KR101384513B1 - 감염력이 있는 구제역바이러스 Ｏ형 ｃＤＮＡ 클론 및 클론의 전체염기서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역의 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3)중에서, O형 PanAsia 계통에 속하는 2002년 국내 발생한 구제역바이러스(O/SKR/2002)의 전체 RNA 게놈을 double strand DNA형태로 증폭하여 벡터에 삽입한 클론들과 그 서열에 관한 것으로서, 이들 클론은 linear DNA형태로 혹은 in vitro transcribed RNA 형태로 특정 세포에 형질도입(Transfection)시켰을 경우에 감염력이 있는 구제역바이러스를 생성하거나 구제역바이러스 단백질을 생산할 수 있도록 최종 선발된 것들이다.
본 발명은 구제역 병원성 확인 연구나 백신 및 진단법 개발의 효과적인 연구 수단으로 폭 넓게 활용될 수 있는 구제역바이러스 cDNA 클론을 작성한 것으로, 클론 작성의 대상이 되는 구제역바이러스는 2002년 국내 양돈농가에서 사육중이던 돼지에서 발생되어 보고된 구제역바이러스 국내분리주 및 임상시료내 바이러스이다. 이 바이러스는 1990년대 초반부터 아시아에서 발생하기 시작하여 현재까지 전 세계적으로 가장 널리 전파된 혈청형 O형의 PanAsia 계통으로 분류되고 있으며, 본 발명에서 이 계통의 바이러스로는 최초로 감염력이 있는 cDNA 형태로 클로닝되었다.
먼저 감염력있는 클론 작성을 위해 돼지유래세포(IB-RS-2)에서 3회 이상 계대증식된 바이러스의 게놈 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 전체 게놈을 네 부위로 나누어 증폭시키고 그 각각을 별개의 벡터에 클로닝 하였다. 이렇게 작성된 클론들을 하나의 벡터로 클로닝하여 연결한 뒤, 클로닝 과정에서 임의로 생성된 비의도적 돌연변이를 site-directed mutagenesis를 통하여 원래의 서열과 동일하도록 교정해 주었다. 한편, 분리주 유래의 cDNA 클론에 돼지 및 소 임상시료내 바이러스(야외주) 염기서열을 반영하기 위한 게놈부위(genomic region) 치환 작업을 광범위하게 실시하였다. 이러한 클론들의 세포실험 또는 동물실험을 통해서 우리는 구제역 cDNA클론의 감염성 획득여부에 결정적인 역할을 하는 두 게놈 부위 (poly(C) 및 VP1)를 확인하였고, 이 두 부위에 대한 적절한 유전적 조작(mutagenesis)를 통해서 감염력이 있는 cDNA클론을 최종적으로 선발할 수 있었다. 아울러 감염력은 확인되지 않으나 복제능이 있고 구제역바이러스 단백질을 생산하는 비감염성 cDNA클론도 선발하였다.
특히, VP1 단백질을 번역하는 게놈부위 특정 위치(Residue)의 아미노산서열이 페닐알라닌(Phenylalanine)이 아닌 cDNA클론의 경우, 이 클론은 DNA 혹은 RNA 형태로 세포에 형질도입(Transfection)된 후의 바이러스 생성과정에서 해당 위치의 아미노산서열이 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 선택(Selection)되어 치환(Substitution)되는 현상이 지속적으로 확인되었다. 이러한 특정위치의 염기서열(아미노산서열)의 변화는 바이러스가 획득될 때 나타내는 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE) 등과 더불어 바이러스 획득여부를 판가름할 수 있는 중요한 지표로 활용될 수 있으며, 바이러스의 침입, 감염 및 진화연구와 바이러스억제제 개발의 소재로도 활용될 수 있다.

Description

감염력이 있는 구제역바이러스 Ｏ형 ｃＤＮＡ 클론 및 클론의 전체염기서열{Infectious cDNA clones of Foot-and-mouth disease virus of type O and the complete sequences of the clones}

본 발명은 RNA 바이러스 연구를 위한 reverse genetics의 근간이 되는 감염성 클론의 제작 및 활용에 관한 것으로서, 최근 이 분야는 활발히 연구가 진행되고 있다. 특히, 이러한 감염성 클론은 특정 부위에 돌연변이를 인위적으로 가할 수 있는 기법(site-directed mutagenesis)을 병용하면서 RNA 바이러스의 증식, 병원성 등에 대한 이해를 심화시켰고 의료 및 보건 산업분야에도 활용될 수 있는 가능성이 커졌다.

이 발명은 구제역바이러스 O형 ME-SA(Middle East-South Asia) 지역형(topotype) 중 세계적으로 그 전파범위가 넓고, 2000년 및 2002년 국내에서도 발생한 Pan Asian strain에 대한 cDNA 클론을 제작하여, linearized DNA 혹은 in vitro transcribed RNA 형태로 특정 세포에 형질도입(transfection)시켰을 경우에 감염력이 있는 구제역바이러스를 얻고자 한 것이다.

구제역바이러스의 감염성 클론은 Zibert 등(1990)에 의해 O1형의 바이러스에 대해 최초로 제작되었는데, 바이러스의 앞쪽 게놈 영역중 단백질을 코딩하지 않는 부위에 존재하고 있는 poly(C) tract의 길이가 60bp 이상은 되어야 세포에서의 감염력을 나타내는 것으로 보고하였다. 그러나 1993년 Rider 등에 의하면 A₁₂ 형에 대한 감염성클론 실험에서 poly(C) tract의 길이가 6개 이상이면 실험실에서 배양한 동물세포에서 감염력을 나타내었고 포유마우스에서는 poly(C) tract가 2개 이상인 클론의 경우 모두 동일한 감염력을 나타냈다고 보고하였다. 이러한 연구결과는 poly(C) tract가 바이러스의 복제에 미치는 영향과 역으로 복제나 계대과정에서 poly(C) tract 길의 변화에 대한 이해가 매우 중요하나 그 역할이나 기작에 대한 이해는 제한적임을 말해주고 있다.

이하 본 발명과 관련된 종래기술에 대해서 기재한다.

첫째, 1990년대 개시된 ‘구제역바이러스 O형 (O1K) 전체 genome을 이용한 감염성 cDNA 클론

(J. of virology, June 1990. 2467-2473)’이 존재한다. Poly(C) tract의 길이가 일정값 이하(25 cytidyl residues)일 때는 감염성을 확인하지 못한 점, 이미 20년 이전에 발생한 바이러스로 제작된 점 등에서 본 발명과 다르다.

둘째, 1990년대 개시된 구제역바이러스 A형 (A₁₂) 전체 genome을 이용한 감염성 cDNA 클론(J. of virology, Sept. 1993. p5139-5145)이 존재한다. 이 발명은 혈청형이 전혀 다른 바이러스를 사용한 점에서 본 발명과 기술적으로 본질이 다르다(이발명의 A형이고, 본 발명은 O형임).

본 발명의 과제는 국내발생 구제역바이러스 게놈(RNA)상의 유전적 정보 일체를 그대로 DNA plasmid (클론) 형태로 전환하여 이 클론으로부터 동일한 유전적 정보를 갖고 있는 감염성이 있는 구제역바이러스를 획득할 뿐만 아니라, 구제역바이러스의 증식성 및 병원성에 영향을 미치는 바이러스 게놈부위(염기서열 혹은 아미노산 위치)에 대한 연구를 수행하고, 그러한 부위에 대한 실험적 결과 일부가 궁극적으로 구제역 백신의 개발에 활용될 수 있는 것을 목표로 하였다.

작성된 구제역바이러스 클론(DNA plasmid)으로 부터 세포안 또는 세포밖에서 T7 RNA polymerase 효소의 작용에 의해서, 감염력이 있는 구제역바이러스 입자내에 있는 게놈 서열과 동일하게 또는 거의 유사하게, 세포내에서 증식이 가능하고 또한 감염력이 있는 progeny virus를 생성할 수 있는 구제역바이러스 genomic RNA가 안정적으로 합성될 수 있어야 한다. 또한, 클론에 있는 바이러스의 유전적 정보(염기서열)는 인위적인 방법에 의해서 일부 부위가 의도적으로 또는 무작위적으로 특정한 대체적 서열 또는 공백으로서 치환되어 바이러스의 생물학적, 생화학적 및 물리화학적 특성에 어떠한 변화를 주는 가가 관찰될 수 있다. 특히, 증식성과 항원성 그리고 면역원성 등에 영향을 주는 부위에 대한 조작을 통해서 진단 및 백신개발 분야에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1과 같은 염기서열을 갖는 구제역바이러스를 이용하여 작성한 cDNA 클론에 관한 것이다. 상세하게는 서열번호 1에 포함된 구제역바이러스 전체염기서열의 주된 주형(template)이 된 구제역바이러스를 이용하여 작성한 cDNA 클론에 관한 것이다. 즉, 2002년 국내분리 구제역바이러스를 이용하여 작성한 최초의 구제역 cDNA 클론(P11) 및 그 서열에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ P11, 11093 bases

* 1-625: pBluescript II SK(+) vector, 1-615

* 625: G(pBluescript II SK(+) vector) -> C(P11)

* 626-644: T7 promotor sequence (TAATACGACTCACTATAGG)

* 645-8877: 구제역바이러스 서열 (0/SKR/2002)

* 8846-8877: poly(A), 32bps

* 8925-11093: pBluescript II SK(+) vector, 793-2961

본 발명은 서열번호 2와 같은 염기서열, 서열번호 3와 같은 염기서열, 서열번호 4와 같은 염기서열 및 서열번호 5와 같은 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 구제역바이러스를 이용하여 작성한 cDNA 클론에 관한 것이다. 즉, P11을 수정하여 2002년 국내발생 소 및 돼지유래 구제역바이러스 서열로 단백질 번역부위 일체를 치환한 클론(ASP, ASC, AS19, AS10) 및 그 서열에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ ASP, 11093bps

* 645-8877: P11에 2002년 구제역감염 돼지유래 임상시료의 구제역바이러스를 세포에 계대한 서열 반영 (반영구간: 1347[TCTAGA, Xba I] to 8083[CTGCAG, Pst I])

□ ASC, 11093bps

* 645-8877: P11에 2002년 구제역감염 소 유래 임상시료의 구제역바이러스를 세포에 계대한 서열 반영 (반영구간: 1347[TCTAGA, Xba I] to 8083[CTGCAG, Pst I])

□ AS19, 11093bps

* 645-8877: P11에 2002년 구제역감염 소 유래 임상시료의 구제역바이러스 서열 반영(반영구간: 1347(TCTAGA, Xba I) to 8083(CTGCAG, Pst I))

□ AS10, 11093bps

* 645-8877: P11에 2002년 구제역감염 돼지유래 임상시료의 구제역바이러스 서열 반영(반영구간: 1347(TCTAGA, Xba I) to 8083(CTGCAG, Pst I))

본 발명은 서열번호 5와 같은 염기서열을 갖는 클론의 UTR(untranslated region) 또는 T7 promotor 부위를 수정하여 replicon의 복제 및 발현의 차이를 확인하게 한 클론으로서, T7 promotor 부위 644nt G 뒤에 G가 하나 더 삽입되고, 9602nt 위치의 C가 T로 치환된 것을 특징으로 하는 클론에 관한 것이다. 즉, AS10의 UTR(untranslated region) 또는 T7 promotor 부위를 수정하여 replicon의 복제 및 발현의 차이를 확인하게 한 클론들(AS10T7G3)에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ AS10T7G3, 11094bps

* AS10의 T7 promotor 부위 644nt G 뒤에 G가 하나 더 삽입됨(TAATACGACTCACTATAGG -> TAATACGACTCACTATAGGG)

* C9602T (AS10의 9602nt 위치의 C가 T로 치환됨, pBluescript vector 영역)

본 발명은 서열번호 5와 같은 염기서열을 갖는 클론의 UTR(untranslated region) 또는 T7 promotor 부위를 수정하여 replicon의 복제 및 발현의 차이를 확인하게 한 클론으로서, 1309nt 위치에서 A가 G로 치환되고, 9458nt 위치의 C가 A로 치환된 것을 특징으로 하는 클론에 관한 것이다. 즉, AS10의 UTR(untranslated region) 또는 T7 promotor 부위를 수정하여 replicon의 복제 및 발현의 차이를 확인하게 한 클론들(AS10IR)에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ AS10IR, 11093bps

* A1309G (1309nt 위치에서 AS10의 A가 G로 치환됨, 구제역의 IRES 영역)

* C9458A (AS10의 9458nt 위치의 C가 A로 치환됨, pBluescript vector 영역)

본 발명은 서열번호 5와 같은 염기서열을 갖는 클론의 UTR(untranslated region) 또는 T7 promotor 부위를 수정하여 replicon의 복제 및 발현의 차이를 확인하게 한 클론으로서, 1309nt 위치의 A가 G로 치환되고, 9602nt 위치의 C가 T로 치환된 것을 특징으로 하는 클론.에 관한 것이다. 즉, AS10의 UTR(untranslated region) 또는 T7 promotor 부위를 수정하여 replicon의 복제 및 발현의 차이를 확인하게 한 클론들(AS10T7G3IR)에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

* AS10T7G3IR, 11094bps

AS10의 T7 promotor 부위 644nt G 뒤에 G가 하나 더 삽입됨(TAATACGACTCACTATAGG -> TAATACGACTCACTATAGGG)

A1309G (AS10의 1309nt 위치의 A가 G로 치환됨, 구제역의 IRES 영역)

C9602T (AS10의 9602nt 위치의 C가 T로 치환됨, pBluescript vector 영역)

본 발명은 서열번호 6과 같은 염기서열을 갖는 replicon 클론에 관한 것이다. 즉, ASP의 S fragment와 poly(C) 부위를 교체하기 위해 작성한 변형된 ASP클론(ASP_A618G)및 그 서열과 이 클론에서 해당부위가 교체된 replicon 클론(ASPs12L) 및 서열에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ ASP_A618G, 11093bps

* ASP의 618nt A를 G로 치환함. 이로써 클론내 유일한 Asc I 제한효소 인식부위(GGCGCGCC)가 생성되었고, 이 부위와 Xba I 제한효소 인식부위(TCTAGA, 1347-1352) 사이를 돼지유래가검시료의 세포계대주 바이러스를 대상으로 증폭하여 교체함.

□ ASPs12L, 11083bps

* ASP와 비교할 때, A618G로 치환, A732G로 치환 C819T로 치환, T865C로 치환, 1013-1034 poly(C) 부위(CCCCCCTCCCCCCCCCCCCCCC)가 CCCCCCCCCCCC(12개)로 교체됨.

본 발명은 ASPs12L에서 poly(C) 부위를 12개에서 24~36개로 연장한 감염성 클론에 관한 것이다. 즉, ASPs12L에서 유래된 poly(C) 부위를 연장한 감염성이 확인된 클론(ASPs24L) 및 그 서열에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ ASPs24L, 11095bps

* Poly(C)부위를 12개에서 24개 이상으로 늘림. Capillary type의 sequencer로서 판별할 수 있는 병렬로 연결된 C의 개수에는 제한이 있음.

* 여기에서는 24개로 기록하나 site-dircted mutation에서 의도한 바대로 변형되었다면 실제로는 36개 정도까지 연장되었을 수 있음.

본 발명은 ASPs24L에서 VP1 34th 부위 아미노산서열을 교체한 감염성 클론에 관한 것이다. 즉, ASPs24L에서 VP1 34th 부위 아미노산서열을 교체한 감염성이 확인된 클론(ASPs11F) 및 그 서열에 관한 것이며, 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ ASPs11F, 11092bps

* ASPs24L의 4022nt C를 T로 치환함 (758째 아미노산, VP1의 34번째 아미노산이 F(phenylalanine)에서 L(leucine)으로 치환됨)

* Mutagenesis 과정에서 poly(C)부위의 C의 갯수가 24개에서 11개로 줄어듦

본 발명은 구제역바이러스 클론의 poly(C) 부위를 연장하여 감염력의 획득력에 변화를 가져올 수 있는 돌연변이 작성법, 이 때 사용된 프라이머 서열에 관한 것이다. 이에 대해 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ High fidelity PCR by Phusion Hot Start DNA Polymerase (프라이머는 poly(C)의 길이를 36개 까지 연장할 수 있도록 설계된 Forward primer(5'-CCCCCCCCCCCCCCCCCCAAGTTTTTAC-3')와 Reverse primer( 5'-GGGGGGGGGGGGGGGGTGAAAGGT-3')를 사용하여 ASPs12L를 주형으로 함)

□ Dpn I 제한효소를 처리하여 주형으로 상용된 플라스미드를 분해함. (Dpn I(TOYOBO)은 methylated된 기존의 플라스미드만 분해함)

□ Self-ligation시킨 후에 transformation 시킴 (Electromax E. coli DH10B cells (Invitrogen) 사용)

본 발명은 Poly(C)의 길이가 24개 이상으로 연장되어 감염력이 확인된 구제역바이러스 cDNA 클론이 형질전환된 대장균의 대량 배양법에 관한 것이다. 이에 대해 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

□ 정확한 원인은 알 수 없지만, poly(C)의 길이가 24개 이상으로 연장되어 감염력이 있는 구제역바이러스 cDNA 플라스미드로 최초 확인된 대장균 클론의 경우는 miniprep을 통해 mutagenesis가 성공된 사실은 확인이 가능하였으나 master plate에서 해당 colony가 잘 자라지 않는 경우가 있었고, midiprep을 위해 일반적으로 사용되는 형질전환된 대장균의 배양조건(16-20시간, 250rpm, 37℃)에서는 증식되지 않는 경우가 있었음.

□ 따라서, 이러한 경우 감염력이 확인된 클론의 플라스미드를 대장균 세포에 재차 형질전환시켜서 약 1ml에 해당하는 배지에서 1시간 정도 배양후 이 배지액 전량을 항생제가 포함된 배지 200ml에 부어준 뒤 100rpm 및 37℃ 온도조건에서 30시간 이상 배양시킴으로서 200ml에서 약 100ug이상의 플라스미드를 획득할 수 있었음.

국내분리된 구제역바이러스 O형 PanAsia 형 바이러스의 게놈 정보를 그 조성과 순서에 있어서 99.9% 이상 동일(poly(C) tract 및 poly(A) tract 제외, 이 부위는 공시된 바이러스의 게놈에서도 그 길이를 정확히 파악하기 곤란함)하거나 아미노산 서열에서는 100% 동일하게 DNA형태로 세균의 플라스미드 형태로 제작하여, 이후 구제역바이러스 감수성 세포에서 이러한 클론(플라스미드)의 구제역바이러스 RNA 게놈을 생성해 내고, 복제 및 발현을 일으키고 또한 최종적으로는 공시된 바이러스와 같이 감염력이 있는 바이러스입자를 생산해 내는 것을 다루었다. 다른 혈청형의 바이러스로 감염성클론이 작성된 사례가 있지만 구제역 혈청형 O내의 PanAsia형 바이러스는 최초로 2002년 국내발생바이러스의 세포계대주에 대해 감염성 클론을 제작하였다.

본 발명은 특히 감염력이 확인되지 않는 replicon형태의 클론 및 감염력이 확인되는 감염성 클론을 포함하고 있으며, 이들 간의 서열상 차이가 사실상 미미한 점을 고려할 때 감염력에 영향을 주는 인자에 대한 연구를 위한 클론 세트를 제공하고 있으며, 복제에 영향을 주는 인자에 대한 연구결과도 나타내었다. 특히, poly(C)의 길이를 조절하는 방법을 제공하고 바이러스의 생존에 있어서 이들의 역할을 파악할 수 있는 재료와 기초결과를 제공한다. 또한, 대장균의 생장과 구제역 게놈이 들어가 있는 플라스미드와의 상호작용에 대한 단서를 제공한다. 또한, 이들의 전체서열과 클론의 기본골격을 확인할 수 있는 제한효소의 사용과 전체서열을 분석할 수 있는 프라이머의 제공으로 원하는 방식으로 클론을 조작하여 백신 및 진단법 개발, 병원성 관련인자 탐색 연구등에 효과적으로 사용될 수 있는 자료를 제공한다.

결과적으로 구제역바이러스의 복제와 발현 그리고 감염과 관련된 기초지식을 획득하는데 이용될 뿐만아니라 일부유전자 및 부위를 조작하여 백신 및 진단의 재료로 활용할 수 있으므로 기존의 구제역 불활화 백신으로 해결할 수 없었던 분야에 도움을 줄 수 있다.

도 1에서 구제역바이러스의 전체 게놈을 플라스미드에 클로닝한 그림이다.
도 2는 구제역바이러스 전체 게놈이 클로닝될 때 나타나는 제한효소 소화 패턴이다.
도 3은 P11 클론을 수정하기위해 공시된 4종의 국내발생구제역 바이러스와 이들이 클로닝된 그림이다.
도 4는 구제역 전체게놈 클론을 세포에 형질도입시켜 그 감염여부를 확인하는 실험법 소개이다.
도 5는 도4의 4개 클론들이 작성되어 실험결과를 나타낸 것이다.
도 6은 도5에서 발현력이 가장 좋은 AS10을 변형시킨 클론들을 DNA형태로 세포에 도입한 결과이다.
도 7은 도5에서 발현력이 가장 좋은 AS10을 변형시킨 클론들을 RNA형태로 세포에 도입한 결과이다.
도 8은 ASP클론을 감염력을 얻게 하기 위해 변형시킨 클론이다.
도 9는 ASP클론의 감염력이 확인되어 그 상층액에 대한 염기서열분석결과이다.
도 10은 감염력이 있는 구제역 바이러스 획득 또는 비감염력의 구제역 바이러스 유사입자 및 단백질의 발현에 관한 것이다.

본 발명은, 구제역바이러스 전체게놈 정보가 이중나선의 circular DNA 벡터에 실려서 T7 RNA polymerase의 작용에 의해 구제역바이러스 단백질의 발현이나 구제역바이러스의 RNA 게놈의 복제가 확인되지 않는 형태의 원형의 DNA클론 (P11)을 제공한다.

이 클론으로부터 구제역바이러스 전체게놈 정보가 이중나선의 circular DNA 벡터에 실려서 T7 RNA polymerase의 작용에 의해 구제역바이러스 단백질을 합성하고 구제역바이러스의 RNA 게놈의 복제가 확인되지만 구제역 감수성 세포로부터 감염성이 있는 구제역 바이러스 입자를 생산할 수는 없는, 즉 replicon 형태의 RNA 게놈과 그 유래의 구제역단백질 생산이 확인되는, DNA 클론(AS10, ASC 및 ASP) 및 이들 클론의 특정 부위에 돌연변이를 유도하거나 특정부위를 교체한 DNA 클론들(ASPs12L 등)을 제공한다. 이들은 모두 감염성이 있는 구제역 바이러스 입자를 즉각적으로 생산할 수는 없지만 RNA 게놈 복제 및 단백질 번역 효율에 상호간 차이를 나타낸다.

또한 위 클론중 ASPs12L에서 유래된, 구제역바이러스 전체게놈 정보가 이중나선의 circular DNA 벡터에 실려서 T7 RNA polymerase의 작용에 의해 구제역 감수성 세포로 부터 감염성이 있는 구제역바이러스 입자를 생산할 수 있는 구제역바이러스 RNA 게놈을 세포내 또는 세포밖에서 합성해 낼 수 있는 DNA 클론(ASPs35L 및 ASPs11F)을 제공한다.

또한, DNA 클론(ASPs12L) 클론의 poly(C) tract 길이를 연장하여 새로운 클론(ASPs24L)을 작성한 뒤, 이 클론을 세포에 도입시키는 실험을 하게 되면, 세포내에서 RNA의 복제과정중에 일어나는 무작위적 혹은 선택적 변이에 의해 DNA 클론에서 의도적으로 변화시킨 부위(VP1, 34th aa)가 둘 다 소수성(hydrophobic)한 아미노산인 L(leucine)에서 F(Phenylalanine)로 변화됨을 관찰하였다. 이 때 사용되는 poly(C) 부위를 연장시킬 수 있는 돌연변이에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 서열 및 돌연변이 생성법 그리고 poly(C) tract가 최소 24개 이상으로 연장된 DNA 클론(ASPs24L)를 제공한다.

위와 같이 RNA 게놈의 복제 및 구제역바이러스 단백질의 생산을 유도할 수 있지만 감염성이 있는 온전한 구제역바이러스 입자의 존재를 간접적으로 확인할 수는 없었던 DNA 클론(ASPs12L)에서 감염성의 획득에 핵심적인 위치로 발견된 VP1의 34번째 아미노산을 L34F로 돌연변이 유도를 해주면 poly(C) tract 길이를 늘리지 않고도 감염성이 있는 구제역바이러스의 생산을 유도할 수 있는 이 아미노산 부위 및 이 부위가 치환된 DNA 클론(ASPs11F)을 제공한다. 이 때 poly(C)의 길이는 12개에서 11개로 오히려 1개 줄어든다.

구제역 바이러스 RNA 게놈으로 부터 작성된 DNA클론이 감염성이 있는 구제역바이러스를 생산하는 여부를 확인하는 방법을 구체적으로 설명하면;

(1) 클로닝된 plasmid 전체서열을 확인하여 구제역 RNA 게놈서열과 일치하는 여부를 확인하는 단계;

(2) 클로닝된 plasmid를 대량으로 얻기 위하여 형질전환된 특정 대장균을 배양하고 plasmid를 회수하는 단계;

(3) 회수된 plasmid를 특정한 제한효소(Nsi I)를 사용하여 구제역바이러스 게놈의 끝단에 해당하는 poly (A)의 뒤쪽을 절단하여 선형의 이중가닥 DNA형태로 만드는 단계;

(4) 선형 이중나선 구조의 DNA 끝단을 Klenow 효소를 사용하여 Blunt end로 변형시키는 단계;

(5) T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주(BHK T7-9)에 위 (4)의 DNA를 형질도입(transfection)시켜서 구제역바이러스 게놈 RNA와 (거의) 동일한 서열의 RNA를 세포내에서 합성되도록 하는 단계, 또는 세포밖 튜브내에서 in-vitro transcribed 된 RNA를 형질도입시키는 단계;

(6) DNA로부터 합성된 구제역바이러스 유사 RNA 게놈이 세포내에서 증식하고 단백질을 번역하는 단계;

(7) 세포내에서 일반적인 구제역바이러스의 복제와 차이점을 찾기 어려운 방식으로 복제된 (염기서열이 구제역바이러스와 (거의) 일치하는) RNA 게놈과 동시에 세포내에서 발현된 구제역 입자 단백질이 조합되어 바이러스입자로 완성된 후 이 바이러스가 또 같은 또는 다른 종류의 새롭게 배양된 세포를 감염시켜서 그 세포내에 증식되어 그 세포를 깨뜨림으로서 감염성이 있는 구제역바이러스로 생산된 단계, 혹은 다른 세포를 감염시키지 못하거나 감염시키더라도 더 이상 증식을 하지 못하는 단계 ;를 포함한다.

이하, 본 발명을 도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명한다.

도 1은 구제역 게놈이 벡터에 삽입된 형태를 나타낸 그림으로서 T7 promotor 아래에 바로 구제역 게놈서열이 시작되며 구제역 게놈 끝단의 poly (A) tail 뒤에는 제한효소 사이트(Nsi I)을 두어서 원형의 플라스미드를 단일의 제한효소 처리로 선형화 할 수 있도록 하였다. 따라서 이 제한효소는 이 원형의 플라스미드에서 오직 한 위치에만 존재하게 된다.

도 2는 도 1과 같이 구제역 전체 게놈이 cDNA 형태로 정상적으로 클로닝 되었을 때 나타나는 제한효소(Fsp I)의 소화된 형태를 나타낸다(약 6147, 2999, 1172, 759 크기의 네 개 단편이 확인 되어야 함). 이러한 패턴은 클론의 일부 유전자나 일부 서열을 수정(치환, 삭제 또는 삽입)하는 과정에서 그 조작이 가해진 산물에 대하여 그 조작의 전후에 있어서 클론의 기본적인 골격이 유지되었는지를 확인할 때 유용하다. 이렇게 그 기본골격이 유지된 클론에 대해 서열분석을 통해 의도한 돌연변이가 생성되었는지를 확인하게 되며, 연속되는 또는 추가적인 클로닝 과정중에 이러한 DNA 클론의 기본 골격이 깨진 군집(colony)는 선택에서 쉽게 배제되어 원하는 돌연변이의 선발을 보다 용이하게 한다.

도 3은 최초의 구제역 cDNA 클론(P11)의 염기서열이 당초 공시된 바이러스의 서열과 비교할 때 CDR (coding region)에 상당한 비의도적 변화가 있음이 밝혀진 후에, P11의 CDR(coding region) 대부분을 교체하기 위해 선발되고 공시된 네 종류의 야외주 또는 세포 계대주 구제역바이러스와 이들 바이러스의 CDR으로 P11이 치환된 네 가지의 클론의 모식도를 나타낸다.

도 4는 작성된 구제역 클론을 DNA 또는 RNA형태로 세포에 형질도입 시키는 과정과 형질도입후 게놈의 복제, 발현 및 감염성 획득여부에 따라 나타날 수 있는 결과에 대한 도해이다. 클론을 DNA형태로 도입시킬 경우에는 T7 RNA polymerase가 세포내에서 발현되도록 변형시킨 세포주(BHK T7-9, 일본 기후대학 Dr Ito 박사로부터 연구용으로 기증받음)를 활용하였다.

도 5는 도 3과 같이 P11의 5' UTR(untranslated region) 대부분과 3‘ UTR을 그대로 유지하고 CDR을 교체하여 새롭게 작성한 네 종류의 클론(ASP, ASC, AS10 및 AS19)을 선형화하여 BHK T7-9세포에 transfection한 결과 AS10에서 구제역 바이러스 특이 구조단백질의 발현이 세 개 클론(ASP, ASC 및 AS10)에서 나타났고, AS10에서 가장 뚜렷하게 나타났다. 한편 상층액에서 바이러스의 RNA를 추출하여 실시간 RT-PCR로 정량분석을 실시한 결과 단백질의 발현량과 비례하는 수치로 RNA양이 관찰되었으며, AS19에서의 수치가 가장 낮았다. 따라서, AS10을 형질도입한 세포의 상층액에 감염성이 있는 구제역바이러스가 생성되어 있을 가능성이 가장 컸으나, 이들 상층액을 구제역감수성 세포에 접종시킨 결과 감염성은 확인되지 않았다. 비록 감염성은 확인되지 않았지만 클론별로 생산되는 RNA copy수의 차이 등을 볼 때 AS10, ASP 및 ASC 등은 세포내에서 replicon형태로 세포내에서 복제되고 구제역바이러스 단백질도 생산하고 있음을 확인할 수 있었다.

도 6은 가장 뚜렷한 replicon의 특징을 보이는, 공시된 구제역바이러스와 서열을 일치시킬 수록 감염력을 획득할 가능성이 높다는 기존의 문헌과 추론에 의거하여, 여전히 AS10의 5'UTR부위(대부분의 5'UTR은 클론 P11 유래임) 특정위치의 염기(IRES부위, 5‘ 끝단으로부터 665nt 번째, 기준 바이러스: )를 공시된 구제역바이러스 야외주에서 관찰되는 서열과 일치시키기 위해 Adenine에서 Guanine으로 치환 조작되거나 T7 RNA polymerase의 전사효율을 늘리고자 T7 promotor 끝단의 연속된 두 염기(GG)를 세 개로 연장한 클론의 세포내 형질도입 실험결과이다. 이러한 작업은 site-directed mutagenesis를 이용하였고 각각의 클론 조작결과를 IR 및 T7G3로 명명하였으며 두 종류의 돌연변이의 조합을 갖춘 조작결과는 T7G3IR로 명명하였다. 한편, 복제력을 상실한 클론을 작성하기 위하여 이미 보고된 바와 같이 3D polymerase의 일부를 제한효소, Sal I을 이용하여 삭제하였고 이 클론을 3Dmut으로 명명하고 세포내에서 복제가 불가능한 대조군으로 활용하였다. 새로이 작성된 클론들은 모두 전체염기서열을 분석하여 의도한 부위외에는 다른 돌연변이가 없음을 확인하였고, 선형화(線形)된 형태로 세포에 형질도입시킨 결과 도 6과 같이 대조 클론(3Dmut)과 비교할 때 다른 클론들에서는 뚜렷하게 증가된 복제현상을 확인할 수 있었다. 또한 이렇게 형질도입된 세포의 상층액에서 구제역바이러스 구조단백질이 발현되고 있음을 western blot으로 확인할 수 있었는데, 복제력을 상실시킨 AS10 유래의 대조 클론(3Dmut)도 세포에 전달시 구조단백질의 발현이 일부 확인되었다. 이는 바이러스 RNA 복제가 없어도 형질도입된 DNA로부터 전사된 RNA가 messenger RNA로 작동하여 일정량의 구제역바이러스 단백질을 발현시킬 수 있음을 보여주었다. 그러나 이들 모두에 있어서 2차 배양에서 세포의 변성을 일으키며 감염성을 보이는 현상은 확인되지 않았다. 한편, IR의 조작을 가할 경우 기존의 AS10 클론에 비교하여 복제나 발현능이 다소 상승되는 효과를 나타내었고 반대로 T7G3의 경우 오히려 AS10의 경우 보다 발현이나 복제능이 다소 떨어지는 현상을 보였으며 이는 T7G3IR의 경우도 마찬가지였다.

도 7은 한편, 도 6에서 비교된 총 다섯 종의 구제역 cDNA클론을 in vitro transcription을 하여 RNA를 합성 후 서로 다른 세 종류의 세포에 도입시켜 발현 및 복제 양상을 비교해 본 것인데, BHK 세포에서는 구제역바이러스의 입자를 구성하는 구조단백질(VP1)의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인할 수 있었다. 특히, T7 promotor 끝단에 한 개의 dGTP를 추가하여 총 세 개가 되게 하는 조작(T7G3)은 세포내에서의 복제 및 발현 효율을 떨어뜨니는 결과를 나타냈는데 이러한 결과는 도 6에서 선형화된 DNA형태로의 형질도입 실험결과와도 일치하는 것이었다. 이는 구제역바이러스 고유의 RNA 게놈의 5’ UTR 끝단에 원래 구제역바이러스 게놈에는 존재하지 않는 guadinine 3개가 불필요하게 따라 붙으면서 복제 및 발현에 오히려 저해되는 효과를 준 것으로 판단된다. 한편, 도 6과는 달리 RNA 게놈의 복제력을 고의적으로 상실시킨 AS10 유래의 대조 클론(3Dmut)에서는 RNA형태로의 세포내 형질 도입의 경우는 구조단백질 발현이 확인되지 않았다. 이러한 차이는 세포내에서 단백질 발현에 사용될 수 있는 messenger RNA의 상대적인 생성량(도입량)의 차이 혹은 messenger RNA의 세포내 이동경로나 분포의 차이에 의한 것으로 추정된다.

도 8은 도 5에서 작성된 cDNA 클론중 증식성은 확인되었으나 감염성이 확인되지 않은 돼지유래 구제역바이러스 세포계대주 클론(ASP)의 추가 조작후 세포에 형질도입시킨 결과이다. 먼저 공시된 세포계대주 염기서열 결과에 비교할 때 s-fragment 및 poly (C) 부위에서 세포계대주의 염기서열과 불일치하는 P11 유래의 5'UTR 영역을 교정하기 위해 공시된 세포주 유래 구제역바이러스의 해당부위를 증폭하여 클로닝한 뒤 ASP의 해당부위를 교체하는 데 성공하였고 이를 ASPs12L 클론으로 명명하였고, poly(C) tract의 cytidine의 개수는 여기서 12개였다. 여기서 poly(C) segment의 cytidine의 개수를 늘려서 감염력의 획득에 보다 유리한 조건을 충족시킨 바, 이 클론을 ASPs24L로 명명하였다. 이 클론의 poly(C) tract의 정확한 길이는 capillary sequencing 기술로는 단정하기 어려우며 최소 24개에서 최대 36개로 추정된다. 이 클론(ASPs24L)의 경우 공시된 구제역바이러스 세포계대주의 서열 대비 synonymous mutation은 6개가 관찰되었고 non-synonymous mutation은 1개가 관찰되었다. 여기서 아미노산 차이는 VP1의 34번째 아미노산에 해당되었다. ASPs24L클론을 선형화된 DNA의 형태로 BHK T7-9 세포에 형질도입한 이후 세포변성효과가 7일경부터 관찰되었고 이 상층액을 IBRS-2세포에 감염시킨 결과 감염력이 확인되었다.

도 9는 이렇게 감염된 세포의 상층액을 수거하여 VP1부위의 염기서열을 조사 비교한 결과로서 ASPs24L클론이 공시된 세포계대주 대비 아미노산서열에서 유일하게 상이했던 VP1의 non-synonymous mutation site가 이 클론을 통하여 IBRS-2의 상층액에서 획득한 바이러스에서는 공시된 세포계대주와 일치하였는데, 이는 무작위적 생성 또는 무작위적 발생과 결부된 선택의 결과로 해석될 수 있을 것이다. 이렇게 최초 IBRS-2 세포주 상층액은 약 3x10⁴ PFU/ml의 역가를 나타내었다. 한편, poly(C) tract의 연장없이 site-directed mutagensis를 통하여 VP1의 34번째 아미노산 서열만을 분리주의 아미노산 서열(F)과 일치시킨 클론 (ASPs11F)도 감염성이 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업자에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] P11을 기본 골격으로 하는 replicon 수준 구제역 cDNA 클론의 작성

2002년 국내분리 O형 구제역바이러스를 감염시킨 IBRS-2 세포 상층액을 RNeasy extraction 키트(Qiagen)를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하였다. 상보적인 DNA는 random hexamer 또는 oligo dT를 프라이머로 하여 Superscript III (Invitrogen)를 사용하여 제작하였고, cDNA를 주형으로 Expand Long template PCR system (Roche) 또는 LA Taq(Takara)를 이용하여 구제역 게놈 전체영역을 4개로 나누어 증폭한 뒤 각각을 클로닝하고 4개의 클론을 순차적으로 연결하여 최종적인 클론(P11)을 얻었다. P11 클론은 정확도(fidelity)가 높지 않은 Taq polymerase의 사용과 지나치게 많은 단계의 클로닝과정 때문에 아미노산 수준에서 의도하지 않았던 돌연변이가 나타났고, 특히 AY312589.1의 여기서열과 비교할 때 10개 이상이 달랐고, 5‘UTR의 변화도 생겨났다.

따라서, 우리는 P11 클론을 교정하기 위해서 에러율이 아주 적은 Phusion High Fidelity DNA polymerase(Finnzyme)를 이용하여 공시된 네 종류의 바이러스의 특정부위를 폭하였다. 증폭에 사용된 순방향 프라이머(xba-pst-F)의 서열은 5' CCTAGTTTTGCCCGTTTTCA 3'이고 역방향 프라이머(xba-pst-R)의 서열은 5' GCCACTAGT TTATTGTTTCTCGACGCCAAT 3'이다. 증폭된 산물을 제한효소 Xba I와 Pst I으로 소화시키면 약 6730bp에 달하는 구제역바이러스 게놈의 약 82%에 해당하는 insert를 얻을 수 있고 벡터는 P11클론을 역시 Xba I과 Pst I로 소화시켜 얻었다.. 이들 분해 산물을 agarose gel상에서 분리 정제한 후 Long ligation kit(TAKARA, Japan)을 이용하여 ligation 시키고 에탄올 precipitation으로 다시 정제한 후, ElectroMAX DH10B competent cell(Invitrogen)에 electroporation 법으로 도입한 후 amplicilin이 함유된 세균배지에 도말하여 하루 이상 37℃ 배양기에 배양하여 최종적으로 형질전환된 군집(colony)를 찾았다. Colony에 대한 PCR을 통해서 일단 구제역바이러스 게놈이 삽입된 것으로 추정되는 DNA클론을 선발하였다. 그리고 종류(AS10, AS19, ASP, ASC)별로 최종 선발된 군집(colony)을 다시금 24시간 이상 200ml 이상의 액체배지에 배양하여 이 대장균들에서 midiprep을 실시하여 약 100ug 이상의 DNA 클론을 얻었다. 이렇게 획득된 DNA 클론은 FSP I 제한효소로 처리하여 DNA클론의 크기와 방향성이 올바른 지 확인된 이후(도 2), DNA 클론 전체 부위에 대한 서열분석을 실시하여 의도한 돌연변이가 제대로 유도되었는 지를 확인하였다 (AS10, AS19, ASP, ASC 각 서열정보).

각각의 DNA 클론중에서 세포에 전달시 복제 및 구제역단백질 발현이 확인되는 AS10클론을 site-directed mutageneiss kit (GenTailer, Invitrogen)을 이용하여 T7 promotor 뒤에 G의 길이를 2개에서 3개로 연장하고 이에 대하여 다시 IRES의 특정부위의 서열을 공시된 바이러스의 서열과 일치시켜 교체하였다.

[실시예 2] ASP를 기본 골격으로 하는 감염성 구제역 cDNA 클론의 작성

ASP 클론의 S fragment를 site-directed mutation을 시킨 클론(ASPs12L)의 poly (C) region을 최대 36개까지 연장시키기 위해 특별히 제작된 primers 를 사용하였다. 이는 poly(C)의 길이가 길어질수록 바이러스의 병원성과 상관성이 있을 수 있다는 발표와 관련이 있다. 이렇게 얻어진 클론의 poly(C) region이 얼마나 연장되었는가는 capillary sequencing 방법을 통해서는 정확히 그 길이를 가늠할 수는 없었지만 기존에 12개 이었던 poly (C)의 길이가 최소 24개 이상으로 연장된 것은 확실히 판단할 수 있었으며 최대 36개 일 것으로 추정된다. 이 클론을 ASPs24L로 명명하였다. 여기서 L은 VP1의 34번째 아미노산으로서 공시된 구제역바이러스(돼지유래세포계대주)의 아미노산서열(F)의 불일치가 일어나는 유일한 곳으로서 아직 F로 치환되지 않은 상태를 나타낸다. 이 ASPs24L은 DNA 및 RNA 형태로 세포에 형질도입시 모두 감염력이 있는 바이러스가 생산되는 것이 확인되었다.

[실시예 3] ASP클론에서 감염성 바이러스를 얻기 위한 충분조건인 VP1의 34번째 아미노산 서열(F) 및 감염력 획득에 있어서 poly(C)의 역할

한편, 감염력을 획득한 바이러스는 VP1의 34번째 아미노산이 L에서 F로 치환되어 있었다. 따라서, ASPs35L 클론의 VP1 34번째 아미노산인 L을 F로 site-directed mutagenesis를 통해서 조작한 결과 VP1 34번째 아미노산 L이 F로 변환되었으나 poly(C)의 길이가 11개로 줄어들어 있었다. ASPs11F로 명명된 이 클론도 세포실험결과 감염성을 나타내었다. 따라서 poly (C)의 길이가 감염력의 획득에 중요한 역할을 하는 것이 인정되지만, poly(C)의 길이가 11개 일때도 감염력을 나타내는 것을 볼 때 poly(C) tract의 역할은 바이러스의 RNA genome의 복제과정 중 바이러스의 생존에 필요한 돌연변이의 발생 및 선발을 촉발하는 기능에 일조하는 것으로 추정된다.

[실시예 4] 구제역바이러스 게놈 cDNA 플라스미드와 이 플라스미드가 복제되는 숙주대장균의 증식과의 상관성 확인

이러한 현상은 바이러스와 진핵세포와의 상호작용의 결과가 아닌 바이러스 게놈이 담긴 플라스미드와 이 플라스미드가 복제되는 곳인 대장균(competent cell)과의 상호작용 결과에 대한 것이다. 이는 바이러스 게놈이 대장균내에서서 circular한 DNA 이중나선 구조로 존재하면서 일정 정도 transcription이 일어나 mRNA형태로 전사되고 이중 일부는 또 단백질로 번역되면서 세균의 생장에 부정적인 역할을 할 수 있다는 추정을 하게된다. 이는 DNA 클론에 돌연변이가 성공적으로 가해져 공시된 바이러스의 게놈 서열과 보다 완벽하게 일치될수록 이렇게 성공된 플라스미드가 담긴 형질전환된 대장균의 colony는 상대적으로 그 크기가 작거나 생장이 느려지는 경우가 많기 때문이다. 따라서, poly(C) tract가 연장된 colony를 대량배양하여 상당한 양의 플라스미드를 정제해 내기 위해서는 변형된 방법으로 이들을 배양할 필요가 있다. 이렇게 poly(C)가 연장된 플라스미드가 확인된 후 대량으로 이들을 정제회수하기 위해서는, 이 프라스미드를 다시 대장균에 transformation하여 세균배지에 도말하여 선발하는 과정을 거치지 않고 1시간정도 transformation된 대장균을 약 1ml 정도의 액체배지에서 진탕배양한 다음 바로 이 배양액을 200ml 이상의 달하는 액체배지에 부어서 1-2일간 낮은 rpm에서 생장시키는 것이다. 이러한 방법으로 보다 성공적으로 형질전환된 세균으로 부터 불안정하고 생장을 더디게 만드는 구제역바이러스 전체 게놈서열이 정확한 순서와 구성으로 담긴 플라스미드를 대량으로 얻어 실험에 활용할 수 있었다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

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Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 서열번호 6에 기재된 염기서열을 갖는 replicon 클론.
   
7. 제6항의 클론에서 poly(C) 부위를 12개에서 24~36개로 연장한 것을 특징으로 하는 감염성 클론.

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