人类受体包括FZD5和FZD8。
12.如权利要求11所述的药剂，其中，所述三种或多于三种人类卷曲受体包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。
13.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，其中，所述药剂与所述人类卷曲受体中的生物学结合部位(BBS)的至少一部分结合。
14.如权利要求13所述的药剂，其中，所述人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与下述(a)、(b)和/或(c)的至少一部分结合：
(a)由氨基酸72(F)、74～75(PL)、78(I)、92(Y)、121～122(LM)和129～132(WPDR)构成的构象表位；
(b)由序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)组成的区域；
(c)由序列QYGFA(SEQ ID NO：66)组成的区域。
15.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，其中：
(a)如果所述人类卷曲受体是FZD8，所述药剂与FZD8的由序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)组成的区域的至少一部分结合；和
(b)如果所述人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10，所述药剂与所述人类卷曲受体的一个区域的至少一部分结合，所述区域与FZD8的由序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO：67)组成的区域对应。
16.如权利要求15所述的药剂，其中
(a)如果所述人类卷曲受体是FZD8，所述药剂还与FZD8的由序列QYGFA(SEQID NO：66)组成的区域的至少一部分结合；和
(b)如果所述人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10，所述药剂还与所述人类卷曲受体的一个区域的至少一部分结合，所述区域与FZD8的由序列QYGFA(SEQ ID NO：66)组成的区域对应。
17.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，其中：
(a)如果所述人类卷曲受体是FZD8，所述药剂与FZD8的由序列QYGFA(SEQ IDNO：66)组成的区域的至少一部分结合；和
(b)如果所述人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10，所述药剂与所述人类卷曲受体的对应于FZD8的所述区域的区域的至少一部分结合。
18.如权利要求13或15～17中任一项所述的药剂，其中，所述人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8及其组合组成的组。
19.如权利要求13～18中任一项所述的药剂，所述药剂特异性地结合至少两种人类卷曲受体。
20.如权利要求19所述的药剂，其中，所述至少两种人类卷曲受体中的每一种选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组。
21.如权利要求20所述的药剂，其中，所述至少两种人类卷曲受体包括FZD5和FZD8。
22.如权利要求19或21所述的药剂，所述药剂特异性地结合至少三种人类卷曲受体。
23.如权利要求22所述的药剂，其中，所述至少三种人类卷曲受体中的每一种选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组。
24.如权利要求1～23中任一项所述的药剂，所述药剂不是抗体。
25.如权利要求1～23中任一项所述的药剂，所述药剂是抗体。
26.如权利要求25所述的药剂，所述药剂包含与所述人类卷曲受体特异性地结合的抗原结合部位。
27.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中，所述抗体具有：重链可变区，所述重链可变区包含
(a)重链CDR1，所述重链CDR1包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；重链CDR2，所述重链CDR2包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和重链CDR3，所述重链CDR3包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO：3)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和/或
(b)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含：SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)或SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)，或者SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7的具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含：EKDNRPSG(SEQID NO：5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO：8)，或者SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8的具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和轻链CDR3，所述轻链CDR3包含：SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)，或者SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9的具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
28.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中，所述抗体具有：
(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ IDNO：3)的重链CDR3；和/或
(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO：7)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ IDNO：8)的轻链CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO：9)的轻链CDR3。
29.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中，所述抗体具有：
(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ IDNO：3)的重链CDR3；和/或
(b)包含SGDKLGKKYAS(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1、包含EKDNRPSG(SEQID NO：5)的轻链CDR2和包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO：6)的轻链CDR3。
30.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的多肽，其中，所述多肽含有：
(a)与SEQ ID NO：10具有至少约80％的序列同一性的多肽；和/或
(b)与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14具有至少约80％的序列同一性的多肽。
31.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的多肽，其中，所述多肽含有：
(a)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的多肽；和/或
(b)具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨基酸序列的多肽。
32.如权利要求30或31所述的多肽，所述多肽是抗体。
33.如权利要求27～32中任一项所述的抗体或多肽，所述抗体或多肽特异性地结合FZD5和FZD8。
34.如权利要求33所述的抗体或多肽，所述抗体或多肽特异性地结合人类FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。
35.一种特异性地结合人类FZD5和/或FZD8的抗体，其中，所述抗体具有：
(a)重链CDR1，所述重链CDR1包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO：77)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；重链CDR2，所述重链CDR2包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：78)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和重链CDR3，所述重链CDR3包含SIVFDY(SEQ ID NO：79)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或
(b)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO：80)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含SG(SEQID NO：81)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和轻链CDR3，所述轻链CDR3包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO：82)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
36.一种特异性地结合人类FZD5和/或FZD8的抗体，其中，所述抗体具有：
(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO：77)的重链CDR1、包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：78)的重链CDR2和包含SIVFDY(SEQ IDNO：79)的重链CDR3；和/或
(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID NO：80)的轻链CDR1、包含SG(SEQ ID NO：81)的轻链CDR2和包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO：82)的轻链CDR3。
37.一种特异性地结合FZD5和/或FZD8的多肽，其中，所述多肽含有：
(a)与SEQ ID NO：85具有至少约80％同一性的多肽；和/或
(b)与SEQ ID NO：86具有至少约80％同一性的多肽。
38.一种特异性地结合FZD5和/或FZD8的多肽，其中，所述多肽包含：
(a)具有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的多肽；和/或
(b)具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的多肽。
39.如权利要求37或38所述的多肽，所述多肽是抗体。
40.一种与18R8、18R5、18R4605或18R4805竞争对人类FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的特异性结合的抗体。
41.一种与44R24竞争对人类FZD5和/或FZD8的特异性结合的抗体。
42.如权利要求1～41中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是所述人类卷曲受体的拮抗剂。
43.如权利要求1～42中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是IgG1或IgG2抗体。
44.如权利要求1～42中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是抗体片段。
45.如权利要求1～43中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是单克隆抗体。
46.如权利要求1～43中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是人类抗体。
47.如权利要求1～43中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是人源化抗体。
48.如权利要求1～47中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体抑制Wnt与所述人类卷曲受体的结合。
49.如权利要求1～48中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体抑制经典Wnt信号传导。
50.如权利要求1～49中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体抑制肿瘤生长。
51.如权利要求1～50中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体结合所述人类卷曲受体的细胞外结构域。
52.如权利要求51所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体结合所述人类卷曲受体的Fri结构域。
53.如权利要求1～52中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体以约100nM或更低的KD与所述人类卷曲受体结合。
54.一种由质粒的序列编码的抗体，所述质粒保藏于ATCC且保藏号为PTA-9540或PTA-9541。
55.如权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体是分离的药剂、多肽或抗体。
56.如权利要求55所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体是基本纯净的药剂、多肽或抗体。
57.一种分离的细胞，所述细胞产生权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
58.一种药物组合物，所述药物组合物包含制药上可接受的载质和权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
59.一种药物组合物，所述药物组合物包含第二抗癌药剂和权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
60.一种试剂盒，所述试剂盒包含第二抗癌药剂和权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
61.一种抑制细胞中的经典Wnt信号传导的方法，所述方法包括用权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体接触所述细胞。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞。
63.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
64.一种减小受试者的含有癌干细胞的肿瘤的致瘤性的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体，其中所述肿瘤中癌干细胞的频率通过施用所述药剂、多肽或抗体而减小。
65.一种诱使受试者的肿瘤中的细胞分化的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述肿瘤是胰腺肿瘤或结肠肿瘤。
67.如权利要求62～65中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤是选自由结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、成胶质细胞瘤和头颈部肿瘤组成的组的肿瘤。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述肿瘤是结肠直肠肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤。
69.一种治疗受试者的癌的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
70.如权利要求69所述的方法，其中，所述癌是选自由结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤和头颈部癌组成的组的癌。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述癌是结肠直肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
72.如权利要求63～71中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述受试者施用第二抗癌药剂。
73.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二抗癌药剂是化疗剂。
74.如权利要求73所述的方法，其中，所述化疗剂是抗代谢物。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述化疗剂是吉西他滨。
76.如权利要求72所述的方法，其中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。
77.如权利要求76所述的方法，其中，所述化疗剂是依立替康。
78.如权利要求72所述的方法，其中，所述化疗剂是抗有丝分裂剂。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述药剂包括紫杉烷类化合物。
80.如权利要求79所述的方法，其中，所述紫杉烷类化合物是紫杉醇。
81.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二抗癌药剂是血管发生抑制剂。
82.如权利要求81所述的方法，其中，所述血管发生抑制剂是抗VEGF的抗体。
83.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二抗癌药剂是Notch信号传导的抑制剂。
84.如权利要求83所述的方法，其中，所述Notch信号传导的抑制剂是抗Notch的抗体或抗DLL4的抗体。
85.一种治疗受试者的疾病的方法，其中，所述疾病与Wnt信号传导的活化有关，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
86.如权利要求85所述的方法，其中，所述Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。
87.一种治疗受试者的病症的方法，其中，所述病症的特征是干细胞和/或祖细胞的水平升高，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
88.如权利要求63～87中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
89.一种分离的多肽，所述多肽包含选自由SEQ ID NO：10～15和SEQ ID NO：85～86组成的组的序列。
90.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求89所述的多肽的多核苷酸。
91.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO：17～22、87～90、92和94～95组成的组的序列。
92.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含在高严谨度条件下与下述(a)或(b)杂交的多核苷酸：
(a)选自由SEQ ID NO：17、19、21、87～90、92和94～95组成的组的多核苷酸；
(b)编码选自由序列SEQ ID NO：10、12、14和85～86组成的组的多肽的多核苷酸。
93.一种载体，所述载体包含权利要求90～92中任一项所述的多核苷酸。
94.一种分离的细胞，所述细胞包含权利要求90～92中任一项所述的多核苷酸。
95.一种筛选具有抗癌干细胞活性的药剂的方法，所述方法包括：
将第一实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平与第二实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平进行比较，所述第一实体瘤已暴露于所述药剂，所述第二实体瘤未暴露于所述药剂。
96.一种筛选具有抗癌干细胞活性的药剂的方法，所述方法包括：
(a)使第一实体瘤暴露于所述药剂，而第二实体瘤不暴露于所述药剂；
(b)评估所述第一实体瘤和第二实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平；和
(c)比较所述第一实体瘤和第二实体瘤中的所述一种或更多种分化标记物的水平。
97.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述药剂特异性地结合一种或更多种人类卷曲受体。
98.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述第一实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平相对于第二实体瘤的升高表明了抗实体瘤干细胞效用。
99.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述实体瘤是胰腺肿瘤。
100.如权利要求99所述的方法，其中，所述一种或更多种分化标记物包括(a)一种或更多种粘液素或(b)嗜铬粒蛋白A(CHGA)。
101.如权利要求100所述的方法，其中，所述一种或更多种分化标记物包括粘液素16(Muc16)。
102.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述实体瘤是结肠肿瘤。
103.如权利要求102所述的方法，其中，所述一种或更多种分化标记物包括细胞角蛋白7。
104.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述药剂是特异性地结合一种或更多种人类卷曲受体的抗体。
105.一种减少实体瘤基质中的成肌纤维细胞活化的方法，所述方法包括用有效量的权利要求1～54中任一项所述的药剂、多肽或抗体接触所述基质。
106.一种诱使肿瘤中的细胞分化的方法，所述方法包括用有效量的抗体接触所述肿瘤，所述抗体与人类卷曲受体特异性地结合并且是所述人类卷曲受体的拮抗剂。
107.一种减少实体瘤基质中的成肌纤维细胞活化的方法，所述方法包括用有效量的抗体接触所述基质，所述抗体与人类卷曲受体特异性地结合并且是所述人类卷曲受体的拮抗剂。
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