CN117025675B

CN117025675B - 一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用

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Publication number: CN117025675B
Application number: CN202311001989.3A
Authority: CN
Inventors: 赵凌; 张渊; 方祾颖; 汪宗梅; 周明; 傅振芳
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2023-08-10
Filing date: 2023-08-10
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2043-08-10
Also published as: CN117025675A

Abstract

本发明公开了一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用，涉及基因工程技术领域。该方法包括以下步骤：构建第一外源基因的基因表达盒，利用Gibson基因重组方法将所述基因表达盒导入线性化骨架质粒的E3区域，得到重组骨架质粒；将第二外源基因连接入穿梭质粒的E1区域，得到重组穿梭质粒；将所述重组骨架质粒与重组穿梭质粒共转染至HEK 293细胞，得到重组腺病毒。本发明旨在解决Admax系统外源基因装载量少，骨架质粒改造困难，未充分利用E3区域的现存问题。实例证明，本发明显著提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量，实现同时表达多种外源基因，显著提高其作为疫苗载体的免疫原性。

Description

一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用。

背景技术

腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种无囊膜的线性双股DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有50余种血清型，大多数腺病毒载体是基于2型和5型，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒复制能力，从而提高其安全性。重组腺病毒仅在高表达E1基因的细胞(HEK 293)中复制，因此是一种可用于治疗的高效控制系统。除此之外，腺病毒载体还拥有感染谱广、感染率高、病毒滴度高和理化性质稳定等诸多优点。腺病毒载体在基因治疗(溶瘤)、传染病(例如埃博拉、新型冠状病毒)预防过程中起到非常积极的作用。

目前，大多重组腺病毒载体为人腺病毒5型，通过基因改造缺失了E1和E3基因，据文献报道E1基因为腺病毒复制必需基因，而E3基因可以帮助病毒实现免疫逃逸。E1和E3基因的缺失极大程度提高了腺病毒载体的安全性，且双基因缺失提高了腺病毒作为病毒载体的外源基因容载量。目前，常用的腺病毒包装系统主要有两种：Adeasy系统(大肠杆菌内实现外源基因重组)和Admax系统(利用Cre/loxp系统在293细胞内实现与辅助质粒的重组)。二者主要区别为重组宿主不同，后者因其重组效率高，包装病毒周期短，因而被广泛应用。然而，Admax系统只能将外源基因整合到E1区域，E1基因区域共缺失3kb左右碱基。这导致插入的外源基因需控制在4000bp以内。据文献报道，随着外源基因片段越长，病毒拯救成功率及滴度均会下降。并且随着病毒传代次数增加，有可能与293细胞中固有E1基因发生整合，产生丢失外源基因且恢复复制能力的子代腺病毒。因此，合理利用缺失的E1,E3区域，可以避免上述问题，很大程度提高外源基因表达量。想要提升外源基因表达量或者表达多种外源基因，可以采取基因融合表达、利用2A肽序列、IRSE序列实现翻译时核糖体跳跃，多表达盒等策略。本发明采用了不同位点多表达盒的方式，在本发明之前，研究者们同样试过融合表达和2A肽连接等策略，最终都以失败告终。究其原因有几下几点：病毒的糖蛋白一般需要糖基化修饰，融合表达后构象破坏，且由于融合基因片段往往较长，超过了腺病毒E1区域容载量，最终导致病毒拯救失败或生物活性下降；2A肽序列存在切割效率问题，尽管文献报道P2A、T2A等2A肽切割效率在90％以上，但实际操作时往往出现切割效率不佳的现象，这跟所连接的基因有相当大的关系。

多表达盒系统即利用多个表达元件表达不同基因。Admax系统缺失了腺病毒E1和E3部分区域，为开发双表达系统创造了有利条件，然而目前并没有E1和E3区域同时表达外源基因的相关报道，更没有研究E1和E3同时表达外源基因来提升腺病毒载体疫苗免疫原性的可行性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该方法可以提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量，实现体内外同时表达多种外源基因。

Admax重组腺病毒包装系统主要通过Cre/loxp系统使携带外源基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒在细胞内发生重组，该系统只能将外源基因整合至腺病毒E1区域，并未合理利用E3区域。腺病毒E3区域位于Admax重组腺病毒包装系统的骨架质粒上，该质粒长达34kb，很难通过传统的分子克隆手段进行改造。本发明尝试通过改造Admax重组腺病毒包装系统骨架质粒，实现外源基因在E3区域的自由插入，进一步实现将外源基因分别导入E1和E3区域，从而提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量，实现同时表达多种外源基因。其中，改造Admax重组腺病毒包装系统骨架质粒可以通过两种方法实现：第一种方法是利用位于E3区域的Pac I酶切位点进行传统酶切，将外源基因导入E3区域；第二种方法是通过体外转录E3区域sgRNA，利用Cas 9核酸酶，将其在体外通过CRISPR/Cas 9实现定点克隆。

基于此，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法，包括以下步骤：

构建第一外源基因的基因表达盒，利用Gibson基因重组方法将所述基因表达盒导入线性化骨架质粒的E3区域，得到重组骨架质粒；

将第二外源基因连接入穿梭质粒的E1区域，得到重组穿梭质粒；

将所述重组骨架质粒和所述重组穿梭质粒共转染至HEK 293细胞，得到重组腺病毒。

进一步地，所述骨架质粒线性化的方法为Pac I单酶切方法或CRISPR/Cas 9体外定点切割方法。

进一步地，所述骨架质粒为pBHGcre/loxp质粒。

进一步地，所述穿梭质粒为pDC315质粒。

本发明还提供一种重组腺病毒，构建方法包括以下步骤：

构建第一外源基因表达盒，利用Gibson基因重组方法将所述基因表达盒导入线性化骨架质粒的E3区域，得到重组骨架质粒；

将所述重组骨架质粒和所述重组穿梭质粒共转染至HEK 293细胞，得到所述重组腺病毒。

进一步地，所述第一外源基因为RVG基因或RVN基因，所述第二外源基因为RVG基因或RVN基因；

所述RVG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述RVN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述第一外源基因为所述RVG基因；所述第二外源基因为所述RVG基因。

本发明还提供上述的重组腺病毒在制备重组腺病毒狂犬疫苗中的应用。

本发明还提供一种重组腺病毒狂犬疫苗，包括上述的重组腺病毒。

进一步地，所述狂犬疫苗还包括药学上可接受的辅料。

本发明公开了以下技术效果：

传统的Admax重组腺病毒包装系统，将外源基因导入穿梭质粒多克隆位点，通过与骨架质粒共转染后，表达Cre酶，识别骨架与穿梭质粒上的Loxp位点，将外源基因置换至骨架质粒E1区域，形成完整的重组腺病毒基因组，最终装配出病毒粒子。本发明通过单酶切或Cas9切割技术，配合Gibson基因重组技术实现了在骨架质粒E3区域导入外源基因表达盒，与穿梭质粒共转染HEK 293细胞后实现了E1和E3区域同时插入外源基因。本发明为更好地利用腺病毒载体表达多个抗原提供了借鉴方法。

本发明通过将狂犬病毒保护性抗原G蛋白(RVG)及N蛋白(RVN)通过不同的组合插入E1和E3区域，构建重组腺病毒狂犬疫苗，来评价了本发明实际应用价值。本发明还通过构建并评估重组腺病毒狂犬疫苗的安全性及免疫原性，证明本发明的构建策略显著地提高了腺病毒作为载体的外源基因表达量，可极大程度节约重组腺病毒疫苗的成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为Admax骨架质粒pBHGcre/loxp的图谱；

图2为E3导入外源基因的Admax骨架质粒pBHGcre/loxp的图谱；

图3为导入外源基因的穿梭质粒pDC315的图谱；

图4为Pac I单酶切构建重组骨架质粒的PCR鉴定结果；

图5为CRISPR/Cas 9构建重组骨架质粒的PCR鉴定结果；

图6为两种骨架质粒构建方式重组病毒拯救结果；

图7为E1和E3同时插入Luciferase基因与E1单独插入Luciferase重组腺病毒在不同细胞系上荧光值强度分析结果；

图8为5株重组腺病毒的构建示意图；

图9为5株重组腺病毒引起细胞病变示意图；

图10为外源基因表达情况的检测结果；其中，A为Westeren Blot检测结果；B为RVG相对表达量灰度分析结果；

图11为5株重组腺病毒的生长曲线；

图12为狂犬病病毒疫苗株SAD-L16与Adv-RVG剂量梯度免疫后，小鼠体重变化；

图13为Adv-RVG梯度免疫后，狂犬病毒特异性中和抗体滴度；

图14为SAD-L16梯度免疫后，狂犬病毒特异性中和抗体滴度；

图15为以10⁷TCID₅₀ SAD-L16与Adv-RVG免疫后狂犬病毒特异性中和抗体对比结果；

图16为重组腺病毒疫苗免疫后生物分布及动力学变化；其中A为5株重组腺病毒免疫后体重变化；B为免疫后不同时间点引流淋巴结中RVG相对表达量；C为注射部位RVN相对表达量；D为免疫不同时间点注射部位RVG表达量；E、F、G、H、I、J、K、L分别为各组免疫后，在肾脏、心脏、肺脏、注射部位肌肉、脾脏、大脑、肝脏、引流淋巴结中Hexon基因相对表达量；

图17为四株重组腺病毒免疫后，狂犬病毒特异性中和抗体滴度水平；

图18为图17结果的中和抗体滴度几何平均值；

图19为小鼠免疫半年后，脑内注射50LD₅₀ CVS-24狂犬病毒标准攻毒株后21d的体重变化；

图20为小鼠免疫半年后，脑内注射50LD₅₀ CVS-24狂犬病毒标准攻毒株后21d的存活率变化；

图21为重组腺病毒狂犬疫苗在犬猫模型免疫效果评估结果；其中A为Adv-RVG与Adv-RVDG免疫犬后，狂犬病毒特异性中和抗体滴度值；B为A抗体结果几何平均值；C为Adv-RVG与Adv-RVDG免疫猫后，狂犬病毒特异性中和抗体滴度值；D为C抗体结果几何平均值；E、F、G、H分别为犬免疫后不同时间点血清中IgG、IgG1、IgG2、IgM OD值结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

为了解决Admax腺病毒包装系统(microbix biosystems)外源基因插入位点的局限性、插入片段的有限性以及大质粒改造的局限性，本发明开发了基于Admax系统的E1和E3区域同时表达外源基因的重组腺病毒的构建方法，以下通过多个实施例，对本发明的技术路线及原理进行说明。

本发明中eGFP、Luci、RVG、RVN和E1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示。

实施例1

一、腺病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

1.Pac I单酶切构建骨架质粒(第一种方案)

1.1按表1所示配置酶切反应体系，之后进行酶切反应。

表1

酶切反应：37℃水浴锅反应30min，由于使用单酶切，故在反应体系中加入碱性磷酸酶防止自连。移液器小心混匀反应体系，防止质粒DNA断裂。

反应产物使用Omega CP回收试剂盒回收后，以NanoDrop^TMOne/One C微量UV-Vis分光光度计检测核酸回收浓度。

1.2pCAGGS-外源基因质粒构建

pCAGGS(GenBank:LT727518.1)因其高表达量，常被用于真核表达系统中，因此插入E3区域的表达盒采用该质粒表达元件。本发明一共构建了pCAGGS-eGFP、pCAGGS-Luci和pCAGGS-RVG 3个质粒，以pCAGGS-RVG为例阐述构建策略。本发明用狂犬病毒疫苗株SAD-L16作对比，包含SAD-L16全基因组的质粒由本实验室保存(疫苗株SAD-L16及SAD-L16全基因组的质粒已在文献“Infectious rabies viruses from cloned cDNA”中公开)。

按表2所示酶切体系，用EcoR I/Nhe I双酶切pCAGGS质粒。

表2

酶切反应：37℃水浴锅反应30min，胶回收。

设计引物扩增RVG基因，将其构建到pCAGGS质粒。设计引物扩增包含目的基因的pCAGGS表达盒。

pCA-RVG-F:TGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGATGGTTCCTCAGGCTCTCCT(SEQID NO.6)；

pCA-RVG-R：AGAGGGAAAAAGATCTGCTAGCTACAGTCTGGTCTCACCCCC(SEQ ID NO.7)。

将表达盒两端通过引物添加骨架质粒Pac I位点同源臂(30bp)，扩增并回收片段。

E3PacI-RVG-F:cttggattacatcaagatcctctagttaatGACATTGATTATTGACTAGTTA(SEQID NO.8)；

E3PacI-RVG-R:ataagatccccgggtactctagttaTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTAT(SEQ ID NO.9)。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit(E5520s)无缝克隆试剂盒将表达盒克隆至线性化骨架质粒E3区域。

配置表3所示重组体系：

表3

将样品混匀后，放入PCR仪，50℃1h

将重组产物转化至stable 3感受态(上海昂羽生物技术有限公司，G6009-10)，涂板、挑菌测序。挑选克隆正确菌株扩大，按omega去内毒素试剂盒说明书抽提质粒，测浓度后4℃保存备用。

Admax骨架质粒pBHGcre/loxp的图谱如图1所示，E3导入外源基因的Admax骨架质粒图谱如图2所示。根据E3区域导入外源基因不同，将重组骨架质粒分别命名为pBHGcre/loxp-eGFP、pBHGcre/loxp-Luci和pBHGcre/loxp-RVG。

2.CRISPR/Cas 9体外切割构建骨架质粒(第二种方案)

2.1设计得到如下所示sgRNA：

sgRNAE3-F：

GATCACTAATACGACTCACTATAgcaactgcgcctgaaacaccGTTTTAGAGCTAGAAA(SEQ IDNO.10)；

sgRNAE3-F1：

GATCACTAATACGACTCACTATAgcgggcaaagcacttgtggGTTTTAGAGCTAGAAA(SEQ IDNO.11)；

sgRNA-R(80bp)：

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC(SEQ ID NO.12)。

2.2Cas 9酶切

a、正反向引物融合(sgRNA-R分别与sgRNAE3-F/F1)，扩增条件：

95℃3min，一个循环；

95℃15s，55℃15s，72℃20s，30个循环；

72℃2min，16℃2min，一个循环。

b、PCR产物用CP纯化回收即可，30μL Rnase free水洗脱，终浓度200-300ng/μL。

c、T7 RNA聚合酶转录(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，转录体系如表4所示：

表4

注意：多位点酶切时，先配Mix再加模板(37℃过夜转录)。

d、酶切体系如表5所示：

表5

注意：酶切前将sgRNA95℃/3min PCR仪处理，随即冰浴，用于酶切。

e、酶切产物回收

将上述酶切产物加入等体积solution I，室温孵育3min，随即利用CP试剂盒回收(omega)切割产物，最终洗脱体积20μL，浓度约100ng/μL。

体外转录后产物可于-80℃冻存(冻存时写清酶切序列)，后期可多次重复使用。

注意：Cas 9酶切时，1μL足够切割骨架质粒5μg，5μg酶切产物足够重组5-10次。(因sgRNA质量有差异，实际酶切5μg质粒时，也不要使用超过2.5μL Cas 9酶，避免浪费)体外转录后产物可于-80℃冻存(冻存时写清酶切序列)，后期可多次重复使用(每次最多转录10μL，5μL足够正常使用)。

2.3连接目的片段

在sgRNA切割位点设计引物扩增包含SAD-L16 RVG基因的pCAGGS表达盒。将表达盒两端通过引物添加Cas 9切割位点两侧同源臂，使用NEBuilder HiFi DNAAssemblyCloning Kit(E5520s)将表达盒克隆至骨架质粒E3区域。转化至stable 3感受态，涂板、挑菌测序。挑选克隆正确菌株扩大，按omega去内毒素试剂盒说明书抽提质粒，测浓度后4℃保存备用。

“1.Pac I单酶切构建骨架质粒”和“2.CRISPR/Cas 9体外切割构建骨架质粒”部分所示的两种构建方法均可实现将外源基因表达盒导入骨架质粒E3区域的目的，且克隆成功率无明显差异，Pac I单酶切法操作步骤更为简单，成本较低；Cas 9酶配合sgRNA定点切割方式较Pac I单酶切法而言，操作步骤更为繁琐，且成本很高，但由于sgRNA靶向性，故该方法可较大程度实现定点克隆。可根据自身要求与条件选择合适克隆方式。

3.穿梭质粒构建

按表6所示体系，用EcoR I/Nhe I双酶切pDC315(购买自Microbix BiosystemsInc.)质粒，37℃水浴锅反应30min，核酸电泳，胶回收载体片段。

表6

设计引物扩增目的基因(eGFP，Luci，RVG，RVN，E1)，通过引物添加Pac I酶切位点同源臂，并在目的基因起始密码子前添加Kozaka序列，引物序列见表7。

表7

按诺唯赞ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(C112-01)说明书，将目的片段与酶切载体连接(反应体系如表8所示)，之后转化至XL-10(北京擎科生物公司)感受态，冰上静置30min，42℃水浴锅热激90s，涂板、挑菌测序。挑选克隆正确菌株扩大，按omega去内毒素试剂盒抽提质粒，分别得到穿梭质粒pDC315-eGFP、pDC315-Luci、pDC315-RVG、pDC315-RVN和pDC315-E1，测浓度后4℃保存备用。本发明构建的导入外源基因的穿梭质粒的图谱如图3所示。

表8

4.以eGFP为模式外源基因验证Pac I单酶切与CRISPR/Cas 9构建策略是否可行

按照“1.Pac I单酶切构建骨架质粒”和“2.CRISPR/Cas 9体外切割构建骨架质粒”所示的构建方法构建得到骨架质粒pBHGcre/loxp-eGFPa(Pac I单酶切构建)和pBHGcre/loxp-eGFPb(CRISPR/Cas 9切割构建)。

提前一天将HEK 293(湖南丰晖生物有限公司)铺至6孔板，待细胞汇合度达80％，使用转染试剂按表9所示组合1：1(质量比)(骨架质粒：穿梭质粒)转染HEK 293细胞。

转染6h后换2％维持液，每日观察细胞状态，根据细胞状态选择全换液或者半换液，第七天开始收集细胞上清，接种新的HEK 293细胞。48h后，在荧光显微镜下观察eGFP表达情况。

表9

5.E1和E3同时表达Lucifrease(简称Luci)酶与E1区域单表达Lucifrease在不同细胞系上荧光值对比

按照1所示的构建方法构建得到骨架质粒pBHGcre/loxp-Luci。

提前一天将HEK 293(湖南丰晖生物有限公司)铺至6孔板，待细胞汇合度达80％，使用转染试剂按表10所示组合1：1(骨架质粒：穿梭质粒)转染HEK 293细胞。

转染6h后换2％维持液，每日观察细胞状态，根据细胞状态选择全换液或者半换液，第七天开始收集细胞上清，接种新的HEK 293细胞。提前将HEK 293铺48孔板，10⁵个细胞/孔，按照0.1MOI接种Adv-Dluci或Adv-luci每孔三个重复，48h后，弃上清，PBS洗涤三遍，收集细胞，计数后，每孔50000个细胞/100μL转移至不透明康宁96孔板中，按YEASENFirefly Glo Luciferase Reporter GeneAssay kit说明书处理样品后，上机读取各组荧光值。

表10

二、实验结果

1.骨架质粒构建结果

1.1Pac I单酶切构建结果

通过Pac I限制性内切酶切割骨架质粒，使用HiFi DNAAssemblyMaster Mix，将目的片段与骨架质粒组装后，转化至Stable 3感受态细胞，涂板。37℃培养12小时后，挑选单个菌落扩大作菌液PCR，结果如图4所示：共挑选40个菌落，克隆阳性率高达87.5％，将菌液PCR鉴定正确的菌落提质粒测序，正确率100％。重复10次试验，克隆阳性率均在85％以上。

1.2CRISPR/Cas 9定点切割骨架质粒构建结果

利用sgRNA靶向骨架质粒E3区域，Cas 9体外切割后，使用HiFi DNAAssembly Master Mix，将目的片段与骨架质粒组装后，转化至Stable 3感受态细胞，涂板。37℃培养12h后，挑选单个菌落扩大作菌液PCR，结果如图5所示：共挑选40个菌落，克隆阳性率高达85％，将菌液PCR鉴定正确的菌落提质粒测序，正确率100％。重复10次试验，克隆阳性率均在85％以上。两种定点切割策略均可获得阳性克隆，且阳性率无显著差异。

2.E3区域表达eGFP的重组腺病毒感染性克隆的拯救

为探索以上两种改造方式能否最终拯救出可以正确表达外源基因的感染性克隆。本发明以eGFP为模式外源基因，将其通过以上两种构建方式将eGFP表达盒克隆至pBHGcre/loxp，与穿梭质粒共转染HEK 2936h后换2％维持液，每日观察细胞状态，根据细胞状态选择全换液或者半换液，第七天开始收集细胞上清，接种新的HEK 293细胞。如图6所示，两种构建方式均可拯救出正确表达外源基因的重组腺病毒。

3.E1/E3同时插入Luciferase基因与E1单独插入Luciferase重组腺病毒在不同细胞系上荧光值强度分析(Adv-Dluci vs Adv-luci)

构建E1/E3同时表达Luciferase酶的重组腺病毒Adv-Dluci及单独E1表达Luciferase酶的重组腺病毒Adv-luci。

提前将HEK 293铺48孔板，10⁵个细胞/孔，0.1MOI接种Adv-Dluci和Adv-luci每孔三个重复，48h后，弃上清，PBS洗涤三遍，收集细胞，计数后，每孔50000个细胞/100μL转移至不透明康宁96孔板中，按YEASEN Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay kit说明书处理样品后，上机读取各组荧光值。其他细胞系操作步骤同上，结果如图7所示。

结果显示Adv-Dluci组荧光值在HEK 293、A549、MDCK、BHK-21和CRFK细胞系上分别为Adv-luci组的9倍、5.6倍、5.2倍、5.8倍和4.9倍。E1/E3同时插入Luci基因，显著增强其在细胞水平表达量。

实施例2

实施例1已经证明通过E1和E3的双表达，可以提高Admax系统的基因表达量，本实施例以重组腺病毒狂犬疫苗为例，来展现本发明技术方案的现实应用价值。其中，将外源基因导入骨架质粒和穿梭质粒的方法同实施例1。

一、方法

1.重组腺病毒狂犬疫苗感染性克隆拯救及鉴定

提前一天将HEK 293铺至6孔板，待细胞汇合度达80％，按表11所示组合转染HEK293细胞。

转染6h后换2％维持液，每日观察细胞状态，根据细胞状态选择全换液或者半换液，第七天开始收集细胞上清，接种新的HEK 293细胞，盲传10代，得到5株重组毒株，滴度测定5株重组毒株毒价。

以0.1MOI将该5株重组毒株分别感染HEK 293细胞，48h后，用RIPA中强裂解液裂解细胞，提取感染后病毒蛋白样品。用碧云天增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒分别测定蛋白浓度，调平蛋白量后通过Westeren Blot检测外源基因表达情况。

以0.1MOI将该5株重组毒株分别感染HEK 293细胞，并于12h、24h、48h、60h、72h，84h，96h收取上清，测定5株重组毒株的生长曲线。

表11

2.重组腺病毒狂犬疫苗免疫剂量摸索

由于外源基因来自狂犬病毒SAD-L16疫苗株(口服型狂犬疫苗株SAD B19的一个cDNA克隆)，因此本发明首先用Adv-RVG与SAD-L16做梯度剂量免疫实验，评估其安全性及免疫原性。

采用6周龄雌性ICR小鼠，分别用DMEM，10⁷、10⁶TCID₅₀ SAD-L16疫苗毒株，10⁹、10⁸、10⁷、10⁶TCID₅₀ Adv-RVG，后肢肌肉免疫，免疫后监测小鼠21d体重变化，每周眼眶静脉采血，分离血清，检测狂犬病毒特异性中和抗体。

3.重组腺病毒疫苗免疫后生物分布

采用6周龄雌性ICR小鼠，后肢肌肉免疫10⁷TCID₅₀ SAD-L16，Adv-RVG，Adv-RVDG，Adv-E1-RVG，Adv-RVN-RVG，在不同时间点安乐死小鼠，采集免疫部位肌肉、引流淋巴结、心、肝、脾、肺、肾、大脑等实质器官，提取组织RNA，反转录成cDNA，设计针对狂犬病毒G蛋白及腺病毒Hexon蛋白的荧光定量PCR引物，检测各组织G/Hexon基因转录水平。

4.横向对比Adv-RVG、Adv-RVDG、Adv-E1-RVG和Adv-RVNG 4株重组腺病毒疫苗免疫原性

采用六周龄雌性ICR小鼠，分别用DMEM、SAD-L16、Adv-RVG、Adv-RVDG、Adv-E1-RVG和Adv-RVNG后肢肌肉注射免疫10⁷TCID₅₀，比较各组狂犬病毒特异性中和抗体的产生及消长规律。分析双抗原的插入是否增强重组腺病毒疫苗免疫原性。

5.重组腺病毒狂犬疫苗在犬猫模型的免疫效果评估

采用3月龄以上犬猫，分别颈部皮下免疫10⁸TCID₅₀Adv-RVDG、Adv-RVG和商品化灭活疫苗。每周桡静脉采血，分离血清，测定狂犬病毒特异性中和抗体及抗体亚型。

二、结果

1.表达不同抗原组合的重组腺病毒狂犬疫苗感染性克隆拯救及鉴定

按图8所示，共构建4株重组腺病毒狂犬疫苗。

转染后第7天开始收集细胞上清，接种新的HEK 293细胞，盲传10代，72h后观察细胞状态，如图9所示，细胞出现皱缩、呈葡萄串状飘起等腺病毒特征性病变。

1.1Western Blot验证重组腺病毒外源基因表达

以0.1MOI将以上5株病毒感染HEK 293细胞，48h后，用RIPA中强裂解液裂解细胞，提取感染后病毒蛋白样品。用碧云天增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒确定蛋白浓度，调平蛋白量后Westeren Blot检测外源基因表达情况，Image J分析条带灰度值，并作统计学分析。

如图10所示，表达双拷贝RVG基因的Adv-RVDG毒株的G蛋白表达量最高，为其他毒株的1.5倍左右，且Adv-RVNG成功表达了G蛋白和N蛋白。

1.2重组腺病毒生长特性分析

Admax系统会随着在E1区域插入外源基因片段增长，重组病毒的滴度和救毒成功率下降，为验证E1和E3同时插入外源基因对病毒生长特性有无影响，以0.1MOI将以上5株病毒感染HEK 293细胞，并于12h、24h、48h、60h、72h、84h和96h收取上清，测定5株病毒生长曲线。如图11所示，实验证明在插入5500bp外源基因(Adv-RVDG)的情况下，仍然不会影响重组腺病毒的生长特性。

2.重组腺病毒狂犬疫苗免疫剂量摸索

由于外源基因来自狂犬病毒SAD-L16疫苗株(口服狂犬病病毒疫苗株SAD B19的一个cDNA克隆)，因此本发明首先用Adv-RVG与SAD-L16做梯度剂量免疫实验，评估其安全性及免疫原性。

采用6周龄雌性ICR小鼠，分别用DMEM，10⁷、10⁶TCID₅₀ SAD-L16疫苗毒株，10⁹、10⁸、10⁷、10⁶TCID₅₀Adv-RVG，后肢肌肉免疫，免疫后监测小鼠21d体重变化，每周眼眶静脉采血，分离血清。测狂犬病毒特异性中和抗体。

如图12-14所示，图12显示了狂犬病病毒疫苗株SAD-L16与Adv-RVG剂量梯度免疫后，小鼠体重变化；图13显示了Adv-RVG梯度免疫后，狂犬病毒特异性中和抗体滴度；图14显示了SAD-L16梯度免疫后，狂犬病毒特异性中和抗体滴度。重组腺病毒以不同剂量免疫小鼠后，小鼠体重未呈现明显下降，而SAD-L16随着免疫剂量的增加，小鼠体重明显下降，虽未有小鼠死亡，但仍有小鼠出现后肢麻痹等狂犬病特征症状。

随后，每周眼眶静脉采血，分离血清。采用OIE规定狂犬病毒中和抗体测定方法-狂犬病毒荧光抗体病毒中和试验(FAVN)滴定抗体，并作统计学分析。如图15所示，Adv-RVG免疫组与SAD-L16免疫组均产生狂犬病毒特异性中和抗体，且呈现明显免疫剂量依赖性趋势。SAD-L16免疫组中和抗体之在3w达高峰后，迅速下降，而Adv-RVG免疫组抗体值下降缓慢，在免疫后14w，仍有8IU/mL狂犬病毒特异性中和抗体，免疫持续期更长。结合安全性评估结果。最终选择以10⁷TCID₅₀重组腺病毒疫苗作后续试验。

3.重组腺病毒疫苗免疫后生物分布及动力学变化

采用6周龄雌性ICR小鼠，后肢肌肉分别免疫10⁷TCID50 SAD-L16、Adv-RVG、Adv-RVDG、Adv-E1-RVG和Adv-RVN-RVG，在不同时间点对小鼠实施安乐死，采集免疫部位肌肉、引流淋巴结、心、肝、脾、肺、肾、大脑等实质器官，提取组织RNA，反转录成cDNA，设计针对狂犬病毒G蛋白及腺病毒Hexon蛋白的荧光定量PCR引物，检测各组织G/Hexon基因转录水平，探究其免疫后体内生物分布及动力学变化，结果见图16。检测结果显示，各组织在不同时间点均未检测到腺病毒Hexon基因mRNA水平的表达，说明四株疫苗株免疫后均不在小鼠体内复制。同时，与体外结果一致，Adv-RVDG免疫后7d，免疫部位G蛋白mRNA表达水平比其他腺病毒免疫组高5-6倍左右，且表达时间较其他组更为持久，该研究结果表明，在E1/E3区域同时插入外源基因可显著增强腺病毒载体在体内表达外源基因的能力。在引流淋巴结中，Adv-RVDG免疫组G蛋白mRNA表达水平也比其他腺病毒免疫组高2-3倍左右。同时，本发明通过记录免疫后小鼠体重变化，评估了重组腺病毒疫苗安全性，实验结果表明，重组腺病毒疫苗在小鼠模型中有较高安全性。

4.四株重组腺病毒疫苗在小鼠模型中免疫效力评估

采用六周龄雌性ICR小鼠，分别用DMEM、SAD-L16、Adv-RVG、Adv-RVDG、Adv-E1-RVG和Adv-RVN-RVG后肢肌肉注射免疫10⁷TCID₅₀，比较各组狂犬病毒特异性中和抗体的产生及消长规律。分析双抗原的插入是否增强重组腺病毒疫苗免疫原性。

如图17-18所示，免疫小鼠后，连续收集抗体至24w，通过狂犬病毒荧光抗体病毒中和试验(FAVN)滴定抗体滴度，试验结果表明Adv-RVDG免疫组小鼠抗体最高，可达40IU/mL，为其他免疫组1.5-2倍。

5.重组腺病毒狂犬疫苗免疫后攻毒保护评价

小鼠免疫24w后，脑内注射50LD₅₀ CVS-24狂犬病毒标准攻毒株，记录21d体重变化及存活率。

如图19-20所示，图19显示了小鼠免疫半年后，脑内注射50LD50 CVS-24狂犬病毒标准攻毒株后21d的体重变化；图20显示了小鼠免疫半年后，脑内注射50LD50 CVS-24狂犬病毒标准攻毒株后21d的存活率变化。Adv-RVDG、Adv-E1-RVG和Adv-RVNG免疫组可以100％保护小鼠免受致死剂量CVS-24毒株攻毒。Adv-RVG与SAD-L16免疫组小鼠保护率分别为90％和20％。

6.重组腺病毒狂犬疫苗在犬猫模型免疫效果评价

基于上述实验结果，本发明最终选择Adv-RVDG和Adv-RVG疫苗株评估本发明现实意义，采用3月龄以上犬猫，每组5只，分别颈部皮下免疫10⁸TCID₅₀Adv-RVDG和Adv-RVG。每周桡静脉采血，分离血清，测定狂犬病毒特异性中和抗体，及抗体亚型。

如图21所示，与小鼠模型结果一致，E1/E3插入双拷贝的Adv-RVDG免疫组中和抗体值为Adv-RVG免疫组的1.5-2.0倍，在犬体内的免疫效果优于猫，通过ELISA检测犬免疫后8w抗体分型，Adv-RVDG产生的狂犬病毒G蛋白特异性抗体远高于Adv-RVG免疫组。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述重组骨架质粒和所述重组穿梭质粒共转染至HEK 293细胞，得到重组腺病毒；

所述骨架质粒为pBHGcre/loxp质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨架质粒线性化的方法为Pac I单酶切方法或CRISPR/Cas 9体外定点切割方法。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述穿梭质粒为pDC315质粒。

4.一种重组腺病毒，其特征在于，构建方法包括以下步骤：

将所述重组骨架质粒和所述重组穿梭质粒共转染至HEK 293细胞，得到所述重组腺病毒；

所述骨架质粒为pBHGcre/loxp质粒。

5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述第一外源基因为RVG基因或RVN基因，所述第二外源基因为RVG基因或RVN基因；

所述RVG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述RVN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求5所述的重组腺病毒，其特征在于，所述第一外源基因为所述RVG基因；所述第二外源基因为所述RVG基因。

7.一种重组腺病毒在制备重组腺病毒狂犬疫苗中的应用，其特征在于，所述重组腺病毒的构建方法包括以下步骤：

所述第一外源基因为RVG基因或RVN基因，所述第二外源基因为RVG基因；

所述RVG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述RVN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述骨架质粒为pBHGcre/loxp质粒。

8.一种重组腺病毒狂犬疫苗，其特征在于，包括重组腺病毒，所述重组腺病毒的构建方法包括以下步骤：

所述RVG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述RVN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述骨架质粒为pBHGcre/loxp质粒。

9.根据权利要求8所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述狂犬疫苗还包括药学上可接受的辅料。