CN111511397A - 具有密码子对去优化区域的重组病毒及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明为设计的重组病毒在治疗多种形式的恶性肿瘤中的用途。本发明的重组病毒为其中的野生型病毒的一个或多个区域被替换为合成的重新编码的序列的病毒，所述合成的重新编码的序列降低了相对于人密码子对偏性的密码子对分值，或增加了CpG二核苷酸的数量，或增加了UpA二核苷酸的数量。特别是，本发明的方法可用于治疗多种器官(例如：乳房、皮肤、结肠、支气管通道、胃肠道的衬里上皮、上呼吸道和生殖泌尿道、肝、前列腺和脑)的恶性肿瘤。实验动物的惊人缓解证实了对恶性多形性胶质母细胞瘤的治疗以及对乳腺癌和黑素瘤的治疗。

Description

具有密码子对去优化区域的重组病毒及其用于治疗癌症的 用途
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请包括2017年12月22日递交的美国临时专利申请No.62/609,945、2018年3月8日递交的美国临时专利申请No.62/640,362、2018年5月28日递交的美国临时专利申请No.62/677,132、以及2018年3月8日递交的美国临时专利申请No.62/640,355的优先权要求，在此以引用的方式将其各自的全部内容并入。
技术领域
本发明涉及包含修饰的病毒基因组的修饰的病毒，所述修饰的基因组包含多个核苷酸置换，所述修饰的病毒用于治疗癌症。核苷酸置换导致密码子被替换为其它同义密码子和/或密码子重排和密码子对偏性(codon pair bias)的变化。这些修饰的病毒用于治疗恶性肿瘤。
背景技术
将本文中的所有出版物都以引用的方式并入，其程度如同将每个单独的出版物或专利申请具体且单独地指示为以引用的方式并入一样。下面的描述包括对于理解本发明可能有用的信息。这并不是承认本文提供的任何信息都是现有技术或者与当前要求保护的发明有关，或者任何明确或隐含地引用的出版物都是现有技术。
合成病毒学
DNA合成技术的快速改进有望革新病毒学中采用的传统方法。传统上用于消除病毒基因组不同区域功能的方法之一大量但费力地使用定点诱变来探索病毒株基因组中小序列变异的影响。然而，病毒(尤其是RNA病毒)的基因组相对较短，通常长度少于10000个碱基，这使得它们适合于使用现有技术进行全基因组合成。最近开发的基于微流控芯片(microfluidic chip)的技术可实现从头(de novo)合成按规格设计的新基因组，每个新基因组仅几百美元。这允许生成完全新颖的编码序列或者对现有序列进行调整，从而达到传统克隆方法几乎无法实现的程度。此类自由的设计为DNA/RNA编码序列的大规模重新设计以实现以下目的，提供了巨大的动力：(1)研究诸如密码子偏性(codon bias)、密码子对偏性(codon-pair bias)和RNA二级结构等参数变化对病毒翻译和复制效率的影响；(2)对程成功病毒繁殖所需的未知调节元件和其它信号进行高效的全基因组扫描；(3)为病毒株的遗传工程和抗病毒疫苗的涉及开发新的生物技术；(4)合成修饰的病毒用于溶瘤疗法。
脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)的反向遗传学
反向遗传学通常涉及发现基因功能的实验方法，其与经典遗传学的所谓正向遗传方法以相反的方向进行。也就是说，正向遗传学方法试图通过阐明表型性状的遗传基础来确定基因的功能，而基于反向遗传学的策略则是从分离的基因开始，并试图通过研究由wt基因或突变的基因的表达所产生的可能表型来发现其功能。如本文在病毒系统的上下文中所使用的，“反向遗传学”系统涉及允许对由RNA组成的病毒基因组进行遗传操作的技术的实用性。简而言之，从病毒粒子(virions)或从感染的细胞中分离病毒基因组，通过酶(逆转录酶)将其转化为DNA(“cDNA”)，可能根据需要进行修饰，并(通常经由RNA中间体)还原成感染性病毒颗粒。小核糖核酸病毒(picornaviruses)中的这一过程非常简单；事实上，针对任何动物RNA病毒开发的第一个反向遗传学系统都是关于PV。病毒反向遗传学系统基于以下历史发现：当被转染到合适的哺乳动物细胞中时，裸露的病毒基因组RNA具有传染性。1970年代逆转录酶的发现和分子克隆技术的发展使科学家能够生成和操纵RNA病毒基因组的cDNA拷贝。最常见的为，将基因组的整个cDNA拷贝直接克隆到噬菌体T7RNA聚合酶启动子(允许体外合成基因组RNA)的下游，然后将其转染入细胞以产生病毒。或者，可将相同的DNA质粒转染到在胞浆中表达T7RNA聚合酶的细胞中。
从头合成病毒基因组
基于计算机的算法被用于设计和从头合成病毒基因组。这些合成的基因组(以本文所述的修饰的PV的合成为例)编码与野生型(wt)病毒完全相同的蛋白质，但是通过使用替代的同义密码子，多种参数(包括密码子偏性、密码子对偏性、RNA二级结构和/或二核苷酸含量)可改变。呈现的数据表明，通常由于蛋白质翻译不良，这些与编码无关的变化产生高度修饰的病毒。
除非另有说明，如本文使用的“修饰的病毒”是指其中它们的基因组全部或部分具有同义密码子和/或密码子重排和密码子对偏性变异的病毒。本发明的修饰的病毒可用于治疗癌症。除非另有说明，本文所述的重组病毒为修饰的病毒。
通过靶向所有病毒的基本功能(即蛋白质翻译)，已经开发了本文所述的本发明方法，以用于可预测地、安全地、快速且廉价地产生修饰的病毒，所述修饰的病毒可用于进行溶瘤疗法。本文显示，PV衣壳编码区中的密码子去优化和密码子对去优化都大幅降低了PV适应性(fitness)。本发明不限于通过同义密码子置换而引起病毒减毒的任何特定分子机制。
替代编码
给定的肽可由大量核酸序列编码。例如，甚至典型的短的10-mer寡肽也可由大约410个(约106个)不同的核酸编码，并且PV的蛋白可由约10442个不同的核酸编码。自然选择最终选择了这些可能的10442个核酸之一作为PV基因组。一级氨基酸序列是由给定mRNA编码的最重要的信息水平，而不同种类的RNA序列中存在其它种类的信息。这些信息包括不同功能的RNA结构元件(例如，对于PV，顺式作用复制元件或CRE)、翻译动力学信号(暂停位点、移码位点等)、多聚腺苷酸化信号、剪接信号、酶功能(核酶)以及(极有可能)其它尚未确定的信息和信号)。
即使告诫必须保留诸如CRE之类的信号，10442种可能的编码序列提供了极大的灵活性，以在脊髓灰质炎(polio)的RNA序列中发生急剧变化，同时保留编码相同蛋白的能力。可在密码子偏性或密码子对偏性方面进行改变，并且可添加或移除RNA中的核酸信号和二级结构。甚至可在替代框中同时编码额外的或新颖的蛋白。
密码子对偏性
编码序列的独特特征是它们的密码子对偏性。这可通过参考氨基酸对Ala-Glu来说明，所述氨基酸对可由8种不同的密码子对编码，并且该配对可具有在人细胞中影响人基因和病毒基因翻译的偏性(表1)。如果除了每个单独的密码子的频率(如表2所示)之外没有其它因素对该密码子对的频率负有责任，则可通过将两个相关密码子的频率相乘来计算8种编码各自的预期频率。例如，通过该计算，预期密码子对GCA-GAA将在所有Ala-Glu编码对中以0.097的频率出现(0.23×0.42；基于表2中的频率)。为了将每个密码子对的预期(假设)频率与人基因组中实测观察到的频率相联系，使用了包含总共14795个人基因的一致注释的人编码区的Consensus CDS(CCDS)数据库。这组基因代表最全面的人编码序列。使用这组基因，通过将密码子的出现数除以编码相同氨基酸的所有同义密码子的数量来重新计算密码子的使用频率。如所预期的，所述频率与先前公布的频率(如表2中给出的频率)紧密相关。轻微的频率变化可能是由于Kazusa DNA研究所(http://www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)密码子使用数据库提供的数据中的过采样效应所致，其计算结果中包括了84949条人编码序列(远远超过人基因的实际数量)。通过以下将由此计算出的密码子频率用于计算预期的密码子对频率：首先将两个相关密码子的频率彼此相乘(请参阅表1预期频率)，然后将该结果与观测到的频率(在整个CCD数据集中)相乘，由所讨论的密码子对编码的氨基酸对以此频率出现。在密码子对GCA-GAA的实例中，此第二次计算得出的预期频率为0.098(与使用Kazusa数据集进行的第一次计算中的0.97相当)。最终，通过对集中每个密码子对的出现总数进行计数并除以该集中编码相同氨基酸对的所有同义编码对的数量，来确定在14,795个人基因的集中观测到的实际密码子对频率(表2；观测到的频率)。可由8种不同密码子对编码的氨基酸对Ala-Glu的频率和观测/预期值见表1，基于14795个人基因的集，3721(612)个密码子对的完整集(Coleman等2008)。
表1.氨基酸对丙氨酸-谷氨酰胺的密码子对分值
氨基酸对 密码子对 预期频率 观测频率 观测/预期比
AE GCAGAA 0.098 0.163 1.65
AE GCAGAG 0.132 0.198 1.51
AE GCCGAA 0.171 0.031 0.18
AE GCCGAG 0.229 0.142 0.62
AE GCGGAA 0.046 0.027 0.57
AE GCGGAG 0.062 0.089 1.44
AE GCTGAA 0.112 0.145 1.29
AE GCTGAG 0.150 0.206 1.37
Total 1.000 1.000
表2.人基因中的密码子偏性
Figure BDA0002550831300000051
Figure BDA0002550831300000061
如果密码子对的观测频率/预期频率之比大于1，则认为该密码子对过度表现(overrepresented)。如果该比率小于1，则表示低度表现(underrepresented)。在实例中，密码子对GCA-GAA过度表现了1.65倍，而编码对GCC-GAA低度表现了超过5倍。
许多其它密码子对显示出非常强的偏性；一些对低度表现，而另一些对则过度表现。例如，密码子对GCCGAA(AlaGlu)和GATCTG(AspLeu)3-6倍低度表现(优选密码子对分别为GCAGAG和GACCTG)，而密码子对GCCAAG(AlaLys)和AATGA(AsnGlu)过度表现了约2倍。值得注意的是，密码子对的偏性与氨基酸对的频率无关，也与单个密码子的频率无关。例如，低度表现的密码子对GATCTG(AspLeu)恰好使用了最频繁的Leu密码子(CTG)。
在原核细胞中发现了密码子对偏性，但此后在包括人在内的所有其它所检查的物种中都已见到。这种效应具有很高的统计意义，而且肯定不只是噪声。然而，其功能意义(如果有的话)是个谜。一个提议为，某些tRNA对当一起在核糖体上时，它们之间相互作用良好，而其它对则相互作用较弱。由于通常由不同的tRNA读取不同的密码子，因此密码子对可能会产生偏性，以避免将不兼容的tRNA对放在一起。另一种观念是，许多(但不是全部)低度表现的密码子对具有中央CG二核苷酸(例如，编码AlaGlu的GCCGAA)，而CG二核苷酸在哺乳动物中系统性地低度表现。因此，密码子对偏性的影响可能有两种：一种是哺乳动物基因组中CG低度表现的间接影响，另一种与翻译的效率、速度和/或准确性有关。要强调的是，本发明不限于密码子对偏性的任何特定分子机制。
密码子对偏性的计算
可能的3721个包含非“终止(STOP)”的密码子对的每个单独密码子对(例如，GTT-GCT)带有指定的“密码子对分值”或“CPS”，其专门针对给定的基因“训练集”。给定密码子对的CPS定义为观测到的出现次数与该基因集(在此实例中为人基因组)所预期的数量的对数比。确定特定密码子对的实际出现次数(或者换句话说，特定氨基酸对由特定密码子对编码的可能性)简单地对特定编码序列的集中密码子对的实际出现次数进行计数即可。然而，确定预期数量需要额外的计算。类似于Gutman和Hatfield，计算出预期数量，使其既不依赖于氨基酸频率，也不依赖于密码子偏性。即，基于由特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算预期频率。CPS值为正表示给定密码子对在统计学上过度表现，而CPS为负则表示在统计学上该对在人基因组中低度表现。
为了在人背景下进行这些计算，使用最新的一致注释的人编码区的ConsensusCDS(CCDS)数据库，其总共包含14,795个基因。该数据集提供了密码子和密码子对，以及由此而来的基因组规模的氨基酸和氨基酸对频率。
Federov等(2002)的模型用来进一步增强Gutman和Hatfield(1989)的方法。这允许计算给定密码子对的预期频率，而依赖于密码子频率并与编码特定氨基酸对的相邻密码子的非随机关联。在WO 2008/121992和WO 2011/044561中公开了用于计算CPB的详细方程，将其以引用的方式并入。
Figure BDA0002550831300000081
在计算中，Pij为在其同义组中以NO(Pij)的频率出现的密码子对。Ci和Cj为包含Pij的两个密码子，在它们的同义组中分别以频率F(Ci)和F(Cj)出现。更明确地说，F(Ci)为在所有编码区中密码子Ci编码相应氨基酸Xi的频率，并且F(Ci)＝No(Cj)/No(Xi)，其中No(Ci)和No(Xi)分别为密码子Ci和氨基酸Xi的观测出现次数。相应地计算F(Cj)。进一步，No(Xij)是在所有编码区中氨基酸对Xij的出现次数。以观测到的频率No(Pij)与预期的Ne(Pij)出现次数的对数比，计算Pij的密码子对偏性分值S(Pij)。
使用上述公式，然后确定当与通过使用整个人CCDS数据集计算的相应基因组Ne(Pij)值相比时，各编码序列中的各密码子对是过度表现还是低度表现。此计算对于在人编码区域中过度表现的密码子对产生正S(Pij)得分值，对于低度表现的密码子对产生负值。
个体编码序列的“组合”密码子对偏性是根据以下公式通过平均所有密码子对分值来计算的：
Figure BDA0002550831300000082
因此，通过将包括该区域的所有单个密码子对分值相加并将该和除以编码序列的长度，来计算整个编码区的密码子对偏性。
密码子对偏性的计算，改变密码子对偏性的算法的实现。
开发了一种算法来量化密码子对偏性。每个可能的个体密码子对都有一个“密码子对分值”或“CPS”。CPS定义为在所有人编码区中每个密码子对观测出现次数与预期出现次数之比的自然对数，其中人代表待重新编码的原始疫苗病毒的宿主物种。
Figure BDA0002550831300000083
尽管对特定密码子对的观测出现的计算是简单的(基因集内的实际计数)，但密码子对的预期出现次数需要额外计算。类似于Gutman和Hatfield，我们计算出这个预期次数与氨基酸频率和密码子偏性无关。即，基于由特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算预期频率。在人基因组，CPS值为正表示给定密码子对在统计学上过度表现，而CPS为负则说明该对在统计学上低度表现。
使用这些计算的CPS，然后通过取密码子对分值的平均值，可按照使用过度表现或低度表现的密码子对对任何编码区进行评定，从而给出整个基因的密码子对偏性(CPB)。
Figure BDA0002550831300000091
如下面进一步讨论的，密码子对偏性考虑了编码序列中每个密码子对的分值，该分值为在编码序列的整个长度上平均而来。根据本发明，密码子对偏性由下式确定：
Figure BDA0002550831300000092
因此，例如，可通过在整个子序列上使密码子对分值最小化或在编码序列的全长上使密码子对分值适当地减少来获得编码序列的相似密码子对偏性。
因为肯定可以使用所有61个有义密码子和所有有义密码子对，所以不能期望将单个稀有密码子置换为频繁密码子，或着将稀有密码子对置换为频繁密码子对将会有很大的效果。无论精确的机制如何，数据表明病毒基因组中同义的去优化密码子的大规模置换导致严重减毒的病毒。这种产生修饰的病毒的程序被称为SAVE(合成减毒病毒工程)。
根据本发明的方面，可通过改变病毒基因组的一个或多个部分中的密码子对偏性以及密码子偏性来实现病毒修饰。然而，预期调节密码子对偏性是特别有利的。例如，通过密码子偏性使病毒减毒通常需要消除常见密码子，因此核苷酸序列的复杂性降低了。相反，可在保持更大的序列多样性的同时实现密码子对偏性的降低或最小化，并因此更好地控制核酸二级结构、退火温度、以及其它物理和生化特性。本文公开的工作包括修饰的密码子对偏性降低或最小化的序列，在所述序列中密码子被改组，但是密码子使用谱未改变。
已知恶性肿瘤是由器官中细胞的不受控的生长引起的。肿瘤生长到一定程度，可通过肿瘤浸润、替换功能组织、竞争必要资源以及(经常地)转移性扩散至第二部位而严重损害正常器官功能。恶性肿瘤是美国第二大死亡原因。
到目前为止，用于治疗恶性肿瘤的方法包括手术切除、放射和/或化学疗法。然而，许多恶性肿瘤对所有传统可用的治疗选择反应不佳，并且已知的实践中的方法有严重的副作用。在降低副作用的严重程度同时提高常用治疗方案的效率方面已经取得了很大进步。然而，仍然存在许多问题，需要寻找其它治疗方式。对于中枢神经系统原发性恶性肿瘤的探究尤为迫切。脑肿瘤(尤其是胶质母细胞瘤)仍然是最困难的治疗挑战之一。尽管单独或组合使用手术、放射疗法和化学疗法，但胶质母细胞瘤几乎总是致命的，中位生存率不到一年，五年生存率为5.5％以下。可用的治疗模式均未实质性改变胶质母细胞瘤的持续发展。
对诊断具有恶性胶质瘤并接受手术以全部或部分移除肿瘤并随后进行化学疗法和/或放射的患者的系统研究表明，一年后的生存率仍然很低，特别是对于超过60岁的患者。已证明恶性胶质瘤对放射和化学疗法方案具有相对的抵抗力。恶性胶质瘤手术切除和辅助放射/化学疗法后局部复发的频繁发生，加重了预后不良。
近年来，已经提出了使用病毒来治疗癌症：(1)作为基因传递载体；(2)作为通过使用经遗传改造以使其致病性丧失的病毒的直接溶瘤剂；或(3)作为使用病毒选择性破坏恶性细胞的药剂，所述病毒已为此目的经过了遗传工程化。
使用病毒对抗恶性胶质瘤的实例包括以下。单纯疱疹病毒dlsptk(HSVdlsptk)是HSV的胸苷激酶(TK)阴性突变体。该病毒由于TK基因中的360个碱基对的删除而使神经毒力减弱，所述TK基因的产物是正常病毒复制所必需的。已经发现HSVdlsptk在快速分裂的恶性细胞中保留了繁殖潜能，引起细胞裂解和死亡。不幸的是，在实验动物中，所有具有减弱的神经致病性的缺陷性疱疹病毒都与脑炎的严重症状有关。例如，在脑内感染有HSVdlsptk的小鼠中，LD50Ic(颅内给予)为106pfu(相当低的剂量)。这限制了该突变体HSV的使用。已经提出并测试了HSV的其它突变体。然而，由病毒性脑炎引起的死亡仍然是一个问题。
另一提议是使用经工程化以包含HSV tk基因的逆转录病毒来表达胸苷激酶，所述胸苷激酶引起核苷类似物如更昔洛韦(gancylovir)或无环鸟苷(acyclovir)的体内磷酸化，阻断DNA的复制并选择性地杀死分裂细胞。Izquierdo,M.等，Gene Therapy，2：66-69(1995)报道了通过带有其自身启动子的HSV tk基因的插入而工程化的Moloney鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MoMLV)的使用。通过MRI对具有胶质母细胞瘤的患者进行了随访，发现肿瘤缩小并且没有明显的短期副作用，所述患者用肿瘤内接种治疗性逆转录病毒进行治疗。然而，实验性疗法对受影响患者的短期或长期生存没有影响。逆转录病毒疗法通常伴有严重的长期副作用的危险(例如，插入诱变)。
已经开发出类似的系统来靶向上呼吸道的恶性肿瘤，这些肿瘤起源于天然易受腺病毒感染的组织内并且易于接近。然而，多形性胶质母细胞瘤(由广泛异种细胞类型(因此命名为多形性)组成的高度恶性肿瘤)的特征在于非常多变的基因型，并且不太可能对针对具有均一基因异常的均质肿瘤的溶瘤病毒系统作出反应。
可以以本领域普通技术人员众所周知的方式确认我们的病毒修饰的效果。非限制性实例诱导噬斑测定、生长测量、RNA病毒的反向遗传学和在测试动物中降低的致死性。本申请证明了修饰的病毒能够在宿主中诱导保护性免疫应答。
发明内容
结合组合物和方法，对以下实施方式及其方面进行描述和说明，其旨在为示例性和说明性的，而不限制范围。
本发明的目的为开发用于治疗多种类型癌症的修饰的病毒。
本发明的另一目的为开发用于治疗多种类型癌症的修饰的病毒，所述修饰的病毒可与抗PDL-1抗体治疗剂或其它免疫肿瘤疗法联合使用。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞以引起癌细胞裂解和死亡来治疗所述癌细胞。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞来治疗癌细胞，从而引发抗肿瘤免疫应答。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞来治疗癌细胞，从而通过增加或降低抗肿瘤免疫蛋白(例如PD-1、CTLA-4、IDO1、TIM3、lag-3)的表达来引发抗肿瘤免疫应答。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞来治疗癌细胞，从而通过激活肿瘤中的固有信号转导受体(RIG-1、STNG)和固有免疫转录因子(IRF3、IRF7或NFkB)在肿瘤细胞中引发固有免疫应答。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞来治疗癌细胞，从而在肿瘤中引发固有免疫应答。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞来治疗癌细胞，从而在肿瘤中引发促炎性免疫应答。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞并由此将促炎性白细胞募集到肿瘤中来治疗癌细胞。
本发明的另一目的为通过用修饰的病毒感染癌细胞并由此减少来自肿瘤的调节性白血细胞来治疗癌细胞。
本发明的另一目的为在给予病毒以治疗癌症之前，用修饰的病毒对接受者进行预治疗以引发免疫应答。
本发明的另一目的为在给予病毒的天然分离物以治疗癌症之前，用修饰的病毒对接受者进行预治疗以引发免疫应答。
本发明的另一目的为开发新的野生型病毒修饰的病毒嵌合体，其将适用于治疗和治愈胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其将适用于腺癌、尤其是宫颈癌的治疗。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其将适用于治疗乳腺癌。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其将适用于治疗通过免疫过氧化物酶染色对角蛋白呈阳性的癌细胞。
本发明的另一目的为开发另外的新的修饰的病毒，其将适用于治疗据报道p53基因表达低或不存在的癌细胞。
本发明的另一目的为开发另外的新的修饰的病毒，其将适用于治疗其中的细胞为亚二倍体(hypodiploid)的肿瘤。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗肺癌(lungcarcinomas)，特别是肺癌症。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗亚三倍体的癌症(例如，约4％的细胞中的染色体计数为64、65或66)。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗每细胞具有单个拷贝的染色体N2和N6的癌症。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的同工酶G6PD-B的癌症。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗黑素瘤。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗衍生自黑素细胞的恶性细胞。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗神经母细胞瘤。
本发明的另一目的为开发新的修饰的病毒，其适用于治疗具有至少3倍MYCN癌基因(oncogene)扩增的癌症。
本发明的另一目的为开发修饰的病毒，其适用于治疗乳腺癌。
本发明的另一目的为开发修饰的病毒，其适用于治疗膀胱癌。
本发明的另一目的为开发修饰的病毒，其适用于治疗结肠癌。
本发明的另一目的为开发修饰的病毒，其适用于治疗前列腺癌。
本发明的另一目的为开发修饰的病毒，其适用于治疗周围神经鞘瘤。
本发明提供了包含修饰的病毒基因组的修饰的病毒，所述修饰的病毒基因组包含在基因组中的一个或多个(例如1个、2个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个或更多个)位置工程化的核苷酸置换，其中这些置换将多个同义密码子引入基因组。这种同义密码子的置换改变多种参数，包括基因组中密码子偏性、密码子对偏性、去优化的密码子和去优化的密码子对的密度、RNA二级结构、CpG二核苷酸含量、C+G含量、UpA二核苷酸含量、翻译移码位点(translation frameshift sites)、翻译暂停位点、组织特异性microRNA识别序列的存在或不存在、或者其任意组合。由于涉及大量不足，本发明的修饰的病毒提供了产生针对多种不同肿瘤类型的稳定修饰的溶瘤病毒的方法。
在一个实施方式中，提供了修饰的病毒，所述修饰的病毒包含编码与亲本病毒的相应序列一致的病毒蛋白或其部分的核酸序列，其中，所述修饰的病毒的核苷酸序列包含自其衍生出所述修饰的病毒的亲本序列的密码子，并且其中，所述核苷酸序列与亲本病毒的核苷酸序列的同一性小于98％。在另一实施方式中，所述核苷酸序列与亲本病毒的序列的同一性小于90％。提供以用于修饰的置换的核苷酸序列的长度为至少100个核苷酸、或者长度为至少250个核苷酸、或者长度为至少500个核苷酸、或者长度为至少1000个核苷酸。修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏性，并且降低了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2。
在一个实施方式中，提供了修饰的病毒，所述修饰的病毒包含编码与亲本病毒的相应序列相似的病毒蛋白或其部分的核酸序列，其中，所述修饰的病毒的核苷酸序列包含与亲本病毒的核苷酸序列的同一性小于98％的核苷酸序列。在另一实施方式中，所述核苷酸序列与亲本病毒的序列的同一性小于90％。提供以用于修饰的置换的核苷酸序列的长度为至少100个核苷酸、或者长度为至少250个核苷酸、或者长度为至少500个核苷酸、或者长度为至少1000个核苷酸。与亲本病毒相比，修饰的序列的CpG二核苷酸含量增加了至少19，或者增加了至少41。
在一个实施方式中，提供了修饰的病毒，所述修饰的病毒包含编码与亲本病毒的相应序列相似的病毒蛋白或其部分的核酸序列，其中，所述修饰的病毒的核苷酸序列包含与亲本病毒的核苷酸序列的同一性小于98％的核苷酸序列。在另一实施方式中，所述核苷酸序列与亲本病毒的序列的同一性小于90％。提供以用于修饰的置换的核苷酸序列的长度为至少100个核苷酸、或者长度为至少250个核苷酸、或者长度为至少500个核苷酸、或者长度为至少1000个核苷酸。修饰的序列的UpA二核苷酸含量比亲本病毒增加了至少13，或者比亲本病毒增加了至少约26。
本发明的实施方式还提供了用于治疗受试者的治疗性组合物，所述治疗性组合物包含修饰的病毒和药学上可接受的载体。本发明还提供了用于在具有癌症的受试者中引发免疫应答的治疗性组合物，所述治疗性组合物包含修饰的病毒和药学上可接受的载体。本发明进一步提供了修饰的宿主细胞系，其被专门工程化以允许在野生型宿主细胞中不能生存的修饰的病毒。
根据本发明，通过将修饰的病毒基因组转染到宿主细胞中来制备修饰的病毒，从而产生修饰的病毒颗粒。本发明进一步提供了适用于癌症治疗的包含修饰的病毒的药物组合物。
本发明的多种实施方式提供了治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给予修饰的病毒，其中，所述修饰的病毒选自于由如下修饰的病毒所组成的组：通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏性，并减少了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2；通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或者至少比亲本病毒基因组高21个实例；通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高出13个实例；通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高出42个实例；以及它们的组合。
本发明的多种实施方式提供了治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给予初始剂量的修饰的病毒；以及向有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的修饰的病毒，其中，初始剂量和加强剂量的修饰的病毒各自独立地选自于由如下病毒所组成的组：通过密码子对去优化以外的其它方法产生的减毒病毒；通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏性，并减少了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2；通过野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高21个实例；通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者至少比亲本病毒基因组高13个实例；通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域而来的衍生自野生型病毒或先前修饰的病毒的修饰的病毒，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高42个实例；以及它们的组合。
在多种实施方式中，可皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予初始剂量。在多种实施方式中，可瘤内或静脉内给予一个或多个加强剂量。
在多种实施方式中，一个或多个加强剂量的第一剂可在一个初始剂量后约2周给予；或者如果超过一个初始剂量，则在最后的初始剂量后约2周给予。
在多种实施方式中，受试者可具有癌症。在多种实施方式中，受试者可处于发展为癌症的较高风险中。
在多种实施方式中，当受试者不具有癌症时，可给予初始剂量。
在多种实施方式中，当受试者没有癌症时，可在初始剂量后大约每1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年给予一个或多个加强剂量。在多种实施方式中，可在诊断出受试者具有癌症之后给予一个或多个加强剂量。
在多种实施方式中，所述方法可进一步包括给予PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
在多种实施方式中，PD-1抑制剂可为抗PD1抗体。在多种实施方式中，抗PD1抗体可选自于由如下抗体所组成的组：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、pidilizumab、AMP-224、AMP-514、spartalizumab、西米普利单抗(cemiplimab)、AK105、BCD-100、BI 754091、JS001、LZM009、MGA012、Sym021、TSR-042、MGD013、AK104、XmAb20717、替雷利珠单抗(tislelizumab)及其组合。
在多种实施方式中，PD-1抑制剂可选自于由如下所组成的组：PF-06801591、表达抗PD1抗体的多能性杀伤性T淋巴细胞(PIK-PD-1)、自体抗EGFRvIII 4SCAR-IgT细胞、及其组合。
在多种实施方式中，PD-L1抑制剂可为抗PD-L1抗体。在多种实施方式中，抗PD-L1抗体可选自于由如下抗体所组成的组：BGB-A333、CK-301、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、阿特株单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、BMS-936559、CK-301及其组合。
在多种实施方式中，抗PD-L1抑制剂为M7824。
在多种实施方式中，治疗恶性肿瘤可降低恶性肿瘤复发的可能性。在多种实施方式中，治疗恶性肿瘤可降低具有不同于所述恶性肿瘤的第二癌症的可能性。
在多种实施方式中，如果受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二癌症，恶性肿瘤的治疗可导致第二癌症的生长减慢。
在多种实施方式中，其中，在恶性肿瘤缓解之后，如果受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二癌症，所述恶性肿瘤的治疗导致第二癌症的生长减慢。
在多种实施方式中，治疗恶性肿瘤可刺激肿瘤中的炎性免疫应答。在多种实施方式中，治疗恶性肿瘤可将促炎细胞募集到肿瘤。在多种实施方式中，治疗恶性肿瘤可刺激抗肿瘤免疫应答。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，修饰的病毒可为重组的修饰的病毒。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，修饰的病毒可从小核糖核酸病毒修饰而来。
在多种实施方式中，小核糖核酸病毒为肠病毒(enterovirus)。在多种实施方式中，肠病毒为肠病毒C。在多种实施方式中，肠病毒C为脊髓灰质炎病毒。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，修饰的病毒可从正粘病毒(orthomyxovirus)修饰而来。在多种实施方式中，正粘病毒可为甲型流感病毒(Influenza A virus)。在多种实施方式中，可重新编码甲型流感病毒的一个或多个区段。在多种实施方式中，HA、NA或者HA和NA区段两者被重新编码(例如，去优化)。
在多种实施方式中，修饰的病毒可为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，修饰的病毒可从黄病毒属(flavivirus)修饰而来。
在多种实施方式中，黄病毒属可为寨卡病毒(Zika virus)。
在多种实施方式中，可对寨卡病毒的前膜/包膜(E)编码区、或非结构蛋白3(NS3)编码区、或两者进行重新编码。在多种实施方式中，重新编码可包括改变E和NS3编码序列中CG和/或TA二核苷酸的频率。在多种实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列或NS3编码序列或两者可具有小于-0.1的密码子对偏性。在多种实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列或NS3编码序列或两者可具有0.1-0.4的密码子对偏性降低。
在多种实施方式中，修饰的病毒可为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述恶性肿瘤可为实体瘤。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述恶性肿瘤可为胶质母细胞瘤、腺癌、黑素瘤、肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌或肝癌。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，修饰的病毒可瘤内、静脉内、脑内、肌内、脊髓内或鞘内给予。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，修饰的病毒可为PV1-MinY，并由野生型病毒或先前修饰的病毒制备，其中，将其P1区的中间部分置换为根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成序列。
本发明的多种实施方式提供了本发明的治疗恶性肿瘤的方法，其中，重组的修饰的病毒可为PV1-MinY，并由先前修饰的病毒PV1(M)或野生型病毒PV1(M)制备，并且将其P1区的中间部分置换为重新编码以具有增加的UpA和/或CpG二核苷酸的合成序列。
在多种实施方式中，重组病毒可为由PV1(M)制备的PV1-MinY，其中，将包含P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸的核苷酸片段置换为包含根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸的相应核苷酸片段。
本发明的多种实施方式提供了一种治疗本发明恶性肿瘤的方法，其中，经修饰的病毒为由PV1(M)制备的PV1-MinY，并且其中，将包含P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸的核苷酸片段置换为包含根据人密码子对偏性而重新编码以具有降低的密码子对分值的P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸的相应核苷酸片段。
本发明的多种实施方式提供了治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括：从野生型小核糖核酸病毒制备重组的修饰的小核糖核酸病毒；以及，向有需要的受试者给予所述重组的修饰的病毒，所述重组的修饰的小核糖核酸病毒通过以下制备：至少将野生型小核糖核酸病毒的P1结构域中的核苷酸片段置换为包含根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成序列的相应核苷酸片段，并任选地将野生型小核糖核酸病毒的P1置换为根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成P1，所述小核糖核酸病毒选自于由PV1(S)、PV2(S)和PV3(S)所组成的组。
在多种实施方式中，至少置换核苷酸片段包括至少将包含SEQ ID NO：1的nt#1513-nt#2470的核苷酸片段(其为修饰的病毒的P1结构)域置换为具有包含根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成序列的相应核苷酸片段。
在多种实施方式中，重组病毒可瘤内、静脉内、脑内、肌内、脊髓内或鞘内给予，并引起肿瘤细胞的细胞裂解。
在多种实施方式中，恶性肿瘤可选自于由如下恶性肿瘤所组成的组：多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、支气管癌和表皮样癌。
在多种实施方式中，小核糖核酸病毒可为肠病毒C种属。在多种实施方式中，小核糖核酸病毒可为脊髓灰质炎病毒。
在多种实施方式中，P1结构域可选自Sabin疫苗株PV1(S)、PV2(S)和PV3(S)。
通过以下结合附图的详细描述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见，所述附图以实例的方式示出了本发明的实施例的多种特征。
附图说明
在参考的附图中示出了示例性实施方式。本文公开的实施方式和附图意图被视为说明性的、而非限制性的。
图1描述了所有的人ORF和合成的P1区的密码子对偏性。计算所有14795个注释的人基因的密码子对偏性(CPB)分值。每个灰色点代表针对其氨基酸长度绘制的基因的计算CPB分值。PV(M)-wt P1区的CPB以及设计的合成脊髓灰质炎病毒衣壳PV-Min、PV-MinXY、PV-MinZ和PV-Max的CPB用箭头和标签指示。
图2描述了构建的PV-Min亚克隆的生存力。(上)脊髓灰质炎病毒基因组，作为单个开放读码框翻译。(下)通过分子克隆构建的多种嵌合的合成脊髓灰质炎病毒构建体的cDNA，以及其在培养的HeLa R19细胞中的生存力。获得病毒，所述病毒包含PV-Min的至少一个区段，因此在任何一个合成区域(X、Y或Z)中都不存在明显的缺陷。显示了将区域分开的核苷酸位置。所有读码框中的前12个核苷酸(4个密码子)均为PV(M)-wt序列，以允许翻译的适当启动。序列的对应颜色：黑色：PV(M)-wt；灰色：PV-Min；Thatched：PV-Max。
图3描述了构建的合成病毒的生长滴度。转染来自所有可存活的病毒构建体的转录本RNA后(图4)，病毒在HeLa R19细胞中通过两次传代进行扩增。然后在HeLa R19细胞单层上通过噬斑测定测量这些病毒生长的滴度。PV-Max和PV(M)-wt病毒生长至相似的滴度(～109)，而PV-Min嵌合体病毒产生了较低的PFU/ml滴度，滴度明显逐步降低。PV-Min序列添加到P1区降低了PFU滴度。该图显示了三个独立实验的平均滴度，误差棒表示标准偏差值。
图4A-图4B描述了改变的密码子对偏性对翻译的影响。(图4A)双顺反子报告分子的结构。第一个顺反子使用丙型肝炎病毒(HCV)内部核糖体进入位点(IRES)来启动海肾(Renilla)荧光素酶(R-Luc)的翻译。该第一个顺反子提供了内部对照，以归一化输入的RNA的量。第二个顺反子使用脊髓灰质炎病毒IRES启动萤火虫荧光素酶(F-Luc)的翻译。标记“P1”的区域被更改CPB的病毒的合成P1区替换。从这些构建体转录(+)RNA。(图4B)在2mMGuHCl的存在下，将各个双顺反子RNA转染到HeLa R19细胞中。6小时后，测量R-Luc和F-Luc活性。将F-Luc/R-Luc比归一化至关于PV(M)-wt P1区的F-Luc/R-Luc比，其被设置为100％。该图显示了三个独立实验的平均值，误差棒表示标准偏差值。使用低度表现的密码子对的P1(PV-Min、PV-MinZ和PV-MinXY)的翻译速率降低，而包含过度表现的密码子对的P1(PV-Max)似乎具有略有提高的翻译效率。
图5A-图5B描述了用修饰的脊髓灰质炎病毒MV-MinY处理的NCR裸鼠中肿瘤生长的控制。在肿瘤达到0.2cm3大小后，在第0天、第3天和第5天用2×107PFU的PV-MinY或模拟(mock)注射来处理每只小鼠(n＝7；A)。
图6描述了与未处理的对照小鼠(上)相比，PV-MinY在NCR裸鼠中对星形细胞瘤的溶瘤作用(下)。向NCR裸鼠皮下注射1×106HTB-14细胞，一旦肿瘤大小达到0.2cm3，则开始实验。在第0天、第3天和第5天，向肿瘤注射模拟稀释剂(上)或2×107PFU的PV-MinY(下)。注射PV-MinY的肿瘤大小维持或减小，而模拟处理组中的动物由于肿瘤大小不得不在7天后安乐死。
图7描述了修饰的病毒PV-MinY对A549细胞的溶瘤作用。A549细胞是亚二倍体(在40％的细胞中染色体计数为64、65或66)人肺上皮癌细胞系的细胞(Giard等，1973)。染色体N2和N6每细胞单个拷贝；N12和N17通常有4个拷贝。通过免疫过氧化物酶染色，A549细胞呈角蛋白阳性。A549表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的同工酶G6PD-B。我们用A549细胞作为肺癌模型。用PV-MinY以1.0的MOI感染A549细胞。A549细胞在DMEM+10％FBS中生长。在室温下1小时振荡后，用106PFU的PV-MinY感染90％汇合的细胞；移除接种物，并替换为DMEM+2％FBS。将感染的细胞在37℃、5％CO2的培养箱中孵育。如图7所示，与未感染的肺癌细胞相比，PV-MinY可在感染后36小时内溶解大多数细胞，在感染后72小时内溶解所有细胞。
图8A-图8B描述了在不到1个月的时间内快速构建了六个SAVE去优化的、活的减毒寨卡病毒疫苗候选物，其在无动物成分的条件下，在Vero细胞中生长。(图8A)关于人ORFeome的寨卡prM/E和NS3基因及它们的SAVE去优化对应物的密码子对偏性。密码子对偏性(CPB)表示为给定基因的开放读码框(ORF)的平均密码子对分值。正CPB值和负CPB值分别表示ORF中统计学上过度表现或低度表现的密码子对的主导地位。红色圆圈表示14795个人ORF各自的CPB，代表了我们分析时大多数已知的注释人基因(ORFeome)。野生型prM/E和NS3基因的CPB处于人宿主细胞基因的正常范围内。通过经由SAVE的密码子对“去优化”后，得到的去优化的prM/E和NS3基因区段现在主要由低度表现的人密码子对编码，这由它们极负的CPB所证实，并且与任何人基因都大不相同。(图8B)野生型和合成的“去优化”嵌合寨卡疫苗变体的cDNA基因组。从头合成了图8A的SAVE去优化的合成prM/E和NS3，并使用重叠PCR分别亚克隆到WT PRVABC59(PR15)或MR766基因组中，产生六个独立的cDNA基因组，每个基因组均包含合成的“去优化”片段。我们在7天内构建了wt PR15和MR766的传染性cDNA基因组，然后在27天内通过将RNA转染到BHK细胞中，完全恢复了用于6种去优化的ZIKV疫苗候选物的感染性的复制病毒。
图9描述了用于通过减少prM+E编码区中的去优化序列的长度来降低减毒或增加免疫原性的亚克隆策略的图表。第二代寨卡疫苗候选物利用SAVE平台的灵活性，以将去优化区域从2014bp(E-min)降低到997bp(E-W/Min)或者进一步降低到664bp(E-W/W/Min)，同时保持氨基酸序列100％的同一性。
图10描述了在ZIKV感染的细胞中蛋白和RNA表达的减少。在33℃下孵育24小时后，蛋白质印迹用于测量被ZIKV株PRVABC59(PR15)和MR766的E-Min(min)和野生型(WT)变体感染的Vero细胞中的包膜糖蛋白表达。在两种ZIKV菌株中，E-Min变体的包膜糖蛋白表达大大降低。
图11描述了感染小鼠中的病毒表型。AG129小鼠中SAVE ZIKV疫苗候选物的减毒。向AG129小鼠注射以下任一种：i)合成来源的野生型病毒MR766和PR15病毒，剂量为102(阳性对照)；ii)疫苗候选物PR15E-Min或MR766E-Min和NS3-Min，剂量为104或102PFU；iii)疫苗候选物PR15NS3+E-Min，单剂量为104；全部以100μL皮下递送。检查注射小鼠的死亡率和发病率(体重减轻)。接种有102wt病毒的所有小鼠和接种有104MR766NS3-Min的小鼠的80％死于感染。所有其它小鼠均存活，包括所有免疫接种有104PFU主要候选物MR766E-Min的小鼠，并且没有任何体重减轻。
图12描述了在AG129小鼠中诱导高水平的中和抗体并保护免受致命性攻击的SAVE减毒的ZIKV疫苗候选物。A)单剂量后的抗PR15寨卡抗体。在第28天收获来自免疫接种动物的血清，并在Vero细胞上通过PRNT50测定对针对ZIKV毒株PR15的抗体进行量化。用104剂量的PR15E-Min和MR766E-Min免疫接种的小鼠产生了高水平的中和抗体(2.8log10PRNT50)。
图13描述了食蟹猕猴(Cynomolgus macaques)的E-W/W/Min疫苗接种的免疫原性。用105或107个空斑形成单位(PFU)的E-W/W/Min对寨卡病毒血清阴性猕猴进行免疫接种(以0.5mL的体积皮下递送)。给模拟免疫接种的动物注射0.5mL疫苗稀释剂。猕猴最初在第0天免疫接种，然后在第28天加强。在第0天、第14天、第21天、第28天和第50天收集血清样品，并在Vero细胞中使用转化灶降低中和50％(FRNT50)分析对针对野生型ZIKV毒株MR766的中和活性进行测试。在第一次免疫接种后，发现用107或105PFU E-W/W/Min的免疫接种优于NIH灭活的ZIKV疫苗候选物，两次剂量触发了相当水平的中和抗体。接种后第14天，所有接种了E-W/Min血清的动物进行了转换。在第28天，加强免疫后未观测到FRNT50滴度的增加，这表明其杀菌免疫力防止继发感染触发回忆应答(anamnestic response)。这进一步表明，单一的相对低剂量的E-W/WMin可足以触发高水平的中和抗体(≥1,028FRNT50)。
图14描述了使用植入到免疫活性DBA/2小鼠中的CCL53.1鼠上皮黑素瘤细胞的体内肿瘤模型来测试MR766E-W/W/Min寨卡病毒的溶瘤性能的实验概述。在第0天、第14天、第26天、第71天和第85天，用MR766E-W/W/Min对小鼠免疫接种5次。在第97天(最终免疫接种后11天)，将CCL53.1细胞植入免疫接种或模拟免疫接种的小鼠中。通过在所有动物的右下胁腹皮下注射1×106CCL53.1细胞来完成植入。还将2.5×105CCL53.1细胞皮下注射到一些小鼠的左下胁腹。仅在第103天(肿瘤植入后10天)，用1×107PFU MR766E-W/W/Min处理植入的小鼠，或者通过用OptiPro SFM直接注射到右侧胁腹肿瘤中进行模拟处理。仅对右侧胁腹肿瘤进行处理，以观测未注射的肿瘤的免疫介导的溶瘤作用。在第105天(肿瘤植入后12天)和第107天(肿瘤植入后14天)，重复相同的处理两次。处理后10天内(第107-第117天)每天监测小鼠的体重和肿瘤大小，之后每隔天监测一次，直到治疗后20天(第118天-第127天)。
图15描述了在植入有CCL53.1鼠上皮黑素瘤细胞的DBA/2小鼠中，通过瘤内途径注射MR766E-W/W/Min处理3次的小鼠的肿瘤大小的减小。到第5天，处理动物的肿瘤显著缩小，而模拟处理的DBA/2小鼠则无改善，并且肿瘤大小增加。
图16描述了用寨卡病毒MR766W-E-W/W/Min预先免疫对植入有CCL53.1鼠上皮黑素瘤细胞的DBA/2小鼠的肿瘤大小的影响。在第0天、第14天、第26天、第71天和第85天，对小鼠免疫接种5次MR766E-W/W/Min，或者用OptiPro培养基进行模拟免疫接种。通过将1×106CCL53.1细胞皮下注射到所有动物的右下胁腹，将CCL53.1细胞植入免疫接种的小鼠或模拟免疫接种的小鼠中。通过直接注射到右侧胁腹肿瘤，用1×107PFU MR766E-W/W/Min、1×107PFU MR766WT处理植入的消暑，或者模拟处理植入的小鼠。每两天进行三次处理，并在处理后10天内每天测量肿瘤大小。模拟免疫：模拟处理的DBA/2小鼠肿瘤在10天内稳定增大，然而，MR766WT和MR766E-W/W/Min处理有效降低了预先用MR766E-W/W/Min免疫的小鼠的平均肿瘤体积。
图17描述了用寨卡病毒E-W/Min和E-W/W/Min预先免疫对植入有CCL53.1鼠上皮黑素瘤细胞的DBA/2小鼠中肿瘤大小的影响。在第0天、第14天、第26天、第71天和第85天，对小鼠免疫接种5次MR766E-W/W/Min和MR766E-W/Min，或者用OptiPro培养基进行模拟免疫接种。通过将1×106CCL53.1细胞皮下注射到所有动物的右下胁腹，将CCL53.1细胞植入免疫接种的小鼠或模拟免疫接种的小鼠中。通过直接注射到右侧胁腹肿瘤中，用1×107PFUMR766E-W/W/Min、1×107PFU MR766WT对植入的小鼠进行处理，或者对植入的小鼠进行模拟处理。每两天进行三次处理，并在处理后10天内每天测量肿瘤大小。模拟免疫：模拟处理的DBA/2小鼠肿瘤在10天内稳定增大；然而，MR766WT和MR766E-W/W/Min处理的肿瘤大小均减小。在免疫接种的小鼠中，MR766E-W/W/Min处理优于MR766WT处理。
图18描述了MR766WT处理对植入有CCL53.1鼠上皮黑素瘤细胞的DBA/2小鼠中肿瘤大小的影响。在第0天、第14天、第26天、第71天和第85天，对小鼠免疫接种5次MR766-W-W-E-Min，或者用OptiPro培养基进行模拟免疫接种。通过将1×106CCL53.1细胞皮下注射到所有动物的右下胁腹，将CCL53.1细胞植入免疫接种的小鼠或者模拟免疫接种的小鼠中。通过直接注射到右侧胁腹肿瘤中，用1×107PFU MR766WT对植入的小鼠进行处理，或者对植入的小鼠进行模拟处理。每两天进行三次处理，并在处理后10天内每天测量肿瘤大小。模拟免疫：模拟处理的DBA/2小鼠肿瘤在10天内稳定增大，在模拟免疫接种小鼠中MR766WT处理的肿瘤也是如此。在MR766E-W/W/Min免疫接种的DBA/2小鼠中，MR766WT处理在第10天时有效地大幅减小肿瘤大小。
图19描述了免疫接种对寨卡病毒MR766-E-W/W/Min处理对植入有CCL53.1鼠上皮黑素瘤细胞的DBA/2小鼠中肿瘤大小的效力的影响。在第0天、第14天、第26天、第71天和第85天，对小鼠免疫接种5次MR766E-W/W/Min、MR766E-W/W/Min和E-W/Min，或者对小鼠用OptiPro培养基进行模拟免疫接种。通过将1×106CCL53.1细胞皮下注射到所有动物的右下胁腹，将CCL53.1细胞植入免疫接种的小鼠或者模拟免疫接种的小鼠中。通过直接注射到右侧胁腹肿瘤中，用1×107PFU MR766E-W/W/Min对植入的小鼠进行处理，或者对植入的小鼠进行模拟处理。每两天进行三次处理，并在处理后10天内每天测量肿瘤大小。模拟免疫：模拟处理的DBA/2小鼠肿瘤在10天内稳定增大，在模拟免疫处理的小鼠中MR766E-W/W/Min处理的肿瘤也是如此。在MR766E-W/W/Min免疫接种的DBA/2小鼠以及MR766E-W/W/Min加上E-W/Min联合免疫接种的DBA/2小鼠中，MR766E-W/W/Min处理后肿瘤大小消失。
图20描述了在用OptiPro培养基或用MR766E-W/W/Min模拟免疫接种并植入有CCL53.1小鼠上皮黑素瘤细胞的DBA/2小鼠中，MR766E-W/W/Min处理对越线(off-side)肿瘤大小的影响。在本研究中，将1×106个CCL53.1鼠上皮黑素瘤细胞皮下注射到小鼠的右下胁腹，所述细胞通过瘤内注射MR766E-W/W/Min进行处理或者用OptiPro培养基进行模拟处理。还将未处理的2.5×105个CCL53.1细胞皮下注射到这些小鼠的左下胁腹。还测量了这些肿瘤的尺寸，以评估免疫介导的病毒溶瘤越位清除。在模拟免疫接种、模拟处理的左侧胁腹肿瘤中，其大小在处理后的10天内稳定增大。在模拟免疫接种的MR766E-W/W/Min治疗的小鼠中，左侧胁腹肿瘤大小维持，然而在MR766E-W/W/Min免疫接种的、E-W/W/Min处理的小鼠中，左侧胁腹肿瘤大勺增大了几倍，然后再次减小。通过单因素ANOVA，在两种MR766E-W/W/Min处理组中左侧胁腹肿瘤均显著小于模拟免疫接种的、模拟处理的动物(P<0.001)。
图21A-21B显示了寨卡病毒处理的动物被保护免受肿瘤再攻击。初始用稀释剂(模拟)、MR766WT病毒(WT)、MR766E-W/Min(EW)或MR766E-W/W/Min(EWW)免疫接种DBA/2小鼠。21A)在用WT或EWW处理治愈了CCL53.1肿瘤(黑素瘤)的小鼠的对侧胁腹用1×106个CCL53.1细胞再次攻击，并与空白
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对照DBA/2小鼠(n＝5；RC01-13-1、RC01-13-2、RC01-13-3、RC01-13-4、RC01-13-5)比较。对于各组，在给予肿瘤细胞后22天内评估胁腹中肿瘤的生长。Y轴为平均肿瘤大小，以mm3测量，X轴为攻击后天数(DPC)；21B)在注射后第22天拍摄每只小鼠的肿瘤。
22A-22C显示了寨卡病毒处理的动物被保护免受异种肿瘤再攻击。最初用MR766E-W/Min免疫接种DBA/2小鼠，并用MR766E-W/Min加强3次。在通过用WT或EWW处理治愈了CCL53.1肿瘤的小鼠的22A)两侧胁腹(两个胁腹汇集的肿瘤大小)用1×106个CRL 2947细胞(肾癌细胞)(n＝4)进行再次攻击；或者22B)在右侧胁腹用KLN-205细胞(肺癌症细胞)(n＝5)进行再次攻击，并与空白对照DBA/2小鼠(n＝3)比较。每个组在攻击后21天内评估胁腹中肿瘤的生长。Y轴为平均肿瘤大小，以mm3进行测量，X轴为攻击后天数(DPC)。免疫小鼠在第11天(p＝0.0064)和第21天(p＝0.0012)具有明显较小的CRL 2947肿瘤大小，因此具有“肿瘤抵抗力”。在攻击后第11天(p＝0.0179)和第14天(p＝0.0478)，KLN-205肿瘤大小也变小，其它时间点也接近显著(p＝0.0532)。22C)在注射后第21天(CRL 2947)和第17天(KLN-205)拍摄每只小鼠的肿瘤。
图23示出了示例性治疗方案。
图24描述了在接种CodaVax-H1N1M101/V6的小鼠中未观测到死亡和发病。
图25A-图25C描述了溶瘤性CodaVax-H1N1M101/V6在Balb/C小鼠中处理植入的同基因4T1TNCB细胞中的效力，在植入后第8天、第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第26天和第28天(DPI)递送8次107PFU的处理的过程中进行观测。图25A描述了在植入后的第8天、第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第26天和第28天(DPI)，在植入有4T1细胞并经模拟处理(n＝5，红色)或用107PFU CodaVax-H1N1M101/V6(n＝8，蓝色)处理的Balb/C小鼠中随时间的平均肿瘤体积(以mm3计)。图25B描述了生存率，并使用肿瘤体积≥400mm3的人道早期终点(human early end point)进行了计算。图25C描述了在植入后第8天、第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第26天和第28天(DPI)，在植入有4T1细胞并经模拟处理(n＝5，红色)或者用107PFU CodaVax-H1N1M101/V6处理(n＝8，蓝色)的Balb/C小鼠中随时间的平均肿瘤体积(以起始体积的百分比计)。
图26描述了皮下植入有CCL53.1细胞的DBA/2小鼠的处理计划。在第0天植入小鼠并在第8天、第10天、第12天、第14天和第16天用CodaVax-H1N1M101/V6处理。测量肿瘤以监测处理进展。在植入后第3天、第7天和第10天，一组模拟处理的小鼠和一组CodaVax-H1N1M101/V6处理的小鼠也还接受了0.1mg抗PD-1抗体。
图27显示了在CodaVax-H1N1接种的小鼠中未观测到死亡和发病。
图28描述了在8DPI处理开始时肿瘤大小(mm3)的比较。在CodaVax-H1N1M101/V6处理开始时，在第3天和第7天用0.1mg抗PD-1抗体处理的植入有CCL53.1细胞的小鼠的肿瘤较小(p＝0.0466，学生t检验)。
图29显示了溶瘤性CodaVax-H1N1M101/V6在DBA/2小鼠中处理植入的同基因CCL53.1黑素瘤细胞中的效力，在8、10、12、14和16DPI递送5次8×105PFU的处理的过程中进行观测。A)使用肿瘤体积≥400mm3的人道早期终点计算生存率。测量肿瘤大小并以体积(mm3)进行报告，以B)平均值±标准偏差作图。
图30显示了通过向培养基中添加100nM PMA，诱导培养的人单核细胞(THP-1)分化为巨噬细胞，用指定的病毒感染，然后在37℃、5％CO2孵育1天和3天时的效果，并通过ELISA测量上清液中的IL-1B的分泌。
图31A-图31F显示了在DBA/2小鼠中的免疫细胞活化，所述DBA/2小鼠在第0天、第14天、第28天和第42天用107FFU MR766E-W/Min免疫接种或者用病毒稀释剂进行模拟免疫接种。在第63天，经皮下途径递送，将1×106个CCL53.1黑素瘤细胞植入免疫接种的小鼠和模拟免疫接种的小鼠，并在第73天开始处理，在第73天、第75天和第77天瘤内递送107PFUMR766EW/W/Min或病毒稀释剂。在处理后第1天和第7天(第74天和第80天)收获肿瘤并将其固定在4％多聚甲醛中用于免疫组织化学和染色，以对免疫标志物进行计数并对CD4+/CD8+细胞浸润进行测量。图31A)单独用MR766E-W/W/Min处理后或在E-W/W/Min免疫接种后再进行E-W/W/Min处理后1天，植入的CCL53.1肿瘤中存在的CD45+细胞的百分比。图31B)在单独用MR766E-W/W/Min处理或在E-W/Min免疫接种后再进行E-W/W/Min处理后1天和7天，植入的CCL53.1肿瘤中存在的CD4+细胞的百分比。图31C)在处理后7天，植入的CCL53.1肿瘤中存在的CD8+细胞的百分比。图31D)在处理后1天，植入的CCL53.1肿瘤中存在的FoxP3+细胞的百分比。植入的CCL53.1黑素瘤细胞的免疫组织化学。31E)在处理后1天，在预先免疫接种MR766E-W/Min的DBA/2小鼠中，植入的CCL53.1肿瘤中CD45+细胞的浸润大大增加(通过免疫组织化学可视化)。图31F)在处理后7天，通过预先免疫接种MR766E-W/Min使得植入的CCL53.1肿瘤中CD+细胞的浸润增强，通过免疫组织化学可视化。
具体实施方式
本文中引用的所有参考文件都以引用的方式整体并入本文进行充分阐述。除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第3版，Revised,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；以及Sambrook和Russel，MolecularCloning:A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(ColdSpring Harbor,NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。
本领域技术人员将认识到可用于本发明的实践中、与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
通过去优化密码子对偏性的病毒修饰
根据本发明的方面，可独立于密码子使用来改变密码子对偏性。例如，在感兴趣的蛋白编码序列中，密码子对偏性可简单地通过其密码子的定向重排而改变。特别是，可将在亲本序列中出现的相同密码子(在宿主有机体中可具有不同的频率)用于改变的序列中，但位置不同。在最简单的形式中，因为使用了与亲本序列相同的密码子，所以在所考虑的蛋白编码区中的密码子使用保持不变(编码的氨基酸序列也是如此)。不过，某些密码子出现在新的环境，即，在所述密码子之前和/或之后为编码与亲本序列中相同的氨基酸，但采用不同的核苷酸三联体的密码子。理想地，密码子的重排导致密码子对的频率比亲本序列中的频率低。在实践中，重新排列的密码子通常会导致一个位置的密码子对频率较低，而第二个位置的频率较高。通过对密码子进行明智的重新排列，可相对于亲本序列降低编码序列给定长度上的密码子对使用偏性。或者，可重新排列密码子以产生利用在宿主中比亲本序列更频繁的密码子对的序列。
如本文所公开，通过依次考虑每个密码子对，根据在宿主的蛋白编码序列中观测到密码子对的频率对每个对进行评分，然后确定该序列的密码子对偏性，来评价密码子对偏性。应当理解，可创造具有相同密码子对偏性的许多不同序列。同时，密码子对的偏性可或多或少地改变，这取决于密码子重新排列的方式。可通过重新编码整个编码序列，或通过重新编码一个或多个子序列来改变编码序列的密码子对偏性。如本文所用，也可在编码序列的长度上评价“密码子对偏性”，即使可能对仅部分序列进行突变。因为在宿主有机体的密码子使用背景下对密码子对进行评分，密码子对偏性值可赋予给野生型病毒序列和突变病毒序列。根据本发明的方面，可通过对病毒的蛋白编码序列的全部或部分进行重新编码来修饰病毒，从而减少其密码子对偏性。
根据本发明的方面，密码子对偏性是从宿主的密码子对使用确定的量化特性。因此，对于任意给定病毒蛋白编码序列，可确定绝对密码子对偏性值。或者，可确定密码子对偏性值的相对变化，以使去优化病毒蛋白编码序列与该优化病毒蛋白编码序列所衍生自的“亲本”序列相关联。由于病毒具有多种类型(即Baltimore分类中的I型至VII型)，并且不同病毒的天然(即强毒(virulent))分离株会产生不同的绝对密码子对偏性值，密码子对偏性的相对变化通常与确定所需的减毒水平更相关。因此，本发明提供了修饰的病毒及其制造方法，其中，所述修饰的病毒包含其中的一个或多个编码蛋白的核苷酸序列的密码子对偏性因突变而降低的病毒基因组，并将这些病毒和疗法用于恶性肿瘤。在仅编码单一蛋白(即多聚蛋白)的病毒中，可将多聚蛋白的全部或部分突变至所需程度的密码子对偏性降低，并且可在重组病毒构建体中提供突变序列的全部或部分。对于单独编码多种蛋白的病毒，可同时降低所有蛋白编码序列的密码子对偏性，或仅选择一种或几种蛋白编码序列进行修饰。密码子对偏性的降低是在蛋白编码序列的长度上确定的，并且降低至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.15、或至少约0.2、或至少约0.3、或至少约0.4。根据病毒，基于宿主的密码子对使用的绝对密码子对偏性可为约-0.05以下、或约-0.1以下、或约-0.15以下、或约-0.2以下、或约-0.3以下、或约-0.4以下。
显然，密码子对偏性也可在其它序列变异上叠加。例如，编码序列可被改变以编码含有一个或多个氨基酸变化的蛋白或多肽，并且还可具有改变的密码子对偏性。同样，在一些情况下，可改组密码子以在密码子偏性降低的蛋白编码序列中完全保持与亲本蛋白编码序列相同的密码子使用谱。该程序强调了密码子对偏性改变的力量，但不需要遵守。或者，密码子选择可导致编码序列中密码子使用的总体变化。就这一点而言，应注意的是，在本文提供的某些实例中，(例如，PV-Min的设计)即使在生成密码子对偏性最小化序列的过程中密码子使用谱未变化，当将该序列的部分亚克隆到未突变的序列(例如PV-MinXY或PV-MinZ)中时，在亚克隆部分上以及在产生的杂交中的密码子使用谱将与原始未突变的蛋白编码序列的谱不匹配。然而，这些密码子使用谱的变化对密码子对偏性具有最小的影响。
类似地，应注意，独自地改变核苷酸序列以编码具有一个或多个氨基酸置换的蛋白或多肽也极不可能产生密码子对偏性显著变化的序列。因此，即使在已进一步修饰以编码突变的氨基酸序列的核苷酸序列中，可识别密码子对偏性改变。还值得注意的是，本身意在增加密码子偏性的突变对密码子对偏性的影响可能不大。例如，如本文所公开的，关于重新编码以使非优选密码子(PV-AB)的使用最大化的修饰的病毒突变体的密码子对偏性从野生型(PV-1(M))降低了约0.05(Mueller等，2006)。还值得注意的是，此类蛋白编码序列具有大大降低的序列多样性。相反，在本发明的密码子对偏性修饰的序列中保持了可观的序列多样性。而且，在不增加稀有密码子使用的情况下可获得的密码子对偏性的显著降低表明，与其使非优选密码子的使用最大化，用足够数量的优选密码子重新排列非优选密码子以更有效地降低密码子对偏性，将是有益的。
突变的程度和强度可根据编码蛋白的核酸的长度，是否可突变全部或部分以及期望的密码子对偏性降低而变化。在本发明的实施方式中，在至少约100个核苷酸、或至少约200个核苷酸、或至少约300个核苷酸、或至少约500个核苷酸、或至少约1000个核苷酸的长度上对蛋白编码序列进行修饰。
术语“亲本”病毒或“亲本”蛋白编码序列在本文中用于指代病毒基因组和蛋白编码序列，从中衍生出可有或多或少修饰的新序列。因此，亲本病毒可为“野生型”或“天然存在”的原型或分离株或变异株，或者基于真实的或认为理想的特性而专门创建或选择的突变体。
使用从头DNA合成，PV(M)的衣壳编码区(从核苷酸755到核苷酸3385的P1区)被重新设计以引入最大可能数量的很少使用的密码子对(病毒PV-Min)。转染有PV-Min突变体RNA的细胞没有被杀死，也没能回收到活病毒。将PV-Min衣壳区域的片段(PV-Min755-2470、PV-Min2470-3386)亚克隆到wt背景中，产生非常虚弱但未死亡的病毒。该结果证实了改变被替换进野生型亲本病毒基因组的密码子对去优化序列的程度来改变整个序列的密码子对偏性和病毒产物的减毒的有效性。
具有去优化的密码子对偏性的病毒被减毒。如Coleman等2008年在参考文献中所举例说明的，通过脑内注射减毒病毒，CD155tg小鼠在攻击中存活了下来，其数量比对野生型病毒的致死性高1000倍。这些发现证明了密码子对偏性去优化使病毒的致死性最小化的能力。此外，通过选择密码子对偏性去优化的程度，可在病毒的生存力与感染力降低之间取得平衡。此外，一旦确定提供所需减毒特性的密码子对偏性去优化的程度或程度的范围，则可设计额外的序列以获得该密码子对偏性的程度。例如，SEQ ID NO：1提供了具有约-0.2的密码子对偏性的修饰的病毒序列，并且突变分布在包含PV-MinY的突变部分的区域上。
序列设计算法
发明人已经开发了几种用于基因设计的算法，其针对特定的期望特性对DNA序列进行优化，同时编码给定的氨基酸序列。特别是，已经开发出用于最大化或最小化序列中期望的RNA二级结构的短发(Cohen和Skiena，2003)以及最大化地添加和/或移除指定的模式集的算法(Skiena，2001)。前一个的问题出现在设计活病毒时，而后一个出于技术原因可用于最佳地插入限制位点。还研究了可设计在交替读码框中同时编码两个或多个基因的重叠基因的程度。在单个核酸的不同读码框中编码不同功能多肽的这种特性在病毒中很常见，并且可用于技术目的，例如编造抗生素抗性基因。
已经建立了用于合成生物学的第一代设计工具，如Jayaraj等(2005)和Richardson等(2006)所述。这些主要集中于可制造性的优化设计(即没有局部二级结构和末端重复的寡核苷酸)，而不是关于生物活性对序列进行优化。这些第一代工具可被视为类似于围绕设计规则检查构建的早期VLSI CAD工具，而非支持高阶设计原理。
如本文所例证的，可使用基于计算机的算法来操纵任何编码区的密码子对偏性。该算法具有对现有密码子进行改组并评价所得CPB，然后对序列进行重新改组的能力，可任选地锁定特别“有价值”的密码子对。该算法还采用了“模拟退火”的形式，以免陷入局部极小。其它参数(例如RNA折叠的自由能)也可任选地在算法的控制下，以避免产生不希望的二级结构。该算法可用于找到密码子对偏性最小的序列，并且在这种序列不提供活病毒的情况下，可对该算法进行调整以找到具有降低的但并未最小化的偏性的序列。当然，也可仅使用计算机最小化序列的子序列来产生可行的病毒序列。
无论是否借助计算机的帮助执行，(例如)使用梯度下降、或模拟退火或其它最小化例程。重新排列起始序列中存在的密码子的程序的实例可通过以下步骤示出：
1)获得野生型病毒基因组序列。
2)选择蛋白编码序列以靶向进行修饰设计。
3)使用非编码功能锁定已知或推测的DNA区段。
4)为重新设计的蛋白中的剩余氨基酸选择期望的密码子分布。
5)对解锁的密码子位置进行随机改组，并计算密码子对分值。
6)任选地采用模拟退火程序进一步降低(或增加)密码子对分值。
7)检查所产生的设计是否有过多的二级结构和不必要的限制性位点：
a.如果有，转到步骤(5)或通过用野生型序列替换有问题的区域来修正该设计，并转到步骤(8)。
8)合成与病毒设计相对应的DNA序列。
9)创建病毒构建体并评估表达：
a.如果减毒过度，则制备亚克隆构建体并转到9；
b.如果减毒不充分，转到2。
或者，可设计一种程序，该程序允许通过选择密码子对来使每对氨基酸去优化，而不需要将密码子从蛋白编码序列中的其它地方换出。
病毒和经修饰的病毒
可通过本文公开的方法对许多病毒进行修饰以用于治疗癌症。病毒可为dsDNA病毒(例如，腺病毒(Adenoviruses)、疱疹病毒(Herpesviruses)、痘病毒(Poxviruses))、单链“正”义DNA病毒(例如细小病毒(Parvoviruses))、双链RNA病毒(例如呼肠孤病毒(Reoviruses))或单链“负”义RNA病毒(例如正粘病毒(Orthomyxoviruses)、弹状病毒(Rhabdoviruses))。在本发明的某些非限制性实施方式中，病毒为脊髓灰质炎病毒(PV)、鼻病毒(rhinovirus)、流感病毒(influenza virus)、登革热病毒(dengue fever virus)、西尼罗河病病毒(West Nile disease virus)、水痘(水痘带状疱疹病毒(varicella-zostervirus))、麻疹(副粘病毒(paramyxovirus))、腮腺炎(副粘病毒)、狂犬病(狂犬病病毒(Lyssavirus))、人乳头瘤病毒(papillomavirus)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’ssarcoma-associated herpesvirus)、单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus)(HSV 1型)或生殖器疱疹(genital herpes)(HSV 2型)。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
脊髓灰质炎是一种由脊髓灰质炎病毒感染引起的中枢神经系统疾病。脊髓灰质炎病毒是一种人肠病毒(enterovirus)，属于小核糖核酸病毒科，分为三种稳定的血清型。其为球形，大小为20nm，并且包含被包膜(由蛋白质组成)包裹着的RNA核心。其通过口腔、喉咙或消化道的粘膜传播。据报道，所有三种修饰的病毒血清型都是麻痹性脊髓灰质炎的病原体，尽管发生频率不同(1型>2型>3型)。
然而，修饰的病毒感染不一定导致脊髓灰质炎的发展。相反，大多数感染(98％–99％)导致病毒在胃肠道的局部复制，仅引起轻度症状，或完全没有症状。修饰的病毒很少侵入CNS，在CNS中其选择性地靶向脊髓前角和髓质运动神经元进行破坏。Bodian，D.，in:Diseases of the Nervous System,Minckler,J.ed.,McGraw-Hill,New York,pp.2323–2339(1972)。
修饰的病毒的异常受限的细胞向性导致独特的病理学特征。其特征为脊髓和髓质中运动神经元的丧失，引起脊髓灰质炎、松弛性麻痹的标志性临床体征。中枢神经系统的其它神经元组成部分以及胶质细胞通常逃脱感染。在电子显微镜下被感染的脑组织中，在运动神经元中观测到了严重的变化，而在神经胶质组成部分中未观测到明显的改变。可在退化的神经元或轴突旁看到正常的星形胶质细胞和少突胶质细胞，其没有感染或反应的迹象。Bodian D.，同上。不了解修饰的病毒的限制性向性。除了限制性的细胞和组织向性外，修饰的病毒仅感染灵长类和灵长类细胞培养物。其它哺乳动物保持不受影响。
在1908年修饰的病毒的分离引起了深入研究努力以了解感染的机制。早期的工作需要使用猴和黑猩猩作为动物模型。此类动物具有较长生命周期，并且非常昂贵，而且难以在研究中使用。人脊髓灰质炎病毒受体(PVR)(也称为CD155，为脊髓灰质炎病毒的细胞对接分子)的发现引起了对表达人的修饰的病毒受体的转基因小鼠的发展，作为脊髓灰质炎的新动物模型。可使用转基因小鼠研究修饰的病毒的致病性。
早期的研究努力还引起了对缺乏神经致病潜能的减毒PV毒株的开发，并很快被测试为预防脊髓灰质炎的潜在疫苗候选物。其中最有效的为A.Sabin研发的修饰的病毒，1型、2型和3型Sabin毒株。在极少数情况下，口服修饰的病毒的活减毒毒株(Sabin株)后，可观测到疫苗相关的麻痹性脊髓灰质炎。疫苗相关的麻痹性小儿麻痹症的发生与免疫后减毒的Sabin毒株的神经毒力变异体的出现有关。
为了理解本发明，理解脊髓灰质炎病毒的结构也很重要。所有小核糖核酸病毒(包括肠病毒、心病毒(cardioviruses)、鼻病毒、aphthoviruses、肝病毒(hepatovirus)和parechoviruses)均包含60个拷贝，分别包含四个多肽链：VP1、VP2、VP3和VP4。这些链是被称为成熟“启动子”的蛋白亚基的元件。启动子被定义为病毒的最小的相同亚基。还观测到了被切割为VP2和VP4的第五种蛋白VP0的痕迹。这些蛋白一起形成脊髓灰质炎病毒的外壳或外衣。
小核糖核酸病毒基因组具有单链信使活性RNA。基因组信使活性RNA的“+”链在3'末端被多聚腺苷酸化，并带有共价附于5'末端的小蛋白VPg。第一个被完全测序并克隆到DNA中的小核糖核酸病毒RNA为1型脊髓灰质炎病毒。然而，脊髓灰质炎病毒缺乏5'm7GpppG帽结构，并且RNA的有效翻译需要核糖体结合，其通过5'非翻译区(5'NTR)内部的核糖体进入位点(IRES)实现。
在图2中示意性地表示了修饰的病毒的常见组织模式，其包含5’NTR、P1、P2、P3和带有多聚腺苷酸尾巴的3’NTR。5’NTR包含6个结构域，分别指定为I、II、III、IV、V和VI。IRES包含结构域II-结构域VI。P1为结构蛋白(也称为衣壳蛋白)的编码区。P2和P3编码非结构蛋白。
在自然界中，存在三种免疫学上不同的修饰的病毒类型：血清型1、血清型2和血清型3。这些类型的区别在于它们的衣壳蛋白中与特定集的中和抗体相互作用的特定序列。在不同毒株中存在所有这三种类型，并且所有天然存在的类型和毒株都可引起脊髓灰质炎。因此，它们是神经毒性的。血清型的遗传组织和复制机制是相同的；它们的基因组的核苷酸序列的同一性>90％。而且，所有脊髓灰质炎病毒(甚至减毒的疫苗毒株)都使用相同的细胞受体(CD155)进入并感染宿主细胞；它们对人和易感转基因动物的组织表现出相同的向性。
修饰的病毒的神经致病性可通过指定为P1和P3蛋白的区域以及5’NTR内核糖体进入位点(IRES)中的突变而减弱。1型、2型和3型Sabin疫苗毒株在其IRES元件的结构域V中各自携带一个突变，这与减毒表型有关。尽管其作为疫苗有效，但Sabin毒株在脊髓灰质炎的动物模型中仍具有神经致病性。尽管发病率很低，但在疫苗中的这些毒株可能引起疾病。
实际上，每个Sabin疫苗毒株的IRES元件中的单点突变可在36小时至数天的时间内在疫苗中恢复。总体而言，与疫苗相关的急性脊髓灰质炎在美国以530000个疫苗中1个的概率发生。从免疫接种脊髓灰质炎的患者中分离出的脊髓灰质炎病毒也可在其基因组的不同位置恢复突变。
在其它实施方式中，修饰的病毒衍生自甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。在其它实施方式中，甲型流感病毒属于但不限于以下亚型：H10N7、H10N1、H10N2、H10N3、H10N4、H10N5、H10N6、H10N7、H10N8、H10N9、H11N1、H11N2、H11N3、H11N4、H11N6、H11N8、H11N9、H12N1、H12N2、H12N4、H12N5、H12N6、H12N8、H12N9、H13N2、H13N3、H13N6、H13N9、H14N5、H14N6、H15N2、H15N8、H15N9、H16N3、H1N1、H1N2、H1N3、H1N5、H1N6、H1N8、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N8、H3N9、H4N1、H4N2、H4N3、H4N4、H4N5、H4N6、H4N7、H4N8、H4N9、H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N3、H6N4、H6N5、H6N6、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N7、H7N8、H7N9、H8N2、H8N4、H8N5、H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9以及未鉴别的亚型。在多种实施方式中，修饰的病毒为如本文公开的H1N1M101/V6。在多种实施方式中，对甲型流感病毒的一个或多个区段进行重新编码(例如，去优化)。在多种实施方式中，对HA区段进行重新编码。在多种实施方式中，对NA区段进行重新编码。在多种实施方式中，对HA区段和NA区段二者进行重新编码。在多种实施方式中，重新编码的甲型流感病毒针对其它病毒具有如本文所讨论的密码子偏性或密码子对偏性降低。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。在多种实施方式中，如本文进一步讨论的，修饰的病毒为寨卡病毒种属。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)病毒家族和所有相关的属、毒株、类型和分离株，例如但不限于人腺病毒A型、B型、C型。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株，例如但不限于单纯疱疹病毒。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于痘病毒科(Poxviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于巢病毒目(Nidovirales)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于杯状病毒科(Caliciviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒属于披膜病毒科(Togaviridae)家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株。
在多种实施方式中，修饰的病毒为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中的任一个。
修饰的寨卡病毒
本发明的实施方式使用其中的病毒蛋白表达降低的减毒的寨卡病毒，其具有可用于疫苗生产的优异的生长性能，还具有非凡的安全性和增强的保护特性。减毒病毒几乎与野生型病毒一样增殖，具有高度减毒的表型(通过LD50值揭示)，通常在提供针对同一毒株的寨卡病毒攻击的保护性免疫力中非常有效，并且还针对寨卡病毒的其它毒株的攻击提供保护性免疫力。
在本发明的某些实施方式中，本发明的减毒寨卡病毒包含重新编码的前膜/包膜(E)编码区、重新编码的非结构蛋白3(NS3)编码区或者E和NS3编码区。C、NS1、NS2、NS4或NS5蛋白编码区未重新编码，并不排除那些序列中的突变和其它变异，而仅意味着在那些序列中进行的任何突变或变异对减毒的影响很小或没有影响。对减毒的影响很小或没有影响，包括以下一项或两项：1)当C、NS1、NS2、NS4或NS5编码区的变异体是测试寨卡病毒中唯一的变异体时，C、NS1、NS2、NS4或NS5编码区的突变或变异不使病毒复制或病毒感染性降低超过20％；2)C、NS1、NS2、NS4或NS5编码区中任一个的突变或变异代表该编码序列中少于10％的核苷酸。
用于本发明的寨卡病毒高度减毒。在本发明的实施方式中(与野生型相比)，与具有相同序列但由不同核苷酸序列编码的蛋白的野生型病毒相比，在AG129小鼠模型中寨卡病毒减毒至少5000倍、或减毒至少10000倍、或减毒至少20000倍、或减毒至少33000倍、或减毒至少50000倍、或减毒至少100000倍。
用于本发明的减毒的寨卡病毒还显示出大的安全裕度(即，LD50和PD50之间的差异)，因此具有高安全系数，在本文中定义为LD50/PD50的比。在本发明的某些实施方式中，安全系数为至少102、或至少103、或至少104、或至少105、或至少2×105、或至少5×105、或至少106、或至少2×106、或至少5×106。在某些实施例中，安全系数为102-103、或者103-104、或者104-105、或者105-106。
本发明的减毒病毒的E和NS3蛋白编码序列的重新编码可利用本领域已知的或新设计的用于重新编码蛋白编码序列的任何算法或程序来进行。根据本发明，在E和NS3编码序列中的多个位置进行核苷酸置换工程化，其中，所述置换将多个同义密码子引入基因组。在某些实施方式中，同义密码子置换改变基因组中的密码子偏性、密码子对偏性、不频繁的密码子或不频繁出现的密码子对的密度、RNA二级结构、CG和/或TA(或UA)二核苷酸含量、C+G含量、翻译移码位点、翻译暂停位点、microRNA识别序列的存在或不存在，或它们的任意组合。可在分布于整个E和NS3编码序列的多个位置或者限于E和NS3编码序列的部分的多个位置进行密码子置换工程化。由于涉及大量缺陷(即核苷酸置换)，本发明提供了产生稳定减毒病毒和活疫苗的方法。
如本文所讨论，在一些实施方式中，通过用在寨卡宿主(例如，人，蚊子(mosquitoes))中较不频繁使用的同义密码子置换一个或多个密码子来重新编码病毒编码序列。在一些实施方式中，通过用在寨卡病毒中较不频繁使用的同义密码子取代一个或多个密码子来重新编码病毒编码序列。在某些实施方式中，被同义密码子置换的密码子的数量为至少5个。在一些实施方式中，至少10个或至少20个密码子被置换为同义密码子。
在一些实施方式中，重新编码病毒密码子对以减少(即，降低密码子对偏性值)密码子对偏性。在某些实施方式中，密码子对偏性通过以下方式降低：识别E或NS3编码序列中具有可降低的密码子对分值的密码子对，并通过用具有更低密码子对分值的密码子对置换该密码子对来降低密码子对偏性。在一些实施方式中，这种密码子对的置换采取重新排列序列的现有密码子的形式。在一些此类实施方式中，通过重新排列同义密码子的子集来，来对密码子对的子集进行置换。在其它实施方式中，通过最大化重新排列的同义密码子的数量，来对密码子对进行置换。应当注意，虽然密码子的重新排列使得病毒编码序列的密码子对偏性整体降低(使负值更大)，并且重新排列使得许多位置的CPS降低，但在其它位置可伴随着CPS的增加，但是平均而言，修饰的序列的密码子对分值以及由此的CPB降低。在一些实施方式中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变E和NS3编码序列的G+C含量。在一些实施方式中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变E和NS3编码序列中CG和/或TA二核苷酸的频率。
在某些实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列具有小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏性。在某些实施方式中，重新编码的(即表达减少的)NS3蛋白编码序列具有小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏性。在某些实施方式中，与重新编码的HA蛋白编码序列所衍生自的亲本E蛋白编码序列相比，重新编码的HA蛋白编码序列的密码子对偏性降低了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4。在某些实施方式中，与重新编码的NS3蛋白编码序列所衍生自的亲本NS3蛋白编码序列相比，重新编码的NS3蛋白编码序列的密码子对偏性降低了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4。在某些实施方式中，E蛋白编码序列的同义密码子的重新排列提供了该E蛋白编码序列所衍生自的亲本E蛋白编码序列的至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4的密码子对偏性降低。在某些实施方式中，NS3蛋白编码序列的同义密码子的重新排列提供了该NS3蛋白编码序列所衍生自的亲本NS3蛋白编码序列的至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4的密码子对偏性降低。
通常，进行这些置换和改变并减少编码的病毒蛋白的表达，而不改变编码的蛋白的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明还包括E和/或NS3编码序列的改变，所述改变导致非同义密码子的取代和所编码的蛋白中的氨基酸置换，其可为保守的或可不为保守的。
大多数氨基酸由多于一种的密码子编码。参见表6中的遗传密码。例如，丙氨酸由GCU、GCC、GCA和GCG编码。三个氨基酸(Leu、Ser和Arg)由六种不同的密码子编码，而只有Trp和Met具有唯一的密码子。“同义”密码子为编码相同氨基酸的密码子。因此，例如，CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG为编码Leu的同义密码子。同义密码子的使用频率不相等。通常，特定有机体中最频繁使用的密码子为同源tRNA丰富的密码子，并且使用这些密码子可提高蛋白翻译的速率和/或准确性。相反，很少使用的密码子的tRNA被发现处于相对低的水平，并且稀有密码子的使用被认为降低翻译速率和/或准确性。
表6.遗传密码
Figure BDA0002550831300000421
a每个编码特定氨基酸的密码子中的第一个核苷酸显示在最左列中；第二个核苷酸显示在第一行中；第三个核苷酸显示在最右列中。
根据本发明，经E和NS3编码序列的密码子对去优化通过减少表达病毒蛋白来实现病毒减毒。减少编码序列表达的一种方式为通过密码子对偏性降低，但也可单独或组合使用其它方法。尽管可改变密码子偏性，但调节密码子对偏性特别有利。例如，通过密码子偏性使病毒减毒通常需要消除常见密码子，因此核苷酸序列的复杂性降低了。相反，可在保持更多的序列多样性的同时，实现密码子对偏性的降低或最小化，并因此更好地控制核酸二级结构、退火温度以及其它物理和生化特性。
如上所述，对蛋白编码序列(即，开放读码框)的密码子对偏性进行计算，并在Coleman等，2008中进行了描述。
可以以本领域普通技术人员众所周知的方式确认病毒减毒和诱导或保护性免疫应答，包括但不限于本文公开的方法和分析。非限制性实例包括噬斑分析、生长测量、测试动物的致死率降低，以及针对随后的野生型病毒感染的保护。
在多种实施方式中，本发明使用高度减毒的病毒。此类寨卡病毒变体包括所谓的非洲谱系和亚洲谱系中的病毒。减毒寨卡蛋白编码序列的实例包括SEQ ID No：2、SEQ IDNo：3和SEQ ID No：4。
密码子置换
在某些实施方式中，用于修饰的病毒的同义密码子置换改变基因组中的密码子偏性、密码子对偏性、去优化密码子和去优化密码子对的密度、RNA二级结构、CpG二核苷酸含量、C+G含量、翻译移码位点、翻译暂停位点、存在或不存在microRNA识别序列，或它们的任意组合。可在分布于整个基因组中的多个位置或限制在基因组的部分中的多个位置进行密码子置换工程化。
在进一步的实施方式中，基因组的部分为衣壳编码区。
在进一步的实施方式中，基因组的部分为基因组的结构蛋白编码区。
在进一步的实施方式中，基因组的部分为基因组的非结构蛋白编码区。
修饰的溶瘤病毒组成
本发明进一步提供了合成本文所述的修饰的病毒中任一种的方法，该方法包括(a)鉴别在病毒基因组的至少一个非调节部分内的多个位置的密码子，所述密码子可被同义密码子置换；(b)选择用以置换各个所鉴别出的密码子的同义密码子；以及(c)用同义密码子置换各个所鉴别出的密码子。
在本方法的某些实施方式中，步骤(a)和步骤(b)由用于合成减毒病毒工程(SAVE)的基于计算机的算法指导，该算法允许在优选界限内通过改变指定的去优化密码子分布和/或去优化密码子对分布的模式集来设计病毒基因组。本发明还提供了方法，其中，所述模式集可替代地或另外地包括：去优化密码子和去优化密码子对的密度、RNA二级结构、CpG二核苷酸含量、UpA二核苷酸含量、C+G含量、重叠编码框、限制性位点分布、移码位点、或其任意组合。
在其它实施方式中，通过从头合成包含同义密码子和/或密码子对的DNA，并用合成的DNA置换基因组的相应区域来实现步骤(c)。在进一步的实施方式中，将整个基因组置换为合成的DNA。在其它实施方式中，将基因组的部分置换为合成的DNA。在其它实施方式中，所述基因组的部分为衣壳编码区。
“受试者”是指任何动物或人工修饰的动物。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、狗、猫、兔、白鼬、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)、以及鸟类。人工修饰的动物包括但不限于具有人免疫系统的SCID小鼠和表达人脊髓灰质炎病毒受体CD155的CD155tg转基因小鼠。在优选的实施方式中，所述受试者为人。鸟类的优选实施方式为驯养的家禽物种，包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅。
在多种实施方式中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区，从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生修饰的病毒，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏性，并且所述修饰的序列的密码子对偏性降低了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2。
在多种实施方式中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域，从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生修饰的病毒，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或为至少比亲本病毒基因组高21个实例。
在多种实施方式中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域，从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生修饰的病毒，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高13个实例。
在多种实施方式中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域，从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生修饰的病毒，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加组合起来为至少比亲本高42个实例。
重组脊髓灰质炎病毒的合成
可通过众所周知的重组DNA技术合成重组的修饰病毒嵌合体。关于DNA技术的任何标准手册都提供了产生本发明的修饰的病毒嵌合体的详细方案。
修饰的病毒致病性降低的测定
在CD155tg小鼠中通过脑内注射逐渐增加剂量的病毒，对PV-Min嵌合体XY和Z以及PV-Max的神经毒力进行测试。具体而言，将分组的4-6只6-8周大的CD155tg小鼠接种不同剂量，然后观测脊髓灰质炎的发作。在平行实验中给小鼠对照组注射PV(M)-wt。注射剂量基于颗粒而不是PFU，以对插入脑的病毒粒子的量进行归一化。每天监测小鼠松弛性麻痹的发作(脊髓灰质炎的特征性症状)。用于量化病毒毒力的标准值为致死剂量50(LD50)。该值指示了百分之五十的动物存活和百分之五十死亡时的接种病毒剂量。合成的病毒PV-MinXY和PV-MinZ具有比PV(M)-wt高的LD50，因此病原性小1500倍(基于颗粒)或20倍(基于PFU)(表4)。
脊髓灰质炎病毒溶瘤性能的评估
本发明的修饰的病毒嵌合体的溶瘤性能还可如下在体内评估。通过皮下或立体定向脑内植入恶性细胞，在无胸腺小鼠中产生实验性肿瘤。在进行多种治疗方案后给予溶瘤的修饰病毒重组体的无胸腺小鼠和未处理的无胸腺小鼠中的肿瘤进展后进行临床观测和病理检查。将肿瘤植入无胸腺小鼠的技术为在Fogh,J.等中详细描述的标准程序。
药物组合物
本发明的修饰的病毒嵌合体可用于预防和治疗组合物中，以治疗多种器官(例如：乳房、结肠、支气管通道、胃肠道的衬里、上呼吸道和生殖泌尿道、肝、前列腺、脑或任何其它人体组织)中的恶性肿瘤。在多种实施方式中，本发明的修饰的病毒嵌合体可用于治疗实体瘤。在特定的实施方式中，所治疗的肿瘤为胶质母细胞瘤、腺癌、黑素瘤或神经母细胞瘤。在多种实施方式中，所治疗的肿瘤为三阴性乳腺癌。
本发明的药物组合物可进一步包含用于预防恶性肿瘤的其它疗法。例如，本发明的修饰的病毒嵌合体可与手术、放射疗法和/或化学疗法联合使用。此外，可将一种或多种修饰的病毒嵌合体与两种以上的前述治疗程序联合使用。此类的联合疗法可有利地利用较低剂量的所给予的治疗剂，从而避免了与多种单一疗法相关的可能的毒性或副作用。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种根据本发明的修饰的病毒嵌合体，以及药学上可接受的载体。“治疗有效量”意味着能够引起癌细胞裂解以引起肿瘤坏死的量。“药学上可接受的载体”意味着在对其给药的患者中不引起变态反应或其它不良作用的载体。
合适的药学上可接受的载体包括(例如)：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡聚糖、甘油、乙醇等的一种或多种，以及它们的组合。药学上可接受的载体可进一步包含少量的辅助物质(例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂)，其可延长修饰的病毒嵌合体的保质期或有效性。
本发明的组合物可为多种形式。这些包括例如液体剂型，如液体溶液、分散剂或悬浮剂、可注射溶液和可输注溶液。优选的形式取决于预期的给药方式以及预防或治疗应用。优选的组合物为可注射溶液或可输注溶液的形式。
预防性癌症治疗和治疗性癌症治疗
本发明涉及可用作溶瘤疗法以治疗不同肿瘤类型的修饰的病毒的生产，以及通过给予本文所述的修饰的病毒来治疗肿瘤和癌症的方法。
因此，本发明的多种实施方式提供了包含修饰的病毒基因组的修饰的病毒，所述修饰的病毒基因组包含在基因组的一个或多个位置进行工程化的核苷酸置换，其中，所述置换将多个同义密码子引入基因组和/或关于相同氨基酸引入现有密码子顺序的变化(改变密码子对利用率)。在这两种情况下，病毒基因产物的原始野生型氨基酸序列的98％以内都得到了保留。
大多数氨基酸由多于一个的密码子编码。参见表1中的遗传密码。例如，丙氨酸由GCU、GCC、GCA和GCG编码。三个氨基酸(Leu、Ser和Arg)由六个不同的密码子编码，而只有Trp和Met具有唯一的密码子。“同义”密码子为编码相同氨基酸的密码子。因此，例如，CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG为编码Leu的同义密码子。同义密码子的使用频率不相等。通常，特定有机体中最频繁使用的密码子为同源tRNA丰富的密码子，使用这些密码子提高蛋白翻译的速率和/或准确性。相反，很少使用的密码子的tRNA被发现处于相对低的水平，并且稀有密码子的使用被认为降低翻译速率和/或准确性。因此，用同义但不频繁使用的密码子替换核酸中的给定密码子为将“去优化的”密码子置换到核酸中。
现有癌症的治疗
本发明的多种实施方式提供了诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用的方法。在多种实施方式中，当已诊断受试者患有癌症时，可进行此种类型的治疗。所述方法包括将修饰的病毒给予有需要的受试者，其中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区域，所述修饰的病毒从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏倚，并且修饰的序列的密码子对偏性降低了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2。
本发明的多种实施方式提供了诱导对恶性肿瘤的溶瘤作用的方法，该方法包括：将修饰的病毒给予有需要的受试者，其中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域，所述修饰的病毒从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或为至少比亲本病毒基因组高21个实例。
本发明的多种实施方式提供了诱导对恶性肿瘤的溶瘤作用的方法，该方法包括：将修饰的病毒给予有需要的受试者，其中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域，所述修饰的病毒从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高13个实例。
本发明的多种实施方式提供了诱导对恶性肿瘤的溶瘤作用的方法，该方法包括：将修饰的病毒给予有需要的受试者，其中，通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域，所述修饰的病毒从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加组合起来为至少比亲本高42个实例。
还可用作初始剂量和/或加强剂量的其它减毒病毒的实例包括本文(例如，在上述“病毒和修饰的病毒”部分中)所述的病毒的科和所有相关的属、毒株、类型和分离株；以及属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株的减毒病毒；属于疱疹病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于弹状病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株的减毒病毒；属于呼肠孤病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于痘病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于披膜病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒。
在多种实施方式中，诱导对恶性肿瘤的溶瘤作用使得治疗恶性肿瘤。
在多种实施方式中，治疗进一步包括给予PD-1抑制剂。在其它实施方式中，治疗进一步包括给予PD-L1抑制剂。在其它实施方式中，治疗进一步包括给予PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂二者。
在多种实施方式中，PD-1抑制剂为抗PD1抗体。在多种实施方式中，PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。本文提供了PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的实例。
在多种实施方式中，恶性肿瘤的治疗降低了恶性肿瘤复发的可能性。其还可降低患有不同于该恶性肿瘤的第二癌症的可能性。如果受试者发展出不同于该恶性肿瘤的第二癌症，则所述恶性肿瘤的治疗使得第二癌症的生长减慢。在一些实施方式中，在恶性肿瘤缓解之后，受试者发展出不同于该恶性肿瘤的第二癌症，该恶性肿瘤的治疗使得第二癌症的生长减慢。
初免-加强治疗
本发明的多种实施方式提供了使用初免-加强型治疗方案来引发免疫应答以及诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用的方法。在多种实施方式中，引起免疫应答以及诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用使得治疗恶性肿瘤。
给予本发明的减毒病毒或修饰的病毒的初始剂量以引发初始免疫应答。此后，给予加强剂量的本发明的减毒病毒或修饰的病毒以诱导对肿瘤的溶瘤作用和/或引发包括对肿瘤的溶瘤作用的免疫应答。
在多种实施方式中，初始剂量和加强剂量包含本发明的相同的减毒病毒或修饰的病毒。在其它实施方式中，初始剂量和加强剂量是本发明的不同的减毒病毒或修饰的病毒。
在多种实施方式中，该方法包括将初始剂量的修饰的病毒给予有需要的受试者；以及将一个或多个加强剂量的修饰的病毒给予有需要的受试者，其中，初始剂量和加强剂量的修饰的病毒各自独立地选自：(1)通过密码子对去优化以外的方法产生的减毒病毒；(2)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏性，并且修饰的序列的密码子对偏性降低了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2；(3)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高21个实例；(4)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高13个实例；(5)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加组合起来为至少比亲本高42个实例；以及(6)上述的组合。
在多种实施方式中，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予初始剂量。
在多种实施方式中，瘤内、静脉内、鞘内或肿瘤内(intraneoplastically)(直接进入肿瘤)给予一个或多个加强剂量。优选的给药方式为直接至肿瘤位点。
初始剂量和加强剂量之间的时间安排可(例如)根据癌症的类型、癌症的阶段以及患者的健康而变化。在多种实施方式中，在初始剂量后约2周给予一个或多个加强剂量中的第一个。即，给予初始剂量，并且此后约两周，给予加强剂量。
在多种实施方式中，在初始剂量后约2周给予一个或多个加强剂量。在多种实施方式中，给予2个、3个、4个或5个加强剂量。在多种实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9或10周。在另外的实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。作为非限制性实例，可给予初始剂量；之后约两周，可给予第一加强剂量；第一加强剂量之后约一个月，可给予第二加强剂量；第二加强剂量之后约6个月，可给予第三加强剂量。作为另一个非限制性实例，可给予初始剂量；之后约两周，可给予第一加强剂量；第一加强剂量之后约六个月，可给予第二加强剂量；第二加强剂量之后约12个月，可给予第三加强剂量。在进一步的实施方式中，可定期地给予额外的加强剂量；例如，每年、隔年、每5年、每10年等。
在多种实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间剂量可变化。作为非限制性实例，与加强剂量相比，初始剂量可包含较少的病毒拷贝。
在其它实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间，通过密码子对去优化以外的方法产生的减毒病毒或本发明的修饰的病毒的类型可变化。在一个非限制性实例中，本发明的修饰的病毒可用于初始剂量中；而相同或不同科、属、种、组或目的减毒病毒(通过密码子对去优化以外的方法生产)可用于加强剂量中。
在其它实施方式中，通过密码子对去优化以外的方法产生的减毒病毒或本发明的修饰的病毒的类型也可用作初始剂量和加强剂量。在一个非限制性实例中，减毒病毒可用于初始剂量中，而相同或不同科、属、种、组或目的减毒病毒(通过密码子对去优化以外的方法生产)可用于加强剂量中。
还可用作初始剂量和/或加强剂量的其它减毒病毒的实例包括本文(例如，在上述“病毒和修饰的病毒”部分中)所述的病毒的科以及所有相关的属、毒株、类型和分离株；以及，属于小核糖核酸病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株的减毒病毒；属于疱疹病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于弹状病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株的减毒病毒；属于呼肠孤病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于痘病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于披膜病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒。
在其它实施方式中，给药途径可在初始剂量和加强剂量之间变化。在非限制性实例中，可皮下给予初始剂量，并且可通过注射将加强剂量给予到肿瘤中；对于难接近或难以接近的肿瘤，可静脉内给予加强剂量。
在多种实施方式中，治疗进一步包括给予PD-1抑制剂。在其它实施方式中，治疗进一步包括给予PD-L1抑制剂。在其它实施方式中，治疗进一步包括给予PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂二者。在具体的实施方式中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或两者在治疗(增强)阶段期间而不是在引发阶段期间给予。
在多种实施方式中，PD-1抑制剂为抗PD1抗体。在多种实施方式中，PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。本文提供了PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的实例。
在具有癌症之前进行初免-加强治疗
本发明的多种实施方式提供了一种方法，该方法在未具有癌症的受试者中引发免疫应答，并且如果该受试者中肿瘤或癌细胞发展以及当该受试者中肿瘤或癌细胞发展时，诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用。该方法使用初免-加强型治疗方案。在多种实施方式中，如果受试者发展为癌症以及当受试者发展为癌症时，引发免疫应答以及诱导对肿瘤或癌细胞诱导溶瘤作用使得治疗恶性肿瘤。
当受试者未具有癌症或当认为受试者未具有癌症时，给予本发明的减毒病毒或修饰的病毒的初始剂量以引发初始免疫应答。后者可归因于无法检测或未检测到的癌症。
当受试者未具有癌症或当认为受试者未具有癌症时，减毒病毒的初始剂量可为通过密码子对去优化以外的方法产生的减毒病毒，或者本发明的修饰的病毒也可用作初始剂量和加强剂量。同样，后者可归因于无法检测或未检测到的癌症。
此后，在一些实施方式中，定期给予加强剂量的本发明的减毒病毒或修饰的病毒以继续引发免疫应答。例如，可约每1年、每2年、每3年、每4年、每5年、每6年、每7年、每8年、每9年或每10年给予加强剂量。在具体的实施方式中，可约每5年给予加强剂量。
或者，在其它实施方式中，在诊断出受试者患有癌症之后，给予加强剂量的本发明的减毒病毒或修饰的病毒。例如，一旦诊断出受试者患有癌症，可在之后不久开始包括给予加强剂量的治疗方案，以诱导对肿瘤的溶瘤作用和/或引发包括对肿瘤的溶瘤作用的免疫应答。在进一步的实施方式中，可给予额外的加强剂量以继续治疗癌症。
尽管不希望受任何具体理论或设定方案的束缚，但据信初始剂量和加强剂量“教导”受试者的免疫系统识别病毒感染的细胞。因此，当受试者发展为癌症并给予加强剂量时，受试者的免疫系统识别病毒感染的细胞；这次，病毒感染的细胞为癌细胞。在针对病毒感染的癌细胞的免疫应答过程中，免疫系统也被癌症抗原引发，因此增强了抗癌免疫力，因为免疫系统还将靶向表达癌症抗原的细胞。
因此，在多种实施方式中，恶性肿瘤的治疗降低了恶性肿瘤复发的可能性。其还可降低具有不同于该恶性肿瘤的第二癌症的可能性。如果受试者发展出不同于该恶性肿瘤的第二癌症，则所述恶性肿瘤的治疗使得第二癌症的生长减慢。在一些实施方式中，在恶性肿瘤缓解之后，受试者发展出不同于该恶性肿瘤的第二癌症，则所述恶性肿瘤的治疗是的第二癌症的生长减慢。
可将初始剂量和加强剂量视为抗癌疫苗，在癌症发展时使免疫系统做好准备以靶向治疗的肿瘤细胞。
在多种实施方式中，初始剂量和加强剂量包含本发明的相同的减毒病毒或修饰的病毒。在其它实施方式中，初始剂量和加强剂量为本发明的不同的减毒病毒或修饰的病毒。
在多种实施方式中，该方法包括将初始剂量的修饰的病毒给予有需要的受试者；以及将一个或多个加强剂量的修饰的病毒给予有需要的受试者，其中，初始剂量和加强剂量的修饰的病毒各自独立地选自：(1)通过密码子对去优化以外的方法产生的减毒病毒；(2)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏性，并且修饰的序列的密码子对偏性降低了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2；(3)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高21个实例；(4)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高13个实例；(5)通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域而从野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加组合起来为至少比亲本高42个实例；以及(6)上述的组合。
在多种实施方式中，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予初始剂量。
在多种实施方式中，当给予不具有癌症的受试者或者未怀疑具有癌症的受试者时，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予一个或多个加强剂量。
在多种实施方式中，当给予诊断患有癌症的受试者时，瘤内、静脉内、鞘内或肿瘤内(直接进入肿瘤)给予一个或多个加强剂量。优选的给药方式为直接至肿瘤位点。
初始剂量和加强剂量之间的时间间隔可(例如)根据癌症的类型、癌症的阶段以及患者的健康而变化。在多种实施方式中，如果受试者未患癌症或未怀疑患有癌症，则在初始剂量后约每1年、每2年、每3年、每4年、每5年、每6年、每7年、每8年、每9年或每10年给予一个或多个加强剂量的第一个。在具体的实施方式中，可约每5年给予加强剂量。
在多种实施方式中，例如，当诊断受试者患有癌症时，在癌症诊断后给予一个或多个加强剂量。在多种实施方式中，给予2个、3个、4个或5个加强剂量。在多种实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9或10周。在另外的实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。作为非限制性实例，可给予初始剂量；之后约五年，可给予第一加强剂量；在第一加强剂量之后约一年，受试者被诊断患有癌症，并且可给予第二加强剂量；在第二加强剂量之后约2周，可给予第三加强剂量；在第三加强剂量后约2周，可给予第四加强剂量；在第四加强剂量后约1个月，可给予第五加强剂量。一旦确定癌症缓解，可给予额外的定期加强剂量；(例如)每6个月、每年、每2年、每3年、每4年或每5年。
在多种实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间剂量可变化。作为非限制性实例，与加强剂量相比，初始剂量可包含较少的病毒拷贝。
在其它实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间，通过密码子对去优化以外的方法产生的减毒病毒或本发明的修饰的病毒的类型可变化。在一个非限制性实例中，本发明的修饰的病毒可用于初始剂量中；而相同或不同科、属、种、组或目的减毒病毒(通过密码子对去优化以外的方法生产)可用于加强剂量中。
还可用作初始剂量和/或加强剂量的其它减毒病毒的实例包括本文(例如，在上述“病毒和修饰的病毒”部分中)所述的病毒的科以及所有相关的属、毒株、类型和分离株；以及，属于小核糖核酸病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株的减毒病毒；属于疱疹病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于弹状病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株、类型和分离株的减毒病毒；属于呼肠孤病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于痘病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒；属于披膜病毒科病毒家族以及所有相关的属、毒株的减毒病毒。
在其它实施方式中，给药途径可在初始剂量和加强剂量之间变化。在非限制性实例中，可皮下给予初始剂量，并且可通过注射将加强剂量给予到肿瘤中；对于难接近或难以接近的肿瘤，可静脉内给予加强剂量。
在多种实施方式中，接受这些治疗(例如，在具有癌症之前的初始剂量，或在具有癌症之前的初始剂量和加强剂量，然后在具有癌症之后的加强剂量)的受试者可为处于发展为癌症的较高风险中的受试者。此类受试者的例子包括但不限于：具有遗传倾向的受试者(例如BRCA1或BRCA2突变、TP53突变、PTEN突变、KRAS突变、c-Myc突变、美国国家癌症研究所认为是癌症易感性突变的任何突变等)、癌症的家族病史、高龄(例如40岁、45岁、55岁、65岁或更大)、高于正常的放射暴露、长时间的阳光暴露、烟草使用史(例如吸烟、咀嚼)、酗酒史、药物滥用史、体重指数>25、慢性炎性疾病史(例如，炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、哮喘、类风湿性关节炎等)、免疫抑制史、已知与癌症风险增加有关的慢性感染史(例如，丙型肝炎、乙型肝炎、EBV、CMV、HPV、HIV、HTLV-1、MCPyV、H.Pylori等)。
在多种实施方式中，接受这些治疗(例如，在具有癌症之前的初始剂量和加强剂量，然后在具有癌症之后的加强剂量)的受试者可为不列入较高风险类别的受试者，但临床医生开出了初始剂量和加强剂量的处方，作为预防未来癌症风险的措施。
在多种实施方式中，治疗进一步包括给予PD-1抑制剂。在其它实施方式中，治疗进一步包括给予PD-L1抑制剂。在其它实施方式中，治疗进一步包括给予PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂二者。在具体的实施方式中，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或两者在治疗(加强)阶段期间而不是在引发阶段期间给予。
在多种实施方式中，PD-1抑制剂为抗PD1抗体。在多种实施方式中，PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。本文提供了PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的实例。
炎症反应
给予本发明的修饰的病毒刺激IL-1B。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，本发明的修饰的病毒提供了对RIG-1、STNG、IRF3、IRF7和NFkB的刺激，其促进持续的炎性反应并部分地提供了治疗效力。
在多种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以刺激受试者中内源性IL-1B的产生。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，本发明的修饰的病毒提供了对固有免疫受体RIG-1和STNG的刺激，其刺激并促进持续的炎性反应并部分地提供了治疗效力。
在多种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以刺激受试者中内源性IL-1B产生。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，本发明的修饰的病毒提供了对固有免疫转录因子IRF3、IRF7和NFκB的刺激，其刺激并促进持续的炎性反应并部分地提供了治疗效力。
在多种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以在受试者中维持治疗有效量的IL-1B产生，以促进持续的炎性反应并部分地提供了治疗效力。
在多种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以刺激受试者中内源性1型干扰素的产生，其部分地提供了治疗效力。
在多种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以在受试者中维持治疗有效量的1型干扰素产生，其部分地提供了治疗效力。
在其他实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以在受试者中激活I型干扰素，以维持受试者的电离放射和化学疗法敏化。
在多种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以将促炎免疫细胞(包括CD45+白细胞、中性粒细胞、B细胞、CD4+T细胞和CD8+免疫细胞)募集到癌症部位，其部分地提供了治疗效力。
在多种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以从癌症部位减少抗炎免疫细胞(例如FoxP3+T调节性细胞或M2-巨噬细胞)，其部分地提供了治疗效力。
在多种实施方式中，恶性肿瘤的治疗降低了恶性肿瘤复发的可能性。其还可降低具有不同于该恶性肿瘤的第二癌症的可能性。如果受试者发展出不同于该恶性肿瘤的第二癌症，则所述恶性肿瘤的治疗使得第二癌症的生长减慢。在一些实施方式中，在恶性肿瘤缓解之后，受试者发展出不同于该恶性肿瘤的第二癌症，则所述恶性肿瘤的治疗使得第二癌症的生长减慢。
PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂
如本文所讨论可使用的抗PD1抗体的实例包括但不限于：派姆单抗、纳武单抗、pidilizumab、AMP-224、AMP-514、spartalizumab、西米普利单抗、AK105、BCD-100、BI754091、JS001、LZM009、MGA012、Sym021、TSR-042、MGD013、AK104、XmAb20717和替雷利珠单抗。
PD-1抑制剂的其它实例包括但不限于PF-06801591、表达抗PD1抗体的多能性杀伤性T淋巴细胞(PIK-PD-1)和自体抗EGFRvIII 4SCAR-IgT细胞。
抗PD-L1抗体的实例包括但不限于：BGB-A333、CK-301、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、阿特株单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、BMS-936559和CK-301。抗PD-L1抑制剂的另一实例为M7824。
给予途径
除了以上讨论的那些以外，治疗性溶瘤性修饰的病毒可瘤内、静脉内、鞘内或肿瘤内(直接进入肿瘤)递送。优选的给药方式为直接至肿瘤位点。用于治疗目的的病毒接种物可以以1μL至10μL的极小体积给予。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明的修饰的病毒嵌合体的治疗有效量可取决于：给予安排、所给予的修饰的病毒嵌合体的单位剂量、修饰的病毒嵌合体是否与其它治疗性药剂联合给予、患者的状况和健康。
溶瘤性重组病毒的治疗有效量可凭经验确定，并且取决于可安全给予的重组病毒的最大量，以及产生有效溶瘤作用的重组病毒的最小量。
溶瘤性修饰病毒的治疗性接种可重复给予，这取决于初始治疗方案的效果。如果宿主对最初给予的特定溶瘤性修饰病毒的免疫应答限制了其有效性，则可额外注射具有不同的修饰的病毒血清型的溶瘤性修饰病毒。可通过血清学容易地确定宿主对特定的修饰病毒的免疫应答。然而，将认识到，根据选择的给予方案，比上述制定剂量更低或更高的剂量。
为此，关于针对任何给定的修饰的病毒的免疫状态的血清学数据可用于做出关于使用哪种修饰的病毒变异体的知情决定。例如，如果通过对用溶瘤性病毒治疗的候选患者进行血清学分析，可明显看出其对修饰的病毒血清型1的高滴度，则应将替代的修饰病毒制剂用于肿瘤治疗。
表7.序列
Figure BDA0002550831300000581
Figure BDA0002550831300000591
Figure BDA0002550831300000601
Figure BDA0002550831300000611
Figure BDA0002550831300000621
Figure BDA0002550831300000631
Figure BDA0002550831300000641
Figure BDA0002550831300000651
Figure BDA0002550831300000661
Figure BDA0002550831300000671
Figure BDA0002550831300000681
Figure BDA0002550831300000691
Figure BDA0002550831300000701
实施例
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明，并且不应将其解释为限制本发明的范围。就提及特定材料的程度而言，其仅出于说明的目的，并不旨在限制本发明。本领域技术人员可开发等同的方法或反应物，而无需行使本发明的能力，也不会脱离本发明的范围。
实施例1
PV序列的修饰以改变相对于人密码子对偏性的密码子对分值。
我们的算法给出了脊髓灰质炎病毒1型Mahoney毒株(PV(M)-wt)的P1结构区的DNA编码序列的输入，并且对该区域的CPB进行了改制(图2)。在使用模拟退火进行改制后，我们产生了两个具有改组密码子以及由此而来的新密码子对的新片段。第一个设计为具有+0.246的正CPB的PV-Max。该正的CPB表明，PV-Max平均使用了过度表现的密码子对。第二个设计为具有-0.474的负CPB的PV-Min。该负CPB表明，PV-Min平均利用了过低表现的密码子对(图1)。PV-Min和PV-Max的前四个密码子(12个核苷酸)没有变化，并且保留与野生型脊髓灰质炎病毒密码子相同。这样做是为了使翻译可在所有购健体中均等地启动。同样，选择P1区作为合成片段替换的合适区域，因为已经证明用外源、非脊髓灰质炎衍生的序列消除或替换该区域不影响复制。P1区中对外源序列的这种耐受性强烈表明该区域内不存在复制调节元件。一个候选PV-MinY的序列(SEQ ID NO：1)为非限制性实例。
脊髓灰质炎病毒P1区的计算机修改产生了两个具有极端CPB的新序列。与PV(M)-wt相比时，PV-Max具有566个沉默突变，PV-Min具有631个沉默突变(图2)。可在图1中观察测到新P1区以及所有注释的人ORF的计算CPB分值(使用前面提到的方程)。设计的PV-Max和PV-Min分别具有+0.246和-0.474的极端CPB，其超出了自然存在的人序列的外部极限(图1)。
实施例2
密码子对去优化的脊髓灰质炎病毒的构建
对含有上述基因型或任何其它变异体的合成重组病毒的cDNA的质粒进行扩增、纯化并用限制性核酸内切酶FspI消化以线性化(该核酸内切酶在载体序列内切割)。所得的线性化cDNA(在病毒cDNA的5'插入位点之前包含DNA依赖性RNA聚合酶T7的识别基序)用于使用T7聚合酶进行体外转录，以产生全长病毒RNA。由此产生的病毒RNA用于通过硫酸葡聚糖法(Dextran-sulfate method)转染HeLa细胞，以产生感染性病毒。观测到转染的细胞的细胞病变作用的发生，表明生产性的修饰病毒感染，并使感染性病毒在HeLa细胞中繁殖、对其进行纯化并冷冻以无限期保存。
实施例3
与野生型病毒相比，修饰的病毒为减毒的，但其生长并杀死腺癌宫颈癌HeLa R19细胞。
在将五个PV-Min衍生RNA转染到HeLa R19细胞中之后，每种产物病毒传代两次以确保病毒被正确扩增，因为RNA转染不如被病毒本身自然感染有效。接下来，进行噬斑分析以阐明每种病毒的表观PFU/ml滴度(apparent PFU/ml titer)(图3)。这些亚克隆产生了具有不同程度减毒的病毒。含有P1片段X和Y的病毒各自减毒了0.8-1log10；然而，当将其加在一起时，它们产生了病毒PV-MinXY，其显著减毒了2.5个数量级。病毒PV-MinZ也像PV-MinXY一样减毒了2.5log10左右。因此，当将Y片段返回PV-MinZ时，构建体PV-YZ不能产生可生存的病毒(图3)。因此，这些不同程度的减毒归因于明显的累加效应。因此，可得出结论，全长PV-Min构建体的无效表型(null phenotype)归因于三个不同子区域中缺陷的总和。
HeLa R19细胞为具有低或不存在p53基因表达并且通过免疫过氧化物酶染色对角蛋白呈阳性的腺癌宫颈癌细胞。
实施例4
CpG和UpA二核苷酸的频率在修饰序列中增加。
提供对CPB的进一步描述的另一重要观测结果表明，密码子对之间的N3-N1核苷酸(即密码子A的最后一个核苷酸和密码子B的第一个核苷酸)实际上对CPB具有最大的影响，并因此强烈影响配对。具体而言，避免在N3具有C且在N1具有G的密码子对(称为CpG或CG3-1)，或者使其强烈低度表现。实际上，该二核苷酸在密码子中也同样被抑制(CG12、CG23)，并且不确定为什么要避免该二核苷酸。在单个密码子内或密码子之间的CpG二核苷酸可影响翻译，由于基因组力量(genomicforce)而受到抑制；或者CpG的存在用于在真核生物中区分自身和非自身。重要的是要注意，最稀有的单个密码子也包含内部CG(即CG1-2和CG2-3)，表明出于某种目的积极地避免这种二核苷酸。
第一个假设为CpG影响翻译，首先是因为稀有密码子包含它(即CG1-2和CG2-3)，并且还由于对应于CG3-1二核苷酸的不相容tRNA。具体而言，该核苷酸对的高堆积能用于妨碍移动的核糖体。另一组认为，由于哺乳动物基因组中DNA甲基化的间接结果，CpG二核苷酸在基因中受到抑制；然而，CpG仍出现在mRNA中，因此不太可能成为甲基化的靶标。最后，众所周知，含CpG的DNA和含CpG的单链RNA是免疫刺激剂，因此，真核有机体自身基因中CpG的过低表现可能是防止细胞自身基因刺激固有应答的自身反应的一种手段。CpG用作自我和非自我识别手段的想法有一些支持性的观测结果。首先，含有CpG(即CG1-2和CG2-3)的密码子本身是稀有密码子，并且在它们交界处带有CpG(CG3-1)的密码子对低度表现。同时，病毒(特别是感染真核生物的小RNA病毒)也会抑制其基因组中的CpG，这可能是因为它们已经进化为降低其CpG含量，从而避免了固有免疫识别和应答触发。最后，已经发现含有CpG的单链RNA可刺激单核细胞。密码子-密码子连接处核酸组成的影响的所有这些观测结果仅用于进一步定义CPB；然而，这些观察结果未能阐明CPB的生物学作用。
实施例5
通过密码子对偏性的修饰和CpG或UpA增加降低蛋白表达。
如图4所示，通过修饰密码子对偏性来降低蛋白表达。
表3.PV-WT和PV-MinY中的CpG和UpA增加。
二核苷酸 PV-WT PV-MinY 增加
CpG 176 218 +41
UpA 366 392 +26
实施例6
通过修饰体内减毒
通过逐渐增加剂量的病毒的脑内注射在CD155tg小鼠中测试了PV-Min嵌合体XY和Z以及PV-Max的神经毒力。具体而言，使分组的4-6只6-8周大的CD155tg小鼠接种不同剂量，然后观测脊髓灰质炎的发作。在平行实验中给小鼠对照组注射PV(M)-wt。注射剂量基于颗粒而不是PFU，以对插入脑的病毒粒子的量进行归一化。每天监测小鼠松弛性麻痹的发作(脊髓灰质炎的特征性症状)。用于量化病毒毒力的标准值为致死剂量50(LD50)。该值指示了百分之五十的动物存活和百分之五十死亡时的接种病毒剂量。合成病毒PV-MinXY和PV-MinZ具有比PV(M)-wt高的LD50，因此病原性小1500倍(基于颗粒)或20倍(基于PFU)(表3)。
表4：通过脑内(i.c.)注射计算的野生型脊髓灰质炎病毒和修饰的病毒的LD50。
Figure BDA0002550831300000741
实施例7
嵌合脊髓灰质炎病毒对星形细胞瘤的体内溶瘤
使用星形细胞瘤细胞系HTB-14(从ATCC获得)，通过将106个细胞皮下植入TaconicFarms NCR裸鼠中来建立恶性胶质瘤。在肿瘤达到0.2cm3大小后，在第0天、第3天和第5天用2×107PFU的PV-MinY、WT PVM或稀释剂以100μL的体积对小鼠进行处理或模拟处理。PV-MinY和PVM在预防裸鼠中肿瘤生长方面有效(图5和图6)。
HTB-14细胞，也称为U-87MG细胞，为恶性胶质母细胞瘤细胞，其为亚二倍体人癌细胞系。
实施例8
肺癌细胞的溶瘤作用
我们将肺癌细胞系A549(ATCC CCL-185)用作我们的溶瘤候选物PV-MinY的模型，用PV-MinY以1.0的MOI感染A549细胞。使A549细胞在DMEM+10％FBS中生长。在室温下震荡1小时后，用1e+6PFU PV-MinY感染90％汇合的细胞，移去接种物，并替换为DMEM+2％FBS。将感染的细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养。如图7所示，与未感染的肺癌细胞相比，PV-MinY可在感染后36小时内溶解大多数细胞，并在感染后72小时内溶解所有细胞。
A549细胞为亚三倍体(在40％的细胞中染色体计数为64、65或66)人肺上皮癌细胞系(Giard等，1973)。染色体N2和N6为每细胞单个拷贝；N12和N17通常有4个拷贝。通过免疫过氧化物酶染色，A549细胞呈角蛋白阳性。A549表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的同工酶G6PD-B。
实施例9
在组织培养物中E、NS3和E-NS3密码子对偏性降低的寨卡病毒的构建和表征。
为了实现寨卡病毒毒株PRVABC59和MR766的减毒，根据计算机算法和化学合成，降低了病毒基因中prM/E和NS3基因的密码子对偏性(引入低度表现的密码子对)，以降低病毒基因的表达水平(图8)。
实施例10
利用SAVE平台的灵活性来创建第二代寨卡病毒候选疫苗
为了微调减毒和免疫原性，使用SAVE平台构建了第二代寨卡病毒疫苗候选物(图9)。根据E-Min设计(图8)，新疫苗候选物包含较小比例的去优化序列，从2014个碱基对(E-Min)降低到997个碱基对(EW/Min)或664个碱基对(E-W/W/Min)，其余恢复为野生型序列。作为非限制性实例，本文提供了三种候选物MR766E-Min(SEQ ID NO：2)、E-W/Min(SEQ ID NO：3)和E-W/W/Min(SEQ ID NO：4)的序列。
实施例11
人神经元细胞系中降低的密码子对偏性变异体的神经减毒。
与较老的ZIKV毒株(如MR766)不同，当前的ZIKV毒株引起神经系统疾病，如小头畸形和Guillain-Barre综合征。因此，根据我们前期与FDA的pre-IND会议，任何减毒的寨卡活疫苗都需要在体外证明在人神经元细胞中的神经减毒，并在非人灵长类动物中体内证明神经减毒(建议的II期工作)。为了开始我们的主要候选物的临床前开发，我们感染了两种良好表征的人神经元细胞系HTB-14(也称为U-87)和HTB-15(也称为U-118)，它们先前已用于表征正在发展的人脑中的寨卡病毒细胞向性，以及测试潜在的抗寨卡病毒抑制剂。我们感染了人神经元细胞HTB-14和HTB-15，并在4天后对峰滴度进行了量化。我们观测到，在人的HTB-14细胞中，MR766E-Min减毒了近4Log10，并且在人HTB-15细胞中，在两个独立的实验中未检测到生长，或者在一个实验中处于检测限(100PFU/ml)，也代表了体外神经减毒接近4Log10水平(数据未示出)。
实施例12
在PRVABC59或MR766衍生的E-Min感染的细胞中蛋白质水平降低。
取自ZIKV感染细胞的全细胞裂解物的蛋白质印迹用于比较不同PRVABC59和MR766变异体之间的蛋白表达水平。对于病毒感染，使Vero细胞在37℃下在OptiPRO培养基中生长直至90％汇合。将包括合成野生型和去优化的(E-Min)MR766和PRVABC59的寨卡病毒稀释至MOI为0.5，然后添加到细胞中。将细胞在室温振荡15分钟，然后在33℃孵育2小时。接下来，除去接种物，并将感染的细胞在33℃下在OptiPRO培养基中继续培养24小时。
对于24小时孵育后全细胞裂解物制备，将细胞用冷PBS短暂冲洗，然后用RIPA缓冲液(150mM NaCl、5mM b-巯基乙醇、1％NP-40、0.1％十二烷基硫酸钠、50mM Tris-HCl，pH8.0)在冰上裂解。收集全细胞裂解物，将其与6×具有b-巯基乙醇的Laemmli缓冲液直接混合，煮沸并分装保存。
对于蛋白质印迹，通过SDS-PAGE对来自每个样品的等体积的WCL进行分级分离，并转移至硝酸纤维素膜上。将膜用处于PBS中的5％小牛血清(BCS)在室温下封闭1小时，然后与抗登革2型包膜(E)蛋白4G2的小鼠单克隆抗体在4℃孵育过夜，用PBS-吐温洗涤3次，随后与HRP缀合的抗小鼠二抗在5％BCS中于室温孵育1小时。将膜洗涤三次，并使用Pierce 1-Step Ultra TMB印迹溶液使蛋白可视化。
发现与野生型相比，ZIKV的PRVABC59和MR766毒株的E-Min变异体中的包膜糖蛋白水平降低(图10)。
实施例13
AG129小鼠中的减毒
如上所述，AG129成年小鼠模型正在被黄病毒疫苗和治疗剂的研究接受。我们使用AG129小鼠来测试：1)剂量为102的每种合成的衍生的野生型病毒MR766和PR15病毒(阳性对照)；2)两剂(104和102PFU)疫苗候选物PR15E-Min或MR766E-Min和NS3-Min；以及3)单剂104的疫苗候选物PR15-NS3/E-Min。在这项研究中，我们检测了减毒、效力和免疫原性。将动物随机分为5只动物的组。各组感染了多种减毒病毒和合成的野生型病毒。在第0天和第28天进行两轮免疫接种以对小鼠进行免疫接种。为了测量减毒，在免疫接种后测量生存率和体重(图11)。
在整个实验过程中每天收集生存率、体重和临床体征数据。与合成的野生型病毒相比，SAVE去优化的PR15和MR766毒株高度减毒，仅MR766NS3-Min以104的剂量诱导40％的小鼠死亡。因此，所有其它毒株减毒了至少500倍。感染有102PFU的合成的野生型PR15或MR766ZIKV的小鼠在死亡前经历了体重急剧下降，类似于“天然”野生型ZIKV所观测到的模式。感染有104PFU候选物MR766E-Min的小鼠没有出现显著的体重减轻或死亡率(图12)。
在动物模型中检查了PRVABC59E-Min和E-Min/NS3-Min变异体以及MR766E-Min和NS3-Min的生长表型和发病机理。五只AG129小鼠的组在皮下接受102或104PFU剂量的每种病毒，并连续监测p.i 28天的动物体重和生存率。监测发病率和死亡率(体重减轻、活动减少、死亡)。通过Reed和Muench的方法(Reed，L.J.；Muench，H.，1938，The American Journal ofHygiene 27：493-497)计算野生型病毒和疫苗候选物的致死剂量50(LD50)。值得注意的是，PRVABC59和MR766的E-Min变异体以及PRVABC59E-Min/NS3-Min病毒在剂量高达104PFU后没有引起明显的疾病，无死亡并且体重减轻最小。因此，E-Min变异体的理论LD50被计算为等于或大于3.16×104PFU，比wt PRVABC59或MR766高出至少1000(表5)。计算得出MR766NS3-Min病毒的LD50≤42。
表5.减毒病毒的LD50和PD50
病毒 LD50 PD50
WT MR766 &lt;3.16x10<sup>1</sup> NA
MR766E-Min &gt;3.16×10<sup>4</sup> 6.81x10<sup>1</sup>
MR766NS3-Min &lt;4.20×10<sup>1</sup> &lt;6.81x10<sup>3</sup>
WT PRVABC59 &lt;3.16x10<sup>1</sup> NA
PRVABC59E-Min 3.16×10<sup>4</sup> 1.47x10<sup>2</sup>
PRVABC59E/NS3-Min 3.16×10<sup>4</sup> &lt;6.81x10<sup>3</sup>
实施例14
AG129小鼠中的免疫原性
疫苗候选物应能够以低剂量提供长期保护，使其免受致死剂量(等于每动物102.3细胞-培养物感染剂量(CCID50))的野生型病毒的攻击。尽管E-Min变异体在细胞培养物中和AG129小鼠中高度减毒，但在仅用68PFU(MR766E-Min)或147PFU(PRVABC59E-Min)攻击后，成功预防AG129小鼠的死亡。我们从减毒研究中测试了每只幸存小鼠的疫苗效力。首先，在第28天通过颞浅静脉从幸存者收获血清，并在第28天第二次用相同的疫苗剂量对动物进行加强。也在第49天(加强后21天)收集血清。使用免疫接种后第14天、第28天和第49天收集的血清的50％噬斑减少中和滴度(PRNT50)分析对来自这些动物的中和抗体进行量化。从1/10稀释度开始，对测试血清进行了一半连续稀释。然后将稀释液与102.4PFU的ZIKV毒株PuertoRico 2015PRVABC-59(PR15)1：1混合。然后将病毒-血清混合物添加到具有Vero 76细胞的12孔组织培养板的各个孔中。将导致来自病毒对照的平均噬斑减少≥50％的测试血清稀释度的倒数记录为PRNT50值。在第28天以及仅进行一次免疫接种后，MR766E-Min能够在所有动物中针对当前PR15毒株产生稳健的抗体应答(图12)。同样，PR15E-Min在单次免疫接种后也提供了稳健的抗体应答。
实施例15
在非人灵长类动物中的效力
食蟹猕猴(CM)通常用作评价黄病毒感染(包括黄热病、登革热、西尼罗河病毒和ZIKV)的模型。ZIKV分离株也已从天然感染的食蟹猕猴中提取。先前的工作表明，尽管CM的实验性ZIKV感染不太可能产生临床疾病，但ZIKV可复制并存在于血液、尿液和其它组织中。在Southern Research进行的一项非GLP研究中，我们评价了天然CM中减毒寨卡病毒(ZIKV)活疫苗候选物的效力。总共十五(15)只(雄性10只和雌性5只)ZIKV血清阴性的CM随机分为五(5)个治疗组。使用初免-加强方案(第0天和第28天)对组1-组4的CM进行免疫接种，其通过皮下(SC)注射500μL体积的107或105PFU剂量的减毒病毒(MR766E-W/W/Min)。分配至模拟对照组(组5)的CM通过SC注射接受PBS。在第14天、第21天、第28天、第50天和第61天通过转化灶降低中和测试(FRNT)评估了疫苗诱导的抗ZIKV中和抗体(Nab)的存在。与单剂量后的NIH灭活疫苗相比，MR766E-W/W/Min免疫接种猕猴的FRNT值高2-4倍(图13)。在第28天加强后，W-W-E-Min免疫接种的猕猴的FRNT值没有增加，表明疫苗诱导了灭菌免疫力，从而阻止了加强病毒的进一步感染。免疫接种后第14天，所有免疫接种E-W/W/Min的动物均已血清转化。该数据表明，相对低剂量的E-W/W/Min可能足以触发高水平(≥1028FRNT50)。
实施例16
免疫活性小鼠中的溶瘤效力
首先对DBA/2小鼠(4-6周龄)免疫接种MR766E-W/W/Min、MR766E-W/Min(剂量为1×107PFU)或模拟注射OptiPro培养基，以50μL的体积经背部皮下递送至颈椎脊柱。在第0天、第14天、第26天、第71天和第85天对小鼠免疫接种5次(图14)。在这些天收集血清样品，以通过噬斑减少中和测试50％(PRNT50)来确定针对寨卡病毒的中和抗体的发展。在第97天(最终免疫接种后第11天)，将CCL53.1上皮黑素瘤细胞(DBA小鼠背景)植入已免疫接种的小鼠或模拟免疫接种的小鼠中。通过将1×106CCL53.1细胞皮下注射入所有动物的右下胁腹进行植入。也有一些以2.5×105CCL53.1细胞皮下注射到左下胁腹(图20)。
仅在第103天(肿瘤植入后第10天)通过直接注射到右侧胁腹肿瘤中，对植入的小鼠用1×107PFU MR766E-W/W/Min、MR766WT进行处理，或者进行模拟处理(图15)。仅对右侧胁腹肿瘤进行治疗，以观测未处理肿瘤的免疫介导溶瘤作用。在第105天(肿瘤植入后12天)和第107天(肿瘤植入后14天)，重复相同的处理两次。在治疗后10天内(第107天-第117天)每天监测小鼠的体重和肿瘤大小，然后每隔一天监测，直到处理后20天(118-127)。用MR766E-W/W/Min处理可观测到肿瘤大小显著减少(图15)。模拟免疫：模拟处理的DBA/2小鼠肿瘤在整个10天内稳定增长(图16-图19)。MR766WT和MR766E-W/W/Min处理在预先用MR766E-W/W/Min免疫的小鼠中有效地减少平均肿瘤体积(图18)。在免疫接种的小鼠中，MR766WT和MR766E-W/W/Min处理的肿瘤大小均缩小，但在免疫的小鼠中，MR766E-W/W/Min处理出乎意料地优于MR766WT处理(图17)。模拟免疫接种的小鼠中MR766WT处理的肿瘤没有改善并稳定增长。在用E-W/W/Min免疫接种的DBA/2小鼠中，MR766WT处理在第10天时有效地大幅减小肿瘤大小(图18)。在模拟免疫接种小鼠中MR766E-W/W/Min的肿瘤处理未成功，然而，在MR766E-W/W/Min以及MR766E-W/W/Min加上E-W/Min免疫接种的DBA/2小鼠中，MR766E-W/W/Min处理后肿瘤大小消除(图19)。这些实验表明，预免疫在寨卡病毒成功溶瘤治疗黑素瘤中起着至关重要的作用，而仅来自病毒复制的肿瘤破坏是不可能的。
在模拟免疫接种、模拟处理的左侧胁腹肿瘤中，在处理后的整个10天中，大小稳定增长。在模拟免疫接种、MR766E-W/W/Min处理的小鼠中左侧胁腹肿瘤大小保持不变，但在用MR766E-W/W/Min免疫接种、E-W/W/Min处理的小鼠中，左胁腹肿瘤大小增加了几倍，然后再次减小。通过单因素ANOVA，两个MR766E-W/W/Min处理组的左侧胁腹肿瘤均显著小于模拟免疫接种、模拟处理的动物(p<0.001；图20)。这些实验提供了有力的证据表明，在小动物模型中，MR766E-W/W/Min的溶瘤治疗可成功地控制整个体内的肿瘤生长，而不仅仅是在治疗部位。
实施例17
Codavax-H1N1治疗使用在Balb/C小鼠中植入的同基因4t1细胞的三阴性乳腺癌
与猪中的野生型A型流感病毒A/CA/04/2009相比，CodaVax-H1N1显著减毒，通过105剂量在不存在微观肺部病变下测量(2)，并在I期临床试验中是安全的。在这项研究中，我们试图测试使用CodaVax-H1N1作为溶瘤剂的可能性。在该试验性实验(pilotexperiment)中，我们选择使用在MDCK细胞中传代101次并在Vero细胞中传代6次的CodaVax-H1N1。
为了该研究目的，最初向Balb/C小鼠(n＝8)植入105个4T1乳腺肿瘤细胞(ATCCCRL-2539)，并在植入后8天(DPI)通过注射100μL含107PFU的CodaVax-H1N1M101/V6开始处理。在10、12、14、16、26和28DPI再次对肿瘤进行注射。用疫苗稀释剂(0.2％BSA MEM)处理模拟对照小鼠(n＝5)。对于死亡率，使用了≥20％体重减轻或肿瘤生长>400mm3的早期人道终点。样本量基于先前实验中观测到的肿瘤大小的标准偏差，并使用GraphPad Statmate 2进行选择以实现足够的统计功效(0.80)。
小鼠植入方案：动物模型：小家鼠(Mus musculus)；小鼠品系：Balb/C(Taconic)；年龄：8-9周龄(雌性)；细胞培养基：RPMI-1640；细胞浓度：1×105/0.1mL(4T1)。
最初，将4T1细胞重悬于RPMI-1640中至浓度为1×105/0.1mL。将Balb/C小鼠右侧胁腹备皮，并皮下注射0.1mL，观测直到肿瘤大小为～40mm3(第8天)。
肿瘤治疗方案：动物模型：小家鼠；小鼠品系：Balb/C(Taconic)；年龄：8-9周龄(雌性)；病毒培养基：0.2％BSA MEM；病毒浓度：1×107/0.1mL(CodaVax-H1N1M101/V6)
在植入后第8天、第10天、第12天、第14天、第16天、第26天和第28天，通过直接注射0.1mL含CodaVax-H1N1M101/V6培养基或病毒培养基(作为对照)对肿瘤进行处理。
在用CodaVax-H1N1M101/V6处理或模拟注射的Balb/C小鼠中，未检测到显著的体重减轻，也没有任何接种的小鼠因流感感染而达到安乐死的早期时间点(图25A-图25C)。
到21DPI时，由于肿瘤体积≥400mm3，所有模拟注射的对照小鼠均达到早期人道终点(图25A-图25C)。相反，在用CodaVax-H1N1M101/V6处理的小鼠中，肿瘤生长减慢且35天生存期增加。使用行平均值的多重t检验(Holm-Sidak方法)，在植入后第11天(p＝0.0066)、第13天(p＝0.0097)、第15天(p＝0.0048)、第16天(p＝0004)、第17天(p＝0.0011)、第19天(p＝0.0004)和第21天(p＝0.0099)观察到肿瘤尺寸显著减小。使用对数秩Mantel-Cox(p＝0.0052)和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验(p＝0.0138)的生存曲线分析表明，至35DPI，处理小鼠的生存率显著提高。
可使用4T1细胞植入在Balb/C小鼠中很好地构建TNBC，并且在本研究中已显示对CodaVax-H1N1M101/V6的处理敏感。尽管对于5/8的小鼠，肿瘤大小是静止的或减小，但处理对2只小鼠无效，但完全清除了1只小鼠的可见肿瘤。该数据是有希望的，并且改变给予剂量或频率可证明更为成功。重要的是，无需预先免疫即可引发甲型流感病毒的溶瘤活性。
实施例18
连续瘤内注射CodaVax-H1N1对植入DBA/2小鼠的CCL53.1细胞的处理
与猪中的野生型甲型流感病毒A/CA/04/2009相比，CodaVax-H1N1显著减毒，通过以105剂量在不存在微观肺部病变的情况下测量(1)，并且在I期临床试验中是安全的。在这项研究中，我们试图测试使用CodaVax-H1N1作为溶瘤剂的可能性。在该试验性实验中，我们选择使用从主要种子储备CodaVax-H1N1M101/V6传代而来的CodaVax-H1N1。
为了该研究目的，最初向DBA/2小鼠(n＝7，8)植入105个克隆M3、Cloudman S-91黑素瘤肿瘤细胞(ATCC CCL-53.1)，并在植入后8天(DPI)通过注射100μL含模拟稀释剂或8×105PFU的CodaVax-H1N1开始进行处理(图26)。还在植入后第3天、第7天和第10天用模拟稀释剂或0.1mg抗小鼠PD-1抗体对小鼠进行i.p.注射。在10、12、14和16DPI再次对肿瘤进行注射。用疫苗稀释剂(0.2％BSA MEM)对模拟对照小鼠(n＝5)进行处理。对于死亡率，使用≥20％体重减轻或肿瘤生长>400mm3的早期人道终点。样本量基于先前实验中观测到的肿瘤大小的标准偏差，并使用GraphPad Statmate 2进行选择以实现足够的统计功效(0.80)。
实验程序：
小鼠植入方案：动物模型：小家鼠；小鼠品系：DBA/2(Taconic)；年龄：8-9周龄(雌性)；细胞培养基：F-12K培养基；细胞浓度：1×105/0.1mL(CCL53.1)。
最初，将CCL53.1细胞重悬于F12-K培养基中至浓度为1×105/0.1mL。将DBA/2小鼠左侧胁腹备皮，皮下注射0.1mL，进行观测直到肿瘤大小为～100mm3(第8天)。
肿瘤治疗方案：动物模型：小家鼠；小鼠品系：DBA/2(Taconic)；年龄：8-9周龄(雌性)；病毒培养基：0.2％BSA MEM；病毒浓度：8×105/0.1mL(CodaVax-H1N1P7)
在植入后第8天、第10天、第12天、第14天和第16天，通过直接注射0.1mL含CodaVax-H1N1培养基或病毒培养基(作为对照)对肿瘤进行处理。
在用CodaVax-H1N1处理的DBA/2小鼠或模拟注射的DBA/2小鼠中未检测到显著的体重减轻，也没有任何接种的小鼠由于流感感染而达到安乐死的早期时间点(图27)。有趣的是，单独注射抗PD-1抗体的小鼠体重增加不及包括PD-1/CodaVax-H1N1处理组在内的其它组。
当在8DPI对抗PD-1抗体处理(n＝14)的小鼠或用抗体稀释剂模拟处理(n＝15)(第3天和第7天)的小鼠的肿瘤大小数据进行汇总时，发现肿瘤大小在处理组中有轻微但显著的下降(图28；p＝0.0466；学生t检验)。
到14DPI，由于肿瘤体积≥400mm3，所有模拟注射的对照小鼠均达到早期人道终点(图29)。相反，在CodaVax-H1N1处理的小鼠、PD-1抗体处理的小鼠中，肿瘤生长较慢，并且34天生存期增加，并且联合疗法的生存期显著改善(p＝0.0008，Gehan-Breslow-Wilcoxon检验)。使用行平均数的多重t检验(Holm-Sidak方法)，在植入后第11天(p＝0.0066)、第13天(p＝0.0097)、第15天(p＝0.0048)、第16天(p＝0004)、第17天(p＝0.0011)、第19天(p＝0.0004)和第21天(p＝0.0099)观测到肿瘤大小显著减小。使用对数秩Mantel-Cox(p＝0.1218)和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验(p＝0.1137)的生存曲线分析表明，单独用PD-1抗体处理或者与CodaVax-H1N1lh联合处理的小鼠之间的存活率接近显著提高。PD-1抗体处理的小鼠和CodaVax-H1N1处理的小鼠之间的生存曲线高度相似(p>0.9999，Gehan-Breslow-Wilcoxon检验)。
可使用CCL53.1细胞植入在DBA/2小鼠中很好地构建黑素瘤模型(2)，并且在该研究中已经显示出其对单独用CodaVax-H1N1或PD-1抗体的治疗有些敏感。该数据是有希望的，并且改变给予剂量或频率可证明更为成功。重要的是，无需预先免疫即可引发甲型流感病毒的溶瘤活性，并且与PD-1疗法联合使用更有效。
实施例19
修饰的病毒刺激IL-1B
如图30所示，通过向培养基中添加100nM PMA并在37℃、5％CO2下孵育3天，诱导培养的人单核细胞(THP-1)分化为巨噬细胞。以350000个细胞/孔的密度粘附到12孔板的各个孔中后，将培养基替换为新鲜的温暖培养基(10％FBS RPMI-1640)，并以在250μL体积MOI为5.0(1.75×106FFU)感染细胞。将细胞在室温下振荡30分钟，然后再添加250μL培养基，并将培养板在37℃、5％CO2下孵育2小时，然后移除病毒接种物，并将培养基替换为温暖的培养基。感染后第1天和第3天，收集上清液样品，在-80℃下冷冻，并使用定量试剂盒(ThermoFisher Catalog#BMS224-2)进行人IL-1βELISA检测。IL-1β被选为由活化的巨噬细胞产生的白介素1细胞因子家族的成员，是炎性反应的重要介体。维甲酸诱导基因1(RIG-I)识别病毒RNA，随后诱导NFκB-IRF3信号转导，从而激活IL-1β的产生。众所周知，RIG-I的激活诱导STING表达，并通过正反馈机制促进持续的炎性反应。
实施例20
募集免疫细胞至肿瘤
如图31所示，在接受植入并在第0天、第14天、第28天和第42天免疫接种107FFUMR766E-W/Min或用病毒稀释剂模拟免疫接种的DBA/2小鼠中，对免疫细胞的活化进行分析。在第63天，将经皮下途径递送的1×106个CCL53.1黑素瘤细胞植入免疫接种的小鼠和模拟免疫接种的小鼠，并在第73天开始处理，在第73天、第75天和第77天瘤内递送107PFUMR766E-W/W/Min或病毒稀释剂。在处理后第1天和第7天(第74天和第80天)收获肿瘤并将其固定在4％多聚甲醛中用于免疫组织化学和染色，以对免疫标志物进行计数，并测量CD4+、CD8+、CD45+和FoxP+细胞浸润。如通过免疫组织化学可视化的，处理后7天MR766E-W/Min预先免疫接种增强了植入的CCL53.1肿瘤中的CD8+细胞浸润。如通过免疫组织化学可视化的，在预先MR766E-W/Min免疫接种的DBA/2小鼠中，植入的CCL53.1肿瘤中CD45+细胞的浸润在处理后1天大大增加。FoxP3+细胞在治疗的肿瘤中减少。
以上在详细描述中对本发明的多种实施方式进行了描述。尽管这些描述直接描述了以上实施例，但是应当理解，本领域技术人员可想到本文示出和描述的特定实施例的修改和/或变化。落入本说明书范围内的任何此类的修改或变化也意图包括在本文中。除非特别指出，否则发明人的意图是将说明书和权利要求书中的词语和短语赋予适用领域的普通技术人员普通和习惯的含义。
已经给出了申请人在提交申请时了解的本发明的多种实施方式的前述描述，并且其旨在为了说明和描述的目的。本说明书不意在详尽无遗，也不意在将本发明限于所公开的精确形式，并且根据上述教导，许多修改和变化是可能的。所描述的实施方式用来解释本发明的原理及其实际应用，并用来使本领域其他技术人员能够按多种实施方式及适合于所预期的特定用途的多种修改来利用本发明。因此，并不意在将本发明限制至所公开的用于实施本发明的特定实施方式。
虽然已经示出和描述本发明的特定实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，根据本文中的教导，在不背离本发明及其较宽泛的方面的情况下可以作出改变和修改，并且因此，所附权利要求书将在它们的范围内涵盖所有此类落在本发明的真正精神和范围内的改变和修改。本领域技术人员将理解，一般而言，本文使用的术语一般旨在作为“开放的”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”；术语“具有”应解释为“具有至少”；术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。
如本文中所使用的，术语“包括”用于指对实施方式有用的组合物、方法及它们各自的组成部分，但对于未指定的要素(有用或非有用的)的开放。本领域技术人员将理解，一般而言，本文中使用的术语通常旨在作为“开放的”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”；术语“具有”应解释为“具有至少”；术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。尽管在本文中使用开放式术语“包括”作为诸如包括、包含或具有的术语的同义词来描述和要求保护本发明，但是本发明或其实施方式可以可替代地使用诸如“由...组成”或“基本上由...组成”的替代术语来进行描述。
序列表
<110> CODAGENIX INC.
COLEMAN, John Robert
MUELLER, Steffen
YANG, Chen
WANG, Ying
STAUFT, Charles
<120> 具有密码子对去优化区域的重组病毒及其用于治疗癌症的用途
<130> 064955-000002WO00
<150> 62/609,945
<151> 2017-12-22
<150> 62/640,362
<151> 2018-03-08
<150> 62/677,132
<151> 2018-05-28
<150> 62/640,355
<151> 2018-03-08
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7440
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体（Synthetic Construct）
<400> 1
ttaaaacagc tctggggttg tacccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60
attgcggtac ccttgtacgc ctgttttata ctcccttccc gtaacttaga cgcacaaaac 120
caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accaccacga acaagcactt ctgtttcccc 180
ggtgatgtcg tatagactgc ttgcgtggtt gaaagcgacg gatccgttat ccgcttatgt 240
acttcgagaa gcccagtacc acctcggaat cttcgatgcg ttgcgctcag cactcaaccc 300
cagagtgtag cttaggctga tgagtctgga catccctcac cggtgacggt ggtccaggct 360
gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca tgggacgcta gttgtgaaca aggtgtgaag 420
agcctattga gctacataag aatcctccgg cccctgaatg cggctaatcc caacctcgga 480
gcaggtggtc acaaaccagt gattggcctg tcgtaacgcg caagtccgtg gcggaaccga 540
ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt ttattgtggc tgcttatggt gacaatcaca 600
gattgttatc ataaagcgaa ttggattggc catccggtga aagtgagact cattatctat 660
ctgtttgctg gatccgctcc attgagtgtg tttactctaa gtacaatttc aacagttatt 720
tcaatcagac aattgtatca taatgggtgc tcaggtttca tcacagaaag tgggcgcaca 780
tgaaaactca aatagagcgt atggtagttc taccattaat tacaccacca ttaattatta 840
tagagattca gctagtaacg cggcttcgaa acaggacttc tctcaagacc cttccaagtt 900
caccgagccc atcaaggatg tcctgataaa aacagcccca atgctaaact cgccaaacat 960
agaggcttgc gggtatagcg atagagtact gcaattaaca ctgggaaact ccactataac 1020
cacacaggag gcggctaatt cagtagtcgc ttatgggcgt tggcctgaat atctgaggga 1080
cagcgaagcc aatccagtgg accagccgac agaaccagac gtcgctgcat gcaggtttta 1140
tacgctagac accgtgtctt ggacgaaaga gtcgcgaggg tggtggtgga agttgcctga 1200
tgcactgagg gacatgggac tctttgggca aaatatgtac taccactacc taggtaggtc 1260
cgggtacacc gtgcatgtac agtgtaacgc ctccaaattc caccaggggg cactaggggt 1320
attcgccgta ccagagatgt gtctggccgg ggatagcaac accactacca tgcacaccag 1380
ctatcaaaat gccaatcctg gcgagaaagg aggcactttc acgggtacgt tcactcctga 1440
caacaaccag acatcacctg cccgcaggtt ctgcccggtg gattacctcc ttggaaatgg 1500
cacgttgttg gggaatgcct tcgtattccc acaccagata attaacttac ggactaacaa 1560
ttgcgcaacc ctagtgttgc catacgttaa ctcactgtca atcgatagta tggtgaaaca 1620
taacaattgg gggatcgcaa tattaccgtt agcgccactg aatttcgcca gcgaatcgtc 1680
acctgagata ccgattaccc ttacaatcgc acctatgtgt tgcgagttca acggattgcg 1740
taatataacc ctaccacggt tgcaggggtt gcccgttatg aataccccag ggtctaacca 1800
ataccttacc gccgataatt tccaatcccc ttgcgcactg ccagagttcg acgtaacccc 1860
tccaatcgac atacccggcg aggttaagaa tatgatggag ttagccgaaa tcgatactat 1920
gataccgttc gatctatccg ctacgaaaaa gaatactatg gagatgtatc gcgtgagatt 1980
gtccgataag ccacataccg acgatccgat actgtgtctg tcactgtcac ccgccagcga 2040
tcctaggttg tcccatacaa tgttaggcga gatactgaat tactataccc attgggccgg 2100
tagtctgaaa ttcacatttc tgttttgcgg atctatgatg gcgaccggaa agctgttagt 2160
gtcatacgct ccacccggag ccgatccacc taaaaaacgc aaggaagcga tgctcggtac 2220
acacgtgata tgggatatcg gactgcaatc gtcatgtact atggtcgtgc catggatatc 2280
gaatacgact tatagacaga caatcgacga tagctttacc gagggggggt atattagcgt 2340
attctatcag acacgtatcg tagtgccact gtcaacccct agagagatgg acatactcgg 2400
attcgtatcc gcatgtaacg actttagcgt gagactgtta cgcgatacta cccatatcga 2460
acagaaagcg ctagcacagg ggttaggtca gatgcttgaa agcatgattg acaacacagt 2520
ccgtgaaacg gtgggggcgg caacatctag agacgctctc ccaaacactg aagccagtgg 2580
accaacacac tccaaggaaa ttccggcact caccgcagtg gaaactgggg ccacaaatcc 2640
actagtccct tctgatacag tgcaaaccag acatgttgta caacataggt caaggtcaga 2700
gtctagcata gagtctttct tcgcgcgggg tgcatgcgtg accattatga ccgtggataa 2760
cccagcttcc accacgaata aggataagct ttttgcagtg tggaagatca cttataaaga 2820
tactgtccag ttacggagga aattggagtt cttcacctat tctagatttg atatggaact 2880
tacctttgtg gttactgcaa atttcactga gactaacaat ggccatgcat taaatcaagt 2940
gtaccaaatt atgtacgtac caccaggcgc tccagtgccc gaaaaatggg acgactacac 3000
atggcaaacc tcatcaaatc catcaatctt ttacacctac gggacagctc cagcccggat 3060
ctcggtaccg tatgttggta tttcgaacgc ctattcacac ttttacgacg gtttttccaa 3120
agtaccactg aaggaccagt cggcagcact aggtgactcc ctttatggtg cagcatctct 3180
aaatgacttc ggtattttgg ctgttagagt agtcaatgat cacaacccga ccaaggtcac 3240
ctccaaaatc agagtgtatc taaaacccaa acacatcaga gtctggtgcc cgcgtccacc 3300
gagggcagtg gcgtactacg gccctggagt ggattacaag gatggtacgc ttacacccct 3360
ctccaccaag gatctgacca catatggatt cggacaccaa aacaaagcgg tgtacactgc 3420
aggttacaaa atttgcaact accacttggc cactcaggat gatttgcaaa acgcagtgaa 3480
cgtcatgtgg agtagagacc tcttagtcac agaatcaaga gcccagggca ccgattcaat 3540
cgcaaggtgc aattgcaacg caggggtgta ctactgcgag tctagaagga aatactaccc 3600
agtatccttc gttggcccaa cgttccagta catggaggct aataactatt acccagctag 3660
gtaccagtcc catatgctca ttggccatgg attcgcatct ccaggggatt gtggtggcat 3720
actcagatgt caccacgggg tgatagggat cattactgct ggtggagaag ggttggttgc 3780
attttcagac attagagact tgtatgccta cgaagaagaa gccatggaac aaggcctcac 3840
caattacata gagtcacttg gggccgcatt tggaagtgga tttactcagc agattagcga 3900
caaaataaca gagttgacca atatggtgac cagtaccatc actgaaaagc tacttaagaa 3960
cttgatcaag atcatatcct cactagttat tataactagg aactatgaag acaccacaac 4020
agtgctcgct accctggccc ttcttgggtg tgatgcttca ccatggcagt ggcttagaaa 4080
gaaagcatgc gatgttctgg agatacctta tgtcatcaag caaggtgaca gttggttgaa 4140
gaagtttact gaagcatgca acgcagctaa gggactggag tgggtgtcaa acaaaatctc 4200
aaaattcatt gattggctca aggagaaaat tatcccacaa gctagagata agttggaatt 4260
tgtaacaaaa cttagacaac tagaaatgct ggaaaaccaa atctcaacta tacaccaatc 4320
atgccctagt caggaacacc aggaaattct attcaataat gtcagatggt tatccatcca 4380
gtctaagagg tttgcccctc tttacgcagt ggaagccaaa agaatacaga aactcgagca 4440
tactattaac aactacatac agttcaagag caaacaccgt attgaaccag tatgtttgct 4500
agtacatggc agccccggaa caggtaaatc tgtagcaacc aacctgattg ctagagccat 4560
agctgaaaga gaaaacacgt ccacgtactc gctacccccg gatccatcac acttcgacgg 4620
atacaaacaa cagggagtgg tgattatgga cgacctgaat caaaacccag atggtgcgga 4680
catgaagctg ttctgtcaga tggtatcaac agtggagttt ataccaccca tggcatccct 4740
ggaggagaaa ggaatcctgt ttacttcaaa ttacgttcta gcatccacaa actcaagcag 4800
aatttccccc cccactgtgg cacacagtga cgcgttagcc aggcgctttg cgttcgacat 4860
ggacattcag gtcatgaatg agtattctag agatgggaaa ttgaacatgg ccatggctac 4920
tgaaatgtgt aagaactgtc accaaccagc aaactttaag agatgctgtc ctttagtgtg 4980
tggtaaggca attcaattaa tggacaaatc ttccagagtt agatacagta ttgaccagat 5040
cactacaatg attatcaatg agagaaacag aagatccaac attggcaatt gtatggaggc 5100
tttgtttcaa ggaccactcc agtataaaga cttgaaaatt gacatcaaga cgagtccccc 5160
tcctgaatgt atcaatgact tgctccaagc agttgactcc caggaggtga gagattactg 5220
tgagaagaag ggttggatag ttaacatcac cagccaggtt caaacagaaa ggaacatcaa 5280
cagggcaatg acaattctac aagcggtgac aaccttcgcc gcagtggctg gagttgtcta 5340
tgtcatgtat aaactgtttg ctggacacca gggagcatac actggtttac caaacaaaaa 5400
acccaacgtg cccaccattc ggacagcaaa ggtacaagga ccagggttcg attacgcagt 5460
ggctatggct aaaagaaaca ttgttacagc aactactagc aagggagagt tcactatgtt 5520
aggagtccac gacaacgtgg ctattttacc aacccacgct tcacctggtg aaagcattgt 5580
gatcgatggc aaagaagtgg agatcttgga tgccaaagcg ctcgaagatc aagcaggaac 5640
caatcttgaa atcactataa tcactctaaa gagaaatgaa aagttcagag acattagacc 5700
acatatacct actcaaatca ctgagacaaa tgatggagtc ttgatcgtga acactagcaa 5760
gtaccccaat atgtatgttc ctgtcggtgc tgtgactgaa cagggatatc taaatctcgg 5820
tgggcgccaa actgctcgta ctctaatgta caactttcca accagagcag gacagtgtgg 5880
tggagtcatc acatgtactg ggaaagtcat cgggatgcat gttggtggga acggttcaca 5940
cgggtttgca gcggccctga agcgatcata cttcactcag agtcaaggtg aaatccagtg 6000
gatgagacct tcgaaggaag tgggatatcc aatcataaat gccccgtcca aaaccaagct 6060
tgaacccagt gctttccact atgtgtttga aggggtgaag gaaccagcag tcctcactaa 6120
aaacgatccc aggcttaaga cagactttga ggaggcaatt ttctccaagt acgtgggtaa 6180
caaaattact gaagtggatg agtacatgaa agaggcagta gaccactatg ctggccagct 6240
catgtcacta gacatcaaca tagaacaaat gtgcttggag gatgccatgt atggcactga 6300
tggtctagaa gcacttgatt tgtccaccag tgctggctac ccttatgtag caatgggaaa 6360
gaagaagaga gacatcttga acaaacaaac cagagacact aaggaaatgc aaaaactgct 6420
cgacacatat ggaatcaacc tcccactggt gacttatgta aaggatgaac ttagatccaa 6480
aacaaaggtt gagcagggga aatccagatt aattgaagct tctagtttga atgactcagt 6540
ggcaatgaga atggcttttg ggaacctata tgctgctttt cacaaaaacc caggagtgat 6600
aacaggttca gcagtggggt gcgatccaga tttgttttgg agcaaaattc cggtattgat 6660
ggaagagaag ctgtttgctt ttgactacac agggtatgat gcatctctca gccctgcttg 6720
gttcgaggca ctaaagatgg tgcttgagaa aatcggattc ggagacagag ttgactacat 6780
cgactaccta aaccactcac accacctgta caagaataaa acatactgtg tcaagggcgg 6840
tatgccatct ggctgctcag gcacttcaat ttttaactca atgattaaca acttgattat 6900
caggacactc ttactgaaaa cctacaaggg catagattta gaccacctaa aaatgattgc 6960
ctatggtgat gatgtaattg cttcctaccc ccatgaagtt gacgctagtc tcctagccca 7020
atcaggaaaa gactatggac taactatgac tccagctgac aaatcagcta catttgaaac 7080
agtcacatgg gagaatgtaa cattcttgaa gagattcttc agggcagacg agaaataccc 7140
atttcttatt catccagtaa tgccaatgaa ggaaattcat gaatcaatta gatggacaaa 7200
agatcctagg aacactcagg atcacgttcg ctctctgtgc cttttagctt ggcacaatgg 7260
cgaagaagaa tataacaaat tcctagctaa aatcaggagt gtgccaattg gaagagcttt 7320
attgctccca gagtactcaa cattgtaccg ccgttggctt gactcatttt agtaacccta 7380
cctcagtcga attggattgg gtcatactgt tgtaggggta aatttttctt taattcggag 7440
<210> 2
<211> 10807
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体（Synthetic Construct）
<400> 2
agttgttgat ctgtgtgagt cagactgcga cagttcgagt ctgaagcgag agctaacaac 60
agtatcaaca ggtttaattt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120
gaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtaaa 180
ccccttggga ggtttgaaga ggttgccagc cggacttctg ctgggtcatg gacccatcag 240
aatggttttg gcgatactag cctttttgag atttacagca atcaagccat cactgggcct 300
tatcaacaga tggggttccg tggggaaaaa agaggctatg gaaataataa agaagttcaa 360
gaaagatctt gctgccatgt tgagaataat caatgctagg aaagagagga agagacgtgg 420
cgcagacacc agcatcggaa tcattggcct cctgctgact acagccatgg cagccgaaat 480
tacgagaagg gggtccgcat actatatgta tctggatagg tccgacgccg gtaaggcaat 540
ctcattcgca acgacactcg gagtgaataa gtgtcacgtt cagattatgg acttagggca 600
tatgtgcgac gctactatgt catacgaatg ccctatgctt gacgaaggcg ttgagccaga 660
cgacgtcgac tgttggtgca atacgactag cacatgggtc gtgtacggta catgccatca 720
caaaaagggc gaagcgagac ggtctagaag ggccgttacg ttgccgtcac actctacgag 780
aaagttgcag actaggtctc agacttggtt ggagtcacgc gaatacacta agcatctgat 840
taaggtcgag aattggattt ttaggaaccc agggttcgca ctagtcgccg tcgcaatcgc 900
ttggttgttg gggtctagta cgagtcagaa agtgatatac ttagtgatga tactgttgat 960
cgcacccgca tactctatta ggtgtatcgg agtgagtaat cgcgatttcg tcgagggtat 1020
gagcggaggg acatgggtcg acgttgtgct tgagcacggg gggtgcgtta ccgttatggc 1080
ccaagacaaa ccgacagtcg atatcgaact ggttacgact accgtttcga acatggccga 1140
agtgagatcg tattgttacg aggctagcat aagcgatatg gctagcgata gtaggtgccc 1200
aacacagggc gaagcgtatc tcgataagca atccgatacg caatacgttt gcaaacggac 1260
attggtcgat agggggtggg gtaacggatg cggactgttc ggtaaggggt cactagtgac 1320
atgcgctaag tttacatgct ctaaaaaaat gaccggtaag tcaatccaac ccgaaaacct 1380
tgagtatagg attatgttga gcgtacacgg atcgcaacac tccggtatga tcgttaacga 1440
taccggatac gagactgacg agaatagggc taaggtcgag gtgacaccta actcacctag 1500
agccgaagcg acattggggg ggttcggatc tctcggactg gattgcgaac ctagaaccgg 1560
attggacttt agcgatctgt actatctgac tatgaacaat aagcattggt tggtgcataa 1620
ggagtggttt cacgacatac cactgccatg gcacgccgga gccgataccg gtacgccaca 1680
ttggaataac aaagaggcac tagtcgagtt taaggacgct cacgctaaga gacagaccgt 1740
agtcgtgttg gggtcacagg agggagccgt gcataccgca ctagccggcg cactcgaggc 1800
cgaaatggac ggagcgaaag ggagactgtt tagcggacac cttaagtgta gactgaaaat 1860
ggacaagttg cgacttaagg gcgttagcta tagcctatgt accgccgcat ttacgtttac 1920
gaaagtgcca gccgaaacgt tgcacggaac cgttaccgtc gaggtgcaat acgccggaac 1980
cgacggacca tgcaagatac ccgtgcaaat ggccgtcgat atgcagacac tgacaccagt 2040
cggacggttg attaccgcta acccagtgat aaccgagtca accgaaaact ctaagatgat 2100
gctcgagctt gacccaccat tcggcgactc atatatcgtt atcggagtcg gcgacaaaaa 2160
gattacgcat cattggcata gatccggatc gacaatcggt aaggcattcg aagcgacagt 2220
gagaggcgct aagcgtatgg ccgtattggg cgataccgca tgggacttcg gatccgtcgg 2280
cggagtgttt aactcactcg gtaaggggat acaccagata ttcggagccg cattcaaatc 2340
gttgttcggc ggaatgtcat ggtttagtca gatactgatc ggaacactgc ttgtgtggtt 2400
ggggttgaac actaagaacg gatcgattag tctgacatgc ttagccttag gcggagtgat 2460
gatttttctg tcaaccgccg ttagcgcaga cgtggggtgc tcagtggact tctcaaaaaa 2520
ggaaacgaga tgtggcacgg gggtattcat ctataatgat gttgaagcct ggagggaccg 2580
gtacaagtac catcctgact ccccccgcag attggcagca gcagtcaagc aggcctggga 2640
agaggggatc tgtgggatct catccgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggaaatcagt 2700
agaaggggag ctcaatgcta tcctagagga gaatggagtt caactgacag ttgttgtggg 2760
atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acaaagattg ccagtgcctg tgaatgagct 2820
gccccatggc tggaaagcct gggggaaatc gtattttgtt agggcggcaa agaccaacaa 2880
cagttttgtt gtcgacggtg acacactgaa ggaatgtccg cttgagcaca gagcatggaa 2940
tagttttctt gtggaggatc acgggtttgg agtcttccac accagtgtct ggcttaaggt 3000
cagagaagat tactcattag aatgtgaccc agccgtcata ggaacagctg ttaagggaag 3060
ggaggccgcg cacagtgatc tgggctattg gattgaaagt gaaaagaatg acacatggag 3120
gctgaagagg gcccacctga ttgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt ctcacacatt 3180
gtggacagat ggagtagaag aaagtgatct tatcataccc aagtctttag ctggtccact 3240
cagccaccac aacaccagag agggttacag aacccaagtg aaagggccat ggcacagtga 3300
agaacttgaa atccggtttg aggaatgtcc aggcaccaag gtttacgtgg aggagacatg 3360
cggaactaga ggaccatctc tgagatcaac tactgcaagt ggaagggtca ttgaggaatg 3420
gtgctgtagg gaatgcacaa tgcccccact atcgtttcga gcaaaagacg gctgctggta 3480
tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agagagcaac ttagtgaggt caatggtgac 3540
agcggggtca accgatcata tggaccactt ctctcttgga gtgcttgtga ttctactcat 3600
ggtgcaggag gggttgaaga agagaatgac cacaaagatc atcatgagca catcaatggc 3660
agtgctggta gtcatgatct tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcca agcttgtgat 3720
cctgatgggt gctactttcg cagaaatgaa cactggagga gatgtagctc acttggcatt 3780
ggtagcggca tttaaagtca gaccagcctt gctggtgtcc ttcattttca gagccaattg 3840
gacaccccgt gagagcatgc tgctagccct ggcttcgtgt cttctgcaaa ctgcgatctc 3900
tgctcttgaa ggtgacttga tggtcctcat taatggattt gctttggcct ggttggcaat 3960
tcgagcaatg gccgtgccac gcactgacaa catcgctcta ccaatcttgg ctgctctaac 4020
accactagct cgaggcacac tgctcgtggc atggagagcg ggcctggcta cttgtggagg 4080
gatcatgctc ctctccctga aagggaaagg tagtgtgaag aagaacctgc catttgtcat 4140
ggccctggga ttgacagctg tgagggtagt agaccctatt aatgtggtag gactactgtt 4200
actcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagtgaa gttctcacag ccgttggcct 4260
gatatgtgca ctggccggag ggtttgccaa ggcagacatt gagatggctg gacccatggc 4320
tgcagtaggc ttgctaattg tcagctatgt ggtgtcggga aagagtgtgg acatgtacat 4380
tgaaagagca ggagacatca catgggaaaa ggacgcggaa gtcactggaa acagtcctcg 4440
gcttgacgtg gcactggatg agagtggtga tttctccttg gtagaggaag atggtccacc 4500
catgagagag atcatactca aggtggtcct gatggccatc tgtggcatga acccaatagc 4560
tatacctttt gctgcaggag cgtggtatgt gtatgtgaag actgggaaaa ggagtggcgc 4620
cctctgggac gtgcctgctc ccaaagaagt gaagaaagga gaaaccacag atggagtgta 4680
cagagtgatg actcgcagac tgctaggttc aacacaggtt ggagtgggag tcatgcaaga 4740
gggagtcttc cacaccatgt ggcacgttac aaaaggagcc gcactgagga gcggtgaggg 4800
aagacttgat ccatactggg gggatgtcaa gcaggacttg gtgtcatact gtgggccttg 4860
gaagttggat gcagcttggg atggactcag cgaggtacag cttttggccg tacctcccgg 4920
agagagggcc agaaacattc agaccctgcc tggaatattc aagacaaagg acggggacat 4980
cggagcagtt gctctggact accctgcagg gacctcagga tctccgatcc tagacaaatg 5040
tggaagagtg ataggactct atggcaatgg ggttgtgatc aagaatggaa gctatgttag 5100
tgctataacc cagggaaaga gggaggagga gactccggtt gaatgtttcg aaccctcgat 5160
gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttgga tctgcatcca ggagccggaa aaaccaggag 5220
agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaaagaga ctccggacag tgatcttggc 5280
accaactagg gttgtcgctg ctgagatgga ggaggccttg agaggacttc cggtgcgtta 5340
catgacaaca gcagtcaacg tcacccattc tgggacagaa atcgttgatt tgatgtgcca 5400
tgccactttc acttcacgct tactacaacc catcagagtc cctaattaca atctcaacat 5460
catggatgaa gcccacttca cagacccctc aagtatagct gcaagaggat acatatcaac 5520
aagggttgaa atgggcgagg cggctgccat ttttatgact gccacaccac caggaacccg 5580
tgatgcgttt cctgactcta actcaccaat catggacaca gaagtggaag tcccagagag 5640
agcctggagc tcaggctttg attgggtgac agaccattct gggaaaacag tttggttcgt 5700
tccaagcgtg agaaacggaa atgaaatcgc agcctgtctg acaaaggctg gaaagcgggt 5760
catacagctc agcaggaaga cttttgagac agaatttcag aaaacaaaaa atcaagagtg 5820
ggactttgtc ataacaactg acatctcaga gatgggcgcc aacttcaagg ctgaccgggt 5880
catagactct aggagatgcc taaaaccagt catacttgat ggtgagagag tcatcttggc 5940
tgggcccatg cctgtcacgc atgctagtgc tgctcagagg agaggacgta taggcaggaa 6000
ccctaacaaa cctggagatg agtacatgta tggaggtggg tgtgcagaga ctgatgaagg 6060
ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct tcttgacaac atctacctcc aggatggcct 6120
catagcctcg ctctatcggc ctgaggccga taaggtagcc gccattgagg gagagtttaa 6180
gctgaggaca gagcaaagga agaccttcgt ggaactcatg aagagagggg accttcccgt 6240
ctggctagcc tatcaggttg catctgccgg aataacttac acagacagaa gatggtgctt 6300
tgatggcaca accaacaaca ccataatgga agacagcgta ccagcagagg tgtggacaaa 6360
gtatggagag aagagagtgc tcaaaccgag atggatggat gctagggtct gttcagacca 6420
tgcggccctg aagtcgttca aagaattcgc cgctggaaaa agaggagcgg ctttgggagt 6480
aatggaggcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag aggtttcagg aagccattga 6540
caacctcgcc gtgctcatgc gagcagagac tggaagcagg ccttataagg cagcggcagc 6600
ccaactgccg gagactctag agacaattat gctcttaggt ttgctgggaa cagtttcact 6660
ggggatcttc ttcgtcttga tgcggaataa gggcatcggg aagatgggct ttggaatggt 6720
aacccttggg gccagtgcat ggctcatgtg gctttcggaa attgaaccag ccagaattgc 6780
atgtgtcctc attgttgtgt ttttattact ggtggtgctc atacccgagc cagagaagca 6840
aagatctccc caagataacc agatggcaat tatcatcatg gtggcagtgg gccttctagg 6900
tttgataact gcaaacgaac ttggatggct ggaaagaaca aaaaatgaca tagctcatct 6960
aatgggaagg agagaagaag gagcaaccat gggattctca atggacattg atctgcggcc 7020
agcctccgcc tgggctatct atgccgcatt gacaactctc atcaccccag ctgtccaaca 7080
tgcggtaacc acttcataca acaactactc cttaatggcg atggccacac aagctggagt 7140
gctgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ttatgcatgg gaccttggag tcccgctgct 7200
aatgatgggt tgctattcac aattaacacc cctgactctg atagtagcta tcattctgct 7260
tgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg cctacaagcg gcagcagcgc gtgctgccca 7320
gaaaaggaca gcagctggca tcatgaagaa tcccgttgtg gatggaatag tggtaactga 7380
cattgacaca atgacaatag acccccaggt ggagaagaag atgggacaag tgttactcat 7440
agcagtagcc atctccagtg ctgtgctgct gcggaccgcc tggggatggg gggaggctgg 7500
agctctgatc acagcagcga cctccacctt gtgggaaggc tctccaaaca aatactggaa 7560
ctcctctaca gccacctcac tgtgcaacat cttcagagga agctatctgg caggagcttc 7620
ccttatctat acagtgacga gaaacgctgg cctggttaag agacgtggag gtgggacggg 7680
agagactctg ggagagaagt ggaaagctcg tctgaatcag atgtcggccc tggagttcta 7740
ctcttataaa aagtcaggta tcactgaagt gtgtagagag gaggctcgcc gtgccctcaa 7800
ggatggagtg gccacaggag gacatgccgt atcccgggga agtgcaaagc tcagatggtt 7860
ggtggagaga ggatatctgc agccctatgg gaaggttgtt gacctcggat gtggcagagg 7920
gggctggagc tattatgccg ccaccatccg caaagtgcag gaggtgagag gatacacaaa 7980
gggaggtccc ggtcatgaag aacccatgct ggtgcaaagc tatgggtgga acatagttcg 8040
tctcaagagt ggagtggacg tcttccacat ggcggctgag ccgtgtgaca ctctgctgtg 8100
tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagag acacgaacac tcagagtgct 8160
ctctatggtg ggggactggc ttgaaaaaag accaggggcc ttctgtataa aggtgctgtg 8220
cccatacacc agcactatga tggaaaccat ggagcgactg caacgtaggc atgggggagg 8280
attagtcaga gtgccattgt ctcgcaactc cacacatgag atgtactggg tgtctggggc 8340
aaagagcaac atcataaaaa gtgtgtccac cacaagtcag ctcctcctgg gacgcatgga 8400
tggccccagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaac ctcggctcgg gtacacgagc 8460
tgtggcaagc tgtgctgagg ctcctaacat gaaaatcatc ggcaggcgca ttgagagaat 8520
ccgcaatgaa catgcagaaa catggtttct tgatgaaaac cacccataca ggacatgggc 8580
ctaccatggg agctacgaag cccccacgca aggatcagcg tcttccctcg tgaacggggt 8640
tgttagactc ctgtcaaagc cttgggacgt ggtgactgga gttacaggaa tagccatgac 8700
tgacaccaca ccatacggcc aacaaagagt cttcaaagaa aaagtggaca ccagggtgcc 8760
agatccccaa gaaggcactc gccaggtaat gaacatagtc tcttcctggc tgtggaagga 8820
gctggggaaa cgcaagcggc cacgcgtctg caccaaagaa gagtttatca acaaggtgcg 8880
cagcaatgca gcactgggag caatatttga agaggaaaaa gaatggaaga cggctgtgga 8940
agctgtgaat gatccaaggt tttgggccct agtggatagg gagagagaac accacctgag 9000
aggagagtgt cacagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga agcaaggaga 9060
gttcgggaaa gcaaaaggta gccgcgccat ctggtacatg tggttgggag ccagattctt 9120
ggagtttgaa gcccttggat tcttgaacga ggaccattgg atgggaagag aaaactcagg 9180
aggtggagtc gaagggttag gattgcaaag acttggatac attctagaag aaatgaatcg 9240
ggcaccagga ggaaagatgt acgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagtaa 9300
gtttgatctg gagaatgaag ctctgattac caaccaaatg gaggaagggc acagaactct 9360
ggcgttggcc gtgattaaat acacatacca aaacaaagtg gtgaaggttc tcagaccagc 9420
tgaaggagga aaaacagtta tggacatcat ttcaagacaa gaccagagag ggagtggaca 9480
agttgtcact tatgctctca acacattcac caacttggtg gtgcagctta tccggaacat 9540
ggaagctgag gaagtgttag agatgcaaga cttatggttg ttgaggaagc cagagaaagt 9600
gaccagatgg ttgcagagca atggatggga tagactcaaa cgaatggcgg tcagtggaga 9660
tgactgcgtt gtgaagccaa tcgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720
catgggaaaa gttaggaaag acacacagga gtggaaaccc tcgactggat ggagcaattg 9780
ggaagaagtc ccgttctgct cccaccactt caacaagctg tacctcaagg atgggagatc 9840
cattgtggtc ccttgccgcc accaagatga actgattggc cgagctcgcg tctcaccagg 9900
ggcaggatgg agcatccggg agactgcctg tcttgcaaaa tcatatgcgc agatgtggca 9960
gctcctttat ttccacagaa gggaccttcg actgatggct aatgccattt gctcggctgt 10020
gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac cacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080
gatgaccact gaggacatgc tcatggtgtg gaatagagtg tggattgagg agaacgacca 10140
tatggaggac aagactcctg taacaaaatg gacagacatt ccctatctag gaaaaaggga 10200
ggacttatgg tgtggatccc ttatagggca cagaccccgc accacttggg ctgaaaacat 10260
caaagacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320
tctatccacc caagtccgct acttgggtga ggaagggtcc acacccggag tgttgtaagc 10380
accaatttta gtgttgtcag gcctgctagt cagccacagt ttggggaaag ctgtgcagcc 10440
tgtaaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagctcatag tcaggccgag aacgccatgg 10500
cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560
gcgcttggaa gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620
gcctgaactg gagactagct gtgaatctcc agcagaggga ctagtggtta gaggagaccc 10680
cccggaaaac gcacaacagc atattgacgc tgggaaagac cagagactcc atgagtttcc 10740
accacgctgg ccgccaggca cagatcgccg aacttcggcg gccggtgtgg ggaaatccat 10800
ggtttct 10807
<210> 3
<211> 10807
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体（Synthetic Construct）
<400> 3
agttgttgat ctgtgtgagt cagactgcga cagttcgagt ctgaagcgag agctaacaac 60
agtatcaaca ggtttaattt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120
gaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtaaa 180
ccccttggga ggtttgaaga ggttgccagc cggacttctg ctgggtcatg gacccatcag 240
aatggttttg gcgatactag cctttttgag atttacagca atcaagccat cactgggcct 300
tatcaacaga tggggttccg tggggaaaaa agaggctatg gaaataataa agaagttcaa 360
gaaagatctt gctgccatgt tgagaataat caatgctagg aaagagagga agagacgtgg 420
cgcagacacc agcatcggaa tcattggcct cctgctgact acagccatgg cagcagagat 480
cactagacgc gggagtgcat actacatgta cttggatagg agcgatgccg ggaaggccat 540
ttcgtttgct accacattgg gagtgaacaa gtgccacgta cagatcatgg acctcgggca 600
catgtgtgac gccaccatga gttatgagtg ccctatgctg gatgagggag tggaaccaga 660
tgatgtcgat tgctggtgca acacgacatc aacttgggtt gtgtacggaa cctgtcatca 720
caaaaaaggt gaggcacggc gatctaggag agccgtgacg ctcccttctc actctacaag 780
gaagttgcaa acgcggtcgc agacctggtt agaatcaaga gaatacacga agcacttgat 840
caaggttgaa aactggatat tcaggaaccc cgggtttgcg ctagtggccg ttgccattgc 900
ctggcttttg ggaagctcga cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 960
tgccccggca tacagtatca ggtgcattgg agtcagcaat agagacttcg tggagggcat 1020
gtcaggtggg acctgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggctgcgtta ccgtgatggc 1080
acaggacaag ccaacagttg acatagagtt ggtcacgacg acggttagta acatggccga 1140
ggtaagatcc tattgctacg aggcatcgat atcggacatg gcttcggaca gtcgttgccc 1200
aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1260
attagtggac agaggttggg gaaacggttg tggacttttt ggcaaaggga gcttggtgac 1320
atgtgccaag tttacgtgtt ctaagaagat gaccggcaag agcattcaac cggaaaatct 1380
ggagtatcgg ataatgctat cagtgcatgg ctcccagcat agcgggatga ttgtcaatga 1440
tacaggatat gaaactgacg aaaatagagc gaaagtcgag gttacgccta actcacctag 1500
agccgaagcg acattggggg ggttcggatc tctcggactg gattgcgaac ctagaaccgg 1560
attggacttt agcgatctgt actatctgac tatgaacaat aagcattggt tggtgcataa 1620
ggagtggttt cacgacatac cactgccatg gcacgccgga gccgataccg gtacgccaca 1680
ttggaataac aaagaggcac tagtcgagtt taaggacgct cacgctaaga gacagaccgt 1740
agtcgtgttg gggtcacagg agggagccgt gcataccgca ctagccggcg cactcgaggc 1800
cgaaatggac ggagcgaaag ggagactgtt tagcggacac cttaagtgta gactgaaaat 1860
ggacaagttg cgacttaagg gcgttagcta tagcctatgt accgccgcat ttacgtttac 1920
gaaagtgcca gccgaaacgt tgcacggaac cgttaccgtc gaggtgcaat acgccggaac 1980
cgacggacca tgcaagatac ccgtgcaaat ggccgtcgat atgcagacac tgacaccagt 2040
cggacggttg attaccgcta acccagtgat aaccgagtca accgaaaact ctaagatgat 2100
gctcgagctt gacccaccat tcggcgactc atatatcgtt atcggagtcg gcgacaaaaa 2160
gattacgcat cattggcata gatccggatc gacaatcggt aaggcattcg aagcgacagt 2220
gagaggcgct aagcgtatgg ccgtattggg cgataccgca tgggacttcg gatccgtcgg 2280
cggagtgttt aactcactcg gtaaggggat acaccagata ttcggagccg cattcaaatc 2340
gttgttcggc ggaatgtcat ggtttagtca gatactgatc ggaacactgc ttgtgtggtt 2400
ggggttgaac actaagaacg gatcgattag tctgacatgc ttagccttag gcggagtgat 2460
gatttttctg tcaaccgccg ttagcgcaga cgtggggtgc tcagtggact tctcaaaaaa 2520
ggaaacgaga tgtggcacgg gggtattcat ctataatgat gttgaagcct ggagggaccg 2580
gtacaagtac catcctgact ccccccgcag attggcagca gcagtcaagc aggcctggga 2640
agaggggatc tgtgggatct catccgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggaaatcagt 2700
agaaggggag ctcaatgcta tcctagagga gaatggagtt caactgacag ttgttgtggg 2760
atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acaaagattg ccagtgcctg tgaatgagct 2820
gccccatggc tggaaagcct gggggaaatc gtattttgtt agggcggcaa agaccaacaa 2880
cagttttgtt gtcgacggtg acacactgaa ggaatgtccg cttgagcaca gagcatggaa 2940
tagttttctt gtggaggatc acgggtttgg agtcttccac accagtgtct ggcttaaggt 3000
cagagaagat tactcattag aatgtgaccc agccgtcata ggaacagctg ttaagggaag 3060
ggaggccgcg cacagtgatc tgggctattg gattgaaagt gaaaagaatg acacatggag 3120
gctgaagagg gcccacctga ttgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt ctcacacatt 3180
gtggacagat ggagtagaag aaagtgatct tatcataccc aagtctttag ctggtccact 3240
cagccaccac aacaccagag agggttacag aacccaagtg aaagggccat ggcacagtga 3300
agaacttgaa atccggtttg aggaatgtcc aggcaccaag gtttacgtgg aggagacatg 3360
cggaactaga ggaccatctc tgagatcaac tactgcaagt ggaagggtca ttgaggaatg 3420
gtgctgtagg gaatgcacaa tgcccccact atcgtttcga gcaaaagacg gctgctggta 3480
tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agagagcaac ttagtgaggt caatggtgac 3540
agcggggtca accgatcata tggaccactt ctctcttgga gtgcttgtga ttctactcat 3600
ggtgcaggag gggttgaaga agagaatgac cacaaagatc atcatgagca catcaatggc 3660
agtgctggta gtcatgatct tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcca agcttgtgat 3720
cctgatgggt gctactttcg cagaaatgaa cactggagga gatgtagctc acttggcatt 3780
ggtagcggca tttaaagtca gaccagcctt gctggtgtcc ttcattttca gagccaattg 3840
gacaccccgt gagagcatgc tgctagccct ggcttcgtgt cttctgcaaa ctgcgatctc 3900
tgctcttgaa ggtgacttga tggtcctcat taatggattt gctttggcct ggttggcaat 3960
tcgagcaatg gccgtgccac gcactgacaa catcgctcta ccaatcttgg ctgctctaac 4020
accactagct cgaggcacac tgctcgtggc atggagagcg ggcctggcta cttgtggagg 4080
gatcatgctc ctctccctga aagggaaagg tagtgtgaag aagaacctgc catttgtcat 4140
ggccctggga ttgacagctg tgagggtagt agaccctatt aatgtggtag gactactgtt 4200
actcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagtgaa gttctcacag ccgttggcct 4260
gatatgtgca ctggccggag ggtttgccaa ggcagacatt gagatggctg gacccatggc 4320
tgcagtaggc ttgctaattg tcagctatgt ggtgtcggga aagagtgtgg acatgtacat 4380
tgaaagagca ggagacatca catgggaaaa ggacgcggaa gtcactggaa acagtcctcg 4440
gcttgacgtg gcactggatg agagtggtga tttctccttg gtagaggaag atggtccacc 4500
catgagagag atcatactca aggtggtcct gatggccatc tgtggcatga acccaatagc 4560
tatacctttt gctgcaggag cgtggtatgt gtatgtgaag actgggaaaa ggagtggcgc 4620
cctctgggac gtgcctgctc ccaaagaagt gaagaaagga gaaaccacag atggagtgta 4680
cagagtgatg actcgcagac tgctaggttc aacacaggtt ggagtgggag tcatgcaaga 4740
gggagtcttc cacaccatgt ggcacgttac aaaaggagcc gcactgagga gcggtgaggg 4800
aagacttgat ccatactggg gggatgtcaa gcaggacttg gtgtcatact gtgggccttg 4860
gaagttggat gcagcttggg atggactcag cgaggtacag cttttggccg tacctcccgg 4920
agagagggcc agaaacattc agaccctgcc tggaatattc aagacaaagg acggggacat 4980
cggagcagtt gctctggact accctgcagg gacctcagga tctccgatcc tagacaaatg 5040
tggaagagtg ataggactct atggcaatgg ggttgtgatc aagaatggaa gctatgttag 5100
tgctataacc cagggaaaga gggaggagga gactccggtt gaatgtttcg aaccctcgat 5160
gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttgga tctgcatcca ggagccggaa aaaccaggag 5220
agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaaagaga ctccggacag tgatcttggc 5280
accaactagg gttgtcgctg ctgagatgga ggaggccttg agaggacttc cggtgcgtta 5340
catgacaaca gcagtcaacg tcacccattc tgggacagaa atcgttgatt tgatgtgcca 5400
tgccactttc acttcacgct tactacaacc catcagagtc cctaattaca atctcaacat 5460
catggatgaa gcccacttca cagacccctc aagtatagct gcaagaggat acatatcaac 5520
aagggttgaa atgggcgagg cggctgccat ttttatgact gccacaccac caggaacccg 5580
tgatgcgttt cctgactcta actcaccaat catggacaca gaagtggaag tcccagagag 5640
agcctggagc tcaggctttg attgggtgac agaccattct gggaaaacag tttggttcgt 5700
tccaagcgtg agaaacggaa atgaaatcgc agcctgtctg acaaaggctg gaaagcgggt 5760
catacagctc agcaggaaga cttttgagac agaatttcag aaaacaaaaa atcaagagtg 5820
ggactttgtc ataacaactg acatctcaga gatgggcgcc aacttcaagg ctgaccgggt 5880
catagactct aggagatgcc taaaaccagt catacttgat ggtgagagag tcatcttggc 5940
tgggcccatg cctgtcacgc atgctagtgc tgctcagagg agaggacgta taggcaggaa 6000
ccctaacaaa cctggagatg agtacatgta tggaggtggg tgtgcagaga ctgatgaagg 6060
ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct tcttgacaac atctacctcc aggatggcct 6120
catagcctcg ctctatcggc ctgaggccga taaggtagcc gccattgagg gagagtttaa 6180
gctgaggaca gagcaaagga agaccttcgt ggaactcatg aagagagggg accttcccgt 6240
ctggctagcc tatcaggttg catctgccgg aataacttac acagacagaa gatggtgctt 6300
tgatggcaca accaacaaca ccataatgga agacagcgta ccagcagagg tgtggacaaa 6360
gtatggagag aagagagtgc tcaaaccgag atggatggat gctagggtct gttcagacca 6420
tgcggccctg aagtcgttca aagaattcgc cgctggaaaa agaggagcgg ctttgggagt 6480
aatggaggcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag aggtttcagg aagccattga 6540
caacctcgcc gtgctcatgc gagcagagac tggaagcagg ccttataagg cagcggcagc 6600
ccaactgccg gagactctag agacaattat gctcttaggt ttgctgggaa cagtttcact 6660
ggggatcttc ttcgtcttga tgcggaataa gggcatcggg aagatgggct ttggaatggt 6720
aacccttggg gccagtgcat ggctcatgtg gctttcggaa attgaaccag ccagaattgc 6780
atgtgtcctc attgttgtgt ttttattact ggtggtgctc atacccgagc cagagaagca 6840
aagatctccc caagataacc agatggcaat tatcatcatg gtggcagtgg gccttctagg 6900
tttgataact gcaaacgaac ttggatggct ggaaagaaca aaaaatgaca tagctcatct 6960
aatgggaagg agagaagaag gagcaaccat gggattctca atggacattg atctgcggcc 7020
agcctccgcc tgggctatct atgccgcatt gacaactctc atcaccccag ctgtccaaca 7080
tgcggtaacc acttcataca acaactactc cttaatggcg atggccacac aagctggagt 7140
gctgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ttatgcatgg gaccttggag tcccgctgct 7200
aatgatgggt tgctattcac aattaacacc cctgactctg atagtagcta tcattctgct 7260
tgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg cctacaagcg gcagcagcgc gtgctgccca 7320
gaaaaggaca gcagctggca tcatgaagaa tcccgttgtg gatggaatag tggtaactga 7380
cattgacaca atgacaatag acccccaggt ggagaagaag atgggacaag tgttactcat 7440
agcagtagcc atctccagtg ctgtgctgct gcggaccgcc tggggatggg gggaggctgg 7500
agctctgatc acagcagcga cctccacctt gtgggaaggc tctccaaaca aatactggaa 7560
ctcctctaca gccacctcac tgtgcaacat cttcagagga agctatctgg caggagcttc 7620
ccttatctat acagtgacga gaaacgctgg cctggttaag agacgtggag gtgggacggg 7680
agagactctg ggagagaagt ggaaagctcg tctgaatcag atgtcggccc tggagttcta 7740
ctcttataaa aagtcaggta tcactgaagt gtgtagagag gaggctcgcc gtgccctcaa 7800
ggatggagtg gccacaggag gacatgccgt atcccgggga agtgcaaagc tcagatggtt 7860
ggtggagaga ggatatctgc agccctatgg gaaggttgtt gacctcggat gtggcagagg 7920
gggctggagc tattatgccg ccaccatccg caaagtgcag gaggtgagag gatacacaaa 7980
gggaggtccc ggtcatgaag aacccatgct ggtgcaaagc tatgggtgga acatagttcg 8040
tctcaagagt ggagtggacg tcttccacat ggcggctgag ccgtgtgaca ctctgctgtg 8100
tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagag acacgaacac tcagagtgct 8160
ctctatggtg ggggactggc ttgaaaaaag accaggggcc ttctgtataa aggtgctgtg 8220
cccatacacc agcactatga tggaaaccat ggagcgactg caacgtaggc atgggggagg 8280
attagtcaga gtgccattgt ctcgcaactc cacacatgag atgtactggg tgtctggggc 8340
aaagagcaac atcataaaaa gtgtgtccac cacaagtcag ctcctcctgg gacgcatgga 8400
tggccccagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaac ctcggctcgg gtacacgagc 8460
tgtggcaagc tgtgctgagg ctcctaacat gaaaatcatc ggcaggcgca ttgagagaat 8520
ccgcaatgaa catgcagaaa catggtttct tgatgaaaac cacccataca ggacatgggc 8580
ctaccatggg agctacgaag cccccacgca aggatcagcg tcttccctcg tgaacggggt 8640
tgttagactc ctgtcaaagc cttgggacgt ggtgactgga gttacaggaa tagccatgac 8700
tgacaccaca ccatacggcc aacaaagagt cttcaaagaa aaagtggaca ccagggtgcc 8760
agatccccaa gaaggcactc gccaggtaat gaacatagtc tcttcctggc tgtggaagga 8820
gctggggaaa cgcaagcggc cacgcgtctg caccaaagaa gagtttatca acaaggtgcg 8880
cagcaatgca gcactgggag caatatttga agaggaaaaa gaatggaaga cggctgtgga 8940
agctgtgaat gatccaaggt tttgggccct agtggatagg gagagagaac accacctgag 9000
aggagagtgt cacagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga agcaaggaga 9060
gttcgggaaa gcaaaaggta gccgcgccat ctggtacatg tggttgggag ccagattctt 9120
ggagtttgaa gcccttggat tcttgaacga ggaccattgg atgggaagag aaaactcagg 9180
aggtggagtc gaagggttag gattgcaaag acttggatac attctagaag aaatgaatcg 9240
ggcaccagga ggaaagatgt acgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagtaa 9300
gtttgatctg gagaatgaag ctctgattac caaccaaatg gaggaagggc acagaactct 9360
ggcgttggcc gtgattaaat acacatacca aaacaaagtg gtgaaggttc tcagaccagc 9420
tgaaggagga aaaacagtta tggacatcat ttcaagacaa gaccagagag ggagtggaca 9480
agttgtcact tatgctctca acacattcac caacttggtg gtgcagctta tccggaacat 9540
ggaagctgag gaagtgttag agatgcaaga cttatggttg ttgaggaagc cagagaaagt 9600
gaccagatgg ttgcagagca atggatggga tagactcaaa cgaatggcgg tcagtggaga 9660
tgactgcgtt gtgaagccaa tcgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720
catgggaaaa gttaggaaag acacacagga gtggaaaccc tcgactggat ggagcaattg 9780
ggaagaagtc ccgttctgct cccaccactt caacaagctg tacctcaagg atgggagatc 9840
cattgtggtc ccttgccgcc accaagatga actgattggc cgagctcgcg tctcaccagg 9900
ggcaggatgg agcatccggg agactgcctg tcttgcaaaa tcatatgcgc agatgtggca 9960
gctcctttat ttccacagaa gggaccttcg actgatggct aatgccattt gctcggctgt 10020
gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac cacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080
gatgaccact gaggacatgc tcatggtgtg gaatagagtg tggattgagg agaacgacca 10140
tatggaggac aagactcctg taacaaaatg gacagacatt ccctatctag gaaaaaggga 10200
ggacttatgg tgtggatccc ttatagggca cagaccccgc accacttggg ctgaaaacat 10260
caaagacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320
tctatccacc caagtccgct acttgggtga ggaagggtcc acacccggag tgttgtaagc 10380
accaatttta gtgttgtcag gcctgctagt cagccacagt ttggggaaag ctgtgcagcc 10440
tgtaaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagctcatag tcaggccgag aacgccatgg 10500
cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560
gcgcttggaa gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620
gcctgaactg gagactagct gtgaatctcc agcagaggga ctagtggtta gaggagaccc 10680
cccggaaaac gcacaacagc atattgacgc tgggaaagac cagagactcc atgagtttcc 10740
accacgctgg ccgccaggca cagatcgccg aacttcggcg gccggtgtgg ggaaatccat 10800
ggtttct 10807
<210> 4
<211> 10807
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体（Synthetic Construct）
<400> 4
agttgttgat ctgtgtgagt cagactgcga cagttcgagt ctgaagcgag agctaacaac 60
agtatcaaca ggtttaattt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120
gaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtaaa 180
ccccttggga ggtttgaaga ggttgccagc cggacttctg ctgggtcatg gacccatcag 240
aatggttttg gcgatactag cctttttgag atttacagca atcaagccat cactgggcct 300
tatcaacaga tggggttccg tggggaaaaa agaggctatg gaaataataa agaagttcaa 360
gaaagatctt gctgccatgt tgagaataat caatgctagg aaagagagga agagacgtgg 420
cgcagacacc agcatcggaa tcattggcct cctgctgact acagccatgg cagcagagat 480
cactagacgc gggagtgcat actacatgta cttggatagg agcgatgccg ggaaggccat 540
ttcgtttgct accacattgg gagtgaacaa gtgccacgta cagatcatgg acctcgggca 600
catgtgtgac gccaccatga gttatgagtg ccctatgctg gatgagggag tggaaccaga 660
tgatgtcgat tgctggtgca acacgacatc aacttgggtt gtgtacggaa cctgtcatca 720
caaaaaaggt gaggcacggc gatctaggag agccgtgacg ctcccttctc actctacaag 780
gaagttgcaa acgcggtcgc agacctggtt agaatcaaga gaatacacga agcacttgat 840
caaggttgaa aactggatat tcaggaaccc cgggtttgcg ctagtggccg ttgccattgc 900
ctggcttttg ggaagctcga cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 960
tgccccggca tacagtatca ggtgcattgg agtcagcaat agagacttcg tggagggcat 1020
gtcaggtggg acctgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggctgcgtta ccgtgatggc 1080
acaggacaag ccaacagttg acatagagtt ggtcacgacg acggttagta acatggccga 1140
ggtaagatcc tattgctacg aggcatcgat atcggacatg gcttcggaca gtcgttgccc 1200
aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1260
attagtggac agaggttggg gaaacggttg tggacttttt ggcaaaggga gcttggtgac 1320
atgtgccaag tttacgtgtt ctaagaagat gaccggcaag agcattcaac cggaaaatct 1380
ggagtatcgg ataatgctat cagtgcatgg ctcccagcat agcgggatga ttgtcaatga 1440
tacaggatat gaaactgacg aaaatagagc gaaagtcgag gttacgccta attcaccaag 1500
agcggaagca accttgggag gctttggaag cttaggactt gactgtgaac caaggacagg 1560
ccttgacttt tcagatctgt attacctgac catgaacaat aagcattggt tggtgcacaa 1620
agagtggttt catgacatcc cattgccttg gcatgctggg gcagacaccg gaactccaca 1680
ctggaacaac aaagaggcat tggtagaatt caaggatgcc cacgccaaga ggcaaaccgt 1740
cgtcgttctg gggagccagg aaggagccgt tcacacggct ctcgctggag ctctagaggc 1800
tgagatggat ggtgcaaagg ggagactgtt tagcggacac cttaagtgta gactgaaaat 1860
ggacaagttg cgacttaagg gcgttagcta tagcctatgt accgccgcat ttacgtttac 1920
gaaagtgcca gccgaaacgt tgcacggaac cgttaccgtc gaggtgcaat acgccggaac 1980
cgacggacca tgcaagatac ccgtgcaaat ggccgtcgat atgcagacac tgacaccagt 2040
cggacggttg attaccgcta acccagtgat aaccgagtca accgaaaact ctaagatgat 2100
gctcgagctt gacccaccat tcggcgactc atatatcgtt atcggagtcg gcgacaaaaa 2160
gattacgcat cattggcata gatccggatc gacaatcggt aaggcattcg aagcgacagt 2220
gagaggcgct aagcgtatgg ccgtattggg cgataccgca tgggacttcg gatccgtcgg 2280
cggagtgttt aactcactcg gtaaggggat acaccagata ttcggagccg cattcaaatc 2340
gttgttcggc ggaatgtcat ggtttagtca gatactgatc ggaacactgc ttgtgtggtt 2400
ggggttgaac actaagaacg gatcgattag tctgacatgc ttagccttag gcggagtgat 2460
gatttttctg tcaaccgccg ttagcgcaga cgtggggtgc tcagtggact tctcaaaaaa 2520
ggaaacgaga tgtggcacgg gggtattcat ctataatgat gttgaagcct ggagggaccg 2580
gtacaagtac catcctgact ccccccgcag attggcagca gcagtcaagc aggcctggga 2640
agaggggatc tgtgggatct catccgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggaaatcagt 2700
agaaggggag ctcaatgcta tcctagagga gaatggagtt caactgacag ttgttgtggg 2760
atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acaaagattg ccagtgcctg tgaatgagct 2820
gccccatggc tggaaagcct gggggaaatc gtattttgtt agggcggcaa agaccaacaa 2880
cagttttgtt gtcgacggtg acacactgaa ggaatgtccg cttgagcaca gagcatggaa 2940
tagttttctt gtggaggatc acgggtttgg agtcttccac accagtgtct ggcttaaggt 3000
cagagaagat tactcattag aatgtgaccc agccgtcata ggaacagctg ttaagggaag 3060
ggaggccgcg cacagtgatc tgggctattg gattgaaagt gaaaagaatg acacatggag 3120
gctgaagagg gcccacctga ttgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt ctcacacatt 3180
gtggacagat ggagtagaag aaagtgatct tatcataccc aagtctttag ctggtccact 3240
cagccaccac aacaccagag agggttacag aacccaagtg aaagggccat ggcacagtga 3300
agaacttgaa atccggtttg aggaatgtcc aggcaccaag gtttacgtgg aggagacatg 3360
cggaactaga ggaccatctc tgagatcaac tactgcaagt ggaagggtca ttgaggaatg 3420
gtgctgtagg gaatgcacaa tgcccccact atcgtttcga gcaaaagacg gctgctggta 3480
tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agagagcaac ttagtgaggt caatggtgac 3540
agcggggtca accgatcata tggaccactt ctctcttgga gtgcttgtga ttctactcat 3600
ggtgcaggag gggttgaaga agagaatgac cacaaagatc atcatgagca catcaatggc 3660
agtgctggta gtcatgatct tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcca agcttgtgat 3720
cctgatgggt gctactttcg cagaaatgaa cactggagga gatgtagctc acttggcatt 3780
ggtagcggca tttaaagtca gaccagcctt gctggtgtcc ttcattttca gagccaattg 3840
gacaccccgt gagagcatgc tgctagccct ggcttcgtgt cttctgcaaa ctgcgatctc 3900
tgctcttgaa ggtgacttga tggtcctcat taatggattt gctttggcct ggttggcaat 3960
tcgagcaatg gccgtgccac gcactgacaa catcgctcta ccaatcttgg ctgctctaac 4020
accactagct cgaggcacac tgctcgtggc atggagagcg ggcctggcta cttgtggagg 4080
gatcatgctc ctctccctga aagggaaagg tagtgtgaag aagaacctgc catttgtcat 4140
ggccctggga ttgacagctg tgagggtagt agaccctatt aatgtggtag gactactgtt 4200
actcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagtgaa gttctcacag ccgttggcct 4260
gatatgtgca ctggccggag ggtttgccaa ggcagacatt gagatggctg gacccatggc 4320
tgcagtaggc ttgctaattg tcagctatgt ggtgtcggga aagagtgtgg acatgtacat 4380
tgaaagagca ggagacatca catgggaaaa ggacgcggaa gtcactggaa acagtcctcg 4440
gcttgacgtg gcactggatg agagtggtga tttctccttg gtagaggaag atggtccacc 4500
catgagagag atcatactca aggtggtcct gatggccatc tgtggcatga acccaatagc 4560
tatacctttt gctgcaggag cgtggtatgt gtatgtgaag actgggaaaa ggagtggcgc 4620
cctctgggac gtgcctgctc ccaaagaagt gaagaaagga gaaaccacag atggagtgta 4680
cagagtgatg actcgcagac tgctaggttc aacacaggtt ggagtgggag tcatgcaaga 4740
gggagtcttc cacaccatgt ggcacgttac aaaaggagcc gcactgagga gcggtgaggg 4800
aagacttgat ccatactggg gggatgtcaa gcaggacttg gtgtcatact gtgggccttg 4860
gaagttggat gcagcttggg atggactcag cgaggtacag cttttggccg tacctcccgg 4920
agagagggcc agaaacattc agaccctgcc tggaatattc aagacaaagg acggggacat 4980
cggagcagtt gctctggact accctgcagg gacctcagga tctccgatcc tagacaaatg 5040
tggaagagtg ataggactct atggcaatgg ggttgtgatc aagaatggaa gctatgttag 5100
tgctataacc cagggaaaga gggaggagga gactccggtt gaatgtttcg aaccctcgat 5160
gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttgga tctgcatcca ggagccggaa aaaccaggag 5220
agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaaagaga ctccggacag tgatcttggc 5280
accaactagg gttgtcgctg ctgagatgga ggaggccttg agaggacttc cggtgcgtta 5340
catgacaaca gcagtcaacg tcacccattc tgggacagaa atcgttgatt tgatgtgcca 5400
tgccactttc acttcacgct tactacaacc catcagagtc cctaattaca atctcaacat 5460
catggatgaa gcccacttca cagacccctc aagtatagct gcaagaggat acatatcaac 5520
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tgatgcgttt cctgactcta actcaccaat catggacaca gaagtggaag tcccagagag 5640
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tccaagcgtg agaaacggaa atgaaatcgc agcctgtctg acaaaggctg gaaagcgggt 5760
catacagctc agcaggaaga cttttgagac agaatttcag aaaacaaaaa atcaagagtg 5820
ggactttgtc ataacaactg acatctcaga gatgggcgcc aacttcaagg ctgaccgggt 5880
catagactct aggagatgcc taaaaccagt catacttgat ggtgagagag tcatcttggc 5940
tgggcccatg cctgtcacgc atgctagtgc tgctcagagg agaggacgta taggcaggaa 6000
ccctaacaaa cctggagatg agtacatgta tggaggtggg tgtgcagaga ctgatgaagg 6060
ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct tcttgacaac atctacctcc aggatggcct 6120
catagcctcg ctctatcggc ctgaggccga taaggtagcc gccattgagg gagagtttaa 6180
gctgaggaca gagcaaagga agaccttcgt ggaactcatg aagagagggg accttcccgt 6240
ctggctagcc tatcaggttg catctgccgg aataacttac acagacagaa gatggtgctt 6300
tgatggcaca accaacaaca ccataatgga agacagcgta ccagcagagg tgtggacaaa 6360
gtatggagag aagagagtgc tcaaaccgag atggatggat gctagggtct gttcagacca 6420
tgcggccctg aagtcgttca aagaattcgc cgctggaaaa agaggagcgg ctttgggagt 6480
aatggaggcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag aggtttcagg aagccattga 6540
caacctcgcc gtgctcatgc gagcagagac tggaagcagg ccttataagg cagcggcagc 6600
ccaactgccg gagactctag agacaattat gctcttaggt ttgctgggaa cagtttcact 6660
ggggatcttc ttcgtcttga tgcggaataa gggcatcggg aagatgggct ttggaatggt 6720
aacccttggg gccagtgcat ggctcatgtg gctttcggaa attgaaccag ccagaattgc 6780
atgtgtcctc attgttgtgt ttttattact ggtggtgctc atacccgagc cagagaagca 6840
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agcctccgcc tgggctatct atgccgcatt gacaactctc atcaccccag ctgtccaaca 7080
tgcggtaacc acttcataca acaactactc cttaatggcg atggccacac aagctggagt 7140
gctgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ttatgcatgg gaccttggag tcccgctgct 7200
aatgatgggt tgctattcac aattaacacc cctgactctg atagtagcta tcattctgct 7260
tgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg cctacaagcg gcagcagcgc gtgctgccca 7320
gaaaaggaca gcagctggca tcatgaagaa tcccgttgtg gatggaatag tggtaactga 7380
cattgacaca atgacaatag acccccaggt ggagaagaag atgggacaag tgttactcat 7440
agcagtagcc atctccagtg ctgtgctgct gcggaccgcc tggggatggg gggaggctgg 7500
agctctgatc acagcagcga cctccacctt gtgggaaggc tctccaaaca aatactggaa 7560
ctcctctaca gccacctcac tgtgcaacat cttcagagga agctatctgg caggagcttc 7620
ccttatctat acagtgacga gaaacgctgg cctggttaag agacgtggag gtgggacggg 7680
agagactctg ggagagaagt ggaaagctcg tctgaatcag atgtcggccc tggagttcta 7740
ctcttataaa aagtcaggta tcactgaagt gtgtagagag gaggctcgcc gtgccctcaa 7800
ggatggagtg gccacaggag gacatgccgt atcccgggga agtgcaaagc tcagatggtt 7860
ggtggagaga ggatatctgc agccctatgg gaaggttgtt gacctcggat gtggcagagg 7920
gggctggagc tattatgccg ccaccatccg caaagtgcag gaggtgagag gatacacaaa 7980
gggaggtccc ggtcatgaag aacccatgct ggtgcaaagc tatgggtgga acatagttcg 8040
tctcaagagt ggagtggacg tcttccacat ggcggctgag ccgtgtgaca ctctgctgtg 8100
tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagag acacgaacac tcagagtgct 8160
ctctatggtg ggggactggc ttgaaaaaag accaggggcc ttctgtataa aggtgctgtg 8220
cccatacacc agcactatga tggaaaccat ggagcgactg caacgtaggc atgggggagg 8280
attagtcaga gtgccattgt ctcgcaactc cacacatgag atgtactggg tgtctggggc 8340
aaagagcaac atcataaaaa gtgtgtccac cacaagtcag ctcctcctgg gacgcatgga 8400
tggccccagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaac ctcggctcgg gtacacgagc 8460
tgtggcaagc tgtgctgagg ctcctaacat gaaaatcatc ggcaggcgca ttgagagaat 8520
ccgcaatgaa catgcagaaa catggtttct tgatgaaaac cacccataca ggacatgggc 8580
ctaccatggg agctacgaag cccccacgca aggatcagcg tcttccctcg tgaacggggt 8640
tgttagactc ctgtcaaagc cttgggacgt ggtgactgga gttacaggaa tagccatgac 8700
tgacaccaca ccatacggcc aacaaagagt cttcaaagaa aaagtggaca ccagggtgcc 8760
agatccccaa gaaggcactc gccaggtaat gaacatagtc tcttcctggc tgtggaagga 8820
gctggggaaa cgcaagcggc cacgcgtctg caccaaagaa gagtttatca acaaggtgcg 8880
cagcaatgca gcactgggag caatatttga agaggaaaaa gaatggaaga cggctgtgga 8940
agctgtgaat gatccaaggt tttgggccct agtggatagg gagagagaac accacctgag 9000
aggagagtgt cacagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga agcaaggaga 9060
gttcgggaaa gcaaaaggta gccgcgccat ctggtacatg tggttgggag ccagattctt 9120
ggagtttgaa gcccttggat tcttgaacga ggaccattgg atgggaagag aaaactcagg 9180
aggtggagtc gaagggttag gattgcaaag acttggatac attctagaag aaatgaatcg 9240
ggcaccagga ggaaagatgt acgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagtaa 9300
gtttgatctg gagaatgaag ctctgattac caaccaaatg gaggaagggc acagaactct 9360
ggcgttggcc gtgattaaat acacatacca aaacaaagtg gtgaaggttc tcagaccagc 9420
tgaaggagga aaaacagtta tggacatcat ttcaagacaa gaccagagag ggagtggaca 9480
agttgtcact tatgctctca acacattcac caacttggtg gtgcagctta tccggaacat 9540
ggaagctgag gaagtgttag agatgcaaga cttatggttg ttgaggaagc cagagaaagt 9600
gaccagatgg ttgcagagca atggatggga tagactcaaa cgaatggcgg tcagtggaga 9660
tgactgcgtt gtgaagccaa tcgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720
catgggaaaa gttaggaaag acacacagga gtggaaaccc tcgactggat ggagcaattg 9780
ggaagaagtc ccgttctgct cccaccactt caacaagctg tacctcaagg atgggagatc 9840
cattgtggtc ccttgccgcc accaagatga actgattggc cgagctcgcg tctcaccagg 9900
ggcaggatgg agcatccggg agactgcctg tcttgcaaaa tcatatgcgc agatgtggca 9960
gctcctttat ttccacagaa gggaccttcg actgatggct aatgccattt gctcggctgt 10020
gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac cacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080
gatgaccact gaggacatgc tcatggtgtg gaatagagtg tggattgagg agaacgacca 10140
tatggaggac aagactcctg taacaaaatg gacagacatt ccctatctag gaaaaaggga 10200
ggacttatgg tgtggatccc ttatagggca cagaccccgc accacttggg ctgaaaacat 10260
caaagacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320
tctatccacc caagtccgct acttgggtga ggaagggtcc acacccggag tgttgtaagc 10380
accaatttta gtgttgtcag gcctgctagt cagccacagt ttggggaaag ctgtgcagcc 10440
tgtaaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagctcatag tcaggccgag aacgccatgg 10500
cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560
gcgcttggaa gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620
gcctgaactg gagactagct gtgaatctcc agcagaggga ctagtggtta gaggagaccc 10680
cccggaaaac gcacaacagc atattgacgc tgggaaagac cagagactcc atgagtttcc 10740
accacgctgg ccgccaggca cagatcgccg aacttcggcg gccggtgtgg ggaaatccat 10800
ggtttct 10807
<210> 5
<211> 1777
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体（Synthetic Construct）
<400> 5
agcaaaagca ggggaaaata aaagcaacaa aaatgaaggc aatactagta gttctgctat 60
atacatttgc aaccgcaaat gcagacacat tatgtatagg ttatcatgcg aacaattcaa 120
cagacactgt agacacagta ctagaaaaga atgtaacagt aacacactct gttaacctat 180
tggaggataa gcataacagt aagctatgca aactgagagg cgtagcacca ttgcatctag 240
gtaagtgtaa tatagccgga tggattctag ggaatcccga atgcgaatca ctatcaaccg 300
ctagctcatg gtcatacata gtcgaaacac catcaagcga taacggtaca tgttatcccg 360
gagactttat cgattacgaa gagcttagag agcaattgtc tagcgtaagc tcattcgaaa 420
gattcgaaat ttttccgaaa actagctcat ggcctaatca cgatagtagt aaaggcgtaa 480
ctgccgcatg cccacacgcc ggagctaaat cattctataa gaatctgatt tggttagtga 540
aaaaagagaa ttcatatccg aaactatcta aatcatacat taacgataag ggtaaggagg 600
tactagtgtt gtgggggata caccatccat caactagcgc cgatcagcaa tcattgtatc 660
agaacgcaga cgcatacgta ttcgtagggt ctagtagata ctctaaaaaa tttaaacccg 720
aaatcgcaat tagaccgaaa gtgagaggcc aagagggtag aatgaattac tattggacac 780
tagtcgaacc aggcgataag attacattcg aagcgacagg gaatctagtc gtaccgagat 840
acgcattcgc aatggagaga aacgccggat ccggaattat tattagcgat acacccgtac 900
acgattgcaa tactacgtgt cagacaccaa aaggcgcaat taatactagt ctgccatttc 960
agaatataca cccaattaca atcggtaagt gtccaaaata cgttaagtca actaagttga 1020
gactcgcaac agggttgaga aatacaccgt caattcaatc tagggggttg ttcggagcaa 1080
tcgcagggtt tatcgaaggg gggtggacag gtatggttga cggatggtac ggataccatc 1140
atcaaaacga acagggatcc ggatacgcag ccgaactgaa aagtacacag aacgctatag 1200
acgaaattac gaataaagtg aatagcgtaa tcgaaaaaat gaatacgcaa tttacagccg 1260
taggtaagga gtttaatcat ctcgaaaaaa ggattgagaa tctgaataaa aaagtcgacg 1320
acggattctt agacatttgg acttataacg ccgaaatgtt agtgttactc gaaaacgaaa 1380
gaacactaga ctatcacgat tcaaacgtta agaatctata cgaaaaagtg agatcgcaat 1440
tgaaaaataa cgctaaagag atagggaatg ggtgtttcga attctatcat aaatgcgata 1500
atacatgtat ggaatccgtt aaaaacggaa catacgatta ccctaagtat agcgaagagg 1560
ctaaactgaa tagggaagag atagacggag tggaacttga atcaactagg atttatcaga 1620
tactcgcaat ttatagtacg gttgccagtt cattggtact ggtagtctcc ctgggggcaa 1680
tcagtttctg gatgtgctct aatgggtctc tacagtgtag aatatgtatt taacattagg 1740
atttcagaag catgagaaaa acacccttgt ttctact 1777
<210> 6
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体（Synthetic Construct）
<400> 6
agcaaaagca ggggtttaaa atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct 60
gtatgacaat tggaatggct aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga 120
ttagccactc aatccaattg gggaatcaga atcaaatcga aacatgcaat caatccgtaa 180
ttacatacga gaataatact tgggtgaatc agacatacgt taacatatcg aatactaatt 240
tcactgccgg acaatccgtc gtgagtgtga aactagccgg taatagtagt ctatgtcccg 300
ttagcggatg ggctatatac tctaaagaca atagcgttag aatcggatct aaaggcgacg 360
tattcgttat acgcgaacca ttcataagtt gtagtccatt agagtgtagg actttttttc 420
tgacacaggg cgcactattg aacgataagc attctaacgg tacaatcaaa gataggtcac 480
catatagaac actaatgtca tgtccgatag gcgaagtgcc tagtccatac aatagtagat 540
tcgaatccgt cgcttggtcc gctagcgcat gccatgacgg tattaattgg ttgacaatcg 600
ggattagcgg acccgataac ggcgcagtcg ccgtacttaa gtataacggt ataattaccg 660
atactattaa gagttggcga aataatatat tgcgaacaca ggaatccgaa tgcgcatgcg 720
ttaacggatc atgttttacc gttatgactg acggaccatc taacgggcaa gcgtcatata 780
agatttttag aatcgaaaaa ggtaagatag tgaaatccgt cgaaatgaac gctcctaatt 840
atcattacga agagtgctca tgttatcccg attctagcga aattacatgc gtatgtagag 900
acaattggca cggatctaat agaccttggg tgtcattcaa tcagaatcta gagtatcaaa 960
tcgggtatat atgctcaggg atattcggag acaatcctag acctaacgat aagacagggt 1020
catgcggacc agtgagttct aacggcgcta acggcgttaa ggggtttagt ttcaaatacg 1080
gtaacggcgt atggataggg agaactaagt caatctctag tagaaacgga ttcgaaatga 1140
tatgggaccc taacggatgg accggaaccg ataataattt ttcgattaaa caggatatcg 1200
tagggattaa cgaatggtca gggtatagcg gatcattcgt acagcatcca gagttaaccg 1260
gactcgattg catacgacca tgtttttggg tcgaactgat tagggggaga ccgaaagaga 1320
atactatatg gactagcggg agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg 1380
gttggtcttg gccagacggt gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa tttgttcaaa 1440
aaactccttg tttctact 1458

Claims (55)

1.一种治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
将修饰的病毒给予有需要的受试者，其中，所述修饰的病毒选自于由如下所组成的组：
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏倚，并且所述修饰的序列的密码子对偏性降低了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2；
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高21个实例；
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高13个实例；
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加的组合为至少比亲本高42个实例；以及
它们的组合。
2.一种治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予初始剂量的修饰的病毒；以及
向有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的修饰的病毒，
其中，所述初始剂量和加强剂量的修饰的病毒各自独立地选自于由如下所组成的组：
通过密码子对去优化以外的其它方法产生的减毒病毒；
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的密码子对去优化区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，修饰的序列的密码子对偏性小于亲本病毒的密码子对偏倚，并且所述修饰的序列的密码子对偏性降低了至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2；
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的CpG二核苷酸的区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，CpG二核苷酸的增加为至少比亲本高41个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高21个实例；
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA二核苷酸的区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA二核苷酸的增加为至少比亲本高26个实例，或者为至少比亲本病毒基因组高13个实例；
通过将野生型病毒的至少一个基因组区域置换为编码相似蛋白序列的具有增加的UpA和CpG二核苷酸的区域，从所述野生型病毒或先前修饰的病毒衍生而来的修饰的病毒，其中，UpA和CpG二核苷酸的增加组合起来为至少比亲本高42个实例；以及
它们的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予所述初始剂量。
4.如权利要求2所述的方法，其中，瘤内或静脉内给予所述一个或多个加强剂量。
5.如权利要求2所述的方法，其中，在一个初始剂量后约2周，给予所述一个或多个加强剂量中的第一个加强剂量；或者如果多于一个初始剂量，在最后的初始剂量后约2周进行给予。
6.如权利要求2所述的方法，其中，所述受试者患有癌症。
7.如权利要求2所述的方法，其中，在所述受试者未患癌症时，给予所述初始剂量。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述受试者处于发展为癌症的较高风险中。
9.如权利要求7所述的方法，其中，在所述受试者未患癌症时，在所述初始剂量后约每1年、每2年、每3年、每4年、每5年、每6年、每7年、每8年、每9年或每10年给予所述一个或多个加强剂量。
10.如权利要求7所述的方法，其中，在所述受试者诊断出患有癌症后，给予所述一个或多个加强剂量。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括给予PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为抗PD1抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述抗PD1抗体选自于由如下抗体所组成的组：派姆单抗、纳武单抗、pidilizumab、AMP-224、AMP-514、spartalizumab、西米普利单抗、AK105、BCD-100、BI 754091、JS001、LZM009、MGA012、Sym021、TSR-042、MGD013、AK104、XmAb20717、替雷利珠单抗及其组合。
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂选自于由如下所组成的组：PF-06801591、表达抗PD1抗体的多能性杀伤性T淋巴细胞(PIK-PD-1)、自体抗EGFRvIII 4SCAR-IgT细胞及其组合。
15.如权利要求11所述的方法，其中，所述PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗PD-L1抗体选自于由如下抗体所组成的组：BGB-A333、CK-301、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、阿特株单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、BMS-936559、CK-301及其组合。
17.如权利要求11所述的方法，其中，所述抗PD-L1抑制剂为M7824。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，治疗所述恶性肿瘤降低了所述恶性肿瘤复发的可能性。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，治疗所述恶性肿瘤降低了患有不同于所述恶性肿瘤的第二癌症的可能性。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，如果所述受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二癌症，所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二癌症的生长减慢。
21.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，在所述恶性肿瘤缓解之后，如果所述受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二癌症，所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二癌症的生长减慢。
22.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，治疗所述恶性肿瘤刺激所述肿瘤中的炎性免疫应答。
23.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，治疗所述恶性肿瘤将促炎细胞募集到所述肿瘤。
24.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，治疗所述恶性肿瘤刺激抗肿瘤免疫应答。
25.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述修饰的病毒为重组的修饰的病毒。
26.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述修饰的病毒由小核糖核酸病毒修饰而来。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述小核糖核酸病毒为肠病毒。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述肠病毒为肠病毒C。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述肠病毒C为脊髓灰质炎病毒。
30.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述修饰的病毒由正粘病毒修饰而来。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述正粘病毒为甲型流感病毒。
32.如权利要求31所述的方法，其中，对所述甲型流感病毒的一个或多个区段进行重新编码。
33.如权利要求31所述的方法，其中，对HA区段、NA区段或者HA区段和NA区段两者进行重新编码。
34.如权利要求31所述的方法，其中，所述修饰的病毒为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。
35.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述修饰的病毒由黄病毒修饰而来。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述黄病毒为寨卡病毒。
37.如权利要求35所述的方法，其中，对所述寨卡病毒的前膜/包膜(E)编码区或非结构蛋白3(NS3)编码区或者两者进行重新编码。
38.如权利要求35所述的方法，其中，重新编码包括改变所述E和NS3编码序列中CG和/或TA二核苷酸的频率。
39.如权利要求37所述的方法，其中，所述重新编码的E蛋白编码序列或所述NS3编码序列或者两者具有小于-0.1的密码子对偏性。
40.如权利要求37所述的方法，其中，所述重新编码的E蛋白编码序列或所述NS3编码序列或者两者具有0.1-0.4的密码子对偏性降低。
41.如权利要求36所述的方法，其中，所述修饰的病毒为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
42.一种如权利要求1至24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述恶性肿瘤为实体瘤。
43.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述恶性肿瘤为胶质母细胞瘤、腺癌、黑素瘤、肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌或肝癌。
44.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，瘤内、静脉内、脑内、肌内、脊髓内或鞘内给予所述修饰的病毒。
45.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述修饰的病毒为PV1-MinY，并由所述野生型病毒或所述先前修饰的病毒制备，其中，将所述野生型病毒或所述先前修饰的病毒的P1区的中间部分置换为根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成序列。
46.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述重组的修饰的病毒为PV1-MinY，并由所述先前修饰的病毒PV1(M)或所述野生型病毒PV1(M)制备，并且将所述先前修饰的病毒PV1(M)或所述野生型病毒PV1(M)的P1区的中间部分置换为重新编码以具有增加的UpA和/或CpG二核苷酸的合成序列。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述重组的病毒是由PV1(M)制备的PV1-MinY，并且将所述PV1(M)中的包含所述P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸的核苷酸片段置换为包含根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸的相应核苷酸片段。
48.一种如权利要求1-24中任一项所述的治疗恶性肿瘤的方法，其中，所述修饰的病毒是由PV1(M)制备的PV1-MinY，并且将所述PV1(M)中的由所述P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸组成的核苷酸片段置换为包含根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的P1区的第1513位核苷酸至第2470位核苷酸的相应核苷酸片段。
49.一种治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
通过以下从野生型小核糖核酸病毒制备重组的修饰的小核糖核酸病毒：至少将所述野生型小核糖核酸病毒的P1结构域中的核苷酸片段置换为包含根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成序列的相应核苷酸片段，并且
任选地，将所述野生型小核糖核酸病毒的P1置换为根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成P1，所述野生型小核糖核酸病毒的P1结构域选自于由PV1(S)、PV2(S)和PV3(S)所组成的组；以及
将所述重组的修饰的病毒给予有需要的受试者。
50.如权利要求49所述的方法，其中，至少将核苷酸片段包括至少将包含SEQ ID NO：1的nt#1513-nt#2470的核苷酸片段置换为包含根据人密码子对偏性重新编码以具有降低的密码子对分值的合成序列的相应核苷酸片段，所述包含SEQ ID NO：1的nt#1513-nt#2470的核苷酸片段为所述修饰的病毒的P1结构域。
51.如权利要求49所述的方法，其中，瘤内、静脉内、脑内、肌内、脊髓内或鞘内给予所述重组病毒，并引起肿瘤细胞的细胞裂解。
52.如权利要求49所述的方法，其中，所述恶性肿瘤选自于由如下恶性肿瘤所组成的组：多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、支气管癌和表皮样癌。
53.如权利要求49所述的方法，其中，所述小核糖核酸病毒为肠病毒C。
54.如权利要求49所述的方法，其中，所述小核糖核酸病毒为脊髓灰质炎病毒。
55.如权利要求49所述的方法，其中，所述P1结构域选自Sabin疫苗毒株PV1(S)、PV2(S)和PV3(S)。
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