KR101233081B1 - 재조합바이러스 비이지박 (ｂＥａｓｙＢａｃ)과 이를 이용한 베큘로바이러스 발현벡터계 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베큘로바이러스 발현벡터계 (Baculovirus Expression Vector System)에 조기 발현 프로모터 (Promter), 치사유전자 (Lethal gene) 및 전이유전자 (Transposition gene)를 도입함으로써, 외래유전자를 발현하는 재조합바이러스 (recombinant virus)의 분리효율을 높이고 대량생산(high-throughput)이 가능하도록 제작한 재조합바이러스 비이지박 (bEasyBac)을 개시한다.

Description

재조합바이러스 비이지박 (ｂＥａｓｙＢａｃ)과 이를 이용한 베큘로바이러스 발현벡터계 {A recombinant virus bEasyBac and baculovirus expression vector system using the same}

본 발명은 재조합 바이러스 비이지박 (bEasyBac)(기탁번호 : KCTC 11499BP)과 이를 이용하는 베큘로바이러스 발현벡터 시스템에 관한 것이다.

핵다각체병 바이러스 (Nuclear Polyhedrosis Virus; NPV)유전자의 강력한 프로모터 (Promoter)를 이용하는 배큘로바이러스 발현벡터계 (Baculovirus Expression Vector System)는 높은 발현효율 뿐만 아니라, 고등진핵세포인 곤충세포를 이용함으로서 발현된 외래 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 뛰어나기 때문에, 대장균 (E. coli), 효모 (Yeast), 포유동물세포 (Mammal cell)등을 이용하는 다른 발현벡터계에 비해 크게 주목을 받고 있다 (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)). 현재, 오토그라파켈리포니카 핵다각체병 바이러스 (Autographa californica NPV; AcNPV)와 누에 핵다각체병 바이러스 (Bombyx mori NPV; BmNPV)를 이용하는 두가지 발현 벡터계가 널리 이용되고 있다 (Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156-2165 (1983); Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985)).

이들 바이러스의 제놈은 약 134 킬로베이스페어 (killobasepair; kbp)의 이중나선 (double stranded)의 원상디엔에이 (circular DNA)구조로 이루어져 있는데, 제놈의 사이즈가 너무 크기 때문에 단순히 이들 바이러스 제놈을 제한효소로 절단하고 외래 단백질유전자를 붙이기는 어렵다. 대신에, 인비트로 (in vitro)상태에서 상동재조합반응 (homologus recombination)에 통해 이들 재조합바이러스를 만든다 (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)). 즉, 재조합을 하고자 하는 위치의 바이러스 유전자절편과 바이러스의 강력한 프로모터인 다각체단백질 (polyhedrin)프로모터를 포함하는 벡터에 외래단백질유전자를 클로닝 (cloning)하여 트랜스퍼 벡터 (transfer vector)를 만들고 이 벡터를 바이러스 전체 제놈과 함께 곤충세포 (insect cell)에 동시전이 (cotransfection)을 시키면 이들간에 이중 상동재조합이 일어나게 되고 외래단백질 유전자는 다각체단백질 프로모터 조절하에 바이러스 제놈내에 삽입되게 된다. 이렇게 생성된 재조합 바이러스는 다각체 (polyhedra)를 형성하지 않기 때문에 다각체를 형성하는 야생주 바이러스 (wild-type virus)로부터 순수 분리할 수 있다. 그러나 실제로는 상동재조합이 일어날 확률이 0.1 내지 1 %밖에 되지않아 수없이 많이 생성되어진 야생주 바이러스로부터 재조합바이러스를 분리하는 작업이 쉽지가 않다.

현재 이러한 문제를 해결하기 위한 연구가 여러 방법으로 이루어 지고 있다. 그 첫 번째 방법은 바이러스 디엔에이를 선상화 (linearization)시키는 것이다 (Kitts et al., Nucleic Acids Res., 18: 5667-5762 (1990)). 선상화된 바이러스 디엔에이는 그 자체로는 바이러스 활성이 없지만 트랜스퍼 벡터와 함께 재조합이 일어나게되면 재조합바이러스는 재원상화 (recircularization)되고 증식력을 갖게되는 것이다. 특히 이러한 방법을 이용할 때에는 바이러스 제놈내에 존재하는 필수유전자 (essential gene)를 이용하면 더욱 효과적이다.

베큘로바이러스의 폴리헤드린 유전자 하류에는 바이러스의 캡시드 (capsid)프로테인을 발현하는 오알에프1629 (ORF 1629)라는 유전자가 존재하는데, 이 유전자는 바이러스의 증식에 있어서 필수적인 유전자이다. 킷츠와 포시 (Kitts and Possee, BioTechniques, 14: 810-817 (1993))는 폴리헤드린 유전자의 상류부분 (upstream region)과 오알에프1629 유전자내에 제한효소 Bsu36I의 작용점을 가지는 재조합 에이씨 엔피브 변이주(variant), 백팩식스(BacPAK 6)를 만들었다. 이 바이러스 제놈에 제한효소 Bsu36I을 처리하게 되면 바이러스내에 존재하는 오알에프1629 유전자는 부분적으로 제거되어지고, 바이러스는 선상화되면서 증식력을 잃게 된다. 그러나 완전한 오알에프1629유전자를 가진 트랜스프 벡터와 재조합이 일어나게되면 바이러스는 다시 증식력을 가지게되는데 이때 목적유전자도 삽입되어져 증식된 바이러스는 대부분 재조합바이러스가되는 것이다. 실지로 이러한 방법을 이용하면 약 90%이상의 재조합 바이러스를 얻을 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나 이러한 방법의 가장 큰 문제점은 바이러스 제놈이 Bsu36I에 의해 완전처리가 되어야하고, 그렇지 못할 경우에는 남아있는 야생주 바이러스에 의해 재조합바이러스의 분리 효율이 급격히 떨어지게 된다.

재조합바이러스 분리를 위한 또 다른 방법으로는 폴리헤드린지역에 미니에프 리플리콘 (mini-F replicon)과 티엔세븐 트랜스포지션 싸이트 (Tn7 transposition site)를 가진 재조합 바이러스, 백미드 (bacmid)를 이용하는 방법이다 (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566-4579 (1993)). 이 백미드의 디엔에이는 이콜라이에서 증식이 가능하다. 즉, 삽입하고자하는 유전자를 트랜스퍼벡터내에 존재하는 티엔세븐 말단사이에 클로닝한 후, 이 트랜스퍼벡터를 백미드 제놈을 포함하면서 티엔세븐 트랜스포제이즈 (transposase)를 발현하는 이콜라이내에 도입하면, 목적유전자는 백미드제놈내의 트랜스포지션 싸이트에 정확히 삽입되게 된다. 이렇게 만들어진 재조합바이러스 디엔에이를 이콜라이로 부터 순수분리 한 후 곤충세포에 감염을 시키면 순수한 재조합바이러스를 얻게 되는 것이다. 이 방법은 재조합바이러스 분리과정이 이콜라이의 콜로니로부터 이루어지기 때문에 바이러스 플라크 (plaque)분리보다 쉬운 장점이 있으나, 순수한 재조합바이러스를 얻기 위해서는 이콜라이 및 곤충세포의 두 단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있다.

이러한 방법 외에도, 크레/록스 피 (cre/loxP)를 이용 (Peakman et al., Nucleic Acids Res. 20, 495-500, 1992)하거나 게이트웨이 테크놀로지 (Gateway technology)를 이용 (BaculoDirectTM, Invitrogen(논문없음))하여 인 비트로에서 (in vitro)에서 특정 위치 재조합 (site specific recombination)에 의한 재조합 바이러스 생산 방법이 소개 되고 있으나, 이것 역시 재조합 효율이 상당히 낮아 재조합 되지 않은 백그라운드(background)로부터 순수 재조합바이러스를 분리하기 위해 시간이나 약재 (Drug)등이 투자되어야 하기에 수많은 외래유전자를 동시에 대량 생산하기에는 약점이 있었다.

따라서, 본 발명자는 상기에서 설명한 바와 같은 베큘로바이러스 발현벡터계의 문제점을 해결하기위하여, 고자 시스템(GOZA System)을 고안하여 그 결과를 논문과 특허로 보고한 바 있었다(Je et al., Biotechnol. Lett. 23, 575-582, 대한민국특허 0436232). 그러나 이 시스템의 원리는 베큘로바이러스의 모든 유전자 외에, 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자대신 가나마이신 저항성유전자와 미니에프 리플리콘을 가지면서, 필수유전자인 오알에프 1629의 절편을 가지고 있게 함으로써 이콜라이 (E. coli)에는 증식이 가능하지만 곤충세포 (insect cell)에는 증식할 수 없도록 만든 것이다. 이러한 고자시스템은 이전의 발현 벡터계보다 훨씬 높은 재조합바이러스 (recombinant virus)의 분리효율을 보이며 경제적이어서 최근에는 이것과 거의 똑같은 발현시스템을 영국에서 제작하여 실제 다양한 재조합바이러스의 대량생산의 가능성을 발표한 적이 있다 (Possee et al., Biotechnol. Bioeng. 101, 1115-1122, 2008). 하지만, 이 시스템 역시 100%의 순수한 재조합바이러스 분리는 불가능한 데, 그 이유는 본 발명의 실험에서 증명되 듯이 동일 세포내에 재조합바이러스와 비재조합바이러스가 동시에 있게 되면 재조합바이러스가 생산한 필수 유전자의 도움으로 비재조합바이러스 또한 일정 정도 증식이 되기 때문이다. 이러한 백그라운드(background)는 대량생산 시에 외래단백질의 발현 효율을 현저하게 떨어뜨리게 될 것으로 판단되고 있다.

이상의 결과로 볼 때, 현재까지도 가장 간편하고 효율적이며 100%의 순수한 재조합바이러스 분리를 위한 베큘로바이러스 발현 시스템은 아직 완전한 것으로 개발되지 못하였고, 따라서 이러한 시스템이 개발되어야만 비로소 기계를 이용한 다양한 외래유전자를 가진 재조합바이러스의 대량생산이 가능할 것으로 판단된다.

따라서 본 발명은 상기 언급한 여러 방법의 단점을 극복한 새로운 재조합바이러스, 비이지박 (bEasyBac)을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 비이지박을 이용하여 다양한 외래 유전자가 도입된 재조합 바이러스를 동시에 대량생산하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 재조합바이러스 비이지박을 제작하는 단계와; 곤충 세포주내에서 상기 재조합바이러스 비이지박의 증식여부를 확인하는 단계와; 상기 비이지박을 이용한 새로운 재조합 바이러스 생산과 백그라운드 생산여부를 확인하는 단계와; 상기 비이지박을 이용하여 재조합 바이러스의 대량생산 여부 확인 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명 재조합바이러스 비이지박의 구성은 도1a와 도1b에 요약하여 두었다. 본 발명에서 언급되어지는 재조합바이러스, 비이지박의 제놈(도1a)은 바이러스의 모든 유전자 외에, 피텐 (p10) 유전자 대신 가나마이신 저항성유전자와 미니에프 리플리콘을 가지 있다. 또한 폴리헤드린 유전자와 프로모터 대신 바실러스 아밀로쿠에페이션스 (Bacillus amyloquefaciens)로부터 분리된 치사유전자인 바네이즈 유전자와 코테시아 플루텔레 브라코바이러스 (Cotesia plutellae brocovirus; CpBV)로부터 분리된 곤충세포 내 조기 발현 프로모터인 오알에프(ORF)3005 프로모터를 가지고 있다. 따라서 재조합바이러스 비이지박은 이콜라이에서는 증식이 가능하도록 되어 있지만, 곤충세포 내에서는 조기발현 프로모터에 의해 치사유전자가 발현됨으로써 바이러스의 증식력을 가지지 못한다.

특히, 이 치사 유전자는 바이러스를 직접 죽이는 것이 아니라, 바이러스가 감염된 세포 자체를 죽이기 때문에 동일 세포내에 재조합바이러스와 비재조합바이러스가 동시에 있게 되더라도, 비재조합바이러스의 증식이 불가능 하여 위의 여러 발현계에서 언급된 백그라운드 생성의 단점이 없다. 또한 본 발명에서 사용된 오알에프3005 프로모터는 이콜라이(E. coli)에서는 전혀 작동되지 않고, 곤충세포 내에서만 자동적으로 그리고 아주 빠른 시간 내에 작동되는 프로모터이다. 이는 프로모터 작동을 위한 약제사용 또는 열처리 등 특별한 처리가 필요 없고, 감염된 바이러스의 증식이 시작되기 훨씬 이전에 발현된 치사 단백질에 의해 곤충 세포가 죽도록 함으로써 비재조합 바이러스의 증식이 전혀 불가능 하게 되고, 오직 도1b의 피듀얼박 (pDualBac)과 같은 트랜스퍼 벡터에 의해 외래 유전자가 치환된 재조합 바이러스가 순수하게 감염된 세포에서만 바이러스의 증식이 가능하게 한다. 따라서 다른 베큘로바이러스 발현계에 비해, 본 발명이 신규성과 진보성을 갖는 것은 바네이즈와 같은 세포성 치사유전자와 오알에프3005 프로모터와 같은 곤충세포 내에서만 자동적으로 그리고 아주 빠른 시간 내에 작동되는 프로모터 때문이다(도 2).

아울러, 본 발명의 재조합바이러스는 오알에프3005 프로모터 조절하에 바네이즈 유전자의 위쪽 부분과 아래쪽 부분에 각각 attR1 과 attR2 싸이트를 도입하였다. 이는 클로내이즈 (Clonase)와 같은 트랜스포제이즈에 의해서도 인비트로 상에서 재조합이 가능하게 한 것으로, 본 발명 이지박은 고자 시스템과 같은 homologous recombination 의한 방법 그리고 베큘로다이렉트 (BaculoDirect)와 같은 인비트로 트랜스포지션 방법 모두 재조합 바이러스 생산에 이용할 수 있는 발현계이다. 본 발명의 재조합바이러스 비이지박(bEasyBac)은 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행 (KCTC)에 2009년 4월 24일자 기탁번호 제 KCTC 11499BP호로서 기탁되었다.

따라서, 본 발명에서 언급되어진 미니에프 리플리콘은 200킬로 베이스 이하인 모든 베큘로바이러스 제놈을 이콜라이에서 증식시킬 수 있는 효과가 있고, 오알에프3005 프로모터와 바네이즈 유전자는 누에, 파밤나방등의 여러 곤충 세포주 에 적용될 수 있기 때문에 본 발명의 구성과 원리는 에이씨엔피브이 외에 비엠엔피브이 등 모든 베큘로바이러스를 이용한 발현시스템에 있어 적용이 가능한 뛰어난 효과가 있다 .

도1은 재조합바이러스 비이지박 (bEasyBac)과 트랜스퍼 벡터 피듀얼박 (pDualbac)의 구성을 나타낸 것이다.
*도2는 이지박 발현계 (EasyBac System)의 재조합바이러스 생산 원리를 나타낸 것이다.
도3은 재조합바이러스 비이지박 (bEasyBac)의 제작 과정을 나타낸 것이다.
도4a는 재조합바이러스 비이지박 (bEasyBac)이 곤충 세포주 내에서 증식할 수 없음을 증명하기 위해, 증식이 가능한 재조합바이러스 (bTenLacZ)를 대조구로 하여 곤충 세포의 증식률을 비교한 것이다.
도4b는 도4a에 있어서, 두 재조합 바이러스 유전자의 곤충 세포주 내에서의 엠알엔에이(mRNA)생성여부를 알티피씨알 (RT-PCR)로 확인한 결과이다.
도5a는 재조합바이러스 비이지박 (bEasyBac)의 외래 단백질 발현 효율을 다른 발현계인 비에씨고자 (bAcGOZA)와 비교한 결과이다.
도5b는 도5a에 있어서, 두 발현계의 외래 단백질 발현 효율 차이가 재조합 바이러스의 순수율에 있음을 피씨알 (PCR)로 확인한 결과이다.
도6a는 이지박 발현계(EasyBac System)를 이용한 재조합 바이러스의 대량생산 여부를 인시추 어쎄이 (in situ Assay)로 증명한 결과이고, 도6b는 도6a의 재조합바이러스들의 외래단백질 생성을 에스디에스 피에이지(SDS-PAGE)로 확인한 결과이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명의 구체적인 내용을 보다 상세히 설명하나 본 발명의 내용이 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합바이러스 비이지박 (bEasyBac) 제작

재조합바이러스 비이지박 bEasyBac(=130kb)의 제작과정은 도3에 요약하였다. 우선 attB1LacZ-EcoRF (5'-GGC GAA TTC ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTT CCA TTC GCC ATT CAG GC-3')의 foreword primer와 attB2LacZ-KpnR (5'-GGC GGT ACC ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG TAG CGC AAC GCA ATT AAT GTG-3')의 reverse primer를 제작하고 이것을 피젬-파이브제트에프(-) (pGEM-5zf(-); Promega, USA)를 template로 하여 PCR을 실시하였다. 합성된 PCR 산물은 발현 프로모터가 포함된 락지 유전자(rac Z)로 앞쪽과 뒤쪽 부분에 각각 attB1과 attB2 site가 포함되어져 있는 구조이다. 다른 한편으론 피백팩에잇 (pBacPAK8; Clontech, USA)을 제한효소 EcoRV와 KpnI으로 절단하고, 여기에 앞서 합성되어 제한효소 KpnI으로 절단된 PCR 산물을 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드 pBac8-LacZ의 DNA는 본 실험실에서 보유중인 재조합 바이러스 비에피고자(bApGOZA) DNA (Je et al., Int. J. Indust. Entomol., 2: 155-160 (2001))와 함께 곤충세포주인 에스에프나인(Sf9)에 코트랜스펙션 (cotransfection) 하여 상동재조합(homologous recombination)에 의한 새로운 재조합 바이러스 vApLacZ를 제작하였다.

한편, 플라스미드 피텐21 (pTen21; QBIOgene, USA)는 제한효소 SacI으로 절단하여 AcNPV의 피텐(P10) 프로모터를 제거하였고, 본 실험실에서 보유중인 플라스미드 pMiniF-Kan (Je et al., Biotechnol. Lett., 23: 575-582 (2001))은 제한 효소 SacI으로 절단하였다. 이 두 DNA fragment를 각각 클레노우 프래그먼트 (Klenow fragment)로 블런팅 (blunting)한 후, ligation 하여 새로운 플라스미드 pTen-MF를 제작하였다.

제작된 재조합 바이러스 vApLacZ와 플라스미드 pTen-MF의 DNA를 곤충세포주인 에스에프나인 (Sf9)에 코트랜스펙션 (cotransfection) 하여 상동재조합(homologous recombination)에 의한 새로운 재조합 바이러스 bTenLacZ를 제작하였다. 이렇게 제작된 재조합 바이러스 bTenLacZ는 곤충 세포주 (Sf9)내에서도 증식이 가능하면서, 이콜라이 (DH10B)에서도 플라즈미드 형태로 증식이 가능하며, 특히 X-gal과 IPTG가 존재하는 배지내에서 이콜라이의 콜로니 (colony)색깔을 푸른빛으로 유도한다.

한편 플라스미드 pDONR-3005ProBarnase를 제작하기 위하여, 3005Pro-SalF (5'-GGG CGT CGA CAG TAT TTG ATC TTT TTT CTA TG-3')의 foreword primer와 BaBa-SalR (5'-GGG CGT CGA CTT AAG AAA GTA TGA TGG TGA-3')의 reverse primer를 제작하고 이것을 본 실험실에서 보유하고 있는 중인 플라스미드 pBac8-3005ProBarnase 를 template로 하여 PCR을 실시하고 증폭된 산물을 SalI으로 절단하였다. 합성된 PCR 산물은 오알에프3005 프로모터가 포함된 바네이즈 유전자로, 이것을 SalI으로 절단된 플라스미드 피디오엔알221 (pDONR221; Invitrogen, USA) 내에 삽입하였다. 이렇게 제작된 플라스미드 pDONR-3005ProBarnase DNA를 재조합 바이러스 bTenLacZ의 DNA와 함께 BP Clonase (Invitrogen, USA)에 의한 트래스포지션 반응을 유도한 후, 이콜라이 DH10B에 일렉트로포레션(electrophration)하여 흰색 콜로니를 나타내는 재조합바이러스 비이지박(bEasyBac)을 분리하였다.

실시예 2: 곤충 세포주내에서 재조합바이러스 비이지박의 증식여부 확인

이콜라이에서는 플라스미드 형태로 증식 가능한 재조합바이러스 비이지박이 곤충 세포주 내에서도 바이러스 형태로 증식 가능한 지를 도4에서 확인하였다. 우선 순수 분리한 비이지박 DNA를 곤충세포주인 에스에프나인 (Sf9)세포에 코트랜스펙션 시킨 후, 4일간 곤충세포주의 증식률을 조사하였다 (도4a). 대조구로는 정상 세포주와 바이러스 증식이 확인된 bTenLacZ의 DNA를 코트랜스펙션 한 곤충세포주를 이용하였다. 정상 세포주의 경우 세포수가 4일째 까지 계속하여 증가하는 반면, bTenLacZ 세포주는 바이러스 감염에 의해 세포수가 거의 늘어나지 않는 것을 확인하였다. 이에 반해 bEasyBac 세포주의 경우, 트랜스펙션 후 1-2일 사이엔 바이러스 감염에 의해 세포수가 늘어나지 않다가, 이내 회복하여 정상 세포주와 같은 증식률 양상을 보였다.

한편, 곤충 세포주내에서 bEasyBac이 정상적으로 증식 하는지를 bTenLacZ를 대조구로하여 RT-PCR로 확인하였다(도4b). 본 실험에서 사용된 gp64와 vp39 유전자는 바이러스 게놈 내에 존재하는 유전자로, 바이러스 증식 시에 각각 발현하는 특징을 가지고 있다. 실험 결과, 대조구인 bTenLacZ 세포주로부터는 gp64와 vp39 유전자의 발현이 정상적으로 이루지는 반면, bEasyBac 세포주로부터는 이 유전자의 발현이 전혀 이루어지지 않음을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과로 볼 때, 본 발명 산물인 bEasyBac은 곤충세포주 Sf9에 초기 감염은 되지만, 더 이상 증식을 하지 못하는 것을 확인 할 수 있다.

실시예 3: 비이지박을 이용한 새로운 재조합바이러스 생산과 백그라운드 생성 여부 확인

본 발명품 비이지박이 기존의 방법보다 나은 베큘로바이러스 발현벡터 시스템임을 증명하기 위해, 대조구인 GOZA 시스템과 함께 재조합바이러스 생산효율과 비재조합 산물인 백그라운드 생성 여부를 비교 실험하였다(도5).

본 실험에 사용된 외래 유전자로는 이지에프피 유전자이며, 이를 트랜스퍼 벡터 피두얼박(pDualBac)내, 즉 폴리헤드린 프로모터 하에 삽입하여, 재조합 바이러스 생성 시 외래단백질인 이지에프피의 발현이 동일하게 유도 되도록 하였다. 제작된 트랜스퍼 벡터 DNA를 비이지박과 비에씨고자(bAcGOZA) DNA와 각각 혼합하여 곤충세포주인 Sf9세포주에 코트랜스팩션하고, 감염 5일후 각각의 곤충 세포주를 수거하여 상청액 만을 분리하고 우선, 이를 다시 곤충 세포주에 감염시키는 것을 한 페세지(Passage)로 하여 총 5 페세지까지의 발현 효율을 비교하였다. 또한, 비재조합바이러스에 의한 발현율 저하를 확인하기 위하여, 각 시스템으로부터 순수 분리한 재조합바이러스의 외래 단백질 발현율을 5 페세지까지 측정하였다(도5a). 한편, 재조합바이러스 순수 분리방법은 각 시스템의 특성에 따라, GOZA 시스템의 경우 플라크법 (O'Reilly et al., Baclovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York 1992) 을 그리고 비이지박의 경우 이콜라이를 이용한 백미드법 (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566-4579 ,1993)을 각각 이용하였다. 비이지박 시스템의 경우, 외래단백질 이지에프피의 발현효율이 첫 페세지에는 낮으나 두 번째 페세지를 거치면서 급격하게 증가하고, 계속된 페세지를 통하여 점점 증가하는 양상을 보였으며, 이러한 현상은 재조합 바이러스를 순수 분리한 시험구와 순수분리 하지 않은 시험구 모두 동일한 패턴을 보였다. 이러한 결과는 첫째, 이지박 시스템에 의해 만들어진 재조합 바이러스는 코트랜스팩션 과정에서 치사단백질에 의해 초기 농도가 낮아지나, 이후 빠른 시간 내에 증식되어지고, 둘째, 특히 이 과정에서 비재조합바이러스는 전혀 증식되어지지 않음을 확인 할 수 있다. 이에 반해, 고자 시스템의 순수 분리한 재조합 바이러스의 경우는 여러 페시지를 통해 고농도의 외래 단백질 발현 효율을 보이지만, 순수 분리 하지 않은 실험구의 경우 비재조합 바이러스의 생성에 의해, 두 번째 페세지 이후 효율이 급격히 떨어지는 것을 확인 할 수 있다. 따라서, 고효율의 외래단백질 발현을 위해서는 반드시 플라크 법과 같은 순수분리 단계가 필요하다.

고자시스템에서, 비재조합 바이러스의 존재는 도 5b에서와 같이 특이 프라이머를 이용한 PCR법으로 확인 할 수 있다. 각 재조합바이러스에 의해 감염된 곤충세포주를 각각 페시지 별로 수거하고, DNA를 추출하여 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 본 실험에서는 외래 단백질 이지에프피 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머 세트(EGFP-F (5'-GAT GGT GAG CAA GGG CG-3')와 EGFP-R (5'-TTA CTT GTA CAG CTC GTC C-3')) 그리고 비재조합 바이러스을 탐지 할 수 있는 프라이머 세트(Ka-F (5'-ATT GTC GCA CCT GAT TGC C-3') 와 Mini-R (5'-GTC ATC TGC ATC AAG AAC TAG-3'))를 각각 사용하였다. PCR 결과, 우선 외래 단백질 이지에프유전자가 두 시스템 그리고 모든 페시지에서 확인됨으로써, 외래유전자를 포함한 재조합 바이러스가 두 시스템 모두에서 성공적으로 생성되고 증식됨을 알 수 있다. 그러나, 비재조합 바이러스 포함 유전자인 미니에프와 카나마이신 저항성 유전자는 고자 시스템의 경우 모든 페시지에서 확인되는 반면, 비이지박의 경우 첫 번째 페시지에서는 나타나지만 이후 페시지를 통하여 사라지지는 것으로 보아, 비이지박 시스템은 고자시스템과는 달리 비재조합 바이러스가 증식되지 못함을 알 수 있다.

실시예 4: 비이지박을 이용하여 재조합 바이러스의 대량생산(high-throughput)여부 확인

본 발명 비이지박이 다양한 재조합 바이러스를 동시에 제작할 수 있는 지를 증명하기 위해, 비이지박과 트랜스퍼 벡터의 다양한 조합으로 인비트로 트랜스포지션과 코트랜스펙션의 동시반복처리를 통한 재조합 바이러스 생성 성공률을 측정하여 보았다(도6). 본 실험에 사용된 외래유전자는 이지에프와 루시퍼레이즈(Luciferase)유전자로 각각의 외래 유전자를 폴리헤드린 프로모터 하에 삽입하여 트랜스퍼 벡터를 제작하고, 이를 각각 비이지박 제놈과 15 ng씩 또는 30 ng씩 혼합한 후 트랜스포제이즈인 엘알 클로네이즈(LR Clonase)로 트랜스포지션 반응을 유도하였다. 각각의 반응 산물을 곤충세포주인 Sf9 세포에 코트랜스펙션한 후, 3번째 페세지에서의 외래단백질 발현 여부를 관찰하였는데, 이러한 코트랜스펙션 실험을 각각 24반복하여 재조합 바이러스의 생성효율을 측정하였다.

도 6a에서 확인되는 것처럼, 비이지박을 이용한 재조합 바이러스 생성 성공률은 비이지박제놈과 트랜스퍼벡터 DNA 농도 15 ng 그리고 30 ng 처리구 모두 95.8%로 나타났고, 이러한 결과는 외래 유전자의 차이와는 상관없이 아주 높은 효율로 재조합바이러스가 제작될 수 있음을 확인하였다. 또한 제작된 재조합 바이러스로부터 외래단백질이 정상적으로 발현되고 있음을 단백질 전기영동 분석으로 확인 할 수 있었다(도6b).

한편 다양한 재조합 바이러스의 대량생산(high-throughput)이 가능하기 위해서는 바이러스 순화과정이 필요 없는 즉, 순수한 재조합 바이러스만의 증식이 필수적인데, 이는 도5에서 증명이 되어졌다. 따라서 본 발명 비이지박은 다양한 외래 유전자가 도입된 재조합 바이러스를 동시에 대량 생산(high-throughput)할 수 있는 효율적인 베큘로바이러스 발현계이다.

본 발명에 의해 제조된 비이지박(bEasybac)은 베큘로바이러스 발현계의 재조합바이러스 제작에 있어 기존의 모벡터와는 전혀 다른 방법으로 만들어진 바이러스제놈으로서 재조합바이러스 생성효율 및 분리방법이 간편하고 우수한 효과가 있으므로 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC11499BP 20090424

Claims (2)

1. 외래 유전자가 도입된 재조합 바이러스를 동시에 대량 생산하는 베큘로바이러스 발현 방법에 있어서,
   상기 베큘로바이러스가 곤충 세포주(Sf9)내에서 증식할 수 없는 비이지박(bEasyBac)(기탁번호 : KCTC 11499BP)인 것이 특징인 베큘로바이러스 발현 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 외래 유전자는 EGFP 유전자이며 이를 트랜스퍼벡터 pDualBac(5,964 bp)내에 삽입하는 것이 특징인 베큘로바이러스 발현 방법.
   

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