JP3076833B2 - 修飾されたバクロウイルス、その製造方法及び該バクロウイルスから得られる発現ベクター - Google Patents
修飾されたバクロウイルス、その製造方法及び該バクロウイルスから得られる発現ベクターInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、野生型のバクロウイルスの２つの強力なレ
イトプロモーター（strong late promoters）の一方が
不活性化されている、修飾されたバクロウイルスから得
られる発現ベクターに関する。
イトプロモーター（strong late promoters）の一方が
不活性化されている、修飾されたバクロウイルスから得
られる発現ベクターに関する。
バクロウイルス類は、現在極めて多数の研究所におい
て、遺伝子の発現用ベクターとして使用されている。実
用上、これらのウイルス類は、以下の様な利点を有して
いる：これらのウイルス類は、DNAの長さセグメントの
挿入を可能とするとともに、さらに、その制御下に置か
れた遺伝子の発現を非常に高いレベルで実現させること
ができる２つの強力なレイトプロモーター、即ちポリヘ
ドリンプロモーターおよびP10蛋白プロモーターを備え
ている。
て、遺伝子の発現用ベクターとして使用されている。実
用上、これらのウイルス類は、以下の様な利点を有して
いる：これらのウイルス類は、DNAの長さセグメントの
挿入を可能とするとともに、さらに、その制御下に置か
れた遺伝子の発現を非常に高いレベルで実現させること
ができる２つの強力なレイトプロモーター、即ちポリヘ
ドリンプロモーターおよびP10蛋白プロモーターを備え
ている。
エル．ケイ．ミラー［エヌ．ジェイ．パナポウロス
編、プレーガー パブリケイションズ、ニューヨーク、
“植物科学における遺伝子工学”（1981）と題されたマ
ニュアルの第14章“無脊椎動物における遺伝子工学用ウ
イルスベクター”、第203−224頁］は、昆虫宿主細胞中
で異種の遺伝子を発現されるためのベクターとしてのバ
クロウイルス類の使用の利点、特にバクロウイルス ア
ウトグラファ カリフォルニカ（AcNPV）の利点を述べ
ている。この刊行物に記載されたAcNPVバクロウイルス
は、それぞれ非−閉鎖型（non−occlusive from;NOV）
および閉鎖型（occlusive from;OV）として言及されて
いる２種の成熟型を有している。非−閉鎖型は、細胞培
地内或いは同一生物体内でのウイルスの伝染に関与す
る。閉鎖型は、１つの生物体から他のものへのウイルス
の伝染に関与する。これらの閉鎖型は、単一の蛋白質で
あるポリヘドリンから実質的に成り立っている結晶性蛋
白質マトリックス中に包み込まれたビリオンからなって
いる。
編、プレーガー パブリケイションズ、ニューヨーク、
“植物科学における遺伝子工学”（1981）と題されたマ
ニュアルの第14章“無脊椎動物における遺伝子工学用ウ
イルスベクター”、第203−224頁］は、昆虫宿主細胞中
で異種の遺伝子を発現されるためのベクターとしてのバ
クロウイルス類の使用の利点、特にバクロウイルス ア
ウトグラファ カリフォルニカ（AcNPV）の利点を述べ
ている。この刊行物に記載されたAcNPVバクロウイルス
は、それぞれ非−閉鎖型（non−occlusive from;NOV）
および閉鎖型（occlusive from;OV）として言及されて
いる２種の成熟型を有している。非−閉鎖型は、細胞培
地内或いは同一生物体内でのウイルスの伝染に関与す
る。閉鎖型は、１つの生物体から他のものへのウイルス
の伝染に関与する。これらの閉鎖型は、単一の蛋白質で
あるポリヘドリンから実質的に成り立っている結晶性蛋
白質マトリックス中に包み込まれたビリオンからなって
いる。
ポリヘドリン遺伝子は、例外的ともいえる強力なプロ
モーターを有しており、このプロモーターは、その制御
下におかれた遺伝子の高レベルでの発現を可能とするこ
とが示されている。それ故、ミラーは、発現させようと
する外来DNAをポリヘドリンプロモーターの制御下にお
く様に挿入して、バクロウイルスを発現ベクターとして
使用することが特に有利であると指摘している。
モーターを有しており、このプロモーターは、その制御
下におかれた遺伝子の高レベルでの発現を可能とするこ
とが示されている。それ故、ミラーは、発現させようと
する外来DNAをポリヘドリンプロモーターの制御下にお
く様に挿入して、バクロウイルスを発現ベクターとして
使用することが特に有利であると指摘している。
他の文献［スミスおよびサマーズ、ジャーナル オブ
ビロロジー,45、215−225（1983）］は、AcNPVウイル
スは、他の強力なレイトプローモーターを有しており、
これは10kDaポリペプチドすなわちP10蛋白質のプロモー
ターであることを示している。
ビロロジー,45、215−225（1983）］は、AcNPVウイル
スは、他の強力なレイトプローモーターを有しており、
これは10kDaポリペプチドすなわちP10蛋白質のプロモー
ターであることを示している。
さらに、バクロウイルスのキャプシドは、大量のDNA
を含むことができるので、挿入される遺伝子の数或いは
長さを制限しない。その結果、バクロウイルスから得ら
れた極めて多数の発現ベクターが提案されている。例え
ば、ヨーロッパ特許出願127,839（サマーズ発明）は、
バクロウイルスから得られた組換え発現ベクターの製造
を可能とする方法を示している。この方法は、その下流
に外来遺伝子を挿入したポリヘドリン遺伝子プロモータ
ーを含むウイルスのDNAフラグメントを含むトランスフ
ァーベクターを介して行なわれる。このトランスファー
ベクターは、次いで野生型のバクロウイルスのDNAで組
換えされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下にある外
来遺伝子を有する組換体が選抜される。
を含むことができるので、挿入される遺伝子の数或いは
長さを制限しない。その結果、バクロウイルスから得ら
れた極めて多数の発現ベクターが提案されている。例え
ば、ヨーロッパ特許出願127,839（サマーズ発明）は、
バクロウイルスから得られた組換え発現ベクターの製造
を可能とする方法を示している。この方法は、その下流
に外来遺伝子を挿入したポリヘドリン遺伝子プロモータ
ーを含むウイルスのDNAフラグメントを含むトランスフ
ァーベクターを介して行なわれる。このトランスファー
ベクターは、次いで野生型のバクロウイルスのDNAで組
換えされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下にある外
来遺伝子を有する組換体が選抜される。
ヨーロッパ特許出願340,359（発明者：ペイジおよび
ロジャース）は、バクロウイルスから得られたトランス
ファーベクターを開示している。このトランスファーベ
クターにおいては、ポリヘドリンATG開始コドンが取り
除かれているので、ポリヘドリンをコードする配列は、
翻訳されない。また、このトランスファーベクターは、
ポリヘドリン遺伝子のＮ−末端の下流で且つこの末端の
極く近傍に外来遺伝子の挿入に適した制限部位を備えて
いる。
ロジャース）は、バクロウイルスから得られたトランス
ファーベクターを開示している。このトランスファーベ
クターにおいては、ポリヘドリンATG開始コドンが取り
除かれているので、ポリヘドリンをコードする配列は、
翻訳されない。また、このトランスファーベクターは、
ポリヘドリン遺伝子のＮ−末端の下流で且つこの末端の
極く近傍に外来遺伝子の挿入に適した制限部位を備えて
いる。
本発明者らのチームは、修飾されたバクロウイルスの
製造方法を開発している。この修飾されたバクロウイル
スは、発現ベクターとして使用でき、且つ適切な制限部
位が、直接的に且つトランスファーベクターによること
なく、強力なレイトプロモーターの下流に挿入されてい
る。その結果、得られたベクターは、導入された制限部
位の位置に、発現させたい遺伝子を担うことができる。
この方法は、ヨーロッパ特許出願345,152に開示されて
いる。
製造方法を開発している。この修飾されたバクロウイル
スは、発現ベクターとして使用でき、且つ適切な制限部
位が、直接的に且つトランスファーベクターによること
なく、強力なレイトプロモーターの下流に挿入されてい
る。その結果、得られたベクターは、導入された制限部
位の位置に、発現させたい遺伝子を担うことができる。
この方法は、ヨーロッパ特許出願345,152に開示されて
いる。
公知の全ての方法において、発現すべき遺伝子は、野
生型バクロウイルスのゲノム中に存在する２個の強力な
レイトプロモーターに１個の制御下に挿入されており、
他の１個のプロモーターは、正常に機能し続ける。
生型バクロウイルスのゲノム中に存在する２個の強力な
レイトプロモーターに１個の制御下に挿入されており、
他の１個のプロモーターは、正常に機能し続ける。
強力なレイトプロモーターの不活性化によりバクロウ
イルスから得られた幾つかの構造も知られている；ラン
キンら［GENE、70、39−49（1988）］は、程度は異なる
が、上記プロモーターの制御下におかれた遺伝子の発現
を抑制する効果を有するポリヘドリンプロモーターの種
々の突然変異を述べている。イアトロウら［GENE、75、
59−71（1989）］は、ポリヘドリンプロモーターが遺伝
子欠失より不活性化されたバクロウイルスの製造を開示
している。彼等は、ポリヘドリンプロモーターの制御下
にではなく、それ自身のプロモーターの制御下に外来の
遺伝子をおくことを望ましい構造を得るためのトランス
ファーベクターとして、これらのバクロウイルスを使用
することを提案している。
イルスから得られた幾つかの構造も知られている；ラン
キンら［GENE、70、39−49（1988）］は、程度は異なる
が、上記プロモーターの制御下におかれた遺伝子の発現
を抑制する効果を有するポリヘドリンプロモーターの種
々の突然変異を述べている。イアトロウら［GENE、75、
59−71（1989）］は、ポリヘドリンプロモーターが遺伝
子欠失より不活性化されたバクロウイルスの製造を開示
している。彼等は、ポリヘドリンプロモーターの制御下
にではなく、それ自身のプロモーターの制御下に外来の
遺伝子をおくことを望ましい構造を得るためのトランス
ファーベクターとして、これらのバクロウイルスを使用
することを提案している。
P10蛋白質プロモーターが不活性化されている構造
も、実現されている；クインら［ジャーナル オブ ジ
ェネティック ビロロジー、70、1273−1280（1989）］
は、外来遺伝子がP10プロモーターの種々の突然変異体
の制御下におかれている構成成分を含む組換えプラスミ
ドを開示している。これらの変異体の幾つかは、プロモ
ーターを完全に不活性化するという効果を発揮する。
も、実現されている；クインら［ジャーナル オブ ジ
ェネティック ビロロジー、70、1273−1280（1989）］
は、外来遺伝子がP10プロモーターの種々の突然変異体
の制御下におかれている構成成分を含む組換えプラスミ
ドを開示している。これらの変異体の幾つかは、プロモ
ーターを完全に不活性化するという効果を発揮する。
しかしながら、これらの構造は、組換えプラスミドに
おいてのみ実現されている。実際にも、P10遺伝子プロ
モーターは、P26蛋白質をコードする配列の一部と重な
っており、このプロモーターにおける変異は、実用的な
バクロウイルスを形成させないものと一般に考えられて
いる。
おいてのみ実現されている。実際にも、P10遺伝子プロ
モーターは、P26蛋白質をコードする配列の一部と重な
っており、このプロモーターにおける変異は、実用的な
バクロウイルスを形成させないものと一般に考えられて
いる。
さらに、バクロウイルスから得られた発現ベクター中
で遺伝子発現を増加させるために、同じベクター中で、
遺伝子のコピー数とプロモーターのコピー数とを増加さ
せることが提案されている。例えば、ヨーロッパ特許出
願0,127,839は、同じバクロウイルス中に、１つの遺伝
子の複数個のコピーをポリヘドリンプロモーターの制御
下におく様に挿入し、他の複数個のコピーをP10プロモ
ーターの制御下におく様に挿入し、必要ならば、さらに
他の複数個のコピーをゲノムの他の位置に挿入すること
を提案している。最後の複数個の遺伝子のコピーのそれ
ぞれは、バクロウイルスプロモーター若しくはそれ自身
のプロモーターの制御下におかれる。
で遺伝子発現を増加させるために、同じベクター中で、
遺伝子のコピー数とプロモーターのコピー数とを増加さ
せることが提案されている。例えば、ヨーロッパ特許出
願0,127,839は、同じバクロウイルス中に、１つの遺伝
子の複数個のコピーをポリヘドリンプロモーターの制御
下におく様に挿入し、他の複数個のコピーをP10プロモ
ーターの制御下におく様に挿入し、必要ならば、さらに
他の複数個のコピーをゲノムの他の位置に挿入すること
を提案している。最後の複数個の遺伝子のコピーのそれ
ぞれは、バクロウイルスプロモーター若しくはそれ自身
のプロモーターの制御下におかれる。
実際のところ、本発明者は、予想外にも、野生型バク
ロウイルスの２個の強力なレイトプロモーターの一方の
除去乃至不活性化は、残余のプロモーターの制御下にお
かれている遺伝子の発現を増加させることを見出した。
ロウイルスの２個の強力なレイトプロモーターの一方の
除去乃至不活性化は、残余のプロモーターの制御下にお
かれている遺伝子の発現を増加させることを見出した。
本発明の目的は、修飾されたバクロウイルスから構築
され、野生型バクロウイルス中に存在する２個の強力な
レイトプロモーターの一方のみが活性である新規な発現
ベクターを提供することにある。
され、野生型バクロウイルス中に存在する２個の強力な
レイトプロモーターの一方のみが活性である新規な発現
ベクターを提供することにある。
本発明の対象物は、発現ベクターであって、野生型バ
クロウイルスのゲノム中に存在する２個の強力なレイト
プロモーターの一方が不活性化されている修飾されたバ
クロウイルスから構築されていること、且つこの修飾さ
れたバクロウイルス中で活性な強力なレイトプロモータ
ーの制御下におかれている配列が、野生型バクロウイル
スの対応する配列とは異なっていることを特徴としてい
る。
クロウイルスのゲノム中に存在する２個の強力なレイト
プロモーターの一方が不活性化されている修飾されたバ
クロウイルスから構築されていること、且つこの修飾さ
れたバクロウイルス中で活性な強力なレイトプロモータ
ーの制御下におかれている配列が、野生型バクロウイル
スの対応する配列とは異なっていることを特徴としてい
る。
本発明においては、“野生型バクロウイルスの対応す
る配列とは異なる配列”とは、特に、野生型バクロウイ
ルス中では、当該プロモーターにより制御される配列
が、当該プロモーターに制御される外来遺伝子の発現を
可能とする方向への修飾に供されていることを意味す
る。この様な修飾は、例えば、外来遺伝子（発現させよ
うとする遺伝子、１個または２個以上の制限部位を有す
る配列など）を野生型バクロウイルスの当該配列中に挿
入するか、或いはこの配列の全てまたは一部に代えて挿
入することからなる。
る配列とは異なる配列”とは、特に、野生型バクロウイ
ルス中では、当該プロモーターにより制御される配列
が、当該プロモーターに制御される外来遺伝子の発現を
可能とする方向への修飾に供されていることを意味す
る。この様な修飾は、例えば、外来遺伝子（発現させよ
うとする遺伝子、１個または２個以上の制限部位を有す
る配列など）を野生型バクロウイルスの当該配列中に挿
入するか、或いはこの配列の全てまたは一部に代えて挿
入することからなる。
本発明による発現ベクターの好ましい一実施態様によ
れば、不活性化されたプロモーターはポリヘドリン遺伝
子のプロモーターであり、活性なプロモーターはP10蛋
白質遺伝子のプロモーターである。
れば、不活性化されたプロモーターはポリヘドリン遺伝
子のプロモーターであり、活性なプロモーターはP10蛋
白質遺伝子のプロモーターである。
本発明による発現ベクターの他の好ましい一実施態様
によれば、不活性化されたプロモーターはP10蛋白質遺
伝子のプロモーターであり、活性なプロモーターはポリ
ヘドリン遺伝子のプロモーターである。
によれば、不活性化されたプロモーターはP10蛋白質遺
伝子のプロモーターであり、活性なプロモーターはポリ
ヘドリン遺伝子のプロモーターである。
本発明の対象物は、さらに上記に定義した様な発現ベ
クターを得るために使用し得る修飾されたバクロウイル
スである。
クターを得るために使用し得る修飾されたバクロウイル
スである。
この意味では、本発明は、P10蛋白質遺伝子のプロモ
ーターが不活性である感染性の修飾されたバクロウイル
スを包含する。
ーターが不活性である感染性の修飾されたバクロウイル
スを包含する。
バクロウイルスAcNPV（Autographa Californica Nucl
ear Polyhedrosis Virus）およびGmNPV（Galleria mell
onella Nuclear Polyhedrosis Virus）において、EcoR
I制限フラグメントＰ内に位置するP10ポリペプチド遺伝
子は、５′末端においてはP26と命名されるポリペプチ
ドをコードする遺伝子に隣接しており、３′末端領域に
おいてはP74と命名されるポリペプチドをコードする遺
伝子に隣接している。P10遺伝子プロモーターは、P26遺
伝子のコード域において、P26遺伝子の３′末端にあ
る。
ear Polyhedrosis Virus）およびGmNPV（Galleria mell
onella Nuclear Polyhedrosis Virus）において、EcoR
I制限フラグメントＰ内に位置するP10ポリペプチド遺伝
子は、５′末端においてはP26と命名されるポリペプチ
ドをコードする遺伝子に隣接しており、３′末端領域に
おいてはP74と命名されるポリペプチドをコードする遺
伝子に隣接している。P10遺伝子プロモーターは、P26遺
伝子のコード域において、P26遺伝子の３′末端にあ
る。
本発明者は、Xho I部位（P26遺伝子の＋569位）とBgl
II部位（P10遺伝子の＋152位）により囲まれる領域を
除去し、次いでクレノウ酵素により修復した後、これら
の部位を再結合した。これにより、プロモーターおよび
P10の５′末端に対応する領域が取り除かれる。P26遺伝
子の最初の569個の塩基とp10遺伝子の最後の130個の塩
基とからなるキメラ遺伝子が得られる；この遺伝子は機
能を発揮して、この様にして修飾されたバクロウイルス
は、完全に生育可能であり、野生型ウイルスよりも多く
のポリヘドリンを生成する。
II部位（P10遺伝子の＋152位）により囲まれる領域を
除去し、次いでクレノウ酵素により修復した後、これら
の部位を再結合した。これにより、プロモーターおよび
P10の５′末端に対応する領域が取り除かれる。P26遺伝
子の最初の569個の塩基とp10遺伝子の最後の130個の塩
基とからなるキメラ遺伝子が得られる；この遺伝子は機
能を発揮して、この様にして修飾されたバクロウイルス
は、完全に生育可能であり、野生型ウイルスよりも多く
のポリヘドリンを生成する。
本発明の好ましい一実施態様によれば、この修飾され
たバクロウイルスのゲノムは、P26ポリペプチドをコー
ドする配列のATG開始コドンから＋569番目の塩基に位置
するXho I部位と、P10ポリペプチドをコードする配列の
ATG開始コドンから＋152番目の塩基に位置するBg1 II部
位とに囲まれるDNA配列を欠失している。
たバクロウイルスのゲノムは、P26ポリペプチドをコー
ドする配列のATG開始コドンから＋569番目の塩基に位置
するXho I部位と、P10ポリペプチドをコードする配列の
ATG開始コドンから＋152番目の塩基に位置するBg1 II部
位とに囲まれるDNA配列を欠失している。
本発明は、ポリヘドリン遺伝子プロモーターが不活性
である以下のバクロウイルス類に関する： − そのゲノムが、−95番目の塩基に位置するEcoR V
部位及びポリヘドリン配列のATG開始コドンから＋910番
目の塩基に位置するSsp I部位により囲まれたDNA配列を
欠いている修飾されたバクロウイルス； − そのゲノムが、−95番目の塩基に位置するEcoR V
部位及びポリヘドリン配列のATG開始コドンから＋633番
目の塩基に位置するKpn I部位により囲まれたDNA配列を
欠いている修飾されたバクロウイルス； − そのゲノムが、−95番目の塩基に位置するEcoR V
部位及びポリヘドリンをコードする配列のATG開始コド
ンから＋733番目の塩基に位置するEco47III部位により
囲まれたDNA配列を欠いている修飾されたバクロウイル
ス。
である以下のバクロウイルス類に関する： − そのゲノムが、−95番目の塩基に位置するEcoR V
部位及びポリヘドリン配列のATG開始コドンから＋910番
目の塩基に位置するSsp I部位により囲まれたDNA配列を
欠いている修飾されたバクロウイルス； − そのゲノムが、−95番目の塩基に位置するEcoR V
部位及びポリヘドリン配列のATG開始コドンから＋633番
目の塩基に位置するKpn I部位により囲まれたDNA配列を
欠いている修飾されたバクロウイルス； − そのゲノムが、−95番目の塩基に位置するEcoR V
部位及びポリヘドリンをコードする配列のATG開始コド
ンから＋733番目の塩基に位置するEco47III部位により
囲まれたDNA配列を欠いている修飾されたバクロウイル
ス。
本発明者は、かくして修飾されたバクロウイルスが、
細胞培養物（cell culture）中に十分に増殖し且つその
プロモーターが不活性化されたタンパク質を製造しない
一方、野生型バクロウイルスよりも、そのプロモーター
が活性なタンパク質を多量に合成することを確立した。
細胞培養物（cell culture）中に十分に増殖し且つその
プロモーターが不活性化されたタンパク質を製造しない
一方、野生型バクロウイルスよりも、そのプロモーター
が活性なタンパク質を多量に合成することを確立した。
本発明の他の好ましい実施態様によれば、修飾された
バクロウイルスは、活性なプロモーターの制御下にある
マーカー配列を含む。
バクロウイルスは、活性なプロモーターの制御下にある
マーカー配列を含む。
本発明において、“マーカー配列”とは、その発現が
修飾されたバクロウイルスの容易に同定可能なフェノタ
イプ（phenotype）に与える配列を意味する。該配列中
への次の外来配列の挿入により、前記フェノタイプは廃
止され、それにより該外来配列を組み込んだバクロウイ
ルスの選択が可能になる。
修飾されたバクロウイルスの容易に同定可能なフェノタ
イプ（phenotype）に与える配列を意味する。該配列中
への次の外来配列の挿入により、前記フェノタイプは廃
止され、それにより該外来配列を組み込んだバクロウイ
ルスの選択が可能になる。
本実施態様の特に有用な配置（arrangement）は、マ
ーカー配列がポリヘドリンをコードする配列からなり、
該配列がP10タンパク質遺伝子のプロモーターの制御下
に置かれる。このようにして得られる修飾されたバクロ
ウイルスは、封入体（inclusions）を製造する能力を回
復する。この配置により得られたバクロウイルス株は、
パリのパスツール・インスティテュート（the Pasteur
Institute）により設立されたコレクシオン・ナシオナ
ル・ド・ミクロオルガニスム（Collection Nationale d
e Microorganismes）（ナショナル・コレクション・オ
ブ・マイクロオーガニズムス）に1990年７月17日に寄託
された。この株は、寄託番号Ｉ−978が与えられた。
ーカー配列がポリヘドリンをコードする配列からなり、
該配列がP10タンパク質遺伝子のプロモーターの制御下
に置かれる。このようにして得られる修飾されたバクロ
ウイルスは、封入体（inclusions）を製造する能力を回
復する。この配置により得られたバクロウイルス株は、
パリのパスツール・インスティテュート（the Pasteur
Institute）により設立されたコレクシオン・ナシオナ
ル・ド・ミクロオルガニスム（Collection Nationale d
e Microorganismes）（ナショナル・コレクション・オ
ブ・マイクロオーガニズムス）に1990年７月17日に寄託
された。この株は、寄託番号Ｉ−978が与えられた。
本実施態様の他の特に有用な配置は、修飾されたバク
ロウイルスが、β−ガラクトシダーゼをコードする配列
を含み、活性プロモーター（P10タンパク質またはポリ
ヘドリン）の制御下に置かれる。この方法により修飾さ
れたバクロウイルスは、基質のＸ−galの存在下に青い
ウイルスプラーク（blue virus plaque）を形成する性
質を有する。
ロウイルスが、β−ガラクトシダーゼをコードする配列
を含み、活性プロモーター（P10タンパク質またはポリ
ヘドリン）の制御下に置かれる。この方法により修飾さ
れたバクロウイルスは、基質のＸ−galの存在下に青い
ウイルスプラーク（blue virus plaque）を形成する性
質を有する。
２種の上記配置の１つにより得られたバクロウイルス
の使用により、外来遺伝子の次ぎの挿入中に、ポリヘド
リン遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼの遺伝子内に前
記外来遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを容易に選択
できるようになる。実際、最初の場合において、上記組
換えウイルスは、もはや多角体（polyhedra）を形成し
ない；第２の場合、それらは青いプラークの代わりに白
いプラークを形成する。
の使用により、外来遺伝子の次ぎの挿入中に、ポリヘド
リン遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼの遺伝子内に前
記外来遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを容易に選択
できるようになる。実際、最初の場合において、上記組
換えウイルスは、もはや多角体（polyhedra）を形成し
ない；第２の場合、それらは青いプラークの代わりに白
いプラークを形成する。
本発明の発現ベクターを得るのに使用できる修飾され
たバクロウイルスを得るために、野生型バクロウイルス
のゲノム中に存在する強力なレートプロモーター（late
promoter）の１種の不活性化が、あらゆる好適な手段
によって行われる。
たバクロウイルスを得るために、野生型バクロウイルス
のゲノム中に存在する強力なレートプロモーター（late
promoter）の１種の不活性化が、あらゆる好適な手段
によって行われる。
例えば、ポリヘドリンプロモーター、またはP10タン
パク質プロモーターの不活性化は、該プロモーターを含
むDNAフラグメントを除去することにより行われる。
パク質プロモーターの不活性化は、該プロモーターを含
むDNAフラグメントを除去することにより行われる。
該DNAフラグメントの除去は、制限酵素を用いて行う
ことができる。
ことができる。
他の方法、例えば相同組換えの技法を用いる通常の方
法は、目的のDNAフラグメントの除去を行うために用い
ることができる。
法は、目的のDNAフラグメントの除去を行うために用い
ることができる。
２種のプロモーターの一方または他方の不活性化も、
例えば上述のラキン（RAKIN）らの公報に記載されてい
るように、前記プロモーターの活性に関与する配列の突
然変異誘発により行うことができる。
例えば上述のラキン（RAKIN）らの公報に記載されてい
るように、前記プロモーターの活性に関与する配列の突
然変異誘発により行うことができる。
本発明の提供された発現ベクターは、限定的に解釈さ
れるものではないが、公知の種々の方法、例えば、欧州
特許出願第127,839号及び第340,359号に記載されている
ようにトランスファー ベクターを用いるか、または欧
州特許出願第345,152号に記載されているように直接挿
入により修飾されたバクロウイルスから得ることができ
る。
れるものではないが、公知の種々の方法、例えば、欧州
特許出願第127,839号及び第340,359号に記載されている
ようにトランスファー ベクターを用いるか、または欧
州特許出願第345,152号に記載されているように直接挿
入により修飾されたバクロウイルスから得ることができ
る。
発現されるのが望ましい外来蛋白質をコードする配列
は、活性プロモーターの制御下に挿入される；該配列
は、野生型バクロウイルス中において通常該プロモータ
ーの制御下に置かれているものであり、全部または一部
が削られ、前記外来遺伝子をコードする配列により置き
換えられる。
は、活性プロモーターの制御下に挿入される；該配列
は、野生型バクロウイルス中において通常該プロモータ
ーの制御下に置かれているものであり、全部または一部
が削られ、前記外来遺伝子をコードする配列により置き
換えられる。
本発明のより良い理解は、以下の追加的な記載により
得られ、それは本発明の発現ベクター及び修飾されたバ
クロウイルスの構成（construction）の実施例に関係す
る。にもかかわらず、これら実施例が単に本発明の例示
を与えるだけのものであり、本発明を制限するものでな
いことは自明である。
得られ、それは本発明の発現ベクター及び修飾されたバ
クロウイルスの構成（construction）の実施例に関係す
る。にもかかわらず、これら実施例が単に本発明の例示
を与えるだけのものであり、本発明を制限するものでな
いことは自明である。
実施例1: プロモーターを欠いた修飾されたバクロウイ
ルス及びポリヘドリンの構造遺伝子の構造 この実施例及び以下の実施例において使用されるプロ
トコールは、マニアティスら、［モレキュラー・クロー
ニング：実験室マニュアル；コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー、1982］に記載されているような
公知の遺伝子工学技術を利用する。各実施例の特有の条
件は、適当な場合には、対応する実施例中で特定され
る。
ルス及びポリヘドリンの構造遺伝子の構造 この実施例及び以下の実施例において使用されるプロ
トコールは、マニアティスら、［モレキュラー・クロー
ニング：実験室マニュアル；コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー、1982］に記載されているような
公知の遺伝子工学技術を利用する。各実施例の特有の条
件は、適当な場合には、対応する実施例中で特定され
る。
本発明の修飾されたバクロウイルスは、２種の制限酵
素を用いて野生型バクロウイルスDNAを部分消化するこ
とで得られ、その制限酵素の開裂部位の１つは、ポリヘ
ドリンプロモーターの上流に位置し、他方は該プロモー
ターの下流であって、ポリヘドリンをコードする配列中
または該配列の下流に位置する。
素を用いて野生型バクロウイルスDNAを部分消化するこ
とで得られ、その制限酵素の開裂部位の１つは、ポリヘ
ドリンプロモーターの上流に位置し、他方は該プロモー
ターの下流であって、ポリヘドリンをコードする配列中
または該配列の下流に位置する。
オートグラファ カリフォルニカ（Autographa calif
ornica）株に属するバクロウイルスの全ゲノムDNAは、
次いでジーン パブリッシング アソシエーツ アンド
ワイリー インターサイエンス（セクション 3.1.
6）により発行されたアウスベル（Ausubel）ら、編集の
“カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー”に記載された部分消化技術に従い、酵素Ec
oR VおよびEco47 IIIにより切断される。
ornica）株に属するバクロウイルスの全ゲノムDNAは、
次いでジーン パブリッシング アソシエーツ アンド
ワイリー インターサイエンス（セクション 3.1.
6）により発行されたアウスベル（Ausubel）ら、編集の
“カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー”に記載された部分消化技術に従い、酵素Ec
oR VおよびEco47 IIIにより切断される。
選択した条件は、以下の通りである： EcoR Vによる開裂 バクロウイルスDNA（10μｇ）を、100μの10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mMMgCl2、150mM NaClで
希釈する。
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mMMgCl2、150mM NaClで
希釈する。
DNA μｇ当たり３ユニットの酵素を加える。次の希
釈は、同一の緩衝液で行い、各希釈において、37℃で15
分間のインキュベーションの後、制限酵素生成物を、ウ
イルスDNA1分子当たりただ１つの開裂だけが与えられる
希釈条件を決定するために、アガロースゲル上で分析し
た。
釈は、同一の緩衝液で行い、各希釈において、37℃で15
分間のインキュベーションの後、制限酵素生成物を、ウ
イルスDNA1分子当たりただ１つの開裂だけが与えられる
希釈条件を決定するために、アガロースゲル上で分析し
た。
適合する希釈度は、EcoR Vで1/27である。
Eco47IIIによる開裂 実験条件は、上述のEcoR Vと同様である。
適合する希釈度は、1/54である。
EcoR VおよびEco47IIIにより切断された分子は、鈍端
を有し、環状ウイルスDNA分子を得るためにその連結（l
igation）を直接に行うことができる。
を有し、環状ウイルスDNA分子を得るためにその連結（l
igation）を直接に行うことができる。
得られたウイルスDNA分子は、精製後に、グラハムお
よびファン・デア・エルブ、［Virology,52、305−309
（1973）］に従い、スポドプテラ・フルギペルダ（Spod
optera frugiperda）細胞（SF9株、ATCC No.CRL 171
1）の培養物（culture）をトランスフェクトするために
使用される。
よびファン・デア・エルブ、［Virology,52、305−309
（1973）］に従い、スポドプテラ・フルギペルダ（Spod
optera frugiperda）細胞（SF9株、ATCC No.CRL 171
1）の培養物（culture）をトランスフェクトするために
使用される。
これらの条件の下で、好ましい欠失除去を伴うDNA分
子は、感染可能であり、プラークは形成するがポリヘド
リンは形成しないウイルスを与える。
子は、感染可能であり、プラークは形成するがポリヘド
リンは形成しないウイルスを与える。
このウイルスは、pob-ウイルスと呼ばれる。
実施例２ Autographa californica バクロウイルスのゲノムDN
Aは、次いでKpn I処理がNaClを含まない緩衝液中1/9の
希釈度で行われる他は、実施例１に記載の条件下に酵素
Kpn IおよびEcoR V酵素により消化される。該分子は、
次いで、再連結（religation）され、上述のようにSpod
optera frugiperdaをトランスフェクトするために使用
される。
Aは、次いでKpn I処理がNaClを含まない緩衝液中1/9の
希釈度で行われる他は、実施例１に記載の条件下に酵素
Kpn IおよびEcoR V酵素により消化される。該分子は、
次いで、再連結（religation）され、上述のようにSpod
optera frugiperdaをトランスフェクトするために使用
される。
実施例３ 手順は、使用された野生型バクロウイルスが、株Gall
eria mellonellaに属することを除いては、実施例１ま
たは２の記載と同様である。
eria mellonellaに属することを除いては、実施例１ま
たは２の記載と同様である。
実施例4: P10タンパク質プロモーターの制御下にある
β−ガラクトシダーゼをコードする配列の挿入 P10タンパク質の構造遺伝子を含む、野生型Autograph
a Californicaバクロウイルスのゲノムから得られたEco
R I制限フラグメントＰを、EcoR I部位でプラスミドpUC
9のマルチ−サイトリンカー（multisite linker）に挿
入する。このフラグメントは、P10遺伝子のATGコドンの
＋152番目の塩基に位置する単一のBgl II部位を含む。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子（それ自身のATGの下流にB
amH I部位を有する）のより多くの部分を有するBamH I
フラグメントをBgl II部位に挿入する;P10タンパク質お
よびβ−ガラクトシダーゼの開始の読取り枠は、同じ相
である。
β−ガラクトシダーゼをコードする配列の挿入 P10タンパク質の構造遺伝子を含む、野生型Autograph
a Californicaバクロウイルスのゲノムから得られたEco
R I制限フラグメントＰを、EcoR I部位でプラスミドpUC
9のマルチ−サイトリンカー（multisite linker）に挿
入する。このフラグメントは、P10遺伝子のATGコドンの
＋152番目の塩基に位置する単一のBgl II部位を含む。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子（それ自身のATGの下流にB
amH I部位を有する）のより多くの部分を有するBamH I
フラグメントをBgl II部位に挿入する;P10タンパク質お
よびβ−ガラクトシダーゼの開始の読取り枠は、同じ相
である。
従って、得られたプラスミド（D3PZ）は、P10タンパ
ク質遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の開始点
（beginning）を有する。Spodoptera frugiperda細胞
は、プラスミドD3PZおよびpob-ウイルスDNA（D3PZの１
μg;pob-DNAの0.5μg;プロトコールは、実施例１と同
じ）の両方でトランスフェクトし、Ｘ−galの存在下に
青いプラークを形成する組換体（pob-β−ガラクトシダ
ーゼ）バクロウイルスを選択する。得られた組換体ウイ
ルスは、以下の実施例７に示すように大量のβ−ガラク
トシダーゼを発現する。
ク質遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の開始点
（beginning）を有する。Spodoptera frugiperda細胞
は、プラスミドD3PZおよびpob-ウイルスDNA（D3PZの１
μg;pob-DNAの0.5μg;プロトコールは、実施例１と同
じ）の両方でトランスフェクトし、Ｘ−galの存在下に
青いプラークを形成する組換体（pob-β−ガラクトシダ
ーゼ）バクロウイルスを選択する。得られた組換体ウイ
ルスは、以下の実施例７に示すように大量のβ−ガラク
トシダーゼを発現する。
実施例5: P10タンパク質の構造遺伝子の代わりのポリ
ヘドリンの構造遺伝子の挿入 ポリヘドリン遺伝子を含むバクロウイルスAutographa
californicaのゲノムDNAのEcoR IフラグメントＩを、E
coR I部位でプラスミドpUC18のマルチ−サイトリンカー
にクローニングする。Pvu II部位は、ポリヘドリンをコ
ードする配列のATGコドンの−２番目の塩基の位置に導
入される。
ヘドリンの構造遺伝子の挿入 ポリヘドリン遺伝子を含むバクロウイルスAutographa
californicaのゲノムDNAのEcoR IフラグメントＩを、E
coR I部位でプラスミドpUC18のマルチ−サイトリンカー
にクローニングする。Pvu II部位は、ポリヘドリンをコ
ードする配列のATGコドンの−２番目の塩基の位置に導
入される。
さらに、（実施例４参照）Autographa californicaの
バクロウイルスのゲノムのEcoR IフラグメントＰを含む
プラスミドが、Bgl II部位で開かれる。酵素Bgl31及び
次のクレノウポリメラーゼを作用させた後、Bgl IIリン
カーを導入する。P10タンパク質をコードする配列のよ
り多くの部分を欠き、且つP10タンパク質ATGの−４番目
の位置にBgl II部位を備えたpGH80−82と名付けられた
プラスミドが、それにより得られる。
バクロウイルスのゲノムのEcoR IフラグメントＰを含む
プラスミドが、Bgl II部位で開かれる。酵素Bgl31及び
次のクレノウポリメラーゼを作用させた後、Bgl IIリン
カーを導入する。P10タンパク質をコードする配列のよ
り多くの部分を欠き、且つP10タンパク質ATGの−４番目
の位置にBgl II部位を備えたpGH80−82と名付けられた
プラスミドが、それにより得られる。
制限酵素Pvu IIおよびEco47 IIIを用いてプラスミドp
UC18から切り出されたポリヘドリンの構造遺伝子が、ク
レノウポリメラーゼで鈍端を修復した後プラスミドpHG8
0−82のBgl II部位に導入される。
UC18から切り出されたポリヘドリンの構造遺伝子が、ク
レノウポリメラーゼで鈍端を修復した後プラスミドpHG8
0−82のBgl II部位に導入される。
得られたプラスミドは、pHG80−82 ob+と名付けら
れ、実施例１で得られたpob-ウイルスとともにSpodopte
ra frugiperda細胞をトランスフェクト（cotransfect）
するのに用いる。
れ、実施例１で得られたpob-ウイルスとともにSpodopte
ra frugiperda細胞をトランスフェクト（cotransfect）
するのに用いる。
ポリヘドリンを形成する組換え（pob- ob+）ウイル
スが選択される。
スが選択される。
組換え（pob- ob+）ウイルス株は、番号Ｉ−978とし
てコレクシオン・ナシオナル・ド・ミクロオルガニスム
に1990年７月17日に寄託された。
てコレクシオン・ナシオナル・ド・ミクロオルガニスム
に1990年７月17日に寄託された。
実施例6: キイロショウジョウバエ（Drosophila）のア
セチルコリンエステラーゼ（Ache）遺伝子のクローニン
グ AchaのmRNAから得られるcDNAフラグメントが、事前に
プラスミドpEMBL8のSma IとEcoR I部位の間にクローニ
ングされた。該プラスミドからAche遺伝子が、酵素Fsp
I（AcheのATGコドンから−14番目の塩基の部位）とSac
I（Acheの終末コドンから＋117番目の塩基の部位）の作
用により切り出される。
セチルコリンエステラーゼ（Ache）遺伝子のクローニン
グ AchaのmRNAから得られるcDNAフラグメントが、事前に
プラスミドpEMBL8のSma IとEcoR I部位の間にクローニ
ングされた。該プラスミドからAche遺伝子が、酵素Fsp
I（AcheのATGコドンから−14番目の塩基の部位）とSac
I（Acheの終末コドンから＋117番目の塩基の部位）の作
用により切り出される。
ファージT4DNAポリメラーゼと処理した後、得られた
フラグメントをプラスミドpGH80−22のBgl II部位に挿
入し、その末端は、事前にクレノウポリメラーゼで鈍端
にされた。
フラグメントをプラスミドpGH80−22のBgl II部位に挿
入し、その末端は、事前にクレノウポリメラーゼで鈍端
にされた。
得られたプラスミドは、pHG80−82 Acheと名付けら
れた。
れた。
このプラスミドは、以下の目的のために使用される： − pob- ob+ウイルスDNAとともに細胞を同時トラン
スフェクト（cotransfect）すること：次いで、もはや
ポリヘドリンを形成しない組換体が選択される； − またはpob−β−ガラクトシダーゼウイルスDNAと
ともに細胞を同時トランスフェクトすること：この場
合、選択された組換体ウイルスは、白いプラークを形成
するものである。
スフェクト（cotransfect）すること：次いで、もはや
ポリヘドリンを形成しない組換体が選択される； − またはpob−β−ガラクトシダーゼウイルスDNAと
ともに細胞を同時トランスフェクトすること：この場
合、選択された組換体ウイルスは、白いプラークを形成
するものである。
実施例7: β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現：従来公
知の組換体バクロウイルスと本発明の発現ベクターの比
較 ３種の構築（construction）が行われた： − β−ガラクトシダーゼ遺伝子が、ポリヘドリン遺
伝子と“融合（fused）”される（ポリヘドリン−β−G
al）。組換体ウイルスは、通常のタイプである（両方の
強力なプロモーターを有する）。
知の組換体バクロウイルスと本発明の発現ベクターの比
較 ３種の構築（construction）が行われた： − β−ガラクトシダーゼ遺伝子が、ポリヘドリン遺
伝子と“融合（fused）”される（ポリヘドリン−β−G
al）。組換体ウイルスは、通常のタイプである（両方の
強力なプロモーターを有する）。
− β−ガラクトシダーゼ遺伝子が、P10ポリペプチ
ド遺伝子と融合される（Acp10Z）。組換体ウイルスは、
通常のタイプである（両方の強力なプロモーターを有
し、ポリヘドリンを製造する）。
ド遺伝子と融合される（Acp10Z）。組換体ウイルスは、
通常のタイプである（両方の強力なプロモーターを有
し、ポリヘドリンを製造する）。
− β−ガラクトシダーゼ遺伝子が、P10ポリペプチ
ド遺伝子（D3PZ）と融合される。組換体ウイルスは、po
b-タイプであり、ポリヘドリンのプロモーターまたは遺
伝子を有しない。
ド遺伝子（D3PZ）と融合される。組換体ウイルスは、po
b-タイプであり、ポリヘドリンのプロモーターまたは遺
伝子を有しない。
これらの異なる組換体ウイルスは、Spodoptera frugi
perda細胞をトランスフェクトするのに用いた。
perda細胞をトランスフェクトするのに用いた。
以下の時間：感染後24時間、48時間および72時間にお
いて、発色基質としてONPGを用い、β−ガラクトシダー
ゼ活性を培養上清と細胞自身とで測定する。
いて、発色基質としてONPGを用い、β−ガラクトシダー
ゼ活性を培養上清と細胞自身とで測定する。
３種の測定を各点で行う。
結果を、以下の表１に要約する トランスフェクションの48時間後に、培養上清は、非
常に少ない活性しか有しない（細胞溶解はまだ起ってい
ない）。D3PZ細胞は、ポリヘドリン−β−Gal細胞の1.4
倍の活性を有する。72時間後には、かなりの細胞溶解に
もかかわらず、D3PZはまだ他の構造よりも多くの活性を
有している。
常に少ない活性しか有しない（細胞溶解はまだ起ってい
ない）。D3PZ細胞は、ポリヘドリン−β−Gal細胞の1.4
倍の活性を有する。72時間後には、かなりの細胞溶解に
もかかわらず、D3PZはまだ他の構造よりも多くの活性を
有している。
実施例8: P10タンパク質のプロモーターおよび構造遺
伝子を欠いた修飾されたバクロウイルスの構造（constr
uction） 株Autographa californicaに属するバクロウイルスの
全ゲノムDNAを、実施例１に記載の部分消化技術に従
い、酵素Xho IおよびBgl IIで順次切断する。使用した
条件は、以下の通りである： Xho Iによる切断 バクロウイルスDNA 10μｇを、100μの50mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl2、100mM NaClで
希釈する。
伝子を欠いた修飾されたバクロウイルスの構造（constr
uction） 株Autographa californicaに属するバクロウイルスの
全ゲノムDNAを、実施例１に記載の部分消化技術に従
い、酵素Xho IおよびBgl IIで順次切断する。使用した
条件は、以下の通りである： Xho Iによる切断 バクロウイルスDNA 10μｇを、100μの50mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl2、100mM NaClで
希釈する。
DNA μｇ当たり３ユニットの酵素を加える。次の希
釈は、同一の緩衝液で行い、各希釈において、37℃で15
分間のインキュベーションの後、制限酵素生成物（rest
riction product）を、ウイルスDNA1分子当たりただ１
つの開裂だけが与えられる希釈条件を決定するために、
アガロースゲル上で分析する。
釈は、同一の緩衝液で行い、各希釈において、37℃で15
分間のインキュベーションの後、制限酵素生成物（rest
riction product）を、ウイルスDNA1分子当たりただ１
つの開裂だけが与えられる希釈条件を決定するために、
アガロースゲル上で分析する。
適合する希釈は、Xho Iで1/27であった。
Bgl IIによる開裂 バクロウイルスDNA 10μｇを、100μの10mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl2、50mM NaClで希
釈する。
−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl2、50mM NaClで希
釈する。
他の実験条件は、Xho Iで記載されたものと同様であ
る。
る。
適合する希釈は、1/54であった。
Xho IおよびBgl IIで切断された分子の末端は、リゲ
ーション（ligation）がなされる前にクレノウ酵素で修
復される。
ーション（ligation）がなされる前にクレノウ酵素で修
復される。
得られたウイルスDNA分子は、Spodoptera frugiperda
細胞をトランスフェクトするのに用いる。
細胞をトランスフェクトするのに用いる。
これらの条件下で、好適な削除を行ったDNA分子は、
感染可能である。
感染可能である。
これらのウイルスは、P10-ウイルスと呼ばれる；それ
らは、野生型ウイルスよりも多くのポリヘドリンを産生
する。
らは、野生型ウイルスよりも多くのポリヘドリンを産生
する。
実施例9: β−ガラクトシダーゼ遺伝子の本発明の修飾
されたバクロウイルスへの挿入 pUC8プラスミドから得られ、ポリヘドリン遺伝子のAT
Gコドンから＋171番目の塩基の位置に、単一のBamH I部
位を含むバクロウイルスのEcoR Iフラグメント１（実施
例５参照）を有するトランスファーベクターが、この構
造に使用される。
されたバクロウイルスへの挿入 pUC8プラスミドから得られ、ポリヘドリン遺伝子のAT
Gコドンから＋171番目の塩基の位置に、単一のBamH I部
位を含むバクロウイルスのEcoR Iフラグメント１（実施
例５参照）を有するトランスファーベクターが、この構
造に使用される。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子のBamH Iフラグメント
（実施例４参照）が、該トランスファーベクターのBamH
I部位に挿入される。
（実施例４参照）が、該トランスファーベクターのBamH
I部位に挿入される。
かくして得られたベクターは、実施例８に記載のプロ
トコールにより得られた修飾されたP10-バクロウイルス
とともに、Spodoptera frugiperda細胞をトランスフェ
クトするのに用いる。
トコールにより得られた修飾されたP10-バクロウイルス
とともに、Spodoptera frugiperda細胞をトランスフェ
クトするのに用いる。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだバクロウイ
ルスは、もはやポリヘドリンを形成しないが、β−ガラ
クトシダーゼは合成し、それは色素性基質Ｘ−galで特
異的に染色することにより容易に検出及び定量できる。
ルスは、もはやポリヘドリンを形成しないが、β−ガラ
クトシダーゼは合成し、それは色素性基質Ｘ−galで特
異的に染色することにより容易に検出及び定量できる。
かくして得られた修飾されたバクロウイルスによるβ
−ガラクトシダーゼの製造は、実施例７に記載されたよ
うに、野生型バクロウイルス（P10タンパク質プロモー
ターとポリヘドリンのプロモーターを有する）から得ら
れる同様な構造物（construction）の製造と比較され
た。感染後48時間に製造されたβ−ガラクトシダーゼの
レベルは、野生型バクロウイルスの場合よりもP10タン
パク質プロモーターを欠損した修飾されたバクロウイル
スの方が25％高い。
−ガラクトシダーゼの製造は、実施例７に記載されたよ
うに、野生型バクロウイルス（P10タンパク質プロモー
ターとポリヘドリンのプロモーターを有する）から得ら
れる同様な構造物（construction）の製造と比較され
た。感染後48時間に製造されたβ−ガラクトシダーゼの
レベルは、野生型バクロウイルスの場合よりもP10タン
パク質プロモーターを欠損した修飾されたバクロウイル
スの方が25％高い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドボーシェル ジェラール フランス国 30380 サン―クリストル ―レ―ザレ シュマン ド レスペルベ ット 137 (72)発明者 セルッティ マルティーヌ フランス国 30380 サン―クリストル ―レ―ザレ ルート ド モンテーゼ 2997 (72)発明者 カオロー クレール フランス国 30100 ニーム リュ ピ エール セマール 16 (72)発明者 マルタン マリアンヌ フランス国 30700 ウーズ ドメーン ド レスカレット シュマン ド レ スカレット 15 ビス (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 7/00
Claims (12)
- 【請求項１】野生型バクロウイルスのゲノム中に存在す
る２種の強力なレイトプロモーターの１種が不活性であ
ること、および修飾されたバクロウイルス中の活性であ
る強力なレイトプロモーターの制御下に置かれた配列が
野生型バクロウイルスの対応する配列と異なることを特
徴とする発現ベクター。 - 【請求項２】不活性なプロモーターが、ポリヘドリン遺
伝子のプロモーターであり、且つ活性なプロモーター
が、P10タンパク質遺伝子のプロモーターであることを
特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項３】不活性なプロモーターが、P10タンパク質
遺伝子のプロモーターであり、且つ活性なプロモーター
が、ポリヘドリン遺伝子のプロモーターであることを特
徴とする請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項４】そのゲノムが、−95番目の塩基に位置する
EcoR V部位及びポリヘドリン配列のATG開始コドンから
＋910番目の塩基に位置するSsp I部位により囲まれたDN
A配列を欠いていることを特徴とする請求項２に記載の
発現ベクターを得るために使用できる修飾されたバクロ
ウイルス。 - 【請求項５】そのゲノムが、−95番目の塩基に位置する
EcoR V部位及びポリヘドリン配列のATG開始コドンから
＋633番目の塩基に位置するKpn I部位により囲まれたDN
A配列を欠いていることを特徴とする請求項２に記載の
発現ベクターを得るために使用できる修飾されたバクロ
ウイルス。 - 【請求項６】そのゲノムが、−95番目の塩基に位置する
EcoR V部位及びポリヘドリンをコードする配列のATG開
始コドンから＋733番目の塩基に位置するEco47 III部位
により囲まれたDNA配列を欠いていることを特徴とする
請求項２に記載の発現ベクターを得るために使用できる
修飾されたバクロウイルス。 - 【請求項７】そのゲノムがP10タンパク質遺伝子のプロ
モーターを欠いていることを特徴とする請求項３に記載
の発現ベクターを得るために使用できる修飾されたバク
ロウイルス。 - 【請求項８】そのゲノムが、P26ポリペプチドをコード
する配列のATG開始コドンから＋569番目の塩基に位置す
るXho I部位及びP10ポリペプチドをコードする配列のAT
G開始コドンから＋152番目の塩基に位置するBgl II部位
により囲まれたDNA配列を欠いていることを特徴とする
請求項７に記載の修飾されたバクロウイルス。 - 【請求項９】活性プロモーターの制御下に置かれている
マーカー配列を含むことを特徴とする請求項１〜３のい
ずれかに記載のベクター。 - 【請求項１０】マーカー配列がポリヘドリンをコードす
る配列であり、該配列がP10タンパク質遺伝子のプロモ
ーターの制御下に置かれていることを特徴とする請求項
９に記載の発現ベクター。 - 【請求項１１】株が、寄託番号Ｉ−978の下で、コレク
シオン ナシオナル ド ミクロオルガニスム（ナショ
ナル コレクション オブ マイクロオーガニズムス）
に1990年７月17日に寄託された請求項10に記載の発現ベ
クターを構成成分とする修飾されたバクロウイルス株。 - 【請求項１２】マーカー配列がβ−ガラクトシダーゼを
コードする配列であることを特徴とする請求項９に記載
の発現ベクター。
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