KR20110089420A

KR20110089420A - 바큘로바이러스 벡터들

Info

Publication number: KR20110089420A
Application number: KR1020117013218A
Authority: KR
Inventors: 폴리 로이; 로버트 제임스 노드
Original assignee: 런던 스쿨 오브 하이진 앤 트로피컬 메디신
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2011-08-08
Also published as: PH12014501252A1; US9212374B2; WO2010055292A2; CL2015000113A1; MY178947A; GB0820631D0; RU2569183C2; EP2358883A2; UA106733C2; EP2358883B1; BRPI0921907A2; AU2009315471B2; US20110281261A1; ES2616855T3; JP2012508004A; JP2016101164A; CN102245777B; US20160090575A1; RU2011114814A; MX340956B

Abstract

본 발명은 바큘로바이러스 서열의 유전자좌 내로 유전자를 삽입하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다. 전달 벡터는 유전자와 작동 가능하게 연결된 진핵 세포의 프로모터 및 이분 선별 카세트를 포함한다. 또한, 본 발명은 전달 벡터, 유도 박미드 및 바큘로바이러스를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

바큘로바이러스 벡터들{Baculoviral Vectors}

본 발명은 삽입 바큘로바이러스(baculovirus) 서열의 유전자좌에 유전자를 삽입하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 전달 벡터 및 유도 박미드들(bacmids) 및 유도 바큘로바이러스들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

구조적 및 생화학적 연구에서, 바큘로바이러스의 발현 시스템은 진핵 세포들에서 수많은 단백질들을 발현하는데 사용되었다(문헌 14). 바큘로바이러스 시스템은 단일 재조합형 단백질들을 발현할 수 있을 뿐만 아니라 복합체들을 형성하는 다중 단백질들을 공동 발현하는 데에도 사용되고 있다(문헌 15~22). 이는 중요한데, 게놈-전반(genome-wide) 상호 작용 스크린(screens)이, 살아 있는 세포들에서 많은 중요 기능들이 다중-서브유닛 단백질 복합체들에 의해 수행된다는 것을 밝혔기 때문이다 (문헌 23). 두 가지 주요한 전략이 바큘로바이러스 시스템을 이용한 단백질의 공동-발현을 달성하는데 사용되고 있다. 현재까지 가장 흔한 접근법은 각각 하나의 재조합 단백질을 발현하는 두 개 이상의 바이러스로 세포들을 동시 감염하는 것이다(문헌 19, 24, 25). 그러나, 이 연구들에 의한 단백질 복합체들의 생산량이 매우 가변적이고, 두 개의 상이한 바큘로바이러스에 의한 동일 세포들의 동시 감염이 푸아송 분포(poisson distribution)를 따르지 않는다(문헌 26). 따라서, 동시 감염 접근법이 기술적으로 간단하지만, 많은 양의 정제된 단백질을 필요로 하지 않는 응용분야에서, 상대적으로 간단한 복합체들을 회수하는 것이 실질적으로 제한된다.

더 많은 단백질을 요구하는 구조적 연구 및 광범위한 백신 연구와 같은 적용 분야들과, 많은 서브 유닛으로부터 형성된 더 복잡한 복합체들에 대하여, 폴리헤드린(polyhedrin) 또는 P10 유전자좌들에서 삽입된 다중적이고 유사한 발현 카세트(cassette)들로부터 단백질들을 동시-발현하는 접근법이 대안으로 사용되고 있다(문헌 15~18, 22, 27). 이 접근법은 재조합 바이러스에 감염된 배양액 내 모든 세포가 재생가능 방식으로 단백질 복합체의 형성에 필요한 모든 단백질들을 발현한다는 장점을 갖는다. 동시감염 접근법과 단일 바큘로바이러스의 접근법을 비교하면, 단일 바큘로바이러스 접근법이 현저하게 재조합 복합체를 많이 생산한다는 것이 입증되었다(문헌 28). 그러나, 단일 재조합 바이러스를 사용하여 다중 단백질을 발현하는 데 어려움이 있다. 막대 형상의 바큘로바이러스는 바큘로바이러스의 게놈 내로 삽입을 꽤 허용함을 나타냄에도 불구하고, 유전자들은 상동 재조합에 의해 바이러스로 전달되고, 전달 벡터는 대장균 내에서 쉽게 조작되는 크기이어야 한다. 그러므로, 전달 벡터 내로 삽입될 수 있는 유전자들의 수량에 한계가 있다. 실제로는, 이것은 단일 유전자좌로부터 4개 이상의 단백질들이 발현될 가능성이 드물다는 것을 의미한다. 더불어, 바큘로바이러스는 서열을 포함하며, 상동 재조합을 촉진하는 단백질들을 발현한다(문헌 29~32). 그러므로 반복 염기서열을 많이 포함하는 바이러스들이 재배열 및 재조합하는 경향이 있다(문헌 21, 33, 34).

단일 바큘로바이러스 동시 발현 접근법은, 폴리헤드린 유전자좌에서 Tn7표적(target)을 이미 포함하는 박미드의 chiA / cathepsin 유전자좌에서, loxP 부위(site)의 삽입에 의해 변형된다(문헌 20). 이로 인해 대장균 내 재조합을 이용하는 이러한 유전자좌들 각각에서, 다중 발현 카세트들을 삽입할 수 있다. 이 시스템이 상이한 유전자들을 발현하도록 변형되는 발현 카세트의 반복 복제에 의존한다는 점으로 예상되는 것처럼, 이 시스템에서 삽입들은 유전적으로 다소 불안정하다는 증가가 있다(문헌 21).

최근 바큘로바이러스 연구는 바이러스 유전자들의 선택적 녹아웃(knockout)을 허용하는 ET 재조합 시스템의 이용으로부터 혜택을 받고 있다(인용 35~49). 그러나, p10 및 폴리헤드린 이외 다른 유전자좌들에서 단백질 발현을 조작하고 용이하게 하는 이 기술에 대한 가능성은 검사되지 않았다.

본 발명은 단일 바큘로바이러스 게놈으로부터 다중 재조합 단백질들(예를 들면, 비-바큘로바이러스 단백질)의 효율적 발현에 대한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 ET 재조합 시스템을 이용하여 바이러스 게놈 내 다른 유전자좌들에 단일 단백질 발현 카세트가 효율적으로 삽입될 수 있도록 한다. 게다가, 상기 방법은 다수의 서브 유닛을 갖는 복합체들을 발현할 수 있다.

발현 시스템으로서 바큘로바이러스를 사용하는 단일 단백질들의 발현은 잘 정립되어 있다. 상기 발현 시스템의 기본적인 방법론은 그것의 첫 번째 생성물 후 거의 변화하지 않았다. 133kb 바큘로바이러스에서, dsDNA 게놈은 직접적으로 조작하기에 너무 크다. 그러므로, 대장균 내에서 외래 단백질들을 암호화하는 유전자들은 AcMNPV 곤충 바이러스로부터 발현 카세트를 포함하는 벡터 내로 복제되고, 이것은 바이러스 DNA와 함께 곤충 세포 내로 도입되어, 바이러스 단백질들 및 세포 단백질들은 외래 단백질을 발현하는 전염성 바이러스(곤충 세포에 대하여)를 생산하는 상동 재조합을 매개한다. 이 주제에서, 재조합이 일어나면 복제만 하는 바이러스 게놈을 포함하는(문헌 1, 2) 변이들이 이미 발생되었다. 상기 변이들은 재조합형 바이러스 선별 속도를 높이기 위하여 트랜스포좀 Tn7의 사용(문헌 3)을 기반으로 하는 박미드로 대장균 내에서 재조합을 수행한다. 곤충 세포 내 다중-단백질 카세트의 발현 또한, 간단하게 전술한 바와 같이 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 성취된다. 초기에, 단일 단백질을 각각 발현하는 다중 바이러스들은 동시-감염에 취약한 세포를 사용하였고, 상기 단백질 복합체는 발현 후 정제했다. 그러나, 이것은 잘 봐야 비효율적이며 규모확대(scale-up) 하기에 알맞게 충분히 재현성이 있지 않다. 대안으로, 다중 발현 유닛들을 포함하나 단일 바이러스 유전자좌와 재결합되는 벡터들을 생산하였다. 이 벡터들은 모든 감염된 세포에서 모든 재조합형 단백질 서브 유닛들을 생산하여, 재조합형 단백질 복합체를 상당히 많이 생산했다는 이점이 있다. 더불어, 단일 바이러스가 모든 단백질을 발현하기 때문에, 감염의 결과가 훨씬 더 재현성을 가졌다. 이 벡터들의 단점은 두 요소이다. 첫째로, 벡터가 반복되는 염기서열들을 포함하고 바큘로바이러스가 상동 재조합을 촉진하는 단백질들을 발현하기 때문에, 발현, 특히 발현 유닛 세 개 또는 네 개를 포함하는 구성체로부터의 발현은, 많은 수의 바이러스 계대들(viral passage)(바큘로바이러스 단백질 발현을 위해서 산업적 규모확대 동안 필요한)을 지나는 동안 유전적으로 항상 안정하지는 않다. 둘째로, 이 벡터들로부터 발현할 수 있는 단백질 수량을 한정하는 대장균 내에서, 용이하게 유지하고 조작할 수 있는 삽입물 크기에 실질적 한계가 있다. 다중 단백질 생산을 위한 제안된 다른 접근법은 바큘로바이러스에서 하나의 유전자좌에 외래 단백질(들)을 삽입 한 후, 그 단백질을 발현하는 바이러스를 선택하고, 다른 단백질들을 발현하도록 두 번째 유전자좌에 재결합하는 이 바이러스 게놈을 사용하는 방법이다(문헌 7). 그러나, 이 접근법에서는 기술적 숙련도가 높아야 하고 시간이 많이 소요되기 때문에(첫 번째 유전자좌에 16일이 소요되고, 이후 유전자좌 각각에 25일이 소요됨) 거의 사용되지 않는다. 근래의 진전은, Tn 7 트랜스포좀 시스템을 기반으로 BAC(bacterial artificial chromosome)를 변형하는 것으로서, 이는 바큘로바이러스에서, 두 번째 유전자좌에 LoxP부위를 삽입하여 대장균 내 이 유전자좌에서도 여분의 유전자들의 삽입이 허용되도록 한다 (문헌 8). 그러나, 이 진전된 방법 세균 벡터에서 프로모터의 복제로 인한 반복 서열들은 구성체가 다중 바이러스 계대 동안 유전적으로 불안정하다는 것을 의미하고, 전달 벡터들은 대장균 내에서 조작을 위한 최대 실제 크기에 빠르게 도달할 것이라는 문제들이 있다.

없음.

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본 발명의 방법은, 유전적 불안정, 재조합의 다중 반복과정 필요성과 같은 기존의 방법들에서 기인하는 문제점들의 적어도 일부를 해소한다.

제1 측면에 따르면, 본 발명은 바큘로바이러스 서열의 유전자좌에 유전자를 삽입하기 위한 전달 벡터를 제공한다. 전달 벡터는:

유전자에 작동 가능하게 연결된 진핵 생물의 프로모터를 포함하는 발현 카세트;

(i) 제1 선별 표지자를 암호화하는 발현 염기서열 및 (ii) 제2 선별 표지자를 암호화하는 발현 염기서열을 포함하는 이분 선별 카세트; 및

상기 발현 카세트 및 상기 이분 선별 카세트에 이웃하는 염기서열들을 포함하되, 상기 염기서열은 바큘로바이러스 서열 내 유전자좌의 염기서열에 실질적으로 대응된다.

본 발명의 전달 벡터는 바큘로바이러스 서열의 유전자좌에 유전자를 효율적으로 삽입하고, 상기 유전자를 포함하는 바큘로바이러스를 선별하는데 사용될 수 있다. 특히, 이분 선별 카세트를 사용함으로써, 단일 선별 표지자를 이용하여 선별하는 것에 비해 양성 클론(예를 들면, 삽입 유전자를 포함하는 바큘로바이러스 염기서열들)의 확인이 상당히 증가하였다. 이것은 단일 선별 표지자를 사용하는 것에 비해 상당한 이점을 제공한다. 작은 양의 바큘로바이러스들만이 형질변환되며, 따라서 표지자들은 매우 낮은 레벨에서만 발현된다. 예를 들면, 표지자가 항생물질에 저항을 가질 때, 매우 작은 양의 항생 물질만이 사용될 수 있다. 이로 인해, 사용된 항생물질에 저항을 갖는 박테리아 변종들을 선별할 수 있게 된다. 따라서, 플레이트 상에서 자란 일부 박테리아는 변형을 포함하지 않을 수 있다. 두 개의 양성 선별 방법의 사용은 이러한 거짓 양성 선별의 가능성을 배제한다.

본 발명의 전달 벡터는 바큘로바이러스 서열 내에 유전자를 삽입하기 위해서 상동 재조합을 통해 바큘로바이러스 서열과 재조합할 수 있는 것이라면 어떠한 벡터라도 가능하다. 적절한 전달 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 전달 벡터의 주요한 특징이 하기에서 상세히 설명된다.

바큘로바이러스 서열 내로 삽입될 수 있는 유전자는 이형 유전자(예를 들어, 바큘로바이러스 유전자가 아닌 유전자)일 수 있다. 상기 이형 유전자는 단백질 복합체의 서브 유닛을 암호화하는 것이 바람직하다. 상기 이형 유전자는 바이러스성 단백질, 수용체 구성요소 또는 샤페론 복합체(chaperone complex)를 암호화할 수 있다. 이형 유전자는 다른 바이러스 단백질과 함께 바이러스 유사 입자(virus like particle, VLP)를 형성할 수 있는 바이러스성 단백질을 암호화하는 것이 특히 바람직하다.

유전자가 삽입되는 바큘로바이러스 서열 내 유전자좌는, 삽입된 유전자가 발현하도록 하고, 바큘로바이러스 서열이 복제하는 것을 방해하지 않는다면 어떠한 유전자좌라도 가능하다. 게다가, 사용된 유전자좌는, 예를 들면 복제 또는 세포로부터 세포로의 확산과 같이, 세포를 감염시키는 바큘로바이러스의 능력에 영향을 끼치지 않아야 한다. 그러한 유전자좌들은 폴리헤드린 유전자좌 및 p10 유전자좌를 포함한다. 본 발명자들이 추가적으로 확인한 적합한 유전자좌들은 ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 및 odv - e56를 포함한다.

바큘로바이러스 서열은 곤충 세포 또는 대장균과 같은 원핵 세포 내에서 복제하는데 적합한 바큘로바이러스 서열일 수 있다. 특히, BAC(bacterial artificial chromosome) 복제 단위(replicon)를 포함하는 바이러스성 바큘로바이러스 게놈 어떤 것이든 사용될 수 있다. 적합한 바큘로바이러스 서열은 AcMNPV 박미드를 포함한다.

"발현 카세트"라는 용어는 유전자 발현에 요구되는 구성 요소들의 조합을 이른다. 따라서, 발현 카세트는 진핵 세포(예컨대, 곤충 세포)에서 암호화된 유전자의 발현을 허용하는 적절한 프로모터와, 유전자 서열에 이웃하는 적절한 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호 서열을 포함한다. 진핵 세포 내에서 유전자 발현을 위한 발현 카세트들은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 특히, 더 적합한 프로모터는 바큘로바이러스 후기 프로모터(late promoter)(예를 들면, p35) 또는 말기 프로모터(very late promoter)(예를 들면, 폴리헤드린 및 p10프로모터)를 포함한다. 적절한 폴리아데닐레이션 신호 서열들은 트립토판 수산화효소(Tph) 폴리아데닐레이션 서열 또는 바큘로바이러스 유전자로부터 폴리아데닐레이션 서열들을 포함한다.

발현 카세트는 하나 이상의 유전자를 발현을 야기하는 하나 이상의 유전자(예를 들면, 2, 3 또는 4개의 유전자들)를 포함한다. 그러나, 통상적으로 발현 카세트는 단일 유전자를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 이분 선별 카세트는 유전자를 성공적으로 수용한 클론들의 식별과 분리를 개선하는 것으로 판명되었다. 이분 선별 카세트는 서로 다른 두 개의 선별 표지자를 포함한다. 또한, 카세트는 하나 이상의 박테리아 프로모터와 같이 박테리아 세포에서 표지자들을 발현하는 데 요구되는 요소라면 어떠한 것이라도 포함할 수 있다. 유전자를 수용한 서열들을 선별하는 단계는 상기 두 개의 선별 표지자 모두를 포함하는 서열을 선별하는 것을 포함한다. 이 선별 단계는 예컨대, 대장균과 같은 박테리아 세포 안에서 수행된다. 선별 표지자들은 카세트를 포함하는 세포를 선별할 수 있는 것이라면 어떠한 표지자로 될 수 있다. 예를 들면, 표지자들은, 세포 또는 콜로니의 외형 또는 색의 변화를 야기하는 표지자들과 같이 가시적일 수 있다. 또는, 표지자는 예컨대, 항생물질과 같은 것에 내성이 있을 수 있다. 두 개의 선별 표지자는, 동일한 유형으로, 예컨대, 상이한 항생물질들에 대한 내성을 가지거나, 상이한 유형으로 예컨대, 항생물질에 대한 내성을 가지는 표지자 및 가시 표지자일 수 있다. 제1 선별 표지자는 LacZ alpha단편 같은 가시 표지자인 것이 바람직하며, 이는 LacZ alpha 단편을 발현하는 셀들이 IPTG 및 X-gal 존재 하에서 파란색으로 나타나도록 한다. 제2 선별 표지자는 예컨대, 클로람페니콜(chloramphenicol), 테트라 사이클린(tetracycline), 퓨로마이신(puromycin), 암피실린(ampicillin), 페니실린(penicillin), 아프라마이신(apramycin), 카나마이신(kanamycin) 또는 프레오마이신(phleomycin)과 같은 항생물질에 내성을 나타내는 표지자인 것이 바람직하다. 특히, 제2 선별 표지자는 프레오마이신에 대하여 내성을 갖는 물질을 사용하는 것이 바람직하다.

바람직한 실시예에서, 이분 선별 카세트는 LoxP 재조합 서열에 이웃한다. LoxP 재조합 서열들은 Cre 재조합효소 존재 하에서 함께 결합하여 개재 서열(intervening sequence, 인트론)의 제거를 야기한다. 따라서, 이분 선별 카세트는 제거될 수 있으며, 이는 바큘로바이러스 서열 내로 어떤 추가 유전자가 삽입될 때 동일한 선별 표지자들이 사용될 수 있게 한다. 바람직하게, LoxP 부위는 부위들 사이에서 재조합이 1회 (single round) 발생하는 것을 확실히 하도록 변형된다. 예컨대, 변형된 Lox66 및 Lox71부위들과 같이 적절하게 변형된 LoxP 부위는 당업자들에게 잘 알려져 있다.

발현 카세트 및 이분 선별 카세트에 인접한 서열들은 전달 벡터 및 바큘로바이러스 서열 사이에서 발생하는 상동 재조합을 허용하는 유전자좌의 염기 서열들에 실질적으로 대응된다. 각 측면 서열(flanking sequence)은 길이가 적어도 20bp 인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 길이가 적어도 30bp이며, 더 더욱 바람직하게는 길이가 50bp 이다. 그리고, 상기 측면 서열은 유전자좌의 서열로 특이적 재조합을 허용하는 염기 서열을 갖는다.

본 발명의 제2 측면에 따르면, 본 발명은 재조합 박미드를 생산하는 방법을 제공한다. 재조합 박미드의 생산 방법은:

동형 재조합을 허용하기 위하여, 박미드 및 본 발명의 제1 측면에 따른 전달 벡터를 합치는 단계; 및

이분 선별 카세트를 포함하는 재조합 박미드를 선별하는 단계를 포함한다.

재조합 박미드는 이분 선별 카세트에 따라 표준 기술을 사용하여 선택될 수 있다.

재조합 박미드를 생산하는 방법은, 박미드 또는 그 발현 생성물 내에 유전자의 존재를 검출하는 단계를 더 포함한다. 적절한 스크린 기술이, 특이적 유전자에 따라, 사용될 수 있다.

게다가, 선별 카세트가 LoxP 재조합 서열에 이웃하는 경우 상기 방법은, 상기 이분 선별 카세트를 제거하기 위해서 Cre 재조합 효소에 박미드를 노출시키는 것에 의하여, LoxP 부위 사이에서 재조합을 유도하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. Cre 재조합 효소는, 아라비노스 프로모터(arabinose promoter)와 같은 유도성 프로모터의 조절하에 있는 것이 바람직하다. 이분 선별 카세트를 제거하는 것의 이점은 동일한 이분 선별 카세트를 포함하는 추가 전달 벡터가 박미드와 재조합할 수 있다는 점이다. 상기 추가 재조합 박미드의 선별은 첫 번째 재조합에 사용된 방법과 동일한 기술을 사용함으로써 수행될 수 있다.

일반적으로, 재조합 박미드를 생산하는 방법은, 원핵 세포 기반 시스템에서 쉽고 빠르게 조작할 수 있어 원핵 세포에서 수행된다. 원핵 세포 기반 시스템은 상동 재조합에 이바지하는 것이 바람직하다. 이러한 시스템은 유럽 특허 EP-1291420에서 기술하고 있는 람다 레드 재조합 시스템(lambda red recombination system)을 포함한다. 재조합 박미드를 생산하는 방법은 대장균 내에서 수행되는 것이 바람직하다. 재조합 박미드를 생산하는 방법은 대장균 EL350세포 라인을 사용하여 수행되는 것이 더 바람직하고, 상기 대장균 EL350세포 라인은 규제된 온도의 람다PL 프로모터 조절 하에서 exo, bet 및 gam로 발현되는 통합 람다 프로파지(integrated lambda prophage)와, 아라비노스 유도 프로모토(arabinose inducible promoter)의 조절 하에서 Cre 재조합 효소를 포함한다.

재조합 박미드를 생산하는 방법은 다수 회 반복될 수 있으며, 그래서 박미드는 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8개 또는 그 이상의 다수 이종 유전자들을 포함할 수 있다. 각 삽입된 유전자를 발현하기 위한 상이한 프로모터를 사용하는 노력에 의해, 그리고 각 유전자가 상이한 유전자좌에 삽입됨으로써, 박미드 내에서 반복 서열들을 포함하는 것을 감소시키거나 피하는 것이 가능하며, 그래서 박미드가 우수한 유전적 안정성을 가지는 것을 확보한다. 필수 유전자의 적어도 하나가 각 삽입된 이형 유전자 사이에 위치되는 것이 더욱 바람직하다. 이와 같은 배열은 상동 재조합이 삽입된 염기 서열 사이에서 발생되는 경우, 필수 유전자가 제거되어 독자생존불능(non-viable) 박미드가 되는 것을 보장한다.

제3 측면에 따르면, 본 발명의 제2 측면에 따른 방법에 의해 획득된 재조합 박미드를 제공한다. 박미드는 삽입된 유전자를 포함하며 또한, LoxP 서열 잔유물들을 포함한다. 이 잔유물들은 박미드를 식별하기 위한 표지자로 사용될 수 있다. 바람직하게 상기 박미드는 적어도 6, 7, 8 또는 9개의 이종 유전자를 포함한다.

제4 측면에 따르면, 본 발명은 재조합 바큘로바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 재조합 바큘로바이러스를 생산하는 방법은 바큘로바이러스가 생성되는 조건하에서 본 발명의 제2 측면에 따른 방법으로 획득된 재조합 박미드를 포함하는 진핵 세포를 배양하는 것을 포함한다.

바람직하게는 진핵 세포들은 곤충 세포이고, 더욱 바람직하게는Spodoptera frugiperda 또는 Trichoplusia ni 곤충 세포에서 파생된 예컨대, Sf21, Sf9 또는 TN 5B-1-4 곤충 세포이다. 바큘로바이러스는 표준 기술과, 테스트된 삽입된 이종 유전자의 발현을 이용하여 분리될 수 있다.

제5 측면에 따르면, 본 발명의 제4 측면에 따른 방법으로 획득된 재조합 바큘로바이러스를 제공한다.

제6 측면에 따르면, 본 발명은 다수의 이종 단백질을 발현하는 재조합 박미드 또는 재조합 바큘로바이러스를 제공한다. 각 단백질은 박미드 또는 바큘로바이러스의 별개의 유전자좌로부터 발현된다. 적어도 하나의 필수 유전자는 이종 단백질을 발현하는 각 유전자좌 사이에 배치되는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 배열은, 상동 재조합이 이형 유전자를 발현하는 유전자좌들 사이에서 발생되는 경우, 필수 유전자가 제거되어, 독자생존불능 박미드 또는 바큘로바이러스를 야기는 것을 보장한다. 바람직하게는 박미드 또는 바큘로바이러스는 적어도 3 개, 더 바람직하게는 적어도 5개 가장 바람직하게는 적어도 8개의 단백질을 발현한다. 단백질들은 이종 단백질로서, 예를 들면, 자연 발생 바큘로바이러스들에 의해서는 암호화되지 않는다. 암호화된 이종의 단백질은 VLP 같은 단백질 수용체, 수용체 복합체 또는 샤페론 복합체의 서브 유닛들인 것이 더 바람직하다.

재조합 박미드 또는 바큘로바이러스의 별개의 유전자좌들은 ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2, odv - e56 및 p10로부터 선택된 것이 바람직하다. 상기 유전자좌들의 위치는 하기의 표 1에서 바큘로바이러스 AcMNPV를 참조하여 상세히 설명된다. 당업자는 이 정보를 이용하여 다른 바큘로바이러스 변종들과 박미드에서 유전자좌들의 위치를 쉽게 결정할 수 있다.

상기 언급된 유전자좌들은 AcMNPV의 기준 접근 서열(접근 번호 nc001623)을 참조하여 아래에서 정의된다.

유전자좌	경계
ctx	2028-2296
egt	11310-13091
39k	29196-30070
orf51	43154-44337
gp37	52192-52327
iap2	60983-61823
p35	116282-117460
p10	118767-119135
odv-e56	128947-130166

제7 측면에 따르면, 본 발명은 재조합 박미드 또는 재조합 바큘로바이러스를 제공한다. 이종 단백질을 암호화하는 발현 카세트는 하기의 적어도 하나 이상의 유전자좌에 삽입된다: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 및 odv - e56.

상기 박미드 또는 바큘로바이러스의 주요한 기능을 방해하는 것 없이, 이 유전자좌들은 이종 단백질의 높은 레벨 발현을 특이적으로 허용한다는 것을 확인하였다.

바람직하게 재조합 박미드 또는 재조합 바큘로바이러스는 다수의 단백질을 암호화하며, 각 발현 카세트는 서로 다른 유전자좌에 삽입된다. 더욱 바람직하게는, 재조합 박미드 또는 재조합 바큘로바이러스는 적어도 3개, 더 바람직하게는 적어도 5개, 가장 바람직하게는 8개의 단백질들을 암호화한다. 암호화된 이종 단백질은 VLP 같은 단백질 복합체, 수용체 복합체 또는 샤페론 복합체의 서브 유닛들인 것이 더 바람직하다.

제8 측면에 따르면, 본 발명은 바큘로바이러스 서열의 유전자좌에 유전자를 삽입하기 위한 전달 벡터를 제공한다. 전달 벡터는:

유전자에 작동 가능하게 연결된 진핵 세포의 프로모터를 포함하는 발현 카세트: 및

상기 발현 카세트에 인접한 서열을 포함하되, 상기 서열은 바큘로바이러스 서열 내 유전자좌의 서열에 실질적으로 대응되며, 상기 유전자좌는 ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 및 odv - e56으로부터 선택된다.

상기에서 지적한 바와 같이, 언급된 유전자좌들에 상기 유전자를 삽입하는 것에 의해 유전자의 높은 레벨 발현이 바큘로바이러스 서열의 주요한 기능의 방해 없이 획득될 수 있다는 것을 확인하였다.

제9 측면에 따르면, 본 발명은 재조합 박미드를 생산하는 방법을 제공한다. 재조합 박미드를 생산하는 방법은:

상동 재조합을 허용하기 위하여, 박미드 및 본 발명의 제8 측면에 따른 전달 벡터를 합치는 단계; 및

발현 카세트를 포함하는 재조합 박미드를 선별하는 단계를 포함한다.

재조합 박미드를 생산하고 박미드를 선별하는 방법들은 당업자에 의해 잘 알려져 있다. 본 발명은 이 방법에 의해 획득된 재조합 박미드를 제공한다.

제10 측면에 따르면, 본 발명은, 본 발명의 방법에 따른 재조합 박미드를 생산하는 단계 및 바큘로바이러스를 생산하기 위하여 박미드를 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바큘로바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.

재조합 바큘로바이러스를 생산하는 방법은 당업자에 의해 잘 알려져 있다. 본 발명은 이 방법에 의해 획득된 재조합 바큘로바이러스를 제공한다.

본 발명은, 본 발명의 상기 측면들에 따른 전달 벡터, 박미드 또는 바큘로바이러스를 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명은 적절한 조건들 하에서 본 발명의 상기 측면들에 따른 재조합 박미드 또는 바큘로바이러스를 배양하는 것을 포함하는 하나 이상의 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 하나 이상의 단백질은 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되며, VLP 같은 단백질 복합체 또는 샤페론 복합체 형성하기 위하여 결합할 수 있다. 하나 이상의 단백질은 당업자에 의해 잘 알려진 표준 기법을 이용하여 분리될 수 있다.

세 개의 단백질 복합체들 모두에 대하여, 혼자 발현되거나 다른 단백질이 존재 하에서 발현될 때, 동일한 재조합형 단백질의 축적에서 명백한 차이점들이 있었다. 거의 모든 경우에서, 다중 단백질들이 동일한 바이러스로부터 발현될 때, 단백질 발현 레벨이 감소하였다. 이것은 어느 정도 예상한 것이었다. 전사, RNA 가공, 번역 및 단백질 접힘을 위하여 요구된 단백질들에 대한 경쟁이, 두 개의 높게 발현된 바큘로바이러스 유전자들은 각각보다 함께 발현된 경우 낮은 발현을 가질 것이라고 예견했다. 그러나, BTV VLP 및 CCT 예시에서 주목해야 할 것은 단백질 발현에서 감소가 서로 상이한 유전자좌들 사이에서 가변적이었다는 점이다. BTV, VP2, VP5, VP3 및 VP7에 대한 예시에 대해서도, BTV, VP2, VP5, VP3 및 VP7이 스스로가 발현될 때, 중요하고 유사한 단백질의 축적의 결과를 내었다. 그러나, 네 개의 단백질을 발현하는 단일 바큘로바이러스에서 결합될 때, VP2 및 VP3는 VP5 및 VP7 보다 낮은 레벨로 축적되었다(도 6a 참조). 단일 바이러스 및 네 개의 바이러스 내에서, 상기 유전자들은 동일한 유전자좌들로부터 발현되었기 때문에, 이 결과는 게놈 통합의 자리 효과에 의해 설명될 수 없다. 하나의 가능한 설명은 이 효과는 상이한 유전자들에 사용되는 상이한 프로모터들에 의해 기인되었다는 것이다. VP5 및 VP7 둘은 p10 프로모터의 조절에 하에 발현되었고, VP2 및 VP3는 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 발현되었다. 이것은 p10 유전자의 제거가 폴리헤드린 유전자좌 13으로부터 증가된 발현을 발생시킨다는 문헌들의 보고와 일치하였다. 그래서, 두 개의 p10 프로모터의 존재에서 폴리헤드린 프로모터의 복제가 폴리헤드린 프로모터 구동 유전자로부터의 발현을 선택적으로 감소하는 것이 예견될 것이다. 그러나, 이것은 CCT 복합체의 경우에서 관찰된 결과를 완전하게 설명할 수 없다. CCT5 및 CCT 2는 p10 프로모터로부터 발현되었고, 홀로 발현될 때 재조합형의 단백질의 높고 안정된 상태의 레벨을 주었다(도 8a 및 8b의 2 및 5 레인 참조). 그러나, 동일한 바이러스 내에서 결합되면 CCT5의 발현이 CCT2와 비교하여 현저히 감소되었다(도 8a 및 8b의 10레인 참조). 이 결과로부터, p10 유전자좌에서 다른 cis 활동 서열 존재는 이 유전자좌들이 삽입된 두 곳인 CCT2 및 BTV VP5의 강화된 상대적 발현에 기여할 수 있다. 동일한 위치에서 삽입될 때, 인플루엔자 HA의 상대적으로 눈에 띄게 낮은 발현은 소포체(ER)에서, 번역의 효과보다는 단백질의 회전율(전환)(turnover)과 더 관련이 있을 수 있다. CCT2 및 VP5 둘 다는 세포질에서 축적된다.

본 발명자들은 바큘로바이러스에서 재조합형의 단백질에 대한 발현 카세트의 일상적 삽입(routine insertion)이 사용될 수 있다는 점에서 ET 재조합 시스템의 효율을 개선하고 있다. 더불어, 본 발명자들은 높은 단백질 발현에 사용될 수 있는 7개의 유전자좌들(ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 및 odv-e56)을 밝혔으며, 세 개의 예시들(influenza A과 BTV VLPs, 및 CCT complex)을 이용한 이 시스템의 사용하여, 다중 단백질 복합체가 결합될 수 있다는 점을 증명하였다.

도 1은 ET 클로닝으로부터 재조합의 개량된 선별을 나타낸다.
도 2는 표지자 유전자들의 선별적 제거를 나타낸다.
도 3은 AcMNPV 게놈에서 재조합 단백질의 발현을 위한 추가적인 자리를 보여준다.
도 4는 egt 유전자좌 및 폴리헤드린 유전자좌에서 인플레인자 M1의 발현을 보여준다.
도 5는 인플루엔자 M1 및 HA의 동시 발현과 VLP의 형성을 보여준다.
도 6은 4개의 단백질들을 동시 발현하는 바큘로바이러스의 생산물을 보여준다.
도 7은 CCT5의 과발현 상에 형성된 결정 플레이트를 나타낸다.
도 8은 곤충 세포에서 CCT의 발현을 보여준다.

본 발명은 이제 하기 도면들을 참조하여 실시예의 방식으로 기술된다.

도 1은 ET 클로닝으로부터 재조합의 개량된 선별을 나타낸다. 도 1a는 cat(chloramphenicol) 재조합 및 이분 재조합에 사용된 DNA를 나타낸다. 두 개의 구성체는 동일한 바큘로바이러스, 측면 서열(AcMNPV), 레닐라 루시페라제(Renilla luciferase) 발현 카세트(Pp35-Rluc-Tph) 및 loxP 부위(LoxP)를 포함했다. 이분 선별 표지자(bipartite selectable marker)는 제오신 내성 유전자(ZeoR)와 LacZa단편을 가졌다. 클로람페티콜 내성의 구조체에서, 이것은 cat 유전자로 대체되었다. 도 1b는 ET 재조합을 따르는 양성 세균 콜로니의 개체수를 나타내는 그래프이다. 도시된 바와 같이, 재조합에 사용되는 DNA는 PCR 또는 제한 효소 처리(restriction enzyme digest)에 의해 생산되었다. 도 1c는 Rluc 발현 카세트의 정확한 삽입은 전사된 DNA에서 하나의 프라이머(primer)와 바큘로바이러스 DNA에서 타깃 유전자좌의 하나의 측면 서열을 사용하는 PCR에 의해 확인되었다. 정확한 PCR 생산물(화살표로 표시됨)은 정확한 통합을 따라 생성됐다. 도 1c에서 12개의 독립적 재조합(1~12 라인), 주형이 없는 PCR 대조군(13 라인), 변형되지 않은 박미드 주형(14 라인) 및 전사 DNA 주형 (15 라인)에 대한 결과들을 보여준다. M 레인(lane)은 표지자 DNA이다. 도 1d는 도 1c의 1~12의 재조합 박미드의 두 번의 계대(passage 2)를 가지고 감염된 세포로부터 세포 용해물에서, 세포의 감염 48시간 후 레닐라 루시페라제 활성(상대적인 발광 유닛(RLU)을 나타내는 그래프이다. 감염되지 않거나 변형되지 않은 박미드(AcMNPV)에 감염된 세포로부터 등가의 용해물에서 배경 활성도는 106배 낮았다.

도 2는 표지자 유전자들의 선별적 제거를 나타낸다. 도 2a는 AcMNPV 박미드 DNA로 발현 카세트 삽입하는(발현) ET 재조합 전략 및, Cre 매개 재조합으로 단지 표지 유전자만을 선택적으로 제거(선별)하는 선별 전략을 보여준다. 도 2b는 도 2a에서 a 및 b라고 지정된 프라이머를 사용하는 PCR를 나타낸다. 1~2 레인: ET 재조합 후 두 개의 독립된 박미드 재조합, 3~6 레인: 세균 선택 표지자들을 제거하기 위하여, Cre 유도된 재조합 후 네 개의 독립된 재조합들, 7레인: 주형 없음, 8레인: 변형되지 않은 박미드 DNA 주형, 9레인: 선택 표지자 카세트를 포함하는 플라즈미드 DNA 주형, 10레인: DNA 표지자. Cre 매개 재조합의 부모 생산물 및 재조합 생산물의 예측된 크기에 대응하는 PCR 생산물은 각각 P 및 R로 지정된다. 도 2c는 도 2b에서 PCR 분석으로부터 대표 재조합의 서열 추적 파일을 나타낸다. 서열 추적 파일은 후속 Cre 매개 재조합을 수행할 능력이 없는 재조합으로 만드는 loxP71 및 loxP66 팔들을 통합하는 손상된 loxP의 존재를 확인한다. 도 2d는 곤충 세포를 감염시킬 때, 도 2b의 부모 박미드와 재조합 박미드의 레닐라 루시페라제 활성을 나타내는 그래프이다. 레닐라 루시페라제 활성은 재조합 바이러스의 계대 후 감염 48시간 후 분석되었다. 감염되지 않은 세포로부터의 배경 활동은 대조군이라고 지정되었다.

도 3은 AcMNPV 게놈에서 재조합 단백질의 발현을 위한 추가적인 자리를 보여준다. 도 3a는 단백질 발현에 사용된 유전자좌들의 상대적 위치를 보여주는 AcMNPV 표이다. 도 3b는 삽입을 위해 사용된 유전자좌들 및 유전자좌를 만들 때 추가적 변화들을 보여주는 도표이다. 도 3c는 지정된 각 유전자좌에서 추가적인 반딧불이 루시페라제 발현 카세트를 포함하는 변형된 바이러스 감염 48시간 후 상대 레닐라 루시페라제 활성도를 나타내는 그래프이다. p35 프로모터의 제어 하에서 p10유전자좌에 모든 바이러스는 동일한 레닐라 루시페라제 발현 카세트를 가졌다. 오차 막대는 각 유전자좌에서 5번의 복제에 따른 표준 편차를 나타낸다. 도 3d는 표준화된 반딧불이 루시페라제 활성을, 지정된 각 유전자좌에 삽입된 폴리헤드린 프로모터-반딧불이 루시페라제 폴리헤드린 종결자 카세트의 상대적 발현으로 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 각 유전자좌의 5번 복제에 따른 표준 편차를 나타낸다. 반딧불이 루시페라제는 동일한 게놈으로부터 발현된 레닐라 루시페라제 대조군을 사용하여 표준화하였다. orf11, v-fgf, pe 및 orf23 유전자좌에서 반딧불이 루시페라제 삽입은 대조 바이러스보다 2 로그 이상 낮은 레벨의 레닐라 루시페라제 때문에 배제되었다. 바이러스 Ph는 폴리헤드린 유전자좌에서 반딧불이 루시페라제를, p10 유전자좌에서 레닐라 루시페라제를 포함한다. 바이러스 Ph*는 동일한 p10 레닐라 루시페라제 삽입을 갖지만 반딧불이 루시페라제 삽입은 갖지 않는다.

도 4는 egt 유전자좌 및 폴리헤드린 유전자좌에서 인플레인자 M1의 발현을 보여준다. 왼쪽 패널은 바큘로바이러스 대조군(1 및 4 레인), egt-M1 (2 레인) 및 YM1-M1 (3레인)에 감염된 세포로부터의 총 단백질의 코마시 염색된 SDS PAGE 젤을 나타낸다. 단백질 표지자들의 크기(M 레인)는 젤의 왼편에 나타낸다. 오른쪽 패널은 항-H7N7 항혈청으로 검출된 복제(duplicate) 젤의 웨스턴 블롯을 보여준다.

도 5는 인플루엔자 M1 및 HA의 동시 발현과 VLP의 형성을 보여준다. 도 5a의 왼쪽 패널은 총 단백질의 코마시 염색된 젤의 웨스턴 블롯을 나타내며, 오른쪽 패널은 항- H7N7 인플루엔자 바이러스 혈청으로 검출된 복제 젤의 웨스턴 블롯을 보여준다. 세포들은 HA 및 MA(1 레인)으로 발현하는 이중 바큘로바이러스, HA만 발현하는 바큘로바이러스(2 레인), 세포 대조군(3 레인), M1만 발현하는 바큘로바이러스(4 레인)에 감염되었다. 도 5b는 인플루엔자 VLP을 음성 염색한 전자 현미경 사진이다. 도 5c는 면역 금(HA) 표지된 금 입자를 갖는 인플루엔자 VLP의 사진이다.

도 6은 4개의 단백질들을 동시 발현하는 바큘로바이러스의 생산물을 보여준다. 도 6a는 VP2(1 레인), VP5(2 레인), VP3(3 레인) 및 VP7(4 레인)를 발현하는 바큘로바이러스에 감염된 세포와, 감염되지 않은 세포(5 레인) 또는 4개의 단백질들(레인 6 내지 10), 표지자 단백질들의 위치(M)로부터의 세포 용해물을 kDa크기로 나타낸다. 도 6b는 VP5, VP2, VP3, VP7 (1 내지 4 레인)을 발현하는 세포 및 정제된 VLP(5 레인)의 세포 용해물을 나타낸다. 도 6c는 각 BTV 단백질의 발현에 사용되는 삽입 유전자좌 및 바이러스 프로모터를 나타내는 표이다. 도 6d는 정제된 BTV VLP를 나타내는 면역 금 음성 염색한 VP5의 전자 현미경 사진이다.

도 7은 CCT5의 과발현 상에 형성된 결정 플레이트를 나타낸다. CCT5를 발현하는 바큘로바이러스에 가장 늦게 감염된 배양 배지에서 사변형의 단백질은 결집한다.

도 8은 곤충 세포에서 CCT의 발현을 보여준다. 도 8a는 CCT 1 내지 CCT 8(각각 1~8 레인)을 발현하는 바큘로바이러스에 감염된 세포, 감염되지 않은 세포(9 레인) 또는 7 CCT 서브 유닛들로 동시 발현하는 바큘로바이러스의 세포(10 레인)로부터 코마시 염색된 세포 용해물을 나타낸다. 도 8b는 다클론성의 항-마우스 CCT 항혈청을 사용하는 복제 젤의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 8c는 각 CCT 서브 유닛들을 발현하는데 사용되는 상이한 유전자좌들 및 프로모터들을 나타내는 표이다.

실시예

바큘로바이러스 발현 시스템은 효소 및 구조적 연구들에서 정확하게 접힌 진핵세포 단백질의 많은 양의 생산을 위한 잠재성이 잘 구축되어 있다. 그러나, 대부분은 아니지만 많은 단백질이 몇몇 구별되는 유전자들의 생산물에 의해 만들어진 복합체들로서 세포 내에서 활성화된다는 것이 점점 분명해지고 있다. 단백질 구조의 발견의 속도가 가속된다면, 빠르고 신뢰할 수 있는 단백질 복합체들의 생산물과 정제화를 위한 시스템을 구축하는 것이 정말 필요하다. 이것은 특히, 많은 단백질 서브 유닛에서의 동시 발현 및 진핵 세포의 접힘과 가공을 요구하는 더 큰 복합체들에서 절실하다. 이전에는 본 발명자들이 동일한 바큘로바이러스 게놈으로부터 2, 3, 4 및 5개의 단백질들을 발현하는 바큘로바이러스 전달 벡터를 개발하였다. 이전 연구에서 본 발명자들의 주요 목표는 구조적 및 효소적 연구를 위하여 단백질이 암호화된 바이러스의 비-등몰 양을 포함하는 바이러스 단백질 복합체의 많은 양을 합성할 수 있는 시스템을 생산하는 것이었다. 이러한 시스템들이 가진 기술로부터 주목해야 할 것 중 하나는, 목적하는 단백질 복합체를 형성하는 것에서, 다중 유전자들을 발현하는 단일 바큘로바이러스가 단일 유전자들을 발현하는 다중 바큘로바이러스를 갖는 곤충 세포의 동시 감염보다 더욱 효과적이라는 점이다. 최근 연구에서, 본 발명자들은 생물학적으로 관련된 포유 동물의 단백질 복합체를 위한 다중 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스의 생산을 위하여 이 주목할 점을 활용하는 새로운 기술을 사용하였다.

특히, 본 발명자들은 다중 단백질을 동시에 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 빠르고 효율적으로 생산하기 위한 세균성 염색체 공학 기술을 적용하고 개선했다. 발전된 새로운 시스템은 기존의 방법들보다 30배 효율적이고, 바큘로바이러스 게놈 내의 어떠한 유전자좌의 상용적 삽입을 허용한다. 이 연구들은 바큘로바이러스 게놈 내에서, 재조합 단백질의 높은 레벨 발현을 허용하는 7개의 새로운 유전자좌들을 확인하였다. 더불어, 본 발명자들은 개별적인 단일 유전자 삽입으로부터 복합체 내의 다중 단백질을 발현하는 바이러스 게놈을 발생하는, 재조합의 다중 반복 과정들(multiple iterative rounds)이 수행될 수 있다는 점을 밝혔다. 예를 들면, 본 발명자들은 암 연구에 중심 역할을 하는 포유 동물의 샤페론 복합체 CCT(TCP) 8개의 서브 유닛뿐만 아니라 인플루엔자 A(H7 서브 타입)을 위한 VLP 단백질 복합체 및 블루텅 바이러스(항원형 1)를 발현시켰다.

물질 및 방법

다중 유전자좌 단일 유전자 삽입은 람다 레드 재조합을 사용하여 대장균 내에서 행해진다. 본 발명은 전에는 다중 단백질 발현에 사용되지 않았던 바큘로바이러스 유전자좌들의 사용과, 바큘로바이러스 게놈으로부터 제거되어 후속하여 재사용될 수 있는 선별 표지자들의 편입을 포함한다. 다른 시스템들과 달리, 재조합 단백질 유전자들은 반복 서열들이 이웃하지 않아, 유전적 안정성을 개선한다.

상기 전달 벡터는 상동 재조합을 목적으로 하는 AcMNPV 영역, 발현 카세트(AcMNPV 프로모터, 다중연결자(polylinker), 폴리아데닐레이션 신호) 및 박테리아 선별 카세트를 포함한다. AcMNPV 프로모터는 바이러스의 후기 유전자(예를 들면, p35) 또는 말기 유전자(예를 들면, 폴리헤드린, p10) 중 하나가 사용된다. 박테리아 선별 카세트는 돌연변이 LoxP 부위-박테리아 선별 표지자- 돌연변이 LoxP 부위로 이루어진다. 상기 돌연 변이 LoxP 부위들은 LoxP 66 및 LoxP71 변종들(variants) 상에 변종들이다(문헌 9). 각 선별 표지자를 위한 LoxP 부위는 재조합에서 표지자가 제거되어 남아 있는 LoxP 부위를 파괴하도록 설계된다. 각 선별 표지자는 상이한 LoxP 돌연변이 팔들을 가져, 동일한 바큘로바이러스 내에 삽입되는 상이한 선별 표지자 유전자들 사이 재조합은 발생되지 않을 것이다.

재조합 단백질의 다중- 유전자좌 발현을 위해 사용되는 시스템의 선택

초기 조사치 계획은, 바큘로바이러스 게놈 내 상이한 유전자좌에서 재조합 단백질을 위한 발현 카세트의 효율적 삽입을 허용하기 위하여 곤충 세포에서 상동 재조합의 사용 또는 대장균 내에서 ET 재조합의 대안적 방법을 포함시켰다. 우리의 초기 데이터는, 생산된 재조합 단백질 이외에 양성 선택하지 않은 유전자좌(p10)에서 재조합 빈도(30%까지)에서 상당한 증가를 가져온 전달 벡터의 선형화를 제안했다. 조사 프로젝트의 시작 무렵에는, 두 개의 시스템(ET 재조합 및 곤충 세포 재조합)이, 그들의 재현성과, 특이 유전자좌 내 재조합 유전자의 완전한 삽입에 걸리는 시간과, 결과 단백질의 발현 체크에 대하여 고려되었다. 발현의 각 과정에 소요되는 시간에서, 바큘로바이러스 내 두 번째 유전자좌에서 유전자의 삽입을 위한 바큘로바이러스 게놈을 준비하기 위하여 필요한 시간이 줄었기 때문에, 주로 이 이유로 ET 재조합 시스템이 더 빨라졌다. 추가적으로, 형질 전환 유전자 발현과 독립적으로 유전적 삽입의 형태를 허용하는 접근법을 고안하는 것이 가능하였고, 그러므로 발현을 체크하기 위하여 곤충 세포 내에서 바이러스를 기를 필요성은 전적인 곤충 세포 기반 시스템에서 보다 덜 중요했다. 둘째로, 바큘로바이러스 시스템에서 삽입 유전자들과 함께 표지자를 함께 도입하는 것이 가능하더라도, 이러한 표지자들의 수량은 제한적이고 각각은 한 번밖에 사용할 수 없다. 상기 프로젝트의 목표 중 하나가 마우스 CCT(TCP1) 복합체(8개의 서브 유닛)의 발현이기 때문에, ET 재조합 접근법은 시스템이 빠르고 다중 유전적 삽입들을 더 잘 적용할 수 있었기에, 상기 접근법에서 연구 우선순위로 채용되었다.

실험예 1

ET 재조합의 효율적 선별을 허용하는 시약의 개발

ET 접근법을 사용한 초기 실험들은 실망적이었다. 리포터 유전자(루시페라제)가 AcMNPV 게놈(박미드) 전체를 나르는 BAC(bacterial artificial chromosome) 내에 삽입되었고, 루시페라제 리포터와 함께 편입된 클로람페니콜 내성을 갖는 유전자에 의해 선별되는 것으로 실험들이 수행되었다. 클로람페니콜 내성 박테리아 콜로니들이 발견되었음에도 불구하고, 후속 분석에서 클로람페니콜 내성 박테리아 콜로니들이 루시페라제 리포터를 가지며 정확하게 변형된 박미드를 포함하지 않았다는 것을 밝혀냈다. 유사한 결과들은, 복제 AcMNPV가 있는 경우에 곤충 세포 내에서 발현될 수 있도록 고안된 리포터가, GFP로 변화될 때에도, 나타났다. 그러나, 클로람페니콜 선별 없이 GFP 구조가 대장균 내에서 재조합을 위해 사용될 때, 그리고 박미드 DNA가 모든 변형된 대장균 개체수를 준비하고 나서, 곤충 세포들(Sf21) 내로 박테리아 감염될 때 이 DNA는 형광을 내는 몇 병소들을 나타내었다. 이 데이터들은, 문제는 재조합 그 자체가 아니라, 삽입을 포함한 박테리아의 포스트-재조합 선별(post-recombination selection )이라는 것을 암시했다. 이 문제를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 변형된 LoxP 재조합 부위에 이웃하는 LacZa 단편 및 제오신 내성 유전자를 기반으로 하는 이분 표지자 시스템을 포함하는 새로운 선별 카세트를 고안했다(도 1A 참조). 이 방법을 사용함에 있어서, 배경 콜로니 성장을 제거하지 않으면서 감소시킬 수 있는 선별 플레이트들에 충분한 제오신을 추가했으며, 재조합형들은 IPTG 및 X-gal 존재 하에서 블루 콜로니 표현형을 기반으로 선별되었다. 클로람페노콜(cat)과 이분 선별 시스템을 사용하는 재조합형들 회수의 상대적 효율을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 변형되지 않은 박미드를 포함하는 재조합 가능 대장균을 클로람페니콜을 기반 또는 이분 선별 카세트 30ng(~12.5fmol)으로 전기 천공하는 박미드 실험을 수행했다(도 1b 참조). 서열을 암호화하는 외래 단백질의 편입을 위한 이상적인 시스템은 삽입된 유전자의 반복된 PCR을 수반하지 않기 때문에, 본 발명자들은 PCR 증폭된 DNA(ET 재조합을 위한 상용적 기법) 및 제한 효소가 방출되고 젤이 정제된 DNA 사이의 재조합의 효율을 비교했다. PCR 프라이머는 PCR 생산물의 말단이 절단 효소 방출 단편들의 말단과 대응되도록 고안되었다.

DNA 단편이 재조합이 PCR에 의해 발생될 때 이분 선별이 클로람페니콜 선별만 했을 때에 비하여 양성 콜로니 개체수가 20배 증가했고, 플라즈미드 DNA의 제한 효소 처리에 의해 방출되었을 때, 30배 증가하였다(도 1b참조). 이 차이는 상당하였다(t-test, p=0.03). 클로람페니콜 선별을 위해, PCR에 의하여 회수된 콜로니들 및 제한 효소에 의해 발생된 DNA의 개체수 사이의 차이는 없었다. 그러나, 이분 선별에서, 콜로니의 개체수는 증폭된 DNA PCR(t-test, p=0.05)에 비하여 제한 효소가 방출된 DNA가 4배 높았다. 새로운 이분 선별로부터 선별된 재조합형들이 순종이고, 삽입된 발현 구조체를 포함하는 변형된 박미드를 대표한다는 것을 확인하기 위하여, PCR은 양성 콜로니들로부터 정제된 박미드 DNA에 대하여 수행되었다. 하나의 프라이머는 제오신 내성 표지자 내부 서열을 위해 고안되었고, 하나의 프라이머는 전이 DNA 내에 있는 것이 아니라, 정확한 삽입 부위 측면의 박미드 DNA에만 존재하는 서열을 표적으로 했다. 그래서 PCR 생산물은 재조합을 위해 사용되는 선형 DNA와 박미드 사이에서만 발생되는 재조합에서만 생산되었다. 12개의 개별 박미드 DNA 샘플은 이 방법을 사용하여 테스트되었다(도 1c의 1~12레인 참조), 모든 샘플은 정확하게 표적이 된 재조합에 대한 PCR 생산물 진단에 대하여 양성이었다. 이와는 대조적으로, 박미드 DNA 단독이나, 재조합을 위해 사용되는 DNA 단편을 포함하는 플라즈미드 DNA나 둘 다 PCR 생산물을 생산하는 주형으로서 행동할 수 없었다(도 1c 참조의 각각 14, 15레인 참조). 재조합이 감염된 재조합형 바큘로바이러스에서 검출된 것을 더 확인하기 위하여, 동일한 12개의 PCR 양성 박미드 클론을 Sf21 세포에 감염시키고, 두 번 계대한 다음, 각 재조합형으로 감염된 세포에서 레닐라 루시페라제 활성을 감염 48시간 후 분석했다. 12개의 재조합형의 바이러스 각각에 감염된 세포들은 배경보다 106배 레닐라 루시페라제 활성을 가졌다(도 1d 참조). 이 데이터를 기반으로 본 발명자들은 이분 선별을 사용하여 후속 실험을 진행하였다.

실험예 2

Cre 매개를 통한 선별 표지자의 제거는 동일한 이분 선별을 갖는 재조합의 다중 반복 과정을 허용한다.

단일 유전자좌 삽입을 사용하는 상이한 다중 서브 유닛을 가진 단백질 복합체를 발현하기 위하여, 이분 표지자 시스템은 변형된 LoxP 부위에 이웃된 선별 복합체를 고안하였다. 이 부위들은 1회 과정(문헌 1)으로 Cre 매개 재조합을 제한하는 lox66 및 lox71 돌연변이를 포함하고, 스페이서(spacer)에서 돌연변이는 야생형 loxP 부위에 상동성을 감소시킨다. 그래서, Cre 재조합 효소를 가진 변형된 박미드의 배양은 이분 선별 표지자의 제거와 lox 재조합 부위의 불활성을 발생시키지만, 바큘로바이러스 발현 카세트는 그대로 둔다. 이 전략이 박미드 DNA에서 다중 삽입 조작을 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 확인하기 위하여, Cre 재조합은 이분 표지자를 레닐라 루시페라제 리포터가 삽입된 박미드로부터 제거하는데 사용되었다. 재조합은 EL305 세포 라인(문헌 2)을 사용하여 대장균에서 성취되었고, EL305 세포 라인은 온도 조절 람다 PL 프로모터(λPL promoter)의 하에서 exo, bet 및 gam으로 발현되는 통합된 람다 프로파지(integrated lambda prophage)와, 아라비노스 유도 프로모터(arabinose inducible promoter)의 제어 하의서 Cre 재조합 효소 둘 다를 가진다. 레닐라 루시페라제-이분 선별 삽입을 통합하기 위하여 변형된 세 개의 박미드를 포함하는 EL 350 세포들(도 1 참조)은, 박미드 및 X-gal를 선별하고 Cre 매개 재조합에 의해 선별 표지자를 잃어버린 콜로니들을 걸러내기 위하여, 아라비노스를 가지고 유도되고 카나미신(kanamaysin)을 포함하는 플레이트에 퍼뜨렸다. 박미드 DNA은 네 개의 추정되는 재조합형들로부터 정제되었고, Cre 매개 재조합은 선별 표지자에 이웃한 프라이머들을 사용하는 PCR에 의해 확인되었다(도 2b 참조). 네 개 재조합형들 모두 성공적인 Cre 재조합으로부터 예상되는 크기와 일치하는 PCR 생산물을 포함하였다. 이것은 네 개의 재조합형들의 변형된 loxP 부위를 가로지르는 염기에 의해 재차 확인되었다(도 2c 참조). 재조합형들은, loxP71 및 loxP66 돌연변이를 포함하며 다음 재조합 과정에 대한 능력이 없는, 불능 loxP 부위를 포함했다. Cre 매개 박미드 재조합형들이 곤충 세포에 생존가능한지를 더 확인하기 위하여, 박미드 DNA을 곤충 세포들로 감염시키고, 이전과 같이 두 번 계대 후 루시페라제 활성을 검출하였다. 모든 재조합형들은 Cre 재조합 전 부모의 박미드의 같은 양만큼 레닐라 루시페라제 활성을 가졌다(도 2d 참조).

실험예 3

바큘로바이러스 게놈에서 이종 단백질들의 높은 레벨로 발현하기에 적절한 유전자좌의 확인.

바큘로바이러스 발현 시스템에서, 광대한 단백질 발현 작업이 수행되어짐에도 불구하고, 대부분의 발현은 재조합형의 단백질들을 발현하기 위한 폴리헤드린 또는 p10 유전자의 치환에 집중된다. 상대적으로 소수의 문헌들에서, 재조합형 단백질의 발현을 위한 대체 유전자좌의 사용을 기술한다. 선별이 상이한 바큘로바이러스 유전자좌들에서 효율적으로 사용되는지에 대한 테스트를 하기 위하여, 두 번째의 재조합은, 이미 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 박미드 중 하나에 수행되었다. 이 실험에서, 동일한 폴리헤드린 프로모터-반딧불이 루시페라제-폴리헤드린 종결자가, 레닐라 및 파이어플라이 루시페라제 단백질들을 위한 이중 발현 바큘로바이러스들을 발생하는 13개의 서로 상이한 유전자좌(ctx , orf11 , egt , orf23 , v-fgf, 39k, orf51 , gp37 , iap2 , chiA , pe , odv - e18 및 odv - e56)에서 독립적으로 삽입되었다(도 3a 참조). 이 실험에서 조직 배양에서 어느 바큘로바이러스 유전자가 바이러스 성장에 필수적이지 않은지를 그리고 특정 유전자좌들에서 바큘로바이러스 유전자들의 배열이 추가 발현 카세트 삽입에 유리한지를 결정함으로써 삽입을 위한 위치로 유전자좌들이 선별되었다. 그럼에도 불구하고, 몇몇의 추가적 변화들이 일부 유전자좌에서 만들어졌고, 특히 특이 바큘로바이러스 유전자의 녹-아웃을 야기시킨 변화가 있었다(도 3b 참조). 재조합 바이러스들은 곤충 세포의 Sf21에서 두 번 계대된 것이며, 세 번 계대한 세포는 감염 48 시간 후 채취되고, 분리되고, 반딧불이 및 레닐라 루시페라제 활성을 검출하였다. 레닐라 루시페라제 활성은, p10유전자좌에서 모든 재조합형들이 레닐라 루시페라제 카세트를 도입하는 동일한p35 프로모터를 가짐으로써, 바이러스 복제 및 단백질 발현에 대한 표지자로서 사용되었다. 각 새로운 유전자좌에서 반딧불이 루시페라제 발현이, 폴리헤드린 유전자의 바이러스 운반 반딧불이 루시페라제 유전자 및 동일한 레닐라 루시페라제 대조 유전자에 대해 비교되었다. 13개의 유전자좌를 테스트한 것 중 9개가 배경보다 적어도 10⁵ 배의 레닐라 루시페라제 활성을 가졌고, 8개(ctx , egt , orf51 , gp37 , iap2 , chiA, odv - e18 and odv - e56)는 부모 레닐라 루시페라제에서만 및 폴리헤드린 유전자좌 반딧불이 루시페라제는 대조군에서 측정된 활성과 동일하거나 높은 레닐라 루시페라제 활성을 가졌다. 배경 활성보다 10배 이내의 레닐라 루시페라제 활성을 주는 네 개의 유전자좌(orf11, v-fgf, pe 및 orf23)는 후속 분석에서 배제되었다. 남아있는 바이러스들을 위하여, 레닐라 루시레파제 활성은, 반딧불이 루시페라제 활성을 표준화하고 각 유전자좌로부터 반딧불이 루시페라제의 상대적 발현 양을 획득하기 위한 기준으로서 사용되었다(도 3d 참조). 7개의 유전자좌(ctx , egt , 39k, orf51, gp37 , iap2 and odv - e56)는 배경보다 적어도 10⁶ 배 높았고, 동일한 유전자가 폴리헤드린으로부터 발현될 때와 유사했다. 두 개의 바이러스(chiA and odv -e18)는 레닐라 루시페라제의 높은 레벨을 가졌지만 상대적으로 반딧불이 루시페라제 발현은 낮았다.

이 연구는 외래 단백질의 높은 레벨의 발현이 바큘로바이러스 게놈 내의 몇몇 유전적 좌위들로부터 가능하고, 우수한 발현을 야기하는 것으로 폴리헤드린 및 p10뿐만 아니라 7개의 유전자좌들(ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 and odv - e56)을 밝혔다. 39k, orf51 and gp37 부위들은 유전자의 암호화 지역에 이웃한 DNA 내에 삽입된 것들이고, 단백질 발현을 직접적으로 방해하지 않는다. 반대로, ctx , egt, iap2 and odv - e56으로 삽입된 것들 각각은 이 유전자들로부터 대응되는 단백질들의 발현을 막을 것으로 기대될 수 있다. 이 유전자들의 처음 셋 세포 배양에서 바이러스의 성장에 비필수적이라고 전술하였다(문헌 3~6). ODV-E56 단백질의 절단도 기술되었다(문헌 7).

반딧불이 루시페라제 리포터의 우수한 발현을 수행하지 않은 유전자좌들 중에서, 4 개의 유전자좌들(orf11, v-fgf, pe and orf23 )은 모든 재조합형에서 존재하는 레닐라 루시페라제 표지자 단백질의 감소된 발현을 초래했다. 연구의 초점이 말단 프로모터 발현 구조체의 삽입을 위한 적절한 부위들을 확인하는 것에 맞추어졌기 때문에, 이렇게 감소된 발현에 대한 정확한 이유를 분석하지 않았다. 가능한 이유들은 바이러스 복제 또는 전사에 대한 유전자좌-특이적 효과 및 필수 프로모터 또는 측면 유전자들에 대한 확장자(enhancer) 요소들의 방해를 포함한다. chiA 및 odv - e18 삽입 바이러스들에서 반딧불이 루시페라제의 낮은 레벨 활성은 다른 이유로 예측할 수 없었다. 다른 문헌들은 chiA 유전자좌에서 재조합형 단백질 발현 카세트들의 삽입을 기술하고 있다(문헌 8, 9). 우리의 실험에서, 이 유전자좌들 내 반딧불이 루시페라제 유전자에서 보여진 감소된 발현 레벨은 삽입에 이웃한 유전자들의 효과에 기인한다. odv - e18에 대하여, 동일한 돌연변이 바이러스를 사용하는 최근 문헌들은 출아 바이러스 생산과 세포들 사이를 이동하는데 필수적인 이 단백질을 제안한다(문헌 10, 11). 이 연구들은 odv - e18 및 상류 측면 유전자(upstream flanking gene)의 암호화 서열 내에서 제거가 있던 곳에서 돌연변이들 기반으로 했다. 상기 실험들에서, 상기 유전자 내 이 지점에서 반딧불이 루시페라제 카세트의 삽입이 뒤따르는 GAT를 암호화하는 서열의 ATG의 돌연변이에 의해 odv - e18이 불활성화되는 곳에서, 감염된 바이러스를 발견할 수 있었다. 부모 바이러스에서의 발현 양에 상응하는 세 번의 계대에서 레닐라 루시페라제의 발현은 이 복제하는 돌연변이의 능력의 손상이 없다는 것을 제안한다. 그러나, 이러한 돌연변이 없는 바이러스와 대비하여 반딧불이 루시페라제 레벨에서 ~2 로그 감소를 고려해 볼 때 돌연변이가 치유되는 곳에서 바이러스의 작은 개체수가 리포터 유전자를 발현하는 두 번째 개체수를 보충했다는 가능성을 배제하는 것은 가능하지 않다.

실험예 4

다중- 유전자좌 바큘로바이러스 발현을 사용하는 단백질 복합체의 발현

실험예 3은 재조합 단백질을 발현하는 잠재적인 다른 바큘로바이러스 유전자좌들을 정량적으로 평가하는 리포터 유전자들의 사용에 초점을 두고 있다. 재조합 단백질 복합체를 발현 및 복구하는 것이 가능한지를 확인하기 위해서, 특이 복합체 3개가 다른 개수의 단백질 서브 유닛들의 표적대상이 되었다. 바이러스 유사 입자들은 바이러스 M1 및 HA 단백질들(2개의 단백질 복합체)의 동시-발현에 의한 인플루엔자(A/seal/Mass/1/80) H7 서브 타입과, VP2, VP3, VP5 및 VP7 (4개의 단백질 복합체)의 동시-발현에 의한 블루텅 바이러스 (BTV) 혈청형 1을 위해 형성되었다. 또한, 본 발명자들은 추가적인 기능적 및 구조적 연구에 사용되기 위한 마우스 CCT 샤페론 복합체(mouse CCT chaperone)의 8개 서브 유닛의 발현을 목표로 했다.

인플루엔자 A VPLs

이 실험들을 위해, 모든 인플루엔자 유전자들은 H7N7(A/seal/Mass/1/80) 격리집단으로부터 파생된 SC35M 마우스 적응 계통을 사용했고 이는, 독일, 마르부르크의 필립 대학에 연구자들로부터 입수했다.

다중-유전자좌 발현 시스템이 두 개의 단백질을 갖는 단백질 복합체들을 생산할 수 있는지를 테스트하기 위하여, 인플루엔자 A MI 단백질에 대한 암호화 서열은 초기에 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에서 egt 유전자좌 내로 삽입되었다. 비교하기 위하여, 동일한 유전자를 폴리헤드린 유전자좌를 표적으로 하는 종래의 바큘로바이러스 발현 벡터(pAc-YM1) 내로 삽입하였다. 재조합 후에, 두 바큘로바이러스는 모두 M1 단백질을 발현했다. 코사미로 염색된 SDS-PAGE에 의해 검출했을 때, egt 및 폴리헤드린 유전자좌들로부터 단백질 발현의 레벨은, 바큘로바이러스에 감염된 세포 내의 어떤 다른 바이러스 단백질 또는 세포 단백질보다 상당히 높았다(도 4 참조).

M1 및 HA 모두를 발현하는 이중 바이러스를 생산하기 위하여, 박테리아 선별 카세트는 Cre 재조합에 의한 박미드를 발현하는 M1으로부터 제거되었고, 동일한 인플루엔자 계통(A/seal/Mass/1/80)으로부터 HA 유전자는 ET 재조합의 두 번째 과정(round)에 의해 p10 유전자좌에 삽입했다. 최종 바이러스로부터 M1 및 HA의 동시-발현은 전술한 바와 같이 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(도 5a 참조). 추가적으로, 인플루엔자 VLPs는 감염된 세포의 배지와 분리되었고, 밀도 구배 원심분리기에 의해 정제되었고, 음성 염색 EM 분석에 의해 시각화되었다(도 5b 참조). 보이는 VLPs가 실제로 인플루엔자인 지를 확인하기 위하여, 입자들은 인플루엔자 HA에 특이적인 항체를 사용하여 면역 금(immunogold)으로 표지 되었다(도 5c 참조).

이 데이터는 다중 유전자좌 접근법이 재조합형 단백질 발현에 성공적으로 사용될 수 있다는 것과, 이분 선별 표지자 시스템의 삽입의 두 번 과정을 통해 재조합형의 바이러스와 같은 것들을 생산하는 것이 실용적이다는 것을 함께 가지고 가는 우수한 증거이었다. Flu VLP는 다른 연구자들에 의해 폭넓게 테스트 되었고, 쥐 및 흰족제비에서 면역성이 있다는 것을 보여준다. VLP를 구조화하는 이 방법은 사전-통합되고 발현이 준비된 M1을 가진 바큘로바이러스 게놈을 가질 수 있다는 장점을 갖는다. 따라서, VLP를 만들기 위해서, 백신 생산물을 위해 필요한 신흥 플루 서브 타입은 무엇이든 HA 유전자를 추가하기 위한 재조합의 단일 과정만 수행하는 것만이 필요할 수 있다. 플루 백신을 기반으로 하는 VLP을 위하여, 이것은 필요한 클로닝을 단순화하고, VLP의 새로운 타입이 만들어지는 속도를 잠재적으로 증가시킬 수 있다.

BTV1 VLPs

인플루엔자와는 다르게, VLP가 단지 두 개의 단백질의 발현에 의해 형성될 수 있는 곳에서, BTV VLP는 네 개의 구조 단백질(VP2, VP3, VP5 and VP7)의 공동 작용 발현을 필요로 한다. 재조합을 위한 새로운 시스템의 유용함을 부가적으로 증명하기 위하여, 바이러스들은 생성되어 각 단백질 단독으로 그리고 네 개의 BTV 구조 단백질들의 조합으로 발현되었다(도 6 참조). 새로운 시스템의 장점 중 하나는 단일 단백질 및 다중 단백질들을 발현하는 바이러스들은 동일한 전달 벡터의 세트로부터 만들어질 수 있다. 이것은 완전한 복합체에서 동시 발현된 단백질의 위치를 위한 표지자들로서 행동하는 단일 단백질을 발현하는 제한 바이러스들의 생산을 용이하게 한다. BTV VLP에 대하여, 상이한 유전자좌들의 세트는 인플루엔자 예들에서 유전자좌들로부터 사용되었다(도 6c 참조). 추가적으로, 새로운 시스템은, 복합체의 서브 유닛 중 하나를 발현하기 위한 폴리헤드린 유전자좌들에서 기존의 전달 벡터의 사용을 허용하기 위하여, Zhao(인용 12) 등에 의해 기술된 orf1629 녹아웃 박미드와 결합되었다. VLPs의 형성은 외피 캡시드 단백질들(VP5) 중 하나에 대한 면역 금 표지로 결합된 음성 염색 EM 하에서 입자 형태에 의해 확인되었다(도 6d 참조).

마우스 CCT

본 발명의 응용은 바이러스 유사 입자의 형성에 한정되지 않는다. 실제로, 세포 단백질이 서브 유닛 하나 이상을 갖는 복합체만큼 존재하여, 이 복합체들의 효율적인 형성은 이 분야의 범위에서 응용될 수 있다. 다른 연구에서 이 시스템의 유용성을 설명하기 위하여, 샤페론 복합체 CCT가 선택되었다. 이 복합체는 암 연구에서 관련을 가지며, 8개의 서브 유닛들은 단백질 발현을 위한 상당한 도전을 나타낸다. 실제로 본 발명의 벡터 및 방법 없이는 바큘로바이러스 시스템에서 이 복합체를 발현시킬 수 없을 것이다. 8개의 전달 벡터들은, 각각 마우스 CCT를 위한 서브 유닛들 중 하나로 발현되고, 각각 상이한 유전자좌를 표적으로 하며, 상기 실험예 3에서 확인되었고, 구조화되었다. 이것들은 각 서브 유닛 단독 및 서브 유닛들의 조합체를 발현하는 재조합형의 바이러스를 생산하기 위하여 사용되었다. 서브 유닛들 중 하나(CCT5)에서, 드문 표현형은 세포 내에서 단백질이 과 발현될 때, 관찰되었다. 결정 바늘들이 세포 내에서 관찰되었고, 세포가 파열되는 감염 후기에서, 사변형 평탄의 결정 물질이 배양 매체에서 관찰되었다(도 7 참조). 이 단백질을 위해서 정제화 계획이 생성되었고, 프로젝트의 CCT 파트를 위한 협력자에 대한 초기 결정화 조건과 감염된 세포 물질이 제공되었다.

다른 CCT 서브 유닛들의 일부의 발현이 감염 후기에서 세포 내에 가시적 덩어리로 발생했음에도 불구하고, 어떤 것도 일반적인 외관을 갖는 덩어리가 아니었다.

8개 CCT 서브 유닛 모두는 높은 발현을 보였고(도 8a 참조), 마우스 CCT에 발생되는 다클론 항혈청과 교차 반응했다. 내생적 곤충 세포 CCT 서브 유닛의 하나와 다클론 항체 사이의 교차 반응이 몇몇 있었다 (도 8b의 9라인 참조). 그러나, 이러한 내성적 신호는 감염된 세포 내 높은 레벨로 축적한 3개의 서브 유닛(CCT1, CCT5 및 CCT6)에만 공존했고, 그래서 명백하게 검출될 수 있었다. 다른 모든 서브 유닛은 약간 상이한 분자 질량 단백질들로 바뀌었고, 그래서 바뀜 기반에서 곤충 세포 단백질로부터 구분될 수 있었다.

상기 언급한 모든 문헌들은 본 명세서 참조로 포함된다.

<110> London School of Hygeine and Tropical Medicine <120> Baculoviral Vector <130> 0005P/WO <140> PCT/GB2009/002647 <141> 2009-11-11 <150> 0820631.0 <151> 2008-11-11 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoxP site of recombination <400> 1 taccgttcgt ataagtagaa tatacgaacg gta 33 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified defective Lox P site <400> 2 taccgttcgt ataagtagaa tatagcgcga acggta 36

Claims

유전자와 작동 가능하여 연결된 진핵 생물 프로모터를 포함하는 발현 카세트;
(ⅰ) 제1 선별 표지자를 암호화하는 발현 염기서열 및 (ⅱ) 제2 선별 표지자를 암호화하는 발현 염기서열을 포함하는 이분 선별 카세트; 그리고
상기 발현 카세트 및 상기 이분 선별 카세트에 이웃한 서열들을 포함하며
상기 서열들은 바큘로바이러스 서열 내 유전자좌의 서열들에 대응하는, 바큘로바이러스 서열의 유전자좌에 유전자를 삽입하기 위한 전달 벡터.
제1항에 있어서,
상기 제1 선별 표지자는 가시적 마커(visual marker)인 전달 벡터.
제2항에 있어서,
상기 제1 선별 표지자는 LacZalpha 분절인 전달 벡터.
제1항에 있어서,
상기 제1 선택 표지자는 항생물질에 대한 내성이 있는 전달 벡터.
제4항에 있어서,
상기 항생물질에 대한 내성은 프레오마이신(phleomycin)에 대한 내성인 전달 벡터.
제1항 내지 제5항 중 하나에 있어서,
상기 이분 선별 카세트는 LoxP 재조합 서열들에 이웃하는 전달 벡터.
제5항에 있어서,
상기 LoxP 서열은 1회의 재조합 과정만 수행될 수 있도록 변형되는 전달 벡터.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 발현 카세트 및 상기 이분 선별 카세트가 이웃하는 서열들은 실질적으로 ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2, odv-e56 및 p10의 유전자좌들 중 어느 하나의 서열들에 대응되는 전달 벡터.
상동 재조합을 허용하기 위하여, 박미드(bacmid) 및 제1항 내지 제8항의 어느 한 항에 따른 전달 벡터를 마련하는 단계; 및
상기 발현 카세트 및 이분 선별 카세트를 포함하는 재조합형 박미드를 선별하는 단계를 포함하는 재조합형 박미드 생산 방법.
제9항에 있어서,
상기 전달 벡터는 제6항 또는 제7항에서 정의된 것이며,
상기 이분 선별 카세트를 상기 박미드로부터 제거하기 위하여, 상기 LoxP 서열들 사이의 재조합을 야기하는 단계를 더 포함하는 재조합형 박미드 생산 방법.
제9항 또는 제10항의 방법에 따른 상기 재조합형 박미드를 생산하는 단계; 및
바큘로바이러스가 생산되도록 상기 박미드를 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합형 바큘로바이러스 생산 방법.
제9항 또는 제10항의 방법에 의해 획득된 재조합형 박미드.
제11항의 방법에 의해 획득된 재조합형 바큘로바이러스.
다수의 단백질을 발현시키되,
상기 단백질들은 각각 재조합형 박미드의 분리된 유전자좌로부터 발현되는 재조합형 박미드.
다수의 단백질을 발현시키되,
상기 단백질들은 각각 재조합형의 바큘로바이러스의 분리된 유전자좌로부터 발현된 재조합 바큘로바이러스.
다수의 단백질이 단백질 복합체를 형성하기 위하여 상호 작용하는 제14항의 재조합형 박미드 또는 제15항의 재조합형의 바큘로바이러스.
단백질 복합체는 바이러스 유사 입자 또는 샤페론 복합체인 제16항의 재조합형 박미드 또는 재조합형 바큘로바이러스.
분리된 유전자좌들은 ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 및 odv-e56로부터 선택은 제14항의 재조합형 박미드 또는 제15항의 재조합형 바큘로바이러스
재조합형 단백질을 암호화한 발현 카세트는 ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 및 odv-e56 유전자좌의 하나 이상이 삽입된 재조합 박미드 또는 재조합 바큘로바이러스.
유전자와 작동 가능하게 연결된 진핵 세포의 프로모터를 포함하는 발현 카세트; 및
상기 발현 카세트에 인접한 서열들을 포함하되,
상기 서열들은 바큘로바이러스 서열 내 유전자좌의 서열들과 실질적으로 대응되며, 상기 유전자좌는 ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 및 odv-e56로부터 선택된 바큘로바이러스 서열의 유전자좌로 유전자를 삽입하는 전달 벡터.
상동 재조합을 허용하기 위하여, 박미드 및 제19항에 따른 전달 벡터를 함께 마련하는 단계; 및
상기 발현 카세트를 포함하는 재조합형 박미드를 선별하는 단계를 포함하는 재조합 박미드 생산 방법.
제21항의 방법에 따른 재조합형 박미드를 생산하는 단계; 및
바큘로바이러스를 생산하도록 상기 재조합형 박미드를 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합형 바큘로바이러스 생산 방법.
제21항의 방법으로 획득되는 재조합형 박미드.
제22항의 방법으로 획득된 재조합형 바큘로바이러스.
제1항 내지 제8항, 제20항의 적어도 하나에 따른 전달 벡터, 제12항, 제14항, 제16항 내지 제19항 및 제23항의 적어도 하나에 따른 박미드 또는 제13항, 제15항 내지 제19항 및 제24항에 따른 바큘로바이러스를 포함하는 세포.
제12항, 제14항, 제16항 내지 제19항 및 제23항의 적어도 하나에 따른 박미드 또는 제13항, 제15항 내지 제19항 및 제24항에 따른 바큘로바이러스를 적절한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 하나 이상의 단백질들 생산하는 방법.