CN1314948A - 用于递送异源基因的定向腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

腺病毒尾丝蛋白和六邻体蛋白的内部位点的修饰允许腺病毒载体的有效导向。鉴定了重新定向腺病毒导向的可及位点。六邻体蛋白的HVR5环和尾丝蛋白的HI环(头部)十分有利于插入外源蛋白序列,这种插入不显著影响相应病毒的生存力和繁殖力。表位的可及性和功能性强烈依赖于相邻间隔的大小。其它结果提示短导向肽可与尾丝蛋白的C端有效融合。在一个具体的实施方案中,制备了一系列在HVR5位点、尾丝蛋白HI环或尾丝蛋白C端进行了修饰以导向含有尿激酶型纤溶酶原激活物受体的细胞的腺病毒载体。这些载体对导向脉管系统如癌症或心血管疾病的基因治疗是特别有用的。

Description

用于递送异源基因的定向腺病毒载体
                      发明领域
本发明涉及通过修饰尾丝蛋白或六邻体蛋白的表面可及位点以包含导向氨基酸序列来获得腺病毒载体的有效导向。本发明成功的关键在于，发现插入的导向序列的N端和C端的额外间隔氨基酸残基对于提供导向序列可识别的结合结构是关键的。因此，导向序列的可及性和功能性以及修饰蛋白的结构强烈取决于相邻间隔的大小和性质。其它结果提示短导向肽可与尾丝蛋白的C端有效融合。本发明还涉及这些载体在向体内或体外特定靶细胞递送治疗基因中的应用。
                    发明背景
                    腺病毒载体
腺病毒显示一些对用作基因治疗的基因转移载体特别有利的性质。具体地，它们具有相当宽的宿主谱，能够感染静止细胞，不整合进入感染细胞的基因组，而且迄今未参与人类主要疾病。因此，腺病毒已被用于将目的基因转移至肌肉(Rogot等，1993，自然(Nature)361:647)、肝脏(Jaffe等，1992，自然遗传学(Nature Genetics)1:372)、神经系统(Akli等，1993，自然遗传学3:224)、肿瘤(Griscelli等，1998,PNAS 95:6367)、完整或损伤的血管内皮细胞(van Belle等，1998，人类基因治疗(Human Gene Therapy)9:1013)、滑膜组织(Ghivizzani等，1998,PNAS 95:4613)等。腺病毒载体可有效转移基因至复制和非复制细胞(见如Crystal,1995，科学(Science)170:404-410)。
                  腺病毒衣壳
腺病毒衣壳的特征是人们熟知的(见如国际专利出版物WO98/07877)。
许多参考文献描述了腺病毒六邻体蛋白，并估计了一些可及位点。例如，Athapilly等(1994，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.242:430-455)描述了2.9A分辨率的精细晶体结构。Crawford-Miksza等(1996，病毒学杂志(J.Virol.)70:1836-1844)报告了7个含有血清型特异残基的六邻体蛋白高变区的位置和结构。的确，已有在腺病毒六邻体表面表达外源表位的报道(Crompton等，1994，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)75:133-139)。然而，正如下面的例子所示，Crompton等的文章没有给出通过修饰六邻体蛋白导向腺病毒的可重复的方法。
其它参考文献提供了关于尾丝蛋白的信息(Chroboczek等，1995，见Doerfler W.& P.Bohm(编)，腺病毒分子的所有组成部分(Themolecular repertoire of adenoviruses)，第163-200页，Springer-Verlag；Stewart和Burnett,ibid.，第25-38页；Xia等，1995，ibid.，第39-46页；Fender等，1995，病毒学(Virol.),214:110-117；Hong和Engler,1996,病毒学杂志，70:7071-7078)。已报道了通过人腺病毒血清型2和3尾丝头部的合成肽来抑制细胞对病毒的粘附和通过抗肽抗体中和病毒(Liebermann等，1996，病毒研究(Virus Research),45:111-121。Xia等(1994，结构(Structure),2:1259-1270)报道了5型腺病毒尾丝蛋白受体结合域的1.7A分辨率的晶体结构。
腺病毒是直径约65-80nm的无包膜的规则二十面体。腺病毒衣壳包含252个衣壳粒，其中240个是六邻体，12个是五邻体。六邻体和五邻体来自3个不同的病毒多肽(Maizel等，1968，病毒学，36:115-125；Weber等，1997，病毒学，76:709-724)。Ad5六邻体包含3个相同的多肽，每个多肽有967个氨基酸，即多肽Ⅱ(Roberts等，1986，科学，232:1148-1151)。五邻体包含一个五邻体基座和一个三聚体尾丝蛋白，五邻体基座提供附着衣壳的位点，而三聚体尾丝蛋白与五邻体基座非共价连接并从它伸展出去。
尾丝蛋白包含多肽Ⅳ(582个氨基酸)的3个相同蛋白质亚基，包括尾、轴(shaft)和头部(knob)(Devaux等，1990，分子生物学杂志，215:567-588)。尾丝轴含有15个氨基酸的假重复，后者被认为形成了两个交替的β-链和β-转角(Green等，1983,EMBO J.,2:1357-1365)。尾丝轴的整个长度和15个氨基酸重复的数目在不同腺病毒血清型之间是不同的。例如，Ad2尾丝轴长37nm，含有22个重复，而Ad3尾丝长11nm，含有6个重复。来自不同腺病毒血清型的10个以上尾丝蛋白的序列测定揭示，其序列多样性比其它腺病毒蛋白之间观察到的多样性更大。例如，紧密相关的Ad2和Ad5血清型的尾丝蛋白的头部区域在氨基酸水平上仅63％相似(Chroboczek等，1992,病毒学，186:280-285)，而它们的五邻体基座序列99％相同。然而，Ad2和Ad5尾丝蛋白均可结合相同细胞受体，因为它们交叉抑制相互的结合。相反，Ad2和Ad3的尾丝仅20％相同(Signas等，1985，病毒学杂志，53:672-678)，并结合不同受体(Defer等，1990，病毒学杂志，64(8),3661-3673)。
已证明腺病毒血清型2使用尾丝和五邻体基座与不同细胞受体相互作用，以附着和有效感染细胞(Wickham等，1993，细胞(Cell),73:309-319)。首先，病毒利用位于尾丝头部上的受体结合域(Henry等，1994，病毒学杂志，68(8):5239-5246)附着于至少两个细胞表面受体中的一个上(Hong等，1997,EMBO J.,16:2294-2306；Bergelson等，1997，科学，275:1320-1323；Phillipson等，1968，病毒学杂志，2:1064-1075:Wickham等，1993见上；Svensson等，1981，病毒学杂志，38:70-81；和DiGuilmi等，1995，病毒研究，38:71-81)。其次，病毒附着后，五邻体基座与异二聚体细胞表面受体(称为整联蛋白)家族的特定成员结合。对于具有长轴尾丝的Ad2和Ad5血清型，五邻体基座没有明显参与病毒对宿主细胞的最初附着(Wickham等，1993，见上)。
大多数整联蛋白识别配体中氨基酸的短线性片段，如在大多数细胞外基质配体中发现的三肽RGD。整联蛋白αⅡbβ3通过氨基酸序列KQAGD(SEQ ID NO:)结合纤维蛋白原(Kloczewiak等，1984，生物化学(Biochemistry),23,1767-1774),α4β1通过核心序列EILDV(SEQID NO:)结合纤连蛋白(Komoriya等，1991，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),266:15075-15079)。另一个存在于含有αv的整联蛋白的β亚基中的结构基序NPXY(SEQ ID NO:)也显示对于整联蛋白介导的内化十分重要(Suzuki等，1990，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),87:5354)。
一旦Ad2或Ad5通过其尾丝附着于细胞上，它就通过与整联蛋白结合的五邻体基座经过受体介导的内化过程进入披网格蛋白的内吞小泡中。最后，病毒颗粒被转运至细胞的核孔复合物中，在此病毒基因组进入细胞核，从而开始从病毒染色体的表达。
然而，在基因治疗中使用腺病毒的一个缺点是，所有含有腺病毒尾丝和五邻体基座的受体的细胞--而不只是需要治疗处理的细胞--都会内化腺病毒，因而也内化施用的一或多个基因。而且，缺乏尾丝受体或五邻体基座受体的细胞在腺病毒介导的基因递送中将会被削弱。看起来缺乏腺病毒尾丝受体的细胞以非常低的效率被腺病毒转导(Curiel等，1992，见上；Cotton等，1990，美国国家科学院院报，87:4033-4037；Wattel等，1996，白血病(Leukemia),10:171-174)。因此，有效指导腺病毒进入特定细胞以及在一些情况下扩充可接受腺病毒介导的基因治疗的细胞的所有组成部分，代表了改良当前载体的一个重要目的。两种解决方法也可能潜在地降低在靶细胞中获得基因表达所必需的腺病毒载体的量，因而潜在地降低与较高剂量腺病毒有关的副作用和并发症。
                  腺病毒导向策略
已采用各种策略改变腺病毒的趋性，即将腺病毒导向野生型腺病毒载体通常不能有效感染的特定细胞类型(见例如国际专利出版物WO 98/07877)。所采用的策略包括修饰尾丝蛋白、六邻体蛋白和五邻体基座蛋白。
美国专利5,559,099描述了一个包含嵌合五邻体基座蛋白和治疗基因的重组病毒，其中嵌合五邻体基座蛋白在野生型五邻体基座序列之外或替代野生型五邻体基座序列含有对受体、抗体或表位特异的非五邻体氨基酸序列。
美国专利5,543,328要求一种腺病毒，其中腺病毒尾丝包括对位于目的细胞类型上的受体特异的配体。这种腺病毒尾丝可通过除去全部或部分尾丝蛋白头部并用配体替代它来制备，或通过构建全长尾丝蛋白和配体间的融合物来制备。
国际专利出版物WO 95/26412公开了修饰腺病毒全长尾丝蛋白以包含用以结合配体的C端接头的策略。据说包含接头是为了避免对尾丝蛋白同三聚体的形成产生空间干扰。
国际专利出版物WO 96/26281公开了一种重组腺病毒，其含有(a)在天然尾丝序列之外或替代天然尾丝序列含有非天然氨基酸序列的嵌合尾丝蛋白，(b)治疗基因，和可选择的(c)替代天然尾丝氨基酸三聚体化结构域的非天然三聚体化结构域。非天然氨基酸序列可以是蛋白结合序列，并可位于C端。
国际专利出版物WO 97/20051公开了一种含有非天然氨基酸序列的嵌合腺病毒外壳蛋白，该非天然氨基酸序列能指导载体比具有野生型外壳蛋白的载体更有效地进入细胞。非天然序列可在外壳蛋白C端或其附近或外壳蛋白暴露的环中插入或替代内部外壳蛋白序列。外壳蛋白可以是尾丝蛋白、五邻体基座或六邻体蛋白。可包括间隔序列。
其它导向技术依赖于病毒外壳蛋白的表达后修饰，例如通过桥连导向基团或导向基团的共价或非共价连接来进行(见例如国际专利申请WO 97/05266；国际专利出版物WO 97/23608；国际专利出版物WO97/32026)。
尽管进行了这些努力，然而本领域仍需要鉴定结合肽插入的合适模式，以便该结合肽在衣壳表面准确显示，以允许病毒生长和对其相关受体的特异结合。
还需要限定允许这些序列识别的关键参数。本领域再另一个需要是提供适于指导腺病毒载体进入体内靶细胞的特异导向肽序列。本发明将满足本领域的这些需要和其它需要。
本文引用的任何参考文献均不应理解为这些文献对于本申请而言是“现有技术”。本文公开的所有文献均以完整的形式并入本申请作为参考。
                        本发明概述
本发明有利地提供有效的定向腺病毒载体。本发明的定向载体的特征是从六邻体蛋白或尾丝蛋白的有效位点适当缺失若干氨基酸。
因此，在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种腺病毒，其中六邻体HRV5环的至少一部分用结合肽或导向序列替代，两侧为连接氨基酸间隔，使得其在衣壳表面功能性显示其结合特异性。在一个具体实施方案中，该腺病毒包括从六邻体HVR5环上缺失约6到17个氨基酸，优选不超过14个氨基酸。
在另一个具体实施方案中，本发明涉及一种腺病毒，其中尾丝HI环的至少一部分用结合肽或导向序列替代，两侧为连接氨基酸间隔，使得可在衣壳表面功能性显示其结合特异性。在一个具体实施方案中，该腺病毒包括从尾丝HI环上缺失约6到17个氨基酸，优选不超过11个氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种重组腺病毒载体，其中一结合肽或导向序列通过连接间隔或接头与尾丝的C端连接，以在衣壳表面功能性表现其结合特异性。
在一个更具体的实施方案中，从相应于腺病毒血清型5(Ad5)约第269个氨基酸残基到约第281个氨基酸残基的六邻体HVR5环上缺失约13个氨基酸。在另一个具体的实施方案中，从相应于腺病毒血清型5(Ad5)约第538个氨基酸残基到约第548个氨基酸残基的尾丝蛋白HI环上缺失约11个氨基酸。导向肽在缺失位点插入。本发明的一个特别的优点是发现导向肽序列应通过导向序列N端的第一间隔和C端的第二间隔连接，其中这些间隔包含一个柔性氨基酸残基。优选地，第一或第二间隔或两者均含有选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。
在一个具体方面，六邻体蛋白经过修饰的定向腺病毒有利地采用了含有柔性氨基酸残基的二肽间隔。在一个具体实施方案中，第一和第二间隔是Gly-Ser二肽。在该方面的另一个具体实施方案中，第一间隔是甘氨酸残基。
在修饰尾丝蛋白HI环的本发明方面中，有利的第一和第二间隔是由柔性氨基酸残基组成的三肽。在本发明该方面的一个具体实施方案中，第一和第二间隔是三肽Gly-Ser-Ser。
优选地，导向序列是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(UPAR)的配体表位。具体地，导向序列可选自如下序列:LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
在修饰六邻体蛋白的另一个实施方案中，包括间隔的导向序列选自如下序列:gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:7)；gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:8)；gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser(SEQ ID NO:9)；gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser(SEQ ID NO:10)；gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:11)；gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:12)；gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser(SEQ ID NO:13)；gly-ser-DCRGDCF-gly-ser(SEQ ID NO:14)；和gly-ser-KKKKKKK-gly-ser(SEQ ID NO:15)。
在修饰尾丝蛋白的另一个实施方案中，包括间隔的导向序列选自如下序列:gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:16)；gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:17)；gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:18)；gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:19)；gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser(SEQ ID NO:20)；gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser(SEQ ID NO:21)；gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser(SEQ ID NO:22)；gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser(SEQ ID NO:23)；gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser(SEQ ID NO:24)；ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:143)；tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:144)；tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:145)；ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:146)；和ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-gly(SEQ ID NO:147)。
优选地，连接间隔或接头包含选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。在一个优选实施方案中，该间隔的第一个氨基酸是脯氨酸。
重组腺病毒可来自人腺病毒血清型，特别是人腺病毒C亚型，如人腺病毒血清型5。尾丝蛋白可修饰成具有比野生型尾丝轴更短的尾丝轴，特别是通过符合读框的缺失或通过用其它血清型的轴替代它来实现。尾丝轴可来自C亚型并含有包括第4到16个重复或第4到19个重复的符合读框的缺失，或者来自C亚型并通过用血清型3(Ad3)的轴替代它来缩短。
根据本发明的任何一个方面(修饰六邻体或尾丝)，尾丝蛋白可修饰成比野生型序列更短。例如，可修饰尾丝蛋白以仅包含Ad5的第1到3个和第17到22个重复；Ad5的第1到3和第20到22个重复；或用腺病毒血清型3(Ad3)轴替代内源Ad5轴。
在以下举例说明的一个具体实施方案中，腺病毒是血清型5腺病毒。在另一个实施方案中，本发明提供在尾丝蛋白C端包含接头肽和导向肽的特异定向腺病毒载体。优选地，导向序列是UPAR的配体，例如FGF-1结合肝素的包含7到15个氨基酸的肽片段CD87，导向序列由5到10个赖氨酸残基组成，优选差不多7个赖氨酸残基，或由5到10个Arg-Arg和Leu-Leu基序组成。
优选地，导向序列选自LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ IDNO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)；RRLLRRLLRR(SEQ ID NO:133)；和KRGPRTHYGQK(SEQ ID NO:134)。优选地，接头肽包含序列PKRARPGS(SEQ ID NO:149)，而包含接头肽的导向序列包含序列PKRARPGSKKKKKKK(SEQ ID NO:132)、PKRARPGSRRLLRRLLRR(SEQ ID NO:141)或PKRARPGSKRGPRTHYGQK(SEQ ID NO:140)。
很自然地，根据本文上面描述和下面更详细公开的导向腺病毒，本发明提供改变腺病毒载体的细胞趋性的方法，包括从腺病毒衣壳蛋白的一个位点缺失一段天然氨基酸序列；并插入导向肽序列，该导向肽序列在N端通过第一间隔连接，在C端通过第二间隔连接，其中这些间隔由柔性氨基酸残基组成。根据本发明的这一方面，导向序列在如下缺失位点插入：与腺病毒Ad5约第269位氨基酸残基至约第281位氨基酸残基相应的六邻体HVR5环约13个氨基酸；或与腺病毒Ad5约第538位氨基酸残基至约第548位氨基酸残基相应的尾丝蛋白HI环约11个氨基酸。在一个优选实施方案中，第一间隔包含选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。在另一个优选实施方案中，第二间隔包含选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。
本发明还包括：●包含与腺病毒血清型5(Ad5)约第269位氨基酸残基至约第281位氨基酸残基相应的HVR5环约13个氨基酸缺失、并在缺失位点包含导向肽序列插入的腺病毒六邻体，其中，导向序列在N端通过第一间隔连接，在C端通过第二间隔连接，而且第一和第二间隔由柔性氨基酸残基组成。●包含与腺病毒血清型5(Ad5)约第538位氨基酸残基至约第548位氨基酸残基相应的HI环约11个氨基酸缺失、并在缺失位点包含导向肽序列插入的腺病毒尾丝蛋白，其中，导向序列在N端通过第一间隔连接，在C端通过第二间隔连接，而且第一和第二间隔由柔性氨基酸残基组成。●在其C端包含接头肽和导向肽的腺病毒尾丝蛋白。
更具体地，本发明提供用于导向表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体(UPAR)的细胞的方法。具体地，该方法包括使用修饰成在衣壳表面暴露上面公开的特异UPAR导向肽的腺病毒。另外，本发明提供通过插入以上定义的特异序列(包括间隔基团)修饰六邻体HVR5环或尾丝蛋白HI环的方法。
根据本发明导向特定细胞类型的方法可通过缩短尾丝蛋白轴来进一步增强，例如尾丝轴缩短至仅包含Ad5的第1到3和第17到22个重复；Ad5的第1到3和第20到22个重复；或Ad3轴。Chroboczek等描述了所述重复(1995，微生物学和免疫学的当前热点(CurrentTopics in Microbiology and Immunology),Springer Verlag,199:163-200)。
本发明还提供在靶细胞中优先表达基因的方法，包括用本发明的定向腺病毒载体接触含有靶细胞的细胞群体，其中导向序列是靶细胞上受体的配体表位。特别地，本发明提供在表达UPAR的靶细胞中优先表达基因的方法，包括用修饰成表现UPAR结合肽的本发明定向腺病毒载体接触含有靶细胞的细胞群体。在该实施方案中，定向腺病毒载体优选包含用于转导活跃分裂的和/或游动的细胞的异源治疗基因或核酸，所述细胞包括肿瘤细胞和转移性肿瘤细胞、肿瘤脉管系统、活化内皮细胞、活化平滑肌细胞等。然而，UPAR定向载体也可被认为是转导其它组织如肌肉、脑、心脏等的候选载体。更具体地，所述核酸编码充当血管发生抑制物、血管生成因子、条件自杀效应基因、肿瘤抑制基因、生长抑制蛋白(GAX)或任何分泌多肽的治疗多肽。
特别地，本发明提供在表达整联蛋白的靶细胞中优先表达基因的方法，其包括用修饰成表现整联蛋白结合肽的本发明定向腺病毒载体接触含有靶细胞的细胞群体。在该实施方案中，定向腺病毒载体优选包含用于转导活跃分裂的和/或游动的细胞的异源治疗基因或核酸，所述细胞包括肿瘤细胞和转移性肿瘤细胞、肿瘤脉管系统、活化内皮细胞、活化平滑肌细胞等。然而，整联蛋白定向载体也可被认为是转导其它组织如骨骼肌、脑、心脏、造血细胞、局部缺血组织等的候选载体。更具体地，所述核酸编码充当血管发生抑制物、血管生成因子、条件自杀效应基因、肿瘤抑制基因、生长抑制蛋白(GAX)、细胞存活促进因子(特别是Akt/PKB家族的成员)或任何分泌多肽的治疗多肽。
因此，本发明的另一个目的是通过基因治疗治疗疾病的方法，其包括施用上文公开的或根据上文公开方法获得的定向腺病毒载体的步骤。
本发明再一个目的是包含上文公开的或根据上文公开方法获得的定向腺病毒载体的药品，以及这种定向腺病毒载体在生产用于通过基因治疗治疗疾病的药品中的应用。本发明的另一个目的是含有这种定向腺病毒载体和有效量的药物活性赋形剂的药物组合物。
因此，本发明的一个目的是提供改变了趋性的腺病毒载体而不对载体的繁殖力产生不利影响。
本发明另一个目的是鉴定合适的插入模式，以便结合肽可及和有效识别其特异受体。
本发明再另一个目的是鉴定可从天然腺病毒衣壳蛋白缺失的氨基酸残基的数目，以便导向肽序列可被有效地插入。
本发明的再另一个目的是提供将要包括在插入的导向肽末端处的间隔序列的有效大小和特征，以使该导向肽采取容许有效结合靶受体的可及构象。
本发明的这些目的和其它目的通过附图和下列“本发明详细描述”进一步阐述。
                   附图的简要描述图1：用修饰了六邻体HVR5区的病毒对W162细胞进行中和测定。图2：缩短尾丝构建体的结构，其中插入了腺病毒血清型3(Ad3)轴以替代Ad5轴。
图2A：杂合Ad3/5尾丝的一般描述；
图2B：杂合Ad3/5尾丝的详细描述图3：293细胞中的头部竞争。图4：在递增剂量的可溶性肝素存在时用各种病毒感染hSMC。图5：用与递增剂量的可溶性uPAR预先温育过的病毒感染hSMC。图6和7：在感染了定向腺病毒的人SMC中Gax的表达。图8A至8C和9：用不同定向病毒感染Hs578T。图10：用与递增剂量的可溶性uPAR预先温育过的病毒AE43感染Hs578T。图11：用与递增剂量的可溶性uPAR或可溶性头部预先温育过的病毒AE43感染Hs578T。图12：用含有Vn4的病毒感染Hs578T。图13：用多种导向病毒感染NIH-3T3。图14A和14B：用与递增剂量的可溶性uPAR预先温育过的病毒BC15X(A)和AE43(B)感染Hs578T。
                     本发明详细描述
如上所述，本领域一直迫切需要改变腺病毒的趋性以便允许将腺病毒载体导向特定靶细胞，包括那些腺病毒不能有效感染的细胞。尽管在该目的的实现中取得了一些成功，但本发明人认识到还没有获得该问题切实可行的解决方法，即，既对病毒繁殖力没有不利影响又使得细胞特异性令人满意的增加的解决方法。特别地，在现有技术中还没有描述导向肽掺入病毒衣壳蛋白的最佳位点、从天然衣壳蛋白缺失的大小(如果有的话)、插入的导向序列的大小、和任何连接导向序列与衣壳蛋白的接头序列的存在和性质。本发明有利地解决了这些问题，并通过如下方式提供了高效的导向：提供插入导向序列的最佳位点，包括待缺失以给该导向肽空出位置的天然序列的大小；鉴定导向序列的适当大小；揭示允许实现导向肽的可及性和特异识别的接头的大小和特性；并鉴定作为靶受体的感兴趣细胞标志。
特别地，本发明人试图在腺病毒衣壳表面导入可及外源肽，由此改变该病毒的天然趋性。根据该设想，设计了一系列具有修饰的六邻体或尾丝的结构，所述六邻体或尾丝整合了Ⅰ型脊髓灰质炎病毒的中和表位。因为可轻易获得同源中和抗体来详细阐明其可及性和功能性，所以选择了脊髓灰质炎病毒序列。
修饰六邻体和尾丝以限制其感染特异靶细胞要求腺病毒尾丝不能与其天然细胞受体有效地相互作用。对于六邻体修饰的衣壳，还需要结合肽可与其细胞表面上的同源受体直接相互作用，而没有尾丝的空间障碍。为此，探索了缩短尾丝轴的可能性。
本发明部分地基于鉴定适于功能性导向序列在六邻体蛋白和尾丝蛋白中插入的位点的实验。我们发现六邻体HVR5环和尾丝HI环的部分替代允许导向序列插入，而不对病毒的繁殖力产生不利影响。而且，数据显示在插入序列末端柔性接头肽的掺入对于导向序列的可及性或识别是关键性的。而且，体外和体内实验显示，对uPAR或对一些整联蛋白特异的配体的掺入在配体的可及性、修饰病毒的繁殖力、靶细胞类型的转导效率上均获得了成功。最后，还显示尾丝的缩短有效降低了天然宿主细胞的病毒亲合力，这使得该策略对Ad5天然趋性的终止很有吸引力。
在一个优选实施方案中，联合了各种不同方法。优选地，在含有修饰的六邻体HVR5环或尾丝HI环的病毒中缩短尾丝蛋白。在另一个例子中，具有缩短尾丝的病毒可(分别)在HVR5或HI中包含插入片段以在感染的第一步导向UPAR，在HI环或HVR5中包含插入以导向有助于病毒在内体中内化的整联蛋白。也可使用相同策略导向任何适当膜受体，即在六邻体和/或尾丝中掺入高亲合配体并联合缩短尾丝。
“本发明详细描述”将在有关具体定义、腺病毒载体、导向肽序列和定向腺病毒载体的应用的章节中进一步详细描述。各章节的各种标题和编排是为了清楚和方便，不应以任何方式视为限制。
                         定义
在整个说明书和权利要求书中使用了各种术语。如果没有特别定义，这些术语适应下列定义：
正如本领域所使用的，“载体”是任何转移根据本发明的核酸至宿主细胞中的工具。对于本发明，术语载体用来修饰“腺病毒”以反映腺病毒经过遗传改造转移目的基因(处于表达控制序列的控制之下或与表达控制序列可操作连接的基因)至靶细胞中的情况。本发明的腺病毒载体将在下面做更为详细的描述。
当病毒DNA被导入细胞中时，则该细胞已经被本发明的腺病毒载体“转染”或“感染”。当转染DNA影响表型改变时，则该细胞已经被外源或异源DNA“转化”。
本文所用术语“相应于”是指类似或同源序列，无论确切位置和与之测量类似性或同源性的分子相同还是不同。核酸或氨基酸序列对比可包含空格。因此，术语“相应于”是指序列类似性，而不是氨基酸残基或核苷酸碱基的数目。例子包括除本文列举的5型腺病毒(Ad5)外的其它腺病毒血清型(2,3，等)的六邻体蛋白或尾丝蛋白。同源腺病毒衣壳蛋白是本领域普通技术人员所熟悉的。
换句话说，本发明为采用本文定义的对Ad5优化的参数修饰其它腺病毒种的同源衣壳蛋白作了准备。本文所用术语“同源”的所有各种语法形式和拼写变体均指具有“共同进化起源”的蛋白质之间的相关性，这些蛋白质包括超家族(如免疫球蛋白超家族)的蛋白质和不同种的同源蛋白质(如肌球蛋白轻链等)(Reeck等，1987，细胞(Cell)50:667)。这些蛋白质(和它们的编码基因)具有序列同源性，正如其高度的序列类似性所反映的一样。
术语“缺失”是指从腺病毒衣壳蛋白即六邻体或尾丝蛋白的一定区域除去天然氨基酸残基。根据本发明，这种缺失的优选大小是约10个到约20个氨基酸之间。更优选地，缺失的大小在约10个到约15个氨基酸之间。在一个特定实施方案中，缺失11和13个氨基酸序列。
本文所用术语“间隔”或“间隔肽”或“接头”或“接头肽”是指包含用来连接结合肽和其衣壳载体蛋白的长约1到约3个氨基酸的序列。间隔或接头优选由具有高旋转自由度的氨基酸残基组成，以允许导向肽采取可被其结合配偶体(如受体)识别的构象。优选地，间隔中不超过3个氨基酸；更优选地，间隔由两个氨基酸组成。间隔优选的氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在具体实施方案中，间隔是具有序列Gly-Ser或Gly-Ser-Ser的肽。
本文所用术语“约”或“大约”是指给定值或范围的20％以内，优选10％以内，更优选5％以内。
                      腺病毒载体
腺病毒是可修饰成有效递送本发明核酸至多种细胞类型的真核DNA病毒。腺病毒存在多种血清型。在这些血清型中，在本发明的范围内，优选使用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(见WO 94/26914)。可用于本发明的动物来源的那些腺病毒包括狗、牛、鼠、(例子：Mav1,Beard等，病毒学75(1990)81)、羊、猪、鸟和猴(例子：SAV)来源的腺病毒。优选地，动物来源的腺病毒是狗腺病毒，更优选CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
腺病毒载体常用于体外、体内转染和基因治疗程序。优选地，腺病毒载体是复制缺陷的，即它们不能在靶细胞中自主复制。通常，本发明范围内复制缺陷的病毒载体的基因组缺乏至少一个病毒在感染细胞中复制所必需的区域。这些区域可采用本领域技术人员已知的任何技术进行(全部或部分)剔除或使其失去功能。这些技术包括病毒增殖必需区域的全部删除、(通过其它序列，特别是插入的核酸)替代、一或多个碱基的部分缺失或插入。这些技术可采用遗传学操作或通过诱变剂处理以体外(对分离的DNA)或原位方式进行。对于本发明，复制缺陷病毒保留了壳体化病毒颗粒所必需的基因组序列。也可使用完全或几乎完全缺乏病毒基因的缺陷病毒。
本发明的复制缺陷腺病毒载体至少包括ITRs、壳体化序列和目的核酸。优选地，至少造成腺病毒载体的E1区没有功能。E1区的缺失优选包括Ad5腺病毒序列的第455至3329位核苷酸(PvuⅡ-BglⅡ片段)，或第382至3446位核苷酸(HinfⅡ-Sau3A片段)，或第382至3512位核苷酸(HinfⅠ-RsaⅠ片段)。也可修饰其它区域，特别是E3区(WO 95/02697)、E2区(WO 94/28938)、E4区(WO 94/28152、WO 94/12649和WO95/02697)、Ⅳa2区(WO 96/10088)或晚期基因L1-L5的任一个。
在一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1区含有缺失(Ad1.0)。E1缺失腺病毒的例子公开于EP 185,573和1997年11月11日提交的FR 97/14383，这些文献的内容以参考文献的形式并入本文。在另一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1和E4区含有缺失(Ad3.0)。E1/E4缺失的腺病毒的例子公开于WO 95/02697和WO 96/22378，这些文献的内容以参考文献的形式并入本文。在另一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1区含有缺失，同时E4功能区和核酸序列在此缺失处插入(见FR 94/13355，其内容以参考文献的形式并入本文)。本发明使用的另一个腺病毒载体见WO 96/10088。
根据本发明的复制缺陷重组腺病毒可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备(Levrero等，基因(Gene)101:195；EP 185 573；Graham,1984,EMBO J.3:2917)。特别地，它们可通过腺病毒和其中携带目的DNA序列的质粒之间的同源重组来制备。同源重组在所述腺病毒和质粒共转染至适合细胞系之后发生。采用的细胞系应优选(ⅰ)可被所述元件转化，和(ⅱ)含有能与复制缺陷腺病毒基因组的一部分互补的序列，其优选以整合形式存在以避免重组的危险。可采用的细胞系的例子是包含整合在其基因组中的Ad5腺病毒基因组左边部分(12％)的人胚胎肾细胞系293(Graham等，1977，普通病毒学杂志36:59)、PER.C6(Bout等，1997，癌症基因治疗(Cancer Gene Therapy)4:324；Fallaux等，1998,Hum Gen Ther 9:1909-1917)、和能与E1和E4的功能互补的细胞系(见申请WO 94/26914和WO 95/02697)。在一个优选实施方案中，使用大肠杆菌(E.coli)载体系统产生腺病毒主链(国际专利出版物WO 96/25506；Crouzet等，1997，美国国家科学院院报94:1414-1419)。
的确，制备本发明腺病毒的标准技术是本领域熟知的。这些技术在文献中有详细解释。见例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A laboratory Manual)，第二版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本文称为“Sambrook等，1989”)；DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)，第Ⅰ和Ⅱ卷(D.N.Glover编，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编，1984)；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hames和S.J.EHiggins编(1985)]；转录和翻译(Transcription And Translation)[B.D.Hames和S.J.Higgins编，(1984)]；动物细胞培养物(Animal Cell Culture)[R.I.Freshney编，(1986)]；固定化细胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)[IRL出版社，(1986)]；B.EPerbal，分子克隆实用指南(APractical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(编者)，分子生物学现代方法(Current Protocols in Mocelular Biology),JohnWiley & Sons公司(1994)。
盒式插入位点的掺入，无论是对异源基因的插入还是对导向序列在六邻体或尾丝蛋白中插入(如下文所举例说明)，均有助于这种遗传操作。“盒”是指能在载体的特定限制性位点插入载体的DNA片段。该DNA片段编码目的多肽，而且盒和限制性位点的设计要确保该盒以转录和翻译正确的读框插入。
采用本领域普通技术人员熟知的标准分子技术(见例如国际专利出版物WO 98/00524、国际专利出版物WO 96/27677、和国际专利出版物WO 97/08298)回收和纯化重组腺病毒。
采用本发明的腺病毒载体表达异源基因。本发明的腺病毒载体优选含有异源基因的DNA编码序列。DNA“编码序列”是当置于适当调节序列控制之下时可在体外或体内细胞中转录和翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子来确定。一个编码序列可包括但不限于原核序列、真核mRNA的cDNA、真核(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、甚至合成DNA序列。如果编码序列将要在真核细胞中表达，则通常在该编码序列的3’端包含多腺苷酸化信号和转录终止序列。当RNA聚合酶转录该编码序列成mRNA、后者又被反式RNA剪接并翻译成该编码序列编码的蛋白质时，则编码序列在细胞中处于转录和翻译控制序列的“控制之下”。在另一个实施方案中，目的核酸不翻译成多肽，而充当特异反义治疗分子，或充当治疗诱饵。
转录和翻译控制序列是为编码序列在宿主细胞中表达作准备的DNA调节序列，如启动子、增强子、终止子等。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是控制序列。“启动子序列”是能在细胞中结合RNA聚合酶并引发下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。为了定义本发明，启动子序列在3’端以转录起始位点为界，向上游(5’方向)延伸至包括以高于背景的可检测水平引发转录所必需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列中将包含转录起始位点(可通过例如用核酸酶S1作图方便地限定)、以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域(共有序列)。
异源蛋白质的表达可由本领域已知的任何启动子/增强子元件控制，但这些调节元件必须在选择用来表达的靶细胞中有功能。可用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒立即早期(CMV-IE或CMV)启动子、SV40早期启动子区(Benoist和Chambon,1980,自然290:304-310)、劳斯肉瘤病毒3’长末端重复中包含的启动子(Yamamoto，等，1980，细胞22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院院报78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，自然296:39-42)；和显示组织特异性并已用于转基因动物中的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶Ⅰ基因控制区(Swift等，1984，细胞38:639-646；Ornitz等，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987，肝脏病学(Hepatology)7:425-515)、在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985，自然315:115-122)、在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，细胞38:647-658；Adames等，1985，自然318:533-538；Alexander等，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7:1436-1444)、在睾丸细胞、乳房细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的鼠乳癌病毒控制区(Leder等，1986，细胞45:485-495)、在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，基因和发育(Genes and Devel.)1:268-276)、在胚胎肝脏和肝癌中有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，分子细胞生物学5:1639-1648；Hammer等，1987，科学235:53-58)、在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，基因和发育1:161-171)、在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Megram等，1985，自然315:338-340；Kellias等，1986，细胞46:89-94)、在脑少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，细胞48:703-712)，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985，自然314:283-286)和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等，1986，科学234:1372-1378)。
在待转运至细胞表面或分泌的蛋白质的编码序列开始处应包括“信号序列”。该序列编码位于成熟多肽N端的信号肽，信号肽可指导宿主细胞将该多肽转运至分泌途径/区室中。本文采用术语“转运信号序列”来指这种信号序列。可发现转运信号序列与多种真核和原核生物天然蛋白质相关，并常在这两种类型生物中有功能。
具体异源基因将在下面涉及本发明载体的部分讨论。
                      导向肽序列
根据本发明，可在六邻体HVR5环或尾丝蛋白中掺入任何已知的导向序列。导向肽的例子在文献中很多。通常，任何肽配体均可提供基于该配体之受体结合序列的导向序列。在免疫学中，这种序列称为表位，而且在本文中术语表位可用来指受体识别的配体的序列。具体地，术语“受体的配体表位”是指可被靶细胞表面的结合配偶体识别的蛋白质或肽的序列，为方便起见称为受体。但是，应当理解，对于本发明，术语“受体”包括信号转导受体(如激素、类固醇、细胞因子、胰岛素和其它生长因子的受体)、识别分子(如MHC分子、B-或T-细胞受体)、营养摄取受体(如转铁蛋白受体)、凝集素、离子通道、粘着分子、细胞外基质结合蛋白和位于靶细胞表面并可及的类似分子。本发明的导向肽可结合这些受体上的多肽或糖部分。
导向肽的大小可在某些参数内变化。正如实施例中所示，长于缺失序列的插入肽并不对病毒繁殖力产生不利影响。因此，本发明打算使用比缺失片段长若干倍的导向序列；优选地，插入肽仅仅长于缺失片段的200％，更优选插入肽与缺失片段大小大致相同。
由于核苷酸编码序列的简并性，在本发明的实施中可使用其它编码与导向肽序列基本相同的氨基酸序列的DNA序列。这些序列包括但不限于等位基因变体、其它物种的同源变体、进行了保守氨基酸替代的变体、改变了(假定对于结合特异性不重要的)高度多态的氨基酸残基的变体。例如，可用充当功能性等同物的其它类似极性的氨基酸替代序列中的一或多个氨基酸残基，导致沉默改变。序列中氨基酸的替代物可选自该氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这种改变可望不显著影响由聚丙烯酰胺凝胶电泳所测定的表观分子量或等电点。
特别优选的替代是：
-以Lys替代Arg或相反，以便可维持正电荷；
-以Glu替代Asp或相反，以便可维持负电荷；
-以Ser替代Thr，以便可维持游离的-OH；
-以Gln替代Asn，以便可维持游离的CONH2。
这些变体可用高度相似的核酸编码。通常，这些核酸可与编码天然氨基酸序列的核酸(包括寡核苷酸探针)杂交。正如下面的实施例中所示，可通过不影响(PCR引物)杂交但可产生内切核酸酶切割位点或改变的氨基酸残基的单碱基变换来导入各种修饰。
当核酸分子的单链形式可在适当的温度和溶液离子强度条件下与另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA或RNA退火(见Sambrook等，见上)时，则该核酸分子与该另一个分子“可杂交”。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格性”。对于同源核酸的初步筛选，可使用低严格杂交条件，相应于55℃的Tm，例如5×SSC,0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉，不加甲酰胺；或30％甲酰胺，5×SSC,0.5％SDS。中等严格杂交条件相应于更高的Tm，例如40％甲酰胺，5×或6×SSC。高严格杂交条件相应于最高的Tm，例如50％甲酰胺，5×或6×SSC。杂交要求这两个核酸含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。杂交核酸适当的严格性取决于核酸的长度和互补程度，这些变量是本领域熟知的。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，则含有这些序列的核酸杂交体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(相应于更高的Tm)按下列顺序降低：RNA:RNA,DNA:RNA,DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已获得了计算Tm的公式(见Sambrook等，见上，9.50-9.51)。对于更短核酸如寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更加重要，而且，寡核苷酸的长度决定其特异性(见Sambrook等，见上，11.7-11.8)。优选地，可杂交核酸的最小长度是至少10个核苷酸；优选至少约15个核苷酸；更优选该长度为至少约20个核苷酸。在一个具体实施方案中，术语“标准杂交条件”是指Tm值55℃，并采用上文所示的条件。在一个优选实施方案中，Tm是60℃；在一个更优选的实施方案中，Tm是65℃。
整联蛋白结合肽。导向肽序列包括人们熟知的整联蛋白结合肽(见例如，美国专利4,517,686；美国专利4,589,881；美国专利4,661,111；美国专利4,578,079；美国专利4,614,517；美国专利5,453,489；美国专利5,627,263)。其它有用的导向肽见国际专利出版物WO 98/17242和欧洲专利申请EP 773 441。
关于整联蛋白的导向，如上所述，许多出版物描述了结合特异整联蛋白的肽，其中一些肽在不同肿瘤或细胞类型中超表达。在一个具体实施方案中，αv-整联蛋白(因此也包括活跃分裂的和/或游动的细胞，包括肿瘤细胞和转移性肿瘤细胞、肿瘤脉管系统、活化内皮细胞、活化平滑肌细胞、骨骼肌细胞等)通过例如用噬菌体展示筛选的肽来导向。当然，任何整联蛋白特异的肽例如文献中所描述的肽都可用于本发明。整联蛋白的导向还可有利于病毒的内化，并可能是一种恢复缩短了尾丝的Ad的感染性的手段。
导向尿激酶受体的肽。在一个下文列举的具体实施方案中，导向尿激酶型溶酶原激活物受体(UPAR；例如CD87)的肽选自许多出版物。当然，结合UPAR的肽有更详尽的名单。可使用任何结合UPAR的肽。
碱性导向肽。本发明的具体实施方案以及具体导向肽详见下文实施例4-6。例如，下文实施例中使用了主要由碱性氨基酸残基如赖氨酸和组氨酸，更优选赖氨酸或精氨酸或两者一起(见例如WO 97/20051)组成的导向肽。在另一个例子中，使用了结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的配体如精氨酸-亮氨酸重复基序RRLLRRLLRR(见RPR专利申请WO 95/21931)和FGF-1的肝素结合域的肽片段KRGPRTHYGQK(Digabriele等，1998，科学，393:812-817)。
而且，结合肝素或糖胺聚糖的序列可参与结合肝素样受体(Sawitzky等，1993，Med.Microbiol.Immunol.,182:285-92)。同样，所谓的“肝素结合序列”可介导含有这些序列的肽或蛋白质与其它细胞表面结合位点如细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖之间的相互作用(Thompson等，1994,J.Biol.Chem.,269:2541-9)。
作为替代，导向氨基酸序列由距α-螺旋约20埃并朝向其相反方向的两个碱性氨基酸(常常是Arg)组成(Margalit等，1993,J.Biol.Chem.,268:19228-31；Ma等，1994，脂质研究杂志(J.Lipid Res.),35:2049-2059)。其它碱性氨基酸可分散在这两个残基之间，朝向一侧，而非极性残基朝向另一侧，形成碱性残基被分离/隔离至一侧的两亲性螺旋结构。
另外，导向序列可包含纤连蛋白和热休克蛋白中存在的共有肝素结合基序(Hansen等，1995,Biochim.Biophys.Acta,1252:135-45)；由Lys或Arg或Lys和Arg的混合物组成的7残基插入片段(Fromm等，1995,Arch.Biochem.Biophys.,323:279-87)；IGFBP-3和IGFBP-5的共同碱性C-末端区域，该区域含大约18个氨基酸并含有肝素结合序列(Booth等，1995,Growth Regul.,5:1-17)；位于hyaluronan(HA)受体RHAMM的C末端的35个氨基酸区域内的两个HA结合基序中的一个或两个(Yang等，1994,J.Cell Biochem.,56:455-68)；仿效金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)玻连蛋白的肝素结合形式、含有肝素结合共有序列的合成肽(Ala347-Arg361)(Liang等，1994,J.Biochem.,116:457-63)；位于牛单纯疱疹病毒Ⅰ糖蛋白gⅢ的第129至310位氨基酸之间的5个肝素结合位点中的任一个或多个，或位于假狂犬病病毒糖蛋白gⅢ的第90至275位氨基酸之间的4个肝素结合位点中的任一个(Liang等，1993，病毒学，194:233-43)；假狂犬病病毒糖蛋白gⅢ的第134至141位氨基酸(Sawitzky等，1993,Med.Microbiol.Immunol.,182:285-92)；相应于人脂蛋白脂肪酶第279-282位和292-304位的带电荷残基的肝素结合区域(Ma等，见上)；具有纤连蛋白类似的序列并表现出肝素结合性质的合成22残基肽N22W(Ingham等，1994,Arch.Biochem.Biophys.,314:242-246)；存在于阿尔茨海默氏病β-淀粉样前体蛋白(APP)以及多种其它APP样蛋白的胞外结构域锌结合位点中的基序，其调节肝素亲合性(Bush等，1994,J.Biol.Chem.,229:26618-21)；来源于层粘连蛋白A链交叉区域的8个氨基酸残基肽(Tashiro等，1994,Biochem.J.,302:73-9)；基于丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ的肝素结合区域的肽，包括肽F123-G148和K121-A134(Tyler-Cross等，1994，蛋白质科学(Protein Sci.)3:620-7)；推测是肝素结合区域的APP的14KN端片段和紧靠该N末端的区域(即第96-110位残基)(Small等，1994，神经科学杂志，14:2117-27)；肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的一段21个氨基酸序列，其特征是具有高含量的赖氨酸和精氨酸残基(Thompson等，1994,J.Biol.Chem.,269:2541-9)；含有钙结合糖蛋白的肝素结合区并相应于hep1合成肽的17个氨基酸区域(Murphy-Ullrich等，1993,J.Biol.Chem.,268:26784-9)；结合肝素的人vonWillebrand因子的23个氨基酸序列(Y565-A587)(Tyler-Cross等，1993,Arch.Biochem.Biophys.,306:528-33)；结合肝素的纤连蛋白衍生肽PRARI，以及含有该基序的更大的肽(Woods等，1993,Mol.Biol.Cell.,4:605-613)；血小板因子4的肝素结合区(Sato等，Jpn.J.CancerRes.,84:485-8)；以及成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶跨膜糖蛋白中的K18K序列(Kan等，1993，科学259:1918-21)。
导向肽序列的鉴定。在另一个实施方案中，可从各种类型的组合文库采用熟知的配体鉴定策略获得导向肽(见美国专利5,622,699和国际专利申请PCT/US96/14600)。一种方法是使用重组噬菌体产生大文库。采用“噬菌体方法”(Scott和Smith,1990，科学，249:386-390；Cwirla等，1990，美国国家科学院院报，87:6378-6382；Devlin等，1990，科学，249:404-406)，可以构建很大的文库(106-108个化学个体)。第二种方法主要使用化学方法，例如Geysen法(Geysen等，1986，分子免疫学(Molecular Immunology)23:709-715；Geysen等，1987，免疫学方法杂志(J.Immumologic Method)102:259-274)和Fodor等的方法(1991，科学251:767-773)。Furka等(1988，第14届生物化学国际会议(14th International Congress of Biochemistry)，第5卷，摘要FR:013；Furka,1991,Int.J.Peptide Protein Res.37:487-493)、Houghton(美国专利4,631,211,1986年12月出版)和Rutter等(美国专利5,010,174,1991年4月23日出版)描述了制备可作为导向序列测试的肽混合物的方法。在另一方面，合成文库(Needels等，1993，美国国家科学院院报90:10700-4；Ohlmeyer等，1993，美国国家科学院院报90:10922-10926；Lam等，国际专利出版物WO 92/00252；Kocis等，国际专利出版物WO 9428028)及类似物可用于筛选导向肽。
本发明载体的应用
以上提供的关于腺病毒载体制备的参考文献描述了这些载体的各种用途。
治疗基因向体内恶性细胞的定向导入可提供肿瘤的有效治疗方法。已尝试过几种治疗形式。例如，一种治疗方法涉及将正常肿瘤抑制基因(如p53、视网膜成纤维瘤蛋白、p16等)和/或激活的癌基因的抑制剂递送至肿瘤细胞中。第二种治疗方法涉及通过导入细胞因子基因增强体内肿瘤细胞的免疫原性。第三种治疗方法涉及导入编码可赋予肿瘤细胞对化疗剂的敏感性的酶的基因。单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tK)基因可特异地将核苷类似物(9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤)转化成毒性中间体并引起正在分裂的细胞死亡。最近Culver等(科学，1992，256:1550-1552)报道，在实验动物中通过逆转录病毒转导递送HSV-tK基因后，接下来的9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤治疗可有效地引起脑肿瘤的退化。Woo等的美国专利5,631,236描述了用编码HSV-tK或VZV-tK的腺病毒载体对实体瘤进行的基因治疗。
在一个优选的实施方案中，本发明的载体可用于使目的核酸导向肿瘤本身、肿瘤的转移部分或肿瘤的脉管系统，例如通过采用结合于UPAR的肽来进行。在一个优选实施方案中，该载体编码血管生成抑制剂或抗血管生成因子的基因。“抗血管生成因子”是一种抑制血管生成的分子，特别是通过阻断内皮细胞迁移来抑制。这种因子包括抑制性的血管生成蛋白片段(例如尿激酶的氨基末端片段)、血管生成抑制因子如制管张素和内抑制素(endostatin)；血管生成因子的可溶性受体，例如尿激酶型受体或FGF/VEGF受体；阻断内皮细胞生长因子受体的分子[O’Reilly等，细胞(Cell)88:277-285(1997)；O’Reilly,Nat.Med.2:689-692(1996)]，和Tie-1或Tie-2抑制剂。一般地，在本发明中使用的抗血管生成因子是蛋白质或多肽，其可被采用本发明的载体转染至肿瘤中的基因编码。例如，根据本发明，本发明的载体可用于将编码抗血管生成蛋白质的基因递送至肿瘤、肿瘤的转移部分或肿瘤的脉管系统中。抗血管生成因子的例子包括但不限于含有EGF样结构域的尿激酶的氨基末端片段(ATF)(例如ATF约第1位至约第135位氨基酸)；以融合蛋白形式提供的ATF，例如与免疫球蛋白或人血清白蛋白形成融合蛋白[WO 93/15199]；制管张素[O’Reilly等，细胞79:315-328(1994)]；金属蛋白酶的组织抑制剂[Johnson等，J.Cell.Physiol.160:194-202(1994)]；或FGF或VEGF的抑制剂，如血管生成因子受体的可溶性形式，包括但不限于可溶性VGF/VEGF受体和可溶性尿激酶受体[wilhem等，FEBS Letters 337:131-134(1994)]。
在另一个优选实施方案中，本发明的载体可用于导向迁移的平滑肌细胞以抑制血管生成后的再狭窄。腺病毒通过递送自杀基因用于抑制再狭窄的例子公开在WO 96/05321中。WO 96/30385中公开了编码GAX蛋白(生长抑制蛋白)的腺病毒在抑制血管平滑肌细胞增生和再狭窄中的应用。其它基因可以是细胞毒性基因(HSV胸苷激酶)、金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、内皮NOS或动脉粥样硬化保护因子(例如ApoE)。
其中包含了肌肉或脑特异性肽的本发明载体也可用于选择性地递送保护或再生生长因子以治疗中枢神经系统(CNS)疾病。腺病毒用于向CNS递送基因的例子公开于WO 94/08026、WO 95/25804和WO95/26408中。
其中包含了骨骼肌或心脏特异性肽的本发明载体也可用于选择性地递送对外周动脉疾病或冠状动脉疾病的治疗有用的物质：血管生成因子(例如VEGF、FGF、angiopoietin家族的成员)、细胞生存促进因子(例如akt/PKB家族的成员)、参与能量代谢的基因(例如磷酸蛋白受体或腺苷酸环化酶)、细胞因子和其受体(例如IL-6、IL-10、CXCR4、CXCR1、sdf1、MCP1、GM-CSF)以及防止细胞程序死亡的基因(akt)。
在一种更为普通的方式中，本发明载体可向靶细胞递送各种基因，其包括：酶；血液衍生物；激素例如胰岛素或生长激素；淋巴因子：白细胞介素、干扰素、TNF等(法国专利9203120)；生长因子例如血管生成因子如VEGF或FGF；神经递质或其前体，或合成酶；营养因子，尤其是神经营养因子，用于治疗神经变性疾病、神经系统损伤引起的中风或视网膜退化的因子：BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、IFGF、NT3、NT5、HARP/超营养因子，或骨骼生长因子、造血因子等；肌营养不良蛋白或最小肌营养不良蛋白(minidystrophim)(法国专利9111947)；编码参与凝血的因子：例如，因子Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ的基因；自杀基因(例如胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶)；血红蛋白或其它蛋白载体的基因；相应于参与脂代谢的蛋白的基因：选自载脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、B、C-Ⅰ、C-Ⅱ、C-Ⅲ、D、E、F、G、H、J和apo(a)的载脂蛋白类型，代谢酶例如脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶、7-α-胆固醇羟化酶、磷脂酰酸性磷酸酶，或脂转移蛋白如胆固醇酯转移蛋白和磷脂转移蛋白，HDL结合蛋白，或以下受体：例如LDL受体、残余乳糜微粒受体和清除受体，等等。此外，可以添加用于治疗肥胖症的leptin。
在其它可被定向载体的基因编码的蛋白质或肽中，重要的是强调抗体、单链抗体的可变片段(ScFv)或任何其它具有识别能力的抗体片段，因为它们可用于免疫治疗，例如治疗感染性疾病、肿瘤、自身免疫病如多发性硬化(可涉及抗独特型抗体的使用)。非限制性地，其它目的蛋白质是可溶性受体，如可用于例如抗HSV治疗的可溶性CD4受体或TNF的可溶性受体，可用于例如治疗肌无力的乙酰胆碱的可溶性受体；用于例如治疗哮喘、血栓和再狭窄的底物肽或酶抑制剂，或作为受体或粘着蛋白的激动剂或拮抗剂的肽；人工、嵌合或截断蛋白。在感兴趣的激素中，可提及的是治疗糖尿病的胰岛素、生长激素和降钙素。
还可将所述基因替换为反义序列或具有如下性质的基因，即其在靶细胞中的表达可控制基因的表达或细胞mRNA的转录。例如，根据欧洲专利140 308中所描述的技术，可将这些序列在靶细胞中转录成与细胞mRNA互补的RNA并由此阻断细胞mRNA翻译成蛋白质。治疗基因还可含有编码能选择性破坏靶RNA的核酶的序列(欧洲专利321 201)。
                       实施例
可通过参考如下非限制性实施例更好地理解本发明，这些实施例是作为本发明的典型实例提供的。如果没有特别指出，这些实施例中存在的所有修改均可组合在一起。实施例1：Ad5六邻体HVR5环的操作
本实施例说明，如果保持该环顶端最保守残基(第268位的丝氨酸和第282位的脯氨酸)的完整，对Ad5六邻体HVR5环第269-281氨基酸(aa)的操作将意想不到地为有效的腺病毒趋性改造提供条件。从Ad5六邻体除去的序列是：TTEAAAGNGDNLT(SEQ ID NO:25)(即，与已发表的Ad5参考序列相比，我们的构建体在六邻体第273位氨基酸处显示苏氨酸到丙氨酸的替代)，保守的侧翼序列是FFS(上游)和PKVV(下游)。
                    材料和方法
为操作六邻体HVR5环构建穿梭质粒。使用下列两对引物制备含有HVR5环侧翼区并且其中HVR5环被恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的xylE标志基因(Zukowski等，1983，PNAS 80:1101-1105)替代的第一个中间质粒IE28:hex-19243G(5’-ATGGGATGAAGCTGCTACTG-3’)(SEQ ID NO:26)和hex-19623D(5’-tcgcgaGAAAAATTGCATTTCCACTT-3’)(SEQ IDON:27)，和hex-19685G(5’-CCTAAGGTGGTATTGTACAG-3’)(SEQ ID NO:28)和hex-20065D(5’-AGCAGTAATTTGGAAGTTCA-3’)(SEQ ID NO:29)。
按照标准PCR技术，使用这些引物扩增分别相当于Ad5基因组(Genbank登记号M73260)第19245-19639位和第19685-20084位核苷酸的六邻体基因的一部分。引物hex-19623D含有限制性位点NruⅠ，引物hex-19685G与Ad5序列相比作了稍稍修饰，以产生Bsu36Ⅰ位点而不改变六邻体的蛋白质序列(第19690位核苷酸：A到G)。将每个PCR产物克隆至质粒pCRⅡ(Invitrogen)中，分别产生质粒IE21和IE22。通过DNA测序证实克隆的正确性。
将含有xylE基因表达盒的质粒pαxylEΩ(Frey等，1988，基因(Gene)62:237-247)用EcoRⅠ限制酶消化，T4 DNA聚合酶平端化，再用HindⅢ消化。该DNA片段克隆至平端化的BamHⅠ-HindⅢ IE21质粒中，获得质粒IE26。最后，将IE26的HindⅢ-XbaⅠ片段和IE22的XhoⅠ-HindⅢ片段克隆至SalⅠ-XbaⅠ切割的已报道质粒pXL2756(Crouzet等，1997,PNAS 94:1414-1419)中，产生穿梭质粒IE28。
所有HVR5环被修饰的质粒均通过用双链寡核苷酸替代xylE基因从质粒IE28获得。简而言之，将互补单链寡核苷酸退火形成双链，并克隆至NruⅠ-Bsu36Ⅰ消化的IE28中，只有质粒IE31除外，该质粒通过连接双链寡核苷酸和BsrGⅠ-NruⅠ切割的IE28获得。采用表型筛选，其基于表达xylE的细菌在喷洒了0.5M儿茶酚后显黄色(Zukowski等，1983，见上)。下表列出了所用的寡核苷酸和相应的穿梭质粒的名称：
表1.用于产生具有特定六邻体插入的质粒结构的寡核苷酸。
    穿梭质粒     寡核苷酸   SEQIDNo:
IE30(Ad2 HVR5) 5’-AATACTACCTCTTTGAACGACCGGCAAGGCAATGCTACTAAACC-3’5’-TTAGGTTTAGTAGCATTGCCTTGCCGGTCGTTCAAAGAGGTAGTATT-3’     3031
IE31(脊髓灰质炎病毒3型的表位)* 5’-AATCTAGACTCTTTGGAACAACCTACTACTCGCGCTCAAAAACCACGTCTAGATTT-3’5’-GTACAAATCTAGACGTGGTTTTTGAGCGCGAGTAGTAGGTTGTTCCAAAGAGTCTAGATT-3’     3233
IE32(Ad30 HVR5) 5’-TCAACCACTATAAACATTCC-3’5’-TTAGGAATGTTTATAGTGGTTGA-3’     3435
IE33(Ad19 HVR5) 5’-ACTCCTGGCGCAAATCCTCCAGCAGGCGGTAGTGGAAACGAAGAATACAAACC-3’5’-TTAGGTTTGTATTCTTCGTTTCCACTACCGCCTGCTGGAGGATTTGCGCCAGGAGT-3’     3637
IE35(脊髓灰质炎病毒1型(5)的表位) 5’-GATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCTACC-3’5’-TTAGGTAGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATC-3’     3839
IE37(脊髓灰质炎病毒1型的表位) 5’-GGAGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCC-3’5’-TTAGGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCTCC-3’     4041
IE40(脊髓灰质炎病毒1型表位) 5’-TCTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCC-3’5’-TTAGGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCAGA-3’     4243
IE41(脊髓灰质炎病毒1型表位) 5’-GGATCTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCC-3’5’-TTAGGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCAGATCC-3’     4445
IE43(脊髓灰质炎病毒1型表位) 5’-GGAGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCTAGGTGGCCC-3’5’-TTAGGGCCACCTAGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCTCC-3’     4647
IE44(脊髓灰质炎病毒1型表位) 5’-GGAGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCTAGGTTCTCC-3’5’-TTAGGAGAACCTAGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCTCC-3’     4849
IE45(脊髓灰质炎病毒1型表位) 5’-GGAGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCTATCTCC-3’5’-TTAGGAGATAGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCTCC-3’     5051
IE46(脊髓灰质炎病毒1型表位) 5’-GGAGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCTATCTGGTCC-3’5’-TTAGGACCAGATAGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCTCC-3’     5253
IE47(脊髓灰质炎病毒1型表位) 5’-GGAGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGCTATCTAGTCC-3’5’-TTAGGACTAGATAGCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCTCC-3’     5455
*Crompton等，1994 J.Gen.Vir.75:133-139。
构建相关的质粒主链和病毒。构建含有xylE基因而不是六邻体基因HVR5环的中间质粒主链，以便于随后对HVR5环操作。为此，根据Crouzet等(1997，见上)所述的方法，将穿梭质粒IE28与质粒主链pXL3006(该质粒含有可被PacⅠ切割的缺失了E1E3的腺病毒基因组，其中CMV-lacZ表达盒替代了E1区)在G4977细菌菌株中重组，获得质粒主链IE28c，后者与质粒主链pXL3006不同在于含有xylE的HVR5序列。
然后，采用“xylE筛选”将IE30-IE47所有穿梭质粒与质粒主链IE28c重组，获得质粒主链IE30c-IE47c。在用PacⅠ酶切割后，使用Lipofectamine(Gibco BRL)将2μg(或5μg)这些消化主链转染911细胞(或293细胞)，产生相应的病毒AdIE30-AdIE47。这些HVR5修饰的E1E3缺失的腺病毒因此表达相同的CMV-lacZ表达盒。
所有其它HVR5修饰的腺病毒(如表现uPAR结合肽或整联蛋白结合肽；见后面的实施例)均采用相同策略构建。
细胞和抗体。293和W162细胞在添加了10％胎牛血清的MEM(Gibco BRL)中维持。911细胞(Fallaux等，1996,Hum.Gene Ther.7:215)在添加了10％胎牛血清的DMEM中生长。抗Blondel等(Blondel等，1983，病毒学126:707)所述的1型脊髓灰质炎病毒的C3单克隆抗体(C3 mAb)由R.Crainic博士(Pasteur研究所，巴黎，法国)提供。抗全Ad5衣壳的L5兔多克隆抗体由RPR-Gencell’sfacilities(RPR SA,Vitry，法国)生产。
病毒。所有病毒均按照经典方法在E1反向互补细胞(如293细胞)中扩增。病毒的模式/特性通过对用Hirt程序获得的病毒DNA进行插入片段的限制分析和测序来控制。病毒原种在293细胞中制备，通过CsCl梯度纯化，用PD10柱(Pharmacia)脱盐并于补充了10％甘油的PBS中保存在-80℃。生物学定量通过在感染W162细胞2天后用X-Gal染色(Dedieu等，1997，病毒学杂志71:4626)计数911细胞上的噬斑形成单位(PFU)和/或计数lacZ转导单位(TDU)来进行。物理学定量通过阴离子交换计数病毒颗粒(VP)来进行。
中和测试。将0.5μg抗脊髓灰质炎病毒C3单克隆抗体与105TDU纯化病毒在PBS中于37℃温育1小时，然后将该混合物并入到6孔板中的W162细胞上，37℃再温育1小时。之后用PBS洗涤细胞，向该细胞中加入新鲜培养基，再将细胞在37℃温育2小时。细胞单层用甲醛(0.37％)-戊二醛(0.2％)固定，X-Gal染色，计数蓝色细胞。
免疫沉淀程序。将CsCl纯化病毒的病毒颗粒(1010)重悬于400μg非变性温育缓冲液(50mM Tris pH7.5,150mM NaCl,0.05％NP40)中，然后与0.1μg抗脊髓灰质炎病毒C3单克隆抗体在4℃温育1小时。然后加入400μg预先用温育缓冲液平衡过的蛋白A-Sepharose，再在4℃温育1小时。温育后，在微量离心机中短暂离心沉淀该混合物。沉淀块用1ml温育缓冲液洗涤两次，用1ml 10mM Tris pH7.5和0.1％NP40在4℃20分钟洗涤一次。含有蛋白A-抗体-病毒复合物的沉淀块重悬在50μg 1×Laemmli缓冲液中，煮沸2分钟，经过短暂离心收集上清液。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Novex)分析10μg上清液。根据ECL程序(Amersham)使用抗全Ad5衣壳的L5兔多克隆血清进行Western印迹。
                      结果
修饰HVR5环的构建策略。制备两个系列的构建体。第一个系列设计成通过用大小相差很大的其它Ad血清型的HVR5环替代Ad5 HVR5环来评价Ad5 HVR5环接受外源序列的“能力”。
表2．基于Ad5的具有异种特异性(heterospecific)HVR5环的腺病毒。
病毒 HVR5序列 替代Ad5 HVR5环的序列 SEQ ID NO:
 AdIE30  Ad2:14aa  NTTSLNDRQGNATK  56
 AdIE32  Ad30:6aa  STTINI  57
 AdIE33  Ad19:17aa  TPGANPPAGGSGNEEYK  58
作为生存力对照，我们导入了Crompton等人(1994,J.Gen.Virol.75:133-139)发表的修饰，其中导入了3型脊髓灰质炎病毒表位替代包含更大的缺失的HVR5。重要的是，Crompton病毒最初通过含有Ad2修饰六邻体的质粒和基于Ad5的腺病毒基因组之间的同源重组来构建。因此，该病毒显示Ad2和Ad5之间的嵌合六邻体蛋白，其中多4个残基的HVR5缺失已被外源肽替代。为了复制尽可能接近的Crompton等人的构建体，通过EDRAG技术构建了基于Ad5的病毒(Ad IE31)，其中导入了Crompton等人的外源肽以替代Ad5六邻体第269-285位残基(TTEAAAGNGDNLTPKVV；SEQ ID NO:59)而不是TTEAAAGNGDNLT(SEQ ID NO:60)。
表3．对照病毒AdIE31的插入片段。
病毒 替代Ad5的HVR5环的序列
Ad IE31  NLDSLEQPTTRAQKPRLD(SEQ ID NO:61)
在第二系列的构建体中，用1型脊髓灰质炎病毒的中和线性表位(DNPASTTNKDK；SEQ ID NO:62)替代了HVR5环(第269至281位aa)。该模型结合肽插入各种相邻环境中(即使用各种由亮氨酸和/或甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的接头)，以评价它们对病毒生存力和肽可及性的重要性。
表4.1型脊髓灰质炎表位在HVR5环中的插入片段。
病毒 上游接头 所用表位 下游接头 SEQ ID NO:
 AdIE35 无  DNPASTTNKDK  L  63
 AdIE37  G  DNPASTTNKDK 无  64
 AdIE40  S  DNPASTTNKDK 无  65
 AdIE41  G S  DNPASTTNKDK 无  66
 AdIE43  G  DNPASTTNKDK  LGG  67
 AdIE44  G  DNPASTTNKDK  LGS  68
 AdIE45  G  DNPASTTNKDK  LS  69
 AdIE46  G  DNPASTTNKDK  LSG  70
 AdIE47  G  DNPASTTNKDK  LSS  71
病毒的生存力。含有Ad2、Ad19或Ad30的HVR5环而不是Ad5HVR5环的3个病毒和含有1型脊髓灰质炎病毒表位的9个嵌合病毒是能生存的。没有观察到繁殖力丧失。出乎意料地，尽管进行了巨大的努力，对照病毒Ad IE31仍不能回收。
通过免疫沉淀测定评价脊髓灰质炎病毒表位的可及性。在非变性条件下使用同源抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体(C3 mAb)对携带脊髓灰质炎病毒表位的病毒进行免疫沉淀实验。下表5总结了获得的数据：
表5．
    病毒  在HVR5环中插入的肽     免疫沉淀
 AdIE35  DNPASTTNKDK-L     -
 AdIE37  G-DNPASTTNKDK     -
 AdIE40  S-DNPASTTNKDK     -
 AdIE41  GS-DNPASTTNKDK     -
 AdIE43  G-DNPASTTNKDK-LGG     ++
 AdIE44  G-DNPASTTNKDK-LGS     ++
 AdIE45  G-DNPASTTNKDK-LS     ++
 AdIE46  G-DNPASTTNKDK-LSG     ++
 AdIE47  G-DNPASTTNKDK-LSS     ++
由此发现脊髓灰质炎病毒表位下游接头的存在对于C3 mAb结合修饰的病毒衣壳是关键的，这很可能因为它允许结合肽在六邻体表面正确的呈递和/或可及性。当免疫沉淀前将修饰的病毒变性时，所有这些病毒均被C3 mAb有效地免疫沉淀(未显示)。
通过中和测定评价脊髓灰质炎病毒表位的功能性。因为C3 mAb中和脊髓灰质炎病毒感染，所以我们期望它也能中和携带脊髓灰质炎病毒表位的Ad的感染性。在PBS中(即在天然条件下)将C3 mAb与整个系列的Ad IE病毒温育，然后感染W162猴细胞。数据显示在图1中。这些数据与免疫沉淀结果很好地关联起来，也就是说，所有能在非变性条件下结合C3 mAb的病毒也被该抗体中和。
                       讨论
数据显示，腺病毒HVR5环的修饰可允许修饰的六邻体与特异结合蛋白功能性和特异性地相互作用。然而，需要特定的插入模型，因为数据显示，结合肽表位的可及性(免疫沉淀测定)和功能性(中和测定)依赖于最小间隔/相邻序列。
与Crompton等人的结论相比，我们的结果也显示Ad5六邻体第269-285位aa的缺失对于病毒的生长和/或生存力有害。这可通过如下事实解释：第282-285位残基位于HVR5环下游的β-链中，它可能对于六邻体作为单体或三聚体的结构是必需的。因此，比Crompton等人所述方法更精确和严格的本方法出乎意料地克服了该文献的缺点，并提供具有修饰趋性的可存活病毒(见下文)。
              实施例2：尾丝HI环的操作
对Ad5尾丝的HI环进行缺失：从尾丝头部除去的序列包括第538-548位残基(即序列GTQETGDTTPS)(SEQ ID NO:72)。因此其侧翼序列是TLN(上游)和AYS(下游)。
                     材料和方法
为操作尾丝HI环构建穿梭质粒。使用下列两对引物制备含有HI环侧翼区并且其中HI环被xylE基因替代的第一个中间质粒pJD3:HIgu1(5’-CAGCTCCATCTCCTAACTGTAGACTAAATG-3’)(SEQ IDNO:73)和HIgd1(5’-GGTTACCGGTTTAGTTTTGTTCCGTTTAA-3’)(SEQ IDON:74)，和HIdu1(5’-AGCGCTTACTCTATGTCATTTTCATGGGAC-3’)(SEQ IDNO:75)和HIdd1(5’-GAGTTTATTAATATCACTGATGAGCGTTTG-3’)(SEQ IDNO:76)。
按照标准PCR技术，使用这些引物对扩增分别相当于Ad5基因组(Genbank登记号M73260)第32255-32634位和第32712-33090位核苷酸的尾丝和E4orf7基因的一部分。引物HIgd1和HIdu1的设计使其分别产生限制性位点BstEⅡ和Eco47Ⅲ，而不修饰HI环紧邻的尾丝蛋白序列。这些位点将用于外源肽直接亚克隆至HI中(见下文和表5)。将每个PCR产物克隆至质粒pCR2.1(Invitrogen)中，分别产生质粒PCR2.1-H4和PCR2.1-I2，然后测序。
将含有xylE基因表达盒的质粒pαxylEΩ用EcoRⅠ限制酶消化，T4 DNA聚合酶平端化，再用HindⅢ消化。该DNA片段亚克隆至HindⅢ消化的PCRⅡ(Invitrogen)中，产生质粒IE23。将IE23的NsiⅠ-XhoⅠ片段导入NsiⅠ-XhoⅠ消化的PCR2.1-H4质粒中，产生质粒pJD2。最后，将pJD2的SacⅠ-XbaⅠ片段和PCR2.1-I2的SpeⅠ-XhoⅠ片段克隆至SacⅠ-SalⅠ切割的已报道质粒pXL2756(Crouzet等人，见上)中，产生穿梭质粒pJD3。
所有HI环被修饰的质粒均通过用双链寡核苷酸替代xylE基因从质粒pJD3获得。简而言之，将互补单链寡核苷酸退火形成双链，并克隆至BstEⅡ-Eco47Ⅲ消化的pJD3中。使用表型筛选，其基于表达xylE的细菌在喷洒了0.5M儿茶酚后显黄色。下表列出了所用的寡核苷酸和相应的穿梭质粒的名称：
表5．用于替代HI环的寡核苷酸的例子。
穿梭质粒 寡核苷酸 SEQIDNO:
pJD7(Ad5的HI环)  5’-GTAACACTAACCATTACACTAAACGGTACCCAGGAAACAGGAGACACAACTCCAAGT-3’5’-ACTTGGAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGGGTACCGTTTAGTGTAATGGTTAGT-3’  7778
 pJD5(Ad2的HI环)  5’-GTAACACTAACCATTACACTAAACGGTACCAGTGAATCCACAGAAACTAGCGAGGTAAGC-3’5’-GCTTACCTCGCTAGTTTCTGTGGATTCACTGGTACCGTTTAGTGTAATGGTTAGT-3’  7980
 pJD6(Ad9的HI环)  5’-GTAACACTAACCATTACACTAAACCAAGAAACACAATGTGAA-3’5’-TTCACATTGTGTTTCTTGGTTTAGTGTAATGGTTAGT-3’  8182
 pCF1(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGAGC-3’5’-GCTCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  8384
 pCF2(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGGGAAGC-3’5’-GCTTCCCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  8586
 pCF3(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGTCAAGC-3’5’-GCTTGACTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  8788
 pCF4(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGGGCGGAAGC-3’5’-GCTTCCGCCCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  8990
 pCF5(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGTCATCTAGC-3’5’-GCTAGATGACTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  9192
 pCF6(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGGGATCCAGC-3’5’-GCTGGATCCCTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  9394
 pCF7(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAGTCAGGAAGC-3’5’-GCTTCCTGACTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  9596
 pCF8(1型脊髓灰质炎病毒的表位)  5’-GTAACCCTAACCATTACACTAAACGGTGATAACCCAGCGTCGACCACGAATAAGGATAAG-3’5’-CTTATCCTTATTCGTGGTCGACGCTGGGTTATCACCGTTTAGTGTAATGGTTAGG-3’  9798
构建相关的质粒主链和病毒。首先构建含有xylE基因而不是尾丝基因HI环的中间质粒主链，以便于随后筛选显示修饰HI环的任何质粒主链。为此，根据Crouzet等人(见上)所述的方法，将穿梭质粒pJD3与质粒主链pXL3006在G4977细菌菌株中重组，获得质粒主链pBX，因而后者显示可被PacⅠ切割的缺失了E1E3的腺病毒基因组，它含有替代E1的CMV-LacZ表达盒以及位于HI环中的xylE标志。
然后，采用“xylE筛选”将穿梭质粒pJD5、7、6和pCF-pCF8与质粒主链pBX重组，获得质粒主链pBV2、5、9和pBC1-pBC8。在用PacⅠ酶切割后，使用Lipofectamine(Gibco BRL)将2μg(或5μg)DNA转染911细胞(或293细胞)，产生相应的病毒vBV2、5、9和vBC1-vBC8。
其它方法。细胞、抗体、病毒、免疫沉淀测定和中和测定见上文
实施例1。
                         结果
HI环插入载体的构建策略。制备两个系列的构建体。第一个系列设计成通过用大小有些不同的其它Ad血清型的HI环替代Ad5 HI环来评价Ad5 HI环接受外源序列的“能力”。
表6．尾丝蛋白HI环中容纳插入片段的能力。
病毒  HI序列 替代Ad5HI环的序列 SEQ ID NO:
vBV2  Ad2:12aa  GTSESTETSEVS  99
vBV5  Ad5:11aa  GTQETGDTTPS  100
vBV9  Ad9:6aa  QETQCE  101
在第二系列的构建体中，用1型脊髓灰质炎病毒的中和表位(DNPASTTNKDK；SEQ ID NO:62)替代HI环。由于处于其天然环境/蛋白质中的Ad5 HI环和脊髓灰质炎病毒序列的N端一侧具有非常接近的3D结构，因而在表位上游加入一个最小单残基接头(甘氨酸)。插入位点的下游则不是这样，其包括不同长度和组成的间隔，以评价它们对病毒生长和肽可及性的影响。
表7.1型脊髓灰质炎病毒表位在HI环中的插入片段。
病毒 所用表位 下游接头 SEQ ID NO:
vBC1  DNPASTTNKDK  S  102
vBC2  DNPASTTNKDK  GS  103
vBC3  DNPASTTNKDK  SS  104
vBC4  DNPASTTNKDK  GGS  105
vBC5  DNPASTTNKDK  SSS  106
vBC6  DNPASTTNKDK  GSS  107
vBC7  DNPASTTNKDK  SGS  108
vBC8  DNPASTTNKDK 无  109
病毒生存力。含有Ad2、Ad5或Ad9的HI环而不是Ad5 HI环的3个病毒和含有脊髓灰质炎病毒表位的9个嵌合病毒是能生存的。没有观察到繁殖力丧失。
通过免疫沉淀测定评价脊髓灰质炎病毒表位的可及性。在非变性条件下使用同源抗脊髓灰质炎病毒C3 mAb对携带脊髓灰质炎病毒表位的病毒进行免疫沉淀实验。下表总结了这些数据：
表8．通过C3 mAb的免疫沉淀检测到的导向序列的识别
病毒 在HI环中插入的肽 免疫沉淀
vBC1  G-DNPASTTNKDK-S -
vBC2  G-DNPASTTNKDK-GS +/-
vBC3  G-DNPASTTNKDK-SS +
vBC4  GDNPASTTNKDK-GGS ++
vBC5  G-DNPASTTNKDK-SSS ++
vBC6  G-DNPASTTNKDK-GSS ++
vBC7  G-DNPASTTNKDK-SGS ++
vBC8  G-DNPASTTNKDK -
这些数据显示，C3 mAb抗体与修饰衣壳的结合关键取决于最小长度间隔序列的存在。特别是，下游的3残基接头赋予了最有效的结合。当免疫沉淀前将这些病毒变性时，所有这些病毒均能结合C3 mAb抗体(未显示)。
通过中和测定评价脊髓灰质炎病毒表位的功能性。然后评价C3mAb中和尾丝修饰病毒的感染性的能力，以确定它是否与实施例1中所举例说明的六邻体修饰衣壳的免疫沉淀数据相关联。但是，与六邻体修饰的结果不同，任何尾丝修饰病毒与C3 mAb温育后均没有感染性抑制(数据未显示)。特别是，在病毒体表面只有12个尾丝三聚体，而六邻体三聚体有240个。因此，抗体结合六邻体修饰衣壳的密度可直接降低病毒感染性，或者导致五邻体基座的RGD基序的空间障碍，因而影响整联蛋白介导的内化作用。无论何种情况，C3 mAb对HI修饰衣壳的特异结合不妨碍该病毒与其靶细胞之间的天然相互作用。
                      讨论
数据说明腺病毒HI环可被外源肽替代，而且相应的病毒是：ⅰ)可存活的，和ⅱ)对病毒的繁殖力没有剧烈影响。数据还说明导入肽的特异性识别需要适合的邻近接头(如最小尺寸的柔性接头)。
         实施例3：尾丝蛋白长度的修饰--短尾丝
考虑到Ad5(长尾丝血清型)与其它血清型如Ad9(短尾丝血清型)的细胞结合途径之间的差异，可通过设计杂合尾丝(用另一种短尾丝血清型Ad3的轴替换Ad5的轴)或缩短的Ad5轴(仅保留天然蛋白质中的6或9个重复而不是22个重复)，修饰尾丝轴的长度。
                    材料和方法
构建具有缩短尾丝的穿梭质粒。构建了三个含有缩短尾丝的穿梭质粒。其中两个质粒(pSF1和pSF2)表现出在尾丝轴中有大的缺失，而第三个质粒(pIF1)包含Ad3的轴而不是Ad5的轴。因此所有的构建体均保留了Ad5的尾和头部结构域。
为构建pSF1，使用了两对引物：5M3g(5’-ATTTCTGTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3’)(SEQ IDNO:110)和5M3d(5’-GTTTGACTTGGTTTTTTTGAGAGGTGGGCT-3’)(SEQID NO:111)，以及5M17g(5’-TTGGATATTAACTACAACAAAGGCCTTTAC-3’)(SEQID NO:112)和5M17d(5’-GAAACTGGAGCTCGTATTTGACTGCCACAT-3’)(SEQID NO:113)。
根据标准PCR技术，使用这些引物扩增部分尾丝基因，即分别相应于Ad5基因组(Genbank登记号M73260)的第30885-31329位核苷酸和第31936-32351位核苷酸的部分。由于分别含有限制性位点SalⅠ和SacⅠ，引物5M3g和5M17d与Ad5的序列稍有不同。通过SalⅠ或SacⅠ消化后，这些PCR产物被连接并克隆至SalⅠ-SacⅠ切割的pXL2756中，获得质粒pSF1，其表现出一个包含了第4-16个轴重复的符合读框的缺失。
为构建pSF2，使用了两对引物：5M3g(5’-ATTTCTGTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3’)(SEQ IDNO:114)和5M3d(5’-GTTTGACTTGGTTTTTTTGAGAGGTGGGCT-3’)(SEQID NO:115)，以及5M20g(5’-CTCAAAACAAAAATTGGCCATGGCCTAGAA-3’)(SEQID NO:116)和5M20d (5’-ATCCAAGAGCTCTTGTATAGGCTGTGCCTT-3’)(SEQID NO:117)。
根据标准PCR技术，使用这些引物扩增部分尾丝基因，即分别相应于Ad5基因组的第30885-31329位核苷酸和第32110-32530位核苷酸的部分。由于分别含有限制性位点SalⅠ和SacⅠ，引物5M3g和5M20d与Ad5的序列稍有不同。通过SalⅠ或SacⅠ消化后，这些PCR产物被连接并克隆至SalⅠ-SacⅠ切割的pXL2756中，获得质粒pSF2，其表现出一个包含了第4-19个轴重复的符合读框缺失。
采用Horton等人(4)描述的基因SOEing法构建pIF1质粒，其中该方法包括在不依赖限制性位点的情况下通过PCR重组DNA序列。为构建含有杂合尾丝基因，即由Ad5的尾和头部以及Ad3的轴所组成的pIF1质粒，必需5个连续步骤。含有Ad5尾丝尾的第一PCR产物通过使用以下引物从Ad5基因组扩增获得：SOE35Tg(5’-TACAAGTCGACAACCAAGCGTCAGAAATTG-3’)(SEQ ID NO:118)和SOE35Td(5’-AAGACTTAAAACCCCAGGGGGACTCTCTTG-3’)(SEQ ID NO:119)。
除了引入SalⅠ位点而稍有修饰外，引物SOE35Tg与Ad5第30660-30689位核苷酸基本匹配。SOE35Td引物中的15个有下划线的碱基与Ad3尾丝轴第一个重复的序列相匹配，而剩余的15个碱基相应于Ad5尾丝尾末端的序列。
含有Ad3尾丝轴的第二PCR产物通过使用以下引物从Ad3尾丝基因扩增获得：SOE35Sg(5’-GAGAGTCCCCCTGGGGTTTTAAGTCTTAAA-3’)(SEQ ID NO:120)和SOE35Sd(5’-GGTCCACAAAGTGTTATTTTTCAGTGCAAT-3’)(SEQ ID NO:121)。
两个引物中有下划线的碱基包含在Ad5的尾丝基因中(分别在尾和头部亚结构域中)，而剩余碱基来自Ad3的轴。
含有Ad5尾丝头部的一部分的第三PCR产物通过使用以下引物从Ad5尾丝基因扩增获得：SOE35Kg(5’-CTGAAAAATAACACTTTGTGGACCACACCA-3’)(SEQ ID NO:122)和SOE35Kd(5’-TCCTGAGCTCCGTTTAGTGTAATGGTTAGT-3’)(SEQ ID NO:123)。
SOE35Kg引物中有下划线的碱基与Ad3尾丝轴的最后一个重复的序列相符，而剩余序列相应于Ad5尾丝头部的开头核苷酸。引物SOE35Kd与Ad5第32634-32663位核苷酸基本匹配，其仅有的修饰导致产生一个SalⅠ位点。在PCR条件下将两个第一PCR产物混合，变性并再退火，以便第一个产物的上链和第二个产物的下链重叠并相互充当引物。该重叠物经聚合酶延伸后形成杂种产物。在SOE反应中包含引物SOE35Tg和SOE35Sd可使重组产物在形成后立即被PCR扩增(见Horton等人的图，见上)。这样产生的PCR产物含有后接Ad3轴的Ad5尾。最后，采用引物SOE35Tg和SOE35Kd对上一个PCR产物和第三PCR产物进行同样的SOE操作，产生的DAN片段含有由Ad5尾、Ad3轴和Ad5头部的一部分组成的杂合尾丝，而且片段的两侧具有独特的限制性位点SalⅠ和SacⅠ(图2)。该最终PCR产物经这些酶消化后，被克隆至SalⅠ-SacⅠ切割的pXL2756质粒中，获得pIF1穿梭质粒。
对质粒pSF1、pSF2和pIF1均进行了测序。
构建相关质粒主链和病毒。根据Crouzet等人(见上)所描述的方法，在G4977细菌菌株中用质粒主链pXL3006(含有一个替代E1区的CMV-lacZ表达盒的PacⅠ可切割的缺失E1E3的重组腺病毒基因组)重组三个穿梭质粒pSF1、pSF2和pIF1，分别获得质粒主链pBS1、pBS2和pBI1。PacⅠ切割后，使用Lipofectamine(Gibco BRL)向911细胞(或293或PER.6细胞)转染2μg(或5μg)DNA，产生相应的病毒vBS1、vBS2和vBI1。此外，通过穿梭质粒IE28与质粒主链pBI1、pBS1和pBS2之间的同源重组构建了中间质粒主链AE31、AE32和AE33。含有替代HVR5六邻体环的xylE表达盒并具有短轴尾丝的这些质粒主链可再用于促进回收同时含有短轴尾丝和HVR5修饰的六邻体(例如，具有UPAR-或整联蛋白结合肽的插入片段；见实施例10)的质粒主链。
同时，通过穿梭质粒pJD3和pBI1、pBS1和pBS2质粒主链之间的重组构建了中间质粒主链AE34、AE35和AE36。这些质粒主链再用于促进回收同时含有短轴尾丝和HI修饰的尾丝(例如，具有UPAR-或整联蛋白结合肽的插入片段)的质粒主链。
其它方法。细胞、抗体、病毒、免疫沉淀测定、和中和测定均与实施例1中所描述的相同，见上。
                     结果和讨论
预测具有缩短尾丝蛋白的病毒将增加暴露在六邻体表面的结合肽的可及性和/或降低野生型(即天然)病毒/细胞的相互作用。这些构建体总结在表9中。
表9．具有缩短的尾丝蛋白的腺病毒
病毒     嵌合尾丝的结构
vBI1 Ad5尾-Ad3轴-Ad5头部
vBS1 来源于Ad5的短轴尾丝(包含第4-16个轴重复的缺失)
vBS2 来源于Ad5的短轴尾丝(包含第4-19个轴重复的缺失)
在所有的三种情况中病毒的繁殖力均极大地降低(尽管程度不同)，这极有可能是因为修饰的尾丝与其细胞受体不能有效地发生相互作用。实际上，293感染细胞中的正常病毒DNA复制参数(即Xgal阳性)和病毒晚期蛋白的正常积累均支持该缺陷发生在这样的早期阶段。此外，非变性情况下的Western印迹说明在所有三种情况中均出现了修饰尾丝的正确三聚体化。
尽管vBS1与CAR(柯萨奇病毒(Coxsackie)和腺病毒受体)阳性细胞结合的效率较低，然而可在PER.C6中将其扩增至实验室规模的量。正如图3所显示，还观察到，与具有天然Ad5尾丝的对照病毒相比，用vBS1感染293细胞导致细胞转导降低10倍，这表明Ad受体结合的大量丧失。在此实验中，将293细胞与PBS或纯化的尾丝头部(100μg/ml)一起于室温温育30分钟，之后以50moi(VP/细胞)于室温进行30分钟感染。然后细胞用PBS洗涤两次后，再次于37℃在培养基中温育24小时，之后制备蛋白提取物。然后定量特异lacZ表达(单位/蛋白提取物)。
基于这些数据，给C57/B16小鼠静脉内注射vBS1构建体或其对照病毒(具有未修饰轴)，以确定主要器官中lacZ表达的分布。通过组织化学分析了肝、心脏、和肺中的β-半乳糖苷酶表达。结果在下面的表10中给出(XGal阳性细胞的百分数：平均值和数值范围)。
表10．主要器官中转基因表达的分布
注射剂量(VP)     对照病毒     vBS1
    肝 3.109(n=5)1010(n=5)3.1010(n=5) 15(10-20)50(50-60)50(20-80)     0(0-0)5(2-5)15(10-20)
    心脏 3.109(n=5)1010(n=5)3.1010(n=5)     000     000
    肺 3.109(n=5)1010(n=5)3.1010(n=5)     000     000
这些数据显示，在肝中对于两个腺病毒均有剂量-反应效应，而任何处理组的心脏和肺组织中均没能发现XGal阳性细胞。最有趣的是，尾丝轴的缩短导致了肝转导降低10倍，这强调了操作尾丝轴以使感染主要指向体内目的器官/细胞的有用性，条件是重组腺病毒已装备了其它不依赖CAR的进入途径。
实施例4：表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的细胞的特异导向
在六邻体HVR5和尾丝HI环中包含，或是在尾丝蛋白的C末端添加各种高亲合性uPAR结合肽。这些肽可来自野生型ATF(Rettenberg等，1995,Biol.Chem.Hoppe-Seyler 376:587-594)和突变ATF(Magdolen等人，1996,Eur.J.Biochem.237:743-751)、噬菌体文库(Goodson等，1994，美国国家科学院院报91:7129-7133)、和相关突变体、或人的玻连蛋白(Waltz等人，1997，J.Clin.Invest.100:58-67)。所有病毒均含有插入替代E1基因的基因表达盒(lacZ或Gax)。
在六邻体HVR5环和尾丝蛋白HI环中插入这些肽的方法与上述实施例1和2中就脊髓灰质炎病毒表位所述相同。尾丝蛋白的缩短可按实施例3所述方法进行。其它材料和方法描述如下。
PER.C6细胞前培养
在含有10％FCA和10mM MgCl2的Dulbecco改良培养基(DMEM)中37℃于10％CO2气氛中培养PER.C6细胞(Fallaux等人，1998,Hum Gene Ther,9:1909-1917)。
重组腺病毒基因组
按法国专利申请FR 2 730 504所述方法采用EDRAG技术，在大肠杆菌中通过同源重组将重组腺病毒基因组克隆至RK2衍生质粒中。按WO 97/10343中所述方法，通过在自杀穿梭质粒中用R6K的复制起点替换ColE1复制起点简化该技术，因为这种替换使得可在任何recA+大肠杆菌菌株中进行重组。通过在合适的限制性位点插入Ad5序列以及采用顺序PCR对序列进行修饰，来构建自杀质粒(也称为穿梭质粒)。通过限制性酶作图和Southern分析评价EDRAG构建体的完整性。涉及PCR扩增或同源重组的区域通过序列分析来证实。
质粒主链pXL3215是一长57.8kb的RK2衍生质粒，含有一个基于Ad5的可被PacⅠ切割的E1和E3缺失的基因组(法国专利申请FR2 730 504)，其中在该基因组中替代E1区有一个处于Rous肉瘤病毒启动子控制下的大肠杆菌lacZ基因。通过利用自杀穿梭质粒pXL3521将大肠杆菌lacZ表达盒更换成人的GAX表达盒，从pXL3215衍生出质粒pXL3527；这样就导致了AV1.0CMV.Gax腺病毒的产生。质粒pXL3497来源于质粒pXL2689(Crouzet等人，美国国家科学院院报，1997,94:1414-1419)，并在尾丝蛋白的C端表现出一个(Gly-Ser)5-(Lys)7肽。经PacⅠ限制酶切并转染El反式互补细胞后，该主链用于产生病毒AV1.kCMV.lacZ，该病毒与Wickham等人(1997，病毒学杂志(J.Virol.),71:8221-8229)所描述的AdZ.F(pK7)bgal一致。
腺病毒的生产和定量
在T25cm2摇瓶中存在LipofectAMINE时用腺病毒基因组转染PER.C6细胞。简单地说，将在水中稀释的5μg PacⅠ消化的DNA质粒与23μg Lipofectamine混合。轻柔混匀后，悬浮液在室温温育30分钟。同时，用磷酸盐缓冲的盐水洗涤50-60％汇合的细胞两次，之后将磷酸盐缓冲的盐水替换成加入了3.8ml无血清DMEM的LipofectAMINE/DNA混合物。细胞在37℃温育5-8小时后，将培养基换成含有10％胎牛血清和10mM MgCl2的DMEM。转染后三天，分离细胞并转移至一个T75cm2摇瓶中。(第10-14天)在完全CPE时收获细胞和上清液，并冻融三个循环，之后离心收集上清液。EDRAG技术产生同源(即克隆)群体；因此不需要进行噬斑纯化。
通过在琼脂糖凝胶型支持物上进行层析，精确定量腺病毒颗粒。
在T150cm2摇瓶中，用重组腺病毒以每细胞10-100个病毒颗粒的MOI感染大约70％汇合的PER.C6细胞。当致细胞病变效应完全时，收获细胞和上清液，冻融3个循环，离心并收集上清液。在某些情况下，必需采用回收程序(见下文)。
在各种来源(尤其是人的平滑肌细胞和内皮细胞来源)的原代细胞，以及由于其细胞表面表达有限水平的腺病毒受体而对感染耐受的一组人和非人肿瘤细胞系中，体外评价修饰病毒的感染性(见实施例8和10)。当使用易于受到Ad5感染的细胞时，将重组头部用作竞争剂。
通过在HI环中插入导向uPAR的肽修饰的病毒
缺失Ad5尾丝的第538-548位残基(GTQETGDTTPS)(SEQ IDNO:72)，并将其替换成6种具有GAS接头侧翼的不同肽。相应的穿梭质粒、质粒主链和病毒的构建按实施例2所述进行。所有的病毒均可存活，但一些(尤其是病毒AE43、AE44和AE45)与其未修饰对照病毒相比表现出改变的稳定性。然而，可通过采用如下程序获得与对照病毒可比的产量(即10000-20000VP/细胞)：感染后3天收获PER.C6细胞，并用温和缓冲液(pH7.5 10mM Tris,1mM MgCl2,1％Tween 20,0.25M NaCl)替代连续的冻融循环进行细胞裂解；然后通过CsCl梯度超离心纯化病毒。
表11：uPAR导向肽插入HI环
腺病毒质粒 所选的肽 有接头的肽序列 SEQ IDNO:
 pAE42 ATF结构域(成熟人尿激酶的第14-22位氨基酸) gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser 16
 pAE45 突变ATF结构域(对uPAR的亲合性增加) gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser 17
 pAE48 通过噬菌体展示选择的肽 gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser 19
 pAE46 上面所选肽的突变物 gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser 18
 pAE43 人玻连蛋白的uPAR结合肽(Vn4) gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser 20
 pAE44 人玻连蛋白的uPAR结合肽(Vn3) gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser 21
通过在HVR5环中插入导向uPAR的肽修饰的病毒
用两侧均具有合适接头(gly-ser)的上述6种uPAR结合肽替换Ad5六邻体的第269-281位残基(TTEATAGNGDNLT)(SEQ ID NO:125)。相应的质粒主链和腺病毒的构建按实施例1所述进行。所有的病毒均可存活。一些构建体(例如AE27、AE28)表现出某种不稳定性，故对其进行相应的纯化(见上)。
表12:uPAR导向肽插入HVR5环
腺病毒质粒 所选的肽 有接头的肽序列 SEQ ID NO:
pAE26 ATF结构域 gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser 7
pAE29 突变ATF结构域 gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser 8
pAEA7 通过噬菌体展示选择的肽(Goodson等人，1994,PNAS91:7129-7133) gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser 10
pAE30 上面所选肽的突变体 gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser 9
pAE27 人玻连蛋白的uPAR结合肽(Vn4) gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser 11
pAE28 人玻连蛋白的uPAR结合肽(Vn3) gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser 12
通过在HI环中插入导向uPAR的肽修饰的并含有缩短尾丝的病毒
按如上所述，缺失Ad5尾丝的第538-548位残基(GTQETGDTTPS)(SEQ ID NO:72)，并将其替换成两侧具有适合接头(gly-ser-ser)的6种uPAR结合肽。按下表中的总结，将这些修饰与缩短的尾丝轴(见实施例3)相结合。
表13：通过插入uPAR导向肽修饰了HI环的短尾丝病毒的类型
 尾     轴     头部修饰
Ad5尾 Ad3轴 Ad5 HI环插入
Ad5尾 Ad5的第1-3个和第17-22个重复 Ad5 HI环插入
Ad5尾 Ad5的第1-3个和第20-22个重复 Ad5 HI环插入
通过在HVR5环中插入导向uPAR的肽修饰的并含有缩短尾丝的病毒
按如上所述，用6种具有适合接头(gly-ser)侧翼的不同肽替换Ad5六邻体的第269-281位残基。如上所述，这些修饰再与尾丝轴的缩短相结合。
例如，病毒AE65含有一个替代了六邻体HVR5并具有gly-ser接头侧翼的NQNSRRPSRA肽(SEQ ID NO:6)，并表现出缩短的尾丝(包含第4-16个重复的轴缺失)。另一个例子是病毒AE63，其与AE65基本一致，只是该病毒所包含的肽是DCRGDCF肽而不是Vn3肽(见
实施例10，图13)。
通过在C端添加一个8氨基酸的接头和之后的导向uPAR的肽使导向受到修饰的病毒
用接头的脯氨酸密码子替换尾丝的终止密码子。在所有构建体中使用的接头序列均是PKRARPGS。
通过修饰向尾丝蛋白编码序列的3’末端引入一个FspⅠ位点。使用PCR诱变产生一个单碱基替换(第32778位核苷酸)，该替换产生一个引入新的FspⅠ识别位点的沉默突变。采用引物MOL1(5’-ggaactttagaaatggagatcttactgaagg-3’)(SEQ ID NO:126)和引物MOL3(5’-cgattctttattcttgcgcaatgtatgaaaaag-3’)(SEQ ID NO:127)，从Ad5基因组扩增Ad5尾丝头部。除了引入FspⅠ限制性位点而稍有修饰外，引物MOL3与Ad5的第32762-32794位核苷酸基本匹配。将该扩增产物导入pCR2.1(Invitrogen)中产生pMA51。
采用寡核苷酸MOL2(5’-cttaagtgagctgcccggggag-3’)(SEQ IDNO:128)和MOL4(5’-ggatccaatgaacttcatcaagt-3’)(SEQ ID NO:129)，通过PCR诱变修饰尾丝蛋白编码序列终止密码子下游的区域，以在polyA区上游引入AatⅡ、NruⅠ、SpeⅠ限制性位点，然后将该区域克隆至pCR2.1(Invitrogen)中产生pMA52。
编码接头肽的序列通过如下两个单链寡核苷酸的退火产生：MOL7(5’-aattctgcgcaagaaccaaagagggccaggcccggatcctaagacgtct-3’)(SEQ ID NO:130)和MOL8(5’-ctagagacgtcttaggatccgggcctggccctctttggttcttgcgcag-3’)(SEQ ID NO:131)。将该双链体克隆在pBSSK+(Stratagene)的EcoRⅠ和XbaⅠ位点中，产生pMA53。
最后，通过把pMA51的BglⅡ-FspⅠ片段和pMA52的FspⅠ-XbaⅠ片段克隆至pXL2756的BamHⅠ和XbaⅠ位点中，将该接头序列引入尾丝蛋白编码序列的3’末端，产生载体pMA55。
通过把pMA52的SmaⅠ-AatⅠ片段克隆至pMA55的SmaⅠ-AatⅠ限制性位点中构建穿梭载体pMA56。根据Crouzet等人(见上)所述的方法，在G4977细菌菌株中用质粒主链pXL3006重组穿梭质粒pMA55，获得含有PacⅠ可切割的E1E3缺失的CMV/lacZ重组病毒基因组的质粒主链22.3，其中该基因组编码具有C端修饰的尾丝。
进行进一步克隆，以通过使用PKRARPGS接头在尾丝C端添加uPAR导向配体。简而言之，构建编码这些修饰的穿梭质粒，并根据EDRAG方法在G4977细菌菌株中使其与腺病毒质粒主链pXL3091(E1区替换为RSV-lacZ)、pXL3006(E1区替换为CMV-lacZ)或pXL3527(E1区替换为hGax表达盒)重组，产生具有lacZ或Gax表达盒和C端修饰尾丝蛋白的腺病毒主链。
除了bC12x外，在PacⅠ限制性酶切主链转染911、293或PER.C6细胞后，回收到所有预期的病毒。它们的繁殖力(VP/细胞)可与其未修饰的对照病毒相比。
表14：通过C-端添加一个紧接UPAR导向肽的8氨基酸接头修饰的病毒
腺病毒主链/病毒 所选肽 肽序列
bc9×(RSV lacZ) ATF结构域(第14-32位氨基酸) LNGGTCVSNKYFSNIHWCN
bc10×(RSV lacZ) 突变ATF结构域(第14-32位氨基酸) LNGGTAVSNKYFSNIHWCN
bc12×(RSV lacZ) 通过噬菌体展示选择的肽 AEPMPHSLNFSQYLWYT
bc11×(RSV lacZ) 上面选择的肽的突变体 AEPMPHSLNFSQYLWT
bc13×(RSV lacZ) 玻连蛋白uPAR结合域Vn3 NQNSRRPSRA
bc14×(RSV lacZ),bc15×(CMV lacz)和pXL3570(Gax) 玻连蛋白uPAR结合域Vn4 RGHSRGRNQNSR
在其它实验中，这些修饰按以上示例与尾丝轴的缩短相结合。实施例5：表达αv整联蛋白受体的细胞的特异导向
在尾丝HI六邻体和HVR5环中包含，或是在尾丝蛋白的C末端添加高亲合性αv整联蛋白结合肽(CDCRGDCFC，称为RGD-4C；也见Pasqualini等人，1997，自然生物技术(Nature Biotech.)15:542)和其变体(DCRGDCF，称为RGD-2C)。这些病毒含有插在E1区中的异源基因(lacZ)，所述E1区已从病毒中缺失。
在六邻体HVR5环和尾丝蛋白HI环中插入这些肽的方法在上述实施例1和2中就脊髓灰质炎病毒的表位已作过描述。
通过在HI环中插入导向αv整联蛋白的肽修饰的，具有或不具有缩短尾丝的病毒
缺失Ad5尾丝的第538-548位残基，并用具有GSS接头侧翼的肽替换。用含有CMVlacZ表达盒的腺病毒质粒主链转染PER.C6细胞；病毒AE60具有生存力并能在PER.C6细胞中以相应于对照病毒的繁殖力进行扩增，而PacⅠ消化的pAE59 DNA的反复转染没有产生相应的病毒，这暗示该特定构建体并不能有效生长。
表15：通过在HI环中插入导向αv整联蛋白的肽而被修饰的病毒
腺病毒主链 所选肽 具有接头的肽的序列 SEQ ID NO:
 pAE59  CDCRGDCFC(SEQ ID NO:124) gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser 22
 pAE60 DCRGDCF(SEQID NO:148) gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser 23
还可获得通过在HI环中插入导向αv整联蛋白的肽而被修饰的、具有缩短尾丝的病毒。
通过在HVR5环中插入导向αv整联蛋白的肽而被修饰的、具有或不具有缩短尾丝的病毒
缺失Ad5六邻体的第269-281位氨基酸，并用具有GSS接头侧翼的肽(使用与上表中所述相同的序列)替换。用含有lacZ或hGax表达盒的腺病毒质粒转染PER.C6或911细胞，从而获得所有3种病毒的回收。观察到293细胞中AE58和AE63病毒繁殖力的丧失，而AE57表现正常；这可能是由于AE58的六邻体的非正确折叠/稳定性、和AE63缩短的尾丝的Ad受体结合降低所致。
表16：通过在HVR5环中插入导向αv整联蛋白的肽而被修饰的，具有或不具有缩短尾丝的病毒
腺病毒主链 所选肽 具有接头的肽的序列 SEQ IDNO: 尾丝轴的特征
pAE58  CDCRGDCFC(SEQID NO:124) gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser 13 未修饰
pAE57(LacZ)和pXL3664(Gax)  DCRGDCF(SEQ IDNO:148) gly-ser-DCRGDCF-gly-ser 14 未修饰
pAE63  DCRGDCF(SEQ IDNO:148) gly-ser-DCRGDCF-gly-ser 14 Ad5缩短的22
六邻体中包含RGD-2C肽也可与在尾丝的C端添加接头序列PKRARPGS-K7(SEQ ID NO 132)相结合。
实施例6：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖定向病毒的构建
通过在大肠杆菌中采用EDRAG技术遗传修饰腺病毒基因组，构建含有lacZ或Gax表达盒的尾丝修饰腺病毒，并在911或PER.C6细胞中进行生产(见实施例4的材料和方法)。
鉴定预期可结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的三个配体：Wickham等人(1997，病毒学杂志，71:8221-8229)描述的七赖氨酸链(K7)，专利申请WO 95/21931中描述的精氨酸-亮氨酸重复基序RRLLRRLLRR(SEQ ID NO 133)，以及Digabriele等人(1998，科学，393:812-817)描述的与肝素KRGPRTHYGQK(SEQ ID NO 134)相结合的FGF-1的肽片段。
其中，5个病毒在尾丝的C端具有七赖氨酸K7链，并在转基因(lacZ或Gax)和/或连接(无接头，(GS)5或PKRARPGS)的特性上不同。包括病毒3497作为参考(Wickham等人，1997，病毒学杂志，71:8221-8229)。然后根据体外和体内病毒的产生和转导效率，评价接头和/或肽的重要性。
E1区中插入了异源基因(lacZ)的病毒还在其六邻体HVR5或尾丝HI环中包含多聚赖氨酸链。
表17：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖定向病毒
腺病毒主链 衣壳修饰
pAE61 用GS-K5-GS(SEQ ID NO 135)替换六邻体的第269-281位氨基酸
pAE62 用GSS-K7-GSS(SEQ ID NO 136)替换尾丝的第538-548位氨基酸
pXL3497(lacZ)和pXL3528(gax) 在尾丝的C端添加(GS)5-K7(SEQ ID NO 137)
pXL3496(lacZ)和pXL3569(gax) 在尾丝的C端添加PKRARPGS-K7(SEQ ID NO 138)
pXL3631(lacZ) 在尾丝的C端添加K7(SEQ ID NO 139)
pXL3662(lacZ)和pXL3665(gax) 在尾丝的C端添加PKRARPGS-KRGPRTHYGQK(SEQ ID NO140)
pXL3663(lacZ)和pXL3666(gax) 在尾丝的C端添加PKRARPGS-RRLLRRLLRR(SEQ ID NO 141)
所有这些病毒均可存活并能在E1反式互补细胞中扩增。下表18总结了在进行的一次实验中以10-100VP/细胞moi感染PER.C6细胞后在该细胞中所获得的病毒产量。
表18：PER.C6细胞中病毒的扩增
病毒 病毒颗粒/细胞
3497 1200
3528 2300
3496 2700
3569 1000
3631 6000
3662 12160
这些C端尾丝延伸不同程度地影响繁殖力。整体来说，这些数据和其它数据均显示，添加在尾丝C端的连接接头序列的存在和特性极大地影响着腺病毒的感染周期/行为。
对于给定的接头序列，发现外来肽本身的特性/性质也是一个重要参数。例如，含有RRLLRRLLRR肽的构建体(AV1.rCMV.lacZ或Ad3663)产生非常低的滴度，而通过KRGPRTHYGQK肽的替换(AV1.fCMV.lacZ或Ad3662)可恢复繁殖力。
对于这些病毒的大多数而言，还必需优化回收程序。例如，按以上所述，总共5.1012VP的Ad3497可通过两步层析方法成功地纯化，并最终重悬在pH8.4 20mM Tris-10％甘油中，整个颗粒回收率达到68％。
实施例7：在HI环中具有Vn4肽的病毒的构建
正如实施例4中提及的，AE43病毒因某些原因表现出某种程度的不稳定性，故需要优化回收过程。为拯救其稳定性而同时又不失去其有利的结合特性，将Vn4肽引入HI环的各种邻近的环境中(见下表19)。按实施例4所述，通过在大肠杆菌中重组克隆构建相应病毒(含有替代E1的lacZ或Gax表达盒)，并在911或PER.C6细胞中扩增该病毒。
表19：在HI环中具有Vn4肽的病毒
病毒 衣壳的修饰 SEQ ID NO
AE43 用GSS-Vn4-GSS替换尾丝的第538-548位氨基酸 20
GL11 用GSS-Vn4+Vn3-GSS*替换尾丝的第538-548位氨基酸 143
GL12 用GTSE-Vn4-GSS替换尾丝的第538-548位氨基酸 144
GL13 用GTQE-Vn4-GSS替换尾丝的第538-548位氨基酸 145
GL14 用GSSS-Vn4-GSS替换尾丝的第538-548位氨基酸 146
GL16 用GSS-Vn4-GGS替换尾丝的第538-548位氨基酸 147
GL17 用SS-Vn4-GSS替换尾丝的第538-548位氨基酸 142
3630(lacZ)和3629(Gax) 在尾丝的第546位氨基酸(Thr)和第547位氨基酸(Pro)之间插入SS-Vn4-GS 150
*Vn4+Vn3=人玻连蛋白来源的RGHSRGRNQNSRRPSRA
几乎所有的构建体均表现出与其未修饰对照病毒可比的繁殖力(见下表20)：表20
病毒 病毒颗粒/细胞
对照病毒 20000(n=2)
AE43  20000(n=2)
GL11 200(n=1)
GL12 20000(n=3)
GL13 25000(n=2)
GL14 20000(n=1)
GL16 4000(n=2)
GL17 15000(n=3)
3630 10000(n=3)
3629 14000(n=1)
病毒的稳定性也受到这些修饰的不同程度影响。具体地，其中一些病毒(如AE43、GL11、GL14和GL16)对于连续冻融循环敏感，因此为了回收病毒，感染细胞必需在温和条件(pH7.5 10mM Tris,1mM MgCl2,1％Tween 20,0.25M NaCl)下进行裂解，这再次突出了接头序列对病毒行为的影响(也见实施例9，图12)。
     实施例8：在人原代细胞中评价定向病毒
                 材料和方法细胞培养
根据Mader等(1992,J Gerontol.Biol.Sci.47:b32-b36)的方法，从成年雄性Spraggue-Dawley大鼠或成年新西兰白兔的胸主动脉制备大鼠和兔平滑肌细胞的原代培养物。在含有10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，于37℃增殖细胞。人动脉平滑肌细胞和HUVEC均购自Clonetics，并按厂家说明进行培养。腺病毒介导的体外基因转移和基因表达测定
实验前1-2天将细胞接种在24孔或12孔平板上。通过在无血清培养基中于37℃与腺病毒载体温育一小时，以moi 100或1000(VP/细胞)对细胞进行感染。然后洗涤细胞，并加入生长培养基48小时，以允许β-半乳糖苷酶表达。然后裂解细胞，并通过使用发光β-半乳糖苷酶遗传报告系统Ⅱ(Luminescentβ-galactosidase genetic reportersystem Ⅱ)(Clontech)或Xgal染色，测定β-半乳糖苷酶活性。
                         结果编码β-半乳糖苷酶报告基因的构建体
以下两个表21和22中给出的数据显示，大多数病毒能比对照病毒更有效地转导hSMC，而且对于进一步的体外和体内研究，病毒AE30、AE42、AE43、AE44、AE45、AE57、AE58、AE61、AE62、BC15X和3497均是良好的选择对象。在以不同途径按1000VP/细胞的moi感染的原代SMC上进行的实验显示，对于几种修饰病毒转导有极为显著的增加(例子提供在表21和22中)。感染后48小时制备提取物，并定量此时蛋白质和β-半乳糖苷酶的活性。然后通过比较lacZ比活性(RLU/蛋白质提取物)的水平评价转导效率。
表21：实验#1
    病毒 在人SMC中的转导效率
    对照     1
    AE30     3.5
    AE43     53
    AE44     23
    AE45     10
    3497     115
    BC15X     26
表22：实验#2
    病毒 在人SMC中的转导效率
    对照     1
    AE27     16
    AE29     6
    AE30     133
    AE42     95
    AE43     825
    AE48     31
    AE57     846
    AE58     264
    AE60     52
    AE61     781
    AE62     772
    BC15X     47
下表23总结了在不同物种的SMC中获得的数据：大多数病毒能有效地转导非人类细胞，说明在其进入途径中没有种间障碍。
表23：不同物种的SMC的感染
    病毒 大鼠SMC中的转导效率 猪SMC中的转导效率 兔SMC中的转导效率
    对照     1     1     1
    BC15X     -     97(n=1)       -
    AE43     77(n=2)     753(n=2)     131(n=3)
    AE62     166(n=2)     2166(n=2)     320(n=5)
    3497     50(n=2)     349(n=2)     55(n=2)
    3496     295(n=2)     2318(n=2)     437(n=2)
    AE57      -     2960(n=1)       -
    AE63     21(n=2)     293(n=2)     23(n=2)
n=实验次数
为证明在衣壳修饰后观察到的转导增加的原因至少部分是感染性的增加，从以1000VP/细胞的moi感染的人SMC提取病毒DNA，对其进行定量PCR。同时，对蛋白质提取物进行RLU测量。
表24表明，在所有的情况下(尽管程度不同)，人平滑肌细胞中表征最佳候选病毒的转导效率的增加均与DNA进入的增加相关。这种相关性对于病毒AE43和BC15X尤其明显。
表24：基因组递送和转基因表达
病毒 基因组/细胞a  RLU/μg总蛋白     RLU的比b 基因组的比c
对照     3.3     191641     1     1
AE30     211     677345     3.5     64
AE43     87     10207798     53     26.5
AE45     427     1851206     10     130
3497     124     22115125     115     38
BC15X     40     5004672     26     12.3
a基因组/细胞是通过PCR定量的病毒基因组量与感染细胞数之比。
bRLU的比：所示病毒的RLU水平与对照病毒的RLU水平之比。
c基因组的比：所示病毒基因组的量与对照病毒基因组的量之比。
正如图4和5所示，通过用可溶性肝素或可溶性uPAR竞争还分析了SMC中的进入途径。
图4中，在存在递增剂量的可溶性肝素时，以1000(VP/细胞)的moi感染hSMC。细胞在PBS中洗涤后再次于37℃温育。感染后48小时制备提取物，对此时的总蛋白质和β-半乳糖苷酶活性进行定量。该数据显示，含有多聚赖氨酸的病毒对hSMC的感染可被可溶性肝素特异地抑制，说明这些病毒可能结合细胞表面的细胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。相反，正如预期的一样，AE43并不使用这种特定进入途径。
图5中，病毒与递增剂量的可溶性uPAR(0-9.4μg/ml)进行预温育，之后按1000(VP/细胞)moi温育hSMC。细胞在PBS中洗涤后再次于37℃温育。感染后48小时制备提取物，对此时的总蛋白质和β-半乳糖苷酶活性进行定量。数据显示，一些uPAR导向病毒(例如AE43)对hSMC的感染可被重组可溶性uPAR特异地抑制。hSMC在其细胞表面表达uPAR(数据未显示)这一事实强烈地暗示了该特定受体在病毒进入细胞中的作用。编码定向腺病毒的Gax
通过Western印迹分析感染的hSMC中Gax的表达水平(下图)。在用病毒3528(在尾丝C端有K7序列)感染后，获得Gax表达的最大增加。以3000VP/细胞moi使用所有修饰病毒均在感染细胞中检测到Gax蛋白，而以相同moi使用对照病毒却未能检测到Gax的表达。
图6显示了定向腺病毒感染的人SMC中Gax的表达。在以所示的moi(VP/细胞)进行感染后24小时，制备蛋白提取物。(1)3×104moi的AV1.0CMVrGax,(2)104moi的AV1.0CMVrGax,(3)104moi的3528,(4)3×103moi的3528,(5)300 moi的3528,(6)3×103moi的3569,(7)300moi的3569,(8)104moi的3570和(9)3×103moi的3570。
图7显示用定向腺病毒感染人SMC后Gax的表达。在以所示的moi(VP/细胞)进行感染后24小时，制备蛋白提取物。
左边组：(1)3×104moi的AV1.0CMVrGax,(2)3×104moi的AV1.0CMVhGax,(3)3×103moi的AV1.0CMVhGax,(4)3000moi的3528,(5)300moi的3528,(6)30moi的3528,(7)3000moi的3569,(8)300moi的3569和(9)30moi的3569。
右边组：(1)3×104moi的AV1.0CMVrGax,(2)3×104moi的AV1.0CMVhGax,(3)3×103moi的AV1.0CMVhGax,(4)3000moi的3570,(5)300moi的3570,(6)30moi的3570,(7)3000moi的3629,(8)300moi的3629和(9)30moi的3629。
在以不同moi感染hSMC后，进一步通过FACS分析验证了Gax表达。正如下表25所阐明的，即使该技术的灵敏性高于Western印迹，结果还是与Western实验相关，并显示了病毒3528和3569比3570和3629具有相对高的有效转导hSMC的能力。
表25：人SMC感染后Gax表达的FACS分析(Gax表达细胞的百分数是在感染后24小时测定的)
    病毒 10000VP/细胞 1000VP/细胞 100VP/细胞
AV1.0CMVrGax     100％     52％     -
AV1.0CMVhGax     86％     8％     -
    3528     nd     99％     99％
    3569     nd     99％     99％
    3570     nd     99％     8％
    3629     nd     99％     18％
      实施例9：定向病毒在人肿瘤细胞中的体外评价
Hs578T细胞(人乳房瘤细胞)对Ad5感染十分耐受，很可能因为它们在其细胞表面上表达的病毒受体量有限。实际上，感染50％的细胞必需高达105VP/细胞的moi。对该细胞被一组衣壳修饰载体转导的能力进行了试验。
图8A、8B、8C和9说明不同定向病毒对Hs578T的感染。在感染后48小时制备细胞提取物。数据显示AE43、AE44、AE45或3497对该细胞类型的转导非常有效。
通过可溶性尾丝头部或可溶性uPAR竞争来分析AE43感染的途径(图10和11)。在图10中，在Hs578T感染前用可溶性uPAR预先温育AE43。感染后48小时制备细胞提取物。
在图11中，在Hs578T感染前用可溶性uPAR(10μg/2×108VP)或可溶性头部(100μg/ml)预先温育AE43。感染后48小时制备细胞提取物。
结果表明，AE43没有通过经典的头部-CAR途径进入细胞，而是使用uPAR依赖性途径进入细胞。
最后，比较含有Vn4的病毒3630、GL12、GL14或GL17和AE43转导Hs578T细胞的能力。如图12所示，在感染后48小时，连接接头的性质的确能够极大地影响插入HI环中的结合肽与其在细胞表面上的特异受体相互作用的效率。
     实施例10：定向病毒在鼠肿瘤细胞中的体外评价
鼠NIH-3T3细胞对Ad5感染十分耐受，因为感染50％的细胞必需105VP/细胞。对该细胞被一组衣壳修饰载体转导的能力进行了试验。在感染后48小时制备细胞提取物。图13包括代表性实验的数据，它说明AE28、AE43、AE44、AE58、AE57或AE62特别有效。
而且，重要的是，AE63(短尾丝，六邻体中为RGD-2C)显示能部分拯救与其短轴对照病毒(vBS1；在六邻体中无插入)相关的缺陷。因此，削弱天然进入途径的衣壳修饰(如显示短轴的尾丝)可与提供其它不依赖CAR的感染途径的衣壳修饰相结合。
通过可溶性uPAR竞争来分析AE43和BC15X的感染途径(图14A和14B)。在图14A和14B中，病毒BC15X(A)和AE43(B)在与细胞温育前与递增剂量的可溶性uPAR预先温育(moi分别为1000和200VP/细胞)。然后洗涤细胞，并再在37℃温育48小时，之后制备细胞提取物。
     实施例11：定向病毒在再狭窄兔模型中的体内评价
在动脉粥样化双重损伤兔模型中进行一些导向病毒的体内评价，该模型是一个良好的再狭窄模型：转移在动脉粥样化的髂动脉中发生；每天给兔子饲喂120g含1％胆固醇的食物，在第3周用直径2.5mm的Nycomed气囊导管进行首次气胀血管成形术(balloon angioplasty)损伤。1周以后，进行腺病毒基因转移。
采用检测β-半乳糖苷酶的SMC染色显微定量，确定基因转移的效率(组织化学分析)。简而言之，检查32个切片/动脉，并对X-Gal阳性细胞计数。数据表示为一个动脉32个切片中的最高得分。结果见下表26。
表26：定向病毒在再狭窄兔模型中的体内评价
注射的病毒 1011VP/动脉 5×1011VP/动脉
对照病毒 阳性动脉：0/8 阳性动脉：7/10*6个动脉其染色细胞＜30*1个动脉其染色细胞为200-400
 AE57，六邻体中插入RGD-2C 阳性动脉：0/6 阳性动脉：2/2*2个动脉其染色细胞＜30
 AE43,HI尾丝中插入VN4 阳性动脉：5/6*2个动脉其染色细胞＜30*2个动脉其染色细胞为30-100*1个动脉其染色细胞为＞400
 BC15C，在尾丝C末端中插入VN4 阳性动脉：4/4*1个动脉其染色细胞＜30*1个动脉其染色细胞为30-100*1个动脉其染色细胞为100-200*1个动脉其染色细胞为200-400
这些数据表明，与未修饰的对照相比，腺病毒AE43和BC15X转导动脉壁的效率显著增加。
本文中所描述的具体实施方案并不限制本发明的范围。的确，根据以上的描述和附图，本文描述之外的本发明各种修改将为本领域技术人员所明了。这些修改均包括在所附权利要求的范围之内。
还应理解，本文给出的各种核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量值均是大致的，提供用于说明。
本文引用的各种出版物的公开均以参考文献完整地并入本文。
                         序列表<110>RHONE-POULENC RORER S.A.<120>递送异源基因的定向腺病毒载体<130>定向腺病毒<140><141><150>US SN 60 09828<151>1998-08-27<160>150<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>1Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His1               5                  10                  15Trp Cys Asn<210>2<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>2Leu Asn Gly Gly Thr Ala Vel Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His1               5                  10                  15Trp Cys Asn<210>3<211>16<212>PRT<213>腺病毒<400>3Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Thr1               5                  10                  15<210>4<211>17<212>PRT<213>腺病毒<400>4Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Tyr1               5                  10                  15Thr<210>5<211>12<212>PRT<213>腺病毒<400>5Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1               5                  10<210>6<211>10<212>PRT<213>腺病毒<400>6Asn Gln Asn Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala1               5                  10<210>7<211>23<212>PRT<213>腺病毒<400>7Gly Ser Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn1               5                  10                  15Ile His Trp Cys Asn Gly Ser
         20<210>8<211>23<212>PRT<213>腺病毒<400>8Gly Ser Leu Asn Gly Gly Thr Ala Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn1               5                  10                  15Ile His Trp Cys Asn Gly Ser
         20<210>9<211>20<212>PRT<213>腺病毒<400>9Gly Ser Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu1               5                  10                  15Trp Thr Gly Ser
         20<210>10<211>21<212>PRT<213>腺病毒<400>10Gly Ser Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu1               5                  10                  15Trp Tyr Thr Gly Ser
         20<210>11<211>16<212>pRT<213>腺病毒<400>11Gly Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Gly Ser1               5                  10                  15<210>12<211>14<212>PRT<213>腺病毒<400>12Gly Ser Asn Gln Asn Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala Gly Ser1               5                  10<210>13<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>13Gly Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Ser1               5                  10<210>14<211>11<212>PRT<213>腺病毒<400>14Gly Ser Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Gly Ser1               5                  10<210>15<211>11<212>PRT<213>腺病毒<400>15Gly Ser Lys Lys Lys Lys 5ys Lys Lys Gly Ser1               5                  10<210>16<211>25<212>PRT<213>腺病毒<400>16Gly Ser Ser Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser1               5                  10                  15Asn Ile His Trp Cys Asn Gly Ser Ser
         20                  25<210>17<211>25<212>PRT<213>腺病毒<400>17Gly Ser Ser Leu Asn Gly Gly Thr Ala Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser1               5                  10                  15Asn Ile His Trp Cys Asn Gly Ser Ser
         20                  25<210>18<211>22<212>PRT<213>腺病毒<400>18Gly Ser Ser Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr  1               5             10               15Leu Trp Thr Gly Ser Ser
         20<210>19<211>23<212>PRT<213>腺病毒<400>19Gly Ser Ser Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr1               5                  10                  15Leu Trp Tyr Thr Gly Ser Ser
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         20<210>144<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>144Gly Thr Ser Glu Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1               5                  10                  15Gly Ser Ser<210>145<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>145Gly Thr Gln Glu Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1               5                  10                  15Gly Ser Ser<210>146<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>146Gly Ser Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1               5                  10                  15Gly Ser Ser<210>147<211>18<212>PRT<213>腺病毒<400>147Gly Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Gly1               5                  10                  15Gly Ser<210>148<211>7<212>PRT<213>腺病毒<400>148Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe1               5<210>149<211>8<212>PRT<213>腺病毒<400>149Pro Lys Arg Ala Arg Pro Gly Ser1               5<210>150<211>16<212>PRT<213>腺病毒<400>150Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Gly Ser1               5                  10                  15

Claims (88)

1．至少一部分六邻体HRV5环被结合肽或导向序列替代，两侧为连接氨基酸间隔，使得可在衣壳表面功能性地表现其结合特异性的腺病毒。
2．根据权利要求1的腺病毒，其包含六邻体HVR5环约6-17个氨基酸的缺失。
3．根据权利要求1和2之一的腺病毒，其包含的六邻体HVR5环缺失不超过14个氨基酸。
4．根据权利要求1-3之一的腺病毒，其包含相应于腺病毒血清型5(Ad5)约第269位氨基酸残基至约第281位氨基酸残基的六邻体HVR5环约13个氨基酸的缺失。
5．根据权利要求1-4之一的腺病毒，其中所述间隔包含选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
6．根据权利要求1-5之一的腺病毒，其中间隔包含选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。
7．根据权利要求1-6之一的腺病毒，其中在至少一个间隔中第一个氨基酸是一个选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
8．根据权利要求1-7之一的腺病毒，其中在所述间隔中第一个氨基酸是一个选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
9．根据权利要求1-8之一的腺病毒，其中在至少一个间隔中第一个氨基酸是甘氨酸残基。
10．根据权利要求1-8之一的腺病毒，其中在所述间隔中第一个氨基酸是甘氨酸残基。
11．根据权利要求1-10之一的腺病毒，其中至少一个间隔是二肽。
12．根据权利要求1-11之一的腺病毒，其中至少一个间隔是二肽Gly-Ser。
13．根据权利要求1-12之一的腺病毒，其中导向序列是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(UPAR)的配体表位。
14．根据权利要求1-12之一的腺病毒，其中导向序列选自
LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；
LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；
AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；
AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR
(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
15．根据权利要求1-12之一的腺病毒，其中包括间隔的导向序列选自：
A．gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:7)；
B．gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:8)；
C．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser(SEQ ID NO:9)；
D．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser(SEQ ID NO:10)；
E．gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:11)；
F．gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:12)；
G．gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser(SEQ ID NO:13)；
H．gly-ser-DCRGDCF-gly-ser(SEQ ID NO:14)；和
I．gly-ser-KKKKKKK-gly-ser(SEQ ID NO:15)。
16．根据权利要求1-15之一的腺病毒，其来自人腺病毒血清型。
17．根据权利要求1-16之一的腺病毒，其来自人腺病毒C亚型。
18．根据权利要求1-17之一的腺病毒，其来自人腺病毒血清型5。
19．根据权利要求1-18之一的腺病毒，其中尾丝蛋白被修饰成具有比野生型尾丝轴短的尾丝轴。
20．根据权利要求19的重组腺病毒，其中尾丝轴通过符合读框的缺失来缩短。
21．根据权利要求19的重组腺病毒，其中尾丝轴通过用另一种血清型的轴替代它来缩短。
22．根据权利要求19的重组腺病毒，其中尾丝轴来自人C亚型(Ad2或Ad5)，并通过用血清型3(Ad3)的轴替代它来缩短。
23．根据权利要求1-22之一的重组腺病毒，其中尾丝轴含有Ad5的第1-3和17-22个重复；Ad5的第1-3和20-22个重复；或腺病毒血清型3(Ad3)的轴。
24．至少一部分六邻体HI环被结合肽或导向序列替代，且两侧为连接氨基酸间隔，使得可在衣壳表面功能性地表现其结合特异性的腺病毒。
25．根据权利要求24的腺病毒，其包含六邻体HI环约6-17个氨基酸的缺失。
26．根据权利要求24和25之一的腺病毒，其包含的六邻体HI环缺失不超过11个氨基酸。
27．根据权利要求24-26之一的腺病毒，其包含相应于腺病毒血清型5(Ad5)约第538位氨基酸残基至约第548位氨基酸残基的六邻体HI环约11个氨基酸的缺失。
28．根据权利要求24-27之一的腺病毒，其中所述间隔包含一个选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
29．根据权利要求24-28之一的腺病毒，其中所述间隔包含一个选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。
30．根据权利要求24-29之一的腺病毒，其中在至少一个间隔中第一个氨基酸是一个选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
31．根据权利要求24-30之一的腺病毒，其中在所述间隔中第一个氨基酸是一个选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
32．根据权利要求24-31之一的腺病毒，其中在至少一个间隔中第一个氨基酸是甘氨酸残基。
33．根据权利要求24-32之一的腺病毒，其中在所述间隔中第一个氨基酸是甘氨酸残基。
34．根据权利要求24-32之一的腺病毒，其中至少一个间隔是三肽。
35．根据权利要求24-32之一的腺病毒，其中至少一个间隔是三肽Gly-Ser-Ser。
36．根据权利要求24-32之一的腺病毒，其中导向序列是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(UPAR)的配体表位。
37．根据权利要求24-32之一的腺病毒，其中导向序列选自
LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；
LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；
AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；
AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR
(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
38．根据权利要求24-32之一的腺病毒，其中包括间隔的导向序列选自：A．gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:16)；B．gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:17)；C．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:18)；D．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:19)；E．gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser(SEQ ID NO:20)；F．gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser(SEQ ID NO:21)；G．gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser(SEQ ID NO:22)；H．gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser(SEQ ID NO:23)；I．gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser(SEQ ID NO:24)；J．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:143)；K．tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:144)；L．tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:145)；M．ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:146)；N．ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly(SEQ ID NO:147)。
39．根据权利要求24-38之一的腺病毒，其来自人腺病毒血清型。
40．根据权利要求24-39之一的腺病毒，其来自人腺病毒C亚型。
41．根据权利要求24-40之一的腺病毒，其来自人腺病毒血清型5。
42．根据权利要求24-41之一的腺病毒，其中尾丝蛋白被修饰成具有比野生型尾丝轴短的尾丝轴。
43．根据权利要求42的重组腺病毒，其中尾丝轴通过符合读框的缺失来缩短。
44．根据权利要求42的重组腺病毒，其中尾丝轴通过用另一种血清型的轴替代它来缩短。
45．根据权利要求42的重组腺病毒，其中尾丝轴来自人C亚型(Ad2或Ad5)，并通过用血清型3(Ad3)的轴替代它来缩短。
46．根据权利要求24-45之一的重组腺病毒，其中尾丝轴含有Ad5的第1-3和17-22个重复；Ad5的第1-3和20-22个重复；或腺病毒血清型3(Ad3)的轴。
47．一种重组腺病毒载体，其中结合肽或导向序列通过一个连接间隔或接头与尾丝的C端连接，使得可在衣壳表面功能性地表现其结合特异性。
48．根据权利要求47的重组腺病毒，其中结合间隔包含选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
49．根据权利要求47和48之一的重组腺病毒，其中间隔中的第一个氨基酸是脯氨酸。
50．根据权利要求47-49之一的重组腺病毒，其来自人腺病毒血清型。
51．根据权利要求50的重组腺病毒，其来自人腺病毒C亚型。
52．根据权利要求50的重组腺病毒，其来自人腺病毒血清型5。
53．根据权利要求47-52之一的腺病毒，其中尾丝蛋白被修饰成具有比野生型尾丝轴短的尾丝轴。
54．根据权利要求53的重组腺病毒，其中尾丝轴通过符合读框的缺失来缩短。
55．根据权利要求53的重组腺病毒，其中尾丝轴通过用另一种血清型的轴替代它来缩短。
56．根据权利要求47-54之一的重组腺病毒，其中其尾丝轴来自C亚型，并含有包括第4-16或4-19个重复的符合读框的缺失。
57．根据权利要求47-53之一的重组腺病毒，其中其尾丝轴来自C亚型，并通过用血清型3(Ad3)的轴替代它来缩短。
58．根据权利要求47-57之一的腺病毒，其包含含有5-30个氨基酸的间隔或接头肽。
59．根据权利要求47-58之一的腺病毒，其中间隔或接头肽包含序列PKRARPGS(SEQ ID NO:149)。
60．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中导向序列是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(UPAR)的配体表位。
61．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中导向序列是FGF-1的结合肝素的肽片段，其包含7-15个氨基酸。
62．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中导向序列是由5-10个赖氨酸残基组成。
63．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中导向序列是由差不多7个赖氨酸残基组成。
64．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中导向序列是由5-10个Arg-Arg和Leu-Leu基序组成。
65．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中导向序列选自
LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；
LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；
AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；
AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR
(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)；
RRLLRRLLRR(SEQ IDNO:133)；和KRGPRTHYGQK(SEQID NO:134)。
66．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中包含接头肽的导向序列含有序列PKRARPGSKKKKKKK(SEQ ID NO:132)。
67．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中包含接头肽的导向序列含有序列PKRARPGSRRLLRRLLRR(SEQ ID NO:141)。
68．根据权利要求47-59之一的腺病毒，其中包含接头肽的导向序列含有序列PKRARPGSKRGPRTHYGQK(SEQ ID NO:140)。
69．修饰腺病毒载体的细胞趋性的方法，包括：
A．从该腺病毒的衣壳蛋白的一个位点缺失天然氨基酸序列；和
B．插入通过导向肽序列N端的第一间隔和C端的第二间隔连接的导向肽序列；而且，其中导向肽在选自如下序列的缺失位点插入：与腺病毒Ad5约第269位氨基酸残基至约第281位氨基酸残基相应的六邻体HVR5环约13个氨基酸；和与腺病毒Ad5约第538位氨基酸残基至约第548位氨基酸残基相应的尾丝蛋白HI环约11个氨基酸。
70．根据权利要求69的方法，其中第一间隔包含选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。
71．根据权利要求69的方法，其中第二间隔包含选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。
72．根据权利要求69的方法，其中导向序列是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(UPAR)的配体表位。
73．根据权利要求72的方法，其中导向序列选自
LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；
LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；
AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；
AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR
(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
74．根据权利要求69的方法，其中包括间隔的导向序列插入至HVR5环中，并选自如下序列：
A．gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:7)；
B．gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:8)；
C．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser(SEQ ID NO:9)；
D．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser(SEQ ID NO:10)；
E．gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:11)；
F．gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:12)；
G．gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser(SEQ ID NO:13)；
H．gly-ser-DCRGDCF-gly-ser(SEQ ID NO:14)；和
I．gly-ser-KKKKKKK-gly-ser(SEQ ID NO:15)。
 75．根据权利要求69的方法，其中包括间隔的导向序列插入至尾丝蛋白HI环中，并选自如下序列：A．gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:16)；B．gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:17)；C．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:18)；D．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:19)；E．gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser(SEQ ID NO:20)；F．gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser(SEQ ID NO:21)；G．gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser(SEQ ID NO:22)；H．gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser(SEQ ID NO:23)；I．gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser(SEQ ID NO:24)；J．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:143)；K．tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:144)；L．tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:145)；M．ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:146)；N．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-gly(SEQ ID NO:147)。
76．根据权利要求69的方法，其还包括缩短尾丝蛋白轴。
77．根据权利要求69的方法，其中尾丝轴包含Ad5的第1-3和17-22个重复；Ad5的第1-3和20-22个重复；或一个Ad3轴。
78．包含与腺病毒血清型5(Ad5)约第269位氨基酸残基至约第281位氨基酸残基相应的HVRS环约13个氨基酸缺失、并在缺失位点包含导向肽序列插入的腺病毒六邻体，其中，导向肽序列在N端通过第一间隔连接，在C端通过第二间隔连接。
79．包含与腺病毒血清型5(Ad5)约第538位氨基酸残基至约第548位氨基酸残基相应的HI环约11个氨基酸缺失、并在缺失位点包含导向肽序列插入的腺病毒尾丝蛋白，其中导向肽序列在N端通过第一间隔连接，在C端通过第二间隔连接。
80．在其C端包含接头肽和导向肽的腺病毒尾丝蛋白。
81．在靶细胞中优先表达基因的方法，其包括用权利要求1-68之一的腺病毒或根据权利要求69-77的方法获得的腺病毒接触含有该靶细胞的细胞群体，其中导向序列是该靶细胞上的受体的配体表位。
82．在表达UPAR的靶细胞中优先表达基因的方法，其包括用权利要求13、60或72之一的定向腺病毒载体接触含有该靶细胞的细胞群体。
83．根据权利要求81的方法，其中定向腺病毒载体包含一个编码用于治疗肿瘤的基因的异源基因。
84．根据权利要求81的方法，其中腺病毒包含用于治疗再狭窄的基因。
85．通过基因治疗治疗疾病的方法，其包括施用根据权利要求1-68的定向腺病毒载体或根据权利要求69-77的方法获得的定向腺病毒载体。
86．权利要求1-68的或根据权利要求69-77的方法获得的定向腺病毒载体在生产用于通过基因治疗治疗疾病的药品中的应用。
87．含有权利要求1-68的或根据权利要求69-77的方法获得的定向腺病毒载体的药品。
88．含有权利要求1-68的或根据权利要求69-77的方法获得的定向腺病毒载体和有效量的药物学上有活性的赋形剂的药物组合物。
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