JP2002523105A - 異種遺伝子の運搬用の標的化アデノウイルスベクター - Google Patents

異種遺伝子の運搬用の標的化アデノウイルスベクター

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ドウデイユ，ジヤン−フランソワ
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イエー，パトリス
ペリコデ，ミシエル
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アバンテイス・フアルマ・エス・アー
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Abstract

(57)【要約】 アデノウイルスファイバータンパク質およびヘキソンタンパク質の内部部位の修飾はアデノウイルスベクターの有効な標的化を可能にする。アデノウイルスの標的化の方向を変えるために利用可能な部位を同定した。該ヘキソンタンパク質のHVR5ループおよび該ファイバータンパク質のHIループ（ノブ）は、外来タンパク質配列の挿入に対して高度に許容性であり、それは対応ウイルスの生存能および生産性に影響を及ぼさないらしかった。該エピトープの利用性および機能性は隣接スペーサーのサイズに強く依存する。他の結果は、短い標的化ペプチドが該ファイバータンパク質のC末端に有効に融合されうると示唆している。特定の実施形態においては、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体保持細胞に標的化するためにHVR5部位、ファイバータンパク質HIループまたはファイバータンパク質C末端において修飾された一連のアデノウイルスベクターを製造した。そのようなベクターは、脈管系に標的化するのに（例えば癌または心臓血管病態の遺伝子治療に）特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、標的化アミノ酸配列を含むようにファイバーまたはヘキソンタンパ
ク質の表面接近可能部位を修飾することによるアデノウイルスベクターの有効な
標的化に関する。本発明の成功の鍵は、挿入される標的化配列のN末端およびC末
端の付加スペーサーアミノ酸残基が該標的化配列の認識可能な結合構造を得るた
めに決定的に重要であるという知見にある。したがって、該標的化配列の接近可
能性および機能性ならびに修飾されたタンパク質の構造は、該隣接スペーサーの
サイズおよび性質に強く依存する。他の結果は、短い標的化ペプチドが該ファイ
バータンパク質のC末端に有効に融合されうると示唆している。本発明は更に、
特定の標的細胞に治療用遺伝子をインビトロおよびインビボで運搬するための、
そのようなベクターの用途に関する。
【０００２】 （発明の背景） アデノウイルスベクター アデノウイルスは、遺伝子治療における遺伝子導入用のベクターとしての使用
に特に有利な一定の特性を示す。特に、それらは、かなり広い宿主スペクトルを
有し、静止期細胞に感染する能力を有し、感染細胞のゲノム内に組込まれず、現
在のところヒトにおける主要な病理学には関連していない。したがって、アデノ
ウイルスは、関心のある遺伝子を筋肉内（Ragotら, 1993, Nature 361:647）、
肝臓内（Jaffeら, 1992, Nature Genetics 1:372）、神経系内（Akliら, 1993,
Nature Genetics 3:224）、腫瘍内（Griscelliら, 1998, PNAS 95:6367）、無傷
または損傷血管内皮内（van Belleら, 1998, Human Gene Therapy 9:1013）、滑
液組織内（Ghivizzaniら, 1998, PNAS 95:4613）などに導入するために使用され
ている。アデノウイルスベクターは、複製細胞および非複製細胞の両方に効率的
に遺伝子を導入する（例えば、Crystalら, 1995, Science 270:404-410を参照さ
れたい）。
【０００３】 アデノウイルスカプシド アデノウイルスカプシドの特徴はよく知られている（例えば、国際特許公開WO
98/07877を参照されたい）。
【０００４】 種々の文献がアデノウイルスヘキソンタンパク質について記載しており、接近
可能部位の或る程度の推測を可能にする。例えば、Athapillyら（1994, J. Mol.
Biol. 242:430-455）は、分解能2.9Aのその高精度結晶構造を記載している。Cr
awford-Mikszaら（1996, J. Virol. 70:1836-1844）は、血清型に特異的な残基
を含有する7個のエキソンタンパク質高度可変領域の位置および構造を報告して
いる。実際に、アデノウイルスヘキソンの表面上での外来性エピトープの発現の
報告がある（Cromptonら, 1994, J. Gen. Virol. 75:133-139）。しかしながら
、後記実施例に示すとおり、Cromptonらの文献は、ヘキソンタンパク質を修飾す
ることによりアデノウイルスを標的化する再現可能な方法を開示していない。
【０００５】 追加的な文献は、ファイバータンパク質に関する情報を提供している（Chrobo
czekら, 1995, Doerfler W. ＆ P. Bohm (編), The molecular repertoire of a
denoviruses, pp. 163-200, Spring-Verlag; StewartおよびBurnett, 同書, pp.
25-38; Xiaら, 1995, 同書, pp. 39-46; Fenderら, 1995, Virol., 214:110-11
7; HongおよびEngler, 1996, J. Virol., 70:7071-7078）。ヒトアデノウイルス
血清型2および3のファイバーノブ（fiber knob）の合成ペプチドによる該ウイル
スに対する細胞接着の抑制および抗ペプチド抗体によるウイルス中和が報告され
ている（Liebermannら, 1996, Virus Research, 45:111-121）。Xiaら（1994, S
tructure, 2:1259-1270）は、アデノウイルス5型ファイバータンパク質の受容体
結合ドメインのの結晶構造（分解能1.7A）を報告している。
【０００６】 アデノウイルスは、エンベロープを有さない直径約65〜80nmの正20面体ウイル
スである。アデノウイルスのカプシドは252個のカプソメアを含み、そのうちの2
40個はヘキソンであり、12個はペントンである。ヘキソンおよびペントンは、3
個の異なるウイルスポリペプチドに由来する（Maizelら, 1968, Virology, 36:1
15-125; Weberら, 1997, Virology: 76, 709-724）。Ad5ヘキソンは、それぞれ9
67アミノ酸の3個の同一ポリペプチド（すなわち、ポリペプチドII）を含む（Rob
ertsら, 1986, Science, 232:1148-1151）。ペントンは、カプシドに対する結合
点を与えるペントンベースと、該ペントンベースに非共有結合しておりそれから
突き出ている三量体ファイバータンパク質とを含む。
【０００７】 ファイバータンパク質は、582アミノ酸のポリペプチドIVの3個の同一タンパク
質性サブユニットを含み、テイル（尾部）、シャフト（柄部）およびノブ（頭部
）を含む（Devauxら, 1990, J. Molec. Biol., 215:567-588）。ファイバーシャ
フトは、2つの交互なβ鎖およびβベンドを形成していると考えられている15ア
ミノ酸の偽反復（pseudorepeat）を含む（Greenら, 1983, EMBO J., 2:1357-136
5）。ファイバーシャフトの全長および15アミノ酸の反復（repeat）の数は、ア
デノウイルスの血清型によって様々である。例えば、Ad2ファイバーシャフトは
長さ37nmであり、22個の反復を含むが、Ad3ファイバーは長さ11nmであり、6個の
反復を含む。種々のアデノウイルス血清型に由来する10個を超えるファイバータ
ンパク質の配列決定は、他のアデノウイルスタンパク質で認められるものより大
きな配列多様性を示した。例えば、密接に関連したAd2およびAd5血清型に由来す
るファイバータンパク質のノブ領域はアミノ酸レベルで63％の類似性しか有して
いないが（Chroboczekら, 1992, Virology, 186:280-285）、それらのペントン
ベースの配列は99％同一である。しかしながら、Ad2およびAd5ファーバータンパ
ク質は共に、同じ細胞受容体に結合するらしい。なぜなら、それらは相互の結合
を交差遮断するからである。これに対して、Ad2およびAd3ファイバーは20％同一
であるにすぎず（Signasら, 1985, J. Virol., 53:672-678）、異なる受容体に
結合する（Deferら, 1990, J. Virol., 64(8), 3661-3673）。
【０００８】 アデノウイルス血清型2は、ファイバーおよびペントンベースを利用して別個
の細胞受容体と相互作用して、細胞に付着し、それに効率的に感染することが示
されている（Wickhamら, 1993, Cell, 73:309-319）。まず、該ウイルスは、フ
ァイバーノブ内に局在化した受容体結合ドメインを用いて（Henryら, 1994, J.
Virol., 68(8):5239-5246）、少なくとも2つの細胞表面受容体の1つに付着する
（Hongら, 1997, EMBO J., 16:2294-2306; Bergelsonら, 1997, Science, 275:1
320-1323; Phillipsonら, 1968, J. Virol., 2:1064-1075; Wickhamら, 1993,
前掲; Svenssonら, 1981, J. Virol., 38:70-81; およびDiGuilmiら, 1995, Vir
us Res., 38:71-81）。ついで、ウイルスの付着後、ペントンベースが、インテ
グリンと称されるヘテロ二量体細胞表面受容体のファミリーの特異的メンバーに
結合する。長いシャフトのファイバーを有するAd2およびAd5血清型の場合、ペン
トンベースは、宿主細胞への初期ウイルス付着に有意には関与しない（Wickham
ら, 1993, 前掲）。
【０００９】 ほとんどのインテグリンは、細胞外マトリックスリガンドの大多数で見出され
る、リガンド中のアミノ酸の短い直鎖状伸長（例えば、トリペプチドRGD）を認
識する。インテグリンαIIbβ3は、アミノ酸配列KQAGD（配列番号）を介してフ
ィブリノーゲンに結合し（Kloczewiakら, 1984, Biochemistry, 23, 1767-1774
）、α4β1は、コア配列EILDV（配列番号）を介してフィブロネクチンに結合す
る（Komoriyaら, 1991, J. Biol. Chem., 266:15075-15079）。また、αV含有イ
ンテグリンのβサブユニット中に存在するもう1つの構造モチーフNPXY（配列番
号）は、インテグリン媒介インターナリゼーションに重要であることが示されて
いる（Suzukiら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5354）。
【００１０】 Ad2またはAd5がそのファイバーを介して細胞に付着すると、それは、インテグ
リンに対するペントンベースの結合によりクラスリン被覆エンドサイトーシス小
胞内への受容体媒介インターナリゼーションを受ける。最終的に、該ウイルス粒
子は該細胞の核膜孔複合体へ輸送され、そこで該ウイルスゲノムが核に進入し、
それにより該ウイルス染色体からの発現を開始させる。
【００１１】 しかしながら、遺伝子治療においてアデノウイルスを使用する場合の欠点は、
治療を要する細胞だけでなく、アデノウイルスのファイバーおよびペントンベー
スに対する受容体を含むすべての細胞が、該アデノウイルスおよびそれに伴う投
与遺伝子をインターナリゼーションしてしまうことである。また、ファイバー受
容体またはペントンベース受容体のいずれかを欠く細胞は、アデノウイルスに媒
介される遺伝子運搬においては不利であろう。アデノウイルスファイバー受容体
を欠いていると考えられる細胞は、アデノウイルスにより形質導入されるとして
も、非常に低い効率でしかない（Curielら, 1992, 前掲; Cottonら, 1990, Proc
. Natl. Acad. USA, 87:4033-4037; Wattelら, 1996, Leukemia, 10:171-174）
。したがって、アデノウイルスの進入を特定の細胞に有効に導き、場合によって
は、アデノウイルス媒介遺伝子治療になじみやすい細胞の範囲（repertoire）を
拡張することは、既存のベクターを改良するための重要な目標の1つである。ま
た、どちらのアプローチも、標的細胞内での遺伝子発現を得るために必要なアデ
ノウイルスベクターの量を潜在的に減少させ、したがって高用量のアデノウイル
スに関連した副作用および合併症を潜在的に減少させうるであろう。
【００１２】 アデノウイルス標的化方法 アデノウイルスの指向性を修飾する（すなわち、野生型アデノウイルスベクタ
ーが通常は効率的に感染しない特定の細胞型にアデノウイルスを標的化する）た
めに、種々の方法が用いられている（例えば、国際特許公開WO 98/07877を参照
されたい）。ファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質およびペントンベース
タンパク質の修飾方法は既に用いられている。
【００１３】 米国特許第5,559,099号は、野生型ペントンベース配列に加えて又はその代わ
りに受容体、抗体またはエピトープに特異的な非ペントンアミノ酸配列を有する
キメラペントンベースタンパク質と治療用遺伝子とを含む組換えウイルスを記載
している。
【００１４】 米国特許第5,543,328号は、所望の細胞型上に位置する受容体に特異的なリガ
ンドを含むアデノウイルスファイバーを有するアデノウイルスを特許請求してい
る。そのようなアデノウイルスファイバーは、該ファイバータンパク質の頭部の
全部または一部を除去し、それをリガンドで置換することにより、あるいは完全
長ファイバーとリガンドとの融合体を作製することにより製造することができる
。
【００１５】 国際特許公開WO 95/26412は、リガンドの結合のためのC末端リンカーを含有す
るようにアデノウイルスの完全長ファイバータンパク質を修飾することを開示し
ている。リンカーの含有は、ファイバータンパク質のホモ三量体の形成に対する
立体的妨害を防ぐと記載されている。
【００１６】 国際特許公開WO 96/26281は、（a）天然ファイバー配列に加えて又はその代わ
りに非天然アミノ酸配列を有するキメラファイバータンパク質、（b）治療用遺
伝子、および所望により（c）天然ファイバーアミノ酸三量体化ドメインに代わ
る非天然三量体化ドメインを含む組換えアデノウイルスを開示している。該非天
然アミノ酸配列はタンパク質結合配列であることが可能であり、C末端に位置し
ていてもよい。
【００１７】 国際特許公開WO 97/20051は、野生型コートタンパク質を有するベクターより
効率的に細胞内へのベクターの進入を導きうる非天然アミノ酸配列を有するキメ
ラアデノウイルスコートタンパク質を開示している。該非天然配列は、内部コー
トタンパク質配列内に又はその代わりに、該コートタンパク質のC末端に若しく
はその付近に又は該コートタンパク質の露出ループ内に挿入されうる。該コート
タンパク質は、ファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質またはヘキソ
ンタンパク質であることが可能である。スペーサー配列が含まれうる。
【００１８】 他の標的化技術は、例えば架橋標的化グループまたは標的化グループの共有結
合または非共有結合による、ウイルスコートタンパク質の発現後修飾に基づくも
のである（例えば、国際特許出願WO 97/05266; 国際特許公開WO 97/23608; 国際
特許公開WO 97/32026を参照されたい）。
【００１９】 これらの努力にもかかわらず、結合ペプチドがカプシド表面に正確に提示され
てウイルスの増殖とその対応受容体に対する結合とを可能にする該結合ペプチド
の適当な挿入方法を同定することが、当技術分野において依然として必要とされ
ている。
【００２０】 さらに、そのような配列の認識を可能にする臨界的パラメーターを定義するこ
とが必要とされている。当技術分野における更にもう1つの要求は、アデノウイ
ルスベクターを標的細胞にインビボで導くのに適した特異的標的化ペプチド配列
を提供することである。当技術分野のこれらの及び他の要求を本発明で検討する
。
【００２１】 本明細書中のいずれかの参照文献の引用は、そのような参照文献が本出願の「
先行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
本明細書に開示の各参照文献の全体を、参照により本出願に組み入れることとす
る。
【００２２】 （発明の概要） 本発明は、有利にも、有効な標的化アデノウイルスベクターを提供する。本発
明の標的化ベクターは、ヘキソンタンパク質またはファイバータンパク質のいず
れかにおける有効部位からのアミノ酸の適当な欠失により特徴づけられる。した
がって、より具体的な実施形態において、本発明は、結合特異性がカプシド表面
において機能的に示されるよう、ヘキソンHRV5ループの少なくとも一部が、連結
アミノ酸スペーサーに隣接する結合ペプチドまたは標的化配列により置換された
アデノウイルスに関する。特定の実施形態においては、該アデノウイルスは、ヘ
キソンHVR5ループからの約6〜17アミノ酸（好ましくは、14アミノ酸を超えない
）の欠失を含む。もう1つの特定の実施形態においては、本発明は、結合特異性
がカプシド表面において機能的に示されるよう、ファイバーHIループの少なくと
も一部が、連結アミノ酸スペーサーに隣接する結合ペプチドまたは標的化配列に
より置換されておりアデノウイルスに関する。特定の実施形態においては、該ア
デノウイルスは、ヘキソンHIループからの約6〜17アミノ酸（好ましくは、11ア
ミノ酸を超えない）の欠失を含む。
【００２３】 もう1つの実施形態においては、本発明は、結合特異性がカプシド表面におい
て機能的に示されるよう、結合ペプチドまたは標的化配列が連結スペーサーまた
はリンカーによりファイバーのC末端に連結されている組換えアデノウイルスベ
クターに関する。
【００２４】 より具体的な実施形態においては、アデノウイルス血清型5（Ad5）のアミノ酸
残基約269〜アミノ酸残基約281に対応する該ヘキソンHVR5ループからの約13アミ
ノ酸が欠失している。もう1つの特定の実施形態においては、アデノウイルス血
清型5（Ad5）のアミノ酸残基約538〜アミノ酸残基約548に対応する該ファイバー
タンパク質HIループからの約11アミノ酸が欠失している。該欠失部位に標的化ペ
プチドを挿入する。本発明の特有の利点は、該標的化ペプチド配列が、標的化配
列のN末端においては第1スペーサーにより、標的化配列のC末端においては第2ス
ペーサーにより連結されるべきである（それらのスペーサーは、柔軟なアミノ酸
残基を含む）という知見にある。好ましくは、該第1スペーサーまたは該第2スペ
ーサーまたはそれらの両方は、グリシンおよびセリンよりなる群から選ばれるア
ミノ酸を含む。
【００２５】 特定の態様においては、ヘキソンタンパク質において修飾された標的化アデノ
ウイルスは、好ましくは、柔軟なアミノ酸残基よりなるジペプチドスペーサーを
用いたものである。特定の実施形態においては、該第1および第2スペーサーはGl
y-Serジペプチドである。この態様のもう1つの特定の実施形態においては、該第
1スペーサーはグリシン残基である。
【００２６】 ファイバータンパク質HIループを修飾する本発明の態様においては、該第1お
よび第2スペーサーは、好ましくは、柔軟なアミノ酸残基よりなるトリペプチド
である。本発明のこの態様の特定の実施形態においては、該第1および第2スペー
サーはGly-Ser-Serトリペプチドである。
【００２７】 好ましくは、該標的化配列は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ
ー受容体（UPAR）に対するリガンドエピトープである。特に、該標的化配列は、
LNGGTCVSNKYFSNIHWCN（配列番号1）、LNGGTAVSNKYFSNIHWCN（配列番号2）、AEPM
PHSLNFSQYLWT（配列番号3）、AEPMPHSLNFSQYLWYT（配列番号4）、RGHSRGRNQNSR
（配列番号5）およびNQNSRRPSRA（配列番号6）よりなる群から選ばれうる。
【００２８】 該ヘキソンタンパク質を修飾するもう1つの実施形態においては、該スペーサ
ーを含む該標的化配列は、 gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser（配列番号7）、 gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser（配列番号8）、 gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser（配列番号9）、 gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser（配列番号10）、 gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号11）、 gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser（配列番号12）、 gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser（配列番号13）、 gly-ser-DCRGDCF-gly-ser（配列番号14）、および gly-ser-KKKKKKK-gly-ser（配列番号15）よりなる群から選ばれる。
【００２９】 該ファイバータンパク質を修飾するもう1つの実施形態においては、該スペー
サーを含む該標的化配列は、 gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser（配列番号16）、 gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser（配列番号17）、 gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser（配列番号18）、 gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser（配列番号19）、 gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser（配列番号20）、 gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser（配列番号21）、 gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser（配列番号22）、 gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser（配列番号23）、 gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser（配列番号24）、 ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser（配列番号143）、 tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号144）、 tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号145）、 ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号146）、および ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly（配列番号147）よりなる群から選ばれる。
【００３０】 好ましくは、該連結スペーサーまたはリンカーは、グリシン、セリン、トレオ
ニン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニンおよ
びプロリンよりなる群から選ばれるアミノ酸を含む。好ましい実施形態において
は、該スペーサー内の第1アミノ酸はプロリンである。
【００３１】 該組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型、特にヒトアデノウイ
ルスC亜群、例えばヒトアデノウイルス血清型5から誘導されうる。該ファイバー
タンパク質は、野生型ファイバーシャフトより短いファイバーシャフトを有する
ように修飾することができ、これは、特に、インフレーム欠失により又はそれを
別の血清型由来のシャフトにより置換することにより行うことができる。該ファ
イバーシャフトは、C亜群由来であることが可能であり、反復4〜16または反復配
列4〜19を含むインフレーム欠失を含む。あるいはそれは、C亜群由来であり、そ
れを血清型3（Ad3）由来のシャフトにより置換することにより短縮化されている
。
【００３２】 本発明のいずれかの態様（該ヘキソンまたは該ファイバーの修飾）においては
、該ファイバータンパク質を、該野生型配列より短くなるように修飾することが
できる。例えば、該ファイバータンパク質を、内因性Ad5シャフトの代わりにAd5
の反復1〜3および17〜22、Ad5の反復1〜3および20〜22、またはアデノウイルス
血清型3（Ad3）シャフトだけを含有するように修飾することができる。
【００３３】 後記に例示する特定の実施形態においては、該アデノウイルスは血清型5アデ
ノウイルスである。もう1つの実施形態においては、本発明は、リンカーペプチ
ドと該ファイバータンパク質のC末端の標的化ペプチドとを含む特異的標的化ア
デノウイルスベクターを提供する。好ましくは、該標的化配列は、7〜15個のア
ミノ酸を含む、UPARに対するリガンド、例えばCD87、ヘパリンに結合するFGF-1
由来のペプチド断片であるか、または5〜10個のリシン残基、好ましくは約7個の
リシン残基を含むか、または5〜10個のArg-ArgおよびLeu-Leuモチーフを含む。
【００３４】 好ましくは、該標的化配列は、LNGGTCVSNKYFSNIHWCN（配列番号1）、LNGGTAVS
NKYFSNIHWCN（配列番号2）、AEPMPHSLNFSQYLWT（配列番号3）、AEPMPHSLNFSQYLW
YT（配列番号4）、RGHSRGRNQNSR（配列番号5）、NQNSRRPSRA（配列番号6）、RRL
LRRLLRR（配列番号133）およびKRGPRTHYGQK（配列番号134）よりなる群から選ば
れる。好ましくは、該リンカーペプチドは、配列PKRARPGS（配列番号149）を含
み、該リンカーペプチドを含む該標的化配列は、配列PKRARPGSKKKKKKK（配列番
号132）、PKRARPGSRRLLRRLLRR（配列番号141）、PKRARPGSKRGPRTHYGQK（配列番
号140）を含む。
【００３５】 本質的には、前記で開示され本明細書中に詳細に記載されている標的化アデノ
ウイルスが与えられたとすると、本発明は、アデノウイルスベクターの細胞指向
性を修飾するための方法であって、該アデノウイルスのカプシドタンパク質内の
部位から天然アミノ酸配列を欠失させ、標的化配列のN末端においては第1スペー
サーにより、標的化配列のC末端においては第2スペーサーにより連結された標的
化ペプチド配列を挿入することを含んでなり、該スペーサーが、柔軟なアミノ酸
残基を含むことを特徴とする方法を提供する。本発明のこの態様では、アデノウ
イルスAd5のアミノ酸残基約269〜アミノ酸残基約281に対応する該ヘキソンHVR5
ループからの約13アミノ酸、およびAd5のアミノ酸残基約538〜アミノ酸残基約54
8に対応する該ファイバータンパク質HIループからの約11アミノ酸よりなる群か
ら選ばれる欠失部位に、該標的化ペプチドを挿入する。好ましい実施形態におい
ては、該第1スペーサーは、グリシンおよびセリンよりなる群から選ばれるアミ
ノ酸を含む。もう1つの好ましい実施形態においては、該第2スペーサーは、グリ
シンおよびセリンよりなる群から選ばれるアミノ酸を含む。また、本発明は、以
下を含む。 ・アデノウイルス血清型5（Ad5）のアミノ酸残基約269〜アミノ酸残基約281に対
応するHVR5ループからの約13アミノ酸の欠失と、標的配列のN末端においては第1
スペーサーにより、標的配列のC末端においては第2スペーサーにより連結された
標的化ペプチド配列の該欠失部位における挿入とを含んでなるアデノウイルスヘ
キソン（該第1および第2スペーサーは、柔軟なアミノ酸残基を含む）。 ・アデノウイルス血清型5（Ad5）のアミノ酸残基約538〜アミノ酸残基約548に対
応するHIループからの約11アミノ酸の欠失と、標的配列のN末端においては第1ス
ペーサーにより、標的配列のC末端においては第2スペーサーにより連結された標
的化ペプチド配列の該欠失部位における挿入とを含んでなるアデノウイルスファ
イバータンパク質（該第1および第2スペーサーが、柔軟なアミノ酸残基を含む）
。 ・リンカーペプチドとそのC末端における標的化ペプチドとを含んでなるアデノ
ウイルスファイバータンパク質。
【００３６】 さらに、本発明は特に、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容
体（UPAR）を発現する細胞に標的化するための方法を提供する。特に、この方法
は、前記の特異的UPAR標的化ペプチドがカプシド表面に露出されるように修飾さ
れたアデノウイルスを使用することを含む。あるいは、本発明は、前記のスペー
サーグループを含む特異的配列を挿入することによる、ヘキソンHVR5ループまた
はファイバータンパク質HIループを修飾するための方法を提供する。
【００３７】 本発明に従い特定の細胞型に標的化するための方法は、該ファイバータンパク
質シャフトを短縮化して、例えば、Ad5の反復1〜3および17〜22、Ad5の反復1〜3
および20〜22またはAd3シャフトだけを該ファイバーシャフトに含有させること
により更に改良されうる。反復は、Chroboczekら（1995, Current Topics in Mi
crobiology and Immunology, Springer Verlag, 199:163-200）に記載されてい
る。
【００３８】 本発明は更に、標的細胞内で遺伝子を優先的に発現させるための方法であって
、該標的細胞を含有する細胞の集団を本発明の標的化アデノウイルスベクターと
接触させることを含んでなり、標的配列が該標的細胞上の受容体に対するリガン
ドエピトープであることを特徴とする方法を提供する。特に、本発明は、UPARを
発現する標的細胞内で遺伝子を優先的に発現させるための方法であって、該標的
細胞を含有する細胞の集団を、UPAR結合ペプチドを提示するように修飾された本
発明の標的化アデノウイルスベクターと接触させることを含んでなる方法を提供
する。この実施形態においては、該標的化アデノウイルスベクターは、好ましく
は、活発に分裂する及び／又は運動性の細胞（腫瘍細胞およびその転移腫瘍、腫
瘍脈管系、活性化内皮細胞、活性化平滑筋細胞を含む）への形質導入のための異
種治療用遺伝子または核酸を含む。しかしながら、UPAR標的化ベクターはまた、
筋肉、脳、心臓などの他の組織への形質導入のための候補ベクターとみなされう
る。特に、該核酸は、血管新生阻害剤、血管新生因子、条件的自殺エフェクター
、癌抑制因子、成長停止タンパク質（GAX）または任意の分泌ポリペプチドとし
て作用する治療用ポリペプチドをコードする。
【００３９】 特に、本発明は、インテグリンを発現する標的細胞内で遺伝子を優先的に発現
させるための方法であって、該標的細胞を含有する細胞の集団を、インテグリン
結合ペプチドを提示するように修飾された本発明の標的化アデノウイルスベクタ
ーと接触させることを含んでなる方法を提供する。この実施形態においては、該
標的化アデノウイルスベクターは、好ましくは、活発に分裂する及び／又は運動
性の細胞（腫瘍細胞およびその転移腫瘍、腫瘍脈管系、活性化内皮細胞、活性化
平滑筋細胞を含む）への形質導入のための治療用遺伝子または核酸を含む。しか
しながら、インテグリン標的化ベクターはまた、骨格筋、脳、心臓、造血細胞、
虚血組織などの他の組織への形質導入のための候補ベクターとみなされうる。特
に、該核酸は、血管新生阻害剤、血管新生因子、条件的自殺エフェクター、癌抑
制因子、成長停止タンパク質（GAX）、細胞生存促進因子（特に、Akt/PKBファミ
リーのメンバー）または任意の分泌ポリペプチドとして作用する治療用ポリペプ
チドをコードする。
【００４０】 したがって、本発明のもう1つの目的は、前記の標的化アデノウイルスベクタ
ーまたは前記の方法に従い得られた標的化アデノウイルスベクターを投与する工
程を含んでなる、遺伝子治療による疾患の治療方法である。
【００４１】 本発明のもう1つの目的は、前記の標的化アデノウイルスベクターまたは前記
の方法に従い得られた標的化アデノウイルスベクターを含んでなる医薬、ならび
に遺伝子治療による疾患の治療のための医薬を製造するための、そのような標的
化アデノウイルスベクターの使用である。本発明の更にもう1つの目的は、その
ような標的化アデノウイルスベクターと製薬的に活性な賦形剤の有効量とを含ん
でなる医薬組成物である。
【００４２】 したがって、本発明の1つの目的は、アデノウイルスベクターの生産性に悪影
響を及ぼすことなく指向性が修飾されたアデノウイルスベクターを提供すること
である。
【００４３】 本発明のもう1つの目的は、結合ペプチドが接近可能となりその特異的受容体
が該結合ペプチドにより有効に認識されるような適当な挿入方法を同定すること
である。
【００４４】 本発明の更にもう1つの目的は、標的ペプチド配列が有効に挿入されうるよう
天然アデノウイルスカプシドタンパク質から欠失されうるアミノ酸残基の数を同
定することである。
【００４５】 本発明の更にもう1つの目的は、標的受容体に対する有効な結合を可能にする
接近可能なコンホメーションを標的化ペプチドが取ることを可能にする、挿入さ
れる標的化ペプチドの末端に含まれるスペーサー配列の有効なサイズおよび特性
を提供することである。
【００４６】 本発明のこれらの及び他の目的については更に、添付図面および以下の「発明
の詳細な記載」において説明する。
【００４７】 （図面の簡単な記載） 図1：ヘキソンHVR5領域内で修飾されたウイルスを用いるW162細胞上での中和
アッセイ。
【００４８】 図2：Ad5シャフトの代わりにアデノウイルス血清型3（Ad3）シャフトが挿入さ
れた短縮化ファイバー構築物の構造。 図2A：ハイブリッドAd3/5ファイバーの概要説明。 図2B：ハイブリッドAd3/5ファイバーの詳細な説明。
【００４９】 図3：293細胞におけるノブの競合。
【００５０】 図4：次第に増加する用量の可溶性ヘパリンの存在下での種々のウイルスによ
るhSMCの感染。
【００５１】 図5：次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベートされたウイ
ルスによるhSMCの感染。
【００５２】 図6および7：標的化アデノウイルスに感染したヒトSMC内でのGax発現。
【００５３】 図8A〜8Cおよび9：種々の標的化ウイルスによるHs578Tの感染。
【００５４】 図10：次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベートされたウイ
ルスAE43によるHs578Tの感染。
【００５５】 図11：次第に増加する用量の可溶性uPARまたは可溶性ノブと共に予めインキュ
ベートされたウイルスAE43によるHs578Tの感染。
【００５６】 図12：Vn4含有ウイルスによるHs578Tの感染。
【００５７】 図13：広い範囲の標的化ウイルスによるNIH-3T3の感染。
【００５８】 図14Aおよび14B：次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベート
されたウイルスBC15X（A）およびAE43（B）によるHs578Tの感染。
【００５９】 （発明の詳細な記載） 前記のとおり、当技術分野においては、特定の標的細胞（アデノウイルスが効
率的に感染しない細胞を含む）へのアデノウイルスベクターの標的化が可能とな
るようアデノウイルスの指向性を修飾することに多大な関心が寄せられている。
この目的を達成したいくつかの成功例があるが、本発明者らは、この課題に対す
る実用的な解決手段（すなわち、ウイルス生産性に悪影響を及ぼさずに細胞特異
性の満足な増加を可能にする解決手段）は得られていないと認識している。特に
、ウイルスカプシドタンパク質中への標的化ペプチドの取込みのための最適部位
、天然カプシドタンパク質からの欠失のサイズ（それを行う場合）、挿入される
標的化配列のサイズ、ならびに該標的配列を該カプシドタンパク質に連結するい
ずれかのリンカー配列の存在および性質は、先行技術においては記載されていな
い。本発明は、有利にも、これらの問題について検討するものであり、標的化配
列の挿入のための最適化部位（該標的化ペプチドの場所を空けるために欠失され
る天然配列のサイズを含む）を提供し、該標的化配列の適当なサイズを同定し、
該標的化ペプチドの接近および特異的認識を可能にするリンカーのサイズおよび
特性を開示し、関心のある細胞マーカーを標的受容体として同定することにより
、非常に効果的な標的化を提供する。
【００６０】 特に、本発明者らは、接近可能な外来ペプチドをアデノウイルスカプシドの表
面上に導入して、該ウイルスの天然指向性を修飾することを試みた。これを考慮
して、ポリオウイルス1型由来の中和エピトープが取込まれた修飾されたヘキソ
ンまたはファイバーを有する一連の構築物を設計した。該ポリオウイルス配列を
対応中和抗体として選択した。それは、その接近可能性および機能性の詳細を立
証するために容易に利用可能であった。
【００６１】 特定の標的細胞に感染を限定するためのヘキソンおよびファイバーの修飾は、
アデノウイルスファイバーがその天然細胞受容体とは効率的に相互作用できない
ことを要する。また、ヘキソン修飾カプシドの場合には、該ファイバーからの立
体妨害を受けることなく、結合ペプチドが細胞表面上のその対応受容体と直接的
に相互作用しうることを要する。これらの目的のために、該ファイバーのシャフ
トを短縮化する可能性を検討した。
【００６２】 本発明は、1つには、ヘキソンタンパク質内およびファイバータンパク質内の
機能的標的化配列の挿入に適した部位を同定した実験に基づく。ヘキソンHVR5ル
ープおよびファイバーHIループの一部の置換が、ウイルス生産性に悪影響を及ぼ
すことなく標的化配列の挿入を可能にすることが見出された。さらに、該データ
は、挿入配列の末端に柔軟なリンカーペプチドを含有させることが、標的化配列
の接近可能性または認識に決定的に重要であることを示した。さらに、uPARに特
異的な又はいくつかのインテグリンに特異的なリガンドを含有させることは、イ
ンビトロおよびインビボ実験で示される該リガンドの接近可能性、該修飾ウイル
スの生産性、標的細胞型の形質導入効率の点で成功している。最後に、該ファイ
バーの短縮化はまた、天然宿主細胞に対するウイルス親和性を効率的に減少させ
ることが示された。このことは、この方法をAd5の天然指向性の排除に関して魅
力的なものとするものである。
【００６３】 好ましい実施形態においては、種々のアプローチを組合せる。好ましくは、修
飾ヘキソンHVR5ループまたはファイバーHIループを有するウイルスにおいて、該
ファイバータンパク質を短縮化させる。もう1つの具体例においては、短縮化フ
ァイバーを有するウイルスが、感染の一次段階としてUPARを標的化するためのHV
R5内またはHI内の挿入物、およびエンドソーム内への該ウイルスのインターナリ
ゼーションを促進するようインテグリンを標的化するためのHIループ内またはHV
R5内の挿入物をそれぞれ有しうるであろう。また、同様の方法（すなわち、該フ
ァイバーの短縮化と組合せた、該ヘキソンおよび／または該ファイバー内の高親
和性リガンドの取込み）を用いて、任意の適当な膜受容体が標的化されうる。
【００６４】 この「発明の詳細な記載」においては、具体的な定義、アデノウイルスベクタ
ー、標的化ペプチド配列、および標的化アデノウイルスベクターの用途に関する
節において、更に詳しく説明することとする。それらの節の種々の見出し及び編
成は、明瞭化および便宜のために与えられているにすぎず、何ら限定的なもので
はない。
【００６５】 定義 本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり種々の用語を用いるが、特に示
さない限り、以下の定義が適用される。
【００６６】 当技術分野において用いられているとおり、「ベクター」は、本発明の核酸を
宿主細胞内に導入するための任意の手段である。本発明の目的においては、ベク
ターなる語は、関心のある核酸（発現制御配列の制御下の又はそれに作動的に連
結された遺伝子）を標的細胞内に導入するためにアデノウイルスが遺伝的に操作
されていることを表すために「アデノウイルス」を修飾することに関して用いら
れる。本発明のアデノウイルスベクターについては、後記で更に詳しく説明する
。
【００６７】 本発明のアデノウイルスベクターにより細胞が「トランスフェクト」されてい
る又は「感染」しているのは、ウイルスDNAが該細胞の内部に導入されている場
合である。外因性または異種DNAにより細胞が「形質転換」されているのは、そ
のトランスフェクトされたDNAが表現型の変化をもたらす場合である。
【００６８】 本発明においては、「対応」なる語は、類似または相同な配列に関して用いら
れ、この場合、類似性または相同性が測定される分子と厳密な位置が同じである
か異なるかには無関係である。核酸またはアミノ酸配列のアライメントは、スペ
ースを含んでいてもよい。したがって、「対応」なる語は配列類似性を指し、ア
ミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指すものではない。具体例には
、本明細書に例示する血清型5アデノウイルス（Ad5）に加えて他のアデノウイル
ス血清型（2、3など）に由来するヘキソンタンパク質またはファイバータンパク
質が含まれる。相同アデノウイルスカプシドタンパク質は、当業者によく知られ
ている。
【００６９】 すなわち、本発明は、Ad5に関して本明細書中に定義されている最適化パラメ
ーターを用いる、他のアデノウイルス種からの相同カプシドタンパク質の修飾を
提供する。本発明で用いる「相同」なる語は、そのすべての文法形態および文字
変形において、「共通の進化起源」を有するタンパク質 [スーパーファミリー（
例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）に由来するタンパク質を含む]間
、および異なる種に由来する相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）間の
関係を意味する（Reeckら, 1987, Cell 50:667）。そのようなタンパク質（およ
びそれらのコード遺伝子）は、それらの高い配列類似性により表されるとおりの
配列相同性を有する。
【００７０】 「欠失」なる語は、アデノウイルスカプシドタンパク質の一定領域（すなわち
、ヘキソンまたはファイバータンパク質）からの天然アミノ酸残基の除去を意味
する。本発明では、そのような欠失のための好ましいサイズは約10〜約20アミノ
酸である。より好ましくは、該欠失のサイズは約10〜約15アミノ酸である。特定
の実施形態においては、11および13アミノ酸の配列を欠失させた。
【００７１】 本発明においては、「スペーサー」または「スペーサーペプチド」または「リ
ンカー」または「リンカーペプチド」なる語は、結合ペプチドをそのカプシドキ
ャリヤータンパク質に連結するために含有させる約1〜約3アミノ酸の配列を表す
ために用いられる。スペーサーまたはリンカーは、好ましくは、標的化ペプチド
の結合相手（例えば、受容体）に認識されるコンホメーションを該標的化ペプチ
ドが取ることを可能にする高い回転自由度を有するアミノ酸残基を含む。好まし
くは、スペーサー内には3個以下のアミノ酸が含まれる。より好ましくは、スペ
ーサーは2アミノ酸よりなる。スペーサーのための好ましいアミノ酸としては、
グリシンおよびセリンが挙げられる。特定の実施形態においては、スペーサーは
、配列Gly-SerまたはGly-Ser-Serを有するペプチドである。
【００７２】 本発明で用いる「約」または「およそ」なる語は、与えられた値または範囲の
20％以内、好ましくは10％以内、より好ましくは5％以内を意味する。
【００７３】 アデノウイルスベクター アデノウイルスは、本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に運搬するように修
飾されうる真核性DNAウイルスである。種々の血清型のアデノウイルスが存在す
る。本発明の範囲内では、これらの血清型のうち、2型もしくは5型ヒトアデノウ
イルス（Ad 2またはAd 5）または動物由来のアデノウイルス（WO94/26914を参照
されたい）の使用が好ましい。本発明の範囲内で使用されうる動物由来のアデノ
ウイルスには、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Mav 1, Beardら, Virology 75 (1
990） 81）、ヒツジ、ブタ、トリおよびシミアン（例えば、SAV）由来のアデノ
ウイルスが含まれる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスは、イヌアデノウ
イルス、より好ましくは、CAV2アデノウイルス（例えば、ManhattanまたはA26/6
1株 (ATCC VR-800)）である。
【００７４】 アデノウイルスベクターは、インビトロ、インビボまたはエクスビボ（ex viv
o）トランスフェクションおよび遺伝子治療方法に一般に使用される。好ましく
は、該アデノウイルスベクターは複製欠損型である。すなわち、それらは標的細
胞内で自律的には複製されない。一般に、本発明の範囲内で使用される複製欠損
ウイルスベクターのゲノムは、感染細胞内での該ウイルスの複製に必要な少なく
とも1つの領域を欠く。これらの領域は、当業者に公知の任意の技術により除去
（全部または一部）または非機能化されうる。これらの技術には、全摘出、置換
（他の配列、特に、挿入される核酸による置換）、ウイルスの増殖に必要な領域
に対する1以上の塩基の付加または部分的欠失が含まれる。そのような技術は、
遺伝子操作の技術を用いて又は突然変異誘発剤での処理によりインビトロ（単離
されたDNA上）またはin situで行うことができる。本発明の目的においては、該
複製欠損ウイルスは、該ウイルス粒子を被包するのに必要なそのゲノムの配列を
保有する。完全に又はほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く欠損ウイルスも使用され
うる。
【００７５】 本発明の複製欠損アデノウイルスベクターは、少なくとも、ITR、被包化配列
、および関心のある核酸を含む。好ましくは、該アデノウイルスベクターの少な
くともE1領域が非機能化されている。E1領域における欠失は、好ましくは、Ad5
アデノウイルスの配列内のヌクレオチド455〜3329（PvuII-BglII断片）またはヌ
クレオチド382〜3446（HinfII-Sau3A断片）または382〜3512（HinfI-RsaI断片）
に伸長する。また、他の領域、特にE3領域（WO95/02697）、E2領域（WO94/28938
）、E4領域（WO94/28152、WO94/12649およびWO95/02697）、IVa2領域（WO96/100
88）または後期遺伝子L1-L5のいずれかが修飾されていてもよい。
【００７６】 好ましい実施形態においては、アデノウイルスベクターは、E1領域に欠失を有
する（Ad 1.0）。E1欠失アデノウイルスの具体例は、EP 185,573および1997年11
月11日付け出願のFR97/14383（それらの内容を参照により本明細書に組み入れる
こととする）に開示されている。もう1つの好ましい実施形態においては、アデ
ノウイルスベクターは、E1およびE4領域における欠失を有する（Ad 3.0）。E1/E
4欠失アデノウイルスの具体例はWO95/02697およびWO96/22378（それらの内容を
参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。さらにもう1
つの好ましい実施形態においては、アデノウイルスベクターは、E4機能的領域お
よび該核酸配列が挿入されるE1領域における欠失を有する [FR94 13355（その内
容を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい]。本発明で
使用するもう1つのアデノウイルスベクターは、WO96/10088に記載されている。
【００７７】 本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術（Levr
eroら, 1991, Gene 101: 195, EP 185 573; Graham, 1984, EMBO J. 3: 2917）
により製造することができる。特に、とりわけ対象DNA配列を保持するプラスミ
ドとアデノウイルスとの間の相同組換えにより、それらを製造することができる
。該アデノウイルスおよびプラスミドを適当な細胞系内にコトランスフェクトし
た後、相同組換えが生じる。使用する細胞系は、好ましくは、（i）前記要素に
より形質転換されるべきであり、そして（ii）好ましくは組換えの危険性をなく
すために組込み形態として、該複製欠損アデノウイルスのゲノム部分を相補しう
る配列を含有すべきである。使用されうる細胞系の具体例としては、ヒト胎児腎
細胞系293（これは、そのゲノム内に組込まれたAd5アデノウイルスのゲノムの左
側部分（12％）を含有する）（Grahamら, 1977, J. Gen. Virol. 36: 59）、PER
.C6（Boutら, 1997, Cancer Gene Therapy 4:324; Fallauxら, 1998, Hum Gen T
her 9:1909-1917）ならびにE1およびE4の機能を相補しうる細胞系（出願WO94/26
914およびWO95/02697に記載されている）が挙げられる。好ましい実施形態にお
いては、アデノウイルスバックボーンを作製するために大腸菌（E. coli）ベク
ター系を使用する（国際特許公開WO 96/25506; Crouzetら, 1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. 94:1414-1419）。
【００７８】 実際、本発明のアデノウイルスを製造するための一般的技術は、当技術分野に
おいてよく知られている。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例
えば、Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, New York（本明細書中では「Sambrookら, 1989」と称される）; DNA Cloning
: A Practical Approach, Vol.IおよびII（D.N. Glover編, 1985）; Oligonucle
otide Synthesis（M.J. Gait編, 1984）; Nucleic Acid Hybridization [B.D. H
ames ＆ S.J. Higgins編, (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Ham
es ＆ S.J. Higgins編, (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney編, (19
86)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B.EPerbal, A Pr
actical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubelら (編), Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. (1994)を参照さ
れたい。カセット挿入部位の取込みは、異種遺伝子の挿入の場合であるか該ヘキ
ソンまたはファイバータンパク質内の該標的化配列の挿入の場合（後記で例示す
る）であるかには無関係に、そのような遺伝的操作を促進する。「カセット」は
、ベクターの特定の制限部位に挿入されうるDNAセグメントを意味する。該DNAセ
グメントは、関心のあるポリペプチドをコードする。該カセットおよび制限部位
は、転写および翻訳に適したリーディングフレームでの該カセットの挿入が保証
されるように設計される。
【００７９】 組換えアデノウイルスは、当業者によく知られた標準的な分子技術を用いて回
収され精製される（例えば、国際特許公開WO 98/00524、国際特許公開WO 96/276
77および国際特許公開WO 97/08298を参照されたい）。
【００８０】 本発明のアデノウイルスベクターによる異種遺伝子の発現 本発明のアデノウイルスベクターは、好ましくは、異種遺伝子に関するDNAコ
ード配列を含有する。DNA「をコードする配列（コード配列）」は、適当な調節
配列の制御下に配置された場合にインビトロまたはインビボで細胞内で転写され
ポリペプチドに翻訳される二本鎖DNA配列である。該コード配列の境界は、5'（
アミノ）末端の開始コドンと、3'（カルボキシル）末端の翻訳終結コドンとによ
り定められる。コード配列には、原核性配列、真核性mRNA由来のcDNA、真核性（
例えば、哺乳類）DNA由来のゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列が含まれうる
が、これらに限定されるものではない。該コード配列を真核細胞内で発現させよ
うとする場合には、通常、該コード配列に対して3'側にポリアデニル化シグナル
および転写終結配列が位置するであろう。RNAポリメラーゼが該コード配列をmRN
Aに転写し、ついでそれがトランスRNAスプライシングされ、該コード配列にコー
ドされるタンパク質に翻訳される場合、該コード配列は、細胞内での転写および
翻訳制御配列の「制御下」にある。もう１つの実施形態においては、関心のある
核酸はポリペプチドには翻訳されず、特定のアンチセンス治療用分子として又は
治療用デコイとして作用する。
【００８１】 転写および翻訳制御配列は、宿主細胞内でのコード配列の発現をもたらすDNA
調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）である
。ポリアデニル化シグナルは真核細胞における制御配列である。「プロモーター
配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼに結合し下流（3'方向）のコード配列の転
写を開始させうるDNA調節領域である。本発明を定義する目的においては、プロ
モーター配列は、その3'末端で転写開始部位と境界をなし、バックグラウンドを
超えて検出可能なレベルでの転写の開始に必要な最小数の塩基または要素を含む
ように上流（5'方向）に伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（例
えば、ヌクレアーゼS1でのマッピングにより簡便に定められる）と、RNAポリメ
ラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）とが見出
されるであろう。
【００８２】 異種タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハン
サー要素により制御されうるが、これらの調節要素は、発現用に選択した宿主内
で機能的でなければならない。遺伝子発現を制御するために使用しうるプロモー
ターには、サイトメガロウイルス前初期（CMV-IEまたはCMV）プロモーター、SV4
0初期プロモーター領域（BenoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-410）
、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列内に含まれるプロモーター（Yamamoto
ら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagne
rら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイ
ン遺伝子の調節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）；および組織特異
性を示しトランスジェニック動物において用いられている動物転写制御領域；膵
臓腺房細胞内で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftら, 1984, Cell 38:
639-646; Ornitzら, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-40
9; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞内で活性なインスリ
ン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ球様細胞内
で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら, 1984, Cell 38:647-65
8; Adamesら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Bio
l. 7:1436-1444）、精巣、乳、リンパ様およびマスト細胞内で活性なマウス乳癌
ウイルス制御領域（Lederら, 1986, Cell 45:485-495）、肝臓内で活性なアルブ
ミン遺伝子制御領域（Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276）、胚肝
臓およびヘパトーマ内で活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら
, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら, 1987, Science 235:53-58
）、肝臓内で活性なα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら, 1987, Ge
nes and Devel. 1:161-171）、骨髄性細胞内で活性なβグロビン遺伝子制御領域
（Mogramら, 1985, Nature 315:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94）、
脳内の希突起神経膠細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（
Readheadら, 1987, Cell 48:703-712）、骨格筋内で活性なミオシン軽鎖-2遺伝
子制御領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）および視床下部内で活性な性腺
刺激ホルモン遺伝子制御領域（Masonら, 1986, Science 234:1372-1378）が含ま
れるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】 「シグナル配列」は、細胞表面において輸出される又は分泌されるタンパク質
のコード配列の開始部に含まれる。この配列は、成熟ポリペプチドのN末端のシ
グナルペプチド（これは、宿主細胞が該ポリペプチドを該分泌経路／画分内に輸
送するよう導く）をコードする。本発明においては、「輸送シグナル配列」なる
語は、この種のシグナル配列を意味するものとして用いられる。輸送シグナル配
列は、真核生物および原核生物に固有の種々のタンパク質に伴って見出されるこ
とがあり、しばしば、両方のタイプの生物において機能的である。
【００８４】 具体的な異種遺伝子については、後記の本発明のベクターの用途に関する節に
おいて検討することとする。
【００８５】 標的化ペプチド配列 本発明においては、ヘキソンHVR5ループまたはファイバータンパク質内に、任
意の公知標的化配列を組込むことができる。標的化ペプチドの具体例は文献に十
分に記載されている。一般に、任意のペプチドリガンドが、該リガンドの受容体
結合配列に基づき標的化配列を与えうる。免疫学においては、そのような配列は
エピトープと称され、本発明においては、エピトープなる語は、受容体により認
識されるリガンドの配列を意味するものとして用いられる。特に、「受容体のリ
ガンドエピトープ」なる語は、便宜的に受容体と称される標的細胞表面上の結合
相手により認識されるタンパク質またはペプチドの配列を意味する。しかしなが
ら、本発明の目的においては、「受容体」なる語は、標的細胞の表面上に位置し
接近可能なシグナル伝達受容体（例えば、ホルモン、ステロイド、サイトカイン
、インスリンおよび他の増殖因子の受容体）、認識分子（例えば、MHC分子、Bま
たはT細胞受容体）、栄養取込み受容体（例えば、トランスフェリン受容体）、
レクチン、イオンチャンネル、接着分子、細胞外マトリックス結合タンパク質な
どを含むと理解されるべきである。本発明の標的化ペプチドは、そのような受容
体上のポリペプチドまたは炭水化物部分に結合しうる。
【００８６】 該標的化ペプチドのサイズは、ある種のパラメーターによって様々となりうる
。実施例に示すとおり、欠失配列より長い挿入ペプチドはウイルス生産性に悪影
響を及ぼさなかった。したがって、本発明は、欠失セグメントより数倍長い標的
化配列の使用を意図する。好ましくは、該挿入ペプチドは、欠失セグメントより
せいぜい200％長い。より好ましくは、該挿入ペプチドは、欠失セグメントとほ
ぼ同じサイズである。
【００８７】 ヌクレオチドコード配列の縮重により標的化ペプチド配列と実質的に同じアミ
ノ酸配列をコードする他のDNA配列を、本発明の実施において使用することがで
きる。これらには、対立遺伝子、他の種に由来する相同遺伝子、同類アミノ酸置
換が生じている変異体、および高度に多型のアミノ酸残基（これは結合特異性に
とって恐らく重要でないであろう）が変化した変異体が含まれるが、これらに限
定されるものではない。例えば、該配列内の1以上のアミノ酸残基を、サイレン
トな変化をもたらす機能的等価体として作用する同様の極性の別のアミノ酸によ
り置換することができる。該配列内のアミノ酸に代わるアミノ酸は、該アミノ酸
が属するクラスの他のメンバーから選ばれうる。例えば、非極性（疎水性）アミ
ノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルア
ラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するア
ミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられ
る。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロ
シン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミ
ノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸
性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような
改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される見掛け分子量にも等
電点にも影響を及ぼさないと予想される。
【００８８】 特に好ましい置換には以下のものが挙げられる： ・ArgからLys、およびその逆（これらの場合には、正電荷が維持されうる）、 ・AspからGlu、およびその逆（これらの場合には、負電荷が維持されうる）、 ・ThrからSer（この場合には、遊離-OHが維持されうる）、および ・AsnからGln（この場合には、遊離CONH2が維持されうる）。
【００８９】 そのような変異体は、高度に類似した核酸によりコードされていてもよい。そ
のような核酸は、一般には、天然アミノ酸配列をコードする核酸（オリゴヌクレ
オチドプローブを含む）にハイブリダイズする。後記実施例に示すとおり、（PC
Rプライマーの）ハイブリダイゼーションに影響を及ぼさないがエンドヌクレア
ーゼ切断部位または改変アミノ酸残基を与えうる単一塩基変化により種々の修飾
を導入することができる。
【００９０】 核酸分子が別の核酸分子（例えば、cDNA、ゲノムDNAまたはRNA）に「ハイブリ
ダイズ」するのは、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で該核酸分子の一
本鎖形態が、その別の核酸分子にアニーリングする場合である（Sambrookら, 前
掲を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーション
の「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸に関する予備的スクリーニング
のためには、55℃のTmに対応する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョン条件（例えば、ホルムアミドの不存在下の5 x SSC、0.1％ SDS、0.25％ミル
ク；または30％ホルムアミド、5 x SSC、0.5％ SDS）を用いることができる。中
等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応
し、例えば、40％ホルムアミドの存在下の5xまたは6x SCCである。高いストリン
ジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いTmに対応し、例えば、50
％ホルムアミド、5xまたは6x SSCである。ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェンシーに応じた塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーション
のためには、2つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリ
ダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性
の度合などの当技術分野においてよく知られた変数に左右される。2つのヌクレ
オチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの配
列を有する核酸ハイブリッドのTmの値は大きくなる。核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの相対的安定性（より高いTmに対応する）は以下の順序で減少する：RNA:RN
A、DNA:RNA、DNA:DNA。100ヌクレオチド長を超えるハイブリッドに関するTmの計
算のための式が誘導されている（Sambrookら, 前掲, 9.50-0.51を参照されたい
）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーショ
ンでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその
特異性を決定する（Sambrookら, 前掲, 11.7-11.8を参照されたい）。好ましく
は、ハイブリダイズ可能な核酸の最低限の長さは少なくとも約10ヌクレオチド、
好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドであり、より好ましくは、その長さは少
なくとも約20ヌクレオチドである。特定の実施形態においては、「標準的なハイ
ブリダイゼーション条件」なる語は55℃のTmを意味し、前記の条件を用いるもの
である。好ましい実施形態においては、Tmは60℃である。より好ましい実施形態
においては、Tmは65℃である。
【００９１】 インテグリン結合ペプチド 標的化ペプチド配列には、よく知られたインテグリン結合ペプチド（例えば、
米国特許第4,517,686号、米国特許第4,589,881号、米国特許第4,661,111号、米
国特許第4,578,079号、米国特許第4,614,517号、米国特許第5,453,489号および
米国特許第5,627,263号を参照されたい）が含まれる。他の有用な標的化ペプチ
ドは、国際特許公開WO 98/17242および欧州特許出願EP 773 441に記載されてい
る。
【００９２】 前記のとおり、インテグリンの標的化に関しては、特異的インテグリン（それ
らのいくつかは種々の腫瘍または細胞型において過剰発現される）に結合するペ
プチドを記載した多数の刊行物がある。特定の実施形態においては、例えば、フ
ァージ提示により選択されたペプチドにより、αvインテグリン（およびそれに
伴い、腫瘍細胞およびその転移腫瘍、腫瘍脈管系、活性化内皮細胞、活性化平滑
筋細胞、骨格筋細胞などを含む活性に分裂する及び／又は運動性の細胞）が標的
化される。もちろん、インテグリンに特異的な任意のペプチド（例えば、文献に
記載されているもの）が本発明において使用されうる。また、インテグリンの標
的化は、該ウイルスのインターナリゼーションを促進し、短縮化ファイバーを有
するAdの感染力を回復させるための手段となりうるであろう。
【００９３】 ウロキナーゼ受容体標的化ペプチド 後記で例示する特定の実施形態においては、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン
アクチベーター（UPAR; 例えばCD87）の受容体を標的化するペプチドを、種々の
刊行物から選択した。もちろん、それよりはるかに網羅的なUPAR結合ペプチドの
一覧があり、UPARに結合する任意のペプチドを使用することが可能であろう。
【００９４】 塩基性標的化ペプチド 後記実施例4〜6には、特定の標的化ペプチドを使用する本発明の特定の実施形
態が詳細に記載されている。例えば、後記実施例においては、主に塩基性アミノ
酸残基（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン、より好ましくは、リシ
ンまたはアルギニンのいずれか、あるいはそれらの両方）を含む標的化ペプチド
（例えば、WO 97/20051を参照されたい）を使用した。別の実施例においては、
ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するリガンド、例えば、RPR特許出願WO95/
21931に記載のアルギニン-ロイシン反復モチーフRRLLRRLLRR、およびヘパリンの
FGF-1結合ドメイン由来のペプチド断片KRGPRTHYGQK（Digabrieleら, 1998, Scie
nce, 393:812-817）を使用した。
【００９５】 また、ヘパリンまたはグリコサミノグリカンに結合する配列は、ヘパリン様受
容体に対する結合に関与している可能性がある（Sawitzkyら, 1993, Med. Micro
biol. Immunol. 182:285-92）。同様に、いわゆる「ヘパリン結合配列」は、他
の細胞表面結合部位（例えば、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン）と共に
含まれるペプチドまたはタンパク質の相互作用を媒介しうる（Thompsonら, 1994
, J. Biol. Chem., 269:2541-9）。
【００９６】 あるいは、該標的アミノ酸配列は、αヘリックスの逆方向に向いて約20オング
ストローム離れて位置する2個の塩基性アミノ酸（Argであることが多い）を含む
（Margalitら, 1993, J. Biol. Chem., 268:19228-31; Maら, 1994, J. Lipid R
es., 35: 2049-2059）。他の塩基性アミノ酸は、一方の側を向いてこれらの2つ
の残基の間に分散することが可能であり、無極性残基はもう一方の側を向き、塩
基性残基が一方の側に分離したラセン状両親媒性構造を形成する。
【００９７】 また、該標的化配列は、フィブロネクチンおよび熱ショックタンパク質内に存
在する共通のヘパラン結合モチーフ（Hansenら, 1995, Biochem. Biophys. Acta
, 1252:135-45）；LysもしくはArgのいずれか又はLysとArgとの混合物の7残基の
挿入（Frommら, 1995, Arch. Biochem. Biophys, 323:279-87）；ヘパリン結合
配列を含む約18アミノ酸のIGFBP-3およびIGFBP-5の共通塩基性C末端領域（Booth
ら, 1995, Growth Regul., 5:1-17）；ヒアルロン酸受容体RHAMMのC末端の35ア
ミノ酸領域内に位置する2つのヒアルロン酸（HA）結合モチーフの一方または両
方（Yangら, 1994, J. Cell Biochem., 56:455-68）；ヘパリン結合コンセンサ
ス配列を含むスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ビトロ
ネクチンのヘパリン結合形態を模した合成ペプチド（Ala347-Arg361）（Liangら
, 1994, J. Biochem, 116:457-63）；ウシヘルペスウイルス1糖タンパク質gIII
のアミノ酸129〜310の5個のヘパリン結合部位のうちのいずれか1以上または仮性
狂犬病ウイルス糖タンパク質gIIIのアミノ酸90〜275の4個のヘパリン結合部位の
いずれか1つ（Liangら, 1993, Virol, 194:233-43）；仮性狂犬病ウイルス糖タ
ンパク質gIIIのアミノ酸134〜141（Sawitzkyら, 1993, Med. MIcrobiol. Immuno
l, 182:285-92）；ヒトリポタンパク質リパーゼの279〜282位および292〜304位
の荷電残基に対応するヘパリン結合領域（Maら, 前掲）；ヘパリン結合特性を示
しフィブロネクチンを模した配列を有する22残基の合成ペプチドN22W（Inghamら
, 1994, Arch. Biochem Biophys., 314:242-246）；アルツハイマーβアミロイ
ド前駆体タンパク質（APP）のエクトドメイン亜鉛結合部位内に存在するモチー
フ、およびヘパリン親和性をモジュレーションする他の種々のAPP様タンパク質
（Bushら, 1994, J. Biol. Chem., 229:26618-21）、ラミニンA鎖の交差領域に
由来する8アミノ酸残基のペプチド（Tashiroら, 1994, Biochem. J., 302:73-9
）；ペプチドF123-G418およびK121-A134を含むセリンプロテアーゼ阻害剤アンチ
トロンビンIIIのヘパリン結合領域に基づくペプチド（Tyler-Crossら, 1994, Pr
otein Sci., 3:620-7）；APPの14KのN末端断片、およびヘパリン結合領域として
提案されているN末端付近の領域（すなわち残基96-110）（Smallら, 1994, J. N
eurosci., 14:2117-27）；高含量のリシンおよびアルギニン残基により特徴づけ
られるヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（HB-EGF）の21アミノ酸の伸長（
Thompsonら, 1994, J. Biol. Chem;, 269:2541-9）；トロンボスポンジンのヘパ
リン結合領域を含みhep 1合成ペプチドに対応する17アミノ酸の領域（Murphy-Ul
lrichら, 1993, J. Biol. Chem., 268:2678-9）；ヘパリンに結合するヒトフォ
ンビルブラント因子の23アミノ酸の配列（Y565-A587）（Tyler-Crossら, 1993,
Arch. Biochem. Biophys, 306:528-33）；フィブロネクチン由来ペプチドPRARI
、およびこのモチーフを含みヘパリンに結合する、より大きなペプチド（Woods
ら, 1993, Mol. Biol. Cell., 4:605-613）；血小板第4因子のヘパリン結合領域
（Satoら, Jpn. J. Cancer Res., 84:458-8）；および繊維芽細胞増殖因子受容
体チロシンキナーゼ膜貫通糖タンパク質内のK18K配列（Kanら, 1993, Science 2
59:1918-21）を含みうる。
【００９８】 標的化ペプチド配列の同定 もう1つの実施形態においては、よく知られたリガンド同定方法（米国特許第5
,622,699号および国際特許出願PCT/US96/14600を参照されたい）を用いて、種々
のタイプの組合せライブラリーから標的化ペプチドを誘導することができる。１
つのアプローチは、大きなライブラリーを得るために組換えバクテリオファージ
を用いるものである。「ファージ法」（ScottおよびSmith, 1990, Science 249:
386-390; Cwirlaら, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382; Devlinら,
1990, Science, 249:404-406）を用いて、非常に大きなライブラリー（106〜108 個の化合物）を構築することができる。第2のアプローチは、主として化学的方
法を用いるものである。そのような化学的方法としては、例えば、Geysen法（Ge
ysenら, 1986, Molecular Immunology 23:709-715; Geysenら, 1987, J. Immuno
logic Method 102:259-274）およびFodorらの方法（1991, Science 251:767-773
）が挙げられる。Furkaら（1988, 14th International Congress of Biochemist
ry, Volume 5, Abstract FR:013; Furka, 1991, Int. J. Peptide Protein Res.
37:487-493）、Houghton（1986年12月発行の米国特許第4,631,211号）およびRu
tterら（1991年4月23日付け発行の米国特許第5,010,175号）は、標的化配列とし
て試験されうるペプチドの混合物の製造方法を記載している。もう1つの態様に
おいては、標的化ペプチドに関してスクリーニングするために、合成ライブラリ
ー（Needelsら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4; Ohlmeyerら,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Lamら, 国際特許公開WO 9
2/00252; Kocisら, 国際特許公開WO 9428028）などを使用することができる。
【００９９】 本発明のベクターの用途 アデノウイルスベクターに関する前記の参照文献は、そのようなベクターの種
々の用途を記載している。
【０１００】 悪性細胞内へのインビボでの治療用遺伝子の標的化導入は、腫瘍の有効な治療
をもたらしうる。いくつかの治療方法が試みられている。例えば、1つの治療は
、正常癌抑制遺伝子（例えば、p53、網膜芽細胞腫タンパク質、p16など）および
／または活性化癌遺伝子インヒビターを腫瘍細胞内に運搬することを含む。第2
の治療は、サイトカイン遺伝子の導入によるインビボでの腫瘍細胞のイムノジェ
ネイティー（immunogeneity）の増強を含む。第3の治療は、化学療法剤に対する
感受性を腫瘍細胞に付与しうる酵素をコードする遺伝子の導入を含む。単純ヘル
ペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子は、ヌクレオシド類似体（ガン
シクロビア）を毒性中間体に特異的に変換し、分裂細胞の死を招く。レトロウイ
ルス導入によるHSV-tk遺伝子の運搬後、それに続くガンシクロビアでの治療は実
験動物において脳腫瘍の退縮を引き起こすことが、Culverら（Science, 1992, 2
56:1550-1552）により最近報告された。Wooらの米国特許第5,631,236号は、HSV-
tkまたはVZV-tkをコードするアデノウイルスベクターでの固形腫瘍に対する遺伝
子治療を記載している。
【０１０１】 好ましい実施形態においては、関心のある核酸を腫瘍自体、その転移体または
腫瘍脈管系に標的化するために、例えば、UPARに結合するペプチドを使用するこ
とにより、本発明のベクターを使用することができる。好ましい実施形態におい
ては、そのようなベクターは、血管新生のインヒビターまたは抗血管新生因子の
遺伝子をコードする。「抗血管新生因子」は、特に血管内皮細胞の遊走を阻止す
ることにより血管新生を抑制する分子である。そのような因子には、抑制性の血
管新生タンパク質の断片（例えば、ウロキナーゼのアミノ末端断片）、血管新生
抑制因子（例えば、アンジオスタチンおよびエンドスタチン）、血管新生因子の
可溶性受容体（例えば、ウロキナーゼ型受容体またはFGF/VEGF受容体）、内皮細
胞増殖因子受容体を遮断する分子 [O'Reillyら Cell 88:277-285(1997); O'Reil
ly, Nat. Med. 2:689-692 (1996)]、およびTie-1またはTie-2インヒビターが含
まれる。一般には、本発明で使用する抗血管新生因子は、本発明のベクターを使
用して腫瘍内にトランスフェクトされる遺伝子によりコードされうるタンパク質
またはポリペプチドである。例えば、本発明に従い抗血管新生タンパク質をコー
ドする遺伝子を腫瘍、その転移体または腫瘍脈管系内に運搬するために、本発明
のベクターを使用することができる。抗血管新生因子の具体例には、ウロキナー
ゼのアミノ末端断片（ATF）[EGF様ドメイン（例えば、ATFのアミノ酸残基約1〜
約135）を含有するもの]、例えば免疫グロブリンまたはヒト血清アルブミンとの
融合タンパク質として提供されるATF [WO93/15199]、アンジオスタチン [O'Reil
lyら, Cell 79:315-328 (1994)]、メタロプロテアーゼ組織インヒビター [Johns
onら, J. Cell. Physiol. 160:194-202 (1994)]、またはFGFまたはVEGFのインヒ
ビター（例えば、血管新生因子の受容体の可溶性形態、例えば、可溶性VGF/VEGF
受容体および可溶性ウロキナーゼ受容体が挙げられるが、これらに限定されるも
のではない）[Wilhemら, FEBS Letters 337:131-134 (1994)]が含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。
【０１０２】 もう1つの好ましい実施形態においては、血管新生後の再発狭窄症を抑制する
ために遊走平滑筋細胞を標的化するのに、本発明のベクターを使用することがで
きる。自殺遺伝子の運搬により再発狭窄症を抑制するためのアデノウイルスの使
用の一例が、WO96/05321に開示されている。血管平滑筋細胞増殖および再発狭窄
症を抑制するための、GAXタンパク質（成長停止タンパク質）をコードするアデ
ノウイルスの使用が、WO96/30385に開示されている。他の遺伝子としては、細胞
傷害性遺伝子（HSVチミジンキナーゼ）、メタロプロテアーゼインヒビター（TIM
P）、内皮NOSまたはアテローム性動脈硬化防御因子（例えば、ApoE）が挙げられ
うる。
【０１０３】 また、中枢神経系（CNS）障害に関する防御性または再生性増殖因子を選択的
に運搬するために、筋肉または脳に特異的なペプチドを含む本発明のベクターを
使用することができる。CNSに遺伝子を運搬するためのアデノウイルスの使用の
具体例は、WO94/08026、WO95/25804およびWO95/26408に開示されている。
【０１０４】 また、血管新生因子（例えば、VEGF、FGF、アンジオポエチンファミリーのメ
ンバー）、細胞生存促進因子（例えば、akt/PKBファミリーのメンバー）、エネ
ルギー代謝に関与する遺伝子（例えば、ホスホランバンまたはアデニルシクラー
ゼ）、サイトカインおよびそれらの受容体（例えば、IL-6、IL 10、CXCR4、CXCR
1、sdf1、MCP 1、GM-CSF）および末梢動脈疾患または冠状動脈疾患の治療に有用
なアポトーシスを防御する遺伝子（akt）を選択的に運搬するために、骨格筋ま
たは心臓に特異的なペプチドを含む本発明のベクターを使用することができる。
【０１０５】 より一般的な方法においては、遺伝子、酵素、血液誘導体、ホルモン、例えば
インスリンまたは増殖ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフ
ェロン、TNF（フランス国特許第92 03120号）、増殖因子、例えば血管新生因子
、例えばVEGFまたはFGF、神経伝達物質またはその前駆体または合成酵素、神経
変性疾患、神経系に損傷を与えた外傷または網膜変性の治療に有用な栄養（特に
神経栄養）因子：BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、IFGF、NT3、NT5、HARP/プレイオ
トロフィン、または骨増殖因子、造血因子など、ジストロフィンまたはミニジス
トロフィン（フランス国特許第91 11947号）、凝固に関与する因子（例えば、VI
I、VIIIおよびIX因子）をコードする遺伝子、自殺因子（例えば、チミジンキナ
ーゼおよびシトシンジアミナーゼ）、ヘモグロビンまたは他のタンパク質担体の
遺伝子、脂質、アポリポタンパク質A-I、A-II、A-IV、B、C-I、C-II、C-III、D
、E、F、G、H、Jおよびapo(a)から選ばれるアポリポタンパク質型の代謝に関与
するタンパク質、代謝酵素、例えばリポタンパク質リパーゼ、肝臓リパーゼ、レ
シチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ、7-α-コレステロールヒドロ
キシラーゼ、ホスファチジル酸性ホスファターゼまたは脂質転移タンパク質、例
えばコレステロールエステル転移タンパク質およびリン脂質転移タンパク質、HD
L結合タンパク質または受容体（例えば、LDL受容体、レムナントキロミクロン受
容体およびスカベンジャー受容体など）に対応する遺伝子を標的化細胞に運搬す
るために、本発明のベクターを使用することができる。さらに、肥満の治療のた
めのレプチンを加えることが可能である。
【０１０６】 該標的化ベクターの遺伝子によりコードされうるその他のタンパク質またはペ
プチドのうち、抗体、一本鎖抗体（ScFv）の可変フラグメント、または免疫療法
における用途 [例えば、感染症、腫瘍、自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（こ
れは抗イディオタイプ抗体の使用を含みうる）の治療]のための認識能を有する
他の任意の抗体フラグメントを重要視することが大切である。関心のある他のタ
ンパク質としては、可溶性受容体、例えば可溶性CD40受容体またはTNFの可溶性
受容体（これは、例えば抗HIV療法で使用することができる）、アセチルコリン
の可溶性受容体（これは、例えば、筋無力症の治療に使用することができる）；
基質ペプチドまたは酵素阻害剤、または受容体もしくは接着タンパク質のアゴニ
ストもしくはアンタゴニストであるペプチド（例えば、喘息、血栓症および再発
狭窄症の治療用のもの）；人工的キメラまたはトランケート化タンパク質が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。関心のあるホルモンとしては、糖
尿病の場合のインスリン、成長ホルモンおよびカルシトニンが挙げられうる。
【０１０７】 また、標的細胞内で発現されることにより遺伝子の発現または細胞mRNAの転写
を制御することを可能にするアンチセンス配列または遺伝子により、前記遺伝子
を置換することができる。欧州特許第140 308号に記載の技術に従えば、そのよ
うな配列は、例えば、細胞mRNAと相補的なRNAに標的細胞内で転写されて、タン
パク質へのそれらの翻訳を遮断しうる。該治療用遺伝子はまた、標的RNAを選択
的に破壊しうるリボザイムをコードする配列を含んでいてもよい（欧州特許第32
1 201号）。
【０１０８】 実施例 本発明を例示するものとして記載されている以下の非限定的な実施例を参照す
ることにより、本発明は、より良く理解されるであろう。特に示されていなけれ
ば、実施例に記載のすべての修飾を組合せることが可能である。
【０１０９】 実施例1：Ad5のヘキソンHVR5ループの操作 本実施例では、ループの末端の最も保存された残基（268位のセリンおよび282
位のプロリン）を無傷のままにしてアミノ酸（aa）269〜281のAd5ヘキソンのHVR
5ループを操作することにより、意外にも、効果的なアデノウイルス指向性修飾
がもたらされることを示す。該Ad5ヘキソンから除去した配列はTTEAAAGNGDNLT（
配列番号25）（すなわち、本発明者らの構築物は、本質的には、公開されている
Ad5参照配列と比較してヘキソン残基273におけるトレオニンからアラニンへの置
換を示す）であり、保存されたフランキング配列はFFS（上流）およびPKVV（下
流）であった。
【０１１０】 材料および方法 該ヘキソンのHVR5ループの操作のためのシャトルプラスミドの構築 シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylEマーカー遺伝子に
よりHVR5ループが置換されたHVR5ループのフランキング領域を含有する第1中間
体プラスミドIE28（Zukowskiら, 1983, PNAS 80:1101-1105）を、以下の2つのプ
ライマー対を使用して作製した：hex-19243G（5'-ATGGGATGAAGCTGCTACTG-3'）（
配列番号26）およびhex-1923D（5'-tcgcgaGAAAAATTGCATTTCCACTT-3'）（配列番
号27）およびhex-19685G（5'-CCTAAGGTGGTATTGTACAG-3'）（配列番号28）および
hex-20065D（5'-AGCAGTAATTTGGAAGTTCA-3'）（配列番号29）。これらのプライマ
ーを使用して、標準的なPCR技術に従いAd5ゲノム（Genbank受託番号M73260）の
ヌクレオチド19245〜19639および19685〜20084にそれぞれ対応するヘキソン遺伝
子の部分を増幅した。プライマーhex-19623DはNruI制限部位を含有していた。プ
ライマーhex-19685GをAd5配列に対して若干修飾して、該ヘキソンのタンパク質
配列を修飾することなくBsu36I部位を作製した（ヌクレオチド19690： AからG）
。各PCR産物をプラスミドpCRII（Invitrogen）内にクローニングして、それぞれ
プラスミドIE21およびIE22を得た。DNA配列決定により、適切なクローニングが
確認された。
【０１１１】 xylE遺伝子の発現カセットを含有するプラスミドpαxylEΩ（Freyら, 1988, G
ene 62:237-247）をEcoRIで制限処理し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、H
indIIIで消化した。このDNA断片を該平滑末端化BamHI-HindIII IE21プラスミド
内にクローニングして、プラスミドIE26を得た。最後に、IE26からのHindIII-Xb
aI断片およびIE22からのXhoI-HindIII断片を、SalI-XbaIで切断されたプラスミ
ドpXL2756（Crouzetら, 1997, PNAS 94:1414-1419に既に記載されている）内に
クローニングして、シャトルプラスミドIE28を得た。
【０１１２】 HVR5ループ内で修飾されたすべてのプラスミドは、xylE遺伝子を二本鎖オリゴ
ヌクレオチドで置換することにより、プラスミドIE28から誘導した。簡単に説明
すると、相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて二本鎖を形成さ
せ、NruI-Bsu36Iで消化されたIE28内にクローニングした（ただし、IE31プラス
ミドは、BsrGI-NruIで切断されたIE28と該二本鎖オリゴヌクレオチドとを連結す
ることにより得た）。0.5Mカテコールの噴霧後のxylE発現細菌の黄色染色に基づ
く表現型スクリーニングを用いた（Zukowskiら, 1983前掲）。以下の表は、使用
したオリゴヌクレオチドの一覧および対応するシャトルプラスミドの名称を示す
。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】 会合プラスミドバックボーンおよびウイルスの構築 HVR5ループの後続の操作を容易にするために、ヘキソン遺伝子のHVR5ループの
代わりにxylE遺伝子を含有する中間体プラスミドバックボーンを構築した。この
目的のために、Crouzetら（1997前掲）により記載されている方法に従い、G4977
細菌株内でシャトルプラスミドIE28をプラスミドバックボーンpXL3006（このプ
ラスミドは、E1領域の代わりにCMV-lacZ発現カセットを有するPacIで切り出され
うるElE3欠失アデノウイルスゲノムを含有する）で組換えて、プラスミドバック
ボーンIE28c（これは、xylE含有HVR5配列によりプラスミドバックボーンpXL3006
とは異なる）を得た。
【０１１５】 ついで、プラスミドバックボーンIE30c〜IE47cを得るために「xylEスクリーニ
ング」を用いてIE30〜IE47のすべてのシャトルベクターをプラスミドバックボー
ンIE28cで組換えた。PacI酵素での切断後、これらの消化されたバックボーン2μ
g（または5μg）を、Lipofectamine（Gibco BRL）を用いて911細胞（または293
細胞）内にトランスフェクトして、対応するウイルスAdIE30〜AdIE47を得た。し
たがって、これらのHVR5修飾E1E3欠失アデノウイルスは、同じCMV-lacZ発現カセ
ットを発現する。
【０１１６】 他のすべてのHVR5修飾アデノウイルス（例えば、uPARまたはインテグリン結合
ペプチド；後記実施例を参照されたい）を、同じ方法により構築した。
【０１１７】 細胞および抗体 293およびW162細胞は、10％ウシ胎仔血清で補足されたMEM（Gibco BRL）内で
維持した。911細胞（Fallauxら, 1996, Hum. Gene Ther. 7:215）は、10％ウシ
胎仔血清で補足されたDMEM内で増殖させた。Blondelら, 1983, Virology 126:70
7に記載のポリオウイルス1型に対するC3モノクローナル抗体（C3 mAb）は、R. C
rainic博士（Pasteur Institute, Paris, France）から提供された。全Ad5カプ
シドに対するL5ウサギポリクローナル抗体は、RPR-Gencellの施設（RPR SA, Vit
ry, France）で製造した。
【０１１８】 ウイルス すべてのウイルスを、古典的方法に従いE1トランス相補細胞（例えば、293細
胞）内で増幅した。Hirt法を用いて得たウイルスDNA上のインサートの制限分析
および配列決定により、該ウイルスのパターン／同一性を制御した。ウイルスス
トックを293細胞内で調製し、CsCl勾配により精製し、PD10カラム（Pharmacia）
を用いて脱塩し、10％グリセロールで補足されたPBS中、-80℃で保存した。911
細胞上のプラーク形成単位（PFU）を計数することにより及び／又はW162細胞の
感染の2日後にX-Gal染色（Dedieuら 1997, J. Virol. 71:4626）に従いlacZ導入
単位（TDU）を計数することにより、生物学的定量を行った。ウイルス粒子（VP
）を計数することにより陰イオン交換により、物理的定量を行った。
【０１１９】 中和試験 0.5μlの抗ポリオウイルスC3モノクローナル抗体を、105 TDUの精製ウイルス
と共に、PBS中、37℃で1時間インキュベートし、ついで該混合物を6ウェルプレ
ート中のW162細胞上に37℃で更に1時間吸収させた。ついで細胞をPBSで2回洗浄
し、新鮮な培地を該細胞に加え、それを37℃で2日間インキュベートした。細胞
単層をホルムアルデヒド（0.37％）-グルタルアルデヒド（0.2％）で固定し、X-
Gal染色し、青色細胞を計数した。
【０１２０】 免疫沈降プロトコール CsCl精製ウイルスのウイルス粒子（1010個）を400μlの非変性インキュベーシ
ョンバッファー（50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.05％ NP40）に再懸濁させ、
ついで0.1μlの抗ポリオウイルスC3モノクローナル抗体と共に4℃で1時間インキ
ュベートした。ついで、インキュベーションバッファーで予め平衡化された400
μlのプロテインA-セファロースを加え、さらに4℃で1時間インキュベートした
。インキュベーション後、ミクロ遠心管内での手短な遠心分離により該混合物を
遠心沈殿させた。該ペレットを1mlのインキュベーションバッファーで2回、1ml
の10mM Tris pH7.5、0.1％ NP40で1回（4℃で20分間）洗浄した。プロテインA-
抗体-ウイルス複合体を含有するペレットを50μlのLaemmliバッファー1xに再懸
濁し、2分間煮沸し、手短な遠心分離後に該上清を集めた。10μlの上清をSDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Novex）により分析した。ECL法（Amersham）に
従い全Ad5カプシドに対するL5ウサギポリクローナル血清を使用して、ウエスタ
ンブロットを行った。
【０１２１】 結果 HVR5ループの修飾のための構築方法 2種類の構築物を作製した。第1構築物は、多種多様なサイズを有する他のAd血
清型由来のHVR5ループによるこのループの置換により外来配列に関するAd5 HRV
ループの「容量」を評価するように設計した。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】 生存能対照として、本発明者らは、Cromptonら（1994, J. Gen. Virol. 75:13
3-139）により公開されている修飾を導入した。この場合、HVR5を含む、より大
きな欠失の代わりに、ポリオウイルス3型エピトープを導入した。重要なことは
、Ad2修飾ヘキソンを含有するプラスミドとAd5に基づくアデノウイルスゲノムと
の相同組換えにより、該Cromptonウイルスを最初に構築したことである。したが
って、このウイルスは、4残基大きなHVR5欠失が外来ペプチドで置換された、Ad2
とAd5とのキメラヘキソンタンパク質を提示する。Cromptonらの構築物を可能な
限り忠実に再現するために、TTEAAAGNGDNLT（配列番号60）ではなくAdのヘキソ
ン残基269〜285（TTEAAAGNGDNLTPKVV; 配列番号59）の代わりにCromptonらの外
来ペプチドを導入するEDRAG技術によりAd5に基づくウイルス（Ad IE31）を構築
した。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】 一連の第2構築物においては、HVR5ループ（aa 269〜281）を、ポリオウイルス
1型の中和直鎖エピトープ（DNPASTTNKDK; 配列番号62）により置換した。このモ
デル結合ペプチドを種々の隣接環境中に挿入して（すなわち、ロイシンおよび／
またはグリシンおよび／またはセリン残基を含む種々のリンカーを使用した）、
ウイルス生存能およびペプチド接近可能性に対するそれらの重要性を評価した。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】 ウイルスの生存能 Ad5 HRVループの代わりにAd2、Ad19またはAd30 HRV5ループを有する3種のウイ
ルス、およびポリオウイルス1型エピトープを含有する9種のキメラウイルスが生
存可能であった。生産性の減少は認められなかった。意外にも、鋭意努力にもか
かわらず対照ウイルスAd IE31を回収することはできなかった。
【０１２８】 免疫沈降アッセイによるポリオウイルスエピトープの接近可能性の評価 非変性条件中で対応抗ポリオウイルスモノクローナル抗体（C3 mAb）を使用し
て、ポリオウイルスエピトープを保持するウイルス上で免疫沈降実験を行った。
得られたデータを以下の表5に要約する。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】 このようにして、ポリオウイルスエピトープの下流のリンカーの存在が、修飾
ウイルスカプシドに対するC3 mAb結合に決定的に重要であることが判明した。こ
れは、十中八九、それが、該ヘキソン表面における該結合ペプチドの適当な提示
および／または接近可能性を可能にするためであろう。免疫沈降の前に該修飾ウ
イルスを変性させた場合には、それらはすべて、C3 mAbにより効率的に免疫沈降
した（示されていない）。
【０１３１】 中和アッセイによるポリオウイルスエピトープ機能の評価 C3mAbはポリオウイルス感染を中和するため、本発明者らは、それが、該ポリ
オウイルスエピトープを保持するAdの感染力をも中和しうると予想した。W162サ
ル細胞への感染の前に、PBS中（すなわち、天然条件下）、C3mAbを一連のすべて
のAd IEウイルスと共にインキュベートした。該データを図1に示す。これらのデ
ータは、免疫沈降の結果と完全に相関する。すなわち、非変性条件下でC3 mAbに
結合することができたすべてのウイルスはまた、この抗体により中和された。
【０１３２】 考察 これらのデータは、アデノウイルスのHVR5ループの修飾が、該修飾ヘキソンと
特異的結合タンパク質との機能的かつ特異的な相互作用を可能にしうることを示
している。しかしながら、該データは、該結合ペプチドエピトープの接近可能性
（免疫沈降アッセイ）および機能性（中和アッセイ）が最低限のスペーサー／隣
接配列に左右されることを示したため、特定の挿入方法が要求される。
【０１３３】 Cromptonらの結論とは対照的に、本発明者らの結果はまた、Ad5ヘキソンのaa
269〜285の欠失がウイルスの増殖および／または生存性に有害であることを示し
ている。これは、残基282〜285が、単量体または三量体としての該ヘキソンの構
造に恐らく必須であるHVR5ループの下流に位置するβ鎖に局在することにより説
明されうる。したがって、Cromptonらに記載のものより正確かつ厳密なこのアプ
ローチは、意外にも、その文献の方法の欠点を克服し、修飾された指向性を備え
た生存可能なウイルスを与えた（後記を参照されたい）。
【０１３４】 実施例2：ファイバーHIループの操作 Ad5ファイバーのHIループの欠失を行った。該ファイバーノブから除去した配
列は残基538〜548（すなわち、配列GTQETGDTTPS（配列番号72））を含む。した
がって、そのフランキング配列はTLN（上流）およびAYS（下流）である。
【０１３５】 材料および方法 該ファイバーのHIループの操作のためのシャトルプラスミドの構築 xylE遺伝子でHIループが置換されたHIループのフランキング領域を含有する第
1中間体プラスミドpJD3を、以下の2つのプライマー対を使用して作製した：HIgu
l（5'-CAGCTCCATCTCCTAACTGTAGACTAAATG-3'）（配列番号73）およびHIgdl（5'-G
GTTACCGGTTTAGTTTTGTCTCCGTTTAA-3'）（配列番号74）およびHIdul（5'-AGCGCTTA
CTCTATGTCATTTTCATGGGAC-3'）（配列番号75）およびHIddl（5'-GAGTTTATTAATATC
ACTGATGAGCGTTTG-3'）（配列番号76）。これらのプライマー対を使用して、標準
的なPCR技術に従いAd5ゲノム（Genbank受託番号M73260）のヌクレオチド32255〜
32634および32712〜33090にそれぞれ対応するファイバーおよびE4orf7遺伝子の
部分を増幅した。HIループの直接隣接部位のファイバータンパク質配列を修飾す
ることなく、プライマーHIgdlおよびHIdulがそれぞれ制限部位BstEIIおよびEco4
7IIIを与えるように、それらのプライマーを設計する。これらの部位を更に、HI
内への外来ペプチドの直接的クローニングに使用した（後記および表5を参照さ
れたい）。各PCR産物をプラスミドpCR2.1（Invitrogen）内にクローニングして
、それぞれプラスミドPCR2.1-H4およびPCR2.1-I2を得、配列決定した。
【０１３６】 xylE遺伝子の発現カセットを含有するプラスミドpαxylEΩをEcoRIで制限処理
し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、HindIIIで消化した。このDNA断片を、
HindIIIで制限処理されたPCRII（Invitrogen）内にサブクローニングして、プラ
スミドIE23を得た。IE23のNsiI-Xho断片を、NsiI-XhoIで消化されたPCR2.1-H4プ
ラスミド内に導入して、プラスミドpJD2を得た。最後に、pJD2からのSacI-XbaI
断片およびPCR2.1-I2からのSpeI-XhoI断片を、SacI-SalIで切断されたプラスミ
ドpXL2756（Crouzetら, 1997, 前掲に既に記載されている）内にクローニングし
て、シャトルプラスミドpJD3を得た。
【０１３７】 HIループ内で修飾されたすべてのプラスミドは、xylE遺伝子を二本鎖オリゴヌ
クレオチドで置換することにより、プラスミドpJD3から誘導した。簡単に説明す
ると、相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて二本鎖を形成させ
、BstEII-Eco47IIIで消化されたpJD3内にクローニングした。0.5Mカテコールの
噴霧後のxylE発現細菌の黄色染色に基づく表現型スクリーニングを用いた。以下
の表は、使用したオリゴヌクレオチドの一覧および対応するシャトルプラスミド
の名称を示す。
【０１３８】
【表６】
【０１３９】 会合プラスミドバックボーンおよびウイルスの構築 修飾HIループを提示するいずれかのプラスミドバックボーンの後続のスクリー
ニングを容易にするために、ファイバー遺伝子のHIループの代わりにxylE遺伝子
を含有する中間体プラスミドバックボーンを最初に構築した。この目的のために
、Crouzetら（前掲）に記載されている方法に従い、シャトルプラスミドpJD3をG
4977細菌株内でプラスミドバックボーンpXL3006で組換えて、プラスミドバック
ボーンpBXを得た。したがって、これは、E1領域の代わりにCMV-lacZ発現カセッ
トおよびHIループ内のxylEマーカー含有する、PacIで切り出されうるElE3欠失ア
デノウイルスゲノムを提示する。
【０１４０】 ついで、プラスミドバックボーンpBV2、5および9ならびにpBC1〜pBC8を得るた
めに「xylEスクリーニング」を用いて、それぞれシャトルプラスミドpJD5、7お
よび6ならびにpCF1〜pCF8をプラスミドバックボーンpBXで組換えた。PacI酵素で
の切断後、2μg（または5μg）のDNAを、Lipofectamine（Gibco BRL）を用いて9
11細胞（または293細胞）内にトランスフェクトして、対応するウイルスvBV2、5
および9ならびにvBC1〜vBC8を得た。
【０１４１】 他の方法 該細胞、抗体、ウイルス、免疫沈降アッセイおよび中和アッセイは、前記実施
例1に記載のとおりである。
【０１４２】 結果 HIループ挿入ベクターの構築方法 一連の2種類の構築物を作製した。第1構築物は、サイズにおけるいくらかの多
様性を有する他のアデノウイルス血清型のHIループによるこのループの置換によ
り外来配列に関するAd5 HIループの「容量」を評価するように設計した。
【０１４３】
【表７】
【０１４４】 一連の第2構築物においては、HIループを、ポリオウイルス1型の中和エピトー
プ（DNPASTTNKDK）（配列番号62）により置換した。天然環境／タンパク質にお
けるポリオーマウイルス配列およびAd5 HIループのN末端側の3D構造が酷似して
いるため、少なくとも1つの残基のリンカー（グリシン）を該エピトープの上流
に付加した。ウイルスの増殖およびペプチドの接近可能性に対する影響を評価す
るために種々の長さおよび組成のスペーサーを含有していた挿入部位の下流の場
合には、そのようなことはなかった。
【０１４５】
【表８】
【０１４６】 ウイルスの生存能 Ad5 HIループの代わりにAd2、Ad5またはAd9 HIループを有する3種の対照ウイ
ルス、およびポリオウイルスエピトープを含有する8種のキメラウイルスが生存
可能であった。生産性の減少は認められなかった。
【０１４７】 免疫沈降アッセイによるポリオウイルスエピトープの接近可能性の評価 非変性条件中で対応抗ポリオウイルスC3 mAbを使用して、ポリオウイルスエピ
トープを保持するウイルス上で免疫沈降実験を行った。該データを以下の表に要
約する。
【０１４８】
【表９】
【０１４９】 これらのデータは、HVR5ループの挿入の場合と同様に、修飾カプシドに対する
C3 mAb抗体の結合が、最小の長さのスペーサー配列の存在に決定的に左右された
ことを示している。特に、3残基の下流リンカーは、最も効率的な結合をもたら
した。該免疫沈降アッセイの前に該ウイルスを変性させた場合には、それらはす
べて、C3 mAb抗体に結合することが可能であった（データは示していない）。
【０１５０】 中和アッセイによるポリオウイルスエピトープ機能の評価 ついで、C3mAbが該ファイバー修飾ウイルス感染力を中和する能力を評価して
、それがまた、ヘキソン修飾カプシドに関して実施例1に例示したのと同様に、
免疫沈降データと相関するか否かを判定した。しかしながら、ヘキソン修飾の結
果とは異なり、該ファイバー修飾ウイルスのいずれかをC3mAbと共にインキュベ
ートした後の感染力の抑制は認められなかった（データは示していない）。種々
の解釈を示唆することができる。特に、ビリオン表面上にファイバー三量体は12
個しか存在しないのに対して、ヘキソン三量体は240個存在した。したがって、
該ヘキソン修飾カプシドに対する抗体結合の密度が、直接的に又はペントンベー
スのRGDモチーフの立体妨害の後に、ウイルス感染力を減少させたのかもしれな
い。したがって、インテグリンに媒介されるインターナリゼーションが影響を受
けたのである。いずれの場合にも、HI修飾カプシドに対するC3mAbの特異的結合
は、該ウイルスとその標的細胞との天然相互作用を妨げなかった。
【０１５１】 考察 該データは、アデノウイルスのHIループが、外来ペプチドにより置換されうる
こと、および対応するウイルスがi）生存可能であり、ii）ウイルス生産性に劇
的な影響を及ぼさないことを示している。該データはまた、導入されたペプチド
の特異的認識のためには、適当な隣接リンカー（すなわち、最小サイズの柔軟な
リンカー）を要することを示している。
【０１５２】 実施例3：ファイバータンパク質の長さの修飾 - 短ファイバー Ad5（長ファイバー血清型）とAd9（短ファイバー血清型）などの他の血清型と
の細胞結合経路の比較を考慮して、型間ファイバー（別の短ファイバー血清型で
あるAd3のシャフトによるAd5シャフトの置換）または短縮化Ad5シャフト（これ
は、天然タンパク質における22個の反復の代わりに6または9個の反復しか保有し
ない）を設計することにより、該ファイバーのシャフトの長さを修飾した。
【０１５３】 材料および方法 短縮化ファイバーを有するシャトルプラスミドの構築 短縮化ファイバーを含有する3個のシャトルプラスミドを構築した。それらの
うちの2個（pSF1およびpSF2）は該ファイバーシャフト内に大きな欠失を提示し
、残りの1個（pIF1）は、Ad5のシャフトではなくAd3シャフトを保持する。した
がって、すべての構築物は、Ad5のテイルおよびノブドメインを保有する。
【０１５４】 pSF1を構築するために、以下の2対のプライマーを使用した：5M3g（5'-ATTTCT
GTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3'）（配列番号110）および5M3d（5'-GTTTGACTTGGTT
TTTTTGAGAGGTGGGCT-3'）（配列番号111）、ならびに5M17g（5'-TTGGATATTAACTAC
AACAAAGGCCTTTAC-3'）（配列番号112）および5M17d（5'-GAAACTGGAGCTCGTATTTGA
CTGCCACAT-3'）（配列番号113）。これらのプライマーを使用して、標準的なPCR
技術に従いAd5ゲノム（Genbank受託番号M73260）のそれぞれヌクレオチド30885
〜31329および31936〜32351に対応するファイバー遺伝子の部分を増幅した。プ
ライマー5M3gおよび5M17dは、それぞれ制限部位SalIおよびSacIを含有する点で
、Ad5配列とは若干異なる。SalIまたはSacIで消化した後、これらのPCR産物を連
結し、SacI-SalIで切断されたpXL2756内にクローニングして、シャフト反復4〜1
6を含むインフレーム欠失を提示するpSF1プラスミドを得た。
【０１５５】 pSF2を構築するために、以下の2対のプライマーを使用した：5M3g（5'-ATTTCT
GTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3'）（配列番号114）および5M3d（5'-GTTTGACTTGGTT
TTTTTGAGAGGTGGGCT-3'）（配列番号115）、ならびに5M20g（5'-CTCAAAACAAAAATT
GGCCATGGCCTAGAA-3'）（配列番号116）および5M20d（5'-ATCCAAGAGCTCTTGTATAGG
CTGTGCCTT-3'）（配列番号117）。これらのプライマーを使用して、標準的なPCR
技術に従いAd5ゲノムのそれぞれヌクレオチド30885〜31329および32110〜32530
に対応するファイバー遺伝子の部分を増幅した。プライマー5M3gおよび5M20dは
、それぞれ制限部位SalIおよびSacIを含有する点で、Ad5配列とは若干異なる。S
alIまたはSacIで消化した後、これらのPCR産物を連結し、SacI-SalIで切断され
たpXL2756内にクローニングして、シャフト反復4〜19を含むインフレーム欠失を
提示するpSF2プラスミドを得た。
【０１５６】 Hortonら（4）に記載の遺伝子SOEing法を用いて、制限部位に依存することな
くPCRにより、組換えDNA配列よりなるpIF1プラスミドを作製した。Ad5のテイル
およびノブとAd3のシャフトとを含む型間ファイバー遺伝子を含有するpIF1プラ
スミドを構築するためには、5つの連続した工程が必要であった。Ad5ファイバー
テイル含有する第1 PCR産物を、以下のプライマーを使用してAd5ゲノムから増幅
した：SOE35Tg（5'-TACAAGTCGACAACCAAGCGTCAGAAATTG-3'）（配列番号118）およ
びSOE35Td（5'-AAGACTTAAAACCCCAGGGGGACTCTCTTG-3'）（配列番号119）。プライ
マーSOE35Tgは、Ad5ヌクレオチド30660〜30689とほぼ完全にマッチする（それは
、SalI部位の生成をもたらす若干の修飾を有する）。SOE35Tdプライマー中の下
線が付された15個の塩基は、Ad3ファイバーシャフトの第1反復の配列とマッチし
、残りの15個の塩基は、Ad5のファイバーテイル末端の配列に対応する。
【０１５７】 Ad3ファイバーシャフトを含有する第2 PCR産物を、以下のプライマーを使用し
てAd3ファイバー遺伝子から増幅した：SOE35Sg（5'-GAGAGTCCCCCTGGGGTTTTAAGTC
TTAAA-3'）（配列番号120）およびSOE35Sd（5'-GGTCCACAAAGTGTTATTTTTCAGTGCAA
T-3'）（配列番号121）。両方のプライマー中の下線が付された塩基はAd5ファイ
バー遺伝子内（それぞれ、テイルおよびノブサブドメイン内）に含まれ、残りの
塩基はAd3シャフト由来である。
【０１５８】 Ad5ファイバーノブの部分を含有する第3 PCR産物を、以下のプライマーを使用
してAd5ファイバー遺伝子から増幅した：SOE35Kg（5'-CTGAAAAATAACACTTTGTGGAC
CACACCA-3'）（配列番号122）およびSOE35Kd（5'-TCCTGAGCTCCGTTTAGTGTAATGGTT
AGT-3'）（配列番号123）。SOE35Kgプライマー中の下線が付された塩基はAd3フ
ァイバーシャフトの最後の反復の配列と合致し、残りの塩基はAd5ファイバーノ
ブの最初の数個のヌクレオチドに対応する。プライマーSOE35Kdは、Ad5ヌクレオ
チド32634〜32663とほぼ完全にマッチする（それは、SacI部位の生成をもたらす
若干の修飾を有する）。2つの第1 PCR産物を混合し、変性させ、再アニーリング
させて（PCR条件下で行った）、第1産物の上側鎖と第2産物の下側鎖とを重ね合
せ、互いのプライマーとして使用した。この重ね合せ体がポリメラーゼにより伸
長されると、該ハイブリッド産物が形成された。SOE反応にプライマーSOE35Tgお
よびSOE35Sdを加えることにより、該組換え産物がその形成の直後にPCR増幅され
た（前記で引用したHortonらの図を参照されたい）。これは、Ad5テイルおよび
それに続くAd3シャフトを含有するPCR産物を与えた。最後に、プライマーSOE35T
gおよびSOE35Kdを使用して、この最後のPCR産物および第3 PCR産物について同じ
SOE法を行って、唯一の制限部位SalIおよびSacIに隣接しAd5テイル、Ad3シャフ
トおよびAd5ノブの一部を含む型間ファイバーを含有するDNA断片を得た（図2）
。これらの酵素で消化した後、最終PCR産物を、SalI-SacIで切断されたpXL2756
プラスミド内にクローニングして、pIF1シャトルプラスミドを得た。
【０１５９】 プラスミドpSF1、pSF2およびpIF1を配列決定した。
【０１６０】 会合プラスミドバックボーンおよびウイルスの構築 Crouzetら, 前掲に記載の方法に従い、3つのプラスミドpSF1、pSF2およびpIF1
をG4977細菌株内でプラスミドpXL3006（E1領域の代わりのCMV-lacZ発現カセット
と共に、PacIで切り出されうるE1E3欠失組換えアデノウイルスゲノムを含有する
）で組換えて、それぞれプラスミドバックボーンpBS1、pBS2およびpBI1を得た。
PacIで切断した後、Lipofectamine（Gibco BRL）を使用して、2μg（または5μg
）のDNAを911細胞（または293細胞またはPER.6細胞）内にトランスフェクトして
、対応するウイルスvBS1、vBS2およびvBI1を得た。また、中間体プラスミドバッ
クボーンAE31、AE32およびAE33を、シャトルプラスミドIE28とpBI1、pBS1および
pBS2プラスミドバックボーンとの相同組換えにより構築した。さらに、HVR5ヘキ
ソンループの代わりのxylE発現カセットと短シャフトファイバーとを含有するこ
れらのプラスミドバックボーンを使用して、短シャフトファイバーとHVR5修飾ヘ
キソンとを合体させるプラスミドバックボーンの回収を容易にした（例えば、UP
ARまたはインテグリン結合ペプチドの挿入による；実施例10を参照されたい）。
【０１６１】 それと平行して、中間体プラスミドバックボーンAE34、AE35およびAE36を、シ
ャトルプラスミドpJD3とpBI1、pBS1およびpBS2プラスミドバックボーンとの組換
えにより構築した。さらに、これらのプラスミドバックボーンを使用して、短シ
ャフトファイバーとHI修飾ファイバーとを合体させるプラスミドバックボーンの
回収を容易にした（例えば、UPARまたはインテグリン結合ペプチドの挿入による
）。
【０１６２】 他の方法 該細胞、抗体、ウイルス、免疫沈降アッセイおよび中和アッセイは、前記実施
例1に記載のとおりであった。
【０１６３】 結果および考察 短縮化ファイバータンパク質を有するウイルスは、ヘキソン表面に露出した結
合ペプチドの接近可能性を増加させ及び／又は野生型（すなわち天然）ウイルス
／細胞相互作用を減少させると予想される。これらの構築物を表9に要約する。
【０１６４】
【表１０】
【０１６５】 ウイルス生産性は、程度は異なるものの3つすべての場合において劇的に減少
した。これは、十中八九、該修飾ファイバーがその細胞受容体と効率的に相互作
用できないためであろう。そのような初期段階で欠陥が生じたことは、実際に、
ウイルス後期タンパク質の正常な蓄積と共に、293感染細胞（すなわちXgal陽性
）における正常なウイルスDNA複製パラメーターにより裏付けられる。また、非
変性条件下でのウエスタンブロット法は、該修飾ファイバーの適切な三量体化が
3つ全ての場合に生じたことを示した。
【０１６６】 vBS1はCAR（コクザッキーおよびアデノウイルス受容体）陽性細胞に、それほ
ど効率的には結合しないが、それはPER.C6内で実験室規模のストックにまで増幅
されうるであろう。図3に示すとおり、vBS1による293細胞の感染は、天然Ad5フ
ァイバーを提示する対照ウイルスの場合と比較して、細胞形質導入における10倍
の減少を引き起こした。このことは、Ad受容体結合の有意な減少を示している。
この実験では、293細胞をPBSまたは精製ファイバーノブ（100μg/ml）と共に室
温で30分間インキュベートした後、50（VP/細胞）のmoiで室温で30分間感染させ
た。ついで細胞をPBSで2回洗浄し、さらに培地内で37℃で24時間インキュベート
した後、タンパク質抽出物を調製した。ついで特異的lacZ発現を定量した（単位
/タンパク質抽出物）。
【０１６７】 これらのデータに基づき、C57/B16マウスにvBS1構築物またはその対照ウイル
ス（非修飾シャフト）を静脈内注射して、主要器官におけるlacZ発現のプロフィ
ールを測定した。肝臓、心臓および肺を、β-ガラクトシダーゼ発現に関して、
組織化学的方法により分析した。結果を以下の表10に示す（XGal陽性細胞の割合
（％）：値の平均および範囲）。
【０１６８】
【表１１】
【０１６９】 これらのデータは、肝臓では両方のアデノウイルスの用量反応効果を示してい
るが、心臓および肺組織ではいずれの処理群においてもXGal陽性細胞を示すこと
はできなかった。最も興味深いのは、該ファイバーシャフトの短縮化が肝臓への
形質導入における10倍の減少をもたらしたことであり、このことは、該組換えア
デノウイルスが追加的なCAR非依存的進入経路を備えていれば、感染の大部分を
所望の器官／細胞にインビボで導くための該ファイバーシャフトの操作の有用性
を強調するものである。
【０１７０】 実施例4：ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体を発現する
細胞の特異的標的化 種々の高親和性uPAR結合ペプチドを、ヘキソンHVR5およびファイバーHIループ
内に含有させるか又は該ファイバータンパク質のC末端に付加した。これらのペ
プチドは、野生型ATF（Rettenbergら, 1995, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 376:58
7-594）および突然変異ATF（Magdolenら, 1996, Eur. J. Biochem. 237:734-751
）、ファージライブラリー（Goodsonら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:712
9-7133）、および会合突然変異体、またはヒトビトロネクチン（Waltzら, 1997,
J. Clin. Invest. 100:58-67）に由来する。すべてのウイルスは、E1遺伝子の
代わりに挿入された遺伝子発現カセット（lacZまたはGax）を含有する。
【０１７１】 ヘキソンHVR5ループおよびファイバータンパク質HIループ内にこれらのペプチ
ドを挿入するための方法は、前記実施例1および2にポリオウイルスエピトープに
関して記載されているとおりであった。該ファイバータンパク質の短縮化は、実
施例3に記載のとおりに行った。さらなる材料および方法を以下に説明する。
【０１７２】 PERC6細胞の細胞培養 PER.C6細胞を、ダルベッコ変法培地（DMEM）、10％ FCSおよび10mM MgCl2中、
37℃で10mM CO2雰囲気中で増殖させた（Fallauxら, 1998, Hum Gene Ther, 9:19
09-1917）。
【０１７３】 組換えアデノウイルスゲノム 組換えアデノウイルスゲノムを、フランス国出願FR 2 730 504に記載のEDRAG
技術を用いて、大腸菌（E. coli）内での相同組換えによりRK2由来プラスミド内
にクローニングした。任意のrecA+大腸菌（E. coli）株における組換えを可能に
する、WO 97/10343に記載の自殺シャトルにおけるR6K複製起点によるColE1複製
起点の置換により、該技術を単純化した。適当な制限部位にAd5配列を挿入し、
連続的PCRにより配列を修飾することにより、自殺プラスミド（シャトルプラス
ミドとも称される）を構築した。制限酵素マッピングおよびサザン分析により、
該EDRAG構築物の完全性を評価した。PCR増幅または相同組換えに関与する領域を
配列分析により確認した。
【０１７４】 プラスミドバックボーンpXL3215は、E1領域の代わりにラウス肉腫ウイルスプ
ロモーターの制御下の大腸菌（E. coli）lacZ遺伝子を有する、PacIで切り出さ
れうるE1とE3とが欠失したAd5に基づくゲノムを含有する57.8kb長のRK2誘導体（
フランス国出願FR 2 730 504）である。自殺シャトルpXL3521を使用して大腸菌
（E. coli）lacZ発現カセットをヒトGAX発現カセットにより置換することにより
、プラスミドpXL3527をpXL3215から誘導する。それは、AV1.0CMV.Gaxアデノウイ
ルスの生成をもたらす。プラスミドpXL3497は、pXL2689（Crouzetら, Proc Natl
Acad Sci USA, 1997, 94:1414-1419）から誘導され、該ファイバータンパク質
のC末端において(Gly-Ser)5-(Lys)7ペプチドを提示する。PacIでの制限酵素処理
およびE1トランス相補性細胞内へのトランスフェクションの後、このバックボー
ンを使用して、Wickhamら（1997, J Virol, 71:8221-8229）に記載のAdZ.F(pK7)
bgalと同一であるウイルスAV1.kCMV.lacZを作製した。
【０１７５】 アデノウイルスの産生および定量 PER.C6細胞内へのアデノウイルスゲノムのトランスフェクションを、T25cm2フ
ラスコ中、lipofectAMINEの存在下で行った。簡単に説明すると、Pacで消化され
H2O中に希釈されたDNAプラスミド5μgを23μlのLipofectamineと混合した。穏や
かな混合後、該懸濁液を室温で30分間インキュベートした。その間、50〜60％コ
ンフルエントの該細胞をリン酸緩衝食塩水で2回洗浄し、ついでそれを該Lipofec
tAMINE/DNA混合物により置換し、それに、血清を含まない3.8mlのDMEMを加えた
。該細胞を37℃で5〜8時間インキュベートし、ついで該培地を、10％ウシ胎仔血
清および10mM MgCl2を含有するDMEMと交換した。トランスフェクションの3日後
、該細胞を1本のT75cm2フラスコ内に分注した。細胞および上清を、完全なCPEが
生じた時点（第10〜14日）で回収し、3サイクルの凍結／融解に付し、ついで遠
心分離し、該上清を集めた。EDRAG技術は、均一（すなわちクローン性）集団を
与える。したがって、プラークの精製は不要である。
【０１７６】 アデノウイルス粒子を、セファロース型担体上でのクロマトグラフィーにより
正確に定量した。
【０１７７】 約70％コンフルエントになった時点で、T25cm2フラスコ中、PER.C6細胞に組換
えアデノウイルスを10〜100ウイルス粒子/細胞のMOIで感染させた。細胞変性効
果が完全になったら、細胞および上清を回収し、3サイクルの凍結／融解に付し
、遠心分離し、該上清を集めた。場合によっては、該回収方法を適合させる必要
があった（後記を参照されたい）。
【０１７８】 種々の器官（特に、ヒト由来の平滑筋細胞および内皮細胞に重点を置いた）の
初代細胞と、限られたレベルのアデノウイルス受容体しか細胞表面上に発現しな
いため感染に抵抗性であるヒトおよび非ヒト腫瘍細胞系のパネルとにおいて、該
修飾ウイルスの感染力をインビトロで評価した（実施例8〜10を参照されたい）
。Ad5が容易に感染しうる細胞を使用した場合には、競合相手として組換えノブ
を使用した。
【０１７９】 uPARを標的化するペプチドの挿入によりHIループにおいて修飾されたウイルス Ad5ファイバーの残基538〜548（GTQETGDTTPS）（配列番号72）を欠失させ、GS
Sリンカーに隣接した6個の異なるペプチドで置換した。対応するシャトルプラス
ミド、プラスミドバックボーンおよびウイルスの構築を、実施例2に記載のとお
りに行った。すべてのウイルスは生存可能であったが、いくつか（特に、ウイル
スAE43、AE44およびAE45）は、それらの未修飾対照ウイルスと比較して変化した
安定性を示した。しかしながら、該方法を適合させることにより、対照ウイルス
に匹敵する収量（すなわち、10000〜20000 VP/細胞）を得ることが可能であった
。PER.C6感染細胞を、感染の3日後に回収し、連続的な凍結／融解サイクルの代
わりに緩和なバッファー（Tris 10mM pH7.5、MgCl2 1mM、Tween 20 1％、NaCl 0
.25M）を用いて細胞溶解した。ついでCsCl勾配上の超遠心分離によりウイルスを
精製した。
【０１８０】
【表１２】
【０１８１】 uPARを標的化するペプチドの挿入によりHVR5ループにおいて修飾されたウイル
ス Ad5ヘキソンの残基269〜281（TTEATAGNGDNLT）（配列番号125）を、適当なリ
ンカー（gly-ser）に両側が隣接した前記の6個のuPAR結合ペプチドで置換した。
対応するプラスミドバックボーンおよびアデノウイルスの構築を、実施例1に記
載のとおりに行った。すべてのウイルスは生存可能であった。それらの構築物の
いくつか（例えば、AE27、AE28）は或る程度の不安定性を示し、それに応じて精
製された。
【０１８２】
【表１３】
【０１８３】 uPARを標的化し短縮化ファイバーを保持するペプチドの挿入によりHIループに
おいて修飾されたウイルス Ad5ファイバーの残基538〜548（GTQETGDTTPS）（配列番号72）を欠失させ、適
当なリンカー（gly-ser-ser）に両側が隣接した6個のuPAR結合ペプチド（前記の
とおり）で置換した。以下の表に要約するとおり、これらの修飾を短縮化ファイ
バーシャフトと組合せた（実施例3を参照されたい）。
【０１８４】
【表１４】
【０１８５】 uPARを標的化し短縮化ファイバーを保持するペプチドの挿入によりHVR5ループ
において修飾されたウイルス Ad5ヘキソンの残基269〜281を、適当なリンカー（gly-ser）に隣接する6個の
異なるペプチド（前記のとおり）により置換した。さらに、これらの修飾を、前
記のとおりファイバーシャフトの短縮化と組合せた。
【０１８６】 例えば、ウイルスAE65は、ヘキソンHVR5の代わりにgly-serリンカーに隣接し
たNQNSRRPSRAペプチド（配列番号6）を含有し、短縮化ファイバー（反復4〜16を
含むシャフトの欠失）を提示する。もう1つの例は、Vn3ペプチドの代わりにDCRG
DCFペプチドを含有する以外はAE65と同一であるAE63である（実施例10、図13を
参照されたい）。
【０１８７】 8アミノ酸のリンカーおよびそれに続くuPAR標的化ペプチドをC末端に付加する
ことにより標的化に関して修飾されたウイルス 該ファイバーの終結コドンを、該リンカーのプロリンコドンで置換する。すべ
ての構築物に使用したリンカー配列は、PKRARPGSであった。
【０１８８】 該ファイバータンパク質コード配列の3'末端を、FspI部位を導入するために修
飾した。PCR突然変異誘発を用いて単一塩基置換（ヌクレオチド32778）を行って
、FspIの新たな認識部位を導入するサイレント突然変異を引き起こした。プライ
マーMOL1（5'-ggaactttagaaatggagatcttactgaagg-3'）（配列番号126）およびMO
L3（5'-cgattctttattcttgcgcaatgtatgaaaaag-3'）（配列番号127）を使用して、
該Ad5ファイバーノブを該Ad5ゲノムから増幅した。プライマーMOL3は、Ad5ヌク
レオチド32762〜32794とほぼ完全にマッチした（それは、FspI制限部位の生成を
もたらす若干の修飾を有していた）。この増幅産物をpCR2.1（Invitrogen）内に
導入してpMA51を作製した。
【０１８９】 ポリA領域の上流にAatII、NruI、SpeI制限部位を導入するために、オリゴヌク
レオチドMOL2（5'-cttaagtgagctgcccggggag-3'）（配列番号128）およびMOL4（5
'-ggatccaatgaacttcatcaagt-3'）（配列番号129）を使用して、該ファイバータ
ンパク質コード配列の終結コドンの下流の領域をPCR突然変異誘発により修飾し
、pCR2.1（Invitrogen）内にクローニングしてpMA52を作製した。
【０１９０】 該リンカーペプチドをコードする配列は、2本の一本鎖オリゴヌクレオチド：M
OL7（5'-aattctgcgcaagaaccaaagagggccaggccggatcctaagacgtct-3'）（配列番号1
30）およびMOL8（5'-ctagagacgtcttaggatccgggcctggccctctttggttcttgcgcag-3'
）（配列番号131）をアニーリングさせることにより作製した。この二本鎖をpBS
SK+（Stratagene）のEcoRIとXbaIとの間にクローニングしてpMA53を作製した。
【０１９１】 最後に、pMA51からの断片BglII-FspIとpMA53からの断片FspI-XbaIをpXL2756の
BamHIおよびXbaI部位内にクローニングすることにより、該リンカー配列を該フ
ァイバータンパク質コード配列の3'末端に導入して、ベクターpMA55を作製した
。
【０１９２】 シャトルベクターpMA56は、pMA52のSmaI-AatII断片をpMA55のSmaI-AatII制限
部位内にクローニングすることにより構築した。Crouzetら（前掲）に記載の方
法に従い、シャトルプラスミドpMA55をG4977細菌株内でプラスミドバックボーン
pXL3006で組換えて、C末端修飾を有するファイバーをコードするPacIで切り出さ
れうるE1E3欠失CMV/lacZ組換えウイルスゲノムを含有するプラスミドバックボー
ン22.3を得た。
【０１９３】 PKRARPGSリンカーを使用して、該ファイバーのC末端にuPAR標的化リガンドを
付加するために更なるクローニングを行った。簡単に説明すると、これらの修飾
をコードするシャトルプラスミドを構築し、EDRAG法に従いG4977細菌株内でアデ
ノウイルスプラスミドバックボーンpXL3091（E1の代わりにRSV-lacZ）、pXL3006
（E1の代わりにCMV-lacZ）またはpXL3527（E1の代わりにhGax発現カセット）で
組換えて、lacZまたはGax発現カセットとC末端修飾ファイバータンパク質とを提
示するアデノウイルスバックボーンを作製した。
【０１９４】 PacIで制限酵素処理されたバックボーンを911、293またはPER.C6細胞内にトラ
ンスフェクトした後に、bC12x以外のすべての予想ウイルスが回収された。それ
らの感染力（VP/細胞）は、それらの未修飾対照ウイルスの感染力に匹敵するも
のであった。
【０１９５】
【表１５】
【０１９６】 追加的な実験において、これらの修飾をファイバーシャフトの短縮化（前記で
例示したとおり）と組合せた。
【０１９７】 実施例5：αvインテグリン受容体を発現する細胞の特異的標的化 高親和性αvインテグリン結合ペプチド（CDCRGDCFC; これはRGD-4Cと称される
; Pasqualiniら, 1997, Nature Biochem. 15:542を参照されたい）およびその変
異体（DCRGDCF; これはRGD-2Cと称される）を、ファイバーHIヘキソンおよびHVR
5ループ内に含有させるか又は該ファイバータンパク質のC末端に付加した。これ
らのウイルスは、該ウイルスから欠失されたE1領域内に挿入された異種遺伝子（
lacZ）を含有する。
【０１９８】 ヘキソンHVR5ループおよびファイバータンパク質HIループ内にこれらのペプチ
ドを挿入するための方法は、前記実施例1および2にポリオウイルスエピトープに
関して記載されているとおりであった。
【０１９９】 短縮化ファイバーと組合された又は組み合わされないαvインテグリン標的化
ペプチドの挿入によりHIループにおいて修飾されたウイルス Ad5ファイバーの残基538〜548を欠失させ、GSSリンカーに隣接するペプチドで
置換した。CMVlacZ発現カセットを含有するアデノウイルスプラスミドバックボ
ーンをPER.C6細胞内にトランスフェクトした。ウイルスAE60は生存可能であり、
PER.C6細胞内で増幅可能であり、その生産性は対照ウイルスに匹敵するものであ
った。一方、PacIで消化されたpAE59 DNAの反復トランスフェクションは該対応
ウイルスを産生しなかった。このことは、この特定の構築物が効率的に増殖でき
なかったことを示唆している。
【０２００】
【表１６】 短縮化ファイバーと組合された、αvインテグリンを標的化するペプチドの挿
入によりHIループにおいて修飾されたウイルスも得る。
【０２０１】 短縮化ファイバーと組合された又は組み合わされないαvインテグリン標的化
ペプチドの挿入によりHVR5ループにおいて修飾されたウイルス Ad5ヘキソンのアミノ酸269〜281を欠失させ、GSリンカーに隣接したペプチド
（前記表に記載されているのと同じ配列を使用した）で置換した。LacZまたはhG
ax発現カセットを含有するアデノウイルスプラスミドをPER.C6または911細胞内
にトランスフェクトして、3つすべてのウイルスを回収した。293細胞においてAE
58およびAE63ウイルスに関しては生産性の減少が認められたが、AE57は正常に挙
動した。これは、AE58の場合には該ヘキソンの不正確なフォールディング／安定
性によると考えられ、AE63の場合には該短縮化ファイバーのAd受容体結合の減少
によると考えられる。
【０２０２】
【表１７】
【０２０３】 また、該ヘキソン内のRGD-2Cペプチドの含有を、該ファイバーのC末端におけ
るリンカーペプチド配列PKRARPGS-K7（配列番号132）の付加と組合せた。対応す
るウイルスは生存可能であった。
【０２０４】 実施例6：ヘパラン硫酸プロテオグリカン標的化ウイルスの構築 EDRAG技術を用いる大腸菌（E. coli）内でのアデノウイルスゲノムの遺伝的修
飾により、lacZまたはGax発現カセットを含有するファイバー修飾アデノウイル
スを構築し、911またはPER.C6細胞内で産生させた（実施例4の「材料および方法
」を参照されたい）。
【０２０５】 ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合すると予想される以下の3つのリガンド
を同定した：Wickhamら（1997, J Virol, 71:8221-8229）に記載のヘプタリシン
（heptalysine）伸長（K7）、親出願WO95/21931に記載のアルギニン-ロイシン反
復モチーフRRLLRRLLRR（配列番号133）、およびDigabrieleら（1998, Science,
393:812-817）に記載のヘパリン結合性FGF-1からのペプチド断片KRGPRTHYGQK（
配列番号134）。とりわけ、5つのウイルスが該ファイバーのC末端にヘプタリシ
ンK7伸長を有し、それらは該トランスジーン（lacZまたはGax）および／または
連結リンカーの種類（リンカー無し、(GS)5またはPKRARPGS）の点で異なる。ウ
イルス3497を基準体として加えた（Wickhamら, 1997, J Virol, 71:8221-8229）
。ついでインビトロおよびインビボにおけるウイルスの生産性および導入効率に
関する該リンカーおよび／またはペプチドの重要性を評価した。
【０２０６】 また、E1領域内に挿入した異種遺伝子（lacZ）を含有するウイルスのヘキソン
HVR5またはファイバーHIループ内にポリリシン伸長を含有させた。
【０２０７】
【表１８】
【０２０８】 これらのすべてのウイルスは生存可能であり、E1トランス相補性細胞内で増幅
可能であった。該細胞に10〜100 VP/細胞のmoiで感染させた後にPER.C6細胞にお
いて行った1つの実験で得られた収量を、以下の表18に要約する。
【０２０９】
【表１９】
【０２１０】 生産性は、これらのC末端ファイバー伸長により、様々な影響を受けた。総合
すると、これらの及び他のデータは、該ファイバーのC末端に付加した連結リン
カー配列の存在および種類がアデノウイルス感染のサイクル／挙動に著しい影響
を及ぼすことを示している。ある与えられたリンカー配列に関しては、外来ペプ
チド自体の種類／性質も重要なパラメーターであることが判明した。例えば、RR
LLRRLLRRペプチドを有する構築物（AV1.rCMV.lacZまたはAd3663）は、非常に低
い力価を与えたが、それをKRGPRTHYGQKペプチド（AV1.fCMV.lacZまたはAd3662）
は生産性を回復させた。
【０２１１】 回収方法もまた、これらのウイルスのほとんどについて最適化される必要があ
った。例えば、合計5.1012 VPのAd3497を2工程のクロマトグラフィー法により精
製することに成功し、最後にそれをTris 20mM（pH8.4）-10％グリセロールに再
懸濁させた。前記のとおり、68％の通算粒子回収率が得られた。
【０２１２】 実施例7：HIループ内にVn4ペプチドを有するウイルスの構築 実施例4に記載のとおり、AE43ウイルスは、どういうわけか、最適化された回
収方法を要する或る程度の不安定性を示した。その有利な結合特性を失うことな
くその安定性を回復させるために、Vn4ペプチドを種々の隣接環境におけるHIル
ープ内に導入した（以下の表19を参照されたい）。対応するウイルス（これは、
E1の代わりにlacZまたはGax発現カセットを含有していた）を、大腸菌（E. coli
）内での組換えクローニングにより構築し、911またはPER.C6細胞内で増幅した
（実施例4に記載のとおり）。
【０２１３】
【表２０】
【０２１４】 ほとんどすべての構築物が、それらの未修飾対照ウイルスの生産性に匹敵する
生産性を示した（以下の表20を参照されたい）。
【０２１５】
【表２１】
【０２１６】 ウイルスの安定性も、これらの修飾により、様々な影響を受けた。特に、それ
らのいくつか（AE43、GL11、GL14およびGL16）は凍結／融解の連続的ラウンドに
感受性であったため、該感染細胞を緩和な条件（Tris 10mM pH7.5、MgCl2 1mM、
Tween 20 1％、NaCl 0.25M）で細胞溶解して回収する必要があった。このことも
また、該ウイルスの挙動に対する該リンカー配列の影響を強調するものである（
実施例9、図12も参照されたい）。
【０２１７】 実施例8：ヒト初代細胞における標的化ウイルスの評価 材料および方法 細胞培養 ラットおよびウサギの平滑筋細胞の初代培養を、Maderら（1992, J Gerontol.
Biol. Sci. 47:b32-b36）に従い、成体雄Spraggue-Dawleyラットまたは成体New
Zealand Whiteウサギの胸大動脈から調製した。10％ウシ胎仔血清（FBS）とペ
ニシリン／ストレプトマイシンとを含有するダルベッコイーグル変法培地（DMEM
）内で細胞を増殖させた。ヒト大動脈平滑筋細胞およびHUVECをCloneticsから購
入し、該製造業者の説明書に従い培養した。
【０２１８】 アデノウイルスに媒介されるインビトロ遺伝子導入および遺伝子発現アッセイ 実験の1〜2日前に24ウェルまたは12ウェルプレート上に細胞を播いた。無血清
培地内で希釈されたアデノウイルスベクターを37℃で1時間インキュベートする
ことにより、細胞を100または1000（VP/細胞）のmoiで感染させた。ついで細胞
を洗浄し、β-ガラクトシダーゼの発現が可能となるよう増殖培地を48時間加え
た。ついで該細胞を細胞溶解し、Luminescent β-ガラクトシダーゼ遺伝子レポ
ーター系II（Clontech）を使用してβ-ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイ
するか又はXgalで染色した。
【０２１９】 結果 βガラクトシダーゼレポーター遺伝子をコードする構築 以下の表21および22に記載するデータは、ほとんどのウイルスが対照ウイルス
より効率的にhSMCに形質導入したこと、およびウイルスAE30、AE42、AE43、AE44
、AE45、AE57、AE58、AE61、AE62、BC15Xおよび3497が更なるインビトロおよび
インビボ研究のための優れた候補であることを示している。種々の継代において
1000 VP/細胞のmoiで感染させた初代SMC上で行った実験は、該修飾ウイルスのい
くつかに関する形質導入の非常に有意な増加を示した（表21および22に具体例を
示す）。感染の48時間後に抽出物を調製し、その時点でタンパク質およびβ-ガ
ラクトシダーゼ活性を定量した。ついでlacZ比活性（RLU/タンパク質抽出物）の
レベルを比較することにより、形質導入効率を評価した。
【０２２０】
【表２２】
【０２２１】
【表２３】
【０２２２】 様々な種に由来するSMCにおいて得られたデータを、以下の表23に要約する。
ほとんどのウイルスは非ヒト細胞に効率的に形質導入することが可能であった。
このことは、それらの進入経路において種障壁が存在しないことを示している。
【０２２３】
【表２４】
【０２２４】 カプシドの修飾後に観察された形質導入の増加が、少なくとも1つには、感染
力の増加によるものであったことを証明するために、1000 VP/細胞のmoiで感染
したヒトSMCから抽出したウイルスDNA上で定量的PCRを行った。同時に、タンパ
ク質抽出物上でRLUの測定を行った。
【０２２５】 表24は、最良の候補ウイルスを特徴づけるヒト平滑筋細胞形質導入効率の増加
がDNAの進入における増加とすべての場合において相関したことを示している。
その相関性は、ウイルスAM43およびBC15Xに関して特に良好であった。
【０２２６】
【表２５】
【０２２７】 また、図4および5に例示するとおり、可溶性ヘパリンまたは可溶性uPARとの競
合において、SMCにおける進入経路を分析した。
【０２２８】 図4においては、次第に増加する用量の可溶性ヘパリンの存在下、hSMCに1000
（VP/細胞）のmoiで感染させた。細胞をPBS中で洗浄した後、37℃で更にインキ
ュベートした。感染の48時間後に抽出物を調製し、その時点で全タンパク質およ
びβ-ガラクトシダーゼ活性を定量した。該データは、ポリリシン含有ウイルス
によるhSMCの感染が可溶性ヘパリンにより特異的に抑制されることを示している
。このことは、これらのウイルスが細胞表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカン
に結合するらしいことを示している。これとは対照的に、予想どおり、AE43は、
進入にこの特定の経路を用いない。
【０２２９】 図5においては、次第に増加する用量の可溶性uPAR（0〜9.4μg/ml）と共にウ
イルスを予めインキュベートした後、1000（VP/細胞）のmoiでhSMC上でインキュ
ベートした。細胞をPBS中で洗浄した後、37℃で更にインキュベートした。感染
の48時間後に抽出物を調製し、その時点で全タンパク質およびβ-ガラクトシダ
ーゼ活性を定量した。該データは、該uPAR標的化ウイルスのいくつか（例えば、
AE43）によるhSMCの感染が組換え可溶性uPARにより特異的に抑制されることを示
している。hSMCがそれらの細胞表面においてuPARを発現することは（データは示
していない）、細胞進入にこの特定の受容体を用いていることを強く示唆してい
る。
【０２３０】 Gaxをコードする標的化アデノウイルス 感染hMCにおけるGax発現レベルをウエスタンブロットにより分析した。ウイル
ス3528（該ファイバーのC末端のK7）の感染後に、Gaxの発現における最高の増加
が得られた。3000 VP/細胞のmoiのすべての修飾ウイルスに関して、Gaxタンパク
質が検出されたが、同じmoiで対照ウイルスに感染した細胞内でのGaxの発現は検
出不可能であった。
【０２３１】 図6は、標的化アデノウイルスに感染したヒトSMC内でのGaxの発現を示す。示
されているmoi（VP/細胞）での感染の24時間後にタンパク質抽出物を調製した。
（1）AV1.0CMVrGax moi 3.104、（2）AV1.0CMVrGax moi 104、（3）3528 moi 10 4 、（4）3528 moi 3.104、（5）3528 moi 300、（6）3569 moi 3.103（7）3569
moi 300、（8）3570 moi 104、および（9）3570 moi 3.103。
【０２３２】 図7は、標的化アデノウイルスがヒトSMCに感染した後のGaxの発現を示す。示
されているmoi（VP/細胞）での感染の24時間後にタンパク質抽出物を調製した。 左パネル：（1）AV1.0CMVrGax moi 3.104、（2）AV1.0CMVhGax moi 3.104、（3
）AV1.0CMVhGax moi 3.103、（4）3528 moi 3000、（5）3528 moi 300、（6）35
28 moi 30、（7）3569 moi 3000、（8）3569 moi 300、（9）3569 moi 30。 右パネル：（1）AV1.0CMVrGax moi 3.104、（2）AV1.0CMVhGax moi 3.104、（3
）AV1.0CMVhGax moi 3.103、（4）3570 moi 3000、（5）3570 moi 300、（6）35
70 moi 30（7）3629 moi 3000、（8）3629 moi 300、（9）3629 moi 30。
【０２３３】 種々のmoiでのhSMCの感染後のFACS分析により、Gaxの発現が立証された。たと
え、この技術の感度がウエスタンブロット法よりはるかに高いとしても、これら
の結果は、ウエスタン実験と相関しており、hSMCに効率的に形質導入する能力に
おける、ウイルス3570および3629に対するウイルス3528および3569の相対的優位
性を示している（以下の表25に例示されているとおり）。
【０２３４】
【表２６】
【０２３５】 実施例9：ヒト腫瘍細胞における標的化ウイルスのインビトロ評価 Hs578T細胞（ヒト乳癌細胞）はAd5感染に完全に抵抗性である。これは、十中
八九、それらが、それらの細胞表面において、限られた量の該ウイルス受容体し
か発現しないからであろう。実際のところ、該細胞の50％に感染させるためには
105 VP/細胞ものmoiが必要である。それらを、それらがカプシド修飾ベクターの
パネルにより形質導入される能力に関して試験した。
【０２３６】 図8A、8B、8Cおよび9は、種々の標的化ウイルスによるHs578Tの感染を示す。
感染の48時間後に細胞抽出物を調製した。これらのデータは、AE43、AE44、AE45
または3497が、この細胞型に形質導入するのに非常に効率的であることを示して
いる。
【０２３７】 可溶性ノブファイバーまたは可溶性uPARとの競合により、AE43の感染経路を分
析した（図10および11）。図10においては、AE43を可溶性uPARと共に予めインキ
ュベートした後、Hs578Tに感染させた。感染の48時間後に細胞抽出物を調製した
。
【０２３８】 図11においては、AE43を可溶性uPAR（10μg/2 108 VP）または可溶性ノブ（10
0μg/ml）と共に予めインキュベートした後、Hs578Tに感染させた。感染の48時
間後に細胞抽出物を調製した。
【０２３９】 これらの結果は、AE43が古典的ノブ-CAR経路から細胞内に進入するのではなく
uPAR依存的経路を用いて進入することを示している。
【０２４０】 最後に、Vn4含有ウイルス3630、GL12、GL14またはGL17を、それらがHs578T細
胞に形質導入する能力においてAE43と比較した。図12に示すとおり、感染の48時
間後、該連結リンカーの性質は、実際に、HIループ内に挿入された結合ペプチド
が細胞表面のその特異的受容体と相互作用する効力に著しい影響を及ぼしうる。
【０２４１】 実施例10：マウス腫瘍細胞における標的化ウイルスのインビトロ評価 マウスNIH-3T3細胞は、該細胞の50％に感染させるためには100000 VP/細胞以
上が必要であるため、Ad5感染に対して非常に抵抗性である。それらがカプシド
修飾ウイルスのパネルにより形質導入される能力に関して、それらを試験した。
感染の48時間後に細胞抽出物を調製した。図13は、AE28、AE43、AE44、AE58、AE
57またはAE62が特に効率的であることを示す代表的な実験からのデータを含む。
また、重要なことは、AE63（短ファイバー、RGD-2C（ヘキソン内））が、その短
シャフト対照ウイルス（vBS1；ヘキソン内の挿入無し）に伴う欠損を部分的にレ
スキューしうることが示されたことである。したがって、天然進入経路を損なう
カプシド修飾（例えば、短シャフトを提示するファイバー）を、感染のための追
加的なCAR非依存的経路を与えるカプシド修飾と組合せることができる。
【０２４２】 可溶性uPARとの競合により、AE43およびBC15Xの感染経路を分析した（図14Aお
よび14B）。図14Aおよび14Bにおいては、ウイルスBC15X（A）およびAE43（B）を
、次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベートした後、細胞と共
にインキュベートした（それぞれ1000および200 VP/細胞のmoi）。ついで細胞を
洗浄し、さらに37℃で48時間インキュベートした後、細胞抽出物を調製した。こ
れらの及び他のデータは、これらのウイルスがuPARを用いて感染することを示し
ている。
【０２４３】 実施例11：再発狭窄症ウサギモデルにおける標的化ウイルスのインビボ評価
該標的化ウイルスのいくつかのインビボ評価を、再発狭窄症の優れたモデルで
あるアテローム二重損傷（atheromatous double injury）ウサギモデルにおいて
行った。アテローム腸骨動脈において導入を行う。ウサギに毎日120gの1％コレ
ステロール食を与え、第3週の時点で、2.5mm径のNycomedバルーンカテーテルを
使用するバルーン血管形成術により第1損傷を行う。1週間後、アデノウイルス遺
伝子導入を行う。β-ガラクトシダーゼに関するSMC染色の顕微鏡的定量を用いて
、遺伝子導入の効力を測定した（組織化学的分析）。簡単に説明すると、32切片
/動脈を検査し、XGal陽性細胞を計数した。それらのデータは、1本の動脈の32切
片のなかの最高得点として記載されている。結果を以下の表26に示す。
【０２４４】
【表２７】
【０２４５】 これらのデータは、アデノウイルスAE43およびBC15Xが、それらの未修飾対照
と比較して劇的に増加した効力で動脈壁に形質導入することを示している。
【０２４６】 本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものでは
ない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前
記の記載および添付図面から当業者に明らかとなろう。そのような修飾は、添付
の請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０２４７】 さらに、核酸またはポリペプチドに関して与えられた全ての塩基サイズまたは
アミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量値は概数であり、説明用に記
載されていると理解されるべきである。
【０２４８】 本明細書中に引用した種々の刊行物の全体を、参照により本明細書に組み入れ
ることとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヘキソンHVR5領域内で修飾されたウイルスを用いるW162細胞上での中和アッセ
イ。
【図２Ａ】 Ad5シャフトの代わりにアデノウイルス血清型3（Ad3）シャフトが挿入された短
縮化ファイバー構築物の構造のハイブリッドAd3/5ファイバーの概要説明。
【図２Ｂ】 Ad5シャフトの代わりにアデノウイルス血清型3（Ad3）シャフトが挿入された短
縮化ファイバー構築物の構造のハイブリッドAd3/5ファイバーの詳細な説明。
【図３】 293細胞におけるノブの競合。
【図４】 次第に増加する用量の可溶性ヘパリンの存在下での種々のウイルスによるhSMC
の感染。
【図５】 次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベートされたウイルスに
よるhSMCの感染。
【図６】 標的化アデノウイルスに感染したヒトSMC内でのGax発現。
【図７】 標的化アデノウイルスに感染したヒトSMC内でのGax発現。
【図８Ａ】 種々の標的化ウイルスによるHs578Tの感染。
【図８Ｂ】 種々の標的化ウイルスによるHs578Tの感染。
【図８Ｃ】 種々の標的化ウイルスによるHs578Tの感染。
【図９】 種々の標的化ウイルスによるHs578Tの感染。
【図１０】 次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベートされたウイルスAE
43によるHs578Tの感染。
【図１１】 次第に増加する用量の可溶性uPARまたは可溶性ノブと共に予めインキュベート
されたウイルスAE43によるHs578Tの感染。
【図１２】 Vn4含有ウイルスによるHs578Tの感染。
【図１３】 広い範囲の標的化ウイルスによるNIH-3T3の感染。
【図１４Ａ】 次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベートされたウイルスBC
15X（A）およびAE43（B）によるHs578Tの感染。
【図１４Ｂ】 次第に増加する用量の可溶性uPARと共に予めインキュベートされたウイルスBC
15X（A）およびAE43（B）によるHs578Tの感染。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 11/06 １０１ 21/04 11/06 25/00 １０１ 21/04 31/04 25/00 １０１ 31/18 31/04 35/00 31/18 37/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/075 37/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ０７Ｋ 14/075 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＧＤ，ＧＥ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ (72)発明者 ラツタ，マルテイーヌ フランス国、エフ−94220・シヤラントン −ル−ポン、リユ・ドウ・パリ、141 (72)発明者 イエー，パトリス フランス国、エフ−91190・ジフ−シユル −イベツト、アレ・ドウ・ラ・ポワント・ ジユネト、48 (72)発明者 ペリコデ，ミシエル フランス国、エフ−28320・エクローヌ、 リユ・ドウ・シヤルトル、31 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA10 DA03 DA20 EA02 FA15 FA20 GA11 HA01 HA17 4B065 AA93X AA95X AA95Y AB01 BA02 BA24 CA24 CA44 4C084 AA02 AA13 AA16 NA14 ZA022 ZA362 ZA452 ZA592 ZA702 ZA942 ZB012 ZB262 ZB312 ZC552 4C087 AA01 BC83 CA12 NA14 ZA02 ZA36 ZA45 ZA59 ZA70 ZA94 ZB01 ZB26 ZB31 ZC55 4H045 AA20 AA30 BA41 CA01 EA20 FA72 FA74

Claims (88)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 結合特異性がカプシド表面において機能的に示されるよう、
    ヘキソンHRV5ループの少なくとも一部が、連結アミノ酸スペーサーに隣接する結
    合ペプチドまたは標的化配列により置換されたアデノウイルス。
  2. 【請求項２】 該ヘキソンHVR5ループからの約6〜17アミノ酸の欠失を含む
    、請求項1に記載のアデノウイルス。
  3. 【請求項３】 14アミノ酸を超えない該ヘキソンHVR5ループ欠失からの欠失
    を含む、請求項1および2のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  4. 【請求項４】 アデノウイルス血清型5（Ad5）のアミノ酸残基約269〜アミ
    ノ酸残基約281に対応する該ヘキソンHVR5ループからの約13アミノ酸の欠失を含
    む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  5. 【請求項５】 該スペーサーが、グリシン、セリン、トレオニン、アラニン
    、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニンおよびプロリンより
    なる群から選ばれるアミノ酸を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアデノ
    ウイルス。
  6. 【請求項６】 該スペーサーが、グリシンおよびセリンよりなる群から選ば
    れるアミノ酸を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  7. 【請求項７】 該スペーサーの少なくとも1つにおける第1アミノ酸が、グリ
    シン、セリン、トレオニン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラ
    ギン、メチオニンおよびプロリンよりなる群から選ばれるアミノ酸である、請求
    項1〜6のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  8. 【請求項８】 該スペーサー内の第1アミノ酸が、グリシン、セリン、トレ
    オニン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニンお
    よびプロリンよりなる群から選ばれるアミノ酸である、請求項1〜7のいずれか1
    項に記載のアデノウイルス。
  9. 【請求項９】 該スペーサーの少なくとも1つにおける第1アミノ酸がグリシ
    ン残基である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  10. 【請求項１０】 該スペーサーの第1アミノ酸がグリシン残基である、請求
    項1〜8のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  11. 【請求項１１】 該スペーサーの少なくとも1つがジペプチドである、請求
    項1〜10のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  12. 【請求項１２】 該スペーサーの少なくとも1つがGly-Serジペプチドである
    、請求項1〜11のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  13. 【請求項１３】 該標的化配列が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチ
    ベーター受容体（UPAR）に対するリガンドエピトープである、請求項1〜12のい
    ずれか1項に記載のアデノウイルス。
  14. 【請求項１４】 該標的化配列が、LNGGTCVSNKYFSNIHWCN（配列番号1）、LN
    GGTAVSNKYFSNIHWCN（配列番号2）、AEPMPHSLNFSQYLWT（配列番号3）、AEPMPHSLN
    FSQYLWYT（配列番号4）、RGHSRGRNQNSR（配列番号5）およびNQNSRRPSRA（配列番
    号6）よりなる群から選ばれる、請求項1〜12のいずれか1項に記載のアデノウイ
    ルス。
  15. 【請求項１５】 該スペーサーを含む該標的化配列が、 A．gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser（配列番号7）、 B．gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser（配列番号8）、 C．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser（配列番号9）、 D．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser（配列番号10）、 E．gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号11）、 F．gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser（配列番号12）、 G．gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser（配列番号13）、 H．gly-ser-DCRGDCF-gly-ser（配列番号14）、および I．gly-ser-KKKKKKK-gly-ser（配列番号15）よりなる群から選ばれる、請求項1
    〜12のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  16. 【請求項１６】 ヒトアデノウイルス血清型に由来する、請求項1〜15のい
    ずれか1項に記載のアデノウイルス。
  17. 【請求項１７】 ヒトアデノウイルスC亜群に由来する、請求項1〜16のいず
    れか1項に記載のアデノウイルス。
  18. 【請求項１８】 ヒトアデノウイルス血清型5に由来する、請求項1〜のいず
    れか1項に記載のアデノウイルス。
  19. 【請求項１９】 該ファイバータンパク質が、野生型ファイバーシャフトよ
    り短いファイバーシャフトを有するように修飾されている、請求項1〜18のいず
    れか1項に記載のアデノウイルス。
  20. 【請求項２０】 該ファイバーシャフトがインフレーム欠失により短縮化さ
    れている、請求項19に記載の組換えアデノウイルス。
  21. 【請求項２１】 そのファイバーシャフトが、それを別の血清型由来のシャ
    フトにより置換することにより短縮化されている、請求項19に記載の組換えアデ
    ノウイルス。
  22. 【請求項２２】 該ファイバーシャフトが、ヒトC亜群（Ad2またはAd5）由
    来であり、それを血清型3（Ad3）由来のシャフトにより置換することにより短縮
    化されている、請求項19に記載の組換えアデノウイルス。
  23. 【請求項２３】 該ファイバーシャフトが、Ad5の反復1〜3および17〜22、A
    d5の反復1〜3および20〜22、またはアデノウイルス血清型3（Ad3）シャフトを含
    有する、請求項1〜22のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  24. 【請求項２４】 結合特異性がカプシド表面において機能的に示されるよう
    、ヘキソンHIループの少なくとも一部が、連結アミノ酸スペーサーに隣接する結
    合ペプチドまたは標的化配列により置換されているアデノウイルス。
  25. 【請求項２５】 該ヘキソンHIループからの約6〜17アミノ酸の欠失を含む
    、請求項24に記載のアデノウイルス。
  26. 【請求項２６】 11アミノ酸を超えない該ヘキソンHIループ欠失からの欠失
    を含む、請求項24および25のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  27. 【請求項２７】 アデノウイルス血清型5（Ad5）のアミノ酸残基約538〜ア
    ミノ酸残基約548に対応する該ヘキソンHIループからの約11アミノ酸の欠失を含
    む、請求項24〜26のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  28. 【請求項２８】 該スペーサーが、グリシン、セリン、トレオニン、アラニ
    ン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニンおよびプロリンよ
    りなる群から選ばれるアミノ酸を含む、請求項24〜27のいずれか1項に記載のア
    デノウイルス。
  29. 【請求項２９】 該スペーサーが、グリシンおよびセリンよりなる群から選
    ばれるアミノ酸を含む、請求項24〜28のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  30. 【請求項３０】 該スペーサーの少なくとも1つにおける第1アミノ酸が、グ
    リシン、セリン、トレオニン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパ
    ラギン、メチオニンおよびプロリンよりなる群から選ばれるアミノ酸である、請
    求項24〜29のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  31. 【請求項３１】 該スペーサー内の第1アミノ酸が、グリシン、セリン、ト
    レオニン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニン
    およびプロリンよりなる群から選ばれるアミノ酸である、請求項24〜30のいずれ
    か1項に記載のアデノウイルス。
  32. 【請求項３２】 該スペーサーの少なくとも1つにおける第1アミノ酸がグリ
    シン残基である、請求項24〜31のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  33. 【請求項３３】 該スペーサーの第1アミノ酸がグリシン残基である、請求
    項24〜32のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  34. 【請求項３４】 該スペーサーの少なくとも1つがトリペプチドである、請
    求項24〜32のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  35. 【請求項３５】 該スペーサーの少なくとも1つがGly-Ser-Serトリペプチド
    である、請求項24〜32のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  36. 【請求項３６】 該標的化配列が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチ
    ベーター受容体（UPAR）に対するリガンドエピトープである、請求項24〜32のい
    ずれか1項に記載のアデノウイルス。
  37. 【請求項３７】 該標的化配列が、LNGGTCVSNKYFSNIHWCN（配列番号1）、LN
    GGTAVSNKYFSNIHWCN（配列番号2）、AEPMPHSLNFSQYLWT（配列番号3）、AEPMPHSLN
    FSQYLWYT（配列番号4）、RGHSRGRNQNSR（配列番号5）およびNQNSRRPSRA（配列番
    号6）よりなる群から選ばれる、請求項24〜32のいずれか1項に記載のアデノウイ
    ルス。
  38. 【請求項３８】 該スペーサーを含む該標的化配列が、 A．gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser（配列番号16）、 B．gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser（配列番号17）、 C．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser（配列番号18）、 D．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser（配列番号19）、 E．gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser（配列番号20）、 F．gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser（配列番号21）、 G．gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser（配列番号22）、 H．gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser（配列番号23）、および I．gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser（配列番号24）、 J．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser（配列番号143）、 K．tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号144）、 L．tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号145）、 M．ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号146）、 N．ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly（配列番号147）よりなる群から選ばれる、請
    求項24〜32のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  39. 【請求項３９】 ヒトアデノウイルス血清型に由来する、請求項24〜38のい
    ずれか1項に記載のアデノウイルス。
  40. 【請求項４０】 ヒトアデノウイルスC亜群に由来する、請求項24〜39のい
    ずれか1項に記載のアデノウイルス。
  41. 【請求項４１】 ヒトアデノウイルス血清型5に由来する、請求項24〜40の
    いずれか1項に記載のアデノウイルス。
  42. 【請求項４２】 該ファイバータンパク質が、野生型ファイバーシャフトよ
    り短いファイバーシャフトを有するように修飾されている、請求項24〜41のいず
    れか1項に記載のアデノウイルス。
  43. 【請求項４３】 該ファイバーシャフトがインフレーム欠失により短縮化さ
    れている、請求項42に記載の組換えアデノウイルス。
  44. 【請求項４４】 そのファイバーシャフトが、それを別の血清型由来のシャ
    フトにより置換することにより短縮化されている、請求項42に記載の組換えアデ
    ノウイルス。
  45. 【請求項４５】 該ファイバーシャフトが、ヒトC亜群（Ad2またはAd5）由
    来であり、それを血清型3（Ad3）由来のシャフトにより置換することにより短縮
    化されている、請求項42に記載の組換えアデノウイルス。
  46. 【請求項４６】 該ファイバーシャフトが、Ad5の反復1〜3および17〜22、A
    d5の反復1〜3および20〜22、またはアデノウイルス血清型3（Ad3）シャフトを含
    有する、請求項24〜45のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  47. 【請求項４７】 結合特異性がカプシド表面において機能的に示されるよう
    、結合ペプチドまたは標的化配列が連結スペーサーまたはリンカーによりファイ
    バーのC末端に連結されている組換えアデノウイルスベクター。
  48. 【請求項４８】 該連結スペーサーが、グリシン、セリン、トレオニン、ア
    ラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニンおよびプロリ
    ンよりなる群から選ばれるアミノ酸を含む、請求項47に記載の組換えアデノウイ
    ルス。
  49. 【請求項４９】 該スペーサー内の第1アミノ酸がプロリンである、請求項4
    7および48のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルス。
  50. 【請求項５０】 ヒトアデノウイルス血清型に由来する、請求項47〜49のい
    ずれか1項に記載の組換えアデノウイルス。
  51. 【請求項５１】 ヒトアデノウイルスC亜群に由来する、請求項50に記載の
    組換えアデノウイルス。
  52. 【請求項５２】 ヒトアデノウイルス血清型5に由来する、請求項50に記載
    の組換えアデノウイルス。
  53. 【請求項５３】 該ファイバータンパク質が、野生型ファイバーシャフトよ
    り短いファイバーシャフトを有するように修飾されている、請求項47〜52のいず
    れか1項に記載のアデノウイルス。
  54. 【請求項５４】 該ファイバーシャフトがインフレーム欠失により短縮化さ
    れている、請求項53に記載の組換えアデノウイルス。
  55. 【請求項５５】 そのファイバーシャフトが、それを別の血清型由来のシャ
    フトにより置換することにより短縮化されている、請求項53に記載の組換えアデ
    ノウイルス。
  56. 【請求項５６】 そのファイバーシャフトが、C亜群由来であり、反復4〜16
    または反復4〜19を含むインフレーム欠失を含む、請求項47〜54のいずれか1項に
    記載の組換えアデノウイルス。
  57. 【請求項５７】 そのファイバーシャフトが、C亜群由来であり、それを血
    清型3（Ad3）由来のシャフトにより置換することにより短縮化されている、請求
    項47〜53のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルス。
  58. 【請求項５８】 5〜30個のアミノ酸を含むスペーサーまたはリンカーペプ
    チドを含む、請求項47〜57のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  59. 【請求項５９】 該スペーサーまたはリンカーペプチドが配列PKRARPGS（配
    列番号149）を含む、請求項47〜58のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  60. 【請求項６０】 該標的化配列が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチ
    ベーター受容体（UPAR）に対するリガンドエピトープである、請求項47〜59のい
    ずれか1項に記載のアデノウイルス。
  61. 【請求項６１】 該標的化配列が、7〜15個のアミノ酸を含む、ヘパリンに
    結合するFGF-1からのペプチド断片である、請求項47〜59のいずれか1項に記載の
    アデノウイルス。
  62. 【請求項６２】 該標的化配列が5〜10個のリシン残基を含む、請求項47〜5
    9のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  63. 【請求項６３】 該標的化配列が約7個のリシン残基を含む、請求項47〜59
    のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  64. 【請求項６４】 該標的化配列が5〜10個のArg-ArgおよびLeu-Leuモチーフ
    を含む、請求項47〜59のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  65. 【請求項６５】 該標的化配列が、LNGGTCVSNKYFSNIHWCN（配列番号1）、LN
    GGTAVSNKYFSNIHWCN（配列番号2）、AEPMPHSLNFSQYLWT（配列番号3）、AEPMPHSLN
    FSQYLWYT（配列番号4）、RGHSRGRNQNSR（配列番号5）、NQNSRRPSRA（配列番号6
    ）、RRLLRRLLRR（配列番号133）およびKRGPRTHYGQK（配列番号134）よりなる群
    から選ばれる、請求項47〜59のいずれか1項に記載のアデノウイルス。
  66. 【請求項６６】 該リンカーペプチドを含む該標的化配列が、配列PKRARPGS
    KKKKKKK（配列番号132）を含む、請求項47〜59のいずれか1項に記載のアデノウ
    イルス。
  67. 【請求項６７】 該リンカーペプチドを含む該標的化配列が、配列PKRARPGS
    RRLLRRLLRR（配列番号141）を含む、請求項47〜59のいずれか1項に記載のアデノ
    ウイルス。
  68. 【請求項６８】 該リンカーペプチドを含む該標的化配列が、配列PKRARPGS
    KRGPRTHYGQK（配列番号140）を含む、請求項47〜59のいずれか1項に記載のアデ
    ノウイルス。
  69. 【請求項６９】 アデノウイルスベクターの細胞指向性を修飾するための方
    法であって、 A．該アデノウイルスのカプシドタンパク質内の部位から天然アミノ酸配列
    を欠失させ、 B．標的化配列のN末端においては第1スペーサーにより、標的化配列のC末端
    においては第2スペーサーにより連結された標的化ペプチド配列を挿入すること
    を含んでなり、 アデノウイルスAd5のアミノ酸残基約269〜アミノ酸残基約281に対応するヘキ
    ソンHVR5ループからの約13アミノ酸、およびAd5のアミノ酸残基約538〜アミノ酸
    残基約548に対応するファイバータンパク質HIループからの約11アミノ酸よりな
    る群から選ばれる欠失部位に、該標的化ペプチドを挿入することを特徴とする方
    法。
  70. 【請求項７０】 該第1スペーサーが、グリシンおよびセリンよりなる群か
    ら選ばれるアミノ酸を含む、請求項69に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 該第2スペーサーが、グリシンおよびセリンよりなる群か
    ら選ばれるアミノ酸を含む、請求項69に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 該標的化配列が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチ
    ベーター受容体（UPAR）に対するリガンドエピトープである、請求項69に記載の
    方法。
  73. 【請求項７３】 該標的化配列が、LNGGTCVSNKYFSNIHWCN（配列番号1）、LN
    GGTAVSNKYFSNIHWCN（配列番号2）、AEPMPHSLNFSQYLWT（配列番号3）、AEPMPHSLN
    FSQYLWYT（配列番号4）、RGHSRGRNQNSR（配列番号5）およびNQNSRRPSRA（配列番
    号6）よりなる群から選ばれる、請求項72に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 該スペーサーを含む該標的化配列が、該HVR5ループ内に挿
    入され、 A．gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser（配列番号7）、 B．gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser（配列番号8）、 C．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser（配列番号9）、 D．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser（配列番号10）、 E．gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号11）、 F．gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser（配列番号12）、 G．gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser（配列番号13）、 H．gly-ser-DCRGDCF-gly-ser（配列番号14）、および I．gly-ser-KKKKKKK-gly-ser（配列番号15）よりなる群から選ばれる、請求項69
    に記載のアデノウイルス。
  75. 【請求項７５】 該スペーサーを含む該標的化配列が、該ファイバータンパ
    ク質HIループ内に挿入され、 A．gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser（配列番号16）、 B．gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser（配列番号17）、 C．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser（配列番号18）、 D．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser（配列番号19）、 E．gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser（配列番号20）、 F．gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser（配列番号21）、 G．gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser（配列番号22）、 H．gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser（配列番号23）、および I．gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser（配列番号24）、 J．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser（配列番号143）、 K．tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号144）、 L．tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号145）、 M．ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser（配列番号146）、 N．ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly（配列番号147）よりなる群から選ばれる、請
    求項69に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 該ファイバータンパク質シャフトを短縮化することを更に
    含む、請求項69に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 該ファイバーシャフトが、Ad5の反復1〜3および17〜22、A
    d5の反復1〜3および20〜22、またはAd3シャフトを含む、請求項69に記載の方法
    。
  78. 【請求項７８】 アデノウイルス血清型5（Ad5）のアミノ酸残基約269〜ア
    ミノ酸残基約281に対応するHVR5ループからの約13アミノ酸の欠失と、標的配列
    のN末端においては第1スペーサーにより、標的配列のC末端においては第2スペー
    サーにより連結された標的化ペプチド配列の該欠失部位における挿入とを含んで
    なるアデノウイルスヘキソン。
  79. 【請求項７９】 アデノウイルス血清型5（Ad5）のアミノ酸残基約538〜ア
    ミノ酸残基約548に対応するHIループからの約11アミノ酸の欠失と、標的配列のN
    末端においては第1スペーサーにより、標的配列のC末端においては第2スペーサ
    ーにより連結された標的化ペプチド配列の該欠失部位における挿入とを含んでな
    るアデノウイルスファイバータンパク質。
  80. 【請求項８０】 リンカーペプチドとそのC末端における標的化ペプチドと
    を含んでなるアデノウイルスファイバータンパク質。
  81. 【請求項８１】 標的細胞内で遺伝子を優先的に発現させるための方法であ
    って、該標的細胞を含有する細胞の集団を、請求項1〜68のいずれか1項に記載の
    アデノウイルスまたは請求項69〜77のいずれか1項に記載の方法に従い得られた
    アデノウイルスと接触させることを含んでなり、標的化配列が該標的細胞上の受
    容体に対するリガンドエピトープであることを特徴とする方法。
  82. 【請求項８２】 UPARを発現する標的細胞内で遺伝子を優先的に発現させる
    ための方法であって、該標的細胞を含有する細胞の集団を、請求項13、60または
    72に記載の標的化アデノウイルスベクターと接触させることを含んでなる方法。
  83. 【請求項８３】 該標的化アデノウイルスベクターが、腫瘍の治療のための
    遺伝子をコードする異種遺伝子を含む、請求項81に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 該アデノウイルスが再発狭窄症の治療のための遺伝子を含
    む、請求項81に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 請求項1〜68のいずれか1項に記載の標的化アデノウイルス
    ベクターまたは請求項69〜77のいずれか1項に記載の方法に従い得られた標的化
    アデノウイルスベクターを投与する工程を含んでなる、遺伝子治療による疾患の
    治療方法。
  86. 【請求項８６】 遺伝子治療による疾患の治療のための医薬を製造するため
    の、請求項1〜68のいずれか1項に記載の標的化アデノウイルスベクターまたは請
    求項69〜77のいずれか1項に記載の方法に従い得られた標的化アデノウイルスベ
    クターの使用。
  87. 【請求項８７】 請求項1〜68のいずれか1項に記載の標的化アデノウイルス
    ベクターまたは請求項69〜77のいずれか1項に記載の方法に従い得られた標的化
    アデノウイルスベクターを含んでなる医薬。
  88. 【請求項８８】 請求項1〜68のいずれか1項に記載の標的化アデノウイルス
    ベクターまたは請求項69〜77のいずれか1項に記載の方法に従い得られた標的化
    アデノウイルスベクターと、製薬的に活性な賦形剤の有効量とを含んでなる医薬
    組成物。
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