JP2016101164A - ベクター - Google Patents
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Abstract
【課題】遺伝的に安定で、組換えの回数を削減した単一のバキュロウイルスゲノムから複数の組換えタンパク質(すなわちバキュロウイルスのものではないタンパク質)を効率良く発現させるバキュロウイルス発現系の提供。【解決手段】発現カセットと隣接する配列を含んでなるトランスファーベクターであって、該配列がバキュロウイルス配列内のctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv−e56遺伝子座から選択されるものである配列トランスファーベクター、並びに該トランスファーベクターから作成される組換えバクミドおよび組換えバキュロウイルス。【選択図】図1
Description
本発明は、遺伝子をバキュロウイルス配列の遺伝子座に挿入するための導入ベクターに関する。また、本発明は、導入ベクターおよび由来するバクミドおよびバキュロウイルスの使用方法にも関する。
バキュロウイルス発現系は、構造的および生化学研究のために真核細胞において何千ものタンパク質を発現させるために用いられている(14)。単一の組換えタンパク質を発現する能力に加え、バキュロウイルスシステムは、また、複合体を形成する複数のタンパク質を共発現させるためにも用いられている(15−22)。全ゲノム相関解析が生きている細胞の多くの重要な機能が多サブユニットタンパク質複合体によって実行されることを明らかにしているので、これは重要である(23)。主に2つの方策を用いて、バキュロウイルスシステムを使用したタンパク質の共発現を達成している。それぞれが1つの組換えタンパク質を発現する2以上のウイルスを細胞に同時に感染させることが、非常に一般的な手法である(19、24、25)。しかしながら、これらの研究でのタンパク質複合体の収率は非常に変わりやすく、異なる2つのバキュロウイルスによる同じ細胞の共感染はポアソン分布とならない(26)。ゆえに、共感染手法は技術的に容易であるにもかかわらず、実際には、大量の精製タンパク質を必要としない用途のための相対的に単一の複合体の回収に限られている。
多くのタンパク質を必要とする構造的研究および大きなワクチン試験などの用途のため、そして多くのサブユニットから形成される複雑な複合体のために、ポリヘドリン又はp10遺伝子座に挿入された複数の同種の発現カセットからタンパク質を共発現させる他の手法が使われている(15−18、22、27)。この手法は、組換えウイルスに感染している培養物のすべての細胞が、再現性のある方法でタンパク質複合体の形成に必要なタンパク質のすべてを発現する点で利点がある。共感染と単一のバキュロウイルス手法を比較すると、後者は組換え複合体の有意に良好な収率を示した(28)。しかしながら、単一の組換えウイルスを使用した複数のタンパク質の発現に欠点がないわけではない。桿状のバキュロウイルスはそのゲノムに挿入の完全な耐性を示すが、遺伝子は相同組換えによってウイルスへ移るので、導入ベクターは大腸菌において容易に操作できるサイズでなければならない。したがって、導入ベクターに挿入されうる遺伝子の数には制限がある。このため、実際には、単一の遺伝子座から4以上のタンパク質をめったに発現させることができない。加えて、バキュロウイルスは、相同組換えを促す配列を含み、タンパク質を発現する(29−32)。したがって、大量の反復配列を含有するウイルスは、再編成および組換えを起こしやすい(21、33、34)。
単一のバキュロウイルス共発現手法は、ポリヘドリン遺伝子座にTn7標的をすでに含有するバクミドのchiA/カテプシン遺伝子座に、loxP部位が挿入されている点で変更されている(20)。これにより、大腸菌での組換えを用いてこれら各々の遺伝子座に複数の発現カセットが挿入される。この系は、異なる遺伝子を発現するように変更された発現カセットの反復的な重複に依存すると推測されるので、この系への挿入は遺伝的に多少不安定であることが証明されている(21)。
近年、バキュロウイルス研究は、ウイルス遺伝子が選択的にノックアウトされたET組換え系の使用により恩恵を受けている(35−49)。しかしながら、p10およびポリヘドリン以外の遺伝子の遺伝子座にタンパク質の発現を設計し、促すためのこの技術の潜在能力は研究されていない。
本発明は、単一のバキュロウイルスゲノムから複数の組換えタンパク質(すなわちバキュロウイルスのものではないタンパク質)を効率良く発現させる方法に関する。この方法によって、単一タンパク質発現カセットがET組換え系を使用してウイルスゲノム内の異なる遺伝子座に効率よく挿入される。さらに、この方法により、数多くのサブユニットを有する複合体が発現される。
発現系としてバキュロウイルスを使用した単一タンパク質の発現が十分に確立されている。発現系の基本的な方法論は、その初期の製造からほとんど変化していない。133kbのバキュロウイルスdsDNAゲノムは非常に大きくて、直接操作することができない。したがって、大腸菌において、外来タンパク質をコードする遺伝子をAcMNPV昆虫ウイルスの発現カセットを含むベクターにクローニングし、ついで、これをウイルスDNAにて昆虫細胞へ導入する。この昆虫細胞では、ウイルスおよび細胞のタンパク質が相同組換えを媒介し、その結果外来タンパク質を発現する(昆虫細胞に関して)感染性のウイルスが産生される。組換えが起こる場合にはただ複製するだけであるウイルスゲノム(1、2)、そして組換えウイルスの選別の速度を上げるトランスポゾンTn7(3)の使用に基づくバクミドによる大腸菌における組換えの実行を含め、このテーマにおいていくつかの変更が既になされている。また、先に簡単に述べたように、昆虫細胞の多タンパク質複合体の発現は、バキュロウイルス発現系を使用して達成された。まず最初に、単一タンパク質を各々発現する複数のウイルスを用いて感受性細胞に共感染させ、タンパク質複合体を発現させた後に精製した。しかしながら、これは効率が良いとは言い難く、スケールアップに適当となるほどの再現性がない。別法として、複数の発現ユニットを組み込むが、単一のウイルス遺伝子座と組換えを起こすベクターが製造された(4−6)。これらのベクターは、すべての組換えタンパク質サブユニットを感染細胞ごとに生産し、組換えタンパク質複合体を有意に高く回収する点に利点があった。加えて、単一のウイルスだけがすべてのタンパク質を発現するので、感染の結果は非常に再現性があった。これらのベクターの不利な点は2つある。第一に、ベクターが反復配列を含み、バキュロウイルスが相同組換えを促すタンパク質を発現するので、特に3又は4の発現ユニットを含むコンストラクトからの発現は、何世代ものウイルス継代に渡って必ずしも遺伝的に安定していない(それは、バキュロウイルスタンパク質発現のための産業的なスケールアップに必要である)。第二に、容易に維持でき、これらのベクターから発現されうるタンパク質の数を制限する大腸菌において操作することができる挿入物の大きさに実務上制限がある。複数のタンパク質の産生のために提唱された他の手法は、バキュロウイルス内の一つの遺伝子座に外来タンパク質(一又は複数)を挿入し、次いでそのタンパク質を発現するウイルスを選別し、そしてこのウイルスゲノムを用いて第二の遺伝子座に組換えて他のタンパク質を発現させることである(7)。しかしながら、この手法には高い技術と時間(第一遺伝子座のために16日および各々続く遺伝子座のために25日)が必要であるため、この手法はほとんど使われていなかった。近年の開発は、BACベースのTn7トランスポゾン系を変更してバキュロウイルス内の第二遺伝子座にLoxP部位を挿入し、大腸菌内のこの遺伝子座に別の遺伝子を挿入させることである(8)。しかしながら、この方法は依然として、細菌ベクター内のプロモーターに重複からの反復配列があることは、コンストラクトが何世代ものウイルス継代に遺伝的に不安定であることを示し、さらに導入ベクターが大腸菌での操作に対して最大の実務上のサイズに急速に達するという問題を抱えている。
本発明の方法は、遺伝的な不安定性および複数回の組換えの必要性といった、従来法に特有の問題の少なくともいくつかを克服する。
第一態様によると、本発明は、バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
以下を含むグループ化選別カセットと、
(i) 第一の選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
(ii)第二の選択マーカーをコードする発現可能な配列、
この発現カセットおよびグループ化選別カセットに隣接する配列であって、このとき、バキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応する配列と
を含んでなる導入ベクターを提供する。
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
以下を含むグループ化選別カセットと、
(i) 第一の選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
(ii)第二の選択マーカーをコードする発現可能な配列、
この発現カセットおよびグループ化選別カセットに隣接する配列であって、このとき、バキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応する配列と
を含んでなる導入ベクターを提供する。
本発明の導入ベクターを用いて、効率良く遺伝子をバキュロウイルス配列の遺伝子座に挿入すること、そして、該遺伝子を含むバキュロウイルス配列を選択することができる。特に、グループ化選別カセットによって、単一の選択マーカーを用いた選別と比較して、陽性クローン(すなわち挿入された遺伝子を含有しているバキュロウイルス配列)の識別が実質的に増加した。これにより、単一の選択マーカーの使用に勝る有意な利点を示す。少数のバキュロウイルスのみが形質転換するので、マーカーは非常に低いレベルで発現されるだけである。例えば、マーカーが抗生物質である場合、非常に低いレベルの抗生物質の使用でよい。この結果、使用する抗生物質に耐性がある細菌変異体が選別される。したがって、プレート上で生育する細菌には、変更を含んでいないものもある。2つの陽性選別法を使用することにより、このような偽陽性を選別する可能性が克服される。
本発明の導入ベクターは、相同組換えによりバキュロウイルス配列と組み換わり、バキュロウイルス配列内に遺伝子を挿入することができる限り、いずれの適切なベクターであってよい。適切な導入ベクターは当業者にとって周知である。導入ベクターの重要な特徴はさらに後述する。
バキュロウイルス配列に挿入される遺伝子は、任意の異種遺伝子(すなわちバキュロウイルスのものでない遺伝子)であってよい。異種遺伝子がタンパク質複合体のサブユニットをコードすることが好ましい。異種遺伝子は、ウイルスタンパク質、レセプターの構成成分又はシャペロン複合体をコードしてよい。異種遺伝子が、他のウイルスタンパク質と共にウイルス様粒子(VLP)を形成しうるウイルスタンパク質をコードすることが、特に好ましい。
バキュロウイルス配列に遺伝子が挿入される遺伝子座は、挿入された遺伝子が発現し、更にバキュロウイルス配列の複製能を妨げない任意の適切な遺伝子座であってよい。さらに、使用する遺伝子座は、バキュロウイルスが細胞に感染する能力、すなわち複製するか又は細胞から細胞へ広がる能力に作用するものであってはならない。このような遺伝子座には、ポリヘドリンおよびp10の遺伝子座が含まれる。本発明の発明者等によって同定された更なる他の適切な遺伝子座には、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56が含まれる。
バキュロウイルス配列は、昆虫細胞および大腸菌などの原核細胞において複製しうる任意の適切なバキュロウイルス配列であってよい。特に、BACレプリコンを含有する任意のウイルス性バキュロウイルスゲノムが用いられてよい。適切なバキュロウイルス配列にはAcMNPVバクミドが含まれる。
「発現カセット」なる用語は、遺伝子の発現に必要な成分の組合せを指す。したがって、発現カセットは、真核細胞(すなわち昆虫細胞)においてコードされた遺伝子の発現を可能とする適切なプロモーターと、該遺伝子配列に隣接する適切なポリアデニル化シグナル配列とを含む。真核細胞における遺伝子の発現のための発現カセットは、当業者に周知である。特に好適なプロモーターには、バキュロウイルスウイルス性後期プロモーター(例えばp35)又はウイルス性最後期プロモーター(例えばポリヘドリンおよびp10プロモーター)が含まれる。適切なポリアデニル化シグナル配列には、トリプトファンヒドロキシラーゼ(Tph)ポリアデニル化配列又はバキュロウイルス遺伝子からのポリアデニル化配列が含まれる。
発現カセットは、複数の遺伝子が発現する複数の遺伝子(例えば2、3又は4の遺伝子)を含みうる。しかしながら、一般に、発現カセットが単一の遺伝子を含むことが好ましい。
グループ化選別カセットは、遺伝子をうまく取り込んだクローンの識別および単離を向上させることが明らかになった。グループ化選別カセットは、2つの異なる選択マーカーを含む。また、カセットは、一又は複数の細菌性プロモーターのような細菌細胞におけるマーカーの発現に必要な任意の成分を含む。遺伝子を取り込んだ配列を選別する工程は、両方の選択マーカーを含む配列について選別することを含む。この選別工程は、細菌細胞、例えば大腸菌において実行される。選択マーカーは、カセットを含む細胞が選択される任意のマーカーであってよい。例えば、マーカーは、細胞又はコロニーの色の出現又は変化を引き起こすマーカーのような可視化されるものであってよい。あるいは、マーカーは、例えば抗生物質に耐性を与えうる。2つの選択マーカーは、同じタイプのマーカー、例えば2つの異なる抗生物質に対する耐性、又は異なるタイプのマーカー、例えば抗生物質耐性と視覚マーカーであってもよい。第一選択マーカーは好ましくは、LacZα断片といった視覚マーカーであり、これによりLacZα断片を発現する細胞がIPTGおよびX−galの存在下で青色になる。第二選択マーカーは、好ましくは、抗生物質耐性、例えばクロラムフェニコール、テトラサイクリン、ピューロマイシン、アンピシリン、ペニシリン、アプラマイシン、カナマイシン又はフレオマイシンに対する耐性を与える任意のマーカーである。第二マーカーがフレオマイシンに耐性を与えることが特に好ましい。
好ましい実施態様では、グループ化選別カセットはLoxP組換え配列が隣接している。LoxP組換え配列は、介在配列の欠失を引き起こすCreリコンビナーゼの存在下で共に組み合わさる。したがって、グループ化選別カセットは、同じ選択マーカーが、任意の他の遺伝子をバキュロウイルス配列に挿入する場合に使用されるように取り除かれてよい。LoxP部位は、1回のみの組換えが部位間で生じるように変更されるのが好ましい。適切な変更LoxP部位、例えばLox66およびLox71変更部位は、当業者に公知である。
発現およびグループ化選別のカセットに隣接する配列は、導入ベクターとバキュロウイルス配列との間で相同組換えを生じさせる遺伝子座の配列と実質的に対応する。各々の隣接配列は、好ましくは少なくとも20bp長、より好ましくは少なくとも30bp長、更により好ましくは少なくとも50bp長であり、遺伝子座の配列と特異的に組換えさせる配列を有する。
第二態様によると、本発明は、組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと本発明の第一態様による導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
グループ化選別カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法を提供する。
バクミドと本発明の第一態様による導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
グループ化選別カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法を提供する。
組換えバクミドは、グループ化選別カセットに応じて標準的な技術を使用して選別されうる。
組換えバクミドの製造方法は、さらに、バクミド又はその発現産物において遺伝子の存在を検出することを含んでよい。特定の遺伝子に応じて、適切なスクリーニング技術が使用されうる。
さらに、選別カセットがLoxP組換え配列に隣接する場合、この方法は好ましくは、例えばバクミドをCreリコンビナーゼにさらすことによってLoxP部位間に組換えを誘導し、グループ化選別カセットを取り除くことを含む。Creリコンビナーゼは、好ましくは、誘導性プロモーター、例えばアラビノースプロモーターの制御下にある。グループ化選別カセットを取り除く利点は、更なる導入ベクターがバクミドと組み換わることができることであり、この更なる導入ベクターは同じグループ化選別カセットを含むものである。更なる組換えバクミドの選別は、1回目の組換えの後に用いたものと同じ技術を用いて実施することができる。
一般に、原核細胞ベースの系が容易かつ迅速に操作できるので、組換えバクミドの製造方法は原核細胞において実行される。原核細胞ベースの系が相同組換えを促すことが好ましい。このような系には、欧州特許出願EP−A−1291420に記述されるラムダレッド組換え系が含まれる。好ましくは、組換えバクミドの製造方法は大腸菌において実行される。この方法は、大腸菌株EL350を使用して実行されることが特に好ましく、この菌株は、温度で調節されるラムダPLプロモーターの制御下にexo、betおよびgamを発現する統合ラムダプロファージと、アラビノース誘導性プロモーターの制御下にCreリコンビナーゼとを有する。
バクミドが多くの異種遺伝子、すなわち1、2、3、4、5、6、7、8以上の異種遺伝子を含むことができるように、組換えバクミドの製造方法は複数回繰り返すことができる。各々の挿入された遺伝子を発現するための異なるプロモーターを使用しようとすることによって、そして、各遺伝子が異なる遺伝子座に挿入されているので、バクミド内の反復配列を低減する又は有することを防ぎ、これによりバクミドが良好な遺伝的安定性を有することができる。少なくとも一つの必須遺伝子が各々挿入された異種遺伝子の間に位置することが、さらに好ましい。このような配位により、挿入した配列の何れかの間に相同組換えが起これば、必須遺伝子は欠失し、生きることができないバクミドとなることが確実となる。
第三態様によると、本発明は、本発明の第二態様による方法によって得られた組換えバクミドを提供する。また、挿入した遺伝子を含むバクミドは、LoxP配列のレムナントも含んでよい。これらのレムナントは、バクミドを識別するためのマーカーとして使われてよい。バクミドは好ましくは、少なくとも6、7、8又は9の異種遺伝子を含む。
第四態様によると、本発明は、組換えバキュロウイルスの製造方法であって、バキュロウイルスが製造されるような条件下で、本発明の第二態様による方法によって得られた組換えバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法を提供する。好ましくは、真核細胞は昆虫細胞であり、より好ましくは、昆虫ヨトウガ又はイラクサギンウワバ、例えば(Sf21、Sf9又はTN 5B-1-4)昆虫細胞由来のものである。バキュロウイルスは、標準的な技術と試験する挿入異種遺伝子の発現を使用して単離することができる。
第五態様によると、本発明はまた、本発明の第四態様による方法によって得られた組換えバキュロウイルスを提供する。
第六態様によると、本発明は、複数の異種タンパク質を発現する組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスであって、このそれぞれのタンパク質がバクミド又はバキュロウイルスの異なる遺伝子座から発現されるものである組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスを提供する。少なくとも一の必須遺伝子が異種タンパク質を発現する各遺伝子の遺伝子座の間に位置することがさらに好ましい。このような配位により、異種遺伝子を発現する遺伝子座の間で相同組換えが起これば、必須遺伝子が欠失し、生きることができないバクミド又はバキュロウイルスが確実に生じる。好ましくは、バクミド又はバキュロウイルスは、少なくとも3、より好ましくは少なくとも5、最も好ましくは少なくとも8のタンパク質を発現する。タンパク質は、異種性、すなわち天然に生じるバキュロウイルスによってコードされていない。コードされた異種タンパク質は、タンパク質複合体、例えばVLP、レセプター複合体又はシャペロン複合体のサブユニットであることがさらに好ましい。
組換えバクミド又はバキュロウイルスの異なる遺伝子の遺伝子座がctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、odv-e56およびp10から選択されることが更に好ましい。このような遺伝子座の位置は、下記の表1にバキュロウイルスAcMNPVに関して具体的に記述する。当業者は、この情報を用いて他のバキュロウイルス株およびバクミド内の遺伝子座の位置を容易に決定することができる。
第七態様によると、本発明はまた、組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスであって、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56の一又は複数の遺伝子の遺伝子座で異種タンパク質をコードする発現カセットが挿入しているものを提供する。
これらの遺伝子の遺伝子座は、バクミド又はバキュロウイルスの必須機能を破壊させずに異種タンパク質を特異的に高く発現させることが明らかにされている。
好ましくは、組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスは複数のタンパク質をコードしており、各々の発現カセットは異なる遺伝子座に挿入される。組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスは、少なくとも3、より好ましくは少なくとも5、最も好ましくは少なくとも8のタンパク質をコードすることが更に好ましい。コードされた異種タンパク質は、タンパク質複合体、例えばVLP、レセプター複合体又はシャペロン複合体のサブユニットであることが更に好ましい。
第八態様によると、本発明はまた、バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
該発現カセットに隣接する配列であって、バキュロウイルス配列内の遺伝子座の配列に実質的に対応し、該遺伝子座がctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56から選択されるものである配列と
を含む導入ベクターを提供する。
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
該発現カセットに隣接する配列であって、バキュロウイルス配列内の遺伝子座の配列に実質的に対応し、該遺伝子座がctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56から選択されるものである配列と
を含む導入ベクターを提供する。
上記のように、遺伝子を列挙した遺伝子の遺伝子座に挿入することによって、バキュロウイルス配列の必須機能を破壊することなく高いレベルで遺伝子を発現させることができることが明らかになった。
第九態様によると、本発明はまた、組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと本発明の第八態様による導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
発現カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法を提供する。
バクミドと本発明の第八態様による導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
発現カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法を提供する。
このような組換えバクミドの製造とこのようなバクミドの選別の方法は、当業者にとって周知である。また、本発明はこの方法によって得られた組換えバクミドも提供する。
第十態様によると、本発明はまた、組換えバキュロウイルスの製造方法であって、本発明の方法による組換えバクミドを製造し、バキュロウイルスが製造されるようにバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法を提供する。
このような組換えバキュロウイルスの製造方法は、当業者に周知である。また、本発明はこの方法によって得られた組換えバキュロウイルスも提供する。
また、本発明は、本発明の何れかの態様による導入ベクター、バクミド又はバキュロウイルスを含む細胞を提供する。
また、本発明は、一又は複数のタンパク質の製造方法であって、適切な条件下で本発明の何れかの態様による組換えバクミド又はバキュロウイルスを培養することを含む方法を提供する。一又は複数のタンパク質は一又は複数の遺伝子によってコードされ、VLPのようなタンパク質複合体又はシャペロン複合体を形成するように組み合わせてよい。一又は複数のタンパク質は、当業者に周知の標準的な技術を使用して単離されうる。
本発明を、以下の図を参照して例示のみとしてここに記載する。
バキュロウイルス発現系は、酵素的および構造的な研究のための、正しく折り畳まれた真核生物タンパク質を大量に製造するための可能性が十分に確立されている。しかしながら、ほとんどではないが多くのタンパク質は、いくつかの異なる遺伝子の生成物から作られる複合体のように、細胞内で活性であることが徐々に明らかになっている。タンパク質構造の発見の速度が上がると、タンパク質複合体の迅速かつ確実な製造および精製のためのシステムが確立されることが求められている。これは、多くのタンパク質サブユニットの共発現や真核生物の折畳みおよびプロセシングを必要とする大きな複合体に特にいえることである。以前、発明者は、同じバキュロウイルスゲノムから2、3、4および5のタンパク質を発現することが可能なバキュロウイルス導入ベクターを開発した。以前の研究の発明者の主な目的は、構造的および酵素的な研究のために、非等モル量のウイルスコードタンパク質を含有するウイルスタンパク質複合体を大量に合成することが可能なシステムを生産することである。これらのシステムによる技術からの所見の一つは、複数の遺伝子を発現する単一のバキュロウイルスが、単一の遺伝子を発現する複数のバキュロウイルスによる昆虫細胞の共感染よりも、所望のタンパク質複合体を形成するのにより効果があることである。今回の研究において、発明者等は、生物学上関連する哺乳類のタンパク質複合体のために複数のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを製造するために、新しい技術を使用してこの所見を利用した。
特に、発明者等は、同時に複数のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの迅速かつ効率的な製造のために新規な細菌染色体工学技術を応用し、改良した。開発した新規のシステムは、従来の方法の30倍の効率であり、バキュロウイルスゲノム内の任意の遺伝子座に慣例的に遺伝子を挿入することが可能である。これらの研究により、組換えタンパク質を高く発現させる、バキュロウイルスゲノム内の7つの新規な遺伝子の遺伝子座を同定した。さらに、発明者等は、複数の反復ラウンドの組換えを実行し、異なる複数の単一遺伝子挿入物からの一つの複合体において複数のタンパク質を発現するウイルスゲノムを生成させることができることを示した。例として、発明者等は、インフルエンザA型(H7サブタイプ)およびブルータングウイルス(セロタイプ1)、並びに癌研究の焦点である8サブユニットの哺乳類シャペロン複合体CCT(TCP)のためのVLPタンパク質複合体を発現した。
材料および方法
多遺伝子座単一遺伝子の挿入は、ラムダred組換えを用いて大腸菌において達成される。本発明には、多タンパク質発現に以前は使われていなかったバキュロウイルス遺伝子座の使用と、バキュロウイルスゲノムから取り除かれ、その後再利用されうる選択マーカーの取込みが含まれる。他のシステムとは異なり、組換えタンパク質遺伝子は反復配列が隣接しておらず、その遺伝的安定性を改善する。
多遺伝子座単一遺伝子の挿入は、ラムダred組換えを用いて大腸菌において達成される。本発明には、多タンパク質発現に以前は使われていなかったバキュロウイルス遺伝子座の使用と、バキュロウイルスゲノムから取り除かれ、その後再利用されうる選択マーカーの取込みが含まれる。他のシステムとは異なり、組換えタンパク質遺伝子は反復配列が隣接しておらず、その遺伝的安定性を改善する。
導入ベクターは、標的相同組換えに対するAcMNPVの領域、発現カセット(AcMNPVプロモーター、ポリリンカー、ポリアデニル化シグナル)および細菌の選別カセットを含有する。使用するAcMNPVプロモーターは、ウイルス後期(例えばp35)又は最後期(例えばポリヘドリン、p10)遺伝子からのものである。細菌の選別カセットは変異形LoxP部位−細菌の選択マーカー−変異形LoxP部位からなる。変異形LoxP部位は、LoxP66およびLoxP71の変異体上の変異体である(9)。各選択マーカーのLoxP部位は、残っているLoxP部位を破壊して組換えの際にマーカーが検出されるように設計する。各選択マーカーは、同じバキュロウイルスに挿入された異なる選択マーカー遺伝子間で組換えが起こらないように、異なるLoxP変異アームを有する。
組換えタンパク質の多遺伝子座発現に使用するシステムの選択
最初の研究計画には、昆虫細胞における相同組換えの使用、又は大腸菌におけるET組換えの代替方法を用い、バキュロウイルスゲノム内の異なる遺伝子座に組換えタンパク質のための発現カセットを効率良く挿入させた。発明者等の準備データは、導入ベクターの直線化により、生産された組換えタンパク質以外の陽性選択を有しなかった遺伝子座(p10)での組換え頻度が有意に増加した(最高およそ30%)ことを示唆した。研究計画の開始時には、特定の遺伝子座での組換え遺伝子の挿入を達成し、結果として生じたタンパク質の発現を検査するために要する時間とその再現性の面で、2つの系(ET組換えおよび昆虫細胞組換え)を考慮していた。発現の各ラウンドに要する時間の面で、ET組換え系がより迅速であり、これは主にバキュロウイルスの第二遺伝子座に遺伝子を挿入するためのバキュロウイルスゲノムの調製に必要な時間が低減したことによる。加えて、導入遺伝子の発現とは関係なく遺伝子の挿入を確認することができるアプローチを設計することができたので、発現を確認するために昆虫細胞内でウイルスを生育させる必要は、完全な昆虫細胞ベースの系の場合ほど重要ではなかった。第二に、バキュロウイルス系に挿入された遺伝子とマーカーを同時に導入することができるが、このようなマーカーの数には限界があり、それぞれは一度しか用いることができなかった。このプロジェクトの目的の一つは、マウスCCT(TCP1)複合体(8サブユニット)を発現させることであったので、ET組換え手法が複数の遺伝子の挿入させることができ、かつ迅速であったので、この系を初期の最優先研究課題とした。
最初の研究計画には、昆虫細胞における相同組換えの使用、又は大腸菌におけるET組換えの代替方法を用い、バキュロウイルスゲノム内の異なる遺伝子座に組換えタンパク質のための発現カセットを効率良く挿入させた。発明者等の準備データは、導入ベクターの直線化により、生産された組換えタンパク質以外の陽性選択を有しなかった遺伝子座(p10)での組換え頻度が有意に増加した(最高およそ30%)ことを示唆した。研究計画の開始時には、特定の遺伝子座での組換え遺伝子の挿入を達成し、結果として生じたタンパク質の発現を検査するために要する時間とその再現性の面で、2つの系(ET組換えおよび昆虫細胞組換え)を考慮していた。発現の各ラウンドに要する時間の面で、ET組換え系がより迅速であり、これは主にバキュロウイルスの第二遺伝子座に遺伝子を挿入するためのバキュロウイルスゲノムの調製に必要な時間が低減したことによる。加えて、導入遺伝子の発現とは関係なく遺伝子の挿入を確認することができるアプローチを設計することができたので、発現を確認するために昆虫細胞内でウイルスを生育させる必要は、完全な昆虫細胞ベースの系の場合ほど重要ではなかった。第二に、バキュロウイルス系に挿入された遺伝子とマーカーを同時に導入することができるが、このようなマーカーの数には限界があり、それぞれは一度しか用いることができなかった。このプロジェクトの目的の一つは、マウスCCT(TCP1)複合体(8サブユニット)を発現させることであったので、ET組換え手法が複数の遺伝子の挿入させることができ、かつ迅速であったので、この系を初期の最優先研究課題とした。
実施例1
ET組換えを効率良く選別するための試薬の開発
ET手法を使用した最初の実験は期待できるものではなかった。レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)を完全なAcMNPVゲノムを保因している細菌性人工染色体(バクミド)に挿入し、ルシフェラーゼレポーターと共に組み込んだクロラムフェニコール耐性遺伝子によって選別した実験を行った。クロラムフェニコール耐性細菌コロニーを回収したが、その後の分析により、それらがルシフェラーゼレポーターにより正しく変更されたバクミドを含有していないことがわかった。AcMNPVを複製する条件下で昆虫細胞においてのみ発現されるように設計されたレポーターをGFPに変えた場合にも、同様の結果が得られた。しかしながら、クロラムフェニコール選別なしで、GFPコンストラクトを大腸菌の組換えに使い、バクミドDNAを完全に形質転換した大腸菌集団のために調製した場合、このDNAは、昆虫細胞(Sf21)に形質移入されると2、3の蛍光焦点が生じた。これらのデータは、組換え自体にではなく、挿入を含有している細菌の組換え後の選別に問題があることを示唆した。これらの問題を克服するために、発明者等は、変更LoxP組換え部位に隣接させたLacZα断片およびゼオシン耐性遺伝子に基づいてグループ化マーカー系を組み込んだ新規な選別カセットを設計した(図1A)。このシステムを用いて、十分なゼオシンを選別プレートに加え、バックグラウンドのコロニー成長を取り除くのではなく低減し、組換えを、IPTGおよびX−galの存在下で青いコロニー表現型に基づいて選択した。クロラムフェニコール(cat)およびグループ化選別系を用いた組換え体回収の相対的な効率を評価するために、発明者等は、変更していないバクミドを含有する組換えコンピテント大腸菌に、30ng(およそ12.5fmol)のクロラムフェニコールベース又はグループ化選別カセットを電気穿孔した実験を行った(図1B)。外来タンパク質コード配列の取込みに理想的な系は、挿入した遺伝子の繰り返しPCRを要しないので、発明者等は、PCR増幅DNA間の組換えの効率も比較した。これは、ET組換えおよび制限酵素により生じゲル精製されたDNAには決まった手順である。PCRプライマーは、PCR産物の端が制限酵素により生じた断片の端に対応するように、設計した。
ET組換えを効率良く選別するための試薬の開発
ET手法を使用した最初の実験は期待できるものではなかった。レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)を完全なAcMNPVゲノムを保因している細菌性人工染色体(バクミド)に挿入し、ルシフェラーゼレポーターと共に組み込んだクロラムフェニコール耐性遺伝子によって選別した実験を行った。クロラムフェニコール耐性細菌コロニーを回収したが、その後の分析により、それらがルシフェラーゼレポーターにより正しく変更されたバクミドを含有していないことがわかった。AcMNPVを複製する条件下で昆虫細胞においてのみ発現されるように設計されたレポーターをGFPに変えた場合にも、同様の結果が得られた。しかしながら、クロラムフェニコール選別なしで、GFPコンストラクトを大腸菌の組換えに使い、バクミドDNAを完全に形質転換した大腸菌集団のために調製した場合、このDNAは、昆虫細胞(Sf21)に形質移入されると2、3の蛍光焦点が生じた。これらのデータは、組換え自体にではなく、挿入を含有している細菌の組換え後の選別に問題があることを示唆した。これらの問題を克服するために、発明者等は、変更LoxP組換え部位に隣接させたLacZα断片およびゼオシン耐性遺伝子に基づいてグループ化マーカー系を組み込んだ新規な選別カセットを設計した(図1A)。このシステムを用いて、十分なゼオシンを選別プレートに加え、バックグラウンドのコロニー成長を取り除くのではなく低減し、組換えを、IPTGおよびX−galの存在下で青いコロニー表現型に基づいて選択した。クロラムフェニコール(cat)およびグループ化選別系を用いた組換え体回収の相対的な効率を評価するために、発明者等は、変更していないバクミドを含有する組換えコンピテント大腸菌に、30ng(およそ12.5fmol)のクロラムフェニコールベース又はグループ化選別カセットを電気穿孔した実験を行った(図1B)。外来タンパク質コード配列の取込みに理想的な系は、挿入した遺伝子の繰り返しPCRを要しないので、発明者等は、PCR増幅DNA間の組換えの効率も比較した。これは、ET組換えおよび制限酵素により生じゲル精製されたDNAには決まった手順である。PCRプライマーは、PCR産物の端が制限酵素により生じた断片の端に対応するように、設計した。
グループ化選別により、陽性コロニーの数は、DNA断片の組換えがPCRによって生成された場合のクロラムフェニコールのみの選別と比較して20倍、プラスミドDNAの制限酵素消化によって生じた場合に30倍の増加となった(図1B)。これらの相違は有意であった(t検定、p=0.03)。クロラムフェニコール選別では、PCRによって回収されるコロニーの数と制限酵素によって生じたDNAとの間に相違はなかった。しかしながら、グループ化選別では、コロニーの平均数は、PCR増幅されたDNAと比較して制限酵素により生じたDNAでは4倍多かった(t検定、p=0.05)。新規なグループ化選別からの組換えが真正であることを確認するために、挿入した発現コンストラクトを含む変更バクミドを発現させる、PCRを、陽性コロニーから精製したバクミドDNAにおいて実行した。ゼオシン耐性マーカーの内側の配列に対して一つのプライマーを設定し、導入DNA内でなく正しい挿入部位に隣接するバクミドDNAにのみ存在する配列を標的として一つのプライマーを設定した。ゆえに、PCR産物は、組換えに用いた線状DNAとバクミドとの間で組換えが生じた場合にのみ生成する。12の異なるバクミドDNA試料をこの方法を使用して試験したところ(図1C、レーン1−12)、すべては正しく目標とした組換えのための診断用PCR産物について陽性であった。これに対して、バクミドDNA単独および組換えに用いたDNA断片を含有するプラスミドDNAはいずれも、PCR産物を生成するためのテンプレートとして機能しなかった(図1C、それぞれレーン14および15)。組換えにより感染組換えバキュロウイルスが回収されたことを更に確認するために、同じ12のPCR陽性バクミドクローンを、Sf21細胞に形質移入し、2代継代し、次いで各組換え体を感染させた細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼ活性を感染の48時間後にアッセイした。12の組換えウイルスの各々を感染させた細胞は、バックグラウンドの106倍のウミシイタケルシフェラーゼ活性を有した(図1D)。これらのデータに基づいて、発明者等は、更なる研究のためのグループ化選別の使用を進めた。
実施例2
選択マーカーのCre媒介除去により、同じグループ化選別による複数回の組換えが可能となる
単一遺伝子座の挿入を使用して複数の異なるサブユニットを有するタンパク質複合体を発現させるために、グループ化マーカー系を、選別カセットが変更LoxP部位に隣接するように設計した。これらの部位は、Creが媒介する組換えを単回に制限するlox66およびlox71の変異(1)と、野生型loxP部位に対する相同性を低減するスペーサー内の変異を組み込む。ゆえに、Creリコンビナーゼと共に変更バクミドをインキュベートすると、グループ化選択マーカーが除去され、lox組換え部位が不活性となるが、バキュロウイルス発現カセットが残る(図2A)。この方策を用いてバクミドDNAに複数の挿入がうまく操作されたことを確認するために、Cre組換えを用いて、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターが挿入されたバクミドからグループ化マーカーを取り除いた。EL350細胞株を用いて大腸菌において組換えを達成した(2)。この細胞株は、温度制御λPLプロモーターの制御下にexo、betおよびgamを、そしてアラビノース誘導性プロモーターの制御下にCreリコンビナーゼを発現する統合されたラムダプロファージを有する。ウミシイタケルシフェラーゼグループ化選別挿入物を組み込むように変更された3つのバクミドを含有するEL350細胞(図1)を、アラビノースにて誘導し、次いで、カナマイシンを含むプレートに広げ、バクミドおよびX-galについて選別して、Creが媒介した組換えによって選択マーカーを失ったコロニーをスクリーニングした。バクミドDNAを4つの推定組換え体から精製し、Cre媒介組換えを、選択マーカーに隣接するプライマーを用いたPCRを使用して確認した(図2B)。4つすべての組換え体は、成功したCre組換えから予想されるサイズと一致するPCR産物を有した。これは、この4つの組換え体の変更loxP部位全体を配列決定することによって更に確認した(図2C)。この組換え体は、loxP71およびloxP66の両変異を組み込み、組換えの更なるラウンドにコンピテントでない無効loxPを含んでいた。Cre媒介バクミド組換え体が昆虫細胞において生存可能なままであったことをさらに確認するために、先の通りに、バクミドDNAを昆虫細胞に形質移入し、2代継代させた後にルシフェラーゼ活性をアッセイした。すべての組換え体は、Cre組換え前の親のバクミドに等価であるウミシイタケルシフェラーゼ活性を有していた(図2D)。
選択マーカーのCre媒介除去により、同じグループ化選別による複数回の組換えが可能となる
単一遺伝子座の挿入を使用して複数の異なるサブユニットを有するタンパク質複合体を発現させるために、グループ化マーカー系を、選別カセットが変更LoxP部位に隣接するように設計した。これらの部位は、Creが媒介する組換えを単回に制限するlox66およびlox71の変異(1)と、野生型loxP部位に対する相同性を低減するスペーサー内の変異を組み込む。ゆえに、Creリコンビナーゼと共に変更バクミドをインキュベートすると、グループ化選択マーカーが除去され、lox組換え部位が不活性となるが、バキュロウイルス発現カセットが残る(図2A)。この方策を用いてバクミドDNAに複数の挿入がうまく操作されたことを確認するために、Cre組換えを用いて、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターが挿入されたバクミドからグループ化マーカーを取り除いた。EL350細胞株を用いて大腸菌において組換えを達成した(2)。この細胞株は、温度制御λPLプロモーターの制御下にexo、betおよびgamを、そしてアラビノース誘導性プロモーターの制御下にCreリコンビナーゼを発現する統合されたラムダプロファージを有する。ウミシイタケルシフェラーゼグループ化選別挿入物を組み込むように変更された3つのバクミドを含有するEL350細胞(図1)を、アラビノースにて誘導し、次いで、カナマイシンを含むプレートに広げ、バクミドおよびX-galについて選別して、Creが媒介した組換えによって選択マーカーを失ったコロニーをスクリーニングした。バクミドDNAを4つの推定組換え体から精製し、Cre媒介組換えを、選択マーカーに隣接するプライマーを用いたPCRを使用して確認した(図2B)。4つすべての組換え体は、成功したCre組換えから予想されるサイズと一致するPCR産物を有した。これは、この4つの組換え体の変更loxP部位全体を配列決定することによって更に確認した(図2C)。この組換え体は、loxP71およびloxP66の両変異を組み込み、組換えの更なるラウンドにコンピテントでない無効loxPを含んでいた。Cre媒介バクミド組換え体が昆虫細胞において生存可能なままであったことをさらに確認するために、先の通りに、バクミドDNAを昆虫細胞に形質移入し、2代継代させた後にルシフェラーゼ活性をアッセイした。すべての組換え体は、Cre組換え前の親のバクミドに等価であるウミシイタケルシフェラーゼ活性を有していた(図2D)。
実施例3
異種タンパク質の高レベルの発現に適切なバキュロウイルスゲノム内の遺伝子座の同定
バキュロウイルス発現系において多大なタンパク質発現作業が行われたにもかかわらず、ほとんどの発現は、組換えタンパク質を発現させるために、ポリヘドリン又はp10遺伝子の置換に集中していた。組換えタンパク質の発現に代替遺伝子座の使用を記述している文献は相対的に少ない。選別が異なるバキュロウイルス遺伝子の遺伝子座で効率的に使われるか否かを試験するために、2回目の組換えをウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含有しているバクミドのうちの1つに行った。これらの実験において、同じポリヘドリンプロモーター−ホタルルシフェラーゼ−ポリヘドリン転写終結因子を、ウミシイタケおよびホタルのルシフェラーゼタンパク質(図3A)のための二重発現バキュロウイルスを生成する合計13の異なる遺伝子の遺伝子座(ctx、orf11、egt、orf23、v-fgf、39k、orf51、gp37、iap2、chiA、pe、odv-e18およびodv−e56)に独立して挿入した。どのバキュロウイルス遺伝子が組織培養におけるウイルス増殖に必須でないか、および特定の遺伝子座のバキュロウイルス遺伝子の配列が他の発現カセットの挿入に適したか否かを決定することによって、これらの実験における挿入のための部位として遺伝子座を選択した。それでもやはり、いくつかの遺伝子座でいくつかの更なる変化、特に特定のバキュロウイルス遺伝子のノックアウトが生じる変化がされた(図3B)。組換えウイルスを、Sf21昆虫細胞において2代継代し、3継代目に細胞を感染の48時間後に回収し、溶解し、ホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼ活性についてアッセイした。すべての組換え体がp10遺伝子座にp35プロモーター作動性ウミシイタケルシフェラーゼカセットを有していたので、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をウイルス置換およびタンパク質発現のマーカーとして用いた。各々の新規な遺伝子座のホタルルシフェラーゼの発現を、ポリヘドリン遺伝子座にホタルルシフェラーゼ遺伝子と同じウミシイタケルシフェラーゼ比較遺伝子を保因するウイルスと比較した。試験した13の遺伝子座の中で、9つはバックグラウンドの少なくとも105倍であったウミシイタケルシフェラーゼ活性を有し、これらのうちの8つ(ctx、egt、orf51、gp37、iap2、chiA、odv-e18およびodv-e56)は親のウミシイタケルシフェラーゼのみ、およびポリヘドリン遺伝子座ホタルルシフェラーゼのコントロールについて測定した活性程度又はそれより上であったウミシイタケルシフェラーゼを有していた(図3C)。バックグラウンド活性の10倍以内のウミシイタケルシフェラーゼ活性を生じたウイルスとなった4つの遺伝子座(orfll、v-fgf、peおよびorf23)は、更なる分析から除いた。残りのウイルスについて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼ活性を正規化するための参照物として用い、各遺伝子座からのホタルルシフェラーゼの相対的な発現を測定した(図3D)。7つの遺伝子座(ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56)は、バックグラウンドより少なくとも106倍高いホタルルシフェラーゼ活性を有しており、これは同じ遺伝子がポリヘドリン遺伝子座から発現されたときと同程度であった(図3D)。2つのウイルス(chiAおよびodv-e18)は高いレベルのウミシイタケルシフェラーゼを有していたが、ホタルルシフェラーゼの発現は相対的に低かった。
異種タンパク質の高レベルの発現に適切なバキュロウイルスゲノム内の遺伝子座の同定
バキュロウイルス発現系において多大なタンパク質発現作業が行われたにもかかわらず、ほとんどの発現は、組換えタンパク質を発現させるために、ポリヘドリン又はp10遺伝子の置換に集中していた。組換えタンパク質の発現に代替遺伝子座の使用を記述している文献は相対的に少ない。選別が異なるバキュロウイルス遺伝子の遺伝子座で効率的に使われるか否かを試験するために、2回目の組換えをウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含有しているバクミドのうちの1つに行った。これらの実験において、同じポリヘドリンプロモーター−ホタルルシフェラーゼ−ポリヘドリン転写終結因子を、ウミシイタケおよびホタルのルシフェラーゼタンパク質(図3A)のための二重発現バキュロウイルスを生成する合計13の異なる遺伝子の遺伝子座(ctx、orf11、egt、orf23、v-fgf、39k、orf51、gp37、iap2、chiA、pe、odv-e18およびodv−e56)に独立して挿入した。どのバキュロウイルス遺伝子が組織培養におけるウイルス増殖に必須でないか、および特定の遺伝子座のバキュロウイルス遺伝子の配列が他の発現カセットの挿入に適したか否かを決定することによって、これらの実験における挿入のための部位として遺伝子座を選択した。それでもやはり、いくつかの遺伝子座でいくつかの更なる変化、特に特定のバキュロウイルス遺伝子のノックアウトが生じる変化がされた(図3B)。組換えウイルスを、Sf21昆虫細胞において2代継代し、3継代目に細胞を感染の48時間後に回収し、溶解し、ホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼ活性についてアッセイした。すべての組換え体がp10遺伝子座にp35プロモーター作動性ウミシイタケルシフェラーゼカセットを有していたので、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をウイルス置換およびタンパク質発現のマーカーとして用いた。各々の新規な遺伝子座のホタルルシフェラーゼの発現を、ポリヘドリン遺伝子座にホタルルシフェラーゼ遺伝子と同じウミシイタケルシフェラーゼ比較遺伝子を保因するウイルスと比較した。試験した13の遺伝子座の中で、9つはバックグラウンドの少なくとも105倍であったウミシイタケルシフェラーゼ活性を有し、これらのうちの8つ(ctx、egt、orf51、gp37、iap2、chiA、odv-e18およびodv-e56)は親のウミシイタケルシフェラーゼのみ、およびポリヘドリン遺伝子座ホタルルシフェラーゼのコントロールについて測定した活性程度又はそれより上であったウミシイタケルシフェラーゼを有していた(図3C)。バックグラウンド活性の10倍以内のウミシイタケルシフェラーゼ活性を生じたウイルスとなった4つの遺伝子座(orfll、v-fgf、peおよびorf23)は、更なる分析から除いた。残りのウイルスについて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼ活性を正規化するための参照物として用い、各遺伝子座からのホタルルシフェラーゼの相対的な発現を測定した(図3D)。7つの遺伝子座(ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56)は、バックグラウンドより少なくとも106倍高いホタルルシフェラーゼ活性を有しており、これは同じ遺伝子がポリヘドリン遺伝子座から発現されたときと同程度であった(図3D)。2つのウイルス(chiAおよびodv-e18)は高いレベルのウミシイタケルシフェラーゼを有していたが、ホタルルシフェラーゼの発現は相対的に低かった。
この研究により、バキュロウイルスゲノム内のいくつかの遺伝子座から高レベルの外来タンパク質の発現が可能であることが明らかとなり、良好な発現が生じるポリヘドリンおよびp10に加え、7つの遺伝子座(ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56)が同定される。これらの部位のうち、39k、orf51およびgp37は遺伝子のコード領域に隣接するDNAへの挿入物であり、タンパク質発現を直接妨げない。これに対して、ctx、egt、iap2およびodv-e56それぞれへの挿入物は、これら遺伝子からの対応するタンパク質の発現を妨げると思われる。これらの遺伝子の初めの3つは、細胞培養物におけるウイルスの増殖に必須ではないと既に記載されている(3−6)。また、ODV-E56タンパク質のトランケーションも報告されている(7)。
ホタルルシフェラーゼレポーターを良好に発現しなかった遺伝子座のうち、4つ(orf11、v-fgf、peおよびorf23)は、すべての組換え体に存在していたウミシイタケルシフェラーゼマーカータンパク質の発現も低減していた。研究の焦点は最後期プロモーター発現コンストラクトの挿入に適した部位を同定することであるので、この発現の低減の主な理由は調査しなかった。ウイルス複製又は転写に対し遺伝子座特異的な効果があり、隣接遺伝子に必須なプロモーター又はエンハンサーの因子を破壊する可能性がある。chiAおよびodv-e18挿入ウイルスにおけるホタルルシフェラーゼの低発現は他の理由が予測できなかった。他に、chiA遺伝子座への組換えタンパク質発現カセットの挿入を記録した報告がある(8、9)。発明者等の実験におけるこの遺伝子座のホタルルシフェラーゼ遺伝子によって見られる発現レベルの低減は、挿入に隣接する遺伝子に対する影響によるものである可能性がある。odv-e18については、同じ変異体ウイルスを使用した最近の報告により、このタンパク質が出芽したウイルス生成および細胞間運動に必須であることが示唆されている(10、11)。これらの研究は、odv-e18のコード配列および上流の隣接遺伝子内に欠失がある変異体に基づいていた。コード配列のATGのGATへの変異の後にこの遺伝子のここでホタルルシフェラーゼカセットが挿入されたことによってodv-e18が不活性化された実験では、感染性ウイルスを回収することが可能であった。第3継代におけるウミシイタケルシフェラーゼの発現が親のウイルスと等価であることから、この変異ウイルスの複製能が障害されなかったことが示唆される。しかしなから、この変異を持たないウイルスと比較してホタルルシフェラーゼレベルがおよそ2log低減したので、この変異が修復されたわずかなウイルスがレポーター遺伝子を発現する第二集団を捕捉していた可能性を除外することができない。
実施例4
多遺伝子座バキュロウイルス発現を用いたタンパク質複合体の発現
実施例3は、組換えタンパク質を発現する異なるバキュロウイルス遺伝子座の潜在能を定量的に評価するためのレポーター遺伝子の使用に注目した。組換えタンパク質複合体を発現させ、回収することが可能か否かを確認するために、異なる数のタンパク質サブユニットを有する3つの特定の複合体を標的とした。ウイルスM1およびHAタンパク質の共発現によりインフルエンザ(A/seal/Mass/1/80) H7サブタイプ(2タンパク質複合体)について、そして、VP2、VP3、VP5およびVP7の共発現によりブルータングウイルス(BTV)セロタイプ1(4タンパク質複合体)について、ウイルス様粒子を生成した。加えて、発明者等は、マウスCCTシャペロン複合体の8つすべてのサブユニットの発現を標的とし、更なる機能的および構造的研究のために用いた。
多遺伝子座バキュロウイルス発現を用いたタンパク質複合体の発現
実施例3は、組換えタンパク質を発現する異なるバキュロウイルス遺伝子座の潜在能を定量的に評価するためのレポーター遺伝子の使用に注目した。組換えタンパク質複合体を発現させ、回収することが可能か否かを確認するために、異なる数のタンパク質サブユニットを有する3つの特定の複合体を標的とした。ウイルスM1およびHAタンパク質の共発現によりインフルエンザ(A/seal/Mass/1/80) H7サブタイプ(2タンパク質複合体)について、そして、VP2、VP3、VP5およびVP7の共発現によりブルータングウイルス(BTV)セロタイプ1(4タンパク質複合体)について、ウイルス様粒子を生成した。加えて、発明者等は、マウスCCTシャペロン複合体の8つすべてのサブユニットの発現を標的とし、更なる機能的および構造的研究のために用いた。
インフルエンザA型VLP
これらの実験では、すべてのインフルエンザ遺伝子は、ドイツ、マールブルク、フィリップス大学の研究者から入手した、H7N7(A/seal/Mass/1/80)単離物由来のSC35Mマウス適応株から得た。
これらの実験では、すべてのインフルエンザ遺伝子は、ドイツ、マールブルク、フィリップス大学の研究者から入手した、H7N7(A/seal/Mass/1/80)単離物由来のSC35Mマウス適応株から得た。
多遺伝子座発現系が2つのタンパク質を有するタンパク質複合体を生産することが可能であるか否かを試験するために、インフルエンザA型M1タンパク質のコード配列をまず最初に、ポリヘドリンプロモーターの制御下のegt遺伝子座に挿入した。比較のために、同じ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子座を標的とした従来のバキュロウイルス発現ベクター(pAc-YM1)に挿入した。組換え後、結果として生じた両バキュロウイルスはM1タンパク質を発現した。クーマシー染色したSDS−PAGEによって評価した場合に、egtおよびポリヘドリン遺伝子座からのタンパク質の発現レベルはいずれも、バキュロウイルス感染細胞における他のいかなるウイルス又は細胞のタンパク質よりも有意に高かった(図4)。
M1とHAとを発現する二重ウイルスを生成するために、細菌の選別カセットを、Cre組換えによってM1発現バクミドから除き、同じインフルエンザ株(A/seal/Mass/1/80)のHA遺伝子を2回目のET組換えによってp10遺伝子座に挿入した。結果として生じたウイルスからのM1およびHAの共発現は、前記のようにSDS−PAGEとウエスタンブロット分析によって確認した(図5A)。さらに、インフルエンザVLPは、感染細胞の培養培地から単離し、密度勾配超遠心法によって精製し、陰性染色EM分析によって可視化した(図5B)。可視化したVLPが実際にインフルエンザであることを確認するために、インフルエンザHAに特異的な抗体を用いて粒子をイムノゴールド標識した(図5C)。
まとめると、これらのデータは、多遺伝子座手法が組換えタンパク質発現のために成功裏に使用できたこと、そしてグループ化選択マーカー系の2回の挿入によってこのような組換えウイルスを生産することが実用的であったことを裏付けるものである。インフルエンザVLPは他者により広く試験されており、マウスおよびフェレットにおいて免疫原性であることが示されている。VLPを構築するこの方法は、すでに予め統合されたM1を有するバキュロウイルスゲノムを有し、発現の準備ができている点で有利である。ゆえに、VLPを造るためには、単回の組換えを実施すること、そしてワクチン製造のために必要な新生インフルエンザサブタイプのいずれかからのHA遺伝子を加えることのみが必要である。VLPベースのインフルエンザワクチンでは、これにより、必要なクローニングを単純化し、そして、潜在的に、新規なタイプのVLPを造る速度を上げるであろう。
BTV1 VLP
VLPがちょうど2つのタンパク質の発現によって形成されるインフルエンザとは異なり、BTV VLPは4つの構造タンパク質(VP2、VP3、VP5およびVP7)の組み合わされた発現を必要とする。組換えのための新規な系の有用性を更に示すために、各タンパク質を単独に、および4つすべてのBTV構造タンパク質の組み合わせを発現するウイルスを製造した(図6)。新規な系の利点のうちの1つは、単一タンパク質と複数のタンパク質を発現するウイルスが同じセットの導入ベクターから製造できる点である。これにより、完全な複合体において共発現されるタンパク質の位置についてのマーカーとして働く単一タンパク質を発現するコントロールウイルスの製造が容易になる。BTV VLPでは、インフルエンザの実施例とは異なるセットの遺伝子座を用いた(図6C)。更に、新規な系は、Zhao et al., (12)によって記載されるorf1629ノックアウトバクミドと組み合わせ、ポリヘドリン遺伝子座に従来の導入ベクターを用いて複合体のサブユニットのうちの1つを発現させた。VLPの形成は、外側のキャプシドタンパク質の1つ(VP5)のイムノゴールド標識と組み合わせた、陰性染色EM下での粒子形態によって確認した(図6D)。
VLPがちょうど2つのタンパク質の発現によって形成されるインフルエンザとは異なり、BTV VLPは4つの構造タンパク質(VP2、VP3、VP5およびVP7)の組み合わされた発現を必要とする。組換えのための新規な系の有用性を更に示すために、各タンパク質を単独に、および4つすべてのBTV構造タンパク質の組み合わせを発現するウイルスを製造した(図6)。新規な系の利点のうちの1つは、単一タンパク質と複数のタンパク質を発現するウイルスが同じセットの導入ベクターから製造できる点である。これにより、完全な複合体において共発現されるタンパク質の位置についてのマーカーとして働く単一タンパク質を発現するコントロールウイルスの製造が容易になる。BTV VLPでは、インフルエンザの実施例とは異なるセットの遺伝子座を用いた(図6C)。更に、新規な系は、Zhao et al., (12)によって記載されるorf1629ノックアウトバクミドと組み合わせ、ポリヘドリン遺伝子座に従来の導入ベクターを用いて複合体のサブユニットのうちの1つを発現させた。VLPの形成は、外側のキャプシドタンパク質の1つ(VP5)のイムノゴールド標識と組み合わせた、陰性染色EM下での粒子形態によって確認した(図6D)。
マウスCCT
本発明の適用は、ウイルス様粒子の形成に限定されない。実際、多くの細胞タンパク質が複数のサブユニットを有する複合体として細胞中で存在するので、これら複合体の効率的な形成は様々な分野に適用がある。他の研究への系の有用性を示すために、シャペロン複合体CCTを選択した。この複合体は癌研究との関連があり、8つのサブユニットを有する場合、タンパク質発現の重要な試みとなる。実際、本発明のベクターおよび方法を用いずにバキュロウイルス系でこの複合体を発現させることはできなかった。先の実施例3において同定された、異なる遺伝子座を各々標的とし、マウスCCTのサブユニットの1つを各々発現する8つの導入ベクターを構築した。これらを用いて、各サブユニットを単独で、そしてサブユニットを組み合わせて発現する組換えウイルスを生成した。サブユニットの1つ(CCT5)では、タンパク質が細胞において過剰に発現される場合、異常な表現型が見られた。細胞内に針状晶が見られ、細胞が破裂した感染後期では、培養培地中に四角形のプレート状の結晶物質が見られた(図7)。このタンパク質のために精製スキームを作り、そして、このプロジェクトのCCTパートのための協力者に、予備的結晶化条件と感染細胞材料を供給した。
本発明の適用は、ウイルス様粒子の形成に限定されない。実際、多くの細胞タンパク質が複数のサブユニットを有する複合体として細胞中で存在するので、これら複合体の効率的な形成は様々な分野に適用がある。他の研究への系の有用性を示すために、シャペロン複合体CCTを選択した。この複合体は癌研究との関連があり、8つのサブユニットを有する場合、タンパク質発現の重要な試みとなる。実際、本発明のベクターおよび方法を用いずにバキュロウイルス系でこの複合体を発現させることはできなかった。先の実施例3において同定された、異なる遺伝子座を各々標的とし、マウスCCTのサブユニットの1つを各々発現する8つの導入ベクターを構築した。これらを用いて、各サブユニットを単独で、そしてサブユニットを組み合わせて発現する組換えウイルスを生成した。サブユニットの1つ(CCT5)では、タンパク質が細胞において過剰に発現される場合、異常な表現型が見られた。細胞内に針状晶が見られ、細胞が破裂した感染後期では、培養培地中に四角形のプレート状の結晶物質が見られた(図7)。このタンパク質のために精製スキームを作り、そして、このプロジェクトのCCTパートのための協力者に、予備的結晶化条件と感染細胞材料を供給した。
他のCCTサブユニットの発現により感染後期の細胞に可視集合体が生じたものもあったが、いずれも通常の外観を有する集合体とはならなかった。
8つすべてのCCTサブユニットは高レベルに発現され(図8A)、マウスCCTに対して生じたポリクローナル抗血清と交差反応した。内在性昆虫細胞CCTサブユニットの1つとポリクローナル抗体との間にいくつかの交差反応があった(図8B、レーン9)。しかしながら、この内在性シグナルのみが、すべてが感染した細胞内で高いレベルで蓄積した3つのサブユニット(CCT1、CCT5およびCCT6)と同じ位置に配置したので、明確に検出することができた。他のすべてのサブユニットは、わずかに異なる分子量のタンパク質として移動したので、移動を基に昆虫細胞タンパク質を区別することができた。
結論
3つすべてのタンパク質複合体について、単独で発現した場合と他のタンパク質と発現した場合とでは、同じ組換えタンパク質の蓄積に明らかな違いがあった。ほとんどすべての場合において、複数のタンパク質が同じウイルスから発現されると、タンパク質発現のレベルが低減した。これはある程度予測されることであった。転写、RNAプロセシング、翻訳およびタンパク質の折畳みに必要なタンパク質が競合するので、高く発現されるバキュロウイルス遺伝子の2つが共に発現されると別々に発現されるよりも低いことが予測できる。しかしながら、BTV VLPおよびCCTの実施例に関して注目すべきことは、タンパク質発現の低減が異なる遺伝子の遺伝子座間で可変的であったことであった。BTV、VP2、VP5、VP3およびVP7を用いた実施例では、すべて、単独で発現した場合に、タンパク質の有意かつ類似な蓄積が生じた。しかしながら、4つすべてのタンパク質を発現する単一のバキュロウイルスに組み込んだ場合、VP2およびVP3はVP5およびVP7より低いレベルで蓄積した(図6A)。単一および4重の両ウイルスでは遺伝子が同じ遺伝子の遺伝子座から発現されたので、この効果はゲノム統合の位置効果によって説明することができない。1つの説明は、この効果が異なる遺伝子のために使われる異なるプロモーターによるものであることが考えられる。VP5およびVP7は共にp10プロモーターの制御下で発現され、VP2およびVP3はポリヘドリンプロモーターの制御下で発現された。これは、p10遺伝子の欠失によりポリヘドリン遺伝子座13からの発現が増加したという文献の報告と一致した。ゆえに、2つのp10プロモーターの存在下でのポリヘドリンプロモーターの複製により、ポリヘドリンプロモーター作動性遺伝子からの発現を選択的に低減することが予測される。しかしながら、これは、CCT複合体の場合に観察される効果を完全に説明するものではない。CCT5およびCCT2はいずれもp10プロモーターから発現され、単独で発現される場合には組換えタンパク質を安定して高いレベルで発現した(図8AおよびB、レーン2および5)。しかしながら、同じウイルスに組み込んだ場合、CCT5の発現はCCT2と比較して実質的に低減した(図8AおよびB、レーン10)。これらのデータから、p10遺伝子座に存在する他のcis作動性配列は、いずれもこの遺伝子座に挿入されているCCT2およびBTV VP5の発現を相対的に上げるように働いているようである。インフルエンザHAが同じ部位に挿入された場合に見かけの発現が相対的に低いことは、転写効果よりもむしろERでのこのタンパク質の代謝回転に関連しているようである。CCT2およびVP5は共に細胞質に蓄積する。
3つすべてのタンパク質複合体について、単独で発現した場合と他のタンパク質と発現した場合とでは、同じ組換えタンパク質の蓄積に明らかな違いがあった。ほとんどすべての場合において、複数のタンパク質が同じウイルスから発現されると、タンパク質発現のレベルが低減した。これはある程度予測されることであった。転写、RNAプロセシング、翻訳およびタンパク質の折畳みに必要なタンパク質が競合するので、高く発現されるバキュロウイルス遺伝子の2つが共に発現されると別々に発現されるよりも低いことが予測できる。しかしながら、BTV VLPおよびCCTの実施例に関して注目すべきことは、タンパク質発現の低減が異なる遺伝子の遺伝子座間で可変的であったことであった。BTV、VP2、VP5、VP3およびVP7を用いた実施例では、すべて、単独で発現した場合に、タンパク質の有意かつ類似な蓄積が生じた。しかしながら、4つすべてのタンパク質を発現する単一のバキュロウイルスに組み込んだ場合、VP2およびVP3はVP5およびVP7より低いレベルで蓄積した(図6A)。単一および4重の両ウイルスでは遺伝子が同じ遺伝子の遺伝子座から発現されたので、この効果はゲノム統合の位置効果によって説明することができない。1つの説明は、この効果が異なる遺伝子のために使われる異なるプロモーターによるものであることが考えられる。VP5およびVP7は共にp10プロモーターの制御下で発現され、VP2およびVP3はポリヘドリンプロモーターの制御下で発現された。これは、p10遺伝子の欠失によりポリヘドリン遺伝子座13からの発現が増加したという文献の報告と一致した。ゆえに、2つのp10プロモーターの存在下でのポリヘドリンプロモーターの複製により、ポリヘドリンプロモーター作動性遺伝子からの発現を選択的に低減することが予測される。しかしながら、これは、CCT複合体の場合に観察される効果を完全に説明するものではない。CCT5およびCCT2はいずれもp10プロモーターから発現され、単独で発現される場合には組換えタンパク質を安定して高いレベルで発現した(図8AおよびB、レーン2および5)。しかしながら、同じウイルスに組み込んだ場合、CCT5の発現はCCT2と比較して実質的に低減した(図8AおよびB、レーン10)。これらのデータから、p10遺伝子座に存在する他のcis作動性配列は、いずれもこの遺伝子座に挿入されているCCT2およびBTV VP5の発現を相対的に上げるように働いているようである。インフルエンザHAが同じ部位に挿入された場合に見かけの発現が相対的に低いことは、転写効果よりもむしろERでのこのタンパク質の代謝回転に関連しているようである。CCT2およびVP5は共に細胞質に蓄積する。
本発明者等は、組換えタンパク質のための発現カセットの慣例的な挿入に使うことができる程度にまでバキュロウイルスに適用できるようにET組換え系の効率を向上させた。さらに、発明者等は、タンパク質の高レベルの発現に使うことができる7つの遺伝子の遺伝子座(ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56)を同定し、3つの実施例(インフルエンザA型およびBTV VLP、およびCCT複合体)を用いて、この系を用いて多タンパク質複合体が蓄積されうることを示した。
前述のすべての文書は出典明記によって本明細書に援用される。
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実施形態
1. バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
(i) 第一の選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
(ii)第二の選択マーカーをコードする発現可能な配列、
を含むグループ化選別カセットと、
この発現カセットおよびグループ化選別カセットに隣接する配列であって、このとき、バキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応する配列と
を含んでなる導入ベクター。
2. 第一選択マーカーが視覚マーカーである、実施形態1に記載の導入ベクター。
3. 第一マーカーがLacZα断片である、実施形態2に記載の導入ベクター。
4. 第二選択マーカーが抗生物質に対する耐性を与える、実施形態1に記載の導入ベクター。
5. 抗生物質耐性遺伝子がフレオマイシンに対する耐性を与える、実施形態4に記載の導入ベクター。
6. グループ化選別カセットがLoxP組換え配列に隣接している、実施形態1から5のいずれか一に記載の導入ベクター。
7. LoxP配列が、単回のみの組換えが起こるように変更されている、実施形態5に記載の導入ベクター。
8. 発現およびグループ化選別カセットに隣接する配列が、以下の遺伝子座:ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、odv-e56およびp10のいずれか一つの配列に実質的に対応する、実施形態1から7のいずれか一項に記載の導入ベクター。
9. 組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと実施形態1から8のいずれか一項に記載の導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
発現カセットとグループ化選別カセットとを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法。
10. 導入ベクターが実施形態6又は実施形態7において定義されたものであり、LoxP配列間に組換えを誘導し、バクミドから選別カセットを取り除くことを更に含む、実施形態9に記載の方法。
11. 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、実施形態9又は実施形態10に記載の方法によって組換えバクミドを製造し、バキュロウイルスが生成されるようにバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法。
12. 実施形態9又は実施形態10に記載の方法によって得た組換えバクミド。
13. 実施形態11に記載の方法によって得た組換えバキュロウイルス。
14. 各タンパク質がバクミドの別々の遺伝子座から発現される、複数のタンパク質を発現する組換えバクミド。
15. 各タンパク質がバキュロウイルスの別々の遺伝子座から発現される、複数のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルス。
16. 複数のタンパク質が相互作用してタンパク質複合体を形成する、実施形態14に記載の組換えバクミド又は実施形態15に記載の組換えバキュロウイルス。
17. タンパク質複合体がウイルス様粒子又はシャペロン複合体である、実施形態16に記載の組換えバクミド又は組換えバキュロウイルス。
18. 別々の遺伝子座が、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56から選択される、実施形態14に記載の組換えバクミド又は実施形態15に記載の組換えバキュロウイルス。
19. 組換えタンパク質をコードする発現カセットが、以下の遺伝子座:ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56の一又は複数に挿入されている、組換えバクミド又は組換えバキュロウイルス。
20. バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
この発現カセットに隣接する配列であって、このとき該配列がバキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応し、該遺伝子座がctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56から選択されるものである配列と、
を含んでなる導入ベクター。
21. 組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと実施形態20に記載の導入ベクターとを共に相同組換えさせること、及び
発現カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法。
22. 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、実施形態21に記載の方法による組換えバクミドを生成し、バキュロウイルスが生成されるようにバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法。
23. 実施形態21に記載の方法によって得た組換えバクミド。
24. 実施形態22に記載の方法によって得た組換えバキュロウイルス。
25. 実施形態1から8および20のいずれか一項に記載の導入ベクター、実施形態12、14、16から19および23のいずれか一項に記載のバクミド、又は実施形態13、15から19および24のいずれか一項に記載のバキュロウイルスを含む細胞。
26. 好適な条件下で、実施形態12、14、16から19および23のいずれか一項に記載の組換えバクミド、又は実施形態13、15から19および24のいずれか一項に記載のバキュロウイルスを培養することを含む、一又は複数のタンパク質の製造方法。
1. バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
(i) 第一の選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
(ii)第二の選択マーカーをコードする発現可能な配列、
を含むグループ化選別カセットと、
この発現カセットおよびグループ化選別カセットに隣接する配列であって、このとき、バキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応する配列と
を含んでなる導入ベクター。
2. 第一選択マーカーが視覚マーカーである、実施形態1に記載の導入ベクター。
3. 第一マーカーがLacZα断片である、実施形態2に記載の導入ベクター。
4. 第二選択マーカーが抗生物質に対する耐性を与える、実施形態1に記載の導入ベクター。
5. 抗生物質耐性遺伝子がフレオマイシンに対する耐性を与える、実施形態4に記載の導入ベクター。
6. グループ化選別カセットがLoxP組換え配列に隣接している、実施形態1から5のいずれか一に記載の導入ベクター。
7. LoxP配列が、単回のみの組換えが起こるように変更されている、実施形態5に記載の導入ベクター。
8. 発現およびグループ化選別カセットに隣接する配列が、以下の遺伝子座:ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、odv-e56およびp10のいずれか一つの配列に実質的に対応する、実施形態1から7のいずれか一項に記載の導入ベクター。
9. 組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと実施形態1から8のいずれか一項に記載の導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
発現カセットとグループ化選別カセットとを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法。
10. 導入ベクターが実施形態6又は実施形態7において定義されたものであり、LoxP配列間に組換えを誘導し、バクミドから選別カセットを取り除くことを更に含む、実施形態9に記載の方法。
11. 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、実施形態9又は実施形態10に記載の方法によって組換えバクミドを製造し、バキュロウイルスが生成されるようにバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法。
12. 実施形態9又は実施形態10に記載の方法によって得た組換えバクミド。
13. 実施形態11に記載の方法によって得た組換えバキュロウイルス。
14. 各タンパク質がバクミドの別々の遺伝子座から発現される、複数のタンパク質を発現する組換えバクミド。
15. 各タンパク質がバキュロウイルスの別々の遺伝子座から発現される、複数のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルス。
16. 複数のタンパク質が相互作用してタンパク質複合体を形成する、実施形態14に記載の組換えバクミド又は実施形態15に記載の組換えバキュロウイルス。
17. タンパク質複合体がウイルス様粒子又はシャペロン複合体である、実施形態16に記載の組換えバクミド又は組換えバキュロウイルス。
18. 別々の遺伝子座が、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56から選択される、実施形態14に記載の組換えバクミド又は実施形態15に記載の組換えバキュロウイルス。
19. 組換えタンパク質をコードする発現カセットが、以下の遺伝子座:ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56の一又は複数に挿入されている、組換えバクミド又は組換えバキュロウイルス。
20. バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
この発現カセットに隣接する配列であって、このとき該配列がバキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応し、該遺伝子座がctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv-e56から選択されるものである配列と、
を含んでなる導入ベクター。
21. 組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと実施形態20に記載の導入ベクターとを共に相同組換えさせること、及び
発現カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法。
22. 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、実施形態21に記載の方法による組換えバクミドを生成し、バキュロウイルスが生成されるようにバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法。
23. 実施形態21に記載の方法によって得た組換えバクミド。
24. 実施形態22に記載の方法によって得た組換えバキュロウイルス。
25. 実施形態1から8および20のいずれか一項に記載の導入ベクター、実施形態12、14、16から19および23のいずれか一項に記載のバクミド、又は実施形態13、15から19および24のいずれか一項に記載のバキュロウイルスを含む細胞。
26. 好適な条件下で、実施形態12、14、16から19および23のいずれか一項に記載の組換えバクミド、又は実施形態13、15から19および24のいずれか一項に記載のバキュロウイルスを培養することを含む、一又は複数のタンパク質の製造方法。
Claims (8)
- 組換えタンパク質をコードする発現カセットが、以下の遺伝子座:ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv−e56の一又は複数に挿入されている、組換えバクミド又は組換えバキュロウイルス。
- バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
この発現カセットに隣接する配列であって、このとき該配列がバキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応し、該遺伝子座がctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2およびodv−e56から選択されるものである配列と、
を含んでなる導入ベクター。 - 組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと請求項2に記載の導入ベクターとを共に相同組換えさせること、及び
発現カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法。 - 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、
請求項3に記載の方法によって組換えバクミドを生成すること、及び
バキュロウイルスが生成されるようにバクミドを含む真核細胞を培養すること
を含む方法。 - 請求項3に記載の方法によって得た組換えバクミド。
- 請求項4に記載の方法によって得た組換えバキュロウイルス。
- 請求項2に記載の導入ベクター、請求項1および5のいずれか一項に記載の組換えバクミド、又は請求項1および6のいずれか一項に記載の組換えバキュロウイルスを含む細胞。
- 好適な条件下で、請求項1および5のいずれか一項に記載の組換えバクミド、又は請求項1および6のいずれか一項に記載の組換えバキュロウイルスを培養することを含む、一又は複数のタンパク質の製造方法。
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